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BR112015004701B1 - Composição, uso de um polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira de expressão recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e para tratamento de proteínas, composição de ração animal, aditivo de ração animal, e, ração animal - Google Patents

Composição, uso de um polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira de expressão recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e para tratamento de proteínas, composição de ração animal, aditivo de ração animal, e, ração animal Download PDF

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BR112015004701B1
BR112015004701B1 BR112015004701-7A BR112015004701A BR112015004701B1 BR 112015004701 B1 BR112015004701 B1 BR 112015004701B1 BR 112015004701 A BR112015004701 A BR 112015004701A BR 112015004701 B1 BR112015004701 B1 BR 112015004701B1
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BR112015004701-7A
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Mary Ann Stringer
Tine Hoff
Peter Rahbek Oestergaard
Katrine Fruergaard Pontoppidan
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Novozymes A/S
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Publication date
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Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO USO DE UM POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, PARA , MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, E PARA TRATAMENTO DE PROTEÍNAS, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL, ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL, E, RAÇÃO ANIMAL. A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease e sequências de ácidos nucleicos isolados codificando as proteases. A invenção também se refere a construções de ácidos nucleicos, vetores, e células hospedeiras, incluindo células de plantas e animais, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos, bem como a métodos para a produção e uso das proteases, em particular o uso das proteases em ração animal.

Description

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] Esse pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é aqui incorporada a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO ÁREA DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease e sequências de ácidos nucleicos isolados codificando as proteases. A invenção também se refere a construções de ácidos nucleicos, vetores, e células hospedeiras, incluindo células de plantas e animais, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos, bem como a métodos para a produção e uso das proteases, em particular o uso das proteases em ração animal.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] No uso de proteases em rações animais (IN VIVO), e/ou o uso de tais proteases para tratamento de proteínas vegetais (IN VITRO), se notou que as proteínas são fatores nutricionais essenciais para animais e humanos. Humanos e gado habitualmente adquirem as proteínas necessárias de fontes de proteínas vegetais. Fontes de proteínas vegetais importantes são, por exemplo, culturas oleaginosas, leguminosas e cereais.
[004] Quando, por exemplo, a farinha de soja é incluída na ração de animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas, uma proporção significativa da farinha de soja não é digerida eficientemente (a digestibilidade de proteína ileal aparente em leitões, porcos em crescimento e aves domésticas tais como frangos de corte, galinhas poedeiras e galos é somente em torno de 80 %).
[005] O trato gastrointestinal de animais consiste em uma série de segmentos representando cada um diferentes ambientes de pH. Em animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas e muitos tipos de peixes, o estômago é fortemente ácido com um pH potencialmente tão baixo como 1-2, enquanto o intestino exibe tem um pH mais neutro de cerca de pH 6-7,5. Para além do estômago e do intestino, as aves domésticas também têm um papo precedendo o estômago. O pH do papo é maioritariamente determinado pela ração ingerida e portanto, tipicamente encontra-se em uma gama de pH de 46. A digestão de proteínas por uma protease pode ocorrer ao longo de todo o trato digestivo, desde que a protease esteja ativa e sobreviva às condições do trato digestivo. Consequentemente, as proteases que são altamente estáveis em ácido e assim possam sobreviver no ambiente gástrico e que ao mesmo tempo são eficazmente ativas na gama larga do pH fisiológico do trato digestivo do animal alvo são especialmente desejáveis. As novas proteases S53 da invenção são úteis para esses propósitos.
[006] Dado que as rações animais são frequentemente formuladas na forma peletizada, em que o vapor é aplicado no processo de peletização, é também desejável que as proteases utilizadas na alimentação animal sejam capazes de permanecer ativas após exposição ao referido tratamento de vapor.
[007] De modo a produzir uma protease para uso industrial, é importante que a protease seja produzida em elevados rendimentos tornando o produto disponível em quantidades suficientes de modo a ser capaz de proporcionar a protease a um preço favorável.
Descrição da Técnica Relacionada
[008] Proteases S53 são conhecidas na técnica. Um peptídeo S53 de Grifola frondosa com o número de acesso MER078639 (SEQ ID NO: 9) tem 83,6 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Uma protease S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5, SEQ ID NO: 10) foi isolada por Martinez et al tendo 74,5 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5 em "Genome, transcriptome, and secretome analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversion", 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:1954-1959.
[009] Vanden Wymelenberg et al. isolaram uma protease S53 (Uniprot: Q281W2, SEQ ID NO: 11) em "Computational analysis of the Phanerochaete chrysosporium v2.0 genome database and mass spectrometry identification of peptides in ligninolytic cultures reveal complex mixtures of secreted proteins", 2006, Fungal Genet. Biol. 43:343-356 tendo 74,1 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Outro polipeptídeo S53 de Postia placenta (Uniprot:B8P431, SEQ ID NO: 12) foi identificado por Martinez et al. em "Genome, transcriptome, and secretome analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose eqpxgtukqp”, 422;. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:1954-1959 tendo 68,2 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Outros peptídeos, incluindo proteases S53, têm menos do que 70 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5.
[0010] Floudas et al publicaram a sequência de uma protease S53 em “Vjg Rcngqzqke qtkikp qh gnz{ocVke nkipkp fgeqorqukvkqp tgeqpuVtweVgf htqo 53 hwpicn igpqogu”, 2012, Science, 336:1715-1719 tendo 80,6 % de identidade com a SEQ ID NO: 5. Fernandez-Fueyo et al publicaram as ugswêpekcu fg Vtêu ugtkpc rtqVgcugu go “EqorctcVkxg igpqokeu qh Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium provide insight invq ugngevkxg nkipkpqn{uku”. 4234. Proc Natl Acad Sci USA. 109:5458- 5463 (Uniprot:M2QQ01, SEQ ID NO: 26, Uniprot:M2QWH2, SEQ ID NO: 27, Uniprot:M2RD67, SEQ ID NO: 28) tendo 80,8 %, 79,1 % e 78,6 % de identidade, respectivamente, com a SEQ ID NO: 5.
[0011] O documento WO 02/068623 descreve uma protease de Aspergillus niger com 49,2 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5 para uso em aplicações de ração animal e alimentícias. O documento WO 12/048334 descreve endopeptidases do tipo serina de Myceliophthora thermophila como aditivo de ração ou para produtos de ração com 47,9 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5.
[0012] A WO 95/28850 divulga a combinação de uma fitase e uma ou mais enzimas proteolíticas microbianas para melhorar a solubilidade de proteínas vegetais. A WO 01/58275 divulga o uso de proteases estáveis em ácido da família das subtilisinas em rações animais. A WO 01/58276 divulga o uso de proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (a protease 10R), bem como uma protease derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010 em rações animais. As WO 04/072221, WO 04/111220, WO 04/111223, WO 05/035747, e WO 05/123911 divulgam proteases relacionadas com a protease 10R e seu uso em rações animais. A WO 04/072279 divulga o uso de outras proteases em rações animais. A WO 04/034776 divulga o uso de uma subtilisina/queratinase, PWD-1, de B. licheniformis na alimentação de aves domésticas. A WO 04/077960 divulga um método de aumento da digestibilidade de forragem ou grão em ruminantes por aplicação de uma protease bacteriana ou fúngica.
[0013] Produtos comerciais compreendendo uma protease e comercializados para uso em rações animais incluem RONOZYME® ProAct (DSM NP/Novozymes), Axtra® (Danisco), Avizyme® (Danisco), Porzyme® *Fcpkueq+. Cnnz{og™ *CnnVgej+. Versazyme® (BioResources, Int.), Rqwnviyitqy™ *Lgfo+ g Ekdgpzc® FR322 *Pqxwu+o
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0014] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease selecionados do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 83 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, (iv) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17, (v) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, (vi) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22, (vii) a fita complementar completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi); (e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (f) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 83 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (g) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22; (h) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (várias) posições; e (i) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) ou (h) tendo atividade de protease.
[0015] A presente invenção também se refere ao uso de polipeptídeos isolados em ração animal tendo atividade de protease selecionados do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, (iv) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17, (v) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, (vi) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22, (vii) a fita complementar completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi); (e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (f) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (g) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22; (h) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (várias) posições; e (i) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) ou (h) tendo atividade de protease.
[0016] A presente invenção se relaciona com polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos da presente invenção, constructos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinante, e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos, e com métodos de produção dos polipeptídeos.
[0017] A presente invenção também se refere a composições, preferencialmente composições de ração animal, compreendendo os polipeptídeos da invenção; uso dos polipeptídeos da invenção em ração animal ou como aditivos de ração animal; métodos de preparação de uma composição para uso em ração animal, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e métodos de tratamento de proteínas a serem usadas em composições de ração animal.
Visão Global da Listagem de Sequências
[0018] SEQ ID NO: 1 é a sequência de cDNA da protease S53 3 isolada de Meripilus giganteus.
[0019] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 1.
[0020] SEQ ID NO: 3 é a sequência de DNA da sequência de DNA expressa de modo recombinante da SEQ ID NO: 1 com cauda HQ.
[0021] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 3.
[0022] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos da protease S53 3 madura de Meripilus giganteus.
[0023] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos da protease S53 madura obtida de SEQ ID NO. 3.
[0024] SEQ ID NO: 7 é a sequência de DNA da protease 10R (WO 05/035747, SEQ ID NO: 1).
[0025] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos da protease 10R (WO 05/035747, SEQ ID NO: 2).
[0026] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Grifola frondosa (MER078639).
[0027] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5).
[0028] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Phanerochaete chrysosporium (Uniprot: Q281W2).
[0029] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Postia placenta (Uniprot: B8P431).
[0030] SEQ ID NO: 13 é o "primer" 597.
[0031] SEQ ID NO: 14 é o "primer" 598.
[0032] SEQ ID NO: 15 é a sequência de cDNA da protease S53 1 isolada de Trametes cf. versicolor.
[0033] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 15.
[0034] SEQ ID NO: 17 é a sequência de DNA da sequência de DNA expressa de modo recombinante da SEQ ID NO: 15.
[0035] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 17.
[0036] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos da protease S53 madura obtida de SEQ ID NO. 15 e SEQ ID NO: 17.
[0037] SEQ ID NO: 20 é a sequência de cDNA da protease S53 2 isolada de Trametes versicolor.
[0038] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 20.
[0039] SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA da sequência de DNA expressa de modo recombinante da SEQ ID NO: 20.
[0040] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos como deduzida a partir de SEQ ID NO: 22.
[0041] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos da protease S53 madura obtida de SEQ ID NO. 20 e SEQ ID NO: 22.
[0042] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Dichomitus squalens (Uniprot: R7SPH9).
[0043] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QQ01).
[0044] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QWH2).
[0045] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2RD67). Matriz de Identidade das sequências:
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Breve Descrição das Figuras
[0046] A Figura 1 mostra o perfil pH-atividade da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em comparação com a protease 10R no substrato Suc-AAPF-pNA a 25 °C.
[0047] A Figura 2 mostra o perfil pH-estabilidade da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em comparação com a protease 10R (atividade residual após 2 horas a 37 oC).
[0048] A Figura 3 mostra o perfil temperatura atividade da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) a pH 4,0 em comparação com a protease 10R em Protazyme AK a pH 6,5.
[0049] A Figura 4 mostra a especificidade para P1 da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) a pH 4 em comparação com a protease 10R a pH 9,0 em 10 substratos Suc-AAPX-pNA, 25 °C.
[0050] A Figura 5 mostra a atividade (OD340 x fator de diluição), em farelo de soja-milho, da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em comparação com a protease 10R.
[0051] A Figura 6 mostra o nível de aminas livres (OD340 x fator de diluição) em Branco de amostras T0, Branco de amostras e amostras incubadas com a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) ou protease 10R.
[0052] A Figura 7 mostra o perfil pH-atividade da protease S53 1 isolada de Trametes cf. versicolor em comparação com a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) no substrato Suc-AAPF-pNA a 25 °C.
[0053] A Figura 8 mostra o perfil pH-estabilidade da protease S53 1 isolada de Trametes cf. versicolor em comparação com a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) (atividade residual após 2 horas a 37oC).
[0054] A Figura 9 mostra o perfil temperatura atividade da protease S53 1 isolada de Trametes cf. versicolor em comparação com a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em Protazyme AK a pH 4.
[0055] A Figura 10 mostra a especificidade para P1 da protease S53 1 isolada de Trametes cf. versicolor em comparação com a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) a pH 4 em 10 substratos Suc-AAPX- pNA, 25 °C.
DEFINIÇÕES
[0056] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0057] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula mRNA, emendada, madura obtida de uma célula eucariótica. O cDNA não tem sequências íntron que podem estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.
[0058] Sequência codificante: Q Vgtoq “ugswêpeic eqfifíecfqtc” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa usualmente com o códon de início ATG ou códons de início alternativos tais como GTG e TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG e TGA. A sequência codificante pode ser um DNA, cDNA, polinucleotídeo sintético, ou recombinante.
[0059] Sequências de controle: O termo “ugswêpeicu fg eqpVtqng” significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo, ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes, para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificadora do polinucleotídio que codifica um polipeptídeo.
[0060] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional, e secreção.
[0061] Vetor de expressão: Q Vgtoq “xgVqt fg gzrtguu«q” ukipkfíec uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a nucleotídeos adicionais que proporcionam a sua expressão.
[0062] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos eliminados do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de protease. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 330 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 20 a 349 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5); em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 345 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 10 a 354 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5); em um aspecto adicional, um fragmento contém pelo menos 355 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 5 a 359 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5). Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 330 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 20 a 349 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20); em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 345 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 10 a 354 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20); em um aspecto adicional, um fragmento contém pelo menos 355 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 5 a 359 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 20). Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 330 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 20 a 349 de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24); em outro aspecto, um fragmento contém pelo menos 345 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 10 a 354 de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24); em um aspecto adicional, um fragmento contém pelo menos 355 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 5 a 359 de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 24).
[0063] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução, e similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer progenitura de uma célula paterna que não é idêntica à célula paterna devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[0064] Polinucleotídeo isolado: O termo "polinucleotídeo isolado" significa um polinucleotídeo que está em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza, tal como (1) qualquer polinucleotídeo que não ocorre naturalmente, (2) qualquer polinucleotídeo que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou de todos os constituintes que ocorrem naturalmente aos quais está associado na natureza; (3) qualquer polinucleotídeo que é modificado pela mão do homem em relação a esse polinucleotídeo como encontrado na natureza ou (4) qualquer polinucleotídeo modificado por aumento da quantidade de polinucleotídeo em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associado (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Em um aspecto, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, mais pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 90 % puro, e pelo menos 95 % puro, como determinado por eletroforese em agarose. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética, sintética, ou quaisquer suas combinações.
[0065] Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" significa um polipeptídeo que está em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza, tal como (1) qualquer polipeptídeo que não ocorre naturalmente, (2) qualquer polipeptídeo que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes que ocorrem naturalmente com os quais está associado na natureza; (3) qualquer polipeptídeo que é modificado manualmente pelo homem em relação a esse polipeptídeo como encontrado na natureza em mistura com outros componentes, tais como outros polipeptídeos, metabólitos secundários, sais, et alia ou (4) qualquer polipeptídeo modificado aumentando a quantidade do polipeptídeo em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associado. Em um aspecto, o polipeptídeo é pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, e pelo menos 90 % puro, como determinado por SDS-PAGE.
[0066] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-tradução, como processamento N-terminal, truncamento C- terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro consiste dos aminoácidos 1 a 366 na numeração de SEQ ID NO: 2 com base no sequenciamento usando degradação de Edman e análise do peso molecular intato do polipeptídeo maduro com cauda de HQ C-terminal. Usando o programa de previsão SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se prevê que os aminoácidos -198 até -182 na numeração da SEQ ID NO: 2 sejam o peptídeo sinal.
[0067] Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro consiste dos aminoácidos 1 a 366 na numeração da SEQ ID NO: 17 com base na sequenciação usando degradação de Edman e análise do peso molecular intato do polipeptídeo maduro. Usando o programa de previsão SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se prevê que os aminoácidos -199 até -183 na numeração da SEQ ID NO: 17 sejam o peptídeo sinal.
[0068] Em um aspecto adicional, se prevê que o polipeptídeo maduro na numeração da SEQ ID NO: 23 consista dos aminoácidos 1 até 366 e se prevê que o peptídeo sinal consista dos aminoácidos -199 até -183 com base no programa de previsão SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6). É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.
[0069] Sequência codificante de polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de protease. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro consiste dos nucleotídeos 605 até 1702 na numeração de SEQ ID NO: 1 com base na determinação do polipeptídeo maduro por degradação de Edman e análise do peso molecular intato do polipeptídeo maduro com cauda de HQ C-terminal. Além disso, se prevê que os nucleotídeos 11 até 61 na numeração da SEQ ID NO: 1 codifiquem um peptídeo sinal com base no programa de previsão SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).
[0070] Em outro aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é a sequência unida dos nucleotídeos 707 até 853, nucleotídeos 912 até 1022, nucleotídeos 1077 até 1276, nucleotídeos 1332 até 1469, nucleotídeos 1531 até 1978 e nucleotídeos 2031 até 2084 da SEQ ID NO: 15 ou da sua sequência de cDNA com base na determinação do polipeptídeo maduro por degradação de Edman e análise do peso molecular intato do polipeptídeo maduro. Se prevê que os nucleotídeos 1 até 51 na numeração da SEQ ID NO: 15 codifiquem um peptídeo sinal com base no programa de previsão SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6). Em um aspecto adicional, a sequência codificante do polipeptídeo maduro consiste dos nucleotídeos 598 até 1695 da SEQ ID NO: 17 ou da sua sequência de cDNA com base na determinação do polipeptídeo maduro por degradação de Edman e análise do peso molecular intato do polipeptídeo maduro. Se prevê que os nucleotídeos 1 até 51 na numeração da SEQ ID NO: 22 codifiquem um peptídeo sinal com base no programa de previsão SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).
[0071] Em outro aspecto, se prevê que a sequência codificante do polipeptídeo maduro seja a sequência unida dos nucleotídeos 706 até 852, nucleotídeos 914 até 1024, nucleotídeos 1080 até 1279, nucleotídeos 1333 até 1470, nucleotídeos 1532 até 1979 e nucleotídeos 2032 até 2085 da SEQ ID NO: 20 ou da sua sequência de cDNA com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 até 51 da SEQ ID NO: 20 codifiquem um peptídeo sinal. Em outro aspecto, se prevê que a sequência codificante do polipeptídeo maduro consista dos nucleotídeos 598 até 1695 da SEQ ID NO: 22 ou da sua sequência de cDNA com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 até 51 da SEQ ID NO: 22 codifiquem um peptídeo sinal.
[0072] Constructo de ácido nucleico: O termo "construto do ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiriam de outro modo na natureza ou que são sintéticos. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão" quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle requeridas para expressão de uma sequência codificante da presente invenção.
[0073] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle está colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.
[0074] Atividade de protease: Q Vgtoq “rtqVgcug cVkxkfcfg” ukipkfiec atividade proteolítica (EC 3.4). Há vários tipos de atividade de protease, como proteases do tipo tripsina que procedem à clivagem, no lado do terminal carboxi, de resíduos Arg e Lys, e proteases do tipo quimotripsina que procedem à clivagem, no lado do terminal carboxi, de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Proteases da invenção são serina endopeptidases (EC 3.4.21) com pH ótimo acídico (pH ótimo < pH 7).
[0075] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH de ensaio e a temperatura de ensaio devem igualmente ser adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH de ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12. Exemplos de temperaturas de ensaio são 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, ou 95 °C. Exemplos de substratos de protease gerais são caseína, albumina de soro bovino e hemoglobina. No método clássico de Anson e Mirsky, é usada hemoglobina desnaturada como substrato e, após a incubação do ensaio com a protease em questão, a quantidade hemoglobulina solúvel em ácido tricloroacético é determinada como uma medição da atividade de protease (Anson, M.L. e Mirsky, A.E., 1932, J. Gen. Physiol. 16: 59 e Anson, M.L., 1938, J. Gen. Physiol. 22: 79).
[0076] Para o propósito da presente invenção, a atividade de protease foi determinada usando ensaios que são descritos em "Materiais e Métodos", tais como o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA, Ensaio de Protazyme AK, Ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA e o-Ftaldialdeído (OPA). Para o ensaio de Protazyme AK, o substrato insolúvel de Protazyme AK (Caseína Reticulada com Azurina) libera uma cor azul quando incubado com a protease e a cor é determinada como uma medida da atividade de protease. Para o ensaio de Suc-AAPF-pNA, o substrato incolor de Suc-AAPF-pNA libera para-nitroanilina amarela quando incubado com a protease e a cor amarela é determinada como uma medida da atividade de protease.
[0077] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e pelo menos 100 % da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 e/ou SEQ D NO: 24.
[0078] Identidade de Sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".
[0079] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 3.0.0 ou posterior. Usou-se a versão 6.1.0. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue:
[0080] (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)
[0081] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 3.0.0 ou posterior. Usou-se a versão 6.1.0. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue:
[0082] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)
[0083] Condições de restringência: As diferentes condições de restringência são definidas como se segue.
[0084] O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 45 °C.
[0085] O termo "condições de baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 50 °C.
[0086] O termo "condições de média estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 55 °C.
[0087] O termo "condições de média-alta estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 60 °C.
[0088] O termo "condições de elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 65 °C.
[0089] O termo "condições de muito elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 70 °C.
[0090] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (vários) nucleotídeos eliminados da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de protease. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 990 nucleotídeos (por exemplo, nucleotídeos 662 a 1651 de SEQ ID NO: 1), por exemplo, e pelo menos 1035 nucleotídeos (por exemplo, nucleotídeos 632 até 1666 da SEQ ID NO: 1), por exemplo, e pelo menos 1065 nucleotídeos (por exemplo, nucleotídeos 617 a 1681 de SEQ ID NO: 1).
[0091] Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo "polinucleotídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polinucleotídeos isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de polipeptídeos geneticamente manipulados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % por peso de outro material de polinucleotídeo com o qual está nativa ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas que ocorrem naturalmente, tais como promotores e terminadores. Preferencialmente, o polinucleotídeo é pelo menos 90 % puro, por exemplo, pelo menos 92 % puro, pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 % puro, e pelo menos 99,5 % puro ou 100 % puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura.
[0092] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeo substancialmente puro" significa uma preparação que contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % por peso de outro material de polipeptídeo com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92 % puro, por exemplo, pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 % puro, pelo menos 99,5 % puro, e 100 % puro por peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.
[0093] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de protease compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, de um ou mais (vários) resíduos de aminoácidos em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma eliminação significa a remoção de um aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adicionar 1-3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20 %, p.ex., pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease
[0094] Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases, ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo que hidrolisam peptídeos começando em qualquer uma das suas extremidades, ou do tipo endo que atuam internamente em cadeias de polipeptídeos (endopeptidases). As endopeptidases mostram atividade em substratos de peptídeo bloqueados nos terminais N e C que são relevantes para a especificidade da protease em questão.
[0095] O termo "protease" é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeo. Esta definição de protease se aplica também à parte de protease dos termos "protease genitora" e "variante de protease", como usados aqui. O termo "protease" inclui qualquer enzima pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas dezoito subclasses). O número EC se refere a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em 1994, Eur. J. Biochem. 223: 1-5; 1995, Eur. J. Biochem. 232: 1-6; 1996, Eur. J. Biochem. 237: 1-5; 1997, Eur. J. Biochem. 250: 1-6; e 1999, Eur. J. Biochem. 264: 610-650, respectivamente. A nomenclatura é regularmente suplementada e atualizada; ver, por exemplo, a World Wide Web (WWW) em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
[0096] As proteases da invenção e para uso de acordo com a invenção são selecionadas do grupo consistindo em: (a) proteases pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4.21; e/ou (b) proteases pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4.14.; e/ou (c) Serina proteases da família de peptidases S53 que compreende dois tipos diferentes de peptidases: tripeptidil aminopeptidases (tipo exo) e endo-peptidases; como descrito em 1993, Biochem. J. 290:205218 e na base de dados de protease MEROPS, versão, 9.4 (31 janeiro 2011) (www.merops.ac.uk). A base de dados é descrita em Rawlings, N.D., Barrett, CoLo g DcVgocp. Co. 4232. “OGTQRU< Vjg rgrVkfcug fcVcdcug”. Nucl. Acids Res. 38: D227-D233.
[0097] Para determinar se uma dada protease é uma Serina protease, e uma protease da família S53, é feita referência ao Handbook acima e aos princípios indicados nele. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.
[0098] A família de peptidases S53 contém endopeptidases que atuam como ácido e tripeptidil-peptidases. Os resíduos da tríade catalítica são Glu, Asp, Ser, e há um resíduo acídico adicional, Asp, no espaço do oxiânion. A ordem dos resíduos é Glu, Asp, Asp, Ser. O resíduo Ser é o nucleófilo equivalente a Ser na tríade Asp, His, Ser da subtilisina, e o Glu da tríade é um substituto da base geral, His, na subtilisina.
[0099] A mutação de qualquer um dos aminoácidos da tríade catalítica ou espaço de oxiânion resultará em mudança ou perda de atividade enzimática. Os aminoácidos da tríade catalítica e espaço de oxiânion da protease S53 3 de Meripilus giganteus (SEQ ID NO: 5) são provavelmente as posições Glu-85, Asp-89, Asp-175 e Ser-283. Os aminoácidos da tríade catalítica e espaço de oxiânion da protease S53 1 de Trametes versicolor (SEQ ID NO: 19) são provavelmente as posições Glu-85, Asp-89, Asp-175 e Ser-283. Os aminoácidos da tríade catalítica e espaço de oxiânion da protease S53 2 de Trametes versicolor (SEQ ID NO: 24) são provavelmente as posições Glu-85, Asp-89, Asp-175 e Ser-283.
[00100] As peptidases da família S53 tendem a ser mais ativas a pH acídico (ao contrário das subtilisinas homólogas), e tal pode ser atribuído à importância funcional de resíduos carboxílicos, notavelmente Asp no espaço de oxiânion. As sequências de aminoácidos não são proximamente similares às da família S8 (isto é, subtilisinas serina endopeptidases e homólogos), e essa característica, considerada conjuntamente com os resíduos de locais ativos bastante diferentes e o menor pH resultante para atividade máxima, proporciona uma diferença substancial relativamente a essa família. O dobramento proteico da unidade peptidase para membros dessa família se assemelha ao da subtilisina, tendo o tipo de clã SB.
[00101] Uma nova protease S53 de Meripilus giganteus com alta atividade a baixo pH (3-4) em farelo de soja-milho foi identificada e clonada relacionada à presente invenção. Para determinar se uma dada protease é uma Serina protease, e uma protease da família S53, é feita referência ao Handbook acima e aos princípios indicados nele. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.
[00102] A presente invenção proporciona polipeptídeos tendo atividade de protease e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. As proteases da invenção são serina proteases da família de peptidases S53. As proteases da invenção exibem propriedades de pH, em especial propriedades de estabilidade ao pH, que as dotam de interesse substancial como candidatos para uso em ração animal, e outras aplicações.
[00103] As proteases da invenção são proteases acídicas com uma preferência por resíduos de aminoácidos hidrofíbicos como Leu, Tyr, Phe e Met na posição P1. As proteases têm elevada atividade em Suc-Ala-Ala-Pro- Leu-pNA e Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA com um intervalo largo de pH entre 25 e retêm mais de 95 % da atividade após serem sujeitas por 2 horas a um pH tão baixo quanto 3.
[00104] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de protease selecionados do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 83 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, (iv) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17, (v) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, (vi) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22, (vii) a fita complementar completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi); (e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (f) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 83 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (g) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22; (h) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (várias) posições; e (i) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) ou (h) tendo atividade de protease.
[00105] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00106] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 86 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00107] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00108] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 88 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00109] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 89 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00110] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00111] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00112] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00113] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00114] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00115] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00116] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00117] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00118] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00119] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00120] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00121] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 de pelo menos 84 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que trinta aminoácidos, por exemplo, por vinte e cinco aminoácidos, por vinte aminoácidos, por quinze aminoácidos, por doze aminoácidos, por dez aminoácidos, por nove aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00122] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00123] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00124] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 86 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00125] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00126] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 88 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00127] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 89 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00128] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00129] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00130] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00131] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00132] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00133] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00134] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00135] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00136] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00137] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00138] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00139] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18 de pelo menos 83 %, por exemplo, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que trinta aminoácidos, por exemplo, por vinte e cinco aminoácidos, por vinte aminoácidos, por quinze aminoácidos, por doze aminoácidos, por dez aminoácidos, por nove aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00140] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 86 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00141] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00142] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 88 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00143] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 89 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00144] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00145] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00146] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00147] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00148] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00149] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00150] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00151] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00152] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00153] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00154] Uma forma de realização da invenção consiste de um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00155] A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 de pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que trinta aminoácidos, por exemplo, por vinte e cinco aminoácidos, por vinte aminoácidos, por quinze aminoácidos, por doze aminoácidos, por dez aminoácidos, por nove aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00156] A presente invenção também se refere ao uso de polipeptídeos isolados em ração animal tendo atividade de protease selecionados do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de média estringência, condições de média-alta estringência, condições de alta estringência ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, (iv) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17, (v) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, (vi) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22, (vii) a fita complementar completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi); (e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (f) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (g) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22; (h) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (várias) posições; e (i) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) ou (h) tendo atividade de protease.
[00157] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00158] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00159] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00160] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00161] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00162] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00163] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00164] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00165] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00166] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00167] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00168] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00169] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00170] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00171] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00172] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00173] A presente invenção refere-se ao uso em ração animal de polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que vinte aminoácidos, por exemplo, por quinze aminoácidos, por dez aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis a aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00174] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00175] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00176] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00177] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00178] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00179] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00180] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00181] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00182] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00183] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00184] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00185] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00186] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00187] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00188] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00189] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00190] A presente invenção refere-se ao uso em ração animal de polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que vinte aminoácidos, por exemplo, por quinze aminoácidos, por dez aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis a aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00191] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00192] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00193] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00194] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00195] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00196] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00197] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00198] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00199] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00200] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00201] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00202] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00203] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00204] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00205] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00206] Uma forma de realização da invenção é um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo para uso em rações animais tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00207] A presente invenção refere-se ao uso em ração animal de polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que vinte aminoácidos, por exemplo, por quinze aminoácidos, por dez aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis a aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00208] Em uma modalidade de realização particular, a presente invenção também se refere a um método para a preparação de uma ração animal ou aditivo para ração, compreendendo a preparação de uma composição de ração para animais ou aditivo de ração compreendendo uma ração animal e uma protease selecionada do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; e (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00209] A presente invenção também se refere a uma composição de ração animal ou aditivo para ração, compreendendo uma ração para animais e uma protease selecionada do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; e (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00210] Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por não mais do que vinte aminoácidos, por exemplo, por quinze aminoácidos, por dez aminoácidos, por oito aminoácidos, por sete aminoácidos, por seis aminoácidos, por cinco aminoácidos, por quatro aminoácidos, por três aminoácidos, por dois aminoácidos, e por um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00211] As composições de ração animal podem, em formas de realização particulares, estar na forma de um pélete, uma composição amassada ou líquida, como adicionalmente descrito no presente documento.
[00212] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma sua variante alélica; ou é um fragmento não tendo p.ex. 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 aminoácidos do terminal N e/ou C e tendo atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto preferencial, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 2.
[00213] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18, uma sua variante alélica; ou é um fragmento não tendo p.ex. 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 aminoácidos do terminal N e/ou C e tendo atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19. Em outro aspecto preferencial, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 16.
[00214] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, uma sua variante alélica; ou é um fragmento não tendo p.ex. 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 aminoácidos do terminal N e/ou C e tendo atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste do polipeptídeo de SEQ ID NO: 24. Em outro aspecto preferencial, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 21.
[00215] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos isolados tendo atividade de protease que são codificados por polinucleotídeos que hibridam sob condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) a fita complementar completa de (i) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).
[00216] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 20 ou uma sua subsequência, bem como a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de protease a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de transferência Southern padrão, de modo a identificar e isolar o correspondente gene aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.
[00217] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que seja homólogo com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 20, ou uma sua subsequência, o material transportador é preferencialmente usado em uma transferência de Southern.
[00218] Para os propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 20, a sua cadeia complementar de comprimento total; ou uma sua subsequência; sob condições de muito baixa até muito elevada restringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.
[00219] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 20. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um seu fragmento. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21 ou um seu fragmento. Em outro aspecto preferencial, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 20.
[00220] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, são definidas condições de elevada a muito elevada estringência como pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 % para estringências muito baixas ou baixas, formamida a 35 % para estringências médias a média-elevadas, ou formamida a 50 % para estringências elevadas a muito elevadas, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas otimamente. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 65 °C (elevada estringência), e a 70 °C (muito elevada estringência).
[00221] Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de restringência são definidas como pré-hibridação e hibridação a cerca de 5 °C a cerca de 10 °C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390) em NaCl a 0,9 M, Tris-HCl a 0,09 M pH 7,6, EDTA a 6 mM, NP-40 a 0,5 %, 1X solução de Denhardt, pirofosfato de sódio a 1 mM, fosfato de sódio monobásico a 1 mM, ATP a 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por mL seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas otimamente. O material transportador é finalmente lavado uma vez em 6X SCC mais SDS a 0,1 % durante 15 minutos e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC de 5 °C a 10 °C abaixo da Tm calculada.
[00222] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos isolados tendo atividade de protease codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 84 %, p.ex., pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.
[00223] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos isolados tendo atividade de protease codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 de pelo menos 83 %, por exemplo, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.
[00224] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos isolados tendo atividade de protease codificados por polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 de pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.
[00225] Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a variantes compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção a uma ou mais (ou várias) posições de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou uma sua sequência homóloga. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições conservativas, inserções ou deleções de aminoácidos que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como uma cauda de poli-histidina ou cauda de HQ, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[00226] Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a variantes compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (ou várias) posições de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18, ou uma sua sequência homóloga. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições conservativas, inserções ou deleções de aminoácidos que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como uma cauda de poli-histidina ou cauda de HQ, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[00227] Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a variantes compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (ou várias) posições de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, ou uma sua sequência homóloga. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições conservativas, inserções ou deleções de aminoácidos que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como uma cauda de poli-histidina ou cauda de HQ, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[00228] Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As trocas que ocorrem mais habitualmente que é esperado não alterarem substancialmente a atividade específica são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Fen, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.
[00229] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físicoquímicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.
[00230] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo genitor podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítio ou mutagênese de rastreio de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Nesta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica podem ser também determinados por análise física da estrutura, tal como determinados por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais podem ser também inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que são relacionados com o polipeptídeo genitor.
[00231] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[00232] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados de elevado rendimento para detetar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.
[00233] A presente invenção também se refere a polipeptídeos variantes tendo atividade de protease e tendo pelo menos 84 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 compreendendo pelo menos uma substituição, deleção, e/ou inserção de pelo menos um ou mais (vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sua sequência homóloga.
[00234] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00235] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 86 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00236] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 87 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00237] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 88 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00238] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 89 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00239] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00240] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 91 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00241] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 92 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00242] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 93 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00243] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 94 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00244] O polipeptÌdeo variante da invenÁ„o pode em uma forma de realização ter pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00245] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 96 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00246] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 97 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00247] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 98 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00248] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.
[00249] O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 não é maior do que 20, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.
[00250] A presente invenção também se refere a polipeptídeos variantes tendo atividade de protease e tendo pelo menos 83 %, por exemplo, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18 compreendendo pelo menos uma substituição, deleção, e/ou inserção de pelo menos um ou mais (vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18 ou uma sua sequência homóloga.
[00251] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 84 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00252] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 85 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00253] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 86 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00254] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 87 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00255] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 88 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00256] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 89 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00257] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00258] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 91 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00259] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 92 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00260] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 93 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00261] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 94 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00262] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00263] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 96 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00264] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 97 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00265] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 98 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00266] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19.
[00267] O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18 não é maior do que 20, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.
[00268] A presente invenção se relaciona também com polipeptídeos variantes tendo atividade de protease e tendo pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 compreendendo pelo menos uma substituição, deleção, e/ou inserção de pelo menos um ou mais (vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 ou uma sua sequência homóloga.
[00269] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 86 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00270] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 87 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00271] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 88 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00272] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 89 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00273] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00274] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 91 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00275] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 92 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00276] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 93 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00277] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 94 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00278] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00279] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 96 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00280] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 97 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00281] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 98 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00282] O polipeptídeo variante da invenção pode em uma forma de realização ter pelo menos 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[00283] O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 não é maior do que 20, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.
[00284] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma porção de um polipeptídeo está fundida no terminal N ou terminal C de uma porção de outro polipeptídeo.
[00285] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no N- terminal ou C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo fundido é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que eles fiquem na estrutura e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. As proteínas de fusão podem ser também construídas usando tecnologia de inteína na qual são criadas fusões pós-tradução (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
[00286] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
[00287] O polipeptídeo pode ser expresso por uma sequência de DNA recombinante contendo a codificação de uma cauda de His ou cauda de HQ para dar origem, após quaisquer modificações pós-tradução, ao polipeptídeo maduro contendo a totalidade ou parte da cauda de His- ou HQ. A cauda de HQ, tendo a sequência -RHQHQHQ, pode ser total ou parcialmente clivada do polipeptídeo durante as modificações pós-tradução, resultando, por exemplo, nos aminoácidos adicionais -RHQHQ ligados ao terminal C do polipeptídeo maduro.
[00288] Moléculas de carboidratos são muitas vezes ligadas a um polipeptídeo de uma fonte fúngica durante a modificação pós-tradução. Para auxiliar a análise de espectrometria de massa, o polipeptídeo pode ser incubado com uma endoglicosidase para desglicosilar cada posição N-ligada. Para cada local desglicosilado N-ligado, uma N-acetil hexosamina permanece na cadeia principal proteica.
Formas de realização
[00289] Em certas formas de realização da invenção, a protease da invenção exibe propriedades benéficas térmicas, tais como termoestabilidade, estabilidade ao vapor, etc. e/ou de pH, tais como estabilidade em ácido, pH ótimo, etc.
[00290] Uma forma de realização da invenção consiste de polipeptídeos isolados tendo atividade de protease melhorada entre pH 2 e 5, como entre pH 2 e 4, preferencialmente entre pH 3 e 5, ou mais preferencialmente entre pH 3 e 4, a 25 oC em comparação com a protease 10R.
[00291] Uma forma de realização adicional da invenção consiste de polipeptídeos isolados tendo atividade de protease melhorada a, por exemplo, 60 oC ou menor, preferencialmente 50 oC ou menor, mais preferencialmente 37 oC ou menor; entre 25 oC e 60 oC, preferencialmente entre 25 oC e 50 oC; ou a 25 oC ou a 37 oC em comparação com a protease 10R.
[00292] Uma forma de realização adicional da invenção consiste de atividade de protease melhorada em farelo de soja-milho entre pH 3,0 e 4,0 a 40 oC em comparação com a protease 10R.
[00293] Outra forma de realização da invenção consiste de atividade proteolítica melhorada em digerido de frango de corte expressa como aumento do nível de aminas primárias em digerido do papo e/ou moela após incubação de 3 ou 1 hora em comparação com um branco de amostra não tratado com protease e em comparação com uma amostra tratada com protease 10R.
Propriedades de acidez/alcalinidade
[00294] Em certas formas de realização da invenção, a protease da invenção exibe propriedades benéficas no que respeita ao pH, tais como estabilidade em ácido, pH ótimo, etc. A estabilidade da protease a um baixo pH é benéfica uma vez que a protease pode ter atividade no intestino após passagem através do estômago. Em uma forma de realização da invenção, a protease retém >70 % de atividade, como >95 % de atividade após 2 horas a pH 3, determinada usando o método descrito no Exemplo 3.
T emperatura-atividade
[00295] O perfil de temperatura-atividade da protease pode ser determinado como descrito no Exemplo 3. Atividade a baixas temperaturas (30-40 °C) pode ser vantajosa para a digestão de proteínas em um animal.
[00296] Em uma forma de realização, a invenção compreende uma protease tendo um perfil de temperatura atividade a pH 4,0 com atividade relativa de 0,20 ou maior a 25 °C, ou atividade relativa de 0,50 ou maior a 37 °C em comparação com a atividade da protease a 50 °C (conferir com Exemplo 3).
Termoestabilidade
[00297] A termoestabilidade pode ser determinada como descrito no Exemplo 6, i.e., usando medições de DSC para determinar a temperatura de desnaturação, Td, da proteína protease purificada. A Td é indicativa da termoestabilidade da proteína: Quanto mais elevada a Td, mais elevada a termoestabilidade. Conformemente, em uma forma de realização preferencial, a protease da invenção tem uma Td que é mais elevada do que a Td de uma protease de referência, em que a Td é determinada em amostras de protease purificadas (preferencialmente com uma pureza de pelo menos 90 % ou 95 %, como determinado por SDS-PAGE).
[00298] Em formas de realização preferenciais, as propriedades térmicas tais como estabilidade ao calor, estabilidade à temperatura, termoestabilidade, estabilidade ao vapor, e/ou estabilidade à peletização como proporcionadas pela atividade residual, temperatura de desnaturação Td, ou outro parâmetro da protease da invenção são mais elevadas do que o valor correspondente, tal como a atividade residual ou Td, da protease de SEQ ID NO: 6, mais preferencialmente 101 % dele, ou pelo menos 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, ou pelo menos 110 % dele. Ainda mais preferencialmente, o valor do parâmetro, tal como atividade residual ou Td, da protease da invenção é pelo menos 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, ou pelo menos 190 % do valor para a protease de SEQ ID NO: 6.
[00299] Em formas de realização preferenciais, as propriedades térmicas tais como estabilidade ao calor, estabilidade à temperatura, termoestabilidade, estabilidade ao vapor, e/ou estabilidade à peletização como proporcionadas pela atividade residual, temperatura de desnaturação Td, ou outro parâmetro da protease da invenção são mais elevadas do que o valor correspondente, tal como a atividade residual ou Td, da protease de SEQ ID NO: 19, mais preferencialmente 101 % dele, ou pelo menos 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, ou pelo menos 110 % dele. Ainda mais preferencialmente, o valor do parâmetro, tal como atividade residual ou Td, da protease da invenção é pelo menos 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, ou pelo menos 190 % do valor para a protease de SEQ ID NO: 19.
[00300] Em formas de realização preferenciais, as propriedades térmicas tais como estabilidade ao calor, estabilidade à temperatura, termoestabilidade, estabilidade ao vapor, e/ou estabilidade à peletização como proporcionadas pela atividade residual, temperatura de desnaturação Td, ou outro parâmetro da protease da invenção são mais elevadas do que o valor correspondente, tal como a atividade residual ou Td, da protease de SEQ ID NO: 24, mais preferencialmente 101 % dele, ou pelo menos 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, ou pelo menos 110 % dele. Ainda mais preferencialmente, o valor do parâmetro, tal como atividade residual ou Td, da protease da invenção é pelo menos 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, ou pelo menos 190 % do valor para a protease de SEQ ID NO: 24.
[00301] Ainda em formas de realização particulares adicionais, a protease termoestável da invenção tem uma temperatura de fusão, Tm (ou uma temperatura de desnaturação, Td), como determinada usando Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) como descrito no exemplo 10 (i.e., em acetato de sódio a 20 mM, pH 4,0), de pelo menos 50 flC. Ainda em formas de realização particulares adicionais, a Tm é pelo menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 100 °C.
Estabilidade ao vapor
[00302] A estabilidade ao vapor pode ser determinada como descrito no Exemplo 7 por determinação da atividade residual de moléculas de protease após tratamento com vapor a 85 °C ou 90 °C durante um tempo curto.
Estabilidade à peletização
[00303] A estabilidade à peletização pode ser determinada como descrito no Exemplo 8 por uso de granulado de enzima pré-misturado com ração. A partir do misturador, a ração é condicionada com vapor até 95 °C. Após condicionamento, a ração é comprimida em péletes e a atividade residual determinada.
Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease
[00304] Um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção pode ser obtido de fungos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado nesse documento em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídio é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídio da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.
[00305] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. For exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo tendo atividade de protease de um filo tal como Basidiomycota. Em um aspecto, o polipeptídeo é uma protease de um fungo da classe Agaricomycetes, como da ordem Polyporales, ou da família Coriolaceae, ou do gênero Meripilus ou do gênero Trametes.
[00306] Será entendido que para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, p.ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica irão prontamente reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.
[00307] Estirpes destes táxons estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[00308] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo micro-organismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídio codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro micro-organismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídio codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídio pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas pelos peritos na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).
Polinucleotídeos
[00309] A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo da presente invenção.
[00310] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico, preparação a partir de cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreio com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma cepa de Bacillus sp., ou outra ou organismo relacionado da ordem Bacillales e assim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie da região codificante de polipeptídeo do polinucleotídeo.
[00311] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados compreendendo ou consistindo em polinucleotídeos tendo um grau de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 84 %, p.ex., pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codificam um polipeptídeo tendo atividade de protease.
[00312] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados compreendendo ou consistindo em polinucleotídeos tendo um grau de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 de pelo menos 83 %, por exemplo, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codificam um polipeptídeo tendo atividade de protease.
[00313] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados compreendendo ou consistindo em polinucleotídeos tendo um grau de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 de pelo menos 85 %, por exemplo, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codificam um polipeptídeo tendo atividade de protease.
[00314] A modificação de um polinucleotídeo codificado um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “uwduVcpekclogpVg similar” co rqlkrgrVifgq ug tgfgtg c 1'oπiicu fq rqlkrgrVifgq que não ocorrem naturalmente. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo manipulado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou similares. A variante pode ser construída com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 20, por exemplo, uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultam em uma mudança da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
[00315] A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados codificando polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de alta estringência, ou condições de muito alta estringência, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNA genômico compreendendo a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) a cadeia complementar completa de (i) ou (ii); ou suas variantes alélicas e subsequências (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui.
[00316] Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1, a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência de SEQ ID NO: 1 que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 2 tendo atividade de protease, tal como o polinucleotídeo dos nucleotídeos 605 a 1702 de SEQ ID NO: 1.
[00317] A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados codificando polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de alta estringência, ou condições de muito alta estringência, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15, (ii) a sequência de DNA genômico compreendendo a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, ou (iii) a cadeia complementar completa de (i) ou (ii); ou suas variantes alélicas e subsequências (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui.
[00318] Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO: 15, a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, ou uma subsequência de SEQ ID NO: 15 que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 16 tendo atividade de protease, como a sequência unida dos nucleotídeos 1207 até 1353, nucleotídeos 1412 até 1522, nucleotídeos 1577 até 1776, nucleotídeos 1832 até 1969, nucleotídeos 2031 até 2478 e nucleotídeos 2531 até 2584 de SEQ ID NO: 15.
[00319] A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isolados codificando polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de estringência média, condições de estringência média-alta, condições de alta estringência, ou condições de muito alta estringência, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 20, (ii) a sequência de DNA genômico compreendendo a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, ou (iii) a cadeia complementar completa de (i) ou (ii); ou suas variantes alélicas e subsequências (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui.
[00320] Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO: 20, a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, ou uma subsequência de SEQ ID NO: 20 que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 21 tendo atividade de protease, como a sequência unida dos nucleotídeos 1206 até 1352, nucleotídeos 1414 até 1524, nucleotídeos 1580 até 1779, nucleotídeos 1833 até 1970, nucleotídeos 2032 até 2479 e nucleotídeos 2532 até 2585 de SEQ ID NO: 20. Construções de Ácidos Nucleicos
[00321] A presente invenção se relaciona também com construções de ácidos nucleicos compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
[00322] Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.
[00323] A sequência de controle pode ser uma sequência promotora, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. A sequência promotora contém sequências de controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.
[00324] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.
[00325] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado incluindo um gene codificando uma alfa-amilase neutra em Aspergilli no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergilli; exemplos não limitantes incluem promotores modificados incluindo o gene codificando alfa-amilase neutra em Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.
[00326] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[00327] A sequência de controle pode ser também uma sequência terminadora da transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.
[00328] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.
[00329] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[00330] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.
[00331] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.
[00332] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e de um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).
[00333] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.
[00334] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
[00335] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[00336] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira de escolha.
[00337] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes da TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.
[00338] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[00339] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e que dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificadora. A sequência codificadora estranha do peptídeo sinal pode ser requerida quando a sequência codificadora não contiver naturalmente uma sequência codificadora de um peptídeo sinal. Alternativamente, a sequência codificadora estranha de um peptídeo sinal pode simplesmente substituir a sequência codificadora de um peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto, pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira de escolha.
[00340] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, prsA de Bacillus subtilis e Bascillus lentus. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[00341] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.
[00342] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[00343] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[00344] Onde estiverem presentes ambas as sequências de peptídeo sinal e pró-peptídeo, no terminal N de um polipeptídeo, a sequência de pró- peptídeo é posicionada próximo do terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal é posicionada próximo do terminal N da sequência do pró-peptídeo.
[00345] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos, podem ser usados o promotor de glucomilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, essas sequências reguladoras incluem o gene da dihidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo seria operacionalmente ligado à sequência reguladora.
Vetores de Expressão
[00346] A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais (vários) locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo a sequência em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de tal modo que a sequência codificadora esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.
[00347] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.
[00348] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.
[00349] O vetor contém preferencialmente um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas, transfetadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.
[00350] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-7Ó- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.
[00351] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.
[00352] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10000 pares de bases, 400 a 10000 pares de bases, e 800 a 10000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificadores ou codificadores. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
[00353] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.
[00354] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.
[00355] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.
[00356] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.
[00357] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.
[00358] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Células Hospedeiras
[00359] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e da sua fonte.
[00360] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.
[00361] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.
[00362] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus, incluindo mas não se limitando a células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.
[00363] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus, incluindo mas não se limitando a células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
[00364] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces, incluindo mas não se limitando a células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.
[00365] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada, por exemplo, por transformação com protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), por uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada, por exemplo, por transformação com protoplastos (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada, por exemplo, por transformação com protoplastos e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma de célula Pseudomonas pode, por exemplo, ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformação com protoplastos (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.
[00366] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.
[00367] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usados aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al., Em, CkpuyqtVj cpf Dkud{’u FkeVkqpct{ of Vjg Hwpik, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU) bem como os Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
[00368] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Ngxgfwtc” eqoq wucfq cswk kpenwk ngxgfwtc cuequrqt„igpc * Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode variar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[00369] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.
[00370] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica hkncogpVquCo “Hwpiou hHcogpVouou” ipenwgo Vqfcu cu loπiicu hHcogpVoucu fc subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
[00371] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.
[00372] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginose, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride. Uma célula hospedeira especificamente preferencial é uma célula de Aspergillus oryzae.
[00373] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de Produção
[00374] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivo de uma célula, a qual na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspecto preferencial, a célula é do gênero Bacillus. Em um aspecto mais preferencial, a célula é sp-19138 de Bacillus.
[00375] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.
[00376] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em balão agitado, e a fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo as fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais é realizada em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, pode ser recuperado de lisatos de células.
[00377] Mais detalhes são proporcionados na Seção sobre “Construtos de Ácido Nucleico, Vetores de Expressão, Células Hospedeiras Recombinante, e Métodos para Produção de Proteases" a seguir.
[00378] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzimas. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade do polipeptídeo.
[00379] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.
[00380] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo mas não se limitando a cromatografia (por exemplo, de troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e de exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.
[00381] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando um polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.
Plantas
[00382] A presente invenção se relaciona também com plantas, por exemplo, uma planta, parte de planta, ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção de modo a expressarem e produzirem o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhoria do valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.
[00383] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e maís (milho).
[00384] Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.
[00385] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além do mais, qualquer célula de planta, independentemente da origem do tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes de plantas, por exemplo, embriões, endospérmios, aleurona e revestimentos de sementes.
[00386] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.
[00387] A planta ou célula de planta transgênica expressando um polipeptídeo pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de um ou mais (vários) construtos de expressão codificando um polipeptídeo no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.
[00388] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo operacionalmente ligada a sequências reguladoras apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificação de células hospedeiras nas quais foi integrada o construto de expressão e sequências de DNA necessárias para introdução do construto na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).
[00389] A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como é desejado que o polipeptídeo seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica quanto ao desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser direcionado para um tecido ou parte de planta específico tal como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
[00390] Para expressão constitutiva, pode ser usado o promotor de 35S-CaMV, ubiquitina 1 do milho, e actina 1 do arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos quanto a órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de dreno de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata, e frutos (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de dreno metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico quanto a sementes tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de sementes desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo oleaginoso de sementes (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor da proteína de reserva napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para sementes conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico quanto a folhas tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus Chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573588). De igual modo, o promotor pode ser induzível por tratamentos abióticos tais como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, p.ex., etanol, estrogênios, hormônios de plantas tais como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.
[00391] Um elemento intensificador de promotores pode ser também usado para alcançar expressão mais elevada de um polipeptídeo na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotores pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.
[00392] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.
[00393] O construto de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na área, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
[00394] Presentemente, a transferência genética mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para geração de dicots transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e pode ser usado também para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados para estas plantas. Presentemente, o método de eleição para gerar monocotiledôneas transgênicas consiste de bombardeamento com partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA de transformação) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação com protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionais de transformação para uso de acordo com a presente divulgação incluem aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,395,966 e 7,151,204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).
[00395] Após transformação, os transformantes tendo incorporado o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é desenhado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso, por exemplo, de cotransformação com dois construtos separados de T-DNA ou excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.
[00396] Adicionalmente à transformação direta de um genótipo particular de planta com um construto preparado de acordo com a presente invenção, podem ser feitas plantas transgênicas por cruzamento de uma planta tendo o construto com uma segunda planta à qual falta o construto. Por exemplo, um construto codificando um polipeptídeo pode ser introduzida em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem necessidade de transformação direta de uma planta dessa dada variedade. Portanto, a presente invenção engloba não só uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a descendência de tais plantas. Como usado aqui, descendência pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta genitora preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção, ou uma porção de um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta em introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora. Exemplos não limitantes de tais passo são articulados na Patente dos E.U.A. No: 7.151.204.
[00397] Podem ser geradas plantas através de um processo de conversão por retrocruzamento. Por exemplo, plantas incluem plantas referidas como genótipo, linhagem, planta endogâmica, ou híbrido convertido de modo retrocruzado.
[00398] Podem ser usados marcadores genéticos para auxiliar a ingressão de um ou mais transgenes da invenção de um fundo genético para outro. A seleção auxiliada por marcadores oferece vantagens em relação ao melhoramento convencional na medida em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, marcadores genéticos podem proporcionar dados dizendo respeito ao grau relativo de plasma germinativo de elite na descendência individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outro modo tem um fundo genético agronomicamente não desejável é cruzada com uma genitora de elite, podem ser usados marcadores genéticos para selecionar descendência que não só possui o traço de interesse, mas tem também uma proporção relativamente grande do plasma germinativo desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para ingressar um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.
[00399] A presente invenção também se refere a métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.
Composições
[00400] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo uma protease da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em uma tal protease. O termo "enriquecido" indica que a atividade protease da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.
[00401] Em um aspecto, a composição compreende um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23; (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de média estringência, condições de média-alta estringência, condições de alta estringência ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (iii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, (iv) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17, (v) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20, (vi) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22, (vii) a fita complementar completa de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi); (e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (f) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 83 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; (g) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22; (h) uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (várias) posições; e (i) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) ou (h) tendo atividade de protease.
[00402] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00403] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00404] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00405] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00406] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00407] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00408] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00409] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00410] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00411] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00412] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00413] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00414] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00415] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00416] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00417] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00418] Em um aspecto, a composição compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em um aspecto adicional, a composição compreende ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto, a composição compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 2, nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 4, nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 5 ou aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 6.
[00419] Em uma forma de realização, a variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 3 tem pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
[00420] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00421] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00422] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00423] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00424] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00425] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00426] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00427] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00428] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00429] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00430] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00431] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00432] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00433] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00434] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00435] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00436] Em um aspecto, a composição compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18. Em um aspecto adicional, a composição compreende ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 19. Em outro aspecto, a composição compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 16, nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 18, ou nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 19.
[00437] Em uma forma de realização, a variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 19 tem pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.
[00438] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00439] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 75 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00440] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00441] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00442] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00443] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00444] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 91 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00445] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 92 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00446] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 93 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00447] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 94 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00448] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00449] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 96 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00450] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00451] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00452] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00453] Uma forma de realização da invenção consiste de uma composição compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00454] Em um aspecto, a composição compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23. Em um aspecto adicional, a composição compreende ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 24. Em outro aspecto, a composição compreende ou consiste nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 21, nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 23, ou nos aminoácidos 1 a 366 de SEQ ID NO: 24.
[00455] Em uma forma de realização, a variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos de SEQ ID NO: 24 tem pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
[00456] Em uma forma de realização preferencial, a composição é uma composição de ração animal que compreende adicionalmente uma ou mais amilases, fitases, xilanases, galactanases, alfa-galactosidases, proteases, fosfolipases, beta-glucanases, ou qualquer mistura respectiva.
[00457] Em outra forma de realização preferencial, a composição é um aditivo de ração animal que compreende adicionalmente pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral vestigial. O aditivo de ração animal pode adicionalmente compreender uma ou mais amilases, fitases, xilanases, galactanases, alfa-galactosidases, proteases, fosfolipases, beta-glucanases, ou qualquer mistura respectiva.
[00458] A composição podem compreender uma protease da presente invenção como principal componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa- glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. A(s) enzima(s) adicional(ais) pode(m) ser produzida(s), por exemplo, por microrganismos tais como bactérias ou fungos ou por plantas ou por animais. As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. A protease pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Usos
[00459] A presente invenção também é dirigida a métodos de uso dos polipeptídeos tendo atividade de protease, ou respectivas composições, por exemplo, para ração animal.
Uso em Ração Animal
[00460] A presente invenção é também dirigida a métodos para uso das proteases tendo atividade de protease em rações animais, bem como composições de ração e aditivos de ração compreendendo as proteases da invenção.
[00461] O termo animal inclui todos os os animais. Exemplos de animais são não ruminantes, e ruminantes. Animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras, e gado, por exemplo, gado de corte, vacas, e bezerros. Em uma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Animais não ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em crescimento, e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas não se limitando a frangos de corte, galinhas poedeiras); cavalos (incluindo mas não se limitando a de sangue quente, de sangue frio e de sangue morno); bezerros jovens; e peixe (incluindo mas não se limitando a salmão, truta, tilápia, peixe-gato e carpas); e crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e gambas).
[00462] O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura, ou composição adequada para ou destinada a toma por um animal.
[00463] No uso de acordo com a invenção, a protease pode ser alimentada ao animal antes do, após o, ou simultaneamente com o regime alimentar. Este último é preferencial.
[00464] Em uma forma de realização particular, a protease, na forma na qual é adicionada à ração, ou quando estando incluída em um aditivo de ração, está bem definida. Bem definida significa que a preparação de protease é pelo menos 50 % pura como determinado por Cromatografia de exclusão por tamanhos (ver Exemplo 12 de WO 01/58275). Em outras formas de realização particulares, a preparação de protease é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95 % pura como determinado por este método.
[00465] Uma preparação de protease bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosear corretamente na ração uma protease que esteja essencialmente livre de interferir ou contaminar outras proteases. O termo dosear corretamente se refere em particular ao objetivo de obtenção de resultados consistentes e constantes, e à capacidade de otimização da dosagem com base no efeito desejado.
[00466] Para o uso em rações animais, no entanto, a protease não necessita de ser tão pura; pode, por exemplo, incluir outras enzimas, em cujo caso deveria ser denominada uma preparação de protease.
[00467] A preparação de protease pode ser (a) diretamente adicionada à ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas), ou (b) pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias, tais como aditivos ou pré-misturas de ração, que são subsequentemente adicionadas à ração (ou usadas em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima se refere à pureza da preparação de protease original, usada de acordo com (a) ou (b) acima.
[00468] As preparações de protease com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de produção, ao passo que elas não são tão facilmente obtidas e também sujeitas a uma variação lote-para-lote muito mais elevada quando a protease é produzida por métodos de fermentação tradicionais.
[00469] Tal preparação de protease pode obviamente ser misturada com outras enzimas.
[00470] A proteína pode ser uma proteína animal, tal como farinha de carne e ossos, farinha de penas, e/ou farinha de peixe; ou pode ser uma proteína vegetal.
[00471] O termo proteínas vegetais como usadas aqui se refere a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou tendo origem em um legume, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em formas de realização particulares, o conteúdo de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 % (p/p).
[00472] As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, tais como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, tais como farinha de soja, farinha de tremoço e farinha de colza.
[00473] Em uma forma de realização particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha, ou feijão.
[00474] Em outra forma de realização particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa.
[00475] Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza, semente de girassol, semente de algodão, e couve.
[00476] Soja é uma fonte de proteínas vegetais preferencial.
[00477] Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz, triticale, e sorgo.
[00478] Em uma forma de realização particular de um processo de tratamento, a(s) protease(s) em questão está(ão) afetando as (ou atua(m) sobre as, ou exerce(m) sua influência de hidrólise ou degradação nas) proteínas, tais como proteínas ou fontes de proteínas vegetais. Para alcançar isto, a proteína ou fonte de proteínas é tipicamente suspensa em um solvente, p.ex., um solvente aquoso tal como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados prestando a devida atenção às características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento pode ter lugar a um valor de pH ao qual a atividade da protease real é pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou pelo menos 90 %. Do mesmo modo, por exemplo, o tratamento pode ter lugar a uma temperatura à qual a atividade da protease real é pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou pelo menos 90 %. As indicações de percentagens de atividade acima são em relação às atividades máximas. A reação enzimática é continuada até ser alcançado o resultado desejado, após o que pode ou não ser parada por inativação da enzima, por exemplo, por um passo de tratamento com calor.
[00479] Em outra forma de realização particular de um processo de tratamento da invenção, a ação de protease é sustentada, significando, por exemplo, que a protease é adicionada às proteínas, mas sua influência de hidrólise não é por assim dizer ligada até mais tarde quando desejado, logo que sejam estabelecidas condições de hidrólise adequadas, ou logo que sejam inativados quaisquer inibidores de enzima, ou quaisquer outro meios que possam ter sido aplicados para adiar a ação da enzima.
[00480] Em uma forma de realização, o tratamento é um pré- tratamento de ração animal ou proteínas para uso em ração animal, i.e., as proteínas são hidrolisadas antes da toma.
[00481] O termo melhoria do valor nutricional de uma ração animal significa melhoria da disponibilidade de nutrientes na ração. Nessa invenção, melhoria dos valores nutricionais se refere, em particular, à melhoria da disponibilidade da fração de proteína da ração, levando deste modo a extração de proteínas aumentada, rendimentos de proteínas mais elevados, e/ou utilização de proteínas melhorada. Quando o valor nutricional da ração é aumentado, a digestibilidade das proteínas e/ou aminoácidos é aumentada e a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão da ração (i.e., o peso da ração ingerida em relação ao ganho de peso) do animal podem ser melhorados.
[00482] A protease pode ser adicionada à ração em qualquer forma, seja uma protease relativamente pura ou em mistura com outros componentes destinados a adição a ração animal, ou seja, na forma de aditivos de rações animais, tal como as chamadas pré-misturas para ração animal.
[00483] Em um aspecto adicional, a presente invenção se relaciona com composições para uso em ração animal, tais como ração animal, e aditivos de ração animal, por exemplo, pré-misturas.
[00484] Sem ser a protease da invenção, os aditivos de ração animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral vestigial, e/ou pelo menos um macromineral.
[00485] Ingredientes aditivos de ração adicionais, opcionais, são agentes corantes, p.ex. carotenoides tais como beta-caroteno, astaxantina, e luteína; estabilizantes; aditivos melhoradores do crescimento e compostos de aroma/aromatizantes, p.ex. creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilideno ftalida, butilideno ftalida, capsaicina e/ou tanina; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs); espécies geradoras de oxigênio reativo; igualmente, pode ser usado um suporte que possa conter, por exemplo, 40-50 % por peso de fibras de madeira, 8-10 % por peso de estearina, 4-5 % por peso de pó de curcuma, 4-58 % por peso de pó de alecrim, 22-28 % por peso de calcário, 13 % por peso de uma goma, tal como goma arábica, 5-50 % por peso de açúcar e/ou amido e 5-15 % por peso de água.
[00486] Uma ração ou um aditivo de ração da invenção pode também compreender pelo menos uma outra enzima selecionada de entre fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa- galactosidase (EC 3.2.1.22); protease adicional (EC 3.4), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); lisozima (EC 3.2.1.17); e/ou beta- glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).
[00487] Em uma forma de realização particular, a ração ou aditivo de ração da invenção também compreende uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26).
[00488] Em uma forma de realização particular, a ração ou aditivo de ração da invenção também compreende uma xilanase (EC 3.2.1.8).
[00489] Uma ração ou um aditivo de ração da invenção pode também compreender pelo menos um probiótico ou alimento direto microbiano (DFM) opcionalmente em conjunto com uma ou mais enzimas diferentes selecionadas de fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); outra protease (EC 3.4), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase, tal como, for exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); e/ou beta- glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).
[00490] O alimento direto microbiano pode ser uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação destas, preferencialmente de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp e mais preferencialmente de estirpes de Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4 (PTA-6507); 22C-P1 (PTA-6508); 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-501 05); BS 18 (NRRL B-50633); e BS 278 (NRRL B-50634).
[00491] Em uma forma de realização particular, estas outras enzimas estão bem definidas (como definido acima para preparações de protease).
[00492] Gzgornqu fg rgrVifgqu cpVkoketqdkcpqu *CORÓU+ u«q ECR3:. Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados em WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos dos acima que retenham atividade antimicrobiana.
[00493] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFPs) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como suas variantes e fragmentos que retenham atividade antifúngica, como divulgado em WO 94/01459 e WO 02/090384.
[00494] Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.
[00495] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são químicos tais como perborato, persulfato, ou percarbonato; e enzimas tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.
[00496] Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais vestigiais, formam parte de uma assim chamada pré-mistura destinada para adição à ração, ao passo que macrominerais são usualmente separadamente adicionados à ração. Qualquer um destes tipos de composição, quado enriquecido com uma protease da invenção, é um aditivo de ração animal da invenção.
[00497] Em uma forma de realização particular, o aditivo de ração animal da invenção se destina a estar incluído (ou prescrito como tendo de estar incluído) em regimes alimentares ou ração de animais a níveis de 0,01 a 10,0 %; mais particularmente 0,05 a 5,0 %; ou 0,2 a 1,0 % (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para pré-misturas.
[00498] O que se segue são listas não exclusivas de exemplos destes componentes:
[00499] Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.
[00500] Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.
[00501] Exemplos de minerais vestigiais são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio, e cobalto.
[00502] Exemplos de macrominerais são cálcio, fósforo e sódio.
[00503] Os requisitos nutricionais destes componentes (exemplificados com aves domésticas e leitões/porcos) são listados na Tabela A de WO 01/58275. Requisito nutricional significa que estes componentes devem ser proporcionados no regime alimentar nas concentrações indicadas.
[00504] Em alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dos, um ou mais do que, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a proporcionar uma concentração na ração dentro da gama indicada na coluna 4, ou coluna 4, ou coluna seis da Tabela A.
[00505] Ainda em uma forma de realização adicional, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas a seguir, preferencialmente para proporcionar uma concentração na ração dentro das gamas especificadas na Tabela 1 a seguir (para regimes alimentares de leitões, e regimes alimentares de frangos de corte, respetivamente). Tabela 1: Recomendações típicas de vitaminas
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[00506] A presente invenção se relaciona também com composições de rações animais. As composições de rações animais ou regimes alimentares têm um conteúdo de proteína relativamente elevado. Os regimes alimentares de aves domésticas e porcos podem ser caracterizados como indicado na Tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. Os regimes alimentares de peixes podem ser caracterizados como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além do mais, tais regimes alimentares de peixes têm um conteúdo de gordura em bruto de 200-310 g/kg.
[00507] WO 01/58275 corresponde a US 09/779334 que é aqui incorporado por referência.
[00508] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um conteúdo de proteína bruta de 50-800 g/kg, e além do mais compreende pelo menos uma protease como reivindicado aqui.
[00509] Além do mais, ou em alternativa (ao conteúdo de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um conteúdo de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um conteúdo de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um conteúdo de lisina de 0,5-50 g/kg.
[00510] Em formas de realização particulares, o conteúdo de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está dentro de qualquer uma das gamas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B de WO 01/58275 (L. 2-5).
[00511] A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, i.e., Proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O conteúdo de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
[00512] A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revista 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e a European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN, 9071463-12-5.
[00513] O conteúdo no regime alimentar de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em regimes alimentares animais completos é calculado com base em tabelas de ração tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN, 90-72839-13-7.
[00514] Em uma forma de realização particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal como definido acima.
[00515] A composição de ração animal da invenção pode conter também proteína animal, tal como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou Farinha de Peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25 %. A composição de ração animal da invenção pode conter também Grãos Secos Destilados com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30 %.
[00516] Ainda em formas de realização particulares adicionais, a composição de ração animal da invenção contém milho a 0-80 %; e/ou sorgo a 0-80 %; e/ou trigo a 0-70 %; e/ou Cevada a 0-70 %; e/ou aveia a 0-30 %; e/ou farinha de soja a 0-40 %; e/ou farinha de peixe a 0-25 %; e/ou farinha de carne e ossos a 0-25 %; e/ou soro de leite coalhado a 0-20 %.
[00517] Os regimes alimentares animais podem p.ex. ser fabricados como ração em puré (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os alimentos moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminais essenciais e minerais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração em puré, uma formulação de enzimas sólida ou líquida pode ser adicionada antes do ou durante o passo de mistura dos ingredientes. Para ração peletizada, a preparação de protease/enzimas (líquida ou sólida) pode ser também adicionada antes do ou durante o passo de ingredientes da ração. Tipicamente, uma preparação de protease/enzimas líquida é adicionada após o passo de peletização. A enzima pode ser também incorporada em um aditivo ou pré- mistura de ração.
[00518] A concentração final de enzima no regime alimentar está dentro da gama de 0,01-200 mg de proteína de enzima por kg de regime alimentar, por exemplo, na gama de 0,5-25 mg de proteína de enzima por kg de regime alimentar animal.
[00519] A protease deve obviamente ser aplicada em uma quantidade eficaz, i.e., em uma quantidade adequada para melhoria da hidrólise, digestibilidade, e/ou melhoria do valor nutricional da ração. Está presentemente contemplado que a enzima seja administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (gamas de dosagem): 0,01-200; 0,01-100; 0,5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0,05-50; ou 0,10-10 - todas estas gamas sendo em mg de proteína protease por kg de ração (ppm).
[00520] Para determinação dos mg de proteína protease por kg de ração, a protease é purificada da composição de ração, e a atividade específica da protease purificada é determinada usando um ensaio relevante (ver sob atividade de protease, substratos, e ensaios). A atividade de protease da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo ensaio, e com base em estas duas determinações, a dosagem em mg de proteína protease por kg de ração é calculada.
[00521] Os mesmos princípios se aplicam para determinação de mg de proteína protease em aditivos de ração. Obviamente, se uma amostra da protease usada para preparação do aditivo de ração ou da ração estiver disponível, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (nenhuma necessidade de purificar a protease da composição ou aditivo de ração). Construtos de Ácido Nucleico, Vetores de expressão, Células Hospedeiras Recombinantes, e Métodos de Produção de Proteases
[00522] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes compreendendo esses polinucleotídeos codificando as proteases da invenção.
[00523] A presente invenção também se refere a métodos de produção de uma protease, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo tal polinucleotídeo; e (b) recuperar a proteína.
[00524] A proteína pode ser nativa ou heteróloga para uma célula jqurgfgktCo Q Vetoq "proteína” p«q ug fguVkpc cswk rctc tefetkt wo comprimento específico do produto codificado e, portanto, engloba peptídeos, oligopeptídeou. e rtqVeipcUo Q Vetoq “rtqVeipc” ep^qdc Vcodfio fqku qw ocku polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas incluem também polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.
[00525] De preferência, a proteína é uma protease. Por exemplo, a proteína pode ser uma hidrolase, tal como uma enzima proteolítica ou protease.
[00526] O gene pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica, ou outra.
[00527] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.
EXEMPLOS Materiais e Métodos Meios
[00528] O meio DAP4C-1 era composto por 0,5 g de extrato de levedura, 10 g de maltose, 20 g de dextrose, 11 g de sulfato de magnésio heptaidratado, 1 g de fosfato de dipotássio, 2 g de ácido cítrico monoidratado, 5,2 g de fosfato de potássio tribásico monoidratado, 1 mL de Dowfax 63N10 (agente antiespumante), 2,5 g de carbonato de cálcio, suplementado com 1 mL de solução de metal KU6, e água desionizada até 1000 mL.
[00529] A solução de metal KU6 era composta por 6,8 g de ZnCl2, 2,5 g de CuSO4.5H2O, 0,13 g de NiCl2, 13,9 g de FeSO4.7H2O, 8,45 g de MnSO4.H2O, 3 g de C6H8O7.H2O, e água desionizada até 1000 mL.
[00530] As placas LB eram compostas por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar Bacto, e água até 1000 mL.
[00531] O meio LB era composto por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, e 10 g de cloreto de sódio, e água desionizada até 1000 mL.
[00532] As placas de Sacarose-T COVE eram compostas por 342 g de sacarose, 20 g de pó de ágar, 20 mL de solução de sais COVE, e água desionizada até 1000 mL. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado até 60 °C e foram adicionados acetamida a 10 mM, Triton X-100 (50 μL/500 mL).
[00533] Os tubos N-Ágar COVE eram compostos por 218 g de Sorbitol, 10 g de Dextrose, 2,02 g de KNO3, 25 g de Ágar, 50 mL de solução de sais Cove, e água desionizada até 1000 mL.
[00534] A solução de sais COVE era composta por 26 g de MgSO4^7H2O, 26 g de KCl, 26 g de KH2PO4, 50 mL de solução de metais vestigiais COVE, e água desionizada até 1000 mL.
[00535] A solução de metais vestigiais COVE era composta por 0,04 g de N2B4O74OH2O, 0,4 g de CuSCM-SHO, 1,2 g de FeSCM^O, 0,7 g de MnSO4-H2Ü, 0,8 g de Na.2MoO4*2H2O, 10 g de ZnSO4-7H2O, e água desionizada até 1000 mL. Ensaios de protease Ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA: : Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400). : Temperatura ambiente (25 °C) : Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 % ajustado até valores de pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, e 11,0 com HCl ou NaOH.
[00536] 20 oL de amostra de protease (diluídos em Triton X-100 a 0,01 %) foram misturados com 100 oL de tampão de ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 oL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01 %). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease. Ensaio de ponto final de Suc-AAPF-pNA: : Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400). : controlada (temperatura de ensaio). : Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 %, pH 4,0.
[00537] 200oL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com o tampão de Ensaio) foram pipetados para um tubo Eppendorf e colocados em gelo. Foram adicionados 20 oL de amostra de protease (diluída em Triton X-100 a 0,01 %). O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura de ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi terminada transferindo o tubo novamente para o banho de gelo e adicionando 600oL de H3BO3/NaOH 500 mM, pH 9,7. O tubo foi misturado e 200oL da mistura foram transferidos para uma placa de microtitulação, que foi lida a OD405. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). OD405(Amostra) - OD405(Cego) foi uma medida da atividade de protease. Ensaio de Protazyme AK: Substrato : Comprimido de Protazyme AK (caseína reticulada e corada; da Megazyme) Temperatura : controlada (temperatura de ensaio). Tampão do ensaio : Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 %, pH 6,5.
[00538] Um comprimido de Protazyme AK foi suspenso em 2,0 mL de Triton X-100 a 0,01 % por agitação suave. 500 oL desta suspensão e 500 oL de tampão de ensaio foram dispensados em tubo Eppendorf e colocados em gelo. Foram adicionados 20 oL de amostra de protease (diluída em Triton X100 a 0,01 %). O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura de ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi parada por transferência do tubo de volta ao banho de gelo. Depois, o tubo foi centrifugado em uma centrífuga gelada durante alguns minutos e 200 oL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação, que foi lida a OD650. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). OD65o(Amostra) - OD65o(Cego) foi uma medida da atividade de protease. Ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA: Substratos de pNA : Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775) Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720) Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835) Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790) Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395) Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770) Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390) Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710) Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725) Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400). Temperatura : Temperatura ambiente (25 °C) Tampão do ensaio : Ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 %, pH 4,0 ou pH 9,0.
[00539] 20 oL de protease (diluídos em Triton X-100 a 0,01 %) foram misturados com 100 oL de tampão de ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 oL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01 %). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease. Ensaio de o-Ftaldialdeído (OPA):
[00540] Este ensaio detecta aminas primárias e, consequentemente, a clivagem de ligações peptídicas por uma protease pode ser medida como a diferença na absorvância entre uma amostra tratada com protease e uma amostra de controle. O ensaio é conduzido essencialmente de acordo com Nielsen et al. (Nielsen, PM, Petersen, D, Dampmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J Food Sci, 2001, 66: 642- 646).
[00541] 500 μL de amostra são filtrados através de um filtro centrífuga Microcon de 100 kDa (60 minutos, 11 000 rpm, 5 °C). As amostras são diluídas apropriadamente (por exemplo, 10, 50 ou 100 vezes) em água desionizada e 25 μL de cada amostra são carregados em uma placa de microtitulação de 96 poços (5 replicados). 200 μL de reagente OPA (tetraborato dissódico decaidratado a 100 mM, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 3,5 mM, di-tiotreitol (DDT) a 3,5 mM,o-ftaldialdeído a 6 mM) são dispensados em todos os poços, a placa é agitada (10 seg, 750 rpm) e a absorvância medida a 340 nm. Cepa
[00542] A cepa Meripilus giganteus foi isolada de um corpo de frutificação coletado na Dinamarca em 1993 pela Novozymes.
[00543] Uma cepa interna de Trametes cf. versicolor identificada por sequenciamento ITS (Internal Transcribed Spacer) foi usada como fonte do gene de protease SEQ ID NO: 15.
[00544] Uma segunda cepa de Trametes versicolor sequenciada pelo Genome Canada (www.fungalgenomics.ca) foi usada para identificar o gene de protease SEQ ID NO: 20.
[00545] A cepa de Escherichia coli Top-10 adquirida à Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi usada para propagar os vetores de expressão.
[00546] A cepa de Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para expressão heteróloga do gene que codifica polipeptídeos tendo homologia com polipeptídeos com atividade de protease. A. oryzae MT3568 é um derivado do gene destruído amdS (acetamidase) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) no qual a auxotrofia de pyrG foi restabelecida por destruição do gene de acetamidase (amdS) de A. oryzae com o gene pyrG. Exemplo 1: Expressão recombinante da protease S53 3 de Meripilus giganteus (SEQ ID NO: 3)
[00547] Com o propósito de obter material para a realização de testes e caracterização da Protease S53 3 de Meripilus giganteus, a sequência de DNA de Seq ID NO: 1 foi clonada em um vetor de expressão de Aspergillus e expressa em Aspergillus oryzae.
[00548] O gene de Protease S53 3 de Meripilus giganteus foi subclonado no vetor de expressão de Aspergillus pMStr100 (WO 10/009400) por amplificação da região codificante sem o códon de terminação do DNA na Seq ID NO: 1 do clone plasmídico de cDNA, pA2PR22, com técnicas de PCR padrão usando os seguintes "primers": 597 TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT (SEQ ID NO: 13) 598 CAGGCCGACCGCGGTGAG (SEQ ID NO: 14)
[00549] O produto de PCR foi restringido com BamHI e ligado nos locais de BamHI e NruI de pMStr100, resultando em uma fusão na estrutura com a sequência de cauda C-terminal RHQHQHQH(fim) no vetor de expressão. O gene de Protease S53 3 na construção de expressão resultante de Aspergillus, