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BRPI0620803A2 - anticorpos dirigidos para o her-3 e seus usos - Google Patents

anticorpos dirigidos para o her-3 e seus usos Download PDF

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BRPI0620803A2
BRPI0620803A2 BRPI0620803-7A BRPI0620803A BRPI0620803A2 BR PI0620803 A2 BRPI0620803 A2 BR PI0620803A2 BR PI0620803 A BRPI0620803 A BR PI0620803A BR PI0620803 A2 BRPI0620803 A2 BR PI0620803A2
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BR
Brazil
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gly
thr
antibody
gln
val
Prior art date
Application number
BRPI0620803-7A
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English (en)
Inventor
Mike Rothe
Martin Treder
Susanne Hartmann
Dan Freeman
Bob Radinsky
Eric Borges
Original Assignee
U3 Pharma Ag
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by U3 Pharma Ag, Amgen Inc filed Critical U3 Pharma Ag
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Publication of BRPI0620803B1 publication Critical patent/BRPI0620803B1/pt
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Abstract

ANTICORPOS DIRIGIDOS PARA O HER-3 E SEUS USOS. A presente invenção refere-se às proteínas de ligação que se ligam ao HER-3 e aos polinucleotídeos que as codificam. Os vetores de expressão e as células hospedeiras que os compreendem para a produção da proteína de ligação da invenção são também proporcionados. Além disso, a invenção proporciona composições e métodos para diagnosticar e tratar doenças associadas com a transdução de sinal mediada pelo HER-3 e/ou seu ligante heregulina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS DIRIGIDOS PARA O HER-3 E SEUS USOS".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
1. Campo da Invenção
A presente invenção refere-se às proteínas de ligação, incluindo os anticorpos e os seus fragmentos de ligação, que se ligam ao HER-3 e aos polinucleotídeos que as codificam. Os vetores de expressão e as células hospedeiras que os compreendem para a produção da proteína de ligação da invenção são também proporcionados. Além disso, a invenção proporcio- na composições e métodos para diagnosticar e tratar doenças associadas com a transdução de sinal mediada pelo HER-3 e/ou seu Iigante heregulina.
2. Antecedentes da Tecnologia
O receptor do fator do crescimento epidérmico humano 3 (HER-3, também conhecido como ErbB3) é uma tirosina cinase protéica receptora e pertence à subfamília das tirosina cinases protéicas receptoras do receptor do fator do crescimento epidérmico (EGFR), que também inclui o HER-1 (também conhecido como EGFR), o HER-2, e o HER-4 (Plowman e col., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus e col., Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 86 (1989), 9193-9197; e Kraus e col., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). Como o receptor do fator do crescimento epidérmico prototípico, o receptor de transmembrana HER-3 consiste em um domínio de ligação ao Iigante extracelular (ECD), um domínio de dimeri- zação dentro do ECD, um domínio de transmembrana, um domínio de tiro- sina cinase (TKD) protéica intracelular e um domínio de fosforilação C-ter- minal.
O ligante Heregulina (HRG) se liga ao domínio extracelular do HER-3 e ativa a via de sinalização mediada por receptor por promoção da dimerização com outros membros da família do receptor do fator do crescimento epidérmico humano (HER) e da transfosforilação de seu domínio intracelular. A formação de dímero entre os membros da família do HER expande o potencial de sinalização do HER-3 e é um meio não somente para a diversificação do sinal, como também para a amplificação do sinal. Por exemplo, o heterodímero HER-2/HER-3 induz um dos sinais mito- gênicos mais importantes entre os membros da família do HER.
O HER-3 foi verificado ser superexpresso em diversos tipos de câncer, tais como os cânceres de mama, gastrointestinais e pancreáticos. De modo interessante, foi mostrada uma correlação entre a expressão de HER-2/HER-3 e a progressão a partir de um estágio não invasivo até um invasivo (Alimandi e col., Oncogene 10,1813-1821; deFazio e col., Câncer 87, 487-498; Naidu e col., Br. J. Câncer 78,1385-1390). Desse modo, agentes que interfiram com a sinalização mediada pelo HER-3 são desejáveis. Os anti- corpos para o HER-3 de murino ou quiméricos foram descritos, tais como em US5968511, US5480968 e WO03013602.
Um anticorpo monoclonal humanizado contra HER-2, Herceptin®, foi mostrado recentemente interferir com a sinalização mediada pelo HER-2 e é terapeuticamente efetivo em seres humanos (Fendly e col., Hybridoma 6, 359-370; Hudziak e col., Mol. CeH Biol Q, 1165-1172; Stebbing e col., Câncer Treat. Rev. 26, 287-290). A Herceptin® foi mostrada atuar através de dois mecanismos diferentes, isto é, a absorção das células efetoras do sistema imune, bem como um efeito indutor da apoptose, citotóxico, direto.
Entretanto, somente os pacientes com HER-2 altamente amplifi- cado respondem significativamente à terapia com Herceptin®, assim limi- tando o número de pacientes adequados para a terapia. Além disso, o desenvolvimento da resistência a fármacos ou uma alteração na expressão ou seqüência de epítopos do HER-2 sobre as células de tumor pode até tornar estes pacientes abordáveis não reativos com o anticorpo e, portanto, anulando os seus benefícios terapêuticos. Portanto, são necessários mais fármacos para as terapias à base de alvos que abordem mais membros da família do HER, tais como o HER-3.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS DOS DESENHOS
A Fig. 1 mostra o grau de expressão do HER-3 em um painel de linhagens celulares de cânceres humanos e demonstra que o HER-3 é ex- presso em uma variedade de cânceres humanos.
A Fig. 2 mostra os resultados da análise por FACS do anticorpo para HER-3 que se liga às células Ratl estavelmente expressando os dife- rentes membros da família do HER ou somente ao vetor vazio.
A Fig. 3 mostra os locais de competição pela ligação dos anti- corpos, mapeados para os domínios do HER3.
A Fig. 4 mostra os resultados da análise da afinidade do anticorpo por FACS Scatchard indireta, efetuada com os anticorpos anti- HER-3 da invenção. A análise indica que os anticorpos anti-HER-3 da inven- ção possuem altas afinidades e fortes constantes de ligação pelo HER-3 expresso sobre a superfície da célula.
A Fig. 5 mostra a endocitose acelerada do HER-3, induzida pelos anticorpos anti-HER-3 dá invenção.
As Figs. 6 a-e mostram os resultados de um ensaio de compe- tição com ligante efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os resultados demonstram que os anticorpos da invenção especificamente reduzem a ligação de [125l]-oc-HRG/[125l]-p-HRG às células que expressam o HER-3 endógeno.
A Fig. 7a mostra os resultados de um ELISA da fosfotirosina HER-3 efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de inibir a ativação do HER-3 mediada pela β-HRG, conforme indicada por fosforilação da tirosina receptora aumentada. Além disso, a fig. 7b mostra os resultados representa- tivos deste experimento com anticorpo titulado.
A Fig. 8 mostra o resultado de um ELISA de MAP-Cinase p42/p44 efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de reduzir a ativação de MAP-Cinase p42/p44 mediada pela β-HRG, conforme indicada pela fosfori- lação aumentada de MAP-Cinase.
A Fig. 9 mostra o resultado de um ELISA de fosfo-AKT efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de reduzir a ativação da AKT mediada pela β-HRG, conforme indicada por fosforilação de AKT.
A Fig. 10 mostra a inibição da proliferação das células MCF7 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção inibem o crescimento celular induzido pela HRG nas células de câncer humanas.
A Fig. 11 mostra a transmigração das células MCF7 inibida pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção.
As Figs. 12a-i mostram a inibição do crescimento celular inde- pendente de ancoragem pelos anticorpos para HER-3 humanos da invenção.
A Fig. 13 mostra a inibição do crescimento de xenoenxertos de células de câncer de mama humanas T47D por um anticorpo anti-HER-3 humano da invenção.
A Fig. 14 mostra a redução das células de câncer do pâncreas humanas BxPC3 em camundongos, após a administração dos anticorpos anti Her3 (U1-59 e U1-53) ou anti EGFR (Erbitux).
A Fig. 15 mostra a redução do crescimento de xenoenxertos de células de câncer do pâncreas humanas BxPC3 por um anticorpo anti-HER- 3 humano da invenção e em combinação com os anticorpos anti EGFR (Erbitux).
A Fig. 16 demonstra que os anticorpos da invenção retardam o crescimento de células de melanoma humanas (HT144) em camundongos nu/nu. _
A Fig. 17 mostra a redução do crescimento no xenoenxerto de células de carcinoma do cólon humanas HT-29 pelos anticorpos para HER-3 humanos da invenção (U1-53, U1-59 e U1-7).
A Fig. 18 mostra a redução do crescimento no xenoenxerto de células de câncer de pulmão humanas Calu-3 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção (U1 -59, U1 -53 e Ul -7).
A Fig. 19 mostra a redução do crescimento no xenoenxerto de células de câncer do pâncreas humanas BxPC-3 pelos anticorpos anti-HER- 3 humanos da invenção (U1 -7, U1 -59 e U1 -53).
A Fig. 20 demonstra que um anticorpo da invenção (U1-59) causa a supressão do HER-3 em xenoenxertos de câncer do pâncreas humano BxPC3. RESUMO DA INVENÇÃO
Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma proteína de ligação isolada que se liga ao HER-3.
Em uma modalidade da presente invenção, uma proteína de li- gação isolada da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das CDR1S selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) CDRH1's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146,
150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, (b) CDRH2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146,
150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e (c) CDRH3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146,
150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e/ou uma seqüência de aminoácidos da ca- deia leve compreendendo pelo menos uma das CDR1S selecionadas a partir do grupo que consiste em: (d) CDRL1's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, (e) CDRL2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, e (f) CDRL3 s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94,98,102,106,110,114,118,124,128,132,136,140,144,148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
Em uma outra modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação isolada da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID Nos:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146,
150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230,
e/ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
Em mais uma outra modalidade da presente invenção, uma proteína dé ligação isolada da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada e uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, 6 e 8, 10 e 12, 14 e 16, 18 e 20, 22 e 24, 26 e 28, 30 e 32, 36 e 38, 42 e 44, 46 e 48, 50 e 52, 54 e 56, 60 e 58, 62 e 64, 66 e 68, 70 e 72, 74 e 76, 78 e 82, 80 e 82, 84 e 86, 88 e 90, 92 e 94, 96 e 98, 100 e 102, 104 e 106, 108 e 110, 112 e 114, 116 e 118, 122 e 124, 126 e 128, 130 e 132, 134 e 136, 138 e 140, 142 e 144, 146 e 148, 150 e 152, 154 e 156, 158 e 160, 162 e 164, 166 e 168, 170 e 172, 174 e 176, 178 e 180, 182 e 184, 186 e 188, 190 θ 192, 194 e 196, 198 e 200, 202 e 204, 206 e 208, 210 e 212, 214 e 216, 218 e 220, 222 e 224, 226 e 228, 230 e 232, ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 60, 62 ou 120, ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 58 ou 64.
De acordo com a presente invenção, uma proteína de ligação isolada que é capaz de ligar-se ao HER-3 interage com pelo menos um epítopo na parte extracelular de HER-3. Os epítopos estão preferivelmente localizados no domínio L1 (aa 19-184), que é o domínio amino terminal, nos domínios S1 (aa 185-327) e S2 (aa 500-632), que são os dois domínios ricos em Cisteína, ou no domínio L2 (328-499), que é flanqueado pelos dois domínios ricos em Cisteína. Os epítopos podem também estar localizados em combinações de domínios, tal como, porém não limitado a um epítopo compreendido pelas partes de L1 e S1. É adicionalmente preferida uma proteína de ligação isolada que se liga a uma estrutura tridimensional formada pelos resíduos de aminoácidos 1-160, 161-358, 359-575, 1-358 e/ou 359-604 do HER-3 maduro, particularmente do HER-3 humano maduro.
De preferência, uma proteína de ligação isolada da invenção é uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo ou um anticorpo, p.ex., um anticorpo anti-HER-3. Em particular, o anticorpo anti-HER-3 é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo U1-1, anticorpo U1-2, anticorpo U1-3, anticorpo U1-4, anticorpo U1-5, anticorpo U1-6, anticorpo U1-7, anticorpo U1-8, anticorpo U1-9, anticorpo U1-10, anticorpo U1-11, anticorpo U1-12, anticorpo U1-13, anticorpo U1-14, anticorpo U1-15, anticorpo U1-16, anticorpo U1-17, anticorpo U1-18, anticorpo U1-19, anticorpo U1-20, anticorpo U1-21, anticorpo U1-22, anticorpo U1-23, anticorpo U1-24, anticorpo U1-25, anticorpo U1-26, anticorpo U1-27, anticorpo U1-28, anticorpo U1-29, anticorpo U1-30, anticorpo U1-31, anticorpo U1-32, anticorpo U1-33, anticorpo U1-34, anticorpo U1-35, anticorpo U1-36, anticorpo U1-37, anticorpo U1-38, anticorpo U1-39, anticorpo U1-40, anticorpo U1-41, anticorpo U1-42, anticorpo U1-43, anticorpo U1-44, anticorpo U1-45, anticorpo U1-46, anticorpo U1-47, anticorpo U1-48, anticorpo U1-49, anticorpo U1-50, anticorpo U1-51, anticorpo U1-52, anticorpo U1-53, anticorpo U1-55.1, anticorpo U1-55, anticorpo U1-57.1, anticorpo U1-57, anticorpo U1-58, anticorpo U1-59, anticorpo U1-61.1, anticorpo U1-61, anticorpo U1-62 ou um anticorpo tendo pelo menos uma cadeia pesada ou leve de um dos ditos anticorpos. São especialmente preferidos os anticorpos U1-49 (SEQ ID NO: 42/44), U1-53 (SEQ ID NO: 54/56) e U1-59 (SEQ ID NO: 70/72) ou um anticorpo tendo pelo menos uma cadeia pesada ou leve de um dos ditos anticorpos.
Além disso, as modalidades adicionais da presente invenção proporcionam uma proteína de ligação isolada, acoplada a um grupo de marcação ou grupo efetor. De preferência, tal proteína de ligação é útil para o tratamento de doenças hiperproliferativas, particularmente as doenças oncológicas, tais como o câncer de mama, o câncer gastrointestinal, o cân- cer pancreático, o câncer da próstata, o câncer ovariano, o câncer do estô- mago, o câncer endometrial, o câncer da glândula salivar, o câncer do pul- mão, o câncer do rim, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer da tireóide, o câncer da bexiga, o glioma, o melanoma, o câncer do testículo, o sarcoma de tecido mole, o câncer da cabeça e do pescoço, ou outros cânce- res que expressam ou superexpressam o HER-3, e a formação de metásta- ses do tumor.
Os outros aspectos da presente invenção relacionam-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica uma proteína de ligação da invenção, um vetor tendo uma molécula de ácido nucléico codificando a proteína de ligação da invenção, e uma célula hospedeira, p.ex., uma célula CHO, uma célula de mieloma NS/0, transformada com tal molécula de ácido nucléico ou vetor.
Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de ligação da invenção, por preparação da dita proteína de ligação a partir de uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação. De preferência, a proteína de ligação da invenção é preparada a partir de uma linhagem celular de hibridoma que secreta uma proteína de ligação ou uma célula CHO ou outro tipo de célula transformada com uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de ligação da invenção.
Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de ligação da invenção, por preparação da dita proteína de ligação a partir de um tecido, produto ou secreção de um animal, planta ou fungo transgênico para uma molécula de ácido nucléico ou moléculas de ácidos nucléicos codificando a proteína de ligação da invenção. De preferência, uma proteína de ligação da invenção é preparada a partir do tecido, produto ou secreção de um animal transgênico, tal como a vaca, a ovelha, o coelho, a galinha ou outra espécie mamífera ou aviária, uma planta transgênica, tal como o milho, o tabaco ou outra planta, ou um fungo transgênico, tal como o Aspergillus, o Pichia ou outra espécie fúngica.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como um agente ativo, pelo menos uma proteína de ligação da invenção em mistura com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, a composição farmacêutica da invenção adicionalmente contém pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um agente antineoplástico. Ainda um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de pelo menos uma proteína de ligação da invenção, e opcionalmente pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um agente antineoplástico, em mistura com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica é adequada para diagnosticar, prevenir ou tratar uma doença hiperproliferativa, particularmente uma doença oncológica, tal como o câncer de mama, o câncer gastrointestinal, o câncer do pâncreas, o câncer da próstata, o câncer ovariano, o câncer do estômago, o câncer endometrial, o câncer da glândula salivar, o câncer do pulmão, o câncer do rim, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer da tireóide, o câncer da bexiga, o glioma, o melanoma ou outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, e a formação de metástases do tumor.
Ademais, a presente invenção refere-se em um aspecto adicional a um método para diagnosticar doenças ou condições associadas com a expressão de HER-3, compreendendo o contato de uma amostra com pelo menos uma proteína de ligação da invenção, e a detecção da presença do HER-3. As doenças ou condições preferidas incluem as doenças hiperproliferativas mencionadas acima.
Ainda um outro aspecto da presente invenção é um método para prevenir ou tratar doenças ou condições associadas com a expressão de HER-3 em um paciente que necessita dele, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade efetiva de pelo menos uma proteína de ligação da invenção e opcionalmente pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um agente neoplástico. De preferência, o paciente é um paciente mamífero, mais preferivelmente um paciente humano. As doenças ou as condições preferidas, associadas com a expressão de HER-3, são as doenças hiperproliferativas mencionadas acima.
Um aspecto adicional da presente invenção refere-se= a um kit para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de doenças ou condições associadas com a expressão de HER-3, compreendendo pelo menos uma proteína de ligação, e/ou a molécula de ácido nucléico e/ou o vetor da invenção. Opcionalmente, o kit da invenção pode adicionalmente compreen- der pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um agente antineoplástico. De preferência, as doenças ou as condições associadas com a expressão de HER-3 são as doenças hiperproliferativas mencionadas acima.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma proteína de ligação isolada que se liga ao HER-3.
Em uma modalidade da presente invenção, a proteína de ligação isolada da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das CDR1S selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) CDRH1's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, (b) CDRH2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e (c) CDRH3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e/ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo pelo menos uma das CDR's selecionadas a partir do grupo que consiste .em: (d) CDRL1's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs:
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, (e) CDRL2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, e (f) CDRL3 s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
Em uma outra modalidade da presente invenção, a proteína de ligação isolada da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230,
e/ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
Em mais uma outra modalidade da presente invenção, a proteína de ligação isolada da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada e uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, 6 e 8, 10 e 12, 14 e 16, 18 e 20, 22 e 24, 26 e 28, 30 e 32, 36 e 38, 42 e 44, 46 e 48, 50 e 52, 54 e 56, 60 e 58, 62 e 64, 66 e 68, IQ e 72, 74 e 76, 78 e 82, 80 e 82, 84 e 86, 88 e 90, 92 e 94, 96 e 98, 100 e 102, 104 e 106, 108 e 110, 112 e 114, 116 e 118, 122 e 124, 126 e 128, 130 e 132, 134 e 136, 138 e 140, 142 e 144, 146 e 148, 150 e 152, 154 e 156, 158 e 160, 162 e 164, 166 e 168, 170 e 172, 174 e 176, 178 e 180, 182 e 184, 186 e 188, 190 e 192, 194 e 196, 198 e 200, 202 e 204, 206 e 208, 210 e 212, 214 e 216, 218 e 220, 222 e 224, 226 e 228, 230 e 232, ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 60, 62 ou 120, ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 58 ou 64.
De acordo com a presente invenção, é para ser entendido que a seqüência de aminoácidos da proteína de ligação da invenção não está limitada aos vinte aminoácidos convencionais (Ver Immunology · A Synthesis (2â Edição, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é incorporado neste documento por referência). Por exemplo, os aminoácidos podem incluir os estereoisômeros (p.ex., os D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, os aminoácidos não naturais, tais como os aminoácidos α-,α-dissubstituídos, os N-alquil aminoácidos, o ácido láctico, e outros aminoácidos não convenci- onais. Os exemplos dos aminoácidos não convencionais que podem também ser componentes adequados para a proteína de ligação da invenção incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetil lisina, ε-Ν-acetil lisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil histidina, 5-hidroxilisina, α-Ν-metilarginina, e outros aminoácidos e imino- ácidos similares, p.ex., a 4-hidroxiprolina.
Além disso, de acordo com a presente invenção, as pequenas variações nas seqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1- 232 são contempladas como estando incluídas pela presente invenção, desde que as variações na seqüência de aminoácidos mantenham pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, 90 %, 95 %, e mais preferivelmente 99% das seqüências mostradas nas SEQ ID NOs: 1-232. As variações podem ocorrer dentro das regiões de armação (isto é, fora das CDRs), dentro das CDRs, ou dentro das regiões de armação e das CDRs. As variações preferidas nas seqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-232, isto é, as remoções, as inserções e/ou as substituições de pelo menos um aminoácido, ocorrem próximas aos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados das seqüências de nucleotídeos e/ou de aminoácidos com as bases de dados de seqüências públicas ou confidenciais. Os métodos de comparação computadorizados podem ser usados para identificar os motivos das seqüências ou os domínios de conformação da proteína preditos que ocorrem em outras proteínas de ligação de estrutura e/ou função conhecidas. Os métodos para identificar as seqüências de proteínas que se duplicam em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Ver, p.ex., Bowie e col., Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova York, N.Y. (1991)); e Thornton e col., Nature 354, 105 (1991), que são todos incorporados neste documento por referência. Assim, aqueles de habilidade na técnica podem reconhecer os motivos de seqüências e as conformações estruturais que podem ser usados para definir os domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção.
As variações especialmente preferidas nas seqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-174 e 1-232 são aquelas que resultam em uma suscetibilidade reduzida à proteólise ou à oxidação, alteram os padrões de glicosilação ou alteram as afinidades de ligação ou conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais da proteína de ligação. Em particular, as substituições de aminoácidos conservativas são contempladas. As substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. As famílias de aminoácidos preferidas são as seguintes: família ácida = aspartato, glutamato; família básica = lisina, arginina, histidina; família apoiar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e família polar não,, carregada = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. As famílias mais preferidas são: família hidróxi-alifática = serina e treonina; família contendo amida = asparagina e glutamina; família alifática = alanina, valina, leucina e isoleucina; e família aromática = fenilalanina, triptofano, e tirosina. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um amino- ácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito principal sobre a ligação ou as propriedades da proteína de ligação resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um sítio de armação. Entretanto, todas as outras substituições de aminoácidos possíveis são também incluídas pela presente invenção. Se uma alteração de aminoácido resulta em uma proteína de ligação funcional, isto é, em uma proteína de ligação que se liga ao HER-3 e reduz a transdução de sinal dos membros da família de HER, pode prontamente ser determinado testando a atividade específica da proteína de ligação resultante em ELISA ou FACS quanto à ligação ao HER-3 ou ensaio funcio- nal in vitro ou in vivo.
De acordo com a presente invenção, a proteína de ligação da invenção interage com pelo menos um epítopo na parte extracelular de HER. Os epítopos estão preferivelmente localizados no domínio L1 (aa 19-184), que é o domínio amino terminal, nos domínios S1 (aa 185-327) e S2 (aa 500-632), que são os dois domínios ricos em Cisteína, no domínio L2 (328- 499), que é flanqueado pelos dois domínios ricos em Cisteína, ou em uma combinação de domínios do HER-3. Os epítopos podem também estar localizados em combinações de domínios, tal como, porém não limitado a um epítopo compreendido pelas partes de L1 e S1. Além disso, a proteína de ligação da invenção é adicionalmente caracterizada pelo fato de que a sua ligação ao HER-3 reduz a transdução de sinal mediada pelo HER-3. De acordo com a presente invenção, uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3 pode, p.ex., ser causada por uma infra-regulação do HER-3, resultando em um desaparecimento pelo menos parcial das moléculas de HER-3 da superfície celular ou por uma estabilização do HER- 3 sobre a superfície celular em uma forma substancialmente inativa, isto é, uma forma que exibe uma transdução de sinal menor, comparada à forma não estabilizada. Alternativamente, uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3 pode também ser causada influenciando, p.ex., diminuindo ou inibindo, a ligação de um Iigante ou um outro membro da família do HER ao HER-3, de GRB2 ao HER-2 ou de GRB2 ao SHC, por inibição da fosforilação da tirosina receptora, da fosforilação da AKT, da fosforilação da tirosina PYK2 ou da fosforilação da ERK2, ou por diminuição da invasão do tumor. Alternativamente, uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3 pode também ser causada por influência, diminuição ou inibição, da formação de dímeros contendo HER-3 com outros membros da família do HER. Um exemplo entre outros pode ser a diminuição ou a inibição da formação do complexo protéico de HER3-EGFR.
De preferência, a proteína de ligação da invenção é uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo ou um anticorpo, isto é, um anticorpo anti-HER-3.
Dentro do contexto da presente invenção, o termo "proteína de andaime", como usado neste documento, significa um polipeptídeo ou proteína com as áreas de superfície expostas, nas quais as inserções, as substituições ou as remoções de aminoácidos são altamente toleráveis. Os exemplos de proteínas de andaime que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são a proteína A de Staphylococcus aureus, a proteína de ligação de bilina de Pieris brassicae ou outras lipocalinas, as proteínas de repetição de anquirina, e a fibronectina humana (revisto em Binz e Plückthun, Curr Opirt Biotechnol, 16, 459-69). A engenharia de uma proteína de andaime pode ser considerada como o enxerto ou a integração de uma função de afinidade sobre a, ou na, armação estrutural de uma proteína estavelmente duplicada. A função de afinidade significa uma afinidade de ligação a uma proteína de acordo com a presente invenção. Um andaime pode ser estruturalmente separável das seqüências de aminoácidos que conferem especificidade de ligação. Em geral, as proteínas que parecem adequadas para o desenvolvimento de tais reagentes de afinidades artificiais podem ser obtidas por técnicas de engenharia de proteínas racionais, ou mais comumente, combinatórias, tais como a bateia ("panning") contra o HER-3, a proteína purificada ou a proteína mostrada sobre a superfície da célula, por agentes de ligação em uma biblioteca de andaime artificial mostrada in vitro, habilidades que são conhecidas na técnica (Skerra, J. Mol. Recog., 2000; Binz e Plückthun, 2005). Além disso, uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo pode ser derivada de um polipeptídeo aceptor contendo o domínio de andaime, que pode ser enxertado com os domínios de ligação de um polipeptídeo doador para conferir a especificidade de ligação ao polipeptídeo doador sobre o domínio de andaime contendo o polipeptídeo aceptor. Os ditos domínios de ligação inseridos podem ser, por exemplo, a região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo, em particular um anticorpo anti- HER-3. A inserção pode ser efetuada por diversos métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, a síntese de polipe- ptídeos, a síntese de ácidos nucléicos de um aminoácido de codificação, bem como por diversas formas de métodos recombinantes, bastante conhe- cidas para aqueles versados na técnica.
Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-HER-3", con- forme usado neste documento, significa um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado (Jones e col., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann e col., Nature 332 (1988), 323-329; e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2 (1992), 593-596), um anticorpo quimérico (Morrison e col., Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), um anticorpo multiespecífico (p.ex., um anticorpo biespecífico) formado a partir de pelo menos dois anticorpos, ou um fragmento de anticorpo dele. O termo "fragmento de anticorpo" compreende qualquer porção dos anticorpos antes mencionados, preferivelmente as suas regiões de ligação a antígenos ou variáveis. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, os fragmentos Fab1, os fragmentos F(ab')2, os fragmentos Fv, os diacorpos (Hollinger e col., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), as moléculas de anticorpos de cadeias individuais (Plückthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg e Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) e outros fragmentos, desde que eles exibam a capacidade desejada de ligação ao HER-3.
Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-HER-3", conforme usado aqui, pode incluir as moléculas similares a anticorpos que contêm subdomínios engenheirados de anticorpos ou variantes de anticor- pos de ocorrência natural. Estas moléculas similares a anticorpos podem ser anticorpos de domínios individuais, tais como os domínios somente VH ou somente VL, derivados de fontes naturais, tais como os camelídeos (Muyldermans e col., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302), ou através da exposição in vitro de bibliotecas de seres humanos, camelídeos ou outras espécies (Holt e col., Trends Biotechnol., 21, 484-90).
De acordo com a presente invenção, o "fragmento Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação a um antígeno. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma leve em associação não covalente, firme. É nesta configuração que três CDR's de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis CDR1S conferem especificidade de ligação a antígeno para o anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDR1S específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora normalmente em uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro. O "fragmento Fab" também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. O "fragmento Fab" difere do "fragmento Fab'" pela adição de alguns resíduos na extremidade de carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. O "fragmento F(ab')2" originalmente é produzido como um par de "fragmentos FabJi", os quais têm cisteínas de articulação entre eles. Os métodos de preparar tais fragmentos de anticorpos, tais como a digestão com papaína ou pepsina, são conhecidos para aqueles versados na técnica.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo anti-HER-3 da invenção é do tipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, preferivelmente do tipo IgG ou IgM, incluindo, porém não limitado ao tipo IgGI, lgG2, lgG3, IgG4, IgMI e lgM2. Nas modalidades mais preferidas, o anticorpo é do tipo IgGI, lgG2 ou lgG4.
Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo anti-HER-3 da invenção é um anticorpo anti-HER-3 dirigido contra o domínio extracelular (ECD) do HER-3.
Em certos aspectos, p.ex., em conexão com a geração de anticorpos como candidatos terapêuticos contra o HER-3, pode ser desejável que o anticorpo anti-HER-3 da invenção seja capaz de fixar o complemento e participar na citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Existem diversos isótipos de anticorpos que são capazes disto, incluindo, sem limitações, os que seguem: IgM de murino, lgG2a de murino, lgG2b de murino, lgG3 de murino, IgM humana, IgGI humana, lgG3 humana, e IgA humana. Será apreciado que os anticorpos que são gerados não necessitam inicialmente possuir tal isótipo, porém, preferivelmente, o anticorpo, conforme gerado, pode possuir qualquer isótipo e o anticorpo pode ser trocado de isótipo por fixação dos genes ou do cDNA da região V molecularmente clonado aos genes ou cDNAs da região constante molecularmente clonados, em vetores de expressão apropriados, usando práticas convencionais biológicas moleculares, que são bastante conhecidas na técnica, e então expressão dos anticorpos em células hospedeiras, usando práticas conhecidas na técnica. O anticorpo trocado de isótipo pode também possuir uma região Fc que tenha sido molecularmente engenheirada para possuir CDC superior sobre as variantes de ocorrência natural (Idusogie e col., J Immunol., 166, 2571-2575) e expressa de modo recombinante em células hospedeiras, usando práticas conhecidas na técnica. Tais práticas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (ver, p.ex., a Patente U.S. N2 4.816.397), técnicas de fusão de célula-célula (ver, p.ex., as Patentes U.S. N- 5.916.771 e 6.207.418), entre outras. Na técnica de fusão de célula-célula, um mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui uma cadeia pesada com qualquer isótipo desejado e um outro mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui a cadeia leve. Tais células podem, após isso, ser fundidas e uma linhagem celular expressando um anticorpo intacto pode ser isolada. Como forma de exemplo, um anticorpo anti-HER-3 de lgG4 humano, que possui a ligação desejada ao antígeno HER-3, poderia ser prontamente trocado de isótipo para gerar um isótipo de IgM humana, IgGI humana ou lgG3 humana, ao mesmo tempo possuindo a mesma região variável (que define a especificidade do anticorpo e algo de sua afinidade). Tal molécula poderia então ser capaz de fixar o complemento e participar na CDC. Além disso, pode também ser desejável para o anticorpo anti- HER-3 da invenção ser capaz de ligar-se aos receptores de Fc sobre as células efetoras, tais como os monócitos e as células exterminadoras naturais (NK), e participar na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Existem diversos isótipos de anticorpos que são capazes disto, incluindo, sem limitações, os que seguem: lgG2a de murino, lgG2b de murino, lgG3 de murino, IgGI humana e lgG3 humana. Será apreciado que os anticorpos que são gerados não necessitam inicialmente possuir tal isótipo, porém, preferivelmente, o anticorpo, conforme gerado, pode possuir qualquer isótipo e o anticorpo pode ser trocado de isótipo por fixação dos genes ou do cDNA da região V molecularmente clonado aos genes ou cDNAs da região constante molecularmente clonados, em vetores de expressão apropriados, usando práticas convencionais biológicas moleculares, que são bastante conhecidas na técnica, e então expressão dos anticorpos em células hospedeiras, usando práticas conhecidas na técnica. O anticorpo trocado de isótipo pode também possuir uma região Fc que tenha sido molecularmente engenheirada para possuir ADCC superior sobre as variantes de ocorrência natural (Shields e col. J biol Chem., 276, 6591-6604) e expressa de modo recombinante em células hospedeiras usando práticas conhecidas na técnica. Tais práticas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (ver, p.ex., a Patente U.S. Ne 4.816.397), técnicas de fusão de célula-célula (ver, p.ex., as Patentes U.S. N— 5.916.771 e 6.207.418), entre outras. Na técnica de fusão de célula-célula, um mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui uma cadeia pesada com qualquer isótipo desejado, e um outro mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui a cadeia leve. Tais células podem, após isso, ser fundidas e uma linhagem celular expressando um anticorpo intacto pode ser isolada. Como forma de exemplo, um anticorpo anti-HER-3 de lgG4 humano, que possui a ligação desejada ao antígeno HER-3, poderia ser prontamente trocado de isótipo para gerar um isótipo de IgGI humana ou lgG3 humana, ao mesmo tempo possuindo a mesma região variável (que define a especificidade do anticorpo e algo de sua afinidade). Tal molécula poderia então ser capaz de ligar-se ao FcyR sobre as células efetoras e participar na ADCC.
Além disso, de acordo com a presente invenção, aprecia-se que o anticorpo anti-HER-3 da invenção é um anticorpo totalmente humano ou humanizado. Os anticorpos humanos evitam certos dos problemas associados com os anticorpos xenogênicos, por exemplo, os anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de murinos ou ratos. A presença de proteínas xenogênicas derivadas, tais como as proteínas derivadas de murinos ou ratos, pode resultar na geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um paciente, subseqüentemente levando à rápida depuração dos anticorpos, à perda de utilidade terapêutica através da neutralização do anticorpo e/ou a reações alérgicas graves, que podem até causar morte.
De preferência, o anticorpo anti-HER-3 da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo U1-2, anticorpo U1- 3, anticorpo U1-4, anticorpo U1-5, anticorpo U1-6, anticorpo U1-7, anticorpo U1-8, anticorpo U1-9, anticorpo U1-10, anticorpo U1-11, anticorpo U1-12, anticorpo U1-13, anticorpo U1-14, anticorpo U1-15, anticorpo U1-16, anticorpo U1-17, anticorpo U1-18, anticorpo U1-19, anticorpo U1-20, anticorpo U1-21, anticorpo U1-22, anticorpo U1-23, anticorpo U1-24, anticorpo U1-25, anticorpo Ul-26, anticorpo U1-27, anticorpo U1-28, anticorpo U1-29, anticorpo U1-30, anticorpo U1-31, anticorpo U1-32, anticorpo U1-33, anticorpo U1-34, anticorpo U1-35, anticorpo U1-36, anticorpo U1-37, anticorpo U1-38, anticorpo U1-39, anticorpo U1-40, anticorpo U1-41, anticorpo U1-42, anticorpo U1-43, anticorpo U1-44, anticorpo U1-45, anticorpo U1-46, anticorpo U1-47, anticorpo U1-48, anticorpo U1-49, anticorpo U1-50, anticorpo U1-51, anticorpo U1-52, anticorpo U1-53, anticorpo U1-55.1, anticorpo U1-55, anticorpo U1-57.1, anticorpo U1-57, anticorpo U1-58, anticorpo U1-59, anticorpo U1-61.1, anticorpo U1-61, anticorpo U1-62.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma proteína de ligação da invenção é acoplada a um grupo de marcação. Tal proteína de ligação é particularmente adequada para aplicações diagnosticas. Conforme usado neste documento, o termo "grupo de marcação" refere-se a um marcador detectável, p.ex., um aminoácido radiomarcado ou porção de biotinila que possa ser detectada pela avidina marcada (p.ex., a estreptavidina ligada a um marcador fluorescente ou atividade enzimática que possa ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Diversos métodos para marcar os polipeptídeos e as glicoproteínas, tais como os anticorpos, são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. Os exemplos de grupos de marcação adequados incluem, porém não estão limitados aos que seguem: radioisótopos ou radionuclídeos (p.ex., 3H, 14C, 15N, 35S1 90Y, "Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p.ex., FITC, rodamina, substâncias fosforescentes de lantanídeos), grupos enzimáticos (p.ex., peroxidase da raiz forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos de biotinila, ou epítopos de polipeptídeos predeterminados, reconhecidos por um relator secundário (p.ex., as seqüências de pares de Ieucina zipper, os sítios de ligação para os anticorpos secundários, os domínios de ligação a metais, as marcas de epítopos). Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos de marcação estejam unidos por braços espaçadores de diversos comprimentos,..para reduzir o impedimento estérico potencial.
Alternativamente, uma proteína de ligação da invenção pode ser acoplada a um grupo efetor em uma outra modalidade preferida da invenção. Tal proteína de ligação é especialmente adequada para aplicações terapêuticas. Conforme usado neste documento, o termo "grupo efetor" refere-se a um grupo citotóxico, tal como um radioisótopo ou radionuclídeo, uma toxina, um grupo terapêutico ou outro grupo efetor conhecido na técnica. Os exemplos para os grupos efetores adequados são os radioisótopos ou os radionuclídeos (p.ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), a caliqueamicina, os análogos de dolastatina, tais como as auristatinas, e os agentes quimioterapêuticos, tais como a geldanamicina e os derivados de maitansina, incluindo o DM1. Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos efetores estejam unidos por braços espaçadores de diversos comprimentos, para reduzir o impedimento estérico potencial.
Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um processo para preparar uma proteína de ligação isolada da invenção, compreendendo a etapa de preparar a proteína de ligação a partir de uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação. As células hospedeiras, que podem ser usadas de acordo com a presente invenção, são hibridomas; células eucarióticas, tais como as células de mamíferos, p.ex., as células de hamster, coelhos, ratos, porcos, camundongos ou outros animais, as células de plantas, as células fúngicas, p.ex., Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, as células procarióticas, tais como E. coli; e outras células usadas na técnica para a produção de proteínas de ligação. Diversos métodos para preparar e isolar as proteínas de ligação, tais como as proteínas de andaime ou os anticorpos, a partir de células hospedeiras são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. Além disso, os métodos para preparar os fragmentos de proteínas de ligação, p.ex., os fragmentos das proteínas de andaime ou os fragmentos dos anticorpos, tais como a digestão com papaína ou pepsina, as técnicas de clonagem modernas, as técnicas para a preparação de moléculas de anticorpos de cadeias individuais (Plückthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg e Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) e diacorpos (Hollinger e col., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), são conhecidos também para aqueles versados na técnica e podem ser usados na efetuação da presente invenção.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma proteína de ligação da invenção é preparada a partir de um hibridoma que secreta a proteína de ligação. Ver, p.ex., Kóhler e col., Nature 256 (1975), 495.
Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção, uma proteína de ligação da invenção é preparada de modo recombinante por otimização e/ou amplificação da expressão da proteína de ligação em uma célula hospedeira e isolamento da proteína de ligação a partir da dita célula hospedeira. Para esta finalidade, as células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com DNA que codifica uma proteína de ligação ou um vetor contendo DNA que codifica a proteína de ligação e cultivadas sob condições apropriadas para produzir a proteína de ligação da invenção. Ver, p.ex., a Patente U.S. N- 4.816.567. As células hospedeiras preferidas podem ser as células CHO1 as células de mieloma NS/O, as células de rins embriônicas humanas 293, E. coli e Saccharomyces cerevisiae.
Com relação às proteínas de ligação que são anticorpos, estes anticorpos podem ser preparados a partir de animais geneticamente engenheirados para preparar anticorpos inteiramente humanos ou a partir de uma biblioteca de exposição de anticorpos feitas em bacteriófago, levedura, ribossomo ou E. coli. Ver, p.ex., Clackson e col., Nature 352 (1991), 624-628, Marks e col., J. Moi Biol. 222 (1991), 581-597, Feldhaus e Siegel J Immunol Methods. 290, 69-80, Groves e Osbourn, Expert Opin Biol Ther., 5, 125-135 e Jostock e Dubel, Comb Chem High Throughput Screen. 8, 127-133.
Os anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associa- dos com os anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de murinos ou ratos. A presença de tais proteínas derivadas de murinos ou ratos pode resultar na rápida depuração dos anticorpos ou pode resultar na geração de uma resposta imune contra o anticorpo, por um ,paciente. Para evitar a utilização de anticorpos derivados de murinos ou ratos, os ânticos inteiramente humanos podem ser gerados através da introdução de locais de anticorpos humanos funcionais em um rodente, outro mamífero ou animal, de modo que o rodente, o outro mamífero ou o animal produza anticorpos inteiramente humanos.
Um método para gerar anticorpos inteiramente humanos é através do uso das cepas XENOMOUSE® de camundongos que tenham sido engenheiradas para conter fragmentos de configurações de linhas germinativas de tamanhos 245 kb e 190 kb do local da cadeia pesada humana e no local da cadeia leve capa. As outras cepas XenoMouse de camundongos contêm fragmentos de configurações de linhas germinativas de tamanhos 980 kb e 800 kb do local da cadeia pesada humana e do local da cadeia leve capa. Ainda as outras cepas XenoMouse de camundongos contêm fragmentos de configurações de linhas germinativas de tamanhos 980 kb e 800 kb do local da cadeia pesada humana e do local da cadeia leve capa mais um local da cadeia leve Iambda humana completa configurada com linha germinativa de tamanho 740 kb. Ver Mendez e col. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). As cepas XENOMOUSE® estão disponíveis de Abgenix1 Inc. (Fremont, CA).
A produção dos camundongos XENOMOUSE® é adicionalmente discutida e descrita nos Pedidos de Patentes U.S. N- de Série 07/466,008, depositado em 12 de janeiro de 1990, 07/610,515, depositado em 8 de novembro de 1990, 07/919,297, depositado em 24 de julho de 1992, 07/922,649, depositado em 30 de julho de 1992, 08/031,801, depositado em 15 de março de 1993, 08/112,848, depositado em 27 de agosto de 1993, 08/234,145, depositado em 28 de abril de 1994, 08/376,279, depositado em 20 de janeiro de 1995, 08/430, 938, 27 de abril de 1995, 08/464,584, depositado em 5 de junho de 1995, 08/464,582, depositado em 5 de junho de 1995, 08/463,191, depositado em 5 de junho de 1995, 08/462,837, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486,853, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486,857, depositado em 5 áe. junho de 1995, 08/486,859, depositado em 5 de junho de 1995, 08/462,513, depositado em 5 de junho de 1995, 08/724,752, depositado em 2 de outubro de 1996, e 08/759,620, depositado em 3 de dezembro de 1996, na Publicação de Patente U.S. 2003/0217373, depositada em 20 de novembro de 2002, e nas Patentes U.S. Nss 6.833.268, 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181, e 5.939.598 e nas Patentes Japonesas N2s 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, e 3 068 507 B2. Ver também a Patente Européia N- EP 0 463 151 B1, concessão publicada em 12 de junho de 1996, o Pedido de Patente Internacional N-WO 94/02602, publicado em 3 de fevereiro de 1994, o Pedido de Patente Internacional N2 WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996, o WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998, o WO 00/76310, publicado em 21 de dezembro de 2000. As divulgações de cada uma das patentes, pedidos, e referências acima citados são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade.
Em uma abordagem alternativa, outros, incluindo a GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem de "minilocal". Na abordagem de minilocal, um local de Ig exógeno é copiado através da inclusão de pedaços (genes individuais) do local de Ig. Assim, um ou mais genes de VH, um ou mais genes de Dh, um ou mais genes de Jh, uma região constante mu, e uma segunda região constante (preferivelmente uma região constante gama) são formados em uma construção para a inserção em um animal. Esta abordagem é descrita na Patente U.S. N- 5.545.807 para Surani e col. e nas Patentes U.S. Nss 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299, e 6.255.458, cada uma para Lonberg e Kay1 nas Patentes U.S. N- 5.591.669 e 6.023.010 para Krimpenfort e Bems, nas Patentes U.S. N- 5.612.205, 5.721.367, e 5.789.215 para Berns e col., e na Patente U.S. N2 5.643.763 para Choi e Dunn, e nos Pedidos de Patentes U.S. Internacionais da GenPharm International N- de Série 07/574,748, depositado em 29 de agosto de 1990, 07/575,962, depositado em 31 de agosto de 1990, 07/810,279, depositado em 17 de dezembro de 1991, 07/853,408, depositado em 18 de mgrço de 1992, 07/904,068, depositado em 23 de junho de 1992, 07/990,860, depositado em 16 de dezembro de 1992, 08/053,131, depositado em 26 de abril de 1993, 08/096,762, depositado em 22 de julho de 1993, 08/155,301, depositado em 18 de novembro de 1993, 08/161,739, depositado em 3 de dezembro de 1993, 08/165,699, depositado em 10 de dezembro de 1993, 08/209,741, depositado em 9 de março de 1994, cujas divulgações são, pelo presente, incorporadas por referência. Ver também a Patente Européia N2 0 546 073 B1, os Pedidos de Patentes Internacionais N25 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884 e a Patente U.S. N2 5.981.175, cujas divulgações são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade. Ver adicionalmente Taylor e col., 1992, Chen e col., 1993, Tuaillon e col., 1993, Choi e col., 1993, Lonberg e col., (1994), Taylor e col., (1994), e Tuaillon e col., (1995), Fishwild e col., (1996), cujas divulgações são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade.
Kirin também demonstrou a geração de anticorpos humanos a partir de camundongos nos quais, através de fusão de microcélulas, foram introduzidos pedaços grandes de cromossomos, ou cromossomos inteiros. Ver os Pedidos de Patentes Europeus N- 773 288 e 843 961, cujas divulgações são, pelo presente, incorporadas por referência. Adicionalmente, foram gerados os camundongos KM®, que são o resultado da hibridização dos camundongos Tc de Kirin com os camundongos de minilocais (Humab) de Medarex. Estes camundongos possuem o transcromossomo de HC dos camundongos de Kirin e o transgene de cadeia capa dos camundongos de Medarex (lshida e col., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
Os anticorpos humanos podem também ser derivados por métodos in vitro. Os exemplos adequados incluem, porém não estão limita- dos à, exposição em fagos (como comercializado por Cambridge Antibody Technology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma1Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), exposição em ribossomos (como comer- cializado por Cambridge Antibody Technology), exposição em leveduras, e similares,
Os anticorpos, como descritos neste documento, foram prepara- dos através da utilização da tecnologia XENOMOUSE®, conforme descrita abaixo. Tais camundongos, então, são capazes de produzir moléculas e anticorpos de imunoglobulinas humanos e são deficientes na produção de moléculas e anticorpos de imunoglobulinas de murinos. As tecnologias utilizadas para obter os mesmos são divulgadas nas patentes, nos pedidos, e nas referências divulgados na seção de fundamentos aqui contida. Em particular, entretanto, uma modalidade preferida da produção transgênica de camundongos e anticorpos a partir deles é divulgada no Pedido de Patente U.S. N2 de Série 08/759,620, depositado em 3 de dezembro de 1996, e nos Pedidos de Patentes Internacionais N- WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998 e WO 00/76310, publicado em 21 de dezembro de 2000, cujas divulgações são, pelo presente, incorporadas por referência. Ver também Mendez e col. Nature Genetics 15:146-156 (1997), cuja divulgação é, pelo presente, incorporada por referência.
Através do uso de tal tecnologia, produziram-se anticorpos monoclonais inteiramente humanos para uma variedade de antígenos. Essencialmente, as linhagens de camundongos XENOMOUSE® são imuni- zadas com um antígeno de interesse (p.ex., o HER-3), as células linfáticas (tais como as células B) são recuperadas dos camundongos que expres- saram os anticorpos, e as linhagens celulares recuperadas são fundidas com uma linhagem celular do tipo mielóide para preparar as linhagens celulares de hibridomas imortais. Estas linhagens celulares de hibridomas são exami- nadas e selecionadas para identificar as linhagens celulares de hibridomas que produziram anticorpos específicos para o antígeno de interesse. Proporcionam-se neste documento métodos para a produção de múltiplas linhagens celulares de hibridomas que produzem anticorpos específicos para HER-3. Ademais, proporciona-se neste documento a caracterização dos anticorpos produzidos por tais linhagens celulares, incluindo as análises das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos das cadeias pesadas e leves de tais anticorpos.
Em geral, os anticorpos produzidos pelos hibridomas fundidos eram cadeias pesadas da IgGI humanas com cadeias leves capa inteira- mente humanas. Os anticorpos descritos neste documento possuem cadeias pesadas da lgG4 humanas, bem como cadeias pesadas da IgGI. Os anticorpos podem também ser de outros isótipos humanos, incluindo lgG2 ou lgG3. Os anticorpos possuíam altas afinidades, tipicamente possuindo uma Kd de cerca de 10-6 até cerca de 10-13 M ou abaixo, quando medidas por técnicas de fase sólida e à base de células.
Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica uma proteína de ligação da invenção. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácido nucléico isolada", conforme usado neste documento, significa um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA, ou sintética, ou alguma combinação disto, que, em virtude de sua origem, a "molécula de ácido nucléico isolada" (1) não está associada com todo ou uma porção de um polinucleotídeo no qual o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) está operavelmente ligada a um polinucleotídeo ao qual não está ligada na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior. Ademais, o termo "molécula de ácido nucléico", como referido neste documento, significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, tal como os nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. O termo também inclui as formas de fitas simples ou duplas de DNA.
Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico da invenção está operavelmente ligada a uma seqüência de controle. O termo "seqüência de controle", conforme usado neste documento, refere-se às seqüências de polinucleotídeos que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento das seqüências de codificação às quais elas estão ligadas. A natureza de tais seqüências de controle difere, dependendo do organismo hospedeiro. Nos procariotos, tais seqüências de controle geralmente incluem promotores, sítios de ligação ribossômicos, e seqüências de terminação da transcrição. Nos eucarjo.tos, geralmente, tais seqüências de controle incluem os promotores e as seqüências de termi- nação da transcrição. De acordo com a presente invenção, o termo "seqüên- cia de controle" é pretendido incluir, em um mínimo, todos os componentes cuja presença seja essencial para a expressão e o processamento, e pode também incluir componentes adicionais cuja presença seja vantajosa, por exemplo, as seqüências líderes e as seqüências de pares de fusão. Ademais, o termo "operavelmente ligada", conforme usado neste documento, refere-se às posições dos componentes assim descritos que estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Além disso, de acordo com a presente invenção, uma seqüência de controle da expressão operavelmente ligada a uma seqüência de codificação está ligada em um modo tal que a expressão da seqüência de codificação é atingida sob condições compatíveis com a seqüência de controle da expressão.
Um aspecto adicional da presente invenção é um vetor compre- endendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de ligação da invenção. A molécula de ácido nucléico pode estar operavelmente ligada a uma seqüência de controle. Além disso, o vetor pode adicional- mente conter uma origem de replicação ou um gene marcador de seleção. Os exemplos de vetores que podem ser usados de acordo com a presente invenção são, p.ex., os plasmídios, os cosmídios, os fagos, os vírus, etc.
Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucléico ou vetor da invenção. A transformação poderia ser feita por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, o acondicionamento do polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e a transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, conforme exemplificados pelas Patentes U.S. N- 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, e 4.959.455, cujas patentes são, pelo presente, incorporadas neste documento por referência. Particularmente, os métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células mamíferas são bastante conhecidos na técnica e incluem a transfecção mediada por .dextrana, a precipitação com fosfato de cálcio, a transfecção mediada por polibreno, a fusão de protoplasto, a eletroporação, a encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos, e a microinjeção direta do DNA nos núcleos. Os exemplos de células hospe- deiras que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são as células eucarióticas de hibridomas, tais como as células de mamíferos, p.ex., as células de hamster, coelhos, ratos, porcos, camundongos ou outros animais; as células de plantas e as células fúngicas, p.ex., milho, tabaco, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris-, as células procarióticas, tais como E. coli; e outras células usadas na técnica para a produção de anticorpos. Especialmente, as linhagens celulares mamíferas disponíveis como hospedeiros para a expressão são bastante conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC) ("Coleta de Cultura do Tipo Americano"), incluindo, porém não limitado às células do ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células do rim de hamster bebê (BHK), células dos rins de macacos (COS), células de carcinoma hepatocelular (p.ex., Hep G2), e diversas outras linhagens celulares.
Mais um outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo, como um agente ativo, pelo menos uma proteína de ligação da invenção e veículos, diluentes e/ou adjuvantes far- maceuticamente aceitáveis. O termo "composição farmacêutica", conforme usado neste documento, refere-se a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando adequadamente administrada a um paciente (The McGraw-HiII Dictionary of Chemical Terms, Parker, S., Ed., McGraw-HiII, San Francisco (1985), incorporado neste documento por referência). De acordo com a presente invenção, a potência da composição farmacêutica da invenção é baseada na ligação da pelo menos uma proteína de ligação ao HER-3. De preferência, esta ligação resulta em uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3.
Além disso, o termo "veículos", quando usado neste documento, inclui os veículos, os excipientes, ou os estabilizantes que sejam não tóxicos para a célula ou cumamífero que está sendo exposto a eles, nas dosagens e concentrações empregadas. Freqüentemente, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa ou um Iipossomo (uma pequena vesícula composta de diversos tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativos, que é útil para a distribuição de um fármaco para um mamífero). Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem os tampões, tais como o fosfato, o citrato, e outros ácidos orgânicos; os antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico; os polipeptídeos de baixos pesos moleculares (menos do que cerca de 10 resíduos); as proteínas, tais como a soro albumina, a gelatina, ou as imunoglobulinas; os polímeros hidrofílicos, tais como a polivinilpirrolidona; os aminoácidos, tais como a glicina, a glutamina, a asparagina, a arginina ou a lisina; os monossacarídeos, os dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo a glicose, a manose ou as dextrinas; os agentes quelantes, tais como o EDTA; os álcoois de açúcares, tais como o manitol ou o sorbitol; os contra-íons formadores de sais, tais como o sódio; e/ou os tensoativos não-iônicos, tais como o TWEEN®, o polietileno glicol (PEG), e os PLURONICS®.
Em uma modalidade da presente invenção, a pelo menos uma proteína de ligação da invenção contida na composição farmacêutica é acoplada a um efetor, tal como a caliqueamicina, a Auristatina-PE, um radio- isótopo ou um agente quimioterapêutico tóxico, tal como a geldanamicina e a maitansina. Em particular, estes conjugados da proteína de ligação são úteis no alvejamento de células, p.ex., as células de câncer, que expressam o HER-3 para a eliminação.
Além disso, a ligação das proteínas de ligação da invenção aos radioisótopos, p.ex., proporciona vantagens para os tratamentos de tumores. Ao contrário da quimioterapia e de outras formas de tratamento do câncer, a radioimunoterapia ou a administração de uma combinação de radioisótopo- proteína de ligação alveja diretamente as células de câncer, com dano mínimo ao tecido saudável, normal, circundante. Com este "remédio mágico", o paciente pode ser tratado com quantidades muito menores de radioisó- topos do que as outras formas de tratamento disponíveis hoje. Os radi- jpisótopos preferidos incluem o ítrio90 (90Y)1 o índio111 (111In), o 131I, o 99mTc, a radioprata-111, a radioprata-199, e o Bismuto213. A ligação dos radioisótopos às proteínas de ligação da invenção pode, p.ex., ser efetuada com quelatos bifuncionais convencionais. Visto que a prata é monovalente, para a ligação da radioprata-111 e da radioprata-199, podem ser usados os Iigadores à base de enxofre (Hazra e col., Cell Biophys. 24-25, 1-7 (1994)). A ligação dos radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com o ácido ascórbico. Além disso, o tiuxetano é um quelante Iigador de MX- DTPA unido ao ibritumomab para formar o ibritumomab tiuxetano (ZevaIin) (Witzig, T.E, Câncer Chemother. PharmacoL 48 Supl 1, 91-5 (2001). O ibritumomab tiuxetano pode reagir com os radioisotipos, tais como o índio111 (111In) ou o 90Y, para formar o 111ln-ibritumomab tiuxetano e o 90Y-ibritu- momab tiuxetano, respectivamente. Além disso, uma proteína de ligação da invenção, particular- mente quando usada para tratar o câncer, pode ser conjugada com fárma- cos quimioterapêuticos tóxicos, tais como a caliqueamicina (Hamann e col., Bioconjug. Chem. 13(1), 40-6 (2002), a geldanamicina (Mandler e col., J. Natl. Câncer Inst., 92(19), 1549-51 (2000)) e a maitansina, por exemplo, o fármaco maitansinóide, DM1 (Liu e col., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93:8618-8623 (1996)). Podem ser empregados com esta tecnologia diferentes Iigadores que liberam os fármacos sob condições ácidas ou redutoras ou na exposição a proteases específicas. De acordo com a presente invenção, uma proteína de ligação da invenção pode ser conjugada conforme descrito na técnica.
A auristatina-PE, p.ex., é um agente antimicrotúbulo que é uma modificação estrutural do constituinte de peptídeo de molusco sem concha, marinho, dolastatina 10. A auristatina-PE tanto tem atividade antitumor quanto atividade vascular antitumor (Otani e col., Jpn. J. Câncer Res. 91(8), 837-44 (2000)). Por exemplo, a auristatina-PE inibe o crescimento da célula e induz a interrupção do ciclo celular e a apoptose nas linhagens celulares de câncer pancreático (Li e col., Int. J. Moi Med. 3(6), 647-53 (1999)). Desse modo, para alvejar especificamente a atividade antitumor e as atividades vasculares antitumor da auristatina-PE aos tumores particulares, a auristatina-PE pode ser conjugada à proteína de ligação da invenção.
Em uma modalidade da presente invenção, a composição farma- cêutica compreende pelo menos um agente ativo adicional. Os exemplos para os agentes ativos adicionais, os quais podem ser usados de acordo com a presente invenção, são os anticorpos ou os inibidores de baixos pesos moleculares de outras cinase protéicas receptoras, tais como o EGFR, o HER-2, o HER-4, o IGFR-1, ou o c-met, os Iigantes de receptores, tais como o fator endotelial vascular (VEGF), os agentes citotóxicos, tais como a doxorrubicina, a cis-platina ou a carboplatina, as citocinas ou os agentes antineoplásticos. Muitos agentes antineoplásticos são atualmente conhe- cidos na técnica. Em uma modalidade, o agente antineoplástico é selecio- nado a partir do grupo de proteínas terapêuticas, incluindo, porém não limitadas aos, anticorpos ou proteínas imunomoduladoras. Em uma outra modalidade, o agente antineoplástico é selecionado a partir do grupo de inibidores de pequenas moléculas ou agentes quimioterapêuticos consis- tindo em inibidores mitóticos, inibidores das cinases, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos que se intercalam, inibidores do fator do crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores das topoisome- rases, inibidores da histona desacetilase, agentes antisobrevivência, modificadores da resposta biológica, anti-hormônios, p.ex., antiandrógenos, e agentes antiangiogênse. Quando o agente antineoplástico for a radiação, o tratamento pode ser obtido com uma fonte interna (braquiterapia BT) ou externa (terapia externa de radiação de feixes: EBRT).
A composição farmacêutica da presente invenção é especial- mente adequada para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de uma doença hiperproliferativa. A doença hiperproliferativa pode estar, p.ex., associada com a transdução aumentada de sinal da família do HER. Parti- cularmente, a doença pode estar associada com a fosforilação aumentada do HER-3 e/ou a formação de complexo aumentada entre o HER-3 e os outros membros da família do HER e/ou a atividade aumentada da Pl3 cinase e/ou a atividade da cinase terminal c-jun e/ou a atividade da AKT aumentadas e/ou a atividade da ERK2 .e/ou a atividade da PYK2 aumentadas. De preferência, a doença hiperproliferativa é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer ovariano, câncer do estômago, câncer endometrial, câncer da glândula salivar, câncer do pulmão, câncer do rim, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da tireóide, câncer da bexiga, glioma, melanoma, ou outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, e na formação de metástases do tumor.
De acordo com a presente invenção, o termo "prevenção ou tratamento", quando usado neste documento, refere-se tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, onde o paciente que necessita é para prevenir ou desacelerar (diminuir) a condição ou o distúrbio patológico alvejado. Aqueles que necessitam de prevenção ou tratamento incluem aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles propen- sos a terem o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio é para ser prevenido.
O paciente que necessita de prevenção ou tratamento é um paciente mamífero, isto é, qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo os seres humanos, os animais domésticos e de fazendas, e os animais de zoológicos, de esportes, ou dê estimação, tais como os cães, os gatos, o gado, os cavalos, as ovelhas, os porcos, as cabras, os coelhos, etc. De preferência, o paciente que necessita de tratamento é um paciente humano.
De acordo com a presente invenção, a composição farmacêutica da invenção pode ser formulada por mistura do(s) agente(s) ativo(s) com veículos, diluentes e/ou adjuvantes fisiologicamente aceitáveis, e opcional- mente outros agentes que sejam normalmente incorporados nas formula- ções para proporcionar a transferência, a distribuição, a tolerância, e similares, aperfeiçoadas. A composição farmacêutica da invenção pode ser formulada, p.ex., na forma de formulações liofilizadas, soluções aquosas, dispersões ou preparações sólidas, tais como comprimidos, drágeas ou cápsulas. Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encon- trada no formulário conhecido para todos os químico-farmacêuticos: Remington1S Pharmaceutical Sciences (18â ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), particularmente o Capítulo 87, por Block, Lawrence, nele. Estas formulações incluem, por exemplo, os pós, as pastas, os ungüentos, as geléias, as ceras, os óleos, os lipídios, as vesículas contendo lipídios (catiônicos ou aniônicos) (tais como a Lipofectin®), os conjugados de DNA, as pastas de absorção anidras, as emulsões de óleo em água e de água em óleo, as emulsões carbowax (polietileno glicóis de diversos pesos moleculares), os géis semi-sólidos, e as misturas semi-sólidas contendo carbowax. Quaisquer das misturas precedentes podem ser apropriadas nos tratamentos e nas terapias de acordo com a presente invenção, desde que o agente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a rota de administração. Ver também Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.", Regul. ToxicoL Pharmacoi 32(2), 210-218 (2000); Wang W., "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.", Int. J. Pharm. 203(1-2), 1-60 (2000); Charman W.N., "Lipids, Iipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.", J. Pharm. Sei. 89(8), 967-978 (2000); Powell e col., "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. Pharm. Sei. Technol. 52, 238-311 (1998); e as citações neles quanto a uma informação adicional relacionada a formulações, excipientes e veículos, bastante conhecidos para os químico-farmacêuticos.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de pelo menos uma proteína de ligação isolada da invenção, e opcionalmente pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um agente antineoplástico conforme descrito acima, em mistura com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, para a manufatura de uma composição farmacêutica para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de uma doença hiperproliferativa. De preferência, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica conforme descrita acima e a doença hiperproliferativa é uma doença hiperproliferativa conforme mencionada acima.
Ainda um outro aspecto da presente invenção está envolvido com um método para diagnosticar doenças ou condições associadas com a expressão do HER-3, compreendendo contatar uma amostra com uma proteína de ligação da invenção, e detectar a presença do HER-3 na amostra. A amostra pode ser uma célula que mostre a expressão do HER-3, tal como uma célula de tumor, uma amostra de sangue ou uma outra amostra adequada. Em uma modalidade preferida da presente invenção, as doenças ou as condições associadas com a expressão do HER-3 são as doenças hiperproliferativas definidas acima.
De acordo com a presente invenção, o método pode, p.ex., ser usado para a detecção do antígeno HER-3 em uma célula, para a determinação da concentração do antígeno HER-3 em pacientes que sofrem de uma doença hiperproliferativa conforme mencionada acima ou para o estadiamento da dita doença hiperproliferativa em um paciente. Para o estadiamento da progressão de uma doença hiperproliferativa em um paciente sob estudo, ou para a caracterização da resposta do paciente a um curso da terapia, uma amostra de sangue pode, p.ex., ser retirada do paciente e a concentração do antígeno HER-3 presente na amostra é determinada. A concentração assim obtida é usada para identificar em qual faixa de concentrações incide o valor. A faixa assim identificada correlaciona-se com um estágio de progressão ou um estágio de terapia identificado nas diversas populações dos pacientes diagnosticados, desse modo proporcionando um estágio no paciente sob estudo. Uma biopsia do tecido com a doença, p.ex., o câncer, obtido do paciente pode também ser usada para avaliar a quantidade de antígeno HER-3 presente. A quantidade de antígeno HER-3 presente no tecido com a doença pode ser avaliada pela imuno-histoquímica, ELISA ou arranjos de anticorpos usando os anticorpos para HER3 da invenção. Os outros parâmetros de interesse diagnóstico são o estado de dimerização, bem como os pares de dimerização da proteína HER3 e o estado de ativação dela e seus pares. Os métodos analíticos com proteínas para determinar aqueles parâmetros são bastante conhecidos na técnica e são, entre outros, as técnicas de transferência westem e imunoprecipitação, as análises por FACS, a reticulação química, a transferência de energia ressonante por bioluminescência (BRET), a transferência de energia ressonante por fluorescência (FRET) e similares (p.ex., Price e col., Methods in Molecular Biology, 218: 255-268 (2002) ou a tecnologia de eTag (W00503707, W004091384, W004011900).
Além disso, a presente invenção refere-se, em um outro aspecto, a um método para prevenir ou tratar doenças ou condições associadas com a expressão do HER-3 em um paciente, compreendendo administrar a um paciente que está necessitado dele uma quantidade efetiva de pelo menos uma proteína de ligação da invenção. De preferência, as doenças ou as condições associadas com a expressão do HER-3 são as doenças hiperproliferativas definidas acima. O paciente que está necessitado de prevenção ou tratamento é um paciente mamífero, isto é, qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo os seres humanos, os animais domésticos e de fazendas, e os animais de zoológicos, esportes, ou de estimação, tais como os cães, os gatos, o gado, os cavalos, as ovelhas, os porcos, as cabras, os coelhos, etc. De preferência, o paciente que está necessitado é um paciente humano.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, o método para prevenir ou tratar uma doença hiperproliferativa em um paciente que está necessitado dele compreende administrar ao paciente uma quantidade efetiva de pelo menos uma proteína de ligação da invenção e adicionalmente pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um agente antineoplástico conforme mencionado acima. De preferência, o método é para inibir o crescimento, a migração ou a invasão anormal de células.
Além dos modos clássicos de administração das substâncias terapêuticas de proteínas de ligação potenciais, p.ex., via as formulações acima mencionadas, as modalidades de administração recentemente desenvolvidas podem também ser úteis de acordo com a presente invenção. Por exemplo, descreveu-se a administração local de anticorpo monoclonal marcado com 131I para o tratamento de tumores primários do cérebro, após a ressecção cirúrgica. Adicionalmente, a injeção intracerebral estereotática direta de anticorpos monoclonais e de seus fragmentos está também sendo estudada clínica e pré-clinicamente. A perfusão hiperosmolar intracarótida é uma estratégia experimental de alvejar a malignidade primária do cérebro com anticorpos monoclonais humanos conjugados com fármacos.
Dependendo do tipo e da gravidade da condição a ser tratada, aproximadamente 1 μg/kg a 15 mg/kg da pelo menos uma proteína de ligação da invenção podem ser administrados a um paciente que necessita dela, p.ex., por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderia variar de cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante diversos dias ou mais tempo, dependendo da condição a ser tratada, o tratamento é continuado até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. A dose do pelo menos um agente antineoplástico administrado depende de uma variedade de fatores. Estes são, por exemplo, a natureza do agente, o tipo de tumor ou a rota de administração. Deve ser enfatizado que a presente invenção não está limitada a qualquer dose.
Finalmente, a presente invenção refere-se, em um aspecto adicional, a um kit para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de doenças hiperproliferativas associadas com a transdução de sinal mediada pelo HER- 3, compreendendo a pelo menos uma proteína de ligação e/ou a molécula de ácido nucléico e/ou o vetor da invenção. Além disso, o kit da invenção pode compreender adicionalmente pelo menos um outro agente ativo, p.ex., pelo menos um outro agente antineoplástico conforme mencionado acima.
Ademais, a presente invenção será explicada pelos Exemplos a seguir e pelas figuras dos desenhos que acompanham. Exemplos
Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos conduzidos e os resultados atingidos, são proporcionados para propósitos ilustrativos somente e não são para serem interpretados como Iimitativos sobre a presente invenção.
EXEMPLO 1: preparação do antígeno HER-3 e da linhagem celular
No presente estudo, as proteínas HER-3 recombinantes foram preparadas. O cDNA do domínio extracelular de HER-3 (ECD) foi clonado por reação em cadeia por polimerase (PCR) a partir de pcDNA3-HER-3 (vetor de expressão com HER-3 humano de tamanho completo, C.WaIlasch e col., EMBO J. 14, 4267-4275) com primers baseados na seqüência de HER-3 (N2 de Acesso do Genebank NM_001982).
Os primers usados para a amplificação do HER-3 foram como a
seguir:
Primer forward: 5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3' (SEQ ID NO: 233)
Primer reverse: 5'-
GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAA
CAGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 234) O produto da PCR foi digerido com BamHI θ Xbal e ligado no pcDNA3 (Invitrogen) digerido com BamHI e Xbal. Os plasmídios foram transfectados nas células HEK293 usando um método de CaPO4. A proteína de fusão de HER-3-HIS foi purificada a partir de meio condicionado coletado, via cromatografia por afinidade de Ni-NTA.
As células Ratl HER-3 foram geradas por transferência de gene retroviral. Resumidamente, as células GP+E 86 (3x105) foram semeadas sobre um disco de cultura de 60 mm e transfectadas com 2 μg/ml de vetor pIXSN ou cDNA de plXSN-HER-3 (C. Wallasch1 Tese de PhD, Max-Planck Insitute of Biochemistry, Martinsried, Alemanha), usando o método de fosfato de cálcio. Após 24 h, o meio foi substituído por meio novo e as células GP+E 86 foram incubadas por 4-8 h. As células Ratl subconfluentes (2x105 células por placa de 6 cm) foram então incubadas com os sobrenadantes das células GP+E 86, liberando pLXSN ou pLXSN-HER-3 de alto título, vírus ρ (>1 X 106 G418 c.f.u./ml; m.o.i. de 10) por 4-12 h, na presença de Polibreno (4 mg/ml; Aldrich). Após trocar o meio, a seleção das células Ratl com G418 foi iniciada. Normalmente, os clones estáveis eram coletados após seleção por 21 dias.
EXEMPLO 2: expressão de HER-3 em linhagens de células de câncer humanas.
As tirosina cinase receptoras, como por exemplo, o HER-3, desempenham uma função crucial na iniciação e na progressão das doenças hiperproliferativas, tal como a transição de crescimento celular hiperplástico benigno para um carcinoma maligno. Visto que a expressão de HER-3 varia entre as células de tumor e o tecido normal, uma análise da expressão de HER-3 é um fator crítico para a identificação de subgrupos de pacientes que se beneficiariam do tratamento com as proteínas de ligação da invenção. Assim, a expressão de HER-3 foi quantificada em um painel de linhagens de células de câncer humanas para esclarecer a função do HER-3 na formação de câncer humano. As linhagens de células de câncer foram desenvolvidas conforme recomendado pela ATCC. Em detalhe, 105 células foram colhidas com EDTA a 10 mM em PBS, lavadas uma vez com tampão de FACS (PBS, 3 % de FCS1 0,4 % de azida) e semeadas sobre uma placa de fundo redondo de 96 poços. As células foram giradas por 3 min a 1000 rpm para remover o sobrenadante e então suspensas novamente com o anticorpo para a-HER-3 2D1D12 (W003013602) (3 μg/ml). As suspensões de células foram incubadas sobre gelo por 1 h, lavadas duas vezes com tampão de FACS e suspensas novamente com o anticorpo secundário (100 μl/poço) anti-PE humano em burro (Jackson) diluído 1:50 em tampão de FACS. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo e no escuro por 30 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e analisadas (FACS, Beckman Coulter). A Fig. 1 mostra os resultados representativos da análise e demonstra que o HER-3 é expresso em uma variedade de cânceres humanos.
EXEMPLO 3: Imunização e título
A proteína do ECD do HER-3, que foi preparada conforme descrito no Exemplo 1, e as células C32 (Melanoma humano; ATCC #CRL- 1585) foram usadas como um antígeno. Os anticorpos monoclonais contra HER-3 foram desenvolvidos imunizando seqüencialmente os camundongos XenoMouse® (cepas XenoMouse®: XMG1 e XMG4, Abgenix, Inc. Fremont, CA). Os animais XenoMouse® foram imunizados via a rota das patas para todas as injeções. O volume total de cada injeção foi 50 μΙ por camundongo, 25 μl por pata.
Para o grupo n- 1 (10 camundongos XMG1), a imunização inicial foi com 10 μg de proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) por camundongo. Os cinco reforços subseqüentes foram feitos com 10 μg da proteína do ECD do HER- 3 misturada 1:1 (v/v) com 100 μg de gel de alúmen (Sigma, Oakville, ON) em D-PBS sem pirogênio. O sexto reforço consistia em 10 μg de proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD®. A sétima injeção consistia em 10 μg de proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 v/v com 100 μg de gel de alúmen. O reforço final foi feito com 10 μg de proteína do ECD do HER-3 em DPBS sem pirogênio, sem adjuvante. Os camundongos XenoMouse® foram imunizados nos dias 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24, e 29 para este protocolo e as fusões foram efetuadas no dia 33. As duas sangrias foram feitas através do procedimento de Sangria Retrorbital no dia 13, após o quarto reforço, no dia 19, após o sexto reforço. Não havia nenhum grupo n- 2.
Para o Grupo n2 3 (10 camundongos XMG1) e o Grupo n2 4 (10 camundongos XMG4), a primeira injeção foi com 107 células C32 em PBS da Dulbecco (DPBS) sem pirogênio, misturadas 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD®, por camundongo. Os quatro reforços seguintes foram com 107 células C32 em DPBS sem pirogênio, misturadas com 25 μg de Adju-Phos e 10 μg de CpG, por camundongo. O sexto reforço foi com 107 células C32 em DPBS sem pirogênio, misturadas 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD®, por camundongo. O sétimo, o oitavo, o nono reforços foram com 107 células C32 em DPBS sem pirogênio, misturadas com 25 μg de Adju-Phos e 10 μg de CpG, por camundongo. Do décimo até o décimo quarto reforço foram 5 μg de proteína do ECD do HER-3 em DPBS sem pirogênio, misturados com 25 μg de Adju-Phos e 10 μ9 de CpG, por camundongo. Um reforço final consistia em 5 μg de proteína do ECD do HER-3 em DPBS sem pirogênio, sem adjuvante. Ambos os Grupos n2 3 e n2 4, os camundongos XenoMouse® foram imunizados nos dias 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21, 24, 28, 33, 35, 38, 42 e 45 para este protocolo e as fusões foram efetuadas no dia 49. As três sangrias foram feitas através do procedimento de Sangria Retrorbital no dia 12, após o quarto reforço, no dia 19, após o sexto reforço, e no dia 40, após o décimo segundo reforço. Seleção dos animais para a coleta por título
Para o grupo n2 1, os títulos de anticorpo anti-HER-3 no soro a partir dos camundongos XenoMouse® imunizados foram determinados por ELISA contra a proteína do ECD do HER-3. O título específico de cada animal XenoMouse® foi determinado a partir da densidade óptica a 650 nm e é mostrado na Tabela 1 abaixo. O valor do título é a recíproca da maior diluição dos soros com uma leitura da DO duas vezes aquela da base. Portanto, quanto maior o número, maior foi a resposta imune humoral ao ECD do HER-3. TABELA 1
Grupo N°1. XMG1
<table>table see original document page 44</column></row><table>
Para os grupos n2 3 e n2 4, os títulos de anticorpo antÍ-HER-3 no soro a partir dos camundongos XenoMouse® imunizados foram determinados por FACS1 usando as células Rat1/HER-3 (linhagem celular positiva para antígeno) e as células Rat1/pl_SXN (linhagem celular negativa para antígeno). Os dados são apresentados como a intensidade fluorescente por média geométrica (MédiaGeo) da coloração celular do anti-HER-3 em célula por diluições em série das amostras de soro. TABELA 2
Grupo N° 3. XMG1
<table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table>
TABELA 3
Grupo N° 4, XMG4
<table>table see original document page 46</column></row><table> <table>table see original document page 47</column></row><table>
EXEMPLO 4: Recuperação dos linfócitos, isolamentos das Células B. fusões e geração de hibridomas
Os camundongos imunizados foram sacrificados e os linfonodos foram coletados e reunidos a partir de cada grupo. As células linfóides foram dissociadas por moagem em DMEM, para liberar as células dos tecidos, e as células foram suspensas em DMEM. As células foram contadas, e 0,9 ml de DMEM por 100 milhões de linfócitos foi adicionado ao precipitado celular para suspender novamente as células, de modo suave, porém completa- mente. Usando 100 μΙ de glóbulos magnéticos CD90+ por 100 milhões de células, as células foram marcadas por incubação das células com os glóbulos magnéticos a 4 9C, por 15 min. A suspensão celular marcada magneticamente contendo até 108 células positivas (ou até 2x109 células totais) foi carregada para uma coluna LS+ e a coluna lavada com DMEM. O efluente total foi coletado como a fração negativa para CD90 (a maior parte destas células era esperada ser células B).
A fusão foi efetuada misturando-se as células B enriquecidas, lavadas, do acima mencionado, e as células de mieloma não secretórias P3X63Ag8.653, adquiridas da ATCC (N- do Cat. CRL 1580) (Kearney e col., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550), em uma razão de 1:1. A mistura celular foi suavemente precipitada por centrifugação a 800 g. Após a remoção completa do sobrenadante, as células foram tratadas com 2 a 4 ml de solução de pronase (CalBiochem. Ns do Cat. 53702; 0,5 mg/ml em PBS) por não mais do que 2 min. Então, 3 a 5 ml de FBS foram adicionados para interromper a atividade da enzima e a suspensão foi ajustada para um volume total de 40 ml, usando solução de eletro fusão celular, ECFS (sacarose a 0,3 M, Sigma, N2 do Cat. S7903, acetato de magnésio a 0,1 mM, Sigma, N2 do Cat. M2545, acetato de cálcio a 0,1 mM, Sigma, N2 do Cat. C4705). O sobrenadante foi removido após centrifugação e as células foram suspensas novamente em 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavagem foi repetida e as células de novo foram suspensas em ECFS até uma concentração de 2x106 células/ml.
A eletro fusão celular foi efetuada usando um gerador de fusão, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. A dimensão da câmara de fusão usada foi 2,0 ml, usando os seguintes ajustes de instrumento: Condição de alinhamento: voltagem: 50 V, tempo: 50 s; rompimento de membrana em: voltagem: 3000 V, tempo: 30 με; tempo de retenção após a fusão: 3 s.
Após a ECF, as suspensões celulares foram cuidadosamente removidas da câmara de fusão, sob condições estéreis, e transferidas para um tubo estéril contendo o mesmo volume de Meio de Cultura de Hibridoma (DMEM (JRH Biosciences), 15 % de FBS (Hyclone), suplementado com L- glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos da Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). As células foram incubadas por 15 a 30 min, a 37 sC, e então centrifugadas a 400 g, por cinco min. As células foram suavemente suspensas novamente em um pequeno volume de Meio de Seleção de Hibridoma (Meio de Cultura de Hibridoma suplementado com 0,5x de HA (Sigma, N2 do Cat. A9666)), e o volume foi ajustado apropriadamente com mais Meio de Seleção de Hibridoma, com base em uma preparação final de 5x106 células totais por placa de 96 poços e 200 μΙ por poço. As células foram suavemente misturadas e pipetadas para as placas de 96 poços e deixadas desenvolverem-se. No dia 7 ou 10, metade do meio foi removido, e as células foram realimentadas com Meio de Seleção de Hibridoma.
EXEMPLO 5: Seleção de anticorpos candidatos por ELISA
Após 14 dias de cultura, a triagem primária dos sobrenadantes de hibridomas a partir do grupo n2 1 (os camundongos no grupo um foram divididos arbitrariamente em fusão n2 1 e n2 2) quanto aos anticorpos específicos para HER-3 foi efetuada por ELISA, usando ECD do HER-3 marcado com his, purificado, e exame por contador contra uma proteína marcada com his irrelevante, por ELISA, usando anti-hulgGFc-HRP em cabra (Caltag Inc., N2 do Cat. H10507, a concentração de uso foi uma diluição de 1:2000), para detectar a ligação da IgG humana ao ECD do HER- 3 imobilizado sobre as placas de ELISA. Os sobrenadantes da cultura antiga, a partir dos poços de crescimento das células de hibridomas positivas, com base na triagem primária, foram removidos e as células de hibridomas positivas para HER-3 foram suspensas com meio de cultura de hibridoma novo e foram transferidas para placas de 24 poços. Após 2 dias na cultura, estes sobrenadantes estavam prontos para uma triagem de confirmação secundária. Na triagem de confirmação secundária quanto aos anticorpos de IgGk inteiramente humanos, específicos para HER-3, os positivos na primeira triagem foram examinados por ELISA com dois grupos de anticorpos investigadores: anti-hulgGFc-HRP em cabra (Caltag Inc., N° do Cat. H10507, a concentração de uso foi uma diluição de 1:2000), para a detecção da cadeia gama humana, e anti-hlg capa-HRP em cabra (Southern Biotechnology, N° do Cat. 2060-05), para a detecção da cadeia leve capa humana. Havia 91 anticorpos monoclonais específicos para IgG/capa HER-3 inteiramente humanos que foram gerados a partir do grupo n°1.
EXEMPLO 6: Seleção de anticorpos candidatos por FMAT/FACS
Após 14 dias de cultura, os sobrenadantes de hibridomas dos grupos n° 3 e n° 4 (fusões n° 3 e n2 4) foram examinados quanto aos anticorpos monoclonais específicos para HER-3 por FMAT. Na triagem primária, os sobrenadantes de hibridomas em diluição final de 1:10 foram incubados com as células Rat1-Her3 expressando o HER-3 humano e 400 ng/ml de anticorpo F(ab')2 anti-lgG humana específico para Fc, em Cabra conjugado a Cy5 (Jackson ImmunoResearch, N° do Cat. 109-176-098), na temperatura ambiente, por 6 h. A ligação do complexo de anticorpos e anticorpos de detecção às células foi medida por FMAT (Applied Biosystems). A ligação não específica dos anticorpos às células foi determinada por sua ligação às células Ratl parentais. Um total de 420 hibridomas produzindo anticorpos específicos para HER-3 foi selecionado a partir da triagem primária da fusão n° 3. Os sobrenadantes destas culturas expandidas foram testados novamente usando o mesmo protocolo de FMAT e 262 deles foram confirmados ligarem-se a células que expressam o HER-3 especificamente. Um total de 193 hibridomas produzindo anticorpos específicos para HER-3 foi selecionado a partir da triagem primária da fusão n° 4. Os sobrenadantes destas culturas expandidas foram testados por FACS e 138 deles foram confirmados ligarem-se a células que expressam o HER-3 especificamente. No ensaio de confirmação por FACS, as células Rat1-Xher3 e as células Rat1 parentais (como controle negativo) foram incubadas com os sobrena- dantes de hibridomas em diluição de 1:2, por 1 h, a 40C, em PBS contendo 2 % de FBS. Após a lavagem com PBS1 a ligação dos anticorpos às células foi detectada por 2,5 μg/m! de anticorpo F(ab')2 anti-lgG humana específico para Fc, em Cabra conjugado a Cy5 (JlR n- 109-176-098) e 5 μg/ml de anticorpo F(ab')2 anti-humano específico para capa em Cabra conjugado a PE (SB n- 2063-09). Após a remoção dos anticorpos não ligados por lavagem com PBS, as células foram fixadas por cytofix (BD η- 51-2090KZ) em diluição de 1:4 e analisadas por FACSCalibur.
EXEMPLO 7: Seleção de hibridomas para a clonagem
Os anticorpos dos grupos 1 e 2 foram selecionados para a clonagem de hibridomas com base na especificidade por HER-3 sobre HER1 (EGFR), HER-2 e HER-4, em ELISA, usando domínios extracelulares recombinantes purificados, disponíveis, por exemplo, de R&D Biosystems, e análise à base de FACS das linhagens de células de tumores humanas que expressam diferentes membros da família do HER, e um aumento > 5 vezes na intensidade fluorescente média na coloração de FACS para as células positivas para HER-3 sobre a base. Com base nestes critérios, um total de linhagens de hibridomas foi selecionado para a clonagem por preparação em placas de células de diluição limitativa.
Os anticorpos dos grupos 3 e 4 foram selecionados para a clonagem de hibridomas com base na especificidade por HER-3 sobre HER- 1(EGFR), HER-2 e HER-4, mais três outros critérios. O primeiro critério foi uma triagem por ELISA quanto aos anticorpos com os epítopos contidos dentro do domínio L2 de HER-3 (ver o Exemplo "Análise Estrutural dos
Anticorpos Anti-HER-3", na invenção).
O segundo critério foi a neutralização da ligação da heregulina- alfa biotinilada às células que expressam o HER-3, em um ensaio à base de FACS. As células SKBR-3 foram coletadas, lavadas em meio de cultura, precipitadas via centrifugação e suspensas novamente em meio de cultura.
As células suspensas novamente foram divididas em alíquotas para as placas de 96 poços. As placas foram centrifugadas para precipitar as células. Os anticorpos de teste nos sobrenadantes de hibridomas de esgotamento foram adicionados a 25 μL/poço e incubados por 1 h sobre gelo, para permitir a ligação dos anticorpos. Cinqüenta μl de uma solução de heregulina-alfa a 10 nM (R&D Biosystems1 Minneapolis, MN) foram adicionados a cada poço para uma concentração final de 5 nM e incubados sobre gelo por 1,5 h. As células foram lavadas em 150 μl de PBS, precipitadas por centrifugação e o sobrenadante removido. As células foram suspensas novamente em 50 μl de anticorpo policlonal anti-HRG-alfa em cabra, a 10 μg/ml, e incubadas por 45 min sobre gelo. As células foram lavadas em 200 μl de PBS, precipitadas por centrifugação e o sobrenadante removido. Cinqüenta μl de uma solução de anticorpo policlonal anti-cabra marcado com Cy5 em coelho, a 5 μg/ml, mais 7AAD, a 10 μg/ml, foram adicionados e incubados sobre gelo por 15 min. As células foram lavadas em 200 μl de PBS, precipitadas por centrifugação e o sobrenadante removido. As células foram suspensas novamente em 100 μl de tampão de FACS e lidas no FACS. Os anticorpos para HER-3 de teste que reduziram a ligação da heregulina-alfa foram aqueles que tiveram a menor intensidade de fluorescência. Como controles positivos, usaram-se diluições em série de 1:5 a partir de 10.000 ng/ml até 16 ng/ml de um mAb para HER-3 de camundongo (105.5) ou do mAb para HER-3 de IgGI humana, U1-49. Os controles negativos eram heregulina-alfa sozinha, as células sozinhas, o anticorpo policlonal anti-heregulina-alfa em cabra sozinho e o anticorpo policlonal anti-cabra marcado com Cy5 em coelho sozinho.
O terceiro critério foi a classificação relativa quanto à afinidade e/ou a maior intensidade de fluorescência média relativa em FACS usando linhagens celulares que expressam o HER-3. A classificação relativa quanto à afinidade foi efetuada por normalização das concentrações de anticorpos específicos para HER-3 e representação contra dados a partir de ELISA com antígeno limitado, como se segue.
Normalização das concentrações de anticorpos específicos para os antígenos usando ELISA com alto teor de antígeno
Usando um método ELISA, os sobrenadantes para a concen- tração de anticorpo específico para antígeno foram normalizados. Usando dois anticorpos de IgGI humana anti-HER-3 a partir do grupo 1, de concentração conhecida, titulados em paralelo, gerou-se uma curva padrão e comparou-se a quantidade de anticorpo específico para antígeno nos sobrenadantes de hibridomas de teste a partir dos grupos 3 e 4 ao padrão. Neste modo, estimou-se a concentração de anticorpo de IgG para HER3 em cada cultura de hibridoma.
As placas de neutravidina foram preparadas revestindo a neutravidina a 8 μg/ml em 1XPBS/0,05% de azida sódica sobre placas de ligação de meio Costar 3368, a 50 ul/poço, com incubação durante a noite, a 4°C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com 1XPBS/1% de leite desnatado. O ECD do HER-3 marcado com his fotobiotinilado, a 500 ng/ml, em 1XPBS/1 % de leite desnatado, foi ligado às placas de neutravidina por incubação por 1 hora, na temperatura ambiente. O sobrenadante de hibridomas, diluído em série a 1:2,5 a partir de uma diluição de partida de 1:31 até uma diluição final de 1:7568, em 1 XPBS/1 % de leite desnatado/0,05% de azida, foi adicionado a 50 μΙ/poço, e então incubado por 20 horas na temperatura ambiente. As diluições em série foram usadas para assegurar a obtenção de leituras de DO para cada incógnita na faixa linear do ensaio. A seguir, um anticorpo de detecção secundário, o anti Fc HRP de IgG humana em cabra, a 400 ng/ml, em 1 XPBS/1 % de leite desnatado, foi adicionado a 50 ul/poço. Após 1 hora na temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com água e 50 μΙ_ de substrato TMB de um componente foram adicionados a cada poço. A reação foi interrompida, após minutos, pela adição de 50 μΙ de ácido clorídrico a 1M a cada poço e as placas foram lidas em comprimento de ondas de 450 nm. Uma curva padrão foi gerada a partir dos dois mAbs para HER-3 de IgGI do grupo 1, diluídos em série a 1:2 a partir de 1000 ng/ml até 0,06 ng/ml e avaliados em ELISA usando o protocolo acima descrito. Para cada incógnita, as leituras de DO na faixa linear do ensaio foram usadas para estimar a concentração de IgG para HER-3 humano em cada amostra.
A análise por antígeno limitado é um método que classifica por afinidade os anticorpos específicos para antígenos preparados em sobrenadantes de culturas de células B em relação a todos os outros anticorpos específicos para antígenos. Na presença de uma cobertura muito baixa de antígeno, somente os anticorpos de maior afinidade devem ser capazes de ligarem-se até qualquer nível detectável, no equilíbrio. (Ver, p.ex., a Publicação PCT WO/03048730A2, intitulada "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING", publicada em 12 de junho de 2003). Neste caso, dois mAbs do grupo 1, ambos de concentração conhecida e KD conhecido, foram usados como referências no ensaio.
As placas de neutravidina foram preparadas revestindo a neutravidina a 8 μg/ml em "IXPBS/0,05% de azida sódica sobre placas de ligação de meio Costar 3368, a 50 ul/poço, com incubação durante a noite, a 4- C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com 1XPBS/1% de leite desnatado. O ECD do HER-3 marcado com his fotobiotinilado (50 μΙ/poço) foi ligado às placas de neutravidina de 96 poços em cinco concentrações: 125, 62,5, 31,2, 15,6, e 7,8 ng/ml em 1XPBS/1% de leite desnatado, por 1 hora, na temperatura ambiente. Cada placa foi lavada 5 vezes com água. os sobrenadantes de hibridomas diluídos a 1:31 em 1XPBS/1% de leite desnatado/0,05% de azida, foram adicionados a 50 ul/poço. Após 20 horas de incubação, na temperatura ambiente, sobre um agitador, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com dH20. A seguir, um anticorpo de detecção secundário, o anti Fc HRP (Peroxidase da Raiz Forte) de IgG humana em cabra, a 400 ng/ml, em 1XPBS/1% de leite desnatado, foi adicionado a 50 μl/poço. Após 1 hora na temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com dH20 e 50 μΙ_ de substrato TMB de um componente foram adicionados a cada poço. A reação foi interrompida, após 30 minutos, pela adição de 50 μΙ_ de ácido clorídrico a 1M a cada poço e as placas foram lidas em comprimento de ondas de 450 nm. As leituras de DO a partir de uma concentração de antígeno que produziu valores de DO na faixa linear foram usadas na análise dos dados.
A representação dos dados de alto teor de antígeno, que estima comparativamente a concentração de anticorpo específica (ver acima quanto aos detalhes), versus a DO do antígeno limitado ilustrou os anticorpos de afinidades relativamente maiores, p.ex., aqueles que ligaram tinham DO maior no ensaio de antígeno limitado, ao mesmo tempo tendo quantidades menores de anticorpo para HER-3 de IgG no sobrenadante.
Os hibridomas dos grupos 3 e 4 para os 33 anticorpos de melhor atuação nestes grupos de ensaios foram promovidos para a clonagem por preparação em placas de hibridomas de diluição limitativa.
Alternativamente, a análise por FACS da expressão do HER-3 das células RatI/pLXSN e RatI/HER-3 mostrou resultados similares (nenhuma reatividade cruzada com os epítopos de ratos endógenos) (Fig. 2).
Em detalhe, 1x105 células foram coletadas com EDTA a 10 mM em PBS, lavadas uma vez com tampão de FACS (PBS, 3 % de FCS, 0,4 % de azida) e semeadas sobre uma placa de fundo redondo de 96 poços. As células foram giradas por 3 min a 1000 rpm para remover o sobrenadante e então suspensas novamente com os anticorpos para a família do HER específicos (3 μg/ml). As suspensões de células foram incubadas sobre gelo por 45 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e suspensas novamente com o anticorpo secundário (100 μΙ/poço) anti-PE humano em burro (Jackson Immunoresearch, PA) diluído 1:50 em tampão de FACS. As suspensões de çélulas foram incubadas sobre gelo e no escuro por 30 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e analisadas (FACS, Beckman Coulter).
EXEMPLO 8: Análise estrutural dos anticorpos anti-HER-3 da invenção
Na discussão a seguir, proporciona-se uma informação estrutu- ral relacionada aos anticorpos preparados de acordo com a invenção. Para analisar as estruturas dos anticorpos produzidos de acordo com a presente invenção, os genes que codificam os fragmentos de cadeias pesadas e leves foram amplificados do hibridoma particular. O seqüenciamento foi efetuado como se segue:
Os transcritos de VH e VL foram amplificados a partir dos clones de hibridomas individuais em placa de 96 poços, usando transcritase reversa reação em cadeia por polimerase (RT-PCR). O poli(A)+-mRNA foi isolado de aproximadamente 2x10^5 células de hibridomas usando o kit Fast-Track (Invitrogen). Quatro reações de PCR foram efetuadas para cada hibridoma: duas para a cadeia leve (capa (κ)), e duas para a cadeia pesada gama (γ). O kit de PCR na temperatura ambiente de Uma Etapa da QIAGEN foi usado para a amplificação (Qiagen, N° do Catálogo 210212). Nas reações de PCR na temperatura ambiente acopladas, os cDNAs foram sintetizados com mistura de enzimas na temperatura ambiente (Omniscript e Sensiscript) usando primer específico para seqüência sem sentido correspondido à C-k, ou a um consenso das regiões CH1 dos genes de Cy. A transcrição reversa foi efetuada a 50°C por 1h, seguida por amplificação por PCR do cDNA pela DNA Polimerase HotStarTaq para alta especificidade e sensibilidade. Cada reação de PCR usou uma mistura de primers com sentido em 5'; as seqüências de primers foram baseadas nas seqüências líderes de VH e VK disponíveis no endereço de página eletrônica da rede de Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
As reações de PCR foram efetuadas a 94°C por 15 min, início a quente inicial seguido 40 ciclos de 94°C por 30 s (desnaturação), 60°C por 30 s (anelamento) e 72°C por 1 min (alongamento).
Os produtos da PCR foram purificados e seqüenciados diretamente usando os primers forward e reverse da PCR1 usando o Kit de reação pronta por seqüenciamento de ciclo terminador ABI PRISM BigDye (Perkin Elmer). Ambas as fitas foram seqüenciadas usando os kits de seqüenciamento de terminador de corante Prims e uma máquina de seqüenciamento ABI 377.
Análise da Seqüência
As análises das seqüências de cDNA de pesada V e capa V humano dos anticorpos para HER3 foram efetuadas alinhando as seqüên- cias do HER-3 com as seqüências de pesada V e capa V da linha germi- nativa humana usando o software doméstico Abgenix (5AS). O software identificou o uso do gene V, do gene D e do gene J, bem como as inserções de nucleotídeos nas junções de recombinação e mutações somáticas. As seqüências de aminoácidos foram também geradas em silico para identificar as mutações somáticas. Puderam ser obtidos resultados similares com o software de análise de seqüência comercialmente disponível e a informação publicamente disponível sobre a seqüência dos genes V, D, e J humanos, p.ex., Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Clonagem molecular do mAb U1-59
O RNA total foi extraído do poço de cultura de tecido contendo múltiplas linhagens de hibridomas, incluindo a linhagem de hibridoma que secreta o anticorpo U1-59. Uma região variável da cadeia pesada foi amplificada usando os primers específicos para a família de VH líder em 5', com o primers 3'-C-gama. Uma banda principal foi amplificada usando um primer de VH4, nenhuma outra banda estava visível. O fragmento de VH4-34 gama foi clonado no vetor de expressão de pCDNA em quadro com um gene da região constante gama 1 humano.
Uma região variável da cadeia pesada de IgM foi amplificada usando primers específicos para a família de VH em 5' com o primer da região constante mu em 3'. Uma banda principal foi amplificada usando o primer de VH2, nenhuma outra banda estava visível. O fragmento de mu de VH2-5 foi clonado no vetor de expressão de pCDNA em quadro com um gene da região constante mu humano. As cadeias capa V foram ampli- ficadas e seqüenciadas. Quatro produtos de RT-PCR de cadeias capa foram identificados. Os produtos foram seqüenciados e, após a análise de seqüên- cia via tradução em silico, somente três deles tinham quadros de leitura abertos. Estas três cadeias capa funcionais foram clonadas do poço de hibridoma U1-59 oligoclonal, identificadas com base no uso do gene de capa V como (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 e (3) B3-JK1. Todas as capa V foram clonadas no vetor de expressão de pCDNA em quadro com um gene da região constante da cadeia leve capa humano. Transfeccões:
Cada cadeia pesada foi transfectada com cada uma das cadeias capa em transfecções transientes para um total de 6 pares de cadeias pesadas/cadeias leves capa. A transfecção da cadeia gama com a cadeia capa de A20 deu uma expressão do anticorpo insatisfatória, enquanto que nenhum anticorpo foi secretado ou detectado quando a cadeia capa de A20 foi co-transfectada com a cadeia mu. Um total de três sups de IgF e dois sups de IgM estava disponível para o ensaio de ligação ao HER-3.
<table>table see original document page 58</column></row><table>
A atividade dé ligação às linhagens celulares HER-3+ foi detectada em FACS com o mAb de IgGI consistindo na VH4-34 e na cadeia capa de B3. Nenhuma outra combinação de VH/Vk deu sinal de fluorescência acima da base em FACS usando as linhagens celulares HER- 3+.
Competição pela ligação dos anticorpos anti-HER-3
A ligação competitiva diversificada do anticorpo foi efetuada conforme publicada em Jia e col. J Immunol Methods. 288, 91-98 (2004), para avaliar os grupos de anticorpos para HER-3 que competiam pela ligação ao HER-3. Os anticorpos para HER-3 testados a partir do grupo 1 agruparam-se em 5 locais com base na competição pela ligação.
<table>table see original document page 58</column></row><table> Caracterização dos epítopos dos anticorpos anti-HER-3
Os epítopos dos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção foram caracterizados. Primeiramente, uma análise por transferência de ponto ("dot blot") da proteína de ECD purificada, marcada com HER-3-His, desnaturada, reduzida, mostrou ausência de ligação pelos anticorpos anti- HER-3 testados (U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44, U1-47, U1-52, U1-40, U1-49), demonstrando que todos tinham epítopos sensíveis à redução das ligações de dissulfeto, sugerindo que todos tinham epítopos descontínuos. A seguir, os anticorpos foram mapeados para definir os domínios na molécula de HER-3 por engenharia de diversas moléculas quiméricas de HER-3 de seres humanos-ratos, com base na divisão do domínio extracelular do HER-3 em quatro domínios:
1) L1 (D1): o domínio de ligação ao Iigante secundário,
2) S1 (D2): o primeiro domínio rico em cisteína,
3) L2 (D3): o domínio de ligação ao Iigante principal, e
4) S2 (D4): o domínio rico em cisteína sec.
O domínio extracelular (ECD) do cDNA do HER-3 Humano foi amplificado a partir das células RAT1-HER-3. O cDNA do HER-3 de rato foi amplificado por RT-PCR a partir do RNA do fígado do rato e confirmado por seqüenciamento. Os cDNAs que expressam o ECD do Her3 humano e de rato foram clonados em vetores de expressão de mamíferos como proteínas de fusão de V5-His. Os domínios a partir do ECD do HER-3 humano foram trocados no andaime proporcionado pelo ECD do HER-3 do rato por utilização dos sítios de restrição internos Mfe 1, BstXI e Dralll. Por este meio, diversas proteínas de fusão quiméricas de ECD do HER-3 HIS de ratos/humanas (aminoácidos 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) foram construídas e expressas via transfecção transiente de células HEK 293T. A expressão das construções foi confirmada usando um anticorpo policlonal de rato contra o HER-3 humano. Os anticorpos monoclonais humanos foram testados em ELISA quanto à ligação aos ECDs quiméricos secretados.
Dois dos anticorpos humanos, incluindo o anticorpo U1-59, reagiram cruzado com o HER-3 do rato. Para determinar os domínios de ligação, estes mAbs foram testados contra uma forma truncada do HER-3 consistindo em proteína marcada com L1-S1-V5his, purificada a partir do sobrenadante de células HEK 293T transfectadas com um DNA de plasmídio que codifica a expressão dos domínios extracelulares L1-S1 do HER3. O mAb U1-59 ligou-se à proteína de L1-S1 em ELISA, indicando que o seu epítopo está em L1-S1. O mAb 2.5.1 não se ligou à proteína de L1-S1, indicando que o seu epítopo está em L2-S2. O mapeamento adicional do anticorpo U1-59 foi efetuado usando espectroscopia de massa com SELDI e por tempo de vôo com os digestos proteolíticos sobre chips dos complexos de mAb-ECD do HER-3.
Mapeamento dos epítopos de U1-59 usando SELDI
O mapeamento adicional do anticorpo U1-59 foi efetuado usando a espectroscopia de massa com SELDI e por tempo de vôo com os digestos proteolíticos sobre chips dos complexos de mAb-ECD do HER-3. A proteína A foi ligada covalentemente a uma arranjo de chip de proteína PS20 e usada para capturar o mAb U1-59. Então, o complexo do chip de proteína PS20 e o anticorpo monoclonal foi incubado com antígeno purificado HER-3- His. A seguir, o complexo de anticorpo-antígeno foi digerido com alta concentração de Asp-N. O chip foi lavado, resultando na retenção de somente o peptídeo HER-3 ligado ao anticorpo sobre o chip. O epítopo foi determinado por SELDI e identificado por massa do fragmento. O fragmento 6814 D identificado corresponde a dois peptídeos esperados possíveis, gerados a partir de um digesto parcial de ECD de HER-3-his. Ambos os peptídeos de sobreposição mapeiam para o domínio S1. Por união dos resultados de SELDI com a ligação a uma construção de remoção de HER-3, o epítopo foi mapeado para os resíduos 251 a 325.
A localização dos domínios de ligação na parte extracelular do HER-3 que são reconhecidos pelos mAbs anti-HER-3 humanos da invenção é resumida na Tabela 4. Os resultados do mapeamento dos domínios dos epítopos estavam consistentes com os resultados dos locais de competição pela ligação dos anticorpos, com os anticorpos que competiam cruzado um com outro pela ligação ao HER-3 também mapeando para os mesmos domínios sobre HER-3 (Fig. 3).
TABELA 4
Um resumo do domínio de ligação dos mAb's com base nos resultados do ensaio ELISA
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XR = reativo cruzado
EXEMPLO 9: Determinação das classes canônicas dos anticorpos
Chothia e col. descreveram a estrutura do anticorpo em termos de "classes canônicas" para as regiões hipervariáveis de cada cadeia de imunoglobulina (J. Mol Biol., 20 de agosto de 1987, 196(4):901-17). As estruturas atômicas dos fragmentos Fab e de VL de uma variedade de imunoglobulinas foram analisadas, para determinar a relação entre as suas seqüências de aminoácidos e as estruturas tridimensionais de seus sítios de ligação a antígenos. Chothia e col. verificaram que existiam relativamente poucos resíduos que, através de seu acondicionamento, ligação de hidro- gênio ou da capacidade de assumir conformações incomuns fi, psi ou ômega, eram principalmente responsáveis pelas conformações das cadeias principais das regiões hipervariáveis. Estes resíduos foram verificados ocorrer em sítios dentro das regiões hipervariáveis e na estrutura de folha β conservada. Pelo exame das seqüências de imunoglobulinas tendo estrutura desconhecida, Chothia e col. mostram que muitas imunoglobulinas têm regiões hipervariáveis que são similares no tamanho a uma das estruturas conhecidas e adicionalmente continham resíduos idênticos nos sítios responsáveis pela conformação observada.
Esta descoberta implicou que estas regiões hipervariáveis têm conformações semelhantes àquelas nas estruturas conhecidas. Para cinco das regiões hipervariáveis, o repertório de conformações parecia estar limitado a um número relativamente pequeno de classes estruturais distintas. Estas conformações de cadeias principais que ocorrem comumente das regiões hipervariáveis foram chamadas "estruturas canônicas". Um trabalho adicional de Chothia e col. (Nature, 21-28 de dez. de 1.989, 342 (6252):877- 83) e de outros (Martin, e col. J. Mol. Biol., 15 de nov. de 1996, 263(5):800- 15) confirmou que há um pequeno repertório de conformações de cadeias principais para pelo menos cinco das seis regiões hipervariáveis dos anticorpos.
As CDRs de cada anticorpo descrito acima foram analisadas para determinar a sua classe canônica. Conforme é sabido, as classes canônicas somente foram determinadas para a CDR1 e a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo, juntamente com a CDR1, a CDR2 e a CDR3 da cadeia leve do anticorpo. As tabelas abaixo resumem os resultados da análise. O dado de classe canônica está na forma de HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2- LCDR3, onde "HCDR" refere-se à CDR da cadeia pesada e "LCDR" refere-se à CDR da cadeia leve. Assim, por exemplo, uma classe canônica de 1-3-2-1-5 refere-se a um anticorpo que tem uma HCDR1 que incide na classe canônica 1, uma HCDR2 que incide na classe canônica 3, uma LCDR1 que incide na classe canônica 2, uma LCDR2 que incide na classe canônica 1, e uma LCDR3 que incide na classe canônica 5.
As determinações foram feitas para uma classe canônica particular, onde havia 70 % ou mais de identidade dos aminoácidos no anticorpo, com os aminoácidos definidos para cada classe canônica. Os aminoácidos definidos para cada anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, nos artigos de Chothia e col. referidos acima. A Tabela 5 e a Tabela 6 descrevem os dados da classe canônica para cada um dos anticorpos para HER-3. Onde houver menos do que 70 % de identidade, a determinação da classe canônica é marcada com um asterisco ("*") para indicar que foi feita a melhor estimativa da classe canônica adequada, com base no comprimento de cada CDR e na totalidade dos dados. Onde não houver nenhuma classe canônica correspondente com o mesmo comprimento da CDR, a determinação da classe canônica é marcada com uma letra s e um número, tal como "s18", significando que a CDR é de tamanho 18. Onde não houver nenhum dado de seqüência disponível para uma das cadeias pesada ou leve, a classe canônica é marcada com "Z".
TABELA 5
<table>table see original document page 63</column></row><table> <table>table see original document page 64</column></row><table>
A Tabela 7 é uma análise do número de anticorpos por classe. O número de anticorpos tendo a classe canônica particular designada na coluna da esquerda é mostrado na coluna da direita. Os quatro mAbs não tendo o dado de seqüência para uma cadeia e, assim, tendo "Z" na determinação canônica não estão incluídos nesta contagem.
A estrutura mais comumente vista é 3-1-2-1-1: Vinte e um dos quarenta e um mAbs tendo as seqüências de cadeias tanto pesadas quanto leves tinham esta combinação.
TABELA 6
<table>table see original document page 64</column></row><table> <formula>formula see original document page 65</formula>
EXEMPLO 10: Determinação da afinidade do anticorpo
As medições das afinidades dos anticorpos anti-HER-3 da invenção foram efetuadas por análise indireta de FACS Scatchard. Portanto, 105 células de interesse ou células SK-Br 3 foram coletadas com EDTA a 10 mM em PBS, lavadas uma vez com tampão de FACS (PBS, 3 % de FCS1 0,4 % de azida) e semeadas sobre uma placa de fundo redondo de 96 poços. As células foram giradas por 3 min a 1000 rpm para remover o sobrenadante e então suspensas novamente com o anticorpo para a-HER-3 (3 μς/ιηΙ) ou com as diluições de anticorpos (100 μΙ/poço), começando com 20 μς/ηιΙ de anticorpo monoclonal humano em tampão de FACS, diluído em etapas de diluição de 1:2. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo por 1 h, lavadas duas vezes com tampão de FACS e suspensas novamente com o anticorpo secundário (100 μΙ/poço) anti-PE humano em burro (Jackson) diluído 1:50 em tampão de FACS. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo e no escuro por 30 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e analisadas (FACS, Beckman Coulter). De acordo com a análise de FACS Scatchard, a média da fluorescência foi calculada para cada medição. A coloração de base (= sem o anticorpo principal) foi subtraída de cada média da fluorescência. Gerou-se o gráfico de Scatchard com o valor de x = média da fluorescência e o valor de y = média da fluorescência/concentração de mAb (nM). A KD foi representada como o valor absoluto de 1/m da equação linear. A Fig. 4 mostra uma análise cinética usando o anticorpo U1-59 da invenção. Na tabela 8 a seguir, proporcionam-se as medições das afinidades para certos anticorpos da invenção selecionados neste modo. TABELA 7
<table>table see original document page 66</column></row><table>
EXEMPLO 11: Os anticorpos anti-HER-3 da invenção induzem a endocitose do receptor HER-3
O HER-3 foi identificado como um fator que pode influenciar o início e a progressão das doenças hiperproliferativas através da atuação como um guardião importante da sinalização celular mediada pela família do HER. Assim, se o HER-3 for depurado efetivamente da superfície/membrana da célula por internalização do receptor, a sinalização da célula e, portanto, a transformação e/ou a manutenção das células na malignidade podem ser diminuídas ou suprimidas no final.
Para investigar se os anticorpos anti-HER-3 da invenção são capazes de induzir a endocitose acelerada do HER-3, comparou-se a quan- tidade relativa de moléculas de HER-3 sobre a superfície celular, após incu- bação por 0,5 e 4 h das células, com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. 3x10^5 células foram semeadas em meio de crescimento normal, em placa de 24 poços, e deixadas desenvolver durante a noite. As células foram pré- incubadas com 10 μg/ml de mAbs anti-HER-3 em meio de crescimento nor- mal pelos tempos indicados, a 37°C. As células foram removidas com EDTA a 10 mM e incubadas com 10 μg/ml de mAbs anti-HER em tampão de lava- gem (PBS, 3 % de FCS1 0,04 % de azida), por 45 min, a 4°C. As células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem, incubadas com anticor- po secundário anti-PE em burro (Jackson) diluído a 1:100, por 45 min, a 4°C, lavadas duas vezes com tampão de lavagem e analisadas por FACS (Beck- manCoulter, EXPO).
Os dados mostrados na Fig. 5 demonstram que o tratamento das células com os anticorpos anti-HER-3 resulta na internalização do recep- tor. Os dados são mostrados como % de internalização e referem-se à redu- ção da intensidade de fluorescência média de amostras tratadas com anti- HER3 em relação a amostras tratadas com controle.
EXEMPLO 12: Inibicão da ligação do ligante às células de câncer humanas SKBr3 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos daJnvencão
Os experimentos de competição com os radioligantes foram efe- tuados para quantificar a capacidade dos anticorpos anti-HER-3 da invenção de inibir a ligação do ligante ao HER-3, em um ensaio a base de células. Portanto, o ensaio de ligação ao receptor HER-3 foi efetuado com 4x10^5 cé- lulas SK-BR-3, que foram incubadas com concentrações variadas de anti- corpos, por 30 min, sobre gelo. As [I^125]-a-HRG/[125I]-p-HRG foram adicionadas a cada poço e a incubação foi continuada por 2 h, sobre gelo. As placas foram lavadas cinco vezes, secadas ao ar e contadas em um contador de cintilação. As Figs. 6a-e mostram os resultados destes experimentos efetuados com os anticorpos anti-HER-3 representativos da invenção e demonstram que os anticorpos da invenção são capazes de reduzir especificamente a ligação de [125I]-a-HRG/[125I]^-HRG às células que expressam o HER-3 endógeno. EXEMPLO 13: Inibicão da fosforilacão de HER-3 induzida por Iiaante pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
Os experimentos de ELISA foram efetuados para investigar se os anticorpos da invenção são capazes de bloquear a ativação do HER-3 mediada pelo ligante β-HRG. A ativação do HER-3 mediada pelo Iigante foi detectada pela fosforilação aumentada da tirosina receptora.
Dia 1: 1 χ a placa de 96 poços foi revestida com 20 μg/ml de Co- lágeno I em ácido acético a 0,1 M por 4 h, a 37 gC. 2,5x105 células foram semeadas em meio de crescimento normal.
Dia 2: As células foram subalimentadas em 100 μΙ de meio sem soro por 24 h.
Dia 3: As células foram pré-incubadas com 10 μg/ml de mAbs anti-HER-3 por 1 h, a 37 eC, e então tratadas com 30 ng/ml de β-HRG- domínio do EGF (R&D Systems), por 10 min. O meio foi removido e as célu- las foram fixadas com solução a 4 % de formaldeído em PBS1 por 1 h, na temperatura ambiente. A solução de formaldeído foi removida e as células foram lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,1 % de Tween 20). As célu- las foram finalizadas com 1 % de H2O2, 0,1 % de NaN3 em tampão de lava- gem e incubadas por 20 min, na temperatura ambiente, então bloqueadas com NET-GELANTINE por 5 h,,a 4 °C. O anticorpo primário fosfo-HER-3 (Tyr1289) (coelho policlonal; Cell signaling n- 4791; 1:300) foi adicionado, durante a noite, a 4 °C.
Dia 4: A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem, então in- cubada com anti-POD de coelho diluído a 1:3000 em PBS - 0,5 % de BSA foi adicionado a cada poço e incubado por 1,5 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem e uma vez com PBS. A tetrame- tilbenzidina (TMB, Calbiochem) foi adicionada e monitorada a 650 nm. A re- ação foi interrompida por adição de 100 μl de HCl a 250 nMea absorbância foi lida a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 650 nm, usando uma leitora de placa Vmax (Thermo Lab Systems).
A Fig. 7a mostra os resultados representativos deste experimen- to, demonstrando que os anticorpos anti-HER-3 da invenção foram capazes de reduzir a ativação do HER-3 mediada pelo ligante, conforme indicado pe- la fosforilação da tirosina receptora diminuída. Os dados são mostrados co- mo porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle.
Para testar a potência do mAb U1-53 em inibir a ativação do HER-3 induzida pelo ligante, as células MCF-7 foram subalimentadas por 24 h, incubadas com o mAb U1-53 por 1 h, a 37 2C1 e estimuladas com HRG-β a 10 nM por 10 min. Os Iisados foram transferidos para as placas de ELISA de 1B4 (mAb anti-HER-3 de camundongo) e a fosforilação do HER-3 foi ana- lisada com o anticorpo 4G10. Conforme mostrado na Fig. 7b, a fosforilação do HER-3 foi quase completamente inibida, em um modo dependente da dose, com uma IC50 de 0,14 nM.
EXEMPLO 14: Inibição da fosforilação de MAP-Cinase p42/p44 induzida por ligante pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
A seguir, os experimentos de ELISA foram efetuados para inves- tigar se os anticorpos da invenção são capazes de bloquear a ativação de MAP-Cinase p42/p44 mediada pelo ligante β-HRG. A ativação do HER-3 mediada pelo ligante foi detectada pela fosforilação aumentada de proteínas (Thr202/Tyr204).
Dja,1: 1 x a placa de 96 poços foi revestida com 20 μg/ml de Co- lágeno I em ácido acético a 0,1 M por 4 h, a 37 QC. 3x105 células foram se- meadas em meio de crescimento normal.
Dia 2: As células foram subalimentadas em 100 μΙ de meio sem soro por 24 h.
Dia 3: As células foram pré-incubadas com 5 μg/ml de mAbs an- ti-HER-3 por 1 h, a 37 QC, e então tratadas com 20 ng/ml de β-HRG-domínio do EGF (R&D Systems), por 10 min. O meio foi removido e as células foram fixadas com solução a 4 % de formaldeído em PBS1 por 1 h, na temperatura ambiente. A solução de formaldeído foi removida e as células foram lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,1 % de Tween 20). As células foram finali- zadas com 1 % de H2O2, 0,1 % de NaN3 em tampão de lavagem e incuba- das por 20 min, na temperatura ambiente, então bloqueadas com PBS/0,5 % de BSA por 5 h, a 4 QC. O anticorpo primário fosfo-MAP Cinase p44/p42 (T- hr202/Tyr204) (coelho policlonal; Cell signaling n2 9101; 1:300) foi adiciona- do, durante a noite, a 4 QC.
Dia 4: A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem, então in- cubada com anti-HRP de coelho diluído a 1:5000 em PBS - 0,5 % de BSA foi adicionado a cada poço e incubado por 1,5 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem e uma vez com PBS. A tetrame- tilbenzidina (TMB, Calbiochem) foi adicionada e monitorada a 650 nm. A re- ação foi interrompida por adição de 100 μΙ de HCI a 250 nMea absorbância foi lida a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 650 nm, usando uma leitora de placa Vmax (Thermo Lab Systems).
A Fig. 8 mostra os resultados representativos deste experimento. Os anticorpos da invenção foram capazes de reduzir a ativação de MAP- Cinase p42/p44 mediada pelo ligante, conforme indicado pela fosforilação diminuída. Os dados são mostrados como a porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle. EXEMPLO 15: Inibicão da fosforilação de fosfo-AKT induzida pela B-HRG pelos anticorpos antí-HER-3 humanos da invenção
No experimento de ELISA a seguir nós investigamos se os anti- corpos anti-HER-3 da invenção são capazes de bloquear a ativação da AKT^„iíi= Cinase mediada pela β-HRG. A ativação da AKT mediada pelo ligante foi detectada pela fosforilação da proteína (Ser473) aumentada.
Dia 1: 1 χ a placa de 96 poços foi revestida com 20 μg/ml de Co- lágeno I em ácido acético a 0,1 M por 4 h, a 37 -C. 3x105 células foram se- meadas em meio de crescimento normal.
Dia 2: As células foram subalimentadas em 100 μΙ de meio sem soro por 24 h.
Dia 3: As células foram pré-incubadas com 5 μg/ml de mAbs an- ti-HER-3 por 1 h, a 37 QC, e então tratadas com 20 ng/ml de β-HRG-domínio do EGF (R&D Systems), por 10 min. O meio foi removido e as células foram fixadas com solução a 4 % de formaldeído em PBS, por 1 h, na temperatura ambiente. A solução de formaldeído foi removida e as células foram lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,1 % de Tween 20). As células foram finali- zadas com 1 % de H2O2, 0,1 % de NaN3 em tampão de lavagem e incuba- das por 20 min, na temperatura ambiente, então bloqueadas com PBS/0,5 % de BSA por 5 h, a 4 QC. O anticorpo primário fosfo-Akt (Ser473) (coelho poli- clonal; Cell signaling n3 9217; 1:1000) foi adicionado, durante a noite, a 4 9C.
Dia 4: A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem, então in- cubada com anti-HRP de coelho diluído a 1:5000 em PBS - 0,5 % de BSA foi adicionado a cada poço e incubado por 1,5 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem e uma vez com PBS. A tetrame- tilbenzidina (TMB, Calbiochem) foi adicionada e monitorada a 650 nm. A re- ação foi interrompida por adição de 100 μl de HCI a 250 nM e a absorbância foi lida a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 650 nm, usando uma leitora de placa Vmax (Thermo Lab Systems).
A Fig. 9 mostra os resultados representativos deste experimento. Os anticorpos anti-HER-3 da invenção foram capazes de reduzir a ativação de AKT mediada pela β-HRG ligante, conforme indicado pela fosforilação diminuída. Os dados são mostrados como a porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle. EXEMPLO 16: Inibicão da proliferação mediada por g-HRG/3-HRG das célu- las MCF7 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção...
Foram conduzidos experimentos in vitro para determinar a capa- cidade dos anticorpos da invenção de inibir a proliferação de células estimu- lada pela HRG. 2000 células MCF7 foram semeadas em meio contendo FCS, sobre placas de 96 poços, durante a noite. As células foram pré- incubadas em quadruplicata com anticorpo diluído em meio com 0,5 % de FCS, por 1 h, a 37 sC. As células foram estimuladas com 30 ng/ml de a-HRG ou 20 ng/ml de β-HRG (R&D Systems) por adição do ligante diretamente à solução de anticorpo e foram deixadas desenvolver por 72 h. O AlamarBlue® (BIOSOURCE) foi adicionado e incubado a 37 5C, no escuro. A absorbância foi medida a 590 nm a cada 30 min. Os dados foram coletados 90 min após a adição do alamar blue. Os resultados, conforme indicados na Fig. 10, mos- tram que os anticorpos representativos da invenção inibem o crescimento celular induzido pela HRG nas células de câncer humanas. Os dados são mostrados como a porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle.
EXEMPLO 17: Inibicão da migração das células MCF7 induzida pela β-HRG pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
Os experimentos dé transmigração foram efetuados para inves- tigar se os anticorpos da invenção bloqueiam a migração celular. As células MCF7 subalimentadas de soro foram pré-incubadas por adição da quantida- de indicada de anticorpo à suspensão celular e incubação de ambos por 45 min, a 37 °C. 500 μl de suspensão celular (50.000 células) foram então colo- cados na câmara de topo de transpoços revestidos com colágeno I (BD Fal- con, poros de 8 μm). 750 μl de meio (MEM, aminoácidos, piruvato de Na1 Pen.-Estrep., 0,1 % de BSA1 sem soro bezerro fetal) sozinho ou contendo os Iigantes β-HRG-domínio do EGF (R&D Systems) foram usados na câmara de fundo. As células foram deixadas migrar por 8 h, a 37 °C, e foram colori- das com DAPI.
Os núcleos coloridos foram contados manualmente; a porcenta- gem de inibição foi expressa como a inibição em relação a um anticorpo de controle.
A Fig. 11 mostra o resultadado experimento demonstrando que os anticorpos anti-HER-3 representativos da invenção reduzem a migração celular induzida pela HRG.
EXEMPLO 18: Ensaio de formação de colônias (ensaio em ágar mole)
Os ensaios em ágar mole foram conduzidos para investigar a capacidade dos anticorpos anti-HER-3 da invenção de inibir o crescimento celular independente de ancoragem. O ensaio de formação de colônias em ágar mole é um ensaio in vitro padrão para testar para células transformadas, visto que somente tais células transformadas podem crescer em ágar mole.
750 a 2000 células (dependendo da linhagem celular) foram pré- incubadas com os anticorpos indicados, a 10 μg/ml, em meio IMDM (Gibco), por 30 min, e suspensas novamente em 0,4 % de ágar nobre da Difco. A suspensão celular foi preparada sobre 0,75 % de agarose contendo 20 % de FCS, em quadruplicata, em uma placa de 96 poços. As colônias foram dei- xadas se formarem por 14 dias e foram então coloridas com 50 μΙ de MTT (0,5 mg/ml em PBS), durante a noite. As Figs. 12a-i mostram os resultados destes experimentos efetuados com três anticorpos representativos da in- venção. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-HER-3 da in- venção reduzem o crescimento celular independente de ancoragem das cé- lulas de câncer de mama MDA-MB361 e NCI-ADR (Fig. 12a,b), das células de câncer gástrico MKN-28 (Fig. 12c), de melanoma HT144 (Fig. 12d), das células de carcinoma do ovário Skov3 (Fig. 12e), das células de câncer da próstata PPC-1 (Fig. 12f), das células de câncer do pâncreas BX-PC3 (Fig. 12g), das células de carcinoma epidermóides A431 (Fig. 12h) e das células de carcinoma do pulmão (Fig. 12i). As colônias foram contadas com um sis- tema de câmera Scanalyzer HTS (Lemnatec/Wuerselen). EXEMPLO 19: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento de carcinoma de mama humano em camundonqos nus
A eficácia antitumor dos anticorpos terapêuticos é freqüentemen- te avaliada em estudos de tumores de xenoenxertos humanos. Nestes estu- dos, os tumores crescem como xenoenxertos em camundongos imunocom- prometidos e a eficácia terapêutica é medida pelo grau de inibição do cres- cimento do tumor. Pa^a determinar se os anticorpos anti-HER-3 da invenção interferem com o crescimento de tumor de células de câncer de mama hu- manas em camundongos nus, 5x106 células T47D foram implantadas em camundongos nus/nus NMRI fêmeos. Os tumores eram subcutâneos, de- senvolvidos sobre o dorso do animal. Os tratamentos começaram quando os tumores atingiram um volume médio de 20 mm3; oito dias após a implanta- ção. Antes do primeiro tratamento, os camundongos foram aleatorizados e os testes estatísticos efetuados para assegurar a uniformidade nos volumes de tumores de partida (média, desvio médio e padrão) através dos grupos de tratamento. O tratamento começou com uma dose de carga de 50 mg/kg, seguida por injeções de 25 mg/kg uma vez por semana por injeção intraperi- toneal. Um braço de controle recebeu a doxorrubicina (grau farmacêutico). Todos os animais foram suplementados com 0,5 mg/kg/semana de estrogê- nio injetado i.p.
Os detalhes dos grupos de tratamento são dados abaixo.
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* tratamento com doxorrubina conforme descrito por Boven e col., Câncer Research, 1992.
Os dados para o volume médio do tumor (Fig. 13) demonstraram que a administração de um anticorpo anti-HER-3 da invenção resultou na redução do crescimento do tumor.
EXEMPLO 20: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento de tumor pancreático humano em camundongos SCID
Para testar o potencial terapêutico dos anticorpos anti-HER3 em outros tipos de tumores sólidos, os anticorpos anti-HER-3, UT-53 e U1-59, foram testados em camundongos com tumores estabelecidos, derivados da linhagem de células de tumores pancreáticos humanos BxPC3. Como con- troles, incluíram-se os grupos de camundongos tratados com o controle veí- culo, a PBS, ou o anticorpo terapêutico estabelecido, Erbitux. 5x106 células BxPC3 foram inoculadas subcutaneamente sem Matrigel em camundongos CB17 SCID. Os camundongos contendo os tumores estabelecidos, com um volume médio de 140 mm2, receberam 50 mg/kg de U1-53, U1-59, Erbitux ou o volume equivalente de PBS, via injeção intraperitoneal. Após isso, os camundongos receberam injeções de 25 mg/kg uma vez por semana, pela duração do estudo.
Os resultados para este experimento são mostrados na Fig. 14. O U1-53 e o U1-59 reduziram o crescimento dos tumores pancreáticos hu- manos em um modo citostático. Notavelmente, neste experimento, o U1-53 e o U1-59 eram mais efetivos do que o anticorpo que objetiva o EGFR, Erbi- tux, no retardo do crescimento do tumor. Estes dados demonstraram a eficá- cia terapêutica dos anticorpos anti-HER-3 da invenção em comparação com um agente terapêutico de referência.
EXEMPLO 21: A combinação dos anticorpos anti-HER-3 humanos com os anticorpos anti-EGFR aumenta a atividade antitumor
A monoterapia das doenças hiperproliferativas com os anticor- pos alvejados é freqüentemente dificultada por problemas tais como, por um lado, o desenvolvimento de resistência a fármacos, e por outro lado, uma alteração na antigenicidade. Por exemplo, a perda de antigenicidade após tratamento prolongado pode tornar as células de tumor insensíveis aos anti- corpos terapêuticos, visto que estas células de tumor que não expressam ou perderam o antígeno alvejado têm uma vantagem de crescimento seletivo. Estes problemas poderiam ser evitados por utilização dos anticorpos da in- venção em combinação com um anticorpo terapêutico que alveje um recep- tor diferente sobre as células de tumor, ou um outro agente antineoplástico. A intervenção nas múltiplas vias de sinalização ou mesmo nas vias relacio- nadas, porém em etapas de intervenção múltiplas, poderia também propor- cionar benefício terapêutico. Estas modalidades de tratamento combinadas são prováveis de serem mais eficazes, porque elas combinam dois agentes anticâncer, cada um operando via um mecanismo de ação diferente.
Para demonstrar a viabilidade dos anticorpos anti-HER-3, da in- venção, U1-53 e U1-59, como agentes de combinação adequados, nós comparamos as administrações monoterapêuticas de U1-53 ou U1-59 com aquelas nas quais o U1-53 ou o U1-59 foi combinado com o anticorpo espe- cífico anti-EGR, Erbitux. 5x10® células BxPC3 foram inoculadas subcutane- amente com Matrigel em camundongos CB17 SCID. Após os volumes dos tumores terem atingido 200 mm3, os camundongos foram aleatorizados em grupos de tratamento individuais. Efetuaram-se administrações intraperito- neais semanais de U1-53, U1-59 e Erbitux, como agentes individuais ou combinações de quaisquer dos dois anticorpos anti-HER3 com o Erbitux ou como um coquetel de dois anticorpos anti HER-3. Todos os anticorpos foram dosados em doses de cargas individuais de 50 mg/kg/semana, seguidas por injeções semanais de 25 mg/kg por seis semanas. Os braços de controle receberam administrações bi-semanais de Gencitabina (120 mg/kg), inje- ções de IgG humana reunida semanalmente ou de veículo semanalmente (PBS). Os regimes são detalhados abaixo.
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Os resultados para este experimento são mostrados na Fig. 15. Os anticorpos U1-53 e U1-59, quando administrados como agentes individu- ais, retardaram o crescimento dos tumores pancreáticos humanos até a mesma proporção que a Gencitabina, que é freqüentemente usada como uma quimioterapia anticâncer pancreático padrão. A co-administração de Erbitux com U1-53 e U1-59 resultou em uma redução significativamente maior do crescimento do tumor do que observado com a administração de quaisquer agentes individuais de U1-53, U1-59 ou Erbitux. Assim, uma res- posta terapêutica benéfica pode ser obtida por combinação dos anticorpos anti-HER-3 da invenção com anticorpos adequados que alvejam antígenos de tumores separados.
Em resumo, os anticorpos anti-HER-3 da invenção têm eficácia terapêutica potente contra os tumores humanos in vivo. Eles podem ser efe- tivamente combinados com outras substâncias terapêuticas antineoplásticas para a atividade antitumor aumentada. EXEMPLO 22: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento de tumores de melanoma humanos em camundongos nu/nu
Os membros da família de receptores erbB, incluindo o Her3, são anormalmente expressos em uma grande variedade de cânceres epiteli- ais e eles desempenham funções importantes no crescimento e na sobrevi- vência de muitos destes tumores sólidos. Estes tumores incluem os mela- nomas, os cânceres de células escamosas da cabeça e do pescoço, os cân- ceres de pulmão de células não pequenas e os cânceres da próstata, glioma, gástricos, de mama, colorretais, pancreáticos, ovarianos. Para verificar que os anticorpos anti-Her3 da invenção não estão restritos em sua atividade anticâncer aos tipos de tumores individuais, p.ex., os cânceres pancreáticos (ver o Exemplo 21), porém podem ser usados como substâncias terapêuti- cas contra muitos tumores dependentes de HER-3, nós testamos o U1-53 e o U1-59 em estudos de xenoenxertos adicionais. Um exemplo é mostrado na Fig. 16. 5 χ 105 células de melanoma humanas, HT144, foram injetadas sub- cutaneamente em camundongos CB17 SCID, seguidas por injeção intraperi- toneal subseqüente imediata de 50 mg/kg de U1-53 e U1-59, pelo volume equivalente de PBS ou Dacarbacina (DITC) a 200 mg/kg. Após isso, os ca- mundongos receberam 25 mg/kg de U1-53 ou U1-59 uma vez por semana, enquanto a DITC era dada uma vez a cada duas semanas, a 200 mg/kg.
Os volumes dos tumores médios a partir de cada grupo de tra- tamento são mostrados na Figura 16. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos melanomas humanos, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com o controle veículo. Estes resultados demonstram que os anticorpos da invenção não estão restritos em seu potencial terapêutico e alvejam uma ampla variedade de cânceres que expressam o HER-3.
EXEMPLO 23: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento dos xenoenxertos de carcinoma do cólon em camundongos
As células de carcinoma do cólon humano HT-29 foram suspen- sas em meio com razão de 2:1 de Matrigel para uma concentração final de 10 χ 106 células/ml. 0,2 ml da suspensão de células foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos nu/nu CD1, de 4-5 semanas de idade. Um total de 95 camundongos foi usado.
Os camundongos foram aleatoriamente designados para os gru- pos de controle e de tratamento. O tratamento começou no mesmo dia. A duração do tratamento foi 29 dias. Ao término do estudo, três tumores por grupo foram coletados 3 horas após a administração do tratamento. Os tu- mores foram congelados rápidos e mantidos a -80 QC,
O seguinte protocolo de tratamento foi realizado: Grupo de controle: 25 mg/kg de IgG humana não específica, du- as vezes por semana, intraperitoneal.
Grupo de tratamento: anticorpo U1-53, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento: anticorpo U1-7, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento: anticorpo U1-59, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento 5-FU: 5-fluorouracil, 50 mg/kg, 9d χ 5, in- traperitoneal
Os volumes dos tumores médios de cada grupo são mostrados na Fig. 17. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos tumores de carcinoma do cólon HT-29, quando compa- rados aos tumores que tinham sido tratados com a IgGI humana não espe- cífica.
EXEMPLO 24: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento do câncer de pulmão em camundongos
As células de câncer do pulmão de células não pequenas huma- nas Calu-3 foram suspensas em meio com razão de 1:1 de Matrigel até uma concentração final de 5 χ 106 células/ml. 0,05 ml da suspensão de células foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos CB17 scid fêmeos, de 9 se- manas de idade. Um total de 60 camundongos foi usado.
Os camundongos foram aleatoriamente selecionados para os grupos de controle e de tratamento. O tratamento começou no mesmo dia. A duração do tratamento foi 32 dias.
O seguinte protocolo de tratamento foi realizado: Grupo de veículo de PBS
Grupo de controle hG: IgG humana não específica: 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento anticorpo U1-53, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento anticorpo U1-7, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento anticorpo U1-59, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Os volumes dos tumores médios de cada grupo de controle e de tratamento são mostrados na Fig. 18. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos xenoenxertos de câncer do pulmão não pequenos, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com o controle veículo de PBS ou a IgG humana não específica. EXEMPLO 25: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento do tumor pancreático humano em camundonqos Balb/C
As células de tumores pancreáticos humanos BxPC3 foram sus- pensas em meio com uma razão a 2:1 de Matrigel até uma concentração final de 5 χ 106 células por ml. 0,2 ml da suspensão celular foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos BaIbC nu/nu fêmeos, de 5-7 semanas de idade. Um total de 100 camundongos foi usado.
Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos para grupos de controle e de tratamento. O tratamento começou no mesmo dia. A dura- ção do tratamento foi 27 dias.
O seguinte protocolo de tratamento foi realizado: Grupo de controle de hlgG: lgG2 humana não específica, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento anticorpo U1-53, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento anticorpo U1-7, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
Grupo de tratamento anticorpo U1-59, 25 mg/kg, semanalmente, intraperitoneal
Grupo de tratamento de Gemzar, gencitabina, 80 mg/kg, sema- nalmente, intraperitoneal
Os volumes dos tumores médios de cada grupo de controle e de tratamento são mostrados na Fig. 19. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos tumores pancreáticos hu- manos, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com a IgG humana não específica ou com Gemzar.
A inibição do HER-3 nos tumores pancreáticos humanos pôde também ser mostrada em um experimento farmacodinâmico. Os xenoenxer- tos de tumores BxPC3 foram desenvolvidos conforme descrito acima. 3 ca- mundongos foram tratados com 500 μg de um anticorpo de controle de IgGI e 3 camundongos foram tratados com 500 μg do anticorpo anti-HER-3 U1-59. Os camundongos foram tratados no dia 1 e no dia 4 e então sacrificados no dia 5 para medir a inibição dependente de anticorpo da fosforilação de HER- 3 (pHER-3).
Os tumores foram homogeneizados em um tampão de RIPA pa- drão com inibidores das proteases. 50 μg de Iisado claro foram separados sobre um gel de 4-20 % de Tris-glicina, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e bloqueados em 3 % de soro albumina bovina (BSA). A imuno- transferência foi efetuada usando um anticorpo anti-HER-3 (anticorpo 21D3, tecnologia de Cell Signaling). Um anticorpo anti-actina (AB a-2066, Sigma) foi usado como um controle.
A expressão foi detectada por quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As imagens foram capturadas com o Sistema de Imageamento Versadoc 5000 (BioRad, Hercules, CA).
Os resultados são mostrados na Fig. 20. Após a administração do anticorpo anti-HER-3 U1-59, a fosforilação de HER-3 não mais era detec- tável. Assim, os anticorpos da invenção são capazes de reduzir significati- vamente a ativação do HER-3 em células de tumores pancreáticos humanos. EXEMPLO 26: Uso dos anticorpos anti-HER-3 da invenção como um agente diagnóstico
O mAb anti-HER-3 pode ser usado no diagnóstico de doenças malignas. O HER-3 é expresso sobre células de tumor em um modo muito distinto comparado ao tecido normal e, portanto, uma análise da expressão do HER-3 auxiliaria no diagnóstico primário de tumores malignos, no estadi- amento e na graduação dos tumores sólidos, na avaliação de critérios prog- nósticos para doenças proliferativas e neoplasias e no controle de risco em pacientes com tumores positivos para HER-3.
A. Detecção do antígeno HER-3 em uma amostra
Um Ensaio Imunológico por Ligação com Enzima (ELISA) para a detecção do antígeno HER-3 em uma amostra é desenvolvido. No ensaio, os poços de uma placa de microtítulo, tal como uma placa de microtítulo de 96 poços ou uma placa de microtítulo de 384 poços, são adsorvidos por di- versas h com um primeiro anticorpo monoclonal inteiramente humano dirigi- do contra o antígeno HER-3. O anticorpo imobilizado serve como um anti- corpo de captura para qualquer do antígeno HER-3 que possa estar presen- te em uma amostra de teste. Os poços são enxaguados e tratados com um agente bloqueador, tal como a proteína do leite ou a albumina, para impedir a adsorção não específica do analito.
Subseqüentemente, os poços são tratados com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno HER-3, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno HER-3. Tal amostra é, por exemplo, uma amostra de soro de um paciente suspeito de ter níveis de antígeno HER-3 circulante considerados serem diagnósticos de uma patologia. Após enxaguar a amostra de teste ou o padrão, os poços são tratados com um segundo anticorpo anti-HER-3 monoclonal inteiramente humano da invenção que está marcado por conjugação com biotina. O anticorpo anti-HER-3 mar- cado serve como um anticorpo de detecção. Após enxaguar o anticorpo se- cundário em excesso, os poços são tratados com peroxidase da raiz forte (HRP) conjugada com avidina e um substrato cromogênico adequado. A concentração do antígeno HER-3 nas amostras de teste é determinada por comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras pa- drões.
B. Detecção do antíqeno HER3 na Imunoistoquímica (IHC)
Para determinar o antígeno HER3 em cortes de tecido por IHC, os tecidos incrustados em Parafina são primeiramente desparafinizados em xileno por 2x5 min e então hidratados com 100% de Etanol 2x3 min, 95% de Etanol 1 min e enxaguados em água destilada. Os epítopos antigênicos mascarados por fixação em formalina e incrustação em parafina são expos- tos por desmascaramento dos epítopos, digestão enzimática ou saponina. Para o desmascaramento dos epítopos, os cortes de parafinas são aqueci- dos em um vaporizador, banho de água ou forno de microondas por 20-40 min, em uma solução de restauração de epítopo, como por exemplo, a solu- ção de HCI a 2N (pH 1,0). No caso de uma digestão com enzima, os cortes de tecidos são incubados a 37BC por 10-30 minutos em diferentes soluções de enzimas, tais como proteinase K, tripsina, pronase, pepsina etc.
Após enxaguar a solução de restauração de epítopo ou a enzi- ma em excesso, os cortes de tecidos são tratados com um tampão bloquea- dor para impedir as interações não específicas. O anticorpo primário é incu- bado em diluições apropriadas em tampão de diluição por 1 hora, na tempe- ratura ambiente ou durante a noite. O anticorpo primário em excesso é en- xaguado e os cortes são incubados em solução de bloqueio de peroxidase por 10 min, na temperatura ambiente. Após uma outra etapa de lavagem, os cortes de tecidos são incubados com um anticorpo secundário, marcado com um grupo que poderia servir como uma âncora para uma enzima. Os exemplos, portanto, são os anticorpos secundários marcados com biotina que são reconhecidos pela peroxidase da raiz forte acoplada à estreptavidi- na. A detecção do dito complexo de anticorpo/enzima é atingida por incuba- ção com um substrato cromogênico adequado.
C. Determinação da concentração de antíqeno HER-3 no soro de pacientes
Um ELISA de sanduíche é desenvolvido para quantificar os ní- veis de HER-3 no soro humano. Os dois anticorpos anti-HER-3 monoclonais inteiramente humanos usados no ELISA de sanduíche reconheceram dife- rentes domínios sobre a molécula de HER-3 e não competem pela ligação, por exemplo, ver o Exemplo 8. O ELISA é efetuado como se segue: 50 μl de anticorpo anti-HER-3 de captura em tampão de revestimento (NaHCO3 a 0,1 M, pH 9,6), em uma concentração de 2 μg/ml, foram revestidos sobre placas de ELISA (Fisher). Após incubação a 4°C durante a noite, as placas são tratadas com 200 μl de tampão de bloqueio (0,5 % de BSA, 0,1 % de Tween 20, 0,01 % de Timerosal em PBS), por 1 h, a 25°C. As placas foram lavadas (3x) usando 0,05 % de Tween 20 em PBS (tampão de lavagem, WB). Os soros normais ou de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) são diluídos em tampão de bloqueio contendo 50 % de soro humano. As placas são incuba- das com amostras de soro durante a noite, a 4°C, lavadas com WB, e então incubadas com 100 μl/poço de anticorpo anti-HER-3 de detecção biotinilado por 1 h, a 25°C. Após a lavagem, as placas são incubadas com HRP- Estreptavidina por 15 min, lavadas como antes, e então tratadas com 100 μl/poço de o-fenilenodiamina em H2O2 (solução de desenvolvimento da Sig- ma) para a geração de cor. A reação é interrompida com 50 μl/poço de H2SO4 (2 M) e analisada usando uma leitora de placa de ELISA a 492 nm. A concentração de antígeno HER-3 nas amostras de soro é calculada por comparação com diluições de antígeno HER-3 purificado, usando um pro- grama de,adaptação de curva de quatro parâmetros.
Estadiamento do câncer em um paciente
Com base nos resultados apresentados e discutidos nos itens A, B e C, através do uso da presente invenção, é possível o estadiamento de um câncer em um paciente baseado nos níveis de expressão do antígeno HER-3. Para um dado tipo de câncer, as amostras de sangue são retiradas dos pacientes diagnosticados como estando em diversos estágios na pro- gressão da doença, e/ou em diversos pontos no tratamento terapêutico do câncer. A concentração do antígeno HER-3 presente nas amostras de san- gue é determinada usando um método que especificamente determina a quantidade do antígeno que está presente. Tal método inclui um método E- LISA, tal como o método descrito nos itens A e B. Usando uma população de amostras que proporciona resultados estatisticamente significativos para cada estágio de progressão ou terapia, designa-se uma faixa de concentra- ções do antígeno HER-3 que pode ser considerada característica de cada estágio.
Para o estadiamento da progressão do câncer em um paciente sob estudo, ou para a caracterização da resposta do paciente a um curso de terapia, uma amostra de sangue é retirada do paciente e a concentração do antígeno HER-3 presente na amostra é determinada. A concentração assim obtida é usada para identificar em qual faixa de concentrações incide o valor. A faixa assim identificada correlaciona-se com um estágio de progressão ou um estágio de terapia identificado nas diversas populações de pacientes di- agnosticados, desse modo proporcionando um estadiamento no paciente sob estudo.
EXEMPLO 27: Usos dos anticorpos anti-HER-3 e dos conjugados de anti- corpos da invenção para o tratamento ou a prevenção de doenças hiperproli- ferativas
Muitos tumores sólidos são dirigidos pela sinalização mediada pela família do HER e foi demonstrado que o HER-3 é um par crucial através de formação de complexo entre o HER-1, o HER-2 e o HER-4. Portanto, uma redução ou uma eliminação da sinalização mediada pelo HER-3 impac- taria todos os outros membros da família do HER e prejudicaria a sinalização celular, resultando em uma janela ampla de intervenções terapêuticas e po- tencial na terapia de combinação com outros agentes alvejados, substâncias biológicas e agentes citotóxicos. Assim, os anticorpos anti-HER-3 da inven- ção podem ser usados para o tratamento de certos distúrbios hiperprolifera- tivos ou associados com o HER-3, que são baseados em diversos fatores, como por exemplo, a expressão do HER-3. Os tipos de tumores, como o câncer de mama, o câncer gastrointestinal, o câncer do pâncreas, o câncer da próstata, o câncer ovariano, o câncer de estômago, o câncer endometrial, o câncer da glândula salivar, o câncer de pulmão, o câncer do rim, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer da tireóide, o câncer de bexiga, o gli- oma, o melanoma, outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, parecem apresentar indicações preferidas, porém as indicações não estão limitadas àquelas na lista precedente. Além disso, os seguintes grupos de pacientes beneficiar-se-ão do tratamento de mAb anti-HER-3 dirigido:
• Pacientes com resistência ao tratamento de mAb anti-HER-2
• Pacientes não qualificados para o tratamento com mAb anti- HER-2
• Pacientes com resistência ao mAb anti-HER-1 ou ao inibidor de anti-EGFR de pequena molécula
• Pacientes com câncer de pulmão de célula não pequena re- sistentes ao erlotinib ou gefitinib
Os anticorpos anti-HER-3 da invenção seriam usados como uma monoterapia ou em combinação com um oü mais agentes em uma assim chamada "terapia de combinação". A dita terapia de combinação pode incluir, porém não está limitada aos, agentes que foram especificados anteriormente na invenção. A terapia de combinação com os anticorpos anti-HER3 e outros agentes pode prolongar a sobrevivência do paciente, o tempo até a progres- são do tumor ou a qualidade de vida do paciente. O protocolo e o projeto de administração abordarão a eficácia terapêutica bem como a capacidade de reduzir as doses usuais das terapias padrões, como por exemplo, a quimio- terapia e a terapia de radiação.
Tratamento dos seres humanos com os anticorpos antUHER-3 da invenção
Para determinar os efeitos in vivo do tratamento com o anticorpo anti-HER-3 em pacientes humanos com tumores, tais pacientes humanos são injetados durante certa quantidade de tempo com uma quantidade efeti- va do anticorpo anti-HER-3 da invenção. Em tempos periódicos durante o tratamento, os pacientes humanos são monitorados para determinar se os seus tumores progridem, em particular, se os tumores crescem e metastati- zam.
Um paciente com tumor tratado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção tem um nível menor de crescimento e/ou metástase do tumor, comparado ao nível de crescimento e metástase do tumor em pacientes com tumor tratados com o padrão atual de substâncias terapêuticas para o cui- dado. Tratamento com os conjugados de anticorpos anti-HER-3 da invenção
Para determinar os efeitos in vivo dos conjugados de anticorpos anti-HER-3 da invenção, pacientes humanos ou animais exibindo tumores são injetados, durante certa quantidade de tempo, com uma quantidade efe- tiva do conjugado de anticorpo anti-HER-3 da invenção. Por exemplo, o con- jugado de anticorpo anti-HER-3 administrado é o conjugado de DM1- anticorpo anti-HER-3, um conjugado de auristatina-anticorpo anti-HER-3 ou o conjugado de radioisótopo-anticorpo anti-HER-3. Em tempos periódicos durante o tratamento, os pacientes humanos ou os animais são monitorados para determinar se os seus tumores progridem, em particular, se os tumores crescem e metastatizam.
Um paciente humano ou animal exibindo tumores e sofrendo tratamento com, por exemplo, os conjugados de DM1-anticorpo anti-HER-3 ou de radioisótopo-anticorpo anti-HER-3, tem um nível menor de crescimen- to e metástase do tumor, quando comparado a um paciente ou animal de controle exibindo tumores e sofrendo tratamento com uma terapia alternativa. Os DM1-anticorpos de controle que podem ser usados em animais incluem os conjugados compreendendo o DM1 ligado aos anticorpos do mesmo isó- tipo dos anticorpos anti-HER-3 da invenção, porém mais especificamente, não tendo a capacidade de ligar-sejap. antígeno HER-3 de tumor. Os radioi- sótopo-anticorpos de controle que podem ser usados em testes com animais incluem os conjugados compreendendo radioisótopo ligado a anticorpos do mesmo isótipo dos anticorpos anti-HER-3 da invenção, porém mais especifi- camente, não tendo a capacidade de ligar-se ao antígeno HER-3 de tumor. Observação: os conjugados de controle não seriam administrados aos seres humanos.
COMENTÁRIOS GERAIS
O relatório descritivo escrito precedente é considerado ser sufi- ciente para capacitar alguém versado na técnica de praticar a invenção. A presente invenção não é para ser limitada no escopo pela construção depo- sitada, visto que a modalidade depositada é pretendida como uma ilustração individual de certos objetivos da invenção e quaisquer construções que se- jam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta invenção. O depósito de material aqui não constitui uma admissão que a descrição escri- ta aqui contida é inadequada para capacitar a prática de qualquer objetivo da invenção, incluindo o seu melhor modo, não é para ser interpretado como limitando o escopo das reivindicações às ilustrações específicas que repre- senta.
A descrição e os Exemplos precedentes detalham certas moda- lidades preferidas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, entretanto, que não importa o quanto deta- lhado o precedente possa aparecer no texto, a invenção pode ser praticada em muitos modos e a invenção não deve ser interpretada de acordo com as reivindicações em anexo e quaisquer seus equivalentes.
Além disso, a não ser que de outro modo definido, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção terão os significados que são comumente entendidos por aqueles de habilidade co- mum na técnica. Ademais, a não ser que de outro modo requerido pelo con- texto, os termos singulares incluirão as pluralidades e os termos plurais in- cluirão o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e as técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, e química e hibridização de oligo- ou polinucleotídeos descritos neste documento, são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas pa- drões são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e cultura e transformação de tecido (p.ex., eletroporação, lipofecção). As rea- ções enzimáticas e as técnicas de purificação são efetuadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente efetuadas na técnica ou como descritas neste documento. As técnicas e os procedimentos prece- dentes são geralmente efetuados de acordo com métodos convencionais, bastante conhecidos na técnica, e conforme descritos em diversas referên- cias gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por todo o pre- sente relatório descritivo. Ver, p.ex., Sambrook e col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3â ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S- pring Harbor, N.Y. (2001)), que é incorporado neste documento por referên- cia. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritas neste documento são aquelas bastante conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrões são usadas para as sínteses químicas, as análises químicas, a preparação farmacêutica, a formulação, e a distribuição, e o tratamento de pacientes.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
Todas as referências citadas neste documento, incluindo as pa- tentes, os pedidos de patentes, os documentos, os livros-textos, e similares, incluindo as referências citadas neles, são, pelo presente, incorporadas nes- te documento por referência em sua totalidade. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> U 3 Pharma AG Amgen Inc.
<120> ANTICORPOS DIRIGIDOS PARA O HER-3 E SEUS USOS
<130> 33091P-W0
<140> PCT/EP2006/012632
<141> 2006-12-29
<150> US60/755103
<151> 2005-12-30
<160> 582
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 342
<212> DNA
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<223> Anticorpo
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ctggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca
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<210> <211> <212> <213> 19 321 DNA Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 19 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattcgc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcttccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg cactttactg ctgtcaacag agtaacggtt ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Cys Cys Gln Gln Ser Asn Gly Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> <211> <212> <213> 21 380 DNA Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 21 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaggag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300 agagagagag agtgggatga ttacggtgac ccccaaggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc 380
<210> 22 <211> 126 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticoirpo
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Glu Arg Glu Trp Asp Asp Tyr Gly Asp Pro Gln 100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 23 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 23
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttac attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatccatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcca a 321
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Gln 100 105
<210> 25
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 25
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctggcctg gtgactctga taccatatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatgaa 300
aactacggtg actacaacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Glu Asn Tyr Gly Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 27
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattcga agttatttaa attggtatca gcagaaaccg 120 gggaatgccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg cactttacta ctgtcaacag agtatcagtt ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Ser Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 29 <211> 374 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 29
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120
actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cactggctat 180
gcacaggtgt tccagggcag agtcaccatg acctggaaca cctccataag cacagcctac 240
atggaactga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatttggg 300
gatctcccgt atgactacag ttactacgaa tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 3 60
gtcaccgtct cctc 374
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Val Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Phe Gly Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Ser Tyr Tyr Glu Trp Phe 100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120
<210> 31
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 31
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagcca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagagacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgca gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 33
<211> 386
<212> DNA
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 33
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagatctct acgatttttg gagtggttat ccctactact acggtatgga cgtctggggc 360 caagggacca cggtcaccgt ctcctc 386
<210> 34
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr 100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 35
<211> 383
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 35
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgáagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac . 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagattact atggttcggg gagtttctac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctc 383
<210> 36
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr 100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 37
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 37
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgct gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cc.cctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vál Glu Ile Lys 100 105
<210> 39 <211> 371 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo
<400> 39
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 12 0
gccgggaagg gactggagtg gattgggcat atctatacca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaagcgatt 300
tttggagtgg gcccctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct c 371
<210> 40 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly His Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro. Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Ala Ile Phe Gly Val Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120
<210> 41
<211> 377
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 41
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggçctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 12 0
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta atattggtgg cacaaactgt 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cggtatagca gcagctggtc ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctc 377
<210> 42 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ile Gly Gly Thr Asn Cys Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 43
gatattctga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg cttagtgatg gagggaccta tttgtattgg 12 0
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat gcagcttccg 300
atcaccttcg gccaagggac acgactggaa attaaa 336
<210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 44
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Leu Ser 20 25 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95
Met Gln Leu Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 45 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 45
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gagcàccaac 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggg 300 ggggacagta actacgagga ttactactac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 3 60 accacggtca ccgtctcctc 380
<210> 46
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Dys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Asp Ser Asn Tyr Glu Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 47
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc atctatttac attggtatca gcagaaacca
gggaaagccc ctaagctctt gatctctgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagaag tctgcaacct
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacactt ccccgatcac cttcggccaa
gggacacgac tggagattaa a
<210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 49 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 49
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagcacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agattcgagt 300 tactatgata gtagtggtta ttacttatac tactacgcta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc 380
<210> 50
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Tyr 100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 51
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 51
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttcctgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatactact 300
cctctcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339
<210> 52
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys. Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ilé 100 105 110
Lys
<210> 53
<211>. 357
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 53
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt atctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300 ggtgacttcg atgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 3 57
<210> 54 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Asp Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 55
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 55
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattacc aactatttga attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatataa ctgtcaacag tgtgaaaatt tcccgatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leü Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Asn Cys Gln Gln Cys Glu Asn Phe Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 57
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtaatg gatacaagta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattattgca tgcaggctct acaaactccg 300
atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210> 58 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys. 100 105 110
<210> <211> <212> <213> 59 374 DNA Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 59 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtggtt actactggaa ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatca attacagtgg gagcaccaac 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300 cgagaactgg aactttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct CCtC 374
<210> 60
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 60
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120
<210> 61 <211> 374 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 61
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttctgagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtggtt actactggaa ctggatccgg 120
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatca attacagtgg gagcaccaac 180
tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
cgagaactgg aactttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctc 374
<210> 62 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120
<210> 63
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 63
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtaatg gatacaagta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcatgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattattgca tgcaggctct acaaactccg 300
atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210> 64 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu Met Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thir Asp Phe Thir Leu Lys I 1θ 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 65 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo
<400> 65
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcagct 300
cgccttgact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 66
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> <211> <212> <213> 67 321 DNA Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 67 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtctcc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattaac agctatttaa attggtttca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctcagctcct gatctttggt gcatccggtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtt ccccgctcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 69
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 69
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaá atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagaaacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agataagtgg 300
acctggtact tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a 351
<210> 70 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Glu Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Asp Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 71
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 71
gacatcgaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca ggtccagcca gagtgtttta tacagctcca gcaataggaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaacccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc ttctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
cctcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 33 9
<210> 72
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 72
Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Ser Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110
Lys
<210> 73
<211> 374
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 73
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt açtactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatg gggaacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctgá gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaactctgt gactgccgcg gacacggccg tatattactg tgcgagaggg 300
ggaactggaa ccaattacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctc 374
<210> 74 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln
10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Met Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Thr Gly Thr Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120
<210> 75
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 75
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gctgggccac tggcatccca 180
aacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 76
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Trp Ala Thr Gly Ile Pro Asn Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 77
<211> 377
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 77
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgt ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggatgggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcagaag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
tccgagtccg agtatagcag ctcgtcgaac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctc 377
<210> 78
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Met Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ser Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 79
<211> 377
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 79
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgt ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggatgggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atátcagaag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
tccgagtccg agtatagcag ctcgtcgaac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctc 377
<210> 80 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 80
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Met Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ser Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 81
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 81
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gaccattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgtatc tgggacagat ttcaccctca ccgtcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Val Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 83
<211> 371
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 83
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagccgaca agtccatcag taccgcctac 240
ctgcagctga gcagccatga aggcctcgga caccgccatg tattactgtg cgagacagat 300
ggctggaaac tacgtacatc acgggtgatc gagacgtcct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct c 371
<210> 84 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser His Glu Gly Leu Gly His Arg His Val Leu Leu 85 90 95
Cys Glu Thr Asp Gly Trp Lys Leu Arg Thr Ser Arg Val Ile Glu Thr 100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120
<210> 85
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <223> Anticorpo
<400> 85
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc agcatctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg cagttttggc 300
caggggacca aactggagat caaa 324
<210> 86
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 86
Glu Ile Val Leu Thr
10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ile 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 87
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
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tcctca 366
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 88
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 89 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 89
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagatacct 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatggtt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Xle Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 91
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 91
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
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tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagcg 300
gattacgatt tttggagtgg ttattttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 3 60 tcctca 366
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 93
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 93
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gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322 <210> 94 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 94
Asp Phe Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 95 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 95
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
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gattacgatt tttggaatgg ttattttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 96
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Asn Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 97
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 97
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gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 99 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 99
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc ctacacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ctggatccgc 12 0
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tcctca 366
<210> 100
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 100
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Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> <211> <212> <213> 101 321 DNA Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 101 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataataatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 102
<211> 107 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 103 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> Anticorpo
<400> 103
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tcctca 366
<210> 104 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223> Anticorpo
<400> 104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 105
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 105
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataataatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 107
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 107
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtçcctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300
gacgacggta tggacgtçtg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 108 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
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<210> 109
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 109 gatattgtga tgactcagtc tcçactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atttcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggaatgg 12 0 tacctgcaga agccagggca gtccccacag ttcatgattt atttggggtc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210> 110 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 110
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 .15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Phe Met Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 111
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 111
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ctggatccgc 120
cagtacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaggtctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagcg 300 gãttacgatt tttggagtgg ttattttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 112
<21]> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 112
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
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<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 113
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatactt acccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 115
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 115
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgg 120
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tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
ggggacgtgg atacagctat ggtcgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 116
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 116
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 .80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gly Asp Val Asp Thr Ala Met Val Asp Ala Phe Asp 100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 117
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 117
gaaattgtat tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 118
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 118
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Asn 20 25 30
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Ile Cys Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
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Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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tcctca 366
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 120
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
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caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct atgacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaggtctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
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caagggacca cggtcaccgt ctcctc 386
<210> 122 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 122
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
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<210> 123
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 123
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aattatttaa attggtatca gcagaaacca 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 124
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 .5 .10 15
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<211> 365
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 125
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 126
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 127
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cágagtcacc 60
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 128
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<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 129
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tcctca 366
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 130
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
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<210> 131 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 131
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
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tcctc 365
<210> 134
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 134
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
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<210> 135 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 135
gacatccaga tgacccagtç tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 136 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 138
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<210> <211> <212> <213> 139 321 DNA Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 139 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataataatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a -- 321 <210> 140
<211> 107 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
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tcctca 366
<210> 142 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 142
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 143
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 143
gacatccagc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgçat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaaatgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 144 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 144
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 145
<211> 365
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 145
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ctggatccgc 120
cagtacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgggctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtatttctg tgcgagagcc 300
gattacgatt tttggagtgg ttattttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
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<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 146
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
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Ser Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 148
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Tyr Pro Trp 85 90 95
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<220>
<223> Anticorpo
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tcctc 365
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 150
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 .60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120
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<223> Anticorpo <400> 151
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatggtt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
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<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 152
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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agtggtgatt actactggag ctggatccgc 120
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tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
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<223> Anticorpo
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 155
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 155
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 156
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 157
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 158
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
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Ala Arg Asp Val Gln Asp Tyr Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
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<210> 160 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo
<400> 160
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
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<220>
<223> Anticorpo <400> 162
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Leu Gln 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
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<400> 163
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gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 300
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<210> 164
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Anticorpo <400> 164
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 166 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
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Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 169
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggttatt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gaccacctac 180 tacaatccgt ccttcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
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tcctca 366
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<210> 171 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 171
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<211> 107
<212> PRT
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<220>
<223> Anticorpo <400> 172
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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<211> 365
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<220>
<223> Anticorpo <400> 173
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<212> PRT
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<220>
<223> Anticorpo
<400> 174
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120
<210> 175
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<220>
<223> Anticorpo <400> 175
atgaggtccc ctgctcagct cctggggctc ctgctactct ggctccgagg tgccagatgt 60
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gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
agattcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 300
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccccatcac cttcggccaa 360
gggacacgac tggagattaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgçtgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgcc ~ 519
<210> 176
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 176
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 177
<211> 534
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 177
accatggact ggacctggag ggtccttttc ttggtggcag cagcaacagg tgcccactcc 60 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactatggta tcagctgggt gcggcaggcc 180 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acgatggtta cagaaactat 240 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgac càctgcctac 300 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatgtt 360 caagactacg gtgactacga ctactttgac tactggggcc agggaáccct ggtcaccgtc 420 tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg tgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accg 534
<210> 178
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 178
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asp Gly Tyr Arg Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Val Gln Asp Tyr Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 179
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 179
cagctcctgg ggctcctgct actctggctc cgaggtgcca gatgtgacat ccagatgacc 60
cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 120
agtcagagca ttagcagtta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaac 180
ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa agtggggtcc catcaagatt cagtggcagt 240
ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 300
tactactgtc aacagagtta cagtaccccc atcaccttcg gccaagggac acgactggag 360
attaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420
aaatctggaa ctgcctctgt- tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480
gtacagtgga aggtggataa cgcc 504
<210> 180
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 180
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50
55
60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65
70
75
80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 85
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 90
Ser Thr Pro Ile 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100
Arg Leu Glu Ile Lys 105
<210> 181
<211> 493
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 181 :
catctgtggt tcttcctcct gctggtggca gctcccagat gggtcctgtc ccaggtgcag 60
ctgcaggagt cgggcccagg actggtgaag ccttcacaga ccctgtccct cacctgcact 120
gtctctggtg gctccatcaa cagtggtgat tactactgga gctggatccg ccagcaccca 180
gggaagggcc tggagtggat tgggtacatc tattacagtg ggagcaccta ctacaacccg 240
tccctcaaga gtcgagttac catatcagta gacacgtcta agaaccagtt ctccctgaag 300
ctgagctctg tgactgccgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgagagc agattacgat 360
ttttggagtg gttactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 420
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acaacggccc tgg 493
<210> 182
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 182
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly
20
25
30
Asp Tyr Tyr Trp Ser 35
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 183
<211> 518
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 183
atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 360
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca" "420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgc 518
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 185
<211> 436
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 185
tggttcttcc ttctgctggt ggcagctccc agatgggtcc tgtcccaggt gcagctgcag 60
gagtcgggcc caggactggt gaagccttca cagaccctgt ccctcacctg cactgtctct 12 0
ggtggctcca tcagcagtgg tggttactac tggagctgga tccgccagca cccagggaag 180
ggcctggagt ggattgggta catctattac agtgggagca cctactacaa cccgtccctc 240
aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg tctaagaacc agttctccct gaagctgagc 300
tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat tactgtgcga gagatggcta tgatagtagt 360
ggttattacc acggctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
gcctccacca agggcc 43 6
<210> 186
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 186
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Xle Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Gly Tyr Phe 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 187
<211> 521
<212> DNA
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo <400> 187
caggtcttca tttctctgtt gctctggatc tctggtgcct acggggacat cgtgatgacc 60
cagtctccag actccctggc tgtgtctctg ggcgagaggg ccaccatcaa ctgcaagtcc 120
agccagagtg ttttatacag ctccaacaat aagaactact tagcttggta ccagcaga.aa 180
ccaggacagc ctcctaagct gctcatttac tgggcatcta cccgggaatc cggggtccct 240
gaccgattca gtggcagcgg gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 3 00
gctgaagatg tggcagttta ttactgtcag caatattata gtactccgct cactttcggc 360
ggagggacca aggtggagat caaacgaact "gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg c 521
<210> 188
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 188
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110
Lys
<210> 189
<211> 455
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 189 ctgtggttct tcctcctgct ggtggcagct cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg 60 caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct tcacagaccc tgtccctcac ctgcactgtc 120 tctggtggct ccatcagtag tggtgattac tactggagct ggatccgcca gcacccaggg 180 aagggcctgg agtggattgg gtacatctat tacagtggga gcacctacta caacccgtcc 240 ctcaagagtc gagttaccat atcagtagac acgtctaaga accagttctc cctgaagttg 300 agctctgtga ctgccgcgga cacggccgtg tattactgtg cgagagccga ttacgatttt 360 tggagtggtt attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctc 455
<210> 190
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 190
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser <5ly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser* Val Asp Tlur Seir Lys Asn Gln Plie 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 191
<211> 442
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 191
gtgcccgctc agcgcctggg gctcctgctg ctctggttcc caggtgccag gtgtgacatc 60
cagatgaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 120
tgccgggcaa gtcagggcat tagaaatgat ttaggctggt atcagcagaa accagggaaa 180
gcccctaagc gcctgatcta tgctgcatcc agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc 240
agcggcagtg gatctgggac agaattcact ctcacaatca gcagcctgca gcctgaagat 300
tttgcaactt attactgtct acagcataat aattacccgt ggacgttcgg ccaagggacc 360
aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420
gagcagttga aatctggaac tg 442
<210> 192
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 192
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 193
<211> 427
<212> DNA
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo <400> 193
tggttcttcc ttctgctggt ggcagctccc agatgggtcc tgtcccaggt gcagctgcag 60 gagtcgggcc caggactggt gaagccttca cagaccctgt ccctcacctg cactgtctct 120 ggtggctcca tcagcagtgg tgattactac tggagctgga tccgccagca cccagggaag 180 ggcctggagt ggattgggta catctattac agtgggagca cctactacaa cccgtccctc 240
aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg tctaagaacc agttctccct gaagctgagc 300
tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat ttctgtgcga gagccgatta cgatttttgg 3 60
agtggttatt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420
aagggcc 427
<210> 194
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 194
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 195
<211> 518
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 195
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatactt acccgtggac gttcggccaa 360
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgc 518
<210> 196
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 196
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 197
<211> 428
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 197
tggttcttcc ttctgctggt ggcagctccc agatgggtcc tgtcccaggt gcagctgcag 60
gagtcgggcc caggactggt gaagccttca cagaccctgt ccctcacctg cactgtctct 120 ggtggctcca tcagcagtgg tgattactac tggagctgga tccgccagca cccagggaag 180
ggcctggagt ggattgggta catctattac agtgggagca cctactacaa cccgtccctc 240
aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg tctaagaacc agttctccct gaagctgagc 300
tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat ttctgtgcga gagccgatta cgatttttgg 360
aatggttatt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420
aagggccc 428
<210> 198
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 198
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1-5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Asn Gly Tyr Phe Ásp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 199
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 199
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcttccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatactt acccgtggac gttcggccaa 360
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgcc 519
<210> 200
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 200
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 201
<211> 398
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 201
ttggtggcag cagctacagg cacccacgcc caggtccagc tggtacagtc tggggctgag 60
gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg tttccggata caccctcact 120
gaattatcca tgtactgggt gcgacaggct cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt 180
tttgatcctg aagatggtga aacaatctac gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg 240
accgaggaca catctacaga cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaggac 300
acggccgtgt attactgtgc aactgggtgg aactacgtct ttgactactg gggccaggga 360
accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggccc 398
<210> 202
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 202
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Gly Trp Asn Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 203
<211> 388
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 203
ggatccagtg gggatattgt gatgactcag tctccactct ccctgcccgt cacccctgga 60
gagccggcct ccatctcctg caggtccagt cagagcctcc tgcatagtaa tggatacaac 120
tatttggatt ggtacctgca gaagccaggg cagtctccac agctcctgat ctatttggat 180
tctcatcggg cctccggggt ccctgacagg ttcagtggca gtggatcagg cacagatttt 240
acactgaaaa tcagcagagt ggaggctgag gatgttgggg tttattactg catgcaagct 300
ctacaaactc cgctcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct 360
gcaccatctg tcttcatctt cccgccat * 388
<210> 204
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 204
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu
Leu Ile Tyr Leu Asp Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 205
<211> 446
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 205
tggttcttcc ttctgctggt ggcagctccc agatgggtcc tgtcccaggt gcagctgcag 60
gagtcgggcc caggactggt gaagccttca cagaccctgt ccctcacctg cactgtctct 120
ggtggctcca tcagcagtgg tgattactac tggagctgga tccgccagca cccagggaag 180
ggcctggagt ggattgggta catctattac agtgggagca cctactacaa cccgtccctc 240
aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg tctaagaacc agttctccct gaagctgagc 300
tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat ttctgtgcga gagccgatta cgatttttgg 360
agtggttatt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420
aagggcccat cgagtcttcc ccctgg 446
<210> 206
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 206
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 207
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 207
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacaaaa ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatactt acccgtggac gttcggccaa 3 60
gggaccaagg tggaaatcag acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgcc 519
<210> 208
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 208
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Lys
65
70
Phe Thr Leu Thr Ile 75
Ser Ser Leu Gln Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85
Leu Gln His 90
Asn Thr Tyr Pro Trp 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 100
Glu Ile Arg 105
<210> 209
<211> 564
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 209
accatgaaac atctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg ggtcctgtcc 60
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 120
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ctggatccgc 180
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 240
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gàaccagttc 300
tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagcg 360
gattacgatt tttggagtgg ttattttgac tactggggcc agggaatcct ggtcaccgtc 420
tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagaacacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcctgga actcaggcgc cctg 564
<210> 210
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 210
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20
25
30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 211
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 211
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaaçca 180
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 360
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 42 0
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgcc 519
<210> 212
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 212
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 213 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Anticorpo <400> 213
tggttcttcc ttctgctggt ggcagctccc agatgggtcc tgtcccaggt gcagctgcag 60
gagtcgggcc caggactggt gaagccttca cagaccctgt ccctcacctg cactgtctct 120
ggtggctcca tcagcagtgg tgattactac tggagctgga tccgccagca cccagggaag 180
ggcctggagt ggattggata catctattac agtgggagca cctactacaa ttcgtccctc 240
aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg tctaagaacc agttctccct gaagctgagc 300
tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat tactgtgcga gagcggatta cgatttttgg 360
agtggttatt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420
aagggcccat cg 432
<210> 214 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo <400> 214
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 215
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 215
ggtgccaggt gtgacatcca gatgacccag tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga 60
gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt cagggcatta gaaatgattt aggctggtat 120
cagcagaaac ctgggaaagc ccctaagcgc ctgatctatg ctgcatccag tttgcaaagt 180
ggggtcccat caaggttcag cggcagtgga tctgggacag aattcactct cacaatcagc 240
agcctgcagc ctgaagattt tgcaacttat tactgtctac agcacaatag ttacccgtgg 300
acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc ca ~ 372
<210> 216
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 216
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50
55
60
Ser Gly Ser Gly 65
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
70
75
80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85
90
95
Thr Phe Gly Gln 100
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 105
<210> 217
<211> 548
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 217
aggttcttcc ttctgctggt ggcagctccc agatgggtcc tgtcccaggt gcagctgcag 60
gagtcgggcc caggactggt gaagccttca cagaccctgt ccctcacctg cactgtctct 120
ggtggctcca tcagcagtgg tgattactac tggagctgga tccgccagca cccagggaag 180
ggcctggagt ggattggata catctattac agtgggagca cctactacaa cccgtccctc 240
aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg tctaagaacc agttctccct gaagctgagc 300
tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat tactgtgcga gagccgatta cgatttttgg 360
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gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccct 548
<210> 218
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 218
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20
25
30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 219
<211> 517
<212> DNA
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo <400> 219
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 3 00
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 3 60
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacg 517
<210> 220
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 221
<211> 446
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 221
ctgtggttct tccttctgct ggtggcagct cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg 60
caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct tcacagaccc tgtccctcac ctgcactgtc 120
tctggtggct ccatcagcag tggtgattac tactggagct ggatccgcca gcacccaggg 180
aagggcctgg agtggattgg gtacatctat tacagtggga gcacctacta caacccgtcc 240
ctcaagagtc gagttaccat gtcagtagac acgtctaaga accagttctc cctgaagctg 300 agctctgtga ctgccgcgga cacggccgtg tattactgtg cgagagccga ttacgatttt 360 tggagtggtc actttgactg ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcttcc 420
accaagggcc ccatccgtct tccccc 446
<210> 222
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 222
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly His Phe Asp Cys Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 223
<211> 419
<212> DNA
<213> Artificial
<22 0>
<223> Anticorpo
<400> 223
atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga gatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gaatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgtctacag catcatagtt acccgtggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcc 419
<210> 224
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 224
Asp Ilé Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asp Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Glu Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 225
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 225
tggctgagct gggttttcct cgttgctctt ttaagaggtg tccagtgtca ggtgcagctg 60
gtggagtctg ggggaggcgt ggtccagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcg 120
tctggattca ccttcaatag ctatgacatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 180
ctggagtggg tggcagttat atggtatgat ggaagtaata aatactatgc agactccgtg 240
aagggccgat tcaccatctc tagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac 300
agcctgagag ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga gagaccgctt gtgtactaat 3 60
ggtgtatgct atgaagacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420
tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctç caggagcacc 480
tccgagagca cagccgccct gggc 504
<210> 226
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 226
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Leu Cys Thr Asn Gly Val Cys Tyr Glu Asp Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 227
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 227
atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctctcagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 180
gggaaagecc ctaaggtcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 240
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 3 00
gaagatgttg caacatatta ctgtcaacac tatgatactc tcccgctcac tttcggcgga 3 60
gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccát ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtgg 504
<210> 228
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 228
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Thr Leu Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 229
<211> 472
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo <400> 229
ggactgtgca agaacatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc agctcccaga
tgggtcctgt cccaggtgca gctgcaggag tcgggcccag gactggtgaa gcctttacag
accctgtccc tcacctgcac tgtctctggt ggctccatca gcagtggtga ttactactgg
agctggatcc gccagcaccc agggaagggc ctggagtgga ttgggtacat ctattacagt
gggaccacct actacaaccc gtccctcaag agtcgagtta ccatatcagt agacacgtct
aagaaccagt tcgccctgaa gctgaactct gtgactgccg cggacacggc cgtgtattac
tgtgcgagag ccgattacga tttttggagt ggttattttg actactgggg ccagggaacc
ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag ggcccatccg tcttccccct gg
<210> 230
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 230
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Leu Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ala Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 231
<211> 531
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 231
atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcaggtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 180 gggaaagccc ctcagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttctctctca caatctccag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgtggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc ttccaatcgg g 531
<210> 232
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Anticorpo
<400> 232
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40
Pro Gln Arg Leu Ile 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 233
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<220>
<221> prim_transcript <222> (1) . . (26)
<400> 233
cgggatccat gtcctagcct aggggc
<210> 234
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<22 0>
<221> prim_transcript <222> (1)..(39)
<400> 234
gctctagatt aatgatgatg atgatgatgt tgtcctaaa 39
<210> 235
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-I CDR-l-h
<400> 235
Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 236 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Ul-I CDR-2-h <400> 236
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-I CDR-3-h <400> 237
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 15 10
<210> 238
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-I CDR-1-1 <400> 238
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<210> 239
<211> 7 - --
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-I CDR-2-1
<400> 239
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
<210> 242
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Ul- 2-CDR-2h
<400> 242
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15
<210> 243
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 2-CDR-3h
<400> 243
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
244 11 PRT
Artificial <220>
<223> Ul- 2-CDR-11 <400> 244
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
<210> <211> <212> <213>
<210> 245
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 2-CDR-21
<400> 245 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
<210> 246
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 2-CDR-31
<400> 246
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<210> 247
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 3-CDR-l-h <400> 247
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
<210> 248
<211> 16
<212 > PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 3-CDR-2h
<400> 248
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 249
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 3-CDR-3h <400> 249
Asp Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 3-CDR-11 <400> 250
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15
Ala
<210> 251
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 3-CDR-21
<400> 251
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
<210> 252
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 3-CDR-31
<400> 252
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
<210> 253
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 253
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 254
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 255
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 4-CDR-3h
<400> 255
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 256
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 4-CDR-11
<400> 256
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
<210> 257
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 4-CDR-21
<400> 257
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 4-CDR-31
<400> 258
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<210> 259
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 259
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
<210> 260
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 5-CDR-2h
<400> 260
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 261 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ul- 5-CDR <400> 261
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 5-CDR-11
<400> 262
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
<210> 263
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 5-CDR-21
<400> 263
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
<210> 264
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 5-CDR-31 <400> 264
Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp Thr
<210> 265
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 265
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<210> 266
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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<400> 266
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 267
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-6-CDR-3h
<400> 267
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<210> 268
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 268
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<212> PRT
<213> Artificial <220>
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<210> 270
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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<400> 270
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<210> 271
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser 15 10
<210> 272
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 7-CDR-2h
<400> 272
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 273
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 7-CDR-3h <400> 273
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 15 10
<210> 274 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 7-CDR-11
<400> 274
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 7-CDR-21 <400> 275
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 276
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser Met Tyr 15 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<210> 279
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul- 8-CDR-3h
<400> 279
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<210> 280
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 280
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<210> 281 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Ul- 8-CDR-21 <400> 281
Leu Asp Ser His Arg Ala Ser 1 5
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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<400> 282
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<210> 283
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 284
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul - 9-CDR-3h
<400> 285
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Asn Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<223> Ul- 9-CDR-31 <400> 288
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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<400> 289
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1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 290
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<210> 291
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> ' Ul-IO-CDR-3h <400> 291
Alá Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 15 10
<210> 292
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 292
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 293
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212
Gln Ser
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<211> 12
<232> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 295
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 297
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 298
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U 1 -11-CDR-21
<400> 299
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U 1 -11-CDR-31
<400> 300
Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp Thr
<210> 301
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 301
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-12-CDR-3h
<400> 303
Ala Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 304
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-12-CDR-11
<400> 304
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 305
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-12-CDR-21
<400> 305
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Ul-12-CDR-31 <400> 306
Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Trp Thr 1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial <220>
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
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<213> Artificial
<220>
<223> U 1 -13-CDR-2h
<400> 308
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> U 1 -13-CDR-3h
<400> 309
Glu Asp Asp Gly Met Asp Val
<210> 310
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U 1 -13-CDR-11 <400> 310
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Glu 1 5 10 15
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U 1 -13-CDR-21 <400> 311
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 312 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U 1 -13-CDR-31 <400> 312
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr 1 5
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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1^ η
£é -L J. /
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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PRT
Artificial <220>
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<212> PRT
<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 396
Alá Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Ser
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gly
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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Val
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<213> Artificial
<220>
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1 5 10
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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Gly
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<213> Artificial
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<223> Ul-42-CDR-3h
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-45-CDR-Ih
<400> 496
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn
1 5 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-45-CDR-2h
<400> 497
Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp
1 5
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Phe Gln 10 15
Gly
<210> 498
<211> .16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-4 5-CDR-3h <400> 498
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-45-CDR-11
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> U1-45-CDR-31
<400> 501
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 502
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<213> Artificial
<220>
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Lys Ser
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<213> Artificial
<220>
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<211> 12
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<213> Artificial
<220>
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<400> 505
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-47-CDR-2h <400> 506
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Lys Ser
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 507
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<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Ul-47-CDR-31
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Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial <220>
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Gly
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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1 5 10 15
Val
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Leu Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr
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<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-49-CDR-31
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Met Gln Ser Met Gln Leu Pro Ile Thr
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 520
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 521
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Gly Gly Asp Ser Asn Tyr Glu Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 524
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Ile Thr 1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
<220> <223> Ul-51-CDR- 2h <400> 527
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-51-CDR-11
<400> 529
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Ala
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-51-CDR-21
<400> 530
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-51-CDR-31
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1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 532
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-52-CDR-2h
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-52-CDR-3h
<400> 534
Gly Gly Thr Gly Thr Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 535
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-52-CDR-11
<400> 535
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
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Gly Ala Ser Ser Trp Ala Thr
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-52-CDR-31
<400> 537
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ser Met Asn
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-53-CDR-3h
<400> 540
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-53-CDR-11
<400> 541
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-53-CDR-21
<400> 542
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-5 3-CDR-31
<400> 543
Gln Gln Cys Glu Asn Phe Pro Ile Thr 1 5
<210> 544
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-55.I-CDR-Ih
<400> 544
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 545
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-55.l-CDR-2h
<400> 545 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 546
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-55.l-CDR-3h <400> 546
Asp Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15
<210> 547
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul^55-CDR-11
<400> 547
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr 1 5
<210> 548
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> U1-55-CDR-21
<400> 548
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
Ser Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp 10 15
<210> 549
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-55-CDR-31
<400> 549
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr
<210> 550
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-57.1-CDR-ll <400> 550
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Asp 1 5 10 15
<210> 551
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-57 .l-CDR-21 <400> 551
Lieu lixy ser Asn /\rg Hia ser 1 5
<210> 552
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Ul-57.l-CDR-31
<400> 552
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr 1 5
<210> 553
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-57_CDR-lh
<400> 553
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-57_CDR-2h
<400> 554
Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Ul-57_CDR-3h <400> 555
Asp Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15
<210> 556
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-5 8-CDR-Ih
<400> 556
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 .10
<210> 557
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-58-CDR-2h
<400> 557
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 558
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-58-CDR-3h <400> 558
Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10
<210> 559
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-58-CDR-11
<400> 559
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asn <210> 560
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-58-CDR-21
<400> 560
Gly Ala Ser Gly Leu Gln Ser 1 5
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-58-CDR-31
<400> 561
Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 1 5
<210> 562
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-5 9-CDR-Ih
<400> 562
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 563
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-59-CDR-2h
<400> 563
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr
1 5
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 10 15
<210> 564
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-5 9-CDR-3h <400> 564
Asp Lys. Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5
<210> 565
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-5 9-CDR-11
<400> 565
Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ser Asn Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 566
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-59-CDR-21
<400> 566
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 567
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-59-CDR-31
<400> 567
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5
<210> 568
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-61.1-CDR-1h <400> 568
Gly Val Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
<210> 569 <211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-61.l-CDR-2h
<400> 569
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 570
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-61.l-CDR-3h
<4Ό0> 570
Asp Ser Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 571
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-61.I-CDR-11
<400> 571
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 572
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-61.I-CDR-21
<400> 572
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly
1 5
<210> 573
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-61.1-CDR-31
<400> 573
Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Leu Thr
1 5 <210> 574
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-61-CDR-Ih
<400> 574
Gly Val Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 10
575
16
PRT
Artificial
Ul-61-CDR-2h 575
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 576 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> U1-61-CDR-3h <400> 576
Asp Ser Glu Ser Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15
<210> <2ii> <212> <213>
<220> <223>
<400>
<210> 577
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ul-62-CDR-Ih <400> 577
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 10
<210> 578
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> U1-62-CDR-2h
<400>
578 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 579 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Ul-62-CDR-3h
<400> 579
Gln Met Ala Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10
<210> 580 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223> U1-62-CDR-11
<400> 580
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ile Tyr Leu Ala 1 5 10
<210> 581 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223> Ul-62-CDR-21
<400> 581
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 582 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223> Ul-62-CDR-31
<400> 582
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Ser 1 5

Claims (52)

1. Uma proteína de ligação isolada que se liga ao HER-3, com- preendendo: uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada que compre- ende pelo menos uma das CDR's selecionadas a partir do grupo que consis- te em (a) CDRH1's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230; (b) CDRH2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230; e (c) CDRH3 s, conforme mostra- das nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230.
2. Uma proteína de ligação isolada que se liga ao HER-3, com- preendendo: uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve que compreende pelo menos uma das CDR1S selecionadas a partir do grupo que consiste em: (d) CDRL1 's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94,98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232; (e) CDRL2 s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232; e (f) CDRL3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232.
3. A proteína de ligação isolada da reivindicação 1 ou 2, onde a dita proteína de ligação compreende: uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada que compre- ende peio menos uma das CDFVs selecionadas a partir do grupo que consis- te em (a) CDRH1 's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230; (b) CDRH2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230; e (c) CDRH3's, conforme mostra- das nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve que compreende pelo menos uma das CDR1S selecionadas a partir do grupo que consiste em: (d) CDRL1 's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232; (e) CDRL2/S, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232; e (f) CDRL3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232.
4. A proteína de ligação isolada da reivindicação 1 ou 2, onde a dita proteína de ligação compreende uma seqüência de aminoácidos da ca- deia pesada que compreende uma CDRH1, uma CDRH2, e uma CDRH3 de quaisquer das SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, ou uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve que compreende uma CDRL1, uma CDRL2, e uma CDRL3 de quaisquer das SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220,224,228e232.
5. A proteína de ligação isolada da reivindicação 3, onde a dita proteína de ligação compreende uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada que compreende uma CDRH1, uma CDRH2, e uma CDRH3 de quaisquer das SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve que compreende uma C- DRL1, uma CDRL2, e uma CDRL3 de quaisquer das SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232.
6. A proteína de ligação isolada da reivindicação 1, compreen- dendo: uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230.
7. A proteína de ligação isolada da reivindicação 2 compreen- dendo: uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148,152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232.
8. A proteína de ligação isolada da reivindicação 1, compreen- dendo: uma seqüência de aminoácidos da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230; e uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232.
9. A proteína de ligação isolada da reivindicação 1, compreen- dendo uma CDRH3 de quaisquer das SEQ ID NOs: -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, -80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, -142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, -202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230.
10. A proteína de ligação isolada da reivindicação 9, compreen- dendo uma seqüência de aminoácidos da cadeia leve de quaisquer das SEQ IDNOs: -4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, -94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, -160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, -220, 224, 228 e 232.
11. A proteína de ligação isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 compreendendo a seqüência de aminoácidos da ca- deia pesada de SEQ ID N0:42 e a seqüência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NO:44.
12. A proteína de ligação isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 compreendendo a seqüência de aminoácidos da ca- deia pesada de SEQ ID NO:54 e a seqüência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NO:56.
13. A proteína de ligação isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 compreendendo a seqüência de aminoácidos da ca- deia pesada de SEQ ID N0:70 e a seqüência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NO:72.
14. Uma proteína de ligação isolada que se liga a uma estrutura tridimensional formada pelos resíduos de aminoácidos 1-160; 161-358; 359-575; 1-358; 359-604 do HER-3 maduro, particularmente do HER-3 maduro humano.
15. A proteína de ligação isolada de quaisquer das reivindica- ções 1-14, onde a proteína de ligação é dirigida contra o domínio extracelu- lar de HER-3.
16. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-15, onde a ligação da proteína de ligação ao HER-3 reduz a trans- dução de sinal mediada pelo HER-3.
17. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-15, onde a ligação da proteína de ligação ao HER-3 reduz a fosfo- rilação do HER-3.
18. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-15, onde a ligação da proteína de ligação ao HER-3 reduz a proii- feração celular.
19. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-15, onde a ligação da proteína de ligação ao HER-3 reduz a migra- ção celular.
20. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-15, onde a ligação da proteína de ligação ao HER-3 aumenta a infra-regulação do HER-3.
21. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1 -20, a qual é um anticorpo.
22. A proteína de ligação isolada da reivindicação 21, onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticor- po quimérico, um anticorpo muItiespecífico, ou um seu fragmento de anticor- po.
23. A proteína de ligação isolada da reivindicação 22, onde o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, um fragmento Fab', um frag- mento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia individual.
24. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-23, onde a dita proteína de ligação isolada é do tipo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4.
25. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-24, onde a proteína de ligação é acoplada a um grupo de marca- ção.
26. A proteína de ligação isolada da reivindicação 25, onde o grupo de marcação é um radioisótopo ou radionuclídeo, um grupo fluores- cente, um grupo enzimático, um grupo quimioluminescente, um grupo de biotinila, ou um epítopo de polipeptídeo predeterminado.
27. A proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindi- cações 1-24, onde a proteína de ligação é acoplada a um grupo efetor.
28. A proteína de ligação isolada da reivindicação 27, onde o grupo efetor é um radioisótopo ou radionuclídeo, uma toxina, ou um grupo terapêutico ou quimioterapêutico.
29. A proteína de ligação isolada da reivindicação 28, onde o grupo terapêutico ou quimioterapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em caliqueamicina, auristatina-PE, geldanamicina, maitansina e seus derivados.
30. Uma molécula de ácido nucléico isolada codificando uma proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações 1-29.
31. A molécula de ácido nucléico isolada da reivindicação 30, onde a molécula de ácido nucléico é operavelmente ligada a uma seqüência de controle.
32. Um vetor compreendendo a molécula de7ácido nucléico da reivindicação 30.
33. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucléico da reivindicação 31.
34. Uma célula hospedeira transformada com o vetor da reivindi- cação 32.
35. Uma célula hospedeira transformada com o vetor da reivindi- cação 33.
36. Um processo para preparar a proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindicações 1-29, compreendendo a etapa de isolar a dita proteína de ligação de uma célula hospedeira.
37. O processo da reivindicação 36, onde a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de planta, uma célula fúngica, ou uma célula procariótica.
38. Uma composição farmacêutica compreendendo como um agente ativo pelo menos uma proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindicações 1-29, e um veículo, diluente ou adjuvante farmaceutica- mente aceitável.
39. A composição da reivindicação 37 ou 38 para uso terapêutico.
40. A composição da reivindicação 37 ou 38 para uso diagnóstico.
41. Um método para tratar ou prevenir uma doença associada com o HER-3 em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma composição farmacêutica da reivindica- ção 38 ou 39 a um paciente que necessita dela.
42. O método da reivindicação 41, onde a doença é uma doença hiperproliferativa.
43. O método da reivindicação 42, onde a dita doença hiperproli- ferativa é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer gastrointestinal, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer ova- riano, câncer do estômago, câncer endometrial, câncer da glândula salivar, câncer do pulmão, câncer do rim, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da tireóide, câncer da bexiga, glioma, melanoma, câncer do testículo, sar- coma de tecido mole, câncer da cabeça.e do pescoço, outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, e formação de metástases do tu- mor.
44. O método da reivindicação 42 ou 43, onde a dita doença hi- perproliferativa está associada com a fosforilação do HER-3 aumentada, a heterodimerização de HER-2/HER-3 aumentada ou uma atividade aumenta- da de Pl3-Cinase, cinase terminal c-jun, AKT, ERK2 e/ou PYK2.
45. Um método para diagnosticar uma doença associada com o HER-3, compreendendo: (a) contatar uma amostra com a proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações 1 -26, sob condições adequadas para per- mitir a ligação da dita proteína de ligação ao HER-3; e (c) identificar a ligação da dita proteína de ligação ao HER-3.
46. O método da reivindicação 45, onde a doença é uma doença hiperproliferativa.
47. O método da reivindicação 46, onde a dita doença hiperproli- ferativa é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer gastrointestinal, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer ova- riano, câncer do estômago, câncer endometrial, câncer da glândula salivar, câncer do pulmão, câncer do rim, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da tireóide, câncer da bexiga, glioma, melanoma, outros cânceres que ex- pressam ou superexpressam o HER-3, câncer do testículo, sarcoma de teci- do mole, câncer da cabeça e do pescoço, e formação de metástases do tu- mor.
48. O método da reivindicação 46 pi 48, onde a dita doença hi- perproliferativa está associada com a fosforilação do HER-3 aumentada, a heterodimerização de HER-2/HER-3 aumentada ou uma atividade aumenta- da de Pl3-Cinase, cinase terminal c-jun, AKT, ERK2 e/ou PYK2.
49. Um kit compreendendo a proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindicações 1-28.
50. O kit da reivindicação 49, compreendendo um agente tera- pêutico adicional.
51. O kit,da reivindicação 50 onde o agente terapêutico adicional é um agente antineoplástico.
52. O kit da reivindicação 51, onde o agente antineoplástico é um anticorpo antitumor ou um agente quimioterapêutico.
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