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BR122020011337B1 - Anticorpos humanos para o receptor de glucagon, composição farmacêutica, usos dos mesmos, molécula de ácido nucleico isolada e vetor de expressão - Google Patents

Anticorpos humanos para o receptor de glucagon, composição farmacêutica, usos dos mesmos, molécula de ácido nucleico isolada e vetor de expressão Download PDF

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BR122020011337B1
BR122020011337B1 BR122020011337-5A BR122020011337A BR122020011337B1 BR 122020011337 B1 BR122020011337 B1 BR 122020011337B1 BR 122020011337 A BR122020011337 A BR 122020011337A BR 122020011337 B1 BR122020011337 B1 BR 122020011337B1
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BR
Brazil
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antibody
gcgr
antibodies
seq
antigen
Prior art date
Application number
BR122020011337-5A
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Inventor
Haruka Okamoto
Mark Sleeman
Joyce Harp
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam ao receptor de glucagon humano, designado GCGR e métodos de utilização dos mesmos. De acordo com determinadas modalidades da invenção, os anticorpos são anticorpos totalmente humanos que se ligam ao GCGR humano. Os anticorpos da invenção são úteis para reduzir os níveis de glicose sanguínea e os níveis de cetona sanguínea e também são úteis para o tratamento de doenças e transtornos associados com uma ou mais atividades biológicas de GCGR, incluindo o tratamento de diabetes, cetoacidose diabética e complicações de longa duração associadas com o diabetes, ou outros transtornos metabólicos caracterizados em parte por níveis elevados de glicose sanguínea.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos humanos de ligação antigênica que ligam especificamente o receptor de glucagon, e métodos terapêuticos de utilização destes anticorpos.
DECLARAÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[0002] Glucagon é um hormônio de 29 aminoácidos produzido pelas células alfa das ilhotas pancreáticas. O glucagon mantém os níveis normais de glicose em animais, incluindo humanos, desequilibrando os efeitos da insulina. É um desequilíbrio de glucagon e insulina que pode desempenhar um papel importante em várias doenças, tais como diabetes mellitus e cetoacidose diabética. Em particular, estudos mostraram que maiores níveis basais de glucagon e a falta de supressão da secreção de glucagon pós-prandial contribuem para condições diabéticas em humanos (Muller et al., N Eng J Med 283: 109-115 (1970)).
[0003] Acredita-se que os efeitos do glucagon sobre a elevação dos níveis de glicose sanguínea são mediados em parte pela ativação de determinados caminhos celulares depois da ligação de glucagon (GCG) a seu receptor (designado GCGR). GCGR é um membro da subfamília das secretinas (família B) de receptores acoplados a proteína G e é expressado predominantemente no fígado. A ligação de glucagon a seu receptor dispara uma cascata de transdução de sinal de proteína G, ativando o AMP cíclico intracelular e levando a um aumento na produção de glicose através de síntese de novo (gliconeogênese) e quebra do glicogênio (glicogenólise) (Wakelam et al., Nature, (1986) 323:68-71; Unson et al., Peptides, (1989), 10:11711177; e Pittner and Fain, Biochem. J. (1991), 277:371-378).
[0004] O receptor de glucagon de rato foi primeiro isolado e purificado por Jelinek et al (Jelinek, L.J. et al. (1993) Science 259(5101): 1614-1616). Em seguida, a sequência de rato foi usada para identificar e clonar a sequência de 477 aminoácidos de receptor de glucagon humano (Lok, S. et al. (1994) Gene 140:203-209; MacNeil, D.J. et al. (1994) Biochem. and Biophys. Res. Comm). A patente dos Estados Unidos No. 5.776.725 revela uma sequência de ácido nucleico isolada codificando um receptor de glucagon humano ou de rato.
[0005] Ter por alvo a produção de glucagon ou função com um antagonista de receptores de glucagon, tal como um anticorpo anti- GCGR, pode ser um método para controlar e reduzir a glicose sanguínea, e como tal, pode se comprovar útil para tratar doenças tais como diabetes mellitus ou cetoacidose diabética. Além disso, por redução dos níveis de glicose, pode ser possível prevenir ou melhorar algumas das complicações de longa duração associadas com níveis elevados de glicose em pacientes diabéticos.
[0006] Estudos precoces demonstraram que anticorpos policlonais para o receptor de glucagon de rato foram capazes de bloquear a ligação de glucagon (Unson, C.G. (1996) PNAS 93(1):310-315). Anticorpos monoclonais para o receptor de glucagon humano foram descritos por Buggy et al. (Buggy, J.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(13): 7474; Buggy, J.J. et al. (1996) Horm Metab Res. 28(5):215-9). O anticorpo descrito por Buggy et al. competiu com glucagon pelo sítio de ligação hormonal do receptor e reconheceu tanto os receptores de glucagon humanos quanto de rato, mas não o receptor de camundongo. Wright et al. revelam um anticorpo monoclonal cultivado em um camundongo contra o receptor de glucagon humano e conduziu determinação da estrutura de proteína detalhada do anticorpo monoclonal para o receptor (Wright, L.M. (2000) Acta Crystallographica Section D. 56(5): 573-580). Outros anticorpos para o receptor de glucagon são descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.770.445 e 7.947.809; no requerimento de patente Europeia No. EP2074149A2; na patente Europeia No. EP0658200B1; nas publicações de patente dos Estados Unidos Nos. 2009/0041784; 2009/0252727; e 2011/0223160; e na publicação de patente internacional No. WO2008/036341.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos (mAbs) e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos que ligam ao receptor de glucagon humano (hGCGR) e inibem ou bloqueiam sua atividade, por exemplo, bloqueiam a ligação de glucagon a seu receptor, deste modo bloqueando a elevação dos níveis de glicose sanguínea. Os anticorpos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos podem ser úteis para reduzir os níveis de glicose sanguínea em um sujeito que sofre de uma doença caracterizada por níveis aumentadas de glicose sanguínea, tais como diabetes mellitus. Os anticorpos também podem ser usados para tratar uma ampla gama de condições e transtornos nos quais é desejado bloqueio da interação de glucagon com o receptor de glucagon, deste modo tendo um efeito benéfico. Os anticorpos em última análise podem ser usados para prevenir as complicações de longa duração associadas com níveis elevados de glicose sanguínea em pacientes diabéticos, ou para melhorar no mínimo um sintoma associado com níveis elevados de glicose sanguínea em pacientes diabéticos.
[0008] Os anticorpos da invenção podem ser de extensão total (por exemplo, um anticorpo de IgG1 ou IgG4) ou podem compreender somente uma porção de ligação antigênica (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv), e pode ser modificada para afetar a funcionalidade, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
[0009] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especificamente o receptor de glucagon humano (hGCGR), em que o anticorpo liga um ectodomínio e/ou um loop extracelular (EC) de GCGR humano, em que o ectodomínio é o domínio N-terminal de GCGR e em que o loop EC é um ou mais de EC1, EC2 e EC3.
[0010] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento do mesmo, o qual liga o domínio N-terminal compreendendo os resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido número 27 até aproximadamente o resíduo aminoácido 144 de SEQ ID NO: 153, ou liga um loop EC de hGCGR, em que o loop EC é um ou mais de EC1, EC2, e EC3, em que EC1 compreende resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido 194 até aproximadamente o resíduo aminoácido 226 de SEQ ID NO: 153; EC2 compreende resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido 285 até aproximadamente o resíduo aminoácido 305 de SEQ ID NO: 153; e EC3 compreende resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido 369 até aproximadamente o resíduo aminoácido 384 de SEQ ID NO: 153.
[0011] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo humano que liga hGCGR compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 e 146, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência. Em determinadas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo que liga hGCGR compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 70, 86, 110 e 126, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0012] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo humano que liga hGCGR compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 e 148, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência. Em determinadas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo que liga hGCGR compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 42, 78, 88, 118 e 128, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0013] Em determinadas modalidades, o anticorpo humano ou fragmento do mesmo que liga hGCGR compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138, e 146/148. Em determinadas modalidades, o par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR é selecionado entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 34/42, 70/78, 86/88, 110/118 e 126/128.
[0014] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo o qual liga especificamente hGCGR, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende os domínios CDR de cadeias pesadas e leves contidos dentro de pares de sequências de cadeias pesadas e leves selecionados entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 e 146/148. Métodos e técnicas para a identificação de CDRs dentro de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são de conhecimento geral na técnica e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas reveladas aqui, neste requerimento de patente. Exemplos de convenções que podem ser usados para identificar os limites de CDRs incluem, por exemplo, a definição Kabat, a definição Chothia, e a definição AbM. Em termos gerais, a definição Kabat é baseada em variabilidade de sequência, a definição Chothia é baseada na localização das regiões de loop estrutural, e a definição AbM é uma harmonização entre as abordagens Kabat e Chothia. Vide, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al- Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para a identificação de sequências de CDR dentro de um anticorpo.
[0015] Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona um anticorpo humano isolado ou um fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especificamente a hGCGR, em que o anticorpo compreende uma HCVR compreendendo as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro da sequência de HCVR selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 e 146; e uma LCVR compreendendo as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro das sequências de LCVR selecionadas entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 e 148.
[0016] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo humano que liga hGCGR, compreendendo um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 e 136, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 e 144, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0017] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento do mesmo que compreende adicionalmente um domínio HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 e 132, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 e 134, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 e 140, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 e 142, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0018] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo compreende: um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 e 136; e um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 e 144.
[0019] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do anticorpo compreende adicionalmente: um domínio HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 e 132; um domínio HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 e 134; um domínio LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 e 140; e um domínio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 e 142.
[0020] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende uma HCVR compreendendo um domínio HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre uma de SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 e 132; um domínio HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre uma de SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 e 134; um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre uma de SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 e 136; e uma LCVR compreendendo um domínio LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre uma de SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 e 140; um domínio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre uma de SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 e 142; e um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre uma de SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 e 144.
[0021] Em determinadas modalidades, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo humano que liga ao GCGR humano compreende um par de sequências de aminoácidos HCDR3/LCDR3 selecionado entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 76/84, 96/104, 116/124 e 136/144. Exemplos não limitantes de anticorpos anti-GCGR tendo estes pares HCDR3/LCDR3 são os anticorpos designados H4H1345N, H4H1617N, H4H1765N, H4H1321B e H4H1321P, H4H1327B e H4H1327P, H4H1328B e H4H1328P, H4H1331B e H4H1331P, H4H1339B e H4H1339P, respectivamente.
[0022] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 4, 6 e 8, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 12, 14 e 16, respectivamente.
[0023] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 20, 22 e 24, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 28, 30 e 32, respectivamente.
[0024] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 36, 38 e 40, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 44, 46 e 48, respectivamente.
[0025] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 52, 54 e 56, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 60, 62 e 64, respectivamente.
[0026] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 72, 74 e 76, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 80, 82 e 84, respectivamente.
[0027] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 92, 94 e 96, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 100, 102 e 104, respectivamente.
[0028] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 112, 114 e 116, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 120, 122 e 124, respectivamente.
[0029] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende as sequências de aminoácidos HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NO: 132, 134 e 136, respectivamente e as sequências de aminoácidos LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NO: 140, 142 e 144, respectivamente.
[0030] Em uma modalidade, o anticorpo anti-hGCGR ou fragmento de ligação antigênica do mesmo compreende uma sequência HCDR1 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO: 202), em que X1 é Gly, X2 é Phe, X3 é Thr, X4 é Phe ou Ser, X5 é Ser, X6 é Ser ou Asn, X7 é Tyr ou Phe, e X8 é Asp, Leu, ou Gly; uma sequência HCDR2 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO: 203), em que X1 é Ile, X2 é Ser, Gln, Asp, ou Trp, X3 é Ser, Glu, Thr, ou Phe , X4 é Asp ou Ala, X5 é Gly ou Glu, X6 é Arg, Ile, ou ausente, X7 é Asp ou Glu, e X8 é Lys ou Thr; uma sequência HCDR3 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 - X17 - X18 -X19 - X20- X21 (SEQ ID NO: 204), em que X1 é Ala ou Thr, X2 é Lys ou Arg, X3 é Glu, X4 é Met, Pro, Gly, ou Asp, X5 é Val, Ser, Lys, Arg, ou ausente, X6 é Tyr, His, Asn, ou ausente, X7 é Tyr, X8 é Asp ou Glu, X9 é Ile, X10 é Leu, X11 é Thr, X12 é Gly, X13 é Tyr, Asp, ou His, X14 é His, Asp, Tyr, ou ausente, X15 é Asn, Tyr, His, ou ausente, X16 é Tyr, X17 é Tyr ou His, X18 é Gly ou Ala, X19 é Met, X20 é Asp e X21 é Val ou Ile; uma sequência LCDR1 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 (SEQ ID NO: 205), em que X1 é Gln, X2 é Gly ou Ala, X3 é Ile, X4 é Asn ou Arg, X5 é Asn, e X6 é Tyr ou Asp; uma sequência LCDR2 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO: 206), em que X1 é Thr ou Ala, X2 é Ala ou Thr, e X3 é Ser ou Phe; e uma sequência LCDR3 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO: 207), em que X1 é Gln ou Leu, X2 é Gln, X3 é Tyr, His, ou Asp, X4 é Asn ou Tyr, X5 é Thr ou Ser, X6 é Tyr, Asn, ou His, X7 é Pro, X8 é Leu, Phe, Arg, ou ausente e X9 é Thr.
[0031] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica liga GCGR humano, de macaco, de camundongo e de rato.
[0032] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica liga GCGR humano, de macaco e de camundongo, mas não liga GCGR de rato.
[0033] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica liga GCGR humano, de macaco e de rato, mas não liga GCGR de camundongo.
[0034] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica liga GCGR humano e de macaco, mas não liga GCGR de rato ou de camundongo.
[0035] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica liga GCGR humano, mas não liga GCGR de macaco, de camundongo ou de rato.
[0036] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal totalmente humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que neutraliza a atividade do hGCGR, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo apresenta uma ou mais das características que se seguem: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 e 146; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 e 148; (iii) compreende um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 e 136, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 e 144, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 e 132, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 e 134, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 e 140, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 e 142, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; (v) liga qualquer um ou mais de GCGR humano, de macaco, de camundongo ou de rato; (vi) pode bloquear ou não a atividade de GCGR em no mínimo uma espécie diferente da espécie humana; (v) demonstra uma KD variando a partir de cerca de 10-8 até cerca de 1012; (vi) reduz os níveis de glicose sanguínea por no mínimo cerca de 25% até cerca de 75% em um mamífero experimentando níveis elevados de glicose sanguínea; (vii) pode reduzir ou não os níveis de triglicerídeos para níveis observados em um mamífero normal; ou (viii) não demonstra efeito adverso sobre os níveis sanguíneos de colesterol LDL, colesterol HDL, ou colesterol total em um mamífero.
[0037] Em outra modalidade relacionada, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que compete para ligação específica a hGCGR com um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica compreendendo domínios CDR de cadeias pesadas e leves contidos dentro de pares de sequências de cadeias pesadas e leves selecionados entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 e 146/148.
[0038] Em outra modalidade relacionada, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga o mesmo epítopo sobre hGCGR que é reconhecido por um anticorpo compreendendo pares de sequências de cadeias pesadas e leves selecionados entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 e 146/148.
[0039] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo anti-hGCGR tendo uma ou mais das características que se seguem: a) é capaz de reduzir os níveis de glicose sanguínea por cerca de 25% até cerca de 75% por um período de no mínimo 7 dias, quando administrado em uma dose variando a partir de cerca de 1 mg/kg até cerca de 30 mg/kg; b) é capaz de resultar em no mínimo uma redução de 10% no peso corporal quando administrado a um mamífero que necessite de semelhante terapia; c) é capaz de reduzir os níveis de cetona sanguínea por cerca de 25% a 75% quando administrado em uma dose variando a partir de cerca de 1 mg/kg até cerca de 30 mg/kg; ou d) é capaz de reduzir os níveis de glicose sanguínea por cerca de 20% a 40% sem provocar uma elevação significativa nos níveis sanguíneos de lipídeos ou colesterol quando administrado com um anticorpo específico para proproteína convertase subtilisina / quexina (PCSK)-9, e de sustentar níveis reduzidos de glicose sanguínea por no mínimo 7 dias pós tratamento.
[0040] Em um segundo aspecto, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos anti-hGCGR ou fragmentos dos mesmos. Vetores de expressão recombinantes carregando os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiras nas quais os vetores referidos foram introduzidos, também são englobados pela invenção, assim como métodos para a produção dos anticorpos por cultura das células hospedeiras sob condições que permitem a produção dos anticorpos, e recuperação dos anticorpos produzidos.
[0041] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 69, 85, 89, 105, 109, 125, 129 e 145, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98%, ou no mínimo 99% de homologia com a mesma. Em uma modalidade, a HCVR é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 69, 85, 109 e 125.
[0042] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende adicionalmente uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137 e 147, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98%, ou no mínimo 99% de homologia com a mesma. Em uma modalidade, a LCVR é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 41, 77, 87, 117 e 127.
[0043] Em uma modalidade, a invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo compreendendo um domínio HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 75, 95, 115 e 135, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 83, 103, 123 e 143, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0044] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo adicionalmente um domínio HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 71, 91, 111 e 131, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 73, 93, 113 e 133, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 79, 99, 119 e 139, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 81, 101, 121 e 141, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0045] Em um terceiro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo humano anti-hGCGR ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo compreendendo uma HCVR codificada por segmentos de sequências de nucleotídeos derivados a partir das sequências da linhagem germinativa VH, DH e JH, e uma LCVR codificada por segmentos de sequências de nucleotídeos derivados a partir das sequências da linhagem germinativa VK e JK, com combinações conforme mostrado na Tabela 2.
[0046] A invenção engloba anticorpos anti-hGCGR tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, pode ser útil modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis, ou por exemplo, remoção de uma porção fucose para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (vide Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, pode ser feita modificação de galactosilação de modo a modificar citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
[0047] Em um quarto aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo, o qual liga especificamente hGCGR, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0048] Em uma modalidade, a invenção apresenta uma composição, a qual é uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo da invenção, e um segundo agente terapêutico. O segundo agente terapêutico pode ser qualquer agente que é combinado vantajosamente com o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção.
[0049] Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um agente capaz de reduzir a glicose sanguínea ou de reduzir no mínimo um sintoma em um paciente sofrendo de uma doença ou condição caracterizada por altos níveis de glicose sanguínea, tais como diabetes mellitus.
[0050] Em determinadas modalidades, o segundo agente terapêutico pode ser um agente que ajuda a neutralizar ou reduzir qualquer um ou mais possíveis efeitos colaterais associados com o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo da invenção, caso o um ou mais efeitos colaterais referidos venham a ocorrer. Por exemplo, no caso de que qualquer dos anticorpos anti- hGCGR aumente os níveis de lipídeos ou colesterol, pode ser benéfico administrar um segundo agente que seja eficaz para reduzir os níveis de lipídeos ou colesterol.
[0051] O segundo agente terapêutico pode ser um fármaco de molécula pequena, uma proteína / polipeptídeo, um anticorpo, uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula antissenso, ou um siRNA. O segundo agente terapêutico pode ser sintético ou derivado naturalmente.
[0052] Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um antagonista do glucagon, ou um segundo antagonista de receptores de glucagon, tal como outro anticorpo para o receptor de glucagon, o qual é diferente dos anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente. Também será reconhecido que os anticorpos e composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser empregados em terapias de combinação, isto é, os anticorpos e composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser administrados concomitantemente com, antes de, ou subsequente a, um ou mais procedimentos médicos ou terapêuticos desejados diversos. A combinação particular de terapias (terapêuticos ou procedimentos) para empregar em um regime de combinação levará em conta a compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentos desejados e o efeito terapêutico desejado a ser obtido. Também será reconhecido que as terapias empregadas podem obter um efeito desejado para o mesmo transtorno (por exemplo, um anticorpo pode ser administrado concomitantemente com outro agente usado para tratar o mesmo transtorno), ou podem obter efeitos diferentes (por exemplo, controle de quaisquer efeitos adversos). Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar ou prevenir uma doença ou condição em particular, são apropriados para a doença, ou condição, sendo tratada.
[0053] Em uma modalidade, os anticorpos anti-hGCGR da invenção podem ser usados em combinação com um ou mais dos seguintes tratamentos de tipo 2 diabetes atualmente disponível. Estes incluem biguanida (metformina), sulfonilureias (tais como gliburida, glipizida), agonistas de receptores gama ativados por proliferador do peroxissoma (PPAR) (pioglitazona, rosiglitazona); e inibidores da alfa glucosidase (acarbose, voglibose). Adicional tratamentos incluem tratamentos injetáveis tais como EXENATIDE® (peptídeo semelhante a glucagon 1), e SYMLIN® (pranlintida).
[0054] Em determinadas modalidades, a composição pode incluir um segundo agente selecionado entre o grupo consistindo em secretagogos sulfonilureianão sulfonilureia, insulina, análogos de insulina, polipeptídeos de exendina-4, agonistas de beta 3 adrenoceptores, agonistas de PPAR, inibidores de dipeptidil peptidase IV, estatinas e combinações contendo estatinas, inibidores da captação de colesterol e/ou reabsorção de ácidos biliares, antagonistas de colesterol LDL, antagonistas de proteína de transferência de éster colesterílico, antagonistas de receptores de endotelina, antagonistas do hormônio do crescimento, sensibilizadores de insulina, miméticos ou agonistas de amilina, antagonistas de receptores canabinoides, agonistas de peptídeo semelhante a glucagon 1, melanocortinas, agonistas de receptores do hormônio de concentração de melanina, SNRIs, um mimético de fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF21) (Vide, por exemplo, a patente dos Estados Unidos No. US20110002845 e a patente dos Estados Unidos No. US20080261236), um agonista de receptores do fator do crescimento de fibroblasto 1c (FGFR1c) ( Vide, por exemplo, a patente dos Estados Unidos No. US20110150901), um inibidor da formação de produtos finais de glicação avançada, tal como, mas não limitado a, aminoguanidina, e inibidores da proteína tirosina fosfatase.
[0055] Em determinadas modalidades, a composição pode incluir um segundo agente para ajudar a reduzir os níveis de lipídeos ou colesterol e pode incluir um agente tal como um inibidor da 3-hidróxi-3- metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase (por exemplo, uma estatina tal como atorvastatina, (LIPITOR®), fluvastatina (LESCOL®), lovastatina (MEVACOR®), pitavastatina (LIVALO®), pravastatina (PRAVACHOL®), rosuvastatina (CRESTOR®) e sinvastatina (ZOCOR®) e semelhante.
[0056] Em determinadas modalidades, pode ser benéfico administrar os anticorpos da invenção em combinação com qualquer um ou mais dos seguintes: (1) niacina, a qual aumenta o catabolismo das lipoproteínas; (2) fibratos ou ácidos carboxílicos anfipáticos, os quais reduzem o nível de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), aumentam os níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL) e de TG, e reduzem o número de ataques cardíacos não fatais; e (3) ativadores do fator de transcrição LXR que desempenha um papel na eliminação do colesterol tal como 22-hidroxicolesterol, ou combinações fixas tais como VYTORIN®) (ezetimibe mais sinvastatina); uma estatina com uma resina biliar (por exemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), uma combinação fixa de niacina mais uma estatina (por exemplo, niacina com lovastatina); ou com outros agentes de redução de lipídeos tais como ésteres etílicos de ácidos graxos ômega 3 (por exemplo, omacor). Além disso, o segundo agente terapêutico pode ser um ou mais outros inibidores de glucagon ou GCGR, bem como inibidores de outras moléculas, tais como proteína semelhante a angiopoietina 3 (ANGPTL3), proteína semelhante a angiopoietina 4 (ANGPTL4), proteína semelhante a angiopoietina 5 (ANGPTL5), proteína semelhante a angiopoietina 6 (ANGPTL6), as quais estão envolvidas no metabolismo dos lipídeos, em particular, a homeostase do colesterol e/ou triglicerídeos. Inibidores destas moléculas incluem moléculas pequenas e anticorpos que ligam especificamente a estas moléculas e bloqueiam sua atividade.
[0057] Em determinadas modalidades, pode ser benéfico administrar os anticorpos anti-GCGR da invenção em combinação com um ácido nucleico que inibe a atividade de hPCSK9, tal como uma molécula antissenso, um RNA de filamento duplo, ou uma molécula de siRNA. Exemplos de moléculas de ácido nucleico que inibem a atividade de PCSK9 são descritos na patente dos Estados Unidos No. US2011/0065644, US2011/0039914, US2008/0015162 e US2007/ 0173473.
[0058] Em determinadas modalidades, pode ser benéfico administrar os anticorpos anti-hGCGR da invenção em combinação com um anticorpo que liga especificamente a e inibe a atividade de hPCSK9, deste modo inibindo sua atividade, em que semelhante anticorpo age reduzindo os níves de lipídeos ou colesterol. Exemplos de anticorpos anti-hPCSK9 são descritos na patente dos Estados Unidos No. US2010/0166768. O anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou um fragmento de ligação antigênica do mesmo, pode ser administrado em uma dose variando a partir de cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 30 mg/kg. Pode ser administrado como uma única dose ou como múltiplas doses. O anticorpo anti-hPCSK9 pode ser administrado concomitantemente com o anticorpo anti-GCGR, ou pode ser administrado antes de ou depois do anticorpo anti-GCGR.
[0059] Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico a ser usado em combinação com um anticorpo da invenção compreende um anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou um fragmento de ligação antigênica do mesmo, em que o anticorpo anti- hPCSK9 compreende as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências de HCVR selecionadas entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 173 e 177; e as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências de LCVR selecionadas entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 175 e 185.
[0060] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 173 e 177.
[0061] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 175 e 185.
[0062] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 173 e 177 e uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 175 e 185.
[0063] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma região variável de cadeia leve (LCVR), em que os pares de sequências HCVR/ LCVR são selecionados entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 173/175; e SEQ ID NO: 177/185.
[0064] Em uma modalidade, o anticorpo isolado que liga especificamente a PCSK9 humano, ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, compreende: uma HCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 161 e 179; uma HCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 163 e 181; uma HCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 165 e 183; uma LCDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 167 e 187; uma LCDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 169 e 189 e uma LCDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 171 e 191.
[0065] Em determinadas modalidades, os anticorpos anti hPCSK9 a ser usado em combinação com os anticorpos anti-GCGR da invenção são codificados por moléculas de ácido nucleico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo anti-hPCSK9 ou fragmento do mesmo compreendendo uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 172 e 176, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98%, ou no mínimo 99% de homologia com a mesma, e uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 174 e 184, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98%, ou no mínimo 99% de homologia com a mesma.
[0066] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo anti-hPCSK9 a ser usado em combinação com os anticorpos anti- GCGR da invenção, em que o anticorpo anti-PCSK9 ou fragmento do mesmo compreende um domínio HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 160 e 178, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 162 e 180, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 164 e 182, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 166 e 186, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; um domínio LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 168 e 188, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 170 e 190, ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 98% ou no mínimo 99% de identidade de sequência.
[0067] Quando múltiplos terapêuticos são coadministrados, as dosagens podem ser ajustadas adequadamente, conforme é reconhecido na técnica pertinente.
[0068] Em um quinto aspecto, a invenção apresenta métodos para inibir a atividade do hGCGR usando o anticorpo anti-hGCGR ou porção de ligação antigênica do anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo. Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar qualquer condição ou transtorno, o qual é aprimorado, melhorado, inibido ou prevenido por remoção, inibição ou redução da atividade do hGCGR. É previsto que os anticorpos da invenção podem ser usados isolados, ou como terapia auxiliar com outros agentes ou métodos conhecidos por serem tratamento padrão para tratar pacientes sofrendo de doenças ou condições caracterizadas em parte por níveis sanguíneos elevados de glicose ou cetona, tais como, mas não limitadas a, diabetes. A terapia de rotina referida pode incluir administração de fluidos, ou administração de quaisquer outros agentes farmacêuticos úteis para reduzir a glicose, as cetonas, ou os lipídeos no sangue, ou para redução de peso.
[0069] Os anticorpos anti-hGCGR da invenção podem funcionar bloqueando a interação entre o glucagon e seu receptor, deste modo inibindo os efeitos de elevação da glicose provocados pelo glucagon. O uso de antagonistas de receptores de glucagon, tais como os anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente, pode ser um meio eficaz para atingir níveis normais de glicose, deste modo melhorando, ou prevenindo um ou mais sintomas de, ou complicações de longo termo associadas com, por exemplo, diabetes. O uso de antagonistas de receptores de glucagon, tais como os anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente, também pode ser um meio eficaz para atingir níveis normais de glicose em pacientes não diabéticos, os quais sofrem de hiperglicemia em consequência de condições ou transtornos não relacionados com o diabetes, tais como hiperglicemia no perioperatório (hiperglicemia observada em pacientes logo antes de cirurgia, ou depois de cirurgia). Em determinadas modalidades, são previstos métodos para a redução dos níveis sanguíneos de glicose ou cetona na cetoacidose diabética usando os anticorpos da invenção. Em determinadas modalidades, também são previstos métodos para o tratamento de pacientes para obter uma redução no peso corporal, ou para prevenir o banho de peso, ou para manter um peso corporal normal, usando os anticorpos da invenção.
[0070] Os anticorpos da presente invenção também podem ser úteis para melhorar condições tais como, por exemplo, tolerância à glicose diminuída, obesidade, ou para tratar condições diabéticas, ou para prevenir ou reduzir a gravidade de qualquer uma ou mais das complicações de longa duração associadas com o diabetes, tais como nefropatia, neuropatia, retinopatia, catarata, derrame, aterosclerose, dificuldade de cicatrização de feridas e outras complicações associadas com o diabetes, de conhecimento das pessoas versadas na técnica.
[0071] Outras condições ou transtornos tratáveis pelos métodos terapêuticos da invenção incluem cetoacidose diabética, hiperglicemia (incluindo hiperglicemia no perioperatório, hiperglicemia no paciente de unidade de tratamento intensivo, e síndrome de hiperglicemia hiperosmolar), hiperinsulinemia, a síndrome metabólica, síndrome de resistência à insulina, alteração da glicemia de jejum, ou hiperglicemia associada com hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, e dislipidemias gerais. Em determinadas modalidades, a invenção proporciona um anticorpo isolado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo específico para GCGR, descrito aqui, neste requerimento de patente, para utilização na redução dos níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou para tratar um paciente tendo uma doença ou condição associada com, ou caracterizada em parte por altos níveis sanguíneos de glicose ou cetona, em que a condição ou doença é selecionada entre diabetes, tolerância à glicose diminuída, obesidade, nefropatia, neuropatia, retinopatia, catarata, derrame, aterosclerose, dificuldade de cicatrização de feridas, cetoacidose diabética, hiperglicemia, síndrome hiperosmolar hiperglicêmica, hiperglicemia no perioperatório, hiperglicemia no paciente de unidade de tratamento intensivo, hiperinsulinemia, a síndrome metabólica, síndrome de resistência à insulina e alteração da glicemia de jejum. Em determinadas modalidades, a utilização do anticorpo isolado ou fragmento de ligação antigênica da invenção é contemplada para preparação de um medicamento para reduzir os níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou para tratar um paciente tendo uma doença ou condição associada com, ou caracterizada em parte por altos níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou para melhorar no mínimo um sintoma de semelhante doença ou condição, em que a condição ou doença é selecionada entre qualquer uma das doenças ou condições mencionadas acima.
[0072] Os anticorpos também podem ser úteis para tratar pacientes com glucagonoma inoperável (tumor endócrino pancreático com ou sem eritema migratório necrolítico e hiperglicemia).
[0073] Outras modalidades se tornarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0074] A Figura 1 mostra a percentagem de alteração nos níveis de glicose sanguínea em camundongos C57BL6 depois da administração de H4H1327P (anticorpo anti-GCGR), e/ou H1H316P (anticorpo anti-PCSK9) quando administrados isolados ou em combinação. Controle (X com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg (' com linha sólida); H4H1327P a 10 mg/kg (▲com linha sólida); H1H316P a 10 mg/kg (T com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (u com linha tracejada); H4H1327P a 10 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (Y com linhas tracejadas).
[0075] A Figura 2 mostra os níveis plasmáticos de colesterol LDL em camundongos C57BL6 depois da administração de H4H1327P, e/ou H1H316P quando administrados isolados ou em combinação. Controle (X com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg (' com linha sólida); H4H1327P a 10 mg/kg (▲com linha sólida); H1H316P a 10 mg/kg (t com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (u com linha tracejada); H4H1327P a 10 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (Y com linhas pontilhadas).
[0076] A Figura 3 mostra os níveis plasmáticos de colesterol HDL em camundongos C57BL6 depois da administração de H4H1327P, e/ou H1H316P quando administrados isolados ou em combinação. Controle (X com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg (' com linha sólida); H4H1327P a 10 mg/kg (▲com linha sólida); H1H316P a 10 mg/kg (t com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (u com linha tracejada); H4H1327P a 10 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (Y com linhas pontilhadas).
[0077] A Figura 4 mostra os níveis plasmáticos de colesterol total em C57BL6 camundongos depois da administração de H4H1327P, e/ou H1H316P quando administrados isolados ou em combinação. Controle (X com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg (' com linha sólida); H4H1327P a 10 mg/kg (▲com linha sólida); H1H316P a 10 mg/kg (T com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (u com linha tracejada); H4H1327P a 10 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (Y com linhas pontilhadas).
[0078] A Figura 5 mostra os níveis plasmáticos de triglicerídeos em camundongos C57BL6 depois da administração de H4H1327P, e/ou H1H316P quando administrados isolados ou em combinação. Controle (X com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg (' com linha sólida); H4H1327P a 10 mg/kg (▲com linha sólida); H1H316P a 10 mg/kg (t com linha sólida); H4H1327P a 3 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (u com linha tracejada); H4H1327P a 10 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (Y com linhas pontilhadas).
[0079] A Figura 6 mostra os níveis hepáticos de triglicerídeos em camundongos C57BL6 depois da administração de H4H1327P, e/ou H1H316P quando administrados isolados ou em combinação. Controle (X); H4H1327P a 3 mg/kg ('); H4H1327P a 10 mg/kg (▲); H1H316P a 10 mg/kg (t); H4H1327P a 3 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (u); H4H1327P a 10 mg/kg + H1H316P a 10 mg/kg (Y).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0080] Antes dos presentes métodos serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a métodos particulares, e às condições experimentais descritas, uma vez que semelhantes métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui, neste requerimento de patente, é para os fins de descrever modalidades particulares somente, e não se pretende que seja limitante, uma vez que o âmbito da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexadas.
[0081] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm o mesmo significado conforme é comumente entendido por uma pessoa com conhecimento regular na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste requerimento de patente, possam ser usados na prática ou experimentação da presente invenção, são agora descritos métodos e materiais preferenciais.
Definições
[0082] O "receptor de glucagon", também referido aqui, neste requerimento de patente, como "GCGR", pertence à família de receptores acoplados a proteína G classe 2 e consiste de um domínio extracelular de terminal amino longo (Vide a SEQ ID NO: 158 para DNA codificando o domínio extracelular N-terminal e a SEQ ID NO: 159 para a sequência de aminoácidos do domínio extracelular N- terminal), sete segmentos transmembrana, e um domínio C-terminal intracelular (Jelinek et al., Science 259: 1614-1616 (1993), Segre et al., Trends Endocrinol. Metab 4:309-314 (1993)). Os receptores de Glucagon são notavelmente expressados sobre a superfície dos hepatócitos onde ligam ao glucagon e transduzem o sinal proporcionado por este para dentro da célula. Por conseguinte, o termo "receptor de glucagon" também se refere a um ou mais receptores que interagem especificamente com glucagon resultando em um sinal biológico. Sequências de DNA codificando receptores de glucagon de origem humana e de rato foram isoladas e reveladas na técnica (EP0658200B1). Os homólogos murinos e de macaco cynomolgus também foram isolados e sequenciados (Burcelin, et al., Gene 164 (1995) 305-310); McNally et al., Peptides 25 (2004) 1171- 1178). Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "receptor de glucagon" e "GCGR" são usados de modo intercambiável. A expressão "GCGR", "hGCGR" ou fragmentos dos mesmos, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à proteína de GCGR humano ou fragmento do mesmo, a menos que especificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo, "GCGR de camundongo", "GCGR de rato", ou "GCGR de macaco". Além disso, "GCGR," ou "hGCGR", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a GCGR humano tendo a sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 157 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma. Há uma variedade de sequências relacionadas com o gene de GCGR tendo os seguintes Números de Acesso no Genbank: NP_000151.1 (humana), NP_742089.1 (de rato), XP_001111894.1 (de macaco-rhesus), e NP_032127.2 (de camundongo). Outras sequências reveladas aqui, neste requerimento de patente, incluem GCGR humano (SEQ ID NO: 153), GCGR de camundongo (SEQ ID NO: 154), de macaco Cynomolgus (SEQ ID NO: 155), GCGR de rato (SEQ ID NO: 156). Em determinadas modalidades, proteínas de fusão úteis na invenção podem incluir a SEQ ID NO: 149 (hGCGR-hFc, resíduos 27-144 da NP_000151.1 fundidos à região Fc de IgG humana), a SEQ ID NO:150 (hGCGR-hFc, resíduos 27-144 da NP_000151.1 fundidos à região Fc de IgG humana), a SEQ ID NO:151 (hGCGR-mmH, resíduos 27-144 da NP_000151.1 fundidos a uma etiqueta myc-myc-his), e a SEQ ID NO:152 (MfGCGR-hFc, contendo a sequência N-terminal de Mf, macaco cynomolgus, a qual é idêntico aos resíduos 27-144 de GCGR do macaco-rhesus, Macaca mulatta, tendo número de acesso XP_001111894.1, e a qual é fundida à região Fc de IgG humana).
[0083] O termo "proproteína convertase subtilisina / quexina humana tipo 9" ou "hPCSK9", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a hPCSK9 codificada pela sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO:192 e tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:193, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma.
[0084] O termo "anticorpo", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende se referir a moléculas de imunoglobulina consistindo em quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por pontes de dissulfeto (isto é, "moléculas de anticorpo inteiras"), bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM) ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos. Cada cadeia pesada consiste de uma região variável de cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") e uma região constante de cadeia pesada (consistindo dos domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve consiste de uma região variável de cadeia leve ("LCVR ou "VL") e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjados a partir do término amino para o término carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em determinadas modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-GCGR (ou fragmento de ligação antigênica do mesmo) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana, ou podem ser modificadas naturalmente ou artificialmente. Uma sequência de consenso de aminoácido pode ser definida com base em uma análise lado a lado de dois ou mais CDRs.
[0085] Também é possível a substituição de um ou mais resíduos de CDR ou a omissão de um ou mais CDRs. Foram descritos na literatura científica anticorpos nos quais um ou dois CDRs podem ser dispensados para ligação. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analisaram as regiões de contato entre anticorpos e seus antígenos, com base em estruturas cristalinas publicadas, e concluíram que somente cerca de um quinto a um terço dos resíduos de CDR na verdade entram em contato com o antígeno. Padlan também descobriu muitos anticorpos nos quais um ou dois CDRs não tinham aminoácidos em contato com um antígeno (vide também, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
[0086] Resíduos de CDR não tendo contato com antígeno podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, os resíduos H60-H65 em CDRH2 frequentemente não são necessários), a partir de regiões de CDRs de Kabat situadas fora de CDRs de Chothia, por modelagem molecular e/ou empiricamente. Se um CDR ou um ou mais resíduos do mesmo forem omitidos, geralmente é substituído com um aminoácido ocupando a posição correspondente em outra sequência de anticorpo humano ou um consenso de sequências semelhantes. Posições para substituição dentro de CDRs e aminoácidos para substituir também podem ser selecionados empiricamente. As substituições empíricas podem ser substituições conservadoras ou não conservadoras.
[0087] Os anticorpos anti-GCGR totalmente humanos revelados aqui, neste requerimento de patente, podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas regiões de framework e/ou de CDR dos domínios variáveis de cadeias pesadas e leves comparadas com as sequências da linhagem germinativa correspondentes. As mutações referidas podem ser prontamente determinadas comparando as sequências de aminoácidos reveladas aqui, neste requerimento de patente, com sequências da linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, em bancos de dados públicos de sequências de anticorpos. A presente invenção inclui anticorpos, e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos, os quais são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos reveladas aqui, neste requerimento de patente, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de framework e/ou de CDR são mudados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou para uma substituição de aminoácido conservadora do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (as alterações de sequência citadas são referidas coletivamente aqui, neste requerimento de patente, como "mutações da linhagem germinativa"). Uma pessoa com conhecimento regular na técnica, iniciando com as sequências de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves reveladas aqui, neste requerimento de patente, pode facilmente produzir numerosos anticorpos e fragmentos de ligação antigênica os quais compreendem uma ou mais mutações individuais da linhagem germinativa ou combinações das mesmas. Em determinadas modalidades, todos os resíduos de framework e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mudados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, somente determinados resíduos são mudados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, somente os resíduos mudados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou somente os resíduos mudados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dos resíduos de framework e/ou de CDR são mudados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma diferente sequência da linhagem germinativa (isto é, uma sequência da linhagem germinativa que é diferente da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro das regiões de framework e/ou de CDR, por exemplo, em que determinados resíduos individuais são mudados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa em particular enquanto outros resíduos determinados que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mudados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, anticorpos e fragmentos de ligação antigênica que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas tais como, especificidade de ligação aprimorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas antagonistas ou agonistas aprimoradas ou reforçadas (conforme for o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação antigênica obtidos desta maneira geral são englobados dentro da presente invenção.
[0088] A presente invenção também inclui anticorpos anti- hGCGR compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR reveladas aqui, neste requerimento de patente, tendo uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-hGCGR tendo sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conservadoras relativas a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR reveladas aqui, neste requerimento de patente.
[0089] O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítioespecífica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nos CDRs e em particular CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, não pretende incluir mAbs nos quais sequências de CDR derivadas a partir da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo), tenham sido enxertadas sobre sequências de FR humanas. Os anticorpos anti-GCGR humano da invenção podem ser designados como "anti-hGCGR" ou "anti-GCGR".
[0090] O termo "liga especificamente," ou semelhante, significa que um anticorpo, ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de no mínimo cerca de 1x10-6 M ou menos (por exemplo, uma KD menor denota uma ligação mais firme). Métodos para determinar se duas moléculas ligam especificamente são de conhecimento geral na técnica e incluem, por exemplo, diálise de, Ressonância de Plasmon Superficial, e semelhantes. No entanto, um anticorpo isolado que liga especificamente hGCGR, pode apresentar reatividade cruzada com outros antígenos tais como moléculas de GCGR de outras espécies. Além disso, anticorpos multiespecíficos que ligam a hGCGR e um ou mais antígenos adicionais ou um biespecífico que liga a duas regiões diferentes de hGCGR são não obstante considerados anticorpos que "ligam especificamente" hGCGR, conforme usado aqui, neste requerimento de patente.
[0091] O termo anticorpo de "alta afinidade" se refere aos mAbs tendo uma afinidade de ligação a hGCGR, expressada como KD, de no mínimo 10-9 M; preferencialmente 10-10 M; mais preferencialmente 10-11 M, ainda mais preferencialmente 10-12 M, conforme medido por Ressonância de Plasmon Superficial, por exemplo, BIACORE™ ou ELISA de solução de afinidade.
[0092] Pelo termo "taxa de desaceleração", "Koff" ou "kd" se indica um anticorpo que dissocia de hGCGR com uma taxa constante de 1 x 10-3 s-1 ou menos, preferencialmente 1 x 10-4 s-1 ou menos, conforme determinado por Ressonância de Plasmon Superficial, por exemplo, BIACORE™.
[0093] Os termos "porção de ligação antigênica" de um anticorpo, "fragmento de ligação antigênica" de um anticorpo, e semelhantes, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína que ocorre naturalmente, obtenível enzimaticamente, sintético, ou produzido por engenharia genética que liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Os termos "porção de ligação antigênica" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de ligar especificamente a hGCGR.
[0094] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmentos de anticorpos da invenção podem ser conjugados a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como um segundo antagonista do GCGR, ou a biguanida (metformina), uma sulfonilureia (tais como gliburida, glipizida), um agonista do receptor PPAR gama (tais como pioglitazona, ou rosiglitazona), um inibidor da alfa glucosidase (tais como acarbose, ou voglibose), EXENATIDE® (peptídeo semelhante a glucagon 1), SYMLIN® (pranlintida), um agente quimioterápico, um radioisótopo, ou qualquer outra porção terapêutica útil para tratar uma doença ou condição provocada em parte por atividade de glucagon indesejada.
[0095] Um "anticorpo isolado", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos (Abs) tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente hGCGR, ou um fragmento do mesmo, é substancialmente livre de Abs que ligam especificamente antígenos diferentes de hGCGR).
[0096] Um "anticorpo de bloqueio" ou um "anticorpo neutralizante", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, (ou um "anticorpo que neutraliza a atividade de GCGR "), pretende se referir a um anticorpo cuja ligação a hGCGR resulta em inibição de no mínimo uma atividade biológica de GCGR. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode auxiliar na prevenção do aumento nos níveis de glicose sanguínea associados com elevação dos níveis de glucagon. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode demonstrar a capacidade de bloquear a produção de cAMP em resposta ao glucagon. Esta inibição da atividade biológica de GCGR pode ser avaliada medindo um ou mais indicadores de atividade biológica de GCGR por um ou mais dos vários testes de rotina in vitro ou in vivo conhecidos na técnica (vide exemplos abaixo).
[0097] O termo "Ressonância de Plasmon Superficial", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um fenômeno ótico que possibilita a análise de interações biomoleculares em tempo real por detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz biossensora, por exemplo usando o sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.).
[0098] O termo "KD", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende se referir à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno em particular.
[0099] O termo "epítopo" se refere a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação antigênica específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecido como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Deste modo, diferentes anticorpos podem ligar a diferentes áreas sobre um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. O termo "epítopo" também se refere a um sítio sobre um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Os epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Epítopos funcionais são de modo geral um subgrupo dos epítopos estruturais e têm os resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epítopos também podem ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não- lineares. Em determinadas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, grupamentos fosforila, ou grupamentos sulfonila, e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas.
[00100] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico," quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou seu filamento complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em no mínimo cerca de 90%, e mais preferencialmente no mínimo cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeo, conforme medido por qualquer algoritmo de identidade de sequência de conhecimento geral, tais como FASTA, BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico tendo identidade substancial com uma molécula de ácido nucleico de referência, em determinados casos, pode codificar um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos que ou substancialmente similar ao polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.
[00101] Conforme aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de gap default, compartilham no mínimo 90% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente no mínimo 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, posições de resíduos, os quais são não idênticos, diferem por substituições de aminoácidos conservadoras. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma na qual um resíduo aminoácido é substituído por outro resíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupamento R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas da outras por substituições conservadoras, a percentagem ou grau de similaridade pode ser ajustada para cima para corrigir para a natureza conservadora da substituição. Meios para fazer este ajuste são de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica. Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas- hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais acidíferas: aspartato e glutamato, e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituições de aminoácidos conservadoras preferenciais são: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer alteração tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 revelada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Uma substituição "moderadamente conservadora" é qualquer alteração tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250.
[00102] A similaridade de sequência para polipeptídeos é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteína combina sequências similares usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservadoras. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como GAP e BESTFIT os quais podem ser usados com parâmetros default para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferente espécies de organismos ou entre uma proteína selvagem e uma muteína da mesma. Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros default ou recomendados; um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de query e search (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial ao comparar uma sequência da invenção com um banco de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computação BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros default. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 e (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.
[00103] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso no método da invenção pode ser monoespecífico, biespecífico, ou multiespecífico. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação antigênica específicos para epítopos de mais de um polipeptídeo alvo. Um exemplo de formato de anticorpo biespecífico que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 de Ig, em que o primeiro e o segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro por no mínimo um aminoácido, e em que no mínimo uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A comparado com um anticorpo biespecífico carecendo da diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig liga Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole a ligação a Proteína A tal como uma modificação H95R (por numeração de éxon do IMGT; H435R por numeração EU). O segundo CH3 pode compreender adicionalmente uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I por EU) no caso de mAbs de IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de mAbs de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de mAbs de IgG4. Variações sobre o formato de anticorpo biespecífico descrito acima são contempladas dentro do âmbito da presente invenção.
[00104] Pela expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" se indica uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual é administrado. A quantidade exata vai depender da finalidade do tratamento, e será determinada por um uma pessoa versada na técnica usando técnicas conhecidas (vide, por exemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
[00105] "Níveis normais de glicose" se refere a valores médios de glicose plasmática em humanos de menos de cerca de 80 mg/dL para níveis em jejum, e cerca de menos de 110 a 120 mg/dL para níveis pós-prandiais. A glicose plasmática pode ser determinada de acordo com Etgen et al., (Metabolism 2000; 49(5): 684-688) ou calculada a partir de uma conversão da concentração da glicose sanguínea total de acordo com D'Orazio et al., (Clin. Chem. Lab. Med. 2006; 44(12): 1486-1490). "Normalização do colesterol" ou "níveis normais de colesterol" se refere a um nível de colesterol total em um humano de cerca de menos de 200 mg/dL, com uma faixa de cerca de 200 a 240 mg/dL considerada níveis limítrofes elevados. A partir do colesterol normal total, um valor do LDL médio em humanos de cerca de 100 até cerca de 129 mg/dL é considerado normal e um valor do HDL acima de 45 mg/dL é considerado normal. O nível normal de triglicerídeos em humanos é menos de 150 mg/dL. A proporção normal de colesterol total / HDL é abaixo de 4,5, e a proporção normal de LDL / HDL é menos de 3. Estes valores podem ser determinados de acordo com a prática laboratorial de rotina (vide também, Friedewald, WT, Clin. Chem (1972), 18:499-502; Chen, Y. et al. Lipids Health Dis. (2010); 9:52; Keevil, JG, et al., Circulation (2007), 115:1363-1370; e Bairaktari, E. et al., Clin. Biochem. (2000), 33:549-555). Em determinadas modalidades da invenção, os anticorpos anti-GCGR podem ser úteis para reduzir os níveis de glicose sanguínea para dentro da faixa normal. Em determinadas modalidades da invenção, os anticorpos anti-GCGR podem ser úteis para aumentar o nível do colesterol HDL. Em determinadas modalidades da invenção, os anticorpos anti-GCGR podem ser úteis para reduzir o nível de triglicerídeos Descrição Geral
[00106] Como o glucagon exerce seus efeitos fisiológicos por sinalização através do receptor de glucagon, o receptor de glucagon pode ser um alvo terapêutico potencial para diabetes e outros transtornos metabólicos relacionados com o glucagon. O uso de antagonistas de receptores de glucagon, tais como os anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente, pode ser um meio eficaz para atingir níveis normais de glicose, deste modo melhorando, ou prevenindo um ou mais sintomas ou complicações de longo termo associadas com o diabetes. Os anticorpos da presente invenção também podem ser úteis para melhorar condições associadas com, por exemplo, tolerância à glicose diminuída, para tratar obesidade, para prevenir o ganho de peso, para tratar a síndrome metabólica, ou para tratar condições diabéticas, incluindo cetoacidose diabética, ou para prevenir e/ou reduzir o risco de desenvolver qualquer uma ou mais das complicações associadas com o diabetes, tais como nefropatia, neuropatia, retinopatia, catarata, derrame, aterosclerose, dificuldade de cicatrização de feridas e outras complicações associadas com o diabetes, conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00107] O uso dos anticorpos anti-hGCGR, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, também pode ser útil para tratar outras condições, incluindo hiperglicemia, síndrome hiperosmolar hiperglicêmica (Stoner, G.D., American Family Physician, (2005), 71(9): 1723-1730; Diabetes Spectrum, Umpierrez, G.E., (2002), 15(1):28-36; Nugent, B.W., Emergency Medicine Clinics of North America, (2005), 23:629-648), hiperglicemia no perioperatório (Frisch, A. et al. Diabetes Care, (2010), 33(8):1783-1788; Hanazaki, K. et al. World J Gastroenterol, (2009), 15(33): 4122-4125; Smiley, D.D. et al. Southern Medical Journal, (2006), 99(6):580-589; Hermanides, J. et al., The Netherlands J. of Med. 67(6):226-229; Maerz, L.L. et al., Current Opinion in Critical Care, (2011), 17:370-375), hiperglicemia em pacientes de unidade de tratamento intensivo (Gunst, J. et al. , Seminars in Dialysis, (2010), 23(2):157-162; Losser, M-R., Critical care, (2010), 14:231), hiperinsulinemia, e síndrome de resistência à insulina e glucagonoma (tumor endócrino pancreático com ou sem eritema migratório necrolítico e hiperglicemia) (Vide por exemplo, Boden, G. et al. , N Engl J Med (1986); 314:1686-1689).
[00108] Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção foram obtidos a partir de camundongos imunizados com um imunogênico primário, seguido por imunização com um imunogênico secundário. O imunogênico pode ser uma linhagem celular expressando a proteína de GCGR, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, ou DNA codificando a proteína de GCGR ou fragmento ativo da mesma, ou a proteína de GCGR ou fragmento ativo da mesma. Por exemplo, em determinadas modalidades, o imunogênico primário pode ser uma linhagem celular manipulada usando procedimentos de rotina conhecidos na técnica para superexpressar hGCGR de extensão total (por exemplo, a linhagem celular MG87 de camundongo). Alternativamente, pode ser realizada imunização por DNA usando DNA codificando hGCGR de extensão total (por exemplo, constructos de hGCGR derivados de número de acesso NP_000151.1), ou DNA codificando um fragmento biologicamente ativo dos mesmos, por exemplo, DNA codificando o domínio N-terminal de GCGR (vide, por exemplo, a SEQ ID NO: 158, a qual codifica a SEQ ID NO: 159), ou uma proteína N-terminal solúvel, incluindo a de SEQ ID NO: 159, ou os aminoácidos abrangendo os resíduos 27-144 da SEQ ID NO: 153. O imunogênico secundário pode ser uma proteína de GCGR, ou fragmento biologicamente ativo da mesma, ou uma proteína de fusão, tal como hGCGR-mmH (REGN547, SEQ ID NO: 151) ou hGCGR-hFc (REGN315, SEQ ID NO: 150; REGN316, SEQ ID NO: 149).
[00109] Em determinadas modalidades da presente invenção, o domínio N-terminal, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 159 (sem a sequência sinal), ou qualquer um ou mais dos ectodomínios de GCGR, por exemplo, qualquer uma ou mais das regiões extracelulares (ou fragmentos das mesmas) pode ser usado para preparar anticorpos que ligam GCGR e inibir sua função, por exemplo, sua capacidade para ligar glucagon, o que resultaria em redução dos níveis de glicose sanguínea.
[00110] A sequência de aminoácidos de GCGR humano de extensão total é mostrada como SEQ ID NO: 153. O peptídeo sinal abrange os resíduos aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 153; o domínio N-terminal abrange os resíduos 27-144 de SEQ ID NO: 153; a região extracelular 1 (EC1) abrange os resíduos aminoácidos 194-226 de SEQ ID NO: 153; a região extracelular 2 (EC2) abrange os resíduos aminoácidos 285-305 de SEQ ID NO: 153; e a região extracelular 3 (EC3) abrange os resíduos aminoácidos 369-384 de SEQ ID NO:153.
[00111] Em determinadas modalidades, anticorpos que ligam especificamente a GCGR podem ser preparados usando fragmentos das regiões extracelulares mencionadas acima, ou peptídeos que se estendem além das regiões designadas por cerca de 5 a cerca de 20 resíduos aminoácidos de qualquer uma, ou ambas, as extremidades de N ou C terminal das regiões descritas aqui, neste requerimento de patente. Em determinadas modalidades, pode ser usada qualquer combinação das regiões mencionadas acima ou fragmentos das mesmas na preparação de anticorpos específicos contra GCGR. Em determinadas modalidades, qualquer uma ou mais das regiões de GCGR mencionadas acima, ou fragmentos das mesmas podem ser usadas para preparar anticorpos monoespecíficos, biespecíficos, ou multiespecíficos. Fragmentos de Anticorpos de Ligação Antigênica
[00112] A menos que especificamente indicado de modo diverso, o termo "anticorpo," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, será entendido como englobando moléculas de anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, "moléculas de anticorpo completas") bem como fragmentos de ligação antigênica das mesmas. Os termos "porção de ligação antigênica" de um anticorpo, "fragmento de ligação antigênica" de um anticorpo, e semelhantes, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína que ocorre naturalmente, obtenível enzimaticamente, sintético, ou produzido por engenharia genética que liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Os termos "porção de ligação antigênica" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de ligar especificamente a hGCGR. Um fragmento de anticorpo pode incluir um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento dAb, um fragmento contendo uma CDR, ou uma CDR isolada. Fragmentos de ligação antigênica de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpos inteiras usando quaisquer técnicas de rotina adequadas tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e a expressão de DNA codificando domínios variáveis e (opcionalmente) constantes de anticorpos. O DNA referido é conhecido e/ou está prontamente disponível, por exemplo, a partir de fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fagos-anticorpos), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para arranjar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[00113] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação antigênica incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia única (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) b unidades de reconhecimento mínimas consistindo dos resíduos aminoácidos que simulam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) tais como um peptídeo de CDR3), ou um peptídeo limitado FR3-CDR3-FR4. Outras moléculas manipuladas, tais como anticorpos domínio-específicos, anticorpos de único domínio, anticorpos de domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, , diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofármacos modulares pequenos (SMIPs), e domínios IgNAR variáveis de tubarão, também são englobados dentro da expressão "fragmento de ligação antigênica," conforme usado aqui, neste requerimento de patente.
[00114] Um fragmento de ligação antigênica de um anticorpo tipicamente compreenderá no mínimo um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e de modo geral compreenderá no mínimo um CDR, o qual é adjacente a ou in frame com uma ou mais sequências de framework. Em fragmentos de ligação antigênica tendo um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem ser situados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação antigênica de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[00115] Em determinadas modalidades, um fragmento de ligação antigênica de um anticorpo pode conter no mínimo um domínio variável ligado de modo covalente a no mínimo um domínio constante. Exemplos não limitantes de configurações de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação antigênica de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2- CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL - CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; e (xiv) VL -CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer um dos exemplos de configurações listados acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ou ligados diretamente um ao outro ou podem ser ligados por uma região encadeadora ou de articulação total ou parcial. Uma região de articulação pode consistir de no mínimo 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, os quais resultam em uma ligação flexível ou semi- flexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação antigênica de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínios variáveis e constantes listadas acima em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por uma ou mais ligações de dissulfeto).
[00116] Conforme com moléculas de anticorpo completas, fragmentos de ligação antigênica podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação antigênica multiespecífico de um anticorpo tipicamente compreenderá no mínimo dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente sobre o mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos revelados aqui, neste requerimento de patente, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação antigênica de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis na técnica. Preparação de Anticorpos Humanos
[00117] São conhecidos na técnica métodos para a produção de anticorpos humanos em camundongos transgênicos. Pode ser usado qualquer um dos métodos referidos no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que ligam especificamente ao GCGR humano.
[00118] Usando a tecnologia VELOCIMMUNE™ (vide, por exemplo, a patente dos Estados Unidos No. US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer outro método conhecido para produzir anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para GCGR são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a produção de um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeias pesadas e leves humanas encadeadas operavelmente a loci endógenos de região constante de camundongo de tal modo que o camundongo produz um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta a estimulação antigênica. O DNA codificando as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo são isolados e encadeados operavelmente a DNA codificando as regiões constantes de cadeias pesadas e leves humanas. O DNA é em seguida expressado em uma célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano.
[00119] De modo geral, um camundongo VELOCIMMUNE® é estimulado com o antígeno de interesse, e células linfáticas (tais como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares imortais de hibridoma, e as linhagens celulares de hibridoma referidas são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específico para o antígeno de interesse. DNA codificando as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser isolados e ligados às regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. Uma proteína de anticorpo semelhante pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, DNA codificando os anticorpos quiméricos antígeno-específicos ou os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas podem ser isolados diretamente a partir dos linfóticos antígeno-específicos.
[00120] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Conforme na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano da invenção, por exemplo IgG1 ou IgG4 selvagem ou modificada. Apesar da região constante selecionada poder variar de acordo com o uso específico, as características de ligação antigênica de alta afinidade e de especificidade alvo estão situadas na região variável.
[00121] Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem afinidades muito elevadas, tipicamente possuindo KD de a partir de cerca de 10-12 até cerca de 10-9 M, quando medidas por ligação a antígeno quer imobilizado sobre fase sólida ou em fase de solução. As regiões constantes de camundongo são substituídas com regiões constantes humanas desejadas para gerar os anticorpos totalmente humanos da invenção. Apesar da região constante selecionada poder variar de acordo com o uso específico, as características de ligação antigênica de alta afinidade e de especificidade alvo estão situadas na região variável. Bioequivalentes
[00122] Os anticorpos anti-GCGR e fragmentos de anticorpos da presente invenção englobam proteínas tendo sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que conservam a capacidade para ligar GCGR humano. Os anticorpos variantes e fragmentos de anticorpos referidos compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de aminoácidos quando comparados com a sequência de origem, mas apresentam atividade biológica que é essencialmente equivalente à atividade biológica dos anticorpos descritos. Do mesmo modo, as sequências de DNA codificando anticorpos anti-GCGR da presente invenção englobam sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de nucleotídeos quando comparadas com a sequência revelada, mas que codificam um anticorpo anti-GCGR ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti- GCGR ou fragmento de anticorpo da invenção.
[00123] Duas proteínas de ligação antigênica, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não apresentam uma diferença significativa quando administrada na mesma dose molar sob condições experimentais similares, ou dose única ou dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas ser forem equivalentes na extensão de sua absorção mas não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque as diferenças na taxa de absorção referidas são intencional e são refletidas na etiquetação, não são essenciais para a obtenção de concentrações corporais eficazes de fármaco, por exemplo, em uso crônico, e são consideradas medicinalmente insignificantes para o produto de fármaco em particular estudado.
[00124] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação antigênica são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente importantes em sua segurança, pureza, e potência.
[00125] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação antigênica são bioequivalentes se um paciente puder ser trocado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma alteração clinicamente significativa na imunogenicidade, ou diminuição da eficácia, em comparação com terapia contínua sem a troca referida.
[00126] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação antigênica são bioequivalentes se as duas agirem sobre um mecanismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, na medida que os mecanismos referidos são conhecidos.
[00127] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e/ou in vitro. Medidas da bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, no qual a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida no sangue, no plasma, no soro, ou em outro fluido biológico como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que tenha sido correlacionado com e seja razoavelmente preditivo de dados da biodisponibilidade in vivo em humanos; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos no qual o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) em um estudo clínico bem controlado que estabelece a segurança, a eficácia, ou a biodisponibilidade ou a bioequivalência de um anticorpo.
[00128] Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-GCGR da invenção podem ser construídas, por exemplo, fazendo várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando resíduos ou sequências terminais ou internos não necessários para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir a formação de pontes de dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas depois de renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpos anti-GCGR compreendendo alterações de aminoácidos, as quais modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações as quais eliminam ou removem a glicosilação. Características Biológicas dos Anticorpos
[00129] Em geral, os anticorpos da presente invenção podem funcionar ligando a no mínimo uma das regiões extracelulares de hGCGR. Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ligar a um epítopo localizado em no mínimo a região N-terminal, ou a um epítopo localizado em no mínimo um dos loops extracelulares (EC) de hGCGR.
[00130] Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem funcionar bloqueando ou inibindo a atividade de GCGR por ligação à região extracelular N-terminal, cuja sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 159, e a qual é codificada pela sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 158.
[00131] Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem funcionar bloqueando ou inibindo a atividade de GCGR por ligação a no mínimo um dos loops EC ou segmentos de loop dentro do receptor inteiro. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ligar a um epítopo localizado em EC1, o qual está localizado entre aproximadamente o resíduo aminoácido194 até aproximadamente o resíduo aminoácido 226 de SEQ ID NO: 153. Alternativamente, ou adicionalmente, os anticorpos da invenção podem ligar a um epítopo encontrado em EC2, o qual está localizado entre aproximadamente o resíduo aminoácido 285 até aproximadamente o resíduo aminoácido 302 de SEQ ID NO: 153. Alternativamente, ou adicionalmente, os anticorpos da invenção podem ligar a um epítopo encontrado em EC3, o qual está localizado entre aproximadamente o resíduo aminoácido 369 até aproximadamente o resíduo aminoácido 384 de SEQ ID NO: 153.
[00132] Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos da invenção podem ligar um epítopo em EC1 e podem também ligar um epítopo em uma região de hGCGR diferente de EC1. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ligar um epítopo em EC1 e podem também ligar um epítopo em EC2 ou EC3, ou na região N-terminal, ou em qualquer outra região dentro de EC1, EC2, ou EC3 de hGCGR, ou qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ligara dois sítios diferentes dentro da mesma região extracelular.
[00133] Mais especificamente, os anticorpos anti-GCGR da invenção podem apresentar uma ou mais das características que se seguem: (1) capacidade para ligar a uma GCGR humano ou um fragmento do mesmo e a um GCGR não humano (por exemplo, de camundongo, macaco, rato, coelho, cão, porco, etc.) ou fragmento do mesmo; (2) capacidade para ligar a um GCGR humano ou fragmento do mesmo, mas não a um GCGR não humano (por exemplo, de camundongo, macaco, rato, coelho, cão, porco, etc.) ou fragmento do mesmo; (3) capacidade para ligar a um GCGR humano ou fragmento do mesmo e a um GCGR de primata não humano (por exemplo, macaco) ou fragmento do mesmo, mas não a um GCGR ou fragmento de GCGR de camundongo, rato, coelho, cão ou porco; (4) capacidade para ligar a um GCGR humano ou fragmento do mesmo e a um GCGR de primata não humano (por exemplo, macaco) ou um fragmento do mesmo, e a um GCGR de camundongo ou um fragmento do mesmo, mas não a um GCGR de rato; (5) capacidade para ligar a um GCGR humano ou fragmento do mesmo e a um GCGR de primata não humano (por exemplo, macaco) ou um fragmento do mesmo, e a um GCGR de rato ou um fragmento do mesmo, ,as não a um GCGR de camundongo; 6) bloqueia a ligação de glucagon a GCGR; 7) bloqueia a produção de cAMP induzida por glucagon; 8) demonstra a capacidade para reduzir os níveis de glicose sanguínea em humanos sofrendo de diabetes e em modelos animais de diabetes; 9) pode ou pode não reduzir os níveis de triglicerídeos para os níveis observados em mamíferos normais; ou 10) não afeta adversamente os níveis plasmáticos de lipídeos.
[00134] Determinados anticorpos anti-GCGR da presente invenção são capazes de inibir ou atenuar a atividade de GCGR em um teste in vitro ou in vivo. A capacidade dos anticorpos da invenção para ligar ao e inibir a ligação de glucagon ao GCGR pode ser medida usando qualquer método de rotina conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo testes de ligação, bioensaios repórter, tais como um ensaio repórter de luciferase.
[00135] Exemplos não limitantes de testes in vitro para medir a atividade de GCGR são ilustrados nos Exemplos 4 e 5, aqui, neste requerimento de patente. No Exemplo 4, as afinidades de ligação e as constantes cinéticas de anticorpos humanos anti-hGCGR foram determinadas por Ressonância de Plasmon Superficial e as medições foram conduzidas em um instrumento T100 Biacore. No Exemplo 5, foi desenvolvido um bioensaio em linhagens celulares de HEK293 expressando GCGR de extensão total humano, de macaco e de camundongo junto com uma luciferase repórter de modo a detectar a ativação através de Gas, e subsequente elevação dos níveis de cAMP e ativação transcricional. Os Exemplos 6, 7, 8, 9 e 10 demonstram os efeitos in vivo dos anticorpos sobre a redução dos níveis de glicose sanguínea, dos níveis de cetona sanguínea, e sobre a perda de peso, em vários modelos animais.
[00136] A presente invenção também inclui anticorpos anti-GCGR e fragmentos de ligação antigênica dos mesmos os quais ligam a no mínimo um fragmento biologicamente ativo de qualquer uma das seguintes proteínas, ou peptídeos: SEQ ID NO: 153 (hGCGR de extensão total), resíduos números 27-144 de SEQ ID NO: 153 (domínio N-terminal de hGCGR); resíduos 194-226 de SEQ ID NO: 153; resíduos 285-305 de SEQ ID NO: 153; resíduos 369-384 de SEQ ID NO: 153. Qualquer um dos peptídeos de GCGR descritos aqui, neste requerimento de patente, ou fragmentos dos mesmos, pode ser usado para gerar anticorpos anti-GCGR.
[00137] Os peptídeos podem ser modificados para incluir adição ou substituição de determinados resíduos para etiquetação ou para os fins de conjugação a moléculas de suporte, tais como, KLH. Por exemplo, uma cisteína pode ser adicionada quer à extremidade N terminal ou C terminal de um peptídeo, ou uma sequência encadeadora pode ser adicionada para preparar o peptídeo para conjugação a, por exemplo, KLH para imunização. Os anticorpos específico para GCGR podem não conter etiquetas ou porções adicionais, ou podem conter uma etiqueta ou porção N-terminal ou C- terminal. Em uma modalidade, a etiqueta ou porção é biotina. Em um teste de ligação, a localização de uma etiqueta (se houver) pode determinar a orientação do peptídeo em relação à superfície sobre a qual o peptídeo é ligado. Por exemplo, se uma superfície for revestida com avidina, um peptídeo contendo uma biotina N-terminal será orientado de tal modo que a porção C-terminal do peptídeo estará distal à superfície.
[00138] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal totalmente humano ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especificamente hGCGR e neutraliza a atividade do hGCGR, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo apresenta uma ou mais das características que se seguem: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130, e 146; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, e 148; (iii) compreende qualquer uma ou mais das sequências de CDR1 de cadeia pesada selecionadas entre o grupo consistindo em 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 e 132; qualquer uma ou mais das sequências de CDR2 de cadeia pesada selecionadas entre o grupo consistindo em 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 e 134; qualquer uma ou mais das sequências de CDR3 de cadeia pesada selecionadas entre o grupo consistindo em 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 e 136; qualquer uma ou mais das sequências de CDR1 de cadeia leve selecionadas entre o grupo consistindo em 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 e 140; qualquer uma ou mais das sequências de CDR2 de cadeia leve selecionadas entre o grupo consistindo em 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 e 142; qualquer uma ou mais das sequências de CDR3 de cadeia leve selecionadas entre o grupo consistindo em 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 e 144; e combinações das mesmas; (iv) demonstra especificidade de ligação para qualquer um ou mais dos seguintes: a região N-terminal do GCGR compreendendo os resíduos aminoácidos 27-144 de SEQ ID NO: 153, ou para qualquer um ou mais dos loops extracelulares de GCGR, incluindo, por exemplo, EC1, EC2, ou EC3, em que EC1 compreende resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo 194 até aproximadamente o resíduo 226 de SEQ ID NO: 153, e em que EC2 compreende resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo 285 até aproximadamente o resíduo 305 de SEQ ID NO: 153; e em que EC3 compreende resíduos aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo 369 até aproximadamente o resíduo 384 de SEQ ID NO: 153; (v) liga qualquer um ou mais de GCGR humano, de macaco, de camundongo ou de rato; (vi) bloqueia a ligação de glucagon ao GCGR; vi) bloqueia a produção de cAMP induzida por glucagon; vii) demonstra a capacidade de reduzir os níveis de glicose sanguínea ou os níveis de cetona sanguínea em humanos sofrendo de diabetes ou em modelos animais de diabetes; viii) pode ou pode não reduzir os níveis de triglicerídeos para os níveis observados em mamíferos normais; ou ix) não afeta adversamente os níveis plasmáticos de lipídeos.
Mapeamento de Epítopos e Tecnologias Relaconadas
[00139] Para triagem para anticorpos que ligam a um epítopo em particular, pode ser realizado um teste de bloqueio cruzado de rotina tal como o descrito Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Outros métodos incluem mutantes de varredura de alanina, Blots peptídicos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), ou análise de clivagem de peptídeo. Além disso, podem ser empregados métodos tais como excisão de epítopos , extração de epítopos e modificação química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
[00140] O termo "epítopo" se refere a um sítio sobre um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Epítopos de células B podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou de aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes desnaturantes, ao passo que epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui no mínimo 3, e mais geralmente, no mínimo 5 ou 8 a 10 aminoácidos em uma única conformação espacial.
[00141] Modification-Assisted Profiling (MAP), também conhecido como Antigen Structure-based Antibody Profiling (ASAP) é um método que categoriza grandes números de anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados contra o mesmo antígeno de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo a superfícies antigênicas modificadas quimicamente ou enzimaticamente (Vide a patente dos Estados Unidos No. US 2004/0101920). Cada categoria pode refletir um único epítopo quer distintamente diferente de ou se sobrepondo parcialmente com epítopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite a rápida filtragem de anticorpos geneticamente idênticos, de tal modo que a caracterização pode ser focalizada sobre anticorpos geneticamente distintos. Quando aplicada a triagem de hibridoma, MAP pode facilitar a identificação de raros clones de hibridoma que produzem mAbs tendo as características desejadas. MAP pode ser usado para classificar os anticorpos anti- GCGR da invenção em grupos de anticorpos ligando diferentes epítopos .
[00142] Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-GCGR ou fragmento de ligação antigênica de um anticorpo liga um epítopo dentro de no mínimo uma das regiões extracelulares de GCGR, ou a um fragmento do mesmo, em que a região extracelular é o domínio N- terminal, ou um dos loops EC, incluindo EC1, EC2, ou EC3, conforme descrito previamente.
[00143] Em uma modalidade, o anticorpo liga um epítopo dentro da região N-terminal do GCGR, ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido 27-144 de SEQ ID NO: 153. Em uma modalidade, o anticorpo liga um epítopo dentro de EC1, ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido 194-226 de SEQ ID NO: 153. Em uma modalidade, o anticorpo liga um epítopo dentro de EC2, ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácidos variando a partir do resíduo aminoácido 285-305 de SEQ ID NO: 153. Em uma modalidade, o anticorpo liga um epítopo dentro de EC3, ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácidos variando a partir de aproximadamente o resíduo aminoácido 369-384 de SEQ ID NO: 153.
[00144] Em determinadas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga um epítopo o qual inclui mais de um dos epítopos de GCGR enumerados dentro do domínio N-terminal, ou dentro de EC1, EC2, ou EC3, e/ou dentro de duas ou três diferente regiões extracelulares (por exemplo, epítopos dentro da região N-terminal, loops EC1, EC2 e EC3, ou dentro de EC1, EC2, e EC3, ou dentro da região N-terminal, loops EC2 e EC3, ou dentro da região N-terminal, loops EC1 e EC3.
[00145] Em determinadas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo dentro de uma região extracelular de GCGR e outro epítopo dentro de uma diferente região extracelular de GCGR, incluindo o domínio N-terminal, ou EC1, EC2, ou EC3.
[00146] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo na região N-terminal de hGCGR e outro epítopo em EC1 de hGCGR. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo na região N-terminal de hGCGR e outro epítopo em EC1 de hGCGR. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo na região N- terminal de hGCGR e outro epítopo em EC2 de hGCGR. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo na região N-terminal de hGCGR e outro epítopo em EC3 de hGCGR. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo em EC1 de hGCGR e outro epítopo em EC2 de hGCGR. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo em EC1 de hGCGR e outro epítopo em EC3 de hGCGR. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo em EC2 de hGCGR e outro epítopo em EC3 de hGCGR.
[00147] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo no domínio N terminal de hGCGR, em que o um epítopo varia a partir de aproximadamente o resíduo 27 até aproximadamente o resíduo 144 de SEQ ID NO: 153 e um segundo epítopo em EC1 de hGCGR, em que o segundo epítopo varia a partir de aproximadamente o resíduo número 194 até aproximadamente o resíduo número 226 de SEQ ID NO: 153. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo no domínio N terminal de hGCGR dentro dos resíduos mencionados acima, e um segundo epítopo em EC2 de hGCGR, em que o segundo epítopo varia a partir de aproximadamente o resíduo número 285 até aproximadamente o resíduo número 305 de SEQ ID NO:153. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo no domínio N terminal de hGCGR dentro dos resíduos mencionados acima, e um segundo epítopo em EC3 de hGCGR, em que o segundo epítopo varia a partir de aproximadamente o resíduo número 369 até aproximadamente o resíduo número 384 de SEQ ID NO: 153.
[00148] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo em EC1 de hGCGR a partir de aproximadamente o resíduo 194 até aproximadamente o resíduo 226 de SEQ ID NO: 153 e um segundo epítopo em EC2 de GCGR a partir de aproximadamente o resíduo 285 até aproximadamente o resíduo 305 de SEQ ID NO: 153. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo em EC1 a partir de aproximadamente o resíduo 194 até aproximadamente o resíduo 226 de SEQ ID NO: 153 e um segundo epítopo em EC3 de GCGR a partir de aproximadamente o resíduo 369 até aproximadamente o resíduo 384 de SEQ ID NO:153. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que liga um epítopo em EC2 a partir de aproximadamente o resíduo 285 até aproximadamente o resíduo 305 de SEQ ID NO:153 e um segundo epítopo em EC3 de GCGR a partir de aproximadamente o resíduo 369 até aproximadamente o resíduo 384 de SEQ ID NO:153.
[00149] A presente invenção inclui anticorpos anti-GCGR que ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos exemplos de anticorpos específicos descritos aqui, neste requerimento de patente, (por exemplo, H4H1345N, H4H1617N, H4H1765N, H4H1321B e H4H1321P, H4H1327B e H4H1327P, H4H1328B e H4H1328P, H4H1331B e H4H1331P, H4H1339B e H4H1339P). Do mesmo modo, a presente invenção também inclui anticorpos anti-GCGR que competem para ligação a GCGR ou um fragmento de GCGR com qualquer um dos exemplos de anticorpos específicos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00150] Pode-se facilmente determinar se um anticorpo liga ao mesmo epítopo que, ou compete para ligação com, um anticorpo anti- GCGR de referência usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-GCGR de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado para ligar a uma proteína de GCGR ou peptídeo sob condições de saturação. Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste para ligar à molécula de GCGR é avaliada. Se o anticorpo de teste for capaz de ligar a GCGR depois de ligação de saturação com o anticorpo anti-GCGR de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste liga a um epítopo diferente do anticorpo anti-GCGR de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de ligar à molécula de GCGR depois de ligação de saturação com o anticorpo anti-GCGR de referência, então o anticorpo de teste pode ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti- GCGR de referência da invenção.
[00151] Para determinar se um anticorpo compete para ligação com um anticorpo anti-GCGR de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado para ligar a uma molécula de GCGR sob condições de saturação seguido por avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula de GCGR. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado para ligar a uma molécula de GCGR sob condições de saturação seguido por avaliação da ligação do anticorpo de referência à molécula de GCGR. Se, em ambas as orientações, somente o primeiro anticorpo (condições de saturação) for capaz de ligar à molécula de GCGR, então se concluiu que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem para ligação a GCGR. Conforme será reconhecido por uma pessoa com conhecimento regular na técnica, um anticorpo que compete para ligação com um anticorpo de referência pode não ligar necessariamente ao idêntico epítopo que o anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência por ligação de um epítopo de sobreposição ou adjacente.
[00152] Dois anticorpos ligam ao mesmo epítopo ou sobrepõem epítopos de cada um inibir (bloquear) competitivamente a ligação do outro ao antígeno. Isto é, um excesso de 1 vez, de 5 vezes, de 10 vezes, de 20 vezes ou de 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro por no mínimo 50% mas preferencialmente por 75%, 90% ou mesmo 99% conforme medido em um teste de ligação competitiva (vide, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos sobrepõem epítopos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
[00153] Experimentação de rotina adicional (por exemplo, análises de mutação e ligação de peptídeo) podem ser então realizadas para confirmar se a falta de ligação do anticorpo de teste observada é de fato devida a ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Ressonância de Plasmon Superficial, citometria de fluxo ou qualquer outro teste quantitativo ou qualitativo de ligação de anticorpo disponível na técnica. Seletividade de Espécies e Reatividade Cruzada entre Espécies
[00154] De acordo com determinadas modalidades da invenção, os anticorpos anti-GCGR ligam a GCGR humano, mas não a GCGR de outras espécies. Alternativamente, os anticorpos anti-GCGR da invenção, em determinadas modalidades, ligam a GCGR humano e a GCGR de uma ou mais espécies não humananão humanas. Por exemplo, os anticorpos anti-GCGR da invenção podem ligar a GCGR humano e pode ligar ou não ligar, conforme for o caso, a um ou mais de GCGR de camundongo, rato, porquinho da índia, hamster, gerbil, porco, gato, cachorro, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, macaco cynomolgus, sagui, macaco-rhesus ou chimpanzé. Imunoconjugados
[00155] A invenção engloba um anticorpo anti-GCGR monoclonal humano conjugado a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como um agente que é capaz de reduzir os níveis de glicose sanguínea, ou um radioisótipo, ou um agente quimioterápico. O tipo de porção terapêutica que pode ser conjugada ao anticorpo anti-GCGR levará em conta a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser obtido. Por exemplo, para tratar diabetes, ou qualquer outra condição por meio da qual é desejável reduzir a glicose sanguínea, e/ou manter níveis normais de glicose sanguínea, um agente tal como biguanida (por exemplo, metformina), uma sulfonilureia (por exemplo, gliburida, glipizida), um agonista do receptor PPAR gama (por exemplo, pioglitazona, rosiglitazona); um inibidor da alfa glucosidase (por exemplo, acarbose, voglibose), um inibidor da formação de produto final da glicação avançada (por exemplo, aminoguanidina), ou um segundo inibidor de GCGR pode ser conjugado ao anticorpo contra GCGR. Alternativamente, se o efeito terapêutico desejado for tratar as sequelas ou os sintomas associados com diabetes, ou qualquer outra condição resultante de níveis de glicose sanguínea elevados, ou descontrolados, pode ser vantajoso conjugar um agente apropriado para tratar as sequelas ou os sintomas da condição Exemplos de agentes adequados para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, a publicação de patente internacional No. WO 05/103081.
Anticorpos Multiespecíficos
[00156] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação antigênica específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Vide, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-GCGR da presente invenção podem ser ligados a ou co-expressados com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais entidades moleculares diversas, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina é específico para GCGR humano ou um fragmento do mesmo, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo alvo terapêutico ou é conjugado a uma porção terapêutica. Em determinadas modalidades da invenção, um braço de uma imunoglobulina é específico para um epítopo sobre o domínio N- terminal de hGCGR ou um fragmento do mesmo, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um epítopo sobre um dos loops EC de hGCGR, ou um fragmento do mesmo. Em determinadas modalidades, um braço de uma imunoglobulina é específico para um loop EC, ou um fragmento do mesmo, e o segundo braço é específico para um segundo loop EC, ou um fragmento do mesmo. Em determinadas modalidades, um braço de uma imunoglobulina é específico para um epítopo sobre um loop EC de hGCGR e o outro braço é específico para um segundo epítopo sobre o mesmo loop EC de hGCGR.
[00157] Um exemplo de formato de anticorpo biespecífico que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 de Ig, em que o primeiro e o segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro por no mínimo um aminoácido, e em que no mínimo uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico a Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico carecendo da diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig liga Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole a ligação de Proteína A tal como uma modificação H95R (por numeração de éxon do IMGT; H435R por numeração EU numbering). O segundo CH3 pode compreender adicionalmente uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG1; N44S, K52N, e V82I (por IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de anticorpos de IgG4. Variações sobre o formato de anticorpo biespecífico descrito acima são contempladas dentro do âmbito da presente invenção.
Administração Terapêutica e Formulações
[00158] A invenção proporciona composições terapêuticas compreendendo os anticorpos anti-GCGR ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos da presente invenção. A administração de composições terapêuticas de acordo com a invenção será administrada com veículos, excipientes, e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para proporcionar aprimorada transferência, liberação, tolerância, e semelhantes. Uma multitude de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário de conhecimento de todos os químicos farmacêuticos, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeos (catiônicos ou aniônicos) (tais como LIPOFECTIN™), conjugados de DNA, pastas de absorção anídricas, emulsões de óleo em água e de água em óleo, emulsões carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semi-sólidos, e misturas semissólidas contendo carbowax. Vide também Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" (Compêndio de excipientes para formulações parenterais) PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[00159] A dose de anticorpo pode variar dependendo da idade e do tamanho de um sujeito a ser administrado, da doença alvo, das condições, da via de administração, e semelhantes. Quando o anticorpo da presente invenção é usado para reduzir os níveis de glicose sanguínea associados com atividade a atividade de GCGR em várias condições e doenças, tais como diabetes, em um paciente adulto, é vantajoso administrar por via intravenosa o anticorpo da presente invenção normalmente em uma única dose de cerca de 0,01 até cerca de 30 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,02 até cerca de 7, cerca de 0,03 até cerca de 5, ou cerca de 0,05 até cerca de 3 mg/kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Em determinadas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo da invenção pode ser administrado como uma dose inicial de no mínimo cerca de 0,1 mg até cerca de 800 mg, cerca de 1 até cerca de 500 mg, cerca de 5 até cerca de 300 mg, ou cerca de 10 até cerca de 200 mg, até cerca de 100 mg, ou até cerca de 50 mg. Em determinadas modalidades, a dose inicial pode ser seguida por administração de uma segunda dose ou uma pluralidade de doses subsequentes do anticorpo ou do fragmento de ligação antigênica do mesmo em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesmo ou menos do que a da dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por no mínimo 1 dia até 3 dias; no mínimo uma semana, no mínimo 2 semanas; no mínimo 3 semanas; no mínimo 4 semanas; no mínimo 5 semanas; no mínimo 6 semanas; no mínimo 7 semanas; no mínimo 8 semanas; no mínimo 9 semanas; no mínimo 10 semanas; no mínimo 12 semanas; ou no mínimo 14 semanas.
[00160] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradérmicas, transdérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.
[00161] A composição farmacêutica também pode ser liberada em uma vesícula, em particular um lipossoma (vide, por exemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
[00162] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser liberada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode ser usada uma bomba. Em outra modalidade, podem ser usados materiais poliméricos. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo da composição, deste modo necessitando somente de uma fração da dose sistêmica.
[00163] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagens para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões para gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por meio de métodos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, poro dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou de seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso usado convencionalmente para injeções. Como o meio aquoso para injeções, há, por exemplo, salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., os quais podem ser usados em combinação com um agente solubilizante apropriado tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, aducto HCO- 50 (polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., os quais podem ser usados em combinação com um agente solubilizante tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção preparada deste modo é preferencialmente preenchida em uma ampola apropriada.
[00164] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser liberada por via subcutânea ou por via intravenosa com uma agulha e seringa de rotina. Além disso, com respeito à liberação subcutânea, um dispositivo de administração de caneta tem prontamente aplicações na administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Um dispositivo de administração de caneta semelhante pode ser reusável ou descartável. Um dispositivo de administração de caneta reusável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tenha sido administrada e o cartucho esteja vazio, o cartucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído com um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de administração de caneta pode ser em seguida reusado. Em um dispositivo de administração de caneta descartável, não há dispositivo de administração de caneta substituível. Ao invés, o dispositivo de administração de caneta descartável vem preenchido com a composição farmacêutica encerrada dentro de um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é descartado.
[00165] Numerosos dispositivos de administração de caneta reusáveis e autoinjetores têm aplicações na administração subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas com certeza não estão limitados a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), canela DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), canela HUMALOG MIX 75/25™, canela HUMALOG™, canela HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly e Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), canela BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, e OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemanha), para nomear somente alguns. Exemplos de dispositivos de administração de caneta descartáveis tendo aplicações na administração subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas com certeza não estão limitados à canela SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), a FLEXPEN™ (Novo Nordisk), e a KWIKPEN™ (Eli Lilly), the SURECLICK ™ Autoinjetor (Amgen, Thousands Oaks, CA), a PENLET ™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), a EPIPEN (Dey, L.P.) e a HUMIRA ™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL), para nomear somente alguns.
[00166] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagens em uma unidade de dose adequada para se ajustar a uma dose dos ingredientes ativos. As formas de dosagens referidas em uma unidade de dose incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo supracitado contida é geralmente de cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma unidade de dose; especialmente sob a forma de injeção, É preferencial que o anticorpo supracitado seja contido em cerca de 5 até cerca de 100 mg e em cerca de 10 até cerca de 250 mg para as outras formas de dosagens. Utilizações Terapêuticas dos Anticorpos
[00167] Decido a sua interação com o receptor de glucagon, os presentes anticorpos são úteis para reduzir os níveis de glicose sanguínea e também para o tratamento de uma ampla gama de condições e transtornos nos quais é benéfico o bloqueio da interação do glucagon com seu receptor. Estes transtornos e condições podem ser selecionados entre qualquer transtorno metabólico relacionado com o glucagon, o qual envolve sinalização de receptor de glucagon que resulta na patofisiologia do transtorno, ou na resposta homeostática ao transtorno. Deste modo, os anticorpos podem encontrar aplicação por exemplo para prevenir, tratar, ou aliviar, doenças ou condições ou sintomas ou sequelas associados, do sistema endócrino, do sistema nervoso central, do sistema nervoso periférico, do sistema cardiovascular, do sistema pulmonar, e do sistema gastrointestinal, ao mesmo tempo que reduzindo e ou eliminando um ou mais dos efeitos colaterais indesejados associados com os tratamentos atuais. Transtornos metabólicos relacionados com o glucagon incluem, mas não estão limitados a, diabetes tipo 1 e tipo 2, cetoacidose diabética, hiperglicemia, síndrome hiperosmolar hiperglicêmica, hiperglicemia no perioperatório, hiperglicemia no paciente de unidade de tratamento intensivo, hiperinsulinemia, hiperglicemia pós-prandial, alteração da glicemia de jejum (IFG), síndrome metabólica, hiper-/hipocalemia, proporção LDL/HDL ruim, transtornos alimentares, ganho de peso, obesidade como uma consequência do diabetes, diabetes pediátrico, diabetes gestacional, complicações tardias do diabetes, micro-/macroalbuminúria, nefropatia, retinopatia, neuropatia, úlceras do pé diabético, cura de feridas, tolerância à glicose diminuída (IGT), síndromes de resistência à insulina, síndrome X, glucagonomas, transtornos gastrointestinais, obesidade, diabetes como uma consequência da obesidade, etc. A presente invenção proporciona adicionalmente; um método para tratar condições resultantes de glucagon excessivo em um mamífero; um método para inibir o receptor de glucagon em um mamífero; um método para inibir uma resposta celular mediada por receptor de glucagon em um mamífero, ou um método para reduzir o nível glicêmico em um mamífero compreendendo administrar a um mamífero que necessite de semelhante tratamento uma quantidade inibidora do receptor de glucagon de um anticorpo anti-GCGR ou de um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[00168] Os presentes anticorpos são eficazes para reduzir a glicose sanguínea, tanto em jejum e no estágio de pós-prandial. Em determinadas modalidades da invenção, os presentes anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento do diabetes tipo 2. Em ainda uma modalidade adicional da invenção os presentes anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para retardar ou para a prevenção da progressão de tolerância à glicose diminuída para diabetes tipo 2. Em ainda outra modalidade da invenção os presentes anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para retardar ou para a prevenção da progressão de diabetes não necessitando de insulina para diabetes necessitando de insulina. Em uma modalidade adicional da invenção os presentes anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de tipo 1 diabetes. O tratamento referido normalmente é acompanhado por terapia de insulina.
Terapias de Combinação
[00169] Terapias de combinação podem incluir um anticorpo anti- hGCGR da invenção e qualquer agente terapêutico adicional que possa ser combinado vantajosamente com um anticorpo da invenção, ou com um fragmento biologicamente ativo de um anticorpo da invenção.
[00170] Por exemplo, um segundo agente terapêutico pode ser empregado para auxiliar a reduzir mais os níveis de glicose, ou para reduzir no mínimo um sintoma em um paciente sofrendo de uma doença ou condição caracterizada por altos níveis de glicose sanguínea, tal como o diabetes mellitus. Um segundo agente semelhante pode ser selecionado entre, por exemplo, um antagonista do glucagon ou outro antagonista do GCGR (por exemplo, um anticorpo antiglucagon ou anti-GCGR ou inibidor de glucagon de molécula pequena ou GCGR), ou pode incluir outras porções terapêuticas úteis para tratar o diabetes, ou outras doenças ou condições associadas com, ou resultantes de níveis elevados de glicose sanguínea, ou metabolismo de glicose comprometido, ou agentes úteis para tratar quaisquer complicações de longo termo associadas com níveis de glicose sanguínea elevados e/ou descontrolados. Estes agentes incluem biguanidas, as quais diminuem a produção de glicose no fígado e aumentam a sensibilidade à insulina (por exemplo, metformina), ou sulfonilureias, as quais estimulam a produção de insulina (por exemplo, gliburida, glipizida). Tratamentos adicionais direcionados para a manutenção da homeostase da glicose incluindo agonistas do receptor PPAR gama, os quais agem como sensibilizantes para insulina (por exemplo, pioglitazona, rosiglitazona); e inibidores da alfa glucosidase, os quais retardam a absorção de amido e a produção de glicose (por exemplo, acarbose, voglibose). Tratamentos adicionais incluem tratamentos injetáveis tais como Exenatide® (peptídeo semelhante a glucagon 1), e Symlin® (pranlintida).
[00171] Em determinadas outras modalidades, a composição pode incluir um segundo agente selecionado entre o grupo consistindo em secretagogos sulfonilureianão sulfonilureias, insulina, análogos da insulina, polipeptídeos exendina-4, agonistas de beta 3 adrenoceptores, agonistas de PPAR, inibidores da dipeptidil peptidase IV, statinas e combinações contendo estatina, inibidores da absorção do colesterol, antagonistas do colesterol LDL, antagonistas da proteína de transferência do éster colesterílico, antagonistas de receptores de endotelina, antagonistas do hormônio do crescimento, sensibilizantes de insulina, miméticos ou agonistas de amilina, antagonistas de receptores canabinoides, agonistas de peptídeo semelhante a glucagon 1, melanocortinas, agonistas de receptores do hormônio de concentração de melanina, SNRIs, e inibidores da proteína tirosina fosfatase.
[00172] Em determinadas outras modalidades, terapia de combinação pode incluir a administração de um segundo agente para neutralizar quaisquer potenciais efeitos colaterais resultantes da administração de um anticorpo da invenção, caso ocorra os efeitos colaterais referidos. Por exemplo, no caso de que qualquer um dos anticorpos anti-GCGR aumente os níveis de lipídeos ou de colesterol, pode ser benéfico administrar um segundo agente para reduzir os níveis de lipídeos ou de colesterol, usando um agente tal como um inibidor da HMG-CoA redutase (por exemplo, uma estatina tal como atorvastatina, (LIPITOR®), fluvastatina (LESCOL®), lovastatina (MEVACOR®), pitavastatina (LIVALO®), pravastatina (PRAVACHOL®), rosuvastatina (CRESTOR®) e sinvastatina (ZOCOR®). Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser combinados com um agente tais como VYTORIN®, o qual é uma preparação de uma estatina e outro agente — tal como ezetimibe / sinvastatina.
[00173] Em determinadas modalidades, pode ser benéfico administrar os anticorpos da invenção em combinação com qualquer um ou mais dos seguintes: (1) niacina, a qual aumenta o catabolismo das lipoproteínas; (2) fibratos ou ácidos carboxílicos anfipáticos, os quais reduzem o nível de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), aumentam os níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL) e de TG, e reduzem o número de ataques cardíacos não fatais; e (3) ativadores do fator de transcrição LXR que desempenha um papel na eliminação do colesterol tal como 22-hidroxicolesterol, ou uma estatina com uma resina biliar (por exemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), uma combinação fixa de niacina mais uma estatina (por exemplo, niacina com lovastatina); ou com outros agentes de redução de lipídeos tais como ésteres etílicos de ácidos graxos ômega 3 (por exemplo, omacor).
[00174] Além disso, o segundo agente terapêutico pode ser um ou mais outros inibidores de glucagon ou GCGR, bem como inibidores de outras moléculas, tais como proteína semelhante a angiopoietina 3 (ANGPTL3), proteína semelhante a angiopoietina 4 (ANGPTL4), proteína semelhante a angiopoietina 5 (ANGPTL5), proteína semelhante a angiopoietina 6 (ANGPTL6), as quais estão envolvidas no metabolismo dos lipídeos, em particular, a homeostase do colesterol e/ou triglicerídeos. Inibidores destas moléculas incluem moléculas pequenas e anticorpos que ligam especificamente a estas moléculas e bloqueiam sua atividade.
[00175] Em determinadas modalidades, pode ser benéfico administrar os anticorpos da invenção em combinação com um anticorpo que age reduzindo os níveis de lipídeos ou colesterol, tal como, mas não limitado a, por exemplo, qualquer anticorpo anti- PCSK9 (proproteína convertase subtilisina / quexina tipo 9), tais como os descritos na patente dos Estados Unidos No. US2010/0166768. Outros anticorpos anti-PCSK9 são descritos na patente dos Estados Unidos No. US2010/0040611, na patente dos Estados Unidos No. US2010/ 0041102, na patente dos Estados Unidos No US2010/0040610, na patente dos Estados Unidos No US2010/0113575, na patente dos Estados Unidos No US2009/0232795, na patente dos Estados Unidos No US2009/0246192, na patente dos Estados Unidos No. US2010/ 0233177, na patente dos Estados Unidos No. US2009/0142352, na patente dos Estados Unidos No. US2009/0326202, na patente dos Estados Unidos No. US2010/0068199, na patente dos Estados Unidos No. US2011/0033465, na patente dos Estados Unidos No. US2011/ 0027287, na patente dos Estados Unidos No. US2010/0150937, na patente dos Estados Unidos No. US2010/0136028 e na patente internacional No. WO2009/055783.
[00176] Em determinadas modalidades, pode ser benéfico administrar os anticorpos anti-GCGR da invenção em combinação com um ácido nucleico que inibe a atividade de PCSK9 (proproteína convertase subtilisina / quexina tipo 9), tais como uma molécula antissenso, um RNA de filamento duplo, ou uma molécula de siRNA. Exemplos de moléculas de ácido nucleico que inibem a atividade de PCSK9 são descritos na patente dos Estados Unidos No. US2011/0065644, na patente dos Estados Unidos No US2011/0039914, na patente dos Estados Unidos No US2008/0015162 e na patente dos Estados Unidos No US2007/0173473.
[00177] O um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais podem ser administrados antes de, concomitantemente com, ou depois da administração do anticorpo anti-GCGR da presente invenção. Para os fins da presente descoberta, os regimes de administração referidos são considerados a administração de um anticorpo anti-GCGR "em combinação com" um segundo componente terapeuticamente ativo. Utilizações de Diagnóstico dos Anticorpos
[00178] Os anticorpos anti-GCGR da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir GCGR em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti- GCGR, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de GCGR. Exemplos de testes de diagnóstico para GCGR podem compreender, por exemplo, contactar uma amostra, obtida a partir de um paciente, com um anticorpo anti-GCGR da invenção, em que o anticorpo anti-GCGR é marcado com uma etiqueta detectável ou molécula repórter ou usado como um ligante de captura para isolar seletivamente proteína de GCGR das amostras do paciente. Alternativamente, um anticorpo anti-GCGR não marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário o qual é o próprio marcado de modo detectável. A etiqueta detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótipo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente tal como isotiocianato de fluoresceína, ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de raiz forte, ou luciferase. Exemplos de testes específicos que podem ser usados para detectar ou medir GCGR em uma amostra incluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), e classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
[00179] Amostras que podem ser usadas em testes de diagnóstico de GCGR de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou fluido obtenível a partir de um paciente, a qual contenha quantidades detectáveis de proteína de GCGR, ou fragmentos da mesma, sob condições normais ou patológicas. De modo geral, os níveis de GCGR em uma amostra particular obtida a partir de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afetado com uma doença ou condição associada com atividade ou níveis anormais de GCGR) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de GCGR basal ou padrão. Este nível basal de GCGR pode ser então comparado contra os níveis de GCGR medidos em amostras obtidas a partir de indivíduos suspeitos de terem uma doença ou condição relacionada com GCGR, ou sintomas associados com a doença ou condição referida. EXEMPLOS
[00180] Os exemplos que se seguem são publicados de modo a proporcionar às pessoas com conhecimento regular na técnica uma revelação e descrição completas de como produzir e usar os métodos e as composições da invenção, e não pretendem limitar o âmbito do quê os inventores consideram como sua invenção. Foram empreendidos esforços para assegurar a precisão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) porém alguns desvios e erros experimentais devem ser contabilizados. A menos que indicado de modo diverso, partes são partes por peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados, e pressão é atmosférica ou próxima da atmosférica. Exemplo 1. Produção de Anticorpos Humanos para GCGR Humano
[00181] Um imunogênico compreendendo qualquer um dos seguintes pode ser usado para produzir anticorpos para hGCGR. Por exemplo, células expressando hGCGR foram usadas em determinadas modalidades como um imunogênico para gerar anticorpos para hGCGR. Adicionalmente, DNA codificando hGCGR foi usado em determinadas modalidades como um imunogênico para preparar os anticorpos da invenção. Além disso, em determinadas modalidades, peptídeos compreendendo sequências de aminoácidos do domínio N-terminal de hGCGR foram utilizados como um imunogênico para gerar anticorpos para GCGR humano. Além disso, em determinadas modalidades, peptídeos compreendendo sequências de aminoácidos de qualquer uma das regiões de loops extracelulares EC1, EC2, ou EC3, de hGCGR podem ser utilizadas como um imunogênico para gerar anticorpos para GCGR humano. As células, DNA, ou peptídeos que foram usados como imunogênicos, conforme mencionado acima, foram administrados diretamente, com um adjuvante para estimular a reação imune, em um camundongo VELOCIMMUNE® compreendendo DNA codificando regiões variáveis de cadeias pesadas e leves kappa de Imunoglobulina humana. A reação imune dos anticorpos foi monitorada por um imunoensaio GCGR-específico. Quando uma reação imune desejada foi obtida, os esplenócitos foram colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de . As linhagens celulares de hibridoma foram triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos específicos contra GCGR. Usando esta técnica, e os vários imunogênicos descritos acima, foram obtidos vários anticorpos quiméricos anti-GCGR (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo); alguns anticorpos exemplares gerados desta maneira foram designados como H4H1345N, H4H1617N e H4H1765N.
[00182] Anticorpos anti-GCGR também foram isolados diretamente a partir de células B antígeno-positivas sem fusão a células de mieloma, conforme descrito no requerimento de patente dos Estados Unidos No. U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, foram obtidos vários anticorpos anti-GCGR totalmente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos); exemplos de anticorpos gerados desta maneira foram designado como se segue: H4H1321B, H4H1321P, H4H1327B, H4H1327P, H4H1328B, H4H1328P, H4H1331B, H4H1331P, H4H1339B e H4H1339P.
[00183] As propriedades biológicas dos exemplos de anticorpos anti-GCGR gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos estipulados abaixo. Exemplo 2. Sequências de Aminoácidos de Regiões Variáveis de Cadeias Pesadas e Leves
[00184] A Tabela 1 estipula os pares de sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de anticorpos anti- GCGR selecionados e seu identificadores de anticorpos correspondentes. Anticorpos tendo a mesma designação numérica de anticorpo, porém diferindo por um sufixo de letra de N, B ou P se referem a anticorpos tendo cadeias pesadas e leves com sequências de CDR idênticas porém com variações de sequências em regiões que se situram fora das sequências de CDR (isto é, nas regiões de framework). Deste modo, variantes N, B e P de um anticorpo em particular têm sequências de CDR idênticas dentro de suas regiões variáveis de cadeias pesadas e leves porém diferem umas das outras dentro de suas regiões de framework. Tabela 1
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Exemplo 3. Análise da Utilização de Gene Variável
[00185] De modo a analisar a estrutura dos anticorpos produzidos, os ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de anticorpos foram clonados e sequenciados. A partir da sequência de ácido nucleico e da sequência de aminoácidos dos anticorpos prevista, foi identificado o uso de gene para cada Região variável de cadeia pesada (HCVR) e Região variável de cadeia leve (LCVR). A Tabela 2 estabelece o uso de gene para anticorpos selecionados de acordo com a invenção. Tabela 2
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Exemplo 4. Ligação de Anticorpos a GCGR Solúvel conforme Determinado por Ressonância de Plasmon Superficial
[00186] As afinidades de ligação e as constantes cinéticas da ligação de anticorpos anti-hGCGR monoclonais humanos a ectodomínio hGCGR recombinante solúvel humano e de macaco (hGCGR e MfGCGR, respectivamente) foram determinadas por Ressonância de Plasmon Superficial tanto a 25°C quanto a 37°C. As medições foram conduzidas em um instrumento T100 Biacore. Anticorpos foram capturados sobre a superfície de chip sensor Biacore através de uma superfície de captura de anticorpo anti-humano kappa ligado de modo covalente, e as proteínas de GCGR solúveis foram aplicadas à superfície quer em um formato monovalente (hGCGR expresso com uma etiqueta C-terminal myc-myc-hexa-histidina) ou bivalente (hGCGR e MfGCGR expresso com uma fusão de Fc N- terminal). Os identificadores de sequências de aminoácidos dos reagentes usados neste exemplo são mostrados na Tabela 3. Tabela 3
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[00187] O GCGR solúvel foi aplicado na célula de fluxo em injeções separadas em múltiplas concentrações variando a partir de 3,1 nM até 50 nM, e foram determinadas as constantes das taxas cinéticas de associação (ka) e de dissociação (kd) ajustando os dados a um modelo de ligação a 1:1 usando o software Scrubber v2.0a de ajuste de curva. Foram calculadas as constantes de equilíbrio de dissociação de ligação e as meias-vidas dissociativas a partir das constantes das taxas cinéticas como: KD = kd / ka; t1/2 = (ln2/kd). Tabela 4a: Dados da análise Biacore para ligação a 25OC
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[00188] Conforme mostrado nas Tabelas 4a e 4b, os anticorpos de exemplo apresentaram alta afinidade de ligação tanto a proteínas solúveis de GCGR humano quanto de macaco. Foi observado um aumento significativo na afinidade de ligação (de 5 vezes a 15 vezes) quando fluindo o hGCGR bivalente em comparação com o hGCGR monovalente. Os anticorpos ligaram consistentemente com maior afinidade (de 3 vezes a 10 vezes) à variante de macaco, MfGCGR, comparada com hGCGR. Exemplo 5. Bioensaio para Medir os Efeitos de Anticorpos Anti-GCGR sobre a Ativação de GCGR
[00189] GCGR é um receptor acoplado à proteína G e seu ligante, glucagon (GCG), estimula a atividade de adenilil ciclase através de Gas e o turnover do fosfoinositol através de Gq (Jiang e Zhang, (2003), Am J Physiol Endocrinol Metab 284: E671-E678). Um bioensaio foi desenvolvido para detectar a ativação através de Gas, a subsequente elevação dos níveis de cAMP e a ativação transcricional. Linhagens celulares de HEK293 foram geradas para expressar de modo estável extensões totais de GCGR humano (Número de acesso no GenBank NP_000151.1; SEQ ID NO: 153), GCGR de macaco (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO: 155), e GCGR de camundongo (NP_032127.2; SEQ ID NO: 154.) junto com um teste de luciferase repórter. As linhagens celulares estáveis foram isoladas e mantidas em 10% de FBS, DMEM, NEAA, Pen/Strep, e 500 mg/ml de G418. Para GCGR de rato, a linhagem celular HEK293 expressando o gene repórter [CRE (4X)-luciferase-IRES-GFP] foi transfectada transitoriamente com GCGR de rato de extensão total (NP_742089.1; SEQ ID NO: 156) usando Lipofectamine2000 (Invitrogen).
[00190] Para o bioensaio, células 293/GCGR foram semeadas sobre lâminas de ensaio de 96 cavidades a 20.000 células / cavidade em meios de baixo teor de soro, 0,1% de FBS e OPTIMEM, e incubadas a 37°C e 5% de CO2 de um dia para o outro. No dia seguinte, GCG foi diluído serialmente a 1:3 e adicionado às células iniciando a partir de 100 nM até 0,002 nM incluindo controle sem GCG para dose resposta. Para inibição, os anticorpos foram diluídos serialmente a 1:3 e adicionados às células iniciando a partir de 200 até 0,003 (para células de hGCGR) ou 100 nM a 0,002 nM (para células de GCGR de macaco, de camundongo e de rato) incluindo controle sem anticorpo com concentração constante de 100 pM de GCG. A atividade de luciferase foi detectada depois de 5,5 horas de incubação em 37°C e 5% de CO2.
[00191] Os valores da EC50 para estimulação de cada linhagem celular repórter por 100 pM de GCG são mostrados na Tabela 5a. Os resultados dos valores da IC50 para anticorpos bloqueando a estimulação de células por 100 pM de GCG são mostrados na Tabela 5b, incluindo os resultados para dois anticorpos de controle, mAb1 controle (controle positivo expressado como isótipo hIgG4; por exemplo, vide a patente internacional No. WO2008/036341 para o anticorpo designado como "A-9" tendo a HCVR de SEQ ID NO: 275, a HCDR1 de SEQ ID NO: 102, a HCDR2 de SEQ ID NO: 128, e a HCDR3 de SEQ ID NO: 169 e a LCVR de SEQ ID NO: 229, a LCDR1 de SEQ ID NO: 14, a LCDR2 de SEQ ID NO: 50 e a LCDR3 de SEQ ID NO: 74) e mAb2 controle (um controle negativo combinado por isótipo).
[00192] Com respeito à inibição de GCGR humano por anticorpos anti-GCGR, foi mostrado que a ativação de GCGR por GCG estimula a atividade de luciferase com uma EC50 de 113 pM e todos os anticorpos com exceção de mAb2 Controle (controle negativo combinado por isótipo) bloquearam a ativação de GCG a 100 pM e diminuíram a atividade de luciferase.
[00193] Com respeito à inibição de GCGR de macaco por anticorpos anti-GCGR, foi mostrado que a ativação de GCGR por GCG estimula a atividade de luciferase com uma EC50 de 36 pM e todos os anticorpos com exceção de mAb2 Controle (controle negativo combinado por isótipo) bloquearam a ativação de GCG a 100 pM e diminuíram a atividade de luciferase. H4H1765N apresentou uma inibição parcial de GCG na maior concentração de anticorpo testada, 100 nM.
[00194] Com respeito à inibição de GCGR de camundongo por anticorpos anti-GCGR, foi mostrado que a ativação de GCGR por GCG estimula a atividade de luciferase com uma EC50 de 83 pM e todos os anticorpos com exceção de H4H1345N, H4H1617N, H4H1765N e mAb2 Controle (controle negativo combinado por isótipo) bloquearam a ativação de GCG a 100 pM e diminuíram a atividade de luciferase.
[00195] Com respeito à inibição de GCGR de rato por anticorpos anti-GCGR, foi mostrado que a ativação de GCGR por GCG estimula a atividade de luciferase com uma EC50 de 252 pM e todos os anticorpos com exceção de H4H1765N e mAb2 Controle (controle negativo combinado por isótipo) bloquearam a ativação de GCG a 100 pM e diminuíram a atividade de luciferase. Tabela 5a
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[00196] Em resumo, oito anticorpos totalmente humanos anti- hGCGR foram testados e demonstraram bloqueio da ativação de GCGR humano por 100 pM de GCG em uma linhagem celular repórter que apresentou uma EC50 de 113 pM quando estimulada por GCG somente. Na linhagem celular repórter de GCGR de macaco, sete de oito anticorpos testados inibiram totalmente a ativação por 100 pM de GCG. H4H1765N não inibiram totalmente GCGR de macaco na maior concentração de anticorpos testada, 100 nM. Cinco de oito dos anticorpos inibiram totalmente a ativação por 100 pM de GCG na linhagem celular repórter de GCGR de camundongo, e sete de oito anticorpos inibiram a ativação por 100 pM de GCG nas células repórter transfectadas com GCGR de rato. Exemplo 6. Efeito de Anticorpos anti-GCGR em Camundongos ob/ob
[00197] Anticorpos anti-hGCGR selecionados, todos os quais possuem reatividade cruzada com GCGR de camundongo, foram testados para sua capacidade para reduzir os níveis de glicose sanguínea em camundongos ob/ob, um modelo de diabetes tipo 2 em camundongo. Camundongos ob/ob foram postos em dez grupos de cinco ou seis animais. Cada grupo recebeu injeções subcutâneas de cada anticorpo a 1 ou 10 mg/kg. O grupo controle foi injetado com um anticorpo de isótipo controle hIgG, o qual não liga a quaisquer proteínas de camundongo conhecidas. Dois ou sete dias depois da administração de anticorpo a 1 ou 10 mg/kg, respectivamente,umas poucas gotas de sangue obtidas por sangrias da cauda foram coletadas dos camundongos. Especificamente, para o grupo que recebeu o anticorpo designado H4H1327P a 10mg/kg, as sangrias da cauda foram coletadas mais frequentemente em 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, e 21 dias depois da administração. Os níveis de glicose sanguínea das amostras de sangrias da cauda foram determinados por ACCU- CHEK® Compact Plus (Roche). A percentagem de redução na glicose sanguínea a partir dos níveis médios de glicose sanguínea do grupo controle foi calculada para cada animal em cada ponto do tempo. A percentagem média de redução na glicose sanguínea foi calculada para cada grupo de anticorpo. A Tabela 6 resume os níveis médios de glicose sanguínea do grupo controle. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) da percentagem de redução da glicose sanguínea, são mostrados na Tabelas 7a e 7b. Tabela 6
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[00198] Camundongos tratados com os anticorpos anti-hGCGR testados (mostrados nas Tabelas 7a e 7b) apresentaram reduções significativas nos níveis de glicose sanguínea comparados com camundongos injetados com anticorpo controle. Exemplo 7. Efeito de Anticorpos Anti-GCGR em Camundongos Transgênicos Expressando a Proteína de GCGR Humana
[00199] Os efeitos de anticorpos anti-hGCGR sobre os níveis de glicose sanguínea e de lipídeos plasmáticos foram determinados em camundongos transgênicos expressando a proteína de GCGR humana ("camundongos GCGR humanizados"). Camundongos GCGR humanizados foram gerados substituindo o gene de GCGR de camundongo com o gene de GCGR humano (SEQ ID NO: 157; codificando proteína de extensão total, Número de acesso no GenBank NP_000151.1; SEQ ID NO: 153) em células-tronco embrionárias C57BL6/129 (F1H4). Depois da transmissão para a linhagem germinativa ter sido estabelecida, camundongos heterozigotos (GCGRhum/+) foram reproduzidos juntos para gerar camundongos homozigotos (GCGRhum/hum) em uma base de C57BL6. Camundongos GCGR humanizados homozigotos foram postos em dez grupos de três ou quatro animais. Cada grupo recebeu injeções subcutâneas de cada anticorpo a 3 mg/kg. O grupo de Controle I foi injetado com um anticorpo de isótipo controle hIgG, o qual não liga a quaisquer proteínas de camundongo conhecidas. O grupo de Controle II foi injetado com um anticorpo hIgG4 anti-hGCGR, o qual foi validado por reduzir os níveis de glicose sanguínea de camundongos GCGR humanizados. Os camundongos foram sangrados três dias depois da administração de anticorpo, e os níveis de glicose sanguínea foram determinados por ACCU-CHEK® Compact Plus (da Roche). A percentagem de redução na glicose sanguínea a partir dos níveis médios de glicose sanguínea do grupo de Controle I foi calculada para cada animal. A percentagem média da redução na glicose sanguínea foi calculada para cada grupo de anticorpo. A Tabela 8a resume os níveis médios de glicose sanguínea do grupo de controle. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) de percentagem de redução da glicose sanguínea, são mostrados na Tabela 8b.
[00200] Adicionalmente com os grupos de Controle I, Controle II e H4H1765N, os camundongos foram sangrados antes e 3 e 8 dias depois da administração de anticorpo, e os níveis plasmáticos de lipídeos foram determinados por ADVIA® 1650 Chemistry System (Siemens). As médias foram calculadas para cada uma das medições dos níveis de colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C), de colesterol de lipoproteínas de alta densidade (HDL-C), de colesterol total (TOTAL-C), de triglicerídeos (TG), de ácidos graxos não esterificados (NEFA) para cada um dos três grupos. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) das concentrações plasmáticas de lipídeos, são mostrados na Tabela 8c.
[00201] Camundongos tratados com a maioria dos anticorpos anti- hGCGR testados (mostrado na Tabela 8b) apresentaram reduções significativas nos níveis de glicose sanguínea comparados com camundongos recebendo anticorpo controle. Camundongos tratados com determinadas dos anticorpos anti-hGCGR testados (mostrados na Tabela 8c) apresentaram reduções significativas nos níveis de triglicerídeos comparados com camundongos recebendo anticorpo controle. Em particular, a redução dos níveis de triglicerídeos foi observada com dois anticorpos anti-GCGR, um designado como H4H1765N (dados mostrados abaixo na Tabela 8c) e o outro designado como H4H1327P (dados não mostrados). Tabela 8a
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Exemplo 8: Efeito da Terapia de Combinação com um Anticorpo Anti- GCGR e um Anticorpo Específico para PCSK9 (proproteína convertase subtilisina / quexina tipo 9) sobre os Níveis de Glicose Sanguínea, de Lipídeos Plasmáticos e de Triglicerídeos Hepáticos em Camundongos Reagentes
[00202] Os anticorpos que se seguem foram usados para estudar o efeito da terapia de combinação com um anticorpo anti-GCGR e um anticorpo específico para PCSK9 sobre os níveis de glicose sanguínea, os níveis de lipídeos plasmáticos e os níveis de triglicerídeos hepáticos em camundongos C57BL/6: Um anticorpo anti- hIL4R designado REGN496, o qual é um isótipo controle hIgG4; um anticorpo anti-GCGR (hIgG4) designado H4H1327P; e um anticorpo anti-PCSK9 (hIgG1) designado H1H316P. Os identificadores de sequências de aminoácidos para as HCVR, LCVR, HCDRs, e LCDRs são mostrados abaixo na Tabela 9. Tabela 9
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Procedimento Experimental
[00203] Os efeitos combinados de H4H1327P, um anticorpo anti- hGCGR, e H1H316P, um anticorpo anti-hPCSK9, sobre os níveis de glicose sanguínea, lipídeos plasmáticos, e triglicerídeos hepáticos (TG) foram determinados em camundongos C57BL/6.
[00204] H4H1327P possui reatividade cruzada com GCGR de camundongo, e H1H316P possui reatividade cruzada com PCSK9 de camundongo. Camundongos C57BL/6 foram postos em seis grupos de seis animais. Cada grupo recebeu uma vez por semana injeções subcutâneas de um anticorpo ou uma combinação de dois anticorpos. O primeiro grupo foi injetado a 10 mg/kg com um anticorpo isótipo controle hIgG4, o qual não liga a qualquer proteína de camundongo conhecida. O segundo grupo e o terceiro grupo receberam H4H1327P a 3 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. O quarto grupo foi injetado com 10 mg/kg de H1H316P. O quinto grupo recebeu uma combinação de 3 mg/kg de H4H1327P e 10 mg/kg de H1H316P, e o sexto grupo foi injetado com uma combinação de 10 mg/kg de H4H1327P e 10 mg/kg de H1H316P. Onze e 19 dias depois da administração inicial de anticorpo, os camundongos foram sangrados para medições da glicose sanguínea e dos lipídeos plasmáticos. No Dia 19, o fígado foi colhido para a determinação do teor de TG hepáticos. Os níveis de glicose sanguínea foram medidos com o uso de Compact Plus ACCU- CHEK® (da Roche). A percentagem de redução na glicose sanguínea a partirr do nível médio de glicose sanguínea do grupo de isótipo controle foi calculada para cada animal. A percentagem de redução e erro associado na glicose sanguínea para cada grupo de tratamento foi em seguida calculada calculando a média de valores para os animais individuais em cada grupo. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) da percentagem de redução da glicose sanguínea, são mostrados na Tabela 10a e na Figura 1.
[00205] Os níveis de lipídeos plasmáticos foram determinados por ADVIA® 1650 Chemistry System (Siemens). Os teores de triglicerídeos hepáticos foram medidos usando um teste colorimétrico (Teco Diagnostics) depois da extração de triglicerídeos do tecido com clorofórmio / metanol. Foram calculadas as médias para cada uma das medições dos níveis plasmáticos de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL- C), colesterol total (TOTAL-C), TG e TG hepáticos para cada grupo. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) das concentrações de lipídeos plasmáticas e hepáticas, são mostrados na Tabela 10b e na Figura 2 (níveis plasmáticos de colesterol LDL); na Figura 3 (níveis plasmáticos de colesterol HDL); na Figura 4 (níveis plasmáticos de colesterol total); na Figura 5 (níveis plasmáticos de TG); e na Figura 6 (teor de TG hepáticos). Sumário dos resultados e conclusões: Tabela 10a
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NA: Não aplicável
Sumário dos Dados Tabelados:
[00206] Camundongos tratados com H4H1327P isolado apresentaram reduções significativas nos níveis de glicose sanguínea e aumentos nos níveis de colesterol LDL, colesterol HDL, e colesterol total em comparação com camundongos que receberam mAb controle. Camundongos tratados com H1H316P isolado apresentaram reduções significativas nos níveis de colesterol sem alteração nos níveis de glicose sanguínea. Camundongos tratados com uma combinação de H4H1327P e H1H316P apresentaram reduções significativas nos níveis de glicose sanguínea sem alterações nos níveis de colesterol em comparação com camundongos que receberam mAb controle. Os teores de TG hepáticos não foram alterados em qualquer um dos grupos de tratamento comparados com o grupo de isótipo controle. Exemplo 9. O Efeito de um Anticorpo Anti-GCGR em um Modelo de Obesidade induzida por Dieta em Camundongo
[00207] Os efeitos de H4H1327P, um anticorpo anti-hGCGR que possui reatividade cruzada com GCGR de camundongo, sobre os níveis de glicose sanguínea e os pesos corporais foram determinados em um modelo de diabetes tipo 2 (T2D) em camundongo de obesidade induzida por dieta (DIO).
[00208] O modelo de DIO é desenvolvido alimentando camundongos com uma dieta de alto teor de gordura (60% kcal) (HFD) a partir de 5 a 6 semanas de idade. Depois de aproximadamente 6 semanas na dieta, os camundongos desenvolvem anormalidades metabólicas incluindo resistência à insulina, intolerância à glicose, e obesidade. O modelo de DIO induz uma condição fisiológica em camundongos mais próxima à T2D humano do que o induzido pelos outros dois modelos de T2D comumente usados, camundongos ob/ob e db/db, uma vez que os últimos dois modelos resultam de mutações em genes de leptina ou receptores de leptina, respectivamente, os quais são raramente a causa de T2D em humanos.
[00209] Neste estudo, camundongos C57BL/6 machos de onze semanas de idade, colocados em dieta de alto teor de gordura (HFD) desde 5 semanas de idade, foram adquiridos da Taconic farms, Inc. e mantidos na dieta por outras 8 semanas. Os camundongos foram divididos em 4 grupos de 10 animais por grupo às 19 semanas de idade. Cada grupo recebeu semanalmente (nos dias 0, 7, 14, e 21) injeções subcutâneas de H4H1327P a 3, 10, ou 30 mg/kg, ou 30 mg/kg do isótipo controle hIgG4, o qual não liga a qualquer proteína de camundongo conhecida. Os níveis de glicose sanguínea e os pesos corporais foram medidos periodicamente, e 6 dias depois de administrar a última dose de anticorpo (no dia 27), 6 camundongos por grupo foram sacrificados. Pelas 6 semanas seguintes, a glicose sanguínea e os pesos corporais foram monitorados para os 4 camundongos / grupo restantes. A percentagem de redução nos níveis de glicose sanguínea comparada com o nível médio de glicose sanguínea do grupo de isótipo controle foi calculada para cada animal. A percentagem de redução e erro associado na glicose sanguínea para cada grupo de tratamento foi em seguida calculada calculando a média entre os valores para os animais individuais em cada grupo. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) da percentagem de redução da glicose sanguínea, são mostrados na Tabela 11. A percentagem de alteração do peso corporal a partir da linha basal (peso no dia 0) foi calculada para cada animal. A percentagem de alteração e erro associado do peso corporal para cada grupo de tratamento foi em seguida calculada calculando a média de valores para os animais individuais em cada grupo. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) da percentagem de alteração do peso corporal a partir da linha basal, são mostrados na Tabela 12.
Sumário dos resultados e conclusões:
[00210] H4H1327P, em todas as dosagens testadas, reduziu a glicose sanguínea e o peso corporal de camundongos DIO comparado com os grupos de isótipo controle. A maior redução da glicose sanguínea relativa (48,5%) ocorreu no grupo de maior dose (30 mg/kg) no dia 10, e a maior redução do peso corporal relativa (12,8%) ocorreu no grupo de maior dose no dia 28. Os grupos de menor dose (3 mg/kg) obtiveram valores de redução da glicose sanguínea média relativa e de redução do peso corporal médio de no mínimo 70% dos valores apresentados pelos grupos de maior dose até o dia 28 (uma semana depois da última dose). Os efeitos observados de redução da glicose sanguínea e do peso corporal depois do último tratamento no dia 21 (isto é, nos dias 28, 47, e 68) persistiram por mais tempo para os grupos de maior dose de H4H1327P comparados com os grupos de menor dose. Tabela 11
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Tabela 12
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Exemplo 10. O Efeito de um Anticorpo Anti-GCGR em um Modelo de Cetoacidose Diabética em Camundongo Induzida por Estreptozotocina (STZ)
[00211] Os efeitos do H4H1327P, um anticorpo anti-hGCGR, o qual tem reação cruzada com o GCGR de camundongo, sobre os níveis plasmáticos de cetona e de glicose foram determinados em um modelo de cetoacidose diabética (DKA) em camundongo induzida por estreptozotocina (STZ). A estreptozotocina é um tóxico químico para as células beta pancreáticas dos mamíferos o qual, portanto, destrói este tipo de células quando administrado aos roedores. Uma única injeção de dose elevada (200 mg/kg) de STZ em camundongos C57BL/6 leva ao desenvolvimento de grave hiperglicemia e cetonúria, condições apresentadas na cetoacidose diabética humana, em 3 dias. Camundongos C57BL/6 machos de nove semanas de idade, adquiridos da Taconic farms, Inc. foram divididos em 2 grupos de 10 animais, e cada grupo recebeu ou injeções intraperitoneais de STZ (em tampão de citrato) a 200 mg/kg ou veículo (também em tampão de citrato). Três dias depois, grave hiperglicemia (níveis de glicose sanguínea >400 mg/dL) e cetonúria foram confirmadas em todos os animais tratados com STZ. Na manhã seguinte, os camundongos tratados com STZ foram divididos em 2 grupos de 5 animais, e cada grupo recebeu uma injeção intravenosa de H4H1327P ou hIgG4 isótipo controle a 10 mg/kg. Os camundongos tratados com tampão de citrato também foram divididos em 2 grupos de 5 animais, e cada grupo recebeu injeção intravenosa de H4H1327P ou hIgG4 isótipo controle a 10 mg/kg. Os camundongos foram sangrados 18 horas antes da administração de anticorpo (2,5 dias depois da administração de STZ) e 28 horas depois da administração de anticorpo sob anestesia com isoflurane para coleta de plasma. Os níveis plasmáticos de cetona foram determinados por teste de beta-hidroxibutirato (Biovision), e os níveis plasmáticos de glicose foram determinados por ADVIA® 1650 Chemistry System (Siemens). Foram calculadas médias para as medições dos níveis de beta-hidroxibutirato e de glicose para cada um dos quatro grupos. Os resultados, expressos como (média ± erro padrão da média) das concentrações plasmáticas de beta- hidroxibutirato e glicose, são mostrados na Tabela 13.
Sumário dos resultados e conclusões:
[00212] Uma redução (média de 67%) na concentração plasmática de beta-hidroxibutirato (cetona) foi observada em camundongos cetoacidóticos diabéticos induzidos por STZ 28 horas depois de tratamento com H4H1327P em comparação com os níveis plasmáticos 18 horas antes do tratamento, demonstrando que H4H1327P efetivamente reduziu os níveis plasmáticos de cetona em um modelo de cetoacidose diabética em camundongos. Para os camundongos tratados com STZ dosados com anticorpo isótipo controle, foi observado um aumento médio de 14% na glicose sanguínea para as amostras séricas coletadas 28 horas depois de tratamento com anticorpo controle comparadas com as amostras coletadas 18 horas antes de tratamento com anticorpo, ao passo que para os camundongos dosados com H4H1327P no grupo tratado com STZ foi observado menos de 1% de alteração média na glicose entre amostras séricas coletadas nestes dois pontos do tempo. Tabela 13
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Exemplo 11. Produção de um Anticorpo Biespecífico
[00213] Vários anticorpos biespecíficos são produzidos para utilização na prática dos métodos da invenção. Por exemplo, anticorpos específicos contra GCGR são gerados em um formato biespecífico (um "biespecífico") nos quais regiões variáveis ligando a epítopos de ectodomínios distintos e/ou loops EC sobre GCGR são encadeados juntos para conferir especificidade de duplo-loop dentro de uma única molécula de ligação. Biespecíficos projetados adequadamente podem reforçar a eficácia de bloqueio de receptores de glucagon total através do aumento tanto da especificidade de GCGR quanto da avidez de ligação. Regiões variáveis com especificidade para epítopos de ectodomínios individuais (por exemplo, segmentos do domínio N-terminal, ou dos loops de GCGR EC1, EC2, ou EC3) ou que podem ligar a diferente regiões dentro de um loop ou segmento de ectodomínio são pareadas sobre um andaime estrutural que possibilita que cada região variável ligue simultaneamente aos epítopos separados, ou a diferentes regiões dentro de um ectodomínio ou loop EC. Em um exemplo para um biespecífico, regiões variáveis de cadeia pesada (VH) de um ligante com uma especificidade de ectodomínio ou loop são recombinadas com regiões variáveis de cadeia leve (VL) de uma série de ligantes com uma segunda especificidade de ectodomínio ou loop EC para identificar parceiros de VL não cognatas que podem ser pareados com uma VH original sem disrupção da especificidade original para aquela VH. Deste modo, um único segmento de VL (por exemplo, VL1) pode ser combinado com dois diferente domínios de VH (por exemplo, VH1 e VH2) para produzir um biespecífico consistindo em dois "braços" de ligação (VH1- VL1 e VH2- VL1). O uso de um único segmento de VL reduz a complexidade do sistema e deste modo simplifica e aumenta a eficiência em processos de clonagem, expressão, e purificação usados para produzir biespecíficos (Vide, por exemplo, a patente USSN13/022759 e a patente dos Estados Unidos No. US2010/0331527).
[00214] Alternativamente, anticorpos que ligam tanto GCGR quanto um segundo alvo, tal como, mas não limitado a, por exemplo, proproteína convertase subtilisina / quexina humana tipo 9 (hPCSK9), podem ser preparados em um formato biespecífico usando técnicas descritas aqui, neste requerimento de patente, ou outras técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Regiões variáveis de anticorpos ligando a regiões de GCGR distintas que são expostas extracelularmente são encadeadas juntas com regiões variáveis que ligam a sítios relevantes sobre, por exemplo, PCSK9, para conferi dupla especificidade antigênica dentro de uma única molécula de ligação. Biespecíficos projetados adequadamente desta natureza servem uma dupla função. Por exemplo, no caso de um anticorpo biespecífico que liga tanto GCGR quanto PCSK9, um pode ser capaz de reduzir a glicose sanguínea em virtude de um braço do anticorpo biespecífico ligando GCGR, enquanto ao mesmo tempo reduzindo os lipídeos plasmáticos, em virtude do segundo braço do anticorpo ligando PCSK9. Regiões variáveis com especificidade para epítopos de GCGR de ectodomínios individuais, são combinados com uma região variável com especificidade para PCSK9 e são pareados sobre um andaime estrutural que possibilita que cada região variável ligue aos antígenos separados.
[00215] Os ligantes biespecíficos são testados para ligação e bloqueio funcional dos antígenos alvo, por exemplo, GCGR e/ou PCSK9, em qualquer um dos testes descritos acima para anticorpos. Por exemplo, métodos de rotina para medir a ligação de proteínas solúveis são usados para avaliar a interação com PCSK9 biespecífica, tais como Biacore, ELISA, cromatografia de exclusão de tamanho, dispersão multiângulo de luz de laser, calorimetria de varredura direta, e outras métodos. Binding of anticorpos biespecíficos a células expressando GCGR é determinada através de citometria de fluco usando um anticorpo secundário marcado com etiqueta fluorescente reconhecendo um ou outro ou ambos os dois antígenos alvo ligados às células. A reatividade cruzada com os diferentes ectodomínios ou loops de GCGR dentro de diferentes espécies variantes e entre diferentes espécies variantes é avaliada usando um ensaio de ligação ELISA no qual peptídeos sintéticos representando os diferentes ectodomínios ou loops são revestidos sobre as cavidades de lâminas de microtítulo, e a ligação de um biespecífico é determinada através do uso de um anticorpo de detecção secundário. Experimentos de ligação com peptídeos de loops também podem ser conduzidos usando experimentos de Ressonância de Plasmon Superficial, nos quais a interação da ligação em tempo real de peptídeo ao anticorpo é medida fluindo um peptídeo ou biespecífico através de uma superfície sensora sobre a qual biespecífico ou peptídeo, respectivamente, é capturado. O bloqueio in vitro funcional do receptor GCGR por um biespecífico é determinado usando qualquer bioensaio tal como o descrito aqui, neste requerimento de patente, ou por determinação in vivo dos níveis de glicose sanguínea em modelos animais apropriados, tais como os descritos aqui, neste requerimento de patente. O bloqueio in vitro funcional de PCSK9 por um biespecífico é determinado usando qualquer bioensaio tal como o descrito na publicação de patente internacional No. WO2010/077854, ou na patente dos Estados Unidos No. US2010/0166768, ou por determinação in vivo dos níveis plasmáticos de lipídeos em modelos animais apropriados, tais como os descritos aqui, neste requerimento de patente.

Claims (15)

1. Anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao receptor de glucagon humano (hGCGR), em que o anticorpo compreende: (a) um domínio HCDR1 com uma sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 36; (b) um domínio HCDR2 com uma sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 38; (c) um domínio HCDR3 com uma sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 40; (d) um domínio LCDR1 com uma sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 44; (e) um domínio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 46; e (f) um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 48.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um par de sequências HCVR/LCVR como estabelecido na SEQ ID NO: 34/42.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação antigênica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que que é um anticorpo IgG1 ou fragmento de ligação antigênica do mesmo.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação antigênica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG4 ou fragmento de ligação antigênica do mesmo.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação antigênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante da cadeia leve humana kappa.
6. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 33 e/ou uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 41 ou sequências de ácido nucleico degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.
7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 6.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo agente terapêutico.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação antigênica do mesmo, que se liga especificamente a PCSK9.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado dentre o grupo consistindo em insulina, uma biguanida, metformina, uma sulfonilureia, gliburida, glipizida, um agonista de PPAR gama, pioglitazona, rosiglitazona, um inibidor da alfa glucosidase, acarbose, voglibose, Exenatide®, peptídeo tipo glucagon 1, Symlin®, pranlintida, um antagonista do glucagon, e um segundo antagonista de GCGR.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor da 3-hidróxi-3-metil-glutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase).
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o inibidor da HMG-CoA redutase é selecionado dentre o grupo consistindo em atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina e sinvastatina.
14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso na redução dos níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou para tratar um paciente tendo uma doença ou condição associada ou definida em parte por altos níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou pelo menos um sintoma ou complicação associada à condição ou doença, de modo que os níveis de glicose ou cetona no sangue sejam reduzidos ou que a condição ou doença seja mediada, ou pelo menos um sintoma ou complicação associada à condição ou doença seja aliviado ou reduzido em gravidade, em que a condição ou doença é selecionada dentre o grupo consistindo em diabetes, tolerância à glicose diminuída, obesidade, nefropatia, neuropatia, retinopatia, catarata, derrame, aterosclerose, dificuldade de cicatrização de feridas, cetoacidose diabética, hiperglicemia, síndrome hiperosmolar hiperglicêmica, hiperglicemia no perioperatório, hiperglicemia em um paciente de unidade de tratamento intensivo, hiperinsulinemia, síndrome metabólica, síndrome de resistência à insulina e alteração da glicemia de jejum.
15. Uso do anticorpo isolado ou fragmento de ligação antigênica do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou da composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para reduzir os níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou para tratar um paciente tendo uma doença ou condição associada ou definida em parte por altos níveis sanguíneos de glicose ou cetona, ou pelo menos um sintoma ou complicação associada à condição ou doença, em que a condição ou doença é selecionada dentre o grupo consistindo em diabetes, tolerância à glicose diminuída, obesidade, nefropatia, neuropatia, retinopatia, catarata, derrame, aterosclerose, dificuldade de cicatrização de feridas, cetoacidose diabética, hiperglicemia, síndrome hiperosmolar hiperglicêmica, hiperglicemia no perioperatório, hiperglicemia em um paciente de unidade de tratamento intensivo, hiperinsulinemia, síndrome metabólica, síndrome de resistência à insulina e alteração da glicemia de jejum.
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