CN104053775A

CN104053775A - 用于治疗缺血性损伤的化合物

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Publication number: CN104053775A
Application number: CN201280062508.3A
Authority: CN
Inventors: 彼得·费迪南德; 佐尔坦·沃尔高; 塔马斯·坎森特; 阿尼哥·戈尔比
Original assignee: Medicine Hungary 2000 Co Limiteds
Current assignee: Medicine Hungary 2000 Co Limiteds
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-10-17
Also published as: US20140256792A1; WO2013057527A3; EP3399039B1; EP2768959B1; EP3399039A1; WO2013057527A2; EP2584040A1; US9457046B2; CN112022870B; CN112022870A; CN104053775B; EP2768959A2

Abstract

本发明涉及用于在急性缺血/再灌注影响治疗中使用的微小RNA(miRNA)化合物，用于通过使用生物样品的缺血-再灌注试验、预处理试验和后处理试验制备miRNA化合物的方法，miRNA化合物在制备在缺血性心脏疾病中具有细胞保护作用和/或抗缺血作用的药物组合物中的用途。

Description

用于治疗缺血性损伤的化合物

技术领域

本发明涉及一种通过检测缺血再灌注、检测生物样品预处理和检测生物样品后处理制备特定的微小RNA(miRNA)化合物的方法，用于细胞或组织的预防和/或治疗以保护它们免于在易感染于缺血或缺血发作的患者体内急性缺血再灌注损伤的影响的miRNA化合物及包括它们的药物组合物，还涉及miRNA化合物及编码它们的核苷酸在诊断和在制备药物组合物中的用途，及用于治疗需要保护细胞或组织免于急性缺血再灌注损伤的影响的患者的方法。

背景技术

微小RNA

微小RNA(miRNA)是小的(长度约18至约25个核苷酸，优选地长度19-23个核苷酸)非蛋白质编码RNA分子，它们在当前被认为是基因表达的内源性生理调节剂[Bartel DP2004]。最近，miRNA通过抑制或激活翻译/转录(“RNA干扰”)在基因表达的转录后调节中起到的重要作用已被公认[Lim LP等，2005；Buchan JR等，2007]。虽然不同的人体miRNA的总数估计高达1000个，体现了整个基因组的大概1-2％，但迄今为止只研究了约300-500个[Small EM等，2010]。然而在很多情况下，靶向基因和因此相关的生物功能还尚未被识别，据估计miRNA调节整个基因组高达30％的基因。大量的miRNA和更大量的靶向基因显示了在大范围疾病的开始和发展中miRNA的重要作用。miRNA活性可以以各种方式被对抗，例如通过反义miRNA、所谓的反义寡核苷酸(antagomir)或miRNA抑制剂，因此，与疾病相关的特定的miRNA的上调可通过依据miRNA的表达在体内或体外给药miRNA抑制剂的治疗被正常化。miRNA的效果可与miRNA激动剂化合物一起取得，miRNA激动剂例如为miRNA模拟物，因此，在这种情况下，与疾病相关的特定的miRNA的下调可在体内或体外通过外源给药miRNA激动剂(例如miRNA模拟物)被正常化。除此之外，使与疾病相关的miRNA正常化表达的药物可被开发。

已知miRNA在一些器官和/或组织的细胞水平的许多生理和病态过程中起到重要作用。例如，在心脏中，这些过程包括缺血再灌注损伤、心肌纤维化、肥厚性反应、肌细胞收缩、心脏发育、和心律失常[vanRooij E等，2007]。最近，若干小组报道了miRNA在心肌梗塞的病理学中的参与[Ren XP等，2009；Dong S等，2009]。miRNA在心脏病理学中的重要性暗示了它们的治疗前景和/或诊断潜力[Frost RJ等，2010；Fasanaro P等，2010]。然而，miRNA在心肌缺血中的作用，特别是在心肌缺血再灌注损伤和内源性心肌保护机制如缺血预处理和缺血后处理的早期阶段中的作用是未知的。

缺血性心脏病和心肌保护

缺血性心脏病在工业化国家是死亡的首要原因。缺血性心脏病包括急性心肌梗塞(MI(其中心肌组织死亡从而出现急性心力衰竭和心律失常)以及慢性心肌梗塞引发的心脏组织重塑和心脏衰竭。当冠状动脉变得闭塞、并且不能再将血液供应到心肌组织时发生MI。这通常主要归因于脆弱的动脉粥样硬化斑块破裂后的冠状动脉闭塞(堵塞)，它是动脉壁上的脂质(脂肪酸)和白血细胞(特别是巨噬细胞)的不稳定聚集。冠状动脉闭塞也可通过其他机制发生，例如通过动脉的机械性闭塞，如在心脏手术期间，或通过动脉的突然收缩，如由于交感紧张的病理性增加。

当急性心肌梗塞发生时，该组织不再接收充足的血液流动并在几小时内死亡。在心肌梗塞的冠状闭塞之后的几秒内，灌注下的心肌细胞不再收缩，导致壁运动异常，梗塞内部和周围的高壁压力、抑制的心室功能、及出现心律失常。在受影响的心肌组织内的细胞死亡后的几周内，心肌细胞被替换为疤痕组织。因此，我们可明确区别急性心肌梗塞(特征为快速细胞死亡)和慢性梗塞(特征为疤痕组织的形成及心肌组织的重塑)。

在急性心肌梗塞之前通常有警示信号和警示症状。与急性心肌梗塞有关的疼痛可感觉像严重的胃灼热。患有急性梗塞的患者可能会感觉到胸腔内的压迫或挤压疼痛，有时伴有出汗、晕眩、恶心或呕吐。他们可能也会经受从胸部延伸到下巴、左手臂或左肩膀的疼痛。感觉胸闷，伴有呼吸气短超过几秒以上、或伴有突发的压倒性的疲劳发作都是非常常见的警示信号。

急性心肌梗塞的治疗已进入新的时代，其中，死亡率可通过允许血流快速回流到梗塞的缺血区域的程序(例如再灌注治疗)大约被减半。但是，再灌注可能导致进一步的并发症，如减弱的心肌收缩功能(晕眩)和心律失常。此外，有实验证据表明，不可逆的细胞损伤导致的细胞坏死和细胞凋亡通过再灌注可能被提高。因此，开发抗缺血剂以在缺血再灌注期间延迟细胞坏死的开始并限制梗塞的总程度从而改善心肌功能以及减少心律失常的发病率是重大的临床重要性，[参见综述：Ferdinandy P等，2007]。

早期的用于减弱缺血再灌注损伤影响的药理方法具有有限的实验效果或未能转化成实用的临床疗法。但是最近，心脏已显示出具有显著的适应缺血再灌注压力的能力，并且在缺血再灌注中，心脏的这种分子可塑性已成为努力研究的焦点，以期望潜在的机制可被运用于治疗开发。

最近，一些研究已表明，miRNA通过改变关键信号元素来有助于缺血再灌注损伤，从而使他们成为潜在的治疗靶点。使用各种体内、间接体内和体外模型的研究已表明miR-1、miR-21、miR-29、miR-92a、miR-133、miR-199a和miR-320参与到缺血再灌注和/或心肌梗塞后的重塑的可能性[参见例如Ye Y.等，2011，Ren XP等，2009]。SepramaniamS.等(2010)已表明反义miR-320a可引起伴随水通道蛋白1及4mRNA及蛋白表达增加的脑内缺血梗塞体积的减少，这与Ren XP等(2009)的结果不同，并表明miRNA在脑内的调节不同于在心脏中的调节。现已表明，肌肉和/或心脏特定的miRNA miR-1、miR-133a/b和miR-208相对于它们在胎心中的调节，参与人体MI后的重塑[Bostjancic E.等，2010，He B，等，(2011)]。

Godwin JG，等(2010)提供了在肾缺血再灌注模型中肾缺血再灌注损伤的miRNA信号。他们发现了miR-192显著地下调。现已识别miRNA信号在整个外围血液中作为新的生物标记用于急性心肌梗塞，并报道了血浆miR-30C水平的显著提高[Meder B等，2010]。

Dong S等(2009)研究了miRNA-21的作用，并表明miRNA-21显示了对抗缺血诱发的心肌细胞损伤的保护作用。然而，作者没有研究在没有再灌注及预处理和后处理的情况下实施的冠状动脉的永久性闭塞。Cheng Y(2010)也表明缺血预处理调节的miRNA-21保护心脏免于缺血/再灌注损伤。两个作者审查了只有在缺血状态开始6小时后miRNA才表达，在这个时间点梗塞在小鼠心脏中充分形成。本发明的发明人基于用于获得样品的预处理、后处理及更为狭窄的、临床上更为重要的时间窗口的特定研究得出不同的结果。

Yin KJ等(2010)已发现miR-497在脑缺血后显著地上调，并表明这一miRNA通过负向调控抗凋亡蛋白、bcl-2和bcl-w促进缺血性神经元死亡，并且这一方式可有助于中风的缺血性脑损伤的发病机理。

Xu，Ch等(2009)已表明mmu-miR-23a、mmu-miR-326、mmu-miR-346_MM1和mmu-miR-370在IPC对抗肝脏中肝脏I/R损伤的保护机制中的潜在作用。然而，miRNA在肝脏中的表达模式似乎明显地不同于其在心脏中的表达模式。在这一研究中，没有测量梗塞尺寸。

Lusardi TA等(2010)表明缺血预处理调控了miRNA的表达和它们在老鼠大脑皮层中的预测靶向目标。没有暗含表明用于急性心肌梗塞的治疗。

He B，等(2011)研究了承受缺血/再灌注的心脏中的miRNA的表达，并发现了任意选取的miRNA-1和miRNA-133在后处理中是上调的。作者试图发现这些miRNA的靶向目标。没有给出使用这些或其他的miRNA用于治疗的建议。

一些miRNA在本领域中因为在心脏疾病或缺血性病症中具有作用已被提到。例如，在US2010/0010073[Thum T.，Bauersachs J.2010]中大量的miRNA序列在心脏疾病的预防或治疗中作为潜在的活性物质被提出，其中包括miR-134、miR-212、miR-214、miR-21、miR-129、miR-182和miR-290。

Wang X.等(2010)已发现靶向促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的MiRNA-494保护对抗缺血-再灌注引发的心脏损伤。

在WO2009/062169(2009)和US2010/0317713(2010)中Olson E.和Van Rooij，E.表明miR-15家族(miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424和miR-497)的抑制作用在心脏肥大、心脏衰竭或心肌梗塞的治疗中及用于这些疾病的诊断中将是有用的。实验数据主要涉及心脏的形态学研究，但没有得出这些分子在急性缺血再灌注损伤中的细胞保护作用的结论。

WO2010/103015[Engelhardt S.和Jentzsch C.(2010)]报道了在心肌细胞用471个人体前体的miRNA库进行转染的实验，并研究了它们对心肌细胞的尺寸及形态的影响。虽然可以得出这些miRNA对心肌细胞的影响的间接提示，但没有得出它们的心肌保护作用的明确结论。

在WO2010/135570[Olson E.和Van Rooij,E.2010]中试图识别在随后的心肌梗塞(MI)中参与的miRNA，MI在小鼠心脏中被实验性地诱导，并且对比了在MI后在第3天和14天的小鼠心脏中的miRNA表达谱。没有公开在MI或急性缺血再灌注后很快的miRNA调控的指示。

在WO2010/091204[Olson E.和Van Rooij,E.2010]中提出共同给药miR-208a或miR-208b的抑制剂及miR-499的抑制剂用于治疗心脏肥大、心脏衰竭或MI，正如已发现这些miRNA的击倒效应(knockdown)抑制心脏应激反应。没有提供直接证据。

在EP2275545A1[Thum T.和Fiedler,J.2011]中在心肌梗塞后的第14天在内皮细胞中检测到了miR-24上调，然而miR-24水平在心肌梗塞后的心肌细胞中并未改变(图1d)。接着，心脏内皮细胞被抑制的反义寡核苷酸和miR-24表达靶向。在小鼠中，在心肌梗塞后使用反义寡核苷酸对抗miR-24的及时治疗导致心脏功能的改善和左心室扩张的衰减。

在WO2010/120969[Olson E.等2010]中公开了miR-30家族成员在心肌梗塞后的第3天和14天的心脏组织中是下调的。在MI后的即刻或不久之后没有提供有关miR30家族调控的数据。

在CN101643791A[Wang N.等2010]中提议在诊断、预防和治疗包括心肌梗塞的心脏疾病中使用miRNA-328的反义核苷酸。

在WO2011/084460[Qlson Eric N.；Rooij Eva Van；Quiat Daniel2011]中研究了在心肌梗塞后的6、24、48小时和/或在再灌注之后miRNA的上调或下调。已发现在MI后，一些miRNA是上调的，一些miRNA是下调的，然而调控水平在不同的时间点是不同的。作者提供了关于哪些miRNA应当被对抗(miR-15家族、miR-30家族、miR-92a、miR-320、miR-20、miR-199a、miR-499a)，或者在研究条件下是否应当在它们中给予激动剂(miR-126、miR-143、miR-210和miR-29a-c)的建议。没有在预处理或后处理中有关miRNA调控数据的报道，然而，也没有缺血再灌注期间或缺血再灌注后即刻的信息。

这些出版物在梗塞之后通常考虑miRNA的后期上调，通常是缺血发作或它们的实验模拟后的数天，并且不涉及miRNA在急性缺血再灌注损伤中的细胞保护作用，并且作者没有检查细胞保护作用中miRNA的潜在作用。此外，在大量的miRNA的情况下，本发明的发明人已发现在实验设定中miRNA种类(species)的不同调控，其中，在预处理和后处理中研究了特定的细胞保护作用。

在现有的实验中，其中，仅以非常少的实例公开了所分析的miRNA或它们的激动剂或拮抗剂；通常情况，仅仅描述了在疾病条件下或在它们的实验模型中有关该miRNA调控的观察。

本领域似乎没有提到用于得到在组织或器官的缺血再灌注中并且特别是急性缺血和/或再灌注中特定参与细胞保护性miRNA以及相关化合物(miRNA化合物，例如miRNA模拟物和/或miRNA抑制剂)的方法。本发明的发明人发现，如果考虑miRNA种类在预处理和/或后处理中的调控，可获得细胞保护性miRNA化合物。所述化合物在急性缺血和/或再灌注损伤期间、之前或之后的细胞保护作用中是特别有用的。

发明内容

本发明涉及一种用于获得微小RNA(miRNA)化合物的方法，该化合物用于在治疗中保护细胞或组织免于在易感染于缺血的或缺血发作的患者心脏内急性缺血性损伤和/或急性再灌注损伤的影响，

i)提供包含表达的miRNA种类的生物样品组，所述样品组包括

对照样品，

第一样品和

第二样品和/或

第三样品

其中，所述样品能够经受缺血，

ⅱ)使每个样品承受需氧灌注一段时间，并在这段时间内

使所述对照样品既不承受缺血也不承受预处理或后处理，从而获得非缺血对照样品，和

使所述第一样品承受缺血，从而承受缺血样品，和

通过使第二样品承受预处理治疗方案并随后承受缺血来预处理第二样品，从而获得预处理的样品，和/或

通过使第三样品承受缺血并随后承受后处理治疗方案来后处理第三样品，从而获得后处理的样品，

iii)评价miRNA种类的表达水平

-在非缺血对照样品中，

-相对于所述非缺血对照样品，在缺血样品中，和

-相对于所述非缺血对照样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于所述非缺血对照样品，在后处理的样品中，和

iv)计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于缺血样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于缺血样品，在后处理的样品中，

v)相对于所述缺血/再灌注样品，在所述预处理的样品和/或后处理的样品中，识别miRNA种类的表达水平被上调至少1.3倍，优选至少1.5倍，或至少1.8倍或至少2.0倍，或下调至少1.3倍，优选1.5倍或至少1.8倍或至少2.0倍，

ⅵ)获得所述miRNA种类的核苷酸序列，

ⅶ)合成miRNA化合物，

-所述miRNA化合物是所述miRNA种类的miRNA激动剂，称为预缺血细胞保护性miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血样品在预处理的样品中是上调的，和/或

-所述miRNA化合物是所述miRNA种类的miRNA激动剂，称为后缺血细胞保护性miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血样品在后处理的样品中是上调的，

和/或

-所述miRNA化合物为所述miRNA种类的miRNA拮抗剂，称为预缺血细胞病变miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血样品在预处理的样品中是下调的，和/或

-所述miRNA化合物为所述miRNA种类的miRNA拮抗剂，称为后缺血性细胞病变miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血样品在后处理的样品中是下调的。

在本发明中，用于表达水平评估的样品优选地在缺血结束后最多1h、1.5h、2h、2.5h或3h后被收集。优选地，在缺血结束后最多1h、1.5h、2h、2.5h或3h后进行再灌注。优选地，在缺血结束后最少0.5h或1h或1.5h进行再灌注。

在优选实施例中，缺血包括缺血及再灌注。

在另一优选实施例中，缺血可被视为缺氧。在优选实施例中，缺氧包括缺氧和复氧。

miRNA种类的显著上调或下调在本文中被称为是miRNA种类的改变或变化水平，其至少1.3倍或优选至少1.5倍或至少1.8倍或至少2.0倍或可能的高于可接受的p值，优选地以在统计学显著性测试中不大于0.05的p值(或以p<0.05)。应当理解的是，显著性问题可取决于测量方法以及测量精度或正确性。因此，重要的是上调或下调的水平显著低于使用条件下的水平，然而以数字给定的水平可以是变化的，因为对于本领域技术人员是清楚理解地。优选地，在本发明的任一实施例中，miRNA种类的表达水平是

上调至少1.5倍，高度优选地至少1.8倍，或至少2倍，和/或

下调至少1.5倍，高度优选地至少1.8倍，或至少2倍。

在优选实施例中，下调通过对数比例来评估，优选通过log2比例或通过线性比例评估。

在本发明实施例中，治疗或预防急性心肌梗塞。

在优选实施例中，所述miRNA化合物选择由下述任一的miRNA种类的miRNA激动剂组成的组：miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3P、miR-320、miR-532-3P、miR-451、miR-212、miR-192、miR-139-5P、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a、miR-7b、let7e、let7i、miR-1和下述任一miRNA种类的miRNA拮抗剂：miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a和miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b以及它们的任何组合。

在更优选实施例中，所述miRNA化合物选自由下述任一的miRNA种类的miRNA激动剂组成的组：miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-212、miR-139-5p、miR-33、miR-let7b和下述任一miRNA种类的miRNA拮抗剂：miR-494、miR-487b以及它们的任意组合。

在优选实施例中，识别的miRNA种类是预缺血细胞保护性miRNA 种类，其中，

该预缺血细胞保护性miRNA种类选自由以下组成的组：miR-320、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-188、miR-192、miR-532-3p、miR-125b*、mir-451、miR-212、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类、为它们的家族成员的miRNA种类，

其中，该miRNA化合物用于在治疗中保护细胞或组织免于在易感染于缺血患者内的缺血性损伤和/或再灌注损伤的影响。

在优选实施例中，该预缺血细胞保护性miRNA种类相对于非缺血对照样品在预处理的样品中是显著上调的，和/或

该miRNA种类相对于非缺血对照样品在缺血样品中是显著下调的。

为了提供解释，相对于非局部缺血对照样品，在预处理的样品中是显著上调的预缺血细胞保护性miRNA种类，在使组织适应缺血和/或再灌注中具有潜在的作用。在优选实施例中，识别的miRNA种类是后缺血细胞保护性miRNA种类，其中，

所述后缺血细胞保护性miRNA种类选自由以下组成的组：miR-125b*、miR-33、miR-139-3p、miR-320、miR-532-3p、miR-188、miR-let7e、miR-let7i、miR-1、miR-503、miR-335、miR-328、miR-181a、miR-let7b、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类，为它们的家族成员的miRNA种类，

其中，所述miRNA化合物用于在治疗中保护细胞或组织免于在缺血发作的患者中急性缺血性损伤的影响。

在优选实施例中，该后缺血细胞保护性miRNA种类相对于非缺血对照样品在后处理的样品中是显著上调的，和/或

所述miRNA种类相对于非缺血对照样品在缺血样品中是显著下调的。

为了提供解释，相对于非缺血对照样品，在后处理的样品中也是显著上调的后缺血细胞保护性miRNA种类，在使组织适应缺血和/或再灌注中可能具有作用。

如果预缺血或后缺血细胞保护性miRNA种类的水平相对于非缺血样品在缺血样品中没有显著地变化，这表明所述miRNA没有参与缺血性损伤。

如果预缺血或后缺血细胞保护性miRNA种类在缺血样品中显著地下调，即在缺血和预处理或后处理中分别观察到相反调控，这表明所述miRNA具有特别强的保护作用。

在优选实施例中，识别的miRNA种类是预缺血细胞病变miRNA 种类，其中

该预缺血细胞病变miRNA种类选自由以下组成的组：mir-487b、miR-494、miR-352、miR-93、miR-106b、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类，为它们的家族成员的miRNA种类，

其中，所述miRNA化合物用于在治疗中保护细胞或组织免于在易感染于缺血的患者中缺血性损伤和/或再灌注损伤的影响。

在优选实施例中，该预缺血细胞病变miRNA种类相对于非缺血对照样品在预处理的样品中是显著下调的。

相对于缺血样品，在预处理的样品中下调的所述预缺血细胞病变miRNA种类被称为是预缺血性细胞毒性miRNA种类，条件是所述miRNA种类相对于非缺血对照样品在缺血样品中也上调至少1.3倍，优选至少1.5倍。

在优选实施例中，识别的miRNA种类是后缺血性细胞病变miRNA 种类，其中，所述后缺血性细胞病变miRNA种类选自由以下组成的组：miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-130a、miR-16、miR-21、miR-22*、miR-26b、miR-30b-5p、miR-30c、miR-30c-1*、miR-30e、miR-339-3p、miR-450a、miR-499、miR-760-5p、miR-99a、miR-99a*、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类、为它们的家族成员的miRNA种类，

其中，所述miRNA化合物用于在治疗中保护细胞或组织免于在缺血发作的患者中缺血性损伤和/或再灌注损伤的影响。

在优选实施例中，该后缺血性细胞病变miRNA种类相对于缺血样品在后处理的样品中是显著下调的。

相对于缺血样品，在后处理的样品中下调的所述后缺血性细胞病变miRNA种类被称为后缺血性细胞毒性miRNA种类，条件是所述miRNA物种相对于非缺血对照样品在缺血样品中也上调至少1.3倍，优选至少1.5倍。

本发明还涉及用于在治疗中保护细胞、组织和/或器官免于在易感染于缺血或缺血发作的患者中缺血性损伤和/或再灌注损伤的影响的miRNA化合物，其中所述miRNA化合物选自

ⅰ)通过如本文所公开的本发明的方法获得的miRNA化合物，

ⅱ)miRNA激动剂

-在所述细胞或组织的预处理期间，在哺乳动物的细胞或组织中预缺血性细胞保护性miRNA种类的miRNA激动剂上调至少1.5倍或至少1.8倍，或至少2倍，和/或

-在所述细胞或组织的预处理期间，在哺乳动物的细胞或组织中后缺血性细胞保护性miRNA种类的miRNA激动剂上调至少1.5倍或至少1.8倍，或至少2倍，

ⅲ)miRNA拮抗剂

-由于所述细胞或组织的预处理，在哺乳动物的细胞或组织中预缺血性细胞病变miRNA种类的miRNA拮抗剂下调至少1.5倍或至少1.8倍，或至少2倍，和/或

-由于所述细胞或组织的后处理，在哺乳动物的细胞或组织中后缺血性细胞病变miRNA种类的miRNA拮抗剂下调至少1.5倍或至少1.8倍，或至少2倍。

本发明还涉及用于在治疗中保护细胞、组织和/或器官免于在易感染于缺血或缺血发作的患者中(在所述患者的心脏中)急性缺血和再灌注损伤的短期和/或直接影响的miRNA化合物。

其中，所述miRNA化合物在缺血发作后的5、4、3、2或1.5小时内或与再灌注同时给药患者和/或在与缺血风险有关的手术或介入前少于一天或少于12、8、6、5、4、3、2或1小时内给药患者。

其中，所述miRNA化合物选自

ⅱ)miRNA激动剂

-一miRNA种类的miRNA激动剂，相对于承受缺血和再灌注的对照心脏组织样品，在承受缺血和再灌注的所述细胞或组织的预处理期间，哺乳动物心脏组织样品中的所述miRNA种类被上调至少1.5倍，且所述miRNA种类是预缺血性细胞保护性miRNA种类，和/或

-一miRNA种类的miRNA激动剂，相对于承受缺血和再灌注的对照心脏组织样品，在承受缺血和再灌注的所述细胞或组织的后处理期间，哺乳动物心脏组织样品中的所述miRNA种类被上调至少1.5倍，且所述miRNA种类是后缺血性细胞保护性miRNA种类，

ⅲ)miRNA拮抗剂

-一miRNA种类的miRNA拮抗剂，由于承受缺血和再灌注的所述细胞或组织的预处理，相对于承受缺血和再灌注的对照心脏组织样品，在哺乳动物心脏组织样品中的所述miRNA种类被下调至少1.5倍，且所述miRNA种类是预缺血性细胞病变miRNA种类，和/或

-miRNA种类的miRNA拮抗剂，由于承受缺血和再灌注的所述细胞或组织的预处理，所述miRNA种类在哺乳动物心脏组织样品中相对于承受缺血和再灌注的对照心脏组织样品中下调至少1.5倍，且所述miRNA种类是后缺血性细胞病变miRNA种类，

其中，所述miRNA激动剂或拮抗剂为核酸部分，所述核酸部分包含等同于或互补于相应miRNA种类的种源区的核苷酸序列，和/或所述核酸部分包括17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA种类的序列或等同于所述成熟miRNA种类的互补序列、或者分别与所述成熟miRNA种类的序列或所述成熟miRNA种类的互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同。

优选地，所述miRNA化合物是选自miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-320、miR-532-3p、miR-451、miR-212、miR-192、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a、miR-7b、let7e、let7i、miR-1及它们的任何组合的组的miRNA种类的miRNA激动剂，和/或选自miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b或它们的任意组合的组的miRNA种类的miRNA拮抗剂。

更优选地，所述miRNA化合物为

选自miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-212、miR-139-5p、miR-33、miR-let7b的组的miRNA种类的miRNA激动剂，和/或

选自miR-494、miR-487b和它们的任意组合的组的miRNA种类的miRNA拮抗剂。

更优选地，所述miRNA化合物选自它本身或选为来自以下组的组合，所述组由miRNA种类miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b的激动剂，miRNA种类miR-494和miR-487b的拮抗剂组成，并且所述miRNA激动剂或拮抗剂包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述miRNA种类的种源区等同或互补，和/或所述核苷酸序列包括17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列与所述miRNA种类的序列等同或互补，或者分别与所述成熟miRNA种类的序列或所述成熟miRNA种类的互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同，其中所述miRNA化合物在心肌细胞存活性测试中显示了细胞保护作用。

优选地，

所述预缺血性细胞保护性miRNA种类选自由以下组成的组：miR-320、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-188、miR-192、miR-532-3p、miR-125b*、miR-451、miR-212、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类、为它们的家族成员的miRNA种类，和/或

所述后缺血性细胞保护性miRNA种类选自由以下组成的组：miR-125b*、miR-33、miR-139-3p、miR-320、miR-532-3p、miR-let7e、miR-let7i、miR-1、miR-503、miR-328、miR-181a、miR-7b、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类、为它们的家族成员的miRNA种类，和/或

所述预缺血性细胞病变miRNA种类选自由以下组成的组：mir-487b、miR-352、miR-93、它们的前体、与它们具有相同的种源区的miRNA种类、为它们的家族成员的miRNA种类，和/或

所述后缺血性细胞病变miRNA种类选自由miR-208、miR-19b、miR-19a、和miR-130a、miR-16、miR-21、miR-22*、miR-26b、miR-30b-5p、miR-30c、miR-30c-1*、miR-30e、miR-339-3p、miR-450a、miR-499、miR-760-5p、miR-99a、miR-99a*组成的组。

在高度优选实施例中，所述miRNA化合物在缺血发作后的4或3小时内或与再灌注同时给药于患者，和/或在手术或介入之前少于6小时内给药于患者。

在优选实施例中，在预处理或后处理期间，所述miRNA激动剂或miRNA拮抗剂分别在所述哺乳动物心脏组织样品中的上调或下调通过以下方法进行评价：

i)提供一组包含表达的miRNA种类的生物样品，所述样品组包括：

对照样品，

第一样品，和

第二样品，和/或

第三样品

其中，所述样品能够经受缺血，

ⅱ)使每个样品于需氧灌注一段时间，并且在这段时间内

使所述第一样品承受缺血，优选承受缺血和再灌注，从而获得缺血样品，和

优选地在缺血后不超过5小时后分离miRNA

iii)评价所述miRNA种类的表达水平

-在非缺血对照样品中

-相对于所述非缺血对照样品，在缺血样品中，和

-相对于所述非缺血对照样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于所述非缺血对照样品，在后处理的样品中，

iv)计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于缺血样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于缺血样品，在后处理的样品中

v)相对于所述缺血/再灌注样品，在所述预处理的样品和/或后处理的样品中，识别所述miRNA种类的表达水平被上调至少1.5倍或下调至少1.5倍，

ⅵ)获得所述miRNA种类的核苷酸序列。

在优选实施例中，所述miRNA种类在承受于缺血和再灌注的对照心脏组织样品中是

-相对于非缺血对照样品显著上调，

-相对于非缺血对照样品显著下调，

-相对于非缺血对照样品既不显著上调也不显著下调。

本发明还涉及用于预防或治疗在易感染于缺血或缺血发作的患者体内(优选地在所述患者的心脏组织中)缺血和/或再灌注损伤影响的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物选自由以下任一miRNA种类的miRNA激动剂组成的组：miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-451、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a；以及以下任一miRNA种类的miRNA拮抗剂：miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-106b，和包括等同于或互补于所述miRNA种类的种源区的核苷酸序列的miRNA激动剂或拮抗剂，和/或所述miRNA激动剂或拮抗剂包含17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA的序列、或等同于所述成熟miRNA的互补序列，或分别与所述成熟miRNA种类的序列或所述成熟miRNA种类的互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同和它们的任一组合。

在本发明中，用于表达水平评估的样品优选地在缺血后最多1h、1.5h、2h、2.5h或3h之后被收集。优选地，在缺血后的最多1h、1.5h、2h、2.5h或3h后进行再灌注。优选地，在缺血后最少0.5h或1h或1.5h进行再灌注。

在优选实施例中，本发明还涉及至少两个根据权利要求1至10任一所述的miRNA化合物的组合，其中，优选地所述组合包括至少miRNA拮抗剂和miRNA激动剂，

所述激动剂和拮抗剂包括等同于或互补于所述miRNA种类的种源区的核苷酸序列，和/或所述激动剂和拮抗剂包括17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA种类的序列或等同于所述成熟miRNA种类的互补序列、或与所述所述成熟miRNA种类或所述互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同，其中，所述miRNA化合物在心肌细胞的存活性测试中显示了细胞保护作用。

优选地，所述miRNA种类的miRNA激动剂选自miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b的组，并且所述miRNA种类的miRNA拮抗剂选自miR-494和miR-487b的组。

在优选实施例中，所述miRNA化合物用于在易感染于缺血的患者体内细胞保护受缺血损伤的组织，所述miRNA化合物在手术之前或期间或与缺血风险相关的介入期间给药所述患者，其中

该miRNA化合物是

-预缺血性细胞保护性miRNA种类的miRNA激动剂，或

-预缺血性细胞病变miRNA种类的miRNA拮抗剂，优选为预缺血性细胞毒性miRNA种类。

例如由于手术或治疗介入或由于患者疾病的缺血可能会损伤细胞、组织或器官。所述手术或治疗介入优选是所述缺血情况可被提前预测的一种，例如在其血管中，例如动脉或动脉线是或可能是被堵塞或血液流动减缓或存在闭塞风险或突然灌注不足的风险。

所述手术或介入可能是紧急介入或选择性介入、心脏手术，例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或血管成形术、支架安置、去除不良运作的血管，例如静脉曲张、肺部手术、心脏移植、肺移植、肾移植、肝移植、皮肤移植、肌肉移植等，脑或神经系统手术，从心脏、大脑、肺、肾、肝、肠、末梢血管疾病中的肿瘤的移除。优选地，通常应用所述miRNA化合物用于预防的目的。

优选地，所述miRNA化合物用于易感染于缺血的患者，其中所述患者处于缺血的持续风险中，且所述miRNA化合物在给定的时间周期内定期给药于患者，优选至少一周，更优选为至少两周、三周、一个月、两个月或更长，用于细胞保护受缺血损伤的组织。

在本发明的任何实施例中，优选地，所述易感染于缺血的患者为易感染于急性缺血和/或急性再灌注损伤的患者。优选地，该患者是患有心血管疾病或缺血性心脏疾病的高风险或至少中等风险的患者，优选为急性缺血和/或急性再灌注损伤，或优选为缺血性心脏发作。优选地，该患者在随后的15、12、10、8、5、3或1年中处于这些疾病的一个或多个的死亡的风险中。

优选地，所述miRNA化合物在手术或介入前少于一周、少于一天或少于12、8、6、5、4、3、2或1小时内给药。

在另一优选实施例中，所述miRNA化合物用于细胞保护患有急性缺血性损伤和/或急性再灌注损伤的患者和/或接受再灌注治疗的患者的组织，并给药于

-缺血发作与再灌注之间，或就在再灌注之前，

-在缺血发作之后，优选地在缺血发作之后的三天、一天或半天之内，更优选6、5、4、3、2或1.5小时之内，更优选在60、50、40或30分钟之内，

-在再灌注期间，或

-在再灌注之后，优选在再灌注之后的三天、60小时、2天、1天、24小时或12小时之内，更优选在6、5、4、3、2或1.5小时之内，更优选在60、50、40、30、20或10分钟之内，或在再灌注的同时，其中

该miRNA化合物是

-后缺血性细胞保护性miRNA种类的miRNA激动剂，或

-后缺血性细胞病变miRNA种类的miRNA拮抗剂，优选为后缺血性细胞毒性miRNA种类。

在优选实施例中

-所述miRNA化合物包含至少16、17、18或19个核苷酸单元，优选地约18至约25个具有或对应于所述miRNA种类的序列、或不同于其中1，2或3个核苷酸单元的序列的核苷酸单元，或

-所述miRNA化合物是miRNA种类的互补序列、抑制剂或拮抗剂，所述miRNA化合物包含至少或至少14、15、16、17、18或19个核苷酸单元，或约18至约25个核苷酸单元，具有或对应于所述miRNA种类的序列或至少它们的种源区的互补序列，或不同于其中1、2或3个核苷酸单元的序列，或所述miRNA化合物包含至少7、8、9个核苷酸单元，具有或对应于至少是所述miRNA种类的种源区序列的互补序列。

优选地，所述miRNA激动剂是所述miRNA种类的miRNA模拟物。

优选地，所述miRNA拮抗剂是miRNA抑制剂，优选为miRNA种类的反义寡核苷酸(antagomir)。

在优选的实施例中，通过RNA阵列或miRNA阵列或“芯片(chip)”技术或通过定量RT-PCR技术评估miRNA种类的表达水平。

本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物用于在治疗时，在易感染于缺血或缺血发作的患者体内、在易感染于急性缺血或急性缺血发作的患者的心脏中，保护细胞、组织和/或器官免于急性缺血和再灌注损伤影响，所述组合物包括一个或多个如权利要求1至13任一项所限定的miRNA化合物及药学上可接受的赋形剂，其中优选地

所述组合物包括选自下列的一种或多种miRNA化合物

-一种或多种预缺血性细胞保护性miRNA种类的一种或多种miRNA激动剂，

-一种或多种预缺血性细胞病变miRNA种类的一种或多种miRNA拮抗剂，

-一种或多种后缺血性细胞保护性miRNA种类的一种或多种miRNA激动剂，和/或

-一种或多种后缺血性细胞病变miRNA种类的一种或多种miRNA的拮抗剂。

优选地，所述药物组合物用于在治疗中保护易感染于缺血或缺血发作的患者、易感染于急性缺血或急性缺血发作的患者的心脏中的细胞、组织和/或器官免于急性缺血和再灌注损伤的短期影响和/或直接影响，

所述组合物包括一种或多种如本文所限定的miRNA化合物及药学上可接受的赋形剂。

根据本发明，优选地，

所述miRNA激动剂是所述miRNA种类的激动剂，该miRNA种类同时为预缺血性细胞保护性miRNA种类和后缺血性细胞保护性miRNA种类，和/或

所述miRNA拮抗剂是所述miRNA种类的拮抗剂，该miRNA种类同时为预缺血性细胞病变miRNA种类和后缺血性细胞病变miRNA种类，

所述miRNA激动剂或拮抗剂对于保护所述患者体内的细胞和/或组织免于急性缺血性损伤并对抗缺血的再次发作均是有用的。

根据本发明，所述缺血-再灌注损伤包括心血管缺血-再灌注损伤。

根据本发明，例如在本发明的药物组合物或治疗方法中，将至少一种miRNA激动剂和至少一种miRNA拮抗剂一起应用。

在另一优选的实施例中，将一种或多种miRNA化合物与一种或多种另一化合物共同给药用于保护或治疗如本文所公开的疾病。优选地，所述一种或多种另一化合物选自用于缺血性心脏疾病的化合物(有机硝酸酯、β-受体阻断剂、钙拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、代谢调节剂如曲美他嗪)、血管扩张剂、纤维蛋白溶解剂、抗血小板剂、抗炎剂、降低心脏速率的药物如伊伐布雷定(ivabradin)、以及用于缓解缺血性心脏疾病的风险因素的化合物(抗高血脂药物如他汀类药物、抗糖尿病化合物、抗高血压药、抗肥胖药等等)。

可依次或同时应用或给药多种化合物。

在优选的实施例中，所述药物组合物包括多种化合物。在另一实施例中，本发明涉及包括多种化合物的药物试剂盒。

本发明还涉及用于识别微小RNA(miRNA)种作为靶向目标用于治疗的方法，以保护易感染于缺血或缺血发作的患者内的细胞或组织免于急性缺血性损伤的影响，

i)提供一组包括表达的miRNA种类的生物样品，所述样品组包括

对照样品，

第一样品，和

第二样品，和/或

第三样品

其中，所述样品能够经受缺血，

ⅱ)使每个样品承受需氧灌注一段时间，并在这段时间内

使对照样品既不承受缺血也不承受预处理或后处理，从而获得非缺血对照样品，和

使第一样品承受缺血，从而获得缺血样品，和

通过使第三样品承受缺血并随后承受后处理治疗方案来后处理第三样品，从而获得后处理的样品

iii)评价miRNA种类的表达水平

-在非缺血对照样品中，

-相对于该非缺血对照样品，在缺血样品中，和

-相对于该非缺血对照样品，在在预处理的样品中，和/或

-相对于该非缺血对照样品，在后处理的样品中，和

iv)计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于该缺血样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于该缺血样品，在后处理的样品中

v)相对于缺血样品，在预处理样品和/或后处理的样品中，识别miRNA种类的表达水平被上调至少1.3倍，优选至少1.5倍或下调至少1.3倍，优选至少1.5倍。

优选地，如上述所定义的术语miRNA种类取决于它们在样品中的上调或下调。

在本发明步骤的优选方法中，所述表达水平的计算比率通过以下步骤获得：

a)评价miRNA种类的表达水平

-在非缺血对照样品中，

-在缺血/再灌注样品中，和

-在预处理的样品中，和

-在后处理的样品中

b)计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于非缺血对照样品，在缺血/再灌注样品中

-相对于非缺血对照样品，在预处理的样品中

-相对于非缺血对照样品，在后处理的样品中

-相对于缺血/再灌注样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于缺血/再灌注样品，在后处理的样品中。

根据本发明，本文中还提供了一种用于治疗缺血-再灌注损伤(包括血管疾病和缺血性心脏疾病)的方法，该方法包括给药于需要根据本发明的miRNA化合物治疗的受试者。

本发明进一步涉及用于治疗易感染于缺血或缺血发作的患者以保护所述患者体内的细胞或组织免于缺血性损伤和/或再灌注损伤影响的方法，所述方法包括给药所述患者根据本发明的miRNA化合物。

优选地，所述缺血性损伤为急性缺血性损伤，所述再灌注损伤为急性再灌注损伤。

在优选的实施例中，所述miRNA化合物在与缺血风险相关的手术或介入之前或期间给药于所述患者，用于细胞保护受缺血损伤的组织，其中

所述miRNA化合物是

如本文所限定的预缺血性细胞保护性miRNA种类的miRNA激动剂，或

如本文所限定的预缺血性细胞病变miRNA种类的miRNA拮抗剂。

优选地，所述miRNA化合物在手术或介入之前少于一周、少于一天或少于12、8、6、5、4、3、2或1小时前给药。

在另一优选的实施例中，所述miRNA化合物给药于患有急性缺血性损伤和/或急性再灌注损伤或接受再灌注治疗的患者，

-在缺血发作与再灌注之间，或就在再灌注之前

-在再灌注期间，或

-在再灌注之后，优选地在再灌注后的一天之内，更优选地在5、4、3、2或1.5小时之内，更优选地在60、50、40或30分钟之内，其中

所述miRNA化合物是

如本文所限定的后缺血性细胞保护性miRNA种类的miRNA激动剂，或

如本文所限定的后缺血性细胞毒性miRNA种类的miRNA拮抗剂。

除非特别注明，否则在本发明中，本发明所公开的一个或多个实施例、或关于本发明的给定方面或实施例所描述的特征可以与本文所公开的任何其他方面或实施例结合，条件是对于本领域技术人员而言在技术上是合理的，并且根据本发明对现有技术做出贡献。

免责声明

可选地，本发明没有涉及一种或多种下述的miRNA种类和/或相应的miRNA化合物，或它们的用途，或所述miRNA种类和/或未被考虑的化合物：

i)在一个或多个实施例中，可选地：miR-134、miR-212、miR-214、miR-21、miR-129、miR-182和miR-290或它们的激动剂，

ii)在一个或多个实施例中，可选地：miR-192、miR-30c、miR-494、miR-497或激动剂或它们的拮抗剂，

iii)在一个或多个实施例中，可选地：miR-15家族的拮抗剂或抑制剂(miR-15a、mir-15b、miR-16、miR-195、miR-424和miR-497)

iv)在一个或多个实施例中，可选地：let-7家族成员、miR-15b、miR-21、miR-199a、miR-199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、miR-146a、miR-146b、miR-221、miR-222、miR-30家族成员、miR-497、miR-20a的拮抗剂，和/或miR-20b、miR-93、miR-101、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150及miR-29a-c的激动剂,

v)在一个或多个实施例中，可选地：miR-208a或miR-208b的拮抗剂或抑制剂，或miR-499的抑制剂，或它们的组合，

vi)在一个或多个实施例中，可选地：miR-24和/或miR-328的拮抗剂或抑制剂，

vii)在一个或多个实施例中，可选地：miR-15家族(例如miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、miR-424和miR-497)，miR-30家族(miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e)，miR-92a，miR-320，miR-20，miR-199a，miR-499a的拮抗剂，和/或miR-126、miR-143、miR-210和miR-29a-c的激动剂，

viii)在一个或多个实施例中，可选地：WO2010103015A1所公开的一种或多种miRNA寡核苷酸。

ix)在一个或多个实施例中，可选地：miR-1和/或miR-133和/或miR-320的激动剂。

可选地，本发明不涉及现有技术所公开的以及通过本发明的方法可获得的一种或多种miRNA种类和/或相应的miRNA化合物，或它们的用途，其中与所述miRNA种类或化合物相关的本发明的方法未被现有技术所公开。

可选地，本发明不涉及一种或多种用于在任一如本文所公开的任一治疗中所使用的上述miRNA种类和/或miRNA化合物。

定义

“miRNA(微小RNA)种”是天然存在的核糖核酸(RNA)分子，该分子是一种小的，约18至约25个核苷酸长的非编码RNA分子，是基因表达的内源性生理调节剂。[Bartel DP2004]。MiRNA在通过翻译/转录(“RNA干扰”)的抑制或激活的基因表达的转录后调控中起到至关重要的作用。

“miRNA化合物”是合成的或人工的核酸化合物，所述核酸化合物是miRNA种类的激动剂或拮抗剂。

“核酸化合物”是包含核酸的有机分子，所述核酸由具有特定序列的核苷酸单元构成，所述特定序列可通过化学或生化方法测定，并且可选地包含一个或多个另一基团，如用于改善生物功能、稳定性、靶向性、报告性或检测性的基团。

miRNA种类的“miRNA激动剂”是核酸化合物，其一旦引入生物材料(如细胞或组织)中，由于它的核苷酸序列会产生相同类型的生物作用或相同模式的作用，例如诱导调节同一生物材料中的相同基因或相应的miRNA种类的基因。

“miRNA模拟物”是为人工的(人造的)双链RNA或RNA衍生物的miRNA激动剂，所述双链RNA或RNA衍生物在转染进入细胞后模拟成熟的内源性miRNA。所述miRNA模拟物可以是化学合成的或重组产生的并由前体处理得到。可选地，miRNA模拟物可以包括一个或多个修饰的或人工的碱基、糖单元或核苷酸连接键。

miRNA种类的“miRNA拮抗剂”广义上是能够减缓、抑制或阻断miRNA调控作用的任何化合物。优选地，是核酸化合物，其一旦引入生物材料(如细胞或组织)中，由于它的核苷酸序列会拮抗在同一生物材料中相应的miRNA种类的作用，例如抑制或沉默所述miRNA种类有关一个或多个基因的调控。

“miRNA抑制剂”是减缓miRNA表达水平(下调)与或抑制其结合它的靶序列或RISC复合物的任何核酸。

优选的miRNA抑制剂是“反义寡核苷酸”，即有用于沉默的内源性微小RNA的化学合成的寡核苷酸。优选地，反义寡核苷酸具有序列，该序列为miRNA序列、或它的部分序列、或它的变体反义的序列，该变体与miRNA有1、2或3个核苷酸不同。

在优选的实施例中，所述miRNA化合物具有核酸部分，所述核酸部分包含等同于或互补于相应的miRNA种类的种源区的核酸序列。

在优选的实施例中，miRNA化合物是核酸化合物，所述核酸化合物包括17到27个核苷酸长度，优选为18至24个，或19至24个，或19至23个核苷酸长度的核酸片段，(“核心序列”)的序列等同于或互补于成熟miRNA种类的序列，或分别与所述成熟miRNA种类的序列或所述成熟miRNA种类的互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同，但保持所述激动或拮抗作用。miRNA化合物还可以包含修饰的碱基(在这种情况下，序列中修饰的碱基被认为是所修饰的起始碱基)，或者人工碱基；如果四个天然RNA碱基明显不对应于人工碱基，那么该人工碱基被考虑为序列中的差异或突变。miRNA化合物还可以包括任何修饰的一个或多个核苷酸连接键。这种修饰的连接键是本领域所公知和合适的，例如用于稳定寡核苷酸。此外，所述miRNA化合物可包括在核心序列侧翼的侧翼区域。

“缺血”是限制，即供应绝对不足或相对不足的血液到组织或组织细胞或有综合损害的整个器官或功能紊乱的组织，由此导致输送到组织的氧气减少(缺氧)。供血不足导致组织缺氧(在根本没有氧气供应情况下的缺氧)，由此导致所有决定细胞死亡的坏死、凋亡和自噬。

如果缺血是由于缺血发作，优选由于例如栓塞、血栓形成、血栓(血凝块)导致的突然供血不足，例如通过手术、在流通或血管损伤中出现异物导致的突然血管障碍，那么缺血是“急性缺血”。“急性缺血”需在症状开始的3天或2天之内治疗，优选地在24或12小时之内，更优选在6、5、4、3、2或1.5小时之内治疗。急性缺血的短期后果是直接地细胞死亡。在心肌缺血细胞死亡导致心脏泵血衰竭的情况下会引起其它器官(脑、肾、肠等)的低血压/低灌注，这被称为心源性休克。细胞死亡也导致心肌细胞的电活动改变，往往导致危及生命的心律失常(心动过速、房颤、束支传导阻滞)，导致心源性猝死。乳头肌的死亡通常导致心脏瓣膜功能障碍，从而导致血液回流和泵血功能无效。心肌细胞的死亡可能导致动脉瘤的形成和心肌壁的破裂。

脑部的急性缺血是“中风”。

在“慢性缺血”中，由于例如动脉粥样硬化(脂质斑块阻塞动脉管腔)、低血压(如败血症或心脏衰竭)等，血液供应不足正逐步发展和局部发展。

缺血可以是心脏缺血，例如心肌缺血。

在“短暂性脑缺血发作”(TIA)中，缺血症状在几分钟内消失。TIA通常是由血块阻塞通向给定组织(例如脑、心脏、肝脏或肾脏)的血管中的一个引起的。

“易感染于缺血患者”是倾向于缺血发作、易受缺血发作影响、通过缺血发作有生命危险的患者，例如该患者

-经历过缺血发作[例如患者处于术后心肌梗塞(PMI)的风险中]，

-显示出任一的代谢综合症、糖尿病、肥胖、高血压、动脉粥样硬化、低密度脂蛋白胆固醇水平高、升高的血清高半胱氨酸、增加的血小板功能或恶化的血小板功能、吸烟、日常身体锻炼尤其是有氧运动水平低的遗传或代谢风险因素，或多种风险因素，

-是或将要经受的治疗介入而增加的缺血风险，例如介入导致的缺氧状态，如手术介入，尤其是涉及心血管系统的手术等。例如，所述介入可以是选择性心脏介入，如选择性PCI、心脏手术、冠状动脉旁路移植手术(CABG)或(早期)外科血管再生如在急性心肌梗塞(AMI)之后。

“再灌注”是血液供应到组织中的修复，该组织由于正常血液供应减少而缺血。该减少可能由于包括动脉粥样硬化阻塞、动脉狭窄或外科夹紧的任何来源。再灌注可自发地发生，或者可受部分治疗的影响。它通过促进局部缺血组织恢复以用于治疗心肌梗塞或其它局部缺血的主要步骤，从而进一步限制坏死和因此的梗塞尺寸。然而，再灌注本身可进一步损伤缺血性组织，引起再灌注损伤。

“缺血和再灌注损伤”或“再灌注损伤”或“缺血-再灌注损伤”(I/R损伤)在这里被理解为任何功能、代谢和/或结构的变化，包括受再灌注、或缺血和再灌注共同影响的缺血组织到受缺血影响的组织的任何区域中的坏死、凋亡和自噬。

“急性缺血-再灌注损伤”或“急性再灌注损伤”是指缺血性再灌注损伤，即任何后果，优选地再灌注或缺血和再灌注共同的短期后果和/或直接后果。从某种意义上说急性再灌注损伤是细胞死亡出现的后果，至少在很大程度上通过坏死和/或凋亡的机制和/或通过自噬。从某种意义上说急性再灌注损伤对抗炎治疗不敏感。在某种意义上的任何后果，可选地细胞死亡出现在再灌注期间或不久之后或立即出现，优选地在再灌注之后一天之内，更优选在5、4、3、2或1.5小时之内，更优选在60、50、40或30分钟之内。

在急性缺血再灌注损伤之后出现的大多数后果和损伤是由在再灌注期间、血液流动至受影响的器官的修复中的急性抗炎反应引起的。

“急性心肌梗塞”(AMI)是在心脏区域的循环受阻并由于坏死、凋亡或细胞自噬的心肌细胞死亡出现的期间出现的心肌梗塞。AMI需要在症状发作的3或2天之内，优选在12小时或6小时之内，更优选在5、4、3、2或1.5小时之内治疗。AMI的特点是急性缺血和急性再灌注损伤。

“缺血性心脏疾病”(IHD)或心肌缺血是一种以心肌缺血为特点的疾病。IHD包括引起心肌组织死亡从而急性心脏衰竭和心律失常的急性心肌梗塞、以及引起心脏组织重塑和心脏衰竭的慢性心肌梗塞。

“缺血预处理”是使缺血性损伤的组织(例如：心肌，肾脏或神经组织)承受简短的、重复周期的缺氧，优选缺血(例如，通过血管闭塞)。在实施例中，缺血预处理包括通过具有产生与组织中所述缺氧的重复周期相同效果的外部效应来使组织承受；这可例如用药学、物理和化学试剂模拟预处理效果处理得以实现。预处理具有心脏保护作用，使该组织免于缺血或再灌注损伤的有害影响，并减小了缺血后的心肌梗塞尺寸、功能障碍和心律失常。

“预处理治疗方案”是一系列若干给定的缺氧周期，优选为正常供氧的给定的时间周期，例如在它们之间再灌注。例如，预承受的时间周期可能是例如1-10分钟，2至8、7或6分钟，更优选约3至6或5分钟，组织承受缺血和再灌注的时间可能有所不同。

“缺血后处理”是使受缺血性损伤的组织(例如：心肌、肾脏或神经组织)承受简短的、重复周期的缺氧，优选缺血之后的短暂缺血(例如，通过血管闭塞)。在实施例中，缺血预处理包括通过具有产生与组织中所述缺氧的重复周期相同效果的外部效应使体内的相同组织或任何远端组织承受；这可例如用药学、物理和化学试剂模拟预处理效果的处理得以实现。后处理具有心肌保护作用，使该组织免于缺血或再灌注损伤的有害影响，并减小了缺血后的心肌梗塞尺寸、功能障碍和心律失常。

“后处理治疗方案”是一系列若干给定的缺氧周期，优选为正常供氧的给定的时间周期，例如在缺血发作之后在它们之间再灌注。例如，预承受的时间周期可以是例如半分钟到10分钟，更优选约1-2分钟，组织承受缺血和再灌注的时间可从1到10不等，或优选从1到6。

“细胞病变”作用在这里被理解为有关、涉及或特征为至少在细胞水平上可检测到或检测不到的任何不利变化或影响的作用。细胞病变作用可以是细胞内或细胞外作用的结果，例如通过细胞病变剂或缺氧、缺血例如急性心肌梗塞或中风、或缺血再灌注损伤例如急性缺血再灌注损伤接触细胞，

“细胞毒性”作用在这里被理解为有关、涉及或特征为在细胞水平可检测到的损害、退行性或病理改变，或具有细胞水平影响的疾病或紊乱的效果的作用。

“细胞保护”作用在这里被理解为miRNA种类或miRNA化合物的作用，其减少或抑制由外部或内部例如生物作用引起的细胞损伤，例如细胞毒性作用。

“生物样品”在这里被理解为任何生物材料，其包括由于外部作用miRNA可被上调或下调的生物材料，并且所述生物样品可被用于实验(即用于选自测试缺血再灌注、缺氧、预处理、后处理任一条件的测试中)。

生物样品可以是细胞、细胞群组或集合、细胞培养、组织样品、器官或模型动物体。

“组织样品”是生物样品，其为组织培养、活体取样的样品、或分离的器官。在本发明的优选实施例中使用分离的器官。

对哺乳动物“给药”有效量的miRNA化合物在这里被理解为包括任何方式的给药化合物，虽然不是miRNA化合物本身被引入所述哺乳动物中，但该方式导致所述哺乳动物中所述miRNA化合物的存在。特别是，该术语涵盖前体miRNA的给药，或从其释放出所述miRNA化合物的组合物的给药，或载体的给药，例如导致在所述miRNA的存在下在一定水平提供有效量的表达载体。给药途径包括口服、静脉内、皮内、皮下、肌内、局部、吸入。

“经皮冠状动脉介入”(PCI)，也被称为血管成形术，涉及将气球型器件插入到患者动脉内以扩宽和打开阻塞动脉。

附图简要说明

图1实验治疗方案

从雄性维斯塔(Wistar)鼠中分离得到的心脏经受时间匹配的需氧灌注(即，非缺血对照，C)，或30分钟的局部缺血和120分钟再灌注(IR)或用3×5分钟缺血-再灌注预处理后进行30min的局部缺血和120分钟的再灌注(PRE)，或进行后处理(POST)治疗方案(在30分钟的局部缺血之后立即施加6×10秒的总体缺血-再灌注、并随后进行120分钟再灌注)。在规定的时间点测量冠脉血流量以便核实冠状动脉闭塞的成功。在局部缺血后的再灌注之后的最初5分钟立即收集冠状动脉流出物用于LDH释放检测。梗塞尺寸在再灌注的第120分钟进行测量。对于独立实验中分离出来的miRNA，左心室在灌注治疗方案结束后冷冻于液氮中。

图2与缺血-再灌注损伤相关联的心脏MiRNA

该图显示出相对于非缺血对照，miRNA显著地被缺血-再灌注改变，但是由于缺血-再灌注，预处理和后处理并没有显著地影响它们的改变。这些结果表明，这些miRNA可能不受心肌保护机制的影响。条形显示出在缺血-再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)、或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血-再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中的miRNA表达的改变。值为倍性表达变化±标准偏差。*表示p<0.05和≥±1.5的倍性变化。

图3涉及在缺血-再灌注损伤的反向调控的基础上通过预处理(板块A)或后处理(板块B和C)进行心脏保护的MiRNA

该图显示出相对于非缺血对照，miRNA显著地被缺血-再灌注改变，然而由于缺血-再灌注，预处理(A)或后处理(B和C)显著地逆转了它们的表达变化。这显示出这些miRNA通过预处理和后处理经由缺血-再灌注的有害机制的逆转参与了心肌保护，尽管所述miRNA自身可能具有心脏保护(miR-33、miR-320)作用或心脏毒性(miR-497、miR-19a、miR-19b、miR-208和miR-106)作用。

条形显示出在缺血-再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中的miRNA表达的改变。值为倍性表达变化±标准偏差。*表示p<0.05和≥±1.5的倍性变化。

图4涉及在缺血-再灌注损伤的反向调控的基础上(板块A和B)或在正常心肌保护诱导机制的基础上(板块C)通过预处理和后处理两者进行心肌保护的MiRNA

该图显示出相对于非缺血对照，miRNA显著地被缺血-再灌注改变(板块A和B)，然而由于缺血-再灌注，预处理和后处理均显著地逆转了它们的表达变化。这表明这些miRNA通过预处理和后处理可能地(特别是在板块A和B中示出的miRNA的情况下)经由缺血-再灌注的有害机制的逆转参与了心肌保护。假设相对于非缺血对照，板块C中miRNA的上调或下调不显著，但在预处理和后处理中分别有显著的下调(miR-352、miR-93)或上调(miR-532-3P)出现表明该机制可能是相同的。条形显示出在缺血再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血-再灌注(POST/IR，灰色阴影条)的miRNA表达的改变。值为倍性表达变化±标准偏差。*表示p<0.05和≥±1.5的倍性变化。

图5在预处理诱导机制的基础上涉及心肌保护的MiRNA

该图显示出相对于缺血-再灌注和非缺血对照，miRNA显著地受预处理诱导，这表明这些miRNA受到预处理的特异性诱导，并在心肌保护适应中起作用(可以称之为保护性mir(Protectomir))。因此，这些miRNA通过在预处理中被激活的机制具有心肌保护作用。条形显示出在缺血再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中的miRNA表达的改变。值为倍性表达变化±标准偏差。*表示p<0.05和≥±1.5的倍性变化。

图6在后处理诱导机制的基础上涉及心肌保护的MiRNA

该图显示出相对于缺血-再灌注，miRNA显著地被后处理改变，表明这些miRNA被后处理特异性改变。这些miRNA必定是下调的以便后处理诱导的心肌保护可以发生，因此所述微小RNA自身可以称为毒性mir(Pathomirs)。条形显示出在缺血-再灌注中对比于非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血-再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中的miRNA表达的改变。值为倍性表达变化±标准偏差。*表示p<0.05和≥±1.5的倍性变化。因此，心肌保护通过抑制剂对抗这些miRNA是可行的。

图7与缺血-再灌注损伤相关联的心肌MiRNA

该图显示出相对于非缺血对照，miRNA显著地被缺血-再灌注改变，但由于缺血-再灌注，预处理和后处理均没有显著地影响它们的改变。这些结果表明这些miRNA可能不受心肌保护机制的影响。条形显示出在缺血-再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血-再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中miRNA表达的改变。值为倍性表达变化的log2值±标准偏差。*表示p<0.05和<-0.585或＞0.585的log2值的倍性变化。

图8涉及通过预处理诱导机制和后处理诱导机制两者进行心肌保护的MiRNA

板块A示出相对于非缺血对照，miRNA-188表达在预处理和后处理中显著地增加，如果相对于缺血-再灌注中的变化，这一改变保持不变。

板块B示出相对于非缺血对照，miRNA(miR-125b*、miR-139-3p、miR-320和miR-532-3p)显著地被缺血-再灌注改变，然而，由于缺血-再灌注，预处理和后处理均显著地逆转了它们的表达变化。

这些结果表明这些miRNA在预处理和后处理中均参与心肌保护。在板块B示出的miRNA的情况中，心肌保护经由缺血-再灌注的有害机制的逆转发生。反之，在板块A示出的miRNA-188的情况中，该miRNA的诱导导致心肌保护。

条形显示出在缺血-再灌注对比非缺血对照(IR/C,黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血-再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中的miRNA表达的变化。值为倍性表达变化的log2值±标准偏差。*表示p<0.05和<-0.585或＞0.585的log2值的倍性变化。

图9在预处理诱导机制的基础上涉及心肌保护的MiRNA

该图显示出相对于缺血-再灌注和非缺血对照，miRNA显著地被预处理改变，表明这些miRNA被预处理特异性诱导，并在心肌保护适应中具有一定作用(可以被称为保护性mir)。因此，这些miRNA通过在预处理中被激活的机制具有心肌保护作用。板块A示出了相对于对照，miRNA表达在缺血再灌注中没有显著地改变，然而，通常相对于对照和缺血样品，预处理显著提高了它们的水平。板块B示出了miRNA-487b在缺血再灌注中经历了显著提高的水平，然而，在预处理中它的表达被逆转表明它的细胞毒性特征。

条形显示出在缺血-再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血-再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中的miRNA表达的改变。值为倍性表达变化的log2值±标准偏差。*表示p<0.05和<-0.585或＞0.585的log2值的倍性变化。

图10在后处理诱导机制的基础上涉及心肌保护的MiRNA(板块A和B)

该图显示出相对于缺血-再灌注，miRNA显著地被后处理改变，表明这些miRNA被后处理特异性改变。某些miRNA，如miR-208、miR-19b和miR-19a必定是下调的以便后处理诱导的心肌保护可以发生，因此所述微小RNA自身可被称为毒性mir，即细胞毒性miRNA(它们在缺血/再灌注中也是显著上调的)。因此，心肌保护经由抑制剂对抗这些miRNA是可行的。

Let-7e、let-7i、miR-1、let-7b、miR-181a、miR-328、miR-33、miR-503都是“保护性mir”，因为由于缺血后处理，它们都是显著上调的。

条形显示出在缺血-再灌注对比非缺血对照(IR/C，黑色条)、预处理对比非缺血对照(PRE/C，白色条)、后处理对比非缺血对照(POST/C，灰色条)或预处理对比缺血-再灌注(PRE/IR，白色阴影条)、后处理对比缺血再灌注(POST/IR，灰色阴影条)中miRNA表达的改变。值为倍性表达变化的log2值±标准偏差。*表示p<0.05和<-0.585或＞0.585的log2值的倍性变化。

图11该图显示出细胞保护通过随机选择的细胞存活性检测中随机选择的心肌保护的微小RNA和/或细胞毒性的微小RNA的抑制剂(见表3b)的组合对抗模拟的缺血。所采用的组合对抵抗模拟的缺血/再灌注损伤都是有效的。

本发明的详细说明具体实施例

最近，心脏已经被证明具有非凡的适应缺血-再灌注压力的能力，并且在缺血再灌注中，心脏的这种分子可塑性已成为激烈研究的焦点，以期望潜在的机制可被应用于治疗性开发中。缺血预处理是良好描述的适应性响应，其中，短暂地承受缺血显著地提高了心脏承受随后的缺血性损伤的能力。此外，在长期缺血之后应用短期的缺血-再灌注还赋予心脏保护作用免于心肌缺血-再灌注的影响，这种现象称为缺血后处理。

内源性抗缺血、心肌保护机制的这两种主要形式的发现已促进了保护缺血和/或再灌注的心肌的新方式的开发，并且详述了在缺血和/或随后的再灌注期间，我们对损伤和存活的分子基础的理解[FerdinandyP等，2007]。值得注意的是，预处理和后处理两者均可在一些可逆的压力刺激下被诱导，例如缺氧、特定药品模拟预处理或者后处理的保护作用，也可通过远端调节被诱导，也就是除了靶向器官的压力刺激[Ferdinandy P等，2007]。

心肌保护介入、模拟这些先天适应性保护机制，特别是缺血后处理已作为人体内用于限制心肌损伤的理论上可能的、临床上适用的方法出现[Qvize M等，2010]。然而，尽管近十年来的激烈研究，由于细胞性活动、其他复发病变的介入及缺血性心脏疾病的风险等因素的复杂性，在预处理和后处理的心肌保护作用下潜在的确切的生物机制依旧不明确[Ferdinandy P等，2007]。因此，生物方法的体系的用途似乎有必要揭露复杂的分子活动。

缺血和因此的急性缺血和/或再灌注损伤不限于心脏，类似的适应性机制和保护性机制应当在肾、肝及其他器官的中风、缺血中起作用。

然而，如何在预防或治疗缺血-再灌注损伤中使用或模拟这些内源性机制作为明确地外科介入用于在多数情况下不被期望的目的和对于处于临界状态的患者可能存在其他风险的目的并不明显。通过外科介入给药具有同样效果的特定治疗性剂代替预处理或后处理将是所期望的，然而，不仅这类化合物，就连潜在的调控机制在很大程度上都是未知的。

在本文所公开的一系列说明本发明的研究中，本发明的发明人旨在识别有关缺血和/或再灌注损伤、以及有关使用miRNA表达模型的系统性对比进行预处理或后处理的miRNA。

在现有技术中，虽然研究了缺血中的miRNA调控，但通常将表达水平与非缺血对照相对比。

作为一种新方法，本发明人在检测缺血(和再灌注)样品及经受组织或细胞保护性处理(预处理和/或后处理)的样品中使用miRNA表达模式，并通过将这些表达模式不仅与非缺血对照相比较、而且与缺血-再灌注处理下预处理和/或后处理的样品中的表达水平相比较的方式获得数据。

在它们的实验设计中，为了研究不同样品中的表达模式，本发明的发明人使用了miRNA微阵列和RT-PCR，以便通过后者的方法可以计算微阵列数据。在图中示出了相关的微阵列数据，并在下列实施例的表格中示出了RT-PCR数据。本领域的技术人员可以理解的是，由于本领域的新的miRNA被连续地识别，通过在较大的miRNA组上不断地重复发明人的实验或使用相同的原则，调控类似于本发明的发明人发现的那些miRNA的进一步的miRNA种类随后将被发现。

对于miRNA有标准的命名体系[Griffiths-Jones S，2006]，其也被用于本说明书中。基于miRNA的这些所命名的序列与其它数据一起可在miRBase数据库(早期Sanger数据库)中被明确地找到。在它们的发现公开之前，由实验证实的miRNA被给予命名。命名包括前缀“mir”或“miR”，其中“mir”是指未成熟的miRNA前体，而大写的“miR”是指成熟的形态。命名中的数字通常表明命名的顺序，即通常为发现的顺序。仅相差一个或两个核苷酸的相关miRNA序列用附加的小写字母进行诠释。例如，miR-19a与miR-19b密切相关。产生100％相同的成熟miRNA但位于基因组中不同部位的miRNA前体用附加的短线-数字后缀进行说明。例如，miRNA前体hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2产生相同的成熟miRNA(hsa-miR-194)但位于基因组的不同区域。原始种用三个字母前缀指定，例如，hasa代表人类(智人)，rno代表大白鼠。当两个成熟的miRNA来源于同一miRNA前体的异侧臂(oppositearms)时，它们将用-3p或-5p后缀被指示。当相关表达水平是已知时，命名后的星号表明相对于发夹弯(hairpin)异侧臂的miRNA，miRNA为低水平表达。例如，miR-123和miR-123*将共享miRNA前体发夹弯，但更多的miR-123将在细胞中被发现。

相当出人意料地，本发明的发明人已意识到承受缺血和随后的再灌注、前处理和随后的缺血-再灌注以及缺血-再灌注和随后的后处理治疗方案的样品中的所述miRNA表达模式的适当比较会导致在这些情况中不同调控的miRNA种类的识别，并对于制备所述miRNA种类的激动剂或拮抗剂的心肌保护的miRNA化合物是有用的，所述miRNA种类的激动剂或拮抗剂在易感染于心脏缺血或心脏缺血发作如急性心肌梗塞的患者的治疗中是有用的，其中，细胞、组织和/或器官被保护以对抗所述患者的心脏中的急性缺血和再灌注的短期和/或直接的影响。优选地，已发现所述miRNA化合物在缺血发作之后5、4、3、2或1.5小时之内或与再灌注同时和/或在与缺血风险相关的手术或介入之前少于1天或少于12、8、6、5、4、3、2或1小时之内给药于患者。

更如此的是，已经惊人地发现，相对于承受缺血-再灌注、没有这些保护机制的组织，在预处理和/或后处理中显著上调的miRNA具有细胞保护作用。类似地，在预处理和/或后处理中miRNA种类的下调允许细胞保护机制在这些条件下发生；因此，这些miRNA将适度地被对抗以便诱导细胞保护。已发现这些miRNA的拮抗剂也有细胞保护作用。

特别地，通过使用350个已知小鼠miRNA基因的miRNA微阵列，通过缺血预处理和后处理在心肌缺血-再灌注损伤和心肌保护的早期阶段中参与的一些miRNA已被识别，并且心肌保护的miRNA化合物即miRNA模拟物(rno-miR-139、rno-miR-125b*、rno-miR-33)和miRNA抑制剂(rno-miR-494、rno-miR-487b)已被制备。

更密切地，根据本发明，提供了一系列样品，包括对照样品、第一样品和第二样品和/或第三样品，使每个样品承受需氧灌注一段时间，且在这一时间内

使对照样品既不承受缺血-再灌注也不承受预处理或后处理从而获得非缺血对照样品，和

使第一样品承受至少于缺血，从而获得缺血样品，和

通过使第二样品承受预处理治疗方案、并随后至少承受缺血来预处理第二样品，从而获得预处理的样品，和/或

通过使第三样品至少承受缺血、并随后承受后处理治疗方案来后处理第三样品，从而获得后处理的样品。

承受缺血的样品通常随后承受再灌注，以便获得缺血-再灌注样品。这尤其是在后处理的情况中。

随后，进行测量以实验地确定miRNA种类的表达水平，优选地，它们是多样性的。

优选地，至少获得下列数据集中的一个：

i)miRNA种类的表达水平

-相对于所述非缺血对照样品，在缺血/再灌注样品中，

-相对于所述非缺血对照样品，在预处理的样品中，和

-相对于所述缺血/再灌注样品，在预处理的样品中，和/或

ii)miRNA种类的表达水平

-相对于所述非缺血对照样品，在缺血/再灌注样品中，

-相对于所述非缺血对照样品，在后处理的样品中，

-相对于所述缺血/再灌注样品，在后处理的样品中。

在优选的实施例中，获得下列数据集：miRNA种类的表达水平

-相对于所述非缺血对照样品，在缺血/再灌注样品中

-相对于所述非缺血对照样品，在预处理的样品中，和

-相对于所述非缺血对照样品，在后处理的样品中，和

-相对于所述缺血/再灌注样品，在预处理的样品中，

-相对于所述缺血/再灌注样品，在后处理的样品中。

至少，miRNA种类的表达水平

-相对于所述缺血/再灌注样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于所述缺血/再灌注样品，在后处理的样品中的表达水平由通过直接测量评估的其他各个数据集进行计算。

在优选的实施例中，获得所述miRNA种类的表达水平的原始数据

-在非缺血对照样品中，

-在缺血/再灌注样品中，和

-在预处理的样品中，和/或

-在后处理的样品中。

计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于非缺血样品在缺血样品中，

-相对于非缺血样品，在预处理的样品中

-相对于非缺血样品，在后处理的样品中

-相对于缺血/再灌注样品，在预处理的样品中，和/或

-相对于缺血/再灌注样品，在后处理的样品中。

基于这些评估和计算，可以识别下述两种基本类型的miRNA种类：

保护性mir：

-miRNA种类，称为预缺血细胞保护性miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血/再灌注样品在预处理的样品中是显著上调的

-miRNA种类，称为后缺血细胞保护性miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血/再灌注样品在后处理的样品中是显著上调的

病变mir：

-miRNA种类，称为预缺血细胞病变miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血/再灌注样品在预处理的样品中是显著下调的

-miRNA种类，称为后缺血细胞病变miRNA种类，条件是该miRNA种类相对于缺血/再灌注样品在后处理的样品中是显著下调的

毒性mir：

-如果相对于非缺血对照，在缺血样品中细胞病变的miRNA是显著上调的以及如果通过预处理和/或后处理，细胞病变的miRNA是下调的，则表明被称为细胞毒性的细胞病变的miRNA在缺血中具有有害作用。这些miRNA可以称为毒性mir。

在本文中可以理解的是，miRNA种类在同一时间可属于多样类别，但有些类别是相互排斥的。

例如，设计为对抗miRNA种类的激动剂为优选的，该miRNA种类同时为预缺血细胞保护性miRNA种类和后缺血细胞保护性miRNA，反之亦然。

例如，设计为对抗miRNA种类的拮抗剂为优选的，该miRNA种类同时为预缺血细胞毒性miRNA种类和后缺血细胞毒性miRNA种类，反之亦然。

预缺血细胞毒性miRNA种类同时为预缺血细胞保护性miRNA种类的情况显然是不可能的和被排除的，对于后缺血性miRNA种类同样如此。

在罕见的事件中发现预缺血细胞毒性miRNA种类同时是后缺血细胞保护性miRNA种类以及预缺血细胞保护性miRNA种类同时是后缺血细胞毒性miRNA种类，这反映了一个事实，即在预处理和后处理中适应的保护基因调控机制可能会有所不同。因此，在易于感染缺血之前和在缺血发作之后情况中的患者需要谨慎的被评估及处理、或不同地和特别地被治疗。

将哪种类型的miRNA化合物给药于患者的难题取决于患者的状态或病情。因此，患者状态的评估可提供有关所给予治疗的重要信息，以便提高保护患者组织免于急性缺血-再灌注损伤。

特别地，如果患者状态的评估表明所述患者易受预期的缺血发作或在患者体内缺少任何内在保护免于这类发作的迹象，这为医疗人员提供了介入是可取的重要信息。

典型地，预缺血细胞病变miRNA的拮抗剂(即病变mir的拮抗剂)或预缺血细胞保护性miRNA的拮抗剂(即保护性mir的拮抗剂)被添加给易受缺血的患者。在这种情况下，患者的一个或多个组织或器官受缺血影响有危险。这种缺血活动可能或不可能是可预测的。如果安排了涉及包括某些组织缺氧引发缺血步骤的治疗性介入，那么可预期的缺血作用的时间可以提前确定，并在可能的缺血时间之前的适宜时间内给予适合的保护性mir。

然而，当包括组织缺氧的缺血的发生是由于所述患者的疾病状态时的情况下，所述发生的时间是无法预测的。在这种情况下，评估或监测所述患者的状态是重要的。在这个方面，心肌梗塞(优选是它的急性变体)的风险因素应该被考虑。若患者处于显著的缺血风险，应该给予他/她适当的保护性mir或混合物或保护性mir的组合物。通过这样来做，由于通过提供了安全的、药理学的和患者适宜的可选治疗方案的预处理，在受损组织中可取得相似的情况。预期地更好的患者依从性突出了这一类型治疗的重要性。

风险因素评估的方法学在最近几年已得到显著改进。

动脉硬化的风险因素通常是心肌梗塞和其他器官(脑、肾、上肢和下肢、视网膜等)梗塞的风险因素。这类风险因素例如：

-糖尿病(有/无胰岛素耐受性)-缺血性心脏疾病(IHD)的单一最重要的风险因素；

-吸烟；

-高胆固醇或升高的血液胆固醇水平(更准确地说高脂蛋白血症，特别是高低密度脂蛋白和低高密度脂蛋白水平)；

-高甘油三酯水平；

-高血压；

-缺血性心脏疾病(IHD)的家族史；

-肥胖(定义为超过30kg/m²的身体质量指数，或者可选地通过腰围或腰臀比定义)；

-年龄-男性在45岁将有独立危险因素，女性在55岁将有独立危险因素；此外，如果个人有在55岁或在55之前患有冠状血管病情的直系男性亲属(兄弟、父亲)，则他还有其它独立危险因素；如果个人有在65岁或小于65岁患有冠状血管病情的直系女性亲属(母亲、姐妹)，则他还有其它独立风险因素；

-高同型半胱氨酸血症(血液中高半胱氨酸水平，当例如服用维生素B2、维生素B6、B12和叶酸不足时，有毒的血氨基酸将升高)；

-压力-高压力指数的职业对于动脉粥样硬化和由此导致的缺血性疾病的敏感性是共知的；

-酒精-研究表明，长期接触高量的酒精可增加心脏发作的风险；

-男性比女性处于更高风险。

许多这些危险因素是可修饰的，所以很多心脏病发作可以通过保持健康的生活方式来预防。个体形成心肌梗塞的易感性例如可通过使用由欧洲心脏病学会编写的SCORE表[Conroy RM等，2003；www.heartscore.org]进行预测。

患有高风险或可能在中等风险的心血管疾病或缺血性心脏疾病的患者应适当地寻求医疗建议，并且应考虑用保护性mir进行治疗(保护性mir治疗)。优选地，具有缺血发作或急性心肌梗死导致的高死亡风险的患者应予以考虑。可能的迹象是CVD(心血管疾病)得分高于3％，更优选高于5％、7％、10％、15％或20％[Conroy RM等人，2003]。其他风险评估方法也是适用的。

在本发明另一实施例中，后缺血细胞病变miRNA的拮抗剂(即病变mir的拮抗剂)或后缺血细胞保护性miRNA的激动剂(即保护性mir的激动剂)将被给予经受缺血、优选为急性缺血、并可能随后再灌注的患者。

在这种情况下，患者在缺血情况之后尽快、或者在再灌注(如果发生的话)期间或之后不久可以得到适当的治疗可能是至关重要，可能包括给药患者细胞保护性miRNA化合物(包括保护性mir)。

在住院后对患者状况的快速评估也很重要。如果需要，外科介入(例如，PCI)可能是必要的，以便实现再灌注或应用再灌注治疗。

根据最近出版的ESC/EACTS指南[Wijns W等人，2010]，基本上会给出关于在血管再生中的再灌注策略的下列建议。

尽一切努力减少所有的时间延迟是有必要的，特别是症状出现后的第一个2小时之内。许可进入没有PCI设备的医院的患者应当转移至PCI功能中心，并且如果预期的首次医疗接触(FMC)与球囊扩张之间的时间延迟小于2小时，则不应当给药纤维蛋白溶解。如果预期的延迟超过2小时(或者在某些超过75岁患者中超过90分钟)，许可进入非PCI中心的患者应立即接受纤维蛋白溶解，并随后被转移到PCI功能中心，其中，应在3-24小时的时间窗口内执行血管造影和PCI。

延迟的PCI可在症状发作长达60小时或3天执行。例如，这在不成功的纤维蛋白溶解之后、或者如果首次医疗接触发生不久、例如症状出现之后不迟于12或24小时可能是必要的。然而，作者发现，在3至28天之间患者持续表现出冠状动脉闭塞，则并没有从PCI中获益。

值得注意的是，在心源性休克的患者中，在症状发生与侵入性诊断以及再血管化之间不应该出现时间限制。

已发现在症状出现后的6-12h之内用高体积治疗的主要PCI(即无纤维蛋白酶溶解的PCI治疗)，有经验的中心显示更有效的血管通畅的恢复，更少的再闭塞，可改善残余的LV(左室)功能，以及比在可比条件下的医院纤维蛋白溶解疗法更好的临床结果。

PCI之前，预缺血性细胞病变miRNA化合物的拮抗剂和/或预缺血性细胞保护性miRNA的化合物的激动剂的给药应在手术过程中及可能的缺血发作、或在自发的(进一步的)缺血-再灌注损伤过程中提供保护作用。

后缺血性细胞病变miRNA的拮抗剂和/或后缺血性细胞保护性miRNA的激动剂应该在治疗性介入之前、期间和随后即刻应用。理由是，当再灌注发生或发生不久之后，应优选给予所述化合物，以巩固或提供后处理的效果。

以上列出了这些miRNA的给药期限，其取决于所施加的介入。

然而，以后给药这些miRNA化合物也是可取的，以预防或减少缺血的长期效果。

所述miRNA种类是否具有所寻求的效果，检测了它们相对于非缺血对照或相对于其他样品，所述miRNA种类在样品组织中是否显著上调或下调。显著上调或下调在本文被理解为相对于其他在参考中使用的样品中的表达水平分别地上调或下调，至少1.3倍，优选至少1.5倍，更优选至少1.8倍，其以统计学显著设置，其中p值小于显著性水平的0.1，优选为0.05或0.01。

应当指出的是，这一显著性水平，特别是1.5倍的水平，涉及测定的当前灵敏度，特别是miRNA微阵列方法。本领域技术人员应当理解，如果应用了更灵敏的方法这可能会改变。此外，用于评估表达水平的方法的灵敏度可能和很可能在未来会增加，正如过去发生的那样。因此，在不脱离本发明构思的情况下，可发现其它miRNA显著上调或下调。即使在更灵敏的方法的情况下，表达水平的1.3倍变化是实际阈值。

已发现，在本领域中的实验性方法和生物信息学方法中，在mRNA上的miRNA靶向位点主要由所述miRNA的5'末端的“种源”区域的6或7个核苷酸确定，即成熟miRNA的2至7、3至9、3至8或2至8的核苷酸位置。确定靶向位点(“3'-补偿性位点”)的附加区域在miRNA的3'部分发现，通常在位置13至18上或之内[Robertson B.，2010；SmallEM2010]。这两个位点限定了相同或相关靶向位点及相同靶基因的miRNA家族。基于相同的种源区域和靶向位点，miRNA被分入可能是靶向相同或靶基因位点相似的家族。此外，现可以通过若干种方法预测miRNA靶基因[Griffiths S.等，2006]。

若干作者也发现，miRNA家族成员在心脏疾病中的调控近似[Olson E.和Van Rooji,E.WO2009/0621692009；Olson Eric N.；RooijEva Van；Quiat Daniel WO2011/0844602011]。本发明人的结果在若干例子中证实了这一发现。

通过用长达8个核苷酸的微小锁定核酸来特定沉默整个miRNA家族的这一发现进一步支持这一想法[Obas S等，2011]。

一旦miRNA种类被识别具有缺血-再灌注和预处理和/或后处理中给定的表达模式，则它将根据上述解释的本发明进行分类。因此，同一家族的其他成员将结合同样的靶向位点并且将调控同样的或近似的基因模式将是合理的推测。事实上，本发明发明人已发现，根据本发明，属于同一家族的miRNA在样品(即条件)中显示出近似的表达调控模式(关于这一点，参见let-7家族、miR-19a和19b、miR-139-3p和139-5p、miR-10a-5p和miR-10b)。考虑到miRBase数据库中miRNA数目渐增的事实，根据本发明的方法发现另外的分类的miRNA的家族成员用于通过本发明的方法识别和制备miRNA在本领域技术人员的技术范围内。一个或多个家族成员没有确切相同的功能和效果可能是会发生的；然而，这可以容易地通过本文公开的功能检测进行确定，通过实施例3的细胞活力检测、或通过使用缺血/再灌注的、预处理的和后处理的样品用于识别相关miRNA的方法。

miRNA测序和特征的数量在过去5至10年已成倍增加，miRNA序列目前储存在miRBase数据库中，该数据库为用于所有miRNA测序的主要数据库。本发明人在相对较小的一组miRNA中发现的细胞保护性和细胞毒性miRNA的数量清晰地表明通过重复本发明的方法进一步有用的miRNA将被识别。一旦这样的miRNA种类被识别，在本领域技术人员的技术范围内能够很好地制备miRNA激动剂(例如，miRNA模拟物)或miRNA拮抗剂(例如拮抗mir)。因此，基于本发明可以清楚地预见，一旦数据库增加，在技术人员的技术范围内可以制备其它miRNA化合物，并且在本文中制备该类化合物是充分可行的。

制备miRNA模拟物和miRNA抑制剂是在本领域技术人员的技术范围内的。基于该序列，技术人员可从商业来源订购模仿物和抑制剂。例如，可从赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)有限公司的子公司Dharmacon订购miRIDIAN miRNA模拟物和发夹抑制剂。Quiagen的miScript miRNA模拟物是合成的、双链RNA，其在转染进入细胞后模仿自然出现的miRNA。Quiagen还销售miScript miRNA抑制剂，它们是合成的、单链的、经化学修饰的RNA，其在转染进入细胞后特异性抑制miRNA的功能。模拟物和抑制剂可被转染进入细胞中，随后通过下游进行的基因表达分析或表型分析阐明特定miRNA的靶向和作用。

Sigma-Aldrich提供人类miRNA模拟物，其为小的、双链RNA分子，当被转染进入细胞后模拟内源性成熟miRNA分子。Sidma-Aldrich从货架上提供了至少985个人类miRNA模拟物，通常购买miRNA的1天内发货。作为一种服务，定购靶序列设计是可行的。

Ambion的Anti-miR^TMmiRNA的抑制剂是设计成特异性结合并抑制内源性miRNA(miRNA)分子的经化学修饰的、单链核酸。即时可用和定制设计形式都是可行的。Pre-miR^TMmiRNA的前体分子设计成模拟内源性成熟miRNA的、小的、经化学修饰的双链RNA分子，其也可购于Ambion公司。

Exiqon提供miRCURY LNA^TMmiRNA的抑制剂库，并声称拥有目前市场上最全面的miRNA抑制剂库。该锁核酸(LNA)抑制剂技术的科学背景例如由Kauppinen S公开(2007)。

已经表明的是，具有互补于成熟miRNA序列的抑制剂可以与所述miRNA-RISC核蛋白复合物交互作用具有抑制效果。Vermeulen等(2007)教导了，高度结构化的、围绕在反向互补核心的双链侧翼区的合并显著增加抑制剂功能，并允许在次纳摩尔(subnanomolar)浓度的多重miRNA抑制。

制备这些miRNA化合物背后的原则在现有技术中是已知的。

miRNA模拟物或抑制剂通常是稳定化的，例如：通过硫代磷酸酯骨架修饰对抗生物体中的降解。此外，各样的核苷酸修饰，包括2'-O-甲基(2'-O-Me)和2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)衍生物已被用于增强miRNA化合物的结合亲和力和稳定性。锁核酸具有特别强的结合力；因此，即使类似于种源序列的较短的序列也足以有效阻止miRNA种类的结合[Obad S.，2011]。化学修饰和设计的方法由伦诺克斯KA(LennoxKA)提出(2011)。

因此，基于根据本发明miRNA化合物所识别的miRNA种类，它的激动剂或拮抗剂是现成可得的。

用于靶向本发明的miRNA化合物的方法在现有技术中也是可得的。在WO2010129672A1中公开了亲脂性多核苷酸轭合物，其中亲脂性基团通过磷酸酯或者乙醚连接轭合。在WO2006137941A2中作者公开了引入合成的miRNA模拟物或抑制剂进入细胞的方法，并公开了功能基团的连接方式。合成的RNA分子具有17-125个残基长度，并包括具有与部分成熟的miRNA序列等同的序列区域。

将miRNA给药于患者的靶组织可受若干方式影响。

传统上，注射miRNA化合物是最容易被接受的方法；然而，这是优选地适用于靶向肝、肾或脾的方法。

封装miRNA化合物于基于脂质的制剂中，例如脂质体或心导管可能更适于引入miRNA进入心血管系统[Small EM2010]。

该miRNA化合物可通过置于受损或损害组织或器官中的药物洗脱装置引入到血液中。该类装置为例如药物-洗脱装置。

在某些实施例中，局部给药是可能的，并且该药物组合物可被配制为油膏、滴剂、溶液、滴眼剂、软膏或洗剂等。这类给药可例如优选在外围血管疾病中。

抑制剂或激动剂可以被引入到适当的组织中并在其中通过包括双链DNA的表达载体进行表达，该双链DNA包括反义miRNA的两个重复的DNA互补序列(WO2009132351A2，CA2609142A1)。

用于从表达的拮抗剂(例如反义miRNA)、或拮抗其他的影响的miRNA、以及是其他激动剂的miRNA(如保护性mir)中引入序列的适合载体在本领域是公知的。该类载体包括但不限于病毒载体，例如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺伴随病毒载体、质粒等。同样地，用于引入DNA或载体的方法是本领域已知的，并且包括但不限于电穿孔、脂质转染或其它的已知转染方法。在优选实施例中，靶向的给定组织细胞被用来作为载体以携带所述可表达的基因材料进入需被处理的组织。这些细胞可靶向所述组织，例如通过归巢机制。该类细胞可以是例如所述组织的干细胞、或者多潜能细胞或多能细胞。

下面通过非限制性实验实施例进一步说明本发明。本领域技术人员应当理解，基于本文提供的本发明的多个一般性教导方法，存在有等同的方案并且是随手可得的。

识别组织保护性miRNA的实验性治疗方案

雄性Wistar大鼠(250-300g)被麻醉并静脉注射给予500U/Kg肝素。心脏随后被分离，并根据Langendorff使用所描述的充氧的、常温的Krebs-Henseleit缓冲剂进行再灌注[CSonka C等，1999]。应用了四种不同的再灌注治疗方案(图1)。对时间匹配的对照组进行需氧灌注190min。在第二组中，通过30min左前降支冠脉闭塞诱导局部缺血后进行120分钟再灌注。在第三组中，心脏经受预处理治疗方案后再通过缺血-再灌注检测。在10min平衡之后，预处理通过3次5min局部缺血(被5min有氧灌注分隔)的间歇周期被诱导。在第四组中，后处理通过在再灌注开始时立即施加的六次10秒心肌梗塞和10秒再灌注的连续循环被诱导。在所有组中，贯穿整个灌注治疗方案监控心率和冠脉血流量(图1)。为了评估组织损伤的严重程度，通过在再灌注结束时用氯化三苯基四氮唑染色确定梗塞尺寸(n＝8-10)，并通过面积法进行计算(梗塞尺寸2.4；Pharmahungary，Szeged，Hungary)。梗塞尺寸表示为处于风险的面积的百分比[Csonka C等，2010]。为进一步评估组织损伤，使用取自缺血检测后在再灌注5分钟收集的冠脉流出物的LDH-P试剂盒(Diagnosticum，Budapest，Hungary)测量心脏释放的乳酸脱氢酶(LDH)(n＝12)。LDH释放被表示为毫单位每分钟每克湿心脏重量。

为了证实预处理和后处理的心肌保护作用，在30分钟局部缺血后进行120分钟的再灌注之后测量梗塞尺寸。相对于缺血-再灌注组的心脏，缺血预处理和缺血后处理组的梗塞尺寸均显著减小(表1)。在冠状动脉流出物中测量LDH释放以进一步证实缺血性损伤的发展。30分钟缺血检测后接受5min再灌注导致缺血再灌注组中显著的LDH释放(表1)，这在缺血预处理和缺血后处理组中均是显著降低的(表1)。心率或冠脉流量都不受灌注结束时的任何介入的显著影响(表1)。

在独立实验中，取自所有组(每组中n＝6)的前壁心肌样品在120min再灌注结束时迅速被冷冻在液氮中用于miRNA分离。在液氮中，在破坏各组中的6个心脏样品后，将样品溶解于20％的由80μl结合缓冲液和320μl不含水的核酸酶制备的结合缓冲液中。所有的其他步骤均根据从试剂盒的组织方案中分离miRNA操作(Roche，德国)。通过加入100μl的洗脱缓冲液将RNA从第二柱中洗脱。使用分光光度计(NanoDrop，美国)和2100生化分析仪(安捷伦(Agilent)，加利福尼亚州(CA)，美国)进行定性和定量评估。将从各组中的6个不同的样品中提取的RNA的任意一对合并，并在微阵列中分析获得的3个样品/组。

miRNA表达的微阵列分析和它通过QRT-PCR检测的校验

使用安捷伦的miRNA完整标记和Hyb试剂盒体系(安捷伦科技帕洛阿尔托(Agilent Technologies Palo Alto)，加利福尼亚州，美国，p/n5190-0456)标记总共50ng的纯的miRNA。该方案简要如下：25-25ng的两个平行样品被合并于2μl的终体积、并在4μl的终体积中使用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)在37℃经脱磷酸作用反应30分钟。在第二步中，添加2.8μl的DMSO到每一样品中用于在100℃变性5分钟，并立即置于冰上。在这一步骤之后，在11.3μl的总体积中使用T4RNA连接酶和Cyanine3-pCp在16℃进行连接反应2小时以标记该RNA样品。标记的样品在中高(45℃)热定型中完全真空干燥，并杂交到安捷伦8x15k大鼠miRNA微阵列(安捷伦科技，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国p/n G4473A)的表面上。包含探针的微阵列用于以下350个来自Sanger数据库v10.1的miRNA(miRBase最近由BBSRC资助在曼彻斯特大学生命科学学院维持，并通过韦尔科姆基金会桑格(Wellcome Trust Sanger)学院预先主办和支持)：

干燥的和标记的样品再次悬浮于18μl的无核酸酶水中，并在终体积为45μl且存在有1x阻断试剂和1x Hi-RPM杂化缓冲液的情况下在100℃变性5分钟，并立即置于冰上。这些混合物用于杂化，其在微阵列杂化室中进行(安捷伦科技公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)，如之前所述[Farago N等,2008]。杂化后，侧翼在扫描前，在室温下在含有安捷伦科技公司的Triton X-102的基因表达洗涤缓冲液1中洗涤1分钟，随后在37℃在含有Triton X-102的基因表达洗涤缓冲液2中再洗涤1分钟。每一阵列如早期所述的用5μm分辨率的安捷伦扫描仪进行扫描[Feher LZ等，2005]。使用安捷伦科技公司的特征提取软件进行输出图片分析和特征提取。

为了确认微阵列结果，使用定量实时PCR(QRT-PCR)。用miRNA反转录试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystems)，加利福尼亚州，美国)进行逆转录反应。每个样品取350ng在5xmiRNA测定仪(应用生物系统，加利福尼亚州，美国)存在下进行逆转录。8μl的反应混合物中含有0.2μL的dNTP、1.5μL的MultiScribe^TM逆转录酶(50U/μL)、0.8μL10x RT缓冲液、0.9μL MgCl₂、0.1μL RNA酶抑制剂(20U/μL)、1.5μL5xRT引物和模板，这些总体积为3μL。反转录在热循环仪(柏业(Bioneer)公司，大同工业株式会社(Daedong)，韩国)中用下列循环参数进行：在16℃持续2分钟，在42℃持续1分钟，在50℃持续1秒，45个循环，然后保持该样品在85℃下5分钟。用64μL的水稀释之后，使用9μL的稀释的反应混合物作为QRT-PCR中的模板。反应在使用TaqMan方案的RotorGene3000仪器(Corbett研究，悉尼，澳大利亚)上进行。20μl的反应混合物中含有10μl的通用PCR扩增预混试剂(应用生物系统)，1μl的miRNA的分析试样和9μl稀释的cDNA。

在文中和表格中微阵列和QRT-PCR数据以平均值±标准差示出，所有其他数据均为平均值±标准误差。在使用单向方差分析(ANOVA)后通过Fisher最小显著性差异(LSD)事后检验被用以评估梗塞尺寸平均值、LDH释放与组间血液动力学参数的差异。

miRNA微阵列的统计分析如之前所述通过使用安捷伦科技公司的特征提取软件进行[Puskas LG等，2005]。所有的个体miRNA在阵列中通过20个不同的探针呈现。如果20个探针中的至少一个探针被检测到，则认为miRNA被检测到。整体基因信号等同于单个个体探针的总和。在Sanger miRBase(版本10.1)中发现的350个miRNA的表达均被核查。

在Sanger miRBase(版本10.1)中发现的350个miRNA的表达均被核查。

基因表达中的变化可通过若干可选方式确定。一方面，至少有3种方式从获得的微阵列表达原始数据中计算表达比(如，例如通过荧光信号强度表达)。

1、从在任意对照的两个样品中获得的原始数据对中计算微小RNA表达比

A、比较随机选取的在任意对照的两个样品中的某些微小RNA的原始数据对。(在图2至图6中使用了这种类型的计算)

B、或者比较在任意对照的两个样品中的所有可能的原始数据对的组合(在图7至图10中使用了这种类型的计算)

2、分别从任意对照的两个样品的平均表达原始数据中计算单个表达比

另一方面，有几种可能的绘图方法来证明基因表达中的改变。通常使用的绘制方法如下：

1、绘制平均表达比(对比原始数据的比率)：在这种情况中，上调用大于1的数字表示，并代表倍数变化。然而，在下调的情况中，该数字在0与1之间，导致比例不均(上调和下调在直观上不具有可比性)。

2、绘制倍数变化值：在下调的情况中，表达比在1与0之间。在这种情况中，倍数变化被定义为表达比的倒数的负值，即1/表达比×-1。因此，倍数的变化值在-1与1之间，不能进行数学上解释，并且这意味着在表达上没有变化。(在图2至图6中使用这种绘制)。

3、绘制表达比的log2值，这产生可比较的比例，然而，这些数据的解释需要进一步的数学方法。例如log2比例中的数字2等于4倍的上调。广泛接受的1.5下调或上调为0.585或-0.585[在这一比率上为log2(1.5)或log2(1/1.5)]。优选的1.8倍变化分别对应于0.848或-0.848，而2倍变化分别为1或-1(在图7至图10中使用这种绘制)。

确定了采用双尾双样品异方差的学生t检验、p值，以发现显著的基因表达变化。P值<0.05和倍性变化<-1.5或倍性变化>1.5的miRNA表达率分别被认为是抑制或过度表达。

外源性miRNA模拟物或抑制剂诱导大鼠心脏中的细胞保护作用经受模拟的缺血-再灌注的治疗方案

用新生Wistar大鼠制备新生大鼠心肌细胞。将心室切碎消化于0.25％胰蛋白酶(Gibco BRL)中30分钟。在消化之后，将细胞悬浮液离心分离(将450xg在4℃下离心15分钟)，细胞沉淀重新悬浮于培养基(Dulbecco公司改良的Eagle培养基(DMEM)，补充有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和抗生素抗真菌混合物(青霉素、链霉素、两性霉素-B))中，所有试剂均来自Sigma公司。解离的细胞在37℃下的6孔平板中预铺板90分钟以富集培养心肌细胞。收集非贴壁肌细胞，并在Burker格中进行细胞计数，然后将细胞以2×10⁴细胞/孔的密度铺在96孔板中、以5×10⁴细胞/孔的密度铺在48孔板中、以10⁵细胞/孔的密度铺在24孔板中。在实验前使培养物生长3天。在制备后的那天改变培养基。将细胞在标准CO₂培养箱(5％CO₂)中保持在37℃。

使用制造商推荐的转染方案将合成的miRNA(Dharmacon)转染到新生大鼠心肌细胞中。单独的miRNA模拟物和抑制剂或它们的混合物被应用，如实施例3中所描述的。Miridian miRNA模拟物和抑制剂在无抗生素的培养基中稀释，并与细胞一起培养至24小时。作为转染试剂，使用DharmaFect1推荐的siRNA转染试剂。对于阴性对照，使用转染试剂cel-miR-67(a C.线虫miRNA)，其显示了最小序列与已知的大鼠miRNA具有同一性。

在转染过程完成之后，转染的细胞经受模拟的缺血-再灌注治疗方案。为了模拟缺血条件，将培养基替换为含有mM量的下列组分的缺氧溶液：NaCl119、KCl5.4、MgSO₄1.3、NaH₂PO₄1.2、HEPES5、MgCl₂0.5、CaCl₂0.9、Na-乳酸盐20、BSA0.1％。为了诱导缺氧，随后将细胞在37℃下置于通有95％N₂和5％CO₂混合气的缺氧腔室中4小时。在缺氧之后，将细胞进行复氧，并将缺氧培养基替换为完整的DMEM培养基在37℃下在95％空气和5％CO₂中持续2小时(模拟再灌注)。通过钙黄绿素-AM染色方法确定心肌细胞存活率。活细胞的特点是存在有无处不在的细胞内酯酶。酯酶活性可以通过基本上无荧光渗透细胞的钙黄绿素-AM到强荧光钙黄绿素的酶转换来确定。聚阴离子染料的钙黄绿素在活细胞内很好的被保留，并在活细胞内生成强烈的均匀的绿色荧光。在模拟缺血-再灌注之后，将细胞洗涤以除去细胞外的酯酶，并随后将其在溶解在D-PBS中的钙黄绿素-AM(2μm，Promokine)中培养30分钟。在移除染料之后，通过荧光酶标仪(FluoStarOptima，BMG Labtech)在495nm的激发波长和520nm的发射波长下检测每个EB的荧光强度。评估每个孔中反映细胞存活率的荧光强度。从各个孔的荧光强度中减去背景荧光强度(染料对照)，并绘制各组的平均强度。将不同的miRNA模拟物和抑制剂的细胞保护作用与模拟的缺血对照组和转染的模拟缺血组的阴性对照进行比较。

实施例1

参与缺血-再灌注损伤的MiRNA的识别

为了确定参与缺血-再灌注损伤的miRNA，在再灌注的2小时后从左心室的前壁中分离出预处理和后处理的miRNA。使用时间匹配的对照组为基准来确定缺血-再灌注后的miRNA表达的相对变化。为了响应缺血-再灌注，所研究的总共350个大鼠miRNA中显示表达的大约有150个miRNA。我们通过采用QRT-PCR测量的随机选择的17组miRNA的表达来确定了微阵列数据。通过QRT-PCR证实了15个miRNA的表达变化(表2)。

为了证明心肌保护的适应作用是否导致了心肌中miRNA谱的改变，将缺血预处理和后处理诱导的miRNA表达水平与非缺血时间匹配的对照组或非处理的缺血-再灌注组或它们两者进行了对比。在相同方向和程度上同时被缺血-再灌注和心肌保护动作显著改变地这些miRNA，可能代表了与缺血再灌注损伤本身相关的miRNA(图2)。

当缺血-再灌注显著地改变它们的表达时，我们认为miRNA与心肌缺血再灌注损伤有关，然而，通过预处理或后处理的心脏保护并不影响这些变化。因此，如果相比于缺血-再灌注中的调控，没有观察到预处理和/或后处理中显著地上调或下调，则这些miRNA仅对缺血性疾病有诊断价值，然而，与预处理或后处理不相关的它们的组织保护价值不能被排除。例如，接近于显著水平的上调的let-7家族的这些成员可作为预缺血性细胞保护性miRNA的潜在候选者(例如let-7a、7b、7c、7d、7d*、7f，数据未显示)。事实上，miRNA let-7b、let-7e和let-7i在目前的系列实验中被证明为实际上是细胞保护的(图10板块A和B)。

在一些miRNA125a-5p、331、333、378*、466b、652、92a和99b(发现miR-99b的下调并不显著，因此需要进一步确认)的情况中，该类表达模式是典型的。有趣的是，在这些样品中，关于上述提到的缺血-再灌注的miRNA的所有变化(miR-466b除外)抑制了miRNA表达，因此，上述提到的miRNA的外源性应用可使组织正常化，miRNA含量可以保护组织免于缺血-再灌注损伤。

实施例2

参与缺血预处理和后处理的心脏保护的MiRNA的识别

当预处理试验导致miRNA表达上的缺血-再灌注影响的显著衰减或显著增强时，我们认为miRNA与缺血预处理相关。这些miRNA包括相比于非缺血时间匹配对照组与非处理的缺血-再灌注组时，预处理诱导显著的miRNA表达改变的情况(miRNA-139-3p、139-5p、188、192、图中阴影条形；参见例如图5)。被缺血-再灌注显著改变的miRNA和被预处理显著逆转的miRNA也被归属为这一分类(miRNA-320；图3A)。该组miRNA的变化很可能有助于预处理诱导的心脏保护的形成。相比于缺血-再灌注，在预处理的条件下观察到的变化方向显示了是否miRNA模拟物(当对比于缺血-再灌注时，预处理增加miRNA表达)或抑制剂(当对比于缺血-再灌注时，预处理降低miRNA表达)适用于缺血疾病的治疗。

为了进一步评估心脏适应性中的miRNA表达，确定了缺血后处理对心肌miRNA表达的影响。基于后处理对缺血-再灌注诱导的miRNA表达的衰减或增强影响，识别了缺血后处理相关的miRNA。这些包括对比于非处理的缺血-再灌注组及优选对比于非缺血时间匹配对照组，受后处理显著影响的miRNA。图6中的下述miRNA：130a、16、21、22*、26b、30b-5p、30c、30c-1*、30e、339-3p、450a、499、760-5p、99a、99a*，缺血-再灌注本身的效果似乎在显著性水平之下，被认为是有害的而不是细胞保护的，因为相比于非处理的缺血-再灌注组，后处理诱导显著下调，即它们可以被认为是病变mir(pathmir)。因此，对抗它们的拮抗剂或抑制剂应当具有免于缺血-再灌注损伤的细胞保护作用。由缺血-再灌注显著改变的miRNA和由后处理显著改变的miRNA，即miRNA-494、33、19a、19b、208和106b也被归属于这一分类(图3B和C)，其中上述机制更为显著。相比于缺血-再灌注，在后处理的条件下观察到的变化方向显示了是否miRNA模拟物(当相比于缺血-再灌注时，后处理增加miRNA表达，即保护性mir)或抑制剂(当相比于缺血-再灌注时，后处理降低miRNA表达，即病变性mir(pathmir))适用于缺血疾病的治疗。对抗miRNA的抑制剂在实施例3中已被检测。该组由参与后处理的细胞保护机制的miRNA组成。

由于缺血预处理和后处理，我们已发现两种miRNA(miRNA-125b*和487b)显示出了近似的表达模式。缺血预处理和缺血后处理均显著衰减了缺血-再灌注诱导的miRNA表达，这表明了这些miRNA在心肌保护性信号转导中的重要作用(图4A和B)。然而，在这两个样品中该变化的传感和方向是相反的，因此，对抗miRNA-487b的miRNA-125b*模拟物或抑制剂应当是细胞或心肌保护性的。另外，三种miRNA(miR-352、miR-532-3p和miR-93)同时受到预处理和后处理的近似影响，而不受缺血-再灌注损伤的影响(图4C)。

该结果也汇总于表4中。

我们已通过使用QRT-PCR测量的随机选取的17组表达确认了miRNA微阵列数据，也见于实施例1(表2)中。

我们总结出所有参与预处理或后处理心脏保护的miRNA都可能是miRNA模拟物或miRNA抑制剂应用治疗的潜在目标。基于这些结果，评估了这些miRNA的潜在作用并给它们的用途提出了建议。

如果给定的miRNA相对于非缺血对照在缺血-再灌注中是显著下调的，尽管相对于缺血-再灌注，在预处理或后处理的样品中表达水平的变化都不是显著的，但它们的miRNA模拟物的潜在的治疗性、细胞保护性和抗缺血的作用仍旧不能排除在外。如果给定的miRNA相对于非缺血对照在缺血-再灌注中是显著上调的，尽管相对于缺血-再灌注，在预处理或后处理的样品中表达水平的变化都不是显著的，但优选地这些miRNA的增加可以表明它们的抑制剂的潜在的治疗作用(例如参见图2中的miR-466b)。

如果miRNA水平的下调在预处理的样品或者后处理的样品中或在这二者中相对于缺血/再灌注样品是显著的，则该miRNA自身的作用被认为是细胞损伤的，即细胞病变的，因此它们的miRNA抑制剂被认为在缺血条件下是细胞保护性的和抗缺血的。如果该miRNA相对于非缺血对照在缺血/再灌注样品中是上调的，则这是特别明确的。在这种情况下，miRNA的抑制剂应当具有细胞保护性和抗缺血作用。

如果miRNA水平的上调在预处理的样品或者后处理的样品中或在这二者中相对于缺血/再灌注样品是显著的，则该miRNA的作用被认为是细胞保护性的，因此它们的miRNA模拟物被认为在缺血条件下是细胞保护性的和抗缺血的。

我们已发现了在缺血预处理和缺血后处理中在反方向显著调控的一小组miRNA。例如，rno-miR-335相对于缺血-再灌注在缺血预处理中是显著下调的，相对于缺血-再灌注在缺血后处理中是显著上调的(数据未示出)。

具有像这样的表达模式的miRNA的治疗价值对于易感染于缺血的患者和缺血发作(或可能发作)的患者可能是不同的。在易感染于缺血的患者中，例如具有风险因素的患者或遭受心脏介入的患者，该类miRNA是下调的(例如miR-335的下调)，该组中的病变mir可导致内源性保护免于缺血-再灌注损伤，并且在预处理中miRNA种类是下调的情况下，在这一阶段给药拮抗剂可以为患者提供一些保护，并提升他/她的恢复前景。然而，在缺血发作出现后的对立是真实的，并且在这种条件下，同样的miRNA可以作为保护性mir，例如在再灌注期间。在缺血之前作为保护性mir并在再灌注中作为病变性mir(pathmir)的miRNA种类随后可能被发现。

实施例3

在模拟缺血-再灌注之后，miRNA转染的原代心肌细胞的存活性

基于miRNA微阵列结果，检测了参与心脏保护或缺血损伤的一些miRNA。为了进一步证明受影响的miRNA与细胞保护之间的动因关系以及证明某些miRNA模拟物或miRNA抑制剂的适用性，一些心脏保护相关的和细胞病变相关的miRNA或它们的组合物被选取以检测是否它们的内源性适用的模拟物或抑制剂能够在接受模拟的缺血-再灌注的心脏心肌细胞中提供细胞保护作用。4个小时模拟的缺血后再经过复氧导致了在新生心脏心肌细胞中的细胞死亡要显著高于保持在正常含氧量条件下的时间匹配对照组。在初级细胞转染实验中，使用3至5个样品，然而稍后将样品数量增加至8个。细胞存活性通过预处理相关的rno-miR-139-5p、后处理相关的rno-miR-33和rno-miR-494(抑制剂)显著增加。存活性通过这两种miRNA(no-miR-125b*和487b的抑制剂)显著增加，其中这两种miRNA受预处理和后处理影响相似。

正如我们在实施例1中描述的，相比于缺血/再灌注，即使没有观察到通过预处理或后处理的数据性的显著上调或下调，也不能排除这些miRNA具有与预处理或后处理无关的组织保护价值。例如，用3-5个样品进行了初级细胞转染实验，let-7家族的某些成员(let-7家族的某些成员的上调接近于显著水平)被认为是作为预缺血性细胞保护性miRNA潜在候选者。与这一假设一致地是，我们用增加的样品数(8个样品)测试了let-7b的微小RNA模拟物的适用性。在这些实验中，我们发现let-7b的微小RNA模拟物能显著增加接受模拟缺血/再灌注的心肌细胞的存活性(表3)。这些结果表明，根据本发明的这些结果的谨慎统计分析是可取的。

随机选取心肌保护性和/或细胞病变性miRNA的随机选取的组合(见表3b)也是有效的，如图11所示。该适用的组合对于对抗模拟的缺血/再灌注损伤也是有效的。

这些结果证明了当使用适宜的相应miRNA模拟物或抑制剂时，我们在实施例2中识别的心肌保护的miRNA对治疗缺血-再灌注损伤是有效的。

实施例4

假定患有缺血发作或处于缺血发作风险的患者的治疗

例1

患有动脉粥样硬化的患者在晚上被送进医院，诉说从症状开始的1小时后持续了至少15分钟的严重的不稳定型心绞痛。在患者家中服用了硝化甘油，但症状没有显著改善。患者的病历显示，两个星期之前出现了不太严重的心绞痛，用硝酸甘油给予了治疗。

冠状动脉造影显示了狭窄(窄)的冠状动脉并制定了紧急经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的决定。PCI在住院40分钟后开始。

由后处理治疗方法的手术决定再灌注。在PCI之前和/或在PCI期间，将预缺血和后缺血的细胞保护性miRNA的激动剂的混合物给药于患者局部地进入血液流动中，并在再灌注3.5小时之后通过输液重复给药后缺血的细胞保护性miRNA。

例2

患者(无心血管疾病史的55岁女人)在症状开始过渡确诊为缺血性心脏发作症状5小时之后来到了非PCI中心并建立了自发性再灌注。患者入院，并立即接受后缺血的细胞保护性激动剂和后缺血的细胞毒性miRNA的拮抗剂的混合物配以低剂量的纤维蛋白酶溶解疗法，并监测患者状态。在她的状态正常之后，她办理出院，并被要求在两周内返回进行控制。

例3

患者(男性60岁，重度吸烟者，高脂血症)在非PCI中心参与定期控制。基于家中的常规血压测量，由医务人员证实的处于控制中的收缩压是160±5Hgmm。计算出的心血管疾病风险因素是19-24，并且有急性脑缺血发作的高风险。在缺血-再灌注损伤中，预缺血的细胞保护性的激动剂与预缺血的细胞毒性miRNA的拮抗剂的混合物连同降血脂的他汀类药物和抗高血压药物共同给药以确保细胞保护作用。强烈警告患者要放弃吸烟，并提议每天至少步行半小时并建议合理膳食。

在一年内，由于停止吸烟、降低的总胆固醇-HDL比率，两次控制的患者的CVD风险因素减少到8。预先准备的方案并没有被改变，放弃了miRNA化合物疗法。

表格

表1心肌细胞组织损伤的标记

值为平均值±标准误差，n.a.为不适用的；*p<0.05对比缺血-再灌注；在再灌注120分钟后测量了风险面积和梗塞尺寸；在再灌注的首个5分钟期间从收集的冠状动脉流出物中测量了LDH释放；在灌注方案结束后测量了在此出现的心率和冠状血流量数据。

表2缺血-再灌注对比时间匹配对照的QRT-PCR微阵列数据检验

值为平均值±标准偏差倍性表达变化。

表3在模拟的缺血-再灌注之后在细胞存活性中miRNA相关的预处理和/或后处理的影响

miRNA模拟物	心肌细胞存活性
		非转染的	100±3
阴性对照	101±1
		rno-let-7b	128±7
rno-miR-139-5p	119±2*
		rno-miR-125b*	128±3*
rno-miR-33	127±2*

miRNA抑制剂	心肌细胞存活性
		非转染的	100±3

阴性对照	102±2
		rno-miR-494	123±2*
rno-miR-487b	121±2*

数据为平均值±标准误差，*p<0.05对比阴性对照转染的细胞；在单因素方差分析后进行Fisher最小显著性差异(LSD)事后检验，每组中n＝8。

表3.b

1	139-5p模拟物	33模拟物	125b*模拟物	let-7b模拟物
					2	139-5p模拟物	33模拟物	125b*模拟物	494抑制剂
3	139-5p模拟物	33模拟物	let-7b模拟物	487b抑制剂
					4	139-5p模拟物	125b*模拟物	let-7b模拟物	487b抑制剂
5	139-5p模拟物	let-7b模拟物	494抑制剂	487b抑制剂
					6	33模拟物	125b*模拟物	let-7b模拟物	494抑制剂

表4图中示出的miRNA种类的调控汇总。在表5中示出了在随后的实验中更精确地限定的分类不明确的某些miRNA，如下

↑上调

↓下调

ns：非显著性调控：低于1.5倍(阳性或阴性)

S：显著性调控限制：1.5倍

SS：非常显著性调控

Bold:优选miRNA种类

表5图中示出的miRNA种类的调控汇总

miRNA

IR/C

PRE/C

POST/C

PRE/IR

POST/IR

效果

////////////

///////////////

图7

miR-92a

↓S

↓S？

ns

miR-877

↓S

ns

miR-652

↓S

ns

miR-494

↑S

ns

后缺血细胞病变性？

miR-378*

↓S

ns

miR-333

↓S

ns

后缺血细胞保护性？

miR-331

↓S

ns

miR-322

↑S

ns

miR-125a-5p

↓S

ns

↓S

ns

图8a预/后

miR-188

ns

↑S

预/后缺血细胞保护性

图8b预/后

miR-125b*

↓SS

ns

↑SS

预/后缺血细胞保护性

miR-139-3p

↓S

↑S

ns

↑SS

↑S

预/后缺血细胞保护性

miR-320

↓S

ns

↑S

预/后缺血细胞保护性

miR-532-3p

↓S

ns

↑S

↑SS

预/后缺血细胞保护性

图9a预

miR-451

ns

↑S

ns

↑S

ns

预缺血细胞保护性

miR-212

ns

↑S

ns

↑SS

ns

预缺血细胞保护性

miR-192

ns

↑S

ns

↑S

ns

预缺血细胞保护性

miR-139-5p

ns

↑SS

↑S

↑SS

ns

预缺血细胞保护性

图9b

miR-487b

↑S

ns

↑S

↓S

ns

预缺血细胞毒性

图10.a后

miR-let7e

ns

↑S

后缺血细胞保护性

miR-let7l

ns

↑S

后缺血细胞保护性

miR-1

ns

↑S

后缺血细胞保护性

图11.b

miR-503

↓S

ns

↑S

后缺血细胞保护性

miR-335

↓S

ns

↓S

↑SS

后缺血细胞保护性

miR-33

↓S

ns

↑SS

后缺血细胞保护性

miR-328

↓S

ns

↑S

后缺血细胞保护性

miR-208

↑S

ns

↓S

后缺血细胞毒性

miR-19b

↑S

ns

后缺血细胞毒性？

miR-19a

↑S

ns

后缺血细胞毒性？

miR-181a

↓S

ns

↑S

后缺血细胞保护性

miR-7b

↓S

ns

↑SS

后缺血细胞保护性

↑上调

↓下调

ns：非显著性调控：低于1.5倍(阳性或阴性)

S：显著性调控限制：1.5倍

SS：非常显著性调控

Bold:优选miRNA种类

工业应性

本发明的发明人在本文中证明了他们在生物样品的缺血-再灌注、预处理和后处理治疗的实验(测试)中分析miNRA水平的发明构思适用于寻找和制备有用于与缺血相关疾病的预防及治疗的miRNA化合物以及在缺血-再灌注损伤中用于细胞保护的特异性合物。已表明来自有限组的一些miRNA化合物具有这样的效果，并且所述miRNA化合物使用了本发明人的方法，在本领域技术人员的技术范围内可制备具有相同良好效果的大量组的miRNA的其它miRNA化合物。

参考文献

Bartel DP.MiRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function Cell.2004；116:281-297.

Bonauer A,Carmona G,Iwasaki M,Mione M,Koyanagi M,Fischer A,Burchfield J,Fox H,Doebele C,Ohtani K,Chavakis E,Potente M,Tjwa M,Urbich C,Zeiher AM,Dimmeler S.MiRNA-92a controls angiogenesis andfunctional recovery of ischemic tissues in mice Science.2009；324:1710-1713.Bostjancic E,Zidar N,Glavac D.MiRNA microarray expression profiling inhuman myocardial infarction Dis Markers.2009；27:255-268.

Bostjancic E,Zidar N,Stajer D,Glavac D.MicroRNAs miR-1,miR-133a,miR-133b and miR-208are dysregulated in human myocardial infarction.Cardiology.2010115(3)163-9.

Buchan JR,Parker R.Molecular biology.The two faces of miRNA Science.2007；318:1877-1878.

Busk PK,Cirera S.MiRNA profiling in early hypertrophic growth of the leftventricle in rats Biochem Biophys Res Commun.2010；396(4):989-93.

Callis TE,Pandya K,Seok HY,Tang RH,Tatsuguchi M,Huang ZP,Chen JF,Deng Z,Gunn B,Shumate J,Willis MS,Selzman CH,Wang DZ.MiRNA-208ais a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice J Clin Invest.2009；119:2772-2786.

Conroy RM,K,Fitzgerald AP,Sans S,Menotti A,De Backer G,DeBacquer D,Ducimetière P,Jousilahti P,Keil U,I,Oganov RG,Thomsen T,Tunstall-Pedoe H,Tverdal A,Wedel H,Whincup P,Wilhelmsen L,Graham IM Estimation of ten-year risk of fatal cardiovascular disease inEurope:the SCORE project.Eur Heart J.2003Jun；24(11):987-1003.

Cheng Y,Zhu P,Yang J,Liu X,Dong S,Wang X,Chun B,Zhuang J and ZhangCh.,Ischaemic preconditioning-regulated miR-21protects heart againstischaemia/reperfusion injury via anti-apoptosis through its target PDCD4,Cardiovascular Research(2010)87,431–439

Csonka C,Fekete V,Kupai K,Csont T,Puskas L,Ferdinandy P.Effect ofpostconditioning on the gene expression pattern of rat hearts:A DNAmicroarray study.J Mol Cell Cardiol.2008；44:817-817.

Csonka C,Kupai K,Kocsis GF,Novak G,Fekete V,Bencsik P,Csont T,Ferdinandy P.Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies JPharmacol Toxicol Methods.2010；61:163-170.

Csonka C,Szilvassy Z,Fulop F,Pali T,Blasig IE,Tosaki A,Schulz R,Ferdinandy P.Classic preconditioning decreases the harmful accumulation ofnitric oxide during ischemia and reperfusion in rat hearts Circulation.1999；100:2260-2266.

Dong S,Cheng Y,Yang J,Li J,Liu X,Wang X,Wang D,Krall TJ,Delphin ES,Zhang C.MiRNA expression signature and the role of miRNA-21in the earlyphase of acute myocardial infarction J Biol Chem.2009；284:29514-29525.

Engelhardt S.and Jentzsch C.microRNA for diagnostic and therapeuticpurposes in cardiovascular diseases WO2010/103015(2010)

Farago N,Kocsis GF,Feher LZ,Csont T,Hackler L,Jr,Varga-Orvos Z,CsonkaC,Kelemen JZ,Ferdinandy P,Puskas LG.Gene and protein expression changesin response to normoxic perfusion in mouse hearts J Pharmacol ToxicolMethods.2008；57:145-154.

Fasanaro P,Greco S,Ivan M,Capogrossi MC,Martelli F.miRNA:emergingtherapeutic targets in acute ischemic diseases Pharmacol Ther.2010；125:92-104.

Feher LZ,Kalman J,Puskas LG,Gyulveszi G,Kitajka K,Penke B,Palotas M,Samarova EI,Molnar J,Zvara A,Matin K,Bodi N,Hugyecz M,Pakaski M,Bjelik A,Juhasz A,Bogats G,Janka Z,Palotas A.Impact of haloperidol andrisperidone on gene expression profile in the rat cortex Neurochem Int.2005；47:271-280.

Ferdinandy P,Schulz R,Baxter GF.Interaction of cardiovascular risk factorswith myocardial ischemia-reperfusion injury,preconditioning,andpostconditioning Pharmacol Rev.2007；59:418-458.

Frost RJ,van Rooij E.miRNAs as therapeutic targets in ischemic heart diseaseJ Cardiovasc Transl Res.2010；3:280-289.

Gene Therapy,(2011)101038

Godwin JG,Ge X,Stephan K,Jurisch A,Tullius SG,Iacomini J.Identificationof a microRNA signature of renal ischemia reperfusion injury.Proc Natl AcadSci U S A.2010107(32)14339-44.

Griffiths-Jones S,Grocock RJ,van Dongen S,Bateman A,Enright AJ.miRBase:miRNA sequences,targets and gene nomenclature.NAR200634(Database Issue):D140-D144

Hasseine LK,Hinault C,Lebrun P,Gautier N,Paul-Bellon R,Van ObberghenE.miR-139impacts FoxO1action by decreasing FoxO1protein in mousehepatocytes Biochem Biophys Res Commun.2009；390:1278-1282.

He B,Xiao J,Ren AJ,Zhang Y-F,Zhang H,Chen M,Xie B,Gao X-G,WangY-W,Role of miR-1and miR-133a in myocardial ischemic postconditioning,Journal of Biomedical Science2011,18:22

Huang C,Yitzhaki S,Perry CN,Liu W,Giricz Z,Mentzer RM,Jr,Gottlieb RA.Autophagy induced by ischemic preconditioning is essential forcardioprotection J Cardiovasc Transl Res.2010；3:365-373.

Kauppinen S,Vester B,Wenge J.Locked nucleic acid(LNA):High affinitytargeting of RNA for diagnostics and therapeutics.Drug Discovery Today:Technologies(2005)2(3)287-290

Le MT,Teh C,Shyh-Chang N,Xie H,Zhou B,Korzh V,Lodish HF,Lim B.MiRNA-125b is a novel negative regulator of p53Genes Dev.2009；23:862-876.

Lee YS,Kim HK,Chung S,Kim KS,Dutta A.Depletion of human micro-RNAmiR-125b reveals that it is critical for the proliferation of differentiated cellsbut not for the down-regulation of putative targets during differentiation J BiolChem.2005；280:16635-16641.

Lennox KA and Behlke MA.Chemical modification and design of anti-miRNAoligonucleotides.

Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked byadenosines,indicates that thousands of human genes are miRNA targets Cell.2005；120:15-20.

Lim LP,Lau NC,Garrett-Engele P,Grimson A,Schelter JM,Castle J,BartelDP,Linsley PS,Johnson JM.Microarray analysis shows that some miRNAsdownregulate large numbers of target mRNAs Nature.2005；433:769-773.

Lu Y,Zhang Y,Wang N,Pan Z,Gao X,Zhang F,Zhang Y,Shan H,Luo X,BaiY,Sun L,Song W,Xu C,Wang Z,Yang B.MiRNA-328contributes to adverseelectrical remodeling in atrial fibrillation Circulation.2010；122:2378-2387.

Meder B,Keller A,Vogel B,Haas J,Sedaghat-Hamedani F,Kayvanpour E,Just S,Borries A,Rudloff J,Leidinger P,Meese E,Katus HA,Rottbauer W.MicroRNA signatures in total peripheral blood as novel biomarkers for acutemyocardial infarction.Basic Res Cardiol.2011106(1)13-23.

Lusardi TA.Farr CD,Faulkner CL,Pignataro G,Yang T,Lan J,Simon RP andSaugstad JA,Ischemic preconditioning regulates expression of microRNAs anda predicted target,MeCP2,in mouse cortex,Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism(2010)30,744–756

Obad Susanna,Santos Camila O dos,Petri Andreas,Heidenblad Markus,Broom Oliver,Ruse Cristian,Fu Cexiong,Lindow Morten,Stenvang Jan,Straarup Ellen Marie,Hansen Henrik Frydenlund,Koch Troels,Pappin Darryl,Hannon Gregory J and Kauppinen Sakari.Silencing of microRNA families byseed-targeting tiny LNAs.Nature Genetics43(2011)371–378

Olson E.and Van Rooij,E.Dual targeting of mir-208and mir-499in thetreatment of cardiac disorders WO2010/091204(2010)

Olson E.and Van Rooij,E.Identification of micro-rnas involved inpost-myocardial infarction remodeling and heart failure WO2010/135570(2010)

Olson E.and Van Rooij,E.Micro-RNAs of the MIR-15family modulatecardiomyocyte survival and cardiac repair.WO2009/062169(2009)

Olson E.and Van Rooij,E.Micro-RNAs of the miR-15family modulatecardiomyocyte survival and cardiac repair US2010/0317713(2010)

Olson E.Van Rooij,E.,Frost R.Targeting of the mir-30family and let-7family as a treatment for heart disease WO2010/120969(2010)

Olson Eric N.；Rooij Eva Van；Quiat D.Micro-rna regulation in ischemia andischemia-reperfusion injury WO2011/084460(2011)

Onody A,Zvara A,Hackler L,Jr,Vigh L,Ferdinandy P,Puskas LG.Effect ofclassic preconditioning on the gene expression pattern of rat hearts:a DNAmicroarray study FEBS Lett.2003；536:35-40.

Ovize M,Baxter GF,Di Lisa F,Ferdinandy P,Garcia-Dorado D,Hausenloy DJ,Heusch G,Vinten-Johansen J,Yellon DM,Schulz R.Postconditioning andprotection from reperfusion injury:where do we stand？:Position Paper fromthe Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society ofCardiology Cardiovasc Res.2010；

Puskas LG,Juhasz F,Zarva A,Hackler L,Jr,Farid NR.Gene profiling identifiesgenes specific for well-differentiated epithelial thyroid tumors Cell Mol Biol.2005；51:177-186.

Ren XP,Wu J,Wang X,Sartor MA,Qian J,Jones K,Nicolaou P,Pritchard TJ,Fan GC.MiRNA-320is involved in the regulation of cardiacischemia-reperfusion injury by targeting heat-shock protein20Circulation.2009；119:2357-2366.

Robertson B,Dalby AB.,Karpilow J,Khvorova A,Leake D,Vermeulen A.Specificity and functionality of miRNA inhibitors.Silence2010110

Sen CK,Roy S.miRNA:licensed to kill the messenger.DNA Cell Biol.2007Apr；26(4):193-4

Sengupta A,Molkentin JD,Yutzey KE.FoxO transcription factors promoteautophagy in cardiomyocytes J Biol Chem.2009；284:28319-28331.

Sepramaniam S,Armugam A,Lim KY,Karolina DS,Swaminathan P,Tan JR,and Jeyaseelan K,MicroRNA320a Functions as a Novel EndogenousModulator of Aquaporins1and4as Well as a Potential Therapeutic Target inCerebral Ischemia The Journal Of Biological Chemistry(2010)285(38)29223–29230,

Shayne C.Gad,Handbook of pharmaceutical biotechnology,John Wiley andSons,2007(1659pages).

Small EM,Frost RJA,Olson EN.MiRNAs add a new dimension tocardiovascular disease Circulation20101211022-1032

Sun HY,Wang NP,Halkos M,Kerendi F,Kin H,Guyton RA,Vinten-JohansenJ,Zhao ZQ.Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibitionof JNK and p38mitogen-activated protein kinase signaling pathwaysApoptosis.2006；11:1583-1593.

Talukder MA,Zweier JL,Periasamy M.Targeting calcium transport inischaemic heart disease Cardiovasc Res.2009；84:345-352.

Thum T.and Fiedler,J.Use of microRNA-24and/or its targets for thetreatment and prevention of ischemia and induction of angiogenesisEP2275545A1(2011)

Thum T.,Bauersachs J.Microrna(mirna)for the diagnosis and treatment ofheart diseases US2010/0010073(2010)

van Rooij E,Olson EN.MiRNAs:powerful new regulators of heart disease andprovocative therapeutic targets J Clin Invest.2007；117:2369-2376.

van Rooij E,Quiat D,Johnson BA,Sutherland LB,Qi X,Richardson JA,KelmRJ,Jr,Olson EN.A family of miRNAs encoded by myosin genes governsmyosin expression and muscle performance Dev Cell.2009；17:662-673.

van Rooij E,Sutherland LB,Qi X,Richardson JA,Hill J,Olson EN.Control ofstress-dependent cardiac growth and gene expression by a miRNA Science.2007；316:575-579.

Vermeulen A,Robertson B,Dalby A B.Double-stranded regions are essentialdesign components of potent inhibitors RNA200713:723-730

Wang HC,Zhang HF,Guo WY,Su H,Zhang KR,Li QX,Yan W,Ma XL,Lopez BL,Christopher TA,Gao F.Hypoxic postconditioning enhances thesurvival and inhibits apoptosis of cardiomyocytes following reoxygenation:role of peroxynitrite formation Apoptosis.2006；11:1453-1460.

Wang Ning；Wang Zhi-Guo；Zhang Ying；Yang Bao-Feng；Pan Zhen-Wei；Lv Yan-Jie；Chu Wen-Feng；Shan Hong-li MicroRNA-328and use ofanti-sense nucleotide thereof in diagnosing,preventing and treating heartdisease CN101643791A(2010)

Wang X,Zhang X,Ren XP,Chen J,Liu H,Yang J,Medvedovic M,Hu Z,FanGC.MiRNA-494targeting both proapoptotic and antiapoptotic proteinsprotects against ischemia/reperfusion-induced cardiac injury Circulation.2010；122:1308-1318.

Waspe LE,Ordahl CP,Simpson PC.The cardiac beta-myosin heavy chainisogene is induced selectively in alpha1-adrenergic receptor-stimulatedhypertrophy of cultured rat heart myocytes J Clin Invest.1990；85:1206-1214.Yan HL,Xue G,Mei Q,Wang YZ,Ding FX,Liu MF,Lu MH,Tang Y,Yu HY,Sun SH.Repression of the miR-17-92cluster by p53has an important functionin hypoxia-induced apoptosis EMBO J.2009；28:2719-2732.

Ye Y,Perez-Polo JR,Qian J,Birnbaum Y.The role of microRNA in modulatingmyocardial ischemia-reperfusion injury.Physiol Genomics.201143(10):534-42.

Yin KJ,Deng Z,Huang H,Hamblin M,Xie C,Zhang J,Chen YE.miR-497regulates neuronal death in mouse brain after transient focal cerebral ischemia.Neurobiol Dis.201038(1)17-26.

Wijns W,Kolh P,Danchin N,Mario C,Falk V,Folliguet T,Garg S,Huber K,James S,Knuuti J,Lopez-Sendon J,Marco J,Menicanti L,Ostojic M,PiepoliMF,Pirlet C,Pomar JL,Reifart N,Ribichini FL,Schalij MJ,Sergeant P,Serruys PW,Silber S,Uva MS,Taggart D,Guidelines on myocardialrevascularization European Heart Journal201031,2501–2555.

Xu,Cheng-fu,Yu Chao-hui and Li,You-ming,Regulation of HepaticMicroRNA Expression in Response to Ischemic Preconditioning followingIschemia/Reperfusion Injury in Mice,A Journal of Integrative Biology200913(6)513-520.

Claims

1.一种miRNA化合物，所述miRNA化合物用于在治疗时，在易感染于缺血或缺血发作的患者中、在所述患者的心脏中，保护细胞、组织和/或器官免于急性缺血和再灌注损伤的短期和/或直接影响，

其中，所述miRNA化合物在所述缺血发作之后5、4、3、2或1.5小时内、或与再灌注同时给药于患者，和/或，在与缺血风险相关的手术或介入之前少于1天或少于12、8、6、5、4、3、2或1小时给药于患者，

其中，所述miRNA化合物选自

ⅱ)miRNA激动剂

ⅲ)miRNA拮抗剂

-miRNA种类的miRNA拮抗剂，由于承受缺血和再灌注的所述细胞或组织的预处理，所述miRNA种类在哺乳动物心脏组织样品中相对于承受缺血和再灌注的对照心脏组织样品中被下调至少1.5倍，且所述miRNA种类是后缺血性细胞病变miRNA种类，

2.根据权利要求1所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA激动剂为一miRNA种类的激动剂，所述miRNA种类同时是预缺血性细胞保护性miRNA种类及后缺血性细胞保护性miRNA种类，其中优选地所述miRNA种类选自miR-118、miR-125b*、miR-139-3p、miR-320和miR-532-3p的组，

和/或

所述miRNA拮抗剂是一miRNA种类的拮抗剂，所述miRNA种类同时是预缺血性细胞病变miRNA种类和后缺血性细胞病变miRNA种类，其中优选地所述miRNA种类选自miR-352和miR-93的组。

3.根据权利要求1所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物是

选自miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-320、miR-532-3p、miR-451、miR-212、miR-192、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a、miR-7b及它们的任何组合的组的miRNA种类的miRNA激动剂，和/或

选自miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b或它们的任意组合的组的miRNA种类的miRNA拮抗剂。

4.根据权利要求3所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物是

5.根据权利要求4所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物选自它本身或选为来自以下组的组合，所述组由miRNA种类miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b的激动剂，miRNA种类miR-494和miR-487b的拮抗剂组成，并且所述miRNA激动剂或拮抗剂包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述miRNA种类的种源区等同或互补，和/或所述核苷酸序列包括17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列与所述miRNA种类的序列等同或互补，或者与所述所述miRNA种类或所述互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同，其中所述miRNA化合物在心肌细胞存活性测试中显示了细胞保护作用。

6.根据权利要求1所述的miRNA化合物，其中，

7.根据权利要求1至6任一项所述的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物在缺血发作之后4或3小时内、或与再灌注同时给药于患者，和/或在手术或介入之前少于6小时给药于患者。

8.根据权利要求1至7任一项所述的miRNA化合物，其中，在预处理或后处理期间，在所述哺乳动物心脏组织样品中分别地对所述miRNA激动剂或miRNA拮抗剂的上调或下调通过以下方法进行评价：

对照样品，

第一样品，和

第二样品，和/或

第三样品

其中，所述样品能够经受缺血，

ⅱ)使每个样品承受需氧灌注一段时间，并且在这段时间内

通过使所述第二样品承受预处理治疗方案并随后承受缺血来预处理所述第二样品，从而获得预处理的样品，和/或

通过使所述第三样品承受缺血并承受后处理治疗方案来后处理所述第三样品，从而获得后处理的样品，

优选地，在缺血后不超过5小时后分离miRNA；

iii)评价所述miRNA种类的表达水平

-在非缺血对照样品中

-相对于所述非缺血对照样品，在所述缺血样品中，和

-相对于所述非缺血对照样品，在所述预处理的样品中，和/或

-相对于所述非缺血对照样品，在所述后处理的样品中，

iv)计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于所述缺血样品，在所述预处理的样品中，和/或

-相对于所述缺血样品，在所述后处理的样品中

v)相对于所述缺血/再灌注样品，在所述预处理的样品和/或所述后处理的样品中，识别所述miRNA种类的表达水平被上调至少1.5倍或下调至少1.5倍，

ⅵ)获得所述miRNA种类的核苷酸序列。

9.根据权利要求1至8任一项所述的miRNA化合物，其中，所述miRNA种类在承受缺血和再灌注的对照心脏组织样品中是

-相对于非缺血对照样品显著上调，

-相对于非缺血对照样品显著下调，

-相对于非缺血对照样品既不显著上调也不显著下调。

10.一种用于预防或治疗易感染于缺血或缺血发作的患者体内缺血和/或再灌注损伤影响的miRNA化合物，

其中，所述miRNA化合物选自由以下任一miRNA种类的miRNA激动剂组成的组：miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-451、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a；以及以下任一miRNA种类的miRNA拮抗剂：miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-106b，和包括等同于或互补于所述miRNA种类的种源区的核苷酸序列的miRNA激动剂或拮抗剂，和/或所述miRNA激动剂或拮抗剂包含17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA的序列、或等同于所述成熟miRNA的互补序列，或与所述成熟miRNA或所述互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同和它们的任一组合。

11.至少两个根据权利要求1至10任一项所述的miRNA化合物的组合，其中，所述组合包括至少miRNA拮抗剂和miRNA激动剂，

12.根据权利要求11所述的miRNA化合物的所述组合，其中，miRNA种类的所述miRNA激动剂选自miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b的组，并且miRNA种类的所述miRNA拮抗剂选自miR-494和miR-487b的组。

13.一种药物组合物，所述药物组合物用于在治疗时，在易感染于缺血或缺血发作的患者体内、在易感染于急性缺血或急性缺血发作的患者的心脏中，保护细胞、组织和/或器官免于急性缺血和再灌注损伤的短期和/或直接影响，

所述组合物包括一个或多个权利要求1至12中任一项所限定的miRNA化合物及药学上可接受的赋形剂。

14.一种用于获取用于在治疗时，在易感染于急性缺血或急性缺血发作的患者心脏中，保护细胞、组织和/或器官免于急性缺血和再灌注损伤的短期和/或直接影响的微小RNA(miRNA)化合物的方法，所述方法包括

i)提供一组包括表达的miRNA种类的生物样品，所述样品组包括

对照样品，

第一样品，和

第二样品，和/或

第三样品

其中，所述样品能够经受缺血，

ⅱ)使每个样品承受需氧灌注一段时间，并在这段时间内

使第一样品承受缺血，从而获得缺血样品，和

通过使所述第三样品承受缺血并承受后处理治疗方案来后处理所述第三样品，从而获得后处理的样品

iii)评价miRNA种类的表达水平

-在所述非缺血性对照样品中

-相对于所述非缺血对照样品，在所述缺血样品中，和

-相对于所述非缺血对照样品，在所述后处理的样品中，和

iv)计算所述miRNA种类的表达水平的比率

-相对于所述缺血样品，在所述预处理的样品中，和/或

-相对于所述缺血样品，在所述后处理的样品中，

v)相对于所述缺血/再灌注样品，在所述预处理的样品和/或所述后处理的样品中，识别miRNA种类的表达水平被上调至少1.5倍或下调至少1.5倍，

vi)获得所述miRNA种类的所述核苷酸序列

vii)合成miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物为所述miRNA种类的激动剂或拮抗剂，并且所述miRNA化合物为核酸部分，所述核酸部分包括等同于或互补于相应miRNA种类的种源区的核苷酸序列，和/或所述miRNA化合物包括17到27个核苷酸长度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA的序列或等同于所述成熟miRNA的互补序列、或分别与所述成熟miRNA或所述互补序列中最多1、2、3、4、5或6个核苷酸不同。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述miRNA化合物选自由以下任一miRNA种类的miRNA激动剂组成的组：miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-320、miR-532-3p、miR-451、miR-212、miR-192、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a、miR-7b；以及以下任一miRNA种类的拮抗剂：miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b，以及它们的任意组合。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述miRNA化合物选自由以下任一miRNA种类的miRNA激动剂组成的组：miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-212、miR-139-5p、miR-33、miR-let7b，以及以下任一miRNA种类的miRNA拮抗剂组成的组：miR-494、miR-487b，以及它们的任意组合。