CH656640A5

CH656640A5 - Verfahren zur herstellung eines polypeptids.

Info

Publication number: CH656640A5
Application number: CH11417/78A
Authority: CH
Inventors: Arthur Dale Riggs
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1977-11-08
Filing date: 1978-11-06
Publication date: 1986-07-15
Also published as: SE7811458L; BG38166A3; AT373280B; IL55890A0; DE2862496D1; GB2008123B; KE3449A; ATA793578A; GB2008123A; NO855217L; NO158880C; NZ188837A; DD145928A5; JPH0123118B2; BE871782A; IE782192L; DE2848052A1; NL7811041A; IE47890B1; IT7829519A0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids durch Expression einer DNA-Sequenz, die für dieses Polypeptid codiert, in einem rekombinanten mikrobiel-len Clonierungsträger. Weiterhin betrifft sie folgende Gegenstände: Ein Verfahren der genannten Art zur Herstellung eines bestimmten, weniger Aminosäuren enthaltenden Polypeptids durch Ausführung des erstgenannten Verfahrens und Abspaltung einer Aminosäuresequenz; einen in beiden Verfahren zu verwendenden rekombinanten Clonierungsträger; Bakterien und Bakterienkulturen, die den Clonierungsträger enthalten; und schliesslich Verfahren zur Herstellung der zwei Arten der genannten Polypeptide mittels der erfindungsge-mässen Bakterien sowie spezielle Clonierungsträger.

Genetische Information befindet sich auf dem Desoxyri-bonucleinsäure-Doppelstrang («DNA» oder «Gene») in Form der Reihenfolge, in der der eine spezifische Information, den Code, liefernde DNA-Strang die charakteristischen Basen seiner sich wiederholenden Nucleotidbestandteile darbietet. Die Expression («Merkmalsauslösung» oder «-ausbil-dung») der spezifischen oder codierten Information zur Bildung von Polypeptiden erfolgt in einem zweiteiligen Prozess. Entsprechend den Befehlen bestimmter Regulationsbereiche (Regulationsgene oder «Regulone») im Gen kann RNA-Po-lymerase zur Bewegung entlang dem den Code liefernden Strang veranlasst werden, wobei Matrizen-RNA (m-RNA) oder Messenger-RNA (Ribonucleinsäure) in einem als Transkription oder «Herstellung einer Arbeitskopie» bezeichneten Prozess gebildet wird. In einer anschliessenden Translations- . Stufe verwandeln die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit der im Cytoplasma löslichen Ribonucleinsäure, der t-RNA oder Transfer-RNA, die Botschaft oder Information der m-RNA in Polypeptide. Zu der Information, die m-RNA von DNA transkribiert, gehören auch Signale für den Beginn und die Beendigung der Ribosomenübertragung sowie für die Identität und Sequenz der Aminosäuren, aus denen das Polypeptid besteht. Der codierende DNA-Strang enthält lange Sequenzen von Nucleotid-Tripletts, die als Codierungseinheiten oder «Codone» bezeichnet werden, weil die charakteristischen Basen der Nucleotide in jedem einzelnen Triplett oder Codon spezifische Informationsbits zum Code beitragen. Beispielsweise ergeben 3 als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) bezeichnete Nucleotide ein m-RNA-Signal, das als «beginne mit der Übertragung» verstanden wird, während Beendigungsco-done TAG, TAA und TGA als «beendige die Übertragung» verstanden werden. Zwischen den Beginn- und Beendigungs-codonen liegen die sogenannten Strukturgene, deren Codone die schliesslich übertragene Aminosäuresequenz bestimmen

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

656 640

oder definieren. Diese Definition verläuft nach dem allgemein gesicherten «genetischen Code» (vgl. z.B. J. D. Watson, Mo-lecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin Inc., N.Y., 3. Aufl. 1976), der die Codone für die verschiedenen Aminosäuren umschreibt. Der genetische Code ist in dem Sinn degeneriert, dass verschiedene Codone die gleiche Aminosäure ergeben können, aber insofern genau als es für jede Aminosäure ein Codon oder mehrere Codone für diese Säure und keine andere gibt. So beinhalten beispielsweise alle der Codone TTT, TTC, TTA und TTG, wenn als solche gelesen, die Information für Serin und keine andere Aminosäure. Während der Transkription muss die richtige Reihenfolge oder der richtige Ableserahmen aufrecht erhalten werden. In diesem Zusammenhang ist zum Beispiel zu bedenken, was geschieht, wenn die die Arbeitskopie erzeugende RNA-Polymerase verschiedene Basen als den Anfang eines Codons (unterstrichen) in der Sequenz .. ..GCTGGTTGTAAG.... liest: ... GCTGGTTGTAAGAla-Gly-Cys-Lys .. .. .GCTGGTTGTAAG .. Leu-Yal-Leu ...

... GCTGGTTGTAAA ... ->•... Trp-Leu-(STOP).

Das schliesslich erzeugte Polypeptid hängt dann in ausschlaggebender Weise von der räumlichen Beziehung des Strukturgens zu dem Regulon ab.

Ein besseres Verständnis des Prozesses der genetischen Expression oder Merkmalsausbildung soll durch die Definition bestimmter Genbestandteile gefördert werden:

Operon - ein Gen aus Strukturgen oder -genen für die Po-lypeptidsynthese und dem Regulationsbereich («Regulon»), der diese Synthese regelt.

Promoter - ein Gen innerhalb des Régulons, womit RNA-Polymerase eine Verbindung zum Beginn der Transkription eingehen muss.

Operator - ein Gen, mit dem Repressorprotein eine Verbindung eingeht und dadurch die Bindung von RNA-Poly-merase an dem benachbarten Promotor verhindert.

Induktor-eine Substanz, die Repressorprotein entaktiviert, indem sie den Operator freisetzt und eine Verbindung der RNA-Polymerase mit dem Promoter ermöglicht und damit den Beginn der Transkription einleitet.

Catabolitaktivatorprotein («CAP»)-Bindungsstelle - ein Gen, das zyklisches Adenosinmonophosphat («c AMP») -vermitteltes CAP bindet und üblicherweise gleichfalls für die Einleitung der m-Transkription erforderlich ist. Die CAP-Bindungsstelle kann in besonderen Fällen unnötig sein. Beispielsweise beseitigt eine Promotermutation in dem Laktose-operon des Phagen % plac UV5 die Notwendigkeit von cAMP und CAP für die Expression; J. Beckwith et al, J. Mol. Biol. 69, ISS-160 (1972).

Promoter-Operator-System - wie hier gebraucht, ein brauchbarer Regelbereich eines Operon hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens einer CAP-Bindungsstelle oder der Fähigkeit, Information für Repressorproteinexpression zu liefern.

Zur Definition und für den Gebrauch in der nachfolgenden Erörterung von Rekombinations-DNA werden noch folgende Begriffe erläutert:

Clonbildungsträger - nicht aus Chromosomen stammende doppelsträngige DNA enthaltend ein intaktes «Repli-con», so dass der Träger verdoppelt wird, wenn es durch einen Prozess der «Transformation» in einen einzelligen Organismus («Mikrobe») eingebracht wird. Ein so transformierter Organismus wird als «Transformat» bezeichnet.

Plasmid-für die vorliegenden Zwecke ein Clonbildungsträger, der aus Viren oder Bakterien stammt, wobei es sich bei den letzteren um «bakterielle Plasmide» handelt.

Komplementarität- durch die Basensequenzen von DNA-Einzelsträngen, die die Bildung von doppelsträngiger DNA

durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen auf den betreffenden Strängen ermöglichen, übertragene Eigenschaft. Adenin (A) passt komplementär zu Thymin (T), während Guanin (G) komplementär zu Cytosin (C) ist.

Die Fortschritte auf dem Gebiet der Biochemie in den s letzten Jahren haben zu der Konstruktion von «Rekombina-tions»-CIonbildungsträgern geführt, worin beispielsweise Plasmide, die exogene DNA enthalten, gebildet werden. In besonderen Fällen kann der Rekombinationspartner «heterologe» DNA enthalten, worunter DNA verstanden wird, die Informationen für Polypeptide liefert, die normalerweise von dem Organismus nicht erzeugt werden, der einer Transformation durch den Rekombinationsträger zugänglich ist. So werden Plasmide unter Bildung von linearer DNA mit verbind-15 baren Enden oder Termini gespalten. Diese werden mit einem exogenen Gen mit verbindbaren Termini unter Bildung einer biologisch funktionsfähigen Gruppe mit einem intakten Re-plieon und einer angestrebten phänotypischen Eigenschaft verbunden. Die Rekombinationsgruppe wird durch Transfor-20 mation in einen Mikroorganismus eingebracht, und Transformanten werden isoliert und mit dem Ziel zur Clonbildung gebracht, grosse Populationen zu erhalten, die zur Expression der neuen genetischen Information fähig sind.

Methoden und Mittel zur Ausbildung von Rekombina-25 tionsclonbildungsträgern und zur Transformation von Organismen mit denselben sind in der Literatur ausführlich beschrieben, vgl. z.B. H. L. Heynecker et al, Nature 263, 748-752 (1976); Cohen et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 69, 2110 (1972); ibid., 70,1293 (1973); ibid., 70,3240 (1973); 30 ibid., 71,1030 (1974); Morrow et al, Proe. Nat. Acad. Sei, USA 71,1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 33,210 (1969); Hershfield et al, Proe. Soc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 (1974) and Jackson et al, ibid. 69,2904 (1972). Eine verallgemeinerte Darstellung dieses Gegenstandes gibt S. Cohen 35 in Scientific American 233,24 (1975). Ausserdem wird auf den DTV-Atlas zur Biologie, 2. Auflage, Deutscher Taschenbuchverlag, München, 1968, Nachr. Chem. Tech. Lab. 26, 349 (1978) und die dort genannten Literaturstellen, Moleku-lar-Biologie, Umschau-Verlag Frankfurt a.M., 1967, Pflan-40 zenphysiologie von Dieter Hess, VTB, E. Ulmer GmbH Stuttgart, 1976 und Grundlagen der Biochemie, Otto Müller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1978, verwiesen. Alle diese Veröffentlichungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung.

45 Es gibt verschiedene bekannte Arbeitsweisen für die DNA-Rekombination, wobei aneinander angrenzende Enden einzelner DNA-Bruchstücke oder Fragmente auf die eine oder andere Weise zur Erleichterung der Bindung zugeschnitten werden. Der Ausdruck Bindung oder Verbindung bezieht 50 sich auf die Ausbildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen angrenzenden Nucleotiden, meist mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase. So können unempfindliche Enden direkt miteinander verbunden werden. Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren angrenzenden Enden können 55 stattdessen aber auch durch Wasserstoffbindung aktiviert werden, die die jeweiligen Enden für eine anschliessende Verbindung in eine geeignete Lage bringt. Solche Einzelstränge, die als Bindeenden oder Cohäsivtermini bezeichnet werden, können durch das Anfügen von Nucleotiden an unempfind-60 liehe Enden unter Verwendung von terminaler Transferase und manchmal einfach durch Abzwicken eines Strangs eines unempfindlichen Endes mit einem Enzym, wie Ä-Exonucle-ase, ausgebildet werden. Wiederum kann man sich, und dies ist das Üblichste, Restriktionsendonucleasen bedienen, die 65 Phosphodiesterbindungen in und um bestimmte Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren spalten. Viele Restriktionsendonucleasen und ihre Erken-

5 656 640

nungsstellen sind bekannt, wobei die sogenannte EcoRI-En- gegebenenfalls keine vergleichbaren selektiven Spaltstellen donuclease die am häufigsten angewandte ist. Restriktionsen- aufweist.

donucleasen, die doppelsträngige DNA bei rotationssymme- Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann die Erzeu-

trischen «Palindromen» spalten, lassen Cohäsivtermini zu- gung eines spezifischen Säuger-Polypeptidhormons oder Zwi-

rüclc. Somit kann ein Plasmid oder ein anderer Clonbildungs- s schenprodukte dafür so durchgeführt werden, dass das Struk-

träger unter Bildung von Termini gespalten werden, die je- turgen für eine erste Aminosäuresequenz codiert, auf die ein weils die Hälfte der Erkennungsstellen der Restriktionsendo- oder mehrere Stop-Codons folgen, und dem in Lesephase eine nuclase aufweisen. Ein mit der gleichen Restriktionsendo- DNA-Sequenz einer zweiten Aminosäuresequenz vorangeht,

nuclease erhaltenes Spaltprodukt von exogener DNA weist zu welche für ein anderes Protein codiert als die erste Aminosäu-

den Plasmidtermini komplementäre Enden auf. Wie weiter î0 resequenz, so dass man durch die Expression ein Polypeptid unten noch gezeigt, kann synthetische DNA mit Cohäsivter- erhält, das sowohl die Aminosäuresequenz des Gens als auch mini stattdessen auch für den Einbau in den gespaltenen Trä- des Proteins sowie eine selektive Spaltstelle neben der ersten ger vorgesehen werden. Zur Unterdrückung der Wiederverei- Aminosäuresequenz aufweist, wobei das Spalten in einem Sy-

nigung der Cohäsivtermini des Trägers während der Einfü- stein ausserhalb der replikativen Umgebung des Plasmids be-

gung von exogener DNA können die Termini mit alkalischer 15 wirkt wird.

Phosphatase aufgeschlossen werden, was zu einer Molekular- Gemäss einer speziellen Ausführungsart des erfindungsge-

selektion von Enden für den Einbau des exogenen Fragments mässen Verfahrens kann ein Vorläuferprotein verwendet wer-

führt. Der Einbau eines Fragments mit einer bezüglich ande- den, dem die Bioaktivität des Hormons fehlt. Nach dem Ver-

rer Merkmale des Trägers richtigen Orientierung kann eine fahren kann beispielsweise Somatostatin, Insulin, Human-

Unterstützung erfahren, wenn sich das Fragement auf Trä- 20 Wachstumshormon oder Rinderwachstumshormon herge-

ger-DNA befindet, die durch zwei verschiedene Restriktions- stellt werden. Als Mittel zur selektiven Spaltung kann Brom-

endonucleasen herausgeschnitten worden ist und selbst Ter- cyan verwendet werden, und man gewinnt als Spaltprodukt mini aufweist, die jeweils die Hälfte der Erkennungssequenz dann ein methioninfreies Produkt, wie zum Beispiel Somato-

der verschiedenen Endonucleasen darstellen. statin.

Weitgespannte Bemühungen auf dem Gebiet der Rekom- 25 Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein mikrobiel-

binations-DNA-Forschung in den letzten Jahren haben nur 1er Rekombinations-Clonbildungsträger zur Verwendung in zu wenigen Ergebnissen geführt, die sich direkt praktisch ver- den genannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass er werten lassen. Dies hat sich besonders im Fall missglückter ein Regulon, eine DNA-Sequenz für ein Polypeptid, enthal-

Versuche gezeigt, durch «synthetische DNA» codierte Poly- tend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Amino-

peptide und dergleichen auszubilden, unabhängig davon, ob 30 säuresequenz, sowie einen oder mehrere Stop-Codons ent-

die synthetische DNA in üblicher Weise Nucleotid um Nu- hält, wobei die Codons, die für die zweite Aminosäurese-

cleotid aufgebaut oder durch Rücktranskription aus isolierter quenz codieren, zwischen das Regulon und die Stop-Codons in-RNA (komplementäre oder «cDNA») erhalten worden ist. ohne Änderung der Lesephase der genannten DNA-Sequenz

In dieser Beschreibung wird angegeben, as allem Anschein eingefügt sind, und der in der Lage ist, durch Expression ein nach die erste Expression eines funktionellen Polypeptidpro- 35 Polypeptid zu bilden, das sowohl die erste als auch die zweite dukts aus einem synthetischen Gen darstellt, wobei auch da- Aminosäuresequenz enthält und neben der ersten Aminosäu-

mit zusammenhängende Entwicklungen mitgeteilt werden, resequenz eine selektive Spaltstelle aufweist.

die allgemeinere Anwendbarkeit verheissen. Das Produkt, auf in diesem Rekombinations-Clonbildungsträger kann das das Bezug genommen wird, ist Somatostatin (US-PS auszubildende Polypeptid keine vergleichbaren selektiven

3 904 594), ein Inhibitor der Sekretion von Wachstumshor- 40 Spaltstellen umfassen. Der mikrobielle Rekombinations-

mon, Insulin und Glucagon, dessen Wirkungen seine Anwen- Clonbildungsträger kann dabei ein bakterielles Plasmid sein,

dung bei der Behandlung von Acromegalie, akuter Pankreati- in dem die genannten Elemente die folgende Sequenz aufwei-

tis und von insulinabhängigem Diabetes begründen (vgl. R. sen: (Regulon) - (Codone für zusätzliches Protein) - (Codone

Guillemin et al, Annual Rev. Med. 27,379,1976). Das Soma- für zu bildendes Polypeptid) - Beendigungscodon(e)). Ein tostatinmodell lässt eindeutig die Anwendbarkeit der hier be- 45 spezielles derartiges Plasmid, in dem die Spaltstelle Methionin schriebenen neuen Entwicklungen auf mehreren wichtigen ist, kann zur Herstellung von Somatostatin geeignet sein.

Gebieten erkennen, wie dies auch aus den beigefügten Zeich- Des weiteren betrifft die Erfindung aus einem oder mehre-

nungen und der weiteren Beschreibung hervorgeht. ren Bakterien mit derartigen Plasmiden geclonte Transforma-

Die Erfindung betrifft nun zunächst ein Verfahren der in torenkulturen, deren Glieder zur Expression des Vorläufer-

der Einleitung erstgenannten Art, das sich dadurch auszeich- 50 proteins fähig sind.

net, dass die DNA-Sequenz ein heterologes Gen enthält, das Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist für eine erste Aminosäuresequenz codiert und in Lesephase ein Verfahren zur Herstellung einer ein Polypeptid aufweisen-

mit Codons ist, die für eine zweite Aminosäuresequenz codie- den immunogenen Substanz, das dadurch gekennzeichnet ist ren, so dass durch die Expression das Polypeptid erhalten dass wird, das beide Aminosäuresequenzen aufweist und eine se- ss (a) dn rekombinater mikrobieller Clonierungsträger mit lektive Spaltstelle neben der ersten Aminosäuresequenz einem heterologen Strukturgen für das Hapten und, in Leseaufweist. phase damit, eine DNA-Sequenz, die für eine zweite Amino-Das erfindungsgemasse Verfahren kann auch so gefuhrt säuresequenz codiert, in einer Grösse zur Verfügung gestellt werden, dass das zusätzliche Protein, sofern es überflüssig ist, wird, die zum Immunogenmachen des Produktes der DNA-nach der Expression des Vorläuferproteins an der genannten 60 Expression ausreicht- und dass selektiven Spaltstelle abgespalten wird. Dabei kann das über- (b) die Expression eines konjugierten Polypeptids der flüssige Protein eine oder mehrere der Aminosäuresequenz Aminosäuresequenz des Haptens und der zweiten Aminosäu-des Polypeptids entsprechende Aminosäuresequenzen aufwei- resequenz bewirkt wird.

sen, und es können alle Aminosäurensequenzen des Polypeptids in dem Vorläuferprotein durch selektive Spaltstellen von- 65 Bei diesem Verfahren kann die bewirkte Expression ein einander getrennt sein. Die Spaltung kann in einem System Produkt mit über 100 Aminosäuren, vorzugsweise ein Probewirkt werden, das sich ausserhalb der replicativen Umge- dukt mit über 200 Aminosäuren ergeben, wobei beispiels-bung des Clonbildungsträgers befindet, wobei das Polypeptid weise als Hapten, dem Immunogenität verliehen wird, Soma-

656 640

tostatin verwendet wird. Als Hapten, dem Immunogenität verliehen wird, kann auch ein solches mit der Aminosäuresequenz eines Spaltproduktes von viralem Mantelprotein verwendet werden, wobei das Spaltprodukt spezifisch durch Antikörper gebunden ist, der dem Mantelprotein entspricht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein mikrobieller Rekombinations-Clonbildungsträger, derein Regulon, ein Strukturgen, das für eine erste Aminosäuresequenz eines Polypeptidhaptens codiert, und einen oder mehrere Stop-Codons enthält, wobei eine DNA-Sequenz, die für eine zweite Aminosäuresequenz codiert, zwischen dem Regulon und dem bzw. den Stop-Codons ohne Änderung der Lesephase des Strukturgens eingefügt ist, so dass durch Expression ein konjugiertes Polypeptid erhalten wird, das im wesentlichen aus der ersten Aminosäuresequenz des Haptens und der zweiten Aminosäuresequenz besteht, wobei letzteres so ausreichend gross ist, dass es dem Konjugat Immunogenität verleiht.

In der folgenden Beschreibung werden bevorzugte Aus-führungsformen der Erfindungsgegenstände erläutert. In der Zeichnung stellen dar:

Fig. 1 einen Verfahrensverlauf zur Herstellung von Somatostatin,

Fig. 2 die Kartographie eines Gens,

Fig. 3 einen Verfahrensverlauf zur Herstellung von Nu-kleotid-Trimeren,

Fig. 4 einen Verfahrensverlauf zur Herstellung eines Re-kombinations-Plasmids,

Fig. 5 die Kartographie von pSOMl und pSOMll-3,

Fig. 6-8 Diagramme, Versuchsergebnisse darstellend,

Fig. 9 die Kartographie der B- und A-Ketten von Insulin, und

Fig. 10 die Herstellung eines Rekombinationsplasmids.

Die beigefügten Zeichnungen erläutern Zusammenhänge, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Anwendung finden, d.h. die Expression des Hormons Somatostatin durch bakterielle Transformanten mit Rekombina-tionsplasmiden, sowie die Erzeugung von Humaninsulin. Figur 1

Schematische Darstellung des Prozesses: Das durch chemische DNA-Synthese hergestellte Gen für Somatostatin wird an das ß-Galactosidase-Gen von E. coli auf dem Plasmid pBR322 angelagert. Nach Transformation in E. coli dirigiert das Rekombinationsplasmid die Synthese eines Vorläuferproteins, das in vitro durch Bromcyan spezifisch an den Methioninresten unter Bildung von aktivem Säugerpolypep-tidhormon gespalten werden kann. Mit A, T, C und G werden die charakteristischen Basen (Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) der Desoxyribonucleotide in dem codierten Strang des Somatostatingens bezeichnet.

Figur 2

Schematische Struktur eines synthetischen Gens, dessen Codierstrang (d.h. der «obere» Strang) Codone für die Aminosäuresequenz von Somatostatin (wie angegeben) aufweist. Figur 3

Schematische Erläuterung der bevorzugten Methode zum Aufbau von Nucleotidtrimeren, die zum Aufbau von synthetischen Genen eingesetzt werden. Bei der angewandten üblichen Bezeichnung für die Darstellung von Nucleotiden in Figur 3 befindet sich das 5'-OH links und das 3'-OH rechts, zum Beispiel B

3'

10

20

30

35

40

50

55

60

5'

HC)

'OH

65

Figur 4

Fliessschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids (zum Beispiel pSOMl 1-3,) das zur Ausbildung eines Somatostatin («SOM») enthaltenden Proteins fähig ist, ausgehend von dem Stammplasmid pBR322. Das ungefähre Molekulargewicht eines jeden Plasmids wird in Dalton («d») angegeben. Apr bzw. Tcr bezeichnen Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, und Tcs bedeutet Tetracyclinempfind-lichkeit infolge der Herausnahme eines Teiles des Tcr-Gens. Die Verhältnisse der Orte der verschiedenen, für Restriktions-endonuclease spezifischen Spaltstellen auf den Plasmiden zueinander sind angegeben (zum Beispiel EcoRI, BamI, etc.). Figuren JA und 5B

Es sind die Nucleotidsequenzen der Schlüsselteile von zwei Plasmiden dargestellt sowie die Richtung der Messenger-RNA-(«mRNA»)-Transkription, die stets von dem 5'-Ende des Codierstranges ausgeht. Die Restriktionsendonuclease-Substratstellen sind wie dargestellt. Jede wiedergegebene Sequenz enthält sowohl die Steuerelemente des lac-(Lactose)-Operons, als auch Codone zur Expression der Aminosäuresequenz von Somatostatin (kursiv). Die Aminosäuresequenzzahlen für ß-Calactosidase («ß-gal») stehen in Klammern. Figuren 6 bis 8

Wie weiter unten noch näher ausgeführt, sind in diesen Figuren die Ergebnisse vergleichender Radioimmunprüfungs-versuche dargestellt, die die Somatostatinaktivität des durch die Rekombinationsplasmide ausgebildeten Produkts zeigen. Figur 9

Schematische Struktur von synthetischen Genen, deren codierende Stränge Codone für die Aminosäuresequenz des A- und B-Strangs von Humaninsulin aufweisen.

Figur 10

Fliessschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids, das zur Expression der B-Kette von Humaninsulin fähig ist.

1. Herstellung von Genen, die den Code für heterologe Polypeptide liefern

Den Code für ein beliebiges Polypeptide mit bekannter Aminosäuresequenz liefernde DNA kann durch Auswahl der Codone nach dem genetischen Code hergestellt werden. Zur Erleichterung der Reinigung und dergleichen werden Oligodesoxyribonucleotidfragmente aus beispielsweise etwa 11 bis 16 Nucleotiden gesondert zubereitet und dann in der gewünschten Reihenfolge angeordnet. Man bereitet also erste und zweite Reihen von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten von zweckmässiger Grösse. Die Verbindung der ersten Reihen in der richtigen Sequenz führt zu einem DNA-Codier-strang zur Polypeptidexpression (vergleiche z.B. Figur 2, Fragmente A, B, C und D). Die zweiten Reihen führen nach entsprechender Verbindung in der richtigen Reihenfolge zu einem Strang, der zu dem Codierstrang komplementär ist (zum Beispiel Figur 2, Fragmente E, F, G und H). Die Fragmente der jeweiligen Stränge überlappen vorzugsweise derart, dass die Komplementarität ihre Selbstanordnung über Wasserstoffbindung der Cohäsivtermini von Fragmentblöcken begünstigt. Nach dieser Anordnung bzw. diesem Aufbau wird das Strukturgen durch Verbinden oder Verknüpfen in der ûblichén Weise fertiggestellt.

Die Degeneration oder Entartung des genetischen Codes ermöglicht beträchtliche Freiheit bei der Wahl von Codonen für eine gegebene Aminosäuresequenz. Für die erfmdungsge-mässen Zwecke wird jedoch die Codonwahl durch drei Überlegungen erleichtert. Erstens werden Codone und Fragmente ausgewählt, und die Zusammenstellung der Fragmente erfolgt stufenweise, um eine unzulässige Komplementarität der Fragmente untereinander zu vermeiden, abgesehen von den Fragmenten, die in dem angestrebten Gen nebeneinander lie-

gen. Zweitens werden an AT-Basenpaaren (z.B. etwa fünf oder mehr) reiche Sequenzen vermieden, insbesondere, wenn ihnen eine an GC-Basenpaaren reiche Sequerizvorangeht, wodurch eine vorzeitige Beendigung der Transkription vermieden wird. Drittens besteht wenigstens ein grösserer Teil

656 640

der gewählten Codone aus solchen, die für die Expression von mikrobiellen Genomen (vgl. zum Beispiel W.Fiers, et al, Nature 260,500,1976) bevorzugt sind. Als für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone werden die folgenden bezeichnet:

Tabelle I

Bevorzugte Bedeutung von Codonen erste Stellung zweite Stellung (von links nach rechts) (5'-Ende)

(von oben nach unten) T C A

A

phe phe leu leu leu leu ile ile met (Start)

vai vai vai vai ser ser pro pro pro pro thr thr thr ala ala tyr

Stop

Stop his his gin gin asn asn lys asp asp glu glu

G

cys

Stop trp arg arg ser giy dritte Stellung (3'-Ende) (von oben nach unten)

T C A G

40

Im Fall von Somatastin am stärksten bevorzugt sind folgende Aminosäure-(Codon)-beziehungen des Strukturgens: gly (GGT); cys (TGT); lys (AAG); trp (TGG); ala (GCT, GCG); asn (AAT, AAC); phe (TTC, TTT); thr (ACT, ACG); und ser (TCC, TCG).

- • Wenn -das Strukturgen eines angestrebten Polypeptids in einen Clonbildungsträger zur Expression als solches eingeführt werden soll, wird dem Gen ein «Start»-Codon (zum Bei- 45 spiel ATG) vorangestellt, und ihm folgen unmittelbar ein oder mehrere Beendigungs- oder Stop-Codone (vergleiche Fi-gur.2). Die Aminosäuresequenz eines bestimmten Polypeptids kann jedoch, wie unten beschrieben, mit weiterem Protein ausgebildet werden, das ihr vorangeht und/oder folgt. Wenn der Verwendungszweck des Polypeptids Spaltung des weiteren Proteins erfordert, werden entsprechende Spaltstellen neben der Polypeptid - weiteres Protein - Codon-Bindung ein-codiert. Sö ist beispielsweise in Figur 1 das Produkt der Expression ein Vorläufer-Protein aus Somatostatin und dem grössten Teil des ß-Galactosidase-Polypeptids. In diesem Fall ist ATG zum Codieren für den Start der Translation nicht erforderlich, weil die Ribosomenkonstruktion des zusätzlichen • ß-gal-Proteins das Somatostatinstrukturgen durchliest. Der Einbau des ATG-Signals ergibt jedoch den Code für die Erzeugung von Methionin, eine Aminosäure, die durch Bromcyan spezifisch gespalten wird, woraus sich eine einfache Methode zur Umwandlung von Vorläuferprotein in das erstrebte

Polypeptid ergibt.

Figur 2 erläutert ein weiteres bevorzugtes Merkmal für he- & terologe DNA, die zur Rekombination verwendet werden soll, d.h. das Cohäsivtermini vorgesehen sind, die vorzugsweise einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonuclea-

50

55

60

se-Erkennungsstelle umfassen. Aus den oben erörterten Gründen werden die Termini vorzugsweise dazu bestimmt, nach Rekombination einzelne verschiedene Erkennungsstellen hervorzurufen.

Nachdem die beschriebenen Entwicklungen als in Verbindung mit dem Somatostatinmodell erfolgreich verlaufend nachgewiesen wurden, wird anerkannt werden, dass eine heterologe DNA-Codierung für praktisch jede bekannte Aminosäuresequenz mutatis mutandis angewandt werden kann. So sind die beschriebenen und noch zu beschreibenden Arbeitsweisen mutatis mutandis auf die Erzeugung von Polyamino-säuren, wie Polyleucin und Polyalanin, Enzymen, Serumproteinen und analgetischen Polypeptiden, wie ß-Endorphinen anwendbar, die Schmerzschwellen etc. beeinflussen können. Die erzeugten Polypeptide sind vorzugsweise als solche Säugerhormone oder Zwischenprodukte dafür. Zu solchen Hormonen gehören u.a. Somatostatin, Humaninsulin, Human-und Rinderwachstumshormon, luteinisierendes Hormon. ACTH und Pankreaspolypeptid. Zu den Zwischenprodukten gehören u.a. Humanvorproinsulin, Humanproinsulin und die A- und B-Ketten von Humaninsulin. Ausser in vitro hergestellter DNA kann die heterologe DNA cDNA enthalten, die bei der Rücktranskription von mRNA gebildet wird, vergleiche z.B. Ullrichetal, Science 196,1313, 1977.

2, Rekombinationsstoffe mit einem Code für die Expression von Vorläuferprotein

Bei dem in Figur 1 schematisch dargestellten Prozess liefert die Expression ein Vorläuferprotein, das durch ein spezifisches heterologes Strukturgen (Somatostatin) codiertes Po-

656 640 8

lypeptid und ausserdem Protein (das einen Teil des ß-Galac- Protein ausreichender Grösse für eine Immunogenität ausge-tosidaseenzyms enthält) umfasst. Eine selektive Spaltstelle ne- bildet werden. Das ß-gal-Somatostatin-Konjugat, dessen ben der Somatostatin-Aminosäuresequenz ermöglicht eine Herstellung hierin beschrieben ist, ist tatsächlich von immu-nachfolgende Abtrennung des angestrebten Polypeptids von nogener Grösse und kann deshalb Antikörper erzeugen, die überflüssigem Protein. Der erläuterte Fall ist für eine grosse 5 das Somatostatinhapten binden. Proteine mit mehr als 100 Gruppe von Arbeitsweisen repräsentativ, die durch die Erfin- Aminosäuren, meist mit mehr als 200 Aminosäuren, zeigen dung erschlossen worden sind. immunogenen Charakter.

In den meisten Fällen wird die Spaltung ausserhalb der replikativen Umgebung des Plasmids oder anderen Trägers, Wie vorstehend beschrieben hergestellte Konjugate kön-beispielsweise nach Gewinnung der mikrobiellen Kultur be- 10 nen zur Bildung von Antikörpern verwendet werden, die sich wirkt. Auf diese Weise kann eine temporäre Konjugation von in Radioimmun- oder anderen Prüfungen auf das Hapten kleinen Polypeptiden mit überflüssigem Protein erstere, zum und auch für die Erzeugung von Vaccinen eignen. Im folgen-Beispiel gegen einen in vivo erfolgenden Abbau durch endo- den wird ein Beispiel für die letztgenannte Anwendung gege-gene Enzyme, schützen. Gleichzeitig bringt das zusätzliche ben. Bromcyan- oder andere Spaltprodukte von viralem Protein gewöhnlich das angestrebte Polypeptid um seine Bio- 15 Mantelprotein ergeben Oligopeptide, die sich an Antikörper aktivität während der extracellulären Spaltung, wodurch die binden, der selbst zu dem Protein wird. Erhält sie die Amino-biologische Gefahrlosigkeit des Vorgangs erhöht wird. In be- säuresequenz eines solchen Oligopeptidhaptens, kann daher sonderen Fällen ist es natürlich zweckmässig, die Spaltung in- heterologe DNA als Konjugat mit weiterem Protein ausgebil-nerhalb der Zelle zu bewirken. Beispielsweise können mit det werden, das Immunogenität beisteuert. Solche Konjugate DNA mit einem Code für Enzyme, die Insulinvorläufer in die 2o können als Vaccinen verwendet werden, die geringere Nebenaktive Form überführen, Clonbildungsträger ausgebildet Wirkungen zeigen, als sie mit der Verwendung von Mantelwerden, die mit einer anderen DNA mit einem Code für die protein selbst zur Erzielung von Immunität verbunden sind. Expression der Vorläuferform zusammenarbeiten.

In einem bevorzugten Fall fehlen dem bestimmten ange- 4. Die Kontrollelemente strebten Polypeptid innere Spaltstellen entsprechend demjeni- 25 In Figur 1 ist ein Prozess dargestellt, bei welchem ein gen, das zum Abwerfen von überflüssigem Protein verwendet Transformantorganismus ein Polypeptidprodukt aus hetero-wird, doch können, wie ohne weiteres ersichtlich, auch dann, loger DNA ausbildet, die unter die Kontrolle eines Régulons wenn diese Bedingung nicht erfüllt ist, konkurrierende Reak- «homolog» zu dem Organismus in seinem nicht umgewandel-tionen das angestrebte Produkt liefern, wenn auch in geringe- ten oder untransformierten Zustand gebracht worden ist. rer Ausbeute. Wenn das angestrebte Produkt methioninfrei 30 Chromosomen-DNA von lactoseabhängigem E. coli enthält sein soll, dann erweist sich eine Bromcyanspaltung beim als ein Lactose- oder «lac»-Operon, das den Lactoseauf-

Methionin neben der angestrebten Sequenz als hoch wirksam, schluss u.a. durch Bildung des Enzyms ß-Galactosidase ver-In entsprechender Weise können arginin- und lysinfreie Pro- mittelt. In dem erläuterten Fall werden die lac-Kontrollele-dukte, zum Beispiel mit Trypsin oder Chymotrypsin bei arg- mente aus einem Bakteriophagen, X plac 5, erhalten, der für arg, lys-lys oder ähnlichen Spaltstellen neben der angestreb- 35 E. coli infektiös ist. Das lac-Operon des Phagen war seiner-ten Sequenz enzymatisch gespalten werden. Falls bei der seits durch Überführung aus der gleichen bakteriellen Species

Spaltung beispielsweise unerwünschtes Arginin an das ange- erhalten worden, daher die «Homologie». Homologe Regu-strebte Produkt gebunden bleibt, kann es durch Carboxypep- Ione, die sich zur Verwendung in dem beschriebenen Verfah-tidaseaufschluss entfernt werden. Bei Verwendung von Tryp- ren eignen, können stattdessen auch aus für den Organismus sin zur Spaltung bei arg-arg können Lysinstellen innerhalb 40 nativer Plasmid-DNA stammen.

des angestrebten Polypeptids vorher geschützt werden, bei- Die Einfachheit und Wirksamkeit des lac-Promoter-Ope-

spielsweise mit Maleinsäure- oder Citraconsäureanhydrid. rator-Systems begründen seine Verwendung in dem beschrie-Die beispielsweise erörterten Spaltarbeitsweisen sind lediglich benen System genauso wie seine Fähigkeit, von IPTG repräsentative Varianten der vielen verschiedenen Möglich- (Isopropylthio-ß-D-galactosid) induziert zu werden. Selbst-keiten, die für den Fachmann aufgrund der hier angegebenen 45 verständlich können auch andere Operone oder Teile davon Lehre offensichtlich sind. verwendet werden, zum Beispiel /.-Promoter-Operator, Ara-

Abspaltbares Protein kann am C- oder N-Ende eines be- binose-Operon (phi 80 dara) oder die Colicin El-, Galactose-, stimmten Polypeptids oder sogar innerhalb des Polypeptids alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Operone. Aus dem selbst ausgebildet werden, wie dies bei der Einschlusssequenz, letzteren, (d.h «Tryp-Operon») stammende Promoter-Opera-durch die sich Proinsulin und Insulin voneinander unterschei- so toren können 100-prozentige Repression während der Induk-den, der Fall ist. Wiederum kann der verwendete Träger den tion (mit Indolacrylsäure) und Gewinnung vermitteln.

Code für die Expression von Protein mit sich wiederholenden

Sequenzen des angestrebten Polypeptids liefern, die jeweils 5. Plasmidaufbau, allgemein durch selektive Spaltstellen voneinander getrennt sind. Es ist Die Einzelheiten des in Figur 4 schematisch erläuterten jedoch besonders bevorzugt, wenn Codone für überflüssiges 55 Prozesses ergeben sich aus dem weiter unten folgenden experi-Protein vor dem Strukturgen des angestrebten Produkts über- mentellen Teil. Bei diesem Punkt ist es jedoch von Nutzen, ei-tragen werden, wie bei dem in den Figuren erläuterten Fall. In nige der zum Aufbau des Rekombinationsplasmids der beallen Fällen soll für die Aufrechterhaltung des passenden Ab- vorzugten Ausführungsform angewandten Arbeitsweisen leserahmens in Bezug auf das Regulon gesorgt werden. kurz zu erörtern.

60 Bei der Clonbildung und Expression des synthetischen So-3. Expression von Immunogenen matostatingens werden zwei Plasmide verwendet. Jedes Plas-

Die Fähigkeit, sowohl ein spezifisches Polypeptid als auch mid hat eine EcoRI-Substrat-Stelle bei einem anderen Bereich überflüssiges Protein auszubilden, ergibt ein brauchbares des ß-Galactosidase-Strukturgens (vgl. Fig. 4 und 5). Die EinMittel für die Erzeugung von immunogenen Substanzen. Po- fügung des synthetischen Somatostation-DNA-Fragments in lypeptid-«Haptene» (d.h. Substanzen, die spezifisch durch es die EcoRI-Stellen dieser Plasmide bringt die Expression der Antikörper und ähnliche Stoffe gebundene Determinanten genetischen Information in das Fragment ein, das sich unter enthalten, aber gewöhnlich zu klein sind, um eine Immunwir- der Kontrolle der lac-Operon-Kontrollelemente befindet, kung hervorzurufen) können als Konjugate mit zusätzlichem Nach der Einfügung des Somatostatinfragments in diese Pias-

9 656 640

mide sollte die Translation zu einem Somatostatinpolypeptid RI-lac-Fragments von X plac5 sind zu erwarten. Eine davon führen, dem entweder 10 Aminosäuren (pSOMl) oder prak- würde den richtigen Ableserahmen bis in das Somatostatin-tiseh die gesamte ß-Galactosidase-Untereinheitsstruktur gen hinein behalten und die andere nicht. Die Analyse von für

(pSOM 11-3) vorangestellt ist. sich allein isolierten Clonen auf Somatostatinaktivität ergibt

Das Schema des Plasmidaufbaus beginnt mit dem Pias- 5 dann Clone, die das richtig orientierte Gen enthalten, und ei-mid pBR322, einem wohldefinierten Clonbildungsträger. Die ner dieser Clone wird als pSOMl 1-3 bezeichnet.

Einführung der lac-Elemente in dieses Plasmid erfolgt durch

Einfügung eines Haelll-Restriktions-Endonucleasefragments 6. Der Mikroorganismus

(203 Nucleotide), das den lac-Promoter, die CAP-Bindungs- Als mögliche Organismen für die Transformation sind stelle, den Operator, die Ribosomenbindungsstelle und die er- 10 verschiedene einzellige Mikroorganismen vorgeschlagen wor-sten 7 Aminosäurecodone des ß-Galactosidase-Strukturgens den, beispielsweise Bakterien, Fungi und Algen. Dabei hanaufweist. Das HaeIH -Fragement stammt aus X plac5 DNA. delt es sich um solche einzelligen Organismen, die in Kulturen Das EcoRI-gespaltene pBR322-Plasmid, dessen Termini mit oder durch Fermentation gezüchtet werden können. Bakte-T4 DNA-Polymersase und Desoxyribonucleotidtriphospha- rien sind grösstenteils die für das Arbeiten damit am besten ten wieder hergestellt worden waren, wird stumpfendig mit 15 geeigneten Organismen. Zu einer Transformation zugängli-dem Haelll-Fragement verbunden, wodurch EcoRI-Termini chen Bakterien gehören Enterobacteriaceae, zum Beispiel an den Einfügungspunkten erzeugt werden. Durch Verbinden Stämme von Escherichia coli und Salmonella; Bacillaceae, dieser HaeIH- und wiederhergestellten EcoRI-Termini wer- wie Bacillus subtitis; Pneumococcus, Streptococcus und Hae-den die EcoRI-Restriktionsstellen (vergleiche Figur 4 und 5) mophilus influenzae.

an jedem Terminus erzeugt. Transformanten von E. coli RR1 20 Der für die folgenden beschriebenen experimentellen Ar-mit dieser DNA werden auf einem 5-Brom-4-chlor-incolylga- beiten gewählte Organismus istE. coli, Stamm RR 1, Geno-lactosid-(X-gal)-Madium auf Resistenz gegen Tetracyclin typ: Pro~Leu"Thi~RB~MB ree A+ Strr Lac y~. E.

(Tc) und Ampicillin (Ap) selektioniert. Auf diesem Indikator- coli RR1 wird aus E. coli HB101 (H. W. Boyer et al, J. Mol. medium können Kolonien, die für die Synthese von ß-Galac- Biol. (1969) 41,459-472) durch Paarung mit E. coli Kl2 tosidase aufgrund der erhöhten Anzahl von lac-Operatoren, 25 Stamm KL16 als Hfr-Donor, vgl. J. H. Miller, Experiments die Repressor titrieren, verantwortlich sind, durch ihre blaue in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York,

Farbe identifiziert werden. Zwei Orientierungen des HaeIH- 1972) [Kulturen von Coli RR1 und E. Coli RR1 (pBR322) Fragments sind möglich, aber sie werden aufgrund der asym- sind am 8. November 1977 bei der American Type Culture metrischen Lage einer Hha-Restriktionsstelle in dem Frag- Collection ohne irgendwelche Beschränkung hinsichtlich der ment unterschieden. Das Plasmid pBHIO wird weiter modifi- 30 Zugänglichkeit hinterlegt worden und haben die ATCC-ziert, wodurch die zu dem lac-Operator (pB20) distale EcoRI- Nummern 31 343 und 31 344 erhalten].

Endonuclease-Stelle eliminiert wird. Der Somatostatin erzeugende Organismus ist am 28. Ok-

Die acht chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleo- tober 1978 der American Type Culture Collection, 12 301,

tide (Figur 2) werden an den 5'-Termini mit [32P]-gamma-ATP Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 - US, mit der durch Polynucleotidkinase markiert und mit T4 DNA-Li- 35 Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 447 hinterlegt worden, gnase verbunden. Durch Wasserstoffbindung zwischen den Im Fall von Humaninsulin werden A- und B-Ketten-

überlappenden Fragmenten erfolgt eine Selbstanordnung des Gene in E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi ~, Hsr~, Somatostatingens und schliesslich eine Polymerisation zu hsmk+), der ebenfalls seit dem 28. Oktober 1978 bei der Ame-grossen Molekülen infolge der cohäsiven Restriktionsstellen- rican Type Culture Collection hinterlegt ist, und zwar mit der termini. Die Ligaturprodukte werden mit EcoRI-BamHI- 40 Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 446 geclont, und dieser Restriktionsendonucleasen behandelt, wodurch das Somato- Organismus wird zur Expression der A-Kette E. coli K-12 statingen, wie in Figur 2 dargestellt, erzeugt wird. Das synthe- Stamm 294 [pIAl], der ebenfalls seit dem 28. Oktober 1978 tische Somatostatingenfragment mit EcoRI- und Baml-Ter- bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist, und mini wird an das pBH20-Plasmid gebunden, das mit den Eco- zwar mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 448, ver-RI- und BamHI-Restriktionsendonculeasen und alkalischer 45 wendet. Die B-Kette von Humaninsulin wird zuerst in einem Phosphatase vorbehandelt worden ist. Die Behandlung mit Derivat von HB101, d.h. E. coli K-12 Stamm D1210, ein lac+ alkalischer Phosphatase führt zu einer Molekularselektion (iQo+z'y+), ausgebildet, und dieser B-Gen enthaltender Orga-von Plasmiden mit dem eingefügten Fragment. Mit dieser ge- nismus ist gleichfalls am 28. Oktober 1978 bei der American bundenen DNA erhaltene ampicillinresistente Transforman- Type Culture Collection hinterlegt worden, und zwar mit der ten werden hinsichtlich Tetracyclinempfindlichkeit aussor- so Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 449. Das B-Gen kann tiert, und mehrere werden bezüglich der Einfügung eines Eco- aber auch in den zuerst genannten Organismen, d.h. Stamm RI-BamHI-Fragments passender Grösse untersucht. 294, eingeführt und davon ausgebildet werden.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter Beide Stränge der EcoRI-BamHI-Fragmente von Plasmi- erläutert.

den aus zwei Clonen werden einer Nucleotidsequenzanalyse, 55 beginnend mit den BamHI- und EcoRI-Stellen, unterworfen. I. Somatostatin

Die Sequenzanalyse wird bis in die lac-Regelelemente ausge- 1. Aufbau von Somatostatingenfragmenten dehnt. Die lac-Fragmentsequenz erweist sich als intakt, und Zuerst werden acht Oligodesoxyribinucleotide, die in Fi-

in einem Fall werden die Nucleotidsequenzen pSOM 1 beider gur 2 mit A bis H bezeichnet sind, nach der modifizierten Stränge unabhängig voneinander bestimmt, wobei jede die in 60 Triestermethode von K. Itakura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, Figur 5A angegebene Sequenz ergibt. 7327 (1975) aufgebaut. Im Fall der Fragmente C, E und H

Das EcoRI-Pst-Fragment des pSOMl-Plasmids mit dem wird jedoch eine verbesserte Arbeitsweise angewandt, wobei lac-regelnden Element wird entfernt und durch das EcoRI- zunächst vollständig geschützte Trimere als Grundeinheiten Pst-Fragment von pBR322 ersetzt, wodurch das Plasmid für den Aufbau längerer Oligodesoxyribonucleotide herge-

pSOM 11 erzeugt wird. Das EcoRI-Fragement von X plac5, 65 stellt werden. Die verbesserte Arbeitsweise ist schematisch in das den lac-Operonkontrollbereich und den grössten Teil des Figur 3 dargestellt, worin B Thymin, N-benzoyliertes Adenin, ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist, wird in die EcoRI- N-benzoyliertes Cytosin oder N-isobutyraliertes Guanin bestelle von pSOM 11 eingefügt. Zwei Orientierungen des Eco- deutet. Unter Bezugnahme auf Figur 3 verläuft mit einem

656 640

Überschuss von I (2 mmolar) die Kupplungsreaktion II (1 mmolar) mit Hilfe eines starken Kupplungsreagens 2,4, 6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mmolar; 2) in 60 Minuten nahezu vollständig. Nach Entfernung der 5'-Schutzgruppe mit einer 2-prozentigen Benzolsulfonsäurelö-sung kann das 5'-Hydroxydimere V durch einfach Lösungsmittelextraktion mit wässriger NaHCO^-Lösung in CHC13 von einem Überschuss des 3'-Phosphodiestermonomeren IV abgetrennt werden. Der vollständig geschützte Trimerblock wird danach aus dem 5'-Hydroxydimeren V, I (2 mmolar) und TPSTe (4 mmolar) hergestellt und durch Chromatographie an Kieselgel nach B. T. Hunt et al, Chem. and Ind. 1868 (1967) isoliert. Die Ausbeuten der nach der verbesserten Arbeitsweise hergestellten Trimeren sind in Tabelle II angegeben.

Tabellen

Ausbeute an vollständig geschützten Trimeren

Sequenz

Ausbeute

Sequenz

Ausbeute

TTT

81%

ATG

69%

TTT

75%

GCC

61%

GGA

41%

CCA

72%

AGA

49%

CAA

72%

ATC

71%

TTA

71%

CCT

61%

CAT

52%

ACA

63%

CCC

73%

ACC

65%

AAC

59%

CGT

51%

GAT

60%

Die acht Oligodesoxyribonucleotide werden nach der Entfernung aller Schutzgruppen durch Hochdruckflüssigchromatographie an Permaphase AAX (R.A. Henry et al J.

Chrom Sci. II, 358 (1973)) gereinigt. Die Reinheit jedes Oligo-meren wird durch Homochromatographie an Dünnschicht-DEAE-Cellulose und auch durch Gelelektrophorese in 20-prozentiger Acrylamidplatte nach Markieren der Oligo-meren mit [gamma-32P]-ATP in Gegenwart von Polynucleo-tid-Kinase kontrolliert. Aus jedem DNA-Fragment wird ein markiertes Hauptprodukt erhalten.

2. Verknüpfung und Acrylamidgelanalyse von Somatosta-tin-DNA

Die 5'-OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente A bis H werden getrennt mit T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert. Zur Phosphorylierung wird [32P]-gamma-ATP verwendet, wodurch die Reaktionsprodukte autoradiographisch verfolgt werden können, obwohl, wie ersichtlich, auch unmarkiertes ATP verwendet werden kann, wenn eine Autoradiographie weggelassen wird. Unmittelbar vor der Kinasereaktion werden 25 uCi [gamma-32P]ATP (etwa 1 500 Ci/mmolar) (Maxam and Gilbert, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 74,1507 (1977« in 0,5 ml Eppendorf-Rohren zur Trockne eingedampft. 5 Mikrogramm Fragment werden mit zwei Einheiten T4-DNA-Kinase (Hydroxylapatitfraktion, 2500 Einheiten/ml; 27) in 70 mm Tris-HCl pH 7,6,10 mm MgCl2, 5 mm Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 150 |il 20 Minuten bei 37 CC inkubiert. Zur Gewährleistung maximaler Phosphorylierung der Fragmente für Verknüpfungszwecke werden 10 jxl einer Mischung aus 70 mm Tris-HCl pH 7,6,10 mm MgCl2,5 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und zwei Einheiten DNA-Kinase zugegeben, und die Inkubation noch weitere 20 Minuten bei 7 °C fortgesetzt. Die Fragemente (250 ng/jil) werden ohne weitere Behandlung bei —20 °C aufgehoben. Jeweils 1,25 (ig der Mit Kinase versehenen Fragmente A, B, E und F werden in einem Gesamtvolumen von 50 (il in 20 mm Tris-HCl pH 7,6,10 mm MgCl2,10

10

mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Hydroxylapatitfraktion, 400 Einheiten/ml; 27) während 16 Stunden bei 4 C verknüpft. Die Fragmente C, D, G und H werden unter vergleichbaren Bedingungen verknüpft. 5 Proben von jeweils 2 ml werden zur Analyse durch Elektrophorese auf einem 10-prozentigen Polyacrylamidgel und anschliessend durch Autoradiographie (H. L. Heyneker et al, Nature 263,748 (1976) entnommen, wobei nicht umgesetzte DNA-Fragmente durch rasch wanderndes Material darge-10 stellt werden und die monomere Form der verknüpften Fragmente mit Bromphenolblau (BPB) wandert. Aufgrund der kohäsiven Enden der verknüpften Fragemente A, B, E und F sowie der verküpften Fragemente C, D, G und H erfolgt auch eine gewisse Dimerisierung. Diese Dimeren stellen das am 1S langsamsten wandernde Material dar und können durch Re-striktionsendonuclease Eco RI bzw. Bam HI gespalten werden. Die zwei Halbmoleküle (verknüpftes A + B + E + F und verknüpftes C + D + G + H) werden in einer weiteren Verknüpfungsstufe verbunden, die 16 Stunden bei 4 CC in eignem Endvolumen von 150 (il durchgeführt wird. Zur Analyse wird 1 Mikroliter entnommen. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten auf 65 °C erwärmt, wodurch die T4-DNA-LÌ-gase entaktiviert wird. Die Wärmebehandlung hat auf das Wanderungsbild der DNA-Mischung keinen Einfluss. Dem 25 Reaktionsgemisch wird für die Spaltung der multimeren Formen der Somatostatin-DNA in 30 Minuten bei 37° ausreichende Restriktionsendonuclease BamHI zugesetzt. Nach Zugabe von NaCl auf 100 mMol wird die DNA mit EcoRI-Endonuclease aufgeschlossen. Der Restriktionsendonculease-30 aufschluss wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet. Das Somatostatin-DNA-Fragment wird durch präparative Elektrophorese auf einem 10-prozentigen Polyacrylamidgel von nichtumgesetzten und teilweise verknüpften DNA-Fragmenten befreit. Die das Somatostatin-35 DNA-Fragment enthaltende Bande wird aus Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Zerschneiden des Gels in kleine Stücke und Extraktion mit Elutionspuffer (0,5 m Am-moniumacetat, 10 mm MgCl2,0,1 mm EDTA, 0,1% SDS) über Nacht bei 26 °C eluiert. Die DNA wird mit 2 Volumen 40 Ethanol gefallt, zentrifugiert, in 200 |xl 10 mm Tris-HCl pH 7,6 wieder gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, wodurch eine Somatostatin-DNA-Konzentration von 4 (ig/ml erhalten wird.

45 3. Aufbau von Rekombinationsplasmiden

In Figur 4 ist schematisch die Art und Weise dargestellt, in der das Somatostatingen enthaltende Rekombinationsplasmide aufgebaut werden, weshalb in Verbindung mit der folgenden Erörterung darauf Bezug genommen wird.

50

A. Das StammplasmidpBR 322

Das für die experimentelle Somatostatinclonbildung gewählte Plasmid ist pBR322, ein kleines Plasmid (Molekulargewicht etwa 2,6 Megadalton) mit gegen die Antibiotika Am-55 picillin (Ap) und Tetracyclin (Tc) resistenten Genen. Wie in Figur 4 angegeben, weist das ampicillinresistente Gen eine Spaltstelle für die Restriktionsendonuclease Pst I und das tetracyclinresistente Gen eine entsprechende Stelle für Restriktionsendonuclease Bam HI auf, und eine EcoRI-Stelle 60 befindet sich zwischen den Apr und Tcr-Genen. Das Plasmid pBR322 stammt aus pBR313, einem 5,8 Megadalton ApTcr" Col™m-Plasmid (R. L. Rodriquez et al, ICN-UCLA Sympo-sia on Molecular and Cellular Biology 5,471-77 (1976), R. L. Rodriques et al, Construction and Characterization of CIo-65 ning Vehicles, in Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, S. 471-77, Academic Press, Inc. (1976). Das Plasmid pBR322 und die Art seiner Gewinnung sind ausführlich in F. Bolivar et al, «Construction and Characteriza-

11

656 640

tion of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System», Gene (November 1977) beschrieben.

B. Aufbau des PlasmidspBHIO

5 Mikrogramm Plasmid pBR322-DNA werden mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuclease EcoRI in 100 milli-molarer Tris-HCl pH 7,6,100 millimolarem NaCl, 6 millimo-larem MgCl2 bei 37 C 30 Minuten lang aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet; die DNA wird dann mit 2 y2 Volumina Ethanol gefällt und in 50 (il T4 DNA Polymerase-Puffer wieder suspendiert (67 mm Tris-HCl pH 8,8,6,7 mm MgCl2,16,6 mm (NH4)2S04,167 [ig/ml Rinderserumalbumin, je 50 um der einzelnen dNTP; A. Panet et al, Biochem. 12, 5045 (1973)). Die Reaktion wird durch Zugabe von zwei Einheiten T4 DNA-Polymerase eingeleitet. Nach 30 Minuten langem Inkubieren bei 37 °C wird die Reaktion durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet, worauf mit Ethanol gefällt wird. 3 Mikrogramm X plac5 DNA (Shapiro et al Nature 224,768 (1969)) werden 1 Stunde bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym HaeIH (3 Einheiten) in 6 mm Tris-HCl pH 7,6 6 mm MgCl2,6 mm ß-Mercaptoethanol in einem Gesamtvolumen von 20 (j.1 aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 °C abgebrochen. Die pBR322-behandelte DNA wird mit der Haelll-aufgeschlosse-nen X plac5-DNA vermischt und in einem Gesamtvolumen von 30 ml mit 1,2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Hydroxylapatitfraktion; A. Panet et al, supra) in 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl210 mm Dithiotreitol, 0,5 mm ATP in 12 Stunden bei 12 °C stumpfendig verknüpft. Die verknüpfte DNA-Mischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert und zur Transformation von E. coli Stamm RRl verwendet. Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclin- und Ampi-cillin-Resistenz auf Minimalmediumplatten ausgewählt, die 40 (ig/ml 5-Brom-4-chlor-incolylgalactosid-(X-gal)-Medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) enthalten. Zur Synthese von ß-Galactosidase fähige Kolonien werden durch ihre blaue Farbe identifiziert. Nach der Durchsicht von 45 unabhängig voneinander isolierten blauen Kolonien erweisen sich drei davon als zwei EcoRI-Stellen enthaltende Plasmid-ENA, die durch etwa 200 Basenpaare voneinander getrennt sind. Die Lage eines asymmetrisch angeordneten Hhal-Fragments in dem HaeIII-lac-Kontrollfragment, b.p. 203, (W. Gilbert et al, in Protein-Ligand Interactions, H. Sand und G. Blauer, Herausgeber (De Gruyter, Berlin (1975) S. 193- 210) ermöglicht die Bestimmung der Orientierung des Haelll-Frag-ments, nun ein EcoRI-Fragment, in diesen Plasmiden. Es zeigt sich, dass das Plasmid pBHIO das Fragment in der angestrebten Orientierung trägt, d.h. die lac-Transkription geht in das Tcr Gen des Plasmids ein.

C. Aufbau des PlasmidspBH20

Plasmid pBHIO wird dann modifiziert, um die zu dem lac-Operator distale EcoRI-Stelle zu eliminieren. Dies wird durch die bevorzugt verlaufende EcoRI-Endonucleasespaltung an der distalen Seite unter teilweisem Schutz durch RNA-Poly-merase der anderen EcoRI-Stelle bewirkt, die sich zwischen dem Tcr-und dem lac-Promoter befindet, zwischen denen nur etwa 40 Basenpaare angeordnet sind. 5 (ig DNA werden nach Bindung der RNA-Polymerase mit einer Einheit EcoRI in einem Gesamtvolumen von 10 jj.1 10 Minuten bei 37 °C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 °C abgebrochen. Die EcoRI-Cohäsivtermini werden mit S1 Nuclease in 25 mm Na-acetat pH 4,5,300 mm NaCl, 1 mm ZnCl2 5 Minuten lang bei 25 °C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bis 10 mm und Tris-HCl pH 8 (bis 50 mm) abgebrochen. Die DNA wird mit

Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 100 (il T4-DNA-Verknüpfungspuffer wieder suspendiert. Nach Zugabe von 1 (il Te DNA-Ligase wird die Mischung 12 Stunden bei 12 °C inkubiert. Die verknüpfte DNA wird in E. 5 coli Stamm RRl transformiert und Apr Tcr-Transformanten werden auf X-gal-Antibiotikummedium selektioniert. Durch Restriktionsenzymanalyse von DNA aus 10 isolierten blauen Kolonien ergibt sich, dass diese Clone Plasmid-DNA mit einer EcoRI-Stelle enthalten. Sieben dieser Kolonien haben die 10 EcoRI-Stelle, die sich zwischen dem lac- und Tcr-Promotor befindet, behalten. Die Nucleotidsequenz von der EcoRI-Stelle bis in den lac-Regelbereich eines dieser Plasmide, pBH20, wird bestätigt gefunden. Dieses Plasmid wird dann zur Clonbildung des Somatostatingens verwendet.

15

D. Aufbau von Plasmid pSOM 1

20 Mikrogramm Plasmid pBH20 werden mit Restriktionsendonuclease EcoRI und BamHI in einem Gesamtvolumen von 50 (il vollständig aufgeschlossen. Nach Zugabe von 20 bakterieller alkalischer Phosphatase (0,1 Einheit von Worthington BAPF) wird die Inkubation 10 Minuten bei 65 °C fortgesetzt. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Ex-traktion beendet, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 50 (il 10 mm Tris-HCl pH 7,6,1 25 mm EDTA gelöst. Die alkalische Phosphatasebehandlung verhindert mit guter Wirkung eine Selbstverknüpfung der EcoRI-BamHI-behandelten pBH20-DNA, aber kreisförmige Rekombinationsplasmide, die Somatostatin-DNA enthalten, können auch nach Verknüpfung noch ausgebildet werden. 30 Da E. coli RRl durch lineare Plasmid-DNA nur mit sehr geringer Wirksamkeit transformiert wird, enthält der grösste Teil der Transformanten Rekombinationsplasmide. 50 Mikroliter Somatostatin-DNA (4 (ig/ml) werden mit 25 ml der BamHI-EcoRI alkalische Phosphatase-behandelter pBH20 35 DNA in einem Gesamtvolumen von 50 (il, enthaltend 20 mm Tris-HCl pH 7,6,10 mm MgCl2,10 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und 4 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 22 °C verknüpft. Nach 10,20 und 30 Minuten werden dem Reaktionsgemisch weitere 40 ng Somatostatin-DNA zugesetzt (die all-40 mähliche Zugabe von Somatostatin-DNA kann die Verknüpfung mit dem Plasmid anstelle einer Selbstverknüpfung begünstigen). Die Verknüpfungsreaktion wird noch 1 Stunde fortgesetzt, worauf die Mischung gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert wird. Bei einem Vergleichsversuch wird Bam-45 HI-, EcoRI-, alkalische Phosphadase-behandelte pBH20-DNA unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Abwesenheit von Somatostatin DNA verknüpft. Beide Präparate werden ohne weitere Behandlung zum Transformieren von E.

coli RRl verwendet. Die Transformationsversuche werden in 50 einem P3-physikalischen Behältergerät National Institutes of Health, USA, Recombinant DNA Research Guidelines, 1976) durchgeführt. Transformanten werden auf Platten aus Minimalmedium, das 20 (ig/ml Ap und 40 ng/ml X-gal enthält, selektioniert. Es werden 10 Transformanten, von denen alle Tc-empfindlich sind, isoliert. Zur Bezugnahme werden sie als pSOMl, pSOM2, etc. ... pSOM 10 bezeichnet. Bei dem Vergleichsversuch werden keine Transformanten erhalten. Vier der 10 Transformanten enthalten Plasmide mit sowohl einer EcoRI- als auch einer BamHI-Stelle. Die Grösse des kleinen EcoRI, BamHI-Fragments dieser Rekombinationsplasmide ist in allen 4 Fällen der Grösse der in vitro hergestellten Somatostatin-DNA vergleichbar. Basensequenzana-lyse nach Maxam und Gilbert Proe. Nat. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977) ergibt, dass das Plasmid pSOMl das gewünschte Somatostatin-DNA-Fragment als Einfügung enthält.

Die DNA-Sequenzanalyse des Clons mit Plasmid pSOMl lässt erwarten, dass damit ein Somatostatin enthaltendes Pep-

55

65

656 640

tid erzeugt wird. Somatostatinradioimmunaktivität lässt sich jedoch in Extrakten von Zellkörnern oder überstehenden Kulturflüssigkeiten nicht nachweisen. Die Gegenwart von Somatostatin lässt sich auch nicht nachweisen, wenn die wachsende Kultur direkt zu 70-prozentiger Ameisensäure und Bromcyan gegeben wird. Es ist beobachtet worden, dass E. coli RRl-Extrakte exogenes Somatostatin sehr rasch abbauen. Das Fehlen von Somatostatinaktivität in Clonen, die Plasmid pSOMl enthalten, kann sehr wohl eine Folge eines intracellulären Abbaus durch endogene proteolytische Enzyme sein. Plasmid pSOM 1 wird daher zum Aufbau eines Plasmids verwendet, das den Code für ein Vorläuferprotein liefert, das Somatostatin enthält und gross genug ist, um einem proteolytischen Abbau zu widerstehen.

E. Der Aufbau der Plasmide pSOM 11 und pSOM 11-3

Es wird ein Plasmid aufgebaut, worin das Somatostatin-gen am C-Terminus des ß-Galactosidasegens angeordnet werden kann, das die Translation in Phase hält. Das Vorhandensein einer EcoRI-Stelle nahe dem C-Terminus dieses Gens und die verfügbare Aminosäuresequenz dieses Proteins (B. Polisky et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 73,3900 (1976) A.V. Fowler et al, ibid 74,1507 (1976), A.I. Bukhari et al, Nature New Biology 243,238 (1973) und K.E. Langley, J. Biol.

Chem. 250,2587 (1975)) ermöglichen die Einführung des EcoRI, BamHI-Somatostatingens in die EcoRI-Stelle unter Aufrechterhaltung des richtigen Leserahmens. Zum Aufbau eines solchen Plasmids werden 50 (ig pSOMl-DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Pstl in einem Gesamtvolumen von 100 (il aufgeschlossen. Ein präparatives 5-prozentiges Polyacrylamidgel wird zur Abtrennung des grossen Pst-EcoRI-Fragements verwendet, das das Somatostatingen des kleinen Fragments mit den lac-Regelelementen aufweist. Die grosse Bande wird aus Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Aufteilen des Gels in kleine Stücke und Extraktion bei 65 °C über Nacht eluiert. In vergleichbarer Weise werden 50 (ig des Plasmids pBR322 DNA mit Pstl- und Eco-RI-Restruktionsendonuclease aufgeschlossen, und die beiden erhaltenen DNA-Fragmente werden durch präparative Elektrophorese auf einem 5-prozentigen Polyacrylamidgel gereinigt. Das kleine Pstl-EcoRI-Fragment von pBR322 (1 jag) wird mit dem grossen Pstl-EcoRI-DNA-Fragment (5 (ig) aus pSOMl in einem Gesamtvolumen von 50 (il mit einer Einheit T4-DNA-Ligase in 12 Stunden bei 12 °C verknüpft. Das Ver-knüpfungsgemisch wird zum Transformieren von E. coli RRl verwendet, und Transformanten werden auf X-gal-Medium auf Ampicillinresistenz selektioniert. Erwartungsgemäss ergeben nahezu alle der Apr-Transformanten (95%) weisse Kolonien (kein lac-Operator) auf X-gal-Indikatorplatten. Das erhaltene Plasmid, pSOMl 1, wird für den Aufbau des Plasmids pSOMl 1-3 verwendet. Eine Mischung aus 5 (ig pSOMl 1-DNAund 5 \igXplac5-DNA wird mit 10 Einheiten EcoRI 30 Minuten bei 37 °C aufgeschlossen. Der Restriktionsendonu-cleaseaufschluss wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet. Die DNA wird dann mit Ethanol gefällt und in 50 nl T4-DNA-Ligase-Puffer erneut suspendiert. Eine Einheit T4-DNA-Ligase wird zu der Mischung gegeben, worauf 12 Stunden bei 12 °C inkubiert wird. Die Verknüpfungsmischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert und zum Transformieren von E. coli, Stamm RRl, verwendet. Transformanten werden auf X-gal-Platten, die Ampicillin enthalten, auf Apr selektioniert und auf wesentliche ß-Galactosidaseerzeu-gung ausgelesen. Etwa 2 % der Kolonien sind blau (pSOMl 1-1,11-2 etc.). Restriktionsenzymanalyse von aus diesen Clonen erhaltener Plasmid-DNA ergibt, dass alle Plasmide ein neues EcoRI-Fragment von etwa 4,4 Megadalton aufweisen, das die lac-Operon-Regelstellen und den grössten Teil des ß-Galactosidasegens aufweist. Da zwei Orientierun12

gen des EcoRI-Fragments möglich sind, wird die asymmetrische Lage einer Hindlll-Restriktionsstelle dazu benutzt festzustellen, welche dieser Kolonien dieses EcoRI-Fragment mit fortschreitender lac-Transkription bis in das Somatostatingen 5 aufweist. Hindlll-BamHI-Doppelaufschlüsse zeigen, dass nur die Clone, die die Plasmide pSOM 11-3, pSOM 11-5, pSOMl 1-6 und pSOMl 1-7 aufweisen, das EcoRI-Fragment in dieser Orientierung enthalten.

4. Radioimmunprüfung auf Somatostatinaktivität 10 Die standardisierte Radioimmunprüfung (RIA) auf Somatostatin (A. Arimura et al, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975)) wird durch Verringerung des Prüfvolumens und durch Verwendung von Phosphatpuffer modifiziert. Tyr! '-Somatostatin wird unter Anwendung einer Chloramin-T-Ar-i5 beitsweise (ibid.) iodiert. Für die Prüfung auf Somatostatin wird die Probe, gewöhnlich in 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, in einem konischen Polypropylenrohr (0,7 ml, Sarstedt) über feuchtem KOH im Vakuum getrocknet. Nach Zugabe von 20 Mikroliter PBSA-Puffer (75 20 mm NaCl; 75 mm Natriumphosphat, pH 7,2; 1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,2 mg/ml Natriumazid) werden 40 jj.1 eines [I25J]-Somatostatin-«Cocktails» und 20 p.1 einer 1000-fa-chen Verdünnung von Kaninchenantisomatostatinimmunse-rums S39 (Vale et al, Metabolism 25,1491 (1976)) in PBSA 25 zugegeben. Der [I25]-Somatostatin-Cocktail enthält je Milliliter PBSA-Puffer 250 p.g normales Kaninchen-gamma-Globu-lin (Antibodies, Inc.), 1500 Einheiten Proteaseinhibitor («Trasylol», Calbiochem.) und ca. 100 000 Zählungen [I25J]-Tyr1'-Somatostatin. Nach wenigstens 16 Stunden bei Zim-30 mertemperatur werden 0,333 ml Ziegen-Antikaninchen-gam-ma-Globulin (Antibodies, Ine, P=0,03) in PBSA-Puffer zu den Proberöhrchen gegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei 37 :C inkubiert, auf 5 :C abgekühlt und dann bei 10 000 x g 5 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit 35 wird entfernt, und das Korn wird in einem gamma-Zähler gezählt. Mit der verwendeten Menge an Antiserum werden 20% der Zählungen ohne unmarkiertes konkurrierendes Somatostatin gefällt. Der Hintergrund mit unendlichem Somatostatin (200 ng) macht gewöhnlich 3 % aus. Die Hälfte der maxi-40 malen Konkurrenz wird mit 10 pg Somatostatin erhalten. Vorversuche mit Extrakten von E. coli Stamm RRl (Empfängerstamm) ergaben, dass weniger als 10 pg Somatostatin in Gegenwart von 16 ng oder mehr bromcyanbehandeltem bakteriellen Protein ohne weiteres erkennbar sind. Mehr als 45 2 (ig Protein aus mit Ameisensäure behandelten bakteriellen Extrakten wirken sich durch Verstärkung des Hintergrundes etwas störend aus, aber diese Störung wird durch Bromcyan-spaltung weitgehend kompensiert. Rekonstruktionsversuche zeigen, dass Somatostatin in mit Bromcyan behandelten Ex-50 trakten stabil ist.

A. Konkurrenz durch bakterielle Extrakte

Die Stämme E. coli RRl (pSOMl 1-5) und E. coli RRl (pSOMl 1-4) werden in Luria-Brühe bei 37 C bis 5 x 108 55 Zellen/ml gezüchtet. Nach Zugabe von IPTG bis auf 1 mm wird die Züchtung noch 2 Stunden fortgesetzt. Aliquote Anteile von je 1 ml werden in einer Eppendorf-Zentrifuge einige Sekunden zentrifugiert, und die Körner werden in 500 jil 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, 6o suspendiert. Nach etwa 24 Stunden bei Zimmertemperatur werden die aliquoten Anteile mit Wasser auf das 10-fache verdünnt, und die in Figur 6 angegebenen Volumina werden dreimal auf Somatostatin geprüft. In Figur 6 bedeute «B/B0» das Verhältnis von in Gegenwart der Probe gebundenem «s [I25J]-Somatostatin zu dem in Abwesenheit von konkurrierendem Somatostatin gebundenem. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt von drei Rohren. Der Proteingehalt der unverdünnten Proben wird mit 2,2 mg/ml für E. coli RRl

13

656 640

(pSOMl 1-5) und mit 1,5 mg/ml für E. coli RRl (pSOM-4) bestimmt.

B. Das Auslesen von pSOMÌl-Clonen auf Somatostatin

Wie oben in Verbindung mit Figur 6 beschrieben werden mit Bromcyan behandelte Extrakte von 11 Clonen (pSOMl 1-2, pSOMl 1-3, etc.) hergestellt. Dreimal 30 Mikroliter jedes Extrakts werden zur Radioimmunprüfung entnommen, deren Ergebnisse in Figur 7 erscheinen. Der Bereich der Prüfpunkte ist angegeben. Die Werte für picogramm Somatostatin sind von einer Standardkurve abgelesen, die als Teil des gleichen Versuchs erhalten werden.

Die oben angegebenen Ergebnisse der Radioimmunprüfung können folgendermassen zusammengefasst werden: Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Versuche mit pSOMl zeigen vier Clone (pSOMl 1-3,11-5,11-6 und 11-7) ohne weiteres nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität (Figuren 6 und 7). Restriktionsfragmentanalyse ergibt, dass pSOMl 1-3, pSOMl 1-5, pSOMl 1-6 und pSOMl 1-7 die gewünschte Orientierung des lac-Operon aufweisen, wohingegen pSOMl 1-2 und 11-4 die entgegengesetzte Orientierung zeigen. Es besteht somit eine einwandfreie Beziehung zwischen der richtigen Orientierung des lac-Operon und der Erzeugung von Somatostatin-Radioimmunaktivität.

C. Wirkungen von IPTG-Induktion und CNBr-Spaltung auf positive und negative Clone.

Die Ausgestaltung des Somatostatinplasmids lässt darauf schliessen, dass die Synthese von Somatostatin unter der 5 Kontrolle des lac-Operon steht. Das lac-Repressorgen ist nicht in dem Plasmid enthalten, und der Empfanger- oder Re-zipientenstamm (E. coli RRl) enthält das Wildtyp-Chromo-somen-lac-Repressorgen, das nur 10 bis 20 Repressormole-küle je Zelle (15) erzeugt. Die Anzahl der Plasmidkopien (und 10 damit die Anzahl an lac-Operatoren) beläuft sich auf etwa 20 bis 30 pro Zelle, so dass eine vollständige Repression unmöglich ist. Wie aus der folgenden Tabelle III hervorgeht, wird die Aktivität von Somatostatin in E. coli RRl (pSOMl 1-3) durch IPTG, einem Induktor des lac-Operons, erhöht. Wie i5 erwartet ist der Grad der Induktion gering und liegt zwischen dem 2,4- bis 7-fachen. Im Versuch 7 (Tabelle III) wird a-Aktivität, ein Mass der ersten 92 Aminosäuren von ß-Galactosi-dase gleichfalls um einen Faktor von 2 induziert. In mehreren Versuchen kann eine nachweisbare Somatostatinradioim-20 munaktivität vor der Bromcyanbehandlung des gesamten cel-lularen Proteins nicht festgestellt werden. Da das bei der Radioimmunprüfung verwendete Antiserum S 39 ein freies N-terminales Alanin erfordert, ist vor der Bromcyanspaltung eine Aktivität nicht zu erwarten.

Tabelle III

Somatostatinradioimmunaktivität

Abkürzungen:

LB = Luriabrühe

IPTG = Isopropylthiogalactosid

CNBr = Bromcyan

SS = Somatostatin

Protein wird nach der Methode von Bradford, Anal. Bio-chem. 72,248 (1976) bestimmt.

IPTG

CNBr

Versuch

Stamm

Medium

1 mmolar

5 mg/ml pg SS/ng Protein

1

11-2

LB

+

<0,1

11-3

LB

+

12

11-4

LB

+

<0,4

11-5

LB

+

15

2

11-3

LB

+

12

11-3

LB

+

—

<0,1

3

11-3

LB

+

61

11-3

LB

—

+

8

11-3

LB

+

—

<0,1

4

11-3

LB

+

71

11-3

VB +

+

62

Glycerin *

5

11-3

LB +

+

250

Glycerin

6

11-3

LB

+

320

11-2

LB

+

<0,1

7

11-3

LB

+

24

11-3

LB

+

10

* Vogel-Bonner-Minimalmedium plus Glycerin

D- Gelfiltration von mit Bromcyan behandelten Extrakten nen werden auf Somatostatin geprüft. Vereinigte negative

Mit Ameisensäure und Bromcyan behandelte Extrakte Clonextrakte (11-2,11-4 und 11-11) werden genauso behander positiven Clone (pSOM 11-3,11-5,11-6 und 11-7) werden delt. Die Ergebnisse sind der Figur 8 zu entnehmen. Auf der vereinigt, (Gesamtvolumen 250 jxl), getrocknet und in 0,1 ml gleichen Säule wird bekanntes Somatostatin (Beckman 50-prozentiger Essigsäure wieder suspendiert. Nach Zugabe 65 Corp.) wie angegegeben (SS) eluiert. In diesem System wird von [3H]Leucin wird die Probe auf eine 0,7 x 47 cm-Säule aus Somatostatin von ausgeschlossenen grossen Peptiden und Sephadex G-50 in 50-prozentiger Essigsäure aufgebracht. Ali- vollständig eingeschlossenen kleinen Molekülen gut getrennt, quote Anteile von jeweils 50 Mikroliter der Kolonnenfraktio- Nur Extrakte von für Somatostatin positiven Clonen zeigen

656 640 14

Radioimmunaktivität in den Säulenfraktionen, und diese Ak- praktisch völlig unterdrückt wird. Wie bereits erörtert, kann tivität wird in der gleichen Position wie chemisch synthetisier- aber auch ein Tryptophan- oder anderes Operatorpromoter-tes Somatostatin eluiert. system angewandt werden, das gewöhnlich vollständig unter drückt ist.

Zusammenfassung der Aktivitätsinformation s In dem rohen Extrakt, der beim Aufbrechen der Zellen in

Die Daten für den Beweis der Synthese eines Polypeptids zum Beispiel einer Eaton-Presse erhalten wird, ist das ß-Ga-mit der Somatostatinaminosäuresequenz sind wie folgt zu- lactosidase-Somatostatinvorläuferprotein unlöslich und fin-sammenzufassen: det sich in dem Korn der ersten Zentrifugierung mit geringer

(1) Somatostatinradioimmunaktivität liegt vor in E. coli- Geschwindigkeit. Die Aktivität kann in 70-prozentiger Amei-Zellen mit dem Plasmid pSOM 11-3, das ein Somatostatingen 10 sensäure, 6m Guanidiniumhydrochlorid oder 2-prozentigem mit erwiesener richtiger Sequenz enthält und die richtige Natriumdodecylsulfat gelöst werden. Vorzugsweise wird je-Orientierung des lac-EcoRI-DNA-Fragments hat. Zellen mit doch der Rohextrakt aus der Eaton-Presse mit 8m Harnstoff dem verwandten Plasmid pSOM 11 -2, das das gleiche Soma- extrahiert und der Rückstand mit Bromcyan gespalten. Bei tostatingen enthält, aber eine entgegengesetzte Orientierung den anfänglichen Versuchen ist Somatostatinaktivität aus E. des lac-EcoRI-Fragments hat, erzeugen keine nachweisbare 15 coli Stamm RRl (pSOM 11-3) durch Alkoholextraktion des Somatostatinaktivität. gespaltenen Produkts und Chromatographie an Sephadex

(2)Wie aufgrund des Gestaltungsschemas vorherzusehen, G-50 in 50-prozentiger Essigsäure etwa 100-fach angereichert ist bis zur Bromcyanbehandlung des Zellextrakts eine nach- worden. Wird das Produkt erneut an Sephadex G-50 chroma-weisbare Somatostatinradioimmunaktivität nicht zu beob- tographiert und dann einer Hochdruckflüssigchromatogra-achten. 20 phie unterworfen, kann praktisch reines Somatostatin erhal-

(3) Die Somatostatinaktivität steht unter der Kontrolle ten werden.

des lac-Operons, was durch Induktion durch IPTG, einen Induktor des lac-Operons, nachgewiesen wird. II. Humaninsulin

(4) Die Somatostatinaktivität ergibt auf Sephadex G-50 Die oben beschriebenen Arbeitsweisen werden als nächein gemeinsames Chromatogramm mit bekanntem Somato- 2s stes auf die Erzeugung von Humaninsulin angewandt. So statin. werden die Gene für die Insulin B Kette ( 104 Basenpaare) und

(5) Die DNA-Sequenz des geclonten Somatostatingens ist für die Insulin A Kette (77 Basenpaare) aus der Aminosäurerichtig. Wenn die Translation nicht in Phase ist, wird ein Pep- sequenz der Humanpolypeptide jeweils mit einzelsträngigen tid gebildet, das sich in jeder Stellung von Somatostatin un- Kohäsivtermini für die EcoRI- und BamHI-Restriktionsen-terscheidet. Es wird eine Radioimmunaktivität festgestellt, 30 donuclease und jeweils für die getrennte Einführung in pBR die anzeigt, dass ein dem Somatostatin nahestehendes Peptid 322-Plasmide bestimmt, gestaltet. Die synthetischen Fraggebildet worden ist, und die Translation muss in Phase sein. mente, Deca- bis Pentadecanucleotide, werden durch die Da Translation in Phase erfolgt, bestimmt der genetische Blockphosphotriestermethode unter Verwendung von Tri-Code, dass ein Peptid mit der genauen Sequenz von Somato- nucleotiden als Baublöcke synthetisiert und schliesslich mit statin gebildet wird. 35 einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gerei-

(6) Schliesslich inhibieren die obigen Proben von E. coli nigt. Die synthetischen Gene für Humaninsulin A- und B-RRl(pSOMl l-3)-Extrakt die Freisetzung von Wachstums- Ketten werden dann getrennt in Plasmid pBR322 zur Clon-hormonen aus Hypophysenzellen von Ratten, wohingegen bildung gebracht. Die synthetischen Gene werden dann in parallel und mit identischer Proteinkonzentration hergestellte Clonform an E. coli-ß-Galactosidasegen wie oben angelagert, Proben von E. coli RRl (pSOM 11-2) keine Wirkung auf 40 wodurch eine wirksame Transkription und Translation und Wachstumshormonfreisetzung ausüben. ein stabiles Vorläuferprotein erhalten wird. Insulinpeptide werden vom ß-Galactosidasevorläufer gespalten, durch Ra-Stabilität, Ausbeute und Reinigung von Somatostatin dioimmunprüfung nachgewiesen und gereinigt. Insulinradio-

Die Stämme mit dem EcoRI-lac-Operon-Fragment immunprüfungsaktivität wird dann durch Vermischen der

(pSOMl 1-2, pSOMl 1-3, etc.) trennen sich hinsichtlich des 45 E.coli-Produkte erzeugt.

Plasmidphänotyps. Beispielsweise ist nach etwa 15 Generationen etwa die Hälfte der E. coli RRl(pSOMl l-3)-Kultur 1- Ausgestaltung und Synthese von Humaninsulingenen für ß-Galactosidase verantwortlich, d.h. weist den lac-Opera- Die für Humaninsulin aufgebauten Gene sind in Figur 9 tor auf, und etwa die Hälfte hiervon ist ampicillinresistent. dargestellt. Die Gene für Humaninsulin, B-Kette und A-Für Somatostatin positive (pSOM 11-3) und negative so Kette, werden aus der Aminosäuresequenz von Humanpoly-

(pSOMl 1-2) Stämme sind unbeständig, und deshalb rührt peptiden gestaltet. Die 5'-Enden jedes Gens haben einsträn-der Wachstumsnachteil vermutlich von der Überproduktion gige kohäsive Termini für die EcoRI- und BamHI-Restrik-der grossen aber unvollständigen und inaktiven Galactosi- tionsendonuclease für die richtige Einfügung jedes Gens in dase her. Die Ausbeute an Somatostatin schwankt von 0,001 das Plasmid pBR322. In die Mitte des B-Ketten-Gens für die bis 0.03 % des gesamten cellularen Proteins (Tabelle I), ver- ss Aminosäuresequenz Glu-Ala wird eine Hindlll-Endonuclea-mutlich infolge der Selektion von Kulturzellen mit Plasmiden se-Erkennungsstelle eingebaut, um Verbreitung und Nach-mit einem fehlenden lac-Bereich. Die höchsten Ausbeuten an weis jeder Hälfte des Gens gesondert vor dem Aufbau des ge-Somatostatin werden mit Präparaten erzielt, bei deren Her- samten B-Kettengens zu ermöglichen. Die B-Ketten- und A-stellung das Wachstum von einer einzigen ampicillinresisten- Ketten-Gene werden so gestaltet, dass sie von 29 verschiede-ten richtunggebenden oder konstitutiven Kolonie ausgegan- eo nen Oligodesoxyribonucleotiden, vom Decameren bis zu den gen ist. Selbst in diesen Fällen haben 30% der Zellen bei der Pentadecameren, aufgebaut werden. Jeder Pfeil bezeichnet Gewinnung oder Ernte Verluste an lac-Bereichen. Lagerung das Fragment, das durch die verbesserte Phosphotriesterme-in gefrorenem Zustand (Lyophilisierung) und Wachstum bis thode synthetisiert wird, H1 bis H8 und B1 bis B12 für das B-zur Gewinnung aus einer einzigen derartigen Kolonie ist da- Kettengen und Al bis Al 1 für das A-Kettengen.

her für das beschriebene System angezeigt. Ausbeuten können &

beispielsweise durch Verwendung von Bakterienstämmen er- 2. Chemische Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden höht werden, die lac-Repressor überproduzieren, so dass eine Die für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden anExpression von Vorläuferprotein vor Induktion und Ernte gewandten Materialien und Methoden sind im Wesentlichen

die in Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250,4592 und Itakura, K. et al (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97,7327 beschriebenen, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen:

a) Die vollständig geschützten Mononucleotide 5'-0-Di-methoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphate werden aus den Nucleosidderivaten unter Verwendung des monofunktionellen Phosphorylierungsmittels p-Chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphorochloridat (1,5 Moläquivalente) in Ace-tonitril in Gegenwart von 1-Methylimidazol, Van Boom, J. H. et al (1975) Tetrahedron 31,2953, synthetisiert. Die Produkte werden in grossem Massstab (100 bis 300 g) durch prä-parative Flüssigchromatographie (Prep 500 LC, Waters Associates) isoliert.

b) Unter Anwendung der Lösungsmittelextraktionsmethode [Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449] werden 32 bifunktionelle Trimere (vergleiche Tabelle IV) in einem Massstab von 5 bis 10 mm und 13 Trimere, 3 Tetramere und 4 Dimere als 3'-Terminusblöcke in einem Massstab von

1 mMol synthetisiert. Die Homogenität der vollständig geschützten Trimeren wird durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel in zwei Methanol/Chloroform-Lösungs-mittelsystemen: Lösungsmittel a 5% Vol./Vol. und Lösungsmittel b 10% Vol./Vol. (vgl. Tabelle IV) kontrolliert. Ausgehend von diesen verschiedenen Verbindungen werden 29 Qli-godesoxyribonucleotide mit definierter Sequenz synthetisiert, 18 für das B-Ketten- und 11 für das A-Ketten-Gen.

Tabelle IV

15 656 640

Als Grundeinheiten für den Aufbau von Polynucleotiden werden zwei Arten von Trimerblöcken, d.h. die bifunktionellen Trimerblöcke von Tabelle IV und entsprechende an der 3'-Hydroxygruppe durch eine Anisoylgruppe geschützte 5 3'-Terminus-Trimere verwendet. Das bifunktionelle Trimere wird mit einer Mischung aus Pyridin, Triethylamin und Wasser (3 :1:1, Vol./Vol.) zu der entsprechenden 3'-Phosphodi-esterkomponente und mit 2% Benzolsulfonsäure zu der entsprechenden 5'-Hydroxykomponente hydrolysiert. Der be-io reits erwähnte 3'-Terminus-Block wird mit 2-prozentiger Benzolsulfonsäure behandelt, wodurch die entsprechende 5'-Hydroxylverbindung gebildet wird. Die Kupplungsreaktion eines Uberschusses des 3'-Phosphodiestertrimeren (1,5 Moläquivalente) mit der 5'-Hydroxylkomponente (1 Mol-i5 äquivalent) in Gegenwart von 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfo-nyltetrazolid (TPSTe, 3 bis 4 Äquivalente) ist nach drei Stunden nahezu vollständig abgelaufen. Zur Entfernung des Überschusses des 3'-Phosphodiesterblocks wird das Reaktionsgemisch durch eine kurze Kieselgelsäule auf einem Sin-20 terglasfilter geleitet. Die Säule wird zuerst mit CHC13 zum Eluieren einiger Nebenprodukte und des Kupplungsreagens und dann mit CHCl3:MeOH (95:5 Vol./Vol.), worin nahezu das gesamte, vollständig geschützte Oligomere eluiert wird, gewaschen. Unter diesen Bedingungen bleibt der eingesetzte 25 3'-Phosphodiesterblock-Reaktionsteilnehmer in der Säule. In entsprechender Weise werden Blockkupplungen wiederholt, bis die gewünschte Länge aufgebaut ist.

Synthese von Trimerbaublöcken

Nr.

Verbin

Ausbeute**

RF

Reinheit***

zugegen in

dung*

(%)

a.

b.

(%)

(siehe Fig. 9)

1.

AAG

47

0,15

0,40

93

B5,B6

2.

AAT

49

0,25

0,52

95

H1,A1,A6

3.

AAC

52

0,28

0,55

93

H5,B6,A2,A8

4.

ACT

43

0,27

0,53

91

B4,B5,A6

5.

ACC

56

0,33

0,60

96

B7

6.

ACG

39

0,18

0,45

90

H5,B7

7.

AGG

45

0,10

0,26

89

H6,H7,B9

8.

AGT

33

0,14

0,40

96

B9,A2,A11

9.

AGC

50

0,19

0,48

92

H8,B1,A5,A10

10.

AGA

48

0,24

0,50

91

A9

11.

TTC

44

0,26

0,52

95

B4,B7,A3

12.

TTC

49

0,11

0,31

94

H3,H5,A2,A3,A5

13.

TCT

58

0,24

0,49

96

A4

14.

TCA

45

0,28

0,53

92

H1,H2,H4,A1

15.

TCG

39

0,12

0,34

91

A2

16.

TGG

32

0,10

0,28

87

H3,A1, AIO

17.

TGC

51

0,18

0,47

93

H6,B2,A4,A7,A8

18.

TGA

46

0,12

0,37

94

H7

19.

TAC

61

0,22

0,50

90

B4,A11

20.

TAA

55

0,17

0,44

95

B5,A10

21.

CCT

53

0,30

0,55

97

H3,H4,B10

22.

CAC

47

0,25

0,51

92

A3

23.

CAA

58

0,25

0,51

93

H2,H6,H8,A7

24.

CTT

41

0,28

0,54

92

B2,B9,A4

25.

CGA

40

0,27

0,52

93

A7

26.

CGT

75

0,25

0,50

89

H2,H4,B3,B1

27.

GGT

35

0.09

0,26

90

B3

28.

GTT

46

0,18

0,45

93

B2

29.

GTA

38

0,25

0,50

95

B6,B8,A6

30.

GAA

39

0,15

0,39

88

H7,B3,B8,A5

31.

GAT

52

0,22

0,49

89

B10,A9

32.

GCA

42

0,14

0,39

93

A9

*

vollständig geschützte Tridesoxynucieotide; 5-09-Dimethoxytrityl-

■3'-p-chlorphenyl-ß-

cyanethylphosphat ** Gesamtausbeute, bezogen auf die 5'-Hydroxylmonomeren *** Aufgrund der HPLC-Analyse

656 640 16

Während der Oligonucleotidsynthese wird ausgiebig von RI-BamHI-Fragmente von zwei ampicillinresistenten, tetra-der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Gebrauch cyclinempfindlichen Clonen (pAlO, pAl 1) enthalten die angemacht, und zwar für die Analyse von a) jedem Trimer- und gestrebte A-Gen-Sequenz.

Tetramerblock, b) den als Zwischenprodukte auftretenden

Fragmenten (Hexamere, Nonamere und Decamere), c) der s 4. Auflau von Plasmiden zur Expression von A- und B-Insu-letzten Kupplungsreaktion und d) zur Reinigung der Endpro- lingenen dukte. Für die HPLC wird ein Spectra-Physics 3500B Flüssig- Figur 10 zeigt den Aufbau des lac-Insulin B Plasmids Chromatograph verwendet. Nach Entfernung aller Schutz- (pIB 1 ). Die Plasmide pBH 1 und PBB101 werden mit EcoRI-gruppen mit konzentriertem NH4OH bei 50 °C (6 Stunden) und HindlH-Endonuciease aufgeschlossen. Das kleine BH-und 80-prozentiger Essigsäure bei Zimmertemperatur (15 Mi- 10 Fragment von pBHl und das grosse Fragment von pBBlOl nuten) werden die Verbindungen an einer Permaphase AAX (enthaltend das BB-Fragment und den grössten Teil von (DuPont) [Van Boom, J. et al (1977) J. Chromatography 131, pBR322) werden durch Gelelektorphorese gereinigt, ver-169] Säule (1 m • 2 mm) unter Anwendung eines linearen Gra- mischt und in Gegenwart von mit EcoRI gespaltenen X plac5 dienten des Lösungsmittels B (0,05m KH2PO4 -1,0m KCl, verknüpft. Das Megadalton-EcoRI-Fragment von X plac5 pH 4,5) in Lösungsmittel A (0,01m KH2P04, pH 4,5) analy- 15 enthält den lac-Regelbereich und den grössten Teil des ß-Ga-siert. Der Gradient verläuft folgendermassen: Es wird mit lactosidase-Strukturgens. Die Konfiguration der Restrik-Puffer A begonnen, und dann werden 3% Puffer B in der Mi- tionsstellen gewährleistet die richtige Verbindung von BH an nute angewandt. Die Elution wird bei 60 C mit einer Strö- BB. Das lac-EcoRI-Fragment kann sieh in zwei Orientierun-mungsgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Auch gen einfügen; deshalb hat nur eine Hälfte der nach Transfor-die Reinigung der 29 End-Oligonucleotide wird an Perma- 20 mation erhaltenen Clone die angestrebte Orientierung. Die phase AAX unter den gleichen oben angegebenen Bedingun- Orientierung von 10 Ampicillinresistenten ß-Galactosidase gen durchgeführt. Die Materialien mit dem gewünschten bildenden Clonen wird durch Restriktionsanalyse kontrol-

Peak werden vereinigt, durch Dialyse entsalzt und lyophili- liert. Fünf dieser Kolonien enthalten die gesamte B-Gense-siert. Nach Markieren der 5'-Termini mit (gamma-32P)ATP quenz und den richtigen Leserahmen aus dem ß-Galactosida-unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase wird die Ho- 25 segen in das B-Kettengen. Eine Kolonie, pIB 1, wird für an-mogenität jedes Oligonucleotids durch Elektrophorese auf ei- schliessende Versuche ausgewählt.

nem 20-prozentigen Polyacrylamidgel kontrolliert. Bei einem vergleichbaren Versuch wird das 4,4-Megadal-

ton-lac-Fragment X plac5 an der EcoRI-Stelle in das pAl 1-3. Anordnimg und Clonbildung von B-Kettengen und A-Ket- Plasmid eingeführt, wodurch pi A1 erhalten wird. Letzteres ten-Gen 30 erweist sich als mit pIB 1 identisch mit der Ausnahme, dass

Das Gen für die B-Kette von Insulin weist eine EcoRI- das B-Gen-Fragment durch das A-Gen-Fragment ersetzt ist. Restriktionsstelle am linken Ende, eine HindlH-Stelle in der Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, dass die korrekten A- und B-Mitte und eine BamHI-Stelle am rechten Ende auf. Dadurch Kettengensequenzen in pi A1 bzw. pIB 1 erhalten geblieben ist es möglich, beide Hälften, die linke EcoRI-Hindlll-Hälfte sind.

(BH) und die rechte Hindlll -BamHI-Hälfte (BB), in dem gut 35 geeigneten Clonbildungsträger pBR322 getrennt zu clonen * 5. Expression und nach Feststellung ihrer Sequenzen zu dem vollständigen Die Stämme mit den in richtiger Weise an ß-Galactosidase

B-Gen zu verbinden (Figur 10). Die BB-Hälfte wird durch gebundenen Isulingenen erzeugen beide grosse Mengen eines Verknüpfen aus 10 Oligodesoxyribonucleotiden, in Figur 9 Proteins mit der Grösse von ß-Galactosidase. Etwa 20% des mit B1 bis BIO bezeichnet, zusammengestellt, die durch che- 40 gesamten Zellproteins bestehen aus diesem ß-Galactosidase-mische Phosphotriestersynthese gebildet wurden. B1 und BIO Insulin A- oder B-Ketten-Hybrid. Die Hybridproteine sind sind nicht phosphoryliert, wodurch eine unerwünschte Poly- unlöslich und finden sich in dem ersten bei geringer Ge-merisation dieser Fragmente über ihre Cohäsivenden schwindigkeit erhaltenen Korn, worin sie etwa 50% des Pro-

(Hindlll und BamHI) vermieden wird. Nach Reinigung teins ausmachen.

durch präparative Acrylamidgelelektrophorese und Elution 45 Zum Nachweis der Expression der Insulin-A- und -B-Ket-der grössten DNA-Bande wird das BB-Fragment in das mit ten wird eine Radioimmunprüfung (RIA) angewandt, die auf Hindlll und BamHI gespaltene Plasmid pBR322 eingefügt. der Bildung von vollständigem Insulin aus den gesonderten Etwa 50% der von der DNA stammenden ampicillinresisten- Ketten beruht. Die Insulinbildungsmassnahmen von Katso-ten Kolonien sind tetracyclinempfindlich, was zeigt, dass ein yannis et al (1967) Biochemistry 6,2642-2655, ergeben, ange-Nichtplasmid-Hindlll-BamHI-Fragment eingeführt worden so passt an ein Prüfvolumen von 27 Mikroliter, eine sehr gut ge-ist. Die kleinen Hindlll-BamHI-Fragmente aus vier dieser eignete Prüfung. Nach Vermischen und Bildung von S-sulfo-Kolonien (pBBlOl bis pBB104) erweisen sich bei der Se- nierten Derivaten der Insulinketten wird ohne weiteres nach-

quenzprüfung als richtig gestaltet. weisbare Insulinaktivität erhalten. Die getrennten S-sulfo-

Das BH-Fragment wird in entsprechender Weise herge- nierten Ketten von Insulin reagieren nach Reduktion und stellt und in mit EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonu- 55 Oxidation nicht merklich mit dem verwendeten Antiinsulin-clease gespaltenes pBR322 eingefügt. Plasmide aus drei ampi- Antikörper.

cillinresistenten, tetracyclinempfindlichen Transformanten Für die Insulinbildungsprüfung wird das ß-Galactosida-

(pBH 1 bis pBH3) werden analysiert. Dabei wird festgestellt, se-A- oder B-Ketten-Hybridprotein teilweise gereinigt, mit dass die kleinen EcoRI-Hindlll-Fragmente die erwartete Bromcyan gespalten und in S-sulfonierte Derivate über-Nucleotidsequenz aufweisen. 60 geführt.

Der Nachweis dafür, dass die richtige Expression von che-

Das A-Kettengen wird aus drei Teilen zusammengestellt, misch synthetisierten Genen für Humaninsulin erzielt worden Die vier linken, vier mittleren und vier rechten Oligonucleo- ist, kann folgendermassen zusammengefasst werden:

tide (vergleiche Figur 9) werden gesondert verknüpft, dann a) Radioimmunaktivität ist für beide Ketten nachgewie-

vermischt und verknüpft (die Oligonucleo tide A1 und A12 6S sen worden.

sind unphosphoryliert). Das zusammengestellte A-Kettengen b) Die nach Clonbildung und Plasmidaufbau erhaltenen wird phosphoryliert, durch Gelelektrophorese gereinigt und DNA-Sequenzen sind direkt als der Gestaltung entsprechend in pBR322 an den EcoRI-BamHI-Stellen geclont. Die Eco- nachgewiesen worden. Da Radioimmunaktivität erhalten

17 656 640

wird, muss die Translation in Phase sein. Der genetische Code men, bei denen die Trennung auf verschiedenen Prinzipien bebestimmt daher, dass Peptide mit der Sequenz von Humanin- ruht (Gelfiltration, lonenaustausch und Umkehrphasen-sulin erzeugt werden. HPLC) als Insulinketten.

c) Nach der Bromcyanspaltung verhalten sich die E. coli- d) Die von E. coli erzeugte A-Kette ist durch HPLC in ei-

Produkte in drei verschiedenen chromatographischen Syste- 5 liem kleinen Massstab gereinigt worden und hat die richtige

Aminosäurezusammensetzung.

C

10 Blatt Zeichnungen

Claims

656 640

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids durch Expression einer DNA-Sequenz, die für dieses Polypeptid codiert, in einem rekombinanten mikrobiellen Clonierungsträ-ger, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz ein he-terologes Gen enthält, das für eine erste Aminosäuresequenz codiert und in Lesephase mit Codons ist, die für eine zweite Aminosäuresequenz codieren, so dass durch die Expression das Polypeptid erhalten wird, das beide Aminosäuresequenzen aufweist und eine selektive Spaltstelle neben der ersten Aminosäuresequenz aufweist.
2. Verfahren zur Herstellung eines bestimmten Polypeptids bestimmter Aminosäuresequenz unter Verwendung eines nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Polypeptid, das neben der Aminosäuresequenz für das bestimmte Polypeptid noch eine zweite, als überflüssig zu entfernende Aminosäuresequenz besitzt und eine selektive Spaltstelle neben der Aminosäuresequenz für das bestimmte Polypeptid aufweist, an der Spaltstelle spaltet.
3. Rekombinanter, mikrobieller Clonierungsträger zur Verwendung im Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Regulon, eine DNA-Sequenz für ein Polypeptid, enthaltend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, sowie einen oder mehrere Stop-Codons enthält, wobei die Codons, die für die zweite Aminosäuresequenz codieren, zwischen das Regulon und die Stop-Codons ohne Änderung der Lesephase der genannten DNA-Sequenz eingefügt sind, und der in der Lage ist, durch Expression ein Polypeptid zu bilden, das sowohl die erste als auch die zweite Aminosäuresequenz enthält und neben der ersten Aminosäuresequenz eine selektive Spaltstelle

Rekombinanter, mikrobieller Clonierungsträger zur Verwendung im Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Regulon, eine DNA-Sequenz für ein Polypeptid, enthaltend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, sowie einen oder mehrere Stop-Codons enthält, wobei die Codons, die für die zweite Aminosäuresequenz codieren, zwischen das Regulon und die Stop-Codons ohne Änderung der Lesephase der genannten DNA-Sequenz eingefügt sind, und der in der Lage ist, durch Expression ein Polypeptid zu bilden, das sowohl die erste als auch die zweite Aminosäuresequenz enthält und neben der ersten Aminosäuresequenz eine selektive Spaltstelle aufweist.
4. Clonierungsträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die selektive Spaltstelle in der zweiten Aminosäuresequenz liegt.
5. Clonierungsträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Aminosäuresequenz keine selektive Spaltstelle aufweist.
6. Clonierungsträger nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er ein bakterielles Plasmid ist und die genannten Elemente folgende Reihenfolge aufweisen: Regulon - Codons für die zweite Aminosäuresequenz - Codons für die erste Aminosäuresequenz-Stop-Codons.
7. Clonierungsträger nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltstelle Methionin ist.
8. Clonierungsträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Codons für die erste Aminosäuresequenz Codons für Somatostatin sind.
9. Clonierungsträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Codons für die erste Aminosäuresequenz Codons für die A-Kette des Insulins oder die B-Kette des Insulins sind.
10. Plasmid pSOMl nach Anspruch 3 mit einer Genkartographie nach Fig. 4 und Fig. 5A.
11. Plasmid pSOMll nach Anspruch 3 mit einer Genkartographie nach Fig. 4.

10
14. Plasmid pIB-1 nach Anspruch 3 mit einer Genkartographie nach Fig. 10.
15. Bakterien mit einem Clonierungsträger nach einem der Ansprüche 3 bis 9.
16. Bakterien mit einem Clonierungsträger nach einem

5 der Ansprüche 10 bis 14.
17. Bakterien nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Bakterienkultur vorliegen.
12. Plasmid pSOMll-3 nach Anspruch 3 mit einer Genkartographie nach Fig. 4.
13. Plasmid pIA-1 nach Anspruch 3 mit einer Genkartographie nach Fig. 10.
18. Bakterien nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur Clone eines oder mehrerer Wirtsorganismen

15 enthält.
19. Bakterien nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur E. coli K-12 RR1 (pSOMll-3) enthält und der Stamm Somatostatin produziert.
20. Bakterien nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,

20 dass die Kultur E. coli K-12 294 (pIA-1) enthält.
21. Bakterien nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur E.coli K-12 D1210 (pIB-1) enthält.
22. Verfahren nach Anspruch 1 zum Herstellen eines zusammengesetzten Polypeptids mit zwei Aminosäuresequen-

25 zen und einer selektiven Spaltstelle neben der ersten Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Bakteriums nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man das Bakterium kultiviert und ein Polypeptid, das zwei Aminosäuresequenzen hat und eine selektive Spaltstelle neben der ersten Aminosäu-

30 resequenz aufweist, gewinnt.
23. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Aminosäuresequenz überflüssig ist und die selektive Spaltstelle in der zweiten Aminosäuresequenz liegt.

35 24. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Clonierungsträger ein bakterielles Plasmid ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass auf das heterologe Gen in Lesephase ein oder

40 mehrere Stop-Codons folgen.
26. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Aminosäuresequenz der ersten Aminosäuresequenz vorangeht.
27. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22 zum Herstellen

45 einer Polypeptidhapten aufweisenden immunogenen Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein rekombinanter mikrobieller Clonierungsträger mit einem heterologen Strukturgen für das Hapten und, in Lesephase damit, eine DNA-Sequenz, die für eine zweite Amino-

50 säuresequenz codiert, in einer Grösse zur Verfügung gestellt wird, die zum Immunogenmachen des Produktes der DNA-Expression ausreicht; und dass b) die Expression eines konjugierten Polypeptids der Aminosäuresequenz des Haptens und der zweiten Aminosäurese-

55 quenz bewirkt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsprodukt mehr als 100 Aminosäuren enthält.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeich-

60 net, dass das Expressionsprodukt mehr als 200 Aminosäuren enthält.
30. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Strukturgen dasjenige von Somatostatin ist.

65 31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Strukturgen dasjenige der Aminosäuresequenz eines Spaltproduktes von viralem Mantelprotein ist, wobei das Spaltprodukt spezifisch

durch Antikörper gebunden wird, die dem Mantelprotein entsprechen.
32. Immunogene Substanz, erhalten nach clëm Verfahren gemäss einem der Ansprüche 27 bis 31.
33. Rekombinanter, mikrobieller Clonierungsträger nach Anspruch 3 zur Ausführung des Verfahrens gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Regulon, ein Strukturgen, das für eine erste Aminosäuresequenz eines Polypeptidhaptens codiert, und ein oder mehrere Stop-Codons enthält, wobei eine DNA-Sequenz, die für eine zweite Aminosäuresequenz codiert, zwischen dem Regulon und dem bzw. den Stop-Codons ohne Änderung der Lesephase des Struk-targens eingefügt ist, so dass durch Expression ein konjugiertes Polypeptid erhalten wird, das im wesentlichen aus der ersten Aminosäuresequenz des Haptens und der zweiten Aminosäuresequenz besteht, wobei letzteres so ausreichend gross ist, dass es dem Konjugat Immunogenität verleiht.

'34.'Verfahren nach Anspruch 2 zum Herstellen eines bestimmten Polypeptids bestimmter Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Bakteriums nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man das Bakterium kultiviert und das erhaltene Polypeptid, das neben der Aminosäuresequenz für das bestimmte Polypeptid noch eine zweite Aminosäuresequenz hat und eine selektive Spaltstelle neben der Aminosäuresequenz für das bestimmte Polypeptid aufweist, an der Spaltstelle spaltet.
35. Verfahren nach Anspruch 2 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Aminosäuresequenz eine oder mehrere der ersten Aminosäuresequenz entsprechende Aminosäuresequenzen aufweist, und dass alle Aminosäuresequenzen der ersten Aminosäuresequenz durch selektive Spaltstellen in dem Polypeptid voneinander getrennt sind.
36. Verfahren nach Anspruch 2 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung in einem System bewirkt wird, das sich ausserhalb der replikativen Umgebung des Clonierungs-trägers befindet.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Aminosäuresequenz keine selektive Spaltstelle enthält.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der ersten Aminosäuresequenz Arginin und Lysin fehlen, und dass die selektive Spaltstelle durch Trypsin gespalten wird.
39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, das der ersten Aminosäuresequenz Arginin fehlt, die selektive Spaltstelle durch Trypsin gespalten wird und in der ersten Aminosäuresequenz etwa vorhandenes Lysin vorher gegen Spaltung geschützt wird,
40. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Aminosäuresequenz methioninfrei ist und die Spaltung mit Bromcyan bewirkt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass als Träger ein bakterielles Plasmid verwendet wird lind die eine Aminosäuresequenz ein Säugerhormon ist.
42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass dem Polypeptid die Bioaktivität des Hormons fehlt.
43. Verfahren nach Anspruch 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Hormon •Somatostatin, Insulin, Proinsulin, die A-Kette des menschlichen Insulins, die B-Kette des menschlichen Insulins, menschliches Wachstumshormon oder Rinderwachstumshormon ist.
44. Verfahren nach Anspruch 2 oder 34 zum Herstellen eines spezifischen Säugerhormons durch Expression eines hete-rologen Strukturgens in einem rekombinanten bakteriellen Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturgen für eine erste Aminosäuresequenz codiert, auf die ein oder mehrere Stop-Codons folgen, und dem in Lesephase eine DNA-

656 640

Sequenz einer zweiten Aminosäuresequenz vorangeht, welche für ein anderes Protein codiert als die erste Aminosäuresequenz, so dass man durch die Expression ein Polypeptid erhält, das sowohl die Aminosäuresequenz des Gens als auch des Proteins sowie eine selektive Spaltstelle neben der ersten Aminosäuresequenz aufweist, wobei das Spalten in einem System ausserhalb der replikativen Umgebung des Plasmids bewirkt wird.
45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass dem Polypeptid die Bioaktivität des Hormons fehlt.
46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass das Hormon Somatostatin, Insulin, menschliches Wachstumshormon oder Rinderwachstumshormon ist.
47. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Spalten mit Bromcyan durchgeführt wird und das gewünschte Spaltprodukt methioninfrei ist.
48. Produkt, erhalten nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 ; 2; 22 bis 26; und 34 bis 47.