BRPI0606389B1

BRPI0606389B1 - Método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos

Info

Publication number: BRPI0606389B1
Application number: BRPI0606389-6A
Authority: BR
Inventors: Abo Masanobu; Würtz Christensen Morten; Hu Zhengyu
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2005-01-10
Filing date: 2006-01-10
Publication date: 2018-02-14
Also published as: DE602006020837D1; US20080113419A1; JP2008526217A; WO2006072256A2; BRPI0606389A2; EP1838860B1; CN101103118B; CA2593282C; JP5133701B2; ES2363094T3; ATE503019T1; WO2006072256A3; US20110201066A1; EP1838860A2; US9593352B2; CA2593282A1; CN101103118A

Abstract

<b>método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos<d>um método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos, em que uma solução compreendendo triglicerídeo e álcool é colocada em contato com uma primeira enzima lipolitica tendo uma atividade relativamente mais elevada sobre os ácidos graxos livres do que sobre o triglicerídeo, e uma segunda enzima lipolítica tendo uma atividade relativamente mais elevada sobre o triglicerídeo do que sobre os ácidos graxos livres.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA PRODUZIR ALQUIL ÉSTERES DE ÁCIDOS GRAXOS (51) Int.CI.: C12P 7/64 (30) Prioridade Unionista: 10/01/2005 DK PA 2005 00041 (73) Titular(es): NOVOZYMES A/S (72) Inventor(es): MASANOBU ABO; MORTEN WÜRTZ CHRISTENSEN; ZHENGYU HU τ

“MÉTODO PARA PRODUZIR ALQUIL ÉSTERES DE ÁCIDOS

GRAXOS”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos a partir do triglicerídeo, mediante o uso de uma primeira enzima lipolítica que favorece a conversão dos ácidos graxos livres em alquil ésteres de ácido graxo.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

O biodiesel, geralmente classificado como mono-alquil ésteres de gorduras e óleos, se tomou mais atrativo recentemente por causa dos seus benefícios ambientais. Não obstante o biodiesel seja no presente quimicamente produzido com sucesso (com o uso por exemplo de NaOH e/ou metóxido de sódio como catalisador), existem vários problemas associados que restringem seu desenvolvimento, tais como o pré-processamento do óleo, por causa dos altos conteúdos de ácidos graxos livres, da remoção do catalisador químico do éster e da fase de glicerol, e remoção de sais inorgânicos durante a recuperação do glicerol.

As desvantagens causadas pelos catalisadores químicos são amplamente impedidas mediante o uso de enzimas lipolíticas como os catalisadores e, nos anos recentes, o interesse tem se desenvolvido no uso de lipases com ou sem imobilização na transesterifieação para a produção do biodiesel.

As esterases fúngicas podem ser usadas na produção enzimática de ésteres, em que elas podem substituir os catalisadores como o ácido mineral (por exemplo, ácido sulfurico, cloreto de hidrogênio e ácido clorossulfônico), hidróxidos anfotéricos de metais dos grupos I, II, III e IV, e outros. O uso de enzimas para a síntese de ésteres foi descrito na técnica anterior, em particular as enzimas classificadas em EC 3.1.1 Hidrolases de ésteres carboxílieos de acordo com a Nomenclatura de Enzimas (Recomendações do Comitê de Nomenclaturas da União Internacional de

Bioquímica e Biologia Molecular, 1992 ou mais tarde.

A WO 88/02775 apresenta lipases A e B de Candida antarctica. Ela estabelece que a lipase B da C. antarctica (CALB) é mais eficaz para a síntese de ésteres.

As cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar a cutina do substrato. As cutinases são conhecidas de vários fungos (P. E. Kolattukudy em “Lipases”, Ed. B. Borgstrõm e H. L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504). A seqüência de aminoácidos de uma cutinase de Humicola insolens foi publicada (U.S. 5.827.719).

Muitos pesquisadores têm relatado que uma alta produção de alquil ésteres pode ser alcançada na presença de solventes orgânicos, mas, por causa da toxicidade e da inflamabilidade dos solventes orgânicos, a alcoólise catalisada pela lipase em um meio livre de solvente é mais desejável. A metanólise catalisada pelas lipases foi mostrada ocorrer em um sistema contendo água livre de solventes orgânicos. Em tais sistemas, as lipases, que são menos sensíveis ao metanol, são vantajosas (Kaieda et al. J. Biosci.

f

Bioeng. 2001, 91: 12-15). E bem conhecido o fato de que os álcoois de excessiva cadeia curta, tais como o metanol, podem inativar seriamente a lipase. Entretanto, pelo menos três equivalentes molares de metanol são necessários para a completa conversão do óleo em seu correspondente metil éter. Du et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 2003, 38: 103-106) estudaram o efeito da relação molar do óleo/metanol comparativamente durante a operação de batelada não contínua e de batelada contínua.

