BR112017024265B1

BR112017024265B1 - Métodos para crescimento de um biofilme de bactérias probióticas em partículas sólidas

Info

Publication number: BR112017024265B1
Application number: BR112017024265-6A
Authority: BR
Inventors: David Baram; Rachel DIAMANT; David Daboush
Original assignee: Mybiotics Pharma Ltd
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2022-08-09
Also published as: US10793847B2; EP3294073A2; AU2016259871B2; CA2985729C; CA2985729A1; CN108135240A; US20210009985A1; US20180355343A1; WO2016181228A2; IL255583A; US20230227806A1; JP6990922B2; JP2018517430A; CN114990099A; BR112017024265A2; EP3294073A4; EP3294073B1; AU2016259871A1; IL287585A; CN108135240B

Abstract

SISTEMAS E MÉTODOS PARA CRESCIMENTO DE UM BIOFILME DE BACTÉRIAS PROBIÓTICAS EM PARTÍCULAS SÓLIDAS PARA COLONIZAÇÃO DE BACTÉRIAS NO INTESTINO. A presente invenção fornece um método, sendo que o método forma um biofilme, em que o biofilme compreende uma população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas, em que o biofilme é configurado para colonizar um intestino de um indivíduo que precisa do mesmo por pelo menos cinco dias, quando for ingerido pelo indivíduo, sendo que o método compreende: a. obter uma população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias; b. inocular um meio de crescimento que contém partículas com a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias; c. incubar as partículas com a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana por tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa de bactérias se afixar às partículas; e d. cultivar a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas em um meio de crescimento por tempo suficiente para formar um biofilme.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisória número de série U.S. 62/159.846, depositado em 11 de maio de 2015 e do Pedido de Patente Provisória número de série U.S. 62/159.849, depositado em 11 de maio de 2015, sendo o conteúdo incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se ao sistema e ao método para o crescimento e encapsulação de pelo menos uma cepa de bactérias sob uma forma de biofilme, configurado para liberação alvejada dependente de pH do biofilme bacteriano no trato gastrointestinal.

Sumário

[003] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método,

[004] em que o método forma um biofilme,

[005] em que o biofilme compreende uma população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas,

[006] em que o biofilme é configurado para colonizar um intestino de um indivíduo que precisa do mesmo por pelo menos cinco dias, quando for ingerido pelo indivíduo, em que o método compreende:

[007] a. obter uma população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias;

[008] b. inocular um meio de crescimento que contém partículas com a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias;

[009] c. incubar as partículas com a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana por tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa de bactérias se afixar às partículas; e

[0010] d. cultivar a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas em um meio de crescimento por tempo suficiente para formar um biofilme.

[0011] Em uma modalidade, o biofilme que compreende uma população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é encapsulada com um composto configurado para liberar pelo menos uma cepa bacteriana a um pH encontrado no intestino do animal.

[0012] Em uma modalidade, o composto configurado para liberar pelo menos uma cepa bacteriana a um pH encontrado no intestino do animal é o alginato.

[0013] Em uma modalidade, a população de pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas é cultivada no meio de crescimento sob condições de fluxo.

[0014] Em uma modalidade, a população de pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas é cultivada no meio de crescimento em condições estáticas.

[0015] Em uma modalidade, a população de pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas é primeiro cultivada no meio de crescimento em condições estáticas, seguida de cultivo no meio de crescimento sob condições de fluxo.

[0016] Em uma modalidade, a população de pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas é cultivada sob condições anaeróbicas.

[0017] Em uma modalidade, a população de pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas é cultivada sob condições aeróbicas.

[0018] Em uma modalidade, as partículas são porosas e selecionadas do grupo que consiste em: sementes, fosfato bicálcico, argila, areia e celulose.

[0019] Em uma modalidade, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é derivada da microflora de intestino.

[0020] Em uma modalidade, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é Lactobacillus plantarum.

[0021] Em uma modalidade, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é Acetobacter pomorum.

[0022] Em uma modalidade, o biofilme formado pelo método é configurado para liberação alvejada dependente de pH do biofilme bacteriano no trato gastrointestinal.

[0023] Em uma modalidade, o biofilme compreende duas ou mais cepas de bactérias.

Breve Descrição das Figuras

[0024] A Figura 1 mostra uma ilustração de uma modalidade exemplificativa da presente invenção, mostrando um sistema de fluxo usado de acordo com os métodos de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[0025] As Figuras de 2A a 2C mostram imagens de algumas modalidades exemplificativas de biofilmes gerados por métodos de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[0026] Mais especificamente, as Figuras 2A ilustram um Biofilme de Lactobacillus plantarum em várias matrizes. Figuras 2A(i) - Biofilme em matrizes orgânicas: a) Maracujá, b) Romã e c) Argila de bentonita. Figuaras 2A(ii) - Biofilme em matrizes inorgânicas: a) Areia e b) Argila branca. Figuras 2A(iii) - Biofilme em matrizes sintéticas - a) Fibras solka, b) DCP e c) Avicel.

[0027] As Figuras 2B ilustram um Biofilme de Acetobacter pomorum em várias matrizes. Figuras 2B(i) - Biofilme em matrizes orgânicas: a) Maracujá e b) Romã. Figuaras 2B(ii) - Biofilme em matriz inorgânica: a) Areia.

[0028] As Figuras 2C ilustram um Biofilme de Pseudomonas spp. em várias matrizes. Figuras 2C(i) - Biofilme em matrizes orgânicas: a) Romã e b) Maracujá.

[0029] A Figura 3 mostra a tolerância à acidez de um biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[0030] A Figura 4 mostra a tolerância à acidez de outro biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[0031] A Figura 5 mostra a tolerância de um biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção para a liofilização. Mais particularmente a Figura 5A mostra a Secagem por congelamento de L. plantarum da planctônica. A Figura 5B mostra o Biofilme de L.plantarum em secagem por congelamento em matriz de POM. A Figura 5C a % de sobrevivência após liofilização.

[0032] A Figura 6 mostra a tolerância à acidez de outro biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[0033] A Figura 7 mostra a capacidade de um biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção para colonizar o intestino de um modelo animal, com o uso das composições indicadas. Mais particularmente, as Figuras 7A e 7B mostram a sobrevivência de Lactobacillus plantarum no trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos. A Figura 7C mostra a sobrevivência de Lactobacillus plantarum no trato gastrointestinal de ratos.

[0034] A Figura 8 mostra a liberação alvejada dependente de pH das bactérias de biofilmes de acordo com algumas modalidades da presente invenção.

[0035] A Figura 9 mostra a capacidade de outro biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção para colonizar o intestino de um modelo animal. Mas particularmente, a Figura 9 mostra a colonização de C. minuta em camundongos SPF.

[0036] A Figura 10 mostra a capacidade de outro biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção para colonizar o intestino de um modelo animal, em comparação com outros biofilmes formados com o uso de outros métodos. Mais particularmente, a Figura 10 mostra a sobrevivência de L. plantarum em trato gastrointestinal de camundongo SPF.

Descrição Detalhada

[0037] Para maior clareza da revelação, e não a título de limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas seguintes subseções que descrevem ou ilustram certas características, modalidades ou aplicações da presente invenção.

[0038] Ao longo do relatório descritivo e das reivindicações, os seguintes termos assumem os significados explicitamente associados aqui, a menos que o contexto dite claramente o contrário. As expressões "em uma modalidade" e "em algumas modalidades", tal como aqui usado, não se referem necessariamente à mesma modalidade (ou modalidades), embora possa. Além disso, as expressões "em outra modalidade" e "em algumas outras modalidades" tal como aqui usadas não se referem necessariamente a uma modalidade diferente, embora possa. Assim, como descrito abaixo, várias modalidades da invenção podem ser facilmente combinadas, sem se afastar do escopo ou espírito da invenção.

[0039] Além disso, tal como aqui usado, o termo "ou" é um operador "ou" inclusivo e é equivalente ao termo "e/ou", a menos que o contexto dite claramente o contrário. O termo "com base em" não é exclusivo e permite basear-se em fatores adicionais não descritos, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Além disso, ao longo do relatório descritivo, o significado de "um", "uma" e "o/a" inclui referências plurais. O significado de "no" inclui "no" e "na".

[0040] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere ao sistema e ao método para o crescimento e encapsulação de pelo menos uma cepa bacteriana sob a forma de biofilme, configurada para liberação alvejada dependente de pH do biofilme bacteriano no trato gastrointestinal.

[0041] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método,

[0042] em que o método forma um biofilme,

[0043] em que o biofilme compreende uma população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas,

[0044] em que o biofilme é configurado para colonizar o intestino de um indivíduo que precisa do mesmo por pelo menos cinco dias, quando for ingerido pelo indivíduo, em que o método compreende:

[0045] a. obter uma população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias;

[0046] b. inocular um meio de crescimento que contém partículas com a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias;

[0047] c. incubar as partículas com a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana por tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa de bactérias se afixar às partículas; e

[0048] d. cultivar a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias afixada às partículas em um meio de crescimento por tempo suficiente para formar um biofilme.

[0049] Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa bacteriana para afixar às partículas é de 2 horas a 12 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa bacteriana para afixar às partículas é de 2 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa bacteriana para afixar às partículas é de 4 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa bacteriana para afixar às partículas é de 6 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa bacteriana para afixar às partículas é de 8 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa de bactérias para afixar às partículas é de 10 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para a população de pelo menos uma cepa bacteriana para afixar às partículas é de 12 horas.

[0050] Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 12 horas a 48 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 12 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 14 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 16 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 18 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 20 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 22 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 24 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 26 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 28 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 30 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 32 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 34 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 36 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 38 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 40 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 42 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 44 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 46 horas. Em algumas modalidades, o tempo suficiente para formar um biofilme é de 48 horas.

[0051] Em algumas modalidades, a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é cultivada no meio de crescimento sob condições de fluxo. Tal como aqui usado, o termo "condições de fluxo" se refere ao movimento do meio de cultura em relação às bactérias afixadas a uma superfície, em que o movimento do meio de cultura exerce uma força de cisalhamento sobre a bactéria.

[0052] Sem pretender se limitar a qualquer teoria em particular, cultivar a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas sob condições de fluxo cria até mesmo forças de cisalhamento suaves sobre o biofilme em crescimento e aumenta a criação rápida do biofilme (por exemplo, em um curto período de tempo em comparação com métodos de crescimento estacionários típicos). Em algumas modalidades, um sistema de fluxo permite a introdução do novo meio de cultura para o biofilme em crescimento e a remoção de resíduos bacterianos.

[0053] Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 10 ml/hora a 100 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 20 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 30 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 40 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 50 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 60 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 70 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 80 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 90 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 100 ml/hora. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem uma taxa de fluxo de 10 ml/hora.

[0054] Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactérias de 90 a 150 rpm. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactérias a 100 rpm. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactérias a 110 rpm. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactéria a 120 rpm. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactérias a 130 rpm. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactérias a 140 rpm. Em algumas modalidades, as condições de fluxo compreendem agitar a cultura de bactérias a 150 rpm.

[0055] Em algumas modalidades, cultivar a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas sob condições de fluxo resulta na produção de um biofilme robusto e saudável em um período de tempo mais curto em comparação com métodos típicos (por exemplo, mas não limitado a 5, 10, 20, 25, 50% menos tempo). Em algumas modalidades, o biofilme resultante tem uma resiliência aumentada em condições severas quando comparado com outros métodos de cultivo, e é adicionalmente detalhado aqui.

[0056] Com relação à Figura 1, é mostrada uma ilustração de uma modalidade exemplificativa da presente invenção, que mostra um sistema de fluxo de acordo com algumas modalidades da presente invenção. No que se refere à Figura 1, o sistema inclui um recipiente que contém as partículas sólidas para o cultivo de biofilmes, uma fonte de meio de crescimento, tubos que conduzem o meio de crescimento para dentro e para fora do recipiente e uma bomba que move o meio através dos tubos. A saída de fluido do recipiente pode retornar ao reservatório do meio para reciclagem, ou pode ser drenada. Em algumas modalidades, este sistema de fluxo pode ser fechado, aberto ou semifechado. As setas em movimento no sentido horário na Figura 1 representam a direção do fluxo e são apenas para fins ilustrativos.

[0057] Em algumas modalidades, a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é cultivada no meio de crescimento em condições estáticas. Tal como aqui usado, o termo "condições estáticas" se refere a condições de cultivo em que não haja força de cisalhamento exercida sobre a bactéria.

[0058] Em algumas modalidades, a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é cultivada primeiro no meio de crescimento em condições estáticas, seguida de cultivo no meio de crescimento sob condições de fluxo.

[0059] Em algumas modalidades, a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é cultivada sob condições anaeróbicas. Tal como aqui usado, o termo "condições anaeróbicas" se refere a condições de cultivo que compreendem a ausência de oxigênio livre ou ligado.

[0060] Em algumas modalidades, a população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é cultivada sob condições aeróbicas. Tal como aqui usado, o termo "condições aeróbicas" se refere a condições de cultura que compreende a presença de oxigênio livre ou ligado.

Partículas

[0061] Em algumas modalidades, as partículas são porosas e selecionadas do grupo que consiste em: sementes, fosfato bicálcico, argila, areia e celulose.

[0062] Em algumas modalidades, as sementes são selecionadas do grupo que consiste em: sementes de romã e sementes de maracujá. Em algumas modalidades, as sementes são esmagadas.

[0063] Em algumas modalidades, as partículas de celulose compreendem a celulose vendida sob o nome comercial AVICEL®. Em algumas modalidades, as partículas de celulose compreendem celulose vendida sob o nome comercial SOLKA®.

[0064] Em algumas modalidades, uma pluralidade de partículas é utilizada no método para formar um biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção. Em algumas modalidades, as partículas variam de 5 mícrons a 1 cm de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 5 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 10 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 15 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 20 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 30 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 40 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 50 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 60 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 70 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 80 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 90 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 100 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 200 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 300 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 400 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 500 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 600 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 700 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 800 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas são de 900 mícrons de diâmetro. Em algumas modalidades, as partículas têm 1 cm de diâmetro.

Cepas Bacterianas

[0065] Em algumas modalidades, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é derivada da flora intestinal.

[0066] Em algumas modalidades, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é uma cepa probiótica. Tal como aqui usado, o termo "probiótico" se refere a uma cepa bacteriana que estimula o crescimento de microrganismos, especialmente aqueles com propriedades benéficas (como os da flora intestinal).

[0067] Em algumas modalidades, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é Lactobacillus plantarum.

[0068] Em algumas modalidades, a população que compreende pelo menos uma cepa bacteriana é Acetobacter pomorum.

[0069] Em algumas modalidades, o biofilme formado pelo método é configurado para liberação alvejada dependente de pH do biofilme bacteriano no trato gastrointestinal.

[0070] Em algumas modalidades, o biofilme compreende duas ou mais cepas de bactéria.

[0071] A Figura 2A mostra imagens de algumas modalidades exemplificativas de biofilmes gerados pelos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, vários tipos de partículas sólidas apropriadas para bactérias probióticas crescentes foram testadas e os resultados são aqui mostrados. A Figura 2A mostra imagens de microscópio eletrônico de biofilme de Lactobacillus plantarum que cresceram em diferentes partículas sólidas, como, por exemplo, sementes de maracujá, sementes esmagadas de romã, argila de bentonita, partículas de areia, argila branca, fibras SOLKA, fosfato bicálcico (DCP), AVICEL. Com exceção da argila branca, a bactéria cresce em todos os tipos de partículas.

[0072] A Figura 2B mostra imagens de algumas modalidades exemplificativas de biofilmes gerados pelos métodos da presente invenção, mostrando o crescimento do biofilme de Acetobacter pomorum em sementes esmagadas de maracujá, sementes esmagadas de romã e areia. O Acetobacter pomorum cresceu e formou um biofilme de sementes de romã. No entanto, observou-se muito pouco crescimento na areia. O Acetobacter pomorum não cresceu nas sementes de maracujá. Outras espécies de bactéria testadas, por exemplo as Pseudomonas spp, não cresceram nas partículas sólidas testadas, como mostrado na Figura 2C.

[0073] Sem estarem ligadas pela teoria, diferentes partículas proporcionam microambientes distinguíveis para que a bactéria cresça, como o tamanho dos poros, a rugosidade da superfície, os nutrientes disponíveis nas partículas, a viscosidade, a carga da superfície, etc., o que pode influenciar a capacidade de várias bactérias para afixar e crescer em vários tipos de partículas.

[0074] Em algumas modalidades dos métodos da presente invenção, o método gera um biofilme contendo pelo menos duas cepas de bactéria probiótica (por exemplo, mas não limitado a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.), em que o biofilme é gerado usando uma combinação de pelo menos duas partículas diferentes (por exemplo, não limitado a sementes de maracujá, sementes esmagadas de romã, etc.). Em algumas modalidades, para criar tais combinações, as condições de crescimento (por exemplo, mas não limitadas a tipos de partículas) são selecionadas de acordo com a (as) cepa (cepas) para utilização na geração de um biofilme. Em uma modalidade exemplificativa, se duas cepas bacterianas forem eventualmente combinadas para gerar um biofilme, cada uma das cepas bacterianas será cultivada usando a partícula mais adequada para o crescimento de cada cepa. Em algumas modalidades, quando duas ou mais cepas bacterianas são cultivadas separadamente, as cepas bacterianas são combinadas durante o processo de encapsulação.

Tratamento

[0075] Em algumas modalidades, um biofilme é administrado em um animal que dele necessite para colonizar o intestino do animal com o biofilme.

[0076] Em algumas modalidades, o biofilme que compreende uma população de pelo menos uma cepa bacteriana afixada às partículas é encapsulada com um composto configurado para liberar pelo menos uma cepa bacteriana a um pH encontrado no intestino do animal.

[0077] Em algumas modalidades, o composto configurado para liberar a pelo menos uma cepa bacteriana a um pH encontrado no intestino do animal é o alginato.

[0078] Em algumas modalidades, o pH encontrado no intestino do animal é pH 8.

[0079] Em algumas modalidades, o biofilme é administrado em um animal que dele necessite, em uma quantidade suficiente para colonizar o intestino. Em algumas modalidades, a colonização é confirmada pela presença de pelo menos uma população de bactéria presente nas fezes do animal durante pelo menos 5 dias após a administração.

[0080] Em algumas modalidades, a bactéria colonizada derivada do biofilme pode habitar o intestino de um mamífero durante pelo menos uma semana (por exemplo, mas não limitado a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc. semanas). Em algumas modalidades, as bactérias colonizadas derivadas do biofilme são sustentáveis dentro de um intestino de mamífero, isto é, não morrem após 3 dias.

[0081] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 a 2 x 109 bactérias por dia, durante 1 a 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 a 2 x 106 bactérias por dia, durante 1 a 5 dias.

[0082] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 bactérias por dia, durante 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 105 bactérias por dia, durante 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 106 bactérias por dia, durante 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 107 bactérias por dia, durante 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 108 bactérias por dia, durante 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 109 bactérias por dia, durante 5 dias.

[0083] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 bactérias por dia, durante 4 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 105 bactérias por dia, durante 4 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 106 bactérias por dia, durante 4 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 107 bactérias por dia, durante 4 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 108 bactérias por dia, durante 4 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 109 bactérias por dia, durante 4 dias.

[0084] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 bactérias por dia, durante 3 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 105 bactérias por dia, durante 3 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 106 bactérias por dia, durante 3 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 107 bactérias por dia, durante 3 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 108 bactérias por dia, durante 3 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 109 bactérias por dia, durante 3 dias.

[0085] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 bactérias por dia, durante 2 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 105 bactérias por dia, durante 2 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 106 bactérias por dia, durante 2 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 107 bactérias por dia, durante 2 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 108 bactérias por dia, durante 2 dias. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 109 bactérias por dia, durante 2 dias.

[0086] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 104 bactérias por dia, durante 1 dia. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 105 bactérias por dia, durante 1 dia. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 106 bactérias por dia, durante 1 dia. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 107 bactérias por dia, durante 1 dia. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 108 bactérias por dia, durante 1 dia. Em algumas modalidades, a quantidade suficiente para colonizar o intestino é de 2 x 109 bactérias por dia, durante 1 dia.

[0087] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente é administrada em uma única partícula. Alternativamente, a quantidade suficiente é administrada em uma pluralidade de partículas.

[0088] Em algumas modalidades, a quantidade suficiente é misturada com alimentos e ingerida.

[0089] Em algumas modalidades, o biofilme é administrado ao animal imediatamente após o cultivo do biofilme. Alternativamente, o biofilme pode ser armazenado, antes de ser administrado. O biofilme pode ser armazenado congelado, ou, alternativamente, em uma forma liofilizada.

[0090] Faz-se referência agora aos seguintes exemplos, que em conjunto com as descrições acima ilustram algumas modalidades da invenção de forma não limitativa.

Exemplos Exemplo 1: Tolerância à acidez de um biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção

[0091] Foi testada a resiliência do biofilme cultivado em partículas sólidas no sistema de fluxo como descrito acima. Especificamente, o primeiro parâmetro testado foi a tolerância à acidez, e os resultados são mostrados na Figura 3.

[0092] Um cultivo noturno de L. plantarum foi inoculado em matriz de romã embebida em meio MRS a 25% (para incentivar a formação de biofilmes, foram usadas condições de fome (ou seja, menos de 100% de concentração de meio de crescimento)) na matriz de recipiente e deixado imóvel durante 2,5 horas (isto é, sem mistura), e então o sistema de fluxo foi iniciado. O meio foi movido do reservatório do meio para o recipiente da matriz usando uma bomba peristáltica a uma velocidade de 12 ml/hora durante 5 dias. O meio não foi reciclado. Um meio novo entrou na cultura e a saída drenou os meios usados. Como controle, foram usadas bactérias cultivadas na forma planctônica (isto é, não afixadas à uma partícula), resultando na falta de formação de biofilmes. Para o controle planctônico, foram inoculadas de 4 a 5 colônias de L. plantarum em 6 ml de 100% de caldo de MRS e deixadas ainda em incubadora a 37 °C durante o período.

[0093] Para testar a tolerância à acidez, uma série de frascos com PBS ajustado para aumentar o pH usando HC1 (solução de reserva 0,5M) preparada antecipadamente para criar pH 1, 2, 3 e 2 gramas das partículas com um biofilme foi transferida para os frascos e incubados por l hora. As bactérias foram então lavadas em PBS e 5 microlitros foram plaqueados como mostrado na Figura 3.

[0094] Para o controle planctônico, foram extraídos 100 μl do cultivo noturno nos frascos de pH e incubados por l hora, a bactéria foi então lavada em PBS e 5 microlitros foram plaqueados como mostrado na Figura 3. Como mostrado na Figura 3, as bactérias do biofilme mostram uma maior resiliência à acidez, uma vez que sobreviveram bem em pH 2, enquanto as bactérias planctônicas não sobreviveram.

[0095] Sem pretender limitar-se a qualquer teoria particular, o pH no estômago é cerca de 2. Assim, após a administração do biofilme a um indivíduo, o biofilme sobreviverá ao ambiente estomacal do indivíduo (isto é, de pH 2) e colonizar o indivíduo.

Exemplo 2: Tolerância à acidez de outro biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção

[0096] Foi conduzido um segundo conjunto de experimentos e eles demonstraram a resiliência bacteriana à acidez (isto é, na forma de um biofilme) que está descrita na Figura 4 e mostrada nas Tabelas 1 e 2 abaixo.

[0097] Um cultivo noturno de L. plantarum foi inoculado em 7 gramas de partículas de semente de romã (POM) embebidas em meio MRS a 25% (condições de fome) e deixadas imóveis por 2,5 horas. Em seguida, o sistema de fluxo foi conduzido por 5 dias, usando uma bomba peristáltica que moveu o meio em velocidade máxima (cerca de 380 ml/hora). Neste experimento, o meio foi reciclado, para comparar com o controle estacionário/de não fluxo. Para controle planctônico, foram inoculadas 4 colônias de L. plantarum em 6 ml de 100% de caldo de MRS e deixadas em incubadora a 37 °C durante a noite + 5 horas. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1: Crescimento celular

Tabela 2: Dados da Figura 4 (Registro de Resultados)

[0098] Conforme mostrado na Figura 4, as bactérias planctônicas apresentaram diminuição da sobrevida quando expostas à diminuição do pH.

Exemplo 3: Reconstituição de um biofilme de acordo com algumas modalidades da presente invenção

[0099] O biofilme cultivado e aprisionado no alginato recuperou após a secagem. O L. plantarum foi cultivado em 25 ml de MRS a 100% + 2gr de POM durante 4 dias à temperatura ambiente para formar biofilmes. Para o controle planctônico, o L. plantarum foi cultivado em 25 ml de MRS a 100% durante 4 dias à temperatura ambiente. Uma amostra de POM + biofilme e controle foi plaqueada em placas MRS em diluições em série. Outra amostra de cada foi centrifugada brevemente, novamente suspensa em 5 ml de tampão de secagem por congelamento, liofilizada durante 24 horas e suspensa em 25 ml de MRS. Nesta fase (após a liofilização, mas antes do crescimento), as amostras foram plaqueadas por diluições em série. O restante da amostra foi deixado para crescer durante mais 48 horas, e plaqueada novamente. Conforme mostrado na Figura 5, as bactérias que cresceram como biofilme em partículas sólidas mostraram uma maior resistência e sobrevivência à liofilização (isto é, reconstituição após secagem).

Exemplo 4: Tolerância à acidez das células DH5a de E. coli

[00100] A tolerância à acidez da cepa DH5a de E. coli foi testada em três condições:

[00101] 1. Planctônica - E. coli cresceu em 20 ml de iniciador LB em agitador por 5 dias a 23 °C.

[00102] 2. Biofilme estático - E. coli cresceu em 20 ml de LB com 2 gr de matrizes diferentes crescidas durante 5 dias em condições estáticas a 37 °C.

[00103] 3. Fluxo de biofilme - E. coli cresceu em fluxo de coluna do sistema com DCP por 5 dias à temperatura ambiente a uma velocidade de aproximadamente 2 ml/hora de 25% de LB. As amostras foram retiradas do topo da coluna (perto da superfície do ar) e da parte do fundo da coluna.

[00104] A cepa DH5a da E. coli foi cultivada durante a noite a 37 °C em agitação. 100 μl do iniciador foi transferido para:

[00105] 1. 2 gr avicel + 20 ml de LB - para cultura estática de biofilme.

[00106] 2. 2 gr de fibras Solka + 20 ml de LB - para cultura estática de biofilme.

[00107] 3. 3 gr de DCP + 20 ml de LB - para cultura estática de biofilme.

[00108] 4. 20 ml de LB - para cultura planctônica.

[00109] Os 2 ml do iniciador foram transferidos durante a noite para 20 ml de LB e inoculados na coluna do sistema de fluxo. O fluxo ficou preso por 2 horas para deixar a E. coli afixar ao DCP. Após 2 horas, o fluxo foi ligado durante 5 dias à temperatura ambiente.

[00110] Após 5 dias de incubação, uma amostra de cada uma das matrizes dos experimentos estáticos (DCP, Avicel e Solka) e uma amostra do DCP formam o topo da coluna e o DCP forma a parte do fundo da coluna foi retirado e inserido em cinco diferentes tubos Eppendorf ("Eppendorfs"). As amostras foram lavadas suavemente uma vez com PBS.

[00111] De cada amostra, a seguinte quantidade de matriz foi colocada em dois frascos:

[00112] 1. DCP estático - 0,02 gr

[00113] 2. Avicel estático - 0,03 gr

[00114] 3. Solka estático - 0,02 gr

[00115] 4. Topo do DCP do fluxo - 0,0 3 gr

[00116] 5. Fundo do DCP do fluxo - 0,03 gr

[00117] O conteúdo de cada Eppendorf foi lavado suavemente uma vez com PBSX1. Para cada par de Eppendorfs (de cada amostra), adicionou-se 1 ml de PBSX1 (pH = 7,4) ou l ml de PBS (pH = 2). Os Eppendorfs foram incubados lado a lado durante 1 hora à temperatura ambiente. Os Eppendorfs foram então centrifugados a 13.000 rpm durante 2 min, o sobrenadante foi descartado. O l ml de PBSX1 foi adicionado a cada Eppendorf e os Eppendorfs foram submetidos a vórtice a plena potência durante 30 segundos para liberarem a bactéria da matriz.

[00118] Manipulação da cultura planctônica: o l ml de cultura foi transferido para um Eppendorf e centrifugado a velocidade máxima durante 2 min. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se l ml de PBS. 100 μl disso foram adicionados ao:

[00119] 1. Eppendorf com l ml de PBSXl (pH = 7,4)

[00120] 2. Eppendorf com l ml de PBS (pH = 2)

[00121] Os Eppendorfs foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente lado a lado, e esta incubação foi seguida por centrifugação a 13.000 rpm durante 2 min. 100 μl de PBSX1 foram adicionados a cada Eppendorf.

Contagens viáveis:

[00122] 10 μl de cada Eppendorf foi transferido para 90 μl de PBSX1. Foram realizadas sete diluições 1:10 em série. 3 μl de cada diluição foram plaqueados em uma placa LB e deixados na incubadora durante a noite.

[00123] Os cálculos foram os seguintes para reter bactérias/ml por planctônico ou bactérias/gr:

[00124] Matrizes: número de colônias X 10número de diluiçãoX333,33X(l/gr tirada)

[00125] Planctônico: Número de colônias X 10número de diluiçãoX333,3

[00126] Todos os materiais neste experimento foram autoclavados por esterilização. Os resultados apresentados nas tabelas abaixo e na Figura 6 demonstram que o biofilme aumentou a tolerância à acidez da bactéria, nas condições estáticas e exibiu um maior aumento nas condições de fluxo. Tabela 3: Resultados (E. coli DH5a):

Tabela 4: Escala logarítmica

Exemplo 5: Colonização de intestino de murino usando uma composição de acordo com algumas modalidades da presente invenção

[00127] Para testar se a bactéria cultivada como biofilme mostra maior capacidade em colonizar o intestino, o biofilme foi preparado como descrito acima e o biofilme serviu de alimento a camundongos de laboratório. A presença de bactérias nas fezes do rato foi testada. Os resultados são mostrados na Figura 7. Protocolo:

[00128] 1. 6 camundongos sem germes

[00129] 2. Biofilme de Lactobacillus plantarum cultivado em matriz.

[00130] 3. Alimento moído para camundongos misturado apenas com matriz estéril (moído junto).

[00131] 4. Alimento moído para camundongos misturado com o biofilme L. plantarum na matriz (moído junto).

[00132] 5. Alimento moído para camundongos misturado com o biofilme L. plantarum em microesferas de alginato.

[00133] 6. Kit de coloração vivo-morto (para determinar a presença de bactérias vivas).

[00134] 7. Matriz de autoclave para camundongos de controle.

[00135] 8. Os camundongos foram divididos em 3 grupos (2 camundongos para cada grupo):

[00136] a. Controle - camundongos que são alimentados apenas com alimentos + matriz.

[00137] b. Biofilme - camundongos que são alimentados com alimentos + biofilme na matriz.

[00138] c. Alginato de biofilme - camundongos que são alimentados com alimentos + biofilme na matriz em microesferas de alginato.

[00139] 9. Alimentar os camundongos com alimentos correspondentes durante 7 dias (D1-D7).

[00140] 10. Amostra de fezes no dia 8 (D8), dia 9 (D9), dia 10 (D10), Dia 11 (Dll), dia 12 (D12), dia 13 (D13) e dia 14 (D14).

[00141] 11. Verificar a presença de L. plantarum em amostras de fezes.

[00142] 12. Tirar parte do interior do intestino para o biofilme de imagem de L. Plantarum no intestino e colorir usando o kit de coloração designado para verificar a presença de bactérias vivas.

[00143] A Figura 7 mostra que a bactéria colonizou o intestino dos camundongos. O intestino dos camundongos foi colonizado com a bactéria derivada do biofilme há mais de 3 dias e, de fato, até 14 dias, mas não limitado a eles.

Exemplo 6: Liberação dependente de pH de bactéria a partir de uma composição de acordo com algumas modalidades da presente invenção

[00144] Um biofilme que compreende E. coli em DCP foi encapsulado em alginato por mistura do DCP com o biofilme em 4% de alginato e por pingar gotículas com o material em solução de CaCl2 a 2%, e um biofilme que compreende L. plantarum foi cultivado no topo de microesferas de alginato. As composições resultantes foram então tratadas de acordo com o Exemplo 1 acima. Os resultados são mostrados na Figura 8.

[00145] Somente o Lactobacillus plantarum foi liberado quando as microesferas foram inseridas em uma solução de pH = 2. Tanto a E. coli quanto o L. plantarum foram liberados das microesferas em pH = 8.

Exemplo 7: Colonização de intestino de murino usando uma composição que compreende C. minuta de acordo com algumas modalidades da presente invenção

[00146] Um biofilme que compreende C. minuta em sementes de romã foi administrado em camundongos SPF uma vez em uma concentração de bactérias de 2*107 no dia 1 do experimento misturado com o alimento. As fezes foram verificadas no dia 1 (antes do tratamento probiótico), 2, 4, 7, 11 e 15 para a % de C. minuta nas fezes.

[00147] Os animais foram tratados da seguinte forma (três camundongos por grupo de tratamento):

[00148] 1. Controle - Apenas alimento (6gr).

[00149] 2. Controle - Alimentos (3 gr) misturados com grãos de romã (3 gr) somente

[00150] 3. Experimento - Alimentos (3gr) misturados com biofilme de C. minuta em grãos de romã (3gr).

[00151] Os camundongos SPF receberam 2*107 células de C. minuta em biofilme em grãos de romã (C. minuta), grãos de romã (POM somente) ou apenas dieta (HFD) no primeiro dia do experimento. As amostras de fezes foram recolhidas antes do tratamento probiótico (1 dia), 2 dias, 4 dias, 7 dias, 11 dias e 15 dias após o tratamento probiótico e enviado para a sequência 16S. A porcentagem de C. minuta na população global de bactérias em cada amostra de fezes foi calculada. Os resultados são mostrados na Figura 9. Estes dados mostram que o biofilme que compreende C. minuta foi capaz de colonizar o intestino de camundongos por até 15 dias, quando o experimento foi encerrado, como evidenciado pela presença de C. minuta em amostras fecais.

Exemplo 8: Colonização do intestino de murino usando uma composição de acordo com algumas modalidades da presente invenção - Comparação com outros métodos

[00152] Um biofilme que compreende L. plantarum foi cultivado de acordo com as condições descritas abaixo e administrado em camundongos SPF uma vez em uma concentração de bactérias de 2*109 bactérias por dia, durante 5 dias. Depois disso, os camundongos foram alimentados somente com alimentos por mais 5 dias.

[00153] Os animais foram tratados da seguinte forma (dois camundongos por grupo de tratamento):

[00154] 1. Controle - Apenas comida

[00155] 2. Controle - Alimentos com partículas somente (grãos de romã POM).

[00156] 3. L. plantarum de planctônico foi cultivado durante a noite em agitação a 37 °C em caldo MRS.

[00157] 4. Biofilme estático em grãos de romã (POM) - 5 gr de partículas com bactéria (aproximadamente 106 bactérias/dia) (de acordo com os métodos descritos em DE202013103204)

[00158] 5. Fluxo de biofilme em grãos de romã (POM) - 1,5 gr de partículas com bactéria.

[00159] 6. Fluxo de biofilme em grãos de romã (POM) e liofilizado - 1,5gr de partículas com bactéria (de acordo com os métodos descritos em Biomacromolecules 2013, 14, 32143222).

[00160] 7. Suplemento probiótico comercial - 2 comprimidos por dia durante 5 dias

[00161] A quantidade de Lactobacillus foi quantificada usando contagens de colônia de fezes de camundongos recolhidas no Dia 5 (o último dia de admissão da amostra), Dia 3 e Dia 5 (3 e 5 dias após a cessação da admissão da amostra). Os resultados são mostrados na Figura 10. Estes dados mostram que o biofilme que compreende L. plantarum formado de acordo com os métodos da presente invenção foi capaz de colonizar o intestino de camundongos por até 5 dias, quando o experimento foi encerrado, como evidenciado pela presença de L. plantarum em amostras fecais. No entanto, as composições formadas de acordo com os métodos descritos em DE202013103204 ou Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222 não foram capazes de colonizar o intestino de camundongos por até 5 dias.

[00162] As publicações citadas ao longo deste documento são incorporadas por referência em sua totalidade. Embora os vários aspectos da invenção tenham sido ilustrados acima por referência a exemplos e modalidades preferidas, será apreciado que o escopo da invenção seja definido não pela descrição anterior, mas pelas reivindicações seguintes, devidamente interpretadas sob os princípios da lei de patentes.

Claims

1. Método para obter biofilme, caracterizado pelo fato de compreender uma população de pelo menos uma cepa bacteriana fixada às partículas, o método compreendendo: (a) obter uma população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias; (b) inocular um meio de crescimento que contém partículas com a população compreendendo pelo menos uma cepa de bactérias; (c) incubar as partículas com a população compreendendo pelo menos uma cepa bacteriana até a população de pelo menos uma cepa de bactérias se fixar às partículas, preferencialmente por 2 horas a 12 horas; e (d) cultivar a população que compreende pelo menos uma cepa de bactérias fixada às partículas em um meio de crescimento até formar um biofilme, preferencialmente por 12 horas a 48 horas, em que o referido cultivo compreende uma etapa de cultivo sob condições anaeróbicas, as referidas partículas são preferencialmente partículas porosas, e pelo menos uma cepa bacteriana é uma cepa probiótica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biofilme é tolerante a ácidos.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o biofilme é configurado para liberação direcionada, dependente de pH, do biofilme bacteriano no trato gastrointestinal.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o biofilme é encapsulado com um composto configurado para liberar pelo menos uma cepa bacteriana a um pH encontrado no intestino de um animal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido composto é alginato.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas porosas variam de 30 a 500 mícrons em diâmetro.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas são selecionadas a partir do grupo consistindo em: fosfato dicálcico, sementes, argila, areia e celulose.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas consistem em fosfato dicálcico.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o biofilme compreende duas ou mais cepas de bactéria.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa bacteriana é selecionada a partir do grupo consistindo em: Lactobacillus, Christensenella e Acetobacter.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido biofilme compreendendo uma população de pelo menos uma cepa bacteriana fixada à uma partícula está em uma forma liofilizada.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas são partículas porosas.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido tempo para a população de pelo menos uma cepa de bactérias se fixar às partículas é de 2 horas a 12 horas.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido tempo para formar um biofilme é de 12 horas a 48 horas.