BR112020007154A2

BR112020007154A2 - método para produzir um polipeptídeo e polipeptídeos heterodimérico

Info

Publication number: BR112020007154A2
Application number: BR112020007154-4A
Authority: BR
Inventors: Ulrich Brinkmann; Stefan Dengl; Guy Georges; Eike Hoffmann; Klaus Mayer; Felix Bormann
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-09-29
Also published as: TW201932142A; AU2018353420A1; WO2019077092A1; CN111246885A; JP2021500348A; KR20200067197A; CA3078157A1; EP3697441A1; US20200392253A1; CN111246885B; MX2020003497A; IL273849A; EP3697441B1; JP7450535B2

Abstract

A presente invenção divulga um método para a geração de anticorpos multiespecíficos por uma reação de troca de meio anticorpo entre dois 2/3 de IgGs (2/3-IgGs) desestabilizados em uma metade por mutações perturbadoras assimétricas, promovendo a geração de anticorpos biespecíficos de comprimento total corretamente montados. O método pode ser realizado na ausência de agentes redutores e não exige ligações de bissulfeto na região de dobradiça nos 2 /3 -IgGs de partida.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E POLIPEPTÍDEOS HETERODIMÉRICO”

[001] A presente invenção divulga um método fácil e escalonável para a geração de anticorpos biespecíficos e multiespecíficos utilizando um novo método de troca de meio-anticorpo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os métodos atuais do estado da técnica para conversão bioquímica de derivados de anticorpos monoespecíficos em anticorpos biespecíficos montados aplicam (i) reações de complementação de meio- anticorpo e (ii) reações de troca IgG-lgG.

[003] Estas tecnologias são divulgadas, por exemplo, no documento WO WO 2015/046467, Rispens et al., J. Biol. Chem. 289 (2014) 6098-6109, US 9.409.989, WO 2013/060867, WO 2011/131746, WO 2011/133886, WO 2011/143545, WO 2010/151792, Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 19637—-19646, WO 2009/041613, WO 2009/089004, WO 2008/119353, WO 2007/114325, US 8.765.412, US 8.642.745, WO 2006/047340, WO 2006/106905, WO 2005/042582, WO 2005/062916, WO 2005/000898, US 7.183.076, US 7.951.917, Segal, D.M., et al., Curr. Opin. Immunol. 11 (1999) 558-562, WO 98/50431, WO 98/04592, Merchant, A.M,, et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681, WO 96/27011, Carter, P., et al, Immunotechnol. 2 (1996) 73, WO 93/11162, e Kostelhy, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553.

[004] Os métodos do estado da técnica para converter anticorpos monoespecíficos ou derivados de anticorpos em anticorpos biespecíficos (bsAbs) têm desvantagens, tais como, por exemplo, limitações relativas a processos e composição de preparações de bsAb pós-montagem.

[005] Por exemplo, a tecnologia de meio-anticorpo reúne lados monoespecíficos e monovalentes de anticorpos em 1IgGs bivalentes. À expressão das moléculas de entrada, bem como a reação de troca, por si só, gera não apenas meio-anticorpos, mas também derivados de anticorpos bivalentes (monoespeciíficos) similares à IgG. Os agregados também estão presentes no material de entrada, bem como na saída das reações de montagem. Ambos (antibióticos monoespecíficos e agregados bivalentes) precisam ser removidos quantitativamente dos bsAbs montados por meio de elaboradas abordagens de purificação ou (quando a remoção quantitativa é difícil de alcançar com alto rendimento) eles “contaminam' até certo ponto as preparações de bsAb.

[006] A tecnologia de troca de braço Fab, por exemplo, monta IgGs bivalentes biespecíficas a partir de derivados de IgG bivalentes monoespecíficas. Assim, a molécula de entrada na reação de troca é bivalente, ou seja, a avidez é ativada por padrão. Para garantir a completa falta de material de entrada monoespeciífico bivalente remanescente nas reações de troca que devem ser submetidas a avidez ou triagem de anticorpos agonísticos, seria necessário garantir a remoção completa de qualquer molécula entrada bivalente restante, bem como de agregados que possam se formar durante a reação de troca. Devido à alta similaridade entre as moléculas de entrada na reação e os bsAbs, são necessários procedimentos elaborados para remoção quantitativa (muito difícil de alcançar no modo de alto rendimento), ou as moléculas de entrada bivalentes e os agregados remanescentes contaminam até certo ponto as preparações finais de bsAb.

[007] Labriin, A.F., et a/., divulgaram a geração eficiente de IgG: biespecíficas estáveis por troca controlada do braço Fab (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150).

[008] O documento WO 2014/081955 divulgou anticorpos heterodiméricos e métodos de uso.

[009] O documento WO 2009/089004 divulga um método para produzir moléculas de anticorpos Fc-heterodiméricas usando efeitos de direção eletrostática. Neste documento, é divulgado que de quatro pares de resíduos de carga única envolvidos na interação domínio-domínio (Asp356---Lys439', Glu357--Lys370', Lys392--Asp399', Asp399---Lys409') apenas Lys409--- Asp399' é adequado para uso na manipulação, pois ambos os resíduos estavam estruturalmente conservados e enterrados. Nos outros três pares, pelo menos um dos parceiros é exposto a solvente (%ASA> 10).

[010] O documento WO 2018/155611 divulgou uma combinação de uma primeira molécula de ligação ao antígeno e uma segunda molécula de ligação ao antígeno que não se ligam por ligação covalente, e que quando misturadas em um líquido formam mais facilmente heterodímeros do que homodímeros. Este documento divulga em um exemplo de realização, mais preferencialmente, que a substituição por outros aminoácidos no resíduo de cisteína em uma ou ambas as posições 226 e 229 no sistema de numeração EU é combinada com uma substituição de um ou ambos primeiro CH3 e segundo CH3 por outros resíduos de aminoácidos de pelo menos uma das posições 357 ou 397 no sistema de numeração EU.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção divulga um método para a geração de anticorpos multiespecíficos por uma reação de troca de meio anticorpo. Verificou-se que anticorpos não completos são vantajosos como material de partida, como 2/3 de IgGs (2/3-lI9Gs) compreendendo uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo e um fragmento da cadeia pesada da região Fc de anticorpo, em que a interação cadeia pesada-cadeia pesada é desestabilizada por uma mutação perturbadora assimétrica, preferencialmente no fragmento da região Fc. Descobriu-se que tal mutação perturbadora promove a dissociação dos anticorpos de partida não completos e gera a montagem correta (por exemplo, o comprimento total) dos anticorpos biespecíficos.

[012] O método de acordo com a invenção pode ser realizado na presença, bem como na ausência de agentes redutores. Neste último caso, nos anticorpos de partida, como, por exemplo, 2/3 de IlgGs (2/3-lgGs) ou anticorpos completos, não são necessárias e portanto não estão presentes as ligações de bissulfeto de cadeia pesada-cadeia pesada, como, por exemplo, as ligações de bissulfeto da região de dobradiça. Assim, a reação de troca de cadeia e o método de acordo com a presente invenção também permite a montagem in vitro de anticorpos biespecíficos sem redução inicial. Portanto, as ligações de bissulfeto intramoleculares entre as cadeias pesadas das moléculas de partida (2/3-lgGs) podem ser removidas, por exemplo, por mutagênese por PCR. À purificação dos 2/3 de IgG (2/3-lI9G) pode ser operada em um método de proteína L/SEC, que pode ser definido como uma estratégia de purificação padrão para essas moléculas. Apesar da falta de todas as ligações de bissulfeto intermoleculares entre as cadeias pesadas, ocorre a formação correta de 2/3-lgGs estáveis, isto é, isoláveis. Assim, com as moléculas de partida foi possível realizar uma geração in vitro de anticorpos biespecíficos com uma reação de troca de cadeia sem redução. Após a reação de troca de cadeia, a purificação do anticorpo biespecífico formado pode ser realizada, por exemplo, por cromatografia de absorção de níquel se um marcador histidina for usado. Ao utilizar esta reação de troca de cadeia sem redução, um rendimento mais alto de proteína de anticorpo biespecífico purificado pode ser formado em comparação com os procedimentos do estado da técnica que dependem de reações de troca de cadeia redutoras. No geral, o método de troca de cadeia livre de redução de acordo com a presente invenção permite uma produção mais eficiente de anticorpos biespecíficos puros e funcionais.

[013] Em geral, a presente invenção divulga um método para produzir um polipeptídeo ligante/multimérico (multiespecífico) compreendendo as seguintes etapas de: - incubação de um primeiro polipeptídeo ligante (que é mono- ou biespecífico e heteromérico)/multimérico — compreendendo um primeiro polipeptídeo — (monomérico) e um segundo polipeptídeo (monomérico) ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina humana (Ig9G1), em que o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende uma ou mais mutações em relação à sua sequência tipo selvagem e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende uma ou mais mutações em relação à sua sequência tipo selvagem, em que as duas ou mais mutações no primeiro e segundo domínio CH3 resultam na formação de um heterodímero, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma primeira mutação perturbadora diferente da mutação necessária para a heterodimerização (e selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071l, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S e W366T7),

em que o primeiro polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos de imunoglobulina (IgG) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam covalentemente ou não covalentemente entre sifformam um dímero covalente ou não covalente/são covalentemente ou não covalentemente associados entre si/são um dímero covalente ou não covalente (pelo qual a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptíideo formam um heterodímero),

e; um segundo polipeptídeo ligante (que é mono- ou biespecífico e heteromérico)/multimérico — compreendendo um terceiro polipeptídeo — (monomérico) e um quarto polipeptídeo

(monomérico), ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina humana (IgG1),

em que o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende uma ou mais mutações em relação à sua sequência tipo selvagem e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende uma ou mais mutações em relação à sua sequência tipo selvagem, em que as duas ou mais mutações no primeiro e segundo domínio CH3 resultam na formação de um heterodímero,

em que o quarto polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

em que o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma segunda mutação perturbadora diferente da mutação necessária para a heterodimerização (e selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S e W366T7), em que o quarto polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos de imunoglobulina (IgG) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina (Ig9G1) tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação no terceiro polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação no segundo polipeptídeo,

em que o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo se associam covalentemente ou não covalentemente entre sifformam um dímero covalente ou não covalente/são covalentemente ou não covalentemente associados entre si/são um dímero covalente ou não covalente (pelo qual a mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o terceiro polipeptideo e o quarto polipeptideco formam um heterodímero), em que a (primeira) mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a (segunda) mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do ligante compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o ligante (multiespecífico).

[014] A presente invenção divulga um método para produzir um polipeptídeo ligante/multimérico (multiespecífico) compreendendo as seguintes etapas: - incubação de um primeiro polipeptídeo ligante (que é mono- ou biespecífico e heteromérico)/multimérico — compreendendo um primeiro polipeptídeo — (monomérico) e um segundo polipeptídeo (monomérico) ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina humana (I9G1), em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma primeira mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071l, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S, e W366T), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina humana (I9G1) tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam covalentemente ou não covalentemente entre si/formam um dímero covalente ou não covalente/são covalentemente ou não covalentemente associados entre si/são um dímero covalente ou não covalente (pelo qual a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptíideo formam um heterodímero),

e; um segundo polipeptídeo ligante (que é mono- ou biespecífico e heteromérico)/multimérico — compreendendo um terceiro polipeptíideo — (monomérico) e um quarto polipeptídeo

(monomérico), ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina humana (I9G1),

em que i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo — compreender mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação Kknob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole,

em que o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma segunda mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S e W366T), em que o quarto polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos de imunoglobulina (I9G:)) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina (I9G1) tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação no terceiro polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação no segundo polipeptídeo, em que o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo se associam covalentemente ou não covalentemente entre sifformam um dímero covalente ou não covalente/são covalentemente ou não covalentemente associados entre si/são um dímero covalente ou não covalente (pelo qual a mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o terceiro polipeptideo e o quarto polipeptidio formam um heterodímero), em que a (primeira) mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a (segunda) mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do ligante compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o ligante (multiespecífico).

[015] Um método de acordo com a invenção é um método para produzir um polipeptídeo multimérico compreendendo as seguintes etapas: - incubação de um primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

b-1) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

c-1) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma primeira mutação perturbadora diferente das mutações sob a-1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na primeira mutação perturbadora,

d-1) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero,

e;

um segundo polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-2) i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo — compreender mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptíideo compreender a mutação knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole,

b-2) o quarto polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

c-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma segunda mutação perturbadora diferente das mutações sob a-2), em que o quarto polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na segunda mutação perturbadora,

d-2) a segunda mutação perturbadora está em uma posição diferente da primeira mutação perturbadora,

e-2) o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são um dímero,

f-2) em que a primeira mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a segunda mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do polipeptídeo multimérico compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o polipeptídeo multimérico.

[016] Em um exemplo de realização, o primeiro ao quarto polipeptídeo compreendem, cada um, na direção N- para C-terminal, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana (um domínio CH2 de IgG: humana variante) e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana (um domínio CH3 de IgG: humana variante).

[017] Em um exemplo de realização, o primeiro ao quarto polipeptídeo compreendem, cada um, na direção N para C-terminal: i) independentemente um do outro, a sequência de aminoácidos DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65) ou a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), ii) um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e iii) um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana.

[018] Em um exemplo de realização, i) o primeiro e o quarto polipeptídeo compreendem ainda um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana (um domínio CH1 de IgG: humana (variante)) e (independentemente um do outro) um domínio variável (de cadeia pesada ou cadeia leve), ou ii) o primeiro ou o quarto polipeptídeo compreende um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana (um domínio CH1 de IgG1 humana (variante)) e o outro polipeptídeo respectivo compreende um domínio derivado de um domínio constante de cadeia leve (domínio kappa humano (variante) ou lambda CL) e cada polipeptídeo compreende ainda um domínio variável. Em um exemplo de realização, o domínio variável do primeiro polipeptídeo e o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável de cadeia pesada (diferente). Em um exemplo de realização, o domínio variável do primeiro polipeptídeo é um domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável do quarto polipeptídeo é um domínio variável de cadeia leve ou vice- versa.

[019] Em um exemplo de realização o primeiro e quarto polipeptídeo podem ter a mesma sequência N- para C-terminal, ou uma sequência diferente, e no caso do primeiro e quarto polipeptídeo serem diferentes, eles são selecionados independentemente uns dos outros a partir do grupo de polipeptídeo que compreende da direção N - para C-terminal; ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, li) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada, iv) um scFv, opcionalmente um ligante peptídico, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, v) um scFab, opcionalmente um ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, vi) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv, vii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab.

viii) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, ix) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

x) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

xi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

xii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

xiii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve, e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

xiv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve (derivado) de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda de IgG: humana,

xv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve (derivado de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xvi) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo polipeptídeo associado) formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em um exemplo de realização a primeira parte do domínio de ligação é uma cadeia pesada de fragmento Fab de anticorpo (VH-CH1 ou CH1I-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é uma cadeia leve de fragmento Fab (VL-CL ou CL- VL) ou vice- versa.

[020] Em um exemplo de realização, um do primeiro e quarto polipeptídeo compreende na direção N para C-terminal um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, um segundo domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio constante de cadeia leve, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana e o outro primeiro e quarto polipeptídeo compreende na direção N para C-terminal o primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana. Em um exemplo de realização, o ligante compreendendo o polipeptídeo que compreende dois domínios variáveis de cadeia pesada compreende ainda uma primeira cadeia leve compreendendo um primeiro domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio constante de cadeia leve (pareamento com o primeiro domínio variável de cadeia pesada) e uma segunda cadeia leve (domínio trocado) compreendendo um segundo domínio variável de cadeia leve e um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana (pareado com o segundo domínio variável de cadeia pesada) e o outro ligante compreende ainda a primeira cadeia leve.

[021] Em um exemplo de realização, um primeiro e quarto polipeptídeos compreendem na direção N para C-terminal um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, um primeiro domínio variável de cadeia leve, um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana e o outro primeiro e quarto polipeptídeos compreendem na direção N- para C-terminal o primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de 1gG1 humana. Em um exemplo de realização, o ligante compreendendo o polipeptídeo compreendendo dois domínios variáveis compreende ainda uma primeira cadeia leve compreendendo um segundo domínio variável de cadeia leve e um primeiro domínio constante de cadeia leve (pareado com o primeiro domínio variável de cadeia pesada) e uma segunda cadeia (de domínio trocado) compreendendo um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio constante de cadeia leve (pareado com o primeiro domínio variável de cadeia leve) e o outro ligante compreende ainda a primeira cadeia leve.

[022] Em um exemplo de realização, cada um dentre o primeiro e o segundo polipeptídeos de partida/ligante multimérico compreende ainda uma cadeia leve de anticorpo.

[023] Em um exemplo de realização o; primeiro polipeptídeo de partida ligante/multimérico compreende; como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

i)) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio

CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve, e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve (derivado) de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda de IgG: humana,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve (derivado de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo polipeptídeo associado) formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em um exemplo de realização a primeira parte do domínio de ligação é uma cadeia pesada de fragmento Fab de anticorpo (VH-CH1 ou CH1I-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é uma cadeia leve de fragmento Fab (VL-CL ou CL- VL) ou vice- versa,

compreendendo a mutação knob ou mutações hole,

e;

como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

compreendendo a mutação knob, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob,

compreendendo uma primeira mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E3S57F, E357K, K360S, K360E, 0362E, S364V, S364L, T366], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409], K439E, L441Y, C349Y, S366T, AS68L, V407Y, C354S, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina (I9G)) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam não covalentemente ou covalentemente um ao outro/formam um dímero não covalente ou covalente, (pelo qual a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptideo e o primeiro polipeptideo formam um heterodímero),

e;

um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve,

em que o terceiro polipeptídeo está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

e;

o segundo polipeptideco de partida ligante/multimérico compreende como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A3S68L, V407Y, C354S e W366T, em que o quinto polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina (I9G)) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (Ig9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,

e;

como quinto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C- terminal;

ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

ii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve, e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio

CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve (derivado) de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda de IgG: humana,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve (derivado de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo polipeptídeo associado) formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em um exemplo de realização a primeira parte do domínio de ligação é uma cadeia pesada de fragmento Fab de anticorpo (VH-CH1 ou CHI-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é uma cadeia leve de fragmento Fab (VL-CL ou CL- VL) ou vice- versa, compreendendo a mutação knob, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o quarto polipeptídeo compreender a mutação knob, em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo se associam não covalentemente ou covalentemente um ao outro/formam um dímero não covalente ou covalente, (pelo qual a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo formam um heterodímero), e; um sexto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto.

[024] Em um exemplo de realização, a etapa de incubação ocorre na presença de um agente redutor.

[025] Em um exemplo de realização, a etapa de incubação ocorre na ausência de um agente redutor.

[026] Em um exemplo de realização i) o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo, ou ii) o segundo polipeptídeo e o quinto polipeptídeo compreendem ainda um marcador (tag) (C-terminal). Em um exemplo de realização, o marcador tem a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) e a recuperação é por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal (níquel). Em um exemplo de realização o marcador tem a sequência de aminoácido EPEA (SEQ ID NO: 87) e a recuperação é através de cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade C-tag.

[027] Em um exemplo de realização;

o primeiro polipeptidio de partida ligante/multimérico compreende;

como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

li) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio

CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve (derivado de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo polipeptídeo associado) formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em um exemplo de realização a primeira parte do domínio de ligação é uma cadeia pesada de fragmento Fab de anticorpo (VH-CH1 ou CHI-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é uma cadeia leve de fragmento Fab (VL-CL ou CL- VL) ou vice- versa,

compreendendo a mutação knob ou mutações hole,

e;

compreendendo uma primeira mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, E3S57K, K370E, e K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos de imunoglobulina humana (I9G1) tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9G:) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam não covalentemente ou covalentemente um ao outro/formam um dímero não covalente ou covalente, (pelo qual a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptideo e o primeiro polipeptideo formam um heterodímero), e; um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, e; o segundo polipeptideco de partida ligante/multimérico compreende como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob,

compreendendo uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E3SS57K, K370E e K439E, em que o quinto polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos de imunoglobulina humana (I9G1) tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (IgG:) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,

e;

como quinto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

li) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana,

compreendendo a mutação knob, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o quarto polipeptídeo compreender a mutação knob,

em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo se associam não covalentemente ou covalentemente um ao outro/formam um dímero não covalente ou covalente, (pelo qual a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo formam um heterodímero), e; um sexto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

[028] Um aspecto, conforme divulgado no presente documento, é um método para identificar uma combinação de ligantes (biespecíficos) que compreende as etapas de - produzir uma mulitude de ligantes (biespecíficos) submetendo cada combinação de um primeiro ligante (monoespecífico) selecionado a partir de uma primeira multidão de ligantes (monoespecíficos) e um segundo ligante (monoespecífico) selecionado a partir de uma segunda multitude (mas diferente da primeira multitude de ligantes monoespecíficos) de ligantes (monoespecíficos) para o método de acordo com a invenção, - —medir individualmente a (quantidade de) ligação simultânea de cada ligante da multitude de ligantes produzida a, pelo menos, dois antígenos em um ensaio de ligação, tal como, por exemplo, um ensaio de ELISA ou SPR, e - —selecionar um ligante a partir da multiplicidade de ligantes com base no resultado do ensaio de ligação, como, por exemplo, o ensaio ELISA ou SPR, e identificar assim uma combinação de ligante (biespecífico).

[029] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção, é um polipeptídeo multimérico que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo;

em que ambos os polipeptídeos compreendem um domínio CH3 de imunoglobulina humana (IgG1),

em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora (selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E3S45R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E3S57S, E357A, E357L, ES57F, ESS57K, K360S, K360E, QO362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, YA407L, Y4071, K409D, K409E, K409|, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S, e W366T), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina (I9G1:) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9G1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se associam não covalentemente ou covalentemente um ao outro/formam um dímero não covalente ou covalente, (pelo qual a mutação perturbadora no segundo polipeptídeo resulta em uma interação desestabilizadora quando o segundo polipeptídeo e o primeiro polipeptídeo formam um heterodímero),

[030] Em um exemplo de realização; o primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, ii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada, iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio

CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv, e vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

e compreende a mutação knob ou mutações hole,

e;

o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana compreendendo a mutação knob ou as mutações hole,

compreendendo uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, E3S57F, E3S57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, YA407I|,

K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASGBL, V407Y, C354S, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina (I9G:)) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(õÕdes) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9gG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.

[031] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo multimérico compreende ainda um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve que está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por pelo menos uma ligação de bissulfeto.

[032] Um aspecto tal como divulgado na presente invenção é uma composição compreendendo; um primeiro polipeptídeo heterotrimérico que compreende; como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana,

compreendendo a mutação knob ou mutações hole,

e;

como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, compreendendo a mutação knob, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, YA407I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina (I9G:)) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9gG1) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, e; como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, e; um segundo polipeptídeo heterotrimérico que compreende;

como primeiro (quarto) polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana,

compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação knob,

compreendendo uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, ES57A, E3S57L, E357F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|], V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A368L, V407Y, C354S e W366T, em que o segundo (quinto) polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina (I9G1) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posições(ões) de aminoácidos que interagem em uma imunoglobulina tipo selvagem (I9G:) com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no primeiro (quarto) polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero, e; como segundo (quinto) polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C- terminal;

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 (derivado de um domínio CH1) de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve (derivado de um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda) de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação (do mesmo polipeptídeo associado) formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo; em um exemplo de realização a primeira parte do domínio de ligação é uma cadeia pesada de fragmento Fab de anticorpo (VH-CH1 ou CHI-VH) e a segunda parte do domínio de ligação é uma cadeia leve de fragmento Fab (VL-CL ou CL- VL) ou vice- versa, compreendendo a mutação knob, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender a mutação knob, e; como terceiro (sexto) polipeptideco, um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao primeiro (quarto) polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, em que ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptideco do primeiro heterotrímero compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreende a mutação knob, em que i) no caso do primeiro polipeptideco do primeiro heterotrímero compreender as mutações hole o primeiro polipeptídeo do segundo polipeptídeo (quarto) do heterotrímero compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação Kknob, o primeiro polipeptídeo do segundo (quarto) polipeptídeo do segundo heterotrímero compreende mutações hole, em que o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero e o primeiro polipeptídeo do segundo (quarto) polipeptídeo heterotrímero não compreendem a mutação perturbadora na mesma posição/compreendem mutações perturbadoras em posições diferentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[033] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que anticorpos multiespecíficos podem ser obtidos por uma reação de troca de meio anticorpo utilizando como material de partida anticorpos não completos, ou seja, que não se ligam de maneira específica. Anticorpos não completos exemplares são os chamados de 2/3 de IlgGs (2/3- IgGs). Os 2/3-lgGs exemplares compreendem uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo (a cadeia pesada e a cadeia leve covalentemente associadas entre si formando um sítio de ligação pelo par dos seus domínios VH e VL) e um fragmento de cadeia pesada da região Fc de anticorpo. O referido fragmento da cadeia pesada da região Fc pode, ele próprio, fazer parte, por exemplo, de uma cadeia pesada de anticorpo completa ou estendida ou variante. O par “cadeia pesada::cadeia pesada do fragmento da região Fc' e o sítio de ligação (funcional) como presente nos 2/3-lgG define o elemento estrutural mínimo necessário para a reação de troca de acordo com a presente invenção. Nos anticorpos não completos, como, por exemplo, nos referidos 2/3-lgGs, a interação entre as regiões Fc é desestabilizada por uma mutação perturbadora assimétrica, de preferência presente no fragmento da região Fc. A referida mutação perturbadora favorece a dissociação dos anticorpos de partida não completos e a geração de anticorpos biespecíficos corretamente montados no caso de estar presente um anticorpo complementar não completo que pareie melhor.

[034] A invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta adicional de que, utilizando compostos de partida como os descritos acima, o método da invenção pode ser realizado mesmo na ausência de agentes redutores. Ou seja, não são necessárias ligações de bissulfeto entre o fragmento da região Fc e a cadeia pesada. Assim, as ligações de bissulfeto da região de dobradiça, bem como outras ligações de bissulfeto entre cadeia pesada-cadeia pesada, podem ser removidas dos anticorpos de partida não completos. Foi descoberto que a geração dos anticorpos de partida não completos sem as referidas ligações de bissulfeto “cadeia pesada-cadeia pesada, bem como a reação de troca e a produção de anticorpos multiespecíficos, ainda funcionam eficientemente.

|. DEFINIÇÕES

[035] Conforme utilizado no presente, as posições de aminoácidos de todas as regiões constantes e os domínios de cadeia pesada e leve são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat descrito em Kabat, et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) e é referido na presente invenção como “numeração de acordo com Kabat”. Especificamente, o sistema de numeração de Kabat (vide as páginas 647-660)

de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) é usado para o domínio constante de cadeia leve CL do isotipo capa e lambda e o sistema de numeração índice EU de Kabat (vide as páginas 661-723) é usado para os domínios constantes de cadeia pesada (CH1, dobradiça, CH2 e CH3, que é aqui ainda clarificado no presente referindo-se a “numeração de acordo com Índice EU de Kabat”, neste caso).

[036] Os domínios CH3 nas cadeias pesadas da região Fc de um anticorpo biespecífico bivalente podem ser alterados pela tecnologia “knob-into- holes” que está descrita em detalhes com alguns exemplos, por exemplo, no documento WO 96/027011 e Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617- 621, e Merchant, A.M,, et al, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. Neste método, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização de ambas as cadeias pesadas contendo esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser “knob” (protuberância), enquanto o outro é “hole” (cavidade). A introdução de uma ligação de bissulfeto (ponte de bissulfeto) estabiliza adicionalmente os heterodímeros (Merchant, A.M. et al. Nature Biotech 16(1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e aumenta o rendimento.

[037] A mutação T366W no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é denotada como “mutação knob" e as mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo são denotadas como “mutações hole" (numeração de acordo com o índice EU da Kabat). Uma ligação de bissulfeto (ponte de bissulfeto) intercadeia adicional entre os domínios CH3 também pode ser usada (Merchant, A.M,, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por exemplo, introduzindo uma mutação S354C no domínio CH3 da cadeia pesada com a “mutação knob” (indicada como

“mutações knob-cys”) e introduzindo uma mutação Y349C no domínio CH3 da cadeia pesada com as “mutações hole” (indicada como “mutações hole-cys") (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) ou vice-versa.

[038] Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[039] Métodos e técnicas úteis para realizar a presente invenção estão descritos, por exemplo, em Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes | a Ill (1997); Glover, N.D., e Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes | e Il (1985), Oxford University Press; Freshney, R.l. (ed.), Animal Cell Culture — a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al, Recombinant DNA, 2º Ed, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.1., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2º ed, Alan R. Liss, Inc., NY (1987).

[040] O uso de tecnologia de DNA recombinante permite a geração de derivados de um ácido nucleico. Tais derivados podem, por exemplo, ser modificados em posições individuais ou em várias posições de nucleotídeos por substituição, alteração, troca, deleção ou inserção. A modificação ou derivatização pode, por exemplo, ser realizada por meio de mutagênese sítio-dirigida. Tais modificações podem ser facilmente realizadas por um especialista na técnica (vide, por exemplo, Sambrook, J., et al, Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., e Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization — a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra).

[041] Deve-se notar que como usado no presente pedido e nas reivindicações anexas, a forma singular “um/uma”, e “o/a” incluem as referências no plural ao menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Assim, por exemplo, a referência a “uma células” inclui uma pluralidade de tais células e equivalentes destas conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto, e assim por diante. Assim, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados de maneira indistinta no presente documento. Deve-se notar também que os termos “compreendendo”, “incluindo”, “tendo” e “possuindo” podem ser usados de forma intercambiável.

[042] O termo “cerca de” indica um intervalo de +/- 20% do valor numérico seguinte. Em um exemplo de realização, o termo cerca de indica um intervalo de +/- 10% do valor numérico seguinte. Em um exemplo de realização, o termo cerca de indica um intervalo de +/- 5% do valor numérico seguinte.

[043] O termo “substituição de aminoácido” ou “mutação de aminoácidos” denota a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido em uma predeterminada sequência de aminoácido parental por outro resíduo de aminoácidos “substituto” diferente. O(s) resíduo(s) de substituição pode(m) ser “resíduos de aminoácidos de ocorrência natural” (ou seja, codificados pelo código genético) e selecionado(s) a partir do grupo consistindo de: alanina (Ala), arginina (Arg); asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys ou Cis), glutamina (Gln), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly ou Gli), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys ou Lis), metionina (Met), fenilalanina (Phe ou Fen), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr ou Tre), triptofano (Trp), tirosina (Tir) e valina (Val). Em um exemplo de realização, o resíduo substituído não é cisteína. A substituição por um ou mais resíduo(s) de aminoácido(s) não natural(ais) também é abrangida pela definição de substituição de aminoácido da presente invenção. Um “resíduo de aminoácido de ocorrência não natural” denota um resíduo que não um daqueles resíduos de aminoácidos de ocorrência natural listados acima, e que é capaz de ligar covalentemente ao(s) resíduo(s) de aminoácido(s) adjacente(s) em uma cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem a norleucina, ornitina, norvaline, homosserina, aib e outros resíduos de aminoácidos análogos aos descritos em Ellman et al. Meth. Enzym, 202: 301- 336 (1991). Para gerar tais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os procedimentos de Noren et al, (Science, 244 (1989) 182) e/ou Ellman et al, (supra), podem ser usados. Resumidamente, esses procedimentos envolvem a ativação quimicamente de um supressor de tRNA com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural seguido pela transcrição e tradução in vitro do RNA. Os aminoácidos que não ocorrem naturalmente também podem ser incorporados em peptídeos através da síntese química de peptídeos e a subsequente fusão destes peptídeos com polipeptídeos produzidos de forma recombinante, tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos.

[044] O termo “citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)' é uma função mediada por ligação ao receptor de Fc e refere-se à lise de células alvo mediada por uma região Fc de anticorpo na presença de células efetoras. Em um exemplo de realização, a ADCC é medida pelo tratamento de uma preparação de células eritroides que expressam alvo (por exemplo, células K562 que expressam alvo recombinante) com 2/3-I9G compreendendo a região Fc, conforme divulgada na presente invenção na presença de células efetoras, como PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) isoladas recentemente ou células efetoras purificadas a partir da camada leuco-plaquetária, como monócitos ou células NK (natural killer). As células alvo são marcadas com Cr-51 e subsequentemente incubadas com os 2/3 de IgG (2/3-IgG). As células marcadas são incubadas com células efetoras e o sobrenadante é analisado quanto à liberação de Cr-51. Os controles incluem a incubação das células endoteliais alvo com células efetoras, mas sem os 2/3-IgG. A capacidade dos 2/3-I9G em induzir as etapas iniciais que medeiam a ADCC é investigada pela medição da ligação às células que expressam receptores Fcy, como células que expressam FeyRI e/ou FeyRIIA de forma recombinante ou células NK (que expressam essencialmente FCyRIIIA). Em exemplo de realização preferido, é medida a ligação ao FcyR em células NK.

[045] O termo “domínio CH1” indica a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente desde a posição EU 118 até a posição EU 215 (sistema de numeração EU de acordo com Kabat). Em um exemplo de realização, um domínio CH1 compreende sequência de aminoácidos de ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK

DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLOSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 27).

[046] O termo “domínio CH2” indica a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente desde a posição EU 231 até a posição EU 340 (sistema de numeração EU de acordo com Kabat). Em um exemplo de realização, um domínio CH2 compreende a sequência de aminoácidos de APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT

CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQODW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 28). O domínio CH2 é exclusivo por não parear-se fortemente com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma região Fc nativa intacta. Especula-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento entre domínios e ajuda estabilizar o domínio CH2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.

[047] O termo “domínio CH3" indica a parte de um polipeptídeo da cadeia pesada de anticorpo que se estende aproximadamente desde a posição EU 341 até a posição EU 446. Em um exemplo de realização, o domínio CH3 compreende a sequência de aminoácidos de GQPREPQVYT

LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSP (SEQ ID NO: 29).

[048] O termo “compreendendo” também inclui expressamente o termo “consistindo de”.

[049] O termo “citotoxicidade dependente de complemento (CDC)" refere-se à lise de células induzida pela região Fc de um anticorpo conforme divulgado na presente invenção na presença do sistema complemento. Em um exemplo de realização, o CDC é mensurado pelo tratamento de células endoteliais humanas que expressam alvo com 2/3-1gG, como divulgado na presente invenção na presença de complemento. Em um exemplo de realização, as células estão marcada com calceína. A CDC é encontrada se os 2/3 de IgG (2/3-Ig9G) induzir a lise de 20% ou mais das células-alvo em uma concentração de 30 ug/mL. A ligação ao fator Ciq ao complemento pode ser medida em um ensaio ELISA. Nesse ensaio, em princípio, uma placa ELISA é revestida com intervalos de concentração de 2/3- IgG, na qual é adicionado C1qg humano purificado ou soro humano. A ligação de C1q é detectada por um anticorpo direcionado contra C1q seguido por um conjugado marcado com peroxidase. A detecção da ligação (ligação máxima Bmáx) é medida como densidade óptica a 405 nm (ODa4o5) para o substrato de peroxidase ABTSº (2,2'-azino-di-[3-etilbenztiazolina-6-sulfonato]).

[050] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com a classe do anticorpo a partir da qual a região é derivada. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: a ligação de C1iq e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), e ativação de células B.

[051] As funções efetoras dependentes de ligação ao receptor Fc podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com receptores Fc (FcRs), que são receptores de superfície celular especializados em células hematopoiéticas. Receptores Fc pertencem à superfamília de imunoglobulinas, e foi demonstrado que eles medeiam tanto a remoção de patógenos revestidos de anticorpo por fagocitose de complexos imunes, como a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) que apresentam a região Fc, através de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (consulte, por exemplo, Van de Winkel, J.G. e Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Os FcRs são definidos por suas especificidades para isotipos de imunoglobulinas: Receptores Fc para regiões Fc tio IgG são referidos como FceyR. Os FcRs estão descritos, por exemplo, em Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Inmunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M,, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.

[052] A reticulação (cross-linking) de receptores para a região Fc de anticorpos tipo IgG (FcyR) desencadeia uma grande variedade de funções efetoras incluindo fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo e liberação de mediadores inflamatórios, bem como a liberação do complexo imune e a regulação da produção de anticorpos. Nos humanos, foram caracterizadas três classes de FcyR, que são: — —FecyRI (CD64) se liga a IgG monomérica com alta afinidade e é expressa em macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. A modificação na região Fc de IgG em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238,

D265, N297, A327 e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) reduz ligação ao FcyRI. Os resíduos de IgG2 nas posições 233-236, substituídos na I19G1: e IgG, reduzem ligação ao FcyRI em 10º vezes e eliminam a resposta de monócitos humanos aos eritrócitos sensibilizados por anticorpo (Armor, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

—- —FeyRIl (CD32) se liga a IMG complexada com meio em baixa afinidade e é amplamente expresso. Este receptor pode ser dividido em dois subtipos, FCyRIIA e FeyRIIB. O FeyRIIA é encontrado em muitas células envolvidas na morte (por exemplo, macrófagos, monócitos, neutrófilos) e parece ser capaz de ativar o processo de morte. O FcyRIIB parece desempenhar um papel importante em processos inibitórios e é encontrado em células B, macrófagos e mastócitos e eosinófilos. Em células B ele parece funcionar para suprimir adicionalmente a produção de imunoglobulinas e a alteração de isotipo, por exemplo, para classe IgE. Em macrófagos, o FCyRIIB age inibindo a fagocitose quando mediado por FCyRIIA. Em eosinófilos e mastócitos, a forma B pode auxiliar a suprimir a ativação dessas células através de ligação de IgE ao seu receptor separado. A ligação reduzida ao FCyRIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc de IgG com mutações em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 e K414 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

—- —FecyRIl (CD16) se liga a IgG com afinidade média a baixa e existe como dois tipos. O FCcyRIIIA é encontrado em células NK, macrófagos, eosinófilos e alguns monócitos e células T e medeia a ADCC. O FcyRIlIB é altamente expresso em neutrófilos. A ligação reduzida ao FCyRIIIA é encontrada, por exemplo, para anticorpos que compreendem uma região Fc de IgG com mutações em pelo menos um dos resíduos de aminoácidos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, 0295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 e D376 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[053] O mapeamento dos sítios de ligação na IgG: humana para receptores Fc, os sítios de mutação mencionados acima e os métodos para medição da ligação ao FcyRI e FCcyRIIA estão descritos em Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

[054] O termo “região dobradiça” indica a parte de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo que une em uma cadeia pesada de anticorpo tipo selvagem, o domínio CH1 e o domínio CH2, por exemplo, da posição 221 à posição 230, de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat, ou da posição 226 à posição 230, de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat. As regiões de dobradiça de outras subclasses de IgG podem ser determinadas alinhando-se com os resíduos de cisteína da região de dobradiça da sequência de subclasse de IgG'.

[055] A região de dobradiça é normalmente uma molécula dimérica que consiste em dois polipeptídeos com sequências de aminoácidos idênticas. Em um exemplo de realização, a região dobradiça possui a sequência de aminoácidos DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 30), em que XK é S ou P. Em um exemplo de realização, a região dobradiça possui a sequência de aminoácidos HTCPXCP (SEQ ID NO: 31), em que Xé S ou P. Em um exemplo de realização, a região dobradiça possui a sequência de aminoácidos CPXCP (SEQ ID NO: 32), em que XK é S ou P. Em um exemplo de realização, a região de dobradiça não possui ligações de bissulfeto internas. Isto é conseguido substituindo os resíduos de cisteína na sequência de SEQ ID NO: 32 (e igualmente na SEQ ID NO: 30 e 31) por resíduos de serina ou excluindo o trecho CPXC (SEQ ID NO: 89) da região de dobradiça de SEQ ID NO: 30, 31 ou 32.

[056] O termo “ligante peptídico” denota um ligante de origem natural e/ou sintética. Um ligante peptídico consiste em uma cadeia linear de aminoácidos em que os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente são os blocos de construção monoméricos que são conectados por ligações peptídicas. A cadeia tem um comprimento de 1 a 50 resíduos de aminoácidos, de modo preferido entre 1 e 28 resíduos de aminoácidos, e de modo especialmente preferido entre 3 e 25 resíduos de aminoácidos. O ligante peptídico pode conter sequências de aminoácidos repetitivas ou sequências polipeptídicas de ocorrência natural. O ligante peptídico tem a função de garantir que os domínios de 2/3-lgdG possam desempenhar sua atividade biológica, permitindo que os domínios se dobrem/enovelem corretamente e sejam apresentados adequadamente. Preferencialmente, o ligante peptídico é um “ligante peptídico sintético”, que é designado para ser rico em resíduos de glicina, glutamina e/ou serina. Esses resíduos estão dispostos, por exemplo, em pequenas unidades repetitivas de até cinco aminoácidos, como GGGS (SEQ ID NO: 69), GGGGS (SEQ ID NO: 70), QQQG (SEQ ID NO: 71), QQQAG (SEQ ID NO : 72), SSSG (SEQ ID NO: 73) ou SSSSG (SEQ ID NO: 74). Essa pequena unidade repetitiva pode ser repetida por duas a cinco vezes para formar uma unidade multimérica, como, por exemplo, (GGGS)2 (SEQ ID NO: 75), (GGGS)s (SEQ ID NO: 76), (GGGS)a (SEQ ID NO: 77), (GGGS)s (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 79), (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 80) ou

(GGGGS)s (SEQ ID NO: 81). Em um exemplo de realização, o ligante peptídico é selecionado a partir do grupo de ligantes de SEQ ID NO: 69 a 82. Em um exemplo de realização, cada um dos ligantes peptídicos é selecionado independentemente um do outro a partir do grupo de ligantes que consiste na SEQ ID NO: 69 a 82. Em um exemplo de realização preferido, o ligante peptídico/cada ligante peptídico é selecionado (independentemente um do outro) a partir do grupo de ligantes que consiste nas SEQ ID NOs: 75 a 81. Nas extremidades amino- e/ou carboxi-terminal da unidade multimérica podem ser adicionados até seis aminoácidos adicionais arbitrários de ocorrência natural. Outros ligantes peptídicos sintéticos são compostos de um único aminoácido, que é repetida entre 10 e 20 vezes e pode compreender na extremidade amino- e/ou carboxi-terminal até seis aminoácidos arbitrários adicionais de ocorrência natural, como por “exemplo, serina no ligante GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 82). Todos os ligantes peptídicos podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico e, portanto, podem ser expressos de maneira recombinante. Como os ligantes são peptídeos, o peptídeo antifusogênico é conectado ao ligante peptídico através de uma ligação peptídica que é formada entre dois aminoácidos.

[057] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a; 2/3-lgGs, Fv, scFv, Fab, scFab, Fab', Fab-SH, F(ab')2, diacorpos (diabodies), anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFV); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson, P. J. et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclional Antibodies, vol. 113,

Rosenburg & Moore (Eds), Springer-Verlag, Nova lorque, (1994) págs. 269- 315; vide também o documento WO 93/16185; e as patentes US 5.571.894 e US 5.587.458.

[058] Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, a EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson, P. J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Os triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson, P. J. et al. Nat. Med. 9 (2003) 129-134.

[059] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, a Patente US 6.248.516).

[060] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos).

[061] O termo “fragmento de anticorpo” inclui também um “Fab de dupla atuação” (Dual Acting Fab) ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação que se liga a dois antígenos diferentes (vide, por exemplo, a publicação US 2008/0069820).

[062] Um “anticorpo monoespecífico” indica um anticorpo que tem uma única especificidade de ligação para um antígeno. Anticorpos monoespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total (completos) ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, 2/3-lgGs, F(ab')2) ou suas combinações (por exemplo, anticorpo de comprimento total mais fragmentos scFv ou Fab adicionais).

[063] Um “anticorpo multiespecífico” indica um anticorpo que possui especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes no mesmo antígeno ou em dois antígenos diferentes. Anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total (completos) ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')) ou suas combinações (por exemplo, anticorpo de comprimento total mais fragmentos scFv ou Fab adicionais). A manipulação de anticorpos com dois, três ou mais (por exemplo, quatro) sítios de ligação ao antígeno funcionais também foi divulgada (vide, por exemplo, a US 2002/0004587 A1). Um anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de engenharia para produzir moléculas Fc heterodiméricas de anticorpos (WO 2009/089004).

[064] O termo “ligação a” indica a ligação de um sítio de ligação ao seu alvo, como, por exemplo, um sítio de ligação de anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo ao respectivo antígeno. Essa ligação pode ser determinada usando, por exemplo, um ensaio BlAcoreº (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Ou seja, o termo “ligação (a um antígeno)” denota a ligação de um anticorpo ao seu antígeno em um ensaio in vitro. Em um exemplo de realização, a ligação é determinada em um ensaio de ligação no qual o anticorpo é ligado a uma superfície e a ligação do antígeno ao anticorpo é mensurada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). À ligação significa, por exemplo, uma afinidade de ligação (Ko) de 10º M ou menos, em alguns exemplos de realização de 10? a 10º M, em alguns exemplos de realização de 10? a 10º M. O termo “ligação” também inclui o termo “se liga especificamente”.

[065] Por exemplo, em um exemplo de realização possível do ensaio BlAcoreº, o antígeno é ligado a uma superfície e a ligação do sítio de ligação do anticorpo é medida por ressonância plasmônica de superfície (SPR). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de associação: constante de velocidade para a associação para formar um complexo) ka (constante de dissociação: constante de velocidade para a dissociação do complexo), e ko (kd/ka). Alternativamente, o sinal de ligação de um sensorgrama SPR pode ser comparado diretamente com o sinal de resposta de uma referência, em relação à altura do pico de ressonância e os comportamentos de dissociação.

[066] A ligação pode ser investigada por um ensaio BlAcore (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de velocidade para a associação do anticorpo a partir do complexo anticorpo/antígeno), ka (constante de dissociação), e ko (Ka/ka).

[067] O termo “sítio de ligação” denota qualquer entidade proteica que mostra especificidade de ligação a um alvo. A entidade proteica pode ser, por exemplo, um receptor, um ligante de receptor, uma anticalina, um affibody, um anticorpo, etc. Assim, o termo “sítio de ligação”, conforme usado na presente invenção, denota um polipeptideco que pode se ligar especificamente ou pode ser especificamente ligado por um segundo polipeptídeo. Em um exemplo de realização, o sítio de ligação é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos que consiste em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo, um domínio variável de cadeia leve de anticorpo, um par de uma cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo, um receptor ou fragmento funcional do mesmo, um ligante de receptor ou um fragmento funcional do mesmo, uma enzima ou seu substrato.

[068] No caso de um anticorpo, o sítio de ligação compreende pelo menos três HVRs (por exemplo, no caso de um VHH) ou seis HVRs (por exemplo, no caso de um anticorpo que ocorre naturalmente, isto é, convencional). Geralmente, os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno estão formando o sítio de ligação. Estes resíduos estão normalmente contidos num par de um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável da cadeia leve de anticorpo cognato. O sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende resíduos de aminoácidos das “regiões hipervariáveis"' ou “HVRS”. As regiões denominadas de “arcabouço”, “estruturais”, “framework" (FR) são aquelas regiões de domínio variável que não são resíduos da região hipervariável conforme definido na presente invenção. Portanto, os domínios variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo compreendem da extremidade N- terminal para a C-terminal; as regiões FR1, HVR1/CDR1, FR2, HVR2/CDR?2, FR3, HVR3/CDR3 e FRA4 (arcabouço de imunoglobulina). Especialmente, a região HVR3/CDR3 do domínio variável de cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao antígeno e define a especificidade de ligação de um anticorpo. Um “site de ligação funcional” é capaz de se ligar especificamente ao seu alvo. O termo “ligação específica a” denota a ligação de um sítio de ligação ao seu alvo em um ensaio in vitro, em um exemplo de realização em um ensaio de ligação. Esse ensaio de ligação pode ser qualquer ensaio desde que o evento de ligação possa ser detectado. Por exemplo, um ensaio no qual o anticorpo está ligado a uma superfície e a ligação do(s) antígeno(s) ao anticorpo é medida por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR). Alternativamente, um ensaio ELISA em ponte pode ser usado. A ligação significa uma afinidade de ligação a partir do anticorpo (ligante) para seu alvo de (Ko) 10º M ou menos, em alguns exemplos de realização de 10? a 10º M,

em alguns exemplos de realização de 10? a 10º M.

[069] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, I9G3, IgGa, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de a, 8, e, 1, e U, respectivamente.

[070] O termo “região Fc” denota a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, que contém pelo menos uma parte da região de dobradiça, o domínio CH2 e do domínio CH3. Em um exemplo de realização, uma cadeia pesada da região Fc de IgG humana estende-se da Asp221 ou da Cis226, ou da Pro230, até a extremidade carboxi-terminal da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lis447) da região Fc pode ou não estar presente. A região Fc é composta por dois polipeptídeos de cadeia pesada da região Fc, que podem estar ligados de forma covalente entre si através de resíduos de cisteína da região de dobradiça que formam ligações de bissulfeto intercadeia.

[071] Os anticorpos, tal como produzidos no método aqui divulgado, compreendem como região Fc, em um exemplo de realização, uma região Fc derivada de origem humana. Em um exemplo de realização, a região Fc compreende todas as partes da região constante humana. A região Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ativação do complemento, ligação ao C1q, ativação de C3 e ligação ao receptor Fc. Embora a influência de um anticorpo sobre o sistema complemento é dependente de certas condições, a ligação ao C1iq é causada por sítios de ligação definidos na região Fc. Tais sítios de ligação são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. e

Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16(1979) 907-917; Burton, D.R., et al, Nature 288(1980) 338-344;. Thommesen, J.E., et al, Mol.. Immunol. 37 (2000) 995- 1004; Idusogie, E.E., et al, J. Immunol.164 (2000) 4178-4184;. Hezareh, M., et al, J. Virol.75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al, Inmunology 86(1995)319- 324; EP 0307434. Tais sítios de ligação são, por exemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Os anticorpos das subclasses IgG1, IgG2, IgG3 geralmente mostram ativação do complemento, ligação ao C1iq e ativação de C3, ao passo que a subclasse IgG4 não ativa o sistema complemento e não se liga ao C1iq e não ativa C3. Uma “região Fc de um anticorpo” é um termo bem conhecido pelos técnicos do assunto e definido com base na clivagem de anticorpos pela papaína. Em um exemplo de realização, a região Fc é uma região Fc humana. Em um exemplo de realização, a região Fc é da subclasse IgGa humana compreendendo as mutações S228P e/ou L235E (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, a região Fc é da subclasse IgG: humana compreendendo as mutações L234A e L235A e opcionalmente P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[072] O termo “anticorpo de comprimento total” ou ainda “anticorpo completo” denota um anticorpo que possui uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa. Um anticorpo de comprimento total compreende duas cadeias leves de anticorpo de comprimento total, cada uma compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, e duas cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total, cada uma compreendendo um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio constante, uma região de dobradiça, um segundo domínio constante e um terceiro domínio constante. Um anticorpo de comprimento total pode compreender outros domínios, tais como, por exemplo, um scFv adicional ou um conjugado scFab com uma ou mais das cadeias do anticorpo de comprimento total. Estes conjugados também são englobados pelo termo anticorpo de comprimento total.

[073] Os termos “célula hospedeira”, “lihhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção.

[074] O termo “derivado de” indica que uma sequência de aminoácidos variante é obtida de uma sequência de aminoácido parental pela introdução de alterações/mutações em pelo menos uma posição. Assim, uma sequência de aminoácidos derivada difere da sequência de aminoácidos parental correspondente em pelo menos uma posição correspondente. Em um exemplo de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental, difere por um a quinze resíduos de aminoácido nas posições correspondentes. Em um exemplo de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental, difere por um a dez resíduos de aminoácido nas posições correspondentes. Em um exemplo de realização, uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos parental, difere por um a seis resíduos de aminoácido nas posições correspondentes. Da mesma forma uma sequência de aminoácidos derivada tem uma elevada identidade de sequência de aminoácidos com a sua sequência de aminoácidos parental

(precursora). Em um exemplo de realização uma sequência de aminoácidos derivada a partir de uma sequência de aminoácidos parental tem 80% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos. Em um exemplo de realização uma sequência de aminoácidos derivada a partir de uma sequência de aminoácidos parental tem 90% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos. Em um exemplo de realização uma sequência de aminoácidos derivada a partir de uma sequência de aminoácidos parental tem 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos.

[075] Em um exemplo de realização, um ou ambos polipeptídeo(s) da cadeia pesada de região Fc são derivadas de um polipeptídeo de região Fc de SEQ ID NO: 01 e ter, pelo menos, uma mutação de aminoácido em comparação com o polipeptídeo da região Fc de SEQ ID NO: 01. Em um exemplo de realização o polipeptídeo da região Fc compreende/tem cerca de uma até dez mutações de aminoácidos, e em um exemplo de realização cerca de uma a cerca de cinco mutações de aminoácidos. Em um exemplo de realização o polipeptídeo da região Fc tem pelo menos cerca de 80% de homologia com um polipeptídeo de região Fc humana de SEQ ID NO: 01. Em um exemplo de realização o polipeptídeo da região Fc tem pelo menos cerca de 90% de homologia com um polipeptídeo de região Fc humana de SEQ ID NO: 01. Em um exemplo de realização o polipeptídeo da região Fc tem pelo menos cerca de 95% de homologia com um polipeptídeo de região Fc humana de SEQ ID NO: 071.

[076] O polipeptídeo de região Fc derivado de um polipeptídeo de região Fc humana de SEQ ID NO: 01, ou 02, ou 03 ou 04 é adicionalmente definido pelas alterações de aminoácidos que estão contidas. Assim, por exemplo, o termo P329G indica um polipeptídeo de região Fc derivado de um polipeptídeo de região Fc humana com a mutação de prolina por glicina na posição de aminoácido 329 em relação ao polipeptídeo da região Fc humana de SEQ ID NO: 01 ou 02 ou 03 ou 04.

[077] Um polipeptídeo de região Fc de IgG: humana compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTOQKSLSLSP (SEQ ID NO: 01).

[078] As seguintes regiões Fc são variantes derivadas da região Fc de IgG: humana tipo selvagem.

[079] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações L234A, L235A compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTOQKSLSLSP (SEQ ID NO: 05).

[080] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V, compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 06).

[081] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações S354C, T366W, compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTOQKSLSLSP (SEQ ID NO: 07).

[082] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações L234A, L235A e as mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V, compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 08).

[083] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com uma L234A, L235A e as mutações S354C, T366W, compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFSCSVMH EALHNHYTOQKSLSLSP (SEQ ID NO: 09).

[084] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com uma mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 10).

[085] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações L234A, L235A e uma mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 11).

[086] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com uma mutação P239G e as mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V, compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTOQKSLSLSP (SEQ ID NO: 12).

[087] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com uma mutação P329G e as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 13).

[088] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações L234A, L235A, P329G e as mutações Y349C,

T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTOQKSLSLSP (SEQ ID NO: 14).

[089] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com as mutações L234A, L235A, P329G e as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 15).

[090] Um polipeptídeo de região Fc de IgG4 humana compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTOQKSLSLSL (SEQ ID NO: 04).

[091] As seguintes regiões Fc são variantes derivadas da região Fc de IgG4 humana tipo selvagem.

[092] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG4 humana com as mutações S228P e L235E compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 16).

[093] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG4 humana com as mutações S228P, L235E e uma mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCK VSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 17).

[094] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de I9gG14 humana com as mutações S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTOQKSLSLSL (SEQ ID NO: 18).

[095] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG4 humana com as mutações Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 19).

[096] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de

IgGa humana com uma mutação S228P, L235E e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 20).

[097] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG4 humana com mutações S228P, L235E e Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 21).

[098] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG4 humana com uma mutação P329G compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCK VSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 22).

[099] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG: humana com mutações P239G e Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 23).

[100] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de IgG4 humana com mutações P329G e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCK VSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYP

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 24).

[101] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de I9G4 humana com mutações S228P, L235E, P329G e Y349C, T366S, L368A, Y407V compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTOQKSLSLSL (SEQ ID NO: 25).

[102] Um polipeptídeo de região Fc derivado da região Fc de I9gG14 humana com uma mutação S228P, L235E, P329G e S354C, T366W compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYP

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSL (SEQ ID NO: 26).

[103] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, as CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere- se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[104] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que compreende os trechos de resíduos de aminoácidos que são hipervariáveis na sequência (“região determinante de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam alças (loops) estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contêm resíduos de contanto ao antígeno (“contato ao antígeno”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no domínio variável de cadeia pesada VH (H1, H2, H3), e três no domínio variável de cadeia leve VL (L1, L2, L3).

[105] As HVRs incluem; (a) alças hipervariáveis exemplares ocorrendo nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (vide Chothia, C. e Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat et al/., Sequences of Proteins of Immunological Interest,

5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242); (c) contatos ao antigênio que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).

[106] Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et al., Supra.

[107] O termo “cadeia leve” denota as cadeias polipeptídicas mais curtas dos anticorpos IgG nativos. A “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Consulte a SEQ ID NO: 33 para um domínio constante de cadeia leve kappa humana e SEQ ID NO: 34 para um domínio constante de cadeia leve lambda humana.

[108] O termo “parátopo” refere-se à parte de uma determinada molécula de anticorpo necessária para a ligação específica entre um alvo e um sítio de ligação. Um parátopo pode ser contínuo, ou seja, formado por resíduos de aminoácidos adjacentes presentes no sítio de ligação ou descontínuo, ou seja, formado por resíduos de aminoácidos que estão em posições sequencialmente diferentes na sequência primária, tal como na sequência de aminoácidos das HVRs/CDRs, mas em estreita proximidade na estrutura tridimensional que o sítio de ligação adota.

[109] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar, CE- SDS) ou por cromatografia (por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.

[110] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada a partir de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente expressam a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou está em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[111] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epíitopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclional, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo “monoclional” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos /oci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclonais descritos na presente divulgação.

[112] “Anticorpos — nativos" referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com diferentes estruturas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de

150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por ligações de bissulfeto. A partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante (CL). À “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[113] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.

[114] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[115] O termo “anticorpo recombinante”, conforme utilizado no presente, denota todos os anticorpos (quiméricos, humanizados e humanos) que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes. Isto inclui os anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira, tal como uma célula NSO, HEK, BHK ou CHO, ou a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana ou anticorpos expressos utilizando um plasmídeo de expressão recombinante, transfectado em uma célula hospedeira. Tais anticorpos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes em uma forma rearranjada. Os anticorpos recombinantes, tal como os divulgados na presente invenção, podem ser submetidos à hipermutação somática in vivo. Assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas a partir de, e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinal humana, não podem existir naturalmente dentro do repertório in vivo da linhagem germinal de anticorpos humanos.

[116] O termo “valente”, usado no presente pedido denota a presença de um determinado número de sítios de ligação em uma molécula (anticorpo). Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalentes”, e “hexavalentes” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula (anticorpo). Os anticorpos biespecíficos preferidos conforme divulgado na presente invenção são, em um exemplo de realização preferido, “bivalentes” ou “trivalentes”.

[117] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao seu antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs) (vide, por exemplo, Kindt, T.j., et al., Kuby Immunology, 6º ed., W.H. Freeman & Co., Nova lorque, (2007) pág. 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

[118] O termo “variante” denota moléculas que possuem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de uma molécula parental. Normalmente, essas moléculas têm uma ou mais alterações, inserções ou deleções. Em um exemplo de realização, o anticorpo modificado ou o polipeptídeo de fusão modificado compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma porção de uma região Fc que não ocorre naturalmente. Tais moléculas têm menos de 100% de identidade de sequência com o domínio parental ou a região Fc. Em um exemplo de realização, a variante tem uma sequência de aminoácidos que tem de cerca de 75% a 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos do domínio ou região Fc parental, especialmente cerca de 80% a menos de 100%, especialmente de cerca de 85% a menos de 100%, especialmente de cerca de 90% a menos de 100% e especialmente de cerca de 95% a menos de 100%. Em um exemplo de realização, o domínio ou região Fc parental e o domínio variante ou região Fc diferem por um (um único), dois ou três resíduos de aminoácidos.

[119] O termo “domínio cruzado” (crossover) conforme utilizado na presente invenção denota que em um par de um fragmento VH-CH1 de cadeia pesada de anticorpo e sua cadeia leve de anticorpo cognata correspondente, ou seja, em um braço de ligação de anticorpo (isto é, no fragmento Fab), a sequência de domínio desvia da sequência natural de modo que pelo menos um domínio de cadeia pesada é substituído pelo seu domínio de cadeia leve correspondente e vice-versa. Existem três tipos gerais de crossovers de domínio, (i) o crossover dos domínios CH1 e CL, que leva ao crossover de domínio de cadeia leve com uma sequência de domínio VL-CH1 e um crossover de domínio de fragmento de cadeia pesada com uma sequência de domínio VH-CL (ou uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento total com uma sequência do domínio VH-CL-dobradiça-CH2-CH3), (ii) o crossover de domínio dos domínios VH e VL, o que leva ao crossover de domínio da cadeia leve com uma sequência de domínio VH-CL e um crossover de domínio de fragmento de cadeia pesada com uma sequência de domínio VL-CH1 e (iii) o crossover de domínio da cadeia leve completa (VL-CL) e o fragmento de cadeia pesada VH-CH1 completo (“Fab crossover”), que leva a um crossover de domínio de cadeia leve com uma sequência de domínio VA-CH1 e um crossover de domínio de fragmento de cadeia pesada com uma sequência de domínio VL-CL (todas as sequências de domínio mencionadas acima são indicadas na direção N-terminal para C-terminal).

[120] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “substituído um pelo outro” em relação aos domínios de cadeia pesada e leve correspondentes refere-se aos cruzamentos (crossovers) de domínio mencionados acima. Desse modo, quando os domínios CH1 e CL são “substituídos um pelo outro”, refere-se ao crossover de domínio mencionado no item (i) e a sequência de domínio de cadeia pesada e leve resultante . Consequentemente, quando VH e VL são “substituídos um pelo outro”, refere- se ao crossover de domínio mencionado no item (ii); e quando os domínios CH1 e CL são “substituídos um pelo outro” e os domínios VH1 e VL são “substituídos um pelos outro”, essas expressões referem-se ao crossover de domínio mencionado no item (iii). Os anticorpos biespecíficos incluindo crossovers de domínios são divulgados, por exemplo, nos documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 e Schaefer, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192.

[121] O anticorpo multiespecífico produzido com um método tal como descrito na presente invenção pode compreender essencialmente fragmentos Fab incluindo um crossover de domínio dos domínios CH1 e CL conforme mencionado no item (i) acima, ou um crossover de domínio dos domínios VH e VL conforme mencionado no item (ii) acima. Os fragmentos Fab que se ligam especificamente ao(s) mesmo(s) antígeno(s) são construídos para serem da mesma sequência de domínio. Assim, no caso de mais do que um fragmento Fab com um crossover de domínio estar contido no anticorpo multiespecífico, o(s) referido(s) fragmento(s) Fab se ligam especificamente ao mesmo antígeno.

Il. MÉTODOS E COMPOSTOS ESPECÍFICOS DE ACORDO COM À INVENÇÃO

[122] Para a identificação da melhor combinação de ligantes para uso em anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos bi ou triespecíficos, é desejável testar o maior número possível de combinações. Portanto, são necessários métodos que permitam combinar uma multiplicidade de diferentes ligantes sítios de ligação diferentes cada um com especificidades, isto é ligantes, uns com os outros e para triar a melhor combinação em um ensaio de ligação ou funcional.

[123] Por exemplo, cada ligante de uma primeira multitude de sítios de ligação com a(s) primeira(s) especificidade(s) de ligação (por exemplo, diferentes pares de domínio variável de cadeia leve e domínio variável da cadeia pesada, fragmentos Fv) é combinado com cada ligante de uma segunda multitude de sítios com a(s) segunda(s) especificidade(s) de ligação (por exemplo, ligação a um epítopo diferente no mesmo antígeno ou a um antígeno diferente). Isto resulta na preparação de uma matriz de combinação que abrange cada combinação de sítios de ligação da referida primeira multitude com cada uma da referida segunda multitude. Além disso, e preferencialmente, também formatos diferentes em relação a valências e funcionalidades estão incluídos nessa matriz de combinação. Os anticorpos multiespecíficos gerados são então submetidos a ensaios para identificar as combinações e formatos que possuem as funcionalidades desejadas (por exemplo, classificando de acordo com o desempenho funcional e/ou parâmetros desejados e importantes para o desenvolvimento da droga). O tamanho das matrizes de combinação de duas especificidades cresce exponencialmente com o número linear crescente de moléculas de entrada, por exemplo, 100 'ligantes-A' e 100 'ligantes-B' geram

10.000 diferentes 'A+B-bsAbs' (bsAb = anticorpo biespecífico). A geração de um número tão grande de A+B bsAbs diferentes por meio de design individual e geração de cassetes de expressão seguidas da expressão e purificação é incômoda e impõe um limite ao tamanho das matrizes que podem ser avaliadas.

[124] Pelo menos duas tarefas se beneficiam da combinação de geração e triagem de muitas entidades de entrada diferentes (diferentes especificidades, epítopos, geometrias, afinidades e/ou valências): a melhora da ligação mediada por avidez e a geração de bsAbs agonísticos.

[125] A melhora da ligação mediada por avidez baseia-se em derivados de anticorpo que possuem funcionalidade de ligação fraca ou nenhuma funcionalidade na forma monovalente, com funcionalidade de ligação alcançada apenas pela conexão física de dois sítios de ligação (diferentes) monovalentes em um bsAb bivalente (ou mesmo multivalente). A bi- ou multivalência gera avidez com especificidade dependente da ligação dos dois sítios de ligação diferentes.

[126] O princíbio dos anticorpos agonísticos bi- Ou multiespecíficos é semelhante: a funcionalidade é provocada pela ligação simultânea (isso pode incluir reticulação) de diferentes antígenos, enquanto a ligação de apenas uma entidade de ligação monovalente não tem atividade.

[127] O denominador comum dos princípios acima é (nenhuma ou no máximo má funcionalidade de entidades de ligação monovalentes individuais e) funcionalidade desejada de combinações bi- ou multivalentes. À identificação das combinações desejadas do sítio de ligação é baseada na avaliação da ligação e/ou função da ligação mediada por avidez ou bsAbs agonísticos (mediada por bi- ou multivalência). Portanto, para esta triagem é necessário que os anticorpos de teste, ou seja, o bsAb gerado, por exemplo, através da reação de troca de acordo com a presente invenção, não contenham moléculas monoespecíficas remanescentes (bivalentes), pois podem gerar resultados falso-positivos. Igualmente ou até mais perturbador, pela mesma razão, são produtos secundários de reação multivalentes, como, por exemplo, agregados.

A) MÉTODO PARA CONVERTER DERIVADOS DE IGG MONOVALENTES MONOESPECÍFICOS EM IGGS BIVALENTES BIESPECÍFICAS

[128] O método de acordo com a presente invenção consegue a conversão de anticorpos monoespecíficos (monovalentes) ou fragmentos de anticorpos em bsAbs bivalentes. Os métodos permitem a fácil remoção de material de partida não convertido, bem como produtos secundários bivalentes, mas monoespecíficos, bem como agregados formados durante a reação. Ou seja, o método de acordo com a invenção resolve, entre outras coisas, pelo menos as duas questões de evitar anticorpos monoespecíficos bivalentes, bem como agregados indesejados, presentes na preparação final.

[129] Para alcançar este objetivo, dois meio anticorpos não funcionais (apenas monoespeciíficos) são utilizados como material de partida. Por exemplo, os chamados 2/3-lgGs podem ser usados como material de partida. 2/3-lgGs são compostos de uma cadeia pesada com o primeiro conjunto de mutações do tipo knob-into-hole (KiH), uma cadeia leve complementar a ela, bem como uma região Fc, que é tornada complementar à região Fc da cadeia pesada pelo respectivo segundo conjunto complementar de mutações knob-into-hole. A região Fc complementar pode ser, por exemplo, um fragmento de cadeia pesada da região Fc ou uma segunda cadeia pesada. Para promover ainda mais a montagem correta do anticorpo bi-(multi- )específico a região Fc complementar compreende além do segundo conjunto complementar de mutações KIH uma mutação adicional que introduz uma carga repulsiva (desestabilizadora) perturbadora. Adicionalmente, a região Fc complementar pode compreender um marcador (tag) de afinidade (por exemplo, His6 ou C-Tag) para a remoção eficiente de edutos e produtos não desejados após a reação. Os segundos 2/3 de IgG (2/3-lgG) compreendem mutações perturbadoras complementares que se transformam em mutações atraentes quando as metades do anticorpo trocam entre si, por exemplo, após a mistura.

[130] A troca de reação/método de acordo com a presente invenção compreende a seguinte etapa de; - "incubação de um primeiro polipeptídeo heterodimérico (de partida), que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, com um segundo polipeptídeo heterodimérico (de partida), que compreende um terceiro polipeptideo e um quarto polipeptídeo, para trocar transversalmente o segundo e o terceiro polipeptídeo e formar um terceiro e um quarto polipeptídeo heterodimérico, e - —recuperação do quarto polipeptídeo heterodimérico (trocado), que compreende o primeiro polipeptídeco e o quarto polipeptídeo, em que:

|) o segundo polipeptideco compreende uma mutação (primeira mutação perturbadora) resultando em uma desestabilização do primeiro polipeptídeo heterodimérico em comparação com um polipeptídeo (heterodimérico) idêntico ao referido primeiro polipeptídeo heterodimérico, exceto para a referida mutação no segundo polipeptídeo,

ii) o terceiro polipeptídeo compreende uma mutação (segunda mutação perturbadora) resultando em uma desestabilização do segundo polipeptídeo heterodimérico em comparação com um polipeptídeo heterodimérico idêntico ao referido segundo polipeptídeo (heterodimérico), exceto para a referida mutação no terceiro polipeptídeo,

iii) a mutação (primeira mutação perturbadora) no segundo polipeptídeo e a mutação (segunda mutação perturbadora) no terceiro polipeptídeo resultam em uma estabilização do terceiro polipeptídeo heterodimérico (trocado) compreendendo o referido segundo polipeptídeo e o referido terceiro polipeptideco em comparação com o primeiro polipeptídeo (de partida) heterodimérico e/ou com o segundo polipeptídeo (de partida) heterodimérico, e iv) o quarto polipeptídeo heterodimérico (trocado) é mais estável em comparação com o primeiro polipeptídeo heterodimérico (de partida) e/ou o segundo polipeptídeo heterodimérico (de partida).

[131] Assim, a presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que a adição de uma única mutação desestabilizadora (perturbadora) (unilateral, não pareada) em um polipeptídeo heterodimérico é suficiente para promover a troca de cadeias polipeptídicas com um segundo polipeptídeo — heterodimérico — compreendendo — também “uma mutação desestabilizadora (perturbadora) única (unilateral, não pareada), pois ambos os polipeptídeos — heterodiméricos trocados recém-formados resultantes têm estabilidade melhorada em comparação com os polipeptídeos heterodiméricos iniciais (isto é, energia livre de ligação CH3-CH3 mais baixa). A única condição que tem de ser cumprida é que as mutações desestabilizadoras (perturbadoras) sejam introduzidas em posições que interagem entre si, uma vez que os respectivos polipeptídeos se associam.

[132] Esta metodologia pode ser aplicada a qualquer polipeptídeo heterodimérico que preencha os critérios descritos acima.

[133] No entanto, o método de acordo com a presente invenção é especialmente útil na área farmacêutica.

[134] Com o método de acordo com a invenção, é facilmente possível gerar grandes bibliotecas de ligantes biespecíficos se os respectivos polipeptídeos de cada um dos polipeptídeos de partida heterodiméricos que se associam durante a reação de troca compreendem um ou mais sítios de ligação. Assim, um dos polipeptídeos heterodiméricos trocados obtido no método de acordo com a presente invenção compreenderá estes sítio de ligação.

[135] São conhecidos a partir do estado da técnica diferentes métodos para a geração de polipeptídeos heterodiméricos. Qualquer um destes métodos pode ser utilizado desde que as mutações necessárias para a formação dos polipeptídeos heterodiméricos de partida não interfiram ou se sobreponham às mutações desestabilizantes (perturbadoras) necessárias para a reação de troca de acordo com a presente invenção.

[136] Voltando à área farmacêutica, os anticorpos são a classe de ligantes mais amplamente utilizada. Os anticorpos dimerizam por meio de interações em sua região constante, especialmente entre os domínios CH3 das cadeias pesadas.

[137] Assim, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na constatação de que, para realizar o método de acordo com a presente invenção, é suficiente a introdução de uma única mutação desestabilizadora em um domínio CH3 de um par de domínios CH3. De modo mais detalhado, verificou-se que a introdução de uma primeira mutação desestabilizadora na posição 357 em apenas um domínio CH3 do primeiro polipeptídeo heterodimérico de partida e uma segunda mutação desestabilizadora na posição 370 em apenas um domínio CH3 do segundo polipeptídeo de partida promove, a pós a incubação, nos dois polipeptídeos heterodiméricos de partida, a troca espontânea de cadeias polipeptídicas entre esses polipeptídeos iniciais. Um dos polipeptídeos trocados resultantes compreende o par de domínios CH3 com as mutações na posição 357 e 370, respectivamente, que resultam em uma estabilização do heterodímero trocado. O mesmo pode ser alcançado com as mutações nas posições 356 e 439. A numeração de todas as posições está de acordo com o índice EU de Kabat. Um par preferido de mutações é o E357K e o K370E. Outro par preferido de mutações é D356K e K439E. O método de acordo com a presente invenção pode ser aplicado a qualquer subclasse de IgG, ou seja, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, uma vez que os resíduos em questão são altamente conservados. Em um exemplo de realização preferido, o domínio CH3 é da subclasse IgG7.

[138] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na constatação de que as cadeias polipeptídicas dos polipeptídeos heterodiméricos de partida não precisam ser covalentemente ligadas entre si, por exemplo, por meio de ligações de bissulfeto, para permitir a formação e o isolamento dos polipeptídeos heterodiméricos iniciais. Mais detalhadamente, como os polipeptídeos de partida já são heterodímeros, estes compreenderão outras mutações para heterodimerização. Verificou-se que essas mutações são suficientes para estabilizar os heterodímeros de partida, mesmo na presença da mutação unilateral desestabilizadora (perturbadora). Deste modo, já não ocorre a necessidade de uma ligação covalente das cadeias nos polipeptídeos heterodiméricos de partida. Assim, em um exemplo de realização, no caso da região de dobradiça contendo polipeptídeos heterodiméricos de partida, essas regiões de dobradiça compreendem as mutações C226S e C229S ou uma exclusão de toda a sequência CPXC (SEQ ID NO: 89) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[139] Pela omissão de ligações de bissulfeto entre a região Fc compreendendo cadeias dos polipeptídeos heterodiméricos de partida, o agente redutor não precisa ser adicionado para iniciar a reação de troca. Isso permite condições de reação mais brandas. Além disso, as ligações de bissulfeto podem estar presentes nos polipeptídeos heterodiméricos de partida, como por exemplo, em um fragmento Fab.

[140] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na constatação de que polipeptídeos heterodiméricos trocados, por exemplo, aqueles que compreendem os sítios de ligação, podem ser adicionalmente estabilizados pela formação de ligações de bissulfeto apenas após a reação de troca. Por exemplo, mutações bem estabelecidas para a formação de anticorpos heterodiméricos são as mutações knobs-into-holes. Estes existem em duas variantes: sem e com ligação de bissulfeto adicional. Assim, um polipeptídeo heterodimérico de partida alternativo compreende as mutações knob-into-holes para a formação dos polipeptídeos heterodiméricos de partida, e provê o resíduo de cisteína do knob-into-hole apenas na cadeia polipeptídica que abriga o(s) sítio(s) de ligação. Desse modo, apenas no polipeptídeo heterodimérico trocado, que compreende os sítios de ligação, ambos resíduos de cisteína necessários para a formação de uma ligação de bissulfeto nas posições correspondentes estão presentes. Dessa forma, apenas no referido produto trocado é formada uma ligação de bissulfeto. Isto resulta em uma estabilização adicional do polipeptídeo heterodimérico trocado alvo.

[141] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que a presença de um marcador em cada uma das cadeias polipeptídicas que também compreende a mutação desestabilizadora (perturbadora) proporciona uma purificação aprimorada do polipeptídeo heterodimérico trocado que compreende os sítios de ligação. Assim, é possível a separação a partir do material de partida não reagido, bem como de polipeptídeos heterodiméricos trocados não alvo, como o polipeptídeo heterodimérico trocado que compreende os sítios de ligação e não compreende o referido marcador.

[142] O termo “heterodimérico”, conforme usado na presente invenção, denota um polipeptídeo compreendendo pelo menos duas cadeias polipeptídicas que não são idênticas nas sequências de aminoácidos, em parte ou completamente, e que atendem aos requisitos da invenção. O termo também abrange polipeptídeos compreendendo três ou mais cadeias polipeptídicas, desde que pelo menos duas delas sejam heterodiméricas de acordo com a invenção. Assim, o termo “multimérico” indica um polipeptídeo compreendendo pelo menos três cadeias polipeptídicas das quais pelo menos duas são heterodiméricas e preencham os requisitos da invenção.

[143] O termo “mutação perturbadora” denota uma mutação que resulta na desestabilizaçção de um polipeptídeo (hetero)dimérico. Esta desestabilização é geralmente alcançada alterando a carga de um resíduo de aminoácido, como por exemplo, trocando um resíduo de aminoácido carregado positivamente por um resíduo de aminoácido carregado negativamente, ou vice-versa. Tal troca resulta em cargas semelhantes nas posições de interação e, portanto, na repulsão de carga. Um par preferido de mutações é o ES57Ke o K370E. Outro par preferido de mutações é D356K e K439E. Adicionalmente, o método de acordo com a presente invenção pode ser aplicado a qualquer subclasse de IgG, ou seja, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, uma vez que os resíduos em questão são altamente conservados. Em um exemplo de realização preferido, o domínio CH3 é da subclasse IgG1.

[144] Um método para avaliar o efeito da mutação do domínio CH3 na estabilidade do dímero é divulgado no documento WO 2009/089004 (incorporado ao presente como referência). Nele é descrito como o software EGAD pode ser usado para estimar a energia livre de ligação do domínio CH3- CH3 (consulte também Pokala, N. e Handel, T.M., J. Mol. Biol. 347 (2005) 203- 227, integralmente incorporado ao presente como referência):

[145] O EGAD pode ser usado para comparar aproximadamente a energia livre de ligação de várias mutações feitas na interface do domínio CH3. A energia livre de ligação de um mutante é definida como AAGmut = À (AGmut - AGwt) (mut = mutante, wt = tipo selvagem). Onde yu (= 0,1, em geral) é o fator de escala usado para normalizar as mudanças previstas na afinidade de ligação para ter uma inclinação de | ao comparar com as energias experimentais. A energia livre de dissociação (AG) é definida como a diferença de energia entre o complexo (AGbound) e os estados livres (AGfree).

[146] A invenção é exemplificada a seguir com materiais de partida específicos e exemplares, isto é, 2/3-lgGs. Isto é apresentado como uma exemplificação do conceito geral subjacente e não deve ser interpretado como uma limitação da invenção. O verdadeiro escopo da invenção é estabelecido nas reivindicações.

[147] A Figura 1 mostra o design e a composição modular de 2/3- IgGs utilizados como compostos de partida exemplares nos métodos de acordo com a presente invenção. Os 2/3-lIgGs são compostos de três cadeias individuais: uma cadeia leve (normalmente uma cadeia leve de comprimento total compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve), uma cadeia pesada (normalmente uma cadeia pesada de comprimento total compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e todos os domínios constantes de cadeia pesada, incluindo uma região de dobradiça), e um polipeptídeo complementar da cadeia pesada da região Fc (normalmente um fragmento de cadeia pesada da região Fc compreendendo pelo menos um fragmento de dobradiça e CH2-CH3). Os domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada formam um sítio de ligação funcional, isto é, um par VH-VL. A cadeia pesada (normalmente da subclasse IgG: humana) contém i) a mutação knob ou as mutações hole (a mutação T366W no domínio CH3 de uma cadeia pesada do anticorpo é denominada de “mutação knob" e a combinação das mutações T366S/L368A/Y407V no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpos são denominadas de “mutações hole" (numeração de acordo com o índice EU de Kabat)) ou ii) as mutações knob-cys ou mutações hole-cys (a combinação das mutações T366W/S354C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é denominada “mutações Kknob-cys" e a combinação das mutações T366S/L368A/Y407V/Y349C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é denominada “mutações hole-cys"; a configuração invertido é igualmente possível: T3866W/Y349C e T366S/L368A/Y407V/S354C (numeração de acordo com índice EU de Kabat)) nos CH3 domínios para permitir a formação de heterodímeros knob-into-hole da região Fc. O polipeptídeo complementar da cadeia pesada da região Fc também pode ser indicado como um “dummy-Fc” (falso-Fc), ou seja, um derivado de IgG: que não possui VH e CH1, começa no N-terminal com a sequência da região de dobradiça (ou um fragmento da mesma) e carrega um marcador (tag) de purificação, por exemplo, His6 ou His8 ou C-Tag, em sua extremidade C-terminal. Além disso, o polipeptídeo complementar da região Fc de cadeia pesada do 2/3-lgG contém em seus domínios CH3 a mutação knob ou as mutações hole, dependendo das mutações na cadeia pesada. Além da mutação knob ou mutações hole o polipeptídeo de cadeia pesada da região Fc compreende pelo menos uma mutação perturbadora (ou seja desestabilizadora) introduzindo uma carga repulsiva (ou seja, uma única carga adicional) em relação à sequência tipo selvagem: por exemplo, D356K ou E357K, respectivamente, em combinação com K370E ou K439E, respectivamente (SEQ ID NO: 35, 36, 37 e 38, que também são aspectos da presente invenção) (consulte a Figura 2). Tal polipeptídeo de cadeia pesada da região Fc mutante é indicado a seguir como MHCFCRP (do inglês: mutated heavy chain Fc-region polypeptide).

[148] A cadeia pesada e o MHCFCcRP podem formar dois tipos de heterodímeros, dependendo da distribuição das mutações knob-into-hole neles: i) cadeia pesada-knob(-cys)::MHCFcRP-hole, e ii), cadeia pesada-hole(-cys):: MHCFCcRP-knob.

[149] Assim, os 2/3-lgGs são heterodímeros com cadeia leve associada, isto é, heterotrímeros. Entretanto, eles são pouco 'defeituosos', pois a mutação de carga no MHCFCRP não possui contraparte correspondente na cadeia pesada e, quando presente na cadeia pesada, o MHCFCRP carece da cisteina CH3 adicional necessária para formar uma ligação de bissulfeto intercadeia para a cadeia pesada.

[150] Os 2/3-l9Gs são monovalentes, não dimerizantes/agregantes, derivados de anticorpos de um braço que podem ser expressos e purificados em rendimentos semelhantes aos de IlgGs normais

(consulte a Figura 3). Isso garante a monovalência do material de partida. Se os 2/3-I9G bivalentes forem usados, eles podem ser monoespeciíficos e também biespeciíficos.

[151] Os polipeptídeos que compõem os 2/3-lgGs defeituosos, no entanto, são capazes de se reorganizar para anticorpos biespecíficos, como mostrado na Figura 4.

[152] A reação de troca entre as duas moléculas de partida é impulsionada por uma melhor complementaridade entre as cadeias pesadas KiH (knobs-into-holes)(cadeias H) (sem repulsão de carga e opcionalmente formando uma ligação de bissulfeto se resíduos de cisteína livres estiverem presentes), bem como por uma melhor complementaridade dos dois MHCFCcRPs entre si Na reação, os complexos de região Fc das duas moléculas de partida dissociam e trocam polipeptídeos para formar dois complexos mais favoráveis. Isso conduz a seguinte reação: 2/3-I9G(A)-tag + 2/3-I9G(B)-tag (polipeptídeos heterodiméricos de partida) = bsAb(AB) + MHCFCRP(A)-MHCFcRP(B)-tag (polipeptídeos heterodiméricos trocados)

[153] No exemplo, como representado na Figura 4, a cadeia pesada (knob-cys) dos 2/3-I9G(A) de partida e a cadeia pesada (hole-cys) dos 2/3-I9G(B) de partida formam uma heterotetrâmero de anticorpo biespecífico pareado (2xHC + 2XLC).

[154] A reação de troca é iniciada (no caso de ligações de bissulfeto da região de dobradiça/inter-cadeia pesada) por uma etapa de redução para romper as ligações de bissulfeto. Se forem usados 2/3-lgGs livres de ligação de bissulfeto na região da dobradiça, a etapa de redução poderá ser omitida (vide abaixo). O rearranjo da cadeia ocorre espontaneamente a partir de então.

[155] Todas as moléculas de 2/3-lgdG de partida, todos subprodutos MHCFCRP diméricos, bem como todos os agregados que podem ser formados durante a reação de troca, compreendem pelo menos um marcador (tag) de afinidade (por exemplo, His6 ou His8 ou C-Tag). Assim, uma única e simples etapa, assim como uma etapa de absorção de alto rendimento absorção compatível (cromatografia por afinidade) pode ser utilizada para remover todas as moléculas indesejáveis, incluindo agregados. Por exemplo, no caso do marcador His6, esta etapa é uma cromatografia por afinidade com quelato metálico (vide as Figuras 6 e 7). Os bsAbs purificados resultantes podem ser aplicados diretamente aos procedimentos de triagem para identificar bsAbs com as funcionalidades desejadas (vide a Figura 8).

[156] Veja os exemplos abaixo, especialmente os exemplos de 1 ao.

B) MÉTODO PARA CONVERTER DERIVADOS DE IGG MONO- E/OU BIVALENTES. MONO- OU BIESPECÍFICOS EM ANTICORPOS Bl-, TRI- OU TETRAVALENTES, Bl-, TRI- OU TETRAESPECÍFICOS.

[157] Com o método de acordo com a presente invenção, é possível não só combinar diferentes especificidades de ligação, como também produzir ao mesmo tempo essas combinações em diferentes formatos e com diferentes valências. Isso é alcançado expandindo os materiais de partida usados no método, conforme descrito na seção anterior.

[158] Por exemplo, a partir de 2/3-l9G como descrito na seção anterior, o MHCFCRP é mantido inalterado, mas a cadeia pesada é usada em diferentes formatos. Tais formatos podem ser, por exemplo, cadeias que possuem um sítio de ligação no C-terminal ou N-terminal ou dois sítios de ligação um cada extremidade (um no N-terminal e outro no C-terminal) (consulte as Figuras 9 e 10).

[159] Neste exemplo, três formatos de partida diferentes (sítio de ligação N-terminal, sítio de ligação C-terminal, sítios de ligação C-terminal e N- terminal) são combinados entre si no método de acordo com a invenção para resultar em 9 formatos de bsAb diferentes que possuem diferentes sítios de ligação, diferentes valências, diferentes geometrias e diferentes arranjos/posições tridimensionais dos sítios de ligação individuais (consulte a Figura 11).

[160] Como exemplo, as moléculas de partida 50 'ligante-A' e 50 'ligante-B' podem ser expressas nos três formatos cada (sítio de ligação no N- terminal, sítio de ligação no C-terminal, sítios de ligação no N-terminal e C- terminal), resultando em 150(3*50) preparações de 2/3 - IgGs para cada ligante como moléculas de partida. Estes podem ser subsequentemente embaralhados e combinados com o método da presente invenção. Isso gera 22.500 (50*3 x 50*3) bsAbs diferentes.

[161] Para a geração dos bsAb princípio que conduz a troca (conversão da moléculas de entrada defeituosa em moléculas de saída pareadas) não é alterado. Os MHCFcRPs também são mantidos. Assim, apenas a cadeia pesada é alterada/diversificada.

[162] As Figuras 1 e 9-10 mostram que três moléculas de partida diferentes (2/3-IgG com sítios de ligação N-terminal, C-terminal, e N-terminal e C-terminal) podem ser combinadas entre si na reação de troca de acordo com a presente invenção, resultando em nove formatos biespecíficos diferentes. Eles diferem em valências, geometrias e posições dos sítios de ligação individuais.

[163] Sem estar ligado a esta teoria, supõe-se que as reações de troca baseadas na separação temporária de heteromultímeros defeituosos de dois 2/3-lgGs diferentes possam resultar em produtos que contenham heterodímeros da região Fc preferencialmente pareados. As trocas convertem,

portanto, os 2/3-I9G monoespecíficos em IgG biespecíficas (em diferentes formatos), bem como o heterodímero da região Fc correspondente.

[164] Para a descrição exemplar das reações de troca, as moléculas de entrada são denominadas da seguinte forma: - “nAounB' para moléculas que tenham o braço Fab no N- terminal normal da cadeia pesada (cadeia H), - “CA ou cB' para moléculas que tenham o braço Fab no C- terminal da cadeia H, - —“ncA ou ncB' para moléculas que tenham o braço Fab no N- terminal bem como no C-terminal da cadeia-H,

[165] As diferentes reações de troca de formato são as seguintes: 2/3-I9G(nNA)-tag + 2/3-I9G(nB)-tag — bsAb(nAnB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-I9G(nNA)-tag + 2/3-I9G(cB)-tag — bsAb(nAcB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-I9G(nNA)-tag + 2/3-IgG(ncB)-tag — bsAb(nAncB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-Ig9G(cB)-tag — bsAb(cAcB) + (MHCFCcRP)2-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-IgG(nB)-tag — bsAb(cAnB) + (MHCFcRP)2>-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-IlgG(ncB)-tag — bsAb(cAncB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-Ig9G(ncA)-tag + 2/3-lgG(nB)-tag — bsAb(ncAnB) + (MHCFcRP)2>-tag 2/3-Ig9G(ncA)-tag + 2/3-Ig9G(cB)-tag — bsAb(ncAcB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-I9G(ncA)-tag + 2/3-IgG(ncB)-tag — bsAb(ncAncB) + (MHCFcRP)2-tag

[166] Se estiverem presentes ligações de bissulfeto na região dobradiça, as reações de troca são iniciadas por uma etapa de redução para quebrar as ligações de bissulfeto intercadeias da região dobradiça. A troca e o rearranjo da cadeia ocorreram espontaneamente. Todas as moléculas de entrada, todos os subprodutos, bem como todos os agregados que potencialmente podem se formar durante a reação de troca carregam um marcador de afinidade (por exemplo, His6). O BsAb desejado produzido na reação de troca, no entanto, não possuem um marcador de afinidade e, consequentemente, foram removidos através de cromatografia de afinidade NINTA (absorção). Os bsAbs restantes (em diferentes formatos) podem ser aplicados diretamente aos procedimentos de triagem e análises para identificar e classificar bsAbs em formatos com funcionalidade ideal.

[167] Consulte os Exemplos 6 e 7.

[168] Para demonstrar a aplicabilidade geral do método de acordo com a invenção formatos variantes baseados nos 2/3-IgG adicionais foram preparados e submetidos a reação de troca de acordo com a presente invenção.

1) LIGANTE NÃO ANTICORPO:

[169] Em um formato adicional, a região Fab de 2/3-lgG foi substituída por um affibody (consulte a Figura 19). A reação de troca também funcionou (consulte a Figura 23, e os resultados do ensaio ELISA).

[170] Consulte o Exemplo 13.

1) ADIÇÃO DE UM TERCEIRO SÍTIO DE LIGAÇÃO (PAR VH/VL) NA REGIÃO FAB:

[171] Em um formato adicional, um dos 2/3-lgGs compreendia uma segunda região Fab (2/3-lgG com Fab estendido; consulte a Figura 26). À reação de troca também funcionou (consulte a Figura 27).

[172] Para a descrição das reações de troca, as moléculas de entrada são denominadas da seguinte forma: - “dA' para moléculas com dois braços Fab no N-terminal normal da cadeia pesada (2/3-I9G com Fab estendido) - “nB' para moléculas possuindo o braço Fab no N-terminal normal da cadeia pesada (cadeia H), - "“cB' para moléculas possuindo o braço Fab no C-terminal da cadeia-H, - “ncB' para moléculas com braços Fab no N-terminal bem como no C-terminal da cadeia-H,

[173] As diferentes reações de troca de formato são as seguintes: 2/3-I9G(dA)-tag + 2/3-IgG(nB)-tag — bsAb(dAnB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-I9G(dA)-tag + 2/3-Ig9gG(cB)-tag — bsAb(dAcB) + (MHCFCcRP)2-tag 2/3-I9G(dA)-tag + 2/3-IgG(ncB)-tag — bsAb(dAncB) + (MHCFcRP)2-tag

[174] Consulte os Exemplos 9, 15 e 16.

1) LIGANTES CONTRAÍDOS:

[175] Em um formato adicional, um dos 2/3-l9Gs compreende, em vez de uma região Fab, um ligante contraído, conforme descrito no WO 2017/191101 (incorporado ao presente como referência) (2/3-I9G contraído, conA, conB; veja a Figura 31). A reação de troca também funcionou (consulte as Figuras 32, 33 e 34).

[176] Para a descrição das reações de troca, as moléculas de entrada são denominadas da seguinte forma: - “conA ou conB' para moléculas com um sítio de ligação contraído compreendendo a primeira parte do sítio de ligação N-terminal à região Fc e a segunda parte do sítio de ligação C-terminal à região Fc, em que a primeira e a segunda parte estão associadas entre si e formam o sítio de ligação, estas moléculas são circulares, - “nAounB' para moléculas que tenham o braço Fab no N- terminal normal da cadeia pesada (cadeia H), - “CA ou cB' para moléculas que tenham o braço Fab no C- terminal da cadeia H, - —“AnCA ou ncB' para moléculas com braços Fab no N-terminal bem como no C-terminal da cadeia-H,

[177] As diferentes reações de troca de formato são as seguintes: 2/3-Ig9G(conA)-tag + 2/3-IgG(nB)-tag — bsAb(nAnB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-Ig9G(conA)-tag + 2/3-IgG(cB)-tag — bsAb(nAcB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-Ig9G(conA)-tag + 2/3-IlgG(ncB)-tag — bsAb(nAncB) + (MHCFcRP)2>-tag 2/3-IgG(conA)-tag + 2/3-IgG(conB)-tag — bsAb(conAconB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-I9G(nNA)-tag + 2/3-I9G(nB)-tag — bsAb(nAnB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-I9G(nA)-tag + 2/3-IgG(cB)-tag — bsAb(nAcB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-I9G(nA)-tag + 2/3-IgG(ncB)-tag — bsAb(nAncB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-I9G(nNA)-tag + 2/3-IgG(conB)-tag — bsAb(nAconB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-IgG(cB)-tag — bsAb(cAcB) + (MHCFcRP)2-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-IlgG(nB)-tag — bsAb(cAnB) + (MHCFcRP)2>-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-IgG(ncB)-tag — bsAb(cAncB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-I9G(cA)-tag + 2/3-IgG(conB)-tag — bsAb(cAconB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-Ig9G(ncA)-tag + 2/3-IgG(nB)-tag — bsAb(ncAnB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-Ig9G(ncA)-tag + 2/3-Ig9G(cB)-tag — bsAb(ncAcB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-Ig9G(ncA)-tag + 2/3-IgG(ncB)-tag — bsAb(ncAncB) + (MHCFcRP)>-tag 2/3-Ig9G(ncA)-tag + 2/3-IgG(conB)-tag — bsAb(ncAconB) + (MHCFcRP)2-tag

[178] Consulte o Exemplo 21. C) &— ELIMINAÇÃO DAS LIGAÇÕES DE BISSULFETO INTERCADEIA DA REGIÃO FC E DA

ETAPA DE REDUÇÃO

[179] As ligações de bissulfeto intercadeia das cadeias pesadas estabilizam os anticorpos e definem a flexibilidade dos braços Fab que estão conectados à dobradiça. A troca aproxima a região de dobradiça que compreende os anticorpos de partida requer a redução destes bissulfetos antes ou durante a reação de troca, assim como a remoção dos agentes de redução após a conclusão da reação de troca (vide os Exemplos 3 e 7). Pode ser desejado evitar essa etapa de redução para algumas abordagens e para facilitar o processamento a jusante de produtos de troca.

[180] Assim, é divulgado como outro aspecto da presente invenção uma reação de troca de moléculas de partida que têm uma região de dobradiça, mas não possuem ligações de bissulfeto da região de dobradiça entre cadeias.

[181] Para exemplificar isso, foram produzidos 3/2 IgGs em que todas as ligações de bissulfeto na região Fc foram eliminados. Verificou-se que esses 2/3-lgGs desprovidos de bissulfeto podem ser produzidos e purificados de maneira eficaz, mesmo sem essas ligações de bissulfeto intercadeia (vide a Figura 15). Ao usar tais 2/3-l9Gs com depleção de bissulfeto como moléculas de partida no método de acordo com a invenção a redução das moléculas de partida e a remoção de agentes redutores, após a reação de troca pode ser omitida. Desse modo, é fornecido um procedimento aprimorado para gerar bsAbs (menos etapas de processamento e menos subprodutos). Os bsAb produzidos a partir destes 2/3-lgG com depleção de bissulfeto são funcionais e estáveis, mantidos juntos por interações Fc-Fc não covalentes sem ligações de bissulfeto intercadeias (vide as Figuras 16 e 17).

[182] Assim, a remoção das ligações de bissulfeto Fc-Fc/região de dobradiça elimina a necessidade da etapa de redução para iniciar a reação de troca. Os bsAbs resultantes são moléculas biespecíficas funcionais, mantidas juntas por interações Fc-Fc não covalentes sem ligações de bissulfeto intercadeia da região Fc. A eliminação de bissulfetos intercadeias Fc- Fc, portanto, permite reações de troca acionadas por região Fc não pareadas correspondentes sem a necessidade de redução e reoxidação, ou seja, em condições fisiológicas. Isso facilita os procedimentos de preparação e triagem (em alto rendimento).

[183] Em um exemplo de realização, a região de dobradiça é livre de ligação de bissulfeto. A região de dobradiça livre de ligação de bissulfeto compreende resíduos de serina no lugar dos resíduos de cisteína na sequência de SEQ ID NO: 32. A reação é eficiente com ou sem ligações de bissulfeto na região de dobradiça (vide a Figura 24, ELISA de acordo com o exemplo 3 ou 12)

[184] Além da remoção das ligações de bissulfeto, a região de dobradiça pode ser encurtada. Ao utilizar essas regiões de dobradiça modificadas, podem ser obtidos anticorpos biespecíficos que proporcionam diferentes distâncias entre os sítios de ligação individuais (consulte a Figura 25). Assim, em um exemplo de realização, a região de dobradiça tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (HTCPXCP, X = S ou P) ou SEQ ID NO: 85 (HTSPXSP, X = S ou P) ou SEQ ID NO: 86 (HTPAPE; CPXC da SEQ ID NO: 31 foi excluído).

[185] Consulte os Exemplos 10, 11, 18 e 19.

[186] Verificou-se que a concentração de montagem dos 2/3- lgGs influencia a eficiência da reação de troca de cadeia e, portanto, a quantidade de anticorpo biespecífico que é formado. Em um exemplo de realização para garantir uma reação eficiente de troca em cadeia, a concentração dos 2/3-lgGs é pelo menos 0,1 uM, ou seja, 0,1 uM ou mais (até 1 M), em um exemplo de realização preferido de 1 UM ou mais.

[187] Consulte o Exemplo 20 e Figura 30.

[188] Em um exemplo de realização preferido, os multímeros de partida são misturados em uma concentração equimolar.

D) VARIANTES DE REGIÃO FC

[189] Em certos exemplos de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais podem ser introduzidas na região Fc de 2/3-lgGs fornecidos na presente invenção, gerando assim um variante da região Fc. A região Fc variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc da IgG1, IgG2, IgG3 ou IgGa humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.

[190] Em determinados exemplos de realização, a invenção contempla 2/3-lgGs variantes que possuem algumas, mas não todas, das funções efetoras, que o torna um candidato desejável para muitas aplicações no qual a meia vida do anticorpo in vivo é importante, ainda que certas funções efetoras (ta como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou prejudiciais. Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução / depleção das atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação com o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que os 2/3-lgGs não tenham ligação ao FcyR (e portanto careçam de atividade ADCC), mas mantenham a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, as células NK, expressam unicamente FcyRIll, enquanto monócitos expressam FeyRI, FeyRIl e FecyRIll. A expressão FCR em células hematopoiéticas está resumida na tabela 3, página 464 de Ravetch, J. V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse estão descritos na Patente US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, |., et al. Proc. Nat Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063) e Hellstrom, | et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499- 1502; US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaio não radioativos (vide, por exemplo, ACTITY ensaio de citotoxicidade não radioativo por citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, e CyTotox 96º ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-

656. Também podem ser realizados ensaios de ligação ao componente C1q para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar ao C1ig e, portanto, não possui atividade CDC (vide, por exemplo, ELISA para ligação ao C1q e C3c no documento WO 2006/029879 e WO 2005/100402). Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, M.S. e Glennie M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743) A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

[191] Os 2/3-lgGs compreendendo regiõês Fc com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos da região Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (US

6.737.056). Tais mutantes da região Fc incluem regiões Fc com substituições em dois ou mais aminoácidos nas posições 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a denominada região Fc mutante “DANA” com a substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).

[192] Determinados 2/3-lgGs que compreendem regiões Fc variantes, tais Fc variantes que possuem ligação melhorada ou diminuída ao FcR estão descritas (vide, por exemplo, US 6.737.056, WO 2004/056312, e Shields, R-L., et al, J. Biol..Chem. 276 (2001) 6591-6604).

[193] Em determinadas realizações, os 2/3-l9G compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ainda mais a função ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

[194] Em alguns exemplos de realização, as alterações são feitas na região Fc, que resultam na alteração da ligação ao C1q (isto é, melhorada ou diminuída) e/ou da Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente US 6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie, E.E., et al. J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

[195] Anticorpos com a meia-vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer, R-L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 e Kim, J. K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos na US 2005/0014934. Tais anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições de um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, a substituição do resíduo 434 da região Fc (Patente US 7.371.826).

[196] Vide também Duncan, A.R., e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5.624.821; e WO 94/29351 relativos a outros exemplos de variantes da região FC.

[197] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, os 2/3-19G compreendem (todas as posições de acordo com o índice EU de Kabat). i) uma região Fc da subclasse IgG: humana com as mutações P329G, L234A e L235A em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou ii), uma região Fc da subclasse IgG. humana com as mutações P329G, S228P e L235E em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou iii) uma região Fc da subclasse IgG: humana com as mutações P329G, L234A, L235A, 1253A, H310A, e H435A em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou com as mutações P329G, L234A, L235A, H310A, H433A, e Y436A em ambos os polipeptídeos da região Fc, ou iv) uma região Fc heterodimérica da subclasse de IgG: humana, em que ambos os polipeptídeos da região Fc compreendem as mutações P329G, L234A e L235A e a) um polipeptídeo da região Fc compreende a mutação T366W e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A e Y407V, ou b) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e Y349C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e S354C, ou c) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e S354C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C, ou v) uma região Fc heterodimérica da subclasse de IgG« humana, em que ambos os polipeptídeos da região Fc compreendem as mutações P329G, S228P e L235E; e a) um polipeptídeo da região Fc compreende a mutação T366W e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A e Y407V, ou b) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366W e Y349C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e S354C, ou c) um polipeptídeo da região Fc compreende as mutações

T366W e S354C e o outro polipeptídeo da região Fc compreende as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C, ou vi) uma combinação de um dentre i), ii) e ili) com um dentre vi) e v).

[198] Em um exemplo de realização de todos os aspectos conforme divulgado na presente invenção, 2/3-lgGs compreendendo um domínio CH3, compreende um dipeptídeo C-terminal glicina-lisina adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização de todos os aspectos conforme divulgado na presente invenção, 2/3-I9Gs compreendendo um domínio CH3, compreende um resíduo de glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[199] Os 2/3 de IgG, conforme divulgado na presente invenção, compreendem em um exemplo de realização uma região Fc caracterizada por ser da subclasse IgG: humana com mutações PVA236, L234A/L235A e/ou GLPSS331 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) ou da subclasse IgG1. Em um exemplo de realização adicional, os 2/3-lIgGs são caracterizados por compreenderem uma região Fc de qualquer classe de IgG, em um exemplo de realização da subclasse IgG: ou IgG4, contendo pelo menos uma mutação E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 e/ou P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, os 2/3-lgGs compreendem uma região Fc da subclasse Ig9G4 humana que contém a mutação S228P, ou as mutações S228P e L235E (Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108) (numeração de acordo com o Índice EU de Kabat).

[200] A porção C-terminal! dos polipeptíideos de fusão compreendidos nos 2/3-lgGs, tal como divulgado na presente invenção, pode ser uma porção C-terminal completa terminando com os resíduos de aminoácidos PGK. O C-terminal pode ser um C-terminal encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido C-terminais foram removidos. Em um exemplo de realização preferido, o C-terminal é um C-terminal encurtado que termina com os resíduos de aminoácidos PG. E) HETERODIMERIZAÇÃO

[201] Várias abordagens para modificações de CH3 para realizar a heterodimerização foram descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291 que estão incluídas no presente por referência.

[202] Tipicamente, nas abordagens conhecidas na técnica, o domínio CH3 da primeira cadeia pesada e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada são ambos modificados/manipulados de maneira complementar de modo que a cadeia pesada compreendendo um domínio CH3 modificado não possa mais homodimerizar com outra cadeia pesada de mesma estrutura (por exemplo, uma primeira cadeia pesada com CH3 modificado não pode mais homodimerizar com outra primeira cadeia pesada com CH3 modificado; e uma segunda cadeia pesada com CH3 modificado não pode mais homodimerizar com outra segunda cadeia pesada com CH3 modificado). Desse modo, a cadeia pesada compreendendo um domínio CH3 modificado heterodimeriza com outra cadeia pesada compreendendo o domínio CH3, que é modificado/manipulado de uma maneira complementar. Para este exemplo de realização da invenção, o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo de cadeia pesada de região Fc e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo de cadeia pesada de região Fc são modificados/manipulados de uma maneira complementar por substituições de aminoácidos, de tal modo que o primeiro polipeptídeo de cadeia pesada de região Fc e o segundo polipeptídeo de cadeia pesada de região Fc heterodimerizam, enquanto o primeiro polipeptídeo de cadeia pesada de região Fc e o segundo polipeptídeo de cadeia pesada de região Fc não podem mais homodimerizar (por exemplo, por razões estéricas).

[203] As diferentes abordagens para suportar a heterodimerização de cadeia pesada conhecidas no estado da técnica, que foram citadas e incluídas acima, são contempladas como diferentes alternativas usadas no fornecimento dos polipeptídeos heterodiméricos/multiméricos (por exemplo, 2/3-lgGs), como divulgado na presente invenção.

[204] Os domínios CH3 dos 2/3-lgGs conforme divulgados na presente invenção, podem ser alterados pela tecnologia “knob-into-holes” que está descrita em detalhes com alguns exemplos, por exemplo, no documento WO 96/027011 e Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, e Merchant, A.M,., et al, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. Neste método, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização de ambos os polipeptídeo de cadeias pesadas de região Fc contendo esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (dos dois polipeptídeos de cadeia pesada de região Fc) pode ser “knob” (protuberância), enquanto o outro é “hole” (cavidade). Uma ligação de bissulfeto pode ser adicionalmente introduzida para estabilizar adicionalmente os heterodímeros (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e aumenta o rendimento na reação de troca de acordo com a presente invenção.

[205] Em um exemplo de realização preferido, os 2/3-lgGs, tal como divulgado no presente, compreende uma mutação T366W no domínio CH3 da “cadeia knob" e mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da “cadeia hole" (numeração de acordo para o índice EU de Kabat). Uma ligação de bissulfeto intercadeia adicional entre os domínios CH3 também podem ser utilizada (Merchant, A.M., et al, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por exemplo através da introdução de uma mutação Y349C em um dos domínios CH3 de cadeia knob e uma mutação E356C ou mutação S354C em um dos domínios CH3 de cadeia hole (na reação de troca de acordo com a presente invenção dois multímeros são usados como materiais de partida e em apenas um dos domínios CH3 dos referidos multímeros compreende os resíduo de cisteína adicionais, de modo que somente no produto trocado é formada a ligação de bissulfeto adicional). Assim, em outro exemplo de realização preferido, os 2/3-lgGs, conforme divulgado no presente pedido, compreendem as mutações Y349C e T366W em um dos domínios CH3 do primeiro multímero e as mutações E356C, T366S, L368A e Y407V no respectivo domínio CH3 complementar do segundo multímero; ou os 2/3-lgGs, conforme divulgado no presente pedido, compreendem as mutações Y349C e T366W em um dos domínios CH3 do primeiro multímero e as mutações S354C, T366S, L368A e Y407V no respectivo domínio CH3 complementar do segundo multímero (a mutação Y349C adicional em um domínio CH3 e a mutação E3S56C ou S354C adicional no domínio CH3 correspondente, formando uma ligação de bissulfeto intercadeia) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[206] Mas também outras tecnologias do tipo “knobs-in-holes”, como a descrito na EP 1.870.459 A1, podem ser alternativamente ou adicionalmente utilizadas. Em um exemplo de realização, os 2/3-lgGs divulgados no presente pedido, compreendem as mutações R409D e K370E no domínio CH3 da “cadeia knob" e as mutações D399K e E357K no domínio CH3 da “cadeia hole" (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[207] Em um exemplo de realização, os 2/3-lgGs, conforme divulgado no presente pedido, compreendem uma mutação T366W no domínio CH3 da “cadeia knob" e as mutações T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 da “cadeia hole" e adicionalmente as mutações R409D e K370E no domínio CH3 da “cadeia knob" e as mutações D399K e E357K no domínio CH3 da “cadeia hole” (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[208] Em um exemplo de realização, os 2/3-lgGs, conforme divulgado no presente pedido, compreendem as mutações Y349C e T366W em um dos domínios CH3 e as mutações S354C, T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 complementar, ou os 2/3-lgGs conforme divulgado no presente pedido, compreendem as mutações Y349C e T366W em um dos domínios CH3 e as mutações S354C, T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 complementar e, adicionalmente, as mutações R409D e K370E no domínio CH3 da “cadeia knob"” e as mutações D399K e E357K no domínio CH3 da “cadeia hole” (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[209] Além da tecnologia “knob-into-hole”, outras técnicas para modificar os domínios CH3 das cadeias pesadas de 2/3-lgG para forçar a heterodimerização são conhecidas no estado da técnica. Estas tecnologias, especialmente as descritas nos documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545 , WO 2012/058768, WO 2013/157954 e WO 2013/096291 são contempladas na presente invenção como alternativas à tecnologia “knob-into-hole" em combinação com os 2/3-Il9G produzidos pelo método aqui divulgado.

[210] Em um exemplo de realização de 2/3-I9G descritos na presente invenção, a abordagem descrita na EP 1870459 A1 é utilizada para suportar a heterodimerização da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada do 2/3-lgG. Esta abordagem se baseia na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos na interface domínio-CH3/CH3 entre as cadeias, a primeira e a segunda cadeia pesada.

[211] Consequentemente, este exemplo de realização refere-se a 2/3-I9G divulgados no presente pedido, em que na estrutura terciária do multímero o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo da cadeia pesada de região Fc e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo da cadeia pesada de região Fc formam uma interface que está localizada entre os respectivos domínios CH3,em que cada uma das respectivas sequências de aminoácidos do domínio CH3 do primeiro polipeptídeo da cadeia pesada de região Fc e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo da cadeia pesada de região Fc compreendem um conjunto de aminoácidos que está localizado dentro da referida interface na estrutura terciária dos 2/3-I9G, em que a partir do conjunto de aminoácidos que está localizado na interface no domínio CH3 de um polipeptídeo de cadeia pesada da região Fc, um primeiro aminoácido é substituído por um aminoácido carregado positivamente e a partir do conjunto de aminoácidos que está localizado na interface do domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada de região Fc, um segundo aminoácido é substituído por um aminoácido negativamente carregado. Os 2/3-lIgGs de acordo com este exemplo de realização também são referidos no presente pedido como “2/3-lgGs modificado CH3(+/-)' (em que a abreviação “+/-" representa os aminoácidos carregados de maneira oposta que foram introduzidos nos respectivos domínios CH3).

[212] Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-lgGs com modificação CH3(+/-), conforme divulgado na presente invenção, o aminoácido carregado positivamente é selecionado dentre K, R e H, e o aminoácido carregado negativamente é selecionado dentre E ou D.

[213] Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-IgGs com modificação CH3(+/-), conforme divulgado na presente invenção, o aminoácido carregado positivamente é selecionado dentre K e R, e o aminoácido carregado negativamente é selecionado dentre E ou D.

[214] Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-IgGs com modificação CH3(+/-), conforme divulgado na presente invenção, o aminoácido carregado positivamente é K, e o aminoácido carregado negativamente é E.

[215] Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-lgGs com modificação CH3(+/-) aqui divulgados, no domínio CH3 de uma cadeia pesada, o aminoácido R na posição 409 é substituído por D e o aminoácido K na posição 370 é substituído por E, e no domínio CH3 da outra cadeia pesada, o aminoácido D na posição 399 é substituído por K e o aminoácido E na posição 357 é substituído por K (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[216] Em um exemplo de realização de 2/3-I9G descritos na presente invenção, a abordagem descrita no documento WO 2013/157953 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc e do segundo polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc dos 2/3-l9G. Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-Ig9G, conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por K e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido L na posição 351 é substituído por D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização dos referidos 2/3-I9G, conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por Ke o aminoácido L na posição 351 é substituído por K, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido L na posição 351 é substituído por D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[217] Em outro exemplo de realização dos referidos 2/3-lgG, conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por K e o aminoácido L na posição 351 é substituído por K, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido L na posição 351 é substituído por D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Além disso, pelo menos uma das seguintes substituições está compreendida no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc: o aminoácido Y na posição 349 é substituído por E, o aminoácido Y na posição 349 é substituído por D e o aminoácido L na posição 368 é substituído por E (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, o aminoácido L na posição 368 é substituído por E (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[218] Em um exemplo de realização dos 2/3-lI9G descritos na presente invenção, a abordagem descrita no documento WO 2012/058768 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc dos 2/3-I9G. Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-lgG, conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido L na posição 351 é substituído por Y e o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por A e o aminoácido K na posição 409 é substituído por F (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização, além das substituições mencionadas acima, no domínio CH3 do outro polipeptídeo da região Fc da cadeia pesada, pelo menos um dos aminoácidos nas posições 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) e 392 (originalmente K) são substituídos (numeração de acordo com o índice EU de Kabat EU). As substituições preferidas são: - — substituição do aminoácido T na posição 411 por um aminoácido selecionado a partir de N R Q, K D/E e W (numeração de acordo com o índice EU de Kabat),

- —substituição do aminoácido D na posição 399 por um aminoácido selecionado a partir de R, W, Y, e K (numeração de acordo com o índice EU de Kabat), - —substituição do aminoácido S na posição 400 por um aminoácido selecionado a partir de E, D, R e K (numeração de acordo com o índice EU de Kabat), - —substituição do aminoácido F na posição 405 por um aminoácido selecionado a partir de || M T, S, Ve W (numeração de acordo com o índice EU de Kabat; - —substituição do aminoácido N na posição 390 por um aminoácido selecionado a partir de R, Ke D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat; e - —substituição do aminoácido K na posição 392 por um aminoácido selecionado a partir de V, MÓ, R L FeE (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[219] Em outro exemplo de realização dos referidos 2/3-lIgG, conforme divulgado no presente (manipulado de acordo com o documento WO 2012/058768), no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido L na posição 351 é substituído por Y e o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por V e o aminoácido K na posição 409 é substituído por F (numeração de acordo com o Índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização dos referidos 2/3- IgG, conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A, e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por A e o aminoácido K na posição 409 é substituído por F (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). No último exemplo de realização mencionado acima, no domínio CH3 do referido outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido K na posição 392 é substituído por E, o aminoácido T na posição 411 é substituído por E, o aminoácido D na posição 399 é substituído por R e o aminoácido S na posição 400 é substituído por R (numeração de acordo com o índice Kabat EU).

[220] Em um exemplo de realização dos 2/3-lgG descritos na presente invenção, a abordagem descrita no documento WO 2011/143545 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc dos 2/3-I9G. Em um exemplo de realização do referido 2/3-lgG, conforme divulgado na presente invenção, as modificações de aminoácidos nos domínios CH3 de ambos os polipeptídeos da cadeia pesada da região Fc são introduzidas nas posições 368 e/ou 409 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[221] Em um exemplo de realização dos 2/3-lg9G descritos na presente invenção, a abordagem descrita no documento WO 2011/090762 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc dos 2/3-I9G. O documento WO 2011/090762 refere-se a modificações de aminoácidos de acordo com a tecnologia “knob-into-hole”. Em um exemplo de realização dos referidos 2/3- IgG com modificações CH3(KiH), conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por W e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido Y na posição 407 é substituído por A (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização dos referidos 2/3-l9G com modificações CH3(KiH), conforme divulgado no presente, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido T na posição 366 é substituído por Y e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido Y na posição 407 é substituído por T (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[222] Em um exemplo de realização de 2/3-lI9G descritos na presente invenção, que é do isotio IgG2, a abordagem descrita no documento WO 2011/090762 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc e do segundo polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc dos 2/3-lgG.

[223] Em um exemplo de realização dos 2/3-lI9G descritos na presente invenção, a abordagem descrita no documento WO 2007/147901 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo da região Fc e do segundo polipeptídeo da região Fc dos 2/3-lgGs. Em um exemplo de realização dos referidos 2/3-I9Gs aqui divulgados, no domínio CH3 de um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc, o aminoácido K na posição 253 é substituído por E, o aminoácido D na posição 282 é substituído por Ke o aminoácido K na posição 322 é substituído por D e no domínio CH3 do outro polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc o aminoácido D na posição 239 é substituído por K, o aminoácido E na posição 240 é substituído por Ke o aminoácido K na posição 292 é substituído por D (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[224] Em um exemplo de realização dos 2/3-lIg9G descritos na presente invenção, a abordagem descrita no documento WO 2007/110205 é utilizada para suportar a heterodimerização do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo dos 2/3-lgGs.

[225] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, conforme divulgado na presente invenção, os 2/3-lgGs possuem uma estrutura de domínio constante de um anticorpo do tipo IgG. Em outro exemplo de realização de todos os aspectos, conforme divulgado na presente invenção, os 2/3-lgGs são caracterizados por compreenderem uma região Fc da subclasse

IgG: humana ou da subclasse IgG: humana com as mutações L234A, L235A e opcionalmente P329G. Em um exemplo de realização adicional de todos os aspectos aqui divulgados, os 2/3-lgGs são caracterizados pelo fato de que os referidos 2/3-l9G compreendem uma região Fc da subclasse IgG2 humana. Em um exemplo de realização adicional de todos os aspectos aqui divulgados, os 2/3-lgGs são caracterizados pelo fato de que os referidos 2/3-I9G compreendem uma região Fc da subclasse IgG3 humana. Em outro exemplo de realização de todos os aspectos, conforme divulgado na presente invenção, os 2/3-lg9Gs são caracterizados por compreenderem uma região Fc da subclasse IgG4 humana ou da subclasse IgG« humana com as mutações adicionais S228P e L235E e opcionalmente P329G.

[226] Em um exemplo de realização de todos os aspectos, os 2/3-l9Gs compreendem um primeiro polipeptídeo da região Fc e um segundo polipeptídeo da região Fc; em que ii) o primeiro e o segundo polipeptíideco de região Fc compreendem a mutação Y436A, ou ii) o primeiro e o segundo polipeptíideo de região Fc compreendem as mutações 1253A, H310A e H435A, ou ii) o primeiro e o segundo polipeptídeco de região Fc compreendem as mutações H310A, H433A e Y436A, ou iv) o primeiro e o segundo polipeptídeco de região Fc compreendem as mutações L251D, L314D e L432D, ou v) o primeiro polipeptídeo de região Fc compreende a mutação Y436A e o segundo polipeptídeo de região Fc compreende; a) as mutações 1253A, H310A e H435A, ou b) as mutações H310A, H433A e Y436A, ou c) as mutações L251D, L314D e L432D, ou vi) o primeiro polipeptideo de região Fc compreende as mutações |1253A, H310A e H435A e o segundo polipeptídeo de região Fc compreende; a) as mutações H310A, H433A e Y436A, ou b) as mutações L251D, L314D e L432D, ou vi) o primeiro polipeptideo de região Fc compreende as mutações H310A, H433A e Y436A e o segundo polipeptídeo de região Fc compreende; a) as mutações L251D, L314D e L432D. Il. CONJUNTOS EXEMPLARES DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO: 1º CONJUNTO EXEMPLAR DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO:

[227] 1. Um método para produzir um polipeptídeo multimérico, compreendendo as seguintes etapas de - incubação de; um primeiro polipeptídeo multimérico compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que |) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma primeira mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na primeira mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero, e; um segundo polipeptídeo multimérico compreendendo um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptíideo — compreender mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, em que o quarto polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, em que o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma segunda mutação perturbadora, em que o quarto polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na segunda mutação perturbadora, em que a segunda mutação perturbadora está em uma posição diferente da primeira mutação perturbadora, em que o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são um dímero, em que a primeira mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a segunda mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do ligante compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o ligante (multiespecífico).

[228] 2. O método, de acordo com o exemplo de realização 1, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem, cada um, na direção N-terminal para C-terminal, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG'.

[229] 3. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 2, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem na direção N-terminal para C-terminal; i) ndependentemente um do outro, a sequência de aminoácidos DKTHTCPPC

(SEQ ID NO: 65) ou a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), ii) um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG e iii) um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG1.

[230] 4. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, caracterizado i) pelos polipeptídeos primeiro e quarto compreenderem ainda um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG: e um domínio variável, ou ii) caracterizado pelo primeiro ou o quarto polipeptídeo compreender um domínio CH1 derivado de um domínio CH1 de IgG e o outro polipeptídeo compreender um domínio derivado de um domínio constante de cadeia leve, e cada polipeptídeo compreende ainda um domínio variável.

[231] 5. O método de acordo com o exemplo de realização 4, caracterizado pelo domínio variável do primeiro polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável do quarto polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia leve ou vice-versa; e esses domínios formam um sítio de ligação quando o primeiro e o quarto polipeptídeo formam um dímero.

[232] 6. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 4, caracterizado pelo primeiro e o quarto polipeptídeo serem independentemente selecionados a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção N-terminal para a C-terminal; i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de IgG: humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um scFv, opcionalmente um ligante peptídico, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

v) um scFab, opcionalmente um ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

vi) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

ix) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

x) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

xi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG' humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

xii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

xiii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio

CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

xiv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana,

xv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xvi) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo.

[233] 7. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, caracterizado pelo primeiro e segundo ligantes compreenderem ainda uma cadeia leve de anticorpo.

[234] 8. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 7, caracterizado por o primeiro ligante compreender como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, li) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de IgG: humana, iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG1 humana e um domínio variável de cadeia pesada, iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG' humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, compreendendo a mutação knob ou mutações hole, e; como segundo polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, compreendendo a mutação knob, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E3S57F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASGBL, V407Y, C354S, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.

em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero,

e; um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve,

em que o terceiro polipeptídeo está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, e;

o segundo ligante compreende como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob,

compreendendo uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E3S57F, E357K, K360S, K360E, 0362E, S364V, S364L, T366], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A3S68L, V407Y, C354S e W366T, em que o quinto polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido de IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posições(s) de aminoácidos que interagem em uma IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,

e;

ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG1 humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

li) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de IgG: humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG1 humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de I1gG' humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio

CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

compreendendo a mutação knob, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o quarto polipeptídeo compreender a mutação knob, em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo são um dímero, e; um sexto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

[235] 9. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, caracterizado pela etapa de incubação ocorrer na presença de um agente redutor.

[236] 10. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, caracterizado; i) pelo segundo polipeptídeo e terceiro polipeptídeo, ou ii) pelo segundo polipeptídeo e quinto polipeptídeo compreenderem ainda um marcador (tag) (C-terminal).

[237] 11. O método, de acordo com o exemplo de realização 10, caracterizado pelo marcador ter a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) e a recuperação ser realizada por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal (níquel).

[238] 12. Um método para identificar uma combinação de ligantes, caracterizado por compreender as etapas de; - produzir uma multitide de ligantes submetendo cada combinação de um primeiro ligante selecionado a partir de uma primeira multitude de ligantes e um segundo ligante selecionado a partir de uma segunda multitude de ligantes de acordo com o método qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 11,

- —- medir individualmente a ligação simultânea de cada ligante da multitude de ligantes produzida a pelo menos dois antígenos em um ensaio ELISA, e - —selecionar um ligante a partir da multitude de ligantes com base no resultado do ELISA e, assim, identificar uma combinação de ligantes.

[239] 13. Um polipeptídeo multimérico, caracterizado por compreender um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo; em que ambos os polipeptídeos compreendem um domínio CH3 de imunoglobulina humana, em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, em que o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 pelo menos uma mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são um dímero.

[240] 14. O polipeptíideo multimérico, de acordo com o exemplo de realização 13, caracterizado;

pelo primeiro polipeptídeo ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

ii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de IgG: humana,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio

CH1 de IgG: humana,

e compreender a mutação knob ou as mutações tipo hole,

e;

pelo segundo polipeptídeo ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção

N- para C-terminal; uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana compreendendo a mutação knob ou as mutações hole, compreendendo uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, QO347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E3S57F, E3SS57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, YA407I, K409D, K409E, K409l, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina IgG: tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora.

e; um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

[241] 15. — Uma composição, compreendendo: um primeiro polipeptídeo heterotrimérico que compreende; como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

ii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de IgG: humana,

iii), uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG humana e um domínio variável de cadeia pesada,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID

NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana,

compreendendo a mutação knob ou mutações hole,

e;

uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

compreendendo a mutação knob, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, YA407I|, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG8L, V407Y, C354S, e W366T, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina IgG: tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina IgG1 tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora. e; como terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, e; um segundo polipeptídeo heterotrimérico que compreende; como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo do primeiro heterotrímero compreender a mutação knob,

compreendendo uma segunda mutação perturbadora selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, O362E, S364V, S364L, T366], L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, YA407L, Y407|, K409D, K409E, K409]|, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A3S68L, V407Y, C354S e W3661T, em que o quinto polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina IgG: tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,

e;

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de

IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG' humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

compreendendo a mutação knob, se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro (quarto) polipeptídeo compreender a mutação knob,

e;

como sexto polipeptídeo, um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

em que i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio

CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, em que o segundo e o quarto polipeptídeo não compreendem mutações perturbadoras na mesma posição. 2º CONJUNTO EXEMPLAR DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO:

[242] 1. Um método para produzir um um polipeptídeo multimérico, compreendendo as seguintes etapas de - incubação de um primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações Aknob-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole- Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, b-1) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, c-1) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma primeira mutação perturbadora diferente das mutações sob a- 1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s)

posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na primeira mutação perturbadora,

d-1) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

e;

um segundo polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-2) i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole-Cys, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações knob- Cys, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole-Cys, o quarto polipeptídeo compreende as mutações knob-Cys, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-Cys, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole-Cys,

c-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma segunda mutação perturbadora diferente das mutações sob a- 2) em que o quarto polipeptideo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na segunda mutação perturbadora, d-2) a segunda mutação perturbadora está em uma posição diferente daquela da primeira mutação perturbadora, e-2) o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um dímero, f-2) em que a primeira mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a segunda mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam (são desenvolvidas para resultarem) em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do polipeptídeo multimérico compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o polipeptídeo multimérico.

com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[243] 2. O método de acordo com o exemplo de realização 1, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação E357K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, a segunda mutação perturbadora ser a mutação K370E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

[244] 3. O método de acordo com o exemplo de realização 1, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação D356K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, a segunda mutação perturbadora ser a mutação K439E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

[245] 4. Um método para produzir um polipeptídeo multimérico, compreendendo as seguintes etapas de - incubação de um primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) ) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

c-1) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma primeira mutação perturbadora diferente das mutações sob a- 1) em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na primeira mutação perturbadora,

d-1) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

e-1) o primeiro polipeptídeo compreende na região dobradiça a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos da IgG: tipo selvagem HTCPPCP (SEQ ID NO: 31),

e;

um segundo polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-2) i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo compreender mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o quarto polipeptideo compreende as mutações hole,

c-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma segunda mutação perturbadora diferente das mutações sob a- 2) em que o quarto polipeptíideco compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na segunda mutação perturbadora,

d-2) a segunda mutação perturbadora está em uma posição diferente daquela da primeira mutação perturbadora,

e-2) o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um dímero,

f-2) em que a primeira mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a segunda mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, g-2) o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos da região de dobradiça da IgG tipo selvagem HTCPPCP (SEQ ID NO: 31) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência da região de dobradiça da IgG: HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90), e; - recuperação do polipeptídeo multimérico compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o polipeptídeo multimérico, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[246] 5. O método de acordo com o exemplo de realização 4, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação E357K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, a segunda mutação perturbadora ser a mutação K370E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

[247] 6. O método de acordo com o exemplo de realização 4, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação D356K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, a segunda mutação perturbadora ser a mutação K439E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

[248] 7. Um método para produzir um polipeptídeo multimérico, compreendendo as seguintes etapas de - incubação de um primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) ) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, b-1) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, c-1) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação E357K como primeira mutação perturbadora e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 370 o resíduo de aminoácido K, d-1) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, e; um segundo polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-2) i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo compreender mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o quarto polipeptideo compreende as mutações hole,

b-2) o quarto polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, c-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação E370K como segunda mutação perturbadora e o quarto polipeptídeo compreende na posição 357 o resíduo de aminoácido E, d-2) o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um dímero, f.2) em que a primeira mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a segunda mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do polipeptídeo multimérico compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o polipeptídeo multimérico, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[249] 8. Um método para produzir um polipeptídeo multimérico, compreendendo as seguintes etapas de - incubação de um primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

c-1) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação D356K como primeira mutação perturbadora e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 439 o resíduo de aminoácido K,

d-1) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

e;

um segundo polipeptídeo de partida multimérico compreendendo um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-2) i) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, de modo que i) no caso do primeiro polipeptídeo compreender mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende a mutação knob, ou ii) no caso do primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole,

c-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação K439E como segunda mutação perturbadora e o quarto polipeptídeo compreende na posição 356 o resíduo de aminoácido D, d-2) o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um dímero, e-2) em que a primeira mutação perturbadora no segundo polipeptídeo e a segunda mutação perturbadora no terceiro polipeptídeo resultam em uma interação atraente quando o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo formam um heterodímero, e; - recuperação do polipeptídeo multimérico compreendendo o primeiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo e, desse modo, produzindo o polipeptídeo multimérico, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[250] 9. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 4 a 8, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, o terceiro polipeptídeo compreender a mutação knob e o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole.

[251] 10. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 4 a 8, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-Cys, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, o terceiro polipeptíideo compreender a mutação knob e o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole-Cys.

[252] 11. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem, cada um, na direção N- terminal para a C-terminal um domínio CH2 de IgG: e um domínio CH3 de

19671.

[253] 12. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3 e de 7 a 11, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem, cada um, na direção N- terminal para C-terminal; i) independentemente um do outro, a sequência de aminoácidos DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65) ou a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) ou a sequência de aminoácidos DKTHT (SEQ ID NO: 91), ii) um domínio CH2 de IgG1 e iii) um domínio CH3 de 1gG1.

[254] 13. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, caracterizado i) pelos polipeptídeos primeiro e quarto compreenderem ainda um domínio CH1 de IgG: e um domínio variável, ou ii) caracterizado pelo primeiro ou o quarto polipeptídeo compreender um domínio CH1 de IgG: e o outro polipeptídeo compreender um domínio constante de cadeia leve, e cada polipeptídeo compreender ainda um domínio variável.

[255] 14. O método de acordo com o exemplo de realização 13, caracterizado pelo domínio variável do primeiro polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável do quarto polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia leve ou vice-versa; e esses domínios formam um sítio de ligação quando o primeiro e o quarto polipeptídeo formam um dímero.

[256] 15. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 14, caracterizado pelo primeiro e o quarto polipeptídeo serem independentemente selecionados a partir de; A) o grupo de polipeptídeo compreendendo na direção N- terminal para C-terminal; i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio

CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

il) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 de IgG: humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um scFv, opcionalmente um ligante peptídico, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana,

v) um scFab, opcionalmente um ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana,

vi) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

vili)um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de I9G1: humana,

ix) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

x) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

xi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

xii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

xiii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG humana,

xiv)um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana,

xv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xvi) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

ou B) o grupo de polipeptídeo compreendendo na direção N- terminal para C-terminal;

i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

li), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de IgG1 humana,

iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um scFv, opcionalmente um ligante peptídico, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana,

v) um scFab, opcionalmente um ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG, humana,

vi) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

x) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de I1gG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

xi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou

66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

xiii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

xivjum primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana,

xv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de

SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xvi) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo.

[257] 16. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 15, caracterizado pelo primeiro e o segundo polipeptídeo de partida multimérico compreender ainda uma cadeia leve de anticorpo.

[258] 17. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 16, caracterizado pelo A) primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreender; como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana,

il) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG: humana,

iii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG; humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG'1 humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de

SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de I1gG1 humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

compreendendo a mutação knob ou mutações hole,

e;

uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de I1gG1 humana,

compreendendo a mutação perturbadora D356K, E357K, K370E ou K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende —“o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, e; um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, e; o segundo polipeptídeo de partida multimérico compreende; como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C- terminal; uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de I1gG1 humana, compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma segunda mutação perturbadora D356S, E357S, K370E ou K439E, em que o quinto polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos da imunoglobulina (I9gG:) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma IgG1 tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,

e;

i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de I1gG1 humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de 19G1 humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo formam um dímero, e;

um sexto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve,

em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

ou

B) primeiro polipeptídeo de partida multimérico compreende;

ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana,

il) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de I1gG1 humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG' humana,

iii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de I9G: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

vi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, e um scFv,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

vili)um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, compreendendo a mutação knob ou mutações hole, e;

uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana,

compreendendo a mutação perturbadora D356K, E357K, K370E ou K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(õdes) de aminoácidos que interagem na imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

e;

o segundo polipeptídeo de partida multimérico compreende;

como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C- terminal;

compreendendo uma segunda mutação perturbadora D356S, E357S, K370E ou K439E, em que o quinto polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos da imunoglobulina (I9G:) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo,

e;

i) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana,

ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG humana,

iii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de I1gG1 humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de I9G: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de

IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, compreendendo a mutação knob, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o quarto polipeptídeo compreender a mutação knob, em que o quarto polipeptídeo e o quinto polipeptídeo formam um dímero, e; um sexto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

[259] 18. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, caracterizado pela etapa de incubação ocorrer na presença de um agente redutor.

[260] 19. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 18, caracterizado; i) pelo segundo polipeptídeo e terceiro polipeptídeo, ou ii) pelo segundo polipeptídeo e quinto polipeptídeo compreenderem ainda um marcador (tag) (C-terminal).

[261] 20. O método de acordo com o exemplo de realização 19, caracterizado i) pelo marcador (tag) ter a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) e a recuperação ser realizada por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal (níquel).

ou ii) pelo marcador ter a sequência de aminoácido EPEA (SEQ ID NO: 87) e a recuperação ser realizada por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade C-tag.

[262] 21. Um método para identificar uma combinação de polipeptídeos multiméricos, caracterizado por compreender as etapas de; a) produzir uma multitide de polipeptídeos multiméricos submetendo cada combinação de um primeiro polipeptídeo multimérico de partida selecionado a partir de uma primeira multitude de polipeptídeos multiméricos e um segundo polipeptídeo multimérico de partida selecionado a partir de uma segunda multitude de polipeptídeos multiméricos de acordo com o método de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, b) medir individualmente a ligação simultânea de cada polipeptídeo multimérico da multiplicidade de polipeptídeos multiméricos produzidos na etapa a) a pelo menos dois antígenos em um ensaio de ligação, e c) c) selecionar um polipeptídeo multimérico a partir da multitude de polipeptídeos multiméricos com base no resultado da ligação e, desse modo, identificar uma combinação de polipeptídeo multimérico.

[263] 22. O método de acordo com o exemplo de realização 21, caracterizado pelo ensaio de ligação ser um método de ELISA ou SPR.

[264] 23. Um polipeptídeo multimérico compreendendo a mutação knob a) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, a-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação perturbadora diferente das mutações sob a-1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, a4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, ou b) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que b-1) i) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações knob e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole-cys, ou ii) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole- e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-cys, b-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, b-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação perturbadora que é diferente das mutações sob b- 1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, b-4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[265] 24. O polipeptídeo multimérico de acordo com o exemplo de realização 23, caracterizado pela mutação perturbadora ser a mutação E357K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação perturbadora ser a mutação K370E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

[266] 25. O polipeptídeo multimérico de acordo com o exemplo de realização 23, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação D356K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação perturbadora ser a mutação K439E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

[267] 26. Um polipeptídeo multimérico, caracterizado por compreender; a) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, a-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação perturbadora diferente das mutações sob a-1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, a4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

a-5) o primeiro/ e/ou o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos da região de dobradiça da IgG: tipo selvagem HTCPPCP (SEQ ID NO: 31) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência da região de dobradiça da IgG HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90),

ou b) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que b-1) i) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob,

b-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

b-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação perturbadora que é diferente das mutações sob a- 2) em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

b-4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, b-5) o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos da região de dobradiça da IgG: tipo selvagem HTCPPCP (SEQ ID NO: 31) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência da região de dobradiça da IgG HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90).

[268] 27. O polipeptíideo multimérico de acordo com o exemplo de realização 26, caracterizado pela mutação perturbadora ser a mutação E357K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação perturbadora ser a mutação K370E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

[269] 28. O polipeptídeo multimérico de acordo com o exemplo de realização 26, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação D356K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação perturbadora ser a mutação K439E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

[270] 292. Um polipeptídeo multimérico, caracterizado por compreender; a) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

a-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação,

a-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação E357K e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 370 o resíduo de aminoácido K,

a4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

b-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação K370E e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 357 o resíduo de aminoácido E,

d4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[271] 30. Um polipeptídeo multimérico, caracterizado por compreender; a) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, a-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação D356K e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 439 o resíduo de aminoácido K, a-4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, ou b) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que b-1) i) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob, b-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, b-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 a mutação K439E e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 356 o resíduo de aminoácido D, b-4) o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um dímero, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[272] 31. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 26 a 30, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo — compreender a mutação knob, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob e o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole.

[273] 32. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 26 a 30, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-cys, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, ou o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob e o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole-cys.

[274] 33. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 29 a 32, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo ou pelo segundo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos da região de dobradiça da IgG tipo selvagem HTCPPCP (SEQ ID NO: 31) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência da região de dobradiça da IgG: HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90).

[275] 34. O polipeptídeo multimérico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 22 a 33, caracterizado; A) pelo primeiro polipeptídeo ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal;

ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana,

ii)) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG: humana,

iii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

vii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de I9G1 humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

e; pelo segundo polipeptídeo ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG humana,

compreendendo uma muta;ao selecionada a partir das mutações D356K, E357K, K370E ou K439E, em que o primeiro — polipeptideo — compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

e;

um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto;

ou

B)

il) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG humana,

iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de I19G: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, e; pelo segundo polipeptídeo ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, compreendendo a mutação knob, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma muta;ao selecionada a partir das mutações D356K, E357K, K370E ou K439E, em que o primeiro — polipeptíideo — compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, e; um terceiro polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve covalentemente ligados ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, 3º CONJUNTO EXEMPLAR DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO:

[276] 1. Um método para produzir um polipeptídeo, compreendendo as seguintes etapas de - incubação de um primeiro multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que: a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações holecys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações knob, a-2) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma primeira mutação diferente das mutações sob a-

1), e a introdução da primeira mutação aumenta a energia livre de ligação CH3-CH3 do primeiro multímero,

e;

um segundo multímero compreendendo um terceiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e;

um quarto polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G,

e;

ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele,

em que:

b-1) no caso o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole-cys, o quarto polipeptídeo compreende as mutações knob-cys e o terceiro polipeptideco compreende as mutações hole,

ou no caso o primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-cys, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole-cys e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações knob,

b-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma segunda mutação diferente das mutações sob a-1), a-2) e b-1), e a introdução da segunda mutação aumenta a energia livre de ligação CH3-CH3 do segundo multímero,

para formar um terceiro multímero que compreende o segundo e o terceiro polipeptídeo e um quarto multímero que compreende o primeiro e o quarto polipeptídeo,

e; - recuperação do quarto multímero e desse modo produzir o polipeptídeo.

[277] 2. O método de acordo com o exemplo de realização 1, caracterizado pela mutação sob o item a-2) ser a mutação E357K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, a mutação sob o item b-2) ser a mutação K370E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E, com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[278] 3. O método de acordo com o exemplo de realização 1, caracterizado pela mutação sob o item a-2) ser a mutação D356K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, a mutação sob o item b-2) ser a mutação K439E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D, com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[279] 4. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, caracterizado pelo primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86) e em que o quarto e/ou terceiro polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86).

[280] 5. Um método para produzir um polipeptídeo, caracterizado por compreender as seguintes etapas de - incubação de um primeiro multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e;

ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que:

a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole,

ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

a-2) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma primeira mutação diferente das mutações sob a-1), e a introdução da primeira mutação aumenta a energia livre de ligação CH3-CH3 do primeiro multímero,

a-3) o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86),

e;

um quarto polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G,

e;

ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele,

em que: b-1) no caso o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende as mutações knob e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações hole, ou no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações knob, b-2) o terceiro polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação que é diferente das mutações sob a-1), a-2) e b-1), e a introdução da segunda mutação aumenta a energia livre de ligação CH3-CH3 do segundo multímero, b-3) o quarto e/ou o terceiro polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86), para formar um terceiro multímero que compreende o segundo e o terceiro polipeptídeo e um quarto multímero que compreende o primeiro e o quarto polipeptídeo, e; - recuperação do quarto multímero e desse modo produzir o polipeptídeo.

[281] 6. O método de acordo com o exemplo de realização 5, caracterizado pela mutação sob o item a-2) ser a mutação E357K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, a mutação sob o item b-2) ser a mutação K370E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E, com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[282] 7. O método de acordo com o exemplo de realização 5,

caracterizado pela mutação sob o item a-2) ser a mutação D356K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, a mutação sob o item b-2) ser a mutação K439E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D, com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[283] 8. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização 1 ou 5, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina G tipo selvagem no domínio CH3 na(s) posição(ões) que interagem com o resíduo de aminoácido mutado no segundo polipeptídeo, e em que o quarto polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina G tipo selvagem no domínio CH3 na(s) posição(ões) que interagem com o resíduo de aminoácido mutado no terceiro polipeptídeo.

[284] 9. Um método para produzir um polipeptídeo, caracterizado por compreender as seguintes etapas de - incubação de um primeiro multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que: a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole,

a-2) o primeiro polipeptídeo compreende na posição 370 o resíduo de aminoácido K e o segundo polipeptídeo compreende a mutação E357K,

e;

um segundo multímero compreendendo um terceiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G,

e; um quarto polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G,

e;

ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele,

em que:

b-1) no caso o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende as mutações knob e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações hole,

ou no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações knob,

b-2) o terceiro polipeptídeo compreende a mutação K370E e o quarto polipeptídeo compreende na posição 357 o resíduo de aminoácido E,

para formar um terceiro multímero que compreende o segundo e o terceiro polipeptídeo e um quarto multímero que compreende o primeiro e o quarto polipeptídeo, e; - recuperação do quarto multímero e desse modo produzir o polipeptídeo, com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[285] 10. Um método para produzir um polipeptídeo, caracterizado por compreender as seguintes etapas de - incubação de um primeiro multímero compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que: a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o primeiro polipeptídeo compreende na posição 439 o resíduo de aminoácido K e o segundo polipeptídeo compreende a mutação D356K, e; um segundo multímero compreendendo um terceiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; um quarto polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, em que: b-1) no caso o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, o quarto polipeptídeo compreende as mutações knob e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações hole, ou no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob, o quarto polipeptídeo compreende as mutações hole e o terceiro polipeptídeo compreende as mutações knob, b-2) o terceiro polipeptídeo compreende a mutação K439E e o quarto polipeptídeo compreende na posição 356 o resíduo de aminoácido D, para formar um terceiro multímero que compreende o segundo e o terceiro polipeptídeo e um quarto multímero que compreende o primeiro e o quarto polipeptídeo, e; - recuperação do quarto multímero e desse modo produzir o polipeptídeo, com as posições numeradas de acordo com o índice EU de

Kabat.

[286] 11. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, caracterizado pela energia livre de ligação CH3-CH3 do terceiro multimero compreendendo o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo ser menor que a energia livre de ligação CH3-CH3 do primeiro multímero e/ou segundo multímero.

[287] 12. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 11, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo formarem um dímero (isolável), e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formarem um dímero (isolável).

[288] 13. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 4 a 12, caracterizado pelo primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos HTCPPCP da região de dobradiça da IgG tipo selvagem (SEQ ID NO: 31) e/ou o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86) no lugar da sequência de aminoácidos da região de dobradiça de IgG HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90) e/ou o terceiro e/ou o quarto polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) no lugar da sequência de aminoácidos da região dobradiça de IgG tipo selvagem HTCPPCP (SEQ ID NO: 31) e/ou o terceiro e/ou o quarto polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86) no lugar da sequência de aminoácidos da região de dobradiça da IgG tipo selvagem HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90).

[289] 14. — O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 5 a 13, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, o terceiro polipeptídeo compreender a mutação knob e o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole.

[290] 15. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 5 a 13, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-Cys, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, o terceiro polipeptídeo compreender a mutação knob e o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole-Cys.

[291] 16. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 15, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem, cada um, na direção N- terminal para a C-terminal um domínio CH2 de IgG: e um domínio CH3 de 19G1.

[292] 17. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 16, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem, cada um, na direção N- terminal para C-terminal; i) independentemente um do outro, a sequência de aminoácidos DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65) ou a sequência de aminoácidos DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) ou a sequência de aminoácidos DKTHT (SEQ ID NO: 91), ii) um domínio CH2 de IgG e iii) um domínio CH3 de IgG'.

[293] 18. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, caracterizado i) pelos polipeptídeos primeiro e quarto compreenderem ainda um domínio CH1 de IgG: e um domínio variável, ou ii) caracterizado pelo primeiro ou o quarto polipeptídeo compreender um domínio CH1 de IgG e o outro polipeptídeo compreender um domínio constante de cadeia leve, e cada polipeptídeo compreender ainda um domínio variável.

[294] 19. O método de acordo com o exemplo de realização 18, caracterizado pelo domínio variável do primeiro polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável do quarto polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia leve ou vice-versa; e esses domínios formam um sítio de ligação no polipeptídeo.

[295] 20. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, caracterizado pelo primeiro e o quarto polipeptídeo serem independentemente selecionados a partir do grupo de polipeptídeos que compreende na direção N-terminal para a C-terminal; ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 de IgG humana, iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada, iv) um scFv, opcionalmente um ligante peptídico, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, v) um scFab, opcionalmente um ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

vi) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

viii) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

x) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

xi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

xiii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

xiv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana, xv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xvi) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo.

[296] 21. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, caracterizado pelo primeiro e segundo multímero compreender ainda uma cadeia leve de anticorpo que está associada ao primeiro polipeptídeo e ao quarto polipeptídeo, respectivamente.

[297] 22. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, caracterizado pelo primeiro ligante compreender como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para

C-terminal;

iii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de I9G: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

vili)um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de 19G1 humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG1 humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de I1gG1 humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

compreendendo a mutação knob ou mutações hole,

e;

uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG humana,

compreendendo a mutação knob, se o primeiro polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o primeiro polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo a mutação perturbadora D356K, E357K, K370E ou K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende —*o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, e; um quinto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto, e; o segundo multímero compreende como terceiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG humana, compreendendo a mutação knob, se o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o segundo polipeptídeo compreender a mutação knob, compreendendo uma segunda mutação perturbadora D356S,

E357S, K370E ou K439E, em que o quinto polipeptídeo compreende resíduo(s) de aminoácidos da imunoglobulina (I9G:)) humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem em uma IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, em que a mutação perturbadora no quarto polipeptídeo está em uma posição diferente da mutação perturbadora no segundo polipeptídeo, e; como quarto polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C- terminal;

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo, compreendendo a mutação knob, se o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole, ou as mutações hole se o quarto polipeptídeo compreender a mutação knob, em que o quarto polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um dímero, e; um sexto polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o sexto polipeptídeo está covalentemente ligado ao quarto polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto,

[298] 23. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3 e 9 a 12, caracterizado pela etapa de incubação ocorrer na presença ou ausência de um agente redutor.

[299] 24. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 4 a 8 e 13 a 22, caracterizado pela etapa de incubação ocorrer na ausência de um agente redutor.

[300] 25. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24, caracterizado; i) pelo segundo polipeptídeo e terceiro polipeptídeo compreenderem ainda um marcador (tag) (C-terminal).

[301] 26. O método de acordo com o exemplo de realização 25, caracterizado i) pelomarcador (tag) ter a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) e a recuperação ser realizada por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal (níquel).

ou ii), pelo marcador ter a sequência de aminoácido EPEA (SEQ ID

NO: 87) e a recuperação ser realizada por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade C-tag.

[302] 27. Um método para identificar uma polipeptídeo multiespecífico, caracterizado por compreender as etapas de; a) produzir uma multiplicidade de polipeptídeos multiespecíficos submetendo cada combinação de um primeiro multímero selecionado a partir de uma primeira multitude de multímeros que se liga especificamente a um primeiro alvo e um segundo multímero selecionado a partir de uma segunda multitude de multímero que se liga especificamente a um segundo alvo (que é diferente do primeiro alvo) a um método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 26, b) medir individualmente para cada membro da multitude de polipeptídeos multiespecíficos produzidos na etapa a) a ligação simultânea aos dois alvos em um ensaio de ligação, e c) selecionar um polipeptídeo multimérico a partir da multitude de polipeptídeos multiméricos com base no resultado do ensaio de ligação e, desse modo, identificar um polipeptídeo multiespecífico.

[303] 28. — O método de acordo com o exemplo de realização 27, caracterizado pelo ensaio de ligação ser um método de ELISA ou SPR.

[304] 292. Um polipeptídeo multimérico isolado compreendendo; a) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que a-1) i) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou ii) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob,

a-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação perturbadora diferente das mutações sob a-1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora,

ad) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero,

ou b) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que b-1) i) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações knob e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole-cys, ou ii) o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole- e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-cys,

b-2) o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação, b-3) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação perturbadora que é diferente das mutações sob b- 1), em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácido de imunoglobulina G tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, b-4) o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo formam um dímero, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat.

[305] 30. O polipeptídeo multimérico de acordo com o exemplo de realização 29, caracterizado pela mutação perturbadora ser a mutação E357K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação perturbadora ser a mutação K370E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

[806] 31. O polipeptíideo multimérico de acordo com o exemplo de realização 29, caracterizado pela primeira mutação perturbadora ser a mutação D356K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação perturbadora ser a mutação K439E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

[307] 32. Um polipeptídeo multimérico isolado compreendendo; um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e;

ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que: a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações holecys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações knob, a-2) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação adicional que é diferente das mutações sob a-1), e a introdução da mutação adicional aumenta a energia livre de ligação CH3-CH3 do primeiro multímero,

[308] 33. — O polipeptídeo multimérico isolado de acordo com o exemplo de realização 32, caracterizado pela mutação sob a-2) ser ES57K,e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 370 o resíduo de aminoácido K; ou caracterizado pela mutação sob a-2) ser K370E, e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[309] 34. O polipeptídeo multimérico isolado de acordo com o exemplo de realização 32, caracterizado pela mutação sob a-2) ser D356K, e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 439 o resíduo de aminoácido K; ou caracterizado pela mutação sob a-2) ser K439E, e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[810] 35. O polipeptídeo multimérico isolado, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 32 a 34, caracterizado pelo primeiro e/ou segundo polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86).

[311] 36. Um polipeptídeo multimérico isolado compreendendo;

[312] um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que: a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação adicional que é diferente das mutações sob a-1), e a introdução da mutação adicional aumenta a energia livre de ligação CH3-CH3 do primeiro multímero, a-3) o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos HTSPPSP (SEQ ID NO: 85) ou a sequência de aminoácidos HTPAPE (SEQ ID NO: 86).

[313] 37. O polipeptídeo multimérico isolado de acordo com o exemplo de realização 36, caracterizado pela mutação sob a-2) ser ES5S7K, e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 370 o resíduo de aminoácido K; ou caracterizado pela mutação sob a-2) ser K370E, e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[314] 38. O polipeptídeo multimérico isolado de acordo com o exemplo de realização 36, caracterizado pela mutação sob a-2) ser D356K, e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 439 o resíduo de aminoácido K; ou caracterizado pela mutação sob a-2) ser K439E, e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

[315] 39. O polipeptídeo multimérico isolado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 32 a 36, caracterizado pelo primeiro —polipeptídeo compreender o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina G tipo selvagem no domínio CH3 na(s) posição(ões) que interagem com o resíduo de aminoácido mutado no segundo polipeptídeo.

[316] 40. Um polipeptídeo multimérico isolado compreendendo; um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que:

a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o primeiro polipeptídeo compreende na posição 370 o resíduo de aminoácido K e o segundo polipeptídeo compreende a mutação E357K, ou o segundo polipeptídeo compreende a mutação K370E e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

[817] 41. Um polipeptídeo multimérico isolado compreendendo; um primeiro polipeptídeo compreendendo i) um domínio CH3 de imunoglobulina G, e; ii) pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte dele, e; um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que: a-1) o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, a-2) o primeiro polipeptídeo compreende na posição 439 o resíduo de aminoácido K e o segundo polipeptídeo compreende a mutação D356K, ou o segundo polipeptídeo compreende a mutação K439E e o primeiro polipeptídeo compreende na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

[318] 42. O polipeptídeo multimérico isolado, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização 29 a 41, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo ser selecionado a partir do grupo de polipeptídeo que compreende na direção N-terminal para C-terminal; ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada, e um domínio CH1 de IgG humana, iii) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada,

iv) um scFv, opcionalmente um ligante peptídico, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

v) um scFab, opcionalmente um ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana,

vi) uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de I1gG' humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFv,

vii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG' humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

ix) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de

SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xi) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG1 humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico e um scFab,

Xiii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana, xiv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana, xv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda humana e um segundo domínio variável de cadeia pesada, e xvi) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 derivado de um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 derivado de um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

[819] 43. O polipeptídeo multimérico isolado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 29 a 42, caracterizado por compreender ainda uma cadeia leve de anticorpo que está associada ao primeiro polipeptídeo.

[320] 44. O polipeptídeo multimérico isolado, de acordo com o exemplo de realização 43, caracterizado por compreender; como primeiro polipeptídeo, um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de polipeptídeos compreendendo na direção N- para C-terminal; ii) um domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG: humana, ii), uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio CH1 de IgG: humana, iii) uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio CH1 de IgG: humana e um domínio variável de cadeia pesada, iv) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio CH1 de IgG: humana, v) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG' humana, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

viii) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio CH1 de IgG: humana, e um domínio variável de cadeia leve,

ix) um domínio variável de cadeia pesada, um primeiro domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio CH1 de IgG: humana,

x) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio

CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda,

xi) um primeiro domínio variável de cadeia pesada, um domínio CH1 de IgG: humana, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente um ligante peptídico, um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda, e um segundo domínio variável de cadeia pesada,

xii) uma primeira parte do domínio de ligação, opcionalmente um primeiro ligante peptídico, uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana, um domínio CH3 de IgG: humana, opcionalmente, um segundo ligante peptídico; e uma segunda parte do domínio de ligação, em que a primeira parte do domínio de ligação e a segunda parte do domínio de ligação formam um sítio de ligação funcional que se liga especificamente a um alvo,

e;

uma região de dobradiça de SEQ ID NO: 65 ou 66 ou 91, um domínio CH2 de IgG: humana e um domínio CH3 de IgG'1 humana,

compreendendo a mutação perturbadora D356K, E357K, K370E ou K439E, em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido da imunoglobulina IgG: humana tipo selvagem em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na imunoglobulina IgG: tipo selvagem com o resíduo de aminoácido na mutação perturbadora, e; como terceiro polipeptídeo um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que o terceiro polipeptídeo está covalentemente ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto.

[321] 45. O polipeptídeo multimérico isolado, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 29 a 44, caracterizado; i) pelo segundo polipeptídeo e terceiro polipeptídeo compreenderem ainda um marcador (tag) (C-terminal).

[322] 46. O polipeptídeo multimérico isolado, de acordo com o exemplo de realização 45, caracterizado por; i) o marcador (tag) tem a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68).

ou ii) o marcador tem a sequência de aminoácidos EPEA (SEQ ID NO: 87).

[323] Os exemplos, sequências e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, sendo o verdadeiro escopo estabelecido nas reivindicações anexas. Deve-se compreender que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[324] Figura 1: Design e composição modular de 2/3-IgGs que podem ser utilizados no método de acordo com a presente invenção.

[325] Figura 2: Interações entre as cadeias pesadas knob-cys e hole-cys (parte superior) e cadeia pesada knob-cys e o MHCFCRP (parte média e inferior). A ligação de bissulfeto covalente é indicada com uma linha tracejada, pares de interação atraentes são representados com linhas entre esferas cheias, interações repulsivas de impedimento estérico resultantes são indicadas com linhas de setas duplas.

[326] Figura 3: Cromatogramas SEC dos 2/3-lgG purificados com MHCFcRPs diferentes: são mostrados os perfis SEC das preparações 2/3- IgG após extração em proteína A a partir de sobrenadantes de cultura de células; o pico principal de cada perfil representa os 2/3-I9G; com especificidades para fluos (fluoresceína) ou bio (Biocitinamida) (vide o Exemplo 2).

[327] Figura 4: Geração de bsAbs (anticorpos biespeciíficos) por reação de troca de acordo com a presente invenção exemplificada com os 2/3-lgGs.

[328] Figura 5: TCEP (x equivalentes molares em relação aos 2/3 de IgGs de entrada) é aplicado para reduzir (parcialmente) as ligações de bissulfeto - dobradiça. O SEC diferencia a molécula inicial de 2/3-I9G, gerou bsAb e MHCFcRP dimérico. Todas as reações em diferentes concentrações de TCEP foram interrompidas após o mesmo tempo de incubação (triângulo: bsAb; cruzamento: 2/3-lgG, diamante: MHCFCRP dimérico).

[329] Figura 6: Remoção de moléculas e subprodutos indesejados não reagidos dos produtos bsAb desejados.

[330] Figura ?7: SDS-page da purificação NINTA; n.r. = não reduzido; r = reduzido; NIiNTA-ligado (painel superior) representa proteínas eluídas a partir de NIiNTA, fluxo de NINTA através (painel inferior) são proteínas que não contêm um marcador His-6 ou His-8-tag; n.r. = não reduzido, r. = reduzido; M = marcador.

[331] Figura 8: Funcionalidade biespecífica de bsAbs gerada por reação de troca de acordo com a invenção. A funcionalidade foi avaliada por um ELISA em ponte que permite a detecção da ligação simultânea dos sítios de ligação de um anticorpo biespecífico. O antígeno A revestido na placa de ELISA foi a fluoresceína (fluos-BSA) e o antígeno B foi o bio-Cy5, que é detectado por sua fluorescência.

[332] Figura 9: Exemplos de 2/3-lIgGs para reação de troca de 2/3-lgG com sítios de ligação no C-terminal da cadeia pesada.

[333] Figura 10: Exemplos de 2/3-lIgGs para reação de troca de 2/3-lgG com sítios de ligação no N-terminal e C-terminal da cadeia pesada.

[334] Figura 11: Reação de troca da IgG usando materiais de partida com a especificidade de ligação e formatos diferentes, exemplificados com 2/3-lgGs.

[335] Figura 12: Matriz de formatos de diferentes bsAb gerada através da reação de troca de acordo com a presente invenção utilizando 2/3- lgGs exemplares. A matriz foi gerada com uma entidade de ligação à fluoresceína e uma entidade de ligação à biocitinamida. As moléculas de entrada e as moléculas de saída derivadas de troca são mostradas na Figura

10. A funcionalidade dos bsAbs gerados foi avaliada através da ELISA em ponte usando o fluos-BSA como antígeno de captura e bio-Cy5 para detectar a funcionalidade de ligação biespecífica. Os sinais derivados do ELISA em ponte mostram que todos os formatos têm eficácia de ligação biespecífica.

[336] Figura 13: Matriz para a geração e caracterização da diversidade de bsAbs através de intercâmbio de reação de acordo com a presente invenção usando uma abordagem de alto rendimento miniaturizado e abordagem compatível com automação.

[337] Figura 14: Formação de anticorpos biespecíficos via troca de acordo com o método da presente invenção com a tecnologia HTS. É mostrado o sinal de um ensaio ELISA em ponte (bridging ELISA) exemplar mostrando sinais de fluorescência dependentes da concentração que são indicativos para a formação de anticorpos biespecíficos. Fluos-bio bridging ELISA, cruzado (cross): fluos [hole/K370E] + bio [knob/E357K], diamante: bio[hole/K370E] + fluos [knob/E357K]. Todas as outras curvas: moléculas 2/3- |IgGs de entrada sem parceiros de troca cognatos não mostram sinal de ligação em ponte.

[338] Figura 15: Esquema da reação de troca de acordo com a presente invenção exemplificado com os 2/3-lgGs sem região de dobradiça e ligações de bissulfeto intercadeia do domínio CH3. Isso permite a reação de troca de cadeia no método de acordo com a presente invenção sem a necessidade de adicionar um agente redutor.

[339] Figura 16: Os 2/3-lgGs sem ligações de bissulfeto intercadeia foram secretados em sobrenadantes de cultura como IgGs padrão, purificados por cromatografia de afinidade e de exclusão por tamanho padrão em proteína A e analisados por SDS-PAGE, confirmando os 2/3-lIgGs com 100 kDa desejados como produtos da expressão. Isto prova a montagem correta dos derivados de 2/3-lgGs purificados sem ligações de bissulfeto intercadeia, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados. A purificação de i) cadeia leve de anticorpo anti-bio (SEQ ID NO: 39) + cadeia pesada-knob de anticorpo anti-bio sem resíduos de cisteína da região de dobradiça (SEQ ID NO: 57) + MHCFCRP-hole-E357K sem resíduos de cisteína da região de dobradiça (SEQ ID NO: 62) (esquerda) e ii) cadeia leve de anticorpo anti-fluos (SEQ ID NO: 42) + cadeia pesada hole de anticorpo anti-fluos completo sem ligações de bissulfeto na região de dobradiça (SEQ ID NO: 60) + MHCFcRP —

Knob-K370E sem resíduos de cisteína da região dobradiça (SEQ ID NO: 63) (direita).

[340] Figura 17: Resultados da reação de troca de acordo com a presente invenção com materiais de partida, sem ligações de bissulfeto da região de dobradiça: concentração de 2,5 uM de moléculas de entrada com bsAb purificado como controle positivo demonstram a geração de bsAb bem sucedida através de troca de cadeia com moléculas de entrada de 2/3-lgGs monoespecíficas sem ligações de bissulfeto intercadeia na região Fc.

[341] Figura 18: Geração de bsAbs (anticorpos biespecíficos) por reação de troca de acordo com a presente invenção exemplificada com 2/3- IgGs (esquerda) e uma IgG (direita).

[342] Figura 19: Geração de bsAbs (anticorpos biespecíficos) por reação de troca de acordo com a presente invenção exemplificada com 2/3- lgGs em que o Fab foi substituído por um affibody (esquerda) e uma IgG (direita).

[343] Figura 20: Cromatograma SEC da construção de anticorpo purificado para uso na reação de troca de acordo com a presente invenção após a purificação cOmpleteº His-Tag a partir do sobrenadante da cultura de células; a linha horizontal indica as frações reunidas para estudos posteriores.

[344] Figura 21: SDS-PAGE da construção com affibody purificada por SEC utilizado na reação de troca de acordo com a presente invenção; M = marcador, S = amostra.

[345] Figura 22: Esquema de ensaio ELISA. Os reagentes carregam etiquetas His e são capazes de se ligar a placas revestidas com Ni, mas não possuem entidade funcional de ligação à biotina (Bio) e, portanto, não se ligam ao Bio-Cy5. Somente após a troca da cadeia na reação de troca de acordo com a presente invenção é gerado o sítio de ligação anti-biotina funcional, o que permite a captura de Bio-Cy5 e a detecção de sinal fluorescente.

[346] Figura 23: Resultados do teste ELISA. O ELISA confirma a troca de cadeias entre entidades que possuem braços Fab e scaffolds.

[347] Figura 24: Reação de troca de acordo com a presente invenção realizada com 2/3-lgGs com e sem ligações de bissulfeto na região dobradiça, isto é, sob condições redutoras (vermelhas) e não redutoras (verdes). A reação de troca foi monitorada utilizando o ensaio em ponte descrito nos exemplos. O controle negativo (cinza) eram ambas as moléculas de partida 2/3-lgGs monoespecíficas.

[348] Figura 25: Pelamodificação da região de dobradiça IgG1, isto é, pela remoção das ligações de bissulfeto ou encurtando a região de dobradiça, diferentes distâncias entre os sítios de ligação individuais podem ser manipuladas.

[349] Figura 26: A reação de troca de acordo com a presente invenção com uma 2/3-lgGs compreendendo uma segunda região Fab.

[350] Figura 27: Cromatograma SEC dos 2/3-lgGs estendido por Fab purificado.

[351] Figura 28: Sensorgrama SPR para o anticorpo biespecífico <FITC> <CD3> - knob-HC (dA)+<Biotina>-hole-nc-His (ncB) obtido por injeções consecutivas de uma proteína marcada com biotina ou FITC (uma vez a primeira marcada com biotina e a segunda com FITC e uma vez a marcada com FITC foi injetada primeiro e a marcada com biotina em segundo).

[352] Figura 290: Cromatogramas CE-SDS não reduzidos para os 2/3-lgGs iniciais compreendendo um marcador C-tag e a mistura de reação após a reação de troca de acordo com a invenção. 2/3-lgGs de partida A é Fluo-knob-n-HC + hole-MHCFCRP (E357K)-C-Tag e 2/3-lgGs de partida B é biotina-hole-n-HC + knob-MHCFCRP (K370E)-C-Tag. Pode ver-se que O anticorpo biespecífico se forma e pode ser coletado no fluxo passante (flow- through). O MHCFCcRP marcado (C-tagged) é ligado após a reação de troca com a resina C-fag e pode ser eluído a partir daí. Assim, uma separação e purificação é alcançada.

[353] Figura 30: Dependência de concentração da reação de troca.

[354] Figura 31: A reação de troca de acordo com a presente invenção com uma 2/3-lgGs compreendendo um sítio de ligação contraído (restrito).

[355] Figura 32: Cromatograma SEC analítico para o produto de reação de troca conAconB obtido.

[356] Figura 33: Cromatograma CE-SDS não reduzido para o produto de reação de troca conAconB obtido.

[357] Figura 34: Sensorgrama SPR para o anticorpo biespecífico <cMET>-hole-HC (conA) + <Fluo>-knob-c-His (ncB) obtido por injeções consecutivas de uma proteína marcada com cMET e Fluo.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PROJETO E COMPOSIÇÃO MODULAR DE 2/3-lGGS

OBSERVAÇÕES GERAIS

[358] A Figura 1 mostra o design e a composição modular de 2/3- IgGs utilizados nos métodos de acordo com a presente invenção. Esses 2/3- IgGs são compostos de três cadeias individuais: uma cadeia leve (normalmente uma cadeia leve de comprimento total compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve), uma cadeia pesada (normalmente uma cadeia pesada de comprimento total compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e todos os domínios constantes de cadeia pesada, incluindo uma região de dobradiça), e um polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc (normalmente um fragmento de cadeia pesada da região Fc compreendendo dobradiça-CH2-CH3). Os domínios variáveis da cadeia leve e a cadeia pesada formam um sítios de ligação funcional. A cadeia pesada (normalmente derivada da subclasse IgG: humana) contém tanto as mutações knob-Cys quanto as mutações hole-Cys (as mutações T366W e S354C do domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é indicada como “mutações knob-cys" e as mutações T366S, L368A, Y407V, Y349C no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo são indicadas como “mutações no hole-cys” (numeração de acordo com o índice EU de Kabat)) no CH3 para permitir a formação de dímeros da região Fc knob-into-hole. O polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc é chamado 'dummy-Fc'/HCFCRP (veja abaixo), isto é, um derivado de IgG: que carece de VH e CH1, começa no N-terminal com a sequência da região de dobradiça e abriga um His6 tag em seu C-terminal. Além disso, o polipeptídeo da cadeia pesada da região Fc dos 2/3-lgGs contem s em seus domínios CH3 a mutação knob ou as mutações hole (a mutação T366W no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpo é indicada como “mutação knob”, e as mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 de uma cadeia pesada de anticorpos são indicadas como “mutações hole" (numeração de acordo com o índice EU de Kabat)). Além das mutações knob ou hole o polipeptídeo de cadeia pesada da região Fc compreende pelo menos uma mutação perturbadora introduzindo uma carga repulsiva (ou seja, uma única carga adicional) em relação à sequência tipo selvagem: D356K ou E 357K ou K370E ou K439E; SEQ ID NO: 35 a 38; este polipeptídeo da região Fc de cadeia pesada mutada é indicado como MHCFCRP a seguir.

[359] A cadeia pesada e o MHCFCRP podem formar dois tipos de heterodímeros, dependendo da distribuição das mutações knob-into-hole neles: i) cadeia pesada-knob::MHCFcRP-hole, e ii), cadeia pesada-hole::MHCFCcRP-knob.

[360] Entretanto, estes heterodímeros são um pouco defeituosos' pois a região Fc complementar carece da cisteína CH3 adicional necessária para as ligações de bissulfeto intercadeias na cadeia pesada, e também eles contêm as mutações de carga sem as contrapartes de cadeia pesada correspondentes. EXEMPLO 2 EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE 2/3-IGGs DE ACORDO COM A INVENÇÃO

[361] A expressão de 2/3-lgGs foi alcançada por cotransfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve, cadeia pesada (com mutações knob ou hole) e MHCFCRP (knob ou hole) correspondente em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) por meio de tecnologias do estado da técnica.

[362] Em mais detalhes, por exemplo, para a produção de 2/3- IgGs por transfecção transitória (por exemplo, em células HEK293) foram aplicados plasmídeos de expressão com baseados em uma organização cCDNA com ou sem o promotor CMV-/ntron A, ou em uma organização genômica com um promotor CMV.

[363] Além do cassete de expressão do anticorpo, os plasmídeos continham: - uma origem de replicação que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, - um gene Bf-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli, e - -ogene da di-hidrofolato redutase de Mus musculus como marcador selecionável em células eucarióticas.

[364] A unidade de transcrição de cada gene do anticorpo foi composta pelos seguintes elementos: - —sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 5' - o facilitador (enhancer) e promotor precoce de expressão imediata do citomegalovírus humano, - “seguido pela sequência Íntron A no caso da organização cDNA, - uma região 5'-não traduzida de um gene de anticorpo humano, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina, - àa cadeia de anticorpo humano como cDNA ou em organização genômica (a organização éxon - íntron de imunoglobulina é mantida), - uma região 3' não traduzida com uma sequência sinal de poliadenilação, e - —sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 3'.

[365] Os genes de fusão compreendendo ácidos nucleicos as cadeias de anticorpo foram gerados por PCR e/ou síntese gênica e montados com métodos e técnicas recombinantes conhecidos pela conexão dos segmentos de ácido nucleico, por exemplo, utilizando sítios de restrição únicos nos respectivos plasmídeos. As sequências de ácido nucleico subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Para transfecções transitórias grandes quantidades de plasmídeos foram preparadas pela preparação de plasmídeo a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

[366] As técnicas de cultura de células estabelecidas foram usadas conforme descritas em “Current Protocols in Cell Biology", Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. (2000).

[367] Os 2/3-lgGs foram gerados por transfecção transitória com o respectivo plasmídeo, usando o sistema HEK293-F (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HEK293-F

(Invitrogen) crescendo em suspensão ou em um frasco sob agitação ou em um fermentador agitado em meio de expressão sem soro “FreeStyle 293” (Invitrogen) foram transfectadas com o respectivo plasmídeo de expressão e 293fectinº ou fectina (Invitrogen). Para um frasco de agitação de 2 L (Corning) as células HEK293-F foram semeadas a uma densidade de 1 x 10º células/mL em 600 mL e incubadas a 120 rpm, 8% de CO». No dia seguinte, as células são transfectadas a uma densidade celular de aproximadamente 1,5*106 células/mlL com aproximadamente 42 mL de uma mistura de A) 20 mL de meio Opti-MEM (Invitrogen) compreendendo 600 ug de DNA plasmidial total (1 vg/mL) e B) 20 mL de meio Opti-MEM + 1,2 mL de 293fectin ou fectina (2 UVl/mL). A solução de glicose foi adicionada de acordo com o consumo de glicose durante o curso da fermentação. Os 2/3-IgGs montados corretamente foram secretados nos sobrenadantes de cultura como IgGs padrão. O sobrenadante contendo os 2/3-lgGs secretados foi coletado depois de 5-10 dias e os 2/3-lgGs foram purificados diretamente a partir do sobrenadante ou o sobrenadante foi congelado e armazenado.

[368] Como os 2/3-lgGs contém uma região Fc, eles foram purificados mediante a aplicação de cromatografia de afinidade em proteína A.

[369] Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes da cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando MabSelectSure- Sepharoseº (GE Healthcare, Suécia) e cromatografia de exclusão por tamanho Superdex 200.

[370] Resumidamente, os sobrenadantes de cultura de células estéreis por filtração foram capturados sobre uma resina MabSeletSuRe equilibrada com tampão PBS (Na2HPOs 10 MM, KH2PO4s 1 mM, NaCl 137 mM e KCl 2,7 mM, pH 7,4), lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com citrato de sódio 25 mM em pH 3,0. As frações eluídas de anticorpo foram reunidas e neutralizadas com 2 M de Tris, pH 9,0. As frações agrupadas (pools) contendo o anticorpo foram adicionalmente purificadas por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0. As frações contendo os 2/3-lgGs foram reunidas (em pools), concentradas até a concentração desejada utilizando dispositivos de ultrafitrtação Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech SA, França) e armazenadas a -80ºC.

[371] A pureza e integridade foram analisadas depois de cada etapa de purificação por CE-SDS utilizando a tecnologia microfluídica LabChip (Caliper Life Science, EUA). Foi preparada uma solução de proteína (5 yL) para análise CE-SDS usando o kit HT Protein Express Reagent de acordo com as instruções do fabricante e analisadas no sistema LabChip GXII utilizando um chip “HT Protein Express Chip'. Os dados foram analisados usando o software LabChip GX .

[372] Os seguintes 2/3-lgGs foram produzidos pela coexpressão dos plasmídeos correspondentes da cadeia L, cadeia H e MHCFcCRP: e =sros [agreste] knob-cys + hole-cys + NA a a a a [mg/L] — EA A [% rend.] [mg/L) Empeee A [% rend.]

[373] Os cromatogramas SEC correspondentes são mostrados na Figura 3.

[374] Além do método da proteína A, conforme descrito acima, também pode ser utilizada a proteína L.

[375] Resumidamente, os sobrenadantes de cultura de células estéreis por filtração foram capturados em uma resina KappaSelect equilibrada com tampão PBS (Na2HPO«s 10 mM, KH2POs 1 mM, NaCl 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4), lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com citrato de sódio 50 mM em pH 2,5. As frações eluídas de anticorpo foram reunidas e neutralizadas com 1 M de Tris, pH 9,0. As frações agrupadas (pools) contendo o anticorpo foram adicionalmente purificadas por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0. As frações contendo os 2/3-lgGs foram reunidas (em pools), concentradas até a concentração desejada utilizando dispositivos de ultrafitração Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech SA, França) e armazenadas a -80ºC.

EXEMPLO 3 GERAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS (BSABS) POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3 DE IGGs (2/3-IGG)

[376] Os 2/3-lgGs que contêm uma cadeia leve, uma cadeia pesada e MHCFCRP foram gerados em dois tipos de heterodímeros KIH: comprimento total de cadeia pesada-knob::MHCFcRP-hole e comprimento total de cadeia pesada-hole::MHCFCcRP-knob. Ambos os tipos de 2/3- IgG são um pouco 'defeituosos' pois o MHCFCRP carece da cisteina CH3 adicional necessária para formar ligações de bissulfeto intercadeias para a cadeia pesada, e o MHCFCRP contém mutações sem carga sem a(s) contraparte(s) correspondente(s) de cadeia pesada de comprimento total. Os polipeptídeos que compõem os 2/3-lgGs defeituosos, no entanto, são capazes de se reorganizar para anticorpos biespecíficos com cargas correspondentes (pareadas), como mostrado na Figura 4. A cadeia pesada de comprimento total (knob-cys) dos 2/3-I9G A e a cadeia pesada de comprimento total (hole-cys) dos 2/3-lI9G B formam um heterodímero correspondente. Os heterodímeros correspondentes (pareados) também se formam quando o MHCFCRP (hole- carga) interage com o MHCFCcRP (knob-carga). Assim, as reações de troca com base na separação temporária de heterodímeros de partida de dois 2/3- lgGs diferentes resultam em produtos que contêm preferencialmente heterodímeros com correspondência (carga). As reações de troca, portanto, convertem dois 2/3-lgGs monoespecíficos em uma IgG biespecífica e um heterodímero MHCFCRP: 2/3-I9G(A)-His6(8) + 2/3-Ilg9G(B)-His6(8) — bsAb(AB) + Fc-His6(8)

[377] A reação de troca foi iniciada por uma etapa de redução (por exemplo, aplicando 2-MEA ou TCEP em várias concentrações) para quebrar especialmente as ligações de bissulfeto intercadeia da região de dobradiça. O rearranjo de cadeia ocorre espontaneamente a partir de então.

[378] Diferentes concentrações de TCEP foram aplicadas para iniciar a troca.

[379] Portanto, as moléculas de entrada anti-2/3-IlgG-fluoresceína e anti-2/3-IgG-biocitinamida foram misturadas em quantidades equimolares a uma concentração de proteína de 100 pg/ml em um volume total de 40 ul 1xPBS + 0,05% de Tween 20 com as concentrações indicadas de TCEP em uma placa REMPº de 384 poços (Brooks, % 1800030). Após a centrifugação, as placas foram seladas e incubadas durante uma hora a 27ºC.

[380] O ensaio ELISA em ponte biotina — fluoresceína foi subsequentemente utilizado para quantificar o anticorpo biespecífico.

[381] Portanto, as placas brancas de 384 poços Nuncº MaxiSorpº foram revestidas com 1 pg/ml de um conjugado de albumina- isotiocianato de fluoresceína (Sigma, % A9771) e incubadas durante a noite a 4ºC. Depois de lavar por 3 vezes com 90 ul de tampão PBST (PBST, água bidestilada, PBS 10x + 0,05% de Tween 20) um tampão de bloqueio (1 x PBS, 2% de gelatina, 0,1% de Tween -20) foi adicionado a 90 ul/poço e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem por 3 vezes com 90 uL de tampão PBST, 25 ul de uma diluição 1:10 de cada reação de troca foram adicionados a cada poço. Após incubação durante uma hora em temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas por 3 vezes com 90 uL de tampão PBST. 25 ul/poço de conjugado biotina-Cy5 em 0,5% de BSA, foi adicionado 0,025% de Tween - 20, PBS 1x a uma concentração final de 0,1 ug/mL e as placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente. Após a lavagem por 6 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados 25 ul de PBS 1x a cada poço. A fluorescência do Cy5 foi medida em um comprimento de onda de emissão de 670 nm (excitação a 649 nm) em um leitor Tecan Safire 2 Reader.

[882] A Figura 5 mostra os resultados das análises das condições redox para geração de bsAb pela troca de 2/3-lI9G. O TCEP é aplicado para reduzir (parcialmente) as ligações de bissulfeto da dobradiça entre os polipeptídeos da cadeia pesada e região Fc, ou seja, entre a metade da IgG de comprimento total e o MHCFCRP. A troca de cadeias pode ser identificada por SEC, que diferencia os 2/3-lgG de entrada, o bsAb de saída e o subproduto de MHCFCRP. Os rendimentos da reação de troca, dependendo da proporção entre 2/3-lgGs e TCEP, são mostrados na Figura 5 (para comparação, todas as reações foram analisadas após o mesmo tempo de reação).

[383] Todas as moléculas 2/3-lI9G de partida, todos os subprodutos não desejados, bem como todos os agregados que foram potencialmente gerados durante as reações de troca carregavam marcadores de afinidade (His6 ou His8). Os bsAb desejados produzidos na reação de troca é a única molécula que não carrega um marcador His-tag. Portanto, uma simples etapa de absorção NINTA foi aplicada para remover todas as moléculas indesejáveis (consulte as Figuras 6 e 7). Os bsAbs remanescentes

(não depletado pela absorção de NINTA) foram aplicados diretamente nos procedimentos de triagem e analisados para identificar bsAbs com as funcionalidades desejadas. EXEMPLO 4 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS (BSABS) POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3 DE IGGs (2/3-IGG)

[384] A funcionalidade biespecífica dos bsAbs que foram gerados como produtos das reações de troca 2/3-I9G foi avaliada por ensaios bridging-ELISA. A Figura 8 mostra como um exemplo do resultado de ligação para um anticorpo biespecífico anti-fluoresceína/biocitinamida gerado por reações de troca de acordo com a presente invenção. Na reação os 2/3-lgG de ligação a biocitinamida (bio) e os 2/3-I9G de ligação a fluoresceína (fluos) foram utilizados como moléculas de partida. O braço de ligação à fluos dos anticorpos biespecífico anti-fluos/bio se ligam às placas de ELISA revestidas com fluos-BSA. A exposição subsequente a bio-Cy5 gera sinais apenas após a captura mediada por bsBs de bio-Cy5 através do braço de ligação à bio do bsAb. Como os sinais mediados pela formação da ponte de ligação (bridging) ocorrem apenas com bsAbs, mas não com os ligantes monoespeciíficos Fluos ou Bio, nenhum sinal foi observado ao usar apenas 2/3-lgGs no ensaio. Por esse motivo e devido a reação de troca não forçar a agregação de moléculas, esse ELISA em ponte (bridging-ELISA) pode ser realizado diretamente nas misturas da reação de troca, sem a necessidade de depleção prévia mediada por NINTA das moléculas não bsAb. Os sinais observados ao aplicar a mistura de reação indicaram a geração bem sucedida e presença de bsAbs funcionais. A geração de sinal via ELISA em ponte dependeu da quantidade de entidades de entrada utilizada na reação de troca.

EXEMPLO 5

A REAÇÃO DE TROCA DIVULGADA NA PRESENTE INVENÇÃO É FUNCIONAL INDEPENDENTE DAS ESPECIFICIDADES DE LIGAÇÃO Ou DA ComPOSIÇÃO DA REGIÃO V Dos 2/3-IGGS DE PARTIDA

[385] Uma variedade de 2/3-lgGs foi produzida para avaliar se a produção de 2/3-lI9G, bem como as reações de troca, funcionam para diferentes anticorpos, independentemente de suas especificidades de ligação e composição da região V, bem como para diferentes combinações de anticorpos.

[386] Portanto, foram usados 2/3-lI9Gs com especificidades de ligação para biocitinamida (bio), digoxigenina (Dig), fluoresceína (fluos), carboidrato-LeY (LeY) VEGF e PDGF. Estes foram produzidos por cotransfecção de plasmídeos de expressão que codificam os polipeptídeos das cadeias leves de comprimento total, cadeias pesadas de comprimento total knob e hole e cadeia pesada da região Fc mutada, tal como descrito acima. Cadeia SEQ ID NO: MHCFcRPs hole-D356K-His8 35 hole-E3S7K-His8 36 knob-K370E-His8 37 knob-K439E-His8 38 cadeia leve de comprimento total de anticorpo anti-bio cadeia pesada de comprimento total knob-cys de anticorpo anti-bio 40 cadeia pesada de comprimento total hole-cys de anticorpo anti-bio cadeia leve de comprimento total de anticorpo anti-fluos 42 cadeia pesada de comprimento total knob-cys de anticorpo anti-fluos cadeia pesada de comprimento total hole-cys de anticorpo anti-fluos 44 cadeia leve de comprimento total de anticorpo anti-dig cadeia leve de comprimento total de anticorpo anti-LeY cadeia leve de comprimento total de anticorpo anti-PDGF 47 cadeia leve de comprimento total de anticorpo anti-VEGF fragmento VH-CH1 de anticorpo anti-dig | 49 fragmento VH-CH1 de anticorpo anti-LeY = so | fragmento VH-CH1 de anticorpo anti-PDGF 51 fragmento VH-CH1 de anticorpo anti-PDGF

[387] As SEQ ID NOs: 49-52 descrevem a região VH-CH1 dos 2/3-lgGs com especificidades para dig, VEGF, PDGF e LeY. Estes foram fundidos às regiões de dobradiça-CH2-CH3 (isto é, substituem as regiões bio VH-CH1) de SEQ ID NO: 40 e 41 para gerar cadeias H completas com a especificidade desejada. Os MHCFCRP's aplicados para gerar essas moléculas estão listados como SEQ ID NO: 35-38.Todos estes 2/3-lI9gGs podem ser produzidos e purificados com rendimentos semelhantes aos de lgGs padrão sob condições comparáveis (vide o Exemplo 2). Exemplos para expressão desses 2/3-lgGs com diferentes especificidades de ligação são mostrados na tabela a seguir.

2/3-IgG = 1/2-lg9G-hole-cys + MHCFCRP-knob-E357K Proteína A [76 76 81 [mg/L] SEC 40-60 >70 >90 >95 >50 [% rend.]

[388] Na matriz de troca, que foi aplicada para gerar bsAbs de diferentes especificidades, foram utilizadas combinações de 2/3-I9Gs com especificidades de ligação para fluoresceína, biocitinamida, VEGF, PDGF e digoxigenina em todas as combinações, como mostrado na tabela a seguir. Reação de troca entre | eo | nes | mw | ver | Per | bio bio bio bio fluos dig VEGF PDGF WB fluos fluos fluos & dig VEGF PDGF

S Fr) dig dig dig dig z bio fluos VEGF PDGF x

VEGF VEGF VEGF VEGF VEGF Zz bio fluos Dig PDGF

PDGF PDGF PDGF PDGF PDGF bio fluos Dig VEGF

[389] A troca de cadeia de 2/3-lgGs de partida e a geração de bsAbs com combinações de especificidade desejadas foi monitorada através do ensaio bridging-ELISA (consulte o Exemplo 4), em que foram aplicados antígenos revestidos em placa e complexos/conjugados de antígenos geradores de sinal correspondentes às combinações de bsAb de diferentes especificidades.

[390] Os resultados do ELISA em ponte aplicado para avaliar as funcionalidades de diferentes combinações de bsAb são mostrados nas Tabelas a seguir. Apenas bsAb que reconhecem o seu par cognato de antígenos presentes como antígenos de detecção ou captura geraram sinais no ELISA em ponte. Outros bsAbs gerados na matriz são negativos devido à ausência de pelo menos uma especificidade.

[391] Tabela: O ELISA em ponte confirma a funcionalidade dos bsAbs gerados. São mostradas as intensidades de sinal relativas dentro de um ensaio na concentração da molécula de entrada de 1,3 uM. O valor mais alto é definido como 100% como referência. N.a. = não disponível.

E e Ds De me 2 TE E a [es [am Os] o er so [a [ao [O es] 2 Fe [is [e Des [IO rp we entre

FEET biocitinamida-fluoresceína | ps e | es dae es x fluos 2,4% 100% 2,8% n.a.

E Sê a

S $ sr je | e | res les

S

X = | ensão — | PDGF-biocitinamida biocitinamida-Cy5 reação de troca MHCFcRP-hole-K370E entre 2 & ; 3,0% 4,1% 4,4% 81,8% =?

biocitinamida-fluoresceína | paes | ame | am | e | pa pas dae dae | moer | em | ra | ae dose | + digoxigeninaVEGF reação de troca MHCFcRP-hole-K370E entre | pes | a | ver | roer | | ps res a ee da x BD fluos 6,5% 6,3% 6,5% nm 8 a

S

IX = digoxigenina-PDGF reação de troca MHCFcRP-hole-K370E entre ss 58 28 fluos 3,7% 3,2% 2,8% =:

CEE es pm pm mo Dm os pem pe jm e o

[392] Para o VEGF que contém os anticorpos biespecíficos o mesmo ensaio foi realizado. Eles também mostraram apenas sinais acima dos níveis de fundo para as respectivas combinações. Pode-se observar que a reação de troca de acordo com a presente invenção é um método geralmente aplicável: as reações de troca levam a bsAb funcional independente das especificidades de ligação ou da composição da região V das moléculas de partida.

EXEMPLO 6 DESIGN, COMPOSIÇÃO E GERAÇÃO DE VARIANTES DE FORMATO

[393] A reação de troca dos 2/3-I9G do Exemplo 4 foi expandida para moléculas de partida que possuem um sítio de ligação no C-terminal da cadeia pesada, ou cadeias pesadas com sítios de ligação N-terminais e também C-terminais. Para a geração dos bsAbs trocados, o princípio da troca (conversão de heterodímeros defeituosos de entrada em heterodímeros de saída correspondentes) foi mantido inalterado. A composição dos MHCFcRPs também foi mantida conforme descrito anteriormente.

[394] As Figuras 1 e 9 a 10 mostram a composição modular dos três formatos de 2/3-lgGs que foram aplicadas para gerar diferentes formatos de bsAb. Um dos 2/3-lgGs tem um braço Fab na posição N-terminal. O outro 2/3-lgGs tem o braço Fab conectado por meio de um ligante flexível ao C- terminal da cadeia pesada (ou seja, começa no N-terminal com a região de dobradiça). O terceiro 2/3-I9G possui o braço Fab C-terminal, bem como o braço Fab N-terminal.

[395] A expressão destes 2/3-lgGs variantes foi conseguida pela cotransfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve, cadeia pesada (knob ou hole) e MHCFCcRP (knob ou hole) correspondente em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) (consulte o Exemplo 2).

[396] As sequências das cadeias pesadas de comprimento total modificadas usadas para a geração dos diferentes formatos de bsAb são as seguintes: Cadeia SEQID NO: MHCFcRPs hole-D356K-His8 35 hole-E357K-His8 36 knob-K370E-His8 37 knob-K439E-His8 38 cadeia pesada de comprimento total hole-cys de anticorpo anti-bio com fusão C-) 53 terminal cadeia pesada de comprimento total hole-cys de anticorpo anti-bio com fusão N- e 54 C-terminal cadeia pesada de comprimento total ho/e-cys de anticorpo anti-fluos com fusão C- 55 terminal cadeia pesada de comprimento total hole-cys de anticorpo anti-fluos com fusão N- 56 e C-terminal

[397] Os 2/3-lgG são secretados nos sobrenadantes de cultura como IgG padrão e foram purificados por cromatografia de afinidade em proteína A padrão (consulte o Exemplo 2). A análise de exclusão por tamanho e espectrometria de massa revelaram a montagem correta das formas variantes de 2/3-I9G purificadas, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados. Os rendimentos de expressão de 2/3-lgGs foram semelhantes aos observados com IgGs padrão nos mesmos sistemas de expressão. Os respectivos dados são apresentados na tabela a seguir.

anticorpo-knob-cys anti-fluoresceína | anticorpo-hole-cys anti-biocitinamida + MHCFCRP-hole-E357K + MHCFCRP-knob-K370E SEQ ID NO: 43 + 36 | 55 + 36 | 56 + 36/41 + 37/53 + 37/54 + 37 (N-Fc) (C-Fo) (NC-Fc) (N-Fc) (C-Fo) (NC-Fc)

ama oo lo + MHCFCRP-hole-E357K + MHCFCRP-knob-K370E SEQ ID NO: 43 + 36 | 55 + 36 | 56 + 36 [41 + 37 53 + 37 | 54 + 37 [mg/L] a pon o [% rend.] EXEMPLO 7

CARACTERIZAÇÃO DE BSABS COM FUNCIONALIDADES DE LIGAÇÃO COMBINADAS EM DIFERENTES VALÊNCIAS, ESTEQUIOMETRIAS E GEOMETRIAS

[398] Três moléculas de partida diferentes (2/3-IgG com sítios de ligação N-terminal, C-terminal, e N-terminal e C-terminal) podem ser combinadas entre si na reação de troca de acordo com a presente invenção, resultando em nove formatos de bsAbs diferentes. Eles diferem em valências, geometrias e posições dos sítios de ligação individuais. A reação de troca para gerar esses diferentes bsAbs foi realizada nas mesmas condições descritas no Exemplo 3.

[399] Todos os tipos de formatos de entrada são “defeituosos como o MHCFCRP que carece da cisteína CH3 adicional necessária para formar as ligações de bissulfetos intercadeia para a pesada cadeia e, uma vez que possui uma mutação de carga repulsiva (ou seja, uma carga sem a contraparte de cadeia pesada de comprimento total correspondente). As cadeias pesadas que constituem esses heterodímeros “defeituosos” se reorganizam para formar heterodímeros correspondentes correspondência (carga e bissulfeto) no método de acordo com a presente invenção. Os diferentes tipos de cadeias pesadas de comprimento total (knob-cys com hole- cys) formam heterodímeros correspondentes. Os heterodímeros correspondentes (pareados) também são formados a partir do MHCFcCRP

(hole-carga com knob-carga).

[400] Sem estar ligado a esta teoria supõe-se que o e reações de troca com baseadas na separação temporária de heterodímeros defeituosos de dois 2/3-lgGs diferentes resultam em produtos que contêm preferencialmente heterodímeros perfeitamente correspondentes com cargas correspondentes (pareadas) e, se presentes, resíduos de cisteína para a formação de ligações de bissulfeto. As trocas convertem, portanto, os 2/3-l9G monoespecíficos em IgG biespecíficas (em diferentes formatos), bem como o heterodímero da região Fc correspondente (região variável livre, ou seja, não competente em se ligar ao alvo).

[401] Para a descrição das reações de troca, as moléculas de entrada são denominadas: - “nAounB para moléculas que tenham o braço Fab no N- terminal normal da cadeia pesada completa (de comprimento total) (cadeia H), - “CA ou cB para moléculas que tenham o braço Fab no C- terminal da cadeia H, - “ncA ou ncB' para moléculas com Fab no N-terminal bem como no C-terminal da cadeia-H,

[402] As diferentes reações de troca de formato são as seguintes: 2/3-I9G(nA)-His-tag + 2/3-Ilg9G(nB)-His-tag — bsAb(nAnB) + Fc-His-tag 2/3-I9G(nNA)-His-tag + 2/3-IlgG(cB)-His-tag — bsAb(nAcB) + Fc-His-tag 2/3-I9G(nNA)-His-tag + 2/3-IlgG(ncB)-His-tag — bsAb(nAncB) + Fc-His-tag 2/3-Ig9G(cA)-His-tag + 2/3-Ilg9G(cB)-His-tag — bsAb(cAcB) + Fc-His-tag 2/3-Ig9G(cA)-His-tag + 2/3-I9G(nB)-His-tag — bsAb(cAnB) + Fc-His-tag 2/3-Ig9G(cA)-His-tag + 2/3-IlgG(ncB)-His-tag — bsAb(cAncB) + Fc-His-tag 2/3-IgG(ncA)-His-tag + 2/3-IlgG(nB)-His-tag — bsAb(ncAnB) + Fc-His-tag

2/3-Ig9G(ncA)-His-tag + 2/3-Ig9G(cB)-His-tag — bsAb(ncAcB) + Fc-His-tag 2/3-Ig9G(ncA)-His-tag + 2/3-IgG(ncB)-His-tag — bsAb(ncAncB) + Fc-His-tag

[403] As reações de troca são iniciadas por uma etapa de redução para quebrar as ligações de bissulfeto intercadeias (região de dobradiça), o rearranjo das cadeias ocorre espontaneamente a partir de então. Todas as moléculas de entrada, todos os subprodutos, bem como todos os agregados que potencialmente podem se formar durante a reação de troca carregam marcadores (tags) de afinidade (por exemplo, His6-tag ou His8-tag). Os produtos bsAb da reação de troca, no entanto, não possuem o marcador de afinidade e, portanto, podem ser separados por cromatografia de absorção por afinidade (por exemplo, NiNTA). Os bsAbs (em diferentes formatos) podem ser aplicados diretamente aos procedimentos de triagem e análises para identificar e classificar os bsAbs em diferentes formatos com funcionalidade ideal.

[404] Os formatos biespecíficos foram gerados trocando os 2/3- lgGs de entrada descritos acima em um formato MTP de 384 poços, seguido por ELISA em ponte para avaliar a montagem funcional. Portanto, os parceiros de troca (molécula 2/3-lgG 1 que consiste em uma cadeia pesada de comprimento total contendo as mutações hole-cys e um MHCFcRP-knob- K370E; molécula 2/3-lgdG 2 que consiste em uma cadeia pesada de comprimento completo contendo as mutações knob-cys e um MHCFcRP-hole- E357K) foram misturados em quantidades equimolares (4 uM) em um volume total de 100 ul de PBS 1x + 0,05% de Tween 20. As soluções proteicas foram diluídas 11 vezes 1:2 em uma placa de 384 poços (Greiner 384 masterblockº). uL de cada amostra a partir da diluição seriada foram misturados com 20 ul de uma solução de TCEP 0,5 mM até uma concentração final de proteína de 200 - 0,2 uguml e TCEP 0,25 mM em uma placa REMPº de 384 poços (Brooks, % 1800030). Após centrifugação, as placas foram seladas e incubadas por uma hora a 37ºC.

[405] Como exemplos de controle, foram utilizados bsAbs contendo a funcionalidade de ligação à bio de um lado e a funcionalidade de ligação à fluoresceína do outro lado. A funcionalidade dos bsAbs resultantes foi avaliada por ELISA em ponte para biotina-fluoresceína. Portanto, as placas brancas de 384 poços Nuncº MaxiSorpº foram revestidas com 1 ug/mL de um conjugado de albumina-isotiocianato de fluoresceína (Sigma, f A9771) e incubadas durante a noite a 4ºC. Depois de lavar por 3 vezes com 90 ul de tampão PBST (PBST, água bidestilada, PBS 10x Roche t11666789001 + 0,05% de Tween 20); 90 ul/poço de tampão de bloqueio (1 x PBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween -20) foram adicionados e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem por 3 vezes com 90 ul de tampão PBST, 25 ul de uma diluição 1:4 de cada reação de troca foram adicionados a cada poço. Após incubação durante uma hora em temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas por 3 vezes com 90 ul de tampão PBST. 25 ul/poço de conjugado biotina-Cy5 em 0,5% de BSA, foi adicionado 0,025% de Tween - 20, PBS 1x a uma concentração final de 0,1 Vg/mL e as placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente. Após a lavagem por 6 vezes com 90 ul de tampão PBST, foram adicionados ul de PBS 1x a cada poço. A fluorescência do Cy5 foi medida em um comprimento de onda de emissão de 670 nm (excitação a 649 nm) em um leitor Tecan Safire 2 Reader.

[406] Diferentes formatos de bsAbs via troca de 2/3-lI9Gs de diferentes formatos foram gerados com uma entidade de ligação à fluoresceína e uma entidade de ligação à biocitinamida. As moléculas de entrada e as moléculas de saída derivadas de troca são mostradas na Figura 11.

[407] A funcionalidade dos bsAbs gerados foi avaliada através da ELISA em ponte, tal como mostrado na Figura 12, usando o fluos-BSA como antígeno de captura e bio-Cy5 para detectar a funcionalidade de ligação em ponte biespecífica. Todos os diferentes formatos resultam em um sinal ELISA em ponte.

[408] Estes resultados mostram a viabilidade de gerar diferentes formatos usando um método de acordo com a presente invenção por meio de reações de troca de cadeia de uma maneira robusta e compatível com alto rendimento.

EXEMPLO 8 GERAÇÃO DE BSABS FUNCIONAIS POR TROCA DE 2/3-I6GGE A TRIAGEM/IDENTIFICAÇÃO DE BSABS COM FUNCIONALIDADE DESEJADA SÃO COMPATÍVEIS COM MINIATURIZAÇÃO E ALTO RENDIMENTO, ALÉM DE TECNOLOGIAS

DE AUTOMAÇÃO

[409] A aplicação de tecnologias de alto rendimento e automação é desejada e, em muitos casos, necessária para lidar com um grande número de diferentes bsAbs - que diferem na sequência e/ou no formato do sítio de ligação. Por esse motivo, foi analisado se a geração de bsAb pelo método de troca de 2/3-l9GG de acordo com a presente invenção, bem como a análise/triagem da funcionalidade, isto é, da ligação biespecífico, dos anticorpos biespecíficos assim gerados, pode ser miniaturizada de modo a ser compatível com tecnologias de alto rendimento e automação.

[410] Portanto, foram realizadas reações de troca de 2/3-lI9G e os produtos da reação foram analisados em escala miniaturizada em placas de 348 poços.

[411] Uma triagem em matriz foi montada no formato placas MTP de 384 poços da seguinte forma: Os parceiros de troca (molécula 2/3-IgG 1 que consiste em uma cadeia pesada de comprimento total contendo as mutações hole-cys e um MHCFCRP-knob-K370E; molécula 2/3-IgG 2 que consiste em uma cadeia pesada de comprimento completo contendo as mutações knob-cys e um MHCFcRP-hole-E357K) foram misturados em quantidades equimolares

(4 uM) em um volume total de 30 ul de PBS 1x + 0,05% de Tween 20. As soluções proteicas foram diluídas quatro vezes 1:3 em uma placa de 384 poços (Greiner 384 masterblockº). 20 uL de cada amostra a partir da diluição seriada foram misturados com 20 ul de uma solução de TCEP 0,5 mM até uma concentração final de proteína de 2 uM - 0,025 uM e TCEP 0,25 mM em uma placa REMPº de 384 poços (Brooks, % 1800030). Após centrifugação, as placas foram seladas e incubadas por uma hora a 37ºC.

[412] A funcionalidade dos bsAb assim gerados foi subsequentemente avaliada por meio de ELISA em ponte (consulte acima) em um formato miniaturizado de alto rendimento: Placas brancas de 384 poços Nuncº MaxiSorpº foram revestidas com 1 ugíml de um conjugado de albumina-isotiocianato de fluoresceína (Sigma, %& A9771), 1 ua/ml de PDGF (CST, & 8912) ou 1 ug/ml de VEGF121 e incubadas durante a noite a 4ºC. Depois de lavar por 3 vezes com 90 ul de tampão PBST (PBST, água bidestilada, PBS 10x + 0,05% de Tween 20) um tampão de bloqueio (1 x PBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween 20) foi adicionado a 90 ul/poço e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem por 3 vezes com 90 yuL de tampão PBST, 25 ul de uma diluição 1:4 de cada reação de troca foram adicionados a cada poço. Após incubação durante uma hora em temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas por 3 vezes com 90 ul de tampão PBST. 25 ul/poço de conjugado biotina-Cy5 ou dig-Cy5 em 0,5% de BSA, foi adicionado 0,025% de Tween - 20, PBS 1x a uma concentração final de 0,1 ug/mL e as placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente. Após a lavagem por 6 vezes com 90 yL de tampão PBST, foram adicionados 25 ul de PBS 1x a cada poço. A fluorescência do Cy5 foi medida em um comprimento de onda de emissão de 670 nm (excitação a 649 nm) em um leitor Tecan Safire 2 Reader. Os detalhes das reações de troca e análises por ELISA em ponte com os módulos 2/3-lgG que se ligam ao

VEGF ou PDGF ou dig ou bio ou fluos são mostrados na Figura 13. Os resultados exemplar destas analises são mostrados na Figura 14 e demonstram que as reações de troca de 2/3-I9G e análises funcionais subsequentes podem ser realizadas e são compatíveis com as tecnologias de automação de alto rendimento. EXEMPLO 9 GERAÇÃO DE BSABS COM TRÊS Sítios DE LIGAÇÃO QUE TÊM Como ALVO Um PRIMEIRO ANTÍGENO COM Um Sítio DE LIGAÇÃO E OUTRO ANTÍGENO COM OS OurTRros Dois Sítios DE LIGAÇÃO

[413] O método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a geração de anticorpos biespecíficos de células T (TCBs). Estes podem ter um formato conforme descrito anteriormente (consulte, por exemplo, o documento WO 2013/026831). Para a abordagem de troca TCB, uma cadeia H (com knob-cys ou hole-cys conforme descrito acima) contém uma entidade N-terminal derivada de CrossFab de ligação a CD3 de sua dobradiça, estendendo-se ainda mais no N-terminal por outra entidade de direcionamento derivada de anticorpo. A reação de troca é realizada nas mesmas condições descritas acima e resulta em um TCB que possui uma entidade de ligação a CD3 e duas entidades de ligação adicionais. Estes podem se ligar a um antígeno da célula alvo. Essas moléculas podem se ligar simultaneamente a CD3 nas células T e a um antígeno em uma célula alvo (por exemplo, tumor) e, dessa forma, induzir a morte de células alvo.

EXEMPLO 10 PROJETO E GERAÇÃO DE 2/3-lGGS SEM LIGAÇÕES DE BISSULFETO INTERCADEIA DA REGIÃO FC (NA REGIÃO DE DOBRADIÇA E NO DOMÍNIO CH3)

[414] A troca de cadeias com bissulfeto região Fc (região de dobradiça) contendo 2/3-lgGs requer a redução como etapa inicial para permitir a separação da cadeia e a montagem subsequente dos bsAbs desejados. Para evitar a etapa de redução e a necessidade associada de remover o agente redutor, foram gerados 2/3-I9GGs sem ligações de bissulfeto na região dobradiça. O princípio é exibido na Figura 15. Os resíduos de cisteína na região da dobradiça responsável pela formação de bissulfeto na dobradiça foram removidos por mutação para serina. Além disso, a cisteina CH3 na posição 354 ou 349 que forma a ligação de bissulfeto associada ao KiH foi omitida. As respectivas sequências de aminoácidos são: Cadeia SEQID NO: cadeia pesada knob de comprimento total de anticorpo anti-bio sem resíduos de 57 cisteína da região de dobradiça cadeia pesada hole de comprimento total de anticorpo anti-bio sem resíduos de 58 cisteína da dobradiça cadeia pesada knob de comprimento total de anticorpo anti-fluos sem resíduos de 59 cisteína da dobradiça cadeia pesada hole de comprimento total de anticorpo anti-fluos sem resíduos de 60 cisteína da dobradiça MHCFcRP hole-D356K-His8 sem resíduos de cisteína da dobradiça 61 hole-E357K-His8 sem resíduos de cisteína da dobradiça 62 knob-K370E-His8 sem resíduos de cisteína da dobradiça 63 knob-K439E-His8 sem resíduos de cisteína da dobradiça 64

[415] A expressão destes 2/3-lgGs acima foi conseguida pela cotransfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve, cadeia pesada (knob ou hole) de comprimento total e MHCFCRP (knob ou hole) correspondente em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) (consulte o Exemplo 2). Os 2/3- IgG foram secretados nos sobrenadantes de cultura como IgG padrão e foram, em seguida, purificados por cromatografia de afinidade em proteína A padrão e de exclusão por tamanho (consulte o Exemplo 2). As análises subsequentes via cromatografia de exclusão por tamanho e SDS-PAGE do produto de expressão 2/3-lgGs desejado de 100 kDa (Figura 16). Isto prova a montagem correta dos 2/3-lIgGs, bem como a ausência de dímeros e agregados indesejados. Isso é surpreendente, pois essas moléculas não são estabilizadas por ligações de bissulfetos entre as regiões Fc (nem na região de dobradiça, nem no domínio CH3). O rendimento da purificação de 2/3-lgGs anti-fluos e anti-bio sem ligações de bissulfeto intercadeias da região Fc é apresentado na Tabela a seguir cadeia leve de anticorpo anti-bio | cadeia leve de anticorpo anti-fluos (SEQ ID NO: 39) + cadeia pesada | (SEQ ID NO: 42) + cadeia pesada knob de anticorpo anti-bio sem | hole de comprimento total de resíduos de cisteína da região de | anticorpo anti-fluos sem ligações de dobradiça (SEQ ID NO: 57) bissulfeto da região de dobradiça + (SEQ ID NO: 60) MHCFCRP-hole-E357K sem | + resíduos de cisteína de regiões de | MHCFCcRP-knob-K370E sem dobradiça (SEQ ID NO: 62) resíduos de cisteína da região de dobradiça (SEQ ID NO: 63) Proteína À >100 >100 [mg/L] Rend. da SEC >50 >50 [mg/L 100 kDa] EXEMPLO 11 GERAÇÃO DE BSABS FUNCIONAIS POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3 DE IGGs (2/3- IGG) SEM REDUÇÃO

[416] Os 2/3-lgGs que não contêm ligações de bissulfeto intercadeia da região Fc foram submetidos a reações de troca em cadeia conforme descrito acima (consulte o Exemplo 3), exceto por omitir a etapa de redução inicial. Os 2/3-lgGs continham sítios de ligação fluos ou bio e regiões Fc sem ligações de bissulfeto intercadeia entre a cadeia pesada de comprimento total e o MHCFCRP. A composição e a produção destes 2/3-IlgG foram descritas no Exemplo 10. Após as reações de troca sem iniciar a redução, foi realizado um ELISA em ponte (bridging ELISA) para demonstrar a funcionalidade biespecífica dos bsAbs. O ELISA em ponte compreendeu a adição dos produtos da reação de troca para fluos-BSA imobilizado, seguido por etapas de lavagem e subsequente adição de bio-Cy5 para sondar a presença do segundo braço de ligação do bsAb (consulte os exemplos anteriores para detalhes sobre o ELISA em ponte). Apenas bsAb funcionais corretamente montados que podem se ligar pelos seus sítios de ligação específicos para fluos na placa de ensaio são retidos e geram sinais através da captura e retenção do bio-Cy5. Moléculas sem biespecificidade não geram sinais, pois ou elas ou não se ligam à placa (apenas ligante de bio) ou elas não podem capturar o gerador de sinal bio-Cy5 (apenas ligante de fluos). Os resultados destas análises (efetuando a reação de troca, neste exemplo, a uma concentração de 2,5 UM de moléculas de entrada com BsAb purificado como controle positivo) estão apresentados na Figura 17. Os resultados demonstram sucesso na geração de bsAb via troca de cadeia com moléculas monoespecíficas de entrada 2/3-lIgG sem ligações de bissulfeto intercadeias da região Fc. A troca produtiva da cadeia ocorreu sem a necessidade de redução inicial. Assim, a remoção de ligações de bissulfeto entre polipeptídeo da região Fc elimina a necessidade de uma primeira etapa de redução. Os bsAbs resultantes são mantidos juntos por interações Fc-Fc não covalentes. À eliminação de bissulfetos intercadeias Fc-Fc permite, assim, reações de troca acionadas “por incompatibilidade no pareamento de regiões Fc correspondentes, sem a necessidade de redução. EXEMPLO 12

REAÇÕES DE TROCA DE CADEIA SÃO IMPULSIONADAS POR CADEIAS PESADAS DE COMPRIMENTO TOTAL PARCIALMENTE DESESTABILIZADAS - INTERFACES MHCFCRP

[417] O levar a conversão de 2/3-lgGGs em bsAbs é projetada uma interface 'defeituosa' entre a cadeia pesada de comprimento total e o MHCFCcRP. Essa interface repulsiva artificial é o resultado de mutações introduzidas nos domínios CH3-knob ou -hole do MHCFCRP. O MHCFCRP se associa ainda aos parceiros knob ou hole correspondentes (“normais”) durante a expressão dos 2/3 IgGs (veja os exemplos acima). Essas moléculas têm estabilidade suficiente para apresentar os 2/3-lgGs e também moléculas sem tendências indesejadas de agregação.

[418] Sem estar ligado pela teoria, a reação de troca de acordo com a presente invenção leva a ocorrência de bsAb quando dois 2/3-lgGs complementares entram em estreita distância e os pares de cadeia pesada de anticorpo de comprimento total: NHHCFcRP são parcialmente libertados uns ao lado dos outros. A remontagem das cadeias pesadas de comprimento total knob-hole correspondentes, ou seja sem repulsão de carga, deve ser favorecida nessas condições, pois as interfaces de cadeia pesada de comprimento total (CH3) de anticorpo são perfeitas. Assim, as cadeias pesadas de comprimento total do bsAb formado permanecem associadas com preferência sobre a reformação das moléculas 2/3-IgG parcialmente imperfeitas (sem correspondência de carga). Assim, uma interface CH3 parcialmente desestabilizada (repulsa de carga) projetada é um parâmetro-chave para reações bem-sucedidas de troca de cadeia direcionada.

[419] A desestabilização parcial da interface Fc, especialmente a interface CH3-CH3, pode ser alcançada pela mutação de resíduos CH3 do MHCFCcRP, mantendo os resíduos de interação na cadeia pesada do anticorpo de comprimento total.

[420] Mutações exemplares que podem ser introduzidas no domínio CH3 do MHCFCcRP que afetam a interface cadeia pesada de comprimento total de anticorpo:: MHCFCRP são fornecidas na Tabela a seguir. Posição (numeração EU) mutação(ões) perturbadora(s) 345E R 357E S ou A ou L ou F ou K 360K SouE

Posição (numeração EU) mutação(ões) perturbadora(s) 392K EouD 394T !

[421] Algumas das mutações incluem trocas que colocam cargas alteradas na interface. As mutações de carga enfraquecem ou quebram os pares de cargas estabilizantes existentes anteriormente ou resultam em efeitos de repulsão ou em ambos.

[422] Da mesma forma, aminoácidos com cadeias laterais de tamanhos diferentes podem ser introduzidos para gerar efeitos de repulsão estérica. Tais mutações enfraquecem ou interferem nas interações hidrofóbicas existentes da interface ou geram obstáculos estéricos, ou combinam ambas.

[423] Mutações que parcialmente desestabilizam por meio de carga e/ou efeitos estéricos também podem ser combinadas entre si.

[424] Além disso, um primeiro 2/3-I9G que contém cargas e/ou alterações estéricas introduzidas em seu MHCFCRP pode ser combinado com um segundo 2/3-I9G que contém cargas e/ou alterações estéricas diferentes introduzidas em seu MHCFCRP que correspondem àquelas do MHCFCcRP do primeiro 2/3-lgG.

[425] Os 2/3-IgGs, bem como os bsAb resultantes são montados de maneira na qual os domínios CH3 pareados possuem mutações knob de um lado e mutações hole no outro. Portanto, a retromutação (back-mutation) para a composição tipo selvagem dos resíduos knob ou hole do MHCFCcRP também geram perturbações de interface. Tais combinações de domínios CH3 knob ou hole domínios tipo selvagem estão listados na Tabela a seguir. 349C* Y 368A L CH3 knob posição (numeração EU) retromutação perturbadora

[426] Estas — retromutações = podem ser aplicadas para desestabilizar parcialmente a interface CH3- CH3. Estas retromutações também podem ser aplicadas em combinação com outras mutações perturbadoras incluindo àquelas descritas na tabela anterior.

[427] Todas as mutações individuais parcialmente perturbadoras ou combinações de mutações, como descrito acima, também podem ser escolhidas de maneira que elas desestabilizam parcialmente os 2/3-l9G, e ainda estabilizam um heterodímero knob-MHCFCRP::hole-MHCFCRP, como segundo produto da reação de troca, e, desse modo, deslocando o equilíbrio da reação para o lado do produto (reação de troca).

EXEMPLO 13 PROJETO DE 2/3-IGGS QUE PERMITEM O DIRECIONAMENTO COM PORÇÃO “NÃO ANTICORPO' E REAÇÃO DE TROCA DE CADEIA

[428] A reação de troca de acordo com a presente invenção utiliza a mutações da interface entre entidades CH3 knob e hole para conduzir as reações de troca de cadeia. A Figura 18 demonstra o princípio: a interação de duas moléculas, cada uma com heterodímeros da cadeia H compostos por interfaces Fc 'imperfeitas' trocam suas cadeias H para formar duas novas entidades, cada uma com interfaces da cadeia H-H 'perfeitas'. Este princípio pode ser aplicado para gerar grandes variedades e formatos de anticorpos biespecíficos, por exemplo, para fins de triagem.

[429] A unidade de haste pode ser usada com qualquer ligante, como por exemplo, porções que não sejam anticorpos. Foi projetada uma molécula que contém uma unidade de ligação “não anticorpo, um affibody que visa a molécula HER2 (ZHER2: 342; Orlova et al., Cancer Res. 66 (2006) 4339- 4348), substituindo a unidade de ligação Fab convencional nos 2/3-IgG. As sequências de aminoácidos das duas cadeias polipeptídicas são SEQ ID NO: 83 e 84. O princípio de acordo com a invenção se aplica também neste caso e é especificamente para esta reação de troca mostrada na Figura 19.

[430] As moléculas foram produzidas conforme descrito no Exemplo 2 e a reação de troca foi realizada conforme descrito no Exemplo 3.

[431] Mais detalhadamente, as sequências para expressão foram geradas por síntese genética ou mutagênese e foram clonadas em plasmídeos de expressão baseados no promotor CMV. As construções abrigavam o ligante affibody Her2 em suas entidades de ligação que foram submetidas à reação de troca de cadeia de acordo com a invenção.

[432] A expressão transitória foi realizada em células FreeStyleº 293-F (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HEK293-F (Invitrogen) crescendo em suspensão em um frasco sob agitação em meio de expressão sem soro FreeStyle 293º (Invitrogen) foram transfectadas com o respectivo plasmídeo de expressão e 293-fectinº (Invitrogen). Para um frasco de agitação de 2 L (Corning) as células HEK293-F foram semeadas a uma densidade de 1 x 10º células/ml. em 600 mL e incubadas a 120 rpm, 8% de CO>2. No dia seguinte, as células são transfectadas a uma densidade celular de aproximadamente 1,5*106 células/mL com aproximadamente 42 mL de uma mistura de 20 mL de meio Opti-MEM (Invitrogen) com 600 ug de DNA plasmidial total (1 ug/mL) e 20 mL de meio Opti-MEM + 1,2 mL de 293-fectin (2 ul/mL). Adicionou-se solução de glicose em bolus e uma solução de alimentação durante o curso da expressão de acordo com o protocolo do fabricante. As proteínas montadas corretamente foram secretadas nos sobrenadantes da cultura. O sobrenadante foi coletado 6 dias após a transfecção.

[433] A purificação da proteína contendo o anticorpo foi realizada por cromatografia de afinidade usando a resina de purificação completeº His- Tag (Roche, Suíça), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho Superdex 200 (GE Healthcare, Suécia). Resumidamente, o sobrenadante da cultura de células esterilizado por filtração foi capturado na resina de purificação completeº His-Tag equilibrada com 50 mM de Na2HPO. e 300 mM de NaCl, pH 7,4, que foi lavada com tampão de equilíbrio e eluída com 50 mM de Na2HPO. e 300 mM de NaCl e 250 mM de imidazol, pH 7,4. As frações proteicas eluídas foram reunidas, concentradas para 2 mL de volume total usando dispositivos de ultrafiltração Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech SA, França) e posteriormente purificadas por cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna Superdex 200 16/60 GL (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0. As frações contendo proteínas foram reunidas, concentradas até à concentração necessária e armazenadas a -80ºC.

[434] A pureza e a composição correta são mostradas na Figura (perfil SEC após purificação por afinidade) e na Figura 21 (SDS-PAGE do material purificado). O rendimento da produção foi comparável a outros 2/3- IgGs contendo Fab (5,8 mg/L de cultura).

[435] A reação de troca de acordo com a presente invenção foi realizada com a proteína que carregava a fração não anticorpo' affibody. Portanto, a proteína foi misturada com uma molécula de pró-fármaco direcionada a LeY (veja a Figura 19 para o esquema de reação de troca) a 2

UM cada, em um volume total de 300 ul em histidina 20 MM, NaCl 140 mM, pH 6,0, seguido de 1 h de incubação a 37ºC.

[436] A reação de troca bem-sucedida de acordo com a presente invenção das entidades pró-droga em moléculas de ligação funcionais foi demonstrada por ELISA. O princípio do ensaio ELISA é exibido na Figura 22. Os reagentes carregam marcadores His-tag, mas ainda não possuem uma entidade funcional de ligação ao antígeno, ou seja, ligação à biotina. Somente após a troca de cadeia, é formado o sítio de ligação para a biotina (par VH/VL, Fv antibiotina), que é um sítio de ligação funcional e permite a captura de Bio- Cy5 e a detecção de sinal fluorescente. Para o ensaio ELISA as amostras foram diluídas a 1 UM de concentração da proteína reagente em PBS 1x com albumina sérica bovina a 1% (p/v), aplicada a 100 ul em placas de 96 poços Black Pierceº Nickel Coated (Thermo Fisher Scientific, EUA) e incubados por uma hora em temperatura ambiente. Após a lavagem três vezes com 250 ul de tampão PBST (1xPBS + 0,05% de Tween 20), foram adicionados 100 uL de 100 ng/ml de conjugado de biotina-Cy5 em PBST. Em seguida uma incubação durante uma hora em temperatura ambiente foi realizada. Após a lavagem por quatro vezes com 250 ul de tampão PBST, foram adicionados 100 ul de PBST a cada poço. A fluorescência do Cy5 foi medida em um comprimento de onda de emissão de 675 nm (excitação a 647 nm) em um leitor Tecan Infinite M200 Pro. A Figura 23 mostra os resultados do ELISA e revela uma troca bem sucedida da cadeia e ativação do Fv de ligação a partir de entidades pró-droga inativas. Isso demonstra que porções que não são anticorpos podem ser usadas na reação de troca de acordo com a invenção e, portanto, para a ativação de pró-droga.

EXEMPLO 14 CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM NÍQUEL.

[437] A remoção do material de partida que não reagiu, bem como do produto de troca contendo a histidina, pode ser realizada utilizando cromatografia de afinidade com níquel.

[438] A cromatografia de afinidade com níquel foi realizada usando colunas de spin HisPurº Ni-NTA de 0,2 mL (ThermoScientific) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de reações brutas da reação de troca foi aplicada à coluna equilibrada. Para maior contato entre a amostra e o material de afinidade à base de agarose, as colunas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente. Opcionalmente, as colunas podem ser giradas durante a incubação. O material não ligado foi eluído por centrifugação no modo de fluxo passante com tampão de lavagem. Após a lavagem por três vezes, o material ligado foi eluído usando o tampão de eluição de acordo com as instruções do fabricante.

EXEMPLO 15 EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE 2/3-IGGs com FAB ESTENDIDO DE ACORDO COM À

INVENÇÃO

[439] A expressão de 2/3-lgGs com Fab estendido foi alcançada por cotransfecção de plasmídeos que codificam cadeia leve com Fab estendido, a cadeia pesada com Fab estendido (com mutações knob ou hole) e MHCFCcRP (knob ou hole) correspondente em células de mamíferos (por exemplo, HEK293) por meio de tecnologias do estado da técnica.

[440] Em mais detalhes, por exemplo, para a produção de 2/3- IgGs com Fab estendido por transfecção transitória (por exemplo, em células HEK293) foram aplicados plasmídeos de expressão com baseados em uma organização cDNA com ou sem o promotor CMV-Íntron A, ou em uma organização genômica com um promotor CMV. O plasmídeo continha uma cassete de expressão para a cadeia pesada com Fab estendido e um cassete de expressão para as duas cadeias leves.

[441] Além do cassete de expressão do anticorpo, os plasmídeos continham: - uma origem de replicação que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, - umgene f-lactamase que confere resistência à ampíicilina em E. coli, e - o gene da di-hidrofolato redutase de Mus musculus como marcador selecionável em células eucarióticas.

[442] A unidade de transcrição de cada gene do anticorpo foi composta pelos seguintes elementos: - —sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 5' - o facilitador (enhancer) e promotor precoce de expressão imediata do citomegalovírus humano, - “seguido pela sequência Íntron A no caso da organização cDNA, - uma região 5'-não traduzida de um gene de anticorpo humano, - “uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina, - —a respectiva cadeia de anticorpo humano como cDNA ou em organização genômica (a organização éxon-íntron de imunoglobulina é mantida), - uma região 3' não traduzida com uma sequência sinal de poliadenilação, e - —sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 3'.

[443] Os genes de fusão foram gerados por PCR e/ou síntese gênica e montados com métodos e técnicas recombinantes conhecidos pela conexão dos segmentos de ácido nucleico, por exemplo, utilizando sítios de restrição únicos nos respectivos plasmídeos. As sequências de ácido nucleico subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Para transfecções transitórias grandes quantidades de plasmídeos foram preparadas pela preparação de plasmídeo a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

[444] As técnicas de cultura de células estabelecidas foram usadas conforme descritas em “Current Protocols in Cell Biology", Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. (2000).

[445] Os 2/3-lgGs com Fab estendido foram gerados por transfecção transitória com o respectivo plasmídeo, usando o sistema HEK293- F (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HEK293-F (Invitrogen) crescendo em suspensão ou em um frasco sob agitação ou em um fermentador agitado em meio de expressão sem soro “FreeStyle 293” (Invitrogen) foram transfectadas com o respectivo plasmídeo de expressão e 293fectinº ou fectina (Invitrogen). Para um frasco de agitação de 2 L (Corning) as células HEK293-F foram semeadas a uma densidade de 1 x 10º células/ml em 600 mL e incubadas a 120 rpm, 8% de CO». No dia seguinte, as células são transfectadas a uma densidade celular de aproximadamente 1,5*106 células/ml. com aproximadamente 42 mL de uma mistura de A) 20 mL de meio Opti-MEM (Invitrogen) compreendendo 600 ug de DNA plasmidial total (1 pug/mL) e B) 20 mL de meio Opti-MEM + 1,2 mL de 293fectin ou fectina (2 ul/mL). A solução de glicose foi adicionada de acordo com o consumo de glicose durante o curso da fermentação. Os 2/3-IgGs com Fab estendido montados corretamente foram secretados nos sobrenadantes de cultura como IgGs padrão. O sobrenadante contendo os 2/3-lIgGs com Fab estendido secretados foi coletado depois de 5-10 dias e os 2/3-lgGs com Fab estendido foram purificados diretamente a partir do sobrenadante ou o sobrenadante foi congelado e armazenado.

[446] Como os 2/3-lgGs com Fab estendido contém uma região

Fc, eles foram purificados mediante a aplicação de cromatografia de afinidade em proteína A.

[447] Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes da cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando MabSelectSure- Sepharose* (GE Healthcare, Suécia) e cromatografia de exclusão por tamanho Superdex 200.

[448] Resumidamente, os sobrenadantes de cultura de células estéreis por filtração foram capturados em uma resina MabSelectSuRe equilibrada com tampão PBS (Na2HPO4s 10 MM, KH2PO4s 1 MM, NaCl 137 mM e KCl 2,7 mM, pH 7,4), lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com citrato de sódio 25 mM em pH 3,0. As frações eluídas de 2/3-I9Gs com Fab estendido anticorpo foram reunidas e neutralizadas com 2 M de Tris, pH 9,0. As frações agrupadas (pools) foram adicionalmente purificadas por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0. As frações contendo os 2/3-lgGs com Fab estendido foram reunidas (em pools), concentradas até a concentração desejada utilizando dispositivos de ultrafiltração Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech SA, França) e armazenadas a - 80ºC.

[449] A pureza e integridade foram analisadas depois de cada etapa de purificação por CE-SDS utilizando a tecnologia microfluídica LabChip (Caliper Life Science, EUA). Foi preparada uma solução de proteína (5 uL) para análise CE-SDS usando o kit HT Protein Express Reagent de acordo com as instruções do fabricante e analisadas no sistema LabChip GXII utilizando um chip “HT Protein Express Chip'. Os dados foram analisados usando o software LabChip GX .

[450] Os seguintes 2/3-lgGs com Fab estendido exemplares foram produzidos pela coexpressão dos plasmídeos correspondentes da cadeia L, cadeia H e MHCFCRP: anti-fluoresceína-anti-CD3-2/3-IgG-knob-cys + anti-biotina-E357K-hole-MHCFCRP. O cromatograma SEC correspondente é mostrado na Figura 27. O teor de monômero de acordo com a SEC foi de 93,4%. O teor de monômero de acordo com a CE-SDS foi de 100%. A massa foi confirmada por MS. EXEMPLO 16 GERAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS (BSABS) POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3- IGG com 2/3-IGGs com FAB ESTENDIDO COMO MATERIAL DE PARTIDA

[451] Os 2/3-l9G com Fab estendido que contêm duas cadeias leves, uma cadeia pesada e MHCFCRP, foram gerados como heterodímero KiH: cadeia pesada-knob de comprimento total::UHCFCRP-hole. Os 2/3-I9G com Fab estendido é um pouco “defeituoso”, pois o MHCFCRP contém uma mutação de carga sem carga correspondente na contraparte de cadeia pesada de comprimento total. Os polipeptídeos que compõem os 2/3-lgGs defeituosos, no entanto, são capazes de se reorganizar em anticorpos biespecíficos com cargas correspondentes (pareadas). A cadeia pesada de comprimento total (knob) dos 2/3-lIgG com Fab estendido 'A' e a cadeia pesada de comprimento total (hole) dos 2/3-IgG “B' formam um heterodímero correspondente (pareado). Os heterodímeros correspondentes (pareados) também se formam quando o MHCFCRP (hole-carga) interage com o MHCFCRP (knob-carga). Assim, as reações de troca com base na separação temporária de heterodímeros de partida de dois 2/3-lg9Gs diferentes resultam em produtos que contêm preferencialmente heterodímeros com correspondência (carga). As reações de troca, portanto, convertem dois 2/3-l9Gs monoespecíficos em uma IgG biespecífica e um heterodímero MHCFCcRP: 2/3-I9G com Fab estendido-His6(8) + 2/3-IgG-His6(8) — bsAb(AB) + Fc-His6(8)

[452] A reação de troca foi iniciada por uma etapa de redução (por exemplo, aplicando 2-MEA ou TCEP em várias concentrações) para quebrar especialmente as ligações de bissulfeto intercadeia da região de dobradiça. O rearranjo de cadeia ocorre espontaneamente a partir de então.

[453] O procedimento para as três reações de troca com os 2/3- IgG com Fab estendido, como mostrado na Figura 26, foi o seguinte:

[454] Misturou-se 1 mg de 2/3-lgG com Fab estendido (dA) com 1 mg do respectivo formato 2/3-lgG (nB ou cB ou ncB) em tampão PBS 1x em um volume total de 2 mL. 16x equivalentes molares de TCEP em tampão PBS 1x foram adicionados à mistura. As amostras foram incubadas por uma hora a 37ºC e sob agitação a 350 rpm. Após o tempo de incubação, as amostras foram purificadas em colunas cromatográficas NINTA (HisCompleteº, Roche, Suíça) e anticorpos biespecíficos reunidos foram coletados no fluxo. O fluxo foi adicionalmente incubado durante a noite em temperatura ambiente. As amostras foram então analisadas pelos métodos analíticos de SEC, CE-SDS e espectroscopia de massa.

[455] Os resultados da reação de troca são apresentados na tabela a seguir: Anticorpo biespecífico rend. |SEC CE-SDS <FITC> = anti-FITC Fab [%] monômero — monômero (sem <CD3> = anti-CD3 Fab [%] redução) <Biotina> = anti-biotina Fab [%] HC = cadeia pesada <FITC><CD3>-knob-HC (dA) 44,7 confirmado <Biotin>-hole-n-HC (nB) <FITC><CD3>-knob-HC (dA) 14 94 43,4 confirmado <Biotina>-hole-nc-HC (ncB) <FITC><CD3>-knob-HC (dA) 17 93 48,5 confirmado <Biotina>-hole-c-HC (cB)

[456] A ligação à biotina e ao FITC foi investigada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento BlAcore T200 (GE Healthcare). Todos os experimentos foram realizados a 25ºC usando HBS- P (10 mM de HEPES, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) como tampão de corrida e diluição. Os anticorpos anti-Fc humana (GE Healthcare *

BR100839) foram imobilizados em um Chip Sensor CM5 Série S (GE Healthcare % 29104988) usando a química padrão de acoplamento de amina. Os anticorpos biespecíficos foram capturados sobre a superfície seguido por injeções consecutivas de uma proteína marcada com biotina ou FITC (uma vez com a primeira marcada com biotina e a segunda marcada com FITC e uma vez com a primeira marcada com FICT e a segunda marcada com biotina). À associação foi monitorada por 60 segundos, dissociação por 120 segundos em concentrações de 10 pg/ml cada. A superfície foi regenerada através da injeção de MgCl2 a 3M durante 60 segundos. Diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida a partir de uma superfície da amostra simulada (branco). As injeções da amostra em branco são subtraídas (= dupla referenciação). Dois sensorgramas SPR exemplares o anticorpo biespecífico <FITC><CD3>-Knob-HC (dA)+<Biotina>-Hole-nc-His (ncB) é mostrado na Figura 28 (os dois sensorgramas representam primeira adição de biotina, segunda adição de FITC e primeira adição de FITC e segunda adição de biotina). Os resultados para todas as combinações são mostrados na tabela a seguir: Anticorpo biespecífico <Biotina>-hole-n-HC (nB) <Biotina>-hole-nc-HC (ncB) <Biotina>--hole-c-HC (cB)

[457] Todas as moléculas de partida, todos os subprodutos não desejados, bem como todos os agregados que foram potencialmente gerados durante as reações de troca carregavam marcadores de afinidade (His6 ou His8). Os anticorpos biespecíficos desejados produzidos na reação de troca é a única molécula que não carrega um marcador His-tag. Portanto, uma simples etapa de absorção de NINTA pode ser aplicada para remover todas as moléculas indesejadas. O anticorpo biespecífico restante a partir do fluxo pode ser aplicado diretamente em procedimentos de triagem e análise para identificar anticorpos biespecíficos com funcionalidades desejadas. EXEMPLO 17 MARCADORES (TAGS) ALTERNATIVOS PARA À PURIFICAÇÃO APÓS A REAÇÃO DE

TROCA

[458] O marcador EPEA C-tag (SEQ ID NO: 87) foi utilizado em vez do marcador poli-histidina nestes experimentos para mostrar que a reação de troca não é influenciada pelo marcador utilizado.

[459] 2/3-lgGs como àqueles do Exemplo 6 foram expressos e purificados utilizando um marcador C-tag com ligante curto (SEQ ID NO: 88) fundido ao respectivo terminal. Os resultados da produção e purificação desses 2/3-lgGs são mostrados na tabela a seguir. 2/3-IgG Rendimentos |SEC pico dejCE-SDS Espectrometria após a|monômero [%] |monômero[%] |de massa purificação [mg/L]* Fluo-knob-n-HC + 64,3 95,1 confirmado hole- MHCFCRP(E357K)-C- Tag Biotina-hole-n-HC + 110,0 95,7 93,6 confirmado knob- MHCFCRP(K370E)-C- Tag Fluo-knob-c HC + 52,1 95,5 98,4 confirmado hole- MHCFCRP(E357K)-C- Tag Fluo-knob-nc HC + 23,4 96,1 95,6 confirmado hole- MHCFCRP(E357K)-C- Tag Biotina-hole-c HC + 83,5 88,5 89,0 confirmado knob- MHCFCRP(K370E)-C- Tag Biotina-hole-nce HC + — [33,5 98,5 98,0 confirmado knob- MHCFCRP(K370E)-C- Tag

[460] A reação de troca foi realizada da seguinte forma:Cada 300 ul dos respectivos 2/3-IgGs de partida (c=1 mg/mL; total 600 uL) foram misturados. Foi adicionado TCEP em um excesso molar de 15x. A amostra foi incubada a 37ºC e 400 rpm. Misturou-se 360 ul da amostra com 200 uL de resina C-tag (Thermo Scientific; 50% de pasta lavada com PBS 1xpH 74)ea mistura foi incubada em uma coluna de copo rotativo por 60 min em temperatura ambiente e agitação a 800 rpm. Após a incubação, a coluna de centrifugação foi centrifugada por 5 min em temperatura ambiente, 800 rpm e o fluxo foi coletado. A resina foi lavada várias vezes com PBS 1x, pH 7,4 (100 ul e subsequente etapa de centrifugação). Após a lavagem, a resina da amostra a foi misturada com 100 ul de tampão HCI pH 2,6 e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente e agitação a 800 rpm. O eluato foi gerado por centrifugação por 5 min em temperatura ambiente e 800 rpm).

[461] Os cromatogramas CE-SDS não reduzidos para uma reação de troca exemplar de 2/3-lgG A (Fluo-knob-n-HC + hole-MHCFcRP (E357K)-C-Tag) com 2/3-lgG B (biotina-hole-n-HC + knob-MHCFCRP (K370E)- C-Tag) são mostrados na Figura 29. Pode ver-se que o anticorpo biespecífico se forma e pode ser coletado no fluxo passante (flow-through). O MHCFcRP marcado (C-tagged) é ligado após a reação de troca com a resina C-tag e pode ser eluído a partir daí. Assim, uma separação e purificação é alcançada.

EXEMPLO 18 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3 DE IeGs (2/3-l6G) SEM REDUÇÃO

[462] A troca de cadeias com bissulfeto região Fc contendo 2/3- IgGs requer a redução como etapa inicial para permitir a separação da cadeia e a subsequente remontagem para formar os anticorpos biespecíficos desejados. Para evitar a etapa de redução e as reações colaterais associadas, como as 2/3-lgGs também contêm ligações de bissulífeto não articuladas

(embaralhamento de bissulfeto), foram gerados 2/3-lIgGs sem bissulfetos entre a cadeia H Fc e o MHCFCRP Fc. Isto foi conseguido através da mutação das cisteínas responsáveis pela formação de ligações de bissulfeto de dobradiça nas metades knob e hole de anticorpo, bem como das cadeias knob- e hole- MHCFCRP. As cisteínas-CH3 que formam as ligações de bissulfetos intercadeias associadas ao KiH entre as metades de anticorpos também foram removidas.

[463] Para eliminar as duas cisteínas que formam bissulfetos de intercadeia H-H, os derivados de IgG: sem bissulfetos intercadeia na dobradiça foram gerados trocando as duas cisteínas em sua cadeia H da região de dobradiça por serina. Assim, a sequência da região de dobradiça da IgG 1 tipo selvagem... HTCPX CP... (SEQ ID NO: 31) foi alterada para codificar... HTSPXSP... (SEQ ID NO: 85).

[464] Outra entidade sem bissulfetos intercadeia da dobradiça foi gerada pela exclusão de todo o trecho da sequência da região de dobradiça que contribui para a formação de ligações de bissulfeto intercadeia. Portanto, a sequência CPPC da região de dobradiça da IgG 1 normal foi excluída para gerar uma dobradiça mais curta com a sequência... HTPAPE... (SEQ ID NO: 86).

[465] A Figura 25 mostra que a substituição de cisteínas por serinas gera anticorpos que - devido à liberação de bissulfetos da dobradiças de outra forma restritivos - têm uma distância de extensão estendida.

[466] A expressão de 2/3 IgGs sem ligações de bissulfeto intercadeia HC-HC foi alcançada cotransfectando células de mamífero com plasmídeos de expressão acionados pelo promotor CMV da mesma maneira que foi descrita acima para entidades contendo bissulfeto. A transfecção transitória para células HEK293 de plasmídeos de expressão leva à coexpressão de 2/3-lgGs direcionada pelo promotor CMV, montagem em compartimentos secretórios e subsequente secreção no sobrenadante de cultura.

[467] Os 2/3 lgGs sem bissulfetos intercadeia HC-HC foram secretados em sobrenadantes de cultura celular e continham regiões Fc, bem como cadeias L kappa. Eles foram, portanto, purificados capturando em uma primeira etapa de proteína A ou KappasSelect. Foi utiizada uma etapa subsequente de separação de acordo com o tamanho por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Este protocolo em duas etapas permitiu a recuperação eficiente dos derivados de 2/3 IgG a partir de sobrenadantes de cultura de células de uma maneira robusta e eficaz, com rendimentos semelhantes aos observados com anticorpos padrão.

EXEMPLO 19 GERAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3-IGG SEM

REDUÇÃO

[468] Os 2/3-lgGs que contêm uma cadeia leve, uma cadeia pesada e a região Fc complementar foram gerados em dois tipos de heterodímeros KiH: cadeia pesada knob::região Fc hole correspondente e cadeia pesada hole::região Fc knob correspondente. Ambos os tipos de 2/3 IgG são 'defeituosos' pois a região Fc complementar contém mutações de carga que não pareia corretamente com as contrapartes de cadeia H. Os polipeptídeos que compõem os 2/3-lgGs defeituosos, no entanto, são capazes de se rearranjar em heterodímeros perfeitos: cadeia pesada (knob) dos 2/3-IlgG 'A' e a cadeia pesada (hole) dos 2/3-I9G “B' formam um heterodímero perfeito. Os heterodímeros perfeitos também são formados quando a região Fc complementar (carga hole) interage com a região Fc complementar (carga knob). Assim, as reações de troca baseadas na separação temporária de heterodímeros de partida de dois tipos diferentes de 2/3-lI9G resultam em produtos que contêm preferencialmente heterodímeros perfeitos. As reações de troca, portanto, convertem dois 2/3-l9gGs monoespecíficos em uma IgG biespecífica e um heterodímero de região Fc complementar.

[469] A reação de troca dos 2/3-lgGs originais que contêm CH3- knob-hole e/ou bissulfetos intercadeias da região de dobradiça deve ser iniciada por uma etapa de redução, como mostrado nos exemplos anteriores. Os agentes redutores como o TCEP são adicionados para romper as ligações de bissulfeto, e depois ocorre o rearranjo de cadeias. Por outro lado, os derivados de 2/3-l9G sem ligações de bissulfeto HC-HC intercadeia não necessitam de uma etapa de redução para iniciar a troca de cadeias, pois suas cadeias H não estão interconectadas por ligações de bissulfeto.

[470] Para analisar se, e em que grau, a conversão de 2/3-lgGs em bsAbs depende da redução inicial, foram realizadas reações de troca de 2/3-l9Gs (com e sem ligações de bissulfetos intercadeia) com e sem redução. Os 2/3-IlgGs monoespecíficos monovalentes que se ligam a bio ou fluos (descritos —acima) foram utilizados como moléculas de entrada. Consequentemente, as reações de troca geram bsAbs biespecíficos bivalentes que se ligam à Bio e Fluos. A formação e a funcionalidade biespecífica dos bsAbs gerados foram avaliadas por um ensaio ELISA em ponte, conforme descrito acima. O ELISA em ponte consistiu na adição da mistura de reação de troca ao Fluos-BSA imobilizado, seguido pelas etapas de lavagem e subsequente adição de Bio-Cy5 à sonda para avaliar a presença do segundo braço de ligação do anticorpo biespecífico. Somente os anticorpos biespecíficos funcionais montados corretamente são retidos pelo braço de ligação à Fluos na placa de ensaio e geram sinais capturando e retendo Bio- Cy5 e, assim, gerando sinais do ensaio. Moléculas de entrada monoespecíficas ou moléculas 'falsas' sem biespecificidade não geram sinais, pois ou elas ou não se ligam à placa (apenas ligante de bio) ou elas não podem capturar o gerador de sinal bio-Cy5 (apenas ligante de fluos).

[471] A Figura 24 mostra os resultados dessas análises de ELISA em ponte de reações de troca com moléculas parentais (contendo bissulfeto intercadeia) e moléculas 2/3-lgG que carecem das ligações de bissulfeto intercadeia H-H com e sem a etapa de redução inicial.

Braço de ligação à fluos na placa de ensaio gera sinais capturando e retendo o Bio-Cy5 e, assim, gera os sinais de ensaio.

Moléculas de entrada monoespecíficas ou moléculas 'falsas' sem biespecificidade não geram sinais, pois ou elas ou não se ligam à placa (apenas ligante de bio) ou elas não podem capturar o gerador de sinal bio-Cy5 (apenas ligante de fluos). A Figura 24 mostra os resultados dessas análises de ELISA em ponte de reações de troca com moléculas parentais (contendo bissulfeto intercadeia) e moléculas 2/3-I9G que carecem das ligações de bissulfeto intercadeia H-H com e sem a etapa de redução inicial.

Observamos que a redução inicial era essencial para permitir a troca de cadeias por 2/3-lgGs que contêm bissulfetos na dobradiça.

Esses 2/3-lgGs com bissulfetos na dobradiça foram convertidos em anticorpos biespecíficos somente quando a troca é iniciada por redução.

Em contrapartida, a geração eficaz de anticorpos biespecíficos foi alcançada aplicando os 2/3-lgGs sem bissulfetos intercadeia na dobradiça (e CH3). A troca de cadeias dessas moléculas gera anticorpos biespecíficos sob condições de redução da mesma maneira como descrito acima para moléculas de entrada com dobradiças conectadas.

Entretanto, uma reação de redução inicial não era essencial para a troca de cadeia produtiva dessas moléculas, pois a troca de cadeia produtiva também ocorria sem a redução inicial, ou seja, na ausência de um agente redutor.

Assim, a remoção de bissulfetos intercadeias Fce-Fc eliminou a necessidade de uma etapa de redução inicial.

Os anticorpos biespecíficos resultantes são mantidos juntos sem ligações de bissulfeto intercadeia da região dobradiça.

Assim, a formação eficaz de anticorpos biespecíficos ocorre ao combinar os 2/3-lgGs livres de bissulfetos de dobradiça de maneira espontânea e a etapa de redução para o início da reação de troca pode ser dispensada ao se utilizar 2/3-lgGs sem ligações de bissulfeto de cadeia HC- HC. EXEMPLO 20

REAÇÕES DE TROCA DE CADEIA SÃO DEPENDENTES DA CONCENTRAÇÃO

[472] O condutor para a conversão de 2/3-lgGs em anticorpos biespecíficos é uma interface 'parcialmente defeituosa' projetada entre as regiões Fc. Essa interface especial é resultado de mutações introduzidas nos domínios CH3-knob ou -hole da molécula Fe MHCFCRP. Os domínios CH3 mutados se associam aos parceiros knob ou hole correspondentes (“normais”) durante a expressão dos 2/3 IgGs. Essas moléculas também possuem estabilidade suficiente para apresentar os 2/3-IgGs e também moléculas sem tendências indesejadas de agregação. A reação de troca produtiva em cadeia que leva a anticorpos biespecíficos ocorre quando dois 2/3-lgGs complementares se aproximam e os pares cadeia-H::MHCFCRP são parcialmente liberados um ao lado do outro. A remontagem das cadeias H knob-hole para formar anticorpos biespecíficos sem mutações desestabilizadoras é favorecida nessas condições, pois essas interfaces de cadeia H (CH3) combinam melhor. Assim, as cadeias de produtos de anticorpos biespecíficos permanecem associadas com preferência para a reformação das moléculas de entrada 2/3-lgGs parcialmente imperfeitas. Devido a isso, uma interface CH3 parcialmente desestabilizada projetada é um parâmetro-chave para reações bem-sucedidas de troca de cadeia direcionada. A desestabilização parcial da interface Fc pode ser alcançada através da mutação de resíduos CH3 da cadeia MHCFCRP como descrito anteriormente na presente invenção.

[473] Outro requisito essencial (além de interfaces parcialmente desestabilizadas) para que ocorram reações de troca é que dois 2/3-lgGs complementares devem estar próximos para permitir a troca de cadeias. À probabilidade das entidades se aproximarem, por sua vez, deve depender de suas concentrações na reação de troca.

[474] As reações de troca foram estabelecidas em condições não redutoras aplicando 2/3-lIgGs de ligação à Bio e Fluos sem ligações de bissulfeto intercadeia HC-HC em diferentes concentrações. Após a conclusão da reação de troca, todas as misturas de reação foram levadas a uma 'concentração de eduto igual' diluindo com amostras de tampão de troca com concentrações de eduto mais altas que as da amostra experimental mais baixa. O ELISA em ponte foi subsequentemente aplicado para determinar a quantidade relativa de bsAb funcional em cada amostra experimental. Como quantidades idênticas de edutos estão presentes nas amostras alinhadas à diluição, a independência da concentração resultaria em valores ELISA iguais/semelhantes em todas as amostras. De forma inversa, sinais consecutivamente aumentados com concentrações mais elevadas de eduto na reação indicariam troca de cadeia dependente da concentração. Os resultados dessas análises revelaram que os sinais de ELISA atingiram um platô nas reações que continham concentrações de eduto > 2 UM. Assim, nessas concentrações e acima delas, as concentrações dos edutos têm apenas um efeito limitado na eficácia da reação de troca. Concentrações mais baixas de eduto geraram sinais de ELISA que reduziram de maneira dependente da dose. Assim, abaixo de certo limiar, a geração de bsAb por troca é significativamente influenciada pela concentração de eduto devido à probabilidade reduzida de que interação do eduto ocorra. Os resultados são exibidos na Figura 30. =—."wÀ—=-= o?

25-96 6 es “== fo8 a a fes

0.4 o.2 EXEMPLO 21 GERAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS (BSABS) POR REAÇÃO DE TROCA DE 2/3- IGG com 2/3-I6GGS CONTRAÍDOS COMO MATERIAL DE PARTIDA

[475] O 2/3-lgG contraído que é circular e o sítio de ligação são formados por uma primeira parte N-terminal da região Fc e uma segunda parte C-terminal da região Fc, em que a primeira e a segunda parte são associadas entre si e formam o sítio de ligação, e o MHCFCRP foi gerado como heterodímero KiH: cadeia pesada circular de comprimento total- knob::MHCFCcRP-hole. Os 2/3- IgGs contraídos são de certa forma 'defeituosos' pois o MHCFCRP carece da cisteína CH3 adicional necessária para formar ligações de bissulfeto intercadeias para a cadeia pesada, e o MHCFcRP contém mutações sem carga sem na contraparte correspondente de cadeia pesada de comprimento total. Os polipeptídeos que compõem os 2/3-lgGs defeituosos, no entanto, são capazes de se reorganizar em anticorpos biespecíficos com cargas correspondentes (pareadas). A cadeia pesada de comprimento total ou de comprimento total contraído (knob-cys) dos 2/3-I9G 'A' e a cadeia pesada de comprimento total ou de comprimento total contraído (hole-cys) dos 2/3-l9G 'B' formam um heterodímero correspondente (com cadeias pareadas). Os heterodímeros correspondentes (pareados) também se formam quando o MHCFCRP (hole-carga) interage com o MHCFCRP (knob- carga). Assim, as reações de troca com base na separação temporária de heterodímeros de partida de dois 2/3-lgGs diferentes resultam em produtos que contêm preferencialmente heterodímeros com correspondência (carga). As reações de troca, portanto, convertem dois 2/3-lgGs monoespecíficos em uma IgG biespecífica e um heterodímero MHCFcRP: 2/3-l9G contraído-His6(8) + 2/3-IgG-His6(8) — bsAb(AB) + Fc-His6(8)

[476] A reação de troca foi iniciada por uma etapa de redução para romper especialmente as ligações de bissulfeto intercadeia da região dobradiça. O rearranjo de cadeia ocorre espontaneamente a partir de então.

[477] O procedimento para as reações de troca como mostrado na Figura 31 foi o seguinte: 1 mg do “Formato de entrada A” foi misturado com 1 mg do “Formato de entrada B" em tampão PBS 1x em um volume total de 2 mL. 16x equivalentes molares de TCEP em tampão PBS 1x foram adicionados à mistura. As amostras foram incubadas por uma hora a 37ºC e sob agitação a 350 rpm. Após o tempo de incubação, as amostras foram purificadas em colunas cromatográficas NINTA (HisCompleteº, Roche, Suíça) e anticorpos biespecíficos reunidos foram coletados no fluxo. O fluxo foi adicionalmente incubado durante a noite em temperatura ambiente. As amostras foram então analisadas pelos métodos analíticos de SEC, CE-SDS e espectroscopia de massa.

[478] Os resultados da reação de troca são apresentados na tabela a seguir: Anticorpo biespecífico Rend. [%] SEC CE-SDS <cMET> = anti-ccMET Fab monômero [%] monômero não <Biotina> = anti-biotina Fab red. [%] < FITC> = anti-FITC Fab HC = cadeia pesada <cMET>-knob-con-HC 50,5 95,4 30,6 confirmado <Biotina>- hole-n-HC <cMET>-knob-con-HC 40 96,8 50 confirmado <Biotina>- hole-ne-HC <CcMET>-knob-con-HC 36 92,9 25,4 confirmado <Biotina>- hole-c-HC <cMET>-hole-con-HC 11 76,7 46,3 confirmado <FITC>- knob-n-HC <cMET>-hole-con-HC 10,4 77,7 40? confirmado <FITC>-knob-nc-HC

Tee TER | <CcMET> = anti-cMET Fab monômero [%] monômero — não <Biotina> = anti-biotina Fab red. [%] < FITC> = anti-FITC Fab HC = cadeia pesada [eme hole- conhe Po js 17 <FITC>-knob-c-HC see Fo ros eme <cMET>-hole-con-HC

[479] A ligação ao c-Met, biotina e FITC foi investigada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento BlAcore T200 (GE Healthcare). Todos os experimentos foram realizados a 25ºC usando HBS- P (10 MM de HEPES, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) como tampão de corrida e diluição. Os anticorpos anti-humano His-tag (GE Healthcare t28995056) foram imobilizados em um Chip Sensor CM5 Série S (GE Healthcare t 29104988) usando a química padrão de acoplamento de amina. O C-MET-Fc (Sistemas de R&D t358-MT) foi injetado na superfície, seguido pela injeção de uma proteína marcada com Biotina ou FITC a uma concentração de 10 ug/mL cada. As fases de associação e dissociação foram monitoradas por 2 min para cada evento de ligação. A superfície foi regenerada através da injeção de glicina a 10M, pH 1,5 durante 60 segundos. Diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida a partir de uma superfície da amostra simulada (branco). As injeções da amostra em branco são subtraídas (= dupla referenciação).

[480] Em uma segunda configuração, o c-MET e o anticorpo anti-Fc humano (GE Healthcare ft BR100839) foram imobilizados em um chip sensor Série S CM5. Os Contorsbodies foram injetados em ambas células de fluxo por 30 segundos a uma concentração de 10 ug/mL. A superfície foi regenerada através da injeção de MgCl2 a 3M durante 60 segundos. Diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida a partir de uma superfície da amostra simulada (branco). As injeções da amostra em branco são subtraídas (= dupla referenciação). Para avaliação, a resposta da ligação ao c-MET resultante foi normalizada pela resposta derivada da ligação ao anticorpo anti-Fc humano, um sensorgrama de SPR exemplar para o anticorpo biespecífico <cMET>-hole-con-HC (con A)+< Fluo>-knob-c-His (cB) é mostrado na Figura 33. Os resultados para todas as combinações são mostrados na tabela a seguir: Anticorpo biespecífico FITC <CcMET>-knob-con-HC ligação ligação n/a <Biotina>-hole-n-HC <CcMET>-knob-con-HC ligação ligação n/a <Biotina>-hole-nce-HC <CcMET>-knob-con-HC ligação ligação n/a <Biotina>-hole-c-HC <cMET>-hole-con-HC ligação n/a ligação <Fluo>-knob-n-HC <cMET>-hole-con-HC ligação na ligação <Fluo>-knob-nc-HC <cMET>-hole-con-HC ligação n/a ligação <Fluo>-knob-c-HC <CcMET>-knob-con-HC ligação n/a n/a <cMET>-hole-con-HC

[481] n/a indica que o respectivo sítio de ligação não está presente no anticorpo biespecífico e, portanto, nenhuma ligação pode ser esperada.

[482] Todas as moléculas de partida, todos os subprodutos não desejados, bem como todos os agregados que foram potencialmente gerados durante as reações de troca carregavam marcadores de afinidade (His6 ou His8). Os anticorpos biespecíficos desejados produzidos na reação de troca é a única molécula que não carrega um marcador His-tag. Portanto, uma simples etapa de absorção de NINTA pode ser aplicada para remover todas as moléculas indesejadas. O anticorpo biespecífico restante a partir do fluxo pode ser aplicado diretamente em procedimentos de triagem e análise para identificar anticorpos biespecíficos com funcionalidades desejadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO trocado heterodimérico, caracterizado por compreender as seguintes etapas de: - incubação de; * um primeiro polipeptídeo heterodimérico de partida, compreendendo um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio CH3 de imunoglobulina G e pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte deste; e um segundo polipeptideo — que — compreende um domínio CH3 de imunoglobulina G; em que o primeiro e o segundo polipeptídeos formam um heterodímero; e em que - o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, e - o segundo polipeptídio inclui no domínio CH3 uma outra mutação selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366l, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407|, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A3SG8L, V407Y, C354S, e W366T, em que a numeração está de acordo com o Índice EU de Kabat; e e um segundo polipeptídeo heterodimérico de partida, compreendendo um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio CH3 de imunoglobulina G e um quarto polipeptídeo que compreende um domínio CH3 de imunoglobulina G, e pelo menos um sítio de ligação funcional ou uma parte deste; em que o terceiro e quarto polipeptídeos formam um heterodímero; e em que;

- no caso do primeiro polipeptíideo compreender as mutações hole-cys, o quarto polipeptídeo compreenderá as mutações knob-cys e o terceiro polipeptídeo compreenderá as mutações hole, ou no caso do primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-cys, o quarto polipeptídeo compreenderá as mutações holecys e o terceiro polipeptídeo compreenderá as mutações knob; e

- o |terceiro polipeptídio inclui no domínio CH3 uma outra mutação selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394|l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y4071, K409D, K409E, K4091I, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A3S68L, V407Y, C354S, e W366T, em que a referida mutação adicional é diferente das mutações presentes no domínio CH3 do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo;

para trocar o segundo e o terceiro polipeptídeos para formar um terceiro polipeptídeo trocado heterodimérico, compreendendo o segundo e o terceiro polipeptídeos e um quarto polipeptídeo heterodimérico trocado, compreendendo o primeiro e o quarto polipeptídeos; e - recuperação do quarto polipeptídeo trocado heterodimérico.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreender uma mutação E357K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreender uma mutação K370E e o quarto polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo do aminoácido E com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreender uma mutação D356K, o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, o domínio CH3 do terceiro polipeptídeo compreender uma mutação K439Ee o quarto polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo do aminoácido D com as posições numeradas de acordo com o índice EU de Kabat.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender as mutações knob-Cys, o segundo polipeptídeo compreender as mutações hole, o terceiro polipeptíideo = compreender a mutação knob e o quarto polipeptídeo compreender as mutações hole-Cys.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem, cada um, na direção N-terminal para a C-terminal um domínio CH?2 de IgG: e um domínio CH3 de IgG'.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelos polipeptídeos do primeiro ao quarto polipeptídeo compreenderem ainda um domínio CH1 de IgG: e um domínio variável.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo domínio variável do primeiro polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável do quarto polipeptídeo ser um domínio variável de cadeia leve ou vice-versa; e esses domínios formam um sítio de ligação no quarto polipeptídio heterodimérico trocado.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo primeiro e segundo polipeptídeos heterodiméricos compreenderem ainda uma cadeia leve de anticorpo que está associada ao primeiro polipeptídeo e ao quarto polipeptídeo, respectivamente.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pela região de dobradiça do primeiro polipeptídeo heterodimérico de partida e a região da dobradiça do segundo polipeptídeo heterodimérico de partida compreender as mutações C226S e C2298S ou uma deleção de toda a sequência CPXC (SEQ ID NO: 89), em que a numeração está de acordo com o índice EU de Kabat.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela etapa de incubação ocorrer na ausência de um agente redutor.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo segundo polipeptídeo e pelo terceiro polipeptídeo compreender ainda um marcador (tag).

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo marcador ser um marcador (tag) C-terminal.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo marcador ter a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) e a recuperação ser realizada em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo marcador ter a sequência de aminoácidos EPEA (SEQ ID

NO: 87) e a recuperação ser feita por cromatografia em uma coluna de cromatografia de afinidade C-tag.

15. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM POLIPEPTÍDEO MULTIESPECÍFICO, caracterizado por compreender as etapas de; a) produzir uma multipliidade de polipeptídeos de troca heterodiméricos — multiespecíficos ao submeter cada combinação de um primeiro polipeptídeo heterodimérico de partida selecionado a partir de uma primeira multiplicidade de polipeptídeos heterodiméricos de partida que se ligam especificamente a um primeiro alvo e um segundo polipeptídeo heterodimérico de partida selecionado a partir de uma segunda multiplicidade de polipeptídeos heterodiméricos de partida que se ligam especificamente a um segundo alvo por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, b) medir individualmente para cada membro da multitude de polipeptídeos de troca heterodiméricos multiespecíficos produzidos na etapa a) a ligação simultânea aos dois alvos em um ensaio de ligação, e c) selecionar um polipeptideco de troca heterodimérico multiespecífico a partir da multitude de polipeptídeos de troca heterodiméricos multiespecíficos com base no resultado do ensaio de ligação e, desse modo, identificar um polipeptídeo multiespecífico.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo ensaio de ligação ser um método de ELISA ou SPR.

17. POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, caracterizado por compreender um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo formam um heterodímero, e em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítios de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação; e em que * o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações Aknob-Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole, ou o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole- Cys e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob, e * o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação adicional selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, ESS57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407l, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, C349Y, S366T, ASG68L, V407Y, C354S, e W366T, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat; e em que o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende o(s) respectivo(s) resíduo(s) de aminoácidos tipo selvagem da imunoglobulihna G em sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação adicional compreendida no domínio CH3 do segundo polipeptídeo.,

18. POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, caracterizado por compreender um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, ambos compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina G, em que o primeiro e o segundo polipeptídeo formam um heterodímero, e em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um sítios de ligação funcional ou pelo menos parte de um sítio de ligação; e em que * o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende a mutação knob e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações hole-cys, ou o domínio CH3 do segundo polipeptídeo compreende as mutações hole e o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo compreende as mutações knob-cys, e * o segundo polipeptídeo compreende no domínio CH3 uma mutação adicional selecionada a partir do grupo de mutações que consistem em E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E3S57L, ES57F, ES57K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366|, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394l, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407l, K409D, K409E, K409Il, K439E, L441Y, C349Y, S366T, A3SG68L, V407Y, C354S, e W366T, com a numeração de acordo com o índice EU de Kabat; e em que o primeiro polipeptídeo compreende o(s) resíduo(s) de aminoácidos de imunoglobulina G tipo selvagem na sua sequência de aminoácidos na(s) posição(ões) de aminoácidos que interagem na respectiva imunoglobulina G tipo selvagem com o resíduo de aminoácidos na mutação perturbadora.

19. POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pela mutação adicional ser a mutação E357K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 370 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação adicional ser a mutação K370E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 357 o resíduo de aminoácido E.

20. “POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 19, caracterizado pela mutação adicional ser a mutação D356K e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 439 o resíduo de aminoácido K, ou a mutação adicional ser a mutação K439E e o primeiro polipeptídeo compreender na posição 356 o resíduo de aminoácido D.

21. “POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender ainda um domínio CH1 de IgG: e um domínio variável.

22. “POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 21, caracterizado por compreender ainda uma cadeia leve de anticorpo que está associada ao primeiro polipeptídeo.

23. —POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 22, caracterizado pelo primeiro e segundo polipeptídeos compreenderem, cada um, na direção N-terminal para a C-terminal, um domínio CH2 de IgG: e um domínio CH3 de I1gG1.

24. —“POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 23, caracterizado pela região de dobradiça compreender as mutações C226S e C229S ou uma deleção de toda a sequência CPXC (SEQ ID NO: 89), em que a numeração está de acordo com o índice EU de Kabat.

25. —POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 24, caracterizado pelo segundo polipeptídeo compreender ainda um marcador (tag).

26. “POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 25, caracterizado pelo segundo polipeptídeo compreender ainda um marcador (tag) C-terminal.

27. POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo marcador ter a sequência de aminoácidos HHHHHH (SEQ ID NO: 67), HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68), ou EPEA (SEQ ID NO: 87).

28. —POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 26, caracterizado para uso em método de produção de um polipeptídeo trocado heterodimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14.

29. “POLIPEPTÍDEO HETERODIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 26, caracterizado para uso em um método de identificação de um polipeptídeo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 17.