BR112020026498A2

BR112020026498A2 - Elementos regulatórios de planta e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020026498A2
Application number: BR112020026498-9A
Authority: BR
Inventors: Ian W. Davis; Aabid Shariff
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-04-06
Also published as: EP3830277A1; CN112368389A; US20220090110A1; CA3105288A1; US20240093216A1; CL2021000262A1; US20200056196A1; US11866718B2; AR114542A1; UY38327A; CR20210037A; WO2020028773A1; CN112368389B; JP2021532739A; US11168330B2; MX2021001076A; CN118792304A; KR20210040838A; PH12021550220A1; JP2024010102A

Abstract

elementos regulatórios de planta e usos dos mesmos. a presente invenção refere-se a moléculas e constructos de dna recombinante, bem como suas sequências de nucleotídeos, úteis para modular a expressão de genes em plantas. a invenção também se refere a plantas transgênicas, células de plantas, partes de plantas e sementes compreendendo as moléculas de dna recombinante operativamente ligadas a moléculas de dna transcritíveis heterólogas, como são métodos para seu uso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ELEMENTOS REGULATÓRIOS DE PLANTA E USOS DOS MESMOS”.

REFERÊNCIA AO PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório dos Estados Unidos 62 /714,228, depositado em 3 de agosto de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] A listagem de sequências que está contida no arquivo denominado "38-21-62691-0001_Seqlist_ST25.txt", é 31.060 bytes (conforme medido no Microsoft Windows®), foi criada em 2 de julho de 2019 e é arquivada com o presente por envio eletrônico e aqui incorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção refere-se aos campos da biologia molecular de plantas e manipulação genética de plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a moléculas de DNA úteis para modular a expressão genética em plantas.

FUNDAMENTOS

[004] Os elementos regulatórios são elementos genéticos que regulam a atividade genética, modulando a transcrição de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada. Tais elementos podem incluir promotores, líderes, íntrons e regiões não traduzidas de 3' e são úteis nos campos da biologia molecular de plantas e engenharia genética de plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A invenção fornece novos elementos regulatórios sintéticos de genes para uso em plantas. A invenção também fornece constructos de moléculas de DNA recombinante compreendendo os elementos regulatórios. A presente invenção também fornece células, plantas e sementes vegetais transgênicas, compreendendo os elementos regulatórios. Numa modalidade, os elementos regulatórios estão operativamente ligados a uma molécula de DNA transcritível. Em certas modalidades, a molécula de DNA transcritível pode ser heteróloga em relação à sequência regulatória. Assim, uma sequência de elemento regulatória fornecida pela invenção pode, em modalidades particulares, ser definida como operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga. A presente invenção também fornece métodos de utilização de elementos regulatórios e fabricação e utilização de moléculas de DNA recombinante compreendendo os elementos regulatórios e as células, plantas e sementes vegetais transgênicas compreendendo os elementos regulatórios operativamente ligados a uma molécula de DNA transcritível.

[006] Assim, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; e (c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26, em que o fragmento tem atividade regulatória do gene; em que a sequência está operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga. Por “molécula de DNA transcrita heteróloga” entende-se que a molécula de DNA transcritível é heteróloga em relação à sequência polinucleotídica à qual está operativamente ligada. Em modalidades específicas, a molécula de DNA recombinante compreende uma sequência de DNA com pelo menos cerca de 85 por cento, pelo menos cerca de 86 por cento, pelo menos cerca de 87 por cento, pelo menos cerca de 88 por cento, pelo menos cerca de 89 por cento, pelo menos cerca de 90 por cento, em pelo menos 91 por cento,

pelo menos 92 por cento, pelo menos 93 por cento, pelo menos 94 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, ou pelo menos 99 por cento de identidade de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26. Em modalidades particulares, a sequência de DNA compreende um elemento regulatório. Em algumas modalidades, o elemento regulatório compreende um promotor. Em ainda outras modalidades, o elemento regulatório compreende um íntron. Em ainda outras modalidades, o elemento regulatório compreende uma UTR 3'. Ainda em outras modalidades, a molécula de DNA transcritível heteróloga compreende um gene de interesse agronômico, tal como um gene capaz de fornecer resistência a herbicidas em plantas, ou um gene capaz de fornecer resistência a pragas de plantas em plantas. Em ainda outras modalidades, a molécula de DNA transcritível heteróloga compreende uma sequência que codifica um RNA pequeno, como um dsRNA, um miRNA ou siRNA. Em ainda outras modalidades, a invenção fornece um constructo compreendendo uma molécula de DNA recombinante como fornecida neste documento.

[007] Em outro aspecto, são fornecidas aqui células vegetais transgênicas compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; e (c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26, em que o fragmento tem atividade regulatória do gene; em que a sequência de DNA está operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga. Em certas modalidades, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal monocotiledônea. Em outras modalidades, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal dicotiledônea.

[008] Em ainda outro aspecto, ainda é fornecido aqui uma planta transgênica, ou parte da mesma, compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: a) uma sequência com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; b) uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26, em que o fragmento tem atividade regulatória do gene; em que a sequência está operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga. Em modalidades específicas, a planta transgênica é uma planta progenitora de qualquer geração que compreende a molécula de DNA recombinante. Uma semente transgênica compreendendo a molécula de DNA recombinante que produz uma planta transgênica quando cultivada também é fornecida neste documento.

[009] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de um produto de base compreendendo obter uma planta transgênica ou uma parte da mesma contendo uma molécula de DNA recombinante da invenção e produzindo o produto de base a partir da mesma. Em uma modalidade, o produto de base são sementes, sementes processadas, concentrado de proteína, isolado de proteína, amido, grãos, partes de plantas, óleo de semente, biomassa, farinha e refeição.

[0010] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de uma planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante da invenção compreendendo transformar uma célula vegetal com a molécula de DNA recombinante da invenção para produzir uma célula vegetal transformada e regenerar uma planta transgênica da célula vegetal transformada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0011] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de DNA de um grupo de elemento de expressão regulatória sintética (EXP), EXP-Zm.GSP850 compreendendo um promotor sintético (P-Zm.GSP850.nno: 4), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L-Zm.GSP850.nno:3).

[0012] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de DNA de um promotor sintético, P-Zm.GSP850.nno:4.

[0013] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de DNA de um líder sintético, L-Zm.GSP850.nno:3.

[0014] SEQ ID NO:4 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-Zm.GSP850.nno+ Zm.GSI153.nno:2 compreendendo um promotor sintético (P-Zm.GSP850.nno:4), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L-Zm.GSP850.nno:3), operativamente ligado em 5' a um íntron sintético (I-Zm.GSI153.nno:1).

[0015] SEQ ID NO:5 é uma sequência de DNA de um íntron sintético, I-Zm.GSI153.nno:1.

[0016] SEQ ID NO:6 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-Zm.GSP990 compreendendo um promotor sintético (P- Zm.GSP990.nno:2), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L- Zm.GSP990.nno:1).

[0017] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de DNA de um promotor sintético, P-Zm.GSP990.nno:2.

[0018] SEQ ID NO: 8 é uma sequência de DNA de um líder sintético, L-Zm.GSP990.nno:1.

[0019] SEQ ID NO:9 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-Zm.GSP990.nno+ Zm.GSI197.nno:2 compreendendo um promotor sintético (P-Zm.GSP990.nno:2), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L-Zm.GSP990.nno:1), operativamente ligado em 5'

a um íntron sintético (I-Zm.GSI197.nno:1).

[0020] SEQ ID NO:10 é uma sequência de DNA de um íntron sintético, I-Zm.GSI197.nno:1.

[0021] SEQ ID NO:11 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 compreendendo um promotor sintético (P-Zm.GSP850.nno:4), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L-Zm.GSP850.nno:3), operativamente ligado em 5' a um íntron sintético (I-Zm.GSI140.nno:1).

[0022] SEQ ID NO:12 é uma sequência de DNA de um íntron sintético, I-Zm.GSI140.nno:1.

[0023] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de DNA de uma UTR 3' sintética, T-Zm.GST9.nno:2.

[0024] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de DNA de uma UTR 3' sintética, T-Zm.GST18.nno:2.

[0025] SEQ ID NO:15 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 compreendendo um promotor sintético (P-Zm.GSP850.nno:4), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L-Zm.GSP850.nno:3), operativamente ligado em 5' a um íntron (I-Zm.DnaK:1).

[0026] SEQ ID NO:16 é sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 compreendendo um promotor sintético (P-Zm.GSP990.nno:2), operativamente ligado em 5' a um líder sintético (L-Zm.GSP990.nno:1), operativamente ligado em 5' a um íntron (I-Zm.DnaK:1).

[0027] SEQ ID NO:17 é uma sequência de DNA de um intensificador sintético, E-Zm.GSP850, que é derivado do promotor sintético, P-Zm.GSP850.nno:4.

[0028] SEQ ID NO:18 é uma sequência de DNA de um intensificador sintético, E-Zm.GSP990, que é derivado do promotor sintético, P-Zm.GSP990.nno:2.

[0029] SEQ ID NO:19 é uma sequência de DNA de uma UTR 3', T- Sb.Nltp4-1:1:2 derivada do gene NLTP4 (proteína de transferência de lipídeo não específica 4) de Sorghum bicolor.

[0030] SEQ ID NO:20 é uma sequência de codificação sintética otimizada para expressão em planta para ß-glucuronidase (GUS) com um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido induzível por luz de batata (Acessão Genbank: X04753).

[0031] SEQ ID NO:21 é uma sequência de DNA de EXP, EXP- CaMV.35S compreendendo o promotor 35S e líder derivado do vírus do mosaico da Couve-flor.

[0032] SEQ ID NO:22 é uma sequência de DNA do íntron, I- Zm.DnaK:1 derivado do gene da proteína de choque térmico 70 (Hsp70) (DnaK) de Zea mays.

[0033] SEQ ID NO:23 é uma sequência de DNA da UTR 3', T- Os.LTP:1 derivada do gene semelhante à proteína de transferência de lipídeos (LTP) de Oryza sativa.

[0034] SEQ ID NO:24 é uma sequência de codificação para expressão em planta para ß-glucuronidase (GUS) com um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido induzível por luz de batata (Acessão Genbank: X04753).

[0035] SEQ ID NO:25 é uma sequência de codificação para a proteína fluorescente de luciferase NanoLuc® (Promega, Madison, WI 53711), Nluc que foi engenheirada por evolução direcionada de uma luciferase de camarão de profundidade (Oplophorus gacilirostris) .

[0036] SEQ ID NO: 26 é uma sequência de DNA de uma UTR 3' sintética, T-Zm.GST43.nno:1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] A invenção fornece elementos regulatórios sintéticos com atividade regulatória de genes em plantas. As sequências nucleotídicas desses elementos regulatórios sintéticos são fornecidas como SEQ ID

NOs: 1-18 e SEQ ID NO: 26. Estes elementos regulatórios sintéticos são capazes de afetar a expressão de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada em tecidos vegetais e, portanto, regular a expressão de genes de um transgene operativamente ligado em plantas transgênicas. A invenção também fornece novos elementos regulatórios endógenos com atividade regulatória de genes em plantas e fornecidos como SEQ ID NO: 19. A invenção também fornece métodos de modificação, produção e utilização de moléculas de DNA recombinante que contêm os elementos regulatórios sintéticos e endógenos fornecidos. A invenção também fornece composições que incluem células vegetais transgênicas, plantas, partes de plantas e sementes contendo as moléculas de DNA recombinante da invenção, e métodos para a preparação e utilização das mesmas.

[0038] As seguintes definições e métodos são fornecidos para melhor definir a presente invenção e para guiar os versados na técnica na prática da presente invenção. Salvo indicação em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados na técnica relevante. Moléculas de DNA

[0039] Como utilizado neste documento, o termo "DNA" ou "molécula de DNA" refere-se a uma molécula de DNA de cadeia dupla de origem genômica ou sintética, isto é, um polímero de bases de desoxirribonucleotídeos ou uma molécula de DNA, lida da extremidade 5' (a montante) para a extremidade 3´ (a jusante). Como utilizado neste documento, o termo "sequência de DNA" refere-se à sequência nucleotídica de uma molécula de DNA. A nomenclatura usada neste documento corresponde àquela do Título 37 do Código dos Regulamentos Federais dos Estados Unidos § 1.822, e apresentada nas tabelas do Padrão WIPO ST.25 (1998), Apêndice 2, Tabelas 1 e 3.

[0040] Como usado neste documento, uma “molécula de DNA recombinante” é uma molécula de DNA que compreende uma combinação de moléculas de DNA que não ocorreriam naturalmente juntas sem intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante pode ser uma molécula de DNA que é composta por pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que se desvia das sequências de DNA existentes na natureza, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA sintética ou uma molécula de DNA que foi incorporado ao DNA de uma célula hospedeira por transformação genética ou edição genética.

[0041] Como utilizado neste documento, uma "sequência nucleotídica sintética" ou "sequência nucleotídica artificial" é uma sequência nucleotídica que não se sabe ocorrer na natureza ou que não ocorre naturalmente. Os elementos regulatórios de genes da presente invenção compreendem sequências nucleotídicas sintéticas. De preferência, as sequências nucleotídicas sintéticas compartilham pouca ou nenhuma homologia estendida com as sequências naturais. Homologia estendida neste contexto geralmente se refere a 100% de identidade de sequência que se estende além de cerca de 25 nucleotídeos de sequência contígua.

