BRPI0316018B1

BRPI0316018B1 - vacina polissacarídica para infecções estafilocócicas

Info

Publication number: BRPI0316018B1
Application number: BRPI0316018A
Authority: BR
Inventors: B Pier Gerald; Maira-Litran Tomas
Original assignee: Brigham & Womens Hospital Inc
Priority date: 2002-11-12
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2017-04-04
Also published as: JP2006513166A; WO2004043405A8; AU2003295520A1; PT1565478T; IL263585A; NO20052828L; NZ539153A; KR20050074582A; NO341730B1; CA2501077C; US20050118198A1; IL209149A0; JP2019089845A; CN100351260C; BRPI0316018B8; ES2648046T3; KR101062525B1; PL229487B1; JP5814494B2; EP1565478B1

Abstract

"vacina polissacarídica para infecções estafilocócicas". a invenção se refere a composições de uma poliglucosamina n-acetilada desacetilada (dpnag) de estafilococos. a dpnag pode ser isolada de fontes naturais ou sinetizada de novo. a invenção também se refere ao uso de dpnag como uma vacina para induzir imunidade ativa a infecções causadas por staphylococcus aureus, s. epidermidis, outros estafilococos coagulase-negativos ou coagulase-positivos relacionados e outros organismos portadores do locus ica (adesão intracelular). a invenção também apresenta processos de uso de anti-corpos dirigidos contra dpnag, particularmente para induzir imunidade passiva à mesma classe de infecções.

Description

"VACINA POLISSACARÍDICA PARA INFECÇÕES ESTAFILOCÓCICAS" Campo da Invenção A presente invenção se refere a composições polis-sacarídicas utilizáveis para induzir imunidade para a prevenção e o tratamento de infecções êstafilocócicas. A invenção também se refere a processos de preparação e uso de an-tígenos â base de polissacarídeos, anticorpos relacionados e kits de diagnóstico e para indução de imunidade ativa e passiva com o material polissacarídico e anticorpos contra ele.

Fundamentos da Invenção Estafilococos são bactérias gram-positivas que normalmente habitam e colonizam a pele e membranas mucosas de seres humanos- Se a pele ou membrana mucosa for lesada durante uma cirurgia ou trauma, os estafilococos podem ganhar acesso aos tecidos internos, causando o desenvolvimento de infecção. Se os estafilococos proliferarem localmente ou entrarem no sistema linfático ou sangüíneo, podem resultar complicações infecciosas graves, como as associadas à bacteremia estafilocócica. Essas complicações incluem choque séptico, endocardite, artrite, osteomielite, pneumonia e abs-cessos em vários órgãos.

Estafilococos incluem tanto organismos coagulase-positivos que produzem uma coagulase livre, quanto organismos coagulase-negativos que não produzem essa coagulase livre. 0 Staphylococcus aureus é a forma coagulase-positiva mais comum dos estafilococos. S. aureus em geral causa infecção em um local delimitado, extravascular ou intravascu- lar, que pode resultar, por fim, em bacteremia. 0 S. aureus também é uma das principais causas de osteomielite aguda e causa infecções de pneumonia estafilocócica. Além disso, o S. aureus é responsável por aproximadamente 1-9% dos casos de meningite bacteriana e 10 - 15% dos abscessos cerebrais. Há pelo menos vinte e uma espécies conhecidas de estafilococos coagulase-negativos, incluindo S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. wameri, S. haemolyticus, S. saprophiticus, S. cohnii, S. xylosus, S. simulans e S. capitis. 0 S. epidermidis ê o agente causador de infecção mais freqüentemente associado a dispositivos de acesso in-travenoso e o isolado mais freqüente em bacteremias nosocô-micas primárias. 0 S. epidermidis também está associado a endocardite de válvula protética. O estafilococo também é uma fonte comum de infecção bacteriana em animais. Por exemplo, mastite estafilocócica é um problema comum em ruminantes, como bovinos, ovinos e caprinos. A doença em geral é tratada com antibióticos para reduzir a infecção, mas o tratamento é um procedimento custoso e ainda resulta em perda na produção de leite. As vacinas mais eficazes até agora identificadas são vacinas de S. aureus intacto vivo, administradas por via subcutânea. A administração de vacinas vivas, entretanto, está associada ao risco de infecção. Por essa razão, muitos pesquisadores tentaram produzir vacinas com S. aureus morto e/ou isolar polissacarídeos capsulares ou componentes de parede celular que induzissem imunidade a S. aureus. Nenhuma dessas tentativas, entretanto, foi bem sucedida.

Sumário da Invenção A presente invenção se refere a processos e produtos para imunização de seres humanos e animais contra infecção por estafilococos coagulase-negativos e coagulase-positivos. Descobriu-se, de acordo com a invenção, que um polissacarídeo de superfície poli N-acetil glucosamina (PNAG) de estafilococos, como S. aureus e S. epidermidis, que é muito pouco substituído com resíduos acetato, é altamente imunogênico in vivo e provoca, de preferência, anticorpos que medeiam a morte opsônica e a proteção contra a infecção. Esse polissacarídeo é, portanto, útil, entre outras coisas, na geração de respostas imunes, incluindo respostas imunes dependentes de anticorpos, contra estafilococos.

Em um aspecto, a invenção apresenta uma composição compreendendo um polissacarídeo isolado que compreende um polímero de β-1,6-glucosamina, com um comprimento de pelo menos duas unidades monoméricas, em que menos de 50% dos grupos amino da glucosamina estão substituídos com acetato. Em um aspecto, a composição é estéril (por exemplo, seria adequada para injeção in vivo). Em outro aspecto, a invenção apresenta uma composição compreendendo um polissacarídeo isolado que compreende um polímero de β-1,6-glucosamina com um comprimento de pelo menos duas unidades monoméricas, em que menos de 50% dos grupos amino da glucosamina estão substituídos com acetato, e em que o polissacarídeo está conjugado a um composto de veículo.

Conforme aqui usado, "um polissacarídeo da invenção" refere-se ao polissacarídeo de superfície poli N-acetil glucosamina (PNAG) estafilocócico com menos de 50% de substituições com acetato. Esse polissacarídeo é aqui chamado de PNAG desacetilado (dPNAG). Deve-se compreender que o dPNAG pode estar completa ou parcialmente desacetilado, contanto que a faixa de acetilação seja de 0 a menos de 50%. Conforme aqui usado, PNAG nativa é uma mistura de formas de PNAG com graus variáveis de acetilação. PNAG nativa pode incluir dPNAG; entretanto, está presente em uma mistura com formas altamente acetiladas de PNAG. Conforme aqui usado, uma forma "altamente acetilada" de PNAG é um PNAG com mais de 50% de substituições com acetato. Várias modalidades se aplicam igualmente aos vários aspectos da invenção. Essas modalidades são apresentadas abaixo.

Em uma modalidade, o polissacarídeo isolado é definido pela seguinte estrutura: em que n é um inteiro maior que ou igual a quatro, R é selecionado no grupo que consiste em -NH-CO-CH3 e -NH2, e menos de 50% dos grupos R são -NH-CO-CH3. De acordo com alguns as- pectos da invenção, em que o polissacarídeo está conjugado um composto de veículo ou a um ligante unido a um composto de veículo, n pode ser 2, 3, 4 ou mais.

Em uma modalidade, o polissacarídeo tem um peso molecular de pelo menos 800 Daltons, ao passo que, em outras modalidades, o peso molecular é de pelo menos 1.000 Daltons. Em ainda outras modalidades, o peso molecular é selecionado no grupo que consiste em pelo menos 1.200 Daltons, pelo menos mais de 2.000 Daltons, pelo menos 2.500 Daltons, pelo menos 5.000 Daltons, pelo menos 7.500 Daltons, pelo menos 10.000 Daltons, pelo menos 25.000 Daltons, pelo menos 50.000 Daltons, pelo menos 75.000 Daltons e pelo menos 100.000 Daltons. Em ainda outras modalidades, o peso molecular é selecionado no grupo que consiste em pelo menos 125.000 Daltons, pelo menos 150.000 Daltons, pelo menos 200.000 Daltons, pelo menos 250.000 Daltons, pelo menos 300.000 Daltons, pelo menos 350.000 Daltons, pelo menos 400.000 Daltons, pelo menos 450.000 Daltons, pelo menos 450.000 Daltons e pelo menos 500.000 Daltons. O polissacarídeo isolado pode ter um comprimento de pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis unidades monoméricas. Em outras modalidades, o comprimento do polissacarídeo é selecionado no grupo que consiste em pelo menos 6, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400 e pelo menos 500 unidades monoméricas.

Em outras modalidades, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 1% ou menos dos grupos amino da glucosamina (ou grupos R) estão substituídos com acetato. Em ainda outras modalidades, nenhum dos grupos amino da glucosamina está substituído com acetato. 0 dPNAG pode se referir a qualquer um desses.

Portanto, o polissacarídeo pode ser um polímero hetero-substituído, em que os grupos R são uma mistura de substituições acetato (isto é, -NH-C0-CH3) e grupos amina (isto é, -NH2) não substituídos, contanto que menos de 50% desses grupos estejam substituídos com acetato. 0 polissacarídeo também pode ser homo-substituído se todos os grupos R forem aminas (isto é, nenhum for substituído com acetato).

Em algumas modalidades da invenção, o polissacarídeo isolado pode ser conjugado a um composto de veículo. 0 composto de veículo pode ser conjugado ao polissacarídeo mediante um ligante. 0 composto de veículo pode ser um veículo peptídico, mas não se limita a esses.

Nessas e em outras modalidades, a composição compreendendo o polissacarídeo isolado também pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em algumas modalidades, a composição é pelo menos 90% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 97% pura ou pelo menos 99% pura (isto é, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% do polissacarídeo presente na composição é dPNAG). Em ainda outras modalidades, a composição é substancialmente livre de fosfato ou ácido teicóico. De preferência, a composição é substancialmente livre de po- lissacarídeos com mais de 50%, mais de 75% ou mais de 95% de substituições com acetato no grupo amino (R) da glucosamina.

Em algumas modalidades, o polissacarídeo consiste na seguinte estrutura: em que cada Χχ, X2, X3, X4, X5 e X6 é H, um composto de veículo ou um ligante unido a um composto de veículo, e cada Υχ, Y2 e Y3 é OH, um composto de veículo ou um ligante unido a um composto de veículo. Em algumas modalidades, apenas um composto de veículo ou ligante unido a um composto de veículo é conjugado à estrutura. Em outras modalidades, apenas um dentre Χχ, X2, X3, X4, X5 e X6 é conjugado a um composto de veículo ou a um ligante unido a um composto de veículo. Em ainda outras modalidades, apenas um dentre Υχ, Y2 e Y3 é conjugado a um composto de veículo ou a um ligante unido a um composto de veículo. Em ainda outras modalidades, o composto de veículo ou elo conjugado a ele é conjugado em apenas uma das posições de Χχ, X2, X3, X4, X5, X6, Υχ, Y2 ou Y3. 0 composto de veículo pode ser um polissacarídeo. Em outras modalidades, a molécula de veículo é um polissacarídeo opcional- mente substituído diretamente, ou mediante um ligante, com um ou mais compostos de veículo, como outros polissacarí-deos, peptídios e similares. Em algumas modalidades, o po-lissacarídeo de veículo não é uma N-acetil beta (/3) 1-6 glu-cosamina. De acordo com alguns aspectos da invenção, em que X é um composto de veículo ou um ligante unido a um composto de veículo, n pode ser 2, 3, 4 ou maior. A invenção apresenta composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos polissacarídeos da invenção, que podem ser usadas como vacinas. Essas composições compreendem o polissacarídeo em uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imune, como uma resposta imune específica para o antígeno. A composição de vacina também pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um adju-vante. A composição farmacêutica pode conter o polissacarídeo conjugado a um composto de veículo, diretamente ou mediante um ligante.

Outros aspectos da invenção apresentam processos para a preparação dos polissacarídeos da invenção. Esses processos são descritos abaixo.

Em um aspecto, a invenção apresenta um polissacarídeo isolado preparado de acordo com o seguinte processo: precipitação com etanol de uma preparação bruta de polissi-carídeo a partir de uma preparação concentrada de corpos de células bacterianas; digestão concomitante do polissacarídeo bruto com lisozima e lisostafina, seguido por digestão se-qüencial com uma nuclease e proteinase K, para formar uma preparação digerida de polissacarídeo; fracionamento por ta- manho da preparação digerida de polissacarídeo; isolamento de uma fração de polissacarídeo acetilado; e desacetilação do polissacarídeo acetilado para produzir um polissacarídeo desacetilado (isto é, um polissacarídeo com menos de 50% de substituições com acetato).

Em outro aspecto, a invenção também apresenta um antígeno polissacarídico compreendendo um polissacarídeo preparado de acordo com o seguinte processo: preparação de um polissacarídeo impuro a partir de uma cultura bacteriana; incubação do polissacarídeo impuro com um ácido ou uma base para produzir um polissacarídeo semi-puro; neutralização da preparação; e incubação da preparação neutralizada em ácido fluorídrico. Em uma modalidade, o processo também envolve o isolamento de um polissacarídeo acetilado da preparação e a desacetilação do polissacarídeo acetilado para produzir um polissacarídeo desacetilado. Em uma modalidade, o polissacarídeo acetilado é quimicamente desacetilado, até um grau desejado que seja menor que 50%. Em outra modalidade, o polissacarídeo acetilado é desacetilado por incubação com uma solução básica, até um grau desejado que seja menor que 50%. Em ainda outra modalidade, o polissacarídeo acetilado é en-zimaticamente desacetilado. Várias modalidade se aplicam aos processos precedentes. Algumas dessas modalidades adicionais são apresentadas abaixo. A cultura bacteriana pode ser uma cultura de es-tafilococos coagulase-negativos ou coagulase-positivos. A cultura bacteriana pode ser uma cultura de Staphylococcus aureus ou uma cultura de Staphylococcus epidermidis. Em ou- tra modalidade, a preparação de polissacarídeo é fracionada por tamanho com uma coluna.

Um exemplo de preparação do polissacarídeo da invenção é o seguinte: uma cultura bacteriana é incubada com uma base forte ou um ácido forte para preparar uma solução ácida ou básica. A solução ácida ou básica é, então, neutralizada a pH 2 para produzir uma suspensão de antígeno bruto. A suspensão de antígeno bruto é dialisada contra uma solução como água desionizada, e antígeno bruto insolúvel é coletado. 0 antígeno bruto insolúvel pode ser liofilizado e, então, novamente posto em suspensão em um tampão. 0 tampão pode ser selecionado no grupo que consiste em PBS a 50 mM e Tris a 100 mM com NaCl a 150 mM. A base ou o ácido forte pode ser NaOH a mais de 1 N ou HC1 a mais de 1 M. Em algumas modalidades, a base ou o ácido frote é NaOH a 5 N ou HCl a 5 M. Em outra modalidade, o extrato de cultura bacteriana é agitado em uma base ou ácido forte durante 18 - 24 horas. A extração com base ou ácido forte pode ser repetida. O processo também envolve o tratamento da preparação de antígeno para remover grupos acetato ligados a mino até um grau desejado de substituição com acetato ser atingido, produzindo, dessa forma, o PNAG desacetilado. A desacetilação pode ser realizada química ou enzimaticamente. Como exemplo, a preparação de antígeno pode ser incubada a 37°C durante 2-20 horas em NaOH a 1,0 N. A incubação também pode ser realizada em bases mais fracas durante tempos mais longos ou a temperaturas mais altas, ou em bases mais fortes durante tempos mais curtos ou a temperaturas mais baixas.

Os processos precedentes podem envolver alternati vamente o isolamento de uma fração da preparação com menos de 50% de substituições com acetato, sem a necessidade de desacetilação adicional. A invenção, em ainda outro aspecto, apresenta processos para a preparação de composições farmacêuticas. Em uma modalidade, o polissacarídeo é combinado com um veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, o polissacarídeo é conjugado a um composto de veículo, diretamente ou mediante um ligante, e, então, opcionalmente combinado com um veículo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

Qualquer um dos polissacarídeos desacetilados aqui descritos (isto é, dPNAG) pode ser usado nos processos terapêuticos ou profiláticos da invenção.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um processo para prevenir uma infecção estafilocócica em um indivíduo, de preferência um indivíduo não roedor. A invenção envolve a administração a um indivíduo que necessite dela de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune contra estafilococos de qualquer um dos polissacarídeos da invenção. Em algumas modalidades, o estafilococo é Staphylococcus aureus, e, em outras, o estafilococo é Staphylococcus epi-dermidis. O indivíduo é qualquer indivíduo que possa ser infectado com estaf ilococos e, de preferência, não é um roedor. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano, e, em outras modalidades, o indivíduo é um primata, cavalo, vaca, suíno, cabra, ovelha, cão ou gato.

Em algumas modalidades, o indivíduo está com risco de exposição a estafilococos, e, em outras modalidades, o indivíduo foi exposto a estafilococos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano com mais de 60 anos de idade. 0 indivíduo pode ser saudável. Em algumas modalidades o indivíduo não recebeu um implante de dispositivo médico.

De preferência, o polissacarídeo é formulado como uma vacina, conforme aqui descrito ou sabido na técnica. Em uma modalidade relacionada, o polissacarídeo é administrado com um adjuvante. Em outras modalidades, o polissacarídeo é administrado por via sistêmica ao indivíduo. O antígeno pode ser conjugado a um composto de veículo. Em algumas modalidades, o composto de veículo é um veículo peptídico, embora não se limite a esses.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um processo para induzir imunidade ativa contra uma infecção estafilocó-cica em um indivíduo. 0 processo inclui a etapa de administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz para induzir imunidade ativa contra uma infecção estafilocócica de qualquer uma das composições contendo polissacarídeos precedentes. Em uma modalidade, o processo é um processo para induzir imunidade contra infecção por Staphylococcus aureus. Em outra modalidade, o processo é um processo para induzir imunidade contra infecção por Staphylococcus epidermidis.

Apresenta-se um processo para produzir anticorpos policlonais ou monoclonais de acordo com outro aspecto da invenção. 0 processo envolve a administração a um indivíduo de um adjuvante e qualquer um dos polissacarídeos da invenção, em uma quantidade eficaz para produzir anticorpos específicos para estafilococos, e isolamento de anticorpos do indivíduo. Neste, assim como em outros aspectos da invenção, o polissacarídeo é usado como um antígeno. Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano, ao passo que, em outras, o indivíduo é um indivíduo não humano, como um coelho, camun-dongo ou rato. 0 processo também pode compreender a purificação do anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um processo para gerar anticorpos monoclonais, que compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz para produzir anticorpos específicos para estafilococos de um polissacarídeo da invenção isolado, e um adjuvante, a colheita de células do baço do indivíduo, a fusão das células do baço do indivíduo a células de mieloma e a colheita da produção de anticorpos de um subclone de fusão.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, apresenta-se um processo para identificar um anticorpo monoclonal específico para um polissacarídeo da invenção. 0 processo envolve a indução da uma resposta imune ao antígeno em um indivíduo não humano, o isolamento de células produtoras de anticorpos do indivíduo, a produção de células imortalizadas a partir das células produtoras de anticorpos e o teste da capacidade das células imortalizadas de produzirem o anticorpo monoclonal com um polissacarídeo da invenção. O processo, em uma modalidade, também inclui a etapa de isolamento de um anticorpo monoclonal do sobrenadante das células imortalizadas. A invenção também apresenta uma composição que compreende um agente de ligação isolado que se liga seletivamente a um polissacarídeo da invenção isolado. Em uma modalidade, o agente de ligação isolado é um peptídio. 0 pep-tídio pode ser um anticorpo ou seu fragmento. 0 anticorpo pode ser um anticorpo policlonal. 0 anticorpo pode ser um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas importantes modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o agente de ligação isolado se liga especificamente a dPNAG. Em outras modalidades, o agente de ligação isolado se liga tanto a dPNAG, quanto a formas altamente acetiladas de PNAG.

Em algumas modalidades, o agente de ligação isolado é conjugado a um marcador detectável. 0 marcador detectá-vel pode ser selecionado no grupo que consiste em um marcador radioativo, uma enzima, uma molécula de biotina, uma molécula de avidina ou um fluorocromo. 0 agente de ligação isolado pode ser conjugado a um bactericida, como um antibiótico .

De acordo com outro aspecto da invenção, apresenta-se um processo para induzir imunidade passiva contra infecções estafilocócicas em um indivíduo. A infecção pode ser uma infecção por Staphylococcus aureus, mas não se limita a essas. 0 processo inclui a etapa de administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz para induzir opsonização de estafilococos de um dos anticorpos precedentes que se ligue a dPNAG.

Os processos acima destinados à prevenção de uma infecção estafilocócica podem ser realizados em indivíduos com risco de desenvolver essa infecção. Esses processos também pode ser aplicados ao tratamento de indivíduo com uma infecção estafilocócica. Os processos profiláticos e terapêuticos da invenção podem ser usados em indivíduos com ou com risco de ter uma infecção de uma espécie bacteriana que expresse PNAG nativa.

Em um aspecto adicional, a invenção apresenta um processo para tratamento de um indivíduo com uma infecção estafilocócica, que compreende a administração de um agente de ligação isolado que se ligue a um polissacarídeo da invenção isolado a um indivíduo, em uma quantidade eficaz para inibir a infecção estafilocócica. Em importantes modalidades, o agente de ligação se liga a formas altamente acetila-das de PNAG, assim como a dPNAG.

Em uma modalidade, a infecção estafilocócica é selecionada no grupo que consiste em infecção por Staphylococcus epidermidis e infecção por Staphylococcus aureus. Em outra modalidade, o agente de ligação isolado é conjugado a um bactericida, como um antibiótico.

Outro aspecto da invenção apresenta um processo para avaliar a capacidade de um polissacarídeo de proteger contra infecção estafilocócica em um indivíduo. 0 processo envolve a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do polissacarídeo, em que o polissacarídeo induz imunidade ativa, a exposição do indivíduo a um estafilococo e o teste quanto à presença do estafilococo no indivíduo.

Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta processo para identificar a presença de dPNAG em uma amostra, que compreende o contato da amostra com um agente de ligação isolado que se ligue a dPNAG, e a detecção da ligação do agente de ligação isolado à amostra. A ligação do agente de ligação isolado à amostra indica a presença de dPNAG na amostra. Se o agente de ligação também se ligar a PNAG, então, o processo também pode ser usado para detectar a presença de PNAG na amostra. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra biológica de um indivíduo. A amostra biológica pode ser selecionada no grupo que consiste em urina, sangue, pus, pele, escarro, fluido articular, linfa e leite. Em uma modalidade, o agente de ligação isolado é conjugado a um marcador detectável, como aqueles aqui descritos. A amostra também pode ser derivada de um suabe de um dispositivo médico implantável ou implantado.

Cada uma das limitações da invenção pode englobar várias modalidades da invenção. Conseqüentemente, considera-se que cada uma das limitações da invenção envolvendo qualquer elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspecto da invenção.

Breve Descrição da Listagem de Seqüência A SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de nucleotídeos do locus ica de S. aureus que foi depositada no GenBank sob o número de acesso AF086783.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 mostra a ligação de anticorpo a PNAG nativa. O anticorpo foi gerado contra PNAG nativa conjugada a toxóide diftérico. A Fig. 2 mostra a ligação de anticorpos a PNAG de-sacetilado. Os anticorpos foram gerados contra dPNAG conjugada a toxóide diftérico. A Fig. 3 mostra títulos de anticorpos obtidos em camundongos (10 por gruo) imunizados 3 vezes por via subcu-tânea, com uma semana de diferença, com PNAG nativa acoplado a toxóide diftérico (DTm). Os animais foram imunizados com a dose indicada na legenda. Amostras de sangue foram obtidas a intervalos semanais, 1-4 semanas após a imunização inicial. A Fig. 4 mostra títulos de anticorpos obtidos em camundongos (10 por grupo) imunizados 3 vezes por via subcu-tânea, com uma semana de diferença, com dPNAG acoplado a toxóide diftérico (DTm). Os animais foram imunizados com a dose indicada na legenda. Amostras de sangue foram obtidas a intervalos semanais, 1-4 semanas após a imunização inicial. A Fig. 5 mostra a morte opsônica de cepas estafi-locócicas, conforme indicado na legenda, por anticorpos do soro de um coelho imunizado com dPNAG conjugada a toxóide diftérico (coelho 1). Cada ponto mostra a porcentagem média morta â diluição indicada. A Fig. 6 mostra a morte opsônica de cepas estafi-locócicas, conforme indicado na legenda, por anticorpos do soro de um coelho imunizado com dPNAG conjugada a toxóide diftérico (coelho 2). Cada ponto mostra a porcentagem média morta à diluição indicada. A Fig. 7 mostra a morte opsônica de cepas estafi-locócicas, conforme indicado na legenda, por anticorpos do soro de um coelho imunizado com PNAG nativa conjugada a to-xóide diftérico (coelho 3). Cada ponto mostra a porcentagem média morta à diluição indicada. A Fig. 8 mostra a morte opsônica de cepas estafi-locócicas, conforme indicado na legenda, por anticorpos do soro de um coelho imunizado com PNAG nativa conjugada a to-xóide diftérico (coelho 4). Cada ponto mostra a porcentagem média morta à diluição indicada. A Fig. 9 resume os títulos de morte opsônica de anticorpos dos soros dos quatro coelhos contra as cepas es-tafilocócicas indicadas no eixo X. Os coelhos são descritos nas legendas das Figuras acima. Cada barra mostra o recíproco da diluição do soro em que 40% das bactérias foram mortas. Barras < 10 indicam soros incapazes de matar 40% das bactérias a uma diluição de soro de 1:10.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção se refere a antígenos polissacarídicos derivados de bactérias estafilocócicas. Esses antígenos são utilizáveis para induzir imunidade contra infecção bacteria-na e também para produzir anticorpos para fins diagnósticos e terapêuticos. A presente invenção se base, em parte, na descoberta de que poli-N-acetil glucosamina (PNAG) fracamente a-cetilada (isto é, desacetilada), aqui chamada de dPNAG, é altamente imunogênica e, portanto, representa um candidato a vacina adequado para estimular respostas imunes protetoras in vivo. Uma PNAG desacetilada tem menos de 50% de seus grupos amino substituídos com acetato. Em algumas modalidades, há 35% ou menos de substituintes acetato, ao passo que, em outras, há 15% ou menos de substituintes acetato. Também se descobriu, de acordo com a invenção, que dPNAG é melhor para gerar anticorpos protetores opsônicos do que a PNAG nativa. PNAG "nativa" refere-se à mistura de ocorrência natural de PNAG com uma faixa de níveis de acetilação que varia de 0 -100%. dPNAG pode ser derivada de PNAG nativa com os processos de desacetilação aqui descritos. Os anticorpos preparados contra dPNAG são, portanto, eficazes contra estafiloco-cos, como S. aureus e S. epidermidis. Portanto, descobriu-se, de acordo com a invenção, que o grau de acetilação influencia o nível de resposta imune induzida pela administração do antígeno in vivo. Os anticorpos gerados após a administração de dPNAG reconhecem dPNAG e, em importantes modalidades, também reconhecem formas altamente acetiladas de PNAG. A invenção apresenta composições de dPNAG isolada, processos de isolamento e, em alguns casos, de purificação de dPNAG, assim como processos de uso, incluindo processos terapêuticos, profiláticos e diagnósticos in vivo. Conforme aqui usado, a dPNAG pode ser chamada de antígeno dPNAG. Esses últimos termos devem ser intercambiáveis. A invenção também apresenta composições farmacêuticas de dPNAG que podem ser usadas como vacinas.

Em alguns aspectos, dPNAG tem a seguinte estrutura: em que n é um inteiro que varia de 2 a mais de ou igual a 300, Ré selecionado no grupo que consiste em -NH-CO-CH3 e -NH2, contanto que menos de 50% dos grupos R sejam -NH-CO-CH3. dPNAG tem uma ligação beta (β) 1-6 (isto é, é composta por unidades monoméricas glucosamina ligadas entre si por ligações beta (β) 1-6. dPNAG pode ser um homopolímero se todos os grupos R forem não substituídos (isto é, R = NH2) . Um homopolímero é um em que os grupos R dos resíduos glucosamina sejam idênticos. dPNAG também pode ser um heteropolímero com uma mistura de grupos -NH2 e -NH-CO-CH3 na posição R, contanto que menos de 50% dos grupos R estejam substituídos com acetato. Dependendo das modalidades, menos de 49%, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% dos grupos R podem ser substituídos com acetato. O tamanho da dPNAG varia grandemente e depende de se a dPNAG está conjugada a um composto de veículo, conforme aqui descrito. Em alguns aspectos, o antígeno dPNAG tem um peso molecular de pelo menos 100.000 Daltons. Em outros aspectos, o antígeno dPNAG tem um peso molecular de menos de 2.000 Daltons. O peso molecular de PNAG pode ser de pelo menos 200 Daltons, ou de pelo menos 400 Daltons, ou de pelo menos 600 Daltons ou de pelo menos 800 Daltons. dPNAG de menor peso molecular pode ser usada de acordo com a invenção, de preferência quando conjugada a um composto de veículo. Essa dPNAG pode ser tão pequena quanto 2-3 unidades mono-méricas, mas, de preferência, tem pelo menos 4-6 unidades monoméricas de comprimento. Os pesos moleculares correspondentes para essas são de aproximadamente 400, 600, 800, 1.000 e 1.200 Daltons. Polissacarídeos entre 500 e 20.000 Daltons são típicos.

Conforme se compreenderá, o valor de n na estrutura acima tem um impacto sobre o peso molecular do antígeno. Se n for igual a ou maior que 300, então, o peso molecular do polissacarídeo mínimo na estrutura é de 60.918 Daltons (300 unidades x 203 Daltons/unidade + 18 Daltons para os substituintes nos resíduos terminais). Se o antígeno tiver um peso molecular mínimo de 100.000 Daltons, então, o polissacarídeo tem mais de 300 unidades, ou o polissacarídeo está conjugado a um composto de veículo que compõe a diferença no peso molecular. A invenção apresenta tanto formas de ocorrência natural, quanto sintéticas do antígeno dPNAG. Conforme aqui usado, dPNAG de ocorrência naturalé uma que exista em ou possa ser isolada ou derivada de fontes de ocorrência natural . Antígenos dPNAG também são apresentados em uma forma isolada. Um polissacarídeo isolado, como dPNAG isolada, é um que tenha sido removido e, portanto, separado do ambiente em que normalmente existe. Em alguns casos, um polissacarídeo isolado é suficientemente separado de outros compostos para ser estrutural ou funcionalmente caracterizado. Por exemplo, um polissacarídeo isolado pode ser "seqüenciado" para se determinar sua composição química. dPNAG pode ser preparada a partir de qualquer cepa bacteriana portadora do locus ica. Essas cepas incluem, mas não se limitam a, S. epidermidis e S. aureus e outras cepas (por exemplo, S. carnosus) que tenham sido transformadas com os genes no locus ica. Em particular, dPNAG pode ser preparada a partir de cepas específicas, incluindo S. epidermidis RP62A (ATCC número 35984), S. epidermidis RP12 (ATCC número 35983), S. epidermidis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27) e S. aureus MN8 mucóide.

Um processo envolve a incubação de PNAG impura com uma base ou ácido para produzir uma preparação de PNAG semi-pura, a neutralização da preparação e o tratamento adicional da preparação neutralizada para produzir a dPNAG. PNAG nativa impura pode ser preparada por vários processos, inclusive a extração de uma preparação de PNAG nativa bruta de uma cultura bacteriana, incluindo células e sobrenadantes de cultura livres de células, o que resulta no isolamento de um material enriquecido com PNAG nativa de alto peso molecular da preparação de PNAG bruta, e obtida inicialmente por precipitação de uma PNAG impura contendo o material enriquecido com PNAG de alto peso molecular com um solvente, como metanol, etanol, acetona ou qualquer outro solvente orgânico conhecido por aqueles versados na técnica como capaz de causar a precipitação de polissacarídeos de soluções aquosas. As etapas de extração da preparação de PNAG nativa bruta e isolamento e precipitação da preparação de antígeno PNAG nativa impura são realizadas por qualquer processo conhecido na técnica, como aqueles incluídos na patente norte-americana n° 5.055.455. Esse material impuro é, então, purificado e desacetilado para produzir a dPNAG da invenção.

As etapas de purificação são conseguidas por incubação de PNAG impura com enzimas bacterianas que possam digerir materiais biológicos, incluindo agentes de ruptura de parede celular, como lisozima, lisostafina e proteinase K, e enzimas nuclease, como DNase e RNase para digerir DNA e RNA. Isso é seguido pela adição de um solvente que precipite PNAG da solução, coleta do precipitado e redissolução da PNAG em uma base, como NaOH, ou um ácido, como HCl, seguido por neutralização. A neutralização pode ser realizada com uma base, se a etapa de incubação foi realizada com um ácido, ou com um ácido, se a etapa de incubação foi realizada com uma base. A fração insolúvel do material neutro é, então, tratada, por exemplo, por incubação em ácido fluorídrico para produzir um antígeno PNAG nativo puro ou por redissolução em tampões com um pH < 4,0, seguido por crivo molecular e/ou cro-matografia de troca iônica.

Outro processo de isolamento inclui as etapas de extração de uma suspensão de PNAG bruta de uma cultura bac-teriana por incubação das bactérias com uma base ou ácido forte. De preferência, as bactérias são agitadas em uma base ou ácido forte durante pelo menos 2 horas e, mais preferivelmente, pelo menos 5, 10, 15, 18 ou 24 horas. A base ou ácido forte pode ser qualquer tipo de base ou ácido forte, mas, de preferência, tem uma força de pelo menos 1 M de NaOH ou HCl. Em algumas modalidades, a base ou ácido forte é NaOH a 5 M ou HCl a 5 Η. A solução ácida ou básica é, então, submetida a centrifugação para coletar os corpos celulares. Em algumas modalidades, o procedimento de extração é repetido várias vezes. A solução ácida ou básica resultante é neutralizada a aproximadamente pH 7 e, então, dialisada para produzir PNAG impura insolúvel. dPNAG pode ser sintetizada a partir de polissaca-rídeos de ocorrência natural que seja mais de 50% substituídos com acetato. Por exemplo, o antígeno dPNAG pode ser sintetizado por desacetilação de um polímero de glucosamina altamente acetilado por meios químicos (por exemplo, tratamento com base) ou enzimáticos.

Antígenos dPNAG também podem ser sintetizados de novo. (Veja, por exemplo, Melean et al. Carbohydrate Research, 337:1893-1916, 2002). Os materiais de partida incluem, mas não se limitam a, poliglicose (isto é, dextrano), poli-glucosaminas, como quitina ou quitosano, e ácido poligluco-saminourônico. O ácido poligalactosaminourônico também pode ser usado para produzir o antígeno dPNAG da invenção. Poli-glucosaminas com vários substituintes também podem ser modificadas para produzir o antígeno PNAG. Por exemplo, adesina intercelular polissacarídica (PIA) é um polímero altamente acetilado de resíduos glucosamina ligados em β-1-6. PIA tem a seguinte estrutura: Para os polissacarídeos que contêm frações imina (C-NH), grupos amino livres podem ser formados por técnicas químicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica. Um processo adequado envolve o uso de boroidreto de sódio. 0 grupo imina pode ser reduzido com boroidreto de sódio para criar um grupo amino livre. Isso é feito por adição de um excesso de 5 mg de boroidreto ao polissacarídeo dissolvido em água destilada, enquanto se agita à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura é, então, dialisada contra água e secada por congelamento. (Veja, por exemplo, Di-Fabio, et al. Biochem. J., 1987 15; 244(1):27-33). A invenção apresenta preparações de dPNAG de pureza variável. Conforme aqui usado, uma "preparação de dPNAG pura" é uma preparação de dPNAG que tenha sido isolada ou sintetizada e que seja mais de 92% livre de contaminantes. Esses contaminantes incluem formas de PNAG altamente substituídas com acetato (isto é, mais de 50% de substituição com acetato), galactose, fosfato, ácido teicóico e outros. Em algumas modalidades, as composições de dPNAG são pelo menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% livres de contarainantes, ou são 100% livres de contaminantes.

Composições de dPNAG também pode ser chamadas de "substancialmente livres" de contaminantes. Uma composição de dPNAG substancialmente livre de, por exemplo, galactose indica a presença de menos de 10%, de preferência menos de 5% ou, mais preferivelmente, menos de 1% de galactose em uma preparação que contenha dPNAG. O grau de pureza da composição de dPNAG pode ser avaliado por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, a pureza pode ser avaliada por ensaios de análise química, assim como cromatografia gasosa e ressonância magnética nuclear para verificar aspectos estruturais do material.

Outro importante contaminante de algumas preparações de dPNAG pode ser ácido teicóico que contenha fosfato. A contaminação com ácido teicóico pode interferir tanto com a caracterização química, quanto com a imunogenicidade do antígeno dPNAG da invenção. Os processos da invenção aqui descrita são capazes de produzir uma preparação de dPNAG isolada que seja substancialmente livre de ácido teicóico. Uma preparação de dPNAG que seja substancialmente livre de ácido teicóico é uma que tenha menos de 1,0% de fosfato e, mais preferivelmente, uma que tenha menos de 0,1% de fosfato. A quantidade de fosfato presente na amostra pode ser avaliada por qualquer meio conhecido na técnica. A quantidade de contaminação por fosfato pode ser avaliada pelos processos descritos em Keleti, G. e W. H. Lederer, ((1974) Handbook of Micromethods for the Biological Sciences, Van Nostrand Reinhold Co., Nova Iorque), que são aqui incorporados por referência. Resumidamente, o ensaio é realizado da seguinte maneira: a 100 pg de amostra, adicionam-se 100 pL de uma solução preparada pela adição de 43,5 mL de água, 6,5 mL de ácido perclórico a 70% (Hcl04) e 50 mL de ácido sulfúrico a 20 N (H2S04) . Aquece-se a 95°C durante 2 horas em um tubo com uma bolinha de vidro sobre ele. A mistura é, então, colocada em um forno a 165°C e aquecida durante mais 2 horas, então, resfriada à temperatura ambiente. A seguir, um mL de reagente 5, preparado pelo processo a seguir, é adicionado à amostra: Reagente 1: 1,36 gramas de acetato de sódio.3H20 dissolvidos em 10 mL de água.

Reagente 2: 500 mg de molibdato de amônio dissolvidos em 20 mL de água.

Reagente 3: 2 mL de reagente 1, 2 mL de reagente 2 e 16 mL de água.

Reagente 4: 2 g de ácido ascórbico dissolvidos em 20 mL de água, preparado imediatamente antes do uso.

Reagente 5: adicionar em um banho de gelo 9 mL de reagente 3 e 1 mL de reagente 4.

Após a adição do reagente 5, os tubos são completamente misturados, e a densidade óptica é lida a 820 nanô-metros em um espectrofotômetro. Uma curva padrão que consiste em fosfato de sódio monobásico (faixa de 0,1 - 5 pg por tubo) é usada para calcular a quantidade de fosfato presente nas amostras de teste. (Lowry, 0. Η., N. R. Roberts, K. Y. Leiner, M. L. Wu e A. L. Farr., (1954), Biol. Chem. 207, 1.) As composições da invenção são utilizáveis em várias aplicações diferentes, inclusive diagnóstico in vitro, in si tu e in vivo de estado patológico, como infecção. As composições podem ser usadas para imunizar indivíduos in vivo, para prevenir ou tratar infecção. As composições também podem ser usadas para desenvolver anticorpos e outros peptí-dios de ligação que sejam úteis para as mesmas finalidades que as composições dPNAG da invenção. Assim, a invenção inclui composições farmacêuticas que compreendem dPNAG ou agentes de ligação correspondentes (por exemplo, anticorpos) que possam ser usados para fins de vacinação para induzir imunidade ativa ou passiva em um indivíduo que necessite disso. A invenção também apresenta processos para gerar agentes de ligação, como anticorpos que se liguem a dPNAG, que podem ser usados no diagnóstico e tratamento de infecções estafilocócicas e estados associados. dPNAG pode ser usada em uma forma conjugada ou não conjugada. Em uma forma conjugada, dPNAG pode ser conjugada a um composto de veículo diretamente ou mediante um ligante. A conjugação pode ocorrer em qualquer posições na unidade monomérica glucosamina ou nas extremidades do polímero.

Um "composto de veículo", conforme aqui usado, é um composto que possa ser conjugado a um polissacarídeo diretamente ou mediante uso de um ligante e que possa ser imu-nologicamente ativo ou inerte.

Compostos de veículo incluem, mas não se limitam a, proteínas, ou peptídios, polissacarídeos, ácidos nucléi-cos, ou outros polímeros, lipídios e moléculas pequenas.

Proteínas incluem, por exemplo, proteínas plasmáticas, como albumina sérica, imunoglobulinas, apolipoproteínas e trans-ferrina; polipeptídios bacterianos, como TRPLE, β-galactosidase, polipeptídios como proteína gD de herpes, a-lergenos, toxóides diftérico e tetânico, flagelina de salmo-nela, pilina de hemophilus, proteínas de membrana de hemophilus de 15 kDa, 28 - 30 kDa e 40 kDa, Escherichia coli, enterotoxina Itb termícamente marcada, toxina da cólera e proteínas virais, incluindo VP de rotavírus e proteínas f e g do vírus sincicial respiratório. As proteínas utilizáveis na invenção incluem qualquer proteína que seja segura para administração a mamíferos e, opcionalmente, que seja uma proteína de veículo imunologicamente eficaz.

Compostos de veículo que são utilizáveis particularmente para imunização incluem proteínas como hemocianina de lapa, albumina sérica, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja. Qualquer outro composto que seja imuno-gênico nas espécies de animais a serem imunizados também pode ser usado. São conhecidos muitos processos na técnica para a conjugação de um polissacarídeo a uma proteína. Em geral, o polissacarídeo deve ser ativado ou de outra forma tornado passível de conjugação, isto é, pelo menos uma fração tem de se tornar capaz de ligação covalente a uma proteína ou outra molécula. Muitos desses processos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a patente norte-americana n° 4.356.170, expedida para Jennings, descreve o uso de ácido periódico para gerar grupos aldeído no polissacarídeo e, então, a realização de uma aminação redutora com cianoboroidreto. A patente norte-americana n° 4.663.160, expedida para Tsay et al., também usa ácido periódico para gerar grupos aldeído, mas, então, liga o polissacarídeo a uma proteína derivada com uma fração carbono 4-12 (preparada na presença de um agente de condensação) com uma reação de base de Schiff, na presença de um agente redutor como cianoboroidreto. A patente norte-americana n° 4.619.828, expedida para Gordon, usa brometo de cianogênio para ativar o polissacarídeo e, então, sua conjugação mediante uma ponte espaçadora de 4 - 8 átomos de carbono â proteína. Na patente norte-americana n° 4.808.700, expedida para Anderson e Clements, um polissacarídeo é modificado para produzir pelo menos uma extremidade redutora mediante divagem oxidativa limitada por periodato, hidrólise por glicosidases ou hidrólise ácida, e é conjugado a uma proteína mediante aminação redutora na presença de cianoboroidreto. A patente norte-americana n° 4.711.779, expedida para Porro e Constantino, descreve a ativação de polissaca-rídeos por introdução de grupos amino primários no grupo redutor terminal com cianoboroidreto de sódio, seguida por conversão em ésteres na presença de derivados de ácido adí-pico e conjugação a um toxóide na presença de um solvente orgânico, como dimetilsulfoxido. Muitos outros processos de conjugação são conhecidos na técnica. O composto de veículo pode ser conjugado a dPNAG mediante um ligante ou espaçador. Um polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante ou espaçador por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, o uso de uma extremidade redutora livre do polissacarídeo para produzir uma ligação covalente com um espaçador ou elo. Uma ligação covalente pode ser produzida por conversão de uma extremidade redutora livre de dPNAG em um 1-aminoglicosídeo livre, que pode ser subseqüentemente ligado covalentemente a um espaçador por acilação. (Lundquist et al., J. Carbohydrate Chem., 10:377 (1991)). Alternativamente, dPNAG pode ser covalentemente ligada ao espaçador com um éster ativo N-hidroxissuccinimida como grupo ativado no espaçador. (Kochetkow, Carbohydrate Research, 146:Cl (1986)). A extremidade redutora livre da dPNAG também pode ser convertida em uma lactona usando hidróxido de iodo e potássio. (Isebell et al., Methods of Carbohydrate Chemistry, Academic Press, Nova Iorque (1962)). A lactona pode ser covalentemente ligada ao espaçador por meio de um grupo amino primário no espaçador ou elo. A extremidade redutora livre da dPNAG também pode ser covalentemente ligada ao elo ou espaçador mediante aminação redutora. A invenção engloba anticorpos que se ligam a dPNAG. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais. 0 anticorpos contra dPNAG se ligam a dPNAG e também podem se ligar a formas de PNAG que sejam mais de 50% acetiladas.

Anticorpos policlonais em geral são gerados em animais por múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitone-ais de um antígeno e um adjuvante. Anticorpos policlonais contra dPNAG podem ser gerados por injeção de dPNAG em forma conjugada ou não conjugada, isoladamente ou em combinação com um adjuvante.

Um exemplo de preparação de anticorpo policlonal é o seguinte. dPNAG ou um conjugado de dPNAG é combinado com um adjuvante, como o adjuvante completo de Freund (por exemplo, 100 pg de conjugado para coelhos ou camundongos em 1 -3 volumes de Freund) e injetado por via intradérmica em múltiplos locais. Aproximadamente um mês mais tarde, os animais são reforçados com 1/5 - 1/10 da quantidade original de an-tígeno, ou conjugado de antígeno, em adjuvante por injeção subcutânea em múltiplos locais. Uma ou duas semanas mais tarde, os animais são sangrados, e o soro é ensaiado quanto à presença de anticorpo. Os animais podem ser repetidamente reforçados até que o título de anticorpo atinja um platô. 0 animal pode ser reforçado apenas com dPNAG, conjugado de dPNAG ou dPNAG conjugado a um composto de veículo diferente, com ou sem um adjuvante. Em algumas modalidades, os reforços podem compreender PNAG, em vez de dPNAG, ou podem conter uma mistura de dPNAG e PNAG.

Além de suprir uma fonte de anticorpos policlo-nais, os animais imunizados podem ser usados para gerar anticorpos monoclonais anti-dPNAG. Conforme aqui usado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população homogênea de imunoglobulinas que se ligam ao mesmo epítopo (isto é, determinante antigênico) de dPNAG. Esse epítopo também pode estar presente em formas de PNAG que sejam mais de 50% acetiladas. Anticorpos monoclonais têm o mesmo rearranjo de gene Ig e, portanto, demonstram especificidade de ligação idêntica. Anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer processo conhecido na técnica, como por imortaliza- ção de células esplânicas isoladas do animal imunizado, por exemplo, por fusão com células de mieloma ou por transformação com vírus Epstein Barr, e triagem de clones que expressem o anticorpo desejado. Outros processos envolvem o isolamento de seqüências de gene Ig rearranjadas e clonagem em linhagens celulares imortalizadas. Processos para preparação e uso de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica.

Anticorpos monoclonais anti-dPNAG murídeos podem ser preparados por qualquer um desse processos, usando dPNAG como um imunógeno. A descrição a seguir de um processo para desenvolver um anticorpo monoclonal anti-dPNAG é exemplifi-cativa e é apresentada apenas para fins ilustrativos. Camun-dongos Balb/c são imunizados por via intraperitoneal com aproximadamente 75 - 100 pg de dPNAG purificada em adjuvante de Freund completo. Injeções de reforço de aproximadamente 25 - 50 pg de dPNAG em Freund incompleto são administradas aproximadamente nos dias 15 e 35 após a injeção inicial. No dia 60 -65, os camundongos recebem injeções de reforço de aproximadamente 25 pg de dPNAG na ausência de adjuvante. A injeção de reforço pode compreender alternativamente uma preparação de PNAG nativa ou uma mistura de dPNAG e PNAG. Três dias depois, os camundongos são mortos, e as células esplânicas isoladas são fusionadas a células de mieloma mu-rídeo NS-1 usando polietileno glicol, por um procedimento como o descrito por Oi (Oi VT: Immunoglobulin-producing hybrid cell lines in Herzenber LA (ed.): Selected Methods in Cellular Biology, São Francisco, CA, Freeman (1980)). Células de hibridoma são selecionadas com hipoxantina, aminopte- rina e timidina (HAT) e cultivadas em cultura. Catorze e quinze dias após a fusão, células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais anti-dPNAG são identificadas mediante um radioimunoensaio em fase sólida por captura de anticorpos anti-dPNAG de meios condicionados com IgG anti-camundongo de cabra imobilizado, seguido por quantificação de dPNAG ou PNAG marcada com 125I especificamente ligada. Hibridomas que testem positivo para anticorpos contra dPNAG são subclonados por diluição limitativa e novamente testados. Ascites para os hibridomas são, então, preparadas em camundongos BALB/c preparados com pristane por injeção de aproximadamente 1 x 106 células/camundongo. Concentrados enriquecidos com os anticorpos monoclonais selecionados são produzidos a partir do fluido de ascite por filtração em geral em S-200 e concentrados com NH4SO4. As pelotas são dissolvidas em uma solução de armazenamento apropriada, como glicerol/H20 a 50%, e são armazenadas a 4°C.

Um "anticorpo anti-dPNAG", conforme aqui usado, inclui anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpos, assim como anticorpos monoclonais e policlonais intactos que se liguem a dPNAG e, em alguns casos, também a formas de PNAG que sejam mais de 50% acetiladas. Um "anticorpo monoclonal humanizado", conforme aqui usado, é um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento funcionalmente ativo com pelo menos regiões constantes humanas e uma região de ligação a dPNAG (por exemplo, uma CDR) de um mamífero de uma espécie diferente da humana. Um anticorpo monoclonal anti-dPNAG humanizado intacto em uma forma isolada ou em uma pre- paração farmacêutica é particularmente adequado em alguns aspectos da invenção. Anticorpos humanizados têm uma utilidade clínica particular pelo fato de reconhecerem especificamente dPNAG e, de preferência, também formas de PNAG nativa, mas não provocarem uma resposta imune em seres humanos contra o próprio anticorpo. Em uma modalidade preferida, uma CDR é enxertada na região estrutural de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Veja, por exemplo, L. Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988); M. S. Neuberger et al., Nature 314, 268 (1985) e EPA 0 239 400 (publicada em 30 de setembro de 1987).

Anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados por qualquer um dos processos conhecidos na técnica, como os expostos na patente norte-americana n° 5.567.610, expedida para Borrebaeck et al., patente norte-americana n° 565.354, expedida para Ostberg, patente norte-americana n° 5.571.893, expedida para Baker et al., Kozber, J. Immunol. 133:3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51 - 63 (Marcei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987), e Boerner et al., J. Immunol., 147:86-95 (1991). Além dos processos convencionais para a preparação de anticorpos monoclonais humanos, esses anticorpos também podem ser preparados por imunização de animais transgênicos que sejam capazes de produzir anticorpos humanos (por exemplo, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993), Brug-germann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993) e patente norte-americana n° 5.569.825, expedida para Lonberg).

Os exemplos a seguir de processos para preparação de anticorpos monoclonais humanizados que interajam com dP-NAG e, de preferência, também com outras formas de PNAG nativa são exemplificativos e apresentados apenas para fins ilustrativos. Anticorpos monoclonais humanizados, por exemplo, podem ser construídos por substituição das regiões não CDR de um anticorpo de mamífero não humano por regiões similares de anticorpos humanos, enquanto se retém a especificidade epitópica do anticorpo original. Por exemplo, CDRs não humanas e, opcionalmente, algumas das regiões estruturais podem ser covalentemente unidas a regiões FR e/ou Fc/pFc' . humanas para produzir um anticorpo funcional. Há instituições nos Estados Unidos que sintetizam comercialmente anticorpos humanizados a partir de regiões específicas de anticorpos murídeos, como a Protein Design Labs (Mountain View, Califórnia), Abgenix e Medarex. 0 pedido de patente européia 0239400, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência, apresenta um ensinamento exemplificativo da produção e uso de anticorpos monoclonais humanizados em que pelo menos a parte de CDR de um anticorpo murídeo (ou de outro mamífero não humano) está incluída no anticorpo humanizado. Resumidamente, os processos a seguir são utilizáveis para construir um anticorpo monoclonal de CDR humanizado que inclua pelo menos uma parte de uma CDR de camundongo. Prepara-se um primeiro vetor de expressão replicável que inclua um promotor adequado operacionalmente ligado a uma seqüência de DNA que codifique pelo menos um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve de Ig e o domínio variável que compreende regiões estruturais de um anticorpo humano e uma região de CDR de um anticorpo mu-rídeo. Opcionalmente, prepara-se um segundo vetor de expressão replicável que inclua um promotor adequado operacionalmente ligado a uma seqüência de DNA que codifique pelo menos o domínio variável de uma cadeia leve ou pesada de Ig humana complementar, respectivamente. Uma linhagem celular é, então, transformada com os vetores. De preferência, a linhagem celular é uma linhagem celular de mamífero imortalizada de origem linfóide, como uma linhagem celular de mieloma, hi-bridoma, trioma ou quadroma, ou é uma célula linfóide normal que tenha sido imortalizada por transformação com um vírus. A linhagem celular transformada é, então, cultivada sob condições conhecidas por aqueles versados na técnica para produzir o anticorpo humanizado.

Conforme exposto no pedido de patente européia 0239400, várias técnicas são bem conhecidas na técnica para a criação dos domínios de anticorpo particulares que serão inseridos no vetor replicável. (Vetores preferidos e técicas recombinantes são discutidos em maiores detalhes abaixo.) Por exemplo, a seqüência de DNA que codifica o domínio pode ser preparada por síntese de oligonucleotídeos. Alternativamente, um gene sintético sem as regiões de CDR em que quatro regiões estruturais estejam fusionadas entre si com sítios de restrição adequados nas junções, de modo que cassetes de CDR subclonados sintéticos ou restringidos de fita dupla com extremidades possam ser ligados nas junções das regiões estruturais. Outro processo envolve a preparação da seqüência de DNA que codifica o domínio que contém CDR variável por mutagênese direcionada a sítio de oligonucleotídeo. Todos esses processos são bem conhecidos na técnica. Conseqüente-mente, aqueles versados na técnica podem construir anticorpos humanizados que contenha uma região de CDR murídea sem destruir a especificidade do anticorpo para seu epítopo.

Anticorpos humanos também podem ser obtidos por recuperação de linfócitos produtores de anticorpos do sangue ou outros tecidos de seres humanos que produzam anticorpos contra dPNAG. Esses linfócitos podem ser tratados para produzir células que cresçam por si mesmas no laboratório sob condições de cultura apropriadas. As culturas de células podem ser tríadas quanto à produção de anticorpos contra dPNAG e, então, clonadas. Culturas clonais podem ser usadas por produzir anticorpos monoclonais humanos contra dPNAG, ou os elementos genéticos que codificam as partes variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo podem ser clonados e inseridos em vetores de ácidos nucléicos para produção de anticorpos de diferentes tipos.

Fragmentos de anticorpos de ligação a dPNAG também estão englobados pela invenção. Conforme se sabe na técnica, apenas uma pequena parte de uma molécula de anticorpo, o pa-ratopo, está envolvida na ligação do anticorpo a seu epítopo (veja, em geral, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc do anticorpo, por exemplo, são efetoras da cascata do com- plemento, mas não estão envolvidas na ligação ao antígeno. Um anticorpo do qual a região pFc' tenha sido enzimaticamen-te clivada, ou que tenha sido produzido sem a região pFc', designado como fragmento F(ab')2/ retém ambos os sítios de ligação a antígeno de um anticorpo intacto. Um fragmento F(ab')2 isolado é chamado de fragmento monoclonal bivalente por causa de seus dois sítios de ligação a antígeno. Da mesma forma, um anticorpo do qual a região Fc tenha sido enzi-maticamente clivada, ou que tenha sido produzido sem a região Fc, designado como fragmento Fab, retém um dos sítios de ligação a antígeno de uma molécula de anticorpo intacta. Continuando, os fragmentos Fab consistem em uma cadeia leve de anticorpo covalentemente ligada e uma parte da cadeia pesada de anticorpo designada como Fd (região variável de cadeia pesada). Os fragmentos Fd são o principal determinante da especificidade do anticorpo (um único fragmento Fd pode estar associado a até dez cadeias leves diferentes sem alterar a especificidade do anticorpo), e fragmentos Fd retêm a capacidade de ligação a epítopo ao isolamento.

Os termos Fab, Fc, pFc', F(ab')2 e Fv são empregados com os significados imunológicos padrões [Klein, Immunology (John Wiley, Nova Iorque, NY, 1982) ; Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)]. Fragmentos de anticorpos funcionalmente ativos bem conhecidos incluem, mas não se limitam a, os fragmentos de anticorpos F(ab')2, Fab, Fv e Fd. Esses fragmentos sem o fragmento Fc do anticorpo intacto são depurados mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação a tecido não específico do que um anticorpo intacto (Wahl et al.( J. Nu-cl. Med. 24:316-325 (1983)). Por exemplo, anticorpos de cadeia única podem ser construídos de acordo com os processos descritos na patente norte-americana n° 4.946.778, de Ladner et al. Esses anticorpos de cadeia única incluem as regiões variáveis das cadeias leve e pesada unidas por uma fração de elo flexível. Processos para a obtenção de um anticorpo de domínio único ("Fd") que compreenda um domínio único de cadeia pesada variável isolado também foram relatados (veja, por exemplo, Ward et al., Nature 341:644-646 (1989), que apresenta um processo de triagem para identificar uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (anticorpo de domínio único VH) com afinidade suficiente por seu epítopo alvo para se ligar a ele em forma isolada) . Processos para a preparação de fragmentos Fv recombinantes baseados em sequências conhecidas de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpos são conhecidos na técnica e foram descrito, por exemplo, em Moore et al., patente norte-americana n° 4.462.334. Outras referências que descrevem o uso e a geração de fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, fragmentos Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)), fragmentos Fv (Hochman et al., Biochemistry 12:1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15:1591 (1976); Ehrilch et al., patente norte-americana n° 4.355.023) e partes de moléculas de anticorpos (Audilore-Hargreaves, patente norte-americana n° 4.470.925). Assim, aqueles versados na técnica podem construir fragmentos de anticorpos a partir de várias partes de anticorpos intactos sem destruir a especificidade dos anticorpos para o epítopo dPNAG. Deve-se compreender que o epítopo reconhecido por anticorpos anti-dPNAG também pode estar presente em outras formas de PNAG nativa.

Os fragmentos de anticorpos também englobam "fragmentos de anticorpos humanizados". Como aqueles versados na técnica reconhecerão, esses fragmentos poderíam ser preparados por divagem enzimática tradicional de anticorpos humanizados intactos. Se, entretanto, anticorpos intactos não forem suscetíveis a essa divagem, por causa da natureza da construção envolvida, as construções indicadas podem ser preparadas com fragmentos de imunoglobulinas usados como os materiais de partida ou, se forem usadas técnicas recombi-nantes, as próprias sequências de DNA podem ser ajustadas para codificar o "fragmento" desejado que, quando expressado, possa ser combinado in vivo ou in vitro, por meios químicos ou biológicos, para preparar o fragmento de imunoglo-bulina intacto desejado final.

Outros agentes de ligação a dPNAG com especificidade de ligação a dPNAG podem ser usados nos processos de diagnótico da invenção. Vários ensaios rotineiros podem ser usados para identificar facilmente peptídios de ligação a dPNAG. Ensaios de triagem para identificar peptídios da invenção são realizados, por exemplo, com procedimentos de exposição de fagos, como os descritos em Hart, et al., J. Biol. Chem. 269:12468 (1994). Hart et al. relatam uma biblio- teca de exposição de fagos filamentosos para identificação de novos ligantes peptídicos para receptores de células de mamíferos. Em geral, bibliotecas de exposição de fagos que usam, por exemplo, fago M13 ou fd são preparadas mediante procedimentos convencionais, como os descritos na referência precedente. As bibliotecas expõe enxertos contendo de 4 a 80 resíduos de aminoácidos. O enxertos representam opcionalmente um arranjo completamente degenerado ou tendencioso de peptídios. Ligantes que se ligam seletivamente a dPNAG são obtidos por seleção de fagos que expressam em sua superfície um ligante que se liga a dPNAG. Esses fagos são, então, submetidos a vários ciclos de resseleção para identificar o fago que expressa o ligante peptídico que tenha as características de ligação mais úteis. Tipicamente, fagos que exibem as melhores características de ligação (por exemplo, maior afinidade) são adicionalmente caracterizados por análise de ácidos nucléicos para identificar as seqüências de aminoácidos particulares dos peptídios expressados na superfície do fago e o comprimento ótimo do peptídio expressado para se conseguir a ligação ótima à dPNAG.

Alternativamente, esses ligantes peptídicos podem ser selecionados em bibliotecas combinatoriais de peptídios que contenham um ou mais aminoácidos. Também se podem sintetizar bibliotecas que contenham frações sintéticas não pep-tídicas que sejam menos sujeitas à degradação enzimática, em comparação com suas contrapartes de ocorrência natural.

Para determinar se um peptídio se liga a dPNAG, pode-se empregar qualquer ensaio de ligação conhecido. Por exemplo, o peptídio pode ser imobilizado em uma superfície e, então, contactado com uma dPNAG marcada. A quantidade de dPNAG que interage com o peptídio ou a quantidade que não se liga ao peptídio pode ser, então, quantificada para determinar se o peptídio se liga a dPNAG. Uma superfície com um anticorpo anti-dPNAG imobilizado a ela pode servir de controle positivo. Ensaios de ligação também podem determinar o grau emq eu um suposto anticorpo específico para dPNAG seliga a outras formas nativas de PNAG.

As composições da invenção são utilizáveis para muitas finalidades in vivo e in vitro. Por exemplo, as composições da invenção são utilizáveis para produzir uma resposta de anticorpo, por exemplo, como uma vacina para imunização ativa de seres humanos e animais, para prevenir infecção estafilocócica e infecções causadas por outras espécies de bactérias que produzem PNAG; como uma vacina para imunização de seres humanos ou animais para produzir anticorpos anti-dPNAG que possam ser administrados a outros seres humanos ou animais, para prevenir ou tratar infecções estafilo-cócicas; como um antígeno para a triagem de agentes biológicos como anticorpos monoclonais capazes de prevenir infecções estafilocócicas, bibliotecas de genes envolvidos na preparação de anticorpos, ou miméticos peptídicos; como um reagente de diagnóstico para infecções estafilocócicas e infecções causadas por outras espécies de bactérias que produzam PNAG; e como um reagente de diagnóstico para determinar o estado imunológico de seres humanos ou animais com relação a sua suscetibilidade a infecções estafilocócicas e infecções causadas por outras espécies de bactérias que produzem PNAG. dPNAG pode ser usada para proteger um indivíduo contra infecções por bactérias que produzem PNAG por indução de imunidade ativa a infecções por estafilococos em um indivíduo. 0 processo é realizado por administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune, como uma resposta de anticorpos contra estafilococos, de qualquer uma das composições de dPNAG da invenção. "Imunidade ativa", conforme aqui usado, envolve a introdução de um antígeno em um indivíduo, de modo que o antígeno cause a diferenciação de algumas células linfóides em células que produzam anticorpos e, em certos casos, outras células linfóides em células de memória. As células de memória não secre-tam anticorpos, mas, ao invés, incorporam os anticorpos em sua membrana para sentir o antígeno se for novamente administrado ao corpo. 0 processo é utilizável para induzir imunidade a infecções por estafilococos. "Estafilococos", conforme aqui usado, refere-se a todas as espécies bacterianas estafilocó-cicas que expressam a PNAG. Embora não desejando ficar limitado a qualquer mecanismo particular, acredita-se que as formas altamente acetilads de PNAG (isto é, > 50% acetila-das) não são capazes de provocar a produção de anticorpos opsônicos protetores na mesma medida que dPNAG. Bactérias que são classificadas como estafilococos são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritas na literatura de microbiologia. Estafilococos que expressam PNAG incluem, mas não se limitam a, Staphylococcus epidermidis (inclu- indo RP62A (ATCC número 35984), RP12 (ATCC número 35983) e M187), Staphylococcus aureus (incluindo RN4220 (pCN27) e MN8 mucóide) e cepas como Staphylococcus carnosus transformadas com os genes no locus ica (incluindo TM300 (pCN27)). Outras cepas bacterianas que expressam PNAG podem ser facilmente identificadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, bactérias estafilocócicas que expressam o locus ica expressam PNAG. Aqueles versados na técnica podem triar facilmente a expressão de mRNA ou proteína relacionada ao locus ica, pois a seqüência de ácidos nucléicos do locus ica é conhecida (SEQ ID NO: 1 e originalmente descrita em Heilmann, C., O. Schweitzer, C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack e F. Gotz (1996) Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Molec. Microbiol. 20:1083.) Cepas bacterianas que expressam PNAG também podem ser identificadas por microscopia imunoeletrônica (ou outro imunoensaio) com anticorpos anti-PNAG ou anticorpos anti-dPNAG para detectar a presença de PNAG na superfície das bactérias. Além disso, a cápsula de cepas bacterianas pode ser isolada e analisada mediante cromatografia líquida e es-pectroscopia de massa.

Um "indivíduo", conforme aqui usado, é um mamífero de sangue quente e inclui, por exemplo, seres humanos, pri-matas, cavalos, vacas, suínos, cabras, ovelhas, cães e gatos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo não roedor. Um indivíduo não roedor é qualquer indivíduo conforme acima definido, mas excluindo especificamente roedores como camundongos, ratos e coelhos. Em algumas modalidades, o indivíduo preferido é um ser humano. dPNAG pode ser administrada a qualquer indivíduo capaz de induzir uma resposta imune, como uma resposta de anticorpos a um antígeno. 0 antígeno é particularmente adequado para induzir imunização ativa contra infecção sistêmica causada por estafilococos em um indivíduo capaz de produzir uma resposta imune e com risco de desenvolver infecção estafilocócica. Um indivíduo capaz de produzir uma resposta imune e com risco de desenvolver uma infecção estafilocócica é um mamífero que possua um sistema imune que esteja com risco de ser exposto a estafilococos ambientais. Por exemplo, pacientes hospitalizados estão em risco de desenvolver infecção estafilocócica como resultado da exposição a bactérias no ambiente hospitalar. Populações com alto risco em particular de desenvolver infecção por S. aureus incluem, por exemplo, pacientes de doença renal em diálise e indivíduos que sofreram cirurgia de alto risco. Populações com alto risco de desenvolver infecção por S. epidermidis também incluem, por exemplo, pacientes com dispositivos médicos implantados, como linhas intravenosas (por exemplo, linhas centrais) ou próteses (por exemplo, próteses de substituição de quadril ou joelho), porque isolados clínicos freqüente-mente são altamente aderentes a superfícies plásticas, devido a seu material extracelular (chamado de biopelícula ou lodo). Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que tenha recebido um implante de dispositivo médico e, em outras modalidades, o indivíduo é um que não tenha recebido um implante de dispositivo médico, mas que possa estar agen- dado para receber um. Indivíduos com alto risco de desenvolver infecção por S. epidermidis também incluem, por exemplo, neonatos pré-termo e pacientes submetidos a quimioterapia. dPNAG pode ser administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta de anticorpos. Uma "quantidade eficaz para induzir uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de anticorpos)", conforme aqui usado, é uma quantidade de dPNAG que seja suficiente para (i) auxiliar o indivíduo a produzir sua própria proteção imune, por exemplo, por indução da produção de anticorpos anti-dPNAG no indivíduo (que possam reconhecer tanto dPNAG, quanto formas altamente acetiladas de PNAG), indução da produção de células de memória e possivelmente uma reação de linfócitos ci-totóxicos e outras e/ou (ii) prevenir que a infecção por es-tafilococos ocorra em um indivíduo que seja exposto a esta-filococos.

Em algumas modalidades preferidas, a quantidade eficaz de uma vacina de dPNAG para estimular uma resposta imune é uma quantidade de vacina de dPNAG que seja capaz de provocar a produção de anticorpos que reajam de maneira cruzada com pelo menos duas espécies de estafilococos, por exemplo, S. aureus e S. epidermidis.

Aqueles versados na técnica podem avaliar se uma quantidade de dPNAG é suficiente para induzir imunidade ativa por processos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, a capacidade de um antígeno específico de produzir anticorpos em um mamífero pode ser avaliada por triagem de anticorpos em um camundongo ou outro indivíduo com o antígeno dPNAG.

Os anticorpos anti-dPNAG da invenção são utilizáveis para induzir imunização passiva em um indivíduo por prevenção do desenvolvimento de infecção sistêmica nos indivíduos com risco de exposição a agentes infecciosos. 0 processo para induzir imunidade passiva a infecção por estafi-lococos, como Staphylococcus aureus, é realizado por administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-dPNAG para induzir uma resposta imune a estafi-lococos, por exemplo, que cause opsonização dos estafiloco-cos, como Staphylococcus aureus. "Imunidade passiva", conforme aqui usado, envolve a administração de anticorpos a um indivíduo, em que os anticorpos são produzidos em um indivíduo diferente (inclusive indivíduos da mesma ou de diferentes espécies), de modo que os anticorpos se fixem à superfície das bactéries e façam com que as bactérias sejam fagoci-tadas. 0 anticorpo anti-dPNAG pode ser administrado a qualquer indivíduo com risco de desenvolver uma infecção es-tafilocócica para induzir imunidade passiva e, em algumas modalidades, pode ser particularmente adequado para indivíduos incapazes de induzir imunidade ativa contra dPNAG. Como a vacinação com dPNAG pode não ser completamente eficaz em indivíduos imunocomprometidos de alto risco, esses indivíduos se beneficiarão do tratamento com preparações de anticorpos gerados contra estafilococos, como Staphylococcus aureus. Um indivíduo que seja incapaz de induzir uma resposta imune é um indivíduo imunocomprometido (por exemplo, um pa- ciente submetido a quimioterapia, paciente de AIDS e outros) ou um indivíduo que ainda não tenha desenvolvido um sistema imune (por exemplo, neonato pré-termo). 0 anticorpo anti-dPNAG pode ser administrado a um indivíduo com risco de desenvolver uma infecção estafilocó-cica para prevenir que o agente infeccioso se multiplique no corpo ou para matar o agente infeccioso. 0 anticorpo anti-dPNAG também pode ser administrado a um indivíduo que já tenha uma infecção causada por estafilococos para prevenir que o agente infeccioso se multiplique no corpo ou para matar o agente infeccioso. 0 anticorpo anti-dPNAG da invenção é administrado ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune a estafilococos, como Staphylococcus aureus. Uma "quantidade eficaz para induzir uma resposta imune a estafi-lococos", conforme aqui usado, é uma quantidade de anticorpo anti-dPNAG que seja suficiente para (i) prevenir que a infecção por estafilococos ocorra em um indivíduo que seja exposto a estafilococos; (ii) inibir o desenvolvimento de infecção, isto é, parar ou retardar seu desenvolvimento; e/ou (iii) aliviar a infecção, isto é, erradicação das bactérias em indivíduos infectados.

Com o uso de procedimentos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica, pode-se determinar se uma quantidade de anticorpo anti-dPNAG é uma "quantidade eficaz para induzir uma resposta imune a estafilococos" em um ensaio de opsonização in vitro que seja preditivo do grau de opsonização de um anticorpo. Um anticorpo que opsonize uma bactéria estafilocócica é um que, quando adicionado a uma amostra de bactérias estafilocócicas, cause a fagocitose das bactérias. Um ensaio de opsonização pode ser um ensaio colo-rimétrico, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de captação fluorescente ou de radiomarcador, um ensaio bactericida mediado por células ou outro ensaio que meça o potencial op-sônico de ummaterial. 0 ensaio de opsonização a seguir pode ser usado para determinar uma quantidade eficaz de anticorpo anti-dPNAG. Anticorpo anti-dPNAG é incubado com uma bactéria estafilocócica e uma célula fagocítica eucariótica e opcionalmente proteínas do complemento. A capacidade opsônica do anticorpo anti-PNAG é determinada com base na quantidade de estafilococos que permanecem após a incubação. Isso pode ser realizado por comparação do número de estafilococos sobreviventes entre dois ensaios similares, apenas um dos quais inclui imunoglobulina opsonizante. Uma redução no número de estafilococos, em comparação com a incubação com imunoglobulina não específica de controle, indica opsonização.

Os processos da invenção também são utilizáveis para induzir imunização passiva a estafilococos em um indivíduo por administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz para induzir opsonização de estafilococos de um anticorpo anti-dPNAGpUra. Um anticorpo anti-dPNAGpura, conforme aqui usado, é um anticorpo que interaja especificamente com um antígeno dPNAG puro da invenção e induza a opsonização de estafilococos coagulase-negativos ou coagulase-positivos, mas que não interaja com uma preparação impura de dPNAG. Conforme discutido acima, preparações de dPNAG impuras podem estar contaminadas com ácido teicóico ou outras impurezas que possam interferir com a imunogenicidade do antígeno. Aqueles versados na técnica podem identificar facilmente se um anticorpo anti-dPNAG é um anticorpo anti-dPNAGpura mediante ensaios de ligação rotineiros. Por exemplo, um anticorpo anti-dPNAG pode ser imobilizado em uma superfície e, então, contactado com uma preparação de dPNAG impura marcada ou uma preparação de dPNAG pura marcada. A quantidade de preparação de dPNAG (preparação pura versus impura) que interage com o anticorpo ou a quantidade que não se liga ao anticorpo pode ser, então, quantificada para determinar se o anticorpo se liga a uma preparação de dPNAG impura. Em importantes modalidades, o anticorpo anti-dPNAGpura é eficaz contra estafilo-cocos coagulase-negativos e coagulase-positivos ou contra qualquer organismo microbiano apropriado que expresse dPNAG ou PNAG altamente acetilada em sua superfície. 0 antígeno dPNAG pode ser formulado como uma vacina. Um meio de veículo adequado para formular uma vacina inclui salina tamponada com fosfato de sódio (pH 7,4) ou gel de fosfato de alumínio a 0,125 M em suspensão em salina tamponada com fosfato de sódio a pH 6 e outros meios convencionais. Genericamente, as vacinas contêm de cerca de 5 a cerca de 100 pg e, de preferência, cerca de 10 - 50 pg do antígeno para gerar níveis eficazes de anticorpo em mamíferos de sangue quente. Quando administrada como uma vacina, a dPNAG pode incluir opcionalmente um adjuvante. O termo "adjuvante" pretende incluir qualquer substância que seja incorporada na ou administrada simulta- neamente com a dPNAG, que potencialize a resposta imune no indivíduo. Adjuvantes incluem, mas não se limitam a, compostos de alumínio, por exemplo, géis, hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, e adjuvante completo ou incompleto de Freund (por exemplo, em que o antígeno dPNAG seja incorporado na fase aquosa de uma água estabilizada em emulsão de óleo de parafina) . 0 óleo de parafina pode ser substituído por diferentes tipos de óleos, por exemplo, escaleno ou óleo de amendoim. Outros materiais com propriedades adjuvantes incluem BCG (Mycobacterium tuberculosis atenuado), fosfato de cálcio, levamisol, isoprinosina, poliânions (por exemplo poli A:U), lentinano, toxina pertussis, lipídio A, saponi-nas, QS-21 e peptídios, por exemplo, muramil dipeptídio. Sais de terras raras, por exemplo, lantânio e cério, também podem ser usados como adjuvantes. A quantidade de adjuvante depende do indivíduo e do antígeno dPNAG particular usado (por exemplo, o nível de substituição de acetato) e pode ser prontamente determinado por aqueles versados na técnica, sem experimentação excessiva.

Em geral, quando administradas para fins terapêuticos, as formulações da invenção são aplicadas em soluções farmaceuticamente aceitáveis. Essas preparações podem rotineiramente conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes de tamponamento, preservativos, veículos compatíveis, adjuvantes e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos.

As composições da invenção podem ser administradas per se (puras) ou na forma de um sal farmaceuticamente acei- tável. Quando usados em medicina, os sais devem ser farma-ceuticamente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente usados para preparar seus sais farmaceuticamente aceitáveis e não estão excluídos do âmbito da invenção. Esses sais farmacológica e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromí-drico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maléico, acético, sa-licílico, p-tolueno sulfônico, tartárico, cítrico, metano sulfônico, fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônico e benzeno sulfônico. Da mesma forma, podem-se preparar sais farmaceuticamente aceitáveis como sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo do ácido carboxílico.

Agentes de tamponamento adequados incluem: ácido acético e um sal (1 - 2% p/v) ,· ácido cítrico e um sal (1 -3% p/v); ácido bórico e um sal (0,5 - 2,5% p/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8 - 2% p/v). Preservativos adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003 - 0,03% p/v); clorobu-tanol (0,3 - 0,9% p/v); parabéns (0,01 - 0,25% p/v) e time-rosal (0,004 - 0,02% p/v). A presente invenção apresenta composições farmacêuticas, para uso médico, que compreendam dPNAG juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos. 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme aqui usado, e descrito mais detalhadamente abaixo, significa uma ou mais substâncias de carga, diluentes ou de encapsulação sólidas ou líquidas compatíveis, que sejam adequadas para administração a um ser humano ou outro animal. Na presente invenção, o termo "veículo" designa um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente ativo seja combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também podem ser misturados com dPNAG e entre si, de modo que não haja interação que prejudique substancialmente a eficiência farmacêutica desejada.

Composições adequadas para administração parenteral compreendem convenientemente uma preparação aquosa estéril do polissacarídeo, que pode ser isotônica com o sangue do receptor. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para essa finalidade, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, inclusive mono ou diglicerí-deos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, como ácido oléi-co, encontram uso na preparação de injetáveis. Formulações de veículo adequadas para administração subcutânea, intra-muscular, intraperitoneal, intravenosa e outras podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA·.

As preparações da invenção são administradas em quantidades eficazes, Uma quantidade eficaz, conforme acima discutido, é a quantidade de dPNAG ou anticorpo anti-dPNAG que, isoladamente ou com doses adicionais, induza imunidade ativa ou opsonização das bactérias infecciosas, respectivamente. Acredita-se que doses que variem de 1 nanogra-ma/quilograma a 100 miligramas/quilograma, dependendo do modo de administração, sejam eficazes. Acredita-se que a faixa preferida esteja entre 500 nanogramas e 500 microgra-mas/quilograma e, mais preferivelmente, entre 1 micrograma e 100 microgramas/quilograma. A quantidade absoluta dependerá de vários fatores, que incluem se a administração é realizada em um indivíduo de alto risco ainda não infectado com as bactérias ou em um indivíduo já com uma infecção, o tratamento concomitante, o número de doses e os parâmetros individuais do paciente, como idade, condição física, tamanho e peso. Esses são fatores bem conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser avaliados com experimentação de rotina. Prefere-se, em geral, que a dose máxima seja usada, isto é, a dose segura mais alta, de acordo com um julgamento médico ponderado.

Consideram-se doses múltiplas das composições farmacêuticas da invenção. Genericamente, os esquemas de imunização envolvem a administração de uma alta dose de um antí-geno, seguida por doses menores subseqüentes do antígeno, após um período de espera de várias semanas. Doses adicionais também podem ser administradas. O cronograma de dosagem para imunização passiva seria bem diferente, com administração mais freqüente, caso necessário. Qualquer regime que resulte em uma resposta imune intensificada contra infecção bacteriana e/ou subseqüente proteção contra infecção pode ser usado. Intervalos de tempo desejados para aplicação de múltiplas doses de uma dPNAG particular podem ser determinados por aqueles versados na técnica mediante emprego de experimentação de rotina. Várias vias de administração está disponíveis. 0 modo particular selecionado dependerá, evidentemente, da dPNAG particular selecionada, do estado particular que será tratado e da dosagem requerida para eficácia terapêutica. Os processos desta invenção podem ser genericamente praticados com qualquer modo de administração que seja medicamento aceitável, o que significa qualquer modo que produza níveis eficazes de uma resposta imune sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Modos de administração preferidos são as vias parenterais. 0 termo "parenteral" inclui injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e intraesternal ou técnicas de infusão. Outras vias incluem, mas não se limitam a, oral, nasal, dérmica, sublingual e local.

As composições podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos processos conhecidos na técnica de farmácia. Todos os processos incluem a etapa de colocação da dPNAG ou de um agente de ligação a dPNAG em associação com um veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas por colocação do polímero em associação uniforme e íntima com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e, então, caso necessário, modelagem do produto. 0 polímero pode ser armazenado liofilizado.

Outros sistemas de distribuição podem incluir sis- temas de distribuição de liberação no tempo, liberação retardada ou liberação prolongada. Esses sistemas podem evitar administrações repetidas dos polissacarídeos da invenção, o que aumenta a conveniência para o indivíduo e o médico. Muitos tipos de sistemas de distribuição por liberação estão disponíveis e são conhecidos por aqueles versados na técnica. Incluem sistemas à base de polímeros, como ácido polilá-tico e poliglicólico, polianidridos e policaprolactona; sistemas não poliméricos que sejam lipídicos, incluindo este-róis, como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras, como mono-, di- e triglicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas à base de peptídios; revestimentos de cera, comprimidos com aglutinantes e excipientes convencionais, implantes parcialmente fundidos e outros. Exemplos específicos incluem, mas não se llimitam a: (a) sistemas erosionais, em que o po-lissacarídeo está contido em uma forma dentro de uma matriz, encontrados nas patentes norte-americanas n° 4.452.775 (Kent), 4.667.014 (Nestor et al.) e 4.748.034 e 5.239.660 (Leonard); e (b) sistemas difusionais, em que um componente ativo permeie a uma taxa controlada através de um polímero, encontrados nas patentes norte-americanas n° 3.832.253 (Hi-guchi et al.) e 3.854.480 (Zaffaroni). Além disso, pode-se usar um sistema de distribuição mecânico à base de bomba, alguns dos quais estão adaptados para implantação.

Aqueles versados na técnica também perceberão que os antígenos PNAG da presente invenção podem ter propriedades adjuvantes por si mesmos. Na medida em que os polissaca- rídeos aqui descritos potencializem respostas imunes humanas, podem-se ser usados como adjuvantes em combinação com outros materiais.

Os antígenos dPNAG e anticorpos anti-dPNAG da invenção podem ser distribuídos juntamente com outro medicamento antibacteriano (isto é, bactericida) ou na forma de coquetéis antibacterianos ou com outros antígenos bacteria-nos ou anticorpos antibacterianos. Um coquetel antibiótico antibacteriano é uma mistura de qualquer das composições da invenção com um medicamento antibacteriano. 0 uso de antibióticos no tratamento de infecção bacteriana é rotineiro. 0 uso de antígenos para induzir imunização ativa e de anticorpos para induzir imunização passiva também é rotineiro. Nesta modalidade, um veículo de administração comum (por exemplo, comprimido, implante, solução injetável e outros) podería conter tanto a composição utilizável nesta invenção, quanto o medicamento antibiótico antibacteriano e/ou antíge-no ou anticorpo. Alternativamente, o medicamento antibiótico antibacteriano e/ou antígeno ou anticorpo pode ser separadamente dosado. 0 agente antibacteriano (por exemplo, um antibiótico) também pode ser conjugado a dPNAG ou a um anticorpo anti-dPNAG.

Medicamentos antibióticos antibacterianos são bem conhecidos e incluem: penicilina G, penicilina V, ampicili-na, amoxicilina, bacampicilina, ciclacilina, epicilina, he-tacilina, pivampicilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, carbenicilina, ticarcilina, avlocilina, mezlocilina, piperacilina, amdino- cilina, cefalexina, cefradina, cefadoxil, cefaclor, cefazo-lina, cefuroxima axetil, cefamandol, cefonicida, cefoxitina, cefotaxima, ceftizoxima, cefmenoxima, ceftriaxona, moxalac-tamo, cefotetano, cefoperazona, ceftazidma, imipenem, clavu-lanato, timentina, sulbactamo, neomicina, eritromicina, me-tronidazol, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, vanco-micina, trimetropim-sulfametoxazol, aminoglicosídeos, quino-lonas, tetraciclinas e rifampicina. (Veja Goodman e Gilman, Pharmacological Basics of Therapeutics, 8a ed., 1993, McGraw Hill Inc.) Outros antígenos polissacarídicos e anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, os seguintes antígenos polissacarídicos e/ou anticorpos contra eles podem ser administrados juntamente com o antígeno dPNAG e/ou anticorpo: antígeno Vi de cápsula de Salmonella typhi (Szu, S. C., X. Li, A. L. Stone e J. B. Robbins, Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysacchari-de, Infection and Immunity. 59:4555-4561 (1991)); cápsula K5 de E. coli (Vann, W., Μ. A. Schmidt, B. Jann e K. Jann, The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary tract infective Escherichia coli, 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin, European Journal of Biochemistry. 116:359-364, (1981)); cápsula tipo 5 de Staphylococcus aureus (Fournier, J.-M., K. Hannon, M. Moreau, W. W. Karakawa e W. F. Vann, Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus, Ann. Inst. Pas-teur/Microbiol. (Paris) 138:561-567 (1987)); exopolissa-carídeo II de Rhizobium melilori (Glazebrook, J. e G. C.

Walker, A novel expolysaccharide can function in place of the calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhízobium meliloti, Cell 65:661-672 (1989)); estreptococos do Grupo B tipo III (Wessels, M. R., V. Pozs-gay, D. L. Kasper e H. J. Jennings, Structure and immuno-chemistry of an oligosaccharide repeating units of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus, Journal of Biological Chemistry, 262:8262-8267 (1987)); cadeia colateral O-específica Fisher 7 de Pseudomonas aeruginosa (Knirel, Y. A., N. A. Paramonov, E. V. Vinogra-dov, A. S. Shashkow, B. A. N. K. Kochetokov, E. S. Stanislavsky e E. V. Kholodkova, Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa. The structure of O-specific polysaccharide chains of lipopolysaccharide of P. aeruginosa 03 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher immunotypes 3 and 7, European Journal of Biochemistry, 167:549 (1987)); cadeia colateral O-específica de Shigella sonnei (Kenne, L., B. Lindberg e K. Petersson, Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide, Carbohydrate Research, 78:119-126 (1980)); cápsula de S. pneumoniae tipo I (Lindberg, B., Lindqvist, B., Lonngren, J., Powell, D. A., Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 1, Carbohydrate Research, 78:111-117 (1980)); e antígeno de grupo de Streptococcus pneumoniae (Jennings, H. J., C. Lugowski e N. M. Young, Structure of the complex polysaccharide C-substance from Streptococcus pneumoniae type 1, Biochemistry, 19:4712-4719 (1980)) .

Outros antígenos não polipeptídicos e anticorpos contra eles são conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser usados juntamente com as composições de dPNAG da invenção.

Os antígenos dPNAG e anticorpos também são utilizáveis em ensaios diagnósticos para determinar o estado imu-nológico de um indivíduo ou de uma amostra, ou podem ser usados como reagentes em imunoensaios. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença em uma amostra de uma bactéria com PNAG na superfície. Se a bactéria estiver presente na amostra, então, os anticorpos podem ser usados para tratar o indivíduo infectado. Os anticorpos também podem ser usados para a triagem de bactérias quanto à presença de antígeno PNAG e o isolamento de antígeno dPNAG ou PNAG e bactérias que contenham antígeno dPNAG ou PNAG de misturas complexas.

Os ensaios acima descritos e qualquer outros ensaio conhecido na técnica pode ser realizado por marcação da dPNAG ou dos anticorpos e/ou imobilização da dPNAG ou dos anticorpos em uma matriz insolúvel. Os processos analíticos e diagnósticos para uso de dPNAG e/ou seus anticorpos usam pelo menos um dos seguintes reagentes: análogo de analito marcado, análogo de analito imobilizado, parceiro de ligação marcado, parceiro de ligação imobilizado e conjugados esté-ricos. 0 marcador usado pode ser qualquer funcionalidade de-tectável que não interfira com a ligação do analito e seu parceiro de ligação. Inúmeros marcadores são conhecidos para uso em imunoensaios. Por exemplo, compostos que possam ser detectados diretamente, como marcadores fluorocrômicos, qui-mioluminescentes e radioativos, assim como compostos que possam ser detectados mediante reação ou derivação, como enzimas. Exemplos desses tipos de marcadores incluem radioisó-topos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos, como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luciferases, como lu-ciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (patente norte-americana n° 4.737.456), luciferina, 2,3-diidroftalavinedionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases, como glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Oxidases heterocíclicas, como uri-case e xantina oxidase, acopladas a uma enzima que use peró-xido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriófagos e radicais livres estáveis.

Os marcadores podem ser conjugados a dPNAG ou a anticorpo anti-dPNAG por processos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, as patentes norte-americanas n° 3.940.475 e 3.645.090 demonstram a conjugação de fluoróforos e enzimas a anticorpos. Outros ensaios apresentados como comumente usados com antígeno e anticorpo e que podem ser usados de acordo com a invenção incluem ensaios de competição e de sanduíche. A invenção inclui um processo de preparação de antígeno dPNAG por produção de uma célula hospedeira que ex- presse PNAG, por introdução de um locus ica na célula, isolamento de antígeno PNAG dessa célula e desacetilação do an-tígeno para formar dPNAG. Uma célula hospedeira PNAG pode ser preparada por transfecção, transdução ou transformação de uma célula com o ácido nucléico que codifique o gene ica (SEQ ID NO: 1). A célula pode ser uma célula eucariótica ou procariótica, mas é, de preferência, uma célula bacteriana. A célula pode ser um estafilococo que não expresse natural-mente PNAG. O ácido nucléico ica, em uma modalidade, é operacionalmente ligado a uma seqüência de expressão de gene que dirija a expressão do ácido nucléico ica dentro de uma célula eucariótica ou procariótica. A "seqüência de expressão de gene" é qualquer seqüência nucleotídica reguladora, como uma seqüência promotora ou uma combinação promotor-intensificador, que facilite a transcrição e tradução eficiente do ácido nucléico ica ao qual está operacionalmente ligada. A seqüência de expressão de gene pode ser, por exemplo, um promotor de mamífero ou viral, como um promotor constitutivo ou induzível. Promotores constitutivos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforribosil transferase (HPTR), adenosina desaminase, piruvato quinase e /3-actina. Promotores virais exemplificativos que funcionam constitutivamente em células incluem, por exemplo, promotores do vírus símio, vírus de papiloma, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma Rous, citomegalovírus, as repetições terminais longas (LTR) do vírus da leucemia Moloney e outros retrovírus, e o promotor de timidina quinase do vírus da herpes simples. Outros promotores constitutivos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os promotores utilizáveis como seqüências de expressão de gene da invenção também incluem promotores induzíveis. Promotores induzíveis são expressados na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor de metalotioneína é induzido para promover a transcrição e tradução na presença de certos íons metálicos. Outros promotores induzíveis são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Em geral, a sequência de expressão de gene deve incluir, quando necessário, seqüências não transcritas 5' e não traduzidas 5' envolvidas no início de transcrição e tradução, respectivamente. Essas seqüências não transcritas 5' incluem uma região promotora que inclui uma seqüência promotora para controle transcricional do ácido nucléico ica operacionalmente ligado. As seqüências de expressão de gene incluem opcionalmente seqüências intensificadoras ou seqüências ativadoras a montante, conforme desejado. A seqüência de ácido nucléico ica e a seqüência de expressão de gene são ditas "operacionalmente ligadas" quando estão covalentemente ligadas, de modo a colocar a transcrição e/ou tradução da seqüência codificadora de ica sob a influência ou controle da seqüência de expressão de gene. Se for desejável que a seqüência de ica seja traduzida em uma proteína funcional, duas seqüências de DNA são ditas operacionalmente ligadas se a indução de um promotor da seqüência de expressão de gene 5' resultar na transcrição da seqüência ica, e se a natureza da ligação entre as duas seqüências de DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação de deslocamento de armação, (2) interferir com a capacidade da região promotora de dirigir a transcrição da sequência de ica, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de RNA correspondente de ser traduzido em uma proteína. Assim, uma se-qüência de expressão de gene estaria operacionalmente ligada a uma seqüência de ácido nucléico ica de modo que o transcrito resultante pudesse ser traduzido na proteína ou poli-peptídio desejado. 0 ácido nucléico ica da invenção pode ser distribuído â célula hospedeira isoladamente ou em associação com um vetor. No sentido mais amplo, um "vetor" é qualquer veículo capaz de facilitar: (1) a distribuição de uma molécula de ácido nucléico que contenha os genes no locus ica que codificam proteínas envolvidas na síntese de PNAG, ou (2) a captação de uma molécula de ácido nucléico que contenha os genes no locus ica que codifiquem proteínas envolvidas na síntese de PNAG por uma célula alvo. De preferência, os vetores transportam a molécula ica para dentro da célula alvo com reduzida degradação com relação ao grau de degradação que resultaria na ausência do vetor. Em geral, os vetores utilizáveis na invenção são divididos em duas classes: vetores biológicos e vetores químicos/físicos. Vetores biológicos são utilizáveis para distribuição/captação de ácidos nu-cléicos ica a/por uma célula alvo. Vetores químicos/físicos são utilizáveis para distribuição/captação de ácidos nucléi-cos ica ou polipeptídios ica a/por uma célula alvo.

Vetores biológicos incluem, mas não se limitam a, plasmídios, fagemídios, vírus, outros veículos derivados de fontes virais ou bacterianas que tenham sido manipulados pela inserção ou incorporação das seqüências de ácidos nucléi-cos da invenção, e fragmentos de ácidos nucléicos livres que possam ser fixados às seqüências de ácidos nucléicos da invenção. Vetores virais são um tipo preferido de vetor biológico e incluem, mas não se limitam a, seqüências de ácidos nucléicos dos seguintes vírus: retrovírus, como vírus da leucemia murídea de Moloney; vírus do sarcoma murídeo de Harvey; vírus de tumor mamário murídeo; vírus de sarcoma de Rous; adenovírus; vírus adeno-associados; vírus do tipo SV40; vírus de polioma; vírus Epstein-Barr; vírus de papilo-ma; vírus da herpes; vírus da varíola; vírus da pólio; e RNA vírus, como qualquer retrovírus. Podem-se empregar prontamente outros vetores não nomeados, mas conhecidos na técnica.

Vetores virais preferidos se baseiam em vírus eu-carióticos não citopáticos, em que genes não essenciais tenham sido substituídos pelo gene de interesse. Vírus não citopáticos incluem retrovírus, cujo ciclo de vida envolve a transcrição reversa de RNA viral genômico em DNA com subse-qüente integração pró-viral no DNA da célula hospedeira. Em geral, os retrovírus são deficientes em replicação (isto é, capazes de dirigir a síntese das proteínas desejadas, mas incapazes de fabricar uma partícula infecciosa). Protocolos padronizados para a produção de retrovírus deficientes em replicação (incluindo as etapas de incorporação de material genético exógeno em um plasmídio, transfecção de uma linha- gem celular acondicionadora com o plasmídio, produção de re-trovírus recombinantes pela linhagem celular acondicionadora, coleta de partículas virais do meio de cultura de tecido e infecção das células alvo com partículas virais) são apresentados em Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", W. H. Freeman Co., Nova Iorque (1990) e Murry, E. J., ed., "Methods in Molecular Biology", vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, Nova Jérsei (1991).

Outro vírus preferido para certas aplicações é o vírus adeno-associado, um vírus de DNA de fita dupla. O vírus adeno-associado pode ser manipulado para ser deficiente em replicação e é capaz de infectar uma ampla gama de tipos e espécies celulares. Também tem vantagens como a estabilidade ao calor e a solvente de lipídios, elevadas freqüências de transdução em células de diversas linhagens; e falta de inibição da superinfecção, o que permite, portanto, múltiplas séries de transduções. Relatadamente, o vírus adeno-associado pode se integrar ao DNA celular humano de maneira específica a sítio, o que minimiza, dessa forma, a possibilidade de mutagênese de inserção e a variabilidade da expressão do gene inserido. Além disso, infecções por vírus adeno-associados de tipo selvagem foram acompanhadas em cultura de tecido por pelo menos 100 passagens na ausência de pressão seletiva, o que implica que a integração genõmica do vírus adeno-associado é um evento relativamente estável. O vírus adeno-associado também pode funcionar de maneira ex-tracromossômica.

Além dos vetores biológicos, vetores quími- cos/físicos podem ser usados para distribuir uma molécula ica a uma célula alvo e para facilitar a captação. Conforme aqui usado, um "vetor químico/físico" refere-se a uma molécula natural ou sintética, diferente daquelas derivadas de fontes bacteriológicas ou virais, capaz de distribuir a molécula ica a uma célula.

Um vetor químico/físico preferido da invenção é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloi-dal incluem sistemas à base de lipídios, inclusive emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomos. Um sistema coloidal preferido da invenção é um lipossomo. Lipossomos são recipientes de membrana artificial que são utilizáveis como um vetor de distribuição in vivo ou in vitro. Demonstrou-se que recipientes unilamelares grandes (LUV), que variam em tamanho de 0,2 - 4,0 pm, podem encapsular grandes macromoléculas. RNA, DNA e vírions intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser distribuídos a células em uma forma biologicamente ativa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sei., (1981) 6:77). Para que um lipossomo seja um vetor de transferência de gene eficiente, uma ou mais das seguintes características devem estar presentes: (1) encapsulação do gene de interesse a alta eficiência com retenção da atividade biológica; (2) distribuição do conteúdo aquoso da vesícula ao citoplasma da célula alvo com alta eficiência; e (3) expressão precisa e eficaz da informação genética.

Lipossomos são comercialmente disponíveis na Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN™ e LIPOFECTACE™, que são formados por lipídios catiônicos, como cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-Ν,Ν,Ν-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Processos para a preparação de lipossomos são bem conhecidos na técnica e foram descritos em muitas publicações. Lipossomos também foram revisados por Gregoriadis, G. em Trends in Biotechnology (1985) 3:235-241.

Agentes de compactação também podem ser usados isoladamente ou em combinação com um vetor biológico ou quí-mico/físico da invenção. Um "agente de compactação", conforme aqui usado, refere-se a um agente, como uma histona, que neutralize as cargas negativas sobre o ácido nucléico e, dessa forma, permita a compactação do ácido nucléico em um grânulo fino. A compactação do ácido nucléico facilita a captação do ácido nucléico pela célula alvo. Os agentes de compactação podem ser usados isoladamente, isto é, para distribuir a molécula ica em uma forma que seja mais eficientemente captada pela célula ou, mais preferivelmente, em combinação com um ou mais dos vetores acima descritos. . Outras composições exemplificativas que podem ser usadas para facilitar a captação por uma célula alvo dos ácidos nucléicos ica incluem fosfato de cálcio e outros mediadores químicos do transporte intracelular, composições de microinjeção, composições de eletroporação e recombinação homóloga (por exemplo, para integrar um ácido nucléico ica em uma localização pré-selecionada no cromossomo da célula alvo) .

Os exemplos a seguir são incluídos para fins de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da invenção Exemplos Exemplo 1: Purificação de dPNAG

Descobriu-se, de acordo com a invenção, que dPNAG pode ser produzida por qualquer cepa bacteriana que expresse o locus ica. Especificamente, essas incluem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus e outras cepas estafilo-cócicas, como Staphylococcus carnosus, transformadas com os genes no locus ica. As seguintes cepas especificas podem ser usadas de acordo com a invenção para purificar PNAG: S. epidermidis RP62A (ATCC número 35984), S. epidermidis RP12 (ATCC número 35983), Staphylococcus epidermidis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27) e S. aureus MN8 mucóide. A seguir, apresenta-se um processo que pode ser usado para produzir dPNAG a partir de estafilococos que contenham o locus ica. O material de partida é preparado a partir de culturas de estafilococos que expressam os genes ica por cultivo das bactérias da seguinte maneira: o polissacarídeo é preparado a partir de culturas de 16 litros de meio de crescimento bacteriano. Um meio preferido é um meio quimicamente definido (CDM) à base de RPMI-1640 AUTO-MOD, uma preparação de RPMI modificada para permitir a esterilização por autoclave (Sigma Chemical Co., St., Mo.) . O CDM é suplementado com aminoácidos adicionais, vitaminas e nucleotídeos para ajustar sua concentração àquelas encontradas em outros CDM (Hussain, M. , J. G. M. Hastings e P. J. White, 1991. A chemically defined médium for slime production by coagulase- negative Staphylococci, J. Med. Microbiol. 34:143-147). 0 meio também é suplementado com sacarose e glicose a uma concentração final de 1%.

Culturas líquidas são inoculadas com uma única colônia de uma cepa de bactérias produtoras de polissacarí-deos. A cepa preferida é designada por Staphylococcus aureus MN8m, uma cepa que é uma superprodutora constitutiva do po-lissacarídeo. Uma única colônia é colhida de uma placa de ágar soja tríptico, ou placa similar de meio de crescimento bacteriano, e cultivada a 37°C. Temperaturas de 10 - 42°C também são aceitáveis. Culturas líquidas são incubadas a 37°C durante 1-96 horas, enquanto se agita continuamente e inunda com oxigênio a uma taxa de 2 litros/min. 0 pH é mantido em 7,0 durante todo o período de crescimento pela adição de NaOH a 10 N mediante um titulador de pH. Ao término do período de crescimento, os corpos celulares são sedimentados a 9.000 g durante 30 minutos, e o sobrenadante, concentrado a ~500 mL mediante filtração de fluxo tangencial (membranas de corte de peso molecular de 10.000 - 500.000). Dois volumes de etanol são adicionados para precipitar a preparação de polissacarídeo bruto. 0 precipitado é recuperado por centrifugação, novamente posto em suspensão em água e diálise por uma noite contra água destilada. O antígeno é insolúvel. 0 antígeno bruto insolúvel é posto em suspensão em 50 mL de salinada tamponada com fosfato (PBS, fosfato a 0,1 M, cloreto de sódio a 0,15 M) para ser digerido com a lisozima (0,5 mg) e lisostafina (0,5 mg) durante 0,5 a 16 h a 37°C. Suspensões de antígeno são adicionalmente tratadas com nucleases (0,5 mg) a 37°C fuante 0,5 a 16 h, seguido por incubação durante 0,5 a 16 h com proteinase K (5 mg) a 37 -56°C. Após diálise e liofilização, extratos secos são dissolvidos em HC1 a 5 M, e o pH é ajustado a 2 com NaOH a 4 N. Alíquotas de vinte mL dessa solução são aplicadas a uma coluna de 5 x 88 cm cheia de Sephacryl S-300 (Pharmacia, Pis-cataway, NJ) usando tampão HC1 a 0,1 N/NaCl a 0,15 M, com o polissacarídeo eluído identificado por absorção óptica a 206 nm. Frações correspondentes ao polissacarídeo, que representam uma faixa contínua de tamanhos moleculares, são separadamente reunidas, dialisadas contra água e liofilizadas. Alternativamente, pode-se efetuar o fracionamento por tamanho com vários procedimentos alternativos conhecidos na técnica, como o uso de membranas de diafiltração. 0 nível de acetilação pode ser ajustado por tratamento químico do polissacarídeo nativo. Assim, um polissacarídeo com > 50% de acetato é isolado e desacetilado para atingir o nível de acetilação desejado. O tratamento é em uma solução básica que sabidamente remova grupos acetato ligados a amino de uma glucosamina. Um meio preferido é a incubação a 37°C durante 2 - 20 horas em NaOH a 1,0 M. Soluções mais fracas e tempos de incubação mais longos ou temperaturas mais elevadas, ou soluções mais fortes com tempos de incubação mais curtos ou temperaturas mais baixas são igualmente eficazes. Generiamente, qualquer tratamento que eleve o pH acima de 10 seria eficaz sob a temperatura apropriada.

Também há meios enzimáticos para desacetilar o an-tígeno. Esses incluem enzimas de desacetilação, como aquelas relacionadas à cloranfenicol desacetilase e o produto do gene icaB.

Exemplo 2: Preparação da Vacina de Conjugado dPNAG Toxóide Diftérico (DTm) DTm foi covalentemente acoplado a dPNAG purificada por aminação redutora. Grupos aldeído foram primeiro introduzidos na superfície de toxóide diftérico (DTm) por tratamento da proteína com glutaraldeído, conforme descrito na etapa 1 abaixo. DTm ativado foi subsequentemente reagido com dPNAG, através de seus grupos amino livres, na presença do agente redutor cianoboroidreto de sódio, conforme descrito na etapa 2 abaixo.

Etapa 1: Ativação de DTm com glutaraldeído 10 mg de DTm (4,86 mg/mL de solução em tampão HEPES a 20 mM, NaCl a 50 mM, pH 8) foram dialisados contra tampão carbonato a 0,1 M (pH 10) durante 3 horas (h) à temperatura ambiente com um cassete de diálise MWCO de 10 kDa. Quando a solução de proteína estava completamente trocada com tampão carbonato, glutaraldeído foi adicionado a uma concentração final de 1,25%, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Isso produziu DTm ativado, que foi trocado com Salina Tamponada com Fosfato (PBS, pH 7,4) e concentrado a aproximadamente 10 mg/mL por ultrafil-tração com uma membrana de filtração MWCO de 10 kDa.

Etapa 2: Acoplamento de DTm ativado a PNAG PNAG foi purificada conforme descrito em Maira et al. (Maira-Litrán T., Kropec A., Abeygunawardana C., Joyce J., Mark III G., Goldman D. A. e Pier G. B., Immunochemical properties of the staphylococcal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 2002; 70:4433-4440). Uma fração desse material, designada por PNAG-II em Maira et al., foi usada para preparar a PNAG desacetilada (dPNAG). PNAG nativa foi dissolvida a uma concentração de 2 mg/mL em NaOH a 5 M e incubada a 37°C com agitação. Após 18 h, a amostra foi colocada em uma pasta semifluida de gelo e deixada resfriar a 10°C. HCl a 5 N também foi resfriado em gelo e adicional em alíquotas de 0,5 mL até que a solução atingisse um pH neutro. A solução de dPNAG foi, então, dialisada durante uma noite contra água destilada em um cassete de di-álise de Corte de Peso Molecular de 10 QuiloDaltons (MWCO de 10K) e liofilizada. Esse procedimento forneceu dPNAG com 15 - 20% de substituições acetato. dPNAG purificada (10 mg) foi dissolvida em 0,25 mL de HCl a 5 M, neutralizada com um volume igual de NaOH a 5 M, e o volume final foi ajustado a 2 mL com PBS. Soluções de dPNAG são insolúveis a pH neutro, mas permanecem completamente solúveis a pH levemente ácido ou básico. Conseqüente-mente, para assegurar a solubilidade, o pH das soluções de dPNAG foi ajustado a 9,0. dPNAG (10 mg) foi misturada com 1 mL de uma solução a 10 mg/mL de DTm ativado em PBS, e o pH da reação foi ajustado em 7,5. Duzentos mg de cianoboroidre-to de sódio purificado foram adicionados à mistura, e a reação foi deixada prosseguir no escuro durante 14 h a 37°C com agitação. Após esse tempo, a mistura de reação foi trocada por diálise com tampão carbonato a 0,1 M, NaCl a 0,15 M, pH 10 (cassete de diálise MWCO de 10 kDa), e o conjugado de e- levado peso molecular foi purificado dos componentes não acoplados com uma coluna Superose 6 prep-grade por cromato-grafia de filtração em gel. 0 conjugado dPNAG-DTm foi diali-sado contra tampão HEPES a 20 mM, NaCl a 50 mM, pH 8, e armazenado congelado a -2°C.

Exemplo 3: Preparação de Vacina de Conjugado PNAG nativa-DTm PNAG nativa (neste caso, com 95% - 100% de substituições acetato) foi covalentemente acoplada a DTm purificado mediante o agente de cianilação orgânica tetrafluorobora-to de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP) para ativar os grupos hidroxila do polissacarídeo, conforme descrito na Etapa 1 abaixo. PNAG ativada com CDAP foi subseqüentemente acoplada a DTm, conforme descrito na Etapa 2 abaixo, sem a necessidade de moléculas espaçadoras adicionais.

Etapa 1: Ativação de PNAG com CDAP 10 mg de PNAG purificada foram dissolvidos em 150 microlitros de HC1 a 5 M, neutralizados com um volume igual de NaOH a 5 M e diluídos até 1 mL com tampão borato, pH 9,2. CDAP foi completado até uma concentração de 100 mg/mL em a-cetonitrila e armazenado a -20°C durante até 1 mês. 200 microlitros de CDAP (contendo 20 mg) foram lentamente pipeta-dos em uma solução previamente remoinhada de PNAG-II (Maira et al., Infec. Immun. 2002, 70:4433-4440) em tampão borato (a adição rápida do co-solvente orgânico precipita o polissacarídeo) , e a reação foi deixada prosseguir durante dois minutos.

Etapa 2: Acoplamento de PNAG Ativada com CDAP a DTm 5 mg de DTm (solução de estoque em tampão HEPES a 20 mM, NaCl a 50 mM, pH 8) foram dialisados contra tampão borato, pH 9,2, durante 3 h com um cassete de diálise MWCO de 10 kDa. Após a ativação de PNAG com CDAP, 5 mg de DTm foram imediatamente adicionados, e a mistura foi reagida à temperatura ambiente durante 3 h com agitação. Após esse tempo, o conjugado de elevado peso molecular foi purificado dos componentes não acoplados com uma coluna Superose 6 prep-grade por cromatografia de filtração em gel. Frações que continham o conjugado PNAG-DTm foram reunidas, concentradas e armazenadas congeladas a -20°C.

Exemplo 4: Produção de Anti-soro em Coelhos Anticorpos contra PNAG purificada-DTm ou dPNAG-DTm foram gerados em coelhos brancos New Zealand por imunização subcutânea com duas doses de 10 μς de polissacarídeo conjugado emulsifiçado, para a primeira dose, em adjuvante de Freund completo e, para a segunda dose, em adjuvante de Freund incompleto, seguido, uma semana mais tarde, por três injeções intravenosas de antígeno em salina, cada uma espaçada de três dias. Os coelhos foram sangrados a cada duas semanas, e os soros foram testados por ELISA. As curvas de ligação obtidas por ELISA de dois coelhos representativos imunizados com conjugados PNAG- ou dPNAG-DTm são mostradas nas Figs. 1 e 2, respectivamente. Os títulos foram determinados conforme descrito por Maira et al. (Maira-Litrán T., Kropec A., Abeygunawardana C., Joyce J., Mark III G., Goldman D. A. e Pier G. B., Immunochemical properties of the staphylococcal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. In- fect. Immun. 2002; 70:4433-4440).

Exemplo 5: Imunogenicidade de PNAG-DTm e dPNAG-DTm em Camundongos Grupos de dez camundongos (Swiss Webster; fêmeos, 5-7 semanas de idade) foram imunizados por via subcutânea, com uma semana de separação, com 1,5, 0,75 ou 0,15 pg de po-lissacarideo conjugado de PNAG-DTm e dPNAG-DTm em 0,1 mL de PBS e sangrados semanalmente durante quatro semanas após a 3a imunização. Grupos de controle foram imunizados com uma mistura de polissacarídeo não conjugado e proteína na mesma razão. Os títulos dos camundongos imunizados com conjugados nativo e desacetilado são mostrados nas Figs. 3 e 4, respectivamente. Os grupos de controle não desenvolveram títulos com qualquer das doses usadas.

Exemplo 6: Atividade de Morte Opsônica de Anti-soro de Coelho Gerado Contra PNAG e dPNAG Conjugado a Toxói-de Tetânico Dois coelhos foram imunizados com PNAG conjugado a toxóide diftérico e dois coelhos foram imunizados com dPNAG conjugado a toxóide diftérico, conforme acima descrito. A atividade de morte opsônica foi determinada com o processo descrito por Maira et al. (Maira-Litrán T., Kropec A., Abey-gunawardana C., Joyce J., Mark III G., Goldman D. A. e Pier G. B., Immunochemical properties of the staphylococcal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 2002; 70:4433-4440). 0 título foi determinado e definido como a diluição sérica em que 40% das bactérias eram mortas. As curvas de ligação dos 4 anti-soros de coelho contra vá- rias cepas estafilocócicas são mostradas nas Figs. 5 - 8. A cepa M187 é uma cepa de S. epidermidis; as outras são todas cepas de S. aureus. As comparações dos títulos são mostradas na Fig. 9. .

Equivalentes 0 relatório escrito precedente é considerado como suficiente para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a invenção. 0 âmbito da presente invenção não é limitado pelos exemplos apresentados, pois os exemplos pretendem ser uma única ilustração de um aspecto da invenção, e outras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito da invenção. Várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas, ficarão aparentes para aqueles versados na técnica com a descrição precedente e se encontram dentro do âmbito das reivindicações anexas. As vantagens e objetivos da invenção não estão necessariamente englobados por cada modalidade da invenção.

Todas as referências, patentes e publicações de patentes que foram citadas neste pedido são aqui incorporadas em sua inteireza por referência.

REIVIMDlCAÇÕES

Claims

1. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender um polissacarídeo isolado compreendendo um polímero de β-1,6-glucosamina, tendo uma estrutura de em que n é pelo menos quatro,, em que R é selecionado a partir do grupo que consiste em -NH-CO-CH3- e -NHs, com a condição de que menos do que 40% dos grupos R são -NH-CO-CH3, e tendo um peso molecular de pelo menos 2500 Dal-tons, e em que a composição farmacêutica é estéril.

2. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender um polissacarídeo isolado conjugado a um composto de veículo.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que: (a) menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10% ou menos de 5% dos grupos R são -NH-CO-CH3, ou (b) nenhum dos grupos R é -NH-CO-CH3.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que n é um, inteiro selecionado do grupo que consiste em pelo menos 6, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400 e pelo menos 500.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o polissacarideo isolado: (a) é um polímero hetero-substituído, (b) tem um peso molecular selecionado do grupo que consiste em pelo menos 5.000 Daltons, pelo menos 7.500 Daltons, pelo menos 10.000 Daltons, pelo menos 25.000 Daltons, pelo menos 50.000 Daltons, pelo menos 75.000 Daltons e pelo menos 100.000 Daltons, (c) tem um peso molecular selecionado do grupo que consiste em pelo menos 125.000 Daltons, pelo menos 150.000 Daltons, pelo menos 200.000 Daltons, pelo menos 250.000 Daltons, pelo menos 300.000 Daltons, pelo menos 350.000 Daltons, pelo menos 400.000 Daltons, pelo menos 450.000 Daltons e pelo menos 500.000 Daltons, ou (d) é formulado como uma vacina.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição tem uma pureza selecionada do grupo que consiste em pelo menos 90% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 97% pura e pelo menos 99% pura.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto de veiculo é (a) conjugado ao polissacarideo isolado através de um ligante, ou (b) um veículo peptídico.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA por compreender adicionalmente um veiculo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que apenas um composto de veiculo ou ligante unido a um composto de veiculo é conjugado à estrutura .

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto de veiculo é um polissacarideo que não é uma N-acetil β 1-6 glucosamina.

11. Método de produção de um polissacarideo isolado CARACTERIZADO por compreender: a precipitação com etanol de uma preparação de polissacarideo bruto a partir de uma preparação de corpos celulares bacterianos concentrada; a digestão concomitante do polissacarideo bruto com lisozima e lisostafina, seguida por digestão sequencial com uma nuclease e proteinase K para formar uma preparação de polissacarideo digerido; o fracionamento por tamanho da preparação de polissacarideo digerido; o isolamento de uma fração de polissacarideo ace- tilado; e a desacetilação da fração de polissacarideo aceti-lado para produzir um polissacarideo isolado compreendendo um polímero de β-l,6-glucosamina, tendo uma estrutura de em que n é um inteiro que é pelo menos quatro, em que R é selecionado a partir do grupo que consiste em -NH-CO-CÜ3- e -NHj, com a condição de que menos do que 40% dos grupos R são -WH-CO-CH3, e a formulação do polissacarideo isolado como uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção bacteriana.

12. Método de produção de um polissacarideo isolado CARACTERIZADO por compreender; a preparação de um polissacarideo impuro a partir de uma cultura bacteriana; a incubação do polissacarídeo impuro com um ácido ou uma base para produzir uma preparação de polissacarídeo semi-puro; a neutralização da preparação; a incubação da preparação neutralizada em ácido fluorídrico; o isolamento de um polissacarídeo acetilado da preparação; e a desacetilaçâo do polissacarideo acetílado, para produzir uni polissacarideo isolado compreendendo um polímero de β-l,6-glucosamina, tendo uma estrutura de em que n é um inteiro que é pelo menos quatro, em que R é selecionado a partir do grupo que consiste em -NH-CO-CH3- e -WHs, com a condição de que menos do que 40% dos grupos R são -NH-CO-CH3, e a formulação do polissacarideo isolado como uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção bacteriana.

13, Método de produção de um polissacarideo isolado CARACTERIZADO por compreender: a preparação de um polissacarideo impuro a partir de uma cultura bacteriana; a incubação do polissacarideo impuro cora ura ácido ou uma base para produzir uma preparação de polissacarídeo semi-puro; a neutralização da preparação; a incubação da preparação neutralizada em ácido fluorídrico; e o isolamento da preparação de um polissacarídeo compreendendo um polímero de β-l,6-glucosamina, tendo uma estrutura de em que n é um inteiro que é pelo menos quatro, em que R é selecionado a partir do grupo que consiste em -NH-CO-CH3- e “NH2, com a condição de que menos do que 40% dos grupos R são -NH-CO-CH3, e a formulação do polissacarídeo isolado como uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção bacterianà.

14, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura bacteríana ou a preparação de corpo de célula bacteriana é: (a) uma cultura de Staphylococcus coagulase-negativo, ou uma preparação de corpo de célula de Staphylococcus coagulase-negativo, ou (b) uma cultura de Staphylococcus aureus ou uma cultura de Staphylococcus epidermidis, ou uma preparação de corpo de célula de Staphylococcus epidermidis.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o polissa-carideo isolado: (a) tem um peso molecular selecionado do grupo que consiste em pelo menos 1.000 Daltons, pelo menos 1.200 Daltons, pelo menos 1.500 Daltons, pelo menos 2.000 Daltons, pelo menos 2.500 Daltons, pelo menos 5.000 Daltons, pelo menos 7.500 Daltons, pelo menos 10.000 Daltons, pelo menos 25.000 Daltons, pelo menos 50.000 Daltons, pelo menos 75.000 Daltons e pelo menos 100.000 Daltons, (b) tem um peso molecular selecionado do grupo que consiste em pelo menos 125.000 Daltons, pelo menos 150.000 Daltons, pelo menos 200.000 Daltons, pelo menos 250.000 Daltons, pelo menos 300.000 Daltons, pelo menos 350.000 Daltons, pelo menos 400.000 Daltons, pelo menos 450.000 Daltons e pelo menos 500.000 Daltons, ou (c) tem uma pureza selecionada do grupo que consiste em pelo menos 90% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 97% pura e pelo menos 99% pura.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente a conjugação de pelo menos um composto de veiculo ao polissacarideo isolado.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de veiculo é (a) conjugado ao polissacarideo isolado através de um ligante, ou (b) um veiculo peptidico.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o polissacarideo acetila-do ou a fração de polissacarideo acetilado é: (a) quimicamente desacetilado, ou (b) enzimaticamente desacetilado.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o polissacarideo acetilado ou a fração de polissacarideo acetilado é desacetilado por incubação com uma solução básica.

20. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a preparação de polissacarideo digerida é fracionada por tamanho usando uma coluna.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente a formulação do polissacarideo isolado como uma vacina.

22. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender o polissacarideo isolado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 7, 9 e 10, em uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imune, em um veiculo farmaceuticamente aceitável.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA por compreender adicionalmente um adjuvante.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a resposta imune é uma resposta imune especifica a antigeno.