BRPI0414721B1 - Dispersão estável de fosfatidilserina (PS) em uma base oleosa, composição farmacêutica e cápsula - Google Patents

Description

(54) Título: DISPERSÃO ESTÁVEL DE FOSFATIDILSERINA (PS) EM UMA BASE OLEOSA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E CÁPSULA (73) Titular: ENZYMOTEC LTD., Sociedade Israelense. Endereço: RamatGavriel Industrial Park, P.O. Box6, Midgal Haemeq 23106, ISRAEL(IL) (72) Inventor: DORIT PLATT; AVIDOR SHULMAN; GAI BEN DROR; YONI TWITO; RASSAN ZUABI; NETA SCHEINMAN

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 02/10/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para DISPERSÃO ESTÁVEL DE FOSFATIDILSERINA (PS) EM UMA BASE OLEOSA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E CÁPSULA.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a preparações estabilizadas de fosfatidilserina e a métodos para prepará-las. As preparações estabilizadas de fosfatidilserina da invenção podem estar na forma de pó, líquido ou dispersão. As preparações de fosfatidilserina podem ser usadas como nutracêuticos ou aditivos nutracêuticos de alimentos funcionais ou composições farmacêuticas.

Antecedentes da Invenção

Todas as publicações mencionadas neste pedido são totalmente incorporadas aqui por referência, incluindo todas as referências aqui citadas.

Fosfatidilserina (PS), um nutriente fosfolipídico, é ativo em mem15 branas celulares e é o componente ácido fosfolipídico principal da membrana de células cerebrais. PS desempenha um papel crucial em muitos processos de células nervosas associados a membrana. A finalidade principal de PS é ajudar a manter a fluidez apropriada, de membrana que tem grandes implicações na maioria das funções de membrana.

PS tem sido matéria de numerosos testes clínicos humanos de perda de memória, humor, desempenho cognitivo e capacidade de aprendizagem. Muitos dos estudos mostram que PS pode ser útil para as pessoas com dificuldade de memória relacionada com a idade. Além disso, PS pode até ajudar a otimizar a cognição de pessoas que não possuem dificuldade cognitiva.

PS dietética é eficiente e rapidamente absorvida no intestino, penetrando no sangue e cruza prontamente a barreira sangue-cérebro para alcançar as células nervosas do cérebro.

PS pode ser extraída de cérebro bovino, de plantas ou pode ser produzida a partir de lecitina de soja usando biocatálise. Com o uso da rea30 ção de transfosfatidilação com fosfolipases D (PLDs), o grupo principal de fosfolipídios pode ser facilmente modificado. Assim, fosfatidilserina pode ser produzida a partir de fosfatidilcolina ou de qualquer outra mistura de fosfoliPetição 870180026769, de 03/04/2018, pág. 5/13

'* pídios com serina através de catalise de PLD.

Normalmente, PS é fabricada e comercializada nas formas em pó e fluida em diferentes concentrações, na faixa de 10 % a 90 %. A forma fluida da PS comumente consiste em uma solução clara e transparente de fosfatidilserina, usualmente em meio oleoso de triglicerídeos de cadeia média (MCT) ou de triglicerídeos de soja. Esta forma é comumente usada para suplementos dietéticos na forma de cápsulas de softgel. Suplementos de PS se encaixam na categoria de nutracêuticos, que são definidos como qualquer substância que é um alimento ou parte de um alimento e que fornece benefícios médicos e/ou de saúde, incluindo prevenção e tratamento de doença. Na definição ampla, tanto suplementos dietéticos como alimentos funcionais são considerados nutracêuticos.

Uma das principais dificuldades das preparações de fosfatidilserina, especialmente em forma líquida, é sua baixa estabilidade devido a rápida decomposição. A exata causa desta decomposição não é totalmente entendida. Há muitas hipóteses com relação à causa deste fenômeno, embora a maioria não seja cientificamente estabelecida ou provada. A crença comum é que a decomposição é causada principalmente por atividade biocatalítica residual e/ou por reações secundárias com água ou glicerol, bem como com outras porções de álcool. Estas reações podem ser especialmente importantes quando a preparação de PS é fluida e é encapsulada em cápsulas de softgei. Encapsulação em softgel usuaimente resulta na migração e subI seqüente incorporação de baixos níveis de água e/ou glicerol no conteúdo da cápsula.

Preparações de PS, especialmente preparações fluidas em que a atividade biocatalítica residual de PLD encontra-se presente, podem ser susceptíveis a degradação biocatalítica de PS por transfosfatidilação, que remove o grupo principal de serina, resultando em perda do ingrediente ativo de PS. Esta atividade de transfosfatidilação pode resultar em hidrólise utilizando água encontrada na própria preparação fluida de PS ou na preparação fluida após a encapsulação. Hidrólise levará à formação de ácido fosfatídico (PA). No caso da transfosfatidilação utilizar glicerol ou outras porções de álcool encontradas na própria preparação fluida de PS ou na preparação fluida após encapsulação; isto pode levar à substituição do grupo principal de serina com outros, fornecendo fosfatidilglicerol (PG) ou outros derivados de fosfolipídios correspondentes.

Outras rotas de degradação também são possíveis. Estas incluem degradação química, como, por exemplo, descarboxilação do grupo carboxílico serina, fornecendo produtos como fosfatidiletanolamina (PE) ou outros derivados. Peroxidação de lipídios pode também desempenhar um papel na degradação de PS. PS pode ser degradada por hidrólise completa ou parcial dos ácidos graxos fosfolipídicos, fornecendo PS desacilada (GPS) ou liso-PS (LPS), correspondentemente. No caso de remoção de PS fosfato, enzimaticamente por enzimas com atividade similar a de fosfolipase C (PLC) ou quimicamente, podem ser criados diglicerídeos, resultando também em redução do ingrediente PS ativo.

Uma maneira de evitar a degradação foi proposta em WO 03/088949 em que o fosfolipídio é embutido em uma matriz dura ou tipo pasta.

Além do que foi sugerido acima, outras rotas de degradação são plausíveis e poderiam ser responsáveis pela aparente degradação de PS em preparações comerciais.

É assim um objetivo da presente invenção prover preparações de PS estabilizadas, como pós, líquidos ou dispersões.

É, ainda, um objetivo da presente invenção prover métodos para o preparo de tais preparações de PS estabilizadas.

É, ainda, um outro objetivo da presente invenção prover as referidas preparações estabilizadas para uso em aplicações comuns de suplementos dietéticos, e particularmente em cápsulas de softgel.

É, ainda, um outro objetivo da presente invenção prover as referidas preparações estabilizadas para uso como nutracêuticos para serem usados sozinhos ou como aditivos a produtos alimentícios ou composições farmacêuticas.

Estes e outros objetivos da invenção ficarão aparentes pela des73 crição a seguir.

Sumário da Invenção

Para superar o problema da instabilidade da fosfatidilserina, os presentes inventores desenvolveram e apresentam aqui uma composição de PS que é mais estável. São também apresentados usos e métodos de produção de tais PS estáveis.

Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição de PS estável compreendendo de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) de fosfatidilserina.

Em uma modalidade da composição da invenção, a referida composição compreende de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) de PS, preferivelmente de cerca de 2,5 a 80 % (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p), de outras ingredientes funcionais, preferivelmente de cerca de 5 a 90 % (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) de fasfatidilcolina (PC), preferivelmente de cerca de 1 a 25 % (p/p), (PC), preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) fosfatidiletanolamina (PE), preferivelmente de cerca de 1 a 10 % (p/p) de cerca de 0,1 a cerca de 99 % (p/p) fosfatídilinosítol (PI), preferivelmente de cerca de 0,5 a 10 % (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) de fonte de Ômega-3, preferivelmente de cerca de 10 a 90 %, de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) de fonte de Ômega-6, preferivelmente de cerca de 10 a 90 % (P/P), e/ou de cerca de 1 a cerca de 99 % (p/p) de esterol ou ésteres de esterol, preferivelmente de cerca de 1 a 65 % (p/p).

Além disso, a composição da invenção é caracterizada pelo fato de seu conteúdo não exceder 15 % de ácido fosfatídico (PA). Preferivelmente, o teor de PA fica abaixo de 10 %, mais preferivelmente entre 1 e 7 %.

Em outra modalidade, a composição da invenção é caracterizada pelo fato de não mais que cerca de 1 a cerca de 5 % da fosfatidilserina ser decomposta após um período de estocagem de pelo menos 6 meses, preferivelmente de pelo menos 12 meses, mais preferivelmente de pelo menos 24 meses.

Em uma modalidade particular da presente invenção, a composição substancialmente não possui atividade de fosfolipase, particularmente atividade de fosfolipase D.

Em outra modalidade particular, a composição de fosfatidilserina está presente na invenção na forma de pó.

Em outra modalidade a PS incluída na composição da invenção está na forma de um sal que é substancial mente solúvel em solventes orgânicos, particularmente sais de íons, monovalente, preferivelmente sal de sódio.

Em outra modalidade a PS incluída na composição da invenção está na forma de um sal que é substancialmente não solúvel em solventes orgânicos, particularmente sais de íons divalentes, preferivelmente um sal de cálcio. Alternativamente pode também ser um sal de magnésio.

A composição da invenção pode também conter opcionalmente aditivos fisiológica mente / farmaceuticamente aceitáveis, como agentes para escoamento livre, emulsificantes, conservantes estabilizantes, colorantes, antiespumantes e agentes anticompactação, bem como diluentes, excipíentes e veículos.

Em ainda outra modalidade, a composição de fosfatidilserina da invenção é para uso como suplemento dietético, alimento nutracêutico e/ou como aditivo de fármaco.

Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma preparação líquida estável de fosfatidilserina incluindo a composição de fosfatidilserina da invenção em que a PS está presente na forma de um sal, substancialmente solúvel em solventes orgânicos, dissolvida em óleo, preferivelmente em um triglicerídeo de cadeia média. Preferivelmente, a referida PS dissolvida em óleo está na forma de um sal de sódio.

Em uma primeira modalidade, a preparação líquida da invenção compreende de cerca de 1 a cerca de 90 % (p/p) de fosfatidilserina, preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 55 % (p/p).

Em outra modalidade, a preparação líquida de fosfatidilserina da invenção é caracterizada pelo fato de não mais que cerca de 1 a cerca de 5 % da fosfatidilserina ser decomposta após um período de estocagem de pelo menos 6 meses, preferivelmente de pelo menos 12 meses, mais preferível15 mente de pelo menos 24 meses.

Em outra modalidade, a preparação líquida de fosfatidilserina da invenção compreende adicionalmente outros ingredientes biofuncionais, preferivelmente pelo menos um entre lecitina, fosfolipídios, vitaminas, antioxidantes, minerais, proteínas ou peptídeos nutricionais, esterol e outros derivados, carboidratos nutricionais e seus derivados, aminoácidos, extratos de plantas, produtos de fermentação, derivados de glicerídeos (mono- e diglicerídeos), ácidos graxos poliinsaturados, e lipídios ômega-3 e/ou ômega 6.

Em ainda outra modalidade, a preparação líquida de fosfatidilserina da invenção é para uso como suplemento dietético, alimento nutracêutico e/ou como aditivo de fármaco.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê uma dispersão estável de fosfatidilserina compreendendo a composição estável de fosfatidilserina da invenção, em que PS está presente na forma de um sal substancialmente não solúvel em solventes orgânicos disperso em uma base líquida. Preferivelmente, o dito sal é um sal de cálcio. Assim, a dispersão estável de 'S é uma sal de cálcio de dispersão PS em uma base líquida que é preferivelmente uma base lipídica, mais preferivelmente uma base oleosa. Alternativamente, a dispersão estável de PS é um sal da magnésio de PS disperso em uma base líquida, preferivelmente lipídica, mais preferivelmente uma base oleosa.

Em uma modalidade, a base lipídica pode ser óleo, ésteres de ácidos graxos, ácidos graxos livres e outros derivados.

Preferivelmente, a referida dispersão de fosfatidilserina da invenção compreende de cerca de 1 a cerca de 70 % (p/p) de fosfatidilserina, preferivelmente de cerca de 5 % a 45 % (p/p).

Em uma modalidade preferida da dispersão de fosfatidilserina da invenção, a referida base oleosa é uma base triglicerídica, particularmente uma base de triglicerídeos de cadeia média ou óleo vegetal.

Em outra modalidade, a dispersão de fosfatidilserina da invenção, compreende adicionalmente outros ingrediente biofuncionais, preferivelmente pelo menos um entre lecitina, fosfolipídios, vitaminas, antioxidan7 tes, minerais, proteínas ou peptídeos nutricionais, esterol e outros derivados, carboidratos nutricionais e seus derivados, aminoácidos, extratos de plantas, produtos de fermentação, derivados de glicerídeos (mono- e diglicerídeos), ácidos graxos poliinsaturados, e lipídios ômega-3 e/ou ômega 6.

Em outra modalidade, a referida dispersão de fosfatidilserina da invenção é para uso como suplemento dietético, alimento nutracêutico e/ou como aditivo de fármaco.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um produto alimentício contendo PS em quaisquer das formas fornecidas pela invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS.

Em uma modalidade o referido produto alimentício contém opcionalmente pelo menos mais um ingrediente biofuncional, por exemplo, um ingrediente biofuncional como descrito acima.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica contendo como agente ativo PS em quaisquer das formas fornecidas pela invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS, e opcionalmente compreendendo ainda pelo menos um agente ativo adicional e/ou pelo menos um aditivo, diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica da invenção pode conter agentes farmaceuticamente ativos adicionais.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma cápsula contendo PS em qualquer uma das formas fornecidas pela invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS. A referida cápsula é preferivelmente uma cápsula macia de gelatina.

A presente invenção também provê o uso de qualquer uma das preparações de PS descritas na invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS, como melhorador do desempenho cognitivo e da capacidade de aprendizagem.

É um outro aspecto da invenção prover PS, em qualquer uma das preparações de descritas na invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS para uso na prevenção de perda de memória, partícularmente perda de memória relacionada com a idade.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um processo para preparação de uma composição estável de fosfatidilserina compreendendo as etapas de:

a. incubar uma mistura aquosa de L-serina e opcionalmente solventes orgânicos apropriados com lecitina na presença de uma fosfolipase imobilizada por um período adequado de tempo para fornecer fosfatidilserina;

b. remover a camada superior que contém a fosfatidilserina;

c. obter a fosfatidilserina da referida camada superior removida por meios padrão;

d. lavar a fosfatidilserina resultante com uma solução aquosa apropriada para remover excesso de L-serina;

e. lavar opcionalmente a fosfatidilserina obtida na etapa (d) com um solvente orgânico adequado, preferivelmente etanol em uma temperatura elevada; e

f. secar a fosfatidilserina obtida na etapa (e).

Em uma modalidade particular do processo da invenção, a referida fosfolipase é preferivelmente fosfolipase D.

Em outra modalidade do processo da invenção, o referido processo pode compreender adicionalmente a etapa de desativar qualquer atividade de fosfolipase residual na fosfatidilserina obtida por meios adequados.

Em ainda outra modalidade preferida do processo da invenção, a referida fosfolipase é imobilizada em uma matriz insolúvel e é opcionalmente revestida com tensoativo e após a etapa (a), a mistura de reação é deixada em repouso até a fosfolipase precipitar.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um processo para

4% preparo de uma preparação líquida estável de base oleosa de fosfatidilserina compreendendo a etapa de dissolver em uma base oleosa adequada a composição de fosfatidilserina da invenção, onde a PS está presente na forma de um sal que é substancialmente solúvel em solventes orgânicos, dissolvido em um óleo, preferivelmente um triglicerídeo de cadeia média. Preferivelmente a referida PS dissolvida em óleo está na forma de um sal de sódio. Preferivelmente a referida base oleosa é constituída de triglicerídeos de cadeia média ou de um óteo vegetal.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um processo para preparo de uma dispersão de base líquida estável de fosfatidilserina compreendendo a etapa de dispersar a composição de fosfatidilserina da invenção, onde a PS está presente na forma de um sal que é substancialmente não solúvel em solventes orgânicos, dissolvido em um óleo, preferivelmente um triglicerídeo de cadeia média e em que preferivelmente a referida PS dissolvida em óleo está na forma de um sal de cálcio, em uma base oleosa adequada, preferivelmente base de triglicerídeos e particularmente de triglicerídeos de cadeia média ou óleo vegetal. Deve ser notado que outros ingredientes podem ser adicionados a esta preparação líquida para enriquecer a mistura.

A presente invenção também provê a composição de fosfatidilserina sempre que preparada por qualquer um dos processos acima descritos.

Descrição Detalhada da Invenção

As seguintes abreviações são empregadas neste relatório :

EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético

GC: cromatografia gasosa

GPS: PS desaciiada

HPLC: Cromatografia líquida de alto desempenho

HPTLC: Cromatografia de camada fina de alto desempenho

LPS: liso-PS

MCT: triglicerídeos de cadeia média (médium chain triglycerides)

RMN: ressonância magnética nuclear (nuclear magnetic reso10 nance)

PA: ácido fosfatídico

PC: fosfatidilcolina

PE: fosfatidiletanolamina

PG: fosfatidilglicerol

Pl: fosfatidilinositol

PLC: fosfolipase C

PLD: fosfolipase D

PS: fosfatidilserina

RH: umidade relativa

TA: temperatura ambiente

Como mencionado acima, fosfatidilserina (PS) é um componente essential de membranas celulares, que é particularmente importante para o bom funcionamento das células cerebrais, com uma ligação conhecida à memória, humor, desempenho cognitivo e capacidade de aprendizagem. Por todas as suas funções importantes, é desejável fazer um suplemento de PS na dieta humana. Embora suplementos realmente existam no mercado, eles são muito problemáticos com relação ao montante que é realmente administrado ao consumidor, já que existe um problema inerente de degeneração e decomposição de PS nas composições correntemente disponíveis para a população geral.

PS é geralmente considerada instável. Mesmo pós secos puros armazenados sob condições de frio estão sujeitos a altas taxas de degradação. Além disso, composições com altas concentrações de PS, e PS puro são usualmente mais sujeitas a problemas de instabilidade. Foi descrito que PS pura é sujeita a degradação em uma velocidade de 0,5 % p/p por dia [Sigma Catalog]. A causa exata ou mecanismo desta degradação não é totalmente conhecida. Em muitos casos, reações de hidrólise ou de transfosfatidilação levam a culpa; no entanto em muitos casos os produtos dessas reações não podem ser isolados.

Para superar este problema de instabilidade, os presentes inventores desenvolveram e apresentaram aqui uma composição de PS que é

Oo mais estável. Usos e métodos para produzir essa PS estável são também apresentados. Esta estabilidade aumentada é fornecida por vários meios, que tratam especialmente as severas causas potenciais da desestabilização de PS, que são detalhadas a seguir.

Os termos estabilizado e estável são usados aqui como sinônimos.

Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma composição estável de PS contendo de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) fosfatidilserina.

Como já mencionado, as causas conhecidas principais da instabilidade de PS são atividade enzimática residual preparações de PS, bem como degradação química de PS, como descarboxilação, peroxidação de lipídios, e hidrólise dos ácidos graxos fosfolipídicos.

Assim, a composição estável de PS fornecida pela invenção não possui ou possui um mínimo de atividade enzimática, é quimicamente estável e estável em estocagem. Tais atributos são claramente demonstrados nos seguintes Exemplos.

Em uma modalidade da composição da invenção, a referida composição compreende de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) PS, preferivelmente de cerca de 2,5 a 80% (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) de outros ingredientes funcionais, preferivelmente de cerca de 5 a 90% (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) de fosfatidilcolína (PC), preferivelmente de cerca de 1 a 25% (p/p), preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) de fosfatidiletanolamina (PE), preferivelmente de cerca de 1 a 10% (p/p), de cerca de 0,1 a cerca de 99% (p/p) fosfatidilinositol (PI), preferivelmente de cerca de 0,5 a 10% (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) de fonte de Ômega-3, preferivelmente de cerca de 10 a 90% (p/p), de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) de fonte de Ômega-6, preferivelmente de cerca de 10 a 90% (p/p), e/ou de cerca de 1 a cerca de 99% (p/p) de esterol ou ésteres de esterol, preferivelmente de cerca de 1 a 65% (p/p).

Além disso, a composição da invenção é caracterizada pelo fato seu teor de ácido fosfatídico (PA) não passar de 15%. Preferivelmente, o teor de PA fica abaixo de 10%, mais preferivelmente entre 1 e 7%.

Em outra modalidade, a composição da invenção é caracterizada pelo fato de que não mais de cerca de 1 a cerca de 5% da fosfatidílserina ser decomposta após um período de estocagem de pelo menos 6 meses, preferivelmente de pelo menos 12 meses, mais preferivelmente pelo menos 24 meses.

Em outras palavras, peto menos 95% do teor original de PS da composição da invenção é preservada após um período de estocagem de pelo menos 6 meses, preferivelmente de pelo menos 12 meses, mais preferivelmente de pelo menos 24 meses. Preferivelmente, pelo menos 97% do teor original de PS é conservado após o referido período de estocagem, e mais preferivelmente pelo menos 99% do teor original de PS é conservado.

Em um modalidade particular da presente invenção, a composição substancialmente desprovida de atividade de fosfolipase, particularmente atividade de fosfolipase D. Por substancialmente é desprovida entendese que menos de 1 unidade/mL, preferivelmente menos de 0,1 unidade/mL ou mesmo 0,05 unidades/mL é a atividade enzimática residual máxima que pode ser encontrada na composição da invenção. Em termos práticos, esta quantidade de atividade enzimática residual é tão desprezível que se encontra quase no limite de ser mensurável, como demonstrado nos resultados mostrados na tabela 3.

O fosfolipase D (PLD) (Fosfatidilcolina fosfatidohidrolase, EC 3.1.4.4) usada na produção de PS como descrito pode ser obtida a partir de fontes animais, microbianas, fúngicas ou de plantas. Exemplos são PLD de repolho, PLD de Streptomyces sp., Streptomyces chromofuscus, etc. Usando uma preparação de PLD imobilizada, os presentes inventores foram capazes de minimizar ou mesmo evitar a presença desta enzima na preparação final de PS, minimizando ou evitando o risco de degradação contínua de PS pela enzima do processo.

Em outra modalidade particular, a composição de fosfatidilserina da presente invenção está na forma de pó. Como demonstrado no Exemplo 1, a preparação de PS obtida através do método de síntese empregado pe13 los inventores está na forma de pó.

Em outra modalidade, a PS contida na composição da invenção está na forma de um sal que é sibstancialmente solúvel em solventes orgânicos, particularmente sais de íons monovalentes, preferivelmente sal de sódio.

Preparações de fosfatidilserina enzimaticamente produzidas são usualmente produzidas como um sal de metais divalentes, no máximo da preferência, Ca⁺². Estes sais não são solúveis em muitos solventes orgânicos, como óleos, hexano e mesmo alcoóis. Os sais divalentes podem ser tornados solúveis em solventes orgânicos por utilização de diferentes técnicas, que vão do uso de misturas complexas de solventes, a utilização de diferentes aditivos e a troca salina. No último, os íons de metais divalentes são trocados com íons de metais monovalentes, como Na+. Isto é obtido expondo os sais divealentes de PS a um excesso dos íons monovalentes sob condições que favorecerão a troca. Além disso, pode-se usar quelantes metálicos seletivos, como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) ou EGTA. Estes quelantes deslocam o equilíbrio devido a seus altos coeficientes de associação aos metais divalentes, e Ca⁺² in particular. Os quelantes eliminam os íons Ca⁺²

Na presença de excesso de íons sódio que toma seu lugar nos sais de PS. Isto é realizado em um ambiente aquoso com 1 a 3 equivalentes dos quelantes metálicos em condições ambientes, e opcionalmente em temperaturas elevadas. O sal de sódio resultante é mais prontamente solúvel em solventes orgânicos.

Por substancialmente solúvel em solventes orgânicos entendese soluções de PS na faixa de 1% p/p a 40% e mesmo 60%, eu são factíveis e formam soluções transparentes.

Solventes orgânicos são, por exemplo, hexano, éter de petróleo, tolueno, etanol, óleos e gorduras (triglicerídeos), ésteres de etila de ácidos graxos, etc.

Em ainda outra modalidade, a PS incluída na composição da invenção está na forma de um sal que é substancialmente não solúvel em solventes orgânicos, particularmente sais de íons divalentes, preferivelmente um sal de cálcio. Altemativamente, pode também ser um sal de magnésio.

A composição da invenção pode ainda opcionalmente conter aditivos fisiologica/farmaceuticamente aceitáveis, como agentes de escoamento livre, emulsificantes, conservantes estabilizantes, colorantes, antiespumantes e agentes anticompactação, bem como diluentes, excipientes, e veículos.

Em ainda outra modalidade, a composição de fosfatidilserina da invenção é para uso como suplemento dietético, alimento nutracêutico e/ou como um aditivo de fármaco.

Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma preparação líquida estável de fosfatidilserina compreendendo a composição de fosfatidilserina da invenção em que a PS está presente na forma de um sal que é substancialmente solúvel em solventes orgânicos, dissolvido em um óleo, preferivelmente triglicerídeo de cadeia média. Preferivelmente, a referida PS dissolvida em óleo está na forma de um sal de sódio.

Em uma primeira modalidade, a preparação líquida da invenção compreende de cerca de 1 a cerca de 90% (p/p) de fosfatidilserina, preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 55% (p/p).

Em outra modalidade, a preparação líquida de fosfatidilserina da invenção é caracterizada pelo fato de não mais que cerca de 1 a cerca de 5% da fosfatidilserina é decomposta após um período de estocagem, de pelo menos 6 meses, preferivelmente de pelo menos 12 meses, mais preferivelmente de pelo menos 24 meses.

Similarmente à composição da invenção, isto significa que pelo menos 95% do teor original de PS da preparação líquida de PS da invenção é preservado após um período de estocagem de pelo menos 6 meses, preferivelmente pelo menos 12 meses, mais preferivelmente pelo menos 24 meses. Preferivelmente, pelo menos 97% do teor original de PS é preservado após o referido período de estocagem, e mais preferivelmente pelo menos 99% do teor original de PS é preservado.

Em outra modalidade, a preparação líquida de fosfatidilserina da âA invenção compreende ainda ingredientes biofuncionais adicionais, preferivelmente pelo menos um entre lecitína, fosfolipídios, vitaminas, antioxidantes, minerais, proteínas ou peptídeos nutricionais, esterol e outros derivados, carboidratos nutricionais e seus derivados, aminoácidos, extratos de plantas, produtos de fermentação, derivados de glícerídeos (mono- e díglicerídeos), ácidos graxos poliinsaturados, e lipídios ômega-3 e/ou ômega 6.

Em ainda outra modalidade, a preparação líquida de fosfatidilserina da invenção é para uso como suplemento dietético, alimento nutracêutico e/ou como aditivo de fármaco.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê uma dispersão estável de fosfatidilserina compreendendo a composição estável de fosfatidilserina da invenção, em que PS está presente na forma de um sal substancialmente não solúvel em solventes orgânicos disperso em uma base líquida. Preferivelmente, o referido sal é um sal de cálcio. Assim, a dispersão estável de PS é um sal de cálcio de PS disperso em uma base líquida, preferivelmente uma base lipídica, mais preferivelmente uma base oleosa. Alternativamente, a dispersão estável de PS é um sal da magnésio de PS disperso em uma base líquida, preferivelmente lipídica, mais preferivelmente uma base oleosa.

Em uma modalidade, a base lipídica pode ser óleo, ésteres de ácidos graxos, ácidos graxos livres e outros derivados.

As dispersões de fosfatidilserina em um veículo lípídico ou orgânico são caracterizadas pelo fato deste tipo de veículo não permitir solubilização completa da PS. Esse veículo pode ser um óleo comestível (por exemplo, produto de base triglicerídica, como óleo vegetal, óleo de peixe, etc.), um polímero orgânico, carboidratos e seus derivados, proteína e preparações peptídicas, etc.

A PS que não é solúvel no referido veículo é encontrado em forma cristalina em diferentes tamanhos de partícula. Nesta forma a PS é menos acessível a fatores de decomposição, como água, glicerol, enzima residual, e qualquer outro fator que requeira reação em nível molecular com a molécula de PS ou um de seus substituintes.

A dispersão de PS também pode ser obtida como uma forma sólida ou semí-sólida (forma com viscosidade extremamente alta). A natureza de sólido inibe adicionaimente ou retarda quaisquer processos de degradação química ou enzimática que possa resultar na redução de níveis de ingrediente ativo PS, meramente devido ao fato de que o perfil cinético de tais processos em fase sólida apresenta coeficientes de velocidade substancialmente mais baixos.

Alternativamente, a base líquida não é lipídica, e pode ser polímeros líquidos orgânicos ou inorgânicos, carboídratos líquidos, etc.

Preferivelmente, a referida dispersão de fosfatidilserina da invenção compreende de cerca de 1 a cerca de 70% (p/p) de fosfatidilserina, mais preferivelmente de cerca de 5 a 45% (p/p).

Os inventores produziram uma dispersão de PS ou uma PS fluida contendo 40% de PS, como mostrado nos Exemplos.

Um produto comum para suplementos dietéticos é uma PS fluida em óleo MCT com 20% p/p de PS. Isto permite a produção de cápsulas de softgel de 500mg com 100mg PS, a dose diária padrão e mais comum de PS correntemente disponível no mercado.

Para encapsulação em softgel, que é uma das formas mais populares de cápsulas hoje em dia, deve-se ter uma preparação fluida em condições ambiente ou em temperaturas que não excedam 35°C. Estas limitações aparecem da técnica e equipamento de encapsulação. Até agora não foi possível produzir PS fluida com mais de 20% de teor de PS. Parece vantajoso produzir PS fluida com concentrações mais altas de PS, já que isso permitirá menores tamanhos de cápsulas ou a adição de outros ingredientes à cápsula, sem necessidade de aumentar a cápsula ou aumentar o número de cápsulas diárias que uma pessoa precisa ingerir. Isto é vantajoso tanto do ponto de vista econômico, como por ser mais palatável para o usuário.

Os presentes inventores desenvolveram uma PS fluida que possui essas vantagens, sem comprometer sua estabilidade. Na presente invenção, sal de sódio de PS é solubilizado em hexano e acrescentado a um veículo oleoso, preferivelmente MCT. PC ou lecitina não é acrescentada e o montante de MCT usado é alterado resultando em uma forma muito mais concentrada de PS. Esta concentração fica acima da solubilidade do sal de sódio de PS em MCT e, portanto, parte da PS precipita. Conseqüentemente, a PS da formulação obtida é parcialmente solúvel e parcialmente dispersa, proporcionando propriedades de fluido, fácil manuseio e dosagem, bem como alta estabilidade.

Em uma modalidade preferida da dispersão de fosfatidilserina da invenção, a referida base oleosa é uma base triglicerídica, particularmente base triglicerídica de cadeia média ou óleo vegetal.

Em outra modalidade, a dispersão de fosfatidilserina da invenção contém ainda ingredientes biofuncionais adicionais, preferivelmente pelo menos um entre lecitina, fosfolipídios, vitaminas, antioxidantes, minerais, proteínas ou peptídeos nutricionais, esterol e outros derivados, carboidratos nutricionais e seus derivados, aminoácidos, extratos de plantas, produtos de fermentação, derivados de glicerídeos (mono- e diglicerídeos), ácidos graxos poliinsaturados, e lipídios ômega-3 e/ou ômega 6.

Em outra modalidade, a referida dispersão de fosfatidilserina da invenção é para uso como suplemento dietético, alimento nutracêutico e/ou aditivo de fármaco.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um produto alimentício contendo PS em qualquer uma das formas fornecidas pela invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS.

Em uma modalidade, o referido produto alimentício opcionalmente compreende ainda pelo menos um ingrediente biofuncional adicional, por exemplo, um ingrediente biofuncional como descrito acima.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica contendo, como agente ativo, PS em qualquer uma das formas fornecidas pela invenção, isto é, como uma composição de fosfatidilserina, como uma preparação líquida de PS ou como uma dispersão de PS, e opcionalmente contendo ainda pelo menos um agente ativo adicional e/ou pelo menos um aditivo, diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica da invenção pode conter agentes farmaceuticamente ativos adicionais.

A preparação das composições farmacêuticas é bem conhecida na técnica e foi descrita em muitos artigos e livros, ver, por exemplo, Remington*s Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Gompany, Easton, Pennsylvania, 1990, e especialmente as páginas 15211712 do mesmo.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em formas de unidades de dosagem. As formas de dosagem podem também incluir dispositivos de liberação controlada. As composições podem ser preparadas por qualquer método bem conhecido na técnica da farmácia. Tais formas de dosagem abrangem veículos fisiologicamente aceitáveis que são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. Exemplos de tais veículos incluem trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, como albumina do soro humano, substâncias tampão, como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais, água, sais, ou eletrólitos tais como sulfato de protamina, fosfato hidrogênio dissódico, fosfato hidrogênio potássico, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias baseadas em celulose, e PEG.

Administração oral é a rota preferida para administrar a composição farmacêutica da invenção, embora outras rotas possam também ser possíveis.

A composição farmacêutica pode ser administrada a um paciente com necessidade da mesma em uma única ou várias ocasiões. O montante efetivo para tratamento) jia composição da invenção é determinado pela severidade da condição em conjunto com os objetivos terapêuticos, a rota de administração e a condição geral do paciente (idade, sexo, peso e outras considerações conhecidas do médico assistente). Assim, será necessário que o médico titule a dosagem e modifique a rota de administração conforme requerido para obtenção do efeito terapêutico ótimo.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê uma cápsula

Μ contendo PS em qualquer uma das formas fornecidas pela invenção, isto é, como composição de fosfatidilserina, como preparação líquida de PS ou como dispersão de PS. A referida cápsula é, preferivelmente, uma cápsula macia de gelatina.

Como mencionado acima, PS foi correlacionada com a melhoria de humor e de memória, bem como com o desempenho cognitivo e capacidade de aprendizagem.

Assim, a presente invenção também provê o uso de qualquer uma das preparações de PS descritas na invenção, isto é, como composição de fosfatidilserina, como preparação líquida de PS ou como dispersão de PS, como um melhorador do desempenho cognitivo e da capacidade de aprendizagem.

É um outro aspecto subseqüênte da presente invenção prover PS, em qualquer uma das formas fornecidas pela invenção, isto é, como composição de fosfatidilserina, como preparação líquida de PS ou como dispersão de PS, para uso na prevenção de perda de memória, particularmente perda de memória relacionada à idade.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para preparação de composição estável de fosfatidilserina compreendendo as etapas de:

(a) incubar uma mistura aquosa de L-serina e opcionalmente solventes orgânicos apropriados com lecitina na presença de uma fosfolipase imobilizada por um período adequado de tempo para fornecer fosfatidilserina:

(b) remover a camada superior que contém a fosfatidilserina:

(c) obter a fosfatidilserina da referida camada superior removida por meios padrão;

(d) lavar a fosfatidilserina obtida na etapa (c) com uma solução aquosa apropriada para remover excesso de L-serina;

(e) lavar opcionalmente a fosfatidilserina obtida na etapa (d) com um solvente orgânico adequado, preferivelmente etanol em uma temperatura elevada; e (f) secar a fosfatidilserina obtida na etapa (e).

Em uma modalidade particular do processo da invenção, a referida fosfolipase é preferivelmente fosfolipase D.

Em outra modalidade do processo da invenção, o referido processo pode compreender a etapa de desativar qualquer atividade residual de fosfolipase na fosfatidilserina obtida por meios adequados.

Os referidos meios adequados podem ser (a) tratamento com EDTA, (b) incubação adicional com solventes orgânicos, preferivelmente metanol, etanol ou propanol, (c) desativação térmica, e/ou (d) adição de inibidores de PLD.

Em ainda outra modalidade preferida do processo da invenção, a referida fosfolipase é imobilizada em uma matriz insolúvel e é opcionalmente revestida com tensoativo, e, após a etapa (a), a mistura de reação é deixada ficar até a precipitação da fosfolipase.

As preparações de PLD imobilizadas podem ser usadas quando o processo é realizado em meio orgânico ou meio aquoso, ou em misturas dos mesmos, também conhecidas como sistemas bifásicos.

Na etapa (a) do processo acima descrito, a lecitina é adicionada a uma solução aquosa de L-serina, opcionalmente na presença de solventes orgânicos adequados que auxiliam na dispersão e/ou solubilização da lecitina na mistura de reação. A mistura é preferivelmente agitada por um período adequado de tempo, preferivelmente cerca de 1 hora, para dispersar homogeneamente os fosfolipídios no meio de reação.

A reação enzimática em si é realizada por um período adequado de tempo, preferivelmente pelo menos 12 horas, sob agitação, e a mistura de reação é, então deixada em repouso.

A camada superior da reação, contendo a fração de fosfolipídios, é obtida por técnicas padrão, como, por exemplo, centrifugação, filtração, fittração por pressão, decantação, etc. A fosfatidilserina resultante é lavada adicionalmente com uma solução aquosa apropriada, para remover qualquer excesso de L-serina, e seca, para obter fosfatidilserina que substancialmente não possui atividade de fosfolipase.

3ο

Onde preparações de PLD imobilizadas foram usadas na produção de PS, em formulações em pó ou fluidas, as formulações finais de PS apresentaram estabilidade superior em comparação com formulações de PS comercialmente disponíveis, como evidenciado por atividade enzimática residual mínima. Vazamento de enzima de preparação imobilizada é um fenômeno altamente comum, devido a degradação mecânica da matriz ou imobilização insuficiente. Para evitar este problema, os inventores empregaram outras etapas para desativar qualquer atividade enzimática presente na PS final. Estas etapas adicionais incluem:

(i) desativação de enzima via incubação com solventes orgânicos, preferivelmente metanol, etanol ou propanol, o qualquer outro solvente orgânico que seja capaz de inativar a enzima, em temperaturas elevadas (até 120°C);

(ii) desativação térmica;

(iii) adição de aditivos que inativa, a enzima, como por exemplo, tratamento com EDTA; (iv) adição de inibidores de PLD.

Tratamento da preparação de PS com inibidores de enzima ou com reagentes seletivos que removem co-fatores como íons Ca⁺², é preferivelmente realizado em meio aquoso para assegurar a acessibilidade de tais inibidores ou reagentes à enzima residual ou aos co-fatores solúveis em água.

Tratamento com quelantes seletivos para íons metálicos, como, mas não restritos a ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) e seus sais e derivados correspondentes resulta na ligação seletiva de íons Ca⁺², tomando-os inacessíveis a qualquer enzima residual. Assim, mesmo se enzima residual está presente na preparação ela não será capaz de exercer qualquer atividade de transfosfatidilação ou hidrolítica devido a falta do co-fator essencial.

A preparação de PS tratada com um sal de EDTA apropriado é lavada adicionalmente com soluções aquosas frescas e obtida porfiltração e subseqüente secagem.

Preferivelmente, a preparação de PS é obtida por extração a um meio orgânico.

O referido meio orgânico pode ser composto de solvente orgânico ou uma mistura de solventes orgânicos ou um sistema lipídico, como óleo, ésteres de etila de ácidos graxos, ácidos graxos livres, triglicerídeos parcialmente hidrolisados, etc. Adicionalmente, o referido meio orgânico pode conter ambos, solvente orgânico e veículos lipídicos, em diferentes proporções. Usualmente, MCTs são usados como veículo lipídico. No caso em que um solvente orgânico, como hidrocarboneto, é usado na extração da preparação de PS tratada, o referido solvente é depois removido por técnicas padrão.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para preparo de uma preparação líquida de fosfatidilserina de base oleosa, estável, compreendendo a etapa de dissolver em uma base oleosa adequada, a composição de fosfatidilserina da invenção em que a PS está presente na forma de um sal que é substancialmente solúvel em solventes orgânicos, dissolvido em um óleo, preferivelmente um triglicerídeo de cadeia média. Preferivelmente, o referido PS dissolvido em um óleo está na forma de um sal de sódio. Preferivelmente, a referida base oleosa é constituída de triglicerídeos de cadeia média ou de um óleo vegetal.

Em um último aspecto, a presente invenção provê um processo para preparo de uma dispersão de base líquida estável de fosfatidilserina compreendendo a etapa de dispersar a composição de fosfatidilserina da invenção, em que a PS está presente na forma de um sal substancialmente não-solúvel em solventes orgânicos, dissolvido em um óleo, preferivelmente um triglicerídeo de cadeia média, e em que preferivelmente a referida PS dissolvida em óleo está na forma de um sal de cálcio, em uma base oleosa adequada, preferivelmente base triglicerídica, particularmente de triglicerídeos de cadeia média ou óleo vegetal. Deve ser notado que outros ingredientes podem ser adicionados a esta preparação líquida, para enriquecer a mistura. Por exemplo, o teor de fosfatidilcolina pode ser aumentado por adição de mais lecitina.

Assim, a PS produzida pelos processos da invenção é obtida em

3223 forma estabilizada de pó ou como uma preparação líquida de base oleosa, ambas substancialmente sem atividade de fosfolipase.

A presente invenção também provê a composição estável de fosfatidilserina sempre que preparada por qualquer um dos processos descritos acima.

Em suma, acredita-se que vários mecanismos, conhecidos e desconhecidos, sejam a causa da degradação de PS. Entre os mecanismos conhecidos, os seguintes podem ser destacados:

(1) hidrólise enzimática e transfosfatidilação, fornecendo PA ou PG; (2) hidrólise parcial ou total dos ácidos graxos fosfotipídicos, fornecendo liso-PS ou PS desacilada (GPS) correspondentemente; (3) remoção do grupo fosfato, fornecendo diglicerídeos (DAG); (4) descarboxilação de grupo carboxilato de L-serina para fornecer PE ou outros produtos mais complexos; (5) hidroperoxidação de fosfolipídios; e (6) oxidação do grupo amina primária do grupo principal L-serina, causada por ar, luz, etc.

Com relação a aminas, e aminas primárias em particular, elas são altamente sensíveis à oxidação. Os produtos dessa oxidação são numerosos e sua identificação é quase impossível. Assim, PS estabilizada que é capaz de suportar oxidação de amina foi produzida pela incorporação de aditivos caracterizados pela sua capacidade de proteger grupos químicos sensíveis da oxidação. Estes aditivos, que possuem características antioxidativas foram adicionados a PS em pó, bem como a PS fluida, e especialmente a PS fluida encapsulada em cápsulas de softgel. As últimas são extremamente susceptíveis à degradação de PS. Os antioxidantes usados consistiram em extrato de Rosemary, tocoferóis e palmitato de ascorbila em níveis de 0-5000 ppm, e BHA, BHT e TBHQ em níveis de 0-200 ppm. Outros antioxidantes ou misturas de antioxidantes, sintéticos ou naturais, são incorporados nesta invenção. Os níveis de antioxidantes usados para proteger a PS de degradação são de pelo menos 100 ppm, e preferivelmente de 10003000 ppm. Estas cápsulas, bem como seu material volumoso, foram analisadas em temperatura ambiente e em testes acelerados para verificar sua estabilidade. O material volumoso foi armazenado em um recipiente vedado em um local escuro em temperatura ambiente.

Em suma, as preparações estabilizadas de PS desta invenção se mostraram particularmente estáveis em termos de degradação enzimática, obtida pelo uso de biocatalisadores imobilizados, desativação de enzimas residuais, e o uso de inibidores enzimáticos.

A estabilidade de PS gerada pelos métodos descritos aqui foi analisada através da monitoração dos diferentes produtos de degradação de cada rota de degradação, listadas acima. A presença destes produtos foi medida por 31P-NMR, e métodos cromatográficos comuns (HPTLC, HPLCELSD, e GC). Em todos os casos não foi detectada nenhuma elevação na presença de tais marcadores de degradação, levando à conclusão de que não ocorreu nenhuma destas rotas de degradação, fornecendo uma PS altamente estável.

Assim, a presente invenção fornece preparações de fosfatidilserina estáveis em qualquer uma das três formas, composição de matéria, líquida ou dispersão, que são resistentes à degradação por pelo menos uma das seguintes rotas: hidrólise enzimática e transfosfatidilação, hidrólise parcial ou completa dos ácidos graxos fosfolipídicos, remoção do grupo fosfato, descarboxilação do grupo carboxilato de L-serina, hidroperoxidação de fosfolipídios, oxidação do grupo amina primária do grupo principal de L-Serina.

Divulgada e descrita,deve ser entendido que esta invenção não é limitada a exemplos particulares, etapas de processo e materiais, aqui divulgados, já que essas etapas de processo em materiais podem variar um pouco. Deve ainda ser entendido que a terminologia usada aqui é utilizada para a finalidade de descrever modalidades particulares somente e não pretende ser limitativa já que o escopo da presente invenção somente será limitada pelas reivindicações anexas e equivalentes das mesmas.

Deve ser notado que, neste relatório e reivindicações anexas, as formas singulares um, uma, o, a incluem referentes no plural, a não ser que o conteúdo claramente indique o contrário.

Neste relatório e nas reivindicações a seguir,a não ser que o contexto exija o contrário, a palavra compreende, e variações como comΜ preendem e compreendendo serão entendidas como implicando na inclusão de um inteiro ou etapa, ou grupo de inteiros ou etapas especificados, mas sem a exclusão de qualquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas.

Os seguintes exemplos são representativos de técnicas empregadas pelos inventores na realização de aspectos da presente invenção. Deve ser apreciado que enquanto estas técnicas são exemplares de modalidades preferidas para a prática da invenção, os versados na técnica, à luz da presente divulgação, reconhecerão que numerosas modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo pretendido da invenção. Exemplos

Exemplo 1 - Preparo de fosfatidilserina estável em pó usando uma preparação de enzima imobilizada

1. Preparo da enzima imobilizada

Nesta invenção os inventores utilizaram vários PLDs comercialmente disponíveis, como Fosfolipase D de Streptomyces sp., repolho, e Streptomyces chromofuscus. Em todos os casos, estas enzimas apresentaram alta reatividade e PS de alta qualidade foi sintetizada. Mais importante, os níveis de ácido fosfatídico eram usualmente baixos (dados nãomostrados).

Vários PLDs foram imobilizados por diferentes técnicas e usando diferentes matrizes insolúveis como veículos. Fosfolipase imobilizada em matriz, preferivelmente revestida com tensoativo, foi preparada de acordo com os métodos descritos em WOOO/56869, totalmente incorporada aqui por referência. Matrizes insolúveis comercial mente disponíveis, projetadas para imobilização enzimática covalente, foram também usadas, como matrizes ativadas por epóxi Eupergit (Rohm and Haas, Germany).

Em resumo, enzima PLD bruta (300mg/l de proteína) foi dissolvida em 1L de tampão Tris pH 6,5, contendo 4 g de matriz inorgânica ou orgânica insolúvel (Celite, sílica-gel, alumina ou polipropileno). A solução foi agitada vigorosamente com um agitador magnético por 30 minutos a 25°C. Para preparos de enzima imobilizada revestida com tensoativo, um tensoati35 vo não-iônico foi adicionado em gotas à solução de enzima agitada. Tanto fosfolipases imobilizadas revestidas com tensoativo quanto fosfolipases brutas imobilizadas foram submetidas a ultra-som por 10 minutos e agitadas por 8 horas a 25°C. O precipitado resultante foi coletado por filtração ou centrifu5 gação (12000 rpm, 4°C), seguindo por congelamento de um dia para o outro a -20°C e líofílização.

Como mostrado na tabela 1, estas preparações de PLD imobilizada produziram com sucesso fosfatidilserina por transfosfatidilação de lecitina com L-serina. D-serina

Pode também ser usada para estas preparações. Rendimento de PS foi sempre superior a 30%. Diferentes graus de PS podem ser produzidos dependendo do material de partida de lecitina. Mais importante, as preparações de PLD imobilizada apresentaram alta atividade independente do material de partida de lecitina empregado no processo (dados não15 mostrados).

2. Preparação de PS estável 250 g de L-serina (Rexim, França) foram colocados em um reator de 1 litro cheio com 750 ml de tampão apropriado (pH 3,5-7), por exemplo tampão de citrato, contendo 200mM de CaCb. Após dissolução completa da serina, 53 g de lecitina de soja fracionada (Solae Company, USA) foram acrescentados, opcionalmente com outros solventes orgânicos, como hexano, acetato de etila, dietil éter, etc., para auxiliar na dispersão dos fosfolipídios. A mistura foi agitada em temperaturas de 20-60°C por 0,5-2 horas, para dispersar homogeneamente o fosfolipídio no meio de reação. 1,25 g de preparação enzimática (Reação 2, PLD2, tabe25 Ia 1) foram adicionados ao meio de reação. A mistura de reação foi agitada por 24 horas e então deixada sem agitação até a preparação enzimática precipitar no fundo do reator. A camada superior, contendo a fração fosfolipídica, foi removida do reator. A fosfatidilserina foi obtida desta fração e lavada com soluções aquosas apropriadas para remover o excesso de serina.

A fosfatidilserina obtida era praticamente isenta de traços de enzima, principalmente devido ao fato de que a enzima foi imobilizada.

Deste preparo, 47 g de fosfatidilserina foram obtidos com mais de 30% de pureza. Este procedimento foi repetido com as preparações enzimáticas mostradas na Tabela 1 (1, 2, 3 e 4, respectiva mente). Rendimentos foram os indicados para a primeira batelada. As preparações enzimáticas imobilizadas foram re-utilizadas em outras bateladas (2^a, 3^a, e 4^a, respecti5 vamente) e os resultados obtidos são também sumariados na Tabela 1.

Tabela 1 - Preparações de PLD imobilizada, condições de reação e rendi* mento de PS

Reação	Enzima	Matriz	Temperatura de reação (QC)	% PS em cada batelada
1a	2a	3a	4a
1	PLD1	Eupergit 1014F	42	31	61
2	PLD2	Duolite A568	42	39	45	47	43
3	PLD1	Duolite A568	42	46	45	44	55
4	PLD1	Duolite A568	37	39	44	43	44

Exemplo 2 - Desativação da Enzima

A. Solventes orgânicos . 10 Para desativar qualquer enzima residual que possa ter vazado da matriz insolúvel, a PS obtida descrita no Exemplo 1 foi vigorosamente agitada na presença de um solvente orgânico de desativação, preferivelmente metanol ou etanol, em temperaturas na faixa de 20°C a 120°C, por períodos apropriados de tempo na faixa de 0,5 a 10 horas.

O solvente orgânico pode dissolver a PS, assegurando acesso total do solvente a qualquer enzima residual encontrada na PS. O solvente orgânico selecionado não dissolve totalmente a PS, e assim cria um processo tipo trituração permitindo que o solvente dissolva somente pequenas quantidades de PS, o que assegura a desativação de qualquer enzima resi20 dual. Nestas condições, após a finalização do processo de desativação, a PS foi filtrada e seca. Quando o solvente orgânico usado na desativação dissolveu quanidades significativas de PS, a PS foi obtida após a realização do tratamento de desativação por técnicas padrão como remoção de solvente e secagem, opcionalmente com secagem por atomização. Estes trata25 mentos significativamente reduziram a decomposição tanto de preparações líquidas de PS como de PS em pó. Para PS em pó, a concentração inicial de

3?

PS foi de cerca de 22%, e nenhuma alteração significativa foi observada após 4 meses de estocagem. Para PS líquida, a concentração inicial de PS foi de cerca de 22,67 %, e novamente nenhuma alteração significativa (uma redução de 0,02%) foi observada após 4 meses de estocagem.

A Tabela 2 descreve a redução na atividade enzimática em função do tempo de desativação, após desativação com solvente orgânico (etanol) com aquecimento.

Tabela 2 - desativação do solvente orgânico com aquecimento

Duração do aquecimento (80°C) em horas	Atividade residual de enzima (unidades/ml)
1	0,0458
2	0,0248
4	0,0088
4,5	0,0082
5	0,0067

A Tabela 3 descreve 3 bateladas de PS preparadas pelos inven10 tores, mostrando atividade enzimática residual extremamente baixa.

Tabela 3 - Comparação entre três preparações de PS

Número da preparação de PS	Atividade enzimática residual nas preparações de Enzymotec (unidades/ml)
1	0,0054
2	0,0058
3	0,0042

* Limite de detecção do método : 0,002 - 0,003 unidade/mi

Em seguida, os inventores analisaram outras preparações de PS produzidas por diferentes fabricantes de PS. Os inventores descobriram que a atividade enzimática residual de PLD era consideravelmente superior comparada com a atividade enzimática residual da PS preparada pelos inventores. Por exemplo, uma dessas preparações estranhas de PS apresentou 0,0242 e 0,0196 unidades/ml em duas bateladas de preparações de PS de tipo similar.

B. Desativação de enzima através de EDTA - preparação de fosfatidilserina líquida estável

A PS em pó obtida no Exemplo 1 foi dispersa em uma solução 0,2M de EDTA em mistura 1:1 água : etanol, e agitada por 10 horas a 25°C. Em seguida, a fosfatidilserina foi extraída com 250 ml de n-hexano. A camada de n-hexano foi lavada duas vezes com água. MCT (95 g) foi adicionada à solução de n-hexano e após evaporação do n-hexano, foi obtido um fluido oleoso transparente de formulação de fosfatidilserina.

PS em pó é obtida pelo processo do Exemplo 1 como um sal de cálcio, que não é solúvel em solventes orgânicos. Tratamento com EDTA desempenha um papel duplo nesta PS. De um lado, ele torna a PS solúvel em solventes orgânicos, por eliminação dos íons Ca⁺², que são substituídos por Na⁺, conseqüentemente tornando PS solúvel, e assim a forma líquida é obtida. Ao mesmo tempo, como Ca⁺² é o co-fator para atividade catalítica de PLD, a redução de Ca⁺² resulta na inativação de enzima residual.

A preparação de PS tratada com o sal de EDTA apropriado foi adicionalmente lavada com soluções aquosas frescas, e a PS obtida por filtração e subseqüente secagem.

A PS resultante pode ser obtida em forma de pó estabilizado ou como preparação líquida de base oleosa estabilizada de fosfatidilserina, ambas substancialmente sem atividade de fosfolipase.

A PS fluida, tratada com EDTA, foi mantida em um recipiente vedado em um local fresco e escuro. Concentração de PS foi analisada através de HPLC com detector de ELS, e através de ³¹P-NMR.

A Tabela 4 mostra a concentração de PS medida logo após sua fabricação e após 4 meses de estocagem monitorada.

Tabela 4 - Estabilidade de PS após tratamento com EDTA (pós-tratamento com solvente orgânico)

Descrição de produto	Duração da estocagem	Concentração de PS quando fabricada (%)	Concentração de PS após estocagem (%)
PS fluida	4 meses	22,67	22,65

Exemplo 3 - Determinação de Atividade de Fosfolipase D

Atividade de Fosfolipase D foi testada por espectrofotometria usando um método modificado reportado por S. Kato et al. [Kato, S. et al.

(1984) Agric. Biol. Chem., 48, 2181-2188].

(1) Definição de unidade de enzima

Uma unidade de enzima de fosfolipase D é definida como a quantidade de uma enzima que libera um micromol de Colina em um minuto a partir do substrato sob as condições especificadas abaixo.

(2) Reagentes

1. Emulsão a 5% de lecitina de soja (Epikuron 200, fosfatidilcolina 95%)

2. Emulsão a 5% de preparação de Fosfatidilserina

3. 0,1 mol/l de tampão Tris-maleato-NaOH, pH 5,5

4. 0,1 mol/l de solução de cloreto de cálcio

5. Solução a 7,5% de Triton X-100

6. 0,05 mol/l de EDTA em 1 mol/l de tampão Tris-HCl, pH 8,0

7. Reagente colorante: 3 unidades de Colinaoxidase (de Alcaligenes sp.), 6 unidades de peroxidase (de rábano-silvestre), 1 mg de fenol e 0,6 mg de 4-amino-antipirina em 4 ml de 50 m de mol/l de tampão HepesNaOH (pH 7,4).

8.1,43 pmol/ml (0,2 g/l) Solução padrão de cloreto de colina

9. 0,01% de solução enzimática (3) Procedimento

As seguintes soluções foram preparadas:

Solução A: Em um tubo de teste, 0,1 ml de emulsão de lecitina de soja a 5% e emulsão de fosfatidilserina a 5%, 0,1 ml de tampão 0,1 mol/l de Tris-maleato-NaOH (pH 5,5), 0,05 ml de solução 0,1 mol/l de cloreto de cálcio e 0,15 ml de solução Triton X-100 a 7,5% foram bem misturados e incubados por 5 min em um banho de água a 37°C. A esta solução, foi adicionado 0,1 ml de solução de enzima, e exatamente após 10 minutos, foram acrescentados 0,2 ml de solução de EDTA e o tubo de incubação colocado em água fervente por 5 min. O tubo foi então removido e resfriado à temperatura ambiente.

Solução B: Em um tubo de teste, 0,1 ml de emulsão de fosfatidilserina a 5%, 0,1 ml de tampão de 0,1 mol/l de Tris-maleato-NaOH (pH 5,5),

0,05 ml de solução 0,1 mol/l de cloreto de cálcio e 0,15 ml de solução Triton X-100 a 7,5% foram bem misturados e incubados por 5 min em um banho de água a 37°C. A esta solução, foi adicionado 0,1 ml de solução de enzima, e exatamente após 10 minutos de incubação, foram acrescentados 0,2 ml de solução de EDTA e o tubo colocado em água fervente por 5 min. O tubo foi então removido e resfriado à temperatura ambiente.

Solução de Controle: Água destilada.

Solução Padrão - Solução padrão de cloreto de colina respectivamente em vez da solução de enzima.

ml de reagente colorante foi então acrescentado a cada uma das quatro soluções, bem misturadas e incubadas por 20 minutos a 37°C. Densidade óptica da reação, bem como das soluções padrão, foram lidas a 500 nm (caminho de luz 1 cm) contra a solução de controle.

(4) Cálculo da Unidade de Enzima

Atividade de Fosfolipase D (unidade por ml) = (ΔΕ da Solução AΔΕ da solução Β)/ ΔΕ do padrão X 0,143. ΔΕ : densidade óptica a 500 nm contra solução de controle.

Exemplo 4 - Preparação de fosfatidilserina estável em forma de pó usando enzima não-imobilizada e desativação de enzima

250 g de L-serina foram adicionados a um reator de 1 litro cheio com 750 ml de tampão apropriado (pH 3,5-7), como tampão de citrato, por exemplo, contendo 200 mM CaCI₂. Após dissolução completa da serina, foram acrescentados 53 g de lecitina de soja fracionada, opcionalmente com outros solventes orgânicos para auxiliar na dispersão dos fosfolipídios. A mistura foi agitada em temperaturas de 20-60°C por 0,5-2 horas, para dispersar homogeneamente o fosfotipídio no meio de reação. 1,25 g de enzima (PLD) foi acrescentada ao meio de reação. A mistura de reação foi agitada por 24 horas. A camada superior contendo os fosfolipídios foi removida do reator. A fosfatidilserina foi obtida desta camada e então lavada com soluções aquosas. A fosfatidilserina foi adicionalmente tratada com um solvente orgânico, preferivelmente metanol ou etanol, em temperaturas elevadas por pelo menos 0,5 hora, para desativar quaisquer traços de enzima. A fosfatidil47 serina foi obtida por filtração ou remoção de solvente e seca. O rendimento da fração fosfolipídica final foi de 47 g, dos quais mais de 60% consistia em PS. A PS produzida também foi usada na produção de preparação fluida (ver abaixo). Tanto a preparação fluida quanto a em pó foram analisadas quanto à estabilidade do produto.

Após desativação da enzima, PS fluida (dissolvida em MCT) e em pó foram mantidas em recipientes vedados em um local fresco e escuro. A concentração de PS foi analisada usando HPLC equipada com detector de ELS, e também através de ³¹P-NMR pré- e pós-estocagem. Após 7 meses de estocagem (para PS fluida) ou 7,5 meses (para PS em pó), praticamente nenhuma (ou menos que 1 %) degradação ocorreu após o tratamento de desativação (através de solvente orgânico e temperatura elevada).

Exemplo 5 - Dispersões de PS

Dispersões de PS estabilizadas foram preparadas por dispersão da fosfatidilserina estabilizada (preferivelmente substancialmente sem atividade de fosfolipase), em uma base oleosa adequada, preferivelmente base triglicerídica e particularmente de triglicerídeos de cadeia média (como MCT ou ésteres de etila de óleo de peixe) ou óleo vegetal em uma temperatura na faixa de temperatura ambiente até 80°C, e resultaram em uma dispersão de PS estabilizada de base oleosa. A dispersão foi obtida por agitação vigorosa, homogeinização, homogeinização com pressão, e outros métodos de mistura industrial.

Estas formulações foram verificadas quanto à estabilidade da fosfatidilserina como um ingrediente ativo em massa e em cápsulas de softgel.

- Preparo de cápsulas de softgel

PS disperso foi preparado como descrito acima e usado na fabricação de cápsulas de softgel, que foram preparadas por método de rotina para preparo de cápsulas de softgel. As cápsulas contendo PS disperso foram armazenadas em três condições diferentes : (1) em recipientes vedados em um local escuro em temperatura ambiente; (2) em recipientes vedados a 35°C e 60% de umidade relativa (condições aceleradas); e (3) em recipientes aber33 tos a 35°C e 60% de umidade relativa (condições aceleradas). As cápsulas armazenadas em temperatura ambiente (condição 1) foram testadas quanto a sua concentração de PS no final do processo de fabricação e após um período de estocagem de 4 semanas. As cápsulas armazenadas em condições aceleradas (2 e 3) foram testadas quanto a sua concentração de PS no final do processo de fabricação e após períodos de estocagem de 1, 2, 3 e 4 semanas. A concentração de PS foi analisada usando HPLC com detector de ELS e/ou HPTLC, e através de 31P-NMR. A Tabela 5 mostra a concentração de PS nas diferentes cápsulas.

Tabela 5: Estabilidade de PS em cápsulas de softgel contendo preparações de PS dispersas

Amostra e condição de estocagem	Concentração de PS préestocagem (*)	Concentração de PS pós- estocagem
1 semana	2 semanas	3 semanas	1 mês
Cápsulas de dispersão a TA	13,26	n.d.	n.d.	n.d.	13,15
Cápsulas de dispersão em condições aceleradas em um recipiente vedado	13,26	13,04	n.d.	n.d.	13,28
Cápsulas de fluido nãoestabilizado em TA	18,67	n.d.	n.d.	n.d.	17,56
Cápsulas de fluido nãoestabilizado em condições aceleradas em um recipiente vedado	18,67	17,87	n.d.	17,04	15,07
Cápsulas de fluido nãoestabilizado em condições aceleradas em um recipiente aberto	18,67	n.d.	17,9	17,3	n.d.

(*) Concentrações de PS são em %. Abreviações : n.d., (não realizado).

Além da concentração de PS, o teor de água e glicerol foram também testados na cápsula no final da fabricação. Como mencionado aci15 ma, água e glicerol, absorvidos pelo conteúdo da cápsula, podem promover a degradação de PS. O teor de água foi testado por um método de KarlFischer padrão. O teor de glicerol foi testado por titulação de acordo com um método padrão da AOCS (American Oil Chemists Society). A Tabela 6 mos34 tra o teor de água e glicerol em cápsulas fabricadas a partir de PS em dispersão e cápsulas fabricadas a partir de PS fluida.

Tabela 6: Teor de água e glicerol em cápsulas fabricadas a partir de PS em dispersão ou fluida.

Amostra (cápsula de)	Teor de água (%)	Teor de glicerol (%)
PS em dispersão	0,5	0,12
PS fluida	1,7	1,43

Foi verificado que na realidade as preparações em dispersão foram também efetivas em minimizar a migração e adsorção de água e glicerol pelo conteúdo de PS da cápsula. Isto, além de outros meios descritos acima, fornece uma PS estabilizada na cápsula.

Exemplo 6 - Outras PS em fase sólida

Fosfatidilserina estabilizada é também fornecida criando preparações de PS que são fluidas somente em temperaturas elevadas e são sólidas em temperatura ambiente. Desta forma todas as reações de degradação são inibidas.

Isto foi obtido por diferentes meios:

(a) usando diferentes sais de PS, como sal de cálcio ou de sódio, criando semidispersão;

(b) usando óleos comestíveis que são sólidos à temperatura ambiente e fluidos o bastante em temperaturas elevadas para permitir o processo de encapsulação; ou (c) usando diferentes aditivos de endurecimento.

A preparação de fosfatidilserina obtida nos exemplos acima (2 g) foi misturada com fosfatidilserina tratada com a solução de EDTA e lavada com n-hexano (80g) como descrito acima. Lecitina de soja (12,26 g) e PKO (26,45 g) foram adicionados à solução. O n-hexano foi evaporado a 45°C. O material final é um óleo turvo que é fluido a 45°C e sólido em temperatura ambiente.

Exemplo 7 - Aditivos estabilizantes / antioxidantes / fotossensibilizantes

Como mencionado acima, vários mecanismos ou fenômenos são considerados como causa da degradação de PS, entre os quais estão :

(1) Hidrólise enzimática e transfosfatidilação, fornecendo PA ou PG;

(2) Hidrólise parcial ou completa dos ácidos graxos fosfoiipídi5 cos, fornecendo liso-PS ou PS desacilada (GPS) correspondentemente;

(3) Remoção do grupo fosfato, fornecendo diglicerídeos (DAG);

(4) Descarboxilação do grupo carboxilato de L-serina para fornecer PE ou outros produtos mais complexos; .

(5) Hidroperoxidação dos fosfolipídios;

(6) Oxidação do grupo amina primária do grupo principal de Lserina (por ar, luz, etc.)

- Degradação resultando em liso-PS, DAG e PE

Por exemplo, uma cápsula de softgel contendo a PS estabilizada produzida pelo método da invenção foi analisada quanto a diferentes marca15 dores de degradação após 4 meses de estocagem em condições ambiente (isto é, temperatura ambiente e umidade não controlada). Níveis de liso-PS (0,68% em p/p), DAG (0,35% em p/p) e PE (0,79% em p/p) foram desprezíveis, indicando que nenhuma das rotas de degradação que levam a tais subprodutos ocorreu.

- Degradação resultando em subprodutos PA e PG

Os métodos analíticos acima mencionados foram também usados para verificar a estabilidade das preparações de PS produzidas pelo método da invenção em termos de degradação enzimática. Supõe-se que esta rota de degradação forneça subprodutos como PA e PG. Após 4 meses de estocagem em condições ambiente, níveis de PA e PG estavam idênticos aos níveis pré-estocagem (apôs produção de PS), em 2,58 e 0,2 % em p/p, respectivamente. Já que nenhum aumento nestes produtos foi detectado, pôde ser concluído que a PS da invenção realmente não possui qualquer atividade enzimática que possa levar a sua decomposição.

- Hidroperoxidação

Outra causa de produtos inferiores é a hidroperoxidação de lipídios, que leva à decomposição de compostos sensíveis como PS. Esta oxi4½ dação é altamente dependente do método de produção do material e dos tratamentos que o material sofreu. A indicação principal desta oxidação é um valor denominado Valor de Peróxido (PV)) que é usualmente medido por titulação como os equivalentes de peróxidos em uma amostra do material.

As preparações de PS da invenção foram analisadas cuidadosamente quanto ao seu valor de peróxido inicial bem como valores de peróxidos em desenvolvimento. Esta análise foi realizada em duas preparações de PS: aquela tratada para desativação da enzima e opcionalmente tratada com inibidores de enzima, como EDTA; bem como as preparações produzi10 das usando enzimas imobilizadas. Os resultados mostrados abaixo (Tabela 7) demonstram a alta estabilidade da PS da invenção em termos de estabilidade oxidativa, como resultado do método de produção de PS e subsequentes tratamentos de desativação de enzima.

Tabela 7 Estabilidade oxidativa de PS

Amostra	PV pré-estocagem (meqC>2/kg)	Tempo de estocagem	PV pós-estocagem (meqO2/kg)
Cápsula oriunda de PS fluida	0	42 [sic]	0
PS fluida	0	296 dias	0,58
PS em pó	2,16	178 dias	2,18

Pode ser visto que seguindo o método de produção descrito nesta invenção e os vários tratamentos subseqüentes, nenhum aumento nos Valores de Peróxido foi detectado, confirmando a estabilidade das preparações de PS da invenção com relação à hidroperoxidação.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Dispersão estável de fosfatidilserina (PS) em uma base oleosa, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de fosfatidilserina, a referida composição compreendendo de cerca de 1 a cerca de

2. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com a reivindicação

3. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que não mais do que cerca de 5 % da fosfatidilse15 rina é decomposta após um período de estocagem de pelo menos 24 meses.

4. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é substancialmente desprovida de atividade de fosfolipase, particularmente atividade de fosfoli20 pase D.

5 um aditivo, diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

5. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o referido sal de PS é sal de cálcio ou sal de magnésio.

5 70 % (p/p) de fosfatidilserina, em que a referida fosfatidilserina está na forma de sal que é insolúvel em um óleo de triglicerídeos comestível, em que não mais do que cerca de 5% da fosfatidilserina é decomposta após um período de armazenamento de pelo menos 6 meses.

6. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma 25 das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende de cerca de 5 % a 45 % (p/p) de fosfatidilserina.

7. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido óleo de triglicerídeos comestível é um óleo de triglicerídeos de cadeia média ou um

30 óleo vegetal.

8. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que é para uso como

Petição 870180026769, de 03/04/2018, pág. 6/13 suplemento dietético, e/ou alimento nutracêutico.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a dispersão de fosfatidilserina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e opcionalmente compreende ainda pelo menos

10. Cápsula, caracterizada pelo fato de que contém a dispersão de fosfatidilserina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a referida cápsula é preferivelmente uma cápsula macia de gelatina.

10 1, caracterizada pelo fato de que não mais do que cerca de 5 % da fosfatidilserina é decomposta após um período de estocagem de pelo menos 12 meses.

11. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma 10 das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é para uso como melhorador do desempenho cognitivo e da capacidade de aprendizagem.

12. Dispersão de fosfatidilserina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção de perda de memória, particularmente perda de memória relaciona15 da com a idade.

Petição 870180026769, de 03/04/2018, pág. 7/13