[0042] A referência neste pedido a uma “molécula de DNA isolada”, ou a um termo ou frase equivalente, pretende significar que a molécula de DNA é uma que está presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro do seu ambiente natural. Por exemplo, elementos de ácido nucleico tais como uma sequência codificadora, sequência de íntrons, sequência líder não traduzida, sequência promotora, sequência de terminação transcricional e semelhantes, que se encontram naturalmente no DNA do genoma de um organismo, não são considerados como “isolados”, desde que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no sítio dentro do genoma em que ele é naturalmente encontrado. No entanto, cada um desses elementos, e subpartes desses elementos, estaria “isolado” dentro do escopo desta divulgação, desde que o elemento não esteja dentro do genoma do organismo e no sítio dentro do genoma em que ele é naturalmente encontrado. De igual modo, uma sequência nucleotídica codificando uma proteína inseticida ou qualquer variante de inseticida de ocorrência natural dessa proteína seria uma sequência nucleotídica isolada desde que a sequência nucleotídica não estivesse no DNA da bactéria a partir da qual a sequência codificadora da proteína seja encontrada naturalmente. Uma sequência nucleotídica sintética codificando a sequência de aminoácidos da proteína inseticida de ocorrência natural seria considerada como sendo isolada para os propósitos desta divulgação. Para os propósitos desta divulgação, qualquer sequência nucleotídica transgênica, isto é, a sequência nucleotídica do DNA inserido no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente num vetor extracromossômico, seria considerada uma sequência nucleotídica isolada, independentemente de ser uma sequência nucleotídica transgênica está presente dentro do plasmídeo ou estrutura semelhante utilizada para transformar as células, no genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis em tecidos, progênie, amostras biológicas ou produtos de base derivados da planta ou bactéria.

[0043] Como utilizado neste documento, o termo “identidade de sequência” refere-se à extensão em que duas sequências polinucleotídicas alinhadas otimamente ou duas sequências polipeptídicas alinhadas otimamente são idênticas. Um alinhamento ótimo de sequências é criado alinhando manualmente duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e outra sequência, para maximizar o número de correspondências de nucleotídeos no alinhamento de sequências com inserções, deleções ou lacunas de nucleotídeos internos apropriados. Como utilizado neste documento, o termo "sequência de referência" refere-se a uma sequência de DNA fornecida como SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26.

[0044] Como utilizado neste documento, o termo “identidade de sequência percentual” ou “identidade percentual” ou “% de identidade” é a fração de identidade multiplicada por 100. A “fração de identidade” para uma sequência otimamente alinhada com uma sequência de referência é o número de correspondências de nucleotídeos no alinhamento ótimo, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos no comprimento total da sequência de referência inteira. Assim, uma modalidade da invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência que, quando alinhada de forma ótima com uma sequência de referência, fornecida neste documento como SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO:26, tem pelo menos cerca de 85 por cento de identidade, pelo menos cerca de 86 por cento identidade, pelo menos cerca de 87 por cento de identidade, pelo menos cerca de 88 por cento de identidade, pelo menos 89 por cento de identidade, pelo menos 90 por cento de identidade, pelo menos 91 por cento de identidade, pelo menos 92 por cento de identidade, pelo menos 93 por cento de identidade, pelo menos cerca de 94 por cento de identidade, pelo menos cerca de 95 por cento de identidade, pelo menos cerca de 96 por cento de identidade, pelo menos cerca de 97 por cento de identidade, pelo menos cerca de 98 por cento de identidade, pelo menos 99 por cento de identidade ou pelo menos 100 por cento de identidade para a sequência de referência. As moléculas de DNA com uma identidade de sequência percentual com a molécula de referência podem exibir a atividade da sequência de referência. Elementos regulatórias

[0045] Elementos regulatórios tais como promotores, líderes

(também conhecidos como UTRs 5'), intensificadores, íntrons e regiões de terminação da transcrição (ou UTRs 3´ ) desempenham um papel fundamental na expressão geral dos genes nas células vivas. O termo "elemento regulatório", como usado neste documento, refere-se a uma molécula de DNA possuindo atividade regulatório do gene. O termo “atividade regulatória do gene”, como usado neste documento, refere- se à capacidade de afetar a expressão de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada, por exemplo, afetando a transcrição e/ou tradução da molécula de DNA que pode ser transcrita ligada de forma operacional. Elementos regulatórios, como promotores, líderes, intensificadores, íntrons e UTRs 3' que funcionam em plantas são, portanto, úteis para modificar fenótipos de plantas por meio de engenharia genética.

[0046] Como utilizado neste documento, uma sequência "grupo de elementos de expressão regulatória" ou "EXP" pode referir-se a um grupo de elementos regulatórios operativamente ligados, tais como intensificadores, promotores, líderes e íntrons. Por exemplo, um grupo de elementos de expressão regulatória pode ser compreendido, por exemplo, de um promotor ligado operativamente em 5' a uma sequência líder. EXP's úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16.

[0047] Os elementos regulatórios podem ser caracterizados por seu padrão de expressão de genes, por exemplo, efeitos positivos e/ou negativos, como expressão constitutiva ou expressão temporal, espacial, de desenvolvimento, tecidual, ambiental, fisiológica, patológica, de ciclo celular e/ou quimicamente responsiva, e qualquer combinação da mesma, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. Como utilizado neste documento, um "padrão de expressão genética" é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA operativamente ligada numa molécula de RNA transcrita. A molécula de

RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína ou pode fornecer uma molécula de RNA antissentido ou outra molécula de RNA regulatória, como um RNA de fita dupla (dsRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA ribossômico (rRNA), um microRNA (miRNA), um RNA interferente pequeno (siRNA) e semelhantes.

[0048] Como utilizado neste documento, o termo "expressão de proteína" é qualquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrito numa molécula de proteína. A expressão de proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento ou morfológicas, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas.

[0049] Um promotor é útil como um elemento regulatório para modular a expressão de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada. Como utilizado neste documento, o termo “promotor” refere-se geralmente a uma molécula de DNA que está envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase II e outras proteínas, tais como fatores de transcrição trans-ativadores, para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado da região 5' não traduzida (5' UTR) de uma cópia genômica de um gene. Alternativamente, os promotores podem ser moléculas de DNA sinteticamente produzidas ou manipuladas. Os promotores também podem ser quiméricos. Promotores quiméricos são produzidos através da fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogas. Promotores úteis na prática da presente invenção incluem elementos promotores fornecidos como SEQ ID NOs: 2 e 7, ou compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16, ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas da invenção, as moléculas de DNA reivindicadas e quaisquer variantes ou derivados dos mesmos como descritos neste documento, são ainda definidas como compreendendo atividade promotora, isto é, são capazes de atuar como um promotor numa célula hospedeira, tal como numa planta transgênica. Ainda noutras modalidades específicas, um fragmento pode ser definido como exibindo atividade promotora possuída pela molécula promotora de partida a partir da qual é derivada, ou um fragmento pode compreender um “promotor mínimo” que fornece um nível basal de transcrição e é compreendido por uma caixa TATA, ou sequência de DNA equivalente para reconhecimento e ligação do complexo de RNA polimerase II para iniciação da transcrição.

[0050] Numa modalidade, são fornecidos fragmentos de uma sequência EXP ou uma sequência promotora divulgada neste documento. Os fragmentos promotores podem compreender atividade promotora, como descrito acima, e podem ser úteis isoladamente ou em combinação com outros promotores e fragmentos promotores, tais como na construção de promotores quiméricos, ou em combinação com outros elementos de expressão e fragmentos de elementos de expressão. Em modalidades específicas, são fornecidos fragmentos de um promotor compreendendo pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 225, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 900 ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma molécula de DNA possuindo atividade promotora tal como divulgada neste documento. Os métodos para produzir tais fragmentos a partir de uma molécula promotora de partida são bem conhecidos na técnica.

[0051] Em outras modalidades, fragmentos de sequências de intensificador ou íntron divulgados neste documento são fornecidos.

Fragmentos de intensificador ou íntron podem compreender a atividade da molécula de base da qual foram derivados e podem ser úteis sozinhos ou em combinação com outros elementos regulatórios, incluindo promotores, líderes, outros intensificadores, outros íntrons ou fragmentos dos mesmos. Em modalidades específicas, fragmentos de um intensificador ou íntron são fornecidos compreendendo pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 225, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma molécula de DNA com atividade de intensificador ou íntron como aqui divulgado. Os métodos para produzir tais fragmentos a partir de uma molécula de partida são bem conhecidos na técnica.

[0052] Em outras modalidades, são fornecidos fragmentos de sequências UTR 3' aqui divulgadas. Os fragmentos de UTR 3' podem compreender a atividade da molécula UTR 3' de base da qual foram derivados e podem ser úteis sozinhos ou em combinação com outros elementos regulatórios, incluindo promotores, líderes, íntrons ou fragmentos dos mesmos. Em modalidades específicas, fragmentos de um íntron são fornecidos compreendendo pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200 , pelo menos cerca de 225, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma molécula de DNA com atividade de UTR 3' como aqui divulgado. Os métodos para produzir tais fragmentos a partir de uma molécula de UTR 3' de início são bem conhecidos na técnica.

[0053] Composições derivadas de qualquer um dos elementos promotores fornecidos como SEQ ID NOs: 2 e 7, ou compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16, como deleções internas ou 5', por exemplo, podem ser produzidos usando métodos conhecidos na técnica para melhorar ou alterar a expressão, incluindo a remoção de elementos que têm efeitos positivos ou negativos na expressão; duplicar elementos que têm efeitos positivos ou negativos na expressão; e / ou duplicar ou remover elementos que têm efeitos específicos de tecido ou célula na expressão. Composições derivadas de qualquer um dos elementos promotores fornecidos como SEQ ID NOs: 2 e 7, ou compreendidas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16, compreendidas por deleções 3' nas quais o elemento caixa TATA ou sequência equivalente do mesmo e a sequência a jusante removida podem ser usados, por exemplo, para fazer elementos intensificadores. Outras deleções podem ser feitas para remover quaisquer elementos positivos ou negativos; efeitos específicos de tecido; específicos de célula; ou específicos do tempo (tais como, mas não limitados a, ritmo circadiano) na expressão. Qualquer um dos elementos promotores fornecidos como SEQ ID NOs: 2 e 7, ou compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16 e fragmentos ou intensificadores derivados deles podem ser usados para tornar quiméricas composições de elementos regulatórios transcricionais.

[0054] De acordo com a invenção, um promotor ou fragmento de promotor pode ser analisado quanto à presença de elementos promotores conhecidos, isto é, características da sequência de DNA, tal como uma caixa TATA e outros motivos do sítio de ligação do fator de transcrição conhecidos. A identificação de tais elementos promotores conhecidos pode ser utilizada por um versado na técnica para conceber variantes do promotor com um padrão de expressão semelhante ao promotor original.

[0055] Como utilizado neste documento, o termo "líder" refere-se a uma molécula de DNA isolada da região 5' não traduzida (UTR 5') de um gene e definida geralmente como um segmento nucleotídico entre o sítio de partida da transcrição (TSS) e o sítio de partida da sequência de codificação da proteína. Alternativamente, os líderes podem ser elementos de DNA sinteticamente produzidos ou manipulados. Um líder pode ser usado como um elemento regulatório 5' para modular a expressão de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada. As moléculas líder podem ser utilizadas com um promotor heterólogo ou com o seu promotor nativo. Líderes úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 3 e 8; ou qualquer um dos elementos líder compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16 ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas, tais sequências de DNA podem ser definidas como sendo capazes de atuar como um líder numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, uma célula vegetal transgênica. Numa modalidade, essas sequências são descodificadas como compreendendo atividade líder.

[0056] As sequências líder (também referidas como UTRs 5') apresentadas como SEQ ID NOs: 3 e 8 ou qualquer um dos elementos líderes compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16 podem ser compostas de elementos regulatórios, ou pode adotar estruturas secundárias que podem ter um efeito na transcrição ou tradução de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada. As sequências líderes apresentadas como SEQ ID NOs: 3 e 8 ou qualquer um dos elementos líderes compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 9, 11, 15 e 16 podem ser utilizadas de acordo com a invenção para fazer elementos regulatórios quiméricos que afetam a transcrição ou tradução de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada.

[0057] Como utilizado neste documento, o termo "íntron" refere-se a uma molécula de DNA que pode ser isolada ou identificada a partir de um gene e pode ser definida geralmente como uma região separada durante o processamento do RNA mensageiro (mRNA) antes da tradução. Alternativamente, um íntron pode ser um elemento de DNA produzido ou manipulado sinteticamente. Um íntron pode conter elementos intensificadores que afetam a transcrição de genes operativamente ligados. Um íntron pode ser utilizado como um elemento regulatório para modular a expressão de uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada. Um constructo pode compreender um íntron e o íntron pode ou não ser heterólogo em relação à molécula de DNA transcritível. Exemplos de íntrons na técnica incluem o íntron de actina de arroz e o íntron de HSP70 de milho.

[0058] Em plantas, a inclusão de alguns íntrons em constructos de genes leva ao aumento do mRNA e ao acúmulo de proteínas em relação a constructos sem o íntron. Este efeito foi denominado “intensificação mediada por íntrons” (IME) da expressão de genes. Íntrons conhecidos por estimular a expressão em plantas foram identificados em genes de milho (por exemplo, tubA1, Adh1, Sh1 e Ubi1), em genes de arroz (por exemplo, tpi) e em genes de plantas dicotiledôneas como os de petúnia (por exemplo, rbcS) (por exemplo, st-ls1) e de Arabidopsis thaliana (por exemplo, ubq3 e pat1). Foi demonstrado que deleções ou mutações nos sítios de emenda de um íntron reduzem a expressão de gene, indicando que a emenda pode ser necessária para IME. No entanto, a IME em plantas dicotiledôneas foi demonstrada por mutações pontuais nos sítios de emenda do gene pat1 de A. thaliana. Múltiplos usos do mesmo íntron em uma planta demonstraram exibir desvantagens. Nesses casos, é necessário ter uma coleção de elementos básicos de controle para a construção de elementos apropriados de DNA recombinante. Os íntrons exemplificativos úteis na prática da presente invenção são apresentados como SEQ ID NOs: 5, 10 e 12.

[0059] Como utilizado neste documento, os termos "molécula 3' de terminação de transcrição", "região 3' não traduzida" ou "UTR 3'" referem-se a uma molécula de DNA que é usada durante a transcrição para a região não traduzida da porção 3' de uma molécula de mRNA. A região 3' não traduzida de uma molécula de mRNA pode ser gerada por clivagem específica e poliadenilação 3´, também conhecida como cauda polyA. Uma UTR 3' pode estar operativamente ligada e localizada a jusante de uma molécula de DNA transcritível pode incluir um sinal de poliadenilação e outros sinais regulatórios capazes de afetar a transcrição, processamento de mRNA ou expressão de genes. Acredita- se que as caudas PolyA funcionem na estabilidade do mRNA e no início da tradução. Exemplos de moléculas de terminação de transcrição 3' na técnica são a região 3' da nopalina sintetase, região 3' de trigo hsp17, região 3' de subunidades pequenas de ervilha rubisco, região E6 3' de algodão e UTR 3' da coixina.

[0060] UTRs 3' normalmente encontram uso benéfico para a expressão recombinante de moléculas de DNA específicas. Uma UTR 3' fraca tem o potencial de gerar leitura, o que pode afetar a expressão da molécula de DNA localizada nas cassetes de expressão vizinhas. O controle apropriado da terminação da transcrição pode impedir a leitura em sequências de DNA (por exemplo, outras cassetes de expressão) localizadas a jusante e pode ainda permitir a reciclagem eficiente de RNA polimerase para melhorar a expressão genética. A terminação eficiente da transcrição (liberação de RNA Polimerase II do DNA) é pré- requisito para o reinício da transcrição e, portanto, afeta diretamente o nível geral do transcrito. Após a terminação da transcrição, o mRNA maduro é liberado do sítio de síntese e o modelo é transportado para o citoplasma. Os mRNAs eucarióticos são acumulados como formas poli (A) in vivo, tornando difícil detectar sítios de terminação transcricional por métodos convencionais. Entretanto, a predição de UTRs 3' funcionais e eficientes por métodos de bioinformática é difícil, pois não há sequências conservadas de DNA que permitam a fácil predição de uma UTR 3' efetiva.

[0061] De um ponto de vista prático, é tipicamente benéfico que uma UTR 3' usada em uma cassete de expressão possua as seguintes características. Primeiro, a UTR 3' deve ser capaz de terminar de forma eficiente e eficaz a transcrição do transgene e impedir a leitura do transcrito em qualquer sequência de DNA vizinha, que pode ser composta por outra cassete de expressão, como no caso de cassetes de expressão múltipla que residem em um DNA de transferência (T- DNA) ou o DNA cromossômico vizinho no qual o T-DNA foi inserido. Segundo, a UTR 3' não deve causar uma redução na atividade transcricional transmitida pelo promotor, líder, intensificadores e íntrons que são usados para dirigir a expressão da molécula de DNA. Finalmente, na biotecnologia vegetal, a UTR 3' é frequentemente usada para inicializar reações de amplificação do RNA reverso transcrito extraído da planta transformada e usado para: (1) avaliar a atividade transcricional ou a expressão da cassete de expressão, uma vez integrada ao cromossomo da planta; (2) avaliar o número de cópias de inserções no DNA da planta; e (3) avaliar a zigosidade da semente resultante após a reprodução. A UTR 3' também é usada em reações de amplificação de DNA extraído da planta transformada para caracterizar a integridade da cassete inserida. UTRs 3' úteis na prática da presente invenção são apresentadas como SEQ ID NOs: 13, 14, 19 e 26.

[0062] Como usado neste documento, o termo 'intensificador" ou "elemento intensificador" refere-se a um elemento regulatório de ação cistambém conhecido como elemento cisque confere um aspecto do padrão de expressão global, mas é geralmente insuficiente sozinho para dirigir a transcrição molécula de DNA transcritível ligada. Ao contrário dos promotores, os elementos intensificadores não incluem habitualmente um sítio de início da transcrição (TSS) ou caixa TATA ou sequência de DNA equivalente. Um promotor ou fragmento de promotor pode compreender naturalmente um ou mais elementos intensificadores que afetam a transcrição de uma sequência de DNA operativamente ligada. Um elemento intensificador também pode ser fundido a um promotor para produzir um elemento promotor quimérico cisque confere um aspecto da modulação geral da expressão de genes.

[0063] Acredita-se que muitos elementos intensificadores do promotor se liguem às proteínas de ligação ao DNA e/ou afetem a topologia do DNA, produzindo conformações locais que permitem seletivamente ou restringem o acesso da RNA polimerase ao DNA ou que facilitam a abertura seletiva da dupla hélice no sítio da iniciação transcricional. Um elemento intensificador pode funcionar para ligar fatores de transcrição que regulam a transcrição. Alguns elementos intensificadores ligam mais do que um fator de transcrição e os fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com mais do que um domínio de intensificador. Os elementos intensificadores podem ser identificados por várias técnicas, incluindo a análise de deleção, isto é, a eliminação de um ou mais nucleotídeos da extremidade 5' ou interna a um promotor, análise da proteína de ligação ao DNA usando pegada DNase I, interferência da metilação, ensaios de deslocamento da mobilidade eletroforética , pegada genômica in vivo por reação em cadeia da polimerase mediada por ligação (PCR) e outros ensaios convencionais, ou por análise de semelhança de sequência de DNA utilizando motivos de elemento cisou elementos intensificadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com métodos convencionais de comparação de sequências de DNA, como BLAST. A estrutura fina de um domínio intensificador pode ser ainda estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais conhecidos na técnica. Os elementos intensificadores podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento a partir de elementos regulatórios que incluem esses elementos, e podem ser sintetizados com nucleotídeos flanqueadores adicionais que contêm sítios de enzima de restrição úteis para facilitar a manipulação subsequente. Assim, a concepção, construção e utilização de elementos intensificadores de acordo com os métodos aqui divulgados para modular a expressão de moléculas de DNA transcritíveis operativamente ligadas são abrangidos pela invenção. Intensificadores exemplificativos úteis na prática desta invenção são apresentados como SEQ ID NOs: 17 e 18.

[0064] Como utilizado neste documento, o termo "quimérico" refere- se a uma única molécula de DNA produzida por fusão de uma primeira molécula de DNA a uma segunda molécula de DNA, em que nem a primeira nem a segunda molécula de DNA seriam normalmente encontradas nessa configuração, isto é , fundidas com a outra. A molécula de DNA quimérica é, portanto, uma nova molécula de DNA que não é normalmente encontrada na natureza. Como utilizado neste documento, o termo "promotor quimérico" refere-se a um promotor produzido através de tal manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA; por exemplo, a fusão de um promotor a um elemento intensificador. Assim, a concepção, construção e utilização de promotores quiméricos de acordo com os métodos aqui divulgados para modular a expressão de moléculas de DNA transcritíveis operativamente ligadas são abrangidos pela presente invenção.

[0065] Elementos regulatórios quiméricos podem ser projetados para compreender vários elementos constituintes que podem ser operativamente ligados por vários métodos conhecidos na técnica, tais como digestão e ligação de enzimas de restrição, clonagem independente de ligação, montagem modular de produtos de PCR durante amplificação ou síntese química direta do elemento regulatório, bem como outros métodos conhecidos na técnica. Os vários elementos regulatórios quiméricos resultantes podem ser constituídos pelas mesmas, ou variantes dos mesmos elementos constituintes, mas diferem na sequência de DNA ou sequências de DNA que compreendem a sequência ou sequências de DNA de ligação que permitem que as partes constituintes sejam operativamente ligadas. Na invenção, as sequências de DNA fornecidas como SEQ ID NOs:1-19 e SEQ ID NO:26 podem fornecer sequências de referência de elemento regulatório, em que os elementos constituintes que compreendem a sequência de referência podem ser unidos por métodos conhecidos na técnica e podem compreender substituições, deleções, e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente na transformação de células bacterianas e vegetais.

[0066] Como utilizado neste documento, o termo “variante” refere- se a uma segunda molécula de DNA, tal como um elemento regulatório, que é em composição semelhante, mas não idêntica a uma primeira molécula de DNA e em que a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade geral, isto é , o mesmo padrão de expressão ou semelhante, por exemplo através de atividade de transcrição mais ou menos equivalente, da primeira molécula de DNA. Uma variante pode ser uma versão mais curta ou truncada da primeira molécula de DNA ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, tal como uma com diferentes sítios de enzimas de restrição e/ou deleções internas, substituições ou inserções. Uma “variante” pode também englobar um elemento regulatório tendo uma sequência nucleotídica compreendendo uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência de referência, em que o elemento regulatório derivado tem mais ou menos ou equivalente atividade de transcrição ou tradução do que a molécula regulatória parental correspondente. “Variantes” do elemento regulatório também abrangerá variantes decorrentes de mutações que ocorrem naturalmente na transformação de células bacterianas e vegetais. Na presente invenção, as sequências polinucleotídicas fornecidas como SEQ ID NOs:1-19 e SEQ ID NO:26 podem ser utilizadas para criar variantes que sejam semelhantes na composição, mas não idênticas à sequência de DNA do elemento regulatório original, mantendo ao mesmo tempo a funcionalidade geral, isto é, o mesmo padrão de expressão ou semelhante, do elemento regulatório original. A produção de tais variantes da invenção está bem dentro do conhecimento comum na técnica à luz da divulgação e está englobada no escopo da invenção.

[0067] A eficácia das modificações, duplicações ou deleções descritas neste documento nos aspectos de expressão desejados de um transgene particular pode ser testada empiricamente em ensaios de plantas estéreis e transitórios, tais como os descritos nos exemplos de trabalho apresentados neste documento, de modo a validar os resultados, que pode variar dependendo das alterações feitas e do objetivo da mudança na molécula de DNA inicial. Constructos

[0068] Como utilizado neste documento, o termo "constructo" significa qualquer molécula de DNA recombinante, tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, fago, ou molécula de DNA ou RNA linear ou circular, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de DNA em que pelo menos uma molécula de DNA foi ligada a outra molécula de DNA de um modo funcionalmente operativo, isto é, operativamente ligado. Como utilizado neste documento, o termo “vetor” significa qualquer constructo que possa ser usada para o propósito de transformação, isto é, a introdução de DNA ou RNA heterólogo em uma célula hospedeira. Um constructo inclui tipicamente uma ou mais cassetes de expressão. Como utilizado neste documento, uma “cassete de expressão” refere-se a uma molécula de DNA compreendendo pelo menos uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada a um ou mais elementos regulatórios, tipicamente pelo menos um promotor e um UTR 3'.

[0069] Como utilizado neste documento, o termo “operativamente ligado” refere-se a uma primeira molécula de DNA unida a uma segunda molécula de DNA, em que a primeira e segunda moléculas de DNA estão dispostas de tal modo que a primeira molécula de DNA afeta a função da segunda molécula de DNA. As duas moléculas de DNA podem ou não ser parte de uma única molécula de DNA contígua e podem ou não ser adjacentes. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma molécula de DNA transcritível se o promotor modular a transcrição da molécula de DNA transcritível de interesse numa célula. Um líder, por exemplo, está operativamente ligado à sequência de DNA quando é capaz de afetar a transcrição ou tradução da sequência de DNA.

[0070] Os constructos da invenção podem ser fornecidos, numa modalidade, como constructos de fronteira de plasmídeo duplo indutor de tumores (Ti) que tem as regiões da fronteira direita (RB ou AGRtu.RB) e da margem esquerda (LB ou AGRtu.LB) do Ti plasmídeo isolado de Agrobacterium tumefaciens compreendendo um T-DNA que, juntamente com moléculas de transferência fornecidas pelas células de A. tumefaciens , permitem a integração do T-DNA no genoma de uma célula vegetal (ver, por exemplo, Patente U.S. 6.603.061). Os constructos também podem conter os segmentos de DNA do esqueleto do plasmídeo que fornecem função de replicação e seleção de antibiótico em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli como ori322, uma ampla gama de origem de replicação de hospedeiro como oriV ou oriRi, e uma região de codificação para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica a Tn7 aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) conferindo resistência a espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável gentamicina (Gm, Gent). Para transformação de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é frequentemente ABI, C58 ou LBA4404 de A. tumefaciens ; no entanto, outras cepas conhecidas pelos versados na técnica da transformação de plantas podem funcionar na invenção.

[0071] Os métodos são conhecidos na técnica para a montagem e introdução de constructos numa célula de tal maneira que a molécula de DNA transcritível é transcrita numa molécula de mRNA funcional que é traduzida e expressa como uma proteína. Para a prática da invenção, as composições e métodos convencionais para a preparação e utilização de constructos e células hospedeiras são bem conhecidos dos versados na técnica. Vetores típicos úteis para a expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens e o vetor de controle de transferência pCaMVCN.

[0072] Vários elementos regulatórios podem ser incluídos em um constructo, incluindo qualquer um dos fornecidos neste documento. Quaisquer desses elementos regulatórios podem ser fornecidos em combinação com outros elementos regulatórios. Tais combinações podem ser projetadas ou modificadas para produzir recursos regulatórios desejáveis. Numa modalidade, os constructos da invenção compreendem pelo menos um elemento regulatório operativamente ligado a uma molécula de DNA transcritível operativamente ligada a uma UTR 3'.

[0073] Os constructos da invenção podem incluir qualquer promotor ou líder fornecido neste documento ou conhecido na técnica. Por exemplo, um promotor da invenção pode ser operativamente ligado a um líder 5’ não traduzido heterólogo, tal como um derivado de um gene de proteína de choque térmico. Alternativamente, um líder da invenção pode ser operativamente ligado a um promotor heterólogo, tal como o promotor do transcrito 35S do vírus da couve-flor.

[0074] As cassetes de expressão podem também incluir uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito que codifica um peptídeo que é útil para o direcionamento subcelular de uma proteína operativamente ligada, particularmente a um organoplasto de cloroplasto, leucoplasto ou outro plastidial; mitocôndria; peroxissoma; vacúolo; ou uma localização extracelular. Muitas proteínas localizadas nos cloroplastos são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplastos (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplasto isoladas incluem, mas não estão limitadas a, aquelas associadas com a subunidade pequena (SSU) de ribulose-1,5, - bisfosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxidoredutase, a proteína I complexa de coleta de luz e a proteína II, tiorredoxina F e fosfato de enolpiruvil shiquimato sintase (EPSPS). Os peptídeos de trânsito de cloroplasto são descritos, por exemplo, na Patente U.S

7.193.133. Foi demonstrado que proteínas não cloroplásticas podem ser direcionadas para o cloroplasto pela expressão de um CTP heterólogo operativamente ligado ao transgene que codifica para proteínas não cloroplásticas. Moléculas de DNA transcritíveis

[0075] Como utilizado neste documento, o termo "molécula de DNA transcritível" refere-se a qualquer molécula de DNA capaz de ser transcrita numa molécula de RNA, incluindo, mas não limitada a, aquelas que têm sequências codificadoras de proteínas e as que produzem moléculas de RNA com sequências úteis para supressão de genes. O tipo de molécula de DNA pode incluir, mas não está limitado a, uma molécula de DNA da mesma planta, uma molécula de DNA de outra planta, uma molécula de DNA de um organismo diferente ou uma molécula de DNA sintético, como uma mensagem antissentido de um gene, ou uma molécula de DNA que codifica uma versão artificial, sintética ou modificada de outro modo de um transgene. Exemplos de moléculas de DNA transcritíveis para incorporação em constructos da invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA ou genes de uma espécie diferente da espécie na qual a molécula de DNA é incorporada ou genes que se originam ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporadas em células receptoras por métodos de engenharia genética, em vez de técnicas clássicas de reprodução.

[0076] Um "transgene" refere-se a uma molécula de DNA transcritível heteróloga a uma célula hospedeira pelo menos em relação à sua localização no genoma da célula hospedeira e/ou uma molécula de DNA transcritível incorporada artificialmente no genoma de uma célula hospedeira na geração atual ou qualquer geração anterior da célula.

[0077] Um elemento regulatório, tal como um promotor da invenção, pode estar operativamente ligado a uma molécula de DNA transcritível que é heteróloga em relação ao elemento regulatório. Como utilizado neste documento, o termo "heterólogo" refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de DNA quando tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de espécies diferentes e/ou as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, genes diferentes da mesma espécie ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um elemento regulatório é assim heterólogo em relação a uma molécula de DNA transcritível, ligada de forma operacional, se essa combinação não for normalmente encontrada na natureza, isto é, a molécula de DNA transcritível não ocorre naturalmente ligada operativamente ao elemento regulatório.

[0078] A molécula de DNA transcritível pode geralmente ser qualquer molécula de DNA para a qual a expressão de um transcrito é desejada. Tal expressão de um transcrito pode resultar na tradução da molécula de mRNA resultante, e assim expressão da proteína. Alternativamente, por exemplo, uma molécula de DNA transcritível pode ser projetada para, em última análise, causar diminuição da expressão de um gene ou proteína específica. Em uma modalidade, isso pode ser realizado usando uma molécula de DNA transcritível que é orientada na direção antissentido. Um de conhecimento comum na técnica está familiarizado com o uso de tal tecnologia antissentido. Qualquer gene pode ser regulado negativamente desta maneira, e, numa modalidade, uma molécula de DNA transcritível pode ser projetada para a supressão de um gene específico através da expressão de uma molécula de dsRNA, siRNA ou miRNA.

[0079] Assim, uma modalidade da invenção é uma molécula de DNA recombinante compreendendo um elemento regulatório da invenção, tal como os fornecidos como SEQ ID NOs:1-19 e SEQ ID NO:26, operativamente ligados a uma molécula de DNA transcritível heteróloga de modo a modular a transcrição da molécula de DNA transcritível em um nível desejado ou em um padrão desejado quando o constructo é integrado no genoma de uma célula vegetal transgênica. Numa modalidade, a molécula de DNA transcritível compreende uma região codificadora de proteína de um gene e noutra modalidade a molécula de DNA transcritível compreende uma região antissentido de um gene. Genes de interesse agronômico

[0080] Uma molécula de DNA transcritível pode ser um gene de interesse agronômico. Como utilizado neste documento, o termo "gene de interesse agronômico" refere-se a uma molécula de DNA transcritível que, quando expressa num tecido vegetal, célula ou tipo de célula particular, confere uma característica desejável. O produto de um gene de interesse agronômico pode atuar dentro da planta para causar um efeito sobre a morfologia da planta, fisiologia, crescimento, desenvolvimento, rendimento, composição de grãos, perfil nutricional, resistência a doenças ou pragas, e/ou tolerância ambiental ou química, ou agir como um agente pesticida na dieta de uma praga que se alimenta da planta. Numa modalidade da invenção, um elemento regulatório da invenção é incorporado num constructo de tal modo que o elemento regulatório esteja operativamente ligado a uma molécula de DNA transcritível que é um gene de interesse agronômico. Em uma planta transgênica contendo tal constructo, a expressão do gene de interesse agronômico pode conferir um traço agronômico benéfico. Um traço agronômico benéfico pode incluir, por exemplo, mas não se limita a tolerância a herbicidas, controle de insetos, rendimento modificado, resistência a doenças, resistência a patógenos, crescimento e desenvolvimento modificado de plantas, teor de amido modificado, teor de óleo modificado, teor de ácido graxo modificado, teor proteico modificado, amadurecimento dos frutos modificado, nutrição animal e humana melhorada, produções de biopolímero, resistência ao stress ambiental, peptídeos farmacêuticos, melhores qualidades de processamento, sabor melhorado, utilidade de produção híbrida de sementes, produção melhorada de fibras e produção desejável de biocombustíveis.

[0081] Exemplos não limitativos de genes de interesse agronômico conhecidos na técnica incluem aqueles para resistência a herbicidas (por exemplo, Patentes U.S. 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876;

6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; e 5.463.175), rendimento aumentado (por exemplo, Patente U.S. USRE38.446;

6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330;

6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; e 5.716.837), controle de inseto (PatentesUS Nº 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046;

6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655;

6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351;

6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649;

6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756;

6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658. 5.880.275;

5.763.245; e 5.763.241), resistência a doençafúngica (Patentes US Nº

6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671;

5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), resistência a vírus (PatentesUS Nº 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864;

5.850.023; e 5.304.730), resistênciaa nematódeo (Patente US Nº

6.228.992), resistência a doença bacteriana (PatenteUS Nº 5.516.671), crescimento e desenvolvimento de planta (Patentes US Nº 6.723.897e

6.518.488), produção de amido (Patentes US Nº 6.538.181; 6.538.179;

6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificados (Patentes US Nº 6.444.876; 6.426.447; e 6.380.462), alta produção de óleo (Patentes US Nº 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; e 6.476.295), teor de ácido graxo modificado (Patentes US Nº 6.828.475; 6.822.141;

6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750;

6.489.461; e 6.459.018), alta produção de proteína (Patente US Nº

6.380.466), maturação defruta (Patente US Nº 5.512.466), nutrição animal e humana intensificada (PatentesUS Nº 6.723.837; 6.653.530;

6.5412.59; 5.985.605; e 6.171.640), biopolímeros (PatentesUS Nº USRE37.543; 6.228.623; e 5.958.745 e 6.946.588), resistência ao estresse ambiental (Patente U.S. 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes U.S. 6.812.379; 6.774.283;

6.140.075; e 6.080.560), traços de processamento melhorados (Patente U.S. 6.476.295), digestibilidade (Patente U.S. 6.531.648) baixa rafinose (Patente U.S. 6.166.292), produção de enzimas industriais (Patente U.S. 5.543.576), sabor melhorado (Patente U.S. 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente U.S. 5.229.114), produção de sementes híbridas (Patente U.S. 5.689.041), produção de fibra (Patente U.S. 6.576.818;

6.271.443; 5.981.834; e 5.869.720) e produção de biocombustíveis (Patente U.S. 5.998.700).

[0082] Alternativamente, um gene de interesse agronômico pode afetar as características ou fenótipos de plantas acima mencionados através da codificação de uma molécula de RNA que causa a modulação direcionada da expressão gênica de um gene endógeno, por exemplo por antissentido (ver, por exemploPatente U.S. 5.107.065); RNA inibitório (“RNAi”, incluindo modulação da expressão gênica por mecanismos mediados por miRNA, siRNA, siRNA- trans-regulatório, e sRNA em fase, por exemplo, conforme descrito nos pedidos publicados U.S. 2006/0200878 e U.S. 2008/0066206, e no pedido de patente U.S. 11/974.469); ou mecanismos mediados por cossupressão. O RNA também pode ser uma molécula de RNA catalítico (por exemplo, uma ribozima ou um riboswitch; veja, por exemplo, US 2006/0200878) modificada para clivar um produto endógeno de mRNA desejado. São conhecidos métodos na técnica para construir e introduzir constructos numa célula de tal maneira que a molécula de DNA transcritível é transcrita numa molécula que é capaz de causar supressão gênica. Marcadores Selecionáveis

[0083] Os transgenes de marcadores selecionáveis podem também ser utilizados com os elementos regulatórios da invenção. Como utilizado neste documento, o termo "transgene de marcador selecionável" refere-se a qualquer molécula de DNA que pode ser transcrita, cuja expressão numa planta, tecido ou célula transgênica, ou falta dela, pode ser triada ou marcada de alguma forma. Os genes marcadores selecionáveis, e as suas técnicas de seleção e triagem associadas, para utilização na prática da invenção são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, moléculas de DNA transcritíveis que codificam a ß-glucuronidase (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), proteínas que conferem resistência a antibióticos e proteínas que conferem tolerância a herbicidas. Exemplos de transgenes marcadores selecionáveis são fornecidos como SEQ ID NOs: 20 e 24. Transformação Celular

[0084] A invenção também dirigida a um método de produção de células e plantas transformadas que compreendem um ou mais elementos regulatórios operativamente ligados a uma molécula de DNA transcritível.

[0085] O termo "transformação" refere-se à introdução de uma molécula de DNA em um hospedeiro receptor. Como utilizado neste documento, o termo "hospedeiro" refere-se a bactérias, fungos ou plantas, incluindo quaisquer células, tecidos, órgãos ou progênie das bactérias, fungos ou plantas. Os tecidos vegetais e células de interesse particular incluem protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, plântulas, embriões e pólen.

[0086] Como utilizado neste documento, o termo "transformado" refere-se a uma célula, tecido, órgão ou organismo no qual uma molécula de DNA estranha, tal como um constructo, foi introduzido. A molécula de DNA introduzida pode ser integrada no DNA genômico da célula, tecido, órgão ou organismo receptor, de tal modo que a molécula de DNA introduzida é herdada pela descendência subsequente. Uma célula ou organismo "transgênico" ou "transformado" também pode incluir progênie da célula ou organismo e progênie produzida a partir de um programa de cruzamento que emprega um organismo transgênico como progenitor em um cruzamento e exibindo um fenótipo alterado resultante da presença de um Molécula de DNA. A molécula de DNA introduzida também pode ser introduzida transientemente na célula receptora, de tal modo que a molécula de DNA introduzida não seja herdada pela progênie subsequente. O termo "transgênico" refere-se a uma bactéria, fungo ou planta contendo uma ou mais moléculas de DNA heterólogas.

[0087] Existem muitos métodos bem conhecidos dos versados na técnica para a introdução de moléculas de DNA em células vegetais . O processo compreende geralmente as etapas de selecionar uma célula hospedeira adequada, transformando a célula hospedeira com um vetor e obtendo a célula hospedeira transformada. Os métodos e materiais para transformar as células vegetais através da introdução de um constructo de plantas num genoma vegetal na prática desta invenção podem incluir qualquer um dos métodos bem conhecidos e demonstrados. Métodos adequados incluem, mas não estão limitados a, infecção bacteriana (por exemplo, Agrobacterium), vetores BAC binários, distribuição direta de DNA (por exemplo, por transformação mediada por PEG, absorção de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carboneto de silício e aceleração de partículas revestidas de DNA), edição genética (por exemplo, sistemas CRISPR-Cas), entre outros.

[0088] As células hospedeiras podem ser qualquer célula ou organismo, tal como uma célula de planta, célula de alga, alga, célula fúngica, fungo, célula bacteriana ou célula de inseto. Em modalidades específicas, as células hospedeiras e as células transformadas podem incluir células de plantas cultivadas.

[0089] Uma planta transgênica subsequentemente pode ser regenerada a partir de uma célula de planta transgênica da invenção. Usando técnicas de reprodução convencionais ou autopolinização, sementes podem ser produzidas a partir desta planta transgênica. Tal semente, e a planta progênie resultante crescida a partir dessa semente, conterá a molécula de DNA recombinante da invenção e, portanto, será transgênica.

[0090] Plantas transgênicas da invenção podem ser autopolinizadas para fornecer sementes para plantas transgênicas homozigotas da invenção (homozigotas para a molécula de DNA recombinante) ou cruzadas com plantas não transgênicas ou diferentes plantas transgênicas para fornecer sementes para plantas transgênicas heterozigotas da invenção (heterozigótica para a molécula de DNA recombinante). Ambas as plantas transgênicas homozigóticas e heterozigóticas são referidas neste documento como "plantas progênie". As plantas progênie são plantas transgênicas descendentes da planta transgênica original e contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. As sementes produzidas usando uma planta transgênica da invenção podem ser colhidas e usadas para cultivar gerações de plantas transgênicas, isto é, plantas progênie da invenção, compreendendo o constructo desta invenção e expressando um gene de interesse agronômico. Descrições de métodos de reprodução que são comumente usados para diferentes culturas podem ser encontradas em um dos vários livros de referência, ver , por exemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) e

Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).

[0091] As plantas transformadas podem ser analisadas quanto à presença do gene ou genes de interesse e o nível e/ou perfil de expressão conferidos pelos elementos regulatórios da invenção. Os versados na técnica estão cientes dos numerosos métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, os métodos para análise de plantas incluem, mas não estão limitados a Southern blots ou Northern blots, abordagens baseadas em PCR, análises bioquímicas, métodos de triagem fenotípico, avaliações de campo e ensaios de imunodiagnóstico. A expressão de uma molécula de DNA transcritível pode ser medida utilizando reagentes e métodos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA), como descrito pelo fabricante e tempos de ciclo de PCR determinados utilizando a matriz de teste TaqMan®. Alternativamente, os reagentes e métodos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) e os métodos descritos pelo fabricante podem ser utilizados para avaliar a expressão do transgene.

[0092] A invenção também fornece partes de uma planta da invenção. As partes da planta incluem, mas não estão limitadas a, folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endosperma, óvulos e pólen. Partes de planta podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis, e/ou não regeneráveis. A invenção também inclui e fornece células vegetais transformadas compreendendo uma molécula de DNA da invenção. As células vegetais transformadas ou transgênicas da invenção incluem células vegetais regeneráveis e/ou não regeneráveis.

[0093] A invenção também fornece um produto de base que é produzido a partir de uma planta transgênica ou parte da mesma contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. Os produtos de base da invenção contêm uma quantidade detectável de DNA compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:1-19 e SEQ ID NO:26. Como utilizado neste documento, um “produto de base” refere-se a qualquer composição ou produto que é constituído por material derivado de uma planta transgênica, semente, célula vegetal ou parte de planta contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. Produtos de base incluem, mas não estão limitados a sementes processadas, grãos, partes de plantas e farinhas. Um produto de base da invenção conterá uma quantidade detectável de DNA correspondente à molécula de DNA recombinante da invenção. A detecção de um ou mais deste DNA em uma amostra pode ser usada para determinar o conteúdo ou a fonte do produto de base. Qualquer método convencional de detecção de moléculas de DNA pode ser utilizado, incluindo métodos de detecção divulgados neste documento.

[0094] A invenção pode ser mais facilmente compreendida através de referência aos exemplos seguintes, que são fornecidos a título ilustrativo, e não se destinam a ser limitativos da invenção, a menos que especificado. Deve ser apreciado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos seguintes representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção. No entanto, os versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que podem ser feitas muitas alterações nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obtêm um resultado semelhante ou semelhante sem se afastarem do espírito e escopo da invenção, portanto, todas as questões estabelecidas ou mostradas nas figuras anexas devem ser interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitativo.

EXEMPLOS Exemplo 1 Projeto, síntese e clonagem dos elementos regulatórios sintéticos

[0095] Novos elementos regulatórios da transcrição sintética são elementos de expressão sintética projetados por meio de métodos algorítmicos. Esses elementos regulatórios projetados computacionalmente foram sintetizados quimicamente e clonados para fazer grupos de elementos de expressão regulatória sintéticos (EXPs). Bem mais de 1.000 elementos regulatórios sintéticos foram projetados e testados em protoplastos de milho e plantas de milho transformadas de forma estável para identificar os elementos regulatórios sintéticos que forneceram as características desejadas, como níveis de expressão de proteínas e padrões de expressão. Os elementos sintéticos da presente invenção fornecem vários padrões de expressão constitutiva úteis na expressão de condução de muitas sequências de codificação diferentes e RNAs interferentes de interesse agronômico.

[0096] Os elementos regulatórios de transcrição sintéticos projetados não têm homologia estendida com quaisquer sequências de ácido nucleico conhecidas que existem na natureza, mas afetam a transcrição de uma sequência de codificação operativamente ligada da mesma maneira que os promotores, líderes, íntrons e UTRs 3' de ocorrência natural. Os EXPs sintéticos e seus promotores sintéticos correspondentes, líderes e íntrons, bem como UTRs 3´ sintéticas são apresentados na Tabela 1. Os EXPs sintéticos foram clonados usando métodos conhecidos na técnica em vetores binários de transformação de plantas, operativamente ligados a uma sequência de codificação de ß-glucuronidase (GUS), e os níveis e padrões de expressão em plantas de milho transformadas de forma estável foram avaliados.

[0097] A análise do elemento regulatório TSS e junções de emenda de íntron/éxon pode ser realizada utilizando tecido vegetal transformado. Resumidamente, as plantas foram transformadas com os vetores de expressão de plantas compreendendo os fragmentos de DNA clonados operativamente ligados a uma molécula de DNA transcritível heteróloga. Em seguida, o Sistema RACE 5' para

Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA, Versão 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia 92008) foi utilizado para confirmar o elemento regulatório TSS e junções de emenda íntron/éxon, analisando a sequência de DNA dos transcritos de mRNA produzidos. As UTRs 3´ sintéticas foram caracterizadas por seu efeito na expressão de genes, bem como pela terminação adequada do transcrito.

[0098] Além dos elementos de expressão sintéticos, uma nova UTR 3' endógena derivada do gene da proteína 4 de transferência de lipídeos não específica de Sorghum bicolor , T-Sb.Nltp4-1:1:2, é fornecida aqui e é apresentada como SEQ ID NO: 19. T-Sb.Nltp4-1:1:2 foi caracterizado de maneira semelhante às UTRs 3´ sintéticas. Tabela 1. Grupos de elementos de expressão regulatória da transcrição sintética, promotores, líderes, íntrons e UTRs 3´. Descrição e/ou elementos regulatórios da SEQ ID Tamanho EXP ligados na direção 5' → 3' (SEQ ID Anotação NO: (bp) NOs): EXP: P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO:2), L- EXP-Zm.GSP850 1 500 Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO:3) P-Zm.GSP850.nno:4 2 450 Promotor L-Zm.GSP850.nno:3 3 50 Líder EXP- EXP: P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO:2), L- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno: Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO:3), I- 2 4 1117 Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO:5) I-Zm.GSI153.nno: 1 5 610 Íntron EXP: P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO:7), L- EXP-Zm.GSP990 6 500 Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO:8) P-Zm.GSP990.nno:2 7 450 Promotor L-Zm.GSP990.nno:1 8 50 Líder EXP- EXP: P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO:7), L- Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno: Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO:8), I- 2 9 1117 Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO:10) I-Zm.GSI197.nno:1 10 610 Íntron EXP- EXP: P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO:2), L- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno: Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO:3), I- 1 11 1117 Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO:12)

Descrição e/ou elementos regulatórios da SEQ ID Tamanho EXP ligados na direção 5' → 3' (SEQ ID Anotação NO: (bp) NOs): I-Zm.GSI140.nno:1 12 610 Íntron T-Zm.GST9.nno:2 13 300 UTR 3' T-Zm.GST18.nno:2 14 400 UTR 3' EXP: P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO:2), L- Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO:3), I- EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 15 1311 Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:22) EXP: P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO:7), L- Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO:8), I- EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 16 1311 Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:22) E-Zm.GSP850 17 418 Intensificador E-Zm.GSP990 18 416 Intensificador T-Zm.GST43.nno:1 26 300 UTR 3' Exemplo 2 Análise dos elementos regulatórios sintéticos que conduzem o GUS em protoplastos de folhas de milho

[0099] Protoplastos de folhas de milho foram transformados com vetores, especificamente vetores de expressão contendo um elemento regulatório de teste que direciona a expressão do transgene ß- glucuronidase (GUS). Os protoplastos de folha de milho transformados resultantes foram analisados quanto à expressão da proteína GUS para avaliar o efeito dos elementos regulatórios selecionados na expressão.

[00100] Protoplastos de milho, derivados de tecido foliar, foram transformados com vetores de expressão compreendendo elementos de expressão sintéticos. O nível e o padrão de expressão desses vetores de elemento de expressão sintéticos em protoplastos de milho foram comparados ao nível e padrão de expressão de elementos de expressão conhecidos na técnica. Experimentos separados foram conduzidos para avaliar a atividade dos EXP, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 1) e EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 6), os íntrons I- Zm.GSI153.nno: 1 ( SEQ ID NO: 5) e I-Zm.GSI197.nno: 1 (SEQ ID NO:

10), e as UTR's 3', T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) e T-Zm .GST18.nno: 2 (SEQ ID NO: 14). Os elementos de expressão foram clonados em vetores de expressão e operativamente ligados a uma sequência de codificação GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1 (SEQ ID NO:24), que compreendia um íntron processável. Os vetores de expressão de controle compreendiam diferentes configurações de elementos de expressão conhecidos que variavam dependendo do tipo de elemento a ser avaliado (EXP, Íntron ou UTR 3'). Um plasmídeo usado na cotransformação dos protoplastos e normalização dos dados também foi construído usando métodos conhecidos na técnica. Ele compreendia uma cassete de transgene composta por EXP, EXP- CaMV.35S (SEQ ID NO: 21) operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação que codifica a proteína fluorescente NanoLuc® luciferase (Promega, Madison, WI 53711), aqui referido como Nluc (SEQ ID NO: 25), que foi operativamente ligado em 5' para uma UTR 3', T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 23).

[00101] Protoplastos de folhas de milho foram transformados usando um método de transformação baseado em PEG, semelhante aos conhecidos na técnica. As células protoplásticas foram transformadas em um formato de noventa e seis (96) poços. Doze (12) microgramas do DNA do vetor de teste ou DNA do vetor de controle e seis (6) microgramas do DNA do vetor NanoLuc® foram usados para transformar 3,2 x 105 protoplastos por poço. Após a transformação, os protoplastos foram incubados a 25oC no escuro por dezesseis a vinte horas. Após a incubação, os protoplastos foram lisados e o lisado foi usado para medir a expressão de luciferase e GUS. Para lisar as células, as células na placa foram sedimentadas por centrifugação, lavadas, ressuspensas em um volume menor e transferidas para tubos de poços de tira. Os tubos foram centrifugados novamente e o sobrenadante foi aspirado deixando para trás o pelete de células protoplásticas. O pelete celular foi ressuspenso em tampão QB (100 mM KPO4, pH 7,8; 1 mM EDTA; 1% de Triton X-100; 10% de Glicerol; 1 mM DTT). As células foram lisadas pipetando vigorosamente as células várias vezes, agitando os tubos em vórtice e deixando os tubos incubar em gelo por cinco minutos. O lisado foi então centrifugado para peletizar os resíduos celulares. O lisado resultante foi então transferido para uma placa limpa.

[00102] A atividade da luciferase foi testada usando Substrato de Ensaio de Nano-Glo® Luciferase (Promega, Madison, WI 53711) em tampão QB. Resumindo, um pequeno volume de lisado, tampão QB e a solução de Substrato de Ensaio Nano-Glo® Luciferase/ QB foram misturados em placas brancas de noventa e seis (96) poços. A fluorescência foi, então, medida usando um leitor de placa PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513).

[00103] A atividade de GUS foi avaliada usando o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil--D-glucuronídeo (MUG) em um volume total de reação de cinquenta (50) microlitros. O produto de reação, 4-metilumbeliferona (4-MU), é máximo fluorescente em pH alto, onde o grupo hidroxil é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio interrompe simultaneamente o ensaio e ajusta o pH para quantificar o produto fluorescente. Uma alíquota de lisado foi misturada com uma alíquota de MUG dissolvida em tampão QB e incubada a 37oC. Uma pequena alíquota da mistura de reação lisado / MUG foi removida e adicionada a um tampão de parada em três pontos de tempo diferentes: (1) imediatamente após a mistura da reação lisado / MUG como “Tempo zero minutos”; (2) vinte minutos; e (3) sessenta minutos. A fluorescência foi medida com excitação a 355 nm, emissão a 460 nm usando um usando um leitor de placas PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513). O nível de expressão é expresso como “nM MUG hidrolisado”, que é derivado da curva padrão na placa.

[00104] Para cada placa, cada constructo é transformado em quatro

(4) a oito (8) poços. Uma alíquota foi retirada de cada transformação para o ensaio MUG e “nM MUG hidrolisado” foi derivado da curva padrão da placa. Uma alíquota também foi retirada de cada transformação para a leitura do NanoLuc® (NanoLuc® RLU). A média nM MUG hidrolisado / NanoLuc® RLU para cada constructo foi normalizada em relação ao constructo EXP-CaMV.35S/ I-Zm.DnaK:1/ T-Os.LTP:1 que é definida para 100%. Análise da expressão de GUS em protoplastos de folhas de milho impulsionados pelo EXP-Zm.GSP850 sintético.

[00105] As células de protoplastos de folha de milho foram transformadas com vetores de expressão que foram construídos usando métodos conhecidos na técnica, compreendendo elementos de expressão que direcionam a expressão de GUS. Dois (2) vetores de expressão de teste compreendiam cassetes de transgene compreendendo o EXP, EXP-Zm.GSP850 sintético (SEQ ID NO: 1). O EXP-Zm.GSP850 sintético é composto por um promotor sintético, P- Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), operativamente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm.GSP850.nno:3 ( SEQ ID NO: 3). O primeiro vetor de teste compreendia EXP-Zm.GSP850, operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação que codifica GUS (SEQ ID NO: 24) que compreendia um íntron processável, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1 (SEQ ID NO: 23). O segundo cassete transgene compreendia EXP-Zm.GSP850, operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22), operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1.

[00106] Três (3) vetores de expressão de controle também foram construídos e usados para transformar protoplastos de folhas de milho. O primeiro vetor de expressão de controle compreendia uma cassete de transgene sem promotor e era composto pelo íntron, I-Zm.DnaK:1,

operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. O segundo vetor de controle compreendia uma cassete de transgene sem íntron e era composto de EXP, EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO:21), operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. O terceiro vetor de controle compreendia uma cassete de transgene que compreendia o EXP, EXP-CaMV.35S, operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK:1, operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T- Os.LTP:1.

[00107] Protoplastos de folhas de milho foram transformados com todos os cinco (5) vetores. A transformação e a lise das células protoplásticas foram realizadas como aqui descrito. A expressão de luciferase e GUS foi ensaiada como aqui descrito. A Tabela 2 mostra a expressão média de GUS testada e é expressa como uma porcentagem de expressão em relação ao terceiro vetor de expressão de controle que compreende EXP-CaMV.35S e I-Zm.DnaK:1 conduzindo GUS. Tabela 2. Expressão percentual média de GUS de protoplastos de folhas de milho transformados com vetores de teste e controle. ID da placa Promotor Íntron Média SD Reps 39 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 0,1 0,337 6 54 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 0,4 0,315 8 95 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 0,1 0,534 8 103 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 0,5 0,149 8 39 EXP-CaMV.35S Sem íntron 48,3 2018 6 54 EXP-CaMV.35S Sem íntron 46,5 3,949 8 95 EXP-CaMV.35S Sem íntron 46,8 4,369 8 103 EXP-CaMV.35S Sem íntron 40 3,333 8 39 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 5,117 6 54 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 6,465 8 95 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 18,603 8 103 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 5,164 8

ID da placa Promotor Íntron Média SD Reps 95 EXP-Zm.GSP850 Sem íntron 14 1,844 8 103 EXP-Zm.GSP850 Sem íntron 8,4 0,336 8 39 EXP-Zm.GSP850 I-Zm.DnaK:1 19 0,732 4 54 EXP-Zm.GSP850 I-Zm.DnaK:1 22 1,954 8

[00108] Como pode ser visto na Tabela 2 acima, EXP-Zm.GSP850 (SEQ ID NO:1) foi capaz de conduzir a expressão do transgene GUS em protoplastos de folhas de milho quando comparados a células de protoplastos de folhas de milho transformadas com um constructo sem promotor. Análise da expressão de GUS em protoplastos de folhas de milho impulsionados pelo EXP-Zm.GSP990 sintético.

[00109] As células de protoplastos de folha de milho foram transformadas com vetores de expressão que foram construídos, compreendendo elementos de expressão que direcionam a expressão de GUS. Um vetor de expressão de teste compreendeu uma cassete de transgene que compreendia o EXP-Zm.GSP990 sintético (SEQ ID NO: 6), operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:22), operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação que codifica GUS (SEQ ID NO: 20), que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. O EXP-Zm.GSP990 sintético (SEQ ID NO: 6) é composto por um promotor sintético, P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), operativamente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm .GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8). Três vetores de expressão de controle também foram transformados em protoplastos de folhas de milho e foram construídos como descrito acima. A Tabela 3 mostra a expressão percentual média em relação ao terceiro vetor de expressão de controle que compreende EXP-CaMV.35S e I-Zm.DnaK:1 conduzindo GUS. Tabela 3. Expressão percentual média de GUS de protoplastos de folhas de milho transformados com vetores de teste e controle.

ID da placa Promotor Íntron Média SD Reps 71 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 0,3 0,125 6 108 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 -0,6 1,211 8 71 EXP-CaMV.35S Sem íntron 45,1 7,791 6 108 EXP-CaMV.35S Sem íntron 39,9 2,636 8 71 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 13,591 6 108 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 7,425 8 71 EXP-Zm.GSP990 I-Zm.DnaK:1 52,3 13,658 4 108 EXP-Zm.GSP990 I-Zm.DnaK:1 45,2 5,468 8

[00110] Como pode ser visto na Tabela 3 EXP-Zm.GSP990 (SEQ ID NO:6) foi capaz de conduzir a expressão do transgene GUS em protoplastos de folhas de milho quando comparados a células de protoplastos de folhas de milho transformadas com um constructo sem promotor. Análise do aumento da expressão de GUS pelo íntron sintético, I- Zm.GSI153.nno:1

[00111] As células de protoplastos de folha de milho foram transformadas com vetores de expressão que foram construídos, compreendendo elementos de expressão que direcionam a expressão de GUS. Um vetor de expressão de teste foi usado para testar o aumento da expressão de GUS a partir do íntron sintético, I- Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), conduzido por EXP-CaMV.35. A cassete do transgene compreendia o EXP, EXP-CaMV.35 operativamente ligado em 5' ao íntron sintético, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação que codifica GUS (SEQ ID NO: 24), que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. Dois vetores de expressão de controle também foram construídos e usados para transformar protoplastos de folhas de milho. O primeiro vetor de expressão de controle compreendia uma cassete de transgene sem íntron e era composto de EXP, EXP-CaMV.35S, operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. O segundo vetor de controle compreendia uma cassete de transgene que compreendia o EXP, EXP- CaMV.35S, operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK:1, operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. A Tabela 4 mostra a expressão percentual média em relação ao segundo vetor de expressão de controle que compreende ambos EXP-CaMV.35S e I- Zm.DnaK:1 conduzindo GUS. Tabela 4. Expressão percentual média de GUS de protoplastos de folhas de milho transformados com vetores de teste e controle.

ID da placa Promotor Íntron Média SD Reps 10 EXP-CaMV.35S Sem íntron 52,8 8,428 6 13 EXP-CaMV.35S Sem íntron 44,4 4,586 8 10 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 16,646 6 13 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 13,123 8 10 EXP-CaMV.35S I-Zm.GSI153.nno: 1 83 5,601 4 13 EXP-CaMV.35S I-Zm.GSI153.nno: 1 83,6 7,596 8

[00112] Como pode ser visto na Tabela 4, o íntron sintético, I- Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5), aumentou a expressão do transgene GUS em protoplastos de folha de milho conduzido por EXP-CaMV.35S quando comparado ao vetor de expressão de controle sem íntron. Análise do aumento da expressão de GUS pelo íntron sintético, I- Zm.GSI197.nno:1

[00113] As células de protoplastos de folha de milho foram transformadas com vetores de expressão que foram construídos, compreendendo elementos de expressão que direcionam a expressão de GUS. Um vetor de expressão de teste foi usado para testar o aumento da expressão de GUS a partir do íntron sintético, I-

Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), conduzido por EXP-CaMV.35. A cassete do transgene compreendia o EXP, EXP-CaMV.35 operativamente ligado em 5' ao íntron sintético, I-Zm.GSI197.nno:1, operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação que codifica GUS (SEQ ID NO: 24), que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. Três vetores de expressão de controle também foram construídos e usados para transformar protoplastos de folhas de milho. O primeiro vetor de expressão de controle compreendia uma cassete de transgene sem promotor e era composto pelo íntron, I- Zm.DnaK:1, operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. O segundo vetor de controle compreendia uma cassete de transgene sem íntron e era composto de EXP, EXP-CaMV.35S, operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. O terceiro vetor de controle compreendia uma cassete de transgene que compreendia o EXP, EXP- CaMV.35S, operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK:1, operativamente ligado em 5' à sequência de codificação GUS, que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T-Os.LTP:1. A Tabela 5 mostra a expressão percentual média em relação ao terceiro vetor de expressão de controle que compreende ambos EXP-CaMV.35S e I- Zm.DnaK:1 conduzindo GUS. Tabela 5. Expressão percentual média de GUS de protoplastos de folhas de milho transformados com vetores de teste e controle.

ID da placa Promotor Íntron Média SD Reps 125 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 1,1 0,317 6 146 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 0,6 0,101 8 125 EXP-CaMV.35S Sem íntron 43,8 4,081 6 146 EXP-CaMV.35S Sem íntron 41 3,666 8 125 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 11,287 6 146 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 100 8,506 8

ID da placa Promotor Íntron Média SD Reps 125 EXP-CaMV.35S I-Zm.GSI197.nno:1 150 12,451 4 146 EXP-CaMV.35S I-Zm.GSI197.nno:1 109,8 8,001 8

[00114] Como pode ser visto na Tabela 5, o íntron sintético, I- Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), aumentou a expressão do transgene GUS em protoplastos de folha de milho conduzido por EXP- CaMV.35S quando comparado ao vetor de expressão de controle sem íntron. O aumento da expressão foi maior do que aquele conferido pelo íntron, I-Zm.DnaK:1, quando comparado ao terceiro vetor de expressão de controle que compreendia o EXP, EXP-CaMV.35S, operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK:1. Análise da intensificação da expressão de GUS pelas UTRs 3´ sintéticas, T-Zm.GST9.nno:2 e T-Zm.GST18.nno:2.

[00115] As células de protoplastos de folha de milho foram transformadas com vetores de expressão que foram construídos, compreendendo elementos de expressão que direcionam a expressão de GUS. Dois vetores de teste compreendem uma cassete de transgene usada para a análise do aumento da expressão de GUS conferido pelas UTRs 3´, T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) e T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) e era composto por EXP-CaMV.35S operativamente ligado em 5' ao íntron I-Zm.DnaK: 1, operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação que codifica GUS (SEQ ID NO: 24), que estava operativamente ligado em 5' à UTR 3', T- Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) ou a UTR 3´, T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14). Três vetores de expressão de controle também foram construídos, como descrito acima, e usados para transformar protoplastos de folhas de milho. A Tabela 6 mostra a expressão percentual média em relação ao terceiro vetor de expressão de controle que compreende ambos EXP- CaMV.35S e I-Zm.DnaK:1 conduzindo GUS. Tabela 6. Expressão percentual média de GUS de protoplastos de folhas de milho transformados com vetores de teste e controle.

ID da Médi placa Promotor Íntron 3´ UTR a SD Reps 119 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 3,5 2,163 8 184 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 0,1 0,205 6 185 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 0 0,331 8 328 Sem Promotor I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 10,2 3,017 6 119 EXP-CaMV.35S Sem íntron T-Os.LTP: 1 45,5 3,729 8 184 EXP-CaMV.35S Sem íntron T-Os.LTP: 1 33,7 2,719 6 185 EXP-CaMV.35S Sem íntron T-Os.LTP: 1 33,6 2,576 8 328 EXP-CaMV.35S Sem íntron T-Os.LTP: 1 48,8 3,69 6 119 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 100 7,305 8 184 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 100 6,91 6 185 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 100 6,308 8 328 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Os.LTP: 1 100 5,989 6 184 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Zm.GST9.nno:2 202,5 17,582 4 119 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Zm.GST18.nno:2 483,2 40,613 8 185 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Zm.GST18.nno:2 254,5 18,347 8 328 EXP-CaMV.35S I-Zm.DnaK:1 T-Zm.GST18.nno:2 307,4 17,772 4

[00116] Como pode ser visto na Tabela 6, as UTRs 3´, T- Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) e T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) intensificaram a expressão de GUS relativa aos controles em protoplastos de folhas de milho. Exemplo 3 Análise da expressão de GUS impulsionada pelos EXPs sintéticos, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 e EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 em plantas de milho LH244 com transformação estável

[00117] As plantas de milho foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de plantas contendo elemento regulatório de teste que conduz a expressão do transgene de ß- glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas quanto à expressão da proteína GUS, para avaliar o efeito do elemento regulatório selecionado na expressão.

[00118] Plantas de milho foram transformadas com constructos de expressão de plantas GUS. Os elementos regulatórios foram clonados num vetor de expressão de planta base utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região de borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda), uma primeira cassete de seleção de transgene usada para a seleção de células vegetais transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato; uma segunda cassete de transgene para avaliar a atividade dos elementos regulatórios sintéticos, que compreendem o EXP sintético, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO:4) ou EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO:11) operativamente ligado em 5´ a uma sequência de codificação sintética projetada para expressão em uma célula vegetal que codifica ß-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno: 1, SEQ ID NO: 20) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido induzível pela luz da batata (Genbank Acessão: X04753), operativamente ligado em 5´ a uma região de terminação 3´ , T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO:19); e uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B- AGRtu.borda direita). O EXP sintético, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4) é composto por um promotor sintético, P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), operativamente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), que está operativamente ligado em 5' a um íntron sintético, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO : 5). O EXP sintético, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) é composto por um promotor sintético, P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), operativmente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm.GSP850.nno:3

(SEQ ID NO: 3), que está operativamente ligado em 5' a um íntron sintético, I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO : 12).

[00119] As células vegetais de milho da variedade LH244 foram transformadas utilizando o constructo de vetor de transformação binária descrita acima por transformação mediada por Agrobacterium, como é bem conhecido na técnica. As células vegetais transformadas resultantes foram induzidas para formar plantas inteiras de milho.

[00120] A análise qualitativa e quantitativa de GUS foi usada para avaliar a atividade do elemento de expressão em órgãos e tecidos vegetais selecionados em plantas transformadas. Para análise qualitativa da expressão de GUS por coloração histoquímica, tecidos inteiros ou seccionados foram incubados com solução de coloração de GUS contendo 1 mg / mL de X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b- glucuronídeo) por 5 h a 37°C e descolorado com 35% de EtOH e 50% de ácido acético. A expressão de GUS foi determinada qualitativamente por inspeção visual de órgãos ou tecidos vegetais selecionados para coloração azul sob um microscópio de dissecação ou composto.

[00121] Para análise quantitativa da expressão de GUS por ensaios enzimáticos, a proteína total foi extraída de tecidos selecionados de plantas de milho transformadas. Um a dois microgramas de proteína total foi incubado com o substrato fluorogênico, 4-metileumbeliferil-- D-glucuronídeo (MUG) na concentração de 1 mM em um volume total de reação de 50 microlitros. Após 1 h de incubação a 37°C, a reação foi interrompida pela adição de 350 microlitros de solução de bicarbonato de sódio 200 mM. O produto de reação, 4-metilumbeliferona (4-MU), é máximo fluorescente em pH alto, onde o grupo hidroxil é ionizado. A adição da solução básica de carbonato de sódio simultaneamente interrompe o ensaio e ajusta o pH para quantificar o produto fluorescente 4-MU. A quantidade de 4-MU formada foi estimada medindo sua fluorescência usando um FLUOstar Omega Microplate

Reader (BMG LABTECH) (excitação em 355 nm, emissão em 460 nm). Os valores da atividade GUS são fornecidos em nmols de 4-MU / hora / mg de proteína total.

[00122] Os seguintes tecidos foram amostrados para expressão de GUS na geração de R0 : Folha e Raiz do estágio V4; Folha e Raiz do estágio V7; Folha, Raiz e Flor / Antera no estágio VT; Estágio R1 Sabugo/Seda; e Embrião Semente e Endosperma Semente de estágio R3 21 dias após a polinização (DAP). A Tabela 7 mostra os valores médios de expressão quantitativa de GUS para cada um dos EXPs sintéticos. Tabela 7. Expressão GUS quantitativa média em plantas de milho variedade LH244 estavelmente transformadas conduzidas pelos EXPs sintéticos, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 e EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1. EXP- EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI15 Zm.GSP850.nno+Zm.GSI14 Estágio Órgão 3.nno:2 (SEQ ID NO:4) 0.nno:1 (SEQ ID NO:11) Folha 694 642 V4 Raiz 870 116 Folha 1423 1265 V7 Raiz 476 521 Folha 2646 344 VT Raiz 424 70 Flor / Antera 5465 1267 R1 Sabugo/Seda 3618 1116 Embrião Semente 21 DAP 260 224 R3 Endosperma Semente 21 DAP 2648 1140

[00123] Como pode ser visto na Tabela 7, o promotor e líder GSP850 sintético (P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) e L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3)) impulsionou expressão constitutiva de GUS em plantas de milho variedade LH244 estavelmente transformadas. A análise molecular do sítio de início da transcrição demonstrou um TSS consistente para o promotor e líder GSP850. Os íntrons sintéticos, I- Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) e I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12) afetaram a expressão de maneira diferente nos diferentes tecidos amostrados. A análise molecular dos sítios de emenda do íntron demonstrou um processamento consistente dos íntrons sintéticos. O aumento geral da expressão de GUS foi maior na maioria das amostras de tecido de plantas compreendendo I-Zm.GSI153.nno: 1 (SEQ ID NO: 5), com exceção da folha do estágio V4, raiz do estágio V7 e embrião de semente R3 onde a expressão de GUS níveis eram relativamente semelhantes. O aumento da expressão conferido por I- Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) em relação a I-Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 12) foi aproximadamente 7,5 vezes maior na raiz V4, 7,7 vezes maior na folha VT, 6,0 vezes maior na raiz VT, 4,3 vezes maior na flor / antera VT, 3,2 vezes maior na espiga / seda R1 e 2,3 vezes maior no endosperma da semente R3. Exemplo 4 Análise da expressão de GUS impulsionada pelos EXPs sintéticos, EXP-Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 e EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 em plantas de milho 01DKD2 com transformação estável

[00124] As plantas de milho foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de plantas contendo elemento regulatório de teste que conduz a expressão do transgene de ß- glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas quanto à expressão da proteína GUS, para avaliar o efeito do elemento regulatório selecionado na expressão.

[00125] Plantas de milho foram transformadas com constructos de expressão de plantas GUS. Os elementos regulatórios foram clonados num vetor de expressão de planta base utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região de borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda), uma primeira cassete de seleção de transgene usada para a seleção de células vegetais transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato; uma segunda cassete de transgene para avaliar a atividade dos elementos regulatórios, que compreendem o EXP sintético, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:15), EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO:4) ou EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO:11) operativamente ligado em 5´ a uma sequência de codificação sintética projetada para expressão em uma célula vegetal que codifica ß-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno: 1, SEQ ID NO: 20) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido induzível pela luz da batata (Genbank Acessão: X04753), operativamente ligado em 5´ a uma região de terminação 3´ , T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO:19); e uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B- AGRtu.borda direita). O EXP sintético, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:15) é composto por um promotor sintético, P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2), operativamente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3), que está operativamente ligado em 5' a um íntron, I- Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22). Os EXPs sintéticos, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2 (SEQ ID NO: 4) e EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1 (SEQ ID NO: 11) são descritos no Exemplo 3.

[00126] As células vegetais de milho da variedade 01DKD2 foram transformadas utilizando o constructo de vetor de transformação binária descrita acima por transformação mediada por Agrobacterium, como é bem conhecido na técnica. As células vegetais transformadas resultantes foram induzidas para formar plantas inteiras de milho. A expressão qualitativa e quantitativa de GUS foi testada conforme descrito no Exemplo 3. A Tabela 8 mostra os valores médios de expressão quantitativa de GUS para cada um dos EXPs sintéticos. Tabela 8. Expressão quantitativa média de GUS em plantas de milho de variedade 01DKD2 estavelmente transformadas conduzidas pelos EXPs sintéticos EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.DnaK:1, EXP- Zm.GSP850.nno+Zm.GSI153.nno:2, e EXP-Zm .GSP850.nno+Zm.GSI140.nno:1.

EXP- EXP- Zm.GSP850.nno+Zm. Zm.GSP850.nno+Z EXP- Estág DnaK:1 (SEQ ID NO: m.GSI153.nno:2 Zm.GSP850.nno+Zm.GSI14 io Órgão 15) (SEQ ID NO:4) 0.nno:1 (SEQ ID NO:11) Folha 208 374 519 V4 Raiz 36 606 341 Folha 314 539 619 V7 Raiz 22 1158 303 Folha 26 610 630 VT Raiz 32 770 797 Flor / Antera 104 797 1121 R1 Sabugo/Seda 160 1139 1312 Embrião Semente 21 DAP 31 188 723 R3 Endosperma Semente 21 DAP 98 1490 1635

[00127] Como pode ser visto na Tabela 8, o promotor e líder GSP850 sintético (P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) e L-Zm.GSP850.nno:3 (SEQ ID NO: 3)) impulsionou expressão constitutiva de GUS em plantas de milho variedade LH244 estavelmente transformadas. Os íntrons sintéticos, I-Zm.GSI153.nno:1 (SEQ ID NO: 5) e I-Zm.GSI140.nno:1

(SEQ ID NO: 12) intensificaram a expressão em relação ao íntron, I- Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22) em todos os tecidos testados. Exemplo 5 Análise da expressão de GUS impulsionada pelos EXPs sintéticos EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 e EXP- Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 em plantas de milho de variedade 01DKD2 estavelmente transformadas

[00128] As plantas de milho foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de plantas contendo elemento regulatório de teste que conduz a expressão do transgene de ß- glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas quanto à expressão da proteína GUS, para avaliar o efeito do elemento regulatório selecionado na expressão.

[00129] Plantas de milho foram transformadas com constructos de expressão de plantas GUS. Os elementos regulatórios foram clonados num vetor de expressão de planta base utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região de borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda), uma primeira cassete de seleção de transgene usada para a seleção de células vegetais transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato; uma segunda cassete de transgene para avaliar a atividade dos elementos regulatórios, que compreendia o EXP EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK: 1 sintético (SEQ ID NO:16) ou EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 (SEQ ID NO:9) operativamente ligado em 5´ a uma sequência de codificação sintética projetada para expressão em uma célula vegetal que codifica ß-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno: 1, SEQ ID NO: 20) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido induzível pela luz da batata (Genbank Acessão: X04753), operativamente ligado em 5´ a uma região de terminação 3´,

T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO:19); e uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda direita). O EXP sintético EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 (SEQ ID NO: 9) é composto por um promotor sintético, P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), operativamente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8), que está operativamente ligado em 5' a um íntron sintético, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10). O EXP sintético, EXP- Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO:16) é composto por um promotor sintético, P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO:7), operativamente ligado em 5' a um líder sintético, L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO:8), que está operativamente ligado em 5' a um íntron, I- Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22).

[00130] As células vegetais de milho da variedade 01DKD2 foram transformadas utilizando o constructo de vetor de transformação binária descrita acima por transformação mediada por Agrobacterium, como é bem conhecido na técnica. As células vegetais transformadas resultantes foram induzidas para formar plantas inteiras de milho. A expressão qualitativa e quantitativa de GUS foi testada conforme previamente descrito no Exemplo 3. A Tabela 9 mostra os valores de expressão quantitativos médios de GUS para cada um dos EXPs sintéticos, em que "ND" indica não determinado. Tabela 9. Expressão quantitativa média de GUS em plantas de milho de variedade 01DKD2 estavelmente transformadas conduzidas pelos EXPs sintéticos EXP-Zm.GSP990.nno + Zm.DnaK:1 e EXP-Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2.

EXP- EXP- Zm.GSP990.nno+Zm.DnaK:1 Zm.GSP990.nno+Zm.GSI197.nno:2 Estágio Órgão (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:9) Folha 99 75 V4 Raiz 32 33

Folha 226 138 V7 Raiz 29 40 Folha 140 61 VT Raiz 55 96 Flor / Antera 87 231 R1 Sabugo/Seda 39 35 Embrião Semente 21 DAP ND 21 R3 Endosperma Semente 21 DAP ND 22

[00131] Como pode ser visto, o promotor e líder GSP990 sintético (P- Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) e L-Zm.GSP990.nno:1 (SEQ ID NO: 8)) direcionou a expressão de GUS. A análise molecular do sítio de início da transcrição demonstrou um TSS consistente para o promotor e líder GSP990. O íntron sintético, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10) atenuou a expressão em alguns tecidos, enquanto intensifica a expressão em outros tecidos, em relação ao íntron, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22). Por exemplo, a expressão de GUS foi atenuada na folha no estágio V4, V7 e VT. A expressão de GUS foi ligeiramente intensificada na raiz V7 e VT, em relação a I-Zm.DnaK:1. A expressão de flor / antera foi intensificada aproximadamente 2,7 vezes por I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), em relação a I-Zm.DnaK:1. As diferenças na expressão conferida por I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10), em relação a I-Zm.DnaK:1, podem ser muito úteis onde a expressão da folha inferior e da flor superior / antera é desejada. A análise molecular dos sítios de emenda do íntron demonstrou processamento consistente do íntron sintético, I-Zm.GSI197.nno:1 (SEQ ID NO: 10). Exemplo 6 Análise do efeito na expressão de GUS pelas UTRs 3´ sintéticas T- Zm.GST9.nno:2, T-Zm.GST18.nno:2, e T-Zm.GST43.nno:1, e o T- Sb.Ntlp4-1: 1: 2 nativo em uma variedade de plantas de milho transformada de forma estável 01DKD2

[00132] As plantas de milho foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de plantas contendo elemento regulatório de teste que conduz a expressão do transgene de ß- glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas quanto à expressão da proteína GUS, para avaliar o efeito do elemento regulatório selecionado na expressão.

[00133] Plantas de milho foram transformadas com constructos de expressão de plantas GUS. Os elementos regulatórios foram clonados num vetor de expressão de planta base utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região de borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. borda esquerda), uma primeira cassete de seleção de transgene usada para seleção de células de planta transformadas que confere resistência ao herbicida glifosato; uma segunda cassete de transgene para avaliar a atividade dos elementos regulatórios de UTR 3', que compunham o EXP EXP-CaMV.35S (SEQ ID NO: 21), operativamente ligado em 5' ao íntron, I-Zm.DnaK:1 (SEQ ID NO: 22), operativamente ligado em 5' a uma sequência de codificação sintética projetada para expressão em uma célula vegetal que codifica ß -glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO:20) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido induzível por luz de batata (Acessão Genbank: X04753), operativamente ligado em 5' a uma região de terminação 3'; e uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. borda direita). Três vetores de expressão de teste compreendiam as UTRs 3´ T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14) ou T-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) operativamente ligado à sequência de codificação GUS. Um vetor de expressão de teste adicional compreendeu a UTR 3' T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO:19)

operativamente ligada à sequência de codificação GUS e foi usada para comparar a expressão entre as UTRs 3' nativas e sintéticas .

[00134] As células vegetais de milho da variedade 01DKD2 foram transformadas utilizando o constructo de vetor de transformação binária descrita acima por transformação mediada por Agrobacterium, como é bem conhecido na técnica. As células vegetais transformadas resultantes foram induzidas para formar plantas inteiras de milho.

[00135] A análise qualitativa e quantitativa de GUS foi usada para avaliar a atividade do elemento de expressão na folha V4 e nos tecidos da raiz das plantas transformadas e foi realizada conforme descrito acima no Exemplo 3. O efeito das UTRs 3´ sintéticas foi avaliado através da comparação com o efeito da expressão da UTR 3´ T-Sb.Nltp4-1:1:2 (SEQ ID NO:19). As transcrições resultantes foram analisadas para determinar se a rescisão adequada ocorreu e se não houve leitura da transcrição. Um método para avaliar se houve leitura foi através do uso de amplificação do cDNA transcrito usando um iniciador de amplificação correspondente a uma porção da sequência de fronteira do T-DNA que é 3´ para a UTR 3´. A expressão média de GUS de plantas transformadas com os quatro constructos compreendendo T- Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T-Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14), T-Zm. GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) e T-Sb.Nltp4-1: 1: 2 (SEQ ID NO: 19) é fornecido na Tabela 10. Tabela 10. Expressão quantitativa média de GUS em plantas de milho variedade 01DKD2 transformadas de forma estável a partir de constructos compreendendo três UTRs 3' diferentes .

T-Sb.Nltp4- T-Zm.GST9.nno:2 T-Zm.GST18.nno:2 T-Zm.GST43.nno:1 Estágio Órgão 1:1:2 (SEQ ID (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:26) NO:19) Folha 350 684 423 113 V4 Raiz 778 924 810 883

[00136] Como pode ser visto na Tabela 10, tanto T-Zm.GST9.nno: 2 (SEQ ID NO: 13) e T-Zm.GST18.nno: 2 (SEQ ID NO: 14) intensificaram a expressão de GUS impulsionada por EXP-CaMV .35S operativamente ligado a I-Zm.DnaK:1, em relação à UTR 3', T-Sb.Nltp4-1:1:2. A expressão de GUS em plantas compreendendo T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13) foi maior do que em plantas compreendendo T- Zm.GST18.nno:2. T-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) aumentou a expressão de GUS na raiz V4 em relação ao T-Sb.Nltp4-1:1:2, mas expressão atenuada na folha V4. A análise dos transcritos GUS de todos os quatro constructos demonstrou o término adequado da transcrição e nenhuma evidência de leitura nas transcritos GUS resultantes. As UTRs 3' T-Zm.GST9.nno:2 (SEQ ID NO: 13), T- Zm.GST18.nno:2 (SEQ ID NO: 14), e T-Zm.GST43.nno:1 (SEQ ID NO: 26) operam de maneira semelhante às UTRs 3' nativas e demonstraram modulação da expressão de GUS, em relação à UTR 3' nativa T- Sb.Nltp4-1:1:2. Todas as quatro UTRs 3' sintéticas e as UTR 3' T- Sb.Nltp4-1:1:2 nativas adicionais fornecem uma faixa de valores de expressão que são úteis no ajuste fino da expressão em plantas de milho transformadas de forma estável. Exemplo 7 Elementos de intensificador derivados dos elementos regulatórios

[00137] Os intensificadores são derivados dos elementos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 2 e 7. Os elementos intensificadores podem ser constituídos por um ou mais elementos regulatórios cis que, quando operativamente ligados em 5' ou 3' a um elemento promotor, ou operativamente ligados em 5' ou 3' a elementos intensificadores adicionais que estão operativamente ligados a um promotor, podem intensificar ou modular os níveis de expressão de uma molécula de DNA transcritível, ou fornecer a expressão de uma molécula de DNA transcritível em um tipo específico de célula ou órgão vegetal ou em um determinado ponto de tempo em desenvolvimento ou ritmo circadiano. Os intensificadores são feitos removendo a caixa TATA ou elementos funcionalmente semelhantes e qualquer sequência a jusante dos promotores que permitem que a transcrição seja iniciada a partir do promotor apresentado como SEQ ID NOs:2 e 7 ou fragmentos dos mesmos.

[00138] A caixa TATA nos promotores de plantas não é tão altamente conservada como em alguns outros organismos eucarióticos. Portanto, a fim de definir um fragmento como um intensificador, primeiro deve-se identificar o sítio de início da transcrição (TSS) do gene, em que a UTR 5' é primeiramente transcrita. Um intensificador derivado do promotor sintético, P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) poderia compreender os nucleotídeos 1 a 418 de SEQ ID NO: 2, resultando no intensificador sintético, E-Zm.GSP850 (SEQ ID NO: 17). Um intensificador derivado do promotor sintético, P-Zm.GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7) poderia compreender os nucleotídeos 1 a 416 da SEQ ID NO: 7, resultando no intensificador sintético, E-Zm.GSP990 (SEQ ID NO: 18). Intensificadores derivados dos promotores podem compreender fragmentos de SEQ ID NOs: 17 e 18, ou duplicações de SEQ ID NOs: 17 e 18 ou seus respectivos fragmentos. A eficácia dos intensificadores sintéticos derivados dos promotores sintéticos é determinada empiricamente pela construção de um elemento regulatório transcricional quimérico compreendendo fragmentos derivados dos promotores sintéticos P-Zm.GSP850.nno:4 (SEQ ID NO: 2) ou P-Zm. GSP990.nno:2 (SEQ ID NO: 7), que está operativamente ligado a um promotor e líder e usado para impulsionar a expressão de uma molécula de DNA transcritível, como GUS, em ensaio de planta estável ou transiente.

[00139] Um refinamento adicional do elemento intensificador pode ser requerido e é validado empiricamente. Além disso, a posição do elemento intensificador em relação a outros elementos dentro de um elemento regulatório da transcrição quimérico também é determinada empiricamente, uma vez que a ordem de cada elemento dentro do elemento regulatório da transcrição quimérico pode transmitir diferentes efeitos, dependendo das posições relativas de cada elemento. Alguns elementos do promotor terão múltiplos elementos de caixa TATA ou semelhantes a caixa TATA e possivelmente múltiplos sítios de início de transcrição. Nessas circunstâncias, pode ser necessário primeiro identificar onde o primeiro TSS está localizado e então começar a projetar intensificadores usando o primeiro TSS para impedir que ocorra o potencial início de transcrição dentro de um elemento intensificador putativo.

[00140] Elementos intensificadores, derivados dos elementos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 2 e 7, são clonados usando métodos conhecidos na técnica como estando operativamente ligados em 5 'ou dentro de um elemento promotor, ou operativamente ligados em 5' ou 3' a elementos intensificadores adicionais que estão operativamente ligados a um promotor. Alternativamente, os elementos intensificadores podem ser clonados, utilizando métodos conhecidos na técnica, para fornecer um elemento intensificador maior que é constituído por duas ou mais cópias do intensificador e clonado utilizando métodos conhecidos na técnica como estando operativamente ligados em 5' ou 3' a um elemento promotor, ou ligado operativamente em 5' ou 3' a elementos intensificadores adicionais que estão operativamente ligados a um promotor que produz um elemento regulatório transcricional quimérico. Elementos intensificadores derivados de promotores derivados de genes de múltiplos organismos do gênero podem ser operativamente ligados aos intensificadores derivados de promotores sintéticos.

[00141] Um vetor de transformação de plantas de expressão de GUS pode ser construído usando métodos conhecidos na técnica semelhante ao descrito no Exemplo 3, em que os vetores de expressão de planta resultante contém uma região de borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (borda esquerda B-AGRtu), uma cassete de seleção transgene primeira usada para a seleção de células vegetais transformados que confere resistência ao herbicida glifosato; e uma segunda cassette do transgene para testar o elemento intensificador composto pelo elemento intensificador operativamente ligado em 5´ ou 3´ a um elemento promotor ou operativamente ligado em 5´ ou 3´ para elementos intensificadores adicionais que por sua vez estão operativamente ligados a um promotor que está operativamente ligado em 5´ a um elemento líder, operativamente ligado em 5´ a um elemento íntron, operativamente ligado a uma sequência de codificação para ß- glucuronidase (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 20) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 de tecido específico induzível por luz da batata (adesão Genbank: X04753), operativamente ligados a uma região de terminação 3´ do gene de Transferência de Lipídios semelhante a Proteína Oryza sativa (T-Os.LTP:1, SEQ ID NO:23); e uma região da borda direita da A. tumefaciens (borda direita B-AGRtu). Os plasmídeos resultantes são utilizados para transformar plantas de milho ou outras plantas do gênero monocotiledônea pelos métodos descritos acima. Alternativamente, as células de protoplasto derivadas de milho ou outras plantas do gênero monocotiledôneas são transformadas utilizando métodos conhecidos na técnica para realizar ensaios transitórios.

[00142] A expressão de GUS dirigida por um elemento regulatório compreendendo um ou mais intensificadores é avaliada em ensaios de plantas estáveis ou transitórios para determinar os efeitos do elemento intensificador na expressão de uma molécula de DNA transcritível. Modificações para um ou mais elementos intensifllicadores ou duplicação de um ou mais elementos intensificadores podem ser realizadas com base na experimentação empírica e na regulação resultante da expressão genética que é observada utilizando cada composição de elemento regulatório. Alterar as posições relativas de um ou mais intensificadores nos elementos regulatório ou quiméricos resultantes pode afetar a atividade transcricional ou a especificidade do elemento regulatório ou regulatório quimérico e determinado empiricamente para identificar os melhores intensificadores para o perfil de expressão transgene desejado na planta de milho ou outro gênero vegetal.

[00143] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para os versados na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjo e em detalhes sem se afastar de tais princípios. Reivindica-se todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações. Todas as publicações e documentos de patentes publicados neste documento citados são incorporados neste documento por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: a) uma sequência com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; b) uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1- 19 e SEQ ID NO: 26, em que o fragmento tem atividade regulatória do gene; em que a referida sequência de DNA está operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga.

2. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência compreende pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26.

3. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência compreende pelo menos 95 por cento de identidade de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26.

4. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA compreende a atividade regulatória do gene.

5. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA transcritível heteróloga compreende um gene de interesse agronômico.

6. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere tolerância ao herbicida em plantas.

7. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere resistência a pragas em plantas.

8. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA transcritível heteróloga codifica um dsRNA, um miRNA ou um siRNA.

9. Célula vegetal transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: a) uma sequência com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; b) uma sequência compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 e SEQ ID NO: 26; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1- 19 e SEQ ID NO: 26, em que o fragmento tem atividade regulatória do gene; em que a referida sequência de DNA está operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga.

10. Célula vegetal transgênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula vegetal transgênica é uma célula vegetal monocotiledônea.

11. Célula vegetal transgênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula vegetal transgênica é uma célula vegetal dicotiledônea.

12. Planta transgênica, ou parte da mesma,

caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1.

13. Planta progênie da planta transgênica, como definida na reivindicação 12, ou uma parte da mesma, caracterizada pelo fato de que a planta progênie ou parte da mesma compreende a referida molécula de DNA recombinante.

14. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de que a semente compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1.

15. Método de produção de um produto básico, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma planta transgênica ou parte da mesma, como definida na reivindicação 12, e a produção do produto de base a partir da mesma.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o produto de base são sementes, sementes processadas, concentrado de proteína, isolado de proteína, amido, grãos, partes de plantas, óleo de semente, biomassa, farinha ou refeição.

17. Método de expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma planta transgênica, como definida na reivindicação 12, e cultivar a planta, em que o DNA passível de transcrição é expresso.