Para evitar a inativação das lipases, a concentração do metanol foi mantida baixa pela adição de metanol às etapas na totalidade da reação (Shimada et al. J Mol. Catalysis Enzymatic, 2002, 17: 133-142; Xu et al.

2004, Biocat. Biotransform. 22: 45-48).

Boutur et al. (J. Biotechnol. 1995, 42: 23-33) relataram uma lipase de Candida deformans, e os quais foram capazes de catalisar tanto a alcoólise do triglicerídeo (TG) quanto a esterificação dos ácidos graxos livres (FFA), porém não sob as mesmas condições de reação. Sob as condições descritas por Boutur et al., apenas a esterificação foi catalisada.

De modo a obter uma produção mais econômica de etil ésteres de ácidos graxos para o biodiesel, existe a necessidade de uma conversão mais rápida das gorduras e óleos em seus correspondentes metil ésteres, e um rendimento mais elevado na referida conversão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos, tais como os metil ésteres de ácidos graxos (FAME) e os etil ésteres de ácidos graxos. Tais ésteres são também denominados biodiesel, porque eles são usados como um aditivo ao diesel mineral para resultar em um combustível de número elevado de cetano, livre de enxofre, o qual seja parcialmente à base de recursos renováveis.

O método da invenção inclui uma solução compreendendo álcool, triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres, cuja solução entra em contato com uma primeira enzima lípolítica e uma segunda enzima lipolítica de diferente especificidade, em que as enzimas lipolíticas catalisam a conversão do triglicerídeo ou ácidos graxos livres ou uma mistura de ambos, em alquil ésteres de ácidos graxos. A primeira enzima lipolítica é caracterizada no fato de que ela apresenta atividade mais elevada contra o triglicerídeo do que os ácidos graxos livres, ao passo que a segunda enzima lipolítica apresenta atividade mais elevada contra os ácidos graxos do que os triglicerídeos.A atividade da primeira e da segunda enzimas lipolíticas é determinada pelo uso dos métodos descritos nos Exemplos 1 e 2 abaixo.

A primeira enzima lipolítica é definida como aquela que tem uma relação de atividade sobre TG/atividade sobre FFA abaixo de 0,2. A segunda enzima lipolítica é definida como aquela que tem uma relação de

atividade sobre TG/atividade sobre FFA acima de 0,5.

A combinação de uma primeira enzima lipolítica e uma segunda enzima lipolítica de acordo com a presente invenção resulta em um efeito sinergístico sobre a conversão do triglicerídeo e do triglicerídeo em combinação com os ácidos graxos livres em alquil ésteres de ácidos graxos, por meio do que um percentual de conversão mais elevado é obtido em um período de tempo mais curto.

Além disso, a invenção diz respeito a um processo de batelada ou um processo contínuo escalonado para produzir ésteres de ácidos graxos com o uso de uma primeira e uma segunda enzima lipolítica como descrito acima, em que o álcool é acrescentado continuamente ou em etapas, e em que as enzimas são recicladas ou usadas apenas uma vez.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos. O método da invenção inclui uma solução compreendendo álcool e um substrato, o qual compreende triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres. A solução é colocada em contato com uma primeira enzima lipolítica e uma segunda enzima lipolítica de diferente especificidade, em que as enzimas lipolíticas catalisam a conversão do triglicerídeo ou dos ácidos graxos livres ou uma mistura de ambos, em alquil ésteres de ácidos graxos.

Substratos Substratos adequados para a produção de alquil ésteres de ácidos graxos de acordo com a presente invenção são uma ampla variedade de óleos e gorduras vegetais; os óleos de colza e de soja são os mais comumente usados, embora os óleos de outras plantas tais como a mostarda, o girassol, canola, coco, cânhamo, palma e mesmo as algas, sejam promissores. O substrato pode ser de qualidade bruta ou ainda processado (refinado, branqueado e desodorizado). Igualmente as gorduras animais, incluindo o sebo, a gordura, aves domésticas, óleo marinho, bem como gorduras e óleos vegetais e animais usados, comumente conhecidos como graxa amarela e marrom, podem ser usadas. Gorduras e óleos adequados podem ser triglicerídeo puro ou uma mistura de triglícerídeo com ácidos graxos livres, comumente observados no óleo vegetal e nas gorduras animais usadas. O substrato podem também ser obtidos de destilados desodorizantes de óleos vegetais. O tipo de ácidos graxos no substrato compreende aqueles de ocorrência natural como glicerideos em gorduras e óleos vegetais e animais. Estes incluem o ácido oléico, o ácido linoleico, o ácido linolênico, o ácido palmítico e o ácido láurico, para citar uns poucos. Os constituintes secundários nos óleos vegetais brutos são tipicamente os fosfolipídeos, os ácidos graxos livres e os glicerideos parciais, isto é, os mono- e diglicerídeos. Quando aqui usada, a expressão “resíduos de ácidos graxos” refere-se a ácidos graxos, ou livres ou esterificados como nos triglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos ou alquil ésteres de ácidos graxos.

Substratos Os alquil ésteres de ácidos graxos, tais como os metil ésteres de ácidos graxos (FAME) e os etil ésteres de ácidos graxos, são também denominados biodiesel, porque eles são usados como um aditivo ao diesel fóssil. O biodiesel constitui um aditivo erescentemente importante ou substituto para os combustíveis diesel com base no óleo fóssil, porque ele é produzido de recursos renováveis.

Álcool O álcool usado no método da invenção é de preferência um álcool inferior tendo de 1 a 5 átomos de carbono (C1-C5). Álcoois preferidos são 0 metanol e o etanol.

Enzima Lipolítica A primeira enzima lipolítica de acordo com a presente invenção é caracterizada no fato de que ela apresenta maior atividade contra o triglicerídeo do que os ácidos graxos livres, ao passo que a segunda enzima lipolítica apresenta atividade maior contra os ácidos graxos livres do que o triglicerídeo. A atividade das enzimas lipolíticas contra os triglicerídeos e os ácidos graxos livres é determinada como descrito no

Exemplo 1 e no Exemplo 2, respeetivamente.

Em conformidade com a presente invenção, a primeira enzima iipolitica é definida como aquela que tem uma relação de atividade sobre o triglicerídeo (medida como conversão de alquil ésteres de ácidos graxos) para a atividade sobre FFA (medida como conversão do FFA em alquil ésteres de ácidos graxos) abaixo de 0,2. A segunda enzima Iipolitica é definida como aquela que tem uma relação de atividade sobre o glicerídeo (medida como conversão do triglicerídeo em alquil ésteres de ácidos graxos) para a atividade sobre FFA (medida como conversão de FFA em alquil ésteres de ácidos graxos) acima de 0,5.

Conseqüentemente, a presente invenção diz respeito a um método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos, caracterizado no fato de que uma solução compreendendo triglicerídeo e álcool é colocada em contato com uma primeira enzima Iipolitica tendo uma relação de atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFA abaixo de 0,2 e uma segunda enzima Iipolitica tendo uma relação de atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFA acima de 0,5.

A primeira enzima Iipolitica preferivelmente tem uma relação de atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFA na faixa de 0,01 a 0,2, mais preferível na faixa de 0,01 a 0,1, mais preferível na faixa de 0,0125 a 0,05, mais preferível na faixa de 0,015 a 0,025, ainda mais preferível na faixa de 0,02 a 0,024. A segunda enzima Iipolitica preferivelmente tem uma relação de atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre o FFA na faixa de 0,5 a 20, mais preferível na faixa de 0,6 a 10, mais preferível na faixa de 0,7 a 5, ainda mais preferível na faixa de 0,8 a 1,5.

Como estabelecido acima, a atividade das enzimas lipolíticas contra os triglicerídeos e o ácido graxo livre é determinada como descrito no Exemplo 1 e no Exemplo 2, respeetivamente. Abaixo, a relação da atividade sobre o triglicerídeo (abreviado TG) medida como no Exemplo 1 para a atividade sobre os ácidos graxos livres (abreviados FFA) medida como no

Exemplo 2, foi calculada quanto às enzimas lipolíticas testadas:

CALB: TG/FFA = 0,55/26,41 = 0,021

H. insolens cutinase: TG/FFA = 12,13/10 = 1,213

T. lanuginosus lipase: TG/FFA = 13,22/16,25 = 0,814.

A combinação de uma primeira enzima lipolítica e uma segunda enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, resulta em um efeito sinergístico sobre a conversão do triglicerídeo e/ou dos ácidos graxos livres em alquil ésteres de ácidos graxos, por meio do que um percentual mais elevado de conversão é obtido em um período de tempo mais curto.

Em uma forma de realização preferida do método da presente invenção, uma primeira enzima lipolítica da presente invenção é a lipase B da Candida antarctica (CALB) como apresentado na WO 88/02775, enquanto a segunda enzima lipolítica é uma das variantes da lipase de Thermomyces lanuginosus (anteriormente Humicola lanuginosus) exemplificadas na WO 00/60063 e das variantes da cutinase de Humicola insolens apresentadas no Exemplo 2 da WO 01/92502, daqui por diante referidas como lipase de T. lanuginosus e cutinase de H. insolens, respectivamente. Em uma segunda forma de realização preferida, uma primeira enzima lipolítica inclui a lipase de Hyphozyma sp. e a lipase de Candida parapsilosis, ao passo que uma segunda enzima lipolítica da presente invenção inclui a lipase A de C. antarctica como apresentado na WO 88/02775 e lipases de Humicola lanuginosus (EP 258 068), Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Thizomucor miehei, Cryptococcus spp. S-2 e Candida parapsilosis.

Em uma terceira forma de realização, a primeira enzima lipolítica é homóloga com CALB, lipase de Hyphozyma sp. e a lipase de

Candida parapsilosis, ao passo que uma segunda enzima lipolítica é homóloga com a lipase de T. lanuginosus, cutinase de H. insolens ou qualquer

Petição 870170021825, de 03/04/2017, pág. 8/11 uma das lipases de Humicola lanuginosus (EP 258 068), Candida rugosa,

Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei,

Cryptococcus spp. S-2 e Candida parapsilosis.

Preferivelmente, a primeira enzima lipolítica de acordo com o 5 método da presente invenção é 60% idêntica a CALB, enquanto a segunda enzima lipolítica é 60% idêntica à lipase de T. lanuginosus, a cutinase de H. insolens. Mais preferível a primeira enzima lipolítica é 70% idêntica a CALB, ainda mais preferível a primeira enzima lipolítica é 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou ainda 99% idêntica a CALB. De forma semelhante, a segunda enzima lipolítica é preferivelmente 70% idêntica à lipase de T. lanuginosus e à cutinase de H. insolens, mais preferivelmente a segunda enzima lipolítica é 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou ainda 99% idêntica à lipase de T. lanuginosus ou à cutinase de H. insolens.

As enzimas podem ser aplicadas como pó liofilizado, imobilizado ou em solução aquosa.

Para os fins da presente invenção, o grau de identidade pode ser adequadamente determinado de acordo com o método descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,

443-445, com os seguintes ajustes para comparação da seqüência de polipeptídeos: penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade da extensão de GAP de 0,1. A determinação pode ser feita por meio de um programa de computador conhecido como GAP fornecido no pacote de programas GCG (Manual de Programas para o Pacote Wisconsin, versão 8, agosto de 1994,

Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

Duas dadas seqüências podem ser alinhadas de acordo com o método descrito em Needleman (acima) com o uso dos mesmos parâmetros.

Isto pode ser feito por meio do programa GAP (supra).

Petição 870170021825, de 03/04/2017, pág. 9/11

Além disso, a invenção diz respeito a um processo de batelada e/ou contínuo, processo escalonado para produzir alquil ésteres de ácidos graxos com o uso de uma primeira e uma segunda enzima lipolítica conforme acima descrito, em que o álcool é adicionado continuamente ou em etapas, e em que as enzimas são recicladas ou usadas apenas uma vez. Se as enzimas estiverem em uma fase aquosa, esta fase pode ser separada da fase graxa mediante um decantador, um sedimentador, ou por centrifugação. No processo contínuo, as duas fases, oleosa e aquosa, respectivamente, podem ser processadas em contra-corrente. Kosugi, Y.; Tanaka, H. e Tomizuka, (1990),

Biotechnology and Bioengineering, vol. 36, 617-622, descrevem um processo em contra-corrente contínuo para hidrolisar o óleo vegetal por lipase imobilizada.

Descrição Geral da Preparação de Alquil ésteres de ácidos graxos

O substrato compreendendo triglicerídeo é misturado com álcool, preferivelmente metanol ou etanol, e aquecido até 30 a 60 °C, de preferência 50 °C, em um banho em agitação de água recíproco (200 rpm). Preferivelmente, água é acrescentada e a solução é misturada e ainda aquecida até a temperatura desejada. As enzimas são adicionadas e a solução é misturada vigorosamente e deixada no banho em agitação de água recíproco na temperatura desejada, preferivelmente a 50 °C e 200 rpm, até reagir. As fases da mistura de reação podem ser misturadas pelo uso de misturadores de alto cisalhamento, tais como os tipos da Silverson ou da IKA Labortechnik, como usados na desengomagem enzimática do óleo vegetal (Clausen, K. (2001), European Journal of Lipid Science and Technology, vol. 103, 33325 340).

A relação molar de metanol/resíduo de ácidos graxos deve ser de pelo menos 0,1 e no máximo de 10, preferivelmente na faixa de 0,3 a 5, mais preferível de 0,4 a 2. O álcool pode ser adicionado em etapas à reação no decorrer do tempo. A água pode ser adicionada separadamente ou dentro de /ί uma solução enzimática aquosa. A concentração final da água na mistura de reação pode ser de 0 a 50% (p/p), preferivelmente de 5 a 40%, mais preferível de 5 a 30%. O substrato compreende de 1 a 99% (p/p) de triglicerídeo, preferivelmente na faixa de 70 a 95%. Além disso, o substrato pode compreender ácidos graxos livres na quantidade de 0,01 a 95% (p/p), preferivelmente na faixa de 0,01 a 30%. Igualmente, os mono- e diglicerídeos e os fosfolipídeos podem estar presentes.

Naturalmente, a reação pode ser seguida pela retirada de amostras da mistura de reação após um certo período de tempo de reação. As amostras são centrifugadas por 14 minutos em 14.000 rpm. A camada superior consiste de material graxo não solúvel na fase de água e esta é analisada por 'H RMN (usando-se CDCfi como solvente). Após a reação ter terminado, a fase glicerol é removido ou por decantação ou por centrifugação. Clonagem de Uma Seqüência de DNA Codificando Uma Enzima Lipolítica

A seqüência de DNA codificando uma enzima lipolítica precursora pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo que produzam a enzima lipolítica em questão, com o uso de vários métodos bem conhecidos na técnica. Primeiro, uma biblioteca genômica de DNA e/ou de cDNA deve ser construída com o uso do DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produza a enzima lipolítica a ser estudada. Depois, se a seqüência de aminoácidos da enzima lipolítica for conhecida, sondas de oligonucleotídeos rotuladas podem ser sintetizadas e usadas para identificar os clones codificando a enzima lipolítica de uma biblioteca genômica preparada do organismo em questão. Altemativamente uma sonda rotulada de oligonucleotídeo contendo seqüências homólogas a outro gene de enzima lipolítica conhecido pode ser usada como uma sonda para identificar os clones codificando a enzima lipolítica, com o uso de hibridização e condições de lavagem de menor estringência.

Outro método ainda para identificar clones codificando a

enzima lipolítica deve envolver a inserção de fragmentos de DNA genômieo em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, transformando as bacténas negativas quanto à eutinase com a biblioteca de DNA genômieo resultante, e depois plaqueando-se as bactérias transformadas sobre ágar contendo um substrato para a enzima lipolítica (isto é, triglicerídeo), desse modo possibilitando que os clones que expressam a enzima lipolítica sejam identificados.

Alternativamente, a seqüência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sintetícamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo o método de fosforoamidita descrito por S. L. Beaucage e Μ. H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, pp. 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, pp. 801-805. No método da fosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificados, recozidos, ligados e clonados em vetores apropriados.

Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origem genômica mista e sintética, de origem mista sintética e de cDNA, ou de origem genômica mista e eDNA, preparada por fragmentos de ligação de origem sintética, genômica ou de cDNA (quando apropriado, os fragmentos correspondentes às várias partes da seqüência de DNA inteira), de acordo com técnicas padrão. A seqüência de DNA também pode ser preparada por reação em cadeia da polimerase (PCR) com o uso de iniciadores específicos, por exemplo como descrito na U.S. 4.683.202 ou R. K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491.

Vetor de Expressão

O vetor de expressão recombinante carregando a seqüência de

DNA codificando uma enzima lipolítica da invenção pode ser qualquer vetor que possa convenientemente ser submetido a procedimentos recombinantes do DNA, e a escolha do vetor ffeqüentemente dependerá da célula hospedeira

dentro da qual ele deva ser introduzido. O vetor pode ser aquele que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) dentro do qual ele tenha sido integrado. Exemplos de vetores de expressão adequados incluem o pMT838.

O vetor de expressão da invenção pode também compreender um terminador de transcrição adequado e, nos eucariotas, as seqüências de poliadenilação operavelmente conectadas à seqüência de DNA que codifica a enzima lipolítica da invenção. As seqüências de terminação e de poliadenilação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes como o promotor.

O vetor pode ainda compreender uma seqüência de DNA que possibilita que o vetor se replique na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBllO, pE194, pAMBl epIJ702.

O vetor pode também compreender um marcador selecionável, por exemplo um gene cujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um que confira resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, à canamicina, ao cloranfenicol ou à tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus, tais como amdS, argB, niaD e sC, um marcador dando origem à resistência à higromicina, ou a seleção pode ser realizada por co-transformação, por exemplo como descrito na WO 91/17243.

Os procedimentos usados para ligar a construção de DNA da invenção codificando uma variante da cutinase, o promotor, o terminador e outros elementos, respectivamente, e introduzi-la nos vetores adequados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos das pessoas habilitadas na técnica (conforme, por exemplo, Sambrook et al.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^Ά Ediçào., Cold Spring Harbor, 1989).

Promotor

No vetor, a seqüência de DNA deve ser operavelmente conectada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que apresente atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e possa ser derivada dos genes codificando proteínas ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da seqüência de DNA codificando uma enzima lipolítica da invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do operon lac de E. coli, os promotores dagA do gene de agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, os promotores do gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, os promotores da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtillis, etc. Para a transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene codificando a amilase de A. oryzae TAKA, o promotor TP1 (triose fosfato isomerase) de S. cerevisiae [Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, pp. 419-434, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa amilase estável a ácido de A. niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae, ou acetamidase de A. nidulans.

Células Hospedeiras

A célula da invenção, ou compreendendo uma construção de

DNA ou um vetor de expressão da invenção, como definido acima, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma enzima lipolítica da invenção. A célula pode ser transformada com a construção de DNA da invenção codificando a enzima lipolítica, convenientemente pela integração da construção de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem já que a seqüência de DNA é mais provável de ser estavelmente mantida na célula. A integração das construções de DNA no cromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo por recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão como descrito acima, em combinação com os diferentes tipos de células hospedeiras.

A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior, tal como um mamífero ou um inseto, particularmente uma célula microbiana, por exemplo uma célula bacteriana ou fungica (inclusive a levedura).

Exemplos de bactérias adequadas são as bactérias Grampositivas, tais como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis ou Streptomyces lividans ou

Streptomyces murinus, ou bactérias Gram-negativas tais como E. coli. A transformação das bactérias pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos ou pelo uso de células competentes de uma maneira por si conhecida.

O organismo da levedura pode favoravelmente ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Scizosaccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae.

A célula hospedeira pode também ser um fungo filanaentoso, por exemplo uma cepa pertencente a uma espécie de Aspergillus, em particular Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger, ou uma cepa de Fusarium,

tal como uma cepa de Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum (no estado perfeito denominada Gibberella zeae. anteriormente Sphaeria zeae, sinônimo de Gibberella roseum e Gibberella roseurn f, sp. cerealis), ou Fusarium sulphureum (no estado perfeito denominada Gibberella puricaris, sinônimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucinum, Fusarium roseum e Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinônimo de Fusarium crokkwellense), ou Fusarium venenatum.

Em uma forma de realização particular da invenção, a célula hospedeira é uma protease deficiente ou uma cepa secundária de protease, Esta pode, por exemplo, ser a cepa deficiente de protease de Aspergillus oryzae JaL 125 tendo o gene da protease alcalina denominado “alp” deletado. Esta cepa é descrita na WO 97/35956 (Novo Nordisk).

As células de fungos filamentosos podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos seguida pela regeneração da parede celular de uma forma por si conhecida. O uso do Aspergillus como um microorganismo hospedeiro é descrito na EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), cujo conteúdo é por este meio incorporado como referência.

Produção da Enzima Lipolítica Mediante Cultivo do Transformante

A invenção diz respeito, inter alia, a um método de produzir uma enzima lipolítica da invenção, método este que compreende cultivar uma célula hospedeira sob condições conducentes à produção da enzima lipolítica e recuperação da enzima lipolítica das células e/ou meio de cultura.

O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado ao cultivo da célula hospedeira em questão, e obter a expressão da enzima lipolítica da invenção. Meios adequados acham-se disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, como descrito nos catálogos da <7 Q

ί. Ζ

American Type Culture Colleetion).

A enzima lipolítica secretada das células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo a separação das células do meio mediante centrifugação ou filtração, e precipitando-se os componentes proteináceos do meio por intermédio de um sal, tal como o sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos tais como a cromatografia de troca de íons, a cromatografia de afinidade, ou coisa parecida.

MATERIAIS E MÉTODOS 10 Atividade de Lipase sobre tributirina (LU)

Um substrato para as enzimas lipolíticas é preparado pela emulsificação da tributirina (tributirato de glicerina) com o uso da goma arábica como emulsificante. A hidrólise da tributirina a 30 °C em pH 7 é seguida em uma experiência de titulação de pH-stato. Uma unidade da atividade da lipase (1 LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ácido butírico/minuto nas condições padrão.

Preparação do alquil éster de ácido graxo

8,00 gramas de substrato são misturados com metanol (0,500 ml => 0,395 grama). Os seguintes tipos de substratos foram usados;

Exemplo 1) 100% de óleo de salada (óleo de soja refinado, branqueado e desodorizado, RDB SBO);

Exemplo 2) 100% de ácido oléico;

Exemplo 3) mistura de 20% p/pde ácido oléico em RBD SBO A mistura de substrato-metanol é aquecida a 50 °C em um banho em agitação de água recíproco (200 rpm). Água desmineralizada é adicionada (volume dependendo do volume de enzimas adicionadas; quantidade total de água: 4,00 ml, incluindo a água de adição de enzimas) correspondente a 32% p/p da mistura total. A mistura é aquecida a 50 °C. Depois, a enzima é adicionada à mistura e vigorosamente misturada por 10

segundos e deixada no banho em agitação de água recíproco em 50 °C e 200 rpm. As fases da mistura de reação podem ser misturadas pelo uso de misturadores de alto cisalhamento, tais como os tipos da Silverson Ltd. Reino Unido ou IKA Kunkel.

Amostras são retiradas da mistura de reação após o tempo de reação de 3 horas, e centrifugadas por 14 minutos a 14000 rpm. A camada superior consiste de material graxo não solúvel na fase de água e este é analisado por 'H RMN (com o uso de CDCI3 como solvente) espectrômetro Varian 400 MHz (Varian Inc. CA, USA). A conversão dos resíduos de ácidos graxos em metil ésteres de ácidos graxos é determinada pela relação dos sinais de metila dos metil ésteres de ácidos graxos, -COOCH₃ (3,70 ppm) e QHy,CH₂- (1,0 - 0,9 ppm) dos resíduos de ácidos graxos.

A dose de enzimas baseia-se em um total de 0,4 mg de proteína/8,00 gramas de substrato. Para testar um efeito sinergístico de duas enzimas combinadas, 0,2 mg de cada enzima foi adicionado a 8 grama de substrato. Com referência à quantidade de proteína a uma atividade enzimática, um ensaio padrão de atividade enzimática pode ser aplicado, neste caso o ensaio de LU como descrito acima (atividade da lipase sobre a tributirina). As seguintes preparações enzimáticas foram testadas:

1. Lipase de T. lanuginosus (TLL, atividade específica 7000 LU/mg de proteína)

2. Lipase B de C. antarctica (CALB, atividade específica 500 LU/mg de proteína)

3. Cutinase de H. insolens (cutinase, atividade específica 1800 LU/mg de proteína)

Dose de enzima e volumes adicionais de água para experiências com enzimas únicas:

1. TLL: 0,700 ml de uma solução de enzimas de 4000 LU/ml + 3,30 ml de água br

L18

2. CALB: 1,680 de uma solução de enzima de 119 LU/ml -r 2,32 ml de água

3. Cutinase: 0,450 ml de uma solução de enzima de 1600 LU/ml + 3,55 ml de água

Dose de enzima e volumes adicionais de água para experiências com combinação de enzimas:

1. TLL + CALB: (0,350 ml de uma solução de 4000 LU/ml de TLL + 0,840 ml de uma solução de 119 LU/ml de CALB + 2,810 ml de água)

2, Cutinase + CALB: (0,225 ml de uma solução de 1600 LU/ml de cutinase + 0,840 ml de uma solução de 119 LU/ml de CALB + 2,935 ml de água).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1, Preparação dos Alquil ésteres de ácidos graxos de

Triglicerídeos

Óleo de soja refinado, branqueado e desodorizado (RBD SBO, óleo de salada) foi usado como substrato de acordo com o método geral descrito acima. As conversões (%) dos resíduos de ácidos graxos em FAME após o tempo de reação de 3 horas com o uso de diferentes enzimas lipolíticas, são apresentadas na Tabela 1, enquanto a conversão (%) obtida eom uma combinação de CALB e TLL é mostrada na Tabela 2, O Coeficiente de Variação em% (% de CV) de quatro experiências idênticas foi determinado como sendo de 2,2%.

CALB	0,55
Cutinase	12,13
TLL	13,22

TABELA 1. Enzimas Únicas,% de Conversão dos Resíduos de Ácidos Graxos em FAME

CALB + TLL

16,21

TABELA 2. Combinação de Enzimas,% de Conversão Dos Resíduos de Ácidos Graxos em FAME

EXEMPLO 2. Preparação de Alquil ésteres de ácidos graxos do Áetdo Oléieo

Ácido oléieo foi usado como substrato de acordo com o método geral descrito acima. As conversões (%) dos resíduos de ácidos graxos em FAME, após o tempo de reação de 3 horas com o uso de diferentes enzimas lipolíticas, são apresentadas na Tabela 3.

EXEMPLO 3. Preparação dos Alquil ésteres de ácidos graxos de

Triglicerideo Contendo Ácidos Graxos Livres

Uma mistura de 20% p/p de ácido oléieo em RBD SBO foi usada como substrato de acordo com o método geral descrito acima. As conversões (%) de resíduos de ácidos graxos em FAME após o tempo de reação de 3 horas com o uso de diferentes enzimas lipolíticas e combinações das referidas enzimas, são apresentadas nas Tabelas 4 e 5.

CALB	16,58
Cutinase	11,22
TLL	14,09

TABELA 4. Enzimas Únicas,% de Conversão dos Resíduos de Ácidos Graxos em FAME

CALB + Cutinase	18,82
CALB + TLL	20

TABELA 5. Combinação de Enzimas,% de Conversão dos Resíduos de Ácidos Graxos em FAME

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos, caracterizado pelo fato de que uma mistura de reação é produzida mediante o contato de uma solução compreendendo um substrato e um álcool, substrato

5 este sendo um óleo ou gordura vegetal que compreende triglicerídeos e ácidos graxos livres, e em que o álcool é um álcool inferior tendo de 1 a 5 átomos de carbono (C1-C5), com uma primeira enzima lipolítica tendo uma relação da atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre ácidos graxos livres abaixo de 0,2, e uma segunda enzima lipolítica tendo uma relação da

10 atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre ácidos graxos livres acima de 0,5.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende ácidos graxos livres na faixa de 0,01 a 95% em peso de ácidos graxos livres.

15
3. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o triglicerídeo é derivado de uma ou mais cargas de alimentação de óleos vegetais, óleo de colza, óleo de soja, óleo de mostarda, óleo de girassol, óleo de canola, óleo de coco, óleo de cânhamo, óleo de palma, talóleo, gorduras animais incluindo sebo, gordura, óleo de aves

20 domésticas e de peixes.
4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a relação molar entre o álcool e os resíduos de ácidos graxos no substrato é de no mínimo 0,1 e de no máximo 10, preferivelmente na faixa de 0,3 a 5, mais preferível de 0,4 a 2, os ácidos

25 graxos sendo tanto livres ou esterificados como nos triglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos ou alquil ésteres de ácidos graxos.
5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o álcool é metanol ou etanol.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

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5, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação ainda compreende água, preferível até 50% (p/p).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, caracterizado pelo fato de que a primeira enzima lipolítica tem uma relação 5 da atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre ácidos graxos livres na faixa de 0,01-0,2 e a segunda enzima lipolítica tem uma relação da atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre ácidos graxos livres na faixa de 0,5 a 20.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

10 7, caracterizado pelo fato de que a primeira enzima lipolítica é Lipase B da

Candida antarctica, lipase da Hyphozyma sp. e lipase da Candida parapsilosis.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a segunda enzima lipolítica é uma dentre a

15 lipase de T. lanuginosus, cutinase de H. insolens, lipase A de C. antarctica, lipases da Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei, Cryptococcus spp. S-2, Candida parapsilosis.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo ocorre em um modo de

20 batelada.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o processo ocorre em um modo contínuo.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as fases da solução na mistura de reação

25 são misturadas com o uso de um misturador de alto cisalhamento.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o processo é conduzido em um modo de contra-corrente.

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