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CN104053670A - 具有降低的免疫原性的纤连蛋白结合域 - Google Patents

具有降低的免疫原性的纤连蛋白结合域 Download PDF

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CN104053670A
CN104053670A CN201280065574.6A CN201280065574A CN104053670A CN 104053670 A CN104053670 A CN 104053670A CN 201280065574 A CN201280065574 A CN 201280065574A CN 104053670 A CN104053670 A CN 104053670A
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wild
seq
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CN201280065574.6A
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J.戴维斯
D.利波夫塞克
R.坎福森
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Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

提供了一种III型纤连蛋白(10Fn3)结合结构域，其具有与降低免疫原性相关的新设计。本申请描述了可选择的10Fn3结合结构域，其中某些免疫原区在产生结合子(binder)时不被修饰，以便保持被宿主生物体识别为自身抗原。本申请还描述了10Fn3结合结构域，其中HLA锚定区被破坏，从而降低了相邻区域的免疫原性贡献。还提供了具有被修饰区域的新型组合的10Fn3结构域，其能够以高亲和力结合期望的靶标。

Description

具有降低的免疫原性的纤连蛋白结合域
序列表
本申请包含一个序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式提交，本文援引并入其全部内容。所述ASCII拷贝于2012年10月31日生成，命名为MXI523PC.txt，大小为48,779字节。
引言
纤连蛋白是一个大蛋白，在细胞外基质的形成和细胞-细胞相互作用中发挥至关重要的作用；它由多个重复的三种类型(I、II和III型)的小结构域构成。III型纤连蛋白结构域(Fn3)是一个大的亚家族，其成员经常作为细胞粘附分子、细胞表面激素和细胞因子受体、分子伴侣和碳水化合物结合结构域的一部分被发现。综述可见Bork&Doolittle、Proc Natl Acad Sci USA89(19):8990-4(1992)；Bork et al.、J Mol Biol.242(4):309-20(1994)；Campbell&Spitzfaden、Structure2(5):333-7(1994)；Harpez&Chothia、J Mol Biol.238(4):528-39(1994))。
基于纤连蛋白的支架(Fibronectin based scaffold)是一个具有免疫球蛋白样折叠的蛋白的家族。这些蛋白一般使用衍生自III型纤连蛋白(Fn3)或Fn3样结构域的支架，以天然或工程化抗体(即多克隆、单克隆或单链抗体)的特征方式发挥作用，并且具有结构上的优势。具体地讲，这些抗体模拟物的结构经常被优化以获得最佳的折叠、稳定性和溶解性，即使是在通常会导致抗体结构和功能丧失的条件下。基于纤连蛋白的支架蛋白的一个实例是AdnectinsTM(Adnexus、Bristol-Myers Squibb的一个全资子公司)。已经显示，基于纤连蛋白的支架的CDR样环区能够被修饰，从而进化成能够结合任何兴趣化合物的蛋白。例如美国专利No.7,115,396描述了Fn3结构域蛋白，其中对BC、DE和FG环的改变产生了高亲和力的TNFα结合子。美国专利No.7,858,739描述了Fn3结构域蛋白，其中对BC、DE和FG环的改变产生了高亲和力的VEGFR2结合子。
蛋白药物在患者体内经常伴随一定水平的免疫原性。这些免疫原性问题可能导致蛋白药物效力降低，以及在患者体内产生潜在的有害免疫应答。因此，获得免疫原性降低的、并可同时用于治疗和诊断目的的改良纤连蛋白结构域支架蛋白，将是有利的。
概要
本申请的一个方面提供基于纤连蛋白的支架多肽，其包含经过修饰的环和支架区，例如与改进的靶结合关联的β-链，的新组合。本申请的另一个方面提供了具有降低的免疫原性的新型基于纤连蛋白的支架多肽。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域包含(i)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的相应环，在从BC、DE和FG环中选出的至少一个北极环(northpole loop)的氨基酸序列中含有修饰，和(ii)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的相应环，在从AB、CD和EF环中选出的至少一个南极环(southpole loop)的氨基酸序列中含有修饰，其中该至少一个修饰的北极环和至少一个修饰的南极环贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，多肽的至少一个北极环或至少一个南极环具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中10Fn3结构域包含(i)AB、BC、CD、DE、EF、或FG环中的至少一个的氨基酸序列中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的修饰，和(ii)至少一个β-链的氨基酸序列中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的修饰，其中该至少一个修饰的环和至少一个修饰的β-链贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，多肽可在至少一个β-链和至少两个环中包含修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽的至少一个修饰的环是从BC、DE和FG环中选出的北极环，且至少一个修饰的环是从AB、CD和EF环中选出的南极环，并且两个环均贡献于对靶标的结合。在一些实施方案中，至少一个环不是修饰的，即至少一个环具有对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在CD和FG环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中CD和FG环贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环的序列，CD环的至少3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸被修饰。在一些实施方案中，CD环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)氨基酸残基46或47的一个或多个氨基酸残基与那些位置处的野生型氨基酸相同。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的序列，FG环的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸被修饰。在一些实施方案中，FG环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基75或87的一个或多个氨基酸残基与那些位置处的野生型氨基酸相同。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，CD环和/或FG环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。还构想了它们的组合。例如，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，CD和FG环中的至少一个的氨基酸序列的长度可以延长，且相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，CD和FG环中的至少一个的氨基酸序列的长度缩短。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列，包含修饰的CD和FG环的10Fn3结构域的多肽可以进一步在β-链C、β-链D、β-链F和/或β-链G的一个或多个中含有氨基酸序列修饰。在一些实施方案中，具有修饰的CD和FG环的多肽可以进一步在BC环的至少一部分中含有氨基酸序列修饰，例如BC环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基30和31的一个或多个氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，一个或多个修饰的β-链与经过修饰的环一起贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，AB、DE和EF环的一个或多个没有被修饰，即所述环具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在CD和DE环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中CD和DE环贡献于对相同靶标的结合。多肽还可以进一步在EF环、β-链C、β-链D和/或β-链F中的一者或多者的氨基酸序列中包含修饰，并且这些额外的修饰可以和CD和DE环一起贡献于对相同靶标的结合。一些实施方案中，相对于野生型序列中的相应残基，对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的残基36-66的氨基酸之间的至少10、15、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或全部31个残基已经被修饰。在一些实施方案中，CD环的长度与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环相比延长或缩短。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在EF和FG环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中EF和FG环贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，该多肽可以进一步在AB环、β-链A和/或β-链G的一个或多个中包含氨基酸序列修饰，并且这些额外的修饰可以和EF和FG环一起贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，多肽可以进一步在N端和/或C端含有序列修饰。特别地，相对于野生型序列中的相应残基，最先7个氨基酸的氨基酸序列或对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的残基93-97的氨基酸的氨基酸序列可以被修饰。这些额外的末端修饰也可以和其它序列修饰一起贡献于对靶标的结合。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)中的相应残基，10Fn3结构域的前15个氨基酸残基中有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或全部15个被修饰。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)中的相应残基，EF环的至少3、4或5个氨基酸残基可以被修饰。在一些实施方案中，相对于野生型序列中的相应残基，对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的残基80-97的氨基酸之间的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或全部18个残基可以被修饰。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环，FG环的氨基酸序列的长度可以被延长或缩短。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链和环的序列在β-链A、AB环、β-链B、CD环、β-链E、EF环和β-链F的氨基酸序列中含有修饰，并且其中被修饰的环和链贡献于对相同靶标的结合。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环，CD环氨基酸序列的长度被延长或缩短。在一些实施方案中，多肽可以进一步在β-链G和/或C端尾巴的氨基酸序列中含有修饰。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的氨基酸残基77-83的序列在FG环中含有序列修饰，并且其中该10Fn3以小于500nM的Kd与靶标结合。在一些实施方案中，相对于野生型FG环的氨基酸残基77-83的序列，FG环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的氨基酸残基77-83的部分的长度被延长或缩短。在一些实施方案中，FG环单独介导与靶的结合。在一些实施方案中，AB、BC、CD、DE或EF环中的一个或多个具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环和β-链的序列在BC环以及β-链B或β-链C中至少一个中包含序列修饰，并且其中相对于在β-链B或β-链C中的至少一个中不含有相对于野生型的序列修饰的等价10Fn3结构域，该10Fn3结构域具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的氨基酸序列，BC环的氨基酸序列的长度被延长或缩短。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的最先7个氨基酸残基的氨基酸序列，10Fn3结构域进一步在最先7个氨基酸残基的氨基酸序列中含有修饰。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的相应环的序列，10Fn3结构域进一步在DE环和/或FG环中含有修饰。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的DE环的氨基酸序列，DE环的氨基酸序列的长度被延长或缩短。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的氨基酸序列，FG环的氨基酸序列的长度被延长或缩短。在一些实施方案中，10Fn3结构域在DE环中含有序列修饰，并且相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列，进一步在β-链F和/或β-链G中含有序列修饰。在一些实施方案中，10Fn3结构域在FG环中含有序列修饰，并且相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列，进一步在β-链D和/或β-链E含有序列修饰。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽的BC环的至少一部分具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。例如，BC环的前1、2、3、4、5、6、7或8个残基可以与野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的BC环中相应的残基相同。在另外的实施方案中，整个BC环具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于在BC环中具有额外修饰的等价多肽，BC环的至少一部分具有野生型序列的多肽的免疫原性降低。
在特定的实施方案中，本文中提供的多肽包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在BC环的一部分和FG环的一部分中含有序列修饰，并且其中相对于和野生型BC环相比BC环的更大一部分被修饰的10Fn3结构域，该10Fn3结构域具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，BC环的被修饰的部分可对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的残基28-29、27-29、26-29、25-29、或24-29。在一些实施方案中，FG环的被修饰的部分可对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的残基77-79、77-80、77-81、77-82、77-83、77-84、77-85、或77-86。在一些实施方案中，FG环的被修饰的部分与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的相应部分相比具有插入或缺失。在一些实施方案中，BC和FG环贡献于对靶标的结合。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的DE环序列，10Fn3结构域进一步在DE环的一部分中含有序列修饰。在一些实施方案中，DE环的被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的BC环的残基52和53。在一些实施方案中，相对于进一步在氨基酸残基23-27中的一个或多个中与野生型BC环中的相应位置相比包含修饰的等价10Fn3结构域，该10Fn3结构域的免疫原性降低。在一些实施方案中，10Fn3结构域以小于500nM的Kd与靶结合。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽的FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽的疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，本文中提供的多肽的至少一个被修饰的环的氨基酸序列的长度被延长。在其它实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，本文中提供的多肽的至少一个被修饰的环的氨基酸序列长度被缩短。
在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列，本文中提供的多肽的C端尾巴的氨基酸序列被修饰。在一些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的最先7个氨基酸残基的氨基酸序列，最先7个氨基酸残基的氨基酸序列被修饰。在其它实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)，多肽的N端截短了1-7个氨基酸，和/或相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1)，C端截短了1-9个氨基酸。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1、2、60或6)的氨基酸序列具有至少50％同一性。在其它实施方案中，所述多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1、2、60或6)的氨基酸序列具有至少65％同一性。在某些实施方案中，10Fn3结构域包含与由SEQ IDNO:1、2、60或6的代表的天然存在的人10Fn3结构域至少60、70、80或90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含III型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:2或60具有至少60％同一性的氨基酸序列，并以小于100nM的Kd与靶分子结合，其中所述10Fn3结构域还包含不含有DK序列的C端尾巴。在一些实施方案中，C端尾巴包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，C端尾巴还包含半胱氨酸残基。在其它实施方案中，C端尾巴包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其它实施方案中，C端尾巴可以包含SEQ ID NOs:23-31中任一的序列。
在某些实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架蛋白结合野生型10Fn3结构域不结合的靶标。
在一些实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架蛋白的10Fn3结构域还包含具有1-10个氨基酸的N端延伸。在某些实施方案中，10Fn3结构域包含位于SEQ ID NO:1或6的第一个氨基酸的N端一侧的M、MG或G N。在其它实施方案中，对应于SEQ ID NO:1或6第1-8个氨基酸的氨基酸残基被SEQ ID NOs:9-11或16-21中的任一个代替。
在一些实施方案中，所述基于纤连蛋白的支架蛋白进一步包含一个或多个选自下组的药代动力学(PK)模块：聚氧化烯模块、人血清白蛋白结合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、转铁蛋白、IgG、IgG结合蛋白和FC片段。在一些实施方案中，PK模块是聚氧化烯模块，并且所述聚氧化烯模块是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG模块通过半胱氨酸或赖氨酸与所述基于纤连蛋白的支架蛋白共价连接。在一些实施方案中，PEG为大约0.5kDa-大约100kDa。
在某些实施方案中，本申请提供可药用的组合物，其包含本文中所述的新型10Fn3结构域。在一些实施方案中，该组合物基本上没有致热源。在一些实施方案中，组合物基本上没有微生物污染，使得其适合于体内施用。组合物可以被配制成用于，例如，静脉内(IV)、腹膜内(IP)或皮下(SubQ)施用。在一些实施方案中，组合物包含生理学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物的pH为4.0-6.5，4.0-5.5，或者等于4.0、4.5、5.0或5.5。在一些实施方案中，组合物中基于纤连蛋白的支架蛋白的浓度为5mg/ml。
在某些实施方案中，本申请提供了编码如本文中所述的新型10Fn3结构域的核酸。还包括含有这些蛋白的多核苷酸的载体。合适的载体包括，例如，表达载体。本申请的进一步的方面提供一种细胞，其包含编码10Fn3结构域的多核苷酸、载体或表达载体。序列优选地被优化，以便在所用细胞类型中获得最大表达。在一些实施方案中，表达在细菌细胞中进行，例如大肠杆菌。在其它实施方案中，表达在哺乳动物细胞中进行。在一个实施方案中，细胞表达包含如本文中所述的10Fn3结构域的蛋白。在某些实施方案中，编码10Fn3结构域的多肽被密码子优化，以便在所选的细胞类型中表达。还提供了用于产生如本文中所述的10Fn3结构域的方法，包括培养包含编码10Fn3结构域的核酸、载体或表达载体的宿主细胞，和从培养物回收所表达的蛋白。
在某些实施方案中，本申请提供了如本文中所述的基于纤连蛋白的支架蛋白的文库。本文中提供的文库可以包含例如至少105、106、107、108、109、1010、1012、1013、或1014或更多个成员。还提供了用于从本文中所述的文库中的一个分离特异性结合感兴趣的靶标的基于纤连蛋白的支架蛋白的方法。例如，文库分离方法可以包括，例如，使基于纤连蛋白的支架蛋白的文库与感兴趣的靶标接触，和分离与靶标结合(例如以特定的亲和力或在合适的清洗条件下结合)的成员。分离步骤可以用任何合适的方法实施，例如噬菌体展示或mRNA展示。类似地，靶标结合可以用任何合适的方法实施，例如将靶标固定在固体支持物(例如柱子、芯片、珠子等)上，并在适合于蛋白结合的条件下将固定的靶标与文库混合。然后将可以已结合的文库成员与未结合的文库成员分离，获得与靶标结合的、分离的基于纤连蛋白的支架蛋白。在某些实施方案中，分离方法可以涉及重复多轮靶标结合和分离步骤。
附图简要说明
图1：野生型10Fn3氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中疏水核心氨基酸残基已被标明。β-链用粗体标明，环区用成对字母标示，疏水核心残基加有粗体下划线(underlined in bold)。氨基酸95-101对应于尾巴，当具有SEQ ID NO:1的10Fn3结构域没有该尾巴时，便成为具有SEQ ID NO:6的10Fn3结构域。
图2(A-F)：野生型10Fn3结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:1或6)，其中全长序列(SEQ ID NO:1)中标明的氨基酸位置可以被突变，以提供一个代表性的修饰10Fn3多肽补丁(patch)文库。可以加以修饰而产生各个代表性补丁文库10Fn3多肽的可能位置用粗体表示并加有下划线。这些标出的位置中的任何一个或它们的组合可以被突变而产生西北结合子(Northwest Binder)(图2A)、东北结合子(Northeast Binder)(图2B)、西侧结合子(West Side Binder)(图2C)、南-前结合子(South-Front Binder)(图2D)、AG链结合子(图2E)和西南结合子(South West Binder)(图2F)。
图3(A-F)：野生型10Fn3结构域的晶体结构，其中显示了不同的可能结合界面的视图。可以从野生型改变的残基用黑体显示。不属于6个环中其中之一的成员的被改变残基添加有棒线(Stick)。显示了野生型10Fn3结构域的西北(Northwest)结合界面(图3A)、东北(Northeast)结合界面(图3B)、西侧(WestSide)结合界面(图3C)、南-前(South-Front)结合界面(图3D)、AG链结合界面(图3E)和西南(South West)结合界面(图3F)。
图4：HLA结合数据显示了5种不同HLA等位蛋白与10Fn3多肽的5种不同肽片段的IC50结合亲和力(μM)。SEQ ID NOs:58、51和52分别是BC、DE和FG环的环区集群(loop region cluster)，环区残基用下划线标示。SEQ IDNOs:53和54分别是10Fn3多肽野生型和经过修饰的支架区片段。如图所示，BC环区集群(SEQ ID NO:58)和两个所测试的支架区肽片段(SEQ ID NOs:53和54)是大多数被测试的HLA等位蛋白的强结合子(<25μM)。支架区肽片段(SEQ ID NOs:53和54)的预测的免疫显性(immunodominant)区用下划线标示。
图5：Notch1:鼠DLL4竞争测定结果，显示通过Biacore分析确定，SEQID NOs:3和4的WS-LI1结合子能够100％抑制Notch1与鼠DLL4之间的相互作用，SEQ ID NO:5的WS-LI1结合子能够抑制75％。
图6：大小排阻色谱结果，显示SEQ ID NO:3的WS-LI1结合子主要是单体，而SEQ ID NOs:4和5的WS-LI1结合子则含有单体和聚集蛋白的混合物。粗线轨迹对应于被测试的WS-LI1结合子，而非粗线轨迹对应于分子量标记，WS-LI1结合子单体的预期在第3和第5标记峰之间洗脱。
图7：大小排阻色谱结果，显示SEQ ID NOs:45-47的WS-LI1结合子主要是单体。粗线轨迹对应于被测试的WS-LI1结合子，而非粗线轨迹对应于分子量标记，WS-LI1结合子单体预期在第3和第5标记峰之间洗脱。
图8：大小排阻色谱结果，显示SEQ ID NOs:48-49的WS-LI1结合子主要是单体。粗线轨迹对应于被测试的WS-LI1结合子，而非粗线轨迹对应于分子量标记，WS-LI1结合子单体预期在第3和第5标记峰之间洗脱。
图9(A-C)：非传统10Fn3结合子的文库设计。图9A显示的是BC环基本上或完全没有被修饰(即BC环的全部或大部分保持野生型序列)的文库设计。图9A所示文库的所有CD和FG环可以在大小上不同，特别是，SP1、WS2’、WS2’-CD、Front3和CD1-环的CD环的长度可以改变。Back3的FG环的大小也可以改变，CD1-环的前3个氨基酸(即VSD)可以被删除。图9B显示的是BC环N端的不同部分被保持为野生型的文库设计。图9C显示的是BC环和BC环两侧的β-链区的一个或两个均被修饰的文库设计。也可以通过将71位的苏氨酸保持恒定和/或将氨基酸1-7的长度保持恒定而构建文库NP-6。也可以通过将71位的苏氨酸保持恒定和/或将氨基酸1-7的长度保持恒定，和/或将BC环保持恒定，来构建文库NP4-5。在图9A-C的每一个中，全长野生型10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)显示在最上，氨基酸编号为1-101，并标示了环区和链区。野生型10Fn3结构域的下面是经典的北极文库(north pole library)设计(即BC、DE和FG环被修饰)。在经典北极文库设计之下显示的是非传统的文库设计。可以被取代修饰的位置用粗体加下划线指示，可以被取代、插入和/或删除修饰的区域用粗体加方框指示，非野生型氨基酸残基加有阴影。在图9B中，所有序列均是基于SEQ ID NO:1。在图9C中，WT10Fn3、经典NP、NP1、NE1、NP4-5、NP6-1、和NW2序列如SEQID NO:1所示；所有其余序列如SEQ ID NO:59所示。在图9A中，WT10Fn3、经典NP、WS1、WS2、WS3、LI-3(a)、WS-LI1、WS2’和WS2’-CD是基于SEQ ID NO:1；所有其余序列基于SEQ ID NO:59。所有文库还可以基于SEQID NO:6或SEQ ID NO:12，即分别缺少SEQ ID NO：1和59的氨基酸95-101。
图10：8个特异性结合人PXR配体结合结构域的10Fn3多肽(Adnectin-1至Adnectin-8)与亲本10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的序列比对。β链的位置用序列比对下方的箭头指示，相应氨基酸用粗体指示。Adnectin-3(SEQ ID NO:62)和-4(SEQ ID NO:63)对应于SEQ ID NOs:48和49，并具有一个额外的6xHis尾巴(SEQ ID NO:44)。Adnectin-1、-2、-5、-6、-7和-8(分别为SEQ IDNOs:70-72和13-15)分别对应于SEQ ID NO:64-69，并具有一个额外的6xHis尾巴(SEQ ID NO:44)。
图11：柱状图显示了(从左至右)玻连蛋白、纤连蛋白、非结合性对照adnectin(RGD被变为RGE)、以及三种不同与特异靶标结合但不含有RGD序列的10Fn3分子(分别为10Fn3A、B和C)与固定的整联蛋白αV-β3的结合程度。
图12：野生型人10Fn3(SEQ ID NO:6)(顶行)和WS4、WS5、WS6和WS7文库的10Fn3的氨基酸序列。用下划线粗体和方框标记的氨基酸可以通过取代、删除和添加而改变。用下划线标记的氨基酸可以通过取代改变。
详细说明
定义
“多肽”的意思是两个或多个氨基酸的任何序列，不考虑其长度、翻译后修饰或功能。“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文中可以互换使用。多肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，例如在美国专利No.6,559,126中描述的那些，本文援引并入其内容。多肽还可以通过多种标准化学方法中的任何一种进行修饰(例如氨基酸可以被保护基团修饰；羧基端氨基酸可以被变成末端酰胺基团；氨基端残基可以被基团修饰从而例如提高亲脂性；或者多肽可以被化学糖基化或被其它修饰，从而提高稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可以包括向多肽附接另一种结构，例如环状化合物或其它分子，也可以包括含有一个或多个构型改变的氨基酸(即R或S；或L或D)的多肽。
如本文中所使用的，10Fn3的“区域”是指人10Fn3结构域的环(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β-链(A、B、C、D、E、F和G)、N端(对应于SEQ IDNO:1的氨基酸残基1-7)、或C端(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基93-101)。
“北极环”是指人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的BC、DE和FG环中的任一个。
“南极环”是指人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的AB、CD和EF环中的任一个。
“支架区”是指人10Fn3结构域的任何非环区。支架区包括β-链A、B、C、D、E、F和G以及N端区(对应于SEQ ID NO:1的残基1-7的氨基酸)、和C端(对应于SEQ ID NO:1的残基93-101的氨基酸)。
本文中“百分比(％)氨基酸同一性”的定义为，在比对序列并在需要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后，同时不将任何保守取代看作序列同一性的一部分，在此条件下候选序列中与所选序列氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的进行的比对，可以使用本领域技术中的各种方法实现，例如使用公众可得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员能够确定用于比对的合适参数，包括在所比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。然而为了本文中的目的，％氨基酸同一性数值通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2如下文所述地获得。ALIGN-2序列比较计算程序由Genentech Inc.编写，并在美国版权局,Washington D.C.、20559,以用户文档存档(filed with user documentation)，其注册的美国版权登记号为No.TXU510087，并可以通过Genentech Inc.(South San Francisco、Calif)公共获得。ALIGN-2程序应当被编译用于在UNIX操作系统，优选地在digital UNIX V4.0D上使用。所有的序列比较参数由ALIGN-2程序设定，并不做改变。
为了本文的目的，给定氨基酸序列A与、和、相对于给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(该语句可以另行表述为，给定的氨基酸序列A与、和、或相对于给定氨基酸序列B具有或包含特定的％氨基酸序列同一性)，其计算如下：100乘以X/Y的分数，其中X是序列比对程序ALIGN-2在程序比对A和B之后打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而Y是B中氨基酸残基的总数。应当意识到，当氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B的％氨基酸序列同一性并不等同于B与A的％氨基酸序列同一性。
如本文中所使用的，如果满足如下条件，则认为多肽中的氨基酸残基“贡献于对靶的结合”：(1)基于实验确定的复合物三维结构，残基的侧链或主链的任何非氢原子被发现与结合靶标的任何原子的距离在之内，和/或(2)将残基突变成其在野生型10Fn3(例如SEQ ID NO:1或6)中的等价物，突变成丙氨酸，或突变成与所述残基具有相似大小或更小的侧链的残基，导致与靶标的平衡解离常数发生可测量的增加(例如kon增加)。
多肽的“半衰期”可以一般地定义为，由于例如多肽的降解和/或多肽通过自然机制被清除或隔离，导致多肽的血清浓度在体内降低50％所需的时间。半衰期可以通过任何本身已知的方法加以确定，例如药代动力学分析。合适的技术是本领域技术人员显而易见的，并且一般地涉及例如如下步骤：向灵长动物施加合适剂量的多肽；以规则的时间间隔从所述灵长动物收集血液样品或其它样品；确定所述血液样品中多肽的水平或浓度；和从所得数据(的图)计算与施用时的初始水平相比多肽的水平或浓度降低50％所需的时间。用于确定半衰期的方法可以在例如如下文献中找到：Kenneth等、ChemicalStability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(1986)；Peters等、Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(1996)；和"Pharmacokinetics"、M Gibaldi和D Perron、Marcel Dekker出版、第二次修改版本(1982)。
半衰期可以用参数表示，例如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)。在本说明书中，“半衰期增加”是指这些参数中任何一个增加，这些参数中的任何两个增加，或这三个参数增加。在某些实施方案中，半衰期增加是指t1/2-β增加，同时伴随或不伴随t1/2-α和/或AUC或两者的增加。
概览
10Fn3结构域是抗体特别是抗体可变区的结构和功能类似物。在历史上，10Fn3结合结构域的设计依赖于10Fn3结构域结构与抗体VH结构域结构的相似性。特别是，10Fn3结合结构域传统上依赖于10Fn3结构域CDR样环的氨基酸序列的修饰。10Fn3结构域AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的每一个都与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)相似，因为它们有柔性并且易于对其氨基酸序列进行修饰，而不会改变10Fn3结构域的整体结构。而且已经显示，对沿着10Fn3结构域一个表面的CDR样环组(即“北极环”)的修饰容许开发出可以结合期望靶标的10Fn3结构域(见例如PCT公开WO02/032925、WO2008/097497、和WO2008/066752)。在这些传统的10Fn3支架设计中，环之间的蛋白序列，即β-链，通常不被修饰或者仅有很少的修饰，因为它们在保持10Fn3的整体结构构象中发挥作用。我们现在惊讶地发现，有可能以非传统的方式对10Fn3结构域进行修饰，从而产生可以结合期望靶标同时保持合适稳定性的蛋白质。
特别地，本申请提供了基于纤连蛋白的支架多肽，其包含经过修饰的环和支架区的新组合，并与改善的性质相关。本文中所述的基于纤连蛋白的支架蛋白包括一个或多个人第十III型纤连蛋白结构域，其已被修饰从而与一种或多种期望的靶标结合。本申请部分地涉及如下令人惊讶的发现，即纤连蛋白结构域环和/或支架区的修饰的新组合与特异的靶结合相关。特别地，已经发现，基于纤连蛋白的支架蛋白中的新支架区(例如非环区)修饰可以与特定的环修饰组合，以获得特异的靶结合。这样的新支架设计拓展了设计基于10Fn3的结合蛋白的潜力。例如，本文中所述的非传统支架设计通过开放10Fn3结构域中的新区域以供序列修饰，为创建具有更大多样性的文库提供了可能。此外，利用非传统支架设计可以产生与传统CDR样环界面提供的界面几何形状相比替代性的表面界面几何形状。这些非传统结合子提供的额外的多样性和备选的表面几何结构可能有助于开发具有期望性质的10Fn3结合结构域，例如通过提供对给定靶标具有更高的亲和力的10Fn3结合结构域，或者通过提供结合给定靶标上的不同表位的10Fn3结合结构域。
本申请还描述了具有降低的免疫原性的新型基于纤连蛋白的支架多肽。如本文中的实施例所述，已经发现，基于强HLA结合活性，β-链B/BC环/β-链C区可能是免疫原性“热点”。特别地，该区域似乎充当HLA结合的强锚定序列。实施例还显示，β-链B/BC环/β-链C区的野生型序列被灵长动物宿主识别为自身抗原。因此，尽管具有强HLA结合，但是没有产生对野生型序列的免疫应答。因此，我们开发了备选的10Fn3支架，其中β-链B/BC环/β-链C区内的关键区域被保留为野生型，同时对该序列其它区域的修饰允许高亲和性靶结合。这些备选的结合子将会有更大的机会产生具有高亲和力，并避免在宿主生物体中发生不良免疫应答的10Fn3结合结构域，因为β-链B/BC环/β-链C区的免疫原性热点没有改变，故其应会被宿主生物体识别为自身抗原。本申请还提供了备选的10Fn3结合结构域，其中β-链B/BC环/β-链C区中的HLA锚定序列已被破坏，其应当会降低该区域的免疫原潜能。这些除去了锚定序列的10Fn3结合结构域应当允许对全部或部分BC环多样化，同时仍然避免发生与此区域相关的不良免疫应答。HLA锚定序列的除去或破坏可以通过修饰β-链B/BC环/β-链C区中的关键残基，结合对BC环区进行修饰来实现。具有被降低的免疫原潜力的非传统10Fn3结合结构域的实例在下面进一步描述。
本文中所述的新型基于纤连蛋白的支架多肽可以加以设计而结合任何感兴趣的靶标。在示例实施方案中，靶标是抗原，多肽或感兴趣的治疗性蛋白靶标。期望的治疗性靶标实例包括，例如，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、δ样蛋白4(DLL4)、白细胞介素17(IL-17)和孕烷X受体(PXP)。
基于纤连蛋白的支架
A.一般结构
Fn3是指纤连蛋白的3型结构域。Fn3结构域小、单体、可溶并且稳定。它缺少二硫键，因此在还原条件下稳定。Fn3的整体结构类似于免疫球蛋白折叠。Fn3结构域包括，按照从N端到C端顺序，β或β样链A；AB环；β或β样链B；BC环；β或β样链C；CD环；β或β样链D；DE环；β或β样链E；EF环；β或β样链F；FG环；和β或β样链G。7个反平行β-链排列成2个β折叠片，它们形成一个稳定核心，同时产生两个由连接β或β样链的环构成的“面”。AB、CD和EF环位于一个面上(“南极”)，BC、DE和FG环位于相对面上(“北极”)。AB、BC、CD、DE、EF和FG环的任一个或全部可参与配体结合。在人纤连蛋白中有至少15种不同的Fn3模组(module)，虽然模组之间的序列相似度较低，但是它们在四级结构上均具有高度相似性。
在示例实施方案中，本文中所述的配体结合支架蛋白是基于第十3型纤连蛋白结构域，即Fn3的第十模组(10Fn3)。天然存在的人10Fn3的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中给出：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:1)(AB、CD和EF环用下划线标出；BC、FG和DE环用粗体强调；β-链位于每两个环区之间；N端和C端区域用斜体显示)。SEQ ID NO:1是包含尾巴，即氨基酸95-101，的10Fn3分子的序列。SEQ ID NO:6是不包含尾巴、并且由SEQ ID NO:1的氨基酸1-94构成的野生型人10Fn3分子的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1中参与形成疏水核心的残基(“核心氨基酸残基”)包括对应于SEQ ID NO:1或6的如下氨基酸的氨基酸：L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90和Y92，其中核心氨基酸残基用单字母氨基酸符号和其后的其在SEQID NO:1中的位置来表示。见例如Dickinson et al.、J.Mol.Biol.236:1079-1092(1994)。在一些实施方案中，使用参与形成疏水核心的残基来界定多肽环区的边界。例如，AB环可以定义为β-链A疏水核心残基A13与β-链B疏水核心残基L18之间的一段氨基酸。见图1。在一些实施方案中，疏水核心氨基酸与野生型序列相比没有被修饰。在其它实施方案中，如下的疏水氨基酸可以突变：A13，其是β-凸起(bulge)的一部分，并可以转变成表面残基；Y32和A74，它们中的一个或两个能够改变，从而与相邻环发生不同的相互作用；I88，其是部分暴露于溶剂的，并且相应位置并不总是天然III型纤连蛋白结构域的疏水残基；和Y92，其与C端尾巴相连，并且在C端区发生多样化时可以被多样化。
在一些实施方案中，AB环对应于SEQ ID NO:1的残基14-17，BC环对应于残基23-31，CD环对应于残基37-47，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基63-67，FG环对应于残基75-87。BC、DE和FG环沿着分子的一个面排列，即“北极”，AB、CD和EF环沿着分子的相对面排列，即“南极”。在SEQ ID NO:1中，β-链A对应于残基8-13，β-链B对应于残基17-22，β-链C对应于残基32-36，β-链D对应于残基48-50，β-链E对应于残基57-62，β-链F对应于残基68-74，β-链G对应于残基88-92。各β-链通过相应的环彼此相连，例如链A和B通过AB环相连，构成β-链A、AB环和β-链B的队形，诸如此类。N端和/或C端区(上面斜体标示)可以被除去或者改变，从而产生保留生物活性并包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分子。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的最先8个氨基酸残基和/或SEQ IDNO:1的最后7个氨基酸残基(即SEQ ID NO:1的氨基酸残基95-101)可以被除去或改变，从而产生包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽(相当于SEQ ID NO:1没有7个N端氨基酸，由SEQ ID NO:1的氨基酸1-94构成)。本文中所述的文库可以包含SEQ ID NO:1中提出的N或C端区。在某些实施方案中，文库包含N端区域，但不包含C端区域(即它们是基于SEQ ID NO:6)。
如上所述，对应于SEQ ID NO:1的残基14-17、23-31、37-47、51-56、63-67和75-87的氨基酸残基分别界定了AB、BC、CD、DE、EF和FG环。然而应当理解，为了获得对期望靶标具有强亲和力的10Fn3结合结构域，并非环区内的每一个残基均需要被修饰。例如，在一些实施方案中，只有对应于CD环的氨基酸39-45和FG环的氨基酸77-87的残基被修饰，从而产生高亲和力10Fn3结合子(见例如具有SEQ ID NO:3、4或5的氨基酸序列的鼠DLL4结合核心，和具有SEQ ID NO:45、46或47的氨基酸序列的鼠IL-17结合核心)。
此外，还可以在环区中进行插入和缺失，同时仍然产生高亲和力10Fn3结合结构域。例如，具有SEQ ID NO:3的鼠DLL4结合子的CD环具有与野生型10Fn3结构域CD环相同的长度，即SEQ ID NO:1的7个氨基酸39-45被SEQ ID NO:3的7个残基41-47代替。与之相对，具有SEQ ID NO:3的鼠DLL4结合子的FG环的长度比野生型10Fn3结构域的FG环更长，即SEQID NO:1的9个氨基酸77-85被SEQ ID NO:3的19个残基79-98代替。
因此，在一些实施方案中，与野生型人10Fn3的相应环相比，选自AB、BC、CD、DE、EF和FG中的一个或多个环的长度可以被延长或缩短。在任何给定的多肽中，一个或多个环的长度可以被延长，一个或多个环的长度可以被缩短，或它们的组合。在一些实施方案中，给定环的长度可以被延长2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15个氨基酸。在一些实施方案中，给定环的长度可以被缩短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5个氨基酸。特别地，10Fn3的FG环长度为13个残基，而抗体重链的相应环长度为4-28个残基不等。因此，为了优化依赖FG进行靶结合的多肽的抗原结合，可以改变10Fn3的FG环的长度和序列，以便获得靶结合中最大的可能灵活性和亲和性。
在一些实施方案中，整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:1或6的氨基酸78-80)中的一个或多个残基可以被取代，以破坏整联蛋白的结合。在一些实施方案中，本文中提供的多肽的FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。在一个实施方案中，RGD序列被极性氨基酸-中心氨基酸-酸性氨基酸序列(从N端到C端方向)取代。在另一个实施方案中，RGD序列被SGE取代。在另外一个实施方案中，RGD序列被RGE取代。
在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含与具有SEQ ID NO:1、2、60或6的氨基酸序列的人10Fn3结构域具有至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％同一性的10Fn3结构域。在某些实施方案中，本文中提供的多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1、2、60或6)的氨基酸序列具有至少50％同一性。在其它实施方案中，多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1、2、60或6)的氨基酸序列具有至少65％同一性。在某些实施方案中，一个或多个环相对于野生型序列相应环的序列不会被修饰，和/或一个或多个β-链相对于野生型序列相应β-链的序列不会被修饰。在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白中的10Fn3结构域的每一个β或β样链可以包含、基本上组成为、或组成为与SEQ ID NO:1或6的相应β或β样链序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。优选地，β链区中的变化不会干扰多肽在生理条件下的稳定性。在示例实施方案中，10Fn3域结合期望靶标的Kd值小于500nM、100nM、50nM、1nM、500pM、100pM或更小。在一些实施方案中，纤连蛋白基蛋白支架的10Fn3结构域结合期望靶标的Kd值为1pM-1μM、100pM-500nM、1nM-500nM、或1nM-100nM。在示例实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白特异性结合不与野生型10Fn3结构域，特别是野生型人10Fn3结构域结合的靶标。
在一些实施方案中，本公开提供了包含10Fn3结构域的多肽，其中该10Fn3结构域包含AB环、BC环、CD环、DE环、EF环和FG环，并且相对于SEQID NO:1的人10Fn3结构域的相应环的序列，从AB、BC、CD、DE、EF和FG环中选出的至少一个环具有改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，BC、DE和FG环被改变。在其它实施方案中，CD和FG环被改变。在其它实施方案中，CD、DE和EF环被改变。在其它实施方案中，EF和FG环被改变。在其它实施方案中，AB、CD和EF环被改变。在其它实施方案中，FG环是唯一一个被改变的环。在其它实施方案中，CD和FG环均被改变。在其它实施方案中，CD和EF环被改变。在一些实施方案中，一个或多个特定的支架变化与一个或多个环变化相组合。“(被)改变”的意思是，与模板序列(即相应的野生型人纤连蛋白结构域)相比，一个或多个氨基酸序列发生变化，并且包括氨基酸添加、缺失和取代。
在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含具有与SEQ ID NO:1或6的非环区有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列的10Fn3结构域，其中选自AB、BC、CD、DE、EF和FG的至少一个环被改变。例如，在某些实施方案中，AB环可以具有最多4个氨基酸取代，最多10个氨基酸插入，最多3个氨基酸缺失，或其组合；BC环可以具有最多10个氨基酸取代，最多4个氨基酸缺失，最多10个氨基酸插入，或其组合；CD环可以具有最多6个氨基酸取代，最多10个氨基酸插入，最多4个氨基酸缺失，或其组合；DE环可以具有最多6个氨基酸取代，最多4个氨基酸缺失，最多13个氨基酸插入，或其组合；EF环可以具有最多5个氨基酸取代，最多10个氨基酸插入，最多3个氨基酸缺失，或其组合；和/或FG环可以具有最多12个氨基酸取代，最多11个氨基酸缺失，最多25个氨基酸插入，或其组合。
在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含由如下序列一般性地限定的10Fn3结构域：
VSDVPRDLEVVAA(X)u LLISW(X)v YRITY(X)w FTV(X)x ATISGL(X)y YT ITVYA(X)z ISINYRT(SEQ ID NO:22)
在SEQ ID NO:22中，AB环用(X)u代表，BC环用(X)v代表，CD环用(X)w代表，DE环用(X)x代表，EF环用(X)y代表，FG环用(X)z代表。X代表任何氨基酸，X后面的脚标代表氨基酸数目的整数。特别地，u、v、w、x、y和z每一个可以独立地是2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸。相对于SEQ ID NO:22中的相应氨基酸，β链(加有下划线的序列在全部7个支架区中可以具有0-10、0-8、0-6、0-6、0-4、0-3、或0-1个取代、缺失或添加。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:22中的相应氨基酸，β的序列在全部7个支架区中可以具有0-10、0-8、0-6、0-6、0-4、0-3、或0-1个保守取代。在某些实施方案中，疏水核心氨基酸残(上面SEQ ID NO:22中的粗体残基)是固定的，而任何取代、保守取代、缺失或添加发生在疏水核心氨基酸残基之外的残基。在一些实施方案中，本文中提供的多肽的疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)没有被修饰。
B.支架区修饰
10Fn3的非环序列，即“支架区”，可以被改变，只要10Fn3结构域仍保持靶标结合功能和/或结构稳定性即可。在一些实施方案中，Asp7、Glu9、和Asp23中的一个或多个被其它氨基酸，例如非负电荷氨基酸残基(例如Asn、Lys等)代替。这些突变已经被报道具有相对于野生型提高突变体10Fn3在中性pH下的稳定性的作用(见PCT公开No.WO02/04523)。许多其他有利的或中性的10Fn3支架改变已经被公开。见例如Batori et al.、Protein Eng.200215(12):1015-20；Koide et al.、Biochemistry200140(34):10326-33。
10Fn3的支架区，例如β-链或N端和C端，可以被修饰以提高多肽与期望靶标的结合或降低免疫原性。在一些实施方案中，参与形成疏水核心的残基，即对应于SEQ ID NO:1或6的L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90和Y92残基的残基，不被突变。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或6所示的氨基酸序列中存在的相应氨基酸，对应于10Fn3多肽支架区残基1-7、9-15、19、21、33、35、36、49、58、60、61、69、7173、88、89和91-101的残基的任何一个残基或任何残基的组合被突变成不同的氨基酸。
在一些实施方案中，可以对多肽的支架区进行突变，但要排除下列特定突变中的一个或多个：V1A；S2P；S2T；D3G；D3S；P5S；R6G；R6S；D7G；D7K；L8P；L8Q；E9D；E9K；E9R；E9V；V10A；V10I；A12D；A12E；A12V；L18E；L18I；L18P；L18Q；L18R；L19Q；S21C；S21G；S21N；R29G；R29S；R29Y；Y31H；Y32F；R33G；I34T；I34V；T35A；T35F；T35I；Y36H；F48L；F48S；T49A；T49I；V50A；V50E；V50M；A57缺失；T58A；T58I；T58缺失；I59V I59缺失；S60G；S60N；S60R；G61C；G61R；L62R；D67G；D67K；D67N；Y68A；Y68D；T69I；I70N；I70S；I70V；T71A；V72A；V72G；Y73C；Y73H；A74G；A74T；I88S；I88T；I88V；S89P；I90F；I90T；I90V；N91D；N91S；N91T；Y92C；Y92H；Y92L；Y92R；Y92缺失；R93Q；R93T和T94A。在某些实施方案中，在BC、DE和FG环被修饰的10Fn3结构域的语境下，这些特定的支架突变被排除。
在一些实施方案中，可以对多肽的支架区进行突变，但是排除以下突变组合：
·L18R、S21C和S60G；
·E9D、L18R、V50E和T56I；
·L18R、T49I和N91D；
·F48S和T71A；
·P5S、V10A、S60G和S89P；
·L18R和Y92C；
·L18R和F48S；
·L18R和V72A；
·L18Q、R33G和F48S；
·Y68D和Y92H；
·R6S、L62R和N91S；
·L8P、E9V、I34V、T71A和Y92缺失；
·E9K、L18R和F48L；
·E9R、L18R、S60G和I70V；
·L18R、I88V和I90T；
·L18R、N91D和Y92C；
·L18R和I34T；
·L18R和G61C；
·Y32F、T71A和T94A；
·L18R、T58A、Y92L和R93T；
·V50M、T58A、S89P、I90F和Y92R；
·S2T、D7G、E9K、V10I、T58A、S60N和S89P；
·I59V、S60N和T94A；
·R6G、S21G、T35A、T58I和S60G；
·L18P、S21C、T58A、Y73H和Y92C；
·Y31H、R33G和G61R；
·A74G、R93Q和T94A
·S2P和T58I；
·T58I和I88T；
·T58I和I90T；
·G61R和A74T
·A57缺失、T58缺失和I59缺失
·R33G、T35I和V50M
·V1A、R33G和V50M
·R33G和V50M
·R33G、I34V和V50M
·D3G、L18I、R33G、V50M、Y73H和N91T
·R6G、T35F和V72A
·A12V、S21N和T35A
·S21G和T49A
·D3S和D7K
·A12V和L19Q
·A12D、L18I和L19Q
·A12E、L18I和L19Q
在某些实施方案中，在BC、DE和FG环被修饰的10Fn3结构域的语境下，这些特定的支架突变组合被排除。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1或6的位置21的位置处具有突变的多肽被排除，除非该位置的突变与对应于SEQ ID NO:1或6的位置1-7、19、31、49、58、60、73、75和89中的任何一个氨基酸位置的突变组合。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1的位置60的位置处具有突变的多肽被排除，除非该位置的突变与对应于SEQ ID NO:1或6的位置1-7、9-17、19、21、23-31、33、35、49、51-56、65-67、75-87和89中的任何一个氨基酸位置的突变组合。在一些实施方案中，在对应于SEQ IDNO:1或6的位置61的位置处具有突变的多肽被排除，除非该位置的突变与对应于SEQ ID NO:1或6的位置11、12、19、46、66-67、69和91的任何一个氨基酸位置的突变组合。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1或6的位置93或94的位置处具有突变的多肽被排除，除非这些位置中任一处的突变与对应于SEQ ID NO:1或6的位置1-7、9-14、65-67、89和91的任何一个氨基酸位置的突变组合。在某些实施方案中，这些排除适用于其中BC、DE和FG环被修饰的10Fn3结构域。
在某些实施方案中，10Fn3结构域的非环区可以被一个或多个保守取代所修饰。10Fn3结构域中多达5％、10％、20％或甚至30％或更多的氨基酸可以通过保守取代被改变，而不会显著改变10Fn3对配体的亲和力。在某些实施方案中，支架可以包含0-15、0-10、0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10个保守氨基酸取代。在示例实施方案中，支架修饰优选地使10Fn3结合子与配体的结合亲和力降低少于100倍、50倍、25倍、10倍、5倍或2倍。这样的变化有可能在体内改变10Fn3的免疫原性，且当免疫原性被降低时，这样的改变是期望的。如本文中所使用的，“保守取代”是用物理上或功能上相似的残基代替相应的参考残基。也就是说，保守取代和其参考残基具有相似的大小、性质、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力，等。优选的保守取代满足在Dayhoff et al.、Atlas of Protein Sequence and Structure5:345-352(1978&Supp.)中定义的可接受的点突变的标准。保守取代的实例包括如下组内的取代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
在一些实施方案中，10Fn3结构域包含具有本文中记载的任何文库设计，例如在图2、9和12(或其氨基酸1-94；SEQ ID NO:6)中提出的任何文库设计的氨基酸序列，并且在环和/或链中包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个额外取代、添加或缺失。在某些实施方案中，10Fn3结构域包含具有本文中记载的、例如在图2、9和12(或其氨基酸1-94；SEQ ID NO:6)中记载的任何文库设计的氨基酸序列，并且没有其它氨基酸修饰。包含具有本文中记载的、例如在图2、9和12(或其氨基酸1-94；SEQ ID NO:6)中记载的任何文库设计的氨基酸序列的10Fn3分子在被改变的位置处可以包含任何氨基酸，在某些情况下甚至包含野生型10Fn3分子的氨基酸。在某些实施方案中，包含具有本文中记载的、例如在图2、9和12(或其氨基酸1-94；SEQ IDNO:6)中记载的任何文库设计的氨基酸序列的10Fn3分子在每一个标示为“被改变”的位置(加有下划线或方框，并用粗体标记的那些)上仅包含非野生型氨基酸。
C.N和C端区
在一些实施方案中，本文中提供的多肽的N端和/或C端区氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应区域的氨基酸序列可以通过缺失、取代或插入被修饰。10Fn3结构域一般以SEQ ID NO:1的氨基酸编号1开始。然而，具有氨基酸缺失的结构域也包含在本发明之内。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的最先8个氨基酸(即残基1-8)和最后7个氨基酸(即残基95-101)缺失，生成具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的10Fn3结构域。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的最后7个氨基酸(即残基95-101)缺失，生成具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的10Fn3结构域。在具有SEQ IDNO:1、2、6、或60氨基酸序列的10Fn3结构域的N或C端也可以添加有额外的序列。例如，在一些实施方案中，N端延伸由选自下组的氨基酸序列构成：M、MG和G。
在某些实施方案中，在本文中提供的多肽中，SEQ ID NO:1或6的前1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应氨基酸序列可以被修饰或缺失。在示例的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1或6的氨基酸1-8的氨基酸被长度为1-20个、1-15个、1-10个、1-8个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个、或1个氨基酸的备选N端区所代替。备选N端区的实例包括(用单字母氨基酸编码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:9)和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:11)、或SEQ ID NO:9和11中任一个的N-端截短物。其它合适的备选N端区包括，例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO:16)、XnDVPRDL(SEQ ID NO:17)、XnVPRDL(SEQ ID NO:18)、XnPRDL(SEQ ID NO:19)、XnRDL(SEQ ID NO:20)、XnDL(SEQ ID NO:21)、或XnL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly。当Met-Gly序列被添加在10Fn3结构域的N端时，M通常会被切掉，在N端留下一个G。在其它实施方案中，备选的N端区包括MASTSG(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应氨基酸序列，本文提供的多肽中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸93-101、94-101、95-101、96-101、97-101、98-101、99-101、100-101、或101的氨基酸序列缺失或被修饰。在示例实施方案中，对应于SEQ ID NO:1氨基酸95-101的氨基酸被长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的备选C端区代替。备选C端区序列的具体实例包括，例如，包含、基本上组成为、或组成为EIEK(SEQ ID NO:7)、EGSGC(SEQID NO:23)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:24)、EIEKPSQ(SEQ ID NO:25)、EIEKP(SEQ ID NO:26)、EIEKPS(SEQ ID NO:27)、EIEKPC(SEQ ID NO:8)、或SEQ ID NO:44构成的多肽。在一些实施方案中，备选C端区包含EIDK(SEQID NO:29)，在特定的实施方案中，备选C端区是EIDKPCQ(SEQ ID NO:31)或EIDKPSQ(SEQ ID NO:30)。
在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含具有备选N端区序列和备选C端区序列二者的10Fn3结构域。
当本文中提到包含特定文库设计的分子，且该文库设计包含氨基酸1-101(SEQ ID NO:1)时，应当理解的是，包含氨基酸1-94(SEQ ID NO:6)、但不包含7个N端氨基酸和/或不包含C端氨基酸的该分子也涵盖在本文之内。
D.具有新的环与支架组合的蛋白质
如本文中所述，“补丁文库”是指这样的文库，其中支架蛋白表面上的某个区域被多样化。要进行多样化的残基可以通过这样的方式确定：挑取(picking)蛋白表面上的一个点(spot)，然后鉴定据其一定距离(例如)内的所有表面和环残基，并调节形状、序列连通性、保守性等。例如，为了产生以支架“西南(西南)”部分为中心的补丁文库，选择EF环中的最后一个氨基酸—Asp67，它大约位于SW侧面的中心。然后鉴定距离Asp67在范围内的所有残基，并从要多样化残基的列表中除去疏水核心残基，从而提供了总共14个供随机化的氨基酸，包括G37-G41、K63-D67、T69，和自N91开始的C端序列(残基位置根据具有SEQ ID NO:1或6的野生型人10Fn3结构域的序列进行编号)。然后可以在支架设计中引入其它多样化手段，例如，改变CD环的长度(以允许更大的形状变化)、或修饰或延伸N端区的序列。图2A-F和9A-C提供了可以加以突变从而产生代表性补丁文库的氨基酸残基的实例。图3A-F显示了10Fn3结构域肽的三维结构，例示了数个不同的界面，这些界面可以被靶定而产生代表性补丁文库。在一些实施方案中，10Fn3结构域多肽的氨基酸的多样化不是就环的定义而言，而是就它们在10Fn3结构表面上的物理定位而言。在一些实施方案中，一个有10-30个或更多个氨基酸的“补丁”被多样化，并被选用来形成一个大体上连续的表面，该表面可以是跨环和链的，或者可以是仅位于链残基上的。
1.北极环和南极环被修饰的结合子
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域具有：(i)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，在从BC、DE和FG环选出的至少一个北极环的氨基酸序列中含有修饰，和(ii)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，在从AB、CD和EF环选出的至少一个南极环的氨基酸序列中含有修饰。所述经修饰的北极环和南极环贡献于对相同靶标的结合。构想了经修饰的北极环与南极环的各种组合。例如，10Fn3可以包含一个经过修饰的北极环和一个经过修饰的南极环，一个经过修饰的北极环和两个经过修饰的南极环，两个经过修饰的北极环和一个经过修饰的南极环，两个经过修饰的北极环和两个经过修饰的南极环，三个经过修饰的北极环和一个经过修饰的南极环，等，其中每一个经过修饰的环均贡献于对相同靶标的结合。可以被修饰的北极环和南极环的组合的实例包括，例如，CD环(南极环)和FG环(北极环)，CD环(南极环)和DE环(北极环)，EF环(南极环)和FG环(北极环)，AB环(南极环)和FG环(北极环)，或DE环(北极环)和EF环(南极环)。另一个环组合实例是CD环(南极环)、DE环(北极环)和EF环(南极环)。再另外的环组合实例是DE环(北极环)和AB、CD和EF环(南极环)中的一个或多个。经过修饰的环可以在整个环中都有序列修饰，或者仅在环的一部分中有序列修饰。此外，一个或多个经过修饰的环可以具有插入或缺失，从而使环的长度与野生型序列的相应环的长度相比发生改变。在某些实施方案中，10Fn3结构域的其它区域(即除了北极环和南极环之外)，例如β-链、N端和/或C端区的序列，与野生型10Fn3结构域相比也可以被修饰，并且这些额外修饰也可以贡献于与靶标的结合。
有至少一个北极环和至少一个南极环被修饰的10Fn3设计实例包括，例如，图9A所示的WS1、WS2、WS3、WS2’、前1、前、后1、后2、WS-LI1、南前、和AG链设计，和图2C-2E所示的西侧、南前和AG链设计。
2.具有环和支架区修饰的结合子
本文中还提供了具有新型环和支架修饰组合的10Fn3结构域。特别地，本申请提供的多肽包含这样的10Fn3结构域，其包括(i)在环AB、BC、CD、DE、EF、或FG的至少一个中的氨基酸序列修饰，和(ii)在至少一个支架区中的氨基酸序列的修饰(即在至少一个β-链、N端区和/或C端区中的修饰)，其中经过修饰的环和经过修饰的支架区均贡献于对相同靶标的结合。在示例实施方案中，支架区修饰与环区中的修饰相邻，例如，如果AB环被修饰，则支架突变多位于在10Fn3结构域的线性序列中与AB环相邻的β-链A和/或β-链B中。在其它实施方案中，在10Fn3结构域的线性序列中彼此相邻的环和支架区内可发现成簇的修饰。例如，例如，同时具有环和支架修饰的10Fn3结合子，可以在10Fn3结构域的线性序列中彼此相邻的环和支架区的如下组合中具有氨基酸修饰簇：β-链/环/β-链、环/β-链/环、环/β-链/环/β-链、末端区/β-链/环、或环/β-链/末端区，等。例如，具有新型环和支架修饰组合的10Fn3结构域可以具有成簇的修饰，从而与野生型相比，在由20个连续氨基酸构成的区段(stretch)中有至少15个氨基酸被修饰。在其它实施方案中，与野生型10Fn3结构域在相应氨基酸区段上的序列相比，在一段连续区段中，20个残基中的至少17个，20个中的至少18个，25个中的至少17个，25个中的至少20个，或30个残基中的至少25个被修饰。在某些实施方案中，给定的10Fn3结构域可以具有两个或三个成簇的修饰，它们被未经修饰的(即野生型)序列隔开。对于任何给定的被修饰区域(即环、β-链或末端区)，区域的全部或仅有一部分与野生型序列相比被修饰。当β-链区被修饰时，优选地疏水核心残基保持不被修饰(即野生型)，而β-链中的一个或多个非核心残基被修饰。环、β-链或末端区中的合适修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入，及其组合。
在至少一个环区和至少一个支架区具有修饰的10Fn3设计实例包括，例如，图9A所示的WS1、前1、前2、后1、后2、SP1、SP2、SP3、南前、AG链和西南设计，图9B所示的NW3设计，图9C所示的NP1、NE1、NP4-5、NP6-1和NW2设计，和图2A-2F所示的设计。
3.“西侧”结合子
在一些实施方案中，本申请提供的10Fn3结构域具有沿着分子“西侧”的结合面(见图3C)，并被称作“西侧结合子”或“WS结合子”。与SEQ ID NO:1或6中记载的相应CD和FG环序列相比，本文中所述的WS结合子包含的10Fn3结构域具有经过修饰的CD环和经过修饰的FG环。CD环和FG环均贡献于对相同靶标的结合。在某些实施方案中，WS结合子可在10Fn3结构域的一个或多个区域中包含额外的修饰。例如，WS结合子可以在与CD和/或FG环相邻的一个或多个β-链区中含有支架修饰。特别地，WS结合子可以在β-链C、β-链D、β-链F和/或β-链G的一个或多个中含有序列修饰。支架修饰的实例包括在对应于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置：33、35、49、69、71、73、89和/或91的一个或多个支架区位置处的修饰。WS结合子还可以在BC环，特别是在BC环的C端部分含有修饰。在一个实施方案中，BC环的最后两个残基(即对应于野生型10Fn3结构域中的氨基酸30和31)与野生型序列相比被修饰。额外的环和支架修饰的全部或部分可以和被修饰的CD和FG环一起贡献于对靶的结合。优选地，疏水核心残基与野生型序列相比不被修饰。
在某些实施方案中，WS结合子具有长为大约3-11个残基、4-9或5个残基的CD环；长为大约1-10个残基，例如6或5个残基的FG环；长为大约6-14、8-11或9个残基的C链；和/或长为大约9-11或10个残基的F链。β链C的位置31、33、35和37-39可以和野生型序列相比被改变。β链C的位置32、34和36可以是疏水残基。β链F的位置67、69、71和73可以和野生型序列相比被改变。β链F的位置68、70和72可以是疏水残基。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置30、31、32、33、34、35、36、37、38和/或39，例如位置31、33、35、37、38和/或39，如位置31和/或33含有氨基酸取代。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置44、45、46、47、48、49、50和/或51，例如位置44、45、47和/或49含有氨基酸取代。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置40、41、42、43、44和/或45含有氨基酸取代。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置67、68、69、70、71、72、73、74、75和/或76，例如位置67、69、71、73和/或76或位置71、73、75和/或76含有氨基酸取代。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置76、77、78、79、81、82、83、84、85和/或86，例如位置84和/或85含有氨基酸取代。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置85、86、87、88、89、90、91、92、93和/或94含有氨基酸取代。WS结合子可以在SEQ ID NO:1或6的位置31、33、47、49、73和/或75含有氨基酸取代。WS结合子可以包含含有4-9个被改变的氨基酸，例如非野生型氨基酸的C环；含有5-6个被改变的氨基酸，例如非野生型氨基酸的FG环；并且其中氨基酸31、33、35、37-39、67、69、71、73和76不是野生型。“不是野生型”的氨基酸是指与野生型人10Fn3分子(具有例如SEQ ID NO:1或6)的相同位置处出现的氨基酸不同的氨基酸。
10Fn3WS结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的WS1、WS2、WS3、WS2’、和WS-LI1设计，和图2C所示的设计(或其氨基酸1-94)。当提到具有基于包含氨基酸1-101的10Fn3序列的特定设计的10Fn3分子时，该表述意图包括那些在末端不含有“DK”和/或不包含N端7个氨基酸，并且对应于所示序列氨基酸1-94的分子。或者，当所示设计包含氨基酸1-94时，该表述意图包括具有N端7个氨基酸的相同设计，其可以没有“DK”序列。本文中描述了其它可以进行的修饰。
图12提供了WS结合子设计的实例。WS3，例如，对应于WS1，其中CD和FG环的长度可以被修饰，D67也可以被修饰。具有WS3设计的分子的一个实例是具有SEQ ID NO:49的PXR结合子。WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、和WS4的变异体包括在位置30、31、33、35、37、38、46、47、49、50、67、69、71、73、75、76、84、85、86、87、89或91具有野生型或突变氨基酸的那些。例如，WS结合子设计可以在CD环的氨基酸39-45中包含一个或多个氨基酸修饰，并在FG环的氨基酸77-83中包含一个或多个氨基酸修饰(WS-LI1设计)，并且其中具有该设计的10Fn3分子特异性结合一个靶分子(并且任选地不包含RGD序列)。WS结合子设计可以包含WS-LI1的设计并在环或链中具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25个额外氨基酸修饰。例如，WS结合子设计可以包含WS-LI1的设计，并在氨基酸位置37、38、46、47、75、76、和85-88等氨基酸位置具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25个额外的氨基酸修饰。可以包含的其它氨基酸修饰是在位置30、31、33、35、49、50、67、69、71、73、89和91的修饰。WS设计的一个实例可以包含WS7的氨基酸序列(图12)，其中环的长度可以和野生型10Fn3分子中环的长度不同，并且其中每个被改变的位置9(粗体且下划线)可以被修饰成任何其它氨基酸，或者在某些情况下，可以保持不修饰，只要具有这种设计的10Fn3分子可以特异性结合靶分子(并且任选地不包含RGD位点)即可。在某些实施方案中，10Fn3分子包含WS7的氨基酸序列，其中CD和FG环的长度可以被改变，其中没有其它的氨基酸可以被改变，并且其中被标示为“可变”(下划线且粗体标示)的氨基酸残基中正好有或者最多有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25个实际上没有改变，而是野生型人10Fn3分子相同位置处的氨基酸，即野生型氨基酸(SEQ ID NO:1或6)。例如，WS7中的氨基酸30、31、33、35、36、37、47、49、50、67、69、71、73、75和87中有一个或多个可以是野生型氨基酸，只要该WS结合子特异性结合其靶标即可。在某些实施方案中，具有WS7设计的WS结合子在除了所标明的氨基酸修饰之外不包含任何氨基酸修饰。在某些实施方案中，具有WS7设计的WS结合子除了所标明的氨基酸修饰之外，还包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或25个氨基酸修饰。
还提供了包含本文中所述任何一种WS结合子设计的文库。一个示例文库是如下的文库，其包含具有被改变的CD和FG环并进一步在位置30、31、33、47和49包含非野生型氨基酸的WS结合子。一个示例文库是如下的文库，其具有被改变的FG环并还在位置30、31、33、47和49包含非野生型氨基酸。
在某些实施方案中，设计序列的氨基酸至少或至多有10、20、30、40、50、或60个不被改变，例如不被取代改变。例如，一个或多个如下的氨基酸保持为野生型人10Fn3分子的氨基酸：位置1-29、32、34、36、48、51-66、68、70、72、88、90和92-101的氨基酸。
可特异性结合治疗性靶标的WS结合子的实例在实施例中有描述，并且包括例如具有SEQ ID NO:3-5、45-49、62-63、66、和72中任何一个的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，WS结合子包括WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6或WS7(或其氨基酸1-94)的氨基酸序列，并且在环和/或链中包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的取代、添加或缺失。在某些实施方案中，WS结合子包含WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6或WS7(或其氨基酸1-94)的氨基酸序列，并且没有其它的氨基酸修饰。包含WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6或WS7(或其氨基酸1-94)的氨基酸序列的WS结合子在被改变的位置处可以包含任何氨基酸，并且在一些情况下甚至包含野生型10Fn3分子的氨基酸。在某些实施方案中，包含WS1、WS2、WS3、WS2’、WS-LI1、WS4、WS5、WS6或WS7(或其氨基酸1-94)的氨基酸序列的WS结合子在每一个标示为“被改变”的位置(下划线和粗体)均包含非野生型氨基酸。
4.“前(Front)”结合子
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域在CD环、DE环，以及在某些情况下EF环中具有修饰，其中环修饰均贡献于对靶的结合。这些多肽在本文中被称作“前结合子”。前结合子可以额外地在一个或多个支架区包含修饰，特别是在位于被修饰环区的两侧或临近的支架区中。例如，与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列相比，前结合子可以在β-链C、β-链D和/或β-链E的一个或多个中含有支架修饰。优选地，疏水核心残基与野生型序列相比不被修饰。可存在于前结合子中的支架修饰的实例包括在对应于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置36、49、58和/或60的一个或多个位置处的修饰。这些支架修饰可以和被修饰的环一起贡献于对靶的结合。在某些实施方案中，前结合子可以包含跨越10Fn3结构域的数个环和链区的成簇的修饰。特别地，前结合子可以在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)残基36-66的氨基酸之间的31个残基中的至少15、20、24、25、或27个中含有修饰。环和/或链修饰可以包含氨基酸取代、缺失和/或插入，或其组合。在示例实施方案中，与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环相比，CD环的长度被延长或缩短。10Fn3前结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的前1和前2设计。
5.“后(Back)”结合子
在一些实施方案中，本文中提供的多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域在EF和FG环中具有修饰，其中环修饰贡献于对相同靶标的结合。这些多肽在本文中被称作“后结合子”。后结合子可以在其它环和/或支架区含有额外的修饰。例如，后结合子可以在AB环的至少一部分，优选地AB环的N端部分中含有修饰。在示例实施方案中，AB环的最先2个氨基酸(即对应于野生型10Fn3结构域的氨基酸残基14和15)相对于野生型序列被修饰。在某些实施方案中，后结合子还可以包含一个或多个支架修饰，特别是在与被修饰的环区相邻的一个或多个支架区中含有修饰。例如，后结合子可以在β-链A、β-链G、N端区和/或C端区的一个或多个中含有一个或多个修饰。优选地，疏水核心残基与野生型序列相比不被修饰。支架修饰的实例包括在对应于SEQ ID NO:1或6氨基酸位置1-7、9-13、89、91、93和/或94的一个或多个位置处含有修饰。所述额外的环和/或支架修饰中的一个或多个可以与被修饰的EF和FG环一起贡献于对靶的结合。合适的环和/或支架区修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其组合。在某些实施方案中，与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环相比，FG环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。
在某些实施方案中，后结合子可以在跨越10Fn3结构域的数个区域的连续区段中包含成簇的被修饰的氨基酸残基。例如，与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应残基相比，10Fn3结构域的最先15个氨基酸残基中的至少14个被修饰，和/或相对于野生型序列中的相应残基，对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)残基80-97(或94)的氨基酸之间的18个残基中有至少15个已被修饰。
10Fn3后结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的后1和后2设计。
6.“南极”结合子
在某些实施方案中，本申请提供包括10Fn3结构域的多肽，其中与野生型序列的相应残基的序列相比，10Fn3结构域在β-链A、AB环、β-链B、CD环、β-链E、EF环和β-链F的氨基酸序列中含有修饰。这些多肽在本文中被称作“南极结合子”或“SP结合子”。这些经过修饰的环和链贡献于对相同靶的结合。与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环相比，CD环的氨基酸序列的长度可以延长或缩短。与野生型序列的相应区域的序列相比，南极结合子可以在β-链G和/或C端区含有额外的修饰。在示例实施方案中，南极环可以在对应于野生型序列位置11、12、19、60、61、69、91、93和95-97的氨基酸处包含一个或多个修饰。10Fn3南极结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的SP1、SP2和SP3设计。
7.“西北(Northwest)”结合子
在一些实施方案中，本申请提供包含10Fn3结构域的多肽，所述10Fn3结构域与SEQ ID NO:1或6中记载的相应BC、DE和FG环序列相比，在BC、DE和FG环中具有修饰，并且在一个或多个β-链C、β-链D、β-链F和β-链G链残基中含有额外的修饰。这些β-链修饰和环区修饰一起贡献于对靶的结合。这些蛋白在本文中被称作“西北结合子”或“NW结合子”。在示例实施方案中，NW结合子在对应于SEQ ID NO:1或6支架区位置R33、T49、Y73和S89的任何一个氨基酸位置或其组合处含有一个或多个支架修饰。环和支架区中的合适修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其组合。在某些实施方案中，与野生型序列相比，BC、DE和FG环中的一个或多个的长度延长或长度缩短，或其组合。在一个实施方案中，与野生型序列(例如SEQ ID NO:1或6)相比，BC、DE和FG环的每一个的长度被延长或缩短，或其组合。在某些实施方案中，与野生型序列相比，只有BC环的一部分，特别是C端部分被修饰。例如，BC环中可以只有对应于野生型BC环氨基酸27-31的氨基酸残基被修饰，而BC环的其余部分(即对应于野生型环的残基23-26)保留不被修饰。
10Fn3NW结合子设计的实例包括，例如，图9B所示的NW3设计，图9C所示的NW2设计，和图2A所示的设计。图3描述了NW结合子的一个模型。
8.“东北(Northeast)”结合子
在一些实施方案中，本申请提供包含10Fn3结构域的多肽，所述10Fn3结构域具有经过修饰的BC、DE和FG环，并且在N端区、β-链A、β-链B和/或β-链E的任何一个或其组合中含有一个或多个额外的修饰。这些蛋白在本文中被称作“东北结合子”或“NE结合子”。在示例实施方案中，NE结合子在对应于野生型序列(SEQ ID NO:1或6)的支架区位置1-7、E9、L19、S21和/或T58的任何一个氨基酸或其组合处被修饰。经过修饰的环和支架区的组合贡献于对靶的结合。10Fn3NE结合子设计的实例包括，例如，图9C所示的NE1设计，和图2B所示的设计。图3B描述了NE结合子的一个模型。
9.“南前(South Front)”结合子
在一些实施方案中，本申请提供包含10Fn3结构域的多肽，所述10Fn3结构域在AB、CD、DE和EF环的一个或多个中具有修饰，并且在β-链B、β-链D和/或β-链E的一个或多个中具有额外的修饰。这些蛋白在本文中被称作“南前结合子”。经过修饰的环和支架区的组合贡献于对靶的结合。在示例实施方案中，南前结合子可以在对应于SEQ ID NO:1或6的支架区位置L19、T49、T58、S60、和/或G61的一个或多个氨基酸位置处被修饰，和/或在对应于SEQ ID NO:1或6的环区位置T14-S17、P51、T56、G40-E47、和/或K63-G65的一个或多个氨基酸位置处被修饰。在示例实施方案中，南前结合子的AB环、对应于野生型序列残基18和20的氨基酸之间，和/或CD环的长度可以被延长或缩短。10Fn3南前结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的南前设计，和图2D所示的设计。图3D描述了南前结合子的一个模型。
10.“AG”结合子
在一些实施方案中，本申请提供包含10Fn3结构域的多肽，所述10Fn3结构域与SEQ ID NO:1或6的相应链相比，具有经过修饰的β-链A和β-链G。这些蛋白在本文中被称作“AG结合子”或“AG链”结合子。在某些实施方案中，AB链结合子在10Fn3结构域的N端和C端部分包含成簇的修饰，而10Fn3的中间部分保持不被修饰。例如，AG链结合子可以在10Fn3结构域的最先19个氨基酸(即对应于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置1-19)中的16个处包含修饰，在10Fn3结构域的最后18个氨基酸(即对应于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置84-101)中的13-17个处包含修饰，或者在10Fn3结构域的最后22个氨基酸(即对应于SEQ ID NO:1或6的氨基酸位置80-101)中的14-18个处包含修饰。在示例实施方案中，AG结合子可以在对应于SEQ ID NO:1的位置1-7、9、11-17、19、84-89和91-97的一个或多个位置处包含修饰。优选地，AB结合子中被修饰的区域贡献于对相同靶的结合。10Fn3AG结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的AG链设计，和图2E所示的设计。图3E描述了AG结合子的一个模型。
11.“西南(西南)”结合子
在一些实施方案中，本申请提供包含10Fn3结构域的多肽，所述10Fn3结构域具有经过修饰的CD和EF环，并在对应于SEQ ID NO:1位置69或91-97中的任何一个残基或残基组合中具有额外的修饰。这些蛋白在本文中被称作“西南结合子”或“SW结合子”。经过修饰的环和支架区贡献于对靶的结合。10Fn3SW结合子设计的实例包括，例如，图9A所示的西南设计，和图2F所示的设计。图3F描述了SW结合子的一个模型。
E.具有降低的免疫原性的蛋白
在一些实施方案中，本文中提供的多肽有降低的免疫原性。如实施例中所述，10Fn3结构域BC环周围的区域似乎是免疫原性热点。因此，本申请提供了两个类型的具有降低的免疫原性的10Fn3设计。在第一个类型的设计中，BC环保持完全未被修饰或至少部分未被修饰，从而宿主(例如人类)免疫应答更可能将10Fn3结构域的BC区识别为自身，借此避免免疫应答。在第二个类型的设计中，10Fn3结构域BC环中的强HLA结合锚被除去或破坏，从而使BC区不会那么紧密地结合宿主HLA受体，藉此降低10Fn3结构域BC环区的免疫原潜力。下面对这些10Fn3设计进行进一步的描述。
在某些实施方案中，本申请提供了具有降低的免疫原性的多肽，其包含10Fn3结构域，其中整个BC环保留为野生型。优选地，这些多肽与在BC环具有修饰的等价多肽相比，具有更低的免疫原性。具有野生型BC环的多肽在10Fn3结构域的其它参与靶结合的区域中具有修饰。优选地，BC环之外的修饰不会导致在宿主体内产生针对10Fn3结构域的强免疫应答。整个BC环保留为野生型的10Fn3结合子的实例包括，例如，本文中所述的WS结合子、前结合子、后结合子、南极结合子、南前结合子、AG结合子和西南结合子。具有与野生型序列相比未被修饰的BC环的10Fn3设计的特定实例包括，例如，图9A所示的WS2、WS3、前1、前2、后1、后2、SP1、SP2、SP3、LI-3(a)、WS-LI1、LU-S9、南前、AG链和西南设计，和图2D-2F所示的设计。在具有野生型BC环的10Fn3结合子设计中，可能理想的是使β-链B和/或β-链C的全部或一部分，特别是与BC环相邻的β-链B和/或β-链C部分(即β-链B的C端部分和/或β-链C的N端部分)，与野生型序列相比保持不被修饰。在示例实施方案中，具有野生型BC环和降低的免疫原性的10Fn3结构域，在10Fn3的处于CD环的N端一侧的部分中可以不含任何修饰，即，N端区、β-链A、AB环、β-链B、BC环和β-链C相对于野生型序列全被保留不被修饰。
在某些实施方案中，本申请提供了具有降低的免疫原性的多肽，其包含10Fn3结构域，其中BC环的一部分被保留为野生型。优选地，这些多肽与在BC环的更大部分中具有修饰的等价多肽相比，具有更低的免疫原性。在示例实施方案中，BC环的N端部分被保留为野生型。例如，BC环的最先1、2、3、4、5、或6个残基可以被保留为野生型，而BC环的其余C端残基可以被修饰。在BC环N端区的至少一部分被保留为野生型的10Fn3设计中，可能理想的是使β-链B和/或β-链C的全部或部分，特别是β-链B和/或β-链C的与BC环相邻的部分(即β-链B的C端部分和/或β-链C的N端部分)，与野生型序列相比保持不被修饰。在示例实施方案中，在BC环的N端部分具有野生型序列和降低的免疫原性的10Fn3结构域在N端区、β-链A、AB环和β-链B中可以不具有任何修饰。在BC环的一部分为野生型的10Fn3设计中，BC环被修饰的部分可以和10Fn3结构域其它区域内的修饰一起贡献于对靶的结合。BC环N端部分保留为野生型的10Fn3结合子的实例包括，例如，图9B所示的10Fn3设计，图9A所示的WS1设计，和图2C所示的10Fn3设计。
在某些实施方案中，本申请提供了具有降低的免疫原性的多肽，其包含10Fn3结构域，其中β-链B/BC环/β-链C(“BC锚”)区中的强HLA锚已被除去或破坏(例如以相对于野生型序列降低对一种或多种HLA受体的结合亲和力的方式被修饰)。例如，可以通过在对应于SEQ ID NO:1或6的位置L19、S21、R33和/或T35的一个或多个位置处对10Fn3结构域进行修饰，而除去或破坏BC锚。当BC锚已被除去或破坏时，有可能修饰BC环的序列而不会显著增加BC区的免疫原潜力。因此，许多这样的10Fn3设计除了β-链B和/或β-链C中的修饰之外，在BC环中也有修饰。BC环可以贡献于对靶的结合，任选地与10Fn3结构域其它区域中的修饰一起贡献于对靶的结合。β-链B和/或β-链C中的修饰可以或者可以不贡献于对靶的结合。BC锚被除去或破坏的10Fn3结合子的实例包括，例如，图9C所示的10Fn3设计和图2B所示的10Fn3设计。
在某些实施方案中，本文中所述的多肽与具有SEQ ID NO:61的多肽相比具有降低的免疫原性，例如多肽的免疫原性比具有SEQ ID NO:61的多肽的免疫原性低。
本文中所述的多肽的免疫原性可以通过例如如下的一种或多种方法进行评估：人白细胞抗原(“HLA”)结合、HLA结合的计算机预测(in silicoprediction)(例如使用Epimatrix程序)、人T细胞的体外活化、体内动物免疫应答，或其它用于评估免疫原性潜力的方法。
在某些实施方案中，免疫原性可以通过HLA结合实验进行评估。优选地，本文中提供的多肽与一种或多种HLA受体结合的IC50小于或等于等价的HLA受体与野生型10Fn3结构域之间结合的IC50。例如，本文中提供的多肽可以以大于10μM、15μM、20μM、25μM、50μM、100μM、150μM或200μM的IC50与HLA受体结合。在一些实施方案中，多肽与HLA受体结合的IC50为10μM-1mM、100μM-1mM或500μM-1mM。用于评估多肽/HLAIC50结合的HLA等位体可以是DRB*0101、DRB*0301、DRB*0401、DRB*0701和/或DRB*1501中的一种或多种。
在一些实施方案中，免疫原性可以通过计算机分析，例如EpiMatrix，进行评估。在特定的实施方案中，本文中提供的多肽的EpiMatrix“Z”评分表得分(“Z”scale score)小于或等于野生型10Fn3结构域的得分。在某些实施方案中，本文中提供的多肽的EpiMatrix“Z”评分表得分不大于野生型10Fn3结构域得分的200％。在一些实施方案中，多肽的EpiMatrix得分在EpiMatrix“Z”评分表上小于1.64(An Z；2009；Therapeutic Monoclonal Antibodies:FromBench to Clinic；John Wiley and Sons；New Jersey；428-429页)。
在一些实施方案中，免疫原性可以通过体内动物免疫应答实验进行评估。例如，可以用本文中提供的多肽注射动物，例如小鼠或猴，并测量IgG和/或IgM免疫应答。优选地，本文中所述的多肽显示的IgG和/或IgM免疫应答不会超过在用野生型10Fn3结构域注射的小鼠或猴中观察到的免疫应答的200％、100％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％或1％。
本申请还提供了本文中所提供的多肽的文库和从文库中筛选可结合期望靶标的结合子的方法。与没有进行设计以避免与BC区相关的免疫原潜力的文库相比，从本文中提供的文库中有更高的可能性分离到具有可接受的免疫原性特征的靶结合分子。这些文库有助于减少对多肽候选物脱免疫(deimmunize)所需的劳动，并提高鉴定出非免疫原性的多肽分子的概率。
F.多价蛋白
在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个或更多个10Fn3结构域的多价蛋白。例如，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白可以包含2、3、或更多个共价缔合的10Fn3结构域。在示例实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白是包含两个10Fn3结构域的双特异性或二聚体蛋白。在某些实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白包含与第一靶分子结合的第一10Fn3结构域，和与第二靶分子结合的第二10Fn3结构域。所述第一和第二靶分子可以是相同或不同的靶分子。当第一和第二靶分子相同时，第一和第二10Fn3结构域可以结合相同的靶标，但结合于不同的表位。此外，当第一和第二靶分子相同时，10Fn3结构域中与靶结合相关的修饰区域可以是相同或不同的。而且，第一和第二10Fn3结构域可以基于相同或不同的支架设计。例如，多价的基于纤连蛋白的蛋白支架可以包含两个10Fn3结构域，其中两个10Fn3均是基于本文中所述的相同的非传统支架设计，其中一个10Fn3结构域基于第一类型的非传统支架设计而第二个10Fn3结构域基于第二种类型的非传统支架设计，或者一个10Fn3结构域基于一种非传统支架设计，而第二个基于传统的支架设计(即BC、DE和FG环被修饰)。
在示例实施方案中，多价的基于纤连蛋白的蛋白支架的每个10Fn3结构域与期望靶标的结合Kd小于500nM、100nM、50nM、1nM、500pM、100pM，或更低。在一些实施方案中，多价的基于纤连蛋白的蛋白支架的每个10Fn3结构域与期望靶标的结合Kd为1pM-1μM、100pM-500nM、1nM-500nM、或1nM-100nM。在示例实施方案中，多价的基于纤连蛋白的蛋白支架的每个10Fn3结构域特异性结合不与野生型10Fn3结构域，特别是野生型人10Fn3结构域结合的靶标。
多价的基于纤连蛋白的支架蛋白的10Fn3结构域可以通过多肽接头连接。示例多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。用于连接10Fn3结构域的合适接头是那些允许不同的结构域彼此独立折叠，从而形成允许与靶分子高亲和力结合的三维结构的接头。合适接头的特定实例包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头，基于甘氨酸-脯氨酸的接头，基于脯氨酸-丙氨酸的接头，以及具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的接头。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基，并且长度可以为8-50、10-30、和10-20个氨基酸。这些接头的实例包括SEQ ID NOs:39-43。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸，并且长度为3-30、10-30、和3-20个氨基酸。这些接头的实例包括SEQ ID NOs:33-35。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸，并且长度可以为3-30、10-30、3-20和6-18个氨基酸。这些接头的实例包括SEQ ID NO:36-38。在示例实施方案中，接头不含有任何Asp-Lys(DK)对。
药代动力学模块
在一个方面中，本申请提供的基于纤连蛋白的支架蛋白进一步包括药代动力学(PK)模块。药代动力学包括化合物被对象例如吸收、分布、代谢和排泄等的性质。药代动力学的改良可以根据预期的治疗需要进行评估。往往期望增加生物利用度和/或延长给药之间的时间，这可能可以通过延长蛋白在施用后在血清中保持可用的时间来实现。在一些情况下，期望提高蛋白的血清浓度随时间推移的连续性(例如降低在刚施用后和在下一次施用即将开始前的蛋白的血清浓度的差异)。基于纤连蛋白的支架蛋白可以附接于这样的模块，其可以将多肽在哺乳动物(例如小鼠、大鼠或人)体内的清除速率与未经修饰的多肽相比降低超过3倍。改良的药代动力学的其它度量包括血清半衰期，其通常被分成α相和β相。这两个相的一个或两个可以通过添加合适的模块而被显著改良。PK模块是指在与生物活性分子融合时会影响生物活性分子药代动力学性质的任何蛋白、肽、或模块。
趋向于减慢蛋白从血液中清除的PK模块包括聚氧化烯模块，例如聚乙二醇、糖(例如唾液酸)和耐受良好的蛋白模块(例如Fc、Fc片段、转铁蛋白或血清白蛋白)。基于纤连蛋白的支架蛋白可以和如美国公开No.20070048282中所述的白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变异体融合。在一些实施方案中，PK模块是血清白蛋白结合蛋白，例如美国公开Nos.2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。在一些实施方案中，PK模块是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如美国公开No.2007/0178082中描述的那些。
在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白可以附接包含非蛋白质聚合物的PK模块。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美国专利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。在示例实施方案中，聚合物是PEG模块。
PEG是一种众所周知的水溶聚合物，其可以商购或者根据本领域众所周知的方法(Sandler and Karo、Polymer Synthesis、Academic Press、New York、第3卷、138-161页)通过乙二醇的开环聚合加以制备。术语“PEG”被广义地使用，包括任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或PEG末端的修饰，并且可以用如下公式表示：X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH(1)，其中n是20-2300，X是H或末端修饰，例如C1-4烷基。在一个实施方案中，本发明PEG的一端用羟基或甲氧基封端，即X是H或CH3(“甲氧基PEG”)。PEG可以进一步含有结合反应必需的化学基团，这是该分子的化学合成的结果；或者其是用于在分子各部分间获得最佳距离的间隔子(spacer)。此外，这种PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链构成。具有超过一个PEG链的PEG被称作多臂或分支PEG。分支PEG可以通过例如向各种多元醇，包括甘油、季戊四醇和山梨醇，添加聚氧乙烯加以制备。例如，四臂的分支PEG可以用季戊四醇和氧化乙烯制备。分支PEG在例如欧洲公开申请No.473084A和美国专利No.5,932,462中有描述。一种形式的PEG包含藉由赖氨酸的伯氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardini、C.、et al.、Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
PEG与肽或蛋白的缀合一般包括PEG的活化和将活化的PEG中间产物直接与靶蛋白/肽偶联，或与接头偶联，而接头随后被活化并与靶蛋白/肽偶联(见Abuchowski、A.et al、J.Biol.Chem.、252、3571(1977)和J.Biol.Chem.、252、3582(1977)、Zalipsky、et al.、和Harris et.al.、in:Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications；(J.M.Harris ed.)PlenumPress:New York、1992；第21和22章)。应当注意，含有PEG分子的基于纤连蛋白的支架蛋白也被称作缀合蛋白，而缺少附接的PEG分子的蛋白可以称作是非缀合的。
所用PEG的大小将会取决于多种因素，包括基于纤连蛋白的支架蛋白的预期用途。优选较大的PEG以增加在体内、血液、非血液细胞外液体或组织内的半衰期。对于体内细胞活性，大约10-60kDa范围内PEG是优选的，小于大约100kDa的PEG，更优选地小于大约60kDa也是优选的，尽管也大于约100kDa的大小也可以使用。对于体内成像应用，可以使用较小的PEG，一般小于约20kDa，其不会像较大的PEG那样增加半衰期，从而允许更快的分布和较小的半衰期。可以选择多种分子量形式的PEG，例如从大约1,000道尔顿(Da)到100,000Da(n为20-2300)，用于缀合到基于纤连蛋白的支架蛋白上。PEG中重复单位“n”的数目是用道尔顿表述的近似分子量。优选地，活化的接头上PEG的总分子量适合于药用。因此，在一个实施方案中，PEG分子的分子量不超过100,000Da。例如，如果三个PEG分子与一个接头连接，其中每一个PEG分子具有12,000Da的相同分子量(每一个n为大约270)，那么接头上PEG的总分子量为大约36,000Da(总n为大约820)。附接在接头上的PEG的分子量也可以不同，例如接头上的三个分子中，2个PEG分子可以各为5,000Da(每一个的n为大约110)，而一个PEG分子可以是12,000Da(n为大约270)。在一些实施方案中，一个PEG模块与基于纤连蛋白的支架蛋白缀合。在一些实施方案中，PEG模块为大约20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些实施方案中，PEG模块为大约40KDa。
在一些实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白含有1、2或更多个PEG模块。在一个实施方案中，PEG模块与位于蛋白表面上和/或背离与靶配体接触的表面的氨基酸残基结合。在一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白中PEG的总或全分子量为大约3,000Da-60,000Da、或大约10,000Da-36,000Da。在一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白中的PEG是基本上线性的直链PEG。
本领域的技术人员可以根据PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白如何应用于治疗、期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的耐受、免疫原性和其它考虑，为PEG选择合适的分子量。关于PEG及其用于提高蛋白性质的应用的讨论，见N.V.Katre、Advanced Drug Delivery Reviews10:91-114(1993)。
在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白与具有如下公式的聚(乙二醇)模块共价连接：-CO-CH2)x-(OCH2CH2)m-OR，其中聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与结合多肽的一个氨基形成酰胺键；R是低级烷基；x为2或3；m为大约450-大约950；n和m的选择令缀合物减去结合多肽的分子量为大约10-40kDa。在一个实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白一个赖氨酸的ε-氨基是可及的(游离的)氨基。
在一个具体实施方案中，用PEG的碳酸酯形成PEG-基于纤连蛋白的支架蛋白偶联物。N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)可在与PEG的反应中使用，从而形成活化的混合PEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯，其随后可以和接头的亲核基团或基于纤连蛋白的支架蛋白的氨基反应(见美国专利No.5,281,698和美国专利No.5,932,462)。在一个相似类型的反应中，可以用1,1’-(苯并三唑基)碳酸酯(1,1’-(dibenzotriazolyl)carbonate)和二-(2-吡啶基)碳酸酯(di-(2-pyridyl)carbonate)和PEG反应，分别形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美国专利No.5,382,657)。
基于纤连蛋白的支架蛋白的PEG化能够根据代表本领域当前技术水平的方法实施，例如通过使基于纤连蛋白的支架蛋白与亲电子活性的PEG(供应商：Shearwater Corp.、USA，万维网shearwatercorp.com)反应。本发明优选的PEG试剂是，例如，N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯或有分支的N-羟基琥珀酰亚胺如mPEG2-NHS(Monfardini、C.、et al.、Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。这些方法可以用于在基于纤连蛋白的支架蛋白的赖氨酸ε-氨基处PEG化，或在基于纤连蛋白的脂蛋白的末端氨基处PEG化。
在另一个实施方案中，PEG分子可以和基于纤连蛋白的支架蛋白上的巯基偶联(Sartore、L.、et al.、Appl.Biochem.Biotechnol.、27、45(1991)；Morpurgoet al.、Biocon.Chem.、7、363-368(1996)；Goodson et al.、Bio/Technology(1990)8、343；美国专利No.5,766,897)。美国专利Nos.6,610,281和5,766,897描述了可以和巯基偶联的反应活性PEG种类的实例。
在一些实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白通过定点PEG化产生，特别地是通过将PEG缀合于半胱氨酸模块而产生。在某些实施方案中，Cys残基可以位于基于纤连蛋白的支架蛋白的N端，N端与最靠N端的β或β样链之间，C端，或C端与最靠C端的β或β样链之间。Cys残基也可以位于其他位置，特别是任何不参与靶结合的环或者位于多价的基于纤连蛋白的支架蛋白的两个结合结构域之间。PEG化基团还可以通过其它化学附接，包括通过与胺缀合。
在一些实施方案中，当PEG分子与基于纤连蛋白的支架蛋白上的半胱氨酸残基缀合时，半胱氨酸是基于纤连蛋白的支架蛋白自带的，而在其它实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基被工程化到基于纤连蛋白的支架蛋白中。可以在基于纤连蛋白的支架蛋白编码序列中引入突变，从而产生半胱氨酸残基。这可以通过，例如，将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变成半胱氨酸氨基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水氨基酸。优选地，要突变成半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。用于根据一级序列或蛋白预测残基的表面可及性的算法是本领域众所周知的。或者，考虑到设计基于纤连蛋白的支架蛋白所依据的第十fn3结构域的框架已经被解析(见Dickinson、et al.、J.Mol.Biol.236(4):1079-92(1994))，则可以通过比较基于纤连蛋白的支架蛋白的氨基酸序列预测表面残基，从而鉴定出表面暴露的残基。在一个实施方案中，半胱氨酸残基被引入到基于纤连蛋白的支架蛋白的N和/或C端或其附近，或者被引入到环区内。半胱氨酸残基的PEG化可以使用，例如，PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-邻二硫吡啶实施。
在一些实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白包含与N端氨基酸的α氨基共价连接的PEG分子。位点特异性N端还原胺化反应在Pepinsky et al.、(2001)JPET、297,1059、和美国专利No.5,824,784中有描述。在美国专利No.4,002,531，在Wieder et al.、(1979)J.Biol.Chem.254,12579，和在Chamow et al.、(1994)Bioconjugate Chem.5、133中描述了使用PEG-醛利用其它可得的亲核氨基对蛋白进行还原胺化反应。
在另一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白包含一个或多个附接于接头的PEG分子，而接头则附接在基于纤连蛋白的支架蛋白的N端氨基酸残基的α氨基上。这种方法在美国公开No.2002/0044921和PCT公开No.WO94/01451中有公开。
在一个实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白在C端被PEG化。在一个具体的实施方案中，通过引入C端叠氮基-甲硫氨酸并随后通过Staudinger反应进行甲基-PEG-三芳基膦化合物缀合，而使蛋白在C端被PEG化。该C端缀合方法在Cazalis et al.、C-Terminal Site-Specific PEGylation of a TruncatedThrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity、Bioconjug Chem.2004；15(5):1005-1009中有描述。
在示例实施方案中，如在下文进一步详述地那样对基于纤连蛋白的支架蛋白进行了C端尾巴区中的PGE化。在示例实施方案中，C端含有半胱氨酸残基，其被用作附接PEG基团的位点。示例C端尾巴包括，例如，具有SEQ ID NO:23、24或31中任一个的多肽。
PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白可以使用本领域已知的常规分离和纯化技术，例如大小排阻(例如凝胶过滤)和离子交换色谱，来进行纯化。还可以使用SDS-PAGE对产物进行分离。可以分离的产物包括单、二、三、多聚和非-PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白，以及游离的PEG。单-PEG偶联物的百分比可以通过汇集(pooling)洗脱峰周围更广泛的级分以增加单-PEG在组合物中的百分比来进行控制。大约90％的单-PEG偶联物代表一个产率和活性的良好平衡。例如其中至少92％或至少96％的偶联物是单-PEG物质的组合物是理想的。在本发明的一个实施方案中，单-PEG偶联物的百分比范围是90％-96％。
在本发明的一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白中的PEG在使用羟胺测定，例如450mM羟胺(pH6.5)在室温下8-16小时的条件时，不会从PEG化氨基酸残基上水解下来，因此是稳定的。在一个实施方案中，超过80％的组合物是稳定的单-PEG-基于纤连蛋白的支架蛋白，更优选地至少90％，最优选地至少95％。
在另一个实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白将会优选地保持未经修饰蛋白的至少大约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的生物活性。在一个实施方案中，生物活性是指其结合一种或多种靶分子的能力，用Kd、kon或koff评价。在一个具体的实施方案中，PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白与未PEG化的基于纤连蛋白的支架蛋白相比，与一种或多种靶分子的结合增强。
PEG修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的血清清除速率与未经修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的清除速率相比，可以降低大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或者甚至90％。与未经修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期相比，PEG修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期(t1/2)提高。与未经修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期相比，PEG修饰的基于纤连蛋白的支架蛋白的半衰期可以提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％or500％、或者甚至1000％。在一些实施方案中，蛋白半衰期在体外测定，例如在缓冲生理盐水溶液或血清中。在其它实施方案中，蛋白半衰期是体内半衰期，例如基于纤连蛋白的支架蛋白在动物的血清或其它体液中的半衰期。
核酸-蛋白融合技术
在一个方面中，本申请提供基于纤连蛋白的支架蛋白，该蛋白包含III型纤连蛋白结构域，其结合人类靶标，例如TNF-α、DLL4、IL-17、PXR或其它蛋白。一种快速制作和测试具有特定结合性质的Fn3结构域的方法是Adnexus，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb Company)，的核酸-蛋白融合技术。这种体外表达和标签化技术称作PROfusionTM，其利用核酸-蛋白融合(RNA-和DNA-蛋白融合)，可用于鉴定对与蛋白的结合重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白融合技术是一种使蛋白与其编码遗传信息共价偶联的技术。关于RNA-蛋白融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述见Szostak et al.、美国专利Nos.:6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公开Nos.WO00/34784；WO01/64942；WO02/032925；和Roberts and Szostak、Proc Natl.Acad.Sci.94:12297-12302、1997，本文援引并入这些文献的内容。
载体和多核苷酸实施方案
编码本文中所公开的各种基于纤连蛋白的支架蛋白中任何一种的核酸可以化学、酶学或重组合成。可以选择密码子用法，以提高在细胞内的表达。这些密码子用法会依赖于所选的细胞类型。已经为大肠杆菌(E.coli)和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发出了专用的密码子使用模式。见例如：Mayfield et al.、Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jan21；100(2):438-42；Sinclair et al.Protein Expr Purif.2002Oct；26(1):96-105；Connell ND.Curr Opin Biotechnol.2001Oct；12(5):446-9；Makrides et al.Microbiol Rev.1996Sep；60(3):512-38；和Sharp et al.Yeast.1991Oct；7(7):657-78。
用于核酸操作的一般技术在例如下列文献中有描述：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,第二版,1989,或F.Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience:New York,1987)及其定期更新，本文援引并入其内容。编码多肽的DNA与来自哺乳动物,病毒或昆虫基因的合适转录或翻译调节元件操作连接。这些调节元件包括转录启动子、控制翻译的任选操作子序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。此外还引入在宿主体内复制的能力(通常由复制原点提供)和便于转化子识别的筛选基因。
本文中所述的基于纤连蛋白的支架蛋白不仅可以直接重组产生，而且可以与异源多肽一起作为融合多肽产生，异源多肽优选地是信号序列或其它在成熟蛋白或多肽N端具有特异切割位点的多肽。所选择的异源信号序列优选地可被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)。对于不识别和加工天然信号序列的原核生物宿主细胞，信号序列可以用原核生物信号序列例如从碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的肠毒素II前导序列(leader)中选出的原核生物信号序列代替。为了进行酵母分泌，可以将天然信号序列替换为例如酵母转换酶前导序列、因子前导序列(factor leader)(包括酵母和克鲁维酵母α-因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、人白色念珠菌糖化酶前导序列或在PCT公开No.WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，如单纯疱疹病毒gD信号。这类前体区的DNA可以和编码蛋白的DNA合阅读框连接。
表达和克隆载体均含有能够使载体在一种或多种所选宿主细胞内复制的核酸序列。一般地，在克隆载体中，该序列是能够使载体独立于宿主染色体DNA复制、并包含复制原点或自主复制序列的序列。许多细菌、酵母和病毒的这些序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制原点适合于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒原点适合于酵母，各种病毒原点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)适合于在哺乳动物体内克隆载体。一般地，哺乳动物表达载体不需要复制原点组分(通常可仅使用SV40原点，因为它含有早期启动子)。
表达和克隆载体可以含有筛选基因，也称作可筛选标签。典型的筛选基因编码如下蛋白，其(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补偿营养缺陷型的缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养素，例如为芽孢杆菌编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
用于酵母的一种合适的筛选基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因(Stinchcomb et al.、Nature、282:39(1979))。trp1基因为不能在无色氨酸条件下生长的酵母突变菌株，例如ATCC No.44076或PEP4-1.Jones,Genetics,85:12(1977)提供了筛选标记。酵母宿主细胞基因组中存在的trp1缺陷提供了一个有效的环境，可通过在无色氨酸条件下生长对转化子进行筛选。类似地，Leu2-缺陷酵母菌株(ATCC20,622或38,626)可以被已知的携带Leu2基因的质粒补偿。
表达和克隆载体通常含有启动子，启动子可以被宿主生物体识别，并与编码基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸可操作连接。适合于原核生物宿主使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，例如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还可含有与编码基于纤连蛋白的支架蛋白的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
真核生物的启动子序列是已知的。实际上，所有真核生物基因在转录起始位点上游大约25-30个碱基处具有一个富含AT的区域。另一个在许多基因转录起始上游70-80个碱基处发现的序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核生物基因的3'端是AATAAA序列，其可能是用于向编码序列3'端添加多聚A尾巴的信号。所有这些基因都被合适地插入在真核生物表达载体中。
用于和酵母宿主使用的合适启动子的实例包括用于3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶的启动子，例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶，和葡萄糖激酶的启动子。
其它酵母启动子，其是具有可通过生长条件控制转录的额外优点的可诱导启动子，是如下酶的启动子区：乙醇脱氢酶2，异细胞色素C(isocytochromeC)，酸性磷酸酶，氮代谢相关降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。用于在酵母中表达的合适载体和启动子在EP专利公开No.73,657中有进一步的描述。酵母增强子也可有利地与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中从载体进行的转录可以用例如如下启动子进行控制，从病毒基因组，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎B病毒，最优选猿猴病毒40(SV40)获得的启动子；来自异源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；来自热休克启动，只要这些启动子与宿主细胞系统兼容即可。
SV40病毒的早期和晚期启动子被方便地用作SV40限制片段，其也含有SV40病毒复制原点。人巨细胞病毒的中早期启动子被方便地用作HindIIIE限制片段。在美国专利No.4,419,446中公开了一种使用牛乳头瘤病毒作为载体的,用于在哺乳动物宿主体内表达DNA的系统。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子控制下表达人β干扰素，另见Reyes etal.,Nature297:598-601(1982)。
经常通过在载体中插入增强子序列提高高等真核生物对编码基于纤连蛋白的支架蛋白的DNA的转录。现在已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制原点晚期侧(late side)(bp100-270)的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制原点晚期侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核细胞启动子，另见Yaniv，Nature297:17-18(1982)。增强子可以剪接(spliced into)到载体多肽编码序列的5'或3'侧的位置，但是优选地位于启动子5'位。
真核生物宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还含有用于终止转录或用于稳定mRNA所需的序列。这些序列通常可以从真核生物或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区获得，偶尔还可从3'非翻译区获得。这些区域在编码多肽的mRNA的非翻译区含有被转录为多聚腺苷酸片段的核苷酸片段。一个有用的转录终止组分是牛生长激素多聚腺苷酸区域。见WO94/11026及其中公开的表达载体。
重组DNA还可以包含任何类型的对基于纤连蛋白的支架蛋白蛋白的纯化有用的标签序列。蛋白标签的实例包括，但不仅限于，组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适克隆和表达载体可以在Cloning Vectors:A LaboratoryManual、(Elsevier、New York、1985)中找到，本文援引并入其相关公开内容。
使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入到宿主细胞中，这是本领域技术人员容易想到的。本领域已知有许多用于将核酸引入到宿主细胞内的方法，包括但不仅限于，电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂质体转染；和感染(其中载体是感染剂)。
合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。酵母，优选地来自酿酒酵母物种如酿酒酵母的酵母，也可用于生产多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也能够用于表达重组蛋白。Luckow和Summers，(Bio/Technology，6:47，1988)综述了用于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞实例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统表达重组蛋白，制备纯化的基于纤连蛋白的支架蛋白。对于许多应用，在大肠杆菌中表达小尺寸的基于纤连蛋白的支架蛋白是优选的表达方法。基于纤连蛋白的支架蛋白随后从培养基或细胞提取物中被纯化。
蛋白生产
用本文中所述的用于蛋白生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中进行培养，常规营养培养基可视需要进行改变以适合于诱导启动子、筛选转化体或扩增编码期望序列的基因。
用于生产基于纤连蛋白的支架蛋白的宿主细胞可以在各种培养基中培养。商品化的培养基，例如Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)、(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco's Modified Eagle'sMedium((DMEM)(Sigma))适合于培养宿主细胞。此外，在Ham et al.、Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.、Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利No.Re.30,985中描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以根据需要添加激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或相当的能量源。任何其它必需添加物也可以合适的浓度存在，其是本领域技术人员已知的。培养条件，例如温度、pH等，与先前用于筛选表达宿主细胞时所用的相同，并且是普通技术人员显而易见的。
本文中公开的基于纤连蛋白的支架蛋白还可以用无细胞翻译系统产生。为此目的，可以修饰编码基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸，使其能够在体外被转录产生mRNA，并允许在所用的特定无细胞系统(无真核生物如哺乳动物或酵母细胞的翻译系统或无原核生物如细菌细胞的翻译系统)中进行mRNA的无细胞翻译。
基于纤连蛋白的支架蛋白还可以通过化学合成来产生(例如通过SolidPhase Peptide Synthesis、第二版、1984、The Pierce Chemical公司、Rockford、IL中描述的方法)。基于纤连蛋白的支架蛋白的修饰也可以通过化学合成产生。
本文中公开的基于纤连蛋白的支架蛋白可以通过蛋白质化学领域公知的蛋白分离/纯化方法进行纯化。非限制性实例包括提取、重结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超过滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、逆流分布或这些的任意组合。纯化后，基于纤连蛋白的支架蛋白可以与不同的缓冲液交换，和/或通过本领域已知的多种方法中的任何方法(包括但不仅限于，过滤和透析)进行浓缩。
纯化的基于纤连蛋白的支架蛋白优选为至少85％纯，更优选地至少95％纯，最优选地至少98％纯。无论纯度的精确数值为何，基于纤连蛋白的支架蛋白的纯度足够用作药物产品。
示例用途
在一个方面中，本申请提供标记有可检测模块的基于纤连蛋白的支架蛋白。基于纤连蛋白的支架蛋白可以用于各种诊断应用。可检测模块可以是任何能够直接或间接产生可检测信号的模块。例如，可检测模块可以是放射性同位素，例如H3、C14、C13、P32、S35、或I131；荧光或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；或者酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
可以采用任何本领域已知的用于将蛋白与可检测模块缀合的方法，包括在下列文献中描述的方法：Hunter、et al.、Nature144:945(1962)；David、et al.、Biochemistry13:1014(1974)；Pain、et al.、J.Immunol.Meth.40:219(1981)；和Nygren、J.Histochem.and Cytochem.30:407(1982)。体外方法，包括本领域众所周知的缀合化学，包括与蛋白质相容的化学，例如用于特定氨基酸如Cys和Lys的化学。为了将可检测标签与基于纤连蛋白的支架蛋白连接，使用连接基团或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫基、硫酯基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团是二硫基和硫酯基，视应用而定。对于没有Cys氨基酸的多肽，可以在特定位置处引入Cys，以便使在蛋白具有活性的同时生成用于缀合的位点。
与可检测模块连接的基于纤连蛋白的支架蛋白可用于体外或体内成像。多肽可以和不透射线剂(radio-opaque agent)或放射性同位素连接，施用给受试者，优选地施用到血流中，并可以测定受试者体内被标记蛋白的存在和定位。例如，当基于纤连蛋白的支架蛋白与癌相关靶标结合时，该成像技术可以用于恶性肿瘤的分期和治疗。基于纤连蛋白的支架蛋白可以用任何可以在受试者内检测到(无论是通过核磁共振、放射学还是本领域已知的其它检测方法)的模块标记。
基于纤连蛋白的支架蛋白还可用作亲和纯化剂。在该过程中，使用本领域众所周知的方法将基于纤连蛋白的支架蛋白固定在合适的支持物上，例如Sephadex树脂或滤纸上。
基于纤连蛋白的支架蛋白可以在任何已知的测定方法中使用，例如竞争结合测定、直接和间接夹心式测定、和免疫沉淀测定(Zola、MonoclonalAntibodies:A Manual of Techniques、pp.147-158(CRC Press、Inc.、1987))。
在某些方面中，本公开提供了用于检测样品中靶分子的方法。该方法可以包括使样品与本文中所述的基于纤连蛋白的支架蛋白接触，其中所述接触在允许基于纤连蛋白的支架蛋白-靶复合物形成的条件下进行；和检测所述复合物，藉此检测所述样品中的所述靶标。检测可以使用本领域已知的任何技术，例如放射照相、免疫测定、荧光检测、质谱或表面等离子体共振来实施。样品经常是生物样品，例如组织活检，特别是肿瘤或疑似肿瘤的组织活检，在基于纤连蛋白的支架蛋白与癌症相关的靶标结合的情况下。样品可以来自人或其它哺乳动物。基于纤连蛋白的支架蛋白可以用标记模块，例如放射性模块、荧光模块、发色模块、化学发光模块或半抗原模块标记。基于纤连蛋白的支架蛋白可以被固定在固体支持物上。
在一个方面中，本申请提供可用于疾病的治疗的基于纤连蛋白的支架蛋白。可以治疗的疾病或病症将由基于纤连蛋白的支架蛋白的结合特异性决定。如本文中所述，基于纤连蛋白的支架蛋白可以被设计成与任何感兴趣的靶标结合。靶标实例包括，例如，TNF-α、DLL4、IL-17和PXR。仅仅作为举例，与TNF-α结合的基于纤连蛋白的支架蛋白可用于治疗自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病和哮喘；与IL-17结合的基于纤连蛋白的支架蛋白可用于治疗哮喘；和与DLL4结合的基于纤连蛋白的支架蛋白可用于治疗与不期望的血管新生有关的过度增殖疾病或病症，例如癌症或肿瘤。
本申请还提供了用于将基于纤连蛋白的支架蛋白施用给受试者的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白对哺乳动物，特别是人而言是可药用的。“可药用的”组合物是指这样的组合物，其施用给动物不会产生明显的不良医学结果。可药用的组合物的实例包括包含缺少整联蛋白结合结构域(RGD)的10Fn3结构域的组合物，和基本上没有内毒素或致热源或具有极低内毒素或致热源水平的组合物。
制剂和施用
本申请进一步提供了可药用的组合物，其包含本文中所述的基于纤连蛋白的支架蛋白，其中该组合物基本上没有内毒素和/或致热源。
包含基于纤连蛋白的支架蛋白的治疗性制剂通过将具有期望纯度水平的所述蛋白与任选的生理学上可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences16版、Osol、A.编辑(1980))混合制备，以水性溶液、冻干或其它干燥制剂的形式储存。可接受的载体、赋形剂和稳定剂在所用剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、醋酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯基(octadecyidimethylbenzyl)氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯类如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲基苯酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖，双糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的反离子，如钠；金属络合物(例如，锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的制剂还可以视需要含有超过一种活性化合物，用于治疗的特定适应证，优选地具有互补活性并且彼此没有不良影响的活性化合物。这些分子以可有效实现所预期目的的量适当地组合存在。
基于纤连蛋白的支架蛋白还可以包埋在通过例如凝聚(coacervation)技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基异丁烯酸)微胶囊，包含在胶状药物输送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包含在大乳状液中(macroemulsion)。这些技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版、Osol、A.编辑(1980)中有公开。
用于体内施用的制剂必须无菌。这可以通过过滤通过无菌滤膜容易地实现。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适实例包括含有本文中所述基于纤连蛋白的支架蛋白的固体疏水聚合物半渗透性基质，该基质呈成形制品(shaped article)的形式，例如薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-甘醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-甘醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和乳酸-甘醇酸共聚物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间较短。当被包埋的蛋白质长时间保持在体内时，它们可能由于暴露于37℃的湿气而变性或聚集，导致生物活性丧失以及可能的免疫原性改变。可以根据所涉及的机理设计出用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机理是由于巯基-二硫化物交换导致的分子内S-S键形成，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂和开发特定的聚合物机制组合物，来实现稳定化。
尽管技术人员会理解，每种基于纤连蛋白的支架蛋白的剂量取决于蛋白的同一性，但是优选的剂量范围是大约10mg/m2-大约2000mg/m2，更优选地，大约50mg/m2-大约1000mg/m2。
对于治疗性应用，基于纤连蛋白的支架蛋白以可药用的剂量形式施用给受试者。它们可以通过单次或在一段时间内连续输注静脉施用，通过肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内，口服，外用，或吸入途径。蛋白还可以通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径施用，发挥局部以及系统治疗效果。合适的可药用的载体、稀释剂、赋形剂是众所周知的，可以由本领域技术人员根据临床状况要求加以确定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)杜氏磷酸盐缓冲液，pH大约7.4，含有大约1mg/ml-25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％生理盐水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)葡萄糖(dextrose)。本发明的方法可以在体外、体内或离体实施。
可以实施基于纤连蛋白的支架蛋白和一种或多种额外治疗剂的施用，无论是共同施用还是序贯施用，如上文关于治疗性应用所述。技术人员会理解，用于共同施用的合适的可药用的载体、稀释剂和赋形剂取决于所共同施用的特定治疗剂的同一性。
当以水性剂型而非冻干状态存在时，基于纤连蛋白的支架蛋白通常以大约0.1mg/ml-10mg/ml的浓度配制，尽管这些范围之外的宽泛变化也是允许的。对于疾病的治疗，基于纤连蛋白的支架蛋白的合适剂量取决于所治疗的疾病类型，疾病的严重程度和进程，基于纤连蛋白的支架蛋白的施用是出于预防还是治疗目的，先前治疗的过程，患者的病史和对基于纤连蛋白的支架蛋白的应答，和主治医生的决定。基于纤连蛋白的支架蛋白可以一次性或通过一系列治疗适当地施用给患者。
基于纤连蛋白的支架蛋白还可以用作结晶伴侣(crystallizationchaperone)，形成蛋白与感兴趣化合物的结构。例如，特异性结合人孕烷X受体(PXR)的基于纤连蛋白的支架蛋白可以用作结晶伴侣，以方便化合物与PXR，例如PXR的配体结合结构域(LBD)一起结晶。本文中描述了数种可结合人PXR的10Fn3分子。
PXR活化会上调多种药物代谢酶，例如细胞色素P450酶和MDR1的细胞水平。CYP酶表达的提高会改变药物的药代动力学，并导致危险的药物-药物相互作用，包括治疗效力丧失和毒性增加。为了避免晚期临床失败和伴随新药上市的高昂成本，许多药物公司采用了筛选测定，用于早期检测可激活PXR的化合物。此外，使用PXR的已知晶体结构进行的计算筛选也越来越多地被用于预测潜在的PXR活性。PXR具有大而柔性的配体结合口袋，而且这些化合物有可能在PXR配体结合空穴内以多个取向结合不同位置，这些都使得对PXR活性的可靠预测变得复杂。特别是对于对预期的治疗靶标具有期望的效力、选择性和生物利用度的更高级的化合物/化学型(chemotype)而言，更是如此。考虑到这些限制，经常需要共结晶结构，以界定精确的结合相互作用，和提示能够干扰与PXR结合有关的关键相互作用同时保持针对主要靶标的活性的特定修饰。例如，在某些实施方案中，用于分析测试剂与PXR相互作用的方法包括，将(i)PXR或其配体结合结构域；(ii)测试剂和(iii)与PXR，例如PXR LBD，特异性结合的10Fn3蛋白，在适合于结晶的条件下共同温育。特异性结合PXR LBD的10Fn3蛋白的实例包含与SEQ ID NOs:48、49和62-69和72的其中一个具有至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性结合PXR LBD的10Fn3蛋白包含与SEQ ID NO:48、49和62-69和72中的任一个相差最多1、2、3、5、10、15、20或25个氨基酸变化，例如取代(例如保守取代)、添加或缺失的氨基酸序列。该方法可进一步包括诱导结晶，并确定测试剂的哪些部分(或原子)与PXR(一般是PXR的配体结合结构域)相互作用，和任选地对测试剂进行修饰，使其不再与PXR相互作用或以更低的亲和力与PXR相互作用。
序列
野生型 10 Fn3序列:
WT10Fn3结构域
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:1)
WT10Fn3结构域核心序列版本1
LEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY(SEQ ID NO:2)
具有D80E取代的WT10Fn3结构域
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGESPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:59)
WT10Fn3结构域核心序列版本2
EVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:60)
WT10Fn3结构域核心序列版本3
VSDVPRDLEVVAA(X)u LLISW(X)v YRITY(X)w FTV(X)x ATISGL(X)y YTITV YA(X)z ISINYRT(SEQ ID NO:22)
WT10Fn3结构域核心序列版本4
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:6)
DLL4结合性WS-LI1结合子:
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEQHSKYPHQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTIQPQDPEQDYQYHYYETSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:3)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEHVADHFDHNQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTYQFQDPEEHYYYHFYDSSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:4)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEYHEHYHSPGFSQKYHYEQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGHKHYHYYYYYHHHSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:5)
N-端延长序列实例:
MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:9)
VSDVPRDL(SEQ ID NO:10)
GVSDVPRDL(SEQ ID NO:11)
XnSDVPRDL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly(SEQ ID NO:16)
XnDVPRDL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly(SEQ ID NO:17)
XnVPRDL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly(SEQ ID NO:18)
XnPRDL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly(SEQ ID NO:19)
XnRDL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly(SEQ ID NO:20)
XnDL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，当n＝2时，X是Met-Gly(SEQ ID NO:21)
MASTSG(SEQ ID NO:50)
C-端尾巴序列实例:
EIEK(SEQ ID NO:7)
EIEKPC(SEQ ID NO:8)
EGSGC(SEQ ID NO:23)
EIEKPCQ(SEQ ID NO:24)
EIEKPSQ(SEQ ID NO:25)
EIEKP(SEQ ID NO:26)
EIEKPS(SEQ ID NO:27)
EGSGS(SEQ ID NO:28)
EIDK(SEQ ID NO:29)
EIDKPSQ(SEQ ID NO:30)
EIDKPCQ(SEQ ID NO:31)
接头序列实例:
PSTSTST(SEQ ID NO:32)
GPG(SEQ ID NO:33)
GPGPGPG(SEQ ID NO:34)
GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO:35)
PAPAPA(SEQ ID NO:36)
PAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:37)
PAPAPAPAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:38)
GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:39)
GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:40)
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42)
GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:43)
6Xhis标签:
HHHHHH(SEQ ID NO:44)
IL-17结合WS-LI1结合子:
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEYHAFFASNGK YYFYIQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTDDTVHHGDSNYHSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:45)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEYSSFFQHQGQ YYHYIQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTQHEHSQDSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:46)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGEFSQFVHSDGE YYQEYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGQYDQDDEPSSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:47)
PXR结合WS1结合子:
MASTSGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVPVSKYVIYYWPGALISS MQAFKVPGSKSTATISGLKPGVLYSIVVDALTGDGQGSYVWDPITITYRTEGSGS(SEQ ID NO:48)
MASTSGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYYITYQELQHHSV PQGFQVPGSKSTATISGLKPGVAYQIAVYAFTGPGLPPSDAPPIVIYYRTEGSGS(SEQ ID NO:49)
图4的 10 Fn3环和支架区肽:
PTSLLISWDAPAVTVRYYRITYG(SEQ ID NO:58)
PVQEFTVPGSKSTATISGLK(SEQ ID NO:51)
TITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:52)
MGEVVAATPTSLLIS(SEQ ID NO:53)
PHFPTRYYRITYGETGGNS(SEQ ID NO:54)
实施例2的BC环序列:
PTSLLISWDAPAVTVRYYRITYG(SEQ ID NO:55)
PTSLLISWSARLKVARYYRITYG(SEQ ID NO:56)
PTSLLISWRHPHFPTRYYRITYG(SEQ ID NO:57)
IGF-1R结合具有经过修饰的BC、DE和FG环的 10 Fn3结构域:
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ(SEQID NO:61)
PXR结合性10Fn3分子:
图10的Adnectin1-8的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NOs:70、71、62、63、72、13、14和15。图10的无6xHis尾巴的Adnectin1-8的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NOs:64、65、48、49、66、67、68和69。
实施例
下面通过参考下面的实施例对本发明进行说明，它们只是举例，并不意图对本发明构成限制。尽管已经通过参照本发明的特定实施方案对本发明进行了详细说明，但是本领域技术人员在不背离本发明精神和范围的前提下显然能够想到各种变化和修改。
实施例1.基于纤连蛋白的支架蛋白的表达和纯化
将选定的结合子克隆到PET9d载体中，并转化大肠杆菌BL21DE3plysS细胞。将被转化的细胞以24孔形式接种在含有50μg/mL卡那霉素和34μg/ml氯霉素的5ml LB培养基中，并37℃过夜培养(接种培养)。通过将200μl接种培养物吸取到含有50μg/mL卡那霉素和34μg/ml氯霉素的5ml(以24-孔形式)TB-过夜表达培养基(自诱导)中，建立生产培养。培养物在37℃培育4小时，此时将温度降低到18℃，并培育20小时。通过4℃2750g离心10分钟收集培养物。
通过将细胞离心沉淀(24-孔形式)混悬在450μl裂解缓冲液(50mMNaH2PO4、0.5M NaCl、1x CompleteTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒-无EDTA(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/ml DNA酶、2μg/ml抑肽酶、pH8.0)中，并在室温振荡1-3小时，裂解细胞。将裂解物澄清并通过转移到安装有96孔、1.2ml收集板(catch plate)的96孔WhatmanGF/D过滤器中并在正压下过滤，将其重新分配(re-racked)成96孔格式。将经过澄清的裂解物转移到先前已经用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4、0.5MNaCl、40mM咪唑、pH8.0)平衡的96孔HisPur Cobalt板上，并温育5min。通过正压力除去未结合的材料。树脂用清洗缓冲液#1(50mM NaH2PO4、0.5MNaCl、5mM CHAPS、40mM咪唑、pH8.0)以2x0.3ml/孔进行清洗，每次通过正压力除去清洗液。在洗脱之前，用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)清洗每个孔，温育5min，通过正压力弃去该清洗液。通过向每孔添加额外的100μl洗脱缓冲液洗脱蛋白。在室温下温育30分钟之后，将板以200g离心5分钟，将被洗脱的蛋白收集在96孔收集板中，在洗脱前向洗脱收集板的底部添加5μl0.5M MgCl2。用总蛋白测定法对被洗脱的蛋白进行定量，以SGE作为蛋白标准。SGE是一种野生型10Fn3结构域，其中FG环的RGD序列被改变为SGE。
实施例2.10Fn3结构域多肽免疫原性的表征
过继性免疫应答是抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞，对内化的蛋白进行加工和消化而触发的。APC将被内化的蛋白切割成短肽，然后将多肽展示在其表面MHC II类分子上。MHC II类分子的肽结合位点长而窄，类似热狗面包(hot-dog bun)，并以使其肽保持延伸的形态，在主结合位点里有可容纳9个氨基酸的空间(一般可允许肽的任一侧有短尾巴)。MHC结合位点中的某些口袋是确定肽结合的决定子。这些口袋对应于9聚体肽的被锚定部分中的氨基酸位置1、4、6和9。在这四个位置中的每一个处具有有利侧链的肽一般可以良好地与HLA(一种MHC II类分子)结合。
位置1被认为是参与肽与HLA分子间结合的最重要的“锚残基”。位置1一般喜好疏水侧链——因此通常结合HLA的9聚体以V、I、L、M、F、Y、或W起始。其它位置的可变性则高得多，不同的HLA等位片段在每个位点有利于不同系列的氨基酸。本文中所述多肽的免疫原性同时用体外和计算机方法进行评估。
A–人白细胞抗原(“HLA”)结合的体外测定
在本实验中，在HLA结合测定中评估合成肽，这些合成肽对应于野生型10Fn3结构域序列或工程化10Fn3结构域序列中的不同区域。类似的HLA结合测定在Reijonen H，Kwok WW，Use of HLA class II tetramers in trackingantigen-specific T cells and mapping T-cell epitopes，Methods29(3):282-8(2003)中有描述。该HLA结合测定中所测试的每一个实验肽或是野生型10Fn3结构域北极环(BC、DE或FG环)肽片段，其在每个环的N和C端两侧具有额外的氨基酸(SEQ ID NOs:58、51和52)；或是来自野生型10Fn3结构域的位于BC环的N端一侧的支架区肽片段(SEQ ID NO:53)；或是来自工程化10Fn3结构域的位于BC环的C端一侧的支架区肽片段(SEQ ID NO:54)。将各实验肽以测定期望浓度的50倍溶解于100％DMSO中。然后将每个肽在反应缓冲液中稀释，并从128μM到2μM顺序滴定。
在HLA结合测定中，将5种不同HLA等位体分子(DRB*0101；DRB*0301；DRB*0401；DRB*0701或DRB*1501等位片段)分别与未标记的实验肽及铕标记的对照(竞争)肽一起分施到96孔板的孔中。将该结合混合物在孔中温育24小时以达到稳定平衡。然后，将HLA分子复合物捕获在包被有抗-人HLA-DR抗体的ELISA平板上。通过时间解析荧光来测量结合的HLA-标记的对照肽，并通过Wallac Victor3TM单元(Perkin-Elmer)在615nm进行评估。实验肽的结合用被标记的对照肽的百分比抑制(实验荧光/对照荧光乘以100)表示。从每个浓度下的被标记对照肽的百分比抑制，为每个实验肽求出针对测试的5种等位体的IC50曲线。这些实验的结果如图4所示。
如图4所示，发现BC环肽发现与5种测试等位体中的4种高亲和力结合，提示它是蛋白内的免疫显性序列。相比之下，对应于DE和FG环的合成肽一般结合更少的HLA等位体，并且亲和力更低。因此，预测DE和FG环不是野生型10Fn3结构域中的免疫显性序列。
如图4所示，SEQ ID NO:53的支架区肽被发现以高亲和力结合5种HLA等位体，而SEQ ID NO:54的支架区肽被发现以高亲和力结合其中4种HLA等位体。这些结果提示，10Fn3结构域的BC环两侧的支架区是免疫显性区。图4所示的SEQ ID NO:53和54序列的下划线部分被预测是这些序列的免疫显性部分。
对于被发现是免疫显性环的BC环，用相同的HLA结合测定进行了进一步评估。具体地说，使用该测定对三种BC环序列变体肽(SEQ ID NO:55-57)进行检验，并发现它们显示几乎相同的对所测试的HLA等位体的强结合模式。SEQ ID NO:55的肽序列是人野生型序列，SEQ ID NO:56和57是来自经工程化而结合两种不同靶的10Fn3结构域的BC环区。在假定相似的结合模式反映共同的基序的条件下，对序列进行比对以帮助鉴定潜在的锚定残基。所测试的不同BC环序列的潜在位置1残基用下划线标示：
15       23      30(基于SEQ ID NO:1的位置序列)
|        |       |
PTSLLISW DAPAVTV RYYRITYG(SEQ ID NO:55)
PTSLLISW SARLKVA RYYRITYG(SEQ ID NO:56)
PTSLLISW RHPHFPT RYYRITYG(SEQ ID NO:57)
这三种肽的共有序列部分是可变BC环前面的β-链B、以及BC环后面的β-链C。这些部分的每一个均具有数个疏水残基(潜在的位置1锚定子)，但是β-链C中的那些疏水残基的后面没有跟随至少8个额外残基，因此不可能是MHC结合的锚定残基。可变BC环中的疏水残基在这三种肽中的位置不同，可见具有共同的β-链C残基的单一9聚体位置不大可能被锚定在BC环内。因此，这些结果提示，β-链B对于设计肽锚定子应该是有用的。
锚定残基最可能的位置似乎是“LLI”(SEQ ID NO:1的位置18-20)，因为它们包含一段位于BC环残基之前的固定的β-链B残基。如果，例如，是由起始于第一个L的9聚体来锚定肽，则第四个位置总是S，这有利于结合许多HLA等位体。
应当注意，尽管许多完整人序列被MHC展示，但是免疫系统将它们识别为“自身”，不会启动免疫应答。此外，在具有相同的10Fn3序列的食蟹猴中施用各种不同10Fn3多肽时会产生免疫应答，但是在施用野生型10Fn3时却不会产生免疫应答。这表明，食蟹猴将人野生型10Fn3序列识别为“自身”蛋白，因此不会启动对它们的免疫应答。
B–HLA结合的计算机预测
HLA结合可以在计算机上进行预测，例如使用EpiMatrix进行预测。EpiMatrix是由EpiVax开发的一种有权利保护的计算算法，其用于筛选蛋白序列中是否存在假定的HLA结合基序。输入序列被解析(parse)成多个重叠的9聚体框，每一个框与前一个框有8个氨基酸重叠。然后对每一个所得的框对一组8种共有II类HLA等位体(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、和DRB1*1501)的预测结合亲和力进行打分。将原始分数相对于随机生成肽的大样本的得分进行标准化。报告所得的“Z”得分。任何EpiMatrix Z-得分超过1.64的9聚体肽被认为是推定的HLA结合基序。
用EpiMatrix算法对来自具有SEQ ID NO:61记载的氨基酸序列的10Fn3多肽的肽表位进行预测。结果显示，10Fn3多肽的BC、DE和FG环的Z-得分分别为21.3、0.9和1.1。
上面的体外和计算机HLA结合结果提示，β-链B/BC环片段可能是对HLA结合而言的“热点”。β-链B/BC环片段可能通过β-链B中的氨基酸强烈地锚定于MHC分子，以致于BC环序列中的至少某些变异体对与HLA的结合几乎没有影响。强锚定可能使得该片段难以被脱免疫。然而，如果整个序列段都是野生型序列，则应当会被免疫系统识别为自身，从而不会引发免疫应答。因此，通过将BC环保留为野生型，或至少将SEQ ID NO:1或6的D23-T28的残基保留为野生型，以使得被锚定在L18、L19、或I20处的任何9聚体肽保持为野生型，可以设计出具有降低的免疫原性的10Fn3结构域多肽文库。图9A显示了其中全部或大部分BC环被保留为野生型的文库的实例。图9B显示了BC环N端区的不同部分被保留为野生型的文库的实例。实施例3中提供了对应于SEQ ID NO:1的D23-T28的残基被保留为野生型的10Fn3结合子的具体实例。或者，如果BC环被修饰，则可以通过在BC环中的修饰的基础上进一步破坏该区域中的强锚定子，即在β-链B中进行修饰，来实现免疫原性的降低。锚定子被除去的文库的实例包括如下文库，其中位置L19和/或S21已经被多样化，藉此增加文库成员缺失锚定子残基的可能性。图9C显示了其中锚定残基被除去的文库的实例。
实施例3.西侧(West Side)结合子的产生
使用mRNA展示法(Xu et al Chem Biol.2002Aug；9(8):933-42)筛选含有经过修饰的10Fn3结构域的西侧(West Side)(“WS”)结合子多肽的文库，检验是否与作为靶标的鼠IL-17、鼠DLL4或人PXR结合。WS结合子设计成保留BC环序列为野生型。使用WS1文库设计(见图9A)鉴定与靶标人PXR的结合子，使用WS-LI1文库设计(见图9A)鉴定与靶标鼠IL-17或鼠DLL4的结合子。靶标结合通过qPCR进行监测，当观察到特异性结合信号时，对群体进行克隆并在大肠杆菌中进行表达。
实施例4.能够结合鼠DLL4的WS-LI1结合子破坏DLL4与Notch1的相互作用
DLL4是Notch1蛋白的配体。采用竞争性Biacore实验，评估了具有WS-LI1设计的10Fn3多肽破坏Notch1与鼠DLL4之间相互作用的能力。将大约4500RU的Notch1-Fc固定在CM5Biacore芯片上。在HBSP缓冲液和5mM CaCl2中，将2μM WS-LI1结合子用20nM鼠DLL4平衡，同时对照中不添加WS-LI1多肽。使每一个样品流过芯片，并将鼠DLL4的结合与没有添加WS-LI1多肽的对照进行比较，信号的减少对应于Notch1:鼠DLL4相互作用的抑制。在每两次样品运行之间，通过用HBSP pH7.4和50mMEDTA进行2次30秒清洗对芯片进行再生。该实验的结果如图5所示。发现具有SEQ ID NO:3和4序列的多肽分别导致对Notch1与鼠DLL4之间相互作用的100％竞争。具有SEQ ID NO:5序列的多肽能够诱发对Notch1与鼠DLL4之间相互作用的75％竞争。
实施例5.能够结合鼠DLL4的WS-LI1结合子的大小排阻色谱分析
利用大小排阻色谱来展示实施例4中观察到的竞争结果是由于所测试的WS-LI1结合子的单体形式所致。具有SEQ ID NO:3或4氨基酸序列的WS-LI1结合子主要是单体，而具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的WS-LI1结合子含有单体蛋白和聚集体蛋白的混合物。该实验结果如图6所示，其表明实施例4中测试的WS-LI1结合子作为单体种类发挥作用，这提示这些结合子作为稳定的、良好折叠的多肽存在。
实施例6.能够结合鼠DLL4的WS-LI1结合子的稳定性
通过基于荧光的热迁移测定(TSF)评估实施例4所述多肽的稳定性。具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽在59℃有跃迁。具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽在49℃有跃迁。具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽没有观察到跃迁。
实施例7.通过能够结合鼠IL-17的WS-LI1结合子破坏鼠IL-17与鼠IL-17RA之间的相互作用
IL-17是IL-17受体A蛋白IL-17RA的配体。通过采用竞争性Alphascreen实验对具有WS-LI1设计的10Fn3结构域破坏鼠IL-17和鼠IL-17RA之间相互作用的能力进行评估。根据制造商的使用说明书混合链霉亲和素供体珠子、抗-人IgG受体珠子、1.5nM鼠IL-17RA-Fc和2.5nM生物素化的鼠IL-17，以便给出强烈的Alphascreen信号。考察了具有SEQ ID NO:45、46或47的序列的多肽当以1μM浓度加入到该混合物中时抑制该信号的能力。具有SEQID NO:45的序列的多肽导致83％的Alphascreen信号抑制，具有SEQ ID NO:46的序列的多肽导致94％的Alphascreen信号抑制，具有SEQ ID NO:47的序列的多肽导致81％的Alphascreen信号抑制。这些结果证明，WS-LI1文库设计产生了能够结合IL-17并可有效抑制IL-17与其受体之间相互作用的10Fn3结构域。
实施例8.能够结合鼠IL-17的WS-LI1结合子的大小排阻色谱分析
使用大小排阻色谱展示实施例7中观察到的竞争结果是由于所测试的WS-LI1结合子的单体形式所致的。具有SEQ ID NO:45、46或47氨基酸序列的WS-LI1结合子主要是单体。该实验结果如图7所示，其表明，实施例7中测试的WS-LI1结合子以单体种类发挥作用，提示这些结合子以稳定的、良好折叠的多肽的形式存在。
实施例9.能够结合鼠IL-17的WS-LI1结合子的稳定性
通过TSF评估实施例7所述多肽的稳定性。具有SEQ ID NO:45氨基酸序列的多肽在51℃有跃迁。具有SEQ ID NO:46氨基酸序列的多肽在60℃有跃迁。具有SEQ ID NO:47氨基酸序列的多肽没有观察到跃迁。
实施例10.能够结合人PXR的WS1结合子的结合性质表征
用Biacore结合测定和带GST标签的PXR对能够结合PXR的WS1结合子进行表征。将14000RU的抗-GST抗体固定在Biacore芯片上，通过使50nM溶液以5μL/min的速度流过芯片3分钟来捕获GST-PXR。使WS1结合子以0.5-2μM浓度流过芯片，观察相对于缺少PXR的对照的结合。每两次运行之间，用10mM甘氨酸、pH2.0进行2次30秒清洗，对芯片进行剥离(stripped)，并捕获新鲜的GST-PXR。在这些条件下，146RU的具有SEQ IDNO:48氨基酸序列的WS1结合子结合了GST-PXR，而81RU的具有SEQ IDNO:49氨基酸序列的WS1结合子结合了GST-PXR。这些结果证明，具有SEQ ID NO:48或49氨基酸序列的WS1结合子能够结合GST-PXR。
实施例11.能够结合人PXR的WS1结合子的大小排阻色谱分析
使用大小排阻色谱来展示实施例10中观察到的竞争结果是由于所测试的WS1结合子的单体形式导致的。具有SEQ ID NO:48或49氨基酸序列的WS1结合子主要是单体。该实验结果如图8所示，其表明，实施例10中测试的WS1结合子以单体种类发挥作用，提示这些结合子作为稳定的、良好折叠的多肽存在。
实施例12.结合人PXR的10Fn3多肽的序列和结合特征
本实施例描述6种其他的可结合人PXR配体结合结构域(LBD)的10Fn3多肽。还提供了这6种多肽以及两种在实施例10中描述的多肽(具有SEQ IDNO:48和49)的结合特征。
通过筛选各种文库鉴定了具有图10中记载的氨基酸序列的10Fn3多肽。例如，从NP1文库分离的Adnectin-1(见图9C)。10Fn3多肽的合成如下。将编码10Fn3多肽的核酸克隆在pET9D载体中，然后在20℃下在大肠杆菌中表达。裂解物用Ni-琼脂糖亲和色谱进行一步纯化。
如下所述在Biacore T100装置(GE Healthcare)上进行表面等离子体共振(SPR)来确定10Fn3多肽的KD值：在固定有抗-GST抗体(GE Healthcare)的芯片上捕获人PXR-GST(Invitrogen)，在人PXR-GST上注射系列浓度的10Fn3多肽，各动力学循环之间用10mM甘氨酸、pH2再生芯片表面。二者的动力学参数用Biacore T100软件计算。结果如表1所示。
表1：Adnectin-1—Adnectin-8与人PXR的结合特征
Adnectin ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
Adnectin-1 1.04E+05±1.20E+04 1.19E-03±3.46E-05 11.4±1
Adnectin-2 1.62E+05±5.37E+03 4.58E-03±3.53E-04 97.8±3.8
Adnectin-3 1.62E+04±6.75E+04 3.78E-04±2.23E-05 2.5±0.9
Adnectin-4 2.15E+04±5.30E+02 1.68E-04 7.8
Adnectin-5 5.09E+05±1.07E+05 2.70E-03±2.36E-04 5.4±0.7
Adnectin-6 6.80E+05±1.69E+05 1.26E-03±1.72E-04 1.9±0.2
Adnectin-7 2.88E+05±2.38E+04 8.82E-05±1.15E-06 0.31±0.03
Adnectin-8 4.17E+04±8.22E+03 1.82E-04±2.78E-05 4.4±0.2
Adnectin-1可有效用作人PXR与小分子的共结晶伴侣，并显示可结合PXR的配体结合结构域。X-射线数据提供了小分子与PXR配体结合结构域之间相互作用的信息。
实施例13.在FG环中缺少RGD可阻止10Fn3多肽与纤连蛋白和玻连蛋白结合
将重组人整联蛋白αVβ3(R&D Systems、Minneapolis MN)在乙酸缓冲液pH5.0(GE Healthcare、Piscataway NJ)中稀释成40ug/mL，然后用标准胺偶联技术固定在CM7芯片(GE Healthcare)上。500nM纤连蛋白(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)和玻连蛋白(Vitronectin)(R&D Systems)和5μM的非结合对照10Fn3分子(由SEQ ID NO:6组成，且在N端有额外的MG，还有将RGD变为RGE的单氨基酸取代)或被靶定的10Fn3分子(具有不含有RGD基序的突变FG环)流过被固定的整联蛋白表面。在样品注射结束后收集结合RU。结果表明，FG环缺少RGD导致10Fn3分子与纤连蛋白和玻连蛋白不结合。
实施例14.从各种文库获得的分子的特征
本实验显示了从11个不同文库获得的分子的各种特征。制作了如下的文库：
·LI-1文库，其是文库LI-1(a)、LI-1(b)和LI-1(c)的混合物，包含具有图9B中提供的氨基酸序列的10Fn3分子。有下划线的氨基酸残基是可以通过任何氨基酸取代发生改变的残基。下划线残基可以是野生型残基；
·LI-3文库，包含具有图9B中提供的氨基酸序列的10Fn3分子(“LI-3(b))，其中被框住的氨基酸残基通过被取代成任何氨基酸或缺失或添加而加以改变。被框住的残基可以是野生型残基；
·WS-LI1文库，包含具有图9A中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中被框住的氨基酸残基可以通过氨基酸取代、添加或删除加以改变。被框住的残基可以是野生型残基；
·LI-S9文库，包含具有图9A中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中被框住的氨基酸残基可以通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，有下划线的残基可以通过取代加以改变，高亮显示的残基被变成E。加框或有下划线的残基可以是野生型残基；
·LI-S8文库，包含具有图9A中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中加框的氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，高亮显示的残基被改变成E。加框的残基可以是野生型残基；
·NP4_FG文库，包含具有图9C中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中加框的氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，有下划线的残基通过取代加以改变。加框的或加下划线的残基可以是野生型残基。该文库对应于NP4文库，其中只有FG、F和G中的残基被改变；
·WS2’_CD文库，包含具有图9A中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中加框的氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，有下划线的残基通过取代加以改变。加框或有下划线的残基可以是野生型残基。该文库对应于WS2’文库，其中只有CD、C和D中的残基被改变；
·NP1’文库，包含具有图9C中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中加框的氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，有下划线的残基通过取代加以改变。加框或有下划线的残基可以是野生型残基；
·NP4文库，包含具有图9C中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中加框的氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，有下划线的残基通过取代加以改变。加框或有下划线的残基可以是野生型残基；和
·WS2’文库，包含具有图9A中记载的氨基酸序列的10Fn3分子，其中加框的氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或删除加以改变，有下划线的残基可以取代加以改变。加框或有下划线的残基可以是野生型残基。
对来自每个文库的克隆进行表达和纯化。将所得的10Fn3分子在PerkinElmer LabChip GX上使用低分子量蛋白分子量标准(ladder)根据制造商的推荐运行。从同样在LabChip GX上运行的SGE标准曲线外推得到10Fn3分子的浓度。浓度高于标准曲线的样品被归类为高于曲线(off-curve-high)(OCH)。确定每个文库的OCH孔的百分比和平均浓度。结果表明，OCH孔的分数和可测量样品的平均浓度遵循相似的模式。
同时对来自每一个文库的10Fn3分子的抗聚集性进行测试。通过大小排阻色谱(SEC)根据制造商的推荐测试每个文库的19-200个克隆的聚集和保留时间。为每个克隆整合SEC色谱图，并评估在17kDa-1.3kDa标准品的洗脱时间之间被洗脱的峰。在该保留时间窗口中的面积大于90％的克隆的SEC得分为1，50％-90％的得分为2，5％-50％的得分为3，小于5％的得分为4。SEC得分为1或2的分数的对聚集的抗性的量度，SEC4的分数是SEC筛选上的载荷的量度。结果表明，SEC为1或2的分数和SEC为4的分数遵循的模式几乎相反。
通过ELISA确定来自每个文库的克隆的靶结合。将克隆所针对的蛋白以2.5μg/mL包被在Nunc Maxisorp平板上。用酪蛋白(ThermoScientific#37532)封闭平板，然后与10Fn3分子温育。用HRP标记的抗-His抗体(R&DSystems#mAb050H)通过His标签检测结合克隆。将任何可给出超过空白孔2X信号的事件确定为命中。命中的分数是筛选载荷的量度。所有文库至少具有预期的命中数目。
还确定了每个文库成员所结合的多个表位的存在。对于三个靶标，这涉及实施例7中提到的竞争性Alphascreen测定。对于这些靶标，来自已经证明的靶标结合子的竞争子和非竞争子的存在证明了多表位覆盖的存在。对于一个多结构域靶标，使用各个亚结构域的重组版本进行的ELISA证明了多表位结合(multiple epitope binding)。被发现有多个表位的靶标的分数是在文库中发现多样的生物活性的概率的量度。不同文库的对多个靶标的多表位覆盖的结果指示封闭的多样性(diversity of blocking)。
援引并入
本文中描述的所有文件和参考文献，包括专利文件和网站，均分别单独地通过援引并入本文件，如同它们全部或部分书面记载在本文件中一样。

Claims (224)

1.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域包含(i)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环，在从BC、DE和FG环中选出的至少一个北极环的氨基酸序列中的修饰，和(ii)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，在从AB、CD和EF环中选出的至少一个南极环的氨基酸序列中的修饰，其中该至少一个被修饰的北极环和至少一个被修饰的南极环贡献于对相同靶标的结合。
2.权利要求1的多肽，其中至少一个北极环或至少一个南极环具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽，其中所述BC环的至少一部分具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
4.权利要求3的多肽，其中所述BC环的最先3个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
5.权利要求3的多肽，其中所述BC环的最先4个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
6.权利要求3的多肽，其中所述BC环的最先5个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
7.权利要求3的多肽，其中所述BC环具有野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
8.权利要求3-7中任一项的多肽，其中相对于在BC环中具有额外修饰的等价多肽，该多肽具有降低的免疫原性。
9.权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
10.权利要求1-9中任一项的多肽，其中至少一个β-链的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的氨基酸序列被修饰。
11.权利要求10的多肽，其中在所述10Fn3结构域的线性序列中所述被修饰的β-链位于所述被修饰的环之一的邻近。
12.权利要求10的多肽，其中在所述10Fn3结构域的线性序列中所述被修饰的β-链位于所述被修饰的北极环和所述被修饰的南极环之间。
13.权利要求10-12中任一项的多肽，其中在所述10Fn3结构域的线性序列中所述被修饰的北极环、所述被修饰的β-链和所述被修饰的南极环彼此邻近。
14.权利要求10-13中任一项的多肽，其中所述被修饰的β-链贡献于对靶标的结合。
15.权利要求1-13中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
16.权利要求1-15中任一项的多肽，其中至少一个被修饰的环的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列长度已延长。
17.权利要求1-16中任一项的多肽，其中至少一个被修饰的环的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列长度已缩短。
18.权利要求1-17中任一项的多肽，其中C端尾巴的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列被修饰。
19.权利要求1-18中任一项的多肽，其中最先7个氨基酸残基的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的最先7个氨基酸残基的氨基酸序列被修饰。
20.权利要求1-17中任一项的多肽，其中该多肽相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)从N端截短了1-7个氨基酸，或相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)从C端截短了1-9个氨基酸，或二者均有。
21.权利要求1-20中任一项的多肽，其中该多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少50％同一性。
22.权利要求1-21中任一项的多肽，其中该多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少65％同一性。
23.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域包含(i)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环，在从BC、DE和FG环中选出的至少一个北极环的氨基酸序列的修饰，和(ii)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，在从AB、CD和EF环中选出的至少一个南极环的氨基酸序列中的修饰。
24.权利要求23的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽含有不同的10Fn3结构域序列。
25.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求23或24的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
26.分离的多肽，其是通过权利要求25的方法鉴定的。
27.权利要求26的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
28.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域包含：(i)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，在AB、BC、CD、DE、EF、或FG环中至少一个的氨基酸序列中的修饰，和(ii)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链，在至少一个β-链的氨基酸序列中的修饰，其中所述至少一个被修饰的环和所述至少一个被修饰的β-链贡献于对相同靶标的结合。
29.权利要求28的多肽，其中在所述10Fn3结构域的线性序列中所述被修饰的β-链与所述被修饰的环邻近。
30.权利要求28或29的多肽，其中至少两个β-链具有相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链被修饰的氨基酸序列。
31.权利要求30的多肽，其中在所述10Fn3结构域线性序列中所述被修饰的β-链与所述被修饰的环的每一侧邻近。
32.权利要求30或31的多肽，其中所述被修饰的β-链均贡献于对靶标的结合。
33.权利要求28-32中任一项的多肽，其中至少两个环具有相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环被修饰的氨基酸序列。
34.权利要求33的多肽，其中至少一个被修饰的环是从BC、DE和FG环中选出的北极环，且至少一个被修饰的环是从AB、CD和EF环中选出的南极环。
35.权利要求33或34的多肽，其中所述被修饰的环均贡献于对靶标的结合。
36.权利要求28-35中任一项的多肽，其中至少一个北极环或至少一个南极环具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
37.权利要求28-35中任一项的多肽，其中所述BC环的至少一部分具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
38.权利要求37的多肽，其中所述BC环的最先3个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
39.权利要求37的多肽，其中所述BC环的最先4个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
40.权利要求37的多肽，其中所述BC环的最先5个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
41.权利要求37的多肽，其中所述BC环具有野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
42.权利要求37-41中任一项的多肽，其中该多肽相对于在BC环中具有额外修饰的等价多肽具有降低的免疫原性。
43.权利要求28-42中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
44.权利要求28-43中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
45.权利要求28-44中任一项的多肽，其中至少一个被修饰的环的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列长度延长。
46.权利要求28-45中任一项的多肽，其中至少一个被修饰的环的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列长度缩短。
47.权利要求28-46中任一项的多肽，其中C端尾巴的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的C端尾巴的氨基酸序列被修饰。
48.权利要求28-47中任一项的多肽，其中最先7个氨基酸残基的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的最先7个氨基酸残基的氨基酸序列被修饰。
49.权利要求28-46中任一项的多肽，其中该多肽相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)从N端截短了1-7个氨基酸，或相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)从C端截短了1-9个氨基酸，或者两者均有。
50.权利要求28-49中任一项的多肽，其中该多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少50％同一性。
51.权利要求28-50中任一项的多肽，其中该多肽与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸序列具有至少65％同一性。
52.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域包含(i)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环，在AB、BC、CD、DE、EF、或FG环中至少一个的氨基酸序列中的修饰，和(ii)相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链，在至少一个β-链的氨基酸序列中的修饰。
53.权利要求52的文库，其中所述文库包含至少105个多肽，每一个多肽含有不同的10Fn3结构域序列。
54.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求52或53的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
55.一种分离的多肽，其是通过权利要求54的方法鉴定的。
56.权利要求55的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
57.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在CD和FG环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中所述CD和FG环贡献于对相同靶标的结合。
58.权利要求57的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的CD环的序列，CD环的11个氨基酸中有至少4个被修饰。
59.权利要求57或58的多肽，其中CD环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基46或47的一个或多个氨基酸残基与这些位置处的野生型氨基酸相同。
60.权利要求57-59中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的序列，FG环的13个氨基酸中有至少11个被修饰。
61.权利要求60的多肽，其中FG环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的氨基酸残基75或87的一个或多个氨基酸残基与这些位置处的野生型氨基酸相同。
62.权利要求57-61中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，CD环、FG环或两者的氨基酸序列的长度延长。
63.权利要求57-61中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，CD环、FG环或两者的氨基酸序列的长度缩短。
64.权利要求57-61中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，CD环和FG环的至少一个的氨基酸序列的长度延长，并且相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环，CD环和FG环的至少一个的氨基酸序列的长度缩短。
65.权利要求57-64中任一项的多肽，其中β-链C和β-链D的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列被修饰。
66.权利要求57-65中任一项的多肽，其中所述BC环的至少一部分相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的序列被修饰。
67.权利要求66的多肽，其中所述BC环中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基30和31的一个或多个氨基酸残基相对于这些位置处的野生型氨基酸被修饰。
68.权利要求57-67中任一项的多肽，其中β-链F和β-链G的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列被修饰。
69.权利要求57-68中任一项的多肽，其中一个或多个所述被修饰的β-链贡献于对靶标的结合。
70.权利要求69的多肽，其中所有所述被修饰的β-链均贡献于对靶标的结合。
71.权利要求57-70中任一项的多肽，其中AB、DE和EF环中的一个或多个具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)相应环的氨基酸序列。
72.权利要求57-71中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
73.权利要求57-72中任一项的多肽，其中所述BC环的至少一部分具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
74.权利要求73的多肽，其中所述BC环的最先3个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
75.权利要求73的多肽，其中所述BC环的最先4个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
76.权利要求73的多肽，其中所述BC环的最先5个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
77.权利要求73的多肽，其中所述BC环的最先6个残基与野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环中的相应残基相同。
78.权利要求73的多肽，其中所述BC环具有野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列。
79.权利要求73-78中任一项的多肽，其中该多肽相对于在BC环中具有额外修饰的等价多肽具有降低的免疫原性。
80.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在CD和FG环的氨基酸序列中含有修饰。
81.权利要求80的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
82.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求80或81的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
83.一种分离的多肽，其是通过权利要求80的方法鉴定的。
84.权利要求83的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
85.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列，所述10Fn3结构域在CD和DE环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中CD和DE环贡献于对相同靶标的结合。
86.权利要求85的多肽，其中EF环的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的EF环的序列被修饰，并且其中EF环贡献于对靶标的结合。
87.权利要求85或86的多肽，其中β-链C、β-链D和β-链F中一个或多个的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列被修饰。
88.权利要求87的多肽，其中一个或多个所述被修饰的β-链贡献于对靶标的结合。
89.权利要求85-88中任一项的多肽，其中相对于野生型序列中的相应残基，在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的残基36至66的氨基酸之间的31个残基中有至少24个已被修饰。
90.权利要求85-89中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环，所述CD环的长度延长或长度缩短。
91.权利要求85-90中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
92.权利要求85-91中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
93.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在CD和DE环的氨基酸序列中含有修饰。
94.权利要求93的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
95.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求93或94的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
96.一种分离的多肽，其是通过权利要求95的方法鉴定的。
97.权利要求96的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
98.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环的氨基酸序列，所述10Fn3结构域在EF和FG环的氨基酸序列中包含修饰，并且其中所述EF和FG环贡献于对相同靶标的结合。
99.权利要求98的多肽，其中AB环的氨基酸序列相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的AB环的序列被修饰，并且其中AB环贡献于对靶标的结合。
100.权利要求98或99的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1)的相应β-链的序列，β-链A和β-链G中一个或多个的氨基酸序列被修饰。
101.权利要求100的多肽，其中一个或多个所述被修饰的β-链贡献于对靶标的结合。
102.权利要求98-101中任一项的多肽，其中最先7个氨基酸的氨基酸序列或对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)残基93至97的氨基酸的氨基酸序列相对于野生型序列中的相应残基已被修饰。
103.权利要求102的多肽，其中额外的被修饰的氨基酸贡献于对靶标的结合。
104.权利要求98-103中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)中的相应残基，所述10Fn3结构域的最先15个氨基酸残基中有至少14个已被修饰。
105.权利要求98-104中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)中的相应残基，所述EF环的5个氨基酸残基中有至少4个已被修饰。
106.权利要求98-105中任一项的多肽，其中相对于野生型序列中的相应残基，在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)残基80-97的氨基酸之间的18个残基中有至少15个已被修饰。
107.权利要求98-106中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环，所述FG环的氨基酸序列长度延长或长度缩短。
108.权利要求98-107中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
109.权利要求98-108中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
110.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在EF和FG环的氨基酸序列中含有修饰。
111.权利要求110的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
112.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求110或111的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
113.一种分离的多肽，其是通过权利要求112的方法鉴定的。
114.权利要求113的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
115.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列，10Fn3结构域在AB和FG环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中AB和FG环贡献于对相同靶标的结合。
116.权利要求115的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的相应β-链和环的序列，β-链A、环AB、β-链B、环FG和β-链G的氨基酸序列含有修饰，并且其中被修饰的环和链贡献于对相同靶标的结合。
117.权利要求115或116的多肽，其中相对于野生型序列中的相应残基，最先7个氨基酸的氨基酸序列或对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的残基93-97的氨基酸的氨基酸序列已被修饰。
118.权利要求117的多肽，其中额外的被修饰的氨基酸贡献于对靶标的结合。
119.权利要求115-118中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的AB环，AB环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。
120.权利要求115-119中任一项的多肽，其中AB环在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基15和18的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
121.权利要求115-120中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环，FG环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。
122.权利要求115-121中任一项的多肽，其中所述FG环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)FG环的氨基酸残基84-87的部分相对于野生型CD环的相同部分具有修饰的氨基酸序列。
123.权利要求115-122中任一项的多肽，其中所述FG环在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基83和88的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
124.权利要求115-123中任一项的多肽，其中β-链B在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基18和20的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
125.权利要求115-124中任一项的多肽，其中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的残基1-19的氨基酸之间的19个残基中有至少16个相对于野生型序列中的相应残基已被修饰。
126.权利要求115-125中任一项的多肽，其中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)残基84-97的氨基酸之间的14个残基中有至少13个相对于野生型序列中的相应残基已被修饰。
127.权利要求115-126中任一项的多肽，其中BC、CD、DE或EF环中的一个或多个具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列。
128.权利要求115-127中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
129.权利要求115-128中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
130.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列在AB和FG环的氨基酸序列中含有修饰。
131.权利要求130的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
132.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求130或131的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
133.一种分离的多肽，其是通过权利要求132的方法鉴定的。
134.权利要求133的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
135.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的氨基酸序列在CD环、EF环、β-链F和β-链G的氨基酸序列中包含修饰，并且其中被修饰的环和链贡献于对相同靶标的结合。
136.权利要求135的多肽，其中相对于野生型序列中的相应残基，对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)残基93-97的氨基酸的氨基酸序列已被修饰。
137.权利要求136的多肽，其中额外的被修饰的氨基酸贡献于对靶标的结合。
138.权利要求135-137中任一项的多肽，其中CD环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环的氨基酸氨基37-45的部分具有相对于野生型CD环的相同部分被修饰的氨基酸序列。
139.权利要求135-138中任一项的多肽，其中CD环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环的氨基酸残基37-45的部分相对于野生型CD环的相同部分含有插入或缺失。
140.权利要求135-139中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的EF环，EF环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。
141.权利要求135-140中任一项的多肽，其中β-链F在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基68和70的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
142.权利要求135-141中任一项的多肽，其中对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基91-97的序列的氨基酸序列具有相对于野生型序列的相同部分被修饰的氨基酸序列。
143.权利要求135-142中任一项的多肽，其中该多肽在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基90和98的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
144.权利要求135-143中任一项的多肽，其中AB、BC或DE环中的一个或多个具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列。
145.权利要求135-144中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
146.权利要求135-145中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
147.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链和环的序列，在CD环、EF环、β-链F和β-链G的氨基酸序列中含有修饰。
148.权利要求147的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
149.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求147或148的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
150.一种分离的多肽，其是通过权利要求149的方法鉴定的。
151.权利要求150的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
152.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链和环的序列，所述10Fn3结构域在β-链A、AB环、β-链B、CD环、β-链E、EF环、和β-链F的氨基酸序列中含有修饰，并且其中经过修饰的环和链贡献于对相同靶标的结合。
153.权利要求152的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的CD环，所述CD环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。
154.权利要求152或153的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQID NO:1或6)的β-链G的序列，所述β-链G的氨基酸序列被修饰。
155.权利要求152-154中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的C端尾巴的氨基酸序列，C端尾巴的氨基酸序列被修饰。
156.权利要求152-155中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
157.权利要求152-156中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
158.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链和环的序列，所述10Fn3结构域在β-链A、AB环、β-链B、CD环、β-链E、EF环和β-链F的氨基酸序列中含有修饰。
159.权利要求158的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
160.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求158或159的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
161.一种分离的多肽，其是通过权利要求160的方法鉴定的。
162.权利要求161的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
163.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链和环的序列，所述10Fn3结构域在AB环、β-链B、CD环、β-链D、DE环、β-链E和EF环的氨基酸序列中含有修饰，并且其中经过修饰的环和链贡献于对相同靶标的结合。
164.权利要求163的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的AB环，所述AB环的氨基酸序列的长度延长或长度缩短。
165.权利要求163或164的多肽，其中CD环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环的氨基酸残基40-47的部分相对于野生型CD环的相同部分具有被修饰的氨基酸序列。
166.权利要求163-165中任一项的多肽，其中CD环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的CD环的氨基酸残基40-47的部分相对于野生型CD环的相同部分含有插入或缺失。
167.权利要求163-166中任一项的多肽，其中β-链B在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)残基18和20的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
168.权利要求163-167中任一项的多肽，其中相对于野生型序列中的相应残基，对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)残基14-19的氨基酸之间的6个残基中有至少5个已被修饰。
169.权利要求163-168中任一项的多肽，其中相对于野生型序列中的相应残基，对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)残基40-66的氨基酸之间的27个残基中有至少18个已被修饰。
170.权利要求163-169中任一项的多肽，其中所述BC环具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列。
171.权利要求163-170中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
172.权利要求163-171中任一项的多肽，其中所述FG环不含有RGD整联蛋白结合位点。
173.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链和环的序列，10Fn3结构域在AB环、β-链B、CD环、β-链D、DE环、β-链E和EF环的氨基酸序列中含有修饰。
174.权利要求173的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
175.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求173或174的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
176.一种分离的多肽，其是通过权利要求175的方法鉴定的。
177.权利要求176的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
178.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的氨基酸残基序列77-83，所述10Fn3结构域在FG环中含有序列修饰，并且其中所述10Fn3以小于500nM的Kd与靶标结合。
179.权利要求178的多肽，其中所述FG环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基77-83的部分相对于野生型FG环的氨基酸残基序列77-83长度延长或长度缩短。
180.权利要求178或179的多肽，其中所述FG环单独介导与靶标的结合。
181.权利要求178-180中任一项的多肽，其中所述AB、BC、CD、DE或EF环中的一个或多个具有野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列。
182.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的氨基酸残基序列77-83，所述10Fn3结构域在FG环中含有序列修饰。
183.权利要求182的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
184.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求182或183的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
185.一种分离的多肽，其是通过权利要求184的方法鉴定的。
186.权利要求200的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
187.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列，所述10Fn3结构域在BC环的一部分和FG环的一部分中含有序列修饰，并且其中与相对于野生型BC环在BC环的更大部分中具有修饰的等价10Fn3结构域相比，该10Fn3结构域具有降低的免疫原性。
188.权利要求187的多肽，其中所述BC环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的残基28和29。
189.权利要求187的多肽，其中所述BC环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的残基27-29。
190.权利要求187的多肽，其中所述BC环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的残基24-29。
191.权利要求187-190中任一项的多肽，其中所述FG环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的残基77-83。
192.权利要求187-190中任一项的多肽，其中所述FG环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的残基72-82。
193.权利要求187-190中任一项的多肽，其中所述FG环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的残基77-86。
194.权利要求187-190中任一项的多肽，其中所述FG环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环残基77-79。
195.权利要求191-194中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的相应部分，所述FG环中的被修饰部分具有插入或缺失。
196.权利要求187-195中任一项的多肽，其中所述BC和FG环贡献于对靶标的结合。
197.权利要求187-196中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的DE环的序列，所述10Fn3结构域在DE环的一部分中进一步含有序列修饰。
198.权利要求197的多肽，其中DE环中被修饰的部分对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的DE环的残基52和53.
199.权利要求187-198中任一项的多肽，其中与在氨基酸残基23-27的一个或多个中相对于野生型BC环中的相应位置进一步包含修饰的等价10Fn3结构域相比，该10Fn3结构域具有降低的免疫原性。
200.权利要求187-199中任一项的多肽，其中所述10Fn3结构域以小于500nM的Kd与靶标结合。
201.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列，所述10Fn3结构域在BC环的一部分和FG环的一部分中含有序列修饰。
202.权利要求201的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
203.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求201或202的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
204.一种用于增加鉴定出结合靶标并具有降低的免疫原性的多肽的可能性的方法，包括筛选权利要求201或202的文库以鉴定出结合所述靶标的多肽。
205.一种分离的多肽，其是通过权利要求203或204的方法鉴定的。
206.权利要求205的分离的多肽，其中所述多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
207.一种包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域在BC环和β-链B或β-链C中的至少一个中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环和β-链的序列含有序列修饰，并且其中与在β-链B或β-链C中的至少一个中相对于野生型不具有序列修饰的等价10Fn3结构域相比，该10Fn3结构域具有降低的免疫原性。
208.权利要求207的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的BC环的氨基酸序列，所述BC环的氨基酸序列长度延长或长度缩短。
209.权利要求207或208的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的最先7个氨基酸残基的氨基酸序列，所述10Fn3结构域进一步在最先7个氨基酸残基的氨基酸序列中含有修饰。
210.权利要求207-209中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环的序列，10Fn3结构域进一步在DE环、FG环或两者中含有修饰。
211.权利要求210的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1或6)的DE环的氨基酸序列，所述DE环的氨基酸序列长度延长或长度缩短。
212.权利要求210或211的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的FG环的氨基酸序列，FG环的氨基酸序列长度延长或长度缩短。
213.权利要求210-212中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列，所述10Fn3结构域在DE环中含有序列修饰，并进一步在β-链D、β-链E或两者中含有序列修饰。
214.权利要求210-212中任一项的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应β-链的序列，所述10Fn3结构域在FG环中含有序列修饰，并进一步在β-链F、β-链G或两者中含有序列修饰。
215.权利要求207-214中任一项的多肽，其中所述BC环的对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的BC环的氨基酸残基27-31的部分相对于野生型BC环的相同部分具有被修饰的氨基酸序列。
216.权利要求207-215中任一项的多肽，其中所述BC环在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基26和32的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
217.权利要求207-216中任一项的多肽，其中β-链D在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基48和50的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
218.权利要求207-217中任一项的多肽，其中β-链F在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基72和74的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
219.权利要求207-218中任一项的多肽，其中β-链G在对应于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的氨基酸残基88和90的氨基酸残基之间含有插入或缺失。
220.权利要求207-219中任一项的多肽，其中疏水核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)没有被修饰。
221.一种文库，其含有多个包含人3型纤连蛋白第十(10Fn3)结构域的多肽，其中相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或6)的相应环和β-链的序列，所述10Fn3结构域在BC环以及β-链B或β-链C的至少一个中包含序列修饰。
222.权利要求221的文库，其中该文库包含至少105个多肽，每一个多肽包含不同的10Fn3结构域序列。
223.一种用于鉴定结合靶标的多肽的方法，包括筛选权利要求221或222的文库以鉴定结合该靶标的多肽。
224.一种用于增加鉴定出结合靶标并具有降低的免疫原性的多肽的可能性的方法，包括筛选权利要求221或222的文库以鉴定出结合所述靶标的多肽。
223.一种分离的多肽，其是通过权利要求223或224的方法鉴定的。
224.权利要求223的分离的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd与靶标结合。
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