BRPI0403964B1 - Formulações líquidas estáveis, artigo manufaturado e uso dessas formulações para o tratamento de disfunção mediada por ige - Google Patents
Formulações líquidas estáveis, artigo manufaturado e uso dessas formulações para o tratamento de disfunção mediada por ige Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0403964B1 BRPI0403964B1 BRPI0403964-5A BRPI0403964A BRPI0403964B1 BR PI0403964 B1 BRPI0403964 B1 BR PI0403964B1 BR PI0403964 A BRPI0403964 A BR PI0403964A BR PI0403964 B1 BRPI0403964 B1 BR PI0403964B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- antibody
- protein
- antibodies
- formulation
- cells
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
- A61M5/178—Syringes
- A61M5/20—Automatic syringes, e.g. with automatically actuated piston rod, with automatic needle injection, filling automatically
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Abstract
formulações líquidas estáveis, artigo manufaturado e métodos de tratamento de disfunção mediada por ige o presente pedido refere-se a formulações de proteína e anticorpo altamente concentradas com viscosidade reduzida que são estáveis, relativamente isotônicas e são de baixa turbidez. as formulações são particularmente apropriadas para administração subcutânea. o pedido descreve ainda artigos manufaturados que contêm essas formulações e método de sua utilização para o tratamento de disfunções que podem ser tratadas pelo anticorpo ou proteína formulada.
Description
A presente invenção refere-se a formulações altamente concentradas de anticorpos, que são particularmente apropriadas para administração subcutânea. A presente invenção fornece ainda formulações líquidas estáveis e altamente concentradas (por exemplo, >100 mg/ml de proteína).
Existe demanda significativa para formulações de anticorpos líquidos em alta concentração. Entretanto, as formulações de proteínas altamente concentradas apresentam diversos problemas. Um problema é a instabilidade devido à formação de particulados. Com preparações liofilizadas reconstituídas para gerar formulações líquidas, este problema foi abordado através do uso de tensoativos (tais como polissorba- to), mas tensoativos são inadequados para formulações líquidas, pois e- les dificultam o processamento adicional. Além disso, os tensoativos também não reduzem a maior viscosidade causada como resultado de numerosas interações intermoleculares da natureza macromolecular de anti-corpos.
Embora os tensoativos tenham exibido redução significativa do grau de formação particulada de proteínas, eles não abordam o problema da maior viscosidade que dificulta a manipulação e administração de formulações de anticorpos concentrados. Os anticorpos tendem a formar soluções viscosas sob alta concentração devido à sua natureza macromolecular e potencial para interações intermoleculares. Além disso, açúcares farmaceuticamente aceitáveis são fre- qüentemente utilizados em grandes quantidades como estabilizantes. Esses açúcares podem aumentar as interações moleculares, de forma a aumentar a viscosidade da formulação. Formulações altamente viscosas são de difícil fabricação, deposição em seringa e injeção subcutânea. O uso da força na manipulação das formulações viscosas gera formação de espuma excessiva, que pode gerar desnaturação e desativação da biologia ativa. Falta solução satisfatória deste problema.
Embora o estado da técnica indique numerosos exemplos de excipientes que podem ser empregados adequadamente para criar formulações farmacêuticas, muito poucas proteínas foram formuladas com sucesso acima de 100 mg/ml ou possuem técnicas para tanto descritas.
Os depositantes descobriram que arginina, especificamente 10 arginina-HCI, é particularmente apropriada para formulações de anticorpos ou proteínas líquidas em alta concentração.
Formulações de proteínas liofilizadas isotônicas estáveis encontram-se descritas no documento WO 97/04801, publicado em 13 de fevereiro de 1997, cujo relatório descritivo é expressamente incorporado ao 15 presente como referência. As formulações liofilizadas descritas podem ser reconstituídas para gerar formulações líquidas com alta concentração de proteína sem perda aparente de estabilidade. Entretanto, as questões potenciais associadas à alta viscosidade das formulações reconstituídas não são abordadas. A agregação de proteínas foi reduzida anteriormente através 20 da adição de açúcares, mas isso aumenta dramaticamente a viscosidade e a osmolaridade, de forma a tornar impraticáveis o processamento e o uso.
O documento WO 02/30463, publicado em 18 de abril de 2002, descreve formulações com alta concentração de proteínas, mas baixa viscosidade, atingidas: 1) através de baixo pH (cerca de 4,0 a 5,3); 2) alto pH 25 (cerca de 6,5 a 12,0) ou 3) aumento da resistência iônica total da formulação através da adição de sais ou tampões. Entretanto, embora a maior resistência iônica realmente reduza a viscosidade da formulação (tal como com NaCI), ela também pode resultar em solução mais turva, o que é freqüentemente associado à formação de partículas de proteínas (por exemplo, agregação). Desta forma, formulação ideal com alta concentração de proteínas deve superar os desafios de estabilidade, viscosidade, osmolaridade e turbidez.
A presente invenção aborda formulações de anticorpos ou proteínas, com alta concentração, que são estáveis e com baixa viscosidade e turbidez.
Particularmente, a presente invenção refere-se a formulações de anticorpos com alta concentração e baixa turbidez que compreendem proteína 10 ou anticorpo (100 a 260 mg/ml), histidina (10 a 100 mM), arginina-HCI (50 a 200 mM) e polissorbato (0,01% a 0,1%), que possuem pH de 5,5 a 7,0, viscosidade de 50 cs ou menos e osmolaridade de 200 mOsm/kg a 450 mOsm/kg. Alternativamente, a proteína ou anticorpo nas formulações pode variar de 120 a 260 mg/ml, alternativamente 150 a 260 mg/ml, alternativamente 15 180 a 260 mg/ml, alternativamente 200 a 260 mg/ml de proteína ou anticorpo.
Alternativamente, a osmolaridade varia de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg. Alternativamente, a concentração de arginina-HCI varia de 100 a 200 mM, alternativamente de 150 a 200 mM, alternativamente de 180 a 200 mM.
Alternativamente, a presente invenção refere-se a formulações de 20 anticorpos com alta concentração e baixa turbidez que compreendem anticorpo (40 a 150 mg/ml), histidina (10 a 100 mM), açúcar (tal como trehalose ou sacarose, 20 a 350 mM) e polissorbato (0,01% a 0,1%).
Em realização específica, a presente invenção fornece uma formulação que contém altas concentrações de proteínas com grande peso 25 molecular, tais como anticorpos ou imunoglobulinas. Os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos dirigidos contra um antígeno específico previamente determinado. Em aspecto específico, o antígeno é IgE (por exemplo, rhuMAbE- 25 e rhuMAbE-26 descritos na Patente US 6.329.509 e no documento WO 99/01556). Alternativamente, o anticorpo anti-lgE pode ser CGP-5101 (Hu-901) descrito em Corne et al, J. Clin. Invest.99 (5): 879-887 (1997), documento WO 92/17207 e Depósitos ATTC n° BRL-10706 e 11130, 11131, 11132 e 11133. Alternativamente, o antígeno pode incluir: as proteínas CD CD3, CD4, CD8, 5 CD19, CD20, CD34 e CD40; membros da família de receptores HER tais como receptor EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; 2C4, 4D5, PSCA, LDP-2, moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mad, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e αv/β3 integrina, que incluem as suas subunidades α e β (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tais como VEGF; antígenos de grupos sangüíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor mp/; CTLA-4 e proteína C.
As formulações de acordo com a presente invenção podem ser formulações farmacêuticas. Em aspecto específico, a formulação é fornecida por via subcutânea.
Em ainda outra realização, a presente invenção fornece um método de tratamento, profilático ou terapêutico, de disfunções que podem ser tratadas pela proteína ou anticorpo formulado, que compreende a administração das formulações descritas no presente que compreendem quantidade terapeuticamente eficaz da proteína ou anticorpo. Estas formulações são particularmente úteis para administração subcutânea. Em aspecto específico, a disfunção é disfunção mediada por IgE. Em ainda outro aspecto específico, a disfunção mediada por IgE é rinite alérgica, asma (tal como asma alérgica e asma não alérgica), dermatite atópica, gastroenteropatia alérgica, hipersensibilidade (tal como analfilaxia, urticária, alergias alimentares etc.), aspergilose broncopulmonar alérgica, doenças parasíticas, cistite intersticial, síndrome de hiper-lgE, ataxia-telangiectasia, síndrome de Wiskott- Aldrich, alinfoplasia tímica, mieloma de IgE e reação de enxerto contra hospedeiro.
Em ainda outra realização, a presente invenção fornece um artigo manufaturado que compreende um recipiente que inclui uma formulação descrita no presente. Em um aspecto, o artigo manufaturado é uma seringa previamente cheia. Em ainda outro aspecto específico, a seringa previamente 5 cheia contém adicionalmente um dispositivo de injeção. Em ainda outro aspecto específico, o dispositivo de injeção é um autoinjetor.
Figura 1: cromatografia de interação hidrofóbica de um anticorpo monoclonal anti-lgE digerido por pepsina. As amostras foram formuladas em 10 diferentes pH e tampões: (•) 20 mM de acetato, (Δ) 20 mM de succinato, (A) 20 mM de Na2HPO4, (A) 20 mM de K2PO4 e (*) 20 mM de tampão Tris. As amostras foram armazenadas a 30 °C por seis meses.
Figura 2: cromatografia de exclusão de tamanhos de anticorpo monoclonal anti-lgE armazenado a 40 °C por seis meses. As amostras foram 15 formuladas em diferentes pH e tampões: (■) 20 mM de glutamato, (•) 20 mM de acetato, (Δ) 20 mM de succinato, (□) 20 mM de histidina, (À) 20 mM de Na2HPO4, (▼) 20 mM de K2PO4 e (*) 20 mM de tampão Tris.
Figura 3: atividade de anticorpo monclonal anti-lgE armazenado a 30 °C por seis meses. Amostras foram formuladas em diferentes pH e tampões: 20 (•) 20 mM de acetato, (Δ) 20 mM de succinato, (□) 20 mM de histidina, (A) 20 mM de Na2HPO4, (▼) 20 mM de K2PO4 e (*) 20 mM de tampão Tris.
Figura 4: efeitos de polissorbato 20 sobre a turbidez do anticorpo monoclonal anti-lgE tensionado. Amostras contêm 100 mg/ml de anticorpo, 20 mM de succinato, 192 mM de trehalose e várias quantidades de polissorbato 25 20 sob pH 6,0. As concentrações de polissorbato são (■) 0, (A) 0,01%, (•) 0,02% e (Δ) 0,05%.
Figura 5: turbidez de anticorpo monoclonal anti-lgE a cerca de 150 mg/ml com diferentes excipientes (A) CaCI2l (V) MgCI2 e (Δ) arginina-HCI.
Figura 6: turbidez de anticorpo monoclonal anti-lgE a cerca de 150 mg/ml com vários excipientes. As amostras foram armazenadas a (▲) -70 °C, (■) 2 a 8 °C, (Δ) 15 °C, (□) 30 °C e (V) 40 °C.
Figura 7: análises por cromatografia de interação hidrofóbica de 5 anticorpo monoclonal anti-lgE digerido por papaína. Amostras foram formuladas a cerca de 150 mg/ml com vários excipientes e armazenadas a (▼) -70 °C, (■) 2 a 8 °C, (À) 15 °C, (Δ) 30 °C e (□) 40 °C.
Figura 8: cromatografia de exclusão de tamanho de anticorpo monoclonal anti-lgE a cerca de 150 mg/ml em (■) 200 mM de arginina-HCI, 23 10 mM de histidina, pH 6,0; (À) 182 mM de arginina-HCI, 20 mM de histidina, pH 6,0; (•) 182 mM de arginina-HCI, 20 mM de histidina, 91 mM de sacarose, pH 6,0; (□) 50 mM de MgCI2, 27 mg/ml de trehalose, 0,01% de acetato; (Δ) 50 mM de MgCI2, 30 mM de MgAc2, 0,01% de acetato e (o) 50 mM de MgCI2, 45 mM de MgAc2, 0,01% de acetato. As amostras foram armazenadas a 30 °C por seis 15 meses.
Figura 9: análises de cromatografia de interação hidrofóbica de anticorpo monoclonal anti-lgE digerido por papaína. As amostras exibidas foram formuladas em (■) 200 mM de arginina-HCI, 23 mM de histidina, (À) 182 mM de arginina-HCI, 20 mM de histidina, (•) 182 mM de arginina-HCI, 20 mM 20 de histidina, 91 mM de sacarose, (□) 50 mM de MgCI2, 27 mg/ml de trehalose, 0,01% de acetato, (Δ) 50 mM de MgCI2, 30 mM de MgAc2, 0,01% de acetato e (o) 50 mM de MgCI2, 45 mM de MgAc2, 0,01% de acetato. As amostras foram armazenadas a 30 °C por seis meses.
Figura 10: exibe comparação das seqüências de comprimento 25 total (tanto cadeias variáveis como constantes) dos anticorpos anti-lgE E25, E26 e Hu-901. As regiões de CDR de Hu-901 são exibidas sublinhadas. Para E25 e E26, as regiões de CDR, conforme definido por Chothia, são exibidas em negrito, enquanto a região de CDR, conforme definido por Kabat, é delineada com parênteses. A Figura 1OA exibe as seqüências de cadeia leve de E25, E26 e Hu-901 (SEQ ID N° 1 a 3), enquanto a Figura 10B exibe as seqüências de cadeia pesada de E25, E26 e Hu-901 (SEQ ID N° 4 a 6).
Por "proteína”, indica-se uma seqüência de aminoácidos para os quais o comprimento de cadeia é suficiente para produzir os níveis mais altos de estrutura terciária e/ou quaternária. Desta forma, as proteínas são diferenciadas dos “peptídeos" que também são moléculas com base em 10 aminoácidos que não contêm essa estrutura. Tipicamente, uma proteína para uso no presente possuirá peso molecular de pelo menos cerca de 15 a 20 kD, preferencialmente pelo menos cerca de 20 kD.
Exemplos de proteínas englobadas na definição do presente incluem proteínas de mamíferos, tais como hormônio do crescimento, incluindo 15 hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; fator de liberação de hormônio do crescimento; hormônio da paratireóide; hormônio estimulante da tireóide; lipoproteínas; α-1-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; proinsulina; hormônio estimulante dos folículos; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores coagulantes, tais como 20 fator VIIIC, fator IX, fator de tecido e fator von Willebrands; fatores anticoagulantes tais como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo dos pulmões; ativador plasminogênio, tal como uroquinase ou ativador plasminogênio do tipo de tecido (t-PA, tal como Activase®, TNKase®, Retevase®); bombazina; trombina; fator de necrose tumorosa α e β; encefalinase; RANTES (célula T normalmente regulada na ativação expressa e segregada); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-1-α); albumina do soro, tal como albumina do soro humano; substância inibidora mulleriana; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró-relaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongos; DNAse; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores do crescimento; integrina; proteína A ou D; fatores reumatóides; fator neurotrófico, tal como fator neurotrófico derivado de ossos (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 5 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6) ou fator de crescimento dos nervos, tal como NGF- β; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastas, tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF), tal como TGF-ot e TGF-β, incluindo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 ou TGF-β5; fator I e II de crescimento similar a insulina (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-l (IGF-I do cérebro); proteínas de ligação de fator de crescimento similar a insulina; proteínas CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina (EPO); trombopoietina (TPO); fatores osteoindutivos; imunotoxinas; proteína morfogenética dos ossos (BMP); interferona, tal como interferona-α, β e y; fatores estimulantes de colônias (CSFs), tais como M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), tais como IL-1 a IL-10; superóxido dismutase; receptores de células T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração da deterioração (DAF); antígeno virai, tal como uma parte do envelope contra a AIDS; proteínas de transporte; receptores domésticos; adressinas; proteínas reguladoras; imunoadesinas; anticorpos; e fragmentos ou variantes biologicamente ativas de quaisquer dos polipeptídeos relacionados acima.
A proteína que é formulada é preferencialmente essencialmente pura e desejavelmente essencialmente homogênea (ou seja, livre de proteínas contaminantes). Proteína “essencialmente pura" indica uma composição que 25 compreende pelo menos cerca de 90% em peso da proteína, com base no peso total da composição, preferencialmente pelo menos cerca de 95% em peso. Proteína ‘‘essencialmente homogênea" indica uma composição que compreende pelo menos cerca de 99% em peso de proteína, com base no peso total da composição.
Em certas realizações, a proteína é um anticorpo. O anticorpo pode ligar-se, por exemplo, a qualquer das moléculas mencionadas acima. Exemplos de alvos moleculares para anticorpos englobados pela presente 5 invenção incluem IgE, as proteínas CD CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 e CD40; membros da família de receptores HER, tais como receptor EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; 2c4, 4D5, PSCA, LDP-2, moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mad, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e αv/β3 integrina, incluindo as suas subunidades α e β (tais como anticorpos anti- 10 CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tais como VEGF; antígenos de grupos sangüíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade; receptor mpl, CTLA-4 e proteína C.
O termo “anticorpo”, da forma utilizada no presente, inclui anticorpos monoclonais (que incluem anticorpos de comprimento total que 15 contêm região Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos, diacorpos e moléculas de cadeia simples, bem como fragmentos de anticorpos (tais como Fab, F(ab’)2 e Fv)). O termo “imunoglobulina” (lg) é utilizado de forma intercambiável com “anticorpo” no presente.
A unidade de anticorpo de quatro cadeias básica é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Um anticorpo IgM consiste de cinco das unidades heterotetraméricas básicas com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J e contém dez locais de ligação de antígenos, enquanto 25 os anticorpos IgA compreendem de duas a cinco das unidades de quatro cadeias básicas que podem polimerizar-se para formar conjuntos polivalentes em combinação com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de quatro cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também contém as pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia H contém, no terminal N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e y e quatro domínios CHpara os isotipos p e ε. Cada cadeia L contém, no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por domínio constante na sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1)-Acredita-se que residues de aminoácidos específicos formem superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. O emparelhamento de VH e VL entre si forma um local de ligação de antígenos isolado. Para estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology,oitava edição, Daniel P. Sties, Abba I. Terr e Tristram G. Parsolw (eds.), Appleton & Lange, Norwalk CT, Estados Unidos, 1994, pág. 71 e capítulo 6.
A cadeia L de qualquer espécie de vertebrados pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH), imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que contêm cadeias pesadas denominadas α, δ, ε, y e p, respectivamente. As classes y e p são adicionalmente divididas em subclasses com base nas diferenças relativamente pequenas na seqüência e função de CH; seres humanos, por exemplo, expressam as subclasses a seguir: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2.
O termo ‘'variável"refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensamente de sequência entre os anticorpos. O domínio V media a ligação de antígenos e define a especificidade de um anticorpo específico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade não é distribuída regularmente ao longo de todo o conjunto dos domínios 5 variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de estiramentos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) com cerca de quinze a trinta resíduos de aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade denominadas "regiões hipervariáveis” ou, às vezes, "regiões de determinação de complementaridade" (CDRs) que contêm cerca de nove a doze resíduos de aminoácidos de comprimento cada uma. Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem quatro FRs cada uma, adotando em grande parte configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam circuitos que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD, Estados Unidos (1991)). Os domínios constantes não são envolvidos diretamente na ligação de anticorpo a antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
A expressão “região hipervariável” (também conhecida como “regiões de determinação de complementaridade” ou CDRs), quando utilizada 25 no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que estão (normalmente três ou quatro regiões curtas de extrema variabilidade de seqüências) dentro do domínio de região V de uma imunoglobulina que formam o local de ligação de antígenos e são os principais determinantes da especificidade de antígenos. Existem pelo menos dois métodos de identificação dos resíduos de CDR: (1) uma abordagem baseada na variabilidade de seqüências em espécies cruzadas (ou seja, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda MS, Estados Unidos, 1991)); e (2) abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos de antígeno e anticorpo (Chothia, C. et al, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Entretanto, até o ponto em que duas técnicas de identificação de resíduos definem regiões de sobreposição, mas não regiões idênticas, elas podem ser combinadas para definir CDR híbrida.
A expressão "anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-tradução (tais como isomerizações e amidações) que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um local antigênico isolado. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque são sintetizados pelo cultivo de hibridomas, não contaminados por outras imunoglobulinas. O adjetivo “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados, por exemplo, através do método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser fabricados através de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais" também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por 5 exemplo, em Clackson et al, Nature,352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).
Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos “quiméricos’’ (imunoglobulinas), em que uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em 10 anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencentes a uma classe ou subclasse especifica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade 15 biológica desejada; Patente US 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos “primitizados" que compreendem seqüências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não humanos (tais como Macaco do Velho Mundo, chimpanzé etc.) e seqüências de região 20 de contato humanas.
Um anticorpo “intacto" é aquele que compreende um local de ligação de antígenos, bem como CL e pelo menos os domínios de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. OS domínios constantes podem ser domínios constantes de seqüência nativa (tais como domínios constantes de seqüência 25 nativa humana) ou suas variantes de seqüências de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções efetoras.
“Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de anticorpo intacto, preferencialmente a região variável e/ou de ligação de antígenos do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab’)2 θ Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide a Patente Norte- Americana n° 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al, Protein Eng.,8 (10): 1057- 1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos 5 multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação de antígenos, denominados fragmentos ‘'Fab", e um fragmento "Fc” residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalização rápida. O fragmento Fab consiste de uma cadeia L inteira juntamente com o 10 domínio de região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia epsada (Cn1). Cada fragmento Fab é monovalente com relação à ligação de antígenos, ou seja, contém um local de ligação de antígenos isolado. O tratamento com pepsina gera um único fragmento F(ab’)2 grande corresponde, de forma geral, a dois fragmentos de Fab ligados por dissulfeto 15 que possuem atividade de ligação de antígenos diferente e ainda é capaz de reticular antígeno. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab porque contêm alguns resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1, que incluem uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpos. Fab-SH é a denominação do presente para Fab’ na qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos 20 domínios constantes contêm um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab’ que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
O fragmento Fc compreende as porções carbóxi-terminais das 25 duas cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por seqüências na região Fc, que também é reconhecida por receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e ligação de antígenos completo. Este fragmento consiste de um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e outro de cadeia pesada em associação firme e não covalente. A partir da dobra desses dois domínios, emanam seis circuitos hipervariáveis (três circuitos cada da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antígenos e conferem especificidade de ligação de antígenos para o anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade menor que 10 todo o local de união.
“Fv de cadeia isolada”, também abreviado “sFv" ou “scFv”, são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos VH e VL conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo sFv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre 15 os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígenos. Para análise de sFv, vide Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore, eds. (Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, 1994), págs. 269-315.
O termo "diacorpos" designa fragmentos de anticorpos pequenos 20 preparados através d construção de fragmentos de sFv (vide parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de cinco a dez resíduos) entre os domínios VH e VL, de tal forma que seja atingido o emparelhamento intercadeias mas não intracadeias dos domínios V, de forma a resultar em fragmento bivalente, ou seja, fragmento que contém dois locais de ligação de antígenos. Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv “cruzados", nos quais os domínios VH e VL dos dois anicorpos estão presentes em cadeias de polipeptídeos diferentes. Os diacorpos são descritos em maiores detalhes, por exemplo, na Patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993).
Um anticorpo que "se liga especificamente a" ou “é específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo sobre um polipeptídeo específico é aquele que se liga àquele polipeptídeo específico ou epítopo sobre 5 polipeptídeo específico, sem ligar-se substancialmente a nenhum outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
A expressão “fase sólida" indica uma matriz não aquosa à qual pode aderir-se o anticorpo de acordo com a presente invenção. Exemplos de fases sólidas englobadas no presente incluem as formadas parcial ou 10 completamente de vidro (por exemplo, vidro de poros controlados), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas realizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender a cavidade de uma placa de ensaio; em outros, é uma coluna de purificação (por exemplo, coluna de cromatografia de afinidade). Esta expressão também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tais como as descritas na Patente US 4.275.149.
As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subseqüências 20 de anticorpos que ligam antígenos) principalmente de seqüências humanas, que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em que resíduos de uma região hipervariável (também CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de 25 uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que apresenta a capacidade, afinidade e especificidade desejada. Em alguns casos, os resíduos de região estrutural (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, “anticorpos humanizados", da forma utilizada no presente, podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor, nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais e otimizar o desempenho do anticorpo. Idealmente, o anticorpo 5 humanizado também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para maiores detalhes, vide Jones et al, Nature321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
“Anticorpo dependente de espécie”, tal como anticorpo anti-lgE humano de mamíferos, é um anticorpo que possui afinidade de ligação mais forte para um antígeno de primeira espécie de mamífero que para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente de espécie “liga-se especificamente"a um antígeno humano (ou seja, possui valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais de cerca de 1 x 10’7 M, alternativamente não mais de cerca de 1 x 10’8 M, alternativamente não mais de cerca de 1 x 10~9 M), mas possui afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humana que é pelo menos cerca de cinqüenta vezes, pelo menos cerca de 20 quinhentas vezes ou pelo menos cerca de mil vezes mais alerta que a sua afinidade de ligação para o antígeno não humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser de qualquer dos vários tipos de anticorpos definidos acima, mas é preferencialmente um anticorpo humano ou humanizado.
As "funções efetoras" de anticorpos designam as atividades 25 biológicas atribuíveis à região Fc (região Fc de sequência nativa ou região Fc com variação de seqüência de aminoácidos) de um anticorpo e variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos das funções efetoras de anticorpos incluem: citotoxicidade dependente de complemento e ligação de C1q; ligação de receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores de superfície celular (por exemplo, receptores de células B); e ativação de células B.
“Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos” ou “ADCC" designa uma forma de citotoxicidade, em que lg segregado e ligado a receptores de Fc (FcRs) presentes sobre certas células citotóxicas (por exemplo, Células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que essas células efetoras citotóxicas liguem-se especificamente a uma célula alvo que apresente antígenos e subseqüentemente matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos “armam" as células citotóxicas e são necessários para matar a célula alvo através deste mecanismo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de Fc sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991). Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode-se realizar teste de ADCC in vitro,tal como descrito na Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o descrito em Clynes et al, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).
"Receptor de Fc" ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que liga um anticorpo de IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA ("receptor de ativação”) e FcyRIIB ("receptor de inibição"), que possuem seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplásmicos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplásmico. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplásmico (vide Daêron, M., Annu. Rev. Immunol.15: 203-234 (1997)). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR” no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol.117: 587 (1976) e Kim et al, J. Immunol.24: 249 (1994)).
"Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células MNK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, tal como sangue.
“Citotoxicidade dependente de complemento" ou “CDC" designa a lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação do processo 25 clássico de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados ao seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
“Isolado”, quando utilizado para descrever os vários polipeptídeos e anticorpos descritos no presente, indica um polipeptídeo ou anticorpo que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado de um componente do seu 5 ambiente de produção. Preferencialmente, o polipeptídeo isolado é livre de associação com todos os demais componentes do seu ambiente de produção. Os componentes contaminantes do seu ambiente de produção, tais como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente interfeririam nos usos em diagnóstico ou terapêuticos para o 10 polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N-terminal através do uso de um seqüenciador de xícaras de agitação ou (2) até a homogeneidade por SDS- 15 PAGE sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Normalmente, entretanto, um anticorpo ou polipeptídeo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.
Uma molécula de ácido nucleico “isolada” que codifica os 20 polipeptídeos e anticorpos do presente é uma molécula de ácido nucleico isolada que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual é normalmente associada no ambiente no qual foi produzida. Preferencialmente, o ácido nucleico isolado é livre de associação com todos os componentes associados ao ambiente de produção. As moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos do presente encontram-se em forma diferente da forma ou ambiente no qual são encontradas na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são diferenciadas, portanto, do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos e anticorpos do presente que existem naturalmente nas células.
A expressão "seqüências de controle” designa seqüências de DNA necessárias para a expressão de seqüência de codificação ligada operativamente em organismo hospedeiro específico. As seqüências de 5 controle que são apropriadas para procariotes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência de operadores, e um local de ligação de ribossomos. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de adenilação e amplificadores.
Ácido nucleico é “ligado operativamente” quando é colocado em 10 relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. DNA para uma seqüência prévia ou líder de secreção, por exemplo, é ligado operativamente a DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de proteína prévia que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificador é ligado operativamente a uma seqüência de codificação caso afete a transcrição da 15 seqüência; ou um local de ligação de ribossomo é ligado operativamente a uma seqüência de codificação caso seja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, “ligado operativamente" indica que as seqüências de DNA sendo ligadas são contíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Os amplificadores, entretanto, não necessitam ser 20 contíguos. A ligação é obtida através de ligação em locais de restrição convenientes. Caso estes locais não existam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.
A expressão “marcado por epítopo”, quando utilizada no presente, 25 designa um polipeptídeo quimérico que compreende um polipeptídeo ou anticorpo descrito no presente como fundido a um “polipeptídeo de marca”. O polipeptídeo de marca contém resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual pode ser fabricado um anticorpo, mas é suficientemente curto para não interferir com a atividade do polipeptídeo ao qual é fundido. O polipeptídeo de marca também é, de preferência, razoavelmente exclusivo, de forma que o anticorpo não apresenta reação cruzada substancial com outros epítopos. Os polipeptídeos de marca apropriados contêm geralmente pelo 5 menos seis resíduos de aminoácidos e normalmente cerca de 8 a 50 resíduos de aminoácidos (preferencialmente, cerca de dez a vinte resíduos de aminoácidos).
Da forma utilizada no presente, o termo “imunoadesina” designa moléculas similares a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de 10 proteína heteróloga (“adesina”) com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem fusão de seqüência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente do local de ligação e reconhecimento de antígenos de um anticorpo (ou seja, é "heterólogo”) e uma seqüência de 15 domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma seqüência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o local de ligação de um receptor ou ligante. A seqüência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como subtipos lgG-1, lgG-2, IgG- 20 3 ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM. As fusões de lg incluem preferencialmente a substituição de um domínio de um polipeptídeo ou anticorpo descrito no presente no lugar de pelo menos uma região variável em uma molécula lg. Em realização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões de articulação, CH2 e CH3 ou as regiões de 25 articulação, CH1, CH2 e CH3 de uma molécula lgG1. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também a Patente US 5.428.130, emitida em 27 de junho de 1995.
Formulação "estável" é aquela em que a proteína retém essencialmente a sua estabilidade físico-química e integridade durante a armazenagem. Várias técnicas analíticas de medição da estabilidade de proteínas são disponíveis na técnica e analisadas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, Nova 5 lorque, Estados Unidos, Pubs. (1991) e Jones, A., Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser medida sob temperatura selecionada por período de tempo selecionado. Para seleção rápida, a formulação pode ser mantida a 40 °C por duas semanas a um mês, quando é medida a estabilidade ao longo do tempo. Quando a formulação necessitar ser armazenada a 2 até 8 10 °C, geralmente a formulação deverá ser estável a 30 °C ou 40 °C por pelo menos um mês e/ou estável a 2 até 8 °C por pelo menos dois anos. Quando a formulação necessitar ser armazenada a 30 °C, geralmente a formulação deverá ser estável por pelo menos dois anos a 30 °C e/ou estável a 40 °C por pelo menos seis meses. A extensão da agregação durante a armazenagem 15 pode ser utilizada, por exemplo, como indicador da estabilidade da proteína. Desta forma, formulação “estável" pode ser aquela em que menos de cerca de 10% e, preferencialmente, menos de cerca de 5% da proteína estão presentes na forma de agregado na formulação. Em outras realizações, pode ser determinado qualquer aumento da formação de agregados durante a 20 armazenagem da formulação.
Formulação “reconstituída" é aquela que foi preparada através da dissolução de proteína liofilizada ou formulação de anticorpo em diluente tal que a proteína através dela. A formulação reconstituída é apropriada para administração (tal como administração parenteral) a um paciente a ser tratado 25 com a proteína de interesse e, em certas realizações da presente invenção, pode ser aquela que seja apropriada para administração subcutânea.
Formulação "isotônica"é aquela que possui essencialmente a mesma pressão osmótica do sangue humano. As formulações isotônicas geralmente possuirão pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. O termo “hipotônico” descreve uma formulação com pressão osmótica abaixo do sangue humano. Conseqüentemente, o termo "hipertônico” é utilizado para descrever uma formulação com pressão osmótica acima do sangue humano. A 5 isotonicidade pode ser medida utilizando, por exemplo, osmômetro do tipo congelamento de gelo ou pressão de vapor. As formulações de acordo com apresente invenção são hipertônicas como resultado da adição de sal e/ou tampão.
Formulação “reconstituída” é aquela que foi preparada através da 10 dissolução de formulação de proteína liofilizada em diluente tal que a proteína seja dispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é apropriada para administração (tal como administração parenteral) a um paciente a ser tratado com a proteína de interesse e, em certas realizações da presente invenção, pode ser aquela que seja apropriada para administração 15 subcutânea.
"Ácido farmaceuticamente aceitável" inclui ácidos orgânicos e inorgânicos que são não tóxicos à concentração e na forma em que são formulados. Os ácidos inorgânicos apropriados incluem, por exemplo, clorídrico, perclórico, bromídrico, iodídrico, nítrico, sulfúrico, sulfônico, sulfínico, 20 sulfanílico, fosfórico, carbônico etc. Os ácidos orgânicos apropriados incluem alquila, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, saturados, insaturados, mono, di e tricarboxílicos de cadeia linear e ramificada, que incluem, por exemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butil acético, antranilico, propanóico, 2- 25 hidroxipropanóico, 2-oxopropanóico, propanodióico, ciclopentanopropiônico, ciclopentanopropiônico, 3-fenilpropiônico, butanóico, butanodióico, benzóico, 3- (4-hidroxibenzoil)benzóico, 2-acetóxi-benzóico, ascórbico, cinâmico, lauril sulfúrico, esteárico, mucônico, mandélico, succínico, embônico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malônico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glícônico, glucônico, pirúvico, glioxálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, ftálico, palmóico, palmeico, tiociânico, metanossulfônico, etanossulfônico, 1,2- etanodissulfônico, 2-hidroxietanossulfônico, benzenossulfônico, 4- 5 clorobenzenossulfônico, naftaleno-2-sulfônico, p-toluenossulfônico, canforsulfônico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, glucoheptônico, 4,4’-metilenobis-3-(hidróxi-2-eno-1-carboxílico) e hidroxinaftóico.
"Bases farmaceuticamente aceitáveis” incluem bases orgânicas e inorgânicas que são não tóxicas na concentração e na forma em que são 10 formuladas. As bases apropriadas incluem, por exemplo, as formadas a partir de metais formadores de bases inorgânicas, tais como lítio, sódio, potássio, magnésio, cálcio, amónio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio, N- metilglucamina, morfolina, piperidina e bases não tóxicas orgânicas, que incluem amina primária, secundária e terciária, aminas substituídas, aminas 15 cíclicas e resinas de troca de íons básicos (tais como N(R')4+ (em que R’ é independentemente H ou CMalquila, tal como amónio, Tris)), tais como resinas de isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, 20 etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, poliamina e similares. As bases não tóxicas orgânicas particularmente preferidas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina e cafeína.
Ácidos e bases farmaceuticamente aceitáveis adicionais que 25 podem ser utilizados com a presente invenção incluem aqueles que são derivados dos aminoácidos, tais como histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina e asparagina.
Sais e tampões "farmaceuticamente aceitáveis” incluem os derivados de sais de adição de ácidos e bases dos ácidos e bases indicados acima. Tampões e/ou sais específicos incluem histidina, succinato e acetato.
“Lioprotetor" é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, evita ou reduz significativamente a instabilidade física e/ou química da proteína durante a liofilização e subseqüente armazenagem. Exemplos de lioprotetores incluem açúcares e seus álcoois de açúcar correspondentes; um aminoácido tal como glutamato monossódico ou histidina; metilamina, tal como betaína; sal liotrópico, tal como sulfato de magnésio; poliol, tal como álcoois de açúcar tri-hídricos ou com peso molecular mais alto, 10 tais como glicerina, dextran, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propileno glicol; polietileno glicol; Pluronics®; e suas combinações. Exemplos adicionais de lioprotetores incluem glicerina e gelatina e os açúcares melibiose, melezitose, rafinose, manotriose e estaquiose. Exemplos de açúcares redutores incluem glicose, maltose, lactose, maltulose, iso-maltulose e 15 lactulose. Exemplos de açúcares não redutores incluem glicosídeos não redutores de compostos poli-hidróxi selecionados a partir de álcoois de açúcar e outros poliálcoois de cadeia linear. Os álcoois de açúcar preferidos são monoglicosídeos, especialmente os compostos obtidos através da redução de dissacarídeos, tais como lactose, maltose, lactulose e maltulose. O grupo 20 lateral glicosídico pode ser glucosídico ou galactosídico. Exemplos adicionais de álcoois de açúcar são glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulose. O lioprotetor preferido são os açúcares não redutores trehalose ou sacarose.
O lioprotetor é adicionado à formulação previamente liofilizada em “quantidade lioprotetora”, o que significa que, após a liofilização da proteína na 25 presença da quantidade lioprotetora do lioprotetor, a proteína retém essencialmente a sua integridade e estabilidade físico-química mediante liofilização e armazenagem.
Ao preparar-se as formulações com viscosidade reduzida de acordo com a presente invenção, dever-se-á tomar cuidado utilizando os excipientes enumerados acima, bem como outros aditivos, especialmente quando adicionados em alta concentração, e forma a não aumentar a viscosidade da formulação.
“Açúcar farmaceuticamente aceitável" é uma molécula que, quando combinada com proteína de ineresse, evita ou reduz significativamente a instabilidade física e/ou química da proteína durante a armazenagem. Quando a formulação destinar-se a liofilização e reconstituição em seguida, os “açúcares farmaceuticamente aceitáveis” podem também ser conhecidos como “lioprotetores". Exemplos de açúcares e seus álcoois de açúcar correspondentes incluem: um aminoácido, tal como glutamato monossódico ou histidina; metilamina, tal como betaína; sal liotrópico, tal como sulfato de magnésio; poliol, tal como álcoois de açúcar tri-hídricos ou de peso molecular mais alto, tais como glicerina, dextran, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propileno glicol; polietileno glicol; Pluronics® e suas combinações. Exemplos de lioprotetores adicionais incluem glicerina e gelatina e os açúcares melibiose, melezitose, rafinose, manotriose e estaquiose. Exemplos de açúcares redutores incluem glicose, maltose, lactose, maltulose, iso-maltulose e lactulose. Exemplos de açúcares não redutores incluem glicosídeos não redutores de compostos poli-hidróxi selecionados a partir de álcoois de açúcar e outros poliálcoois de cadeia linar. Os álcoois de açúcar preferidos são monoglicosídeos, especialmente os compostos obtidos através da redução de dissacarídeos tais como lactose, maltose, lactulose e maltulose. O grupo lateral glicosídico pode ser glucosídico ou galactosídico. Exemplos adicionais de álcoois de açúcar são glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulose. Os açúcares farmaceuticamente aceitáveis preferidos são os açúcares não redutores trehalose ou sacarose.
Açúcares farmaceuticamente aceitáveis são adicionados à formulação em "quantidade protetora” (tal como liofilização prévia), o que significa que a proteína retém essencialmente a sua integridade e estabilidade físico-química durante a armazenagem (tal como após a reconstituição e armazenagem).
O “diluente” de interesse no presente é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a seres humanos) e é útil para a preparação de formulação líquida, tal como formulação reconstituída após a liofilização. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), solução tamponada por 10 pH (tal como solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose. Em realização alternativa, os diluentes podem incluir soluções aquosas de sais e/ou tampões.
“Conservante” é um composto que pode ser adicionado às formulações do presente para reduzir a atividade bacteriana. A adição de 15 conservante pode facilitar, por exemplo, a produção de formulação de múltiplo uso (múltipla dosagem). Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamônio em que os grupos alquila são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetônio. Outros 20 tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos tais como álcool fenólico, butílico e benzílico, alquil parabens tais como metil ou propil paraben, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol. O conservante de maior preferência no presente é álcool benzílico.
“Tratamento” designa o tratamento terapêutico e medidas 25 profiláticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem aqueles que já possuem a disfunção, bem como aqueles em que a disfunção deve ser evitada.
"Mamífero", para os propósitos de tratamento, designa qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda e animais de zoológico, esportivos ou de estimação, tais como cães, coelhos, bois, porcos, hamsters, outros roedores, camundongos, furões, ratos, gatos etc. Preferencialmente, o mamífero é ser 5 humano.
"Disfunção" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com a proteína. Esta inclui disfunções ou doenças agudas e crônicas, que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão. Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente 10 incluem carcinomas e alergias.
“Quantidade terapeuticamente eficaz" é pelo menos a concentração mínima necessária para efetuar melhoria mensurável ou prevenção de disfunção específica. Quantidades terapeuticamente eficazes de proteínas conhecidas são bem conhecidas na técnica, enquanto as 15 quantidades eficazes de proteínas descobertas a seguir podem ser determinadas através de técnicas padrão que se encontram bem dentro do conhecimento dos técnicos no assunto, tais como médicos comuns.
“Viscosidade", da forma utilizada no presente, pode ser "viscosidade cinemática” ou “viscosidade absoluta". “Viscosidade cinemática" é medida do fluxo resistivo de um fluido sob a influência da gravidade. Quando dois fluidos com igual volume são colocados em viscômetros capilares idênticos e mantidos em fluxo por gravidade, um fluido viscoso leva mais tempo que um fluido menos viscoso para fluir através do capilar. Se um fluido levar 200 segundos para completar o seu fluxo e outro fluido levar 400 segundos, o segundo fluido é duas vezes mais viscoso que o primeiro em escala de viscosidade cinemática. “Viscosidade absoluta", às vezes denominada viscosidade simples ou dinâmica, é o produto da viscosidade cinemática e a densidade do fluido:
A dimensão da viscosidade cinemática é L2/T, em que L é comprimento e T é tempo. Comumente, a viscosidade cinemática é expressa em centistokes (cSt). A unidade SI de viscosidade cinemática é mm2/s, que é de 1 cSt. A viscosidade absoluta é expressa em unidades de centipoise (cP). A unidade SI de viscosidade absoluta é o miliPascal-segundo (mPa-s), em que 1 cP = 1 mPa-s.
“Anti-histamina", da forma utilizada no presente, é um agente que antagoniza o efeito fisiológico da histamina. A ligação de histamina aos seus receptores Hi e H2 resulta em sintomas alérgicos característicos e efeitos ou coceira, vermelhidão, inchaço etc. Muitas anti-histaminas agem através do bloqueio da ligação de histamina aos seus receptores Hi e H2; entretanto, acredita-se que outras operem através da inibição da liberação de histamina. Exemplos de anti-histaminas são clorfeniramina, difenidramina, prometazina, cromolin sódio, astemizol, maleato de azatadina, maleato de brofeniramina, 15 maleato de carbinoxamina, cloridrato de cetirizina, fumarato de clemastina, cloridrato de ciproheptadina, maleato de dexbronfeniramina, maleato de dexclorfeniramina, dimenidrinato, cloridrato de difenidramina, succinato de doxilamina, cloridrato de fexofendadina, cloridrato de terfenadina, cloridrato de hidrozina, loratidina, cloridrato de meclizina, citrato de tripelanamina, cloridrato de tripelenamina e cloridrato de triprolidina.
“Bronquiodilatador”, da forma utilizada no presente, descreve agentes que antagonizam ou revertem a bronquioconstrição, evento fisiológico que ocorre tipicamente em reações asmáticas de fase inicial, resultando em redução da capacidade pulmonar e dificuldades de respiração. Exemplos de 25 bronquiodilatadores incluem epinefrina, alfa e beta-adrenérgico de ação ampla, e os beta-adrenérgicos albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol e isoetarina. A bronquiodilatação pode também ser atingida através da administração de xantinas, que incluem aminofilina e teofilina.
“Glucocorticóide", da forma utilizada no presente, descreve agentes com base esteroidal que possuem atividade antiinflamatória. Glucocorticóides são comumente utilizados para atenuar reação asmática de 5 fase final. Exemplos de glucocorticóides incluem prednisona, dipropionato de beclometasona, triancinolona acetonida, flunisolida, betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, predinosolona, prednisona e triamcinolona.
“Droga antiinflamatória não esteroidal” ou "NSAID", da forma utilizada no presente, descreve agentes que possuem atividade antiinflamatória que não são baseados em esteroidal. Exemplos de NSAIDs incluem acetaminofen, aspirina, bromfenac sódio, diclofenac sódio, diflunisal, etodolac, fenoprofen cálcio, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, cetoprofen, 15 meclofenamato sódio, ácido mefenâmico, nabumetona, naproxen, naproxen sódio, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac e tolmetin sódio.
A descrição a seguir refere-se principalmente à produção dos 20 polipeptídeos ou anticorpos descritos no presente através do cultivo de células transformads ou transfectadas com um vetor que contém ácido nucleico que o codifica e purificação da proteína ou anticorpo resultante. Naturalmente, contempla-se que métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem ser empregados para a preparação desses polipeptídeos ou anticorpos. Essas seqüências ou suas porções podem ser produzidas, por exemplo, através de síntese direta de peptídeos utilizando técnicas de fase sólida (vide, por exemplo, Stewart et al, Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., São Francisco CA, Estados Unidos (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)). A síntese de proteínas in vitropode ser realizada através do uso de técnicas manuais ou de automação. A síntese automatizada pode ser conseguida, por exemplo, através do uso de um Sintetizador de Peptídeos da Applied Byosistems (Foster City CA, Estados Unidos), utilizando as 5 instruções do fabricante. Várias porções das proteínas ou anticorpos descritos no presente podem ser sintetizadas quimicamente de forma separada e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos.
DNA codificador das proteínas descritas no presente pode ser 10 obtido a partir de biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que se acredita possuir o mRNA correspondente e expressá-la em nível detectável. Consequentemente, esse DNA codificador de proteínas humanas pode ser convenientemente obtido a partir de biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. O gene codificador de 15 proteína pode também ser obtido a partir de biblioteca genômica ou de procedimentos sintéticos conhecidos (tais como síntese de ácido nucleico automatizada).
As bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (tais como oligonucleotldeos com pelo menos cerca de 20 a 80 bases) projetadas para 20 identificar o gene de interesse. A seleção da biblioteca genômica ou de cDNA com a sonda selecionada pode ser conduzida através do uso de procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque, Estados Unidos: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Meio alternativo de isolar o gene que codifica o gene 25 desejado é o uso de metodologia PCR (Sambrook et al, acima; Dieffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
Os Exemplos abaixo descrevem métodos de seleção de biblioteca de cDNA. As seqüências de oligonucleotideos selecionadas como sondas deverão possuir comprimento suficiente e ser suficientemente não ambíguas para que os falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferencialmente marcado de tal forma que possa ser detectado mediante hibridização em DNA na biblioteca sendo selecionada. Métodos de marcação são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de radiomarcas como ATP 32P- marcado, biotinilação ou marcação com enzimas. As condições de hibridização, que incluem estringência moderada e alta estringência, são fornecidas em Sambrook et al, acima.
As seqüências identificadas nesses métodos de seleção de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras seqüências conhecidas depositadas e disponíveis em bancos de dados públicos, tais como Genbank ou outros bancos de dados de seqüências privados. A identidade de seqüências (em nível de nucleotídeo ou de aminoácido) em regiões definidas da molécula ou através da seqüência de comprimento total pode ser determinada através do uso de métodos conhecidos na técnica e conforme descrito no presente.
Seqüência de codificação de proteínas que contém ácido nucleico pode ser obtida através de seleção de bibliotecas genômicas ou de cDNA selecionadas, utilizando a seqüência de aminoácido deduzida descrita no presente pela primeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos de extensão de primers convencionais conforme descrito em Sambrook et al, acima, para detectar precursores e intermediários de processamento de mRNA que podem não haver sido transcritos em reverso em cDNA.
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de clonagem ou de expressão que contêm as proteínas ou os anticorpos descritos no presente para produção e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas. As condições de cultivo, tais como meios, temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelos técnicos no 5 assunto sem experimentação indevida. De forma geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas de maximização da produtividade dos cultivos celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al, acima.
Métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação 10 de células procarióticas são conhecidos dos técnicos comuns no assunto, tais como CaCh, CaPO4, mediados por lipossomos e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito em Sambrook et al, acima, ou eletroporação geralmente é utilizado para procariotes. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para a transformação de certas células vegetais, conforme descrito por Shaw et al, Gene, 23: 315 (1983) e no documento WO 89/05859, publicada em 29 de junho de 1989. Para células de mamíferos sem essas paredes celulares, pode ser empregado o método de precipitação de fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology,52: 456- 457 (1978). Aspectos gerais de transfecções de sistema de hospedeiro celular de mamíferos foram descritos na Patente Norte-Americana n° 4.399.216. Transformações em levedura são tipicamente conduzidas de acordo com o método de Van Solingen et al, J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al, Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S. A.), 76: 3829 (1979). Entretanto, outros métodos de introdução de DNA em células, tais como através de microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplastas bacterianos com células intactas ou policátions, tais como polibreno e poliornitina, podem também ser utilizados.
Para várias técnicas de transformação de células de mamíferos, vide Keown et al, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) e Mansour et al, Nature, 336: 348-352 (1988).
Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão do 5 DNA nos vetores do presente incluem células procarióticas, de leveduras ou eucarióticas superiores. Os procariotes apropriados incluem, mas sem limitar- se a eubactérias, tais como organismos grama-negativos ou grama-positivos, tais como enterobactérias como E. coli. Várias linhagens de E. coli são disponíveis para o público, tais como linhagem MM294 de E. coli K12 (ATCC w 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); linhagem W3110 de E. coli (ATCC 27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluem enterobactérias tais como Escherichia,como E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella,como Salmonella typhimurium, Serratia, tai como Serratia marcescans, e Shigella,bem como 15 Bacilli, tais como B. subtilis e B. licheniformis (como B. licheniformis 41P descrita na Patente Alemã n° DD 266.710, publicada em doze de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitadores. A linhagem W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido, pois é uma 20 linhagem hospedeira comum para fermentações de produto de DNA recombinante. Preferencial mente, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. A linhagem W3110 pode ser modificada, por exemplo, para efetuar mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos desses hospedeiros incluindo E. coli W3110 linhagem 1A2, que contém o genótipo completo tonA-, linhagem 9E4 de E. coli W3110, que contém o genótipo completo tonA ptr3\ linhagem 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que contém o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr-, linhagem 37D6 de E. coli W3110, que contém o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 HvG kanr; linhagem 40B4 de E. coli W3110, que é linhagem 37D6 com mutação de deleção degP não resistente a canamicina; e linhagem E. coli que contém protease periplásmica mutante descrita na Patente US 4.946.783, 5 emitida em sete de agosto de 1990. Alternativamente, são apropriados métodos in vitrode clonagem, tais como PCR ou outras reações de polimerase de ácidos nucleicos.
Além de procariotes, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de expressão ou de clonagem 10 apropridaos para vetores que codificam as proteínas ou anticorpos descritos no presente. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe(Beach e Nurse, Nature290: 140 (1981); Patente EP 139.383, publicada em dois de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente US 15 4.943.529; Fleer et al, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)), tais como K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al, J. Bacteriol., 154 (2): 737-42 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum(ATCC 36.906; Van den Berg et al, Bio/Technology 8: 135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (Patente EP 402.226); Pichia pastoris (Patente EP 183.070; Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol.,28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (Patente EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces, tais como Schwanniomyces occidentalis(Patente EP 394.538, publicada em 31 de 25 outubro de 1990); e fungos filamentosos, tais como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357, publicada em dez de janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus,tais como A. nidulans(Ballance et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al, Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 1470-1474 (1984)) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)). Leveduras metilotrópicas são apropriadas no presente e incluem, mas sem limitar-se a levedura capaz de crescimento sobre metanol selecionada a partir dos gêneros 5 que consistem de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula.Relação de espécies específicas que são exemplos desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
As células hospedeiras apropriadas para a expressão de forma 10 glicosilada dos polipeptídeos e anticorpos descritos no presente são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos, tais como Drosophila S23 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células COS e de ovário de hamster chinês (CHO). Exemplos 15 mais específicos incluem linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultivo de suspensão, Graham et al, J. Gen. Virol.,36: 59 (1977)); células de ovário de hamster chinês/DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51). Considera-se que a seleção da célula hospedeira apropriada encontra-se dentro do conhecimento da técnica.
O ácido nucleico (tal como cDNA ou DNA genômico) que codifica os polipeptídeos e anticorpos descritos no presente podem ser inseridos em um vetor que pode ser reproduzido para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores são disponíveis ao público. O vetor pode estar presente, por exemplo, na forma de plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor através de uma série de procedimentos. De forma geral, DNA é inserido em um 5 ou mais locais de endonuclease de restrição apropriados, utilizando métodos conhecidos na técnica. Os componentes de vetor geralmente incluem, mas sem limitar-se a um ou mais dentre uma sequência de sinal, origem de reprodução, um ou mais genes marcadores, elemento amplificador, promotor e seqüência de término de transcrição. A construção de vetores apropriados que 10 contenham um ou mais destes componentes emprega métodos de ligação padrão que são conhecidos do técnico no assunto.
A produção recombinante dos polipeptídeos ou anticorpos pode ser atingida não apenas diretamente, mas também na forma de polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo. A parte heteróloga pode ser uma 15 seqüência de sinal ou outro polipeptídeo que possui local de divisão específico no terminal N do polipeptídeo ou proteína madura. De forma geral, a seqüência de sinal pode ser um componente do vetor ou pode ser uma parte do DNA que codifica o polipeptídeo ou anticorpo que é inserido no vetor. A seqüência de sinal pode ser uma seqüência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a 20 partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis a quente. Para a secreção de leveduras, a seqüência de sinal pode ser, por exemplo, o líder invertase de levedura, líder fator alfa (incluindo líderes de fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces, este último descrito na Patente US 5.010.182), ou líder de fosfatase ácida, o líder de glucoamilase de C. albicans(Patente EP 362.179, publicada em quatro de abril de 1990), ou o sinal descrito no documento WO 90/13646, publicada em quinze de novembro de 1990. Em expressão de células de mamíferos, podem ser utilizadas seqüências de sinais de mamíferos para dirigir a secreção da proteína, tais como seqüências de sinais de polipeptídeos segregados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, bem como líderes de secreção virai.
Tanto os vetores de clonagem como de expressão contêm uma seqüência de ácido nucleico que permite a reprodução do vetor em uma ou 5 mais células hospedeiras selecionadas. Estas seqüências são bem conhecidas para uma série de bactérias, leveduras e vírus. A origem de reprodução do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias grama- negativas, a origem de plasmídeo 2p é apropriada para leveduras e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para a 10 clonagem de vetores em células de mamíferos.
Os vetores de clonagem e de expressão conterão tipicamente um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, 15 (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, tais como o gene que codifica D- alanino racemase para Bacilli.
Um exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células 20 competentes para a tomada da seqüência de DNA que codifica os polipeptídeos ou anticorpos descritos no presente, tais como DHFR ou timidino quinase. Uma célula hospedeira apropriada ao empregar-se DHFR do tipo selvagem é a linhagem de células de CHO com deficiência na atividade de DHFR, preparadas e propagadas conforme descrito por Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4216 (1980). Um gene de seleção apropriado para uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al, Nature,282: 39 (1979); Kingsman et al, Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al, Gene, 10: 157 (1980)). O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura que não possui a capacidade de crescimento em triptofano, tal como ATCC n° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics,85: 12 (1977)).
Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm um 5 promotor ligado operativamente a essas seqüências de DNA para dirigir a síntese de mRNA. Promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e lactose (Chang et al, Nature,275: 615 (1978); Goeddel et al, Nature,281: 544 10 (1979)), fosfatase alcalina, sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res.,8: 4057 (1980); Patente EP 36.776) e promotores híbridos, tais como o promotor tac (deBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 80: 21-25 (1983)). Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma seqüência Shine-Dalgarno (S. D.) ligada operativamente a essas 15 seqüências de DNA.
Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para uso com hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et al, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg.,7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 20 4900 (1978)), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de leveduras, que são promotores indutíveis 25 que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associadas ao metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores apropriados para uso na expressão de leveduras são adicionalmente descritos na Patente EP 73.657.
A transcrição de vetores em células hospedeiras de mamíferos 5 pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírus da catapora (Patente UK 2.211.504, publicada em cinco de julho de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus sarcoma das aves, citomegalovírus, retrovirus, vírus da hepatite B e Vírus dos Simios 40 (SV40), a partir de promotores de 10 mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, a partir de promotores de choque por aquecimento, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
A transcrição de ácido nucleico codificador do polipeptídeos e anticorpos do presente por eucariotes superiores pode ser aumentada pela 15 inserção de uma seqüência amplificadora no vetor. Os amplificadores são elementos que agem como cis de DNA, normalmente cerca de 10 a 300 bp, que atuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Diversas seqüências amplificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteina e insulina). Tipicamente, 20 entretanto, utilizar-se-á um amplificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 no lado posterior da origem de reprodução (bp 100-270), o amplificador promotor precoce de citomegalovírus, o amplificador de polioma sobre o lado posterior da origem de reprodução e amplificadores de adenovirus. O amplificador pode ser dividido no vetor em 25 posição a 5’ ou 3' do DNA para a seqüência de codificação, mas é preferencialmente localizado em local a 5’ do promotor.
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, seres humanos ou nucleadas a partir de outros organismos multicelulares) também conterão seqüências necessárias para o término de transcrição e estabilização do mRNA. Essas seqüências são comumente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5’ e, ocasionalmente, 3’ de cDNAs ou DNAs virais ou eucarióticos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA codificador dos polipeptídeos ou anticorpos descritos no presente.
Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras apropriadas para adaptação à síntese do polipeptídeo ou anticorpos descritos no presente no cultivo de células de vertebrados recombinantes encontram-se descritos em Gething et al, Nature,293: 620-625 (1981); Mantei et al, Nature,281: 40-46 (1979); Patente EP 117.060; e Patente EP 117.058.
A expressão e/ou amplificação genética pode ser medida diretamente em uma amostra, através, por exemplo, de Southern Blot convencional, Northern Blot para quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 5201-5205 (1980)), Dot Blot (análise de DNA) ou hibridização in situ,utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas seqüências fornecidas no presente. Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que possam reconhecer duplex específicos, incluindo duplex de DNA, duplex de RNA e duplex híbridos de DNA-RNA ou duplex de DNA-proteína. Os anticorpos, por sua vez, podem ser marcados e o teste pode ser conduzido quando o duplex for ligado a uma superfície, de forma que, mediante a formação de duplex sobre a superfície, a presença de anticorpo unido ao duplex possa ser detectada.
Alternativamente, a expressão genética pode ser medida através de métodos imunológicos, tais como manchas imunohistoquímicas de células ou seções de tecidos e teste de cultivo celular ou fluidos do corpo, para quantificar diretamente a expressão de produto genético. Anticorpos úteis para manchas imunohistoquímicas e/ou teste de amostras de fluidos podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra os 5 polipeptídeos descritos no presente ou contra um peptídeo sintético com base nas seqüências de DNA fornecidas no presente ou contra seqüências exógenas fundidas a DNA codificador desses polipeptídeos e anticorpos e codificar um epítopo de anticorpo específico.
Formas deles podem ser recuperadas a partir de meio de cultivo ou de lisatos de células hospedeiras. Se for ligado por membrana, ele pode ser liberado da membrana através do uso de solução de detergente apropriada (tal como Triton-X 100) ou de divisão enzimática. As células empregadas na expressão dos polipeptídeos ou anticorpos descritos no presente podem ser 15 rompidas através de vários meios físicos ou químicos, tais como ciclização de descongelamento/congelamento, sonicação, rompimento mecânico ou agentes de lise celular.
Pode-se desejar purificar os polipeptídeos ou anticorpos descritos no presente a partir de proteínas celulares recombinantes ou outros 20 polipeptídeos. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: através de fracionamento sobre coluna de troca de íons; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou resina de troca de cátions, tal como DEAE; cromatoconcentração; SDS- PAGE; precipitação em sulfato de amónio; filtragem de gel utilizando, por 25 exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes metálicas para ligar formas marcadas por epitopos do polipeptídeo ou anticorpo. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregados e esses métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza do 5 processo de produção utilizado e do polipeptídeo ou anticorpo específico produzido.
Em certas realizações da presente invenção, a proteína selecionada é um anticorpo. Seguem-se técnicas de produção de anticorpos, 10 que incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.
Os anticorpos policlonais são geralmente elevados em animais através de diversas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do 15 antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada, tal como hemocianina de conchas (KLH), albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando agente bifuncional ou derivatizante, tal como éster maleimidobenzoil sufossuccinimida (conjugação através de 20 resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são independentemente grupos alquila inferiores. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil lipídio A, trehalose dicorinomicolato sintético). O 25 protocolo de imunização pode ser selecionado pelos técnicos no assunto sem experimentação indevida.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados através da combinação, por exemplo, de 100 |ig ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução de forma intradérmica em diversos locais. Um mês mais tarde, os animais são incentivados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou 5 conjugado em adjuvante completo de Freund, através de injeção subcutânea em diversos locais. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado para titulagem de anticorpos. Os animais são incentivados até a estabilização do título. Os conjugados também podem ser fabricados em cultivo celular recombinante, na forma de fusões de proteínas. Além disso, agentes 10 agregantes tais como alúmen são apropriadamente utilizados para aumentar a reação imunológica.
Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais 15 que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-tradução (tais como isomerizações e amidações) que podem estar presentes em pequenas quantidades. Desta forma, o adjetivo “monoclonal"indica o caráter do anticorpo como não sendo mistura de anticorpos discretos.
Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados, por exemplo, através da utilização do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al, Nature256: 495 (1975) ou podem ser fabricados através de métodos de DNA recombinantes (Patente US 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal 25 hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se liguem especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.Os linfócitos são fundidos em seguida com células de mieloma, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,págs. 59 a 103 (Academic Press, 1986)).
O agente imunizador incluirá tipicamente a proteína antigênica ou uma de suas variantes de fusão. Geralmente, são utilizados linfócitos do sangue periférico ("PBLs") caso sejam desejadas células de origem humana, ou células do baço ou células do nódulo linfático são utilizadas caso sejam desejadas fontes de mamíferos não humanos. Os linfócitos são fundidos em 10 seguida com uma linhagem de células imortalizadas, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs. 59-103.
Linhagens de células imortalizadas são normalmente células de 15 mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origem humana, bovina e de roedores. Normalmente, são empregadas linhagens de células de mieloma de rato ou camundongo. As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultivo apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem 20 o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultivo seletivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de 25 células com deficiência de HGPRT.
As células de mieloma imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apóiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio seletivo tal como meio HAT. Dentre estas, são preferidas as linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis através do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 (e 5 seus derivados, tais como células X63-Ag8-653) disponíveis através da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassus, Virgínia, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol.,133: 3001 (1984); e Brodeur et al, 10 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,págs. 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987)).
O meio de cultivo em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos 15 monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou de um teste de ligação in vitro,tal como radioimunoensaio (RIA) ou teste imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).
O meio de cultivo no qual as células de hibridoma são cultivadas pode ser testado para determinar a presença de anticorpos monoclonais 20 dirigidos contra o antígeno desejado. Preferencialmente, a afinidade e a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal podem ser determinadas através de imunoprecipitação ou de teste de ligação in vitro,tal como radioimunoensaio (RIA) ou teste ligado por enzimas (ELISA). Estes métodos e testes são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada, 25 por exemplo, através da análise de Scatchard descrita por Munson et al, Anal. Biochem., 107: 220(1980).
Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão (Goding, acima). Meios de cultivo apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI- 1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na 5 forma de tumores de ascite em mamíferos.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são apropriadamente separados do meio de cultivo, fluido de ascite ou soro através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, 10 diálise ou cromatografia de afinidade.
Os anticorpos monoclonais podem também ser fabricados através de métodos de DNA recombinante, tais como os descritos na Patente US 4.816.567 e conforme descrito acima. O DNA codificador dos anticorpos monoclonais é facilmente isolado e seqüenciado através da utilização de 15 procedimentos convencionais (utilizando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para 20 células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, a fim de obter a síntese de anticorpos monoclonais nessas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que 25 codificam o anticorpo incluem Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol.,5: 256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs.,130: 151-188 (1992).
Em realização adicional, os anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature,348: 552-554 (1990). Clackson et al, Nature,352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos humanos e murinos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) através de mistura de cadeias (Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al, Nucl. Acids. Res.,21: 2265-2266 (1993)). Desta forma, essas técnicas são 10 alternativas viáveis a técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
O DNA pode também ser modificado, por exemplo, através da substituição da seqüência de codificação por domínios constantes de cadeia leve e cadeia pesada humanas em lugar das seqüências murinas homólogas 15 (Patente US 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851 (1984)), ou através de ligação covalente à seqüência de codificação de imunoglobulinas com a seqüência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte. Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, 20 ou são substituídos pelos domínios variáveis do local de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antígenos que apresenta especificidade para um antígeno e outro local de combinação de antígenos que apresenta especificidade para um antígeno diferente.
Os anticorpos monoclonais descritos no presente podem ser monovalentes, cuja preparação é bem conhecida na técnica. Um método envolve, por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e uma cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto da região Fc, de forma a evitar reticula de cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes podem ser substituídos com outro resíduo de aminoácido ou são excluídos para evitar a reticula. Métodos in vitrotambém são apropriados para a preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir seus fragmentos, particularmente fragmentos Fab, pode ser obtida utilizando métodos rotineiros conhecidos na técnica.
Anticorpos quiméricos ou híbridos podem também ser preparados in vitro,utilizando métodos conhecidos na química de proteína sintética, que incluem aqueles que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação de tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender adicionalmente anticorpos humanos ou humanizados. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (tais como murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab’)2 ou outras subseqüências de ligação de antígenos de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do paciente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho que possua a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de cadeia principal de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüências de cadeia principal ou CDR importadas. De forma geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá idealmente pelo menos uma parte de região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Jones et al, Nature321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature332: 323-329 (1988) e Presta, Curr. Opin. Struct. Biol.2: 593-596 (1992).
Métodos de humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados resíduos “importados”, que são simplesmente retirados de um domínio variável "importado'’. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)), ou através da substituição de seqüências de CDR ou CDRs de roedores pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de “melhor adequação", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de 5 roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que é mais próxima da do roedor é aceita em seguida como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol.,151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma estrutura 10 específica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol.,151: 2623 (1993)).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade de ligação para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos 20 humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de possíveis seqüências de 25 imunoglobulina selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da possível seqüência de imunoglobulina, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina possível ligar seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora e importada, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antfgeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos da CDR são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação 5 de antígenos.
São contempladas diversas formas do anticorpo humanizado. O anticorpo humanizado pode ser, por exemplo, um fragmento de anticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, a fim de gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado 10 pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgG 1 intacto.
Como alternativa para a humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante 15 imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (JH) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem de gérmens resulta na inibição completa da produção de anticorpos 20 endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem de gérmen humano nesses camundongos com mutação da linhagem de gérmens resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature,362: 255-258 (1993); Bruggermann et 25 al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); Patente US 5.591.669 e documento WO 97/17852.
Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitroa partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados (McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)). De acordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonados em estrutura em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita única do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo que exibe essas propriedades. Desta forma, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fago pode ser realizada em uma série de formatos, analisados, por exemplo, por Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Curr. Opin. Struct. Biol.3: 564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição do fago. Clackson et al, Nature,352: 624-628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo auto- antígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Vide também as Patentes US 5.565.332 e US 5.573.905.
As técnicas de Cole et al e Boerner et al também são disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e Boerner et al, J. Immunol. 147 (1): 86-95 (1991). De forma similar, anticorpos humanos podem ser elaborados através da introdução de locais de imunoglobulina humana em animais transgênicos, tais como camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram completa ou parcialmente desativados. Mediante desafio, observa-se a produção de anticorpos humanos, que relembram de perto os observados em seres humanos em todos os aspectos, 5 incluindo a redisposição genética, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.545.807, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016 e nas publicações científicas a seguir: Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature368: 856-859 (1994); Morrison, Nature368: 812- 10 13 (1994), Fishwild et al, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).
Por fim, anticorpos humanos podem também ser gerados in vitro por células B ativadas in vitro(vide as Patentes US 5.567.610 e US 5.229.275).
Em certas circunstâncias, existem vantagens na utilização de fragmentos de anticorpos, e não anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite liberação rápida e pode gerar maior acesso a tumores sólidos.
Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al, J. Biochem. Biophys. Methods24: 107-117 (1992); e Brennan et al, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpos Fab, Fv e scFv podem ser expressos em E. coli e dele segregados, de forma a permitir a produção fluente de grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab’-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab’)2 (Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, 5 fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir do cultivo de células hospedeiras recombinantes. Fab e F(ab')2 com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores de recuperação são descritos na Patente US 5.869.046. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento de Fv de fita única (scFv). Vide o 10 documento WO 93/16185; Patente US 5.571.894; e Patente US 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um “anticorpo linear”, conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.641.870. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados em ADEPT através da conjugação do anticorpo a uma enzima ativadora de pró-drogas que converte uma pró-droga (tal como agente quimioterapêutico de peptidila, vide o documento WO 81/01145) em uma droga 20 anti-câncer ativa. Vide, por exemplo, o documento WO 88/07378 e a Patente US 4.975.278.
O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir sobre uma pró-droga, de forma tal a convertê-la na sua forma citotóxica mais ativa.
As enzimas que são úteis no método de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitar-se a glicosidase, glicose oxidase, lisozima humana, glucuronidase humana, fosfatase alcalina útil para a conversão de pró-drogas que contêm fosfato em drogas livres; arilsulfatase útil para a conversão de pró-drogas que contêm sulfato em drogas livres; citosino desaminase útil para a conversão de 5-fluorocitosina não tóxica na droga anti- câncer 5-fluorouracila; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases (tais como carboxipeptidase G2 e 5 carboxipeptidase A) e catepsinas (tais como catepsinas B e L) que são úteis para a conversão de pró-drogas que contêm peptídeos em drogas livres; D- alanilcarboxipeptidases, úteis para a conversão de pró-drogas que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas que dividem carboidrato, tais como β- galactosidase e neuraminidase úteis para a conversão de pró-drogas 10 glicosiladas em drogas livres; β-lactamase útil para a conversão de drogas derivadas com β-lactamas em drogas livres; e penicilino amidases, tais como penicilino vamidase ou penicilino G amidase, úteis para a conversão de drogas derivadas nos seus nitrogénios amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em drogas livres. Alternativamente, anticorpos com atividade 15 enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas”, podem ser utilizados para converter as pró-drogas de acordo com a presente invenção em drogas ativas livres (vide, por exemplo, Massey, Nature328: 457-458 (1987)). Conjugados de anticorpos e abzimas podem ser preparados conforme descrito no presente para o fornecimento da abzima a uma população de células 20 tumorosas.
As enzimas acima podem ser ligadas covalentemente ao polipeptídeo ou anticorpos descritos no presente através de métodos bem conhecidos na técnica, tais como o uso dos agentes reticulantes heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão que 25 compreendem pelo menos a região de ligação de antígenos do anticorpo de acordo com a presente invenção ligadas a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima de acordo com a presente invneção podem ser construídas utilizando métodos de DNA recombinantes bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Neuberger et al, Nature312: 604- 608(1984)).
Os anticorpos biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que possuem 5 especificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes, que incluem os que se encontram na mesma ou em outra proteína. Alternativamente, um braço pode ser armado para ligar-se ao antígeno alvo e outro braço pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora sobre um leucócito, tal como uma molécula receptora de células T 10 (tal como CD3) ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyR1 (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a concentrar e localizar mecanismos de defesa celular para a célula que expressa antígenos alvo. Estes anticorpos podem ser derivados de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (tais como anticorpos biespecíficos F(ab')2).
Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressem o antígeno alvo. Esses anticorpos possuem um braço que liga o antígeno desejado e outro braço que liga o agente citotóxico (tal como saporina, anti-interferon-a, vinca alcolóide, cadeia A rícina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Exemplos de anticorpos biespecíficos conhecidos incluem anti-ErbB2/anti- FcgRIll (documento WO 96/16673), anti-ErbB2/anti-FcgRI (Patente US 5.837.234), anti-ErbB2/anti-CD3 (Patente US 5.821.337).
Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de 25 comprimento total baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al, Nature,305: 537-539 (1983)). Devido à disposição aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e os 5 rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos no documento WO 93/08829 e em Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
De acordo com abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação 10 de antígenos e anticorpos) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão efetua-se com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), que contém o local necessário para ligação 15 de cadeias leves, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificadores das fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina são inseridos em vetores de expressão separados e cotransfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade de ajuste das proporções mútuas dos três 20 fragmentos de polipeptídeos em realizações em que razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção proporcionam os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inseriras seqüências de codificação de duas ou de todas as três cadeias de polipeptídeos em um único vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos 25 em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não possuírem significado específico.
Em realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que proporciona segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica possibilita a separação do composto biespecífico desejado de 5 combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade das moléculas biespecíficas proporciona forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh et al, Methods in 10 Enzymology,121: 210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita no documento WO 96/27011 ou na Patente US 5.731.168, a superfície intermediária entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que é recuperado do cultivo de células 15 recombinantes. A superfície intermediária preferida compreende pelo menos uma parte da regão CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da superfície intermediária da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias 20 de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a superfície intermediária da segunda molécula de anticorpo, através da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodimero sobre outros produtos finais indesejados, tais 25 como homodímeros.
As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, através da utilização de ligações químicas. Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos de F(ab’)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente formador de complexo de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis 5 vizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos de Fab’ gerados são convertidos em seguida em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então novamente convertido no derivado de Fab’-TNB para formar o anticorpo específico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados na forma de agentes para a 10 imobilização seletiva de enzimas.
Fragmentos de Fab’ podem ser recuperados diretamente a partir de E. coli e acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab’)2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada 15 fragmento de Fab’ foi segregado separadamente a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitropara formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico formado desta maneira foi capaz de ligar-se a células que sobreexpressam o receptor de ErbB2 e células T humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de 20 tumor de mama humanos.
Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos bivalentes diretamente a partir de cultivo celular recombinante também foram descritas. Heterodímeros bivalentes foram produzidos, por exemplo, através da utilização de fechos de leucina. Kostelny et al, J. Immunol.,148 (5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às partes Fab’ de dois anticorpos diferentes através de fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos"descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90: 6444- 6448 (1993) forneceu mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos/bivalentes. Os fragmentos compreendem um 5 domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VLθ VH complementares de outro fragmento, 10 de maneira a formar dois locais de ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos/bivalentes através da utilização de dímeros Fv de fita única (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al, J. Immunol.,152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências. 15 Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J. Immunol.147: 60 (1991).
Exemplos de anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes sobre uma dada molécula. Alternativamente, um braço antiproteína pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula 20 acionadora sobre um leucócito, tal como uma molécula receptora de células T (tal como CD2, CD3, CD28 ou B7) ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a concentrar mecanismos de defesa celular para a célula que expressa a proteína específica. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar 25 agentes citotóxicos para células que expressem uma proteína especifica. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de proteína e um braço que liga um agente citotóxico ou quelante de radionucleto, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecífico de interesse liga a proteína de interesse e liga adicionalmente o fator de tecido (TF).
Anticorpos heteroconjugados também se encontram dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos 5 de dois anticorpos ligados covalentemente. Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado, por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Propôs-se que esses anticorpos dirigissem, por exemplo, células do sistema imunológico a células indesejadas, na Patente US 4.676.980, e para o tratamento de infecções com HIV, nos documentos WO 91/00360 e WO 92/200373 e na Patente EP 0308936. Contempla-se que os anticorpos podem ser preparados in vitroutilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo os que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação de tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e 4-mercaptobutirimidato de metila e os descritos, por exemplo, na Patente US 4.676.980. Anticorpos heteroconjugados podem ser elaborados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e descritos na Patente US 4.676.980, junto com uma série de técnicas de reticula.
Pode ser desejável modificar o anticorpo de acordo com a presente invenção com relação à função efetora, de forma a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer. Resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, por exemplo, de forma a permitir a formação de ligações de dissulfeto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico gerado desta forma pode apresentar maior capacidade de internalização e/ou maior morte celular mediada por complemento e citotoxicidade cellular dependente de anticorpos (ADCC). Vide Caron et al. J. Exp. Med. 176: 1191- 1195 (1992) e Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com maior atividade antitumores podem também ser preparados através do uso de reticulantes heterobifuncionais, conforme 5 descrito em Wolff et al, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser elaborado um anticorpo que contenha regiões Fc duplas e pode, desta forma, apresentar lise de complemento e capacidades de ADCC aprimoradas. Vide Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
A presente invenção também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um 15 isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).
Agentes quimioterapêuticos úteis na geração desses imunoconjugados incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina, vinblastina, adriamicina e 5-fluorouracila.
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem 20 ser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de união de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa),cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, crotina, inibidor 25 sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são fabricados através da utilização de uma série de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidila (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCL), ésteres ativos (tais como suberato de dissucinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p- 5 azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p- diazonobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Pode-se preparar uma imunotoxina rfcina, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1- 10 isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleto ao anticorpo. Vide o documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante divisível”, que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, ligante instável a ácidos, ligante sensível a 15 peptidase, ligante de dimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al, Cancer Res. 52: 127-131 (1992)).
Além disso, as toxinas de moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansina (Patente US 5.208.020), tricoteno e CC1065 também são contempladas como toxinas conjugáveis para uso com a 20 formulação de acordo com a presente invenção. Em uma realização, o anticorpo de comprimento total ou seus fragmentos de ligação de antígenos podem ser conjugados a uma ou mais moléculas de maitansinóide (tais como cerca de uma a cerca de dez moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo). Os maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem através da 25 inibição da polimerização de tubulina. Os maitansinóides, isolados de fontes naturais ou preparados sinteticamente, que incluem maitansina, maitansinal e seus derivados e análogos, foram descritos, por exemplo, na Patente US 5.208.020 e referências ali mencionadas (vide col. 2, linha 53 a col. 3, linha 10) e Patentes US 3.896.111 e US 4.151.042. Métodos de preparação de conjugados de anticorpos e maitansinóides também são descritos na Patente US 5.208.020. Em realização preferida, um maitansinóide é ligado ao anticorpo através de um grupo de ligação de dissulfeto ou outro que contenha enxofre. Maitansina pode ser convertida, por exemplo, em May-SS-Me, que pode ser reduzido para May-SH3 e reagido com anticorpo modificado para gerar um imunoconjugado de maitansinóide e anticorpo. Chari et al, Cancer Res.52: 127-131 (1992). O anticorpo pode ser modificado através de métodos conhecidos e o anticorpo que contém grupos tiol livres ou protegidos é reagido 10 em seguida com um maitansinóide que contém dissulfeto para produzir o conjugado. A citotoxicidade do conjugado de anticorpo e maitansinóide pode ser medida in vitroou in vivo através de métodos conhecidos e o IC50 é determinado.
Caliqueamicina é outro imunoconjugado de interesse. A família de 15 caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de linhagem dupla em concentrações subpicomolares. Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a y/, az1, as1, N-acetil-yi1, PSAG e θ1! (Hinman et al, Cancer Res.53: 3336-3342 (1993) e Lode et al, Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)). Outras drogas antitumores às 20 quais o anticorpo pode ser conjugado incluem QFA que é um antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm locais intracelulares de ações e não cruzam facilmente a membrana de plasma. Portanto, a absorção celular destes agentes através da internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos.
Os imunoconjugados formados entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ou endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase) também são contemplados.
O anticorpo pode também ser conjugado a um átomo altamente radioativo. Uma série de radionucletos é disponível para a produção de anticorpos rádio-conjugados. Exemplos incluem At211, Bi212, I131, In131, Y90, Re188, Re188, Sm153, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando for 5 utilizado para diagnóstico, o conjugado pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como Tc99 ou I123, ou uma marca de centrifugação para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, 10 nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
As radiomarcas ou outras podem ser incorporadas ao conjugado de formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos, utilizando precursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor-19 no 15 lugar de hidrogênio. Marcas tais como Tc"m, I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligadas através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. O método IODOGEN® pode ser utilizado para incorporar iodo-123, Fraker et al (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 (1978). Outros métodos de conjugação de radionucletos 20 são descritos em Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press, 1989).
Alternativamente, pode ser fabricada uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e o agente citotóxico, através, por exemplo, de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA pode 25 compreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes do conjugado, sejam eles adjacentes entre si ou separados por uma região codificadora de um peptídeo ligante que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um “receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento de tumores, em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado da circulação, utilizando um 5 agente limpante e, em seguida, administração de um “ligante” (tal como avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).
Os anticorpos descritos no presente podem também ser 10 formulados como imunolipossomos. Um “lipossomo” é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para o fornecimento de drogas a mamíferos. Os componentes do lipossomo são comumente dispostos em formação bicamada, similar à disposição de lipídios de membranas biológicas.
Os lipossomos que contêm o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na técnica, conforme descrito em Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4030 (1980); e Patentes US 4.485.045 e US 4.544.545. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente US 5.013.556.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídios que compreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudados através de filtros com tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos de Fab' do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos descritos em Martin et al, J. Biol. Chem. 257: 286- 288 (1982) através de reação de intercâmbio de dissulfetos. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorubicina) é opcionalmente contido no interior do lipossomo. Vide Gabizon etal, J. National Cancer Inst. 81 (19): 1484 (1989).
Outras modificações do anticorpo são contempladas no presente. O anticorpo pode ser ligado, por exemplo, a um dentre uma série de polímeros 5 não proteináceos, tais como polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo pode também ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de aglutinação ou polimerização interfacial (tais como microcápsulas de gelatina ou hidroximetilcelulose e microcápsulas de 10 poli(metilmetacrilato), respectivamente) em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas e outras formulações apropriadas encontram-se descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy,20a edição, Alfonso 15 Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).
As formulações descritas no presente podem também ser preparadas como formulações liofilizadas reconstituídas. As proteínas ou os anticorpos descritos no presente são liofilizados e reconstituídos em seguida 20 para produzir as formulações líquidas estáveis com viscosidade reduzida de acordo com a presente invenção. Nesta realização específica, após a preparação da proteína de interesse conforme descrito acima, é produzida uma “formulação pré-liofilizada”. A quantidade de proteína presente na formulação pré-liofilizada é determinada tomando-se em conta os volumes de dose 25 desejados, modo(s) de administração etc. A concentração inicial de um anticorpo intacto pode ser, por exemplo, de cerca de 2 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, preferencialmente cerca de 5 mg/ml a cerca de 40 mg/ml e, de preferência superior, de cerca de 20 a 30 mg/ml.
A proteína a ser formulada encontra-se geralmente presente em solução. Nas formulações com viscosidade reduzida e resistência iônica elevada de acordo com a presente invenção, por exemplo, a proteína pode 5 estar presente em solução tamponada com pH em pH de cerca de 4 a 8, preferencialmente cerca de 5 a 7. A concentração de tampão pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 20 mM, alternativamente cerca de 3 mM a cerca de 15 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da tonicidade desejada da formulação (por exemplo, da formulação reconstituída). Exemplos de tampões 10 e/ou sais são aqueles que são farmaceuticamente aceitáveis e podem ser criados a partir de seus ácidos, bases e sais apropriados, tais como aqueles que são definidos como ácidos, bases ou tampões “farmaceuticamente aceitáveis”.
Em uma realização, adiciona-se um lioprotetor à formulação 15 previamente liofilizada. A quantidade de lioprotetor na formulação previamente liofilizada geralmente é tal que, mediante reconstituição, a formulação resultante será isotônica. Entretanto, formulações reconstituídas hipertônicas podem também ser apropriadas. Além disso, a quantidade de lioprotetor não deve ser tão baixa a ponto que ocorra quantidade inaceitável de 20 degradação/agregação da proteína durante a liofilização. Entretanto, exemplos de concentrações de lioprotetor na formulação previamente liofilizada são de cerca de 10 mM a cerca de 400 mM, alternativamente cerca de 30 mM a cerca de 300 mM, alternativamente cerca de 50 mM a cerca de 100 mM. Exemplos de lioprotetores incluem açúcares e álcoois de açúcar, tais como sacarose, 25 manose, trehalose, glicose, sorbitol e manitol. Entretanto, sob circunstâncias específicas, certos lioprotetores podem também contribuir para aumentar a viscosidade da formulação. Desta forma, dever-se-á tomar cuidado para selecionar lioprotetores específicos que minimizam ou neutralizam este efeito. Lioprotetores adicionais são descritos acima sob a definição de “lioprotetores”, também denominados no presente “açúcares" farmaceuticamente aceitáveis”.
A razão entre proteína e lioprotetor pode variar para cada combinação de lioprotetor e proteína ou anticorpo específica. No caso de um 5 anticorpo como proteína selecionada e açúcar (tal como sacarose ou trehalose) como lioprotetor para gerar formulação reconstituída isotônica com alta concentração de proteína, a razão molar entre lioprotetor e anticorpo pode ser de cerca de 100 a cerca de 1500 moles de lioprotetor para um mol de anticorpo, preferencialmente cerca de 200 a cerca de 1000 moles de lioprotetor 10 para um mol de anticorpo, tal como cerca de 200 a cerca de 600 moles de lioprotetor para um mol de anticorpo.
Em realização preferida, pode ser desejável adicionar um tensoativo à formulação previamente liofilizada. Alternativa ou adicionalmente, o tensoativo pode ser adicionado à formulação liofilizada e/ou à formulação 15 reconstituída. Exemplos de tensoativos incluem tensoativos não iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20 ou 80); polioxâmeros (tais como poloxâmero 188); Triton; sódio octil glicosídeo; lauril, miristil, linoleil ou estearil-sulfobetaína; lauril, miristil, linoleil ou estearil-sarcosina; linoleil, miristil ou cetil-betaína; lauroamidopropil, cocamidopropil, linoleamidopropil, 20 miristamidopropil, palmidopropil ou isoestearamidopropil-betaína (tal como lauroamidopropil); miristamidopropil, palmidopropil ou isoestearamidopropil- dimetilamina; sódio metil cocoil ou dissódio metil oleil-taurato; e a série MONAQUA® (Mona Industries, Inc., Paterson, Nova Jérsei, Estados Unidos), polietil glicol, polipropil glicol e copolímeros de etileno e propileno glicol (tais 25 como Pluronics, PF68 etc.). A quantidade de tensoativo adicionada é tal que reduz a formação de partículas da proteína reconstituída e minimiza a formação de particulados após a reconstituição. O tensoativo pode estar presente, por exemplo, na formulação previamente liofilizada em quantidade de cerca de 0,001 a 0,5%, alternativamente cerca de 0,005 a 0,05%,
Uma mistura do lioprotetor (tal como sacarose ou trehalose) e agente formador de volume (tal como manitol ou glicina) pode ser utilizada na preparação da formulação pré-liofilização. O agente formador de volume pode 5 permitir a produção de um aglomerado liofilizado uniforme sem bolsos excessivos no seu interior etc. Outros veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como os descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980), podem ser incluídos na formulação previamente liofilizada (e/ou a formulação liofilizada e/ou a 10 formulação reconstituída), desde que não prejudiquem as características desejadas da formulação. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem: agentes tamponadores adicionais; conservantes; co-solventes; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metíonina; agentes quelantes, tais 15 como EDTA; complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); polímeros biodegradáveis, tais como poliésteres; e/ou contraíons formadores de sais, tais como sódio.
A formulação do presente pode também conter mais de uma proteína, conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, 20 preferencialmente aquelas com atividades complementares que não prejudiquem a outra proteína. Pode ser desejável, por exemplo, fornecer dois ou mais anticorpos que se liguem ao alvo desejado (tal como receptor ou antígeno) em uma única formulação. Estas proteínas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito 25 desejado.
As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por filtragem através de membranas de filtragem estéreis, antes ou depois da liofilização e reconstituição. Alternativamente, a esterilidade de toda a mistura pode ser obtida através de autoclave dos ingredientes, exceto pela proteína, a cerca de 120 °C por cerca de trinta minutos, por exemplo.
Após a mistura da proteína, lioprotetor opcional e outros componentes opcionais entre si, a formulação é liofilizada. Muitos secadores de congelamento diferentes são disponíveis para este propósito, tais como secadores por congelamento Hull50® (Hull, Estados Unidos) ou GT20® (Leybold-Heraeus, Alemanha). A secagem por congelamento é obtida através do congelamento da formulação e subsequente sublimação de gelo do conteúdo congelado sob temperatura apropriada para secagem primária. Sob esta condição, a temperatura do produto está abaixo do ponto eutético da temperatura de colapso da formulação. Tipicamente, a temperatura de prateleira para a secagem primária variará de cerca de -30 a 25 °C (desde que o produto permaneça congelado durante a secagem primária) sob pressão apropriada, que varia tipicamente de cerca de 50 a 250 mTorr. A formulação, tamanho e tipo do recipiente que retém a amostra (tal como ampola de vidro) e o volume de líquido ditarão principalmente o tempo necessário para secagem, que pode variar de algumas horas até vários dias (por exemplo, 40 a 60 horas). Opcionalmente, pode também ser realizado um estágio de secagem secundário, dependendo do nível de umidade residual desejado no produto. A temperatura à qual é conduzida a secagem secundária varia de cerca de 0 a 40 °C, dependendo principal mente do tipo e do tamanho do recipiente e do tipo de proteína empregado. A temperatura em armazenagem ao longo de toda a fase de remoção de água de liofilização pode ser, por exemplo, de cerca de 15 a 30 °C (por exemplo, cerca de 20 °C). O tempo e a pressão necesários para secagem secundária serão tais que produzam um aglomerado liofilizado apropriado, dependendo, por exemplo, da temperatura e de outros parâmetros. O tempo de secagem secundário é ditado pelo nível de umidade residual desejado no produto e tipicamente leva pelo menos cerca de cinco horas (tal como de dez a quinze horas). A pressão pode ser a mesma empregada durante a etapa de secagem primária. As condições de secagem por congelamento podem variar, dependendo da formulação e do tamanho da 5 ampola.
Antes da administração ao paciente, a formulação liofilizada é reconstituída com diluente farmaceuticamente aceitável, de tal forma que a concentração de proteína na formulação reconstituída seja de pelo menos 10 cerca de 50 mg/ml, tal como cerca de 50 mg/ml a cerca de 400 mg/ml, alternativamente cerca de 80 mg/ml a cerca de 300 mg/ml, alternativamente cerca de 90 mg/ml a cerca de 150 mg/ml. Essas altas concentrações de proteína na formulação reconstituída são consideradas particularmente úteis quando se pretender fornecimento subcutâneo da formulação reconstituída. Entretanto, para outras vias de administração, tais como administração intravenosa, podem ser desejadas concentrações mais baixas da proteína na formulação reconstituída (por exemplo, cerca de 5 a 50 mg/ml ou cerca de 10 a 40 mg/ml de proteína na formulação reconstituída). Em certas realizações, a concentração de proteína na formulação reconstituída é significativamente mais alta que na formulação previamente liofilizada. A concentração de proteína na formulação reconstituída pode ser, por exemplo, de cerca de duas a quarenta vezes, alternativamente de três a dez vezes, alternativamente de três a seis vezes (por exemplo, pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes) a da formulação previamente liofilizada.
A reconstituição geralmente tem lugar sob temperatura de cerca de 25 °C para garantir hidratação completa, embora outras temperaturas possam ser empregadas conforme o desejado. O tempo necessário para reconstituição dependerá, por exemplo, do tipo de diluente, quantidade de excipiente(s) e proteína. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), solução tamponada com pH (tal como solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose. O diluente contém opcionalmente um 5 conservante. Exemplos de conservantes foram descritos acima, com álcoois aromáticos tais como álcool benzílico ou fenólico sendo os conservantes preferidos. A quantidade de conservante empregada é determinada através da avaliação de diferentes concentrações de conservantes para compatibilidade com o teste de eficácia do conservante e proteína. Caso o conservante seja um w álcool aromático, por exemplo (tal como álcool benzílico), ele pode estar presente em quantidade de cerca de 0,1 a 2,0% e, preferencialmente, cerca de 0,5 a 1,5%, mas de preferência superior cerca de 1,0 a 1,2%.
Preferencialmente, a formulação reconstituída contém menos de 6000 partículas por ampola, que possuem tamanho de > 10 pm.
São preparadas formulações terapêuticas para armazenagem através de mistura do ingrediente ativo que possui o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, Mack Publishing 20 Co., Easton PA 18042, Estados Unidos (1990)). Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os pacientes às dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, antioxidantes que incluem ácido ascórbico, metionina, vitamina E e metabissulfito de sódio; conservantes, isotonificantes, estabilizantes, complexos metálicos (tais como complexos de 25 proteína e Zn); agentes quelantes tais como EDTA e/ou tensoativos não iônicos.
Quando o agente terapêutico for um fragmento de anticorpo, é preferido o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Com base nas seqüências de região variável de um anticorpo, por exemplo, podem ser projetados fragmentos de anticorpos ou até moléculas de peptídeos que retêm a capacidade de ligar a seqüência de proteína alvo. Esses peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou 5 produzidos através de tecnologia de DNA recombinante (vide, por exemplo, Marasco etal, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 90: 7889-7893 (1993)).
São utilizados tampões para controlar o pH em faixa que otimiza a eficácia terapêutica, especialmente se a estabilidade for dependente do pH. Tampões encontram-se preferencialmente presentes em concentrações que variam de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM. Agentes tamponadores apropriados para uso com a presente invenção incluem ácidos orgânicos e inorgânicos e seus sais. Por exemplo, citrato, fosfato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato e acetato. Além disso, os tampões podem ser compostos de sais de histidina e trimetilamina, tais como Tris.
São adicionados conservantes para retardar o crescimento microbiano e eles estão tipicamente presentes em faixa de 0,2% a 1,0% (p/v). Conservantes apropriados para uso com a presente invenção incluem (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio); cloreto de hexametônio; haletos de benzalcônio (tais como cloreto, brometo e iodeto), cloreto de benzetônio; álcool timerosálico, fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens, tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol.
Agentes de tonicidade, às vezes conhecidos como “estabilizantes”, estão presentes para ajustar ou manter a tonicidade de 25 composições líquidas. Quando utilizados com biomoléculas grandes e carregadas, tais como proteínas e anticorpos, eles são freqüentemente denominados “estabilizadores”, pois podem interagir com os grupos carregados das cadeias laterais de aminoácidos, de forma a reduzir o potencial de interações inter e intramoleculares. Agentes de tonicidade podem estar presentes em qualquer quantidade de 0,1% a 25% em peso, preferencialmente de 1 a 5%, considerando as quantidades relativas dos demais ingredientes. Os agentes de tonicidade incluem álcoois de açúcar póli-hídricos, 5 preferencialmente álcoois de açúcar tri-hídricos ou superiores, tais como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.
Excipientes adicionais incluem agentes que podem servir como um ou mais dos seguintes: (1) agentes formadores de volume, (2) amplificadores da solubilidade, (3) estabilizantes e (4) agentes que evitam a 10 desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Os estabilizantes podem estar presentes na faixa de 0,1 a 10.000 partes em peso de anticorpo ou proteína ativa. Os estabilizantes típicos incluem: álcoois de açúcar póli-hídrico (enumerados acima); aminoácidos, tais como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido 15 glutâmico, treonina etc.; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, tais como sacarose, lactose, lactitol, trehalose, estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (tais como inositol), polietileno glicol; agentes redutores que contêm enxofre, tais como uréia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, a- 20 monotioglicerol e tiossulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular, tais como albumina de soro humano, albumina de soro bovino, gelatina ou outras imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; monossacarídeos (tais como xilose, manose, frutose, glicose); dissacarídeos (tais como lactose, maltose, sacarose); trissacarídeos tais como rafinose; e 25 polissacarídeos, tais como dextrina ou dextran.
Tensoativos não iônicos ou detergentes (também conhecidos como "agentes umectantes”) estão presentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem como proteger a proteína terapêutica contra a agregação induzida por agitação, o que também permite que a formulação seja exposta a tensão superficial de corte sem causar desnaturação da proteína ou anticorpo terapêutico ativo. Os tensoativos não iônicos estão presentes em faixa de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, preferencialmente cerca de 0,07 mg/ml a 5 cerca de 0,2 mg/ml.
Os tensoativos não iônicos apropriados incluem polissorbatos (20, 40, 60, 65, 80 etc.), polioxâmeros (184, 188 etc.), polióis Pluronic®, Triton®, monoéteres de polioxietileno sorbitan (Tween® 20, Tween® 80 etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, óleo de mamona hidrogenado 10 com polioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Os detergentes aniônicos que podem ser utilizados incluem lauril sulfato de sódio, sulfossuccinato de dioctil sódio e sulfonato de dioctil sódio. Detergentes catiônicos incluem cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio.
Para que as formulações sejam utilizadas para administração in vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por filtragem através de membranas de filtragem estéreis. As composições terapêuticas do presente são geralmente colocadas em um recipiente que contém uma porta de acesso estéril, tal como saco ou ampola de solução 20 intravenosa que contém uma tampa perfurável através de agulha de injeção hipodérmica.
A via de administração é de acordo com métodos conhecidos e aceitos, tais como injeção ou infusão de uma ou mais misturas por longo período de tempo de maneira apropriada, tal como injeção ou infusão através 25 de vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional ou intraarticular, administração tópica, inalação ou através de meios de liberação prolongada ou estendida.
A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo, conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente os que tenham atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente citotóxico, citoquina ou agente inibidor do 5 crescimento. Essas moléculas estão apropriadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito desejado.
Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou 10 gelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, acima.
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, com essas matrizes estando na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada 20 incluem poliésteres, hidrogéis (tais como metacrilato de (póli)2-hidroxietila ou álcool (póli)vinílico), polilactídeos (Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de y-etila, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido glicólico e ácido láctico degradáveis, tais como DEPOT® da LUPRON (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lactic e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico. A microencapsulação de proteínas recombinantes para liberação prolongada foi realizada com sucesso com hormônio do crescimento humano (rhGH), interferona (rhlFN-), interleucina-2 e MN rpg 120. Johnson et al, Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al, Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al, Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell e Newman, 5 eds. (Plenum Press: Nova Iorque, Estados Unidos, 1995), págs. 439-462; documentos WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; e Patente US 5.654.010.
As formulações de liberação prolongada destas proteínas podem ser desenvolvidas utilizando polímero de ácido póliláctico-coglicólico (PLGA) 10 devido à sua biocompatibilidade e ampla faixa de propriedades biodegradáveis. Os produtos de degradação de PLGA, ácidos láctico e glicólico, podem ser limpos rapidamente no corpo humano. Além disso, a capacidade de degradação deste polímero pode ser ajustada em meses até anos, dependendo do seu peso molecular e composição. Lewis, Controlled Release 15 of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Polymer em Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker, Nova Iorque, Estados Unidos, 1990), M. Chasin e R. Langer (eds.), págs. 1-41.
Embora polímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido láctico- ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de cem dias, certos 20 hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por longo período, eles podem desnaturar-se ou agregar-se, como resultado da exposição à umidade a 37 °C, o que resulta em perda da atividade biológica e possíveis mudanças da imunogenicidade. Podem ser idealizadas estratégias racionais para 25 estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Caso se descubra, por exemplo, que o mecanismo de agregação é a formação de ligação S-S intermolecular através de troca de tiodissulfeto, pode-se atingir a estabilização através da modificação de resíduos sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas.
Composições de proteinóides ou lipossômicas podem também ser utilizadas para formular as proteínas ou os anticorpos descritos no presente. 5 Vide as Patentes US 4.925.673 e US 5.013.556.
A estabilidade das proteínas e dos anticorpos descritos no presente pode ser aumentada através do uso de “sais metálicos polivalentes hidrossolúveis" não tóxicos. Exemplos incluem Ca2*, Mg2*, Zn2*, Fe2*, Fe3*, Cu2*, Sn2*, Sn4*, Al2* e Al3*. Exemplos de ânions que podem formar sais 10 hidrossolúveis com os cátions metálicos polivalentes acima incluem os formados a partir de ácidos inorgânicos e/ou ácidos orgânicos. Esses sais hidrossolúveis possuem solubilidade em água (a 20 °C) de pelo menos cerca de 20 mg/ml, alternativamente pelo menos cerca de 100 mg/ml, alternativamente pelo menos cerca de 200 mg/ml.
Os ácidos inorgânicos apropriados que podem ser utilizados para formar os “sais metálicos polivalentes hidrossolúveis” incluem ácido clorídrico, acético, sulfúrico, nítrico, tiociânico e fosfórico. Os ácidos orgânicos apropriados que podem ser utilizados incluem ácido carboxílico alifático e ácidos aromáticos. Os ácidos alifáticos, dentro da presente definição, podem 20 ser definidos como ácidos C2-9 carboxílicos saturados ou instaurados (tais como ácidos mono, di e tricarboxílicos alifáticos). Exemplos de ácidos monocarboxílicos dentro da presente definição incluem, por exemplo, os ácidos C2-9 monocarboxílicos saturados acético, propiônico, butírico, valérico, capróico, enântico, caprílico, pelargônico e capriônico e os ácidos C2-9 25 monocarboxílicos insaturados acríclico, propiólico, metacrílico, crotônico e isocrotônico. Exemplos de ácidos dicarboxílicos incluem os ácidos C2-9 dicarboxílicos saturados malônico, succínico, glutárico, adípico e pimélico, enquanto os ácidos C2-9 dicarboxílicos insaturados incluem ácidos maleico, fumárico, citracônico e mesacônico. Exemplos de ácidos tricarboxílicos incluem os ácidos C2-9 tricarboxílicos saturados ácido tricarbalílico e 1,2,3- butanotricarboxilico. Além disso, os ácidos carboxílicos de acordo com a presente definição podem também conter um ou dois grupos hidroxila para 5 formar ácidos hidróxi carboxílicos. Exemplos de ácidos hidróxi carboxílicos incluem ácido glicólico, láctico, glicérico, tartrônico, málico, tartárico e cítrico. Os ácidos aromáticos dentro da presente definição incluem ácido benzóico e salicílico.
Sais de metais polivalentes hidrossolúveis comumente 10 empregados que podem ser utilizados para ajudar a estabilizar os polipeptídeos encapsulados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo: (1) os sais metálicos de ácidos inorgânicos de haletos (tais como cloreto de zinco e cloreto de cálcio), sulfatos, nitratos, fosfatos e tiocianatos; (2) os sais metálicos de ácido carboxílico alifático (tais como acetato de cálcio, 15 acetato de zinco, propionato de cálcio, glicolato de zinco, lactato de cálcio, lactato de zinco e tartrato de zinco); e (3) os sais metálicos de ácido carboxílico aromático de benzoatos (tais como benzoato de zinco) e salicilatos.
Para a prevenção ou o tratamento da doença, a dosagem 20 apropriada de um agente ativo dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da severidade e do curso da doença, se o agente é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao agente e o critério do médico atendente. O agente é administrado apropriadamente ao paciente de uma vez 25 ou ao longo de uma série de tratamentos.
Um método de tratamento preferido é o tratamento de disfunções mediadas por IgE. As disfunções mediadas por IgE incluem disfunções atópicas, que são caracterizadas por propensão herdada de reação imunológica a muitos antígenos ingeridos e inalados de ocorrência natural comuns e à produção contínua de anticorpos de IgE. Disfunções atópicas específicas incluem asma, rinite alérgica, dermatite atópica e gastroenteropatia alérgica. Pacientes atópicos freqüentemente possuem diversas alergias, o que 5 indica que eles possuem anticorpos IgE para muitos alérgenos ambientais e sintomas deles, incluindo pólens, fungos (tais como mofos), partículas de animais e insetos e certos alimentos.
Entretanto, as disfunções associadas a níveis elevados de IgE não se limitam à etiologia herdada (atópica). Outras disfunções associadas a 10 níveis de IgE elevados que aparentemente são mediadas por IgE e podem ser tratadas com as formulações de acordo com a presente invenção incluem hipersensibilidade (tal como hipersensibilidade anafilática), eczema, urticária, aspergilose broncopulmonar alérgica, doenças parasíticas, síndrome de hiper IgE, ataxia-telangiectasia, síndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tímica, 15 mieloma de IgE e reação de enxerto contra hospedeiro.
Rinite alérgica, também conhecida como rinoconjuntivite alérgica ou febre do feno, é a manifestação mais comum de reação atópica a alérgenos inalados, cuja severidade e duração é freqüentemente correlacionada à intensidade e duração da exposição ao alérgeno. Trata-se de doença crônica, 20 que pode aparecer em primeiro lugar em qualquer idade, mas cuja instalação ocorre normalmente durante a infância ou adolescência. Ataque típico consiste de rinorréia aquosa em profusão, espirros paroxismais, obstrução nasal e coceira no nariz e palato. Drenagem do muco pós-nasal também causa dor de garganta, pigarro e tosse. Pode também haver sintomas de blefaroconjuntivite 25 alérgica, com intensa coceira da conjuntiva e pálpebras, vermelhidão, lacrimejação e fotofobia. Ataques severos são freqüentemente acompanhados por dor de cabeça sistêmica, fraqueza, fadiga e, às vezes, dores musculares após períodos intensos de espirros.
Asma, também conhecida como doença obstrutiva das vias aéreas reversível, é caracterizada por hiper-reação da árvore traqueobrônquica a irritantes respiratórios e substâncias bronquiorrestritoras, produzindo ataques de espirros, dispnéia, dureza no peito e tosse que são reversíveis 5 espontaneamente ou com tratamento. É doença crônica que envolve todas as vias aéreas, mas sua severidade varia de episódios temporários suaves ocasionais até obstrução brônquica crônica e severa que ameaça a vida. Asma e atopia podem coexistir, mas somente cerca da metade dos asmáticos também é atópica e percentual ainda menor de pacientes atópicos também 10 possui asma. Atopia e asma, entretanto, não são completamente independentes, pois a asma ocorre mais freqüentemente entre indivíduos atópicos que entre não atópicos, especialmente durante a infância. A asma foi historicamente dividida em dois subgrupos, asma extrínseca e asma intrínseca.
A asma extrínseca, também conhecida como asma alérgica, 15 atópica ou imunológica, descreve pacientes que geralmente desenvolvem asma cedo na vida, normalmente durante a infância. Outras manifestações de atopia, que incluem eczema ou rinite alérgica, freqüentemente coexistem. Ataques asmáticos podem ocorrer durante sessões de pólen, na presença de animais ou mediante exposição a poeira doméstica, travesseiros de penas ou 20 outros alérgenos. Testes dérmicos exibem reações positivas de pústula e chama aos alérgenos causadores. De forma interessante, as concentrações totais de IgE no soro são freqüentemente elevadas, mas às vezes são normais.
A asma intrínseca, também conhecida como asma não alérgica ou idopática, ocorre tipicamente em primeiro lugar durante a vida adulta, após 25 infecção respiratória aparente. Os sintomas incluem obstrução brônquica crônica ou recorrente não relacionada com sessões de pólen ou exposição a outros alérgenos. Os testes dérmicos são negativos para os alérgenos atópicos habituais e a concentração de IgE no soro é normal. Sintomas adicionais incluem sangue na saliva e eosinofilia. Outros esquemas de classificação de asma em subgrupos, tais como sensível a aspirina, induzida por exercício, infecciosa e psicológica meramente definem fatores acionadores externos que afetam certos pacientes mais que a outros.
Por fim, é importante observar que, embora algumas classificações tenham historicamente associado asma alérgica somente à dependência de IgE, existem agora fortes dados estatisticamente significativos que exibem correlação entre IgE e asma (tanto alérgica quanto não alérgica). Capítulo 27, The Atopic Diseases, A. I. Terr em Medical Immunology, nona 10 edição, Simon e Schuster, Stites et al, Ed. (1997). Como resultado, a expressão “disfunções mediadas por IgE”, para os propósitos do presente pedido de patente, incluem asma alérgica e não alérgica.
Os sinais físicos de ataque de asma incluem taquipnéia, espirros audíveis e o uso de músculos acessórios de respiração. Pulso rápido e pressão 15 arterial elevada também estão tipicamente presentes, bem como níveis elevados de eosinófilos nas secreções nasais e sangue periférico. As funções pulmonares exibem redução das velocidades de fluxo e volume expiratório forçado de um segundo (FEV-i). A capacidade total do pulmão e a capacidade residual funcional são tipicamente normais ou levemente aumentadas, mas 20 podem ser reduzidas com bronquioespasmos extremos.
A patologia da asma pode ser diferenciada por reações de fase precoce e fase posterior. A face precoce é caracterizada por contração dos músculos moles, edema e hipersecreção, enquanto as reações de fase posterior por inflamações celulares. A asma pode ser induzida por vários 25 acionadores não específicos, que incluem infecções (tais como infecções respiratórias virais), fatores fisiológicos (tais como exercício, hiperventilação, respiração profunda, fatores psicológicos), fatores atmosféricos (tais como dióxido de enxofre, amónia, ar frio, ozônio, vapor d'água destilado), ingestores (tais como propranolol, aspirina, drogas antiinflamatórias não esteroidais), inaladores experimentais (tais como soluções hipertônicas, ácido cítrico, histamina, metacolina, prostaglandina F2O) e inaladores ocupacionais (tais como isocianatos). Vários alérgenos ambientais ou ocupacionais adicionais que 5 causam asma alérgica podem incluir produtos animais, pós para insetos, criaturas do mar, produtos vegetais, frutas, sementes, folhas e pólens, tinturas orgânicas e tintas, agentes microbianos, enzimas, agentes terapêuticos, agentes esterilizantes, substâncias orgânicas e inorgânicas.
Dermatite atópica, também conhecida como eczema, neurodermatite, eczema atópico ou prurido de Besnier, é disfunção dérmica crônica comum específica para um subconjunto de pacientes com as características familiares e imunológicas de atopia. A característica essencial é reação inflamatória dérmica prurítica, que induz erupção dérmica distribuída simetricamente característica com predileção por certos locais. Existe também 15 freqüente sobreprodução de IgE por linfócitos B. Embora a dermatite atópica seja classificada como forma cutânea de atopia por ser associada a rinite alérgica, asma e altos níveis de IgE, a severidade da dermatite, entretanto, nem sempre é relacionada à exposição a alérgenos durante teste na pele e a dessensibilização (ao contrário de outras doenças alérgicas) não é tratamento 20 eficaz. Embora alto IgE em soro confirme o diagnóstico de asma alérgica, níveis normais não o inibem. A instalação da doença pode ocorrer em qualquer idade e as lesões agudas começam com papula edematosa eritematose ou placa com escamação. A coceira gera lacrimejação e formação de crosta, depois a liquenificação crônica. Em nível celular, a lesão aguda é edemosa e a 25 derme é infiltrada com células mononucleares, linfócitos CD4. Neutrófilos, eosinófilos, células de plasma e basófilos são raros, mas células mastro desgranuladas estão presentes. Lesões crônicas apresentam hiperplasia epidérmica, hiperceratose e paraceratose e a derme é infiltrada com células mononucleares, células de Langerhans e células mastro. Pode também haver áreas focais de fibrose, que incluem o envolvimento do perineu de nervos pequenos.
Gastroenteropatia alérgica, também conhecida como 5 gastroenteropatia eosinofílica, é manifestação atópica incomum na qual as sensibilidades alimentares a vários IgE são associadas a reação da mucosa do trato gastrointestinal local. É rara em adultos, mas mais comum, mas temporária, em crianças. A condição resulta quando alérgenos alimentares ingeridos reagem com anticorpos IgE locais na mucosa em jejum e liberam 10 mediadores de células mastro, resultando em sintomas gastrointestinais pouco após a refeição. Exposição continua produziu inflamações crônicas, resultando em perda de proteínas gastrointestinais e edema hipoproteinêmico. A perda de sangue através da mucosa intestinal inflamada pode ser suficientemente significativa para causar anemia com deficiência de ferro. A reação alérgica 15 ocorre localmente na mucosa gastrointestinal superior após a exposição a alérgenos, mas é resolvida evitando-se alérgenos.
Anafilaxia e urticária são claramente mediadas por IgE, mas não contêm determinantes genéticos e não possuem predileção por indivíduos atópicos. Anafilaxia é uma reação alérgica aguda e generalizada com 20 envolvimento simultâneo de vários sistemas de órgãos, normalmente cardiovasculares, respiratórios, cutâneos e gastrointestinais. A reação é mediada imunologicamente e ocorre durante a exposição a alérgenos aos quais o paciente tenha sido sensibilizado anteriormente. Urticária e angioedema designam inchaço físico, eritema e coceira resultantes de receptor 25 estimulado por histamina em vasos sangüíneos cutâneos superficiais e são a característica cutânea marcante da anafilaxia sistêmica. Anafilaxia sistêmica é a ocorrência de reação mediada por IgE simultaneamente em vários órgãos, resultante de drogas, veneno de insetos ou alimentos. É causada subitamente por IgE carregado com células mastro induzido por alérgenos, resultando em profunda alteração ameaçadora da vida no funcionamento de vários órgãos vitais. O colapso vascular, obstrução aguda das vias aéreas, edema e vasodilatação cutânea e espasmos musculares gastrointestinais e 5 genitourinários ocorrem quase simultaneamente, embora nem sempre ao mesmo grau.
A patologia da anafilaxia inclui angioedema e pulmões hiperinflados, com obstrução da mucosa das vias aéreas e ateletase focal. Em nível celular, os pulmões aparecem de forma similar a durante ataque agudo de 10 asma, com hipersecreção das glândulas submucosas brônquicas, edema da mucosa ou submucosa, congestão vascular peribrônquica e eosinofilia nas paredes brônquicas. Edema e hemorragia pulmonar podem estar presentes. Espasmos dos músculos brônquicos, hi peri nfl ação e até ruptura de alvéolos podem também estar presentes. Características importantes da anafilaxia 15 humana incluem edema, congestão vascular e eosinofilia na lâmina própria da laringe, traquéia, epiglote e hipofaringe.
A exposição ao alérgeno pode ocorrer através de ingestão, injeção, inalação ou contato com a pele ou membrana mucosa. A reação inicia- se em segundos ou minutos após a exposição ao alérgeno. Pode existir 20 surpresa inicial ou sensação de condenação por impedimento, seguida rapidamente por sintomas em um ou mais sistemas de órgãos alvo: cardiovascular, respiratório, cutâneo e gastrointestinal.
Os alérgenos responsáveis pela anafilaxia diferem dos comumente associados a atopia. Alimentos, drogas, venenos de insetos ou 25 látex são as fontes comuns. Os alérgenos alimentícios incluem os encontrados em crustáceos, moluscos (tais como lagosta, camarão, caranguejo), peixes, legumes (tais como amendoins, ervilhas, feijão, alcaçuz), sementes (tais como gergelim, semente de algodão, alcaravia, mostarda, linhaça, girassol), nozes, bagas, claras de ovos, trigo sarraceno e leite. Alérgenos de drogas incluem os encontrados em polipeptídeos e proteínas heterólogas, polissacarídeos e drogas haptênicas. Alérgenos de insetos incluem insetos heminópteros, que incluem as abelhas, vespa amarela, vespão, vespa e formiga do fogo.
Embora epinefrina seja o tratamento típico para anafilaxia, anti- histamina ou outros bloqueadores de histamina são tipicamente receitados para reação angioedêmica ou urticária menos severa.
O método de acordo com a presente invenção pode ser 10 combinado com métodos de tratamento conhecidos para disfunções mediadas por IgE, seja na forma de etapas de tratamento adicionais ou combinadas ou como componentes adicionais de formulações terapêuticas.
Anti-histaminas, por exemplo, especialmente anti-histaminas não sedativas, podem ser administradas, antes, depois ou simultaneamente com os 15 anticorpos anti-lgE de acordo com a presente invenção. Anti-histaminas apropriadas incluem as da alquilamina (tais como clorfeniramina), etanolamina (tais como difenidramina) e fenotiazina (tais como prometazina). Embora várias anti-histaminas antagonizem os efeitos farmacológicos de histamina através de bloqueio dos seus locais receptores sobre as células efetoras, outras drogas 20 anti-histamínicas comuns operam através do bloqueio da liberação de histamina de células mastro que tenham sido sensibilizadas e armadas com IgE específico de alérgenos (tal como cromolin sódio). Exemplos de anti- histaminas incluem astemizol, maleato de azatadina, maleato de brofeniramina, maleato de carbinoxamina, cloridrato de cetirizina, fumarato de clemastina, 25 cloridrato de ciproheptadina, maleato de dexbronfeniramina, maleato de dexclorfeniramina, dimenidrinato, cloridrato de difenidramina, succinato de doxilamina, cloridrato de fexofendadina, cloridrato de terfenadina, cloridrato de hidroxizina, loratidina, cloridrato de meclizina, citrato de tripelanamina, cloridrato de tripelenamina e cloridrato de triprolidina.
Sintomas específicos de disfunções mediadas por IgE (tais como reações de fase precoce) podem ser melhorados com simpatomiméticos ou drogas que possuem efeito bronquiodilatador. Epinefrina é um alfa e beta- 5 adrenérgico de ação ampla freqüentemente administrado por via subcutânea em dose de 0,2 a 0,5 ml de solução aquosa 1:100. Forma de ação mais longa de epinefrina (ou seja, terbutalina) em suspensão 1:200 também é utilizada quando se deseja efeito de duração mais longa. Beta-adrenérgicos adicionais apropriados incluem abuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol, isoetarina 10 e formoterol para administração por via nasal (tal como nebulizador manual, dispositivo de respiração sob pressão positiva intermitente ou inaldores pressurizados por dose medida) ou oral.
A bronquiodilatação pode também ser atingida através da administração de xantinas, especialmente quando são administradas em 15 combinação com as drogas simpatomiméticas acima. Exemplos de xantinas incluem aminofilina (iv. 250 a 500 mg) e teofilina (oral, 10 a 20 pg/ml de concentração em soro).
Outros sintomas de várias disfunções mediadas por IgE (tais como reações de fase posterior) podem ser atenuados através de tratamento 20 com glucocorticóides ou outras drogas que possuem efeitos antiinflamatórios. Prednisona (30 a 60 mg por dia) é administrada sistemicamente para ataques severos, enquanto dipropionato de beclometasona, triancinolono acetonida e flunisolida são administradas em forma de aerossol como terapia de manutenção a longo prazo. Além disso, coricoesteróides que possuem efeitos 25 antiinflamatórios incluem: betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triancinolona.
Drogas antiinflamatórias não esteroidais que podem também ser utilizadas em combinação com os métodos terapêuticos de acordo com a presente invenção incluem acetaminofen, aspirina, bromfenac sódio, diclofenac sódio, diflunisal, etodolac, fenoprofen cálcio, flurbiprofen, ibuprofen, indometacina, cetoprofen, meclofenamato sódio, ácido mefenâmico, 5 nabumetona, naproxen, naproxen sódio, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac e tolmetin sódio.
Além disso, pode também ser atingido benefício terapêutico máximo com a administração de descongestionantes (tais como fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefadrin), supressores da tosse (tais como 10 dextrometorfan, codeína ou hidrocodona) ou analgésicos (tais como acetaminofen e aspirina).
A dessensibilização de alérgenos é forma de tratamento na qual os alérgenos são injetados no paciente com o propósito de redução ou eliminação da reação alérgica. Também é conhecida como imunoterapia de 15 alérgenos, hipossensibilização ou terapia de injeção de alergia. É frequentemente utilizada em combinação com outros tratamentos de alergia, mas não freqüentemente como tratamento principal. Vem sendo empegada com sucesso quando é impossível evitar-se o alérgeno. Um tratamento de dessensibilização de alérgenos típico incorpora a injeção subcutânea de 20 alérgeno estéril em doses crescentes uma ou duas vezes por semana até atingir-se dose que produza pequena área local temporária de inflamação no local da injeção. A dose é fornecida em seguida em programa de manutenção uma vez a cada duas a quatro semanas. A dessensibilização alérgica é mais freqüentemente utilizada no tratamento de asma alérgica e rinite alérgica, 25 embora tenha apresentado sucesso no tratamento de anafilaxia. A dessensibilização também vem sendo utilizada efetivamente através do uso de adjuvantes, tais como adjuvante de Freund incompleto, que é uma emulsão de antígeno aquoso em óleo mineral. O efeito fisiológico cria um depósito liquid insolúvel do qual gotículas de alérgeno são gradualmente liberadas. Outra forma de dessensibilização de alérgenos é a polimerização de alérgenos monoméricos com glutaraldeído para criar uma molécula com alergenicidade relativamente baixa (ou seja, causa reação alérgica), enquanto retém grau 5 eficaz de imunogenicidade.
As dosagens e concentrações desejadas da droga de composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem variar, dependendo da utilização especifica desejada. A determinação da dosagem ou 10 via de administração apropriada encontra-se dentro do conhecimento dos técnicos comuns. Experiências com animais proporcionam orientações confiáveis para a determinação de doses eficazes para terapia humana. O escalonamento inter-espécies de doses eficazes pode ser realizado seguindo- se os princípios descritos por Mordenti, J. e Chappell, W., The Use of 15 Interspecies Scaling in Toxicokinetics em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al, Eds., Pergamon Press, Nova Iorque, Estados Unidos, 1989, págs. 42 a 46.
Ao empregar-se administração in vivo dos polipeptídeos ou anticorpos descritos no presente, as quantidades normais de dosagem podem 20 variar de cerca de cerca de 10 ng/kg até cerca de 100 mg/kg de peso do corpo do mamífero ou mais por dia, preferencialmente cerca de 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Orientação sobre as dosagens específicas e métodos de fornecimento é fornecida na literatura; vide, por exemplo, Patentes US 4.657.760, US 5.206.344 ou US 5.225.212. Encontra-se dentro do escopo da presente invenção que formulações diferentes serão eficazes para tratamentos diferentes e diferentes disfunções, e que a administração destinada a tratar um órgão ou tecido específico pode necessitar de fornecimento de maneira diferente daquela de outro órgão ou tecido. Além disso, as dosagens podem ser administradas através de uma ou mais administrações separadas, ou de infusão contínua. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da 5 doença. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado através de métodos e testes convencionais.
As formulações de acordo com a presente invenção, que incluem 10 mas sem limitar-se a formulações reconstituídas, são administradas a mamíferos necessitados de tratamento com a proteína, preferencialmente seres humanos, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa na forma de mistura ou através de infusão contínua ao longo de um período de tempo, através de vias intramuscular, intraperitoneal, 15 intracerebroespinhal, subcutânea, intraarticular, intrassinovial, intratecal, oral, local ou inalatória.
Em realizações preferidas, as formulações são administradas ao mamífero através de administração subcutânea (ou seja, abaixo da pele). Para estes propósitos, a formulação pode ser injetada utilizando-se uma seringa. 20 Entretanto, são disponíveis outros dispositivos para administração da formulação, tais como dispositivos de injeção (por exemplo, os dispositivos Inject-ease® e Genject®); canetas injetoras (tais como GenPen®); dispositivos autoinjetores, dispositivos sem agulha (tais como MediJector® e BioJector®); e sistemas de fornecimento de emplastros subcutâneos.
Em realização específica, a presente invenção refere-se a kits para uma unidade de administração de dose única. Esses kits compreendem um recipiente com formulação aquosa de anticorpo ou proteína terapêutica, que incluem seringas previamente cheias com uma ou mais câmaras. Exemplos de seringas previamente cheias são disponíveis através da Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha.
A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz”) da proteína dependerá, por exemplo, da condição a ser tratada, da severidade e 5 do transcurso da condição, se a proteína é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação à proteína, tipo de proteína utilizado e critério do método atendente. A proteína é adequadamente administrada ao paciente por uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos e pode ser administrada ao paciente a qualquer momento a partir do diagnóstico em diante. A proteína pode ser administrada como tratamento único ou em conjunto com outras drogas ou terapias úteis no tratamento da condição em questão.
Quando a proteína selecionada for um anticorpo, cerca de 0,1 a 20 mg/kg é dose inicial possível para administração ao paciente se, por 15 exemplo, através de uma ou mais administrações separadas. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado através de técnicas convencionais.
Os usos de formulação anti-lgE (tal como rhuMAbE-25, rhMAbE- 26, Hu-901) incluem o tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas mediadas por IgE, infecções parasíticas, cistite intersticial e asma, por exemplo. Dependendo da doença ou disfunção a ser tratada, quantidade terapeuticamente eficaz (tal como cerca de 1 a 15 mg/kg) do anticorpo anti-lgE é administrada ao paciente.
Em outra realização da presente invenção, é fornecido um artigo manufaturado que contém a formulação e fornece preferencialmente instruções para o seu uso. O artigo manufaturado compreende um recipiente. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas (tais como ampolas de câmara dupla), seringas (tais como seringas de câmara única ou dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém a formulação e o rótulo sobre o recipiente, ou a ele associado, pode indicar instruções de 5 reconstituição e/ou uso. O rótulo pode ainda indicar que a formulação é útil ou destinada a administração subcutânea. O recipiente que contém a formulação pode ser uma ampola de múltiplo uso, que permite administrações repetidas (tais como de duas a seis administrações) da formulação reconstituída. O artigo manufaturado pode compreender adicionalmente um segundo recipiente que 10 compreende um diluente apropriado (tal como BWFI). Mediante a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concentração final de proteína será geralmente de pelo menos 50 mg/ml. O artigo manufaturado pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e 15 bulas com instruções de uso.
A presente invenção será compreendida mais completamente através de referência aos exemplos a seguir. Eles não deverão, contudo, ser interpretados como limitadores do escopo da presente invenção. Todas as citações ao longo do relatório descritivo são expressamente incorporadas ao 20 presente como referência.
Em outra realização, a presente invenção fornece um artigo manufaturado que compreende as formulações descritas no presente para administração em dispositivo autoinjetor. Um autoinjetor pode ser descrito como dispositivo de injeção que, mediante ativação, fornecerá o seu conteúdo 25 sem ação necessária adicional do paciente ou administrador. Eles são particularmente apropriados para a automedicação de formulações terapêuticas quando a taxa de fornecimento necessitar ser constante e o tempo de fornecimento for de mais que alguns momentos.
As formulações do anticorpo anti-lgE monoclonal rhuMAbE25 foram preparadas a partir de E25 a granel, lote residual K9094A (40 mg/ml de 5 rhuMAb E25, 85 mM de trehalose, 5 mM de histidina, pH 6, 0,01% de Tween 20) ou conjunto Q de rhuMAbE25 (5 mg/ml de rhuMAb E25, 25 mM de Tris, 200 mM de NaCI).
Soluções aquosas de rhuMAbE25 foram preparadas através de * diálise em tampões dieferentes (20 mM de His-HCI e 200 mM de Arg-HCI, pH 10 6,0) a 2-8 °C, utilizando Conjunto de Diálise e Lisador Slide A (Pierce). As amostras foram transferidas em seguida para o reservatório de amostra de um microconcentrador por centrifugação Centricon-30 (Amicon). As proteínas foram concentradas através de fiação do concentrador Centricon-3 a 4000 até 5000 g até atingir-se a concentração de proteína desejada.
As amostras foram concentradas em seguida até cerca de 150 mg/ml de rhuMAb E25 utilizando ultrafiltragem. Tween 20 foi adicionado a cada preparação até concentração final de 0,02%. Todas as formulações foram > filtradas, enchidas assepticamente em ampolas FormaVitrum de 3 cc e tampadas com tampas Diakyo de 13 mM em sala Classe 100.
Estudos de estabilidade: todas as formulações foram preenchidas em 1 ml em ampolas de vidro FormaVitrum de 3 cc e tampadas com tampas Diakyo de 13 mm em suíte de enchimento estéril Classe 100. As ampolas 25 foram colocadas a -70, 2 a 8, 15, 30 e 40 °C em recipientes impermeáveis à luz.
Estudo de agitação: parcelas de cada formulação foram colocadas nas ampolas de vidro. As ampolas foram agitadas horizontalmente em Agitador Superior de Bancada Glas-Col à temperatura ambiente. O agitador foi ajustado em 70 com comprimento de braço de 30 cm (máximo). Após agitação, as amostras foram inspecionadas e analisadas de acordo com o protocolo a seguir.
Estudo de congelamento e descongelamento: amostras de E25 sofreram três ciclos de congelamento e descongelamento. Cada ciclo consistiu de congelamento a -70 °C por uma noite e descongelamento subseqüente à temperatura ambiente por cerca de uma hora. Após cada ciclo, as amostras foram inspecionadas visualmente utilizando uma caixa leve para determinar a cor e a claridade do líquido. A turbidez e agregados solúveis foram medidos de acordo com o protocolo descrito abaixo.
Métodos analíticos: amostras de estabilidade foram analisadas através dos métodos descritos na Tabela 1. TABELA 1 MÉTODOS ANALITICOS
A cor, aparência e claridade da amostra foram determinadas visualmente contra o fundo branco e preto da inspeção e comparados com volume igual de controle negativo. As amostras deverão ser cuidadosamente giradas para garantir mistura homogênea, mas não tão vigorosamente de forma a criar bolhas de ar.
Foi utilizada coluna TSK SUPER SW3000 (4,6 x 300 mm) em sistema de cromatografia HP 1100. A coluna foi carregada com 20 pg de proteína e eluída em 0,1 M de fosfato de potássio, pH 6,8. A amostra foi medida a 280 nm por um detector de UV.
Os experimentos de HIC foram conduzidos através da utilização de coluna TSK Fenil-5PW (7,5 x 75 mm) (TosoHaas) em um sistema de cromatografia de líquidos HP 1100. A coluna foi carregada com 28 pg de fragmentos de Fab digeridos por papaína e eluída com gradiente de concentração de sulfato de amónio em tampão de 20 mM de Tris de 2 M a 0 M. Os picos foram monitorados a 210 nm por um detector de UV.
A turbidez das amostras foi determinada em cubeta com comprimento de trajeto de 1 cm, utilizando espectrômetro HP. A turbidez foi calculada como absorção média de 340 a 360 nm. e A atividade do anticorpo monoclonal anti-lgE foi determinada através de teste de inibição da ligação de receptores. As amostras foram diluídas até encontrar-se dentro da faixa da curva padrão de 100 e 1,56 pg/ml em diluente de teste contendo tampão de fosfato, BSA a 0,5%, polissorbato 20 a 0,05% e Timerosol a 0,01%. Uma placa de microtítulos foi revestida com receptor de IgE, incubada em seguida com a IgE-biotina e amostra anti-lgE diluída. A quantidade de IgE-biotina ligada ao receptor que se correlacionou com a atividade de anticorpo monoclonal anti-lgE foi medida utilizando Estreptavidina-HRP. Os dados foram analisados utilizando um programa de adequação de curva logística de quatro parâmetros. f A concentração de anticorpo foi obtida em um espectrofotômetro de conjunto de diodos Hewlett Packard 8453 com cubeta de quartzo de 1 cm. A concentração foi calculada utilizando absorção de 5 1,5 cm'1 (mg/ml)'1. RESUMO DE FORMULAÇÕES LÍQUIDAS:
Dados de estabilidade para 80 mg/ml de E25 em formulação de histidina e trehalose: a. Cromatografia de exclusão de tamanho para a medição de agregados solúveis e fragmentos. b. Cromatografia de interação hidrofóbica para E25 digerido por papaína. c. Teste de inibição de ligação de receptores de IgE. d. Diâmetro externo médio (340 a 360 nm). ESTUDO DE AGITAÇÃO:
Formulação 1: 156 mg/ml de E25, 200 mM de ArgCI, 23 mM de His, 0,02% T20.
Formulação 2: 150 mg/ml de E25, 182 mM de ArgCI, 20 mM de 5 His, 0,02% T20.
Formulação 1: 156 mg/ml de E25, 200 mM de ArgCI, 23 mM de His, 0,02% T20.
Formulação 2: 150 mg/ml de E25, 182 mM de ArgCI, 20 mM de His, 0,02% T20.
Amostras de formulações líquidas do anticorpo monoclonal anti- lgE (E26) foram preparadas em 20 mM de tampões e armazenadas em seguida a 30 °C e 40 °C. A estabilidade de E26 foi determinada através de cromatografia e medições da atividade. A cromatografia de exclusão de tamanho foi utilizada para determinar os agregados solúveis e a cromatografia de interação hidrofóbica de amostra digerida por pepsina foi utilizada para medir a isomerização. A atividade da amostra foi monitorada através do uso de um teste de inibição da ligação de receptor de IgE. Conforme exibido nas Figuras 1, 2 e 3, a degradação de E26 é altamente dependente do pH dos tampões. O E26 aparentemente é mais estável em pH de cerca de 6,0.
A formação de particulados é desafio importante para fabricar a formulação líquida sob alta concentração, pois ela normalmente aumenta com o aumento da concentração de proteína sob condições tensionadas. A Figura 4 exibe o resultado do estudo de agitação para formulação líquida de E26 10 concentrada. A formulação foi preparada em 20 mM de succinato, 192 mM de trehalose sob pH 6,0 com concentração diferente de polissorbato 20. A formulação particulada foi monitorada através da medição da turbidez. O resultado demonstra que a turbidez da solução E26 aumenta com o tempo de agitação. A adição de pelo menos 0,01% de polissorbato é essencial para 15 reduzir a formação de particulado sob a condição tensionada. Resultados similares também foram observados para formulação líquida de E25 concentrada.
A Figura 5 exibe a formulação líquida de 150 mg/ml de E25 20 preparados através da reconstituição do E25 liofilizado. O aumento da concentração de sal inibe a formação de particulado reversível e resulta na redução da leitura da turbidez. Dentre todos os sais testados, a formulação com Arg-HCI aparentemente possui a menor turbidez. O efeito da concentração de sal sobre a redução da leitura de turbidez também foi observado para E25 25 preparado utilizando processo de TFF.
A formulação líquida de E25 na presença de ArgHCI aparentemente também possui melhor estabilidade que outras formulações líquidas. As Figuras 6 e 7 exibem o estudo de estabilidade de E25 a 150 mg/ml em formulações líquidas que contêm ArgHCI, CaCI2 e MgCI2. Para formulações líquidas que contêm ArgHCI com ou sem sacarose, existe pouca diferença na sua estabilidade em termos de turbidez, isomerização e fragmentação. As formulações líquidas que contêm ArgHCI são mais estáveis que a formulação que contém MgCI2 e CaCI2.
A Figura 8 exibe os resultados de um estudo de estabilidade de formulação líquida E25 com formulações de acetato e histidina. A formulação 10 com histidina possui pH mais alto que a formulação de acetato. Os resultados demonstraram claramente que o E25 em formulação liquida de ArgHCI e histidina é mais estável que sob outras condições.
A alta concentração de E25 pode formar gel sólido na presença 15 de certos íons, tais como citrato, succinato e sulfato (Tabela I), particularmente sob temperatura de armazenagem de 2 a 8 °C. O uso de arginina-HCI como excipiente permite-nos formular E25 até mais de 200 mg/ml sem a formação de gel ou precipitado. TABELA 1 EFEITO DE VÁRIOS EXCIPIENTES SOBRE A FORMAÇÃO DE GEL DEE25 A 125 MG/ML, PH DE CERCA DE 6,0
Este exemplo ilustra a preparação de forma não glicosilada de uma proteína desejada ou anticorpo através da expressão recombinante de E. 5 coli.
A seqüência de DNA que codifica o anticorpo ou proteína desejada é inicialmente amplificada utilizando primers de PCR selecionados. Os primers deverão conter locais de enzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas de restrição sobre o vetor de expressão selecionado. Pode ser empregada uma série de vetores de expressão. Um exemplo de vetor apropriado é pBR322 (derivado de E. coli;vide Bolivar et al, Gene, 2: 95 (1977)), que contém genes para resistência a tetraciclina e ampicilina. O vetor é digerido com enzima de restrição e desfosforilado. As seqüências amplificadas por PCR são ligadas em seguida ao vetor. O vetor incluirá 5 preferencialmente seqüências que codificam um gene de resistência a antibióticos, promotor de trp, líder póli-his (que inclui os primeiros seis códons STII, seqüência póli-his e local de divisão de enteroquinase), a região de codificação do anticorpo ou proteína desejada, terminal de transcrição lambda e gene argU. Além disso, o vetor pode incluir pelo menos partes não 10 significativas das seções 5’ e 3’ não traduzidas do ácido nucleico de seqüência nativa que codifica o anticorpo ou a proteína desejada.
A mistura de ligação é utilizada em seguida para transformar uma linhagem de E. coli selecionada, utilizando os métodos descritos em Sambrook et al, acima. Os transformadores são identificados através da sua capacidade 15 de crescimento sobre placas LB e as colônias resistentes a antibióticos são selecionadas em seguida. DNA de plasmídeo pode ser isolado e confirmado através de análise de restrição e seqüenciamento de DNA.
Clones selecionados podem ser cultivados por uma noite em meio de cultivo líquido tal como caldo de LB suplementado com antibióticos. O 20 cultivo por uma noite pode ser utilizado em seguida para inocular cultivo em escala maior. As células são cultivadas em seguida até densidade ótica desejada, durante a qual o promotor de expressão é ligado.
Após o cultivo das células por várias horas mais, as células podem ser colhidas através de centrifugação. A pelota celular obtida através da 25 centrifugação pode ser solubilizada utilizando vários agentes conhecidos na técnica e a proteína desejada solubilizada ou anticorpo pode ser purificado em seguida, utilizando coluna quelante metálica sob condições que permitem a firme ligação do anticorpo ou proteína solubilizada.
O anticorpo ou proteina desejada pode ser expressa em E. coli em forma marcada por póli-his, utilizando o procedimento a seguir. O DNA codificador do anticorpo ou proteína desejada é inicialmente amplificado, utilizando primers de PCR selecionados. Os primers conterão locais de 5 enzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas de restrição sobre o vetor de expressão selecionado e outras seqüências úteis que proporcionam início de tradução eficiente e confiável, purificação rápida sobre coluna de quelação metálica e remoção proteolítica com enteroquinase. As seqüências marcadas com póli-his amplificadas por PCR são ligadas em 10 seguida em um vetor de expressão, que é utilizado para transformar um hospedeiro E. coli com base na linhagem 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (laclq). Os transformadores são cultivados em primeiro lugar em LB que contém 50 mg/ml de carbenicilina a 30EC com agitação até atingir-se OD600 de 3 a 5. Os cultivos são diluídos em seguida de 50 a 100 15 vezes em meios CRAP (preparados através da mistura de 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de sódio 2H2O, 1,07 g de KCI, 5,36 g de extrato de levedura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF em 500 ml de água, bem como 110 mM de MPOS, pH 7,3, 0,55% (p/v) de glicose e 7 mM de MgSÜ4) e cultivados por cerca de vinte a trinta horas a 30EC com agitação. As amostras 20 são removidas para verificar a expressão atarvés de análise SDS-PAGE e o cultivo a granel é centrifugado para peletizar as células. As pelotas celulares são congeladas até a purificação e redobra.
Pasta de E. colide fermentações de 0,5 a 1 I (pelotas de 6 a 10 g) é novamente suspensa em dez volumes (p/v) em tampão de 7M de guanidina, 25 20 mM de Tris, pH 8. Sulfito de sódio sólido e tetrationato de sódio é adicionado para elaborar concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e a solução é agitada por uma noite a 4EC. Esta etapa resulta em proteína desnaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados através de sulfitolização. A solução é centrifugada a 40.000 rpm em Ultracentrifugador Beckman por trinta minutos. O sobrenadante é diluído com três a cinco volumes de tampão de coluna de quelato metálico (6M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) e filtrado através de filtros de 0,22 micra 5 para clarificação. O extrato clarificado é carregado sobre uma coluna de 5 ml de quelato metálico Qiagen Ni-NTA equilibrada no tampão de coluna de quelato metálico. A coluna é lavada com tampão adicional contendo 50 mM de imidazol (Calbiochem, grau Utrol), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão que contém 250 mM de imidazol. Frações que contêm a proteína desejada são 10 reunidas e armazenadas a 4EC. A concentração de proteína é estimada através da sua absorção a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na sua seqüência de aminoácidos.
As proteínas são novamente dobradas através de lenta diluição da amostra em tampão de redobra recém preparado que consiste de: 20 mM 15 de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCI, 2,5 M de uréia, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina e 1 mM de EDTA. Os volumes de redobra são selecionados de tal forma que a concentração final de proteína seja de 50 a 100 pg/ml. A solução em redobra é agitada suavemente a 4EC por 12 a 36 horas. A reação de redobra é resfriada através da adição de TFA até concentração final de 0,4% (pH de 20 cerca de 3). Antes da purificação adicional da proteína, a solução é filtrada através de filtro de 0,22 micra e adiciona-se acetonitrila até concentração final de 2 a 10%. A proteína redobrada é cromatografada sobre coluna de fase reversa Poros R1/H utilizando tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição com gradiente de acetonitrila de 10 a 80%. Parcelas de frações com absorção A280 25 são analisadas sobre géis de SDS poliacrilamida e frações que contêm proteína redobrada homogênea são reunidas. Geralmente, a espécie dobrada adequadamente da maior parte das proteínas é eluída sob as concentrações mais baixas de acetonitrila, pois estas espécies são as mais compactas com seus interiores hidrofóbicos isolados contra interação com a resina de fase reversa. Espécies agregadas são normalmente eluídas em concentrações de acetonitrila mais altas. Além da resolução de formas mal dobradas de proteínas da forma desejada, a etapa de fase reversa também remove endotoxina das 5 amostras.
Frações que contêm o anticorpo ou proteína desejada dobrada são reunidas e a acetonitrila é removida utilizando suave fluxo de nitrogênio dirigido à solução. As proteínas são formuladas em 20 mM de Hepes, pH 6,8 com 0,14 M de cloreto de sódio e manitol a 4% através de diálise ou filtragem 10 de gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão de formulação e filtradas estéreis.
Este exemplo ilustra a preparação de formas potencialmente 15 glicosiladas do anticorpo ou proteína desejada através de expressão recombinante em células de mamíferos.
O vetor, pRK5 (vide a Patente EP 307.247, publicada em quinze de março de 1989), é empregado como o vetor de expressão. Opcionalmente, DNA que codifica o anticorpo ou proteína desejada é ligado a pRK5 com 20 enzimas de restrição selecionadas para permitir a inserção desse DNA utilizando métodos de ligação tais como os descritos em Sambrook et al, acima.
Em uma realização, as células hospedeiras selecionadas podem ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são cultivadas até a 25 confluência em placas de cultivo de tecidos em meios tais como DMEM suplementado com soro de feto de bezerro e, opcionalmente, componentes de nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 pg de DNA que codifica o anticorpo ou proteína desejada ligado a pRK5 são misturados com cerca de 1 pg de DNA que codifica o gene VA RNA (Thimmappaya et al, Cell,31: 543 (1982)) e dissolvidos em 500 pl de 1 mM de Tris-HCI, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCh. A esta mistura, adiciona-se em gotas 500 jxl de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCI, 1,5 mM de NaPC>4 e permite-se a formação de um 5 precipitado por dez minutos a 25 °C. O precipitado é suspenso, adicionado às células 293 e mantido em deposição por cerca de quatro horas a 37 °C. O meio de cultivo é aspirado e 2 ml de glicerol a 20% em PBS são adicionados por trinta segundos. As células 293 são lavadas em seguida com meio livre de soro, adiciona-se meio novo e as células são incubadas por cerca de cinco 10 dias.
Cerca de 24 horas após as transfecções, o meio de cultivo é removido e substituído com meio de cultivo (isolado) ou meio de cultivo que contém 200 jiCi/ml de 35S-cisteína e 200 pCi/ml de 35S-metionina. Após incubação por doze horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado em 15 filtro de fiação e carregado sobre gel de SDS a 15%. O gel processado pode ser seco e exposto a filme por período de tempo selecionado para revelar a presença do anticorpo ou proteína desejada. Os cultivos que contêm células transfectadas podem sofrer incubação adicional (em meio livre de soro) e o meio é testado em biotestes selecionados.
Em método alternativo, o anticorpo ou proteína desejada pode ser introduzido em células 293 de forma transitória, utilizando o método de sulfato de dextran descrito por Somparyrac et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 12: 7575 (1981). Células 293 são cultivadas até densidade máxima em frasco agitador e adiciona-se 700 pg de DNA que codifica o anticorpo ou proteína desejada ligada a pRK5. As células são concentradas em primeiro lugar do frasco agitador através de centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de DNA e dextran é incubado sobre a pelota celular por quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% por noventa segundos, lavadas com meio de cultivo de tecido e reintroduzidas no frasco agitador que contém meio de cultivo de tecidos, 5 pg/ml de insulina bovina e 0,1 pg/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, os meios condicionados são centrifugados e filtrados para remover células e fragmentos. A amostra que contém a proteína ou anticorpo 5 desejado expresso pode ser concentrada e purificada em seguida através de qualquer método selecionado, tal como diálise e/ou cromatografia de coluna.
Em outra realização, o anticorpo ou proteína desejada pode ser expresso em células de CHO. O DNA que codifica o anticorpo ou proteína desejada ligada a pRK5 pode ser transfectado em células de CHO utilizando 10 reagentes conhecidos tais como CaPO4 ou DEAE-dextran. Conforme descrito acima, os cultivos celulares podem ser incubados e o meio substituído com meio de cultivo (isolado) ou meio que contém uma radiomarca tal como 35S- metionina. Após determinar a presença do anticorpo ou proteína desejada, o meio de cultivo pode ser substituído com meio livre de soro. Preferencialmente, 15 os cultivos são incubados por cerca de seis dias e, em seguida, o meio condicionado é colhido. O meio que contém o anticorpo ou proteína desejada expressa pode ser concentrado e purificado em seguida através de qualquer método selecionado.
Variantes marcadas por epítopo da proteína ou anticorpo 20 desejado podem também ser expressas em células de CHO hospedeiras. O DNA que codifica o anticorpo ou proteína desejada ligado a pRK5 pode ser subclonado do vetor pRK5. O insert© de subclone pode sofrer PCR para fundir na estrutura com uma marca de epítopo selecionada, tal como uma marca póli- his em um vetor de expressão de bacilovirus. O DNA marcado por póli-his que 25 codifica o inserto de anticorpo ou proteína desejada pode ser subclonado em seguida em um vetor dirigido por SV40 que contém um marcador de seleção tal como DHFR para seleção de clones estáveis. Por fim, as células de CHO podem ser transfectadas (conforme descrito acima) com o vetor dirigido por SV40. A marcação pode ser realizada, conforme descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultivo que contém o anticorpo ou proteína desejada marcada poe póli-His expresso pode ser concentrado e purificado em seguida através de qualquer método selecionado, tal como através de cromatografia de 5 afinidade de Ni2+-quelato.
O anticorpo ou proteína desejada pode também ser expressa em células de CHO e/ou COS através de procedimento de expressão transitória ou em células de CHO através de outro procedimento de expressão estável.
A expressão estável em células de CHO é realizada através da 10 utilização do procedimento a seguir. As proteínas são expressas na forma de construção de IgG (imunoadesina), em que as seqüências de codificação para as formas solúveis (tais como domínios extracelulares) das proteínas correspondentes são fundidas a uma seqüência de região constante de lgG1 que contém os domínios CH2, CH2 e de articulação e/ou é uma forma marcada 15 por póli-His.
Após a amplificação por PCR, os DNAs correspondentes são subclonados em um vetor de expressão de CHO, através da utilização de técnicas padrão conforme descrito em Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology,Unidade 3.16, John Wiley & Sons (1997). São construídos 20 vetores de expressão de CHO para conter locais de restrição 5’ e 3’ compatíveis do DNA de interesse para permitir o lançamento conveniente de cDNAs. O vetor utilizado na expressão em células CHO é conforme descrito em Lucas et al, Nucl. Acids Res.24: 9 1774-1779 (1996), e utiliza o promotor/amplificador precoce de SV40 para dirigir a expressão do cDNA de 25 interesse e di-hidrofolato reductase (DHFR). A expressão de DHFR permite seleção para manutenção estável do plasmídeo em seguida à transfecção.
Doze microgramas do DNA de plasmídeo desejado são introduzidos em cerca de dez milhões de células de CHO, utilizando reagentes de transfecção disponíveis comercialmente Superfect® (Quiagen), Dosper® ou Fugene® (Boehringer Mannheim). As células são cultivadas conforme descrito em Lucas et al, acima. Cerca de 3 x 10‘7 células são congeladas em uma ampola para produção e crescimento adicional conforme descrito abaixo.
As ampolas que contêm o DNA de plasmídeo são derretidas através de colocação em banho de água e misturadas através de turbilhonamento. O conteúdo é colocado através de pipeta em um tubo centrifugador contendo 10 ml de meios e centrifugado a 1000 rpm por cinco minutos. O sobrenadante é aspirado e as células são novamente suspensas em 10 ml de meios seletivos (0,2 pm de PS20 filtrado com 0,2 pm de soro bovino fetal diafiltrado a 5%). As células são então parceladas em um centrifugador de 100 ml contendo 90 ml de meios seletivos. Após um a dois dias, as células são transferidas para um centrifugador de 250 ml preenchido com 150 ml de meio de crescimento seletivo e incubadas a 37 °C. Após outros dois a três dias, centrifugadores de 250 ml, 500 ml e 2000 ml são semeados com 3 x 105 células/ml. O meio celular é substituído com meios novos através de centrifugação e re-suspensão em meio de produção. Embora qualquer meio de CHO apropriado possa ser empregado e pode ser utilizado na realidade um meio de produção descrito na Patente US 5.122.469, emitida em 16 de junho de 1992. Um centrifugador de produção de três litros é semeado a 1,2 x 106 células/ml. No dia 0, é determinado o número de células e o pH. No dia 1, o centrifugador é amostrado e inicia-se o espargimento com ar filtrado. No dia 2, o centrifugador é amostrado, a temperatura modificada para 33 °C e foram retirados 30 ml de glicose a 500 g/l e 0,6 ml de antiespumante a 10% (por exemplo, emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, Emulsão de Grau Médico 365 da Dow Corning). Ao longo da produção, o pH é ajustado conforme o necessário para mantê-lo em volta de 7,2. Após dez dias, ou até que a viabilidade caísse abaixo de 70%, o cultivo celular é colhido através de centrifugação e filtragem através de um filtro de 0,22 pm. O filtrado foi armazenado a 4 °C ou carregado imediatamente sobre colunas para purificação.
Para as construções marcadas com póli-His, as proteínas são 5 purificadas utilizando uma coluna de Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazol aos meios condicionados até concentração de 5 mM. Os meios condicionados são bombeados em uma coluna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada a 4 °C, em 20 mM de Hepes, pH 7,4, tampão contendo 0,3 M de NaCl e 5 mM de imidazol em velocidade de fluxo de 4 a 5 m!/min. Após 10 carregamento, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína foi eluída com tampão de equilíbrio contendo 0,25 M de imidazol. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em um tampão de armazenagem contendo 10 mM de Hepes, 0,14 M de NaCl e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna de 25 ml de G25 Superfino (Pharmacia) 15 e armazenada a -80 °C.
Construções de imunoadesína (contendo Fc) são purificadas a partir dos meios condicionados conforme segue. O meio condicionado é bombeado em uma coluna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que havia sido equilibrada em 20 mM de tampão fosfato de Na, pH 6,8. Após o 20 carregamento, a coluna é lavada extensamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada através do recolhimento de frações de 1 ml em tubos contendo 275 pl de 1 M de tampão Tris, pH 9. A proteína altamente purificada é subseqüente dessalinizada em tampão de 25 armazenagem conforme descrito acima para as proteínas marcadas por póli-His. A homogeneidade é determinada através de géis de SDS poliacrilamida e seqüenciamento de aminoácidos N-terminais por degradação de Edman.
O método a seguir descreve a expressão recombinante da proteína ou anticorpo desejado em levedura.
Em primeiro lugar, são construídos vetores de expressão de levedura para a produção intracelular ou secreção da proteína ou anticorpo desejado do promotor de ADH2/GAPDH. DNA codificador da proteína ou anticorpo desejado e o promotor é inserido em locais de enzimas de restrição apropriados no plasmídeo selecionado, a fim de dirigir a expressão intracelular. Para a secreção, DNA codificador da proteína ou anticorpo desejado pode ser clonado no plasmídeo selecionado, juntamente com DNA codificador do promotor de ADH2/GAPDH, um peptídeo de sinal nativo ou outro peptídeo de sinal de mamífero ou, por exemplo, uma seqüência líder/sinal de secreção de invertase ou fator alfa de levedura, e seqüências de ligação (se necessário) 15 para a expressão da proteína ou anticorpo desejado.
Células de leveduras, tais como linhagem de levedura AB110, podem ser transformadas em seguida com os plasmídeos de expressão descritos acima e cultivadas em meios de fermentação selecionados. Os sobrenadantes de levedura transformados podem ser analisados através de 20 precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação através de SDS- PAGE, seguida por manchas dos géis com manchas de Azul de Coomassie.
A proteína ou anticorpo recombinante pode ser subseqüentemente isolado e purificado através de remoção das células de levedura do meio de fermentação, através de centrifugação e concentração do 25 meio em seguida, utilizando-se filtros de cartuchos selecionados. O concentrado que contém o anticorpo ou proteína recombinante pode ser adicionalmente purificado utilizando resinas de cromatografia de coluna selecionadas.
O método a seguir descreve a expressão recombinante da 5 proteína ou anticorpo desejado em células de insetos infectadas por bacilovírus.
A codificação de seqüência para a proteína ou anticorpo desejado é fundida antes de uma marca de epítopo contida em um vetor de expressão de bacilovírus. Essas marcas de epítopos incluem marcas póli-his e marcas de 10 imunoglobulina (como regiões Fc de IgG). Uma série de plasmídeos pode ser empregada, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos disponíveis comercialmente, tais como pVL1393 (Novagen). Resumidamente, a seqüência codificadora da porção desejada da proteína ou anticorpo, tal como a seqüência codificadora do domínio extracelular de uma proteína 15 transmembranosa ou da seqüência codificadora da proteína madura, caso a proteína seja extracelular, é amplificada através de PCR com primers complementares às regiões 5’ e 3’. O “primer"5’ pode incorporar locais de enzimas de restrição laterais (selecionados). O produto é digerido em seguida com as enzimas de restrição selecionadas e subclonado no vetor de 20 expressão.
Bacilovírus recombinante é gerado através de cotransfecção do plasmídeo acima e DNA virai BaculoGold® (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda (“Sf9”) (ATCC CRL 1711), utilizando lipofectina (disponível comercialmente através da GIBCO-BRL). Após quatro a cinco dias 25 de incubação a 28 °C, os vírus liberados são colhidos e utilizados para amplificações adicionais. Expressão de proteínas e infecção virai são realizadas conforme descrito por 0'Reilley et al, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford, Inglaterra: Oxford University Press (1994).
Proteína ou anticorpo marcado por póli-his expresso pode ser purificado em seguida, por exemplo, através de cromatografia de afinidade de Ni2+-que1ato conforme segue. São preparados extratos a partir de células Sf9 infectadas por vírus recombinantes, conforme descrito por Rupert et al, Nature, 362: 175-179 (1993). Resumidamente, as células Sf9 são lavadas, novamente suspensas em tampão de sonicação (25 ml de Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI2; 0,1 mM de EDTA; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; 0,4 M de KCI) e sonicadas por duas vezes por vinte segundos sobre gelo. Os sonicados são 10 limpos através de centrifugação e o sobrenadante é diluído cinqüenta vezes em tampão de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 |im. Uma coluna de agarose Ni2+-NTA (disponível comercialmente através da Qiagen) é preparada com volume de leito de 5 ml, lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão de carregamento. O extrato celular filtrado é carregado sobre a coluna a 0,5 ml por minuto. A coluna é lavada até a linha básica A28o conn tampão de carregamento, quando se inicia o recolhimento de fração pontual. Em seguida, a coluna é lavada com tampão de lavagem secundário (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 6,0), que elui proteína não especificamente ligada. Após atingir novamente a linha básica A28o, a coluna é desenvolvida com 0 a 500 mM de gradiente de imidazol no tampão de lavagem secundário. Frações de 1 ml são recolhidas e analisadas através de SDS-PAGE e manchas de prata ou Western blot com Ni2+-NTA conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Frações que contêm a proteína ou anticorpo marcado com His10 eluído são reunidas e dialisadas contra tampão de carregamento.
Alternativamente, a purificação da proteína ou anticorpo marcado com IgG (ou marcado com Fc) pode ser realizada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo, por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína A ou Proteína G.
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que 5 podem especificamente ligar a proteína de interesse ou o antígeno desejado.
As técnicas de produção dos anticorpos monoclonais são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Goding, acima. Os imunogenes que podem ser empregados incluem proteína desejada ou anticorpo alvo purificado, proteínas de fusão que contêm a proteína desejada 10 ou antígeno alvo e células que expressam essa proteína ou antígeno recombinante sobre a superfície celular. A seleção do imunogene pode ser realizada pelo técnico no assunto sem experimentações indevidas.
Camundongos, tais como Balb/c, são imunizados com o imunogene de proteína desejada ou antígeno alvo emulsificado em adjuvante 15 de Freund completo e injetados por via subcutânea ou intraperitoneal em quantidade de 1 a 100 microgramas. Alternativamente, o imunogene é emulsificado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton MT, Estados Unidos) e injetado nas almofadas das patas traseiras dos animais. Os camundongos imunizados são então amplificados em dez a 20 doze dias mais tarde com imunogene adicional emulsificado no adjuvante selecionado. Em seguida, por várias semanas, os camundongos podem também ser amplificados com injeções de imunização adicionais. Amostras de soro podem ser obtidas periodicamente dos camundongos através de sangramento retroorbital para testes em ensaios ELISA para a detecção de 25 anticorpos dirigidos para a proteína ou antígeno desejado.
Após a detecção do título de um anticorpo apropriado, os animais "positivos" para anticorpos podem ser injetados com uma injeção intravenosa final da proteína desejada ou antígeno alvo. Três a quatro dias mais tarde, os camundongos são sacrificados e as células do baço são colhidas. As células do baço são então fundidas (utilizando polietileno glicol a 35%) em uma linhagem celular de mieloma murino selecionada, tal como P3X63AgU.1, disponível através de ATCC, n° CRL 1597. As fusões geram células de 5 hibridoma que podem então ser colocadas em placas sobre placas de cultivo de tecidos com 96 cavidades contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma são selecionadas em ELISA pela 10 reatividade contra a proteína desejada ou antígeno alvo. A determinação de células de hibridoma “positivas" que segregam esses anticorpos monoclonais encontra-se dentro dos conhecimentos da técnica.
As células de hibridoma positivas podem ser injetadas por via intraperitoneal em camundongos Balb/c singeneicos para produzir ascite que 15 contém esses anticorpos monoclonais. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas em frascos de cultivo de tecidos ou garrafas cilíndricas. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos na ascite pode ser realizada utilizando precipitação de sulfato de amónia, seguida por cromatografia de exclusão de gel. Alternativamente, pode-se empregar 20 cromatografia de afinidade com base na ligação de anticorpos a proteína A ou proteína G.
A proteína desejada, em forma nativa ou recombinante, pode ser 25 purificada através de uma série de métodos padrão na técnica de purificação de proteínas. Pró-polipeptídeo, polipeptídeo maduro ou formas de pré- polipeptídeo da proteína desejada podem ser purificados, por exemplo, através de cromatografia de imunoafinidade, utilizando anticorpos específicos para a proteína desejada. De forma geral, uma coluna de imunoafinidade é construída através de acoplamento covalente do anticorpo que ligga especificamente a proteína desejada a uma resina cromatográfica ativada.
Imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros 5 imunológicos através de precipitação com sulfato de amónia ou de purificação sobre Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway NJ, Estados Unidos). De forma similar, são preparados anticorpos monoclonais a partir de fluido de ascite de camundongo, através de precipitação de sulfato de amónio ou cromatografia sobre Proteína A imobilizada. Imunoglobulina 10 parcialmente purificada é ligada covalentemente a uma resina cromatográfica tal como SEPHAROSE® ativada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é acoplado à resina, a resina é bloqueada e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.
Essa coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação da 15 proteína desejada através da preparação de uma fração de células que a expressam em forma solúvel. Esta preparação é derivada da solubilização de toda a célula ou de uma fração subcelular obtida através de centrifugação diferencial pela adição de detergente ou outros métodos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, proteína solúvel que contém uma seqüência de sinal 20 pode ser segregada em quantidade útil no meio em que são cultivadas as células.
A preparação solubilizada que contém a proteína desejada passa sobre a coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições que permitem a absorção preferencial da proteína desejada (por exemplo, tampões 25 de alta resistência iônica na presença de detergente). Em seguida, a coluna é eluída sob condições que interrompem a ligação de anticorpo a proteína (por exemplo, tampão de baixo pH, tal como cerca de pH 2 a 3, ou alta concentração de um caotropo, tal como uréia ou íon de tiocianato) e a proteína desejada é recolhida em seguida.
Claims (12)
1. Formulação líquida estável com baixa turbidez, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) anticorpo monoclonal anti-lgE, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em uma quantidade de 150 mg/ml, em que o anticorpo anti-lgE ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende três CDRs de uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO:1 e três CDRs de uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO:4, (b) arginina-HCI em uma quantidade de 200 mM; (c) histidina em uma quantidade 20 mM; e (d) polissorbato em uma quantidade de 0,01 a 0,1%, em que a formulação possui adicionalmente pH 6,0.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-lgE compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO:1 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO:4, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polissorbato está em uma quantidade de 0,02%.
4. Artigo manufaturado, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente que inclui a formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Artigo manufaturado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma seringa.
6. Artigo manufaturado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a seringa é contida adicionalmente em um dispositivo de injeção.
7. Artigo manufaturado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de injeção é um auto-injetor.
8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma dis função mediada por IgE em um paciente.
9. Formulação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a disfunção mediada por IgE é selecionada a partir do grupo que consiste em: 5 (i) rinite alérgica, asma, asma alérgica, asma não alérgica, der matite atópica e gastroenteropatia; ou (ii) hipersensibilidade, aspergilose bronquiopulmonar alérgica, doenças parasíticas, cistite intersticial, síndrome de hiper-lgE, ataxia- telangiectasia, síndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tímica, mieloma de 10 IgE e reação de enxerto contra hospedeiro.
10. Formulação de acordo com a reivindicação 9(ii), caracterizada pelo fato de que a disfunção de hipersensibilidade é selecionada a partir do grupo que consiste em anafilaxia, urticária e alergia alimentar.
11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada 15 pelo fato de que a alergia alimentar resulta da exposição a legumes, e em que, opcionalmente, o legume é amendoim.
12. Formulação de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a formulação é usada em combinação com um anti- histamínico, um broncodilatador, um glicocorticoide, ou um NSAID.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US46065903P | 2003-04-04 | 2003-04-04 | |
US60/460,659 | 2003-04-04 | ||
PCT/US2004/009613 WO2004091658A1 (en) | 2003-04-04 | 2004-03-29 | High concentration antibody and protein formulations |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BRPI0403964A BRPI0403964A (pt) | 2005-03-01 |
BRPI0403964B1 true BRPI0403964B1 (pt) | 2020-10-06 |
BRPI0403964B8 BRPI0403964B8 (pt) | 2021-05-25 |
Family
ID=33299719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BRPI0403964A BRPI0403964B8 (pt) | 2003-04-04 | 2004-03-29 | formulações líquidas estáveis, artigo manufaturado e uso dessas formulações para o tratamento de disfunção mediada por ige |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US20040197324A1 (pt) |
EP (3) | EP1610820B2 (pt) |
JP (2) | JP4869064B2 (pt) |
KR (2) | KR101208291B1 (pt) |
CN (2) | CN1798575A (pt) |
AR (2) | AR043826A1 (pt) |
AT (1) | ATE480567T1 (pt) |
AU (2) | AU2004229335C1 (pt) |
BR (1) | BRPI0403964B8 (pt) |
CA (1) | CA2519408C (pt) |
CL (3) | CL2004000731A1 (pt) |
CO (1) | CO5660273A2 (pt) |
CY (2) | CY1111232T1 (pt) |
DE (1) | DE602004029015D1 (pt) |
DK (2) | DK2335725T3 (pt) |
EC (2) | ECSP056142A (pt) |
ES (2) | ES2609010T3 (pt) |
HK (1) | HK1085933A1 (pt) |
HR (1) | HRP20050934B1 (pt) |
HU (1) | HUE030579T2 (pt) |
IL (2) | IL170866A (pt) |
LT (1) | LT2335725T (pt) |
MA (1) | MA27773A1 (pt) |
MX (1) | MXPA05010555A (pt) |
MY (1) | MY172641A (pt) |
NO (3) | NO338143B1 (pt) |
NZ (1) | NZ542964A (pt) |
PE (1) | PE20050394A1 (pt) |
PL (2) | PL1610820T5 (pt) |
PT (2) | PT2335725T (pt) |
RU (1) | RU2332986C2 (pt) |
SI (1) | SI2335725T1 (pt) |
TN (1) | TNSN05229A1 (pt) |
TW (1) | TWI357820B (pt) |
WO (1) | WO2004091658A1 (pt) |
ZA (1) | ZA200507757B (pt) |
Families Citing this family (268)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2322216A1 (en) | 1997-03-21 | 2011-05-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | A preventive or therapeutic agent for sensitized T cell-mediated diseases comprising IL-6 antagonist as an active ingredient |
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US8703126B2 (en) | 2000-10-12 | 2014-04-22 | Genentech, Inc. | Reduced-viscosity concentrated protein formulations |
PT1324776E (pt) * | 2000-10-12 | 2009-12-23 | Genentech Inc | Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
US20160279239A1 (en) * | 2011-05-02 | 2016-09-29 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of anti-cd74 antibody for systemic lupus erythematosus and autoimmune disease |
MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US20050158303A1 (en) * | 2003-04-04 | 2005-07-21 | Genentech, Inc. | Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations |
HUE030579T2 (en) | 2003-04-04 | 2017-05-29 | Genentech Inc | High Concentration Antibody And Protein Products |
GB2401040A (en) * | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
TWI306458B (en) | 2003-05-30 | 2009-02-21 | Elan Pharma Int Ltd | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
WO2005020923A2 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Cedars-Sinai Medical Center | Composition and method for the treatment of cancer and other physiologic conditions based on modulation of the ppar-gamma pathway and her-kinase axis |
US9714282B2 (en) | 2003-09-26 | 2017-07-25 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
MX370489B (es) | 2004-01-09 | 2019-12-16 | Pfizer | Anticuerpos contra madcam. |
WO2005072772A1 (en) * | 2004-01-30 | 2005-08-11 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Pharmaceutical compositions |
US7319032B2 (en) | 2004-04-22 | 2008-01-15 | Medtox | Non-sugar sweeteners for use in test devices |
WO2005112894A1 (en) | 2004-05-12 | 2005-12-01 | Baxter International Inc. | Nucleic acid microspheres, production and delivery thereof |
WO2005112893A1 (en) * | 2004-05-12 | 2005-12-01 | Baxter International Inc. | Microspheres comprising protein and showing injectability at high concentrations of said agent |
WO2005112885A2 (en) * | 2004-05-12 | 2005-12-01 | Baxter International Inc. | Oligonucleotide-containing microspheres, their use for the manufacture of a medicament for treating diabetes type 1 |
US8728525B2 (en) | 2004-05-12 | 2014-05-20 | Baxter International Inc. | Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties |
US7973134B2 (en) | 2004-07-07 | 2011-07-05 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in anaplastic large cell lymphoma signaling pathways |
SI2471813T1 (sl) | 2004-07-15 | 2015-03-31 | Xencor, Inc. | Optimirane Fc variante |
CN101048427B (zh) | 2004-07-23 | 2015-01-14 | 健泰科生物技术公司 | 抗体或其片段的结晶 |
US20060051347A1 (en) | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Winter Charles M | Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof |
US7935790B2 (en) | 2004-10-04 | 2011-05-03 | Cell Singaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in T-cell receptor signaling pathways |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
CN102746404B (zh) | 2004-11-12 | 2016-01-20 | 赞科股份有限公司 | 对FcRn的结合被改变的Fc变体 |
CA2590337C (en) | 2004-12-15 | 2017-07-11 | Neuralab Limited | Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition |
US7807789B2 (en) | 2004-12-21 | 2010-10-05 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in EGFR-signaling pathways |
US20060142234A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Guohua Chen | Injectable non-aqueous suspension |
AR052469A1 (es) * | 2005-01-28 | 2007-03-21 | Wyeth Corp | Formulaciones liquidas estabilizadas de polipeptido |
GT200600031A (es) * | 2005-01-28 | 2006-08-29 | Formulacion anticuerpo anti a beta | |
DE602006003108D1 (de) * | 2005-03-03 | 2008-11-27 | Ajinomoto Kk | Methode zur Verbesserung der Ausbeute bei der Proteinreinigung mittels Gelfiltrationschromatographie und Arginin |
AU2014240252B2 (en) * | 2005-03-08 | 2016-10-06 | Pfizer Products Inc | Anti-CTLA-4 Antibody Compositions |
AU2012200203B2 (en) * | 2005-03-08 | 2014-07-03 | Pfizer Products Inc. | Anti-CTLA-4 Antibody Compositions |
CA2600608A1 (en) * | 2005-03-08 | 2006-09-14 | Pharmacia & Upjohn Company Llc | Composition comprising human igg2 antibody and chelating agent |
ES2633574T3 (es) * | 2005-03-25 | 2017-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Formulaciones de antagonistas de VEGF |
WO2006112838A1 (en) * | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Xtl Biopharmaceuticals Ltd. | Stabilized anti-hepatitis b (hbv) antibody formulations |
DK1874821T3 (da) | 2005-04-26 | 2013-07-08 | Trion Pharma Gmbh | Kombination af antistoffer med glykokortikoider til behandling af kræft |
WO2006138181A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | Amgen Inc. | Self-buffering protein formulations |
US20060286171A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Tianhong Zhou | Bone morphogenetic protein formulations |
EP1934867A2 (en) | 2005-08-31 | 2008-06-25 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in leukemia signaling pathways |
GB2430883B (en) * | 2005-09-30 | 2008-03-19 | Cambridge Antibody Tech | Interleukin-13 antibody composition |
AU2006299429B2 (en) | 2005-10-03 | 2012-02-23 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized Fc receptor binding properties |
US9309316B2 (en) | 2005-12-20 | 2016-04-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof |
US10508144B2 (en) | 2005-12-20 | 2019-12-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Carbohydrate content of CTLA4 molecules |
US8476239B2 (en) * | 2005-12-20 | 2013-07-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Stable protein formulations |
AR058568A1 (es) | 2005-12-20 | 2008-02-13 | Bristol Myers Squibb Co | Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo |
BRPI0620316A2 (pt) | 2005-12-21 | 2011-11-08 | Wyeth Corp | formulações de proteìnas com viscosidades reduzida e seus usos |
AR059066A1 (es) | 2006-01-27 | 2008-03-12 | Amgen Inc | Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) |
BRPI0708909B8 (pt) | 2006-03-15 | 2021-05-25 | Alexion Pharma Inc | uso de um anticorpo que se liga a c5 para tratar um paciente que sofre de hemoglobinúria paroxística noturna |
AU2007229554A1 (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anti-IGF-1R human monoclonal antibody formulation |
US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
MX2008013508A (es) * | 2006-04-21 | 2008-10-31 | Novartis Ag | Composiciones farmaceuticas de anticuerpos antagonistas anti-cd40. |
CA2654510C (en) | 2006-06-16 | 2015-03-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration |
AU2007281737B2 (en) | 2006-08-04 | 2013-09-19 | Baxter Healthcare S.A. | Microsphere-based composition for preventing and/or reversing new-onset autoimmune diabetes |
US7939636B2 (en) | 2006-08-11 | 2011-05-10 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in c-Src signaling pathways |
EP2059536B1 (en) | 2006-08-14 | 2014-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized antibodies that target cd19 |
PL2061810T3 (pl) | 2006-09-05 | 2015-05-29 | Alexion Pharma Inc | Sposoby i kompozycje do leczenia neuropatii zależnych od przeciwciał |
AU2007308145A1 (en) * | 2006-10-12 | 2008-04-17 | Wyeth | Modification of ionic strength in antibody-solutions to reduce opalescence/aggregates |
CN101553504A (zh) * | 2006-12-11 | 2009-10-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | Aβ抗体胃肠外制剂 |
AU2007234612B2 (en) * | 2006-12-14 | 2013-06-27 | Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc | Protein stabilization formulations |
EP1972639A3 (en) | 2007-03-07 | 2008-12-03 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways |
US20090068684A1 (en) | 2007-03-26 | 2009-03-12 | Cell Signaling Technology, Inc. | Serine and threoninephosphorylation sites |
EP2142565A4 (en) | 2007-03-29 | 2010-03-31 | Abbott Lab | CRYSTALLINE HUMAN ANTI-IL-12 ANTIBODIES |
US20110130544A1 (en) * | 2007-03-30 | 2011-06-02 | Medimmune, Llc | Antibodies with decreased deamidation profiles |
JP5744513B2 (ja) * | 2007-04-17 | 2015-07-08 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | 肺送達のための核酸微小粒子 |
US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
US7977462B2 (en) | 2007-04-19 | 2011-07-12 | Cell Signaling Technology, Inc. | Tyrosine phosphorylation sites |
EP1983002A3 (en) | 2007-04-19 | 2009-03-11 | Peter Hornbeck | Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them |
EP1983003A3 (en) | 2007-04-19 | 2009-03-11 | Peter Hornbeck | Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them |
US20090053831A1 (en) | 2007-05-01 | 2009-02-26 | Cell Signaling Technology, Inc. | Tyrosine phosphorylation sites |
WO2008143867A1 (en) * | 2007-05-15 | 2008-11-27 | Stryker Corporation | Concentrated protein preparations of bone morphogenetic proteins and methods of use thereof |
EP2708557A1 (en) | 2007-05-30 | 2014-03-19 | Xencor, Inc. | Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells |
HUE043228T2 (hu) | 2007-06-22 | 2019-08-28 | Univ Texas | Stabil szubmikron peptid vagy protein részecskék képzése vékonyfilm fagyasztással |
WO2009006301A2 (en) * | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Battelle Memorial Institute | Protein stabilization |
US7678764B2 (en) | 2007-06-29 | 2010-03-16 | Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc | Protein formulations for use at elevated temperatures |
US20100189721A1 (en) * | 2007-07-06 | 2010-07-29 | Smithkline Beecham Corporation | Antibody formulations |
EP2167127A1 (en) * | 2007-07-10 | 2010-03-31 | F. Hoffmann-Roche AG | Novel formulation |
ES2498040T3 (es) | 2007-07-27 | 2014-09-24 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados |
CA2695697A1 (en) | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Protein formulations comprising gdf-5 in aqueous acidic solution |
WO2009037190A2 (en) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Pharmaceutical formulation for il-ir antibody |
ES2750254T3 (es) | 2007-09-27 | 2020-03-25 | Amgen Inc | Formulaciones farmacéuticas |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
EP2062920A3 (en) | 2007-11-21 | 2009-06-17 | Peter Hornbeck | Protein phosphorylation by basophilic serine/threonine kinases in insulin signalling pathways |
US20110177963A1 (en) * | 2007-11-28 | 2011-07-21 | Yale Unversity | Variation in the CHI3L1 Gene Influences Serum YKL-40 Levels, Asthma Risk and Lung Function |
SG10201604258YA (en) * | 2007-11-30 | 2016-07-28 | Abbvie Biotechnology Ltd | Anti-tnf antibody formulations |
US8883146B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-11-11 | Abbvie Inc. | Protein formulations and methods of making same |
CA3147069A1 (en) | 2007-12-26 | 2009-07-09 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to fcrn |
PE20091174A1 (es) * | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
MX2010010085A (es) | 2008-03-14 | 2011-03-29 | Biocon Ltd | Un anticuerpo monoclonal y el metodo para su uso. |
AU2009236459B2 (en) * | 2008-04-14 | 2013-07-25 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Liquid buffered GDF-5 formulations |
WO2010042705A1 (en) * | 2008-10-09 | 2010-04-15 | Medimmune, Llc | Antibody formulation |
AU2009314311B2 (en) | 2008-10-29 | 2013-01-10 | Ablynx N.V. | Methods for purification of single domain antigen binding molecules |
RU2481824C2 (ru) * | 2008-10-29 | 2013-05-20 | Аблинкс Н.В | Препараты однодоменных антигенсвязывающих молекул |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
CA2743789C (en) * | 2008-11-16 | 2017-10-31 | Board Of Regents, The Univesity Of Texas System | Low viscosity highly concentrated suspensions |
CA2742988A1 (en) * | 2008-11-17 | 2010-05-20 | Genentech, Inc. | Method and formulation for reducing aggregation of a macromolecule under physiological conditions |
NZ606283A (en) * | 2008-11-28 | 2014-08-29 | Abbvie Inc | Stable antibody compositions and methods for stabilizing same |
EP2196476A1 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-16 | Novartis Ag | Antibody formulation |
US20130064834A1 (en) | 2008-12-15 | 2013-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9 |
JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
SG10201704214VA (en) * | 2009-01-29 | 2017-06-29 | Medimmune Llc | Human anti-il-6 antibodies with extended in vivo half-life and their use in treatment of oncology, autoimmune diseases and inflammatory diseases |
US10005830B2 (en) | 2009-03-05 | 2018-06-26 | Ablynx N.V. | Antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof |
WO2010102241A1 (en) * | 2009-03-06 | 2010-09-10 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
EP2412817B2 (en) | 2009-03-27 | 2019-06-05 | Asahi Kasei Medical Co., Ltd. | Method for removing viruses in high-concentration monoclonal antibody solution |
SG175188A1 (en) * | 2009-05-04 | 2011-11-28 | Abbott Biotech Ltd | Stable high protein concentration formulations of human anti-tnf-alpha-antibodies |
US8263581B2 (en) | 2009-07-03 | 2012-09-11 | Jdp Therapeutics, Inc. | Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof |
US8513259B2 (en) | 2009-07-03 | 2013-08-20 | Jdp Therapeutics, Inc. | Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof |
US9345661B2 (en) | 2009-07-31 | 2016-05-24 | Genentech, Inc. | Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof |
US8454956B2 (en) * | 2009-08-31 | 2013-06-04 | National Cheng Kung University | Methods for treating rheumatoid arthritis and osteoporosis with anti-IL-20 antibodies |
WO2011028952A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
LT2805731T (lt) | 2009-09-03 | 2019-02-11 | Ablynx N.V. | Stabilios polipeptidų kompozicijos ir jų panaudojimas |
AR078161A1 (es) | 2009-09-11 | 2011-10-19 | Hoffmann La Roche | Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento. |
US8834874B2 (en) | 2009-10-09 | 2014-09-16 | Armagen Technologies, Inc. | Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the CNS |
SI2493922T1 (sl) | 2009-10-26 | 2017-06-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Postopek za proizvodnjo glikoziliranega imunoglobulina |
KR101832510B1 (ko) * | 2009-10-26 | 2018-02-26 | 제넨테크, 인크. | 치료 항-ige 항체에 대해 특이적인 항체를 검출하기 위한 검정 및 아나필락시스에서의 이의 용도 |
DK3721904T3 (da) * | 2009-11-20 | 2021-11-15 | Biocon Ltd | Formuleringer af t1h-antistof |
JO3417B1 (ar) | 2010-01-08 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r |
TWI505838B (zh) | 2010-01-20 | 2015-11-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Stabilized antibody solution containing |
JP5859987B2 (ja) * | 2010-02-24 | 2016-02-16 | アレコー リミテッド | タンパク質製剤 |
CN107693791B (zh) | 2010-02-26 | 2022-06-07 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 包含稳定抗体的组合物 |
CN105521491B (zh) | 2010-03-01 | 2020-03-24 | 西托戴恩有限公司 | 浓缩蛋白制剂及其用途 |
DK2542257T3 (en) | 2010-03-01 | 2017-10-16 | Bayer Healthcare Llc | OPTIMIZED MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST Tissue FACTOR ROAD INHIBITOR (TFPI) |
US20130171128A1 (en) * | 2010-03-02 | 2013-07-04 | Amgen Inc. | Reducing viscosity of pharmaceutical formulations |
CA2792125C (en) | 2010-03-22 | 2019-02-12 | Genentech, Inc. | Compositions and methods useful for stabilizing protein-containing formulations |
JP2013525484A (ja) * | 2010-05-03 | 2013-06-20 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | タンパク質含有製剤の粘度を低減させるために有用な組成物及び方法 |
US20130136733A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-05-30 | Novo Nordisk A/S | Stable Multi-Dose Compositions Comprising an Antibody and a Preservative |
JO3659B1 (ar) * | 2010-06-02 | 2020-08-27 | Astellas Deutschland Gmbh | أشكال جرعات بينداموستين عن طريق الفم وإستخداماته العلاجية |
EP2399604A1 (en) * | 2010-06-25 | 2011-12-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Novel antibody formulation |
AR083034A1 (es) | 2010-09-17 | 2013-01-30 | Baxter Int | ESTABILIZACION DE INMUNOGLOBULINAS Y OTRAS PROTEINAS MEDIANTE UNA FORMULACION ACUOSA CON CLORURO DE SODIO A pH ACIDO DEBIL A NEUTRO |
MX344294B (es) | 2010-10-06 | 2016-12-13 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-receptor de interleucina-4 (il-4r). |
KR20220070586A (ko) | 2010-11-08 | 2022-05-31 | 제넨테크, 인크. | 피하 투여용 항―il―6 수용체 항체 |
MX344727B (es) | 2010-11-11 | 2017-01-05 | Abbvie Biotechnology Ltd | Formulaciones liquidas de anticuerpos anti-tnf-alfa de alta concentracion mejoradas. |
KR20140043313A (ko) | 2011-01-13 | 2014-04-09 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도 |
WO2012101253A1 (en) | 2011-01-28 | 2012-08-02 | Sanofi | Pharmaceutical compositions comprising human antibodies to pcsk9 |
KR20140018966A (ko) * | 2011-04-07 | 2014-02-13 | 글락소스미스클라인 엘엘씨 | 점도가 감소된 제제 |
JO3283B1 (ar) | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
UA116189C2 (uk) * | 2011-05-02 | 2018-02-26 | Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. | КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА |
EP4378959A3 (en) | 2011-05-02 | 2024-09-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-alpha4beta7 antibody |
AR087305A1 (es) | 2011-07-28 | 2014-03-12 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit |
BR112014005522A2 (pt) | 2011-09-16 | 2017-03-21 | Regeneron Pharma | métodos para redução dos níveis de lipoproteína(a) pela administração de um inibidor da proproteína subtilisina quexina-9 convertase (pcsk9) |
RU2654567C2 (ru) | 2011-10-11 | 2018-05-21 | Дженентек, Инк. | Улучшенная сборка биспецифических антител |
TWI589299B (zh) | 2011-10-11 | 2017-07-01 | 再生元醫藥公司 | 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法 |
WO2013063284A1 (en) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | Onclave Therapeutics | Antibody formulations and methods |
EP2771031B1 (en) | 2011-10-28 | 2018-04-18 | Prothena Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
BR112014010186A2 (pt) | 2011-10-28 | 2017-05-02 | Integritybio Inc | formulação farmacêutica estável, kit, composição farmacêutica, método para preparar uma formulação farmacêutica, e, método para tratar um humano ou animal |
WO2013066866A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Genentech, Inc. | Antibody formulations |
EA033387B1 (ru) | 2012-01-23 | 2019-10-31 | Regeneron Pharma | СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ СОСТАВЫ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ Ang-2 |
JP6342333B2 (ja) | 2012-01-27 | 2018-06-13 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | α−シヌクレインを認識するヒト化抗体 |
AU2013262083A1 (en) * | 2012-05-14 | 2014-11-06 | Novo Nordisk A/S | Stabilised protein solutions |
SG10201709555SA (en) * | 2012-05-18 | 2017-12-28 | Genentech Inc | High-concentration monoclonal antibody formulations |
AR092325A1 (es) | 2012-05-31 | 2015-04-15 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-dll4 y kit |
SG11201407779YA (en) * | 2012-06-21 | 2015-02-27 | Ucb Pharma Sa | Pharmaceutical formulation |
US9221904B2 (en) | 2012-07-19 | 2015-12-29 | National Cheng Kung University | Treatment of osteoarthritis using IL-20 antagonists |
US8852588B2 (en) | 2012-08-07 | 2014-10-07 | National Cheng Kung University | Treating allergic airway disorders using anti-IL-20 receptor antibodies |
US8603470B1 (en) | 2012-08-07 | 2013-12-10 | National Cheng Kung University | Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases |
FR2994390B1 (fr) | 2012-08-10 | 2014-08-15 | Adocia | Procede d'abaissement de la viscosite de solutions de proteines a concentration elevee |
US8883979B2 (en) | 2012-08-31 | 2014-11-11 | Bayer Healthcare Llc | Anti-prolactin receptor antibody formulations |
US8613919B1 (en) | 2012-08-31 | 2013-12-24 | Bayer Healthcare, Llc | High concentration antibody and protein formulations |
US9592297B2 (en) | 2012-08-31 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Antibody and protein formulations |
FR2995213A1 (fr) * | 2012-09-12 | 2014-03-14 | Lfb Biotechnologies | Seringue contenant une composition, notamment pharmaceutique, comprenant des immunoglobulines, son procede de fabrication et son utilisation |
UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
CN106421782A (zh) * | 2012-10-25 | 2017-02-22 | 米迪缪尼有限公司 | 稳定的低粘度抗体配制品 |
EP2727602A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-07 | Takeda GmbH | Method for preparation of a high concentration liquid formulation of an antibody |
UA117466C2 (uk) * | 2012-12-13 | 2018-08-10 | Мерк Шарп Енд Доме Корп. | СТАБІЛЬНИЙ СКЛАД У ВИГЛЯДІ РОЗЧИНУ АНТИТІЛА ДО IL-23p19 |
US10111953B2 (en) | 2013-05-30 | 2018-10-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9) |
MX363403B (es) | 2013-07-04 | 2019-03-22 | Hoffmann La Roche | Inmumoensayo con interferencia suprimida para la deteccion de anticuerpos anti-farmacos en muestras de suero. |
US10513555B2 (en) * | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
AU2014294616B2 (en) | 2013-07-23 | 2019-07-11 | Biocon Limited | Use of a CD6 binding partner and method based thereon |
JP6412575B2 (ja) | 2013-09-11 | 2018-10-24 | イーグル バイオロジクス, インコーポレイテッド | 有機ホスフェートを含有する液状タンパク質製剤 |
EP3062814A1 (en) * | 2013-10-29 | 2016-09-07 | Albumedix A/S | Antibody composition |
KR20160081978A (ko) | 2013-11-12 | 2016-07-08 | 사노피 바이오테크놀로지 | Pcsk9 억제제의 사용을 위한 투약 요법 |
PL2946765T3 (pl) | 2014-05-23 | 2017-08-31 | Ares Trading S.A. | Ciekła kompozycja farmaceutyczna |
EP2946767B1 (en) | 2014-05-23 | 2016-10-05 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
EP2946766B1 (en) | 2014-05-23 | 2016-03-02 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
US10478498B2 (en) | 2014-06-20 | 2019-11-19 | Reform Biologics, Llc | Excipient compounds for biopolymer formulations |
US20160074515A1 (en) | 2014-06-20 | 2016-03-17 | Reform Biologics, Llc | Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations |
US11357857B2 (en) | 2014-06-20 | 2022-06-14 | Comera Life Sciences, Inc. | Excipient compounds for protein processing |
CN107206068A (zh) | 2014-07-16 | 2017-09-26 | 赛诺菲生物技术公司 | 用于治疗杂合型家族性高胆固醇血症(heFH)患者的方法 |
DK3170005T3 (da) | 2014-07-18 | 2019-07-08 | Sanofi Sa | Fremgangsmåde til forudsigelse af resultatet af en behandling med aflibercept hos en patient, der mistænkes for at lide af cancer |
WO2016019969A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer |
EP3200804A4 (en) | 2014-10-01 | 2018-04-18 | Eagle Biologics, Inc. | Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents |
AU2015332151A1 (en) * | 2014-10-18 | 2017-04-27 | Pfizer Inc. | Anti-IL-7R antibody compositions |
EA033444B1 (ru) * | 2014-10-23 | 2019-10-31 | Amgen Inc | Снижение вязкости фармацевтических составов |
MA41115A (fr) | 2014-12-02 | 2017-10-10 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer |
US20180264112A1 (en) * | 2015-01-18 | 2018-09-20 | Biogen Ma Inc. | Anti-CD40 Antibody Formulations |
HUE061084T2 (hu) | 2015-02-19 | 2023-05-28 | Compugen Ltd | PVRIG elleni antitestek és alkalmazási eljárások |
EP3259597B1 (en) | 2015-02-19 | 2022-04-06 | Compugen Ltd. | Pvrig polypeptides and methods of treatment |
AR103726A1 (es) | 2015-02-27 | 2017-05-31 | Merck Sharp & Dohme | Cristales de anticuerpos monoclonales anti-pd-1 humanos |
MY180297A (en) | 2015-06-24 | 2020-11-27 | Hoffmann La Roche | Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity |
CA2991980A1 (en) | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Compugen Ltd. | Hide1 compositions and methods |
LT3334747T (lt) | 2015-08-13 | 2023-12-27 | Amgen Inc. | Įkrautas giluminis antigeną surišančio baltymo filtravimas |
MA42657A (fr) | 2015-08-18 | 2018-06-27 | Regeneron Pharma | Anticorps inhibiteurs anti-pcsk9 destinés au traitement des patients atteints d'hyperlipidémie subissant une aphérèse de lipoprotéines |
TWI747843B (zh) | 2015-10-02 | 2021-12-01 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法 |
AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
WO2017066714A1 (en) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Compugen Ltd. | Anti-vsig1 antibodies and drug conjugates |
PT3384049T (pt) | 2015-12-03 | 2023-08-18 | Regeneron Pharma | Método de associação de variantes genéticas com um resultado clínico em doentes que sofrem de degeneração macular relacionada à idade tratados com anti-vegf |
CA3008779A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Astellas Pharma Inc. | Pharmaceutical composition comprising anti-human tslp receptor antibody |
EP3397287A1 (en) | 2015-12-30 | 2018-11-07 | Genentech, Inc. | Formulations with reduced degradation of polysorbate |
KR102366547B1 (ko) * | 2016-04-28 | 2022-02-23 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | 항-혈액 수지상 세포 항원 2 항체의 임상적 사용을 위한 약제학적 조성물 및 투약 요법 |
JP7148504B2 (ja) | 2016-06-08 | 2022-10-05 | ゼンコー,インコーポレイティド | CD32Bに交差結合した抗CD19抗体を用いたIgG4関連疾患の治療 |
ES2770674T3 (es) * | 2016-06-10 | 2020-07-02 | Octapharma Ag | Composición de inmunoglobulinas de alta concentración para aplicaciones farmacéuticas |
CA3036965A1 (en) | 2016-09-16 | 2018-03-22 | Leukocare Ag | A method for stabilization of a biopharmaceutical drug product during processing |
JP7275027B2 (ja) | 2016-10-06 | 2023-05-17 | アムジェン インコーポレイテッド | 粘度低下タンパク質医薬製剤 |
EP3529269A2 (en) | 2016-10-19 | 2019-08-28 | Invenra, Inc. | Antibody constructs |
EA201990998A1 (ru) | 2016-10-21 | 2019-11-29 | Фармацевтические составы и способы их получения | |
US11242401B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-02-08 | Biocon Limited | Monoclonal antibody and a method of use for the treatment of lupus |
EP3559039A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-10-30 | Università Degli Studi Magna Graecia Catanzaro | A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of cd43 |
SG11201906852XA (en) | 2017-02-01 | 2019-08-27 | Univ Yale | Treatment of diuretic resistance |
JP7377596B2 (ja) | 2017-02-22 | 2023-11-10 | アムジエン・インコーポレーテツド | 低粘度、高濃度エボロクマブ製剤及びそれらの製造方法 |
TWI761453B (zh) | 2017-03-01 | 2022-04-21 | 英商梅迪繆思有限公司 | 抗rsv單株抗體配製物 |
EP3603669B1 (en) | 2017-03-31 | 2024-06-19 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Aqueous formulation, aqueous formulation in injector, antibody protein disaggregating agent, and antibody protein disaggregation method |
EP3606964A4 (en) | 2017-04-03 | 2020-12-09 | Immunomedics, Inc. | SUBCUTANE ADMINISTRATION OF ANTIBODY DRUG CONJUGATES FOR CANCER THERAPY |
JOP20190260A1 (ar) | 2017-05-02 | 2019-10-31 | Merck Sharp & Dohme | صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها |
CA3060581A1 (en) | 2017-05-02 | 2018-11-08 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Formulations of anti-lag3 antibodies and co-formulations of anti-lag3 antibodies and anti-pd-1 antibodies |
MX2019014265A (es) | 2017-06-01 | 2020-08-03 | Compugen Ltd | Tratamientos conjuntos triples con anticuerpos. |
JP7160491B2 (ja) | 2017-07-14 | 2022-10-25 | ファイザー インコーポレイティッド | MAdCAMに対する抗体 |
CA3069756A1 (en) | 2017-07-27 | 2019-01-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | High concentration anti-c5 antibody formulations |
BR112020003498A2 (pt) * | 2017-08-22 | 2020-08-25 | Biogen Ma, Inc. | composições farmacêuticas e regimes de dosagem que contêm anticorpos anti-alfa(v)beta(6) |
FI3672631T3 (fi) * | 2017-08-22 | 2023-06-29 | Biogen Ma Inc | Beeta-amyloidin vasta-aineita sisältäviä lääkekoostumuksia |
KR20200051687A (ko) | 2017-09-05 | 2020-05-13 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 생물학적 제제의 점도를 감소시키기 위한 화합물 |
US12128101B2 (en) | 2017-10-26 | 2024-10-29 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-C5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) |
AU2018374232A1 (en) * | 2017-11-30 | 2020-07-23 | Bio-Thera Solutions, Ltd. | Liquid preparation of humanized antibody for treating IL-6-related disease |
EA202091640A1 (ru) | 2018-01-05 | 2020-10-26 | Корвидиа Терапьютикс, Инк. | Способы лечения опосредованного il-6 воспаления без иммунодепрессии |
WO2019153200A1 (zh) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
CR20200394A (es) | 2018-02-09 | 2020-11-05 | Genentech Inc | Métodos terapéuticos y diagnósticos para enfermedades inflrmatorias mediadas por mostocitos |
AU2019244666A1 (en) * | 2018-03-26 | 2020-10-08 | Novartis Ag | Methods of treating chronic spontaneous urticaria using ligelizumab |
CN112739323A (zh) | 2018-05-10 | 2021-04-30 | 瑞泽恩制药公司 | 含有高浓度vegf受体融合蛋白的制剂 |
US11519020B2 (en) | 2018-05-25 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF |
US20210246187A1 (en) | 2018-06-05 | 2021-08-12 | King's College London | Btnl3/8 targeting constructs for delivery of payloads to the gastrointestinal system |
TW202011995A (zh) * | 2018-07-03 | 2020-04-01 | 比利時商葛萊伯格有限公司 | 高濃度液體抗體配製物 |
BR112021004126A2 (pt) * | 2018-09-05 | 2021-05-25 | Ventria Bioscience Inc. | formulação profilática e/ou terapêutica estabilizada e método profilático ou terapêutico |
CA3111784A1 (en) | 2018-09-12 | 2020-03-19 | Silverback Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of disease with immune stimulatory conjugates |
EP3870145A1 (en) * | 2018-10-26 | 2021-09-01 | Amgen Inc. | Formulations comprising a tris buffer and a protein |
CR20210432A (es) * | 2019-01-17 | 2022-01-05 | Leti Pharma S L | Métodos para purificar un extracto de alérgeno |
JP7542543B2 (ja) | 2019-01-31 | 2024-08-30 | サノフィ・バイオテクノロジー | 若年性特発性関節炎を治療するための抗il-6受容体抗体 |
UA128098C2 (uk) | 2019-02-18 | 2024-04-03 | Елі Ліллі Енд Компані | Водна фармацевтична композиція антитіла проти il-17a |
WO2020185479A1 (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-il-36r antibody formulations |
MX2021015533A (es) | 2019-06-19 | 2022-02-10 | Silverback Therapeutics Inc | Anticuerpos anti-mesotelina e inmunoconjugados de los mismos. |
AU2020323926A1 (en) * | 2019-07-29 | 2022-03-10 | Compugen Ltd. | Anti-PVRIG antibodies formulations and uses thereof |
WO2021038532A1 (en) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | Kashiv Biosciences, Llc | Novel formulation of highly concentrated pharmacologically active antibody |
CN112516090B (zh) * | 2019-09-18 | 2023-06-20 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 抗体偶联药物的药物组合、冷冻干燥剂及制备方法、用途 |
EP3808777A1 (en) | 2019-10-16 | 2021-04-21 | Glenmark Specialty S.A. | Stable liquid antibody formulations |
KR20220097932A (ko) * | 2019-11-04 | 2022-07-08 | 컴퓨젠 엘티디. | 항-pvrig 항체 제제 및 항-pd-1 항체를 사용한 병용 요법 |
EP4106819A1 (en) | 2020-02-21 | 2022-12-28 | Silverback Therapeutics, Inc. | Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof |
JP2023514721A (ja) * | 2020-02-24 | 2023-04-07 | メディミューン,エルエルシー | 抗内皮リパーゼ抗体の製剤 |
WO2022006327A1 (en) | 2020-07-01 | 2022-01-06 | Silverback Therapeutics, Inc. | Anti-asgr1 antibody conjugates and uses thereof |
BR112022026999A2 (pt) | 2020-07-17 | 2023-01-24 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorpos anti-il-36r para tratamento de dermatoses neutrofílicas |
CN114762727A (zh) * | 2021-01-15 | 2022-07-19 | 海正生物制药有限公司 | 一种稳定的帕妥珠单抗的药物组合物 |
JP2024510480A (ja) * | 2021-03-16 | 2024-03-07 | カシーヴ バイオサイエンシズ,リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 融合タンパク質の新規製剤 |
US20240239875A1 (en) | 2021-05-17 | 2024-07-18 | Curia Ip Holdings, Llc | Sars-cov-2 spike protein antibodies |
WO2022245877A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-24 | Curia Ip Holdings, Llc | Sars-cov-2 spike protein antibodies |
US20240269279A1 (en) | 2021-06-14 | 2024-08-15 | Novartis Ag | PHARMACEUTICAL FORMULATION CONTAINING AN ANTI-IgE ANTIBODY |
CA3224052A1 (en) * | 2021-06-18 | 2022-12-22 | Techmix, Llc | Bovine supplement for neonatal calves |
JP2024531300A (ja) * | 2021-08-16 | 2024-08-29 | メディミューン,エルエルシー | 抗il-13抗体製剤 |
CN114159555A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-03-11 | 江西赛基生物技术有限公司 | 抗原蛋白冻干小球及其制备方法 |
KR20230130558A (ko) * | 2022-03-02 | 2023-09-12 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | Fviii 모방 이중특이적 항체의 월 1회 투여 방법 |
KR20230130561A (ko) * | 2022-03-02 | 2023-09-12 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | Fviii 모방 이중특이적 항체를 2주마다 1회 투여하는 방법 |
KR20230130560A (ko) * | 2022-03-02 | 2023-09-12 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | Fviii 모방 이중특이적 항체의 주 1회 투여 방법 |
US12030959B1 (en) * | 2023-07-05 | 2024-07-09 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibody therapy for multiple food allergies |
Family Cites Families (141)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US3896111A (en) | 1973-02-20 | 1975-07-22 | Research Corp | Ansa macrolides |
CA1064396A (en) * | 1975-02-18 | 1979-10-16 | Myer L. Coval | Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol |
US4151042A (en) | 1977-03-31 | 1979-04-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for producing maytansinol and its derivatives |
US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
US4657760A (en) | 1979-03-20 | 1987-04-14 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells |
US4374763A (en) † | 1979-09-17 | 1983-02-22 | Morishita Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for producing gamma-globulin for use in intravenous administration and method for producing a pharmaceutical preparation thereof |
WO1981001145A1 (en) | 1979-10-18 | 1981-04-30 | Univ Illinois | Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs |
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
US4375763A (en) | 1980-10-14 | 1983-03-08 | Agl Corporation | Device for detecting and locating leaks in pipelines |
US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
US4499073A (en) * | 1981-08-24 | 1985-02-12 | Cutter Laboratories, Inc. | Intravenously injectable immune serum globulin |
NZ201705A (en) | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
US4943529A (en) | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
AU2353384A (en) | 1983-01-19 | 1984-07-26 | Genentech Inc. | Amplification in eukaryotic host cells |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
US4544545A (en) | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
AU3145184A (en) | 1983-08-16 | 1985-02-21 | Zymogenetics Inc. | High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US5206344A (en) | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
WO1988001213A1 (en) | 1986-08-18 | 1988-02-25 | Clinical Technologies Associates, Inc. | Delivery systems for pharmacological agents |
US5567610A (en) | 1986-09-04 | 1996-10-22 | Bioinvent International Ab | Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US4946783A (en) | 1987-01-30 | 1990-08-07 | President And Fellows Of Harvard College | Periplasmic protease mutants of Escherichia coli |
GB8705477D0 (en) | 1987-03-09 | 1987-04-15 | Carlton Med Prod | Drug delivery systems |
US4940782A (en) * | 1987-06-08 | 1990-07-10 | G. D. Searle & Co. | Monoclonal antibodies against IgE-associated determinants, hybrid cell lines producing these antibodies, and use therefore |
US5010182A (en) | 1987-07-28 | 1991-04-23 | Chiron Corporation | DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides |
US4975278A (en) | 1988-02-26 | 1990-12-04 | Bristol-Myers Company | Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells |
DE3782737T3 (de) | 1987-08-21 | 1999-05-20 | Imcera Group Inc., Northbrook, Ill. | Stabilisierung von Wachstumshormonen. |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
EP0308936B1 (en) | 1987-09-23 | 1994-07-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells |
GB8724885D0 (en) | 1987-10-23 | 1987-11-25 | Binns M M | Fowlpox virus promotors |
US4877608A (en) * | 1987-11-09 | 1989-10-31 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media |
US5169770A (en) | 1987-12-21 | 1992-12-08 | The University Of Toledo | Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds |
CA1331133C (en) * | 1988-03-01 | 1994-08-02 | Michael Jon Pikal | Pharmaceutical growth hormone formulations |
ATE117434T1 (de) * | 1988-03-30 | 1995-02-15 | Toray Industries | Gefriergetrocknete zusammensetzung, die ein mit meerrettichperoxydase markiertes fab'-fragment eines gegen menschliches beta-interferon gerichteten antikörpers und trehalose enthält; eia kit, der diese zusammensetzung enthält. |
US5215743A (en) * | 1988-04-13 | 1993-06-01 | Maninder Singh | Tumor necrosis factor formulations |
US5096885A (en) * | 1988-04-15 | 1992-03-17 | Genentech, Inc. | Human growth hormone formulation |
GB2218703B (en) † | 1988-05-10 | 1992-10-28 | Sumitomo Chemical Co | Human monoclonal antibody to p.aeruginosa: its production and use |
DE68908175T2 (de) | 1988-05-27 | 1994-03-03 | Centocor Inc | Gefriergetrocknete formulierung für antikörperprodukte. |
AU4005289A (en) | 1988-08-25 | 1990-03-01 | Smithkline Beecham Corporation | Recombinant saccharomyces |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
US5225538A (en) | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
CA2049342A1 (en) | 1989-03-27 | 1990-09-28 | Sally Bolmer | Formulations for stabilizing of igm antibodies |
ZA902663B (en) | 1989-04-07 | 1991-12-24 | Syntex Inc | Interleukin-1 formulation |
ES2038579T3 (es) | 1989-04-28 | 1997-02-16 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Celulas de levadura del genero schwanniomyces. |
FR2646437B1 (fr) | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
ATE144793T1 (de) | 1989-06-29 | 1996-11-15 | Medarex Inc | Bispezifische reagenzien für die aids-therapie |
FR2649120B1 (fr) | 1989-06-30 | 1994-01-28 | Cayla | Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5225212A (en) | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
DE4001451A1 (de) * | 1990-01-19 | 1991-08-01 | Octapharma Ag | Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix |
US5945098A (en) | 1990-02-01 | 1999-08-31 | Baxter International Inc. | Stable intravenously-administrable immune globulin preparation |
US5229275A (en) | 1990-04-26 | 1993-07-20 | Akzo N.V. | In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
DK0814159T3 (da) | 1990-08-29 | 2005-10-24 | Genpharm Int | Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
JPH0565233A (ja) | 1991-03-08 | 1993-03-19 | Mitsui Toatsu Chem Inc | モノクローナル抗体含有凍結乾燥製剤 |
WO1992017207A1 (en) | 1991-03-26 | 1992-10-15 | Tanox Biosystems, Inc. | MONOCLONAL ANTIBODIES WHICH BIND TO SECRETED AND MEMBRANE-BOUND IgE, BUT NOT TO IgE ON BASOPHILS |
EP0586505A1 (en) | 1991-05-14 | 1994-03-16 | Repligen Corporation | Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection |
EP0940468A1 (en) | 1991-06-14 | 1999-09-08 | Genentech, Inc. | Humanized antibody variable domain |
JP2966592B2 (ja) | 1991-07-20 | 1999-10-25 | 萩原 義秀 | 安定化されたヒトモノクローナル抗体製剤 |
US6685939B2 (en) * | 1991-08-14 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Method of preventing the onset of allergic disorders |
ATE233813T1 (de) | 1991-08-14 | 2003-03-15 | Genentech Inc | Veränderte immunglobuline für spezifische fc- epsilon rezeptoren |
US6329509B1 (en) | 1991-08-14 | 2001-12-11 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies |
US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
GB9120304D0 (en) | 1991-09-24 | 1991-11-06 | Erba Carlo Spa | Stable pharmaceutical compositions containing a granulocyte macrophage colony stimulating factor |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
EP0617706B1 (en) | 1991-11-25 | 2001-10-17 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
US5849700A (en) * | 1991-12-20 | 1998-12-15 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical formulation |
EP0625200B1 (en) | 1992-02-06 | 2005-05-11 | Chiron Corporation | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
WO1993022336A1 (en) * | 1992-04-30 | 1993-11-11 | Alpha Therapeutic Corporation | Improved solubilization and stabilization of factor viii complex |
EP0656064B1 (en) | 1992-08-17 | 1997-03-05 | Genentech, Inc. | Bispecific immunoadhesins |
RU2139731C1 (ru) | 1992-11-13 | 1999-10-20 | Айдек Фармасьютикалс Корпорейшн (US | Способ лечения, антитела, гибридома |
JPH08503950A (ja) | 1992-12-02 | 1996-04-30 | アルカーメス・コントロールド・セラピユーテイクス・インコーポレーテツド | 徐放性成長ホルモン含有マイクロスフェア |
DE4344824C1 (de) | 1993-12-28 | 1995-08-31 | Immuno Ag | Hochkonzentriertes Immunglobulin-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung |
US5580856A (en) * | 1994-07-15 | 1996-12-03 | Prestrelski; Steven J. | Formulation of a reconstituted protein, and method and kit for the production thereof |
GB9418092D0 (en) * | 1994-09-08 | 1994-10-26 | Red Cross Found Cent Lab Blood | Organic compounds |
CN1157562A (zh) | 1994-09-09 | 1997-08-20 | 武田药品工业株式会社 | 含有一种肽金属盐的缓释制剂 |
WO1996016673A1 (en) | 1994-12-02 | 1996-06-06 | Chiron Corporation | Method of promoting an immune response with a bispecific antibody |
DK0748326T3 (da) | 1994-12-28 | 2001-09-17 | Rhodia Chimie Sa | Optisk aktive diphosphiner og fremstilling heraf ved spaltning af den racemiske blanding |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US6037453A (en) * | 1995-03-15 | 2000-03-14 | Genentech, Inc. | Immunoglobulin variants |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
WO1996040072A2 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition for sustained release of human growth hormone |
US5837234A (en) | 1995-06-07 | 1998-11-17 | Cytotherapeutics, Inc. | Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane |
ZA965368B (en) | 1995-07-14 | 1997-01-14 | Novo Nordisk As | A pharmaceutical formulation |
US6267958B1 (en) * | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
US6685940B2 (en) * | 1995-07-27 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
CN1151842C (zh) | 1995-07-27 | 2004-06-02 | 基因技术股份有限公司 | 稳定等渗的冻干蛋白制剂 |
DE19544393A1 (de) | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Synergistische herbizide Mischungen |
US5770700A (en) * | 1996-01-25 | 1998-06-23 | Genetics Institute, Inc. | Liquid factor IX formulations |
KR100236393B1 (ko) | 1996-02-02 | 1999-12-15 | 나까니시 히로유끼 | 사람성장호르몬을 함유하는 의약제제 |
TWI240627B (en) * | 1996-04-26 | 2005-10-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Erythropoietin solution preparation |
GB9610992D0 (en) | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Glaxo Group Ltd | Concentrated antibody preparation |
EP0852951A1 (de) | 1996-11-19 | 1998-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern |
US6172213B1 (en) * | 1997-07-02 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides |
US5994511A (en) * | 1997-07-02 | 1999-11-30 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides |
US6096872A (en) * | 1997-10-14 | 2000-08-01 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Viral clearance process |
US6541606B2 (en) * | 1997-12-31 | 2003-04-01 | Altus Biologics Inc. | Stabilized protein crystals formulations containing them and methods of making them |
WO2000015260A1 (en) | 1998-09-16 | 2000-03-23 | Tanox, Inc. | Anti-ige gene therapy |
GB9820525D0 (en) * | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
JP2000247903A (ja) * | 1999-03-01 | 2000-09-12 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 長期安定化製剤 |
ES2276698T3 (es) | 1999-10-04 | 2007-07-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Composiciones farceuticas que contienen un polipeptido liquido estabilizado. |
WO2001039799A2 (en) * | 1999-12-06 | 2001-06-07 | Panacea Pharmaceuticals, Llc. | Passive desensitization |
AU4458401A (en) | 2000-03-31 | 2001-10-15 | Kirin Brewery | Powdery preparation for transmucosal administration containing a polymeric form of drug and exhibiting improved storage stability |
US7288390B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
GB0023383D0 (en) * | 2000-09-23 | 2000-11-08 | Synprotec Ltd | 3,5-Bis (Trifluormethyl)Benzene derivatives |
CN1469756A (zh) | 2000-10-11 | 2004-01-21 | 江头健辅 | 治疗肝病的药物 |
PT1324776E (pt) * | 2000-10-12 | 2009-12-23 | Genentech Inc | Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida |
US8703126B2 (en) | 2000-10-12 | 2014-04-22 | Genentech, Inc. | Reduced-viscosity concentrated protein formulations |
KR20030074693A (ko) | 2000-12-28 | 2003-09-19 | 알투스 바이올로직스 인코포레이티드 | 전항체 및 이의 단편의 결정과 이의 제조 및 사용 방법 |
GB0113179D0 (en) * | 2001-05-31 | 2001-07-25 | Novartis Ag | Organic compounds |
WO2003009817A2 (en) † | 2001-07-25 | 2003-02-06 | Protein Design Labs, Inc. | Stable lyophilized pharmaceutical formulation of igg antibodies |
BR0213298A (pt) * | 2001-10-16 | 2006-11-07 | Rxkinetix Inc | formulações com alta concentração de proteìna e processo de fabricação |
ES2392073T3 (es) * | 2001-11-08 | 2012-12-04 | Abbott Biotherapeutics Corp. | Formulación farmacéutica líquida estable de anticuerpos IGG |
AU2003267905B2 (en) | 2002-10-04 | 2009-02-05 | Biolnvent International Ab | Peptide-based passive immunization therapy for treatment of atherosclerosis |
AU2003293543A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-09 | Abgenix, Inc. | System and method for stabilizing antibodies with histidine |
US20050158303A1 (en) * | 2003-04-04 | 2005-07-21 | Genentech, Inc. | Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations |
HUE030579T2 (en) * | 2003-04-04 | 2017-05-29 | Genentech Inc | High Concentration Antibody And Protein Products |
US20060051347A1 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Winter Charles M | Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof |
WO2007092772A2 (en) | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Medimmune, Inc. | Protein formulations |
BRPI0806313A2 (pt) | 2007-01-09 | 2011-09-06 | Wyeth Corp | Formulação de anticorpo anti-il-13; formulação em aerossol de um anticorpo anti-il-13; formulaçãoliofilizada de um anticorpo anti-il-13; composição farmacêutica para o tratamento de um transtorno relacionado a il-13; fabricação de uma composição farmacêutica ; método de tratamento de um transtorno relacionado a il-13; seringa injetável; dispositivo para administração nasal; emplastro transdérmico; bolsa intravenosa; kit compreendendo pelo menos um recipiente; kit; e seringa injetável previamente enchida |
UA100255C2 (uk) | 2007-12-28 | 2012-12-10 | Біоінвент Інтернешенл Аб | Фармацевтична композиція |
WO2010102241A1 (en) | 2009-03-06 | 2010-09-10 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
-
2004
- 2004-03-29 HU HUE10008980A patent/HUE030579T2/en unknown
- 2004-03-29 CN CNA2004800155562A patent/CN1798575A/zh active Pending
- 2004-03-29 PL PL04759018T patent/PL1610820T5/pl unknown
- 2004-03-29 CN CN2011102022637A patent/CN102258464A/zh active Pending
- 2004-03-29 CA CA2519408A patent/CA2519408C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 KR KR1020117013034A patent/KR101208291B1/ko active IP Right Grant
- 2004-03-29 ES ES10008980.4T patent/ES2609010T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 SI SI200432368A patent/SI2335725T1/sl unknown
- 2004-03-29 PT PT100089804T patent/PT2335725T/pt unknown
- 2004-03-29 PT PT04759018T patent/PT1610820E/pt unknown
- 2004-03-29 JP JP2006509445A patent/JP4869064B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 LT LTEP10008980.4T patent/LT2335725T/lt unknown
- 2004-03-29 BR BRPI0403964A patent/BRPI0403964B8/pt active IP Right Grant
- 2004-03-29 NZ NZ542964A patent/NZ542964A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-03-29 MX MXPA05010555A patent/MXPA05010555A/es active IP Right Grant
- 2004-03-29 ES ES04759018T patent/ES2349779T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 DK DK10008980.4T patent/DK2335725T3/en active
- 2004-03-29 AT AT04759018T patent/ATE480567T1/de active
- 2004-03-29 RU RU2005134236/15A patent/RU2332986C2/ru active
- 2004-03-29 EP EP04759018.7A patent/EP1610820B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 PL PL10008980T patent/PL2335725T3/pl unknown
- 2004-03-29 ZA ZA200507757A patent/ZA200507757B/en unknown
- 2004-03-29 EP EP10008980.4A patent/EP2335725B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 EP EP16193296.7A patent/EP3178492A1/en not_active Withdrawn
- 2004-03-29 KR KR1020057018843A patent/KR101195295B1/ko active IP Right Grant
- 2004-03-29 WO PCT/US2004/009613 patent/WO2004091658A1/en active Application Filing
- 2004-03-29 DK DK04759018.7T patent/DK1610820T4/da active
- 2004-03-29 US US10/813,483 patent/US20040197324A1/en not_active Abandoned
- 2004-03-29 DE DE602004029015T patent/DE602004029015D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-29 AU AU2004229335A patent/AU2004229335C1/en not_active Expired
- 2004-04-01 MY MYPI20041210A patent/MY172641A/en unknown
- 2004-04-01 PE PE2004000345A patent/PE20050394A1/es active IP Right Grant
- 2004-04-01 AR ARP040101106A patent/AR043826A1/es not_active Application Discontinuation
- 2004-04-02 CL CL200400731A patent/CL2004000731A1/es unknown
- 2004-04-02 TW TW093109166A patent/TWI357820B/zh not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-09-14 IL IL170866A patent/IL170866A/en active IP Right Grant
- 2005-09-16 TN TNP2005000229A patent/TNSN05229A1/en unknown
- 2005-10-03 CO CO05099863A patent/CO5660273A2/es not_active Application Discontinuation
- 2005-10-28 HR HRP20050934AA patent/HRP20050934B1/hr not_active IP Right Cessation
- 2005-11-02 MA MA28576A patent/MA27773A1/fr unknown
- 2005-11-04 NO NO20055202A patent/NO338143B1/no unknown
- 2005-11-04 EC EC2005006142A patent/ECSP056142A/es unknown
-
2006
- 2006-06-17 HK HK06106945.7A patent/HK1085933A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2006-10-13 US US11/549,194 patent/US20070053900A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-08-22 US US12/197,005 patent/US20090280129A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-03-02 AU AU2010200784A patent/AU2010200784B2/en not_active Expired
- 2010-11-12 CY CY20101101025T patent/CY1111232T1/el unknown
-
2011
- 2011-06-21 US US13/165,643 patent/US8961964B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2011-07-21 JP JP2011159503A patent/JP5449268B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-01-14 CL CL2013000142A patent/CL2013000142A1/es unknown
- 2013-08-20 IL IL228034A patent/IL228034A0/en unknown
-
2014
- 2014-07-28 EC ECIEPI201411269A patent/ECSP14011269A/es unknown
-
2015
- 2015-01-16 US US14/599,301 patent/US10034940B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-07 AR ARP160100933A patent/AR104198A2/es not_active Application Discontinuation
- 2016-06-03 NO NO20160963A patent/NO342573B1/no unknown
- 2016-08-31 US US15/253,689 patent/US20170049888A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-01-03 CY CY20171100007T patent/CY1118467T1/el unknown
- 2017-01-26 CL CL2017000208A patent/CL2017000208A1/es unknown
-
2018
- 2018-05-22 NO NO20180694A patent/NO20180694A1/no not_active Application Discontinuation
-
2019
- 2019-02-07 US US16/270,381 patent/US20190358323A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5449268B2 (ja) | 高濃度抗体及びタンパク質製剤 | |
US20100158898A1 (en) | METHODS OF TREATING IgE-MEDIATED DISORDERS COMPRISING THE ADMINISTRATION OF HIGH CONCENTRATION ANTI-IgE ANTIBODY FORMULATIONS | |
AU2012200957B2 (en) | High concentration antibody and protein formulations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: NOVARTIS AG (CH) Free format text: TRANSFERIDO DE: GENENTECH, INC. |
|
B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI |
|
B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/10/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
|
B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 29/03/2004 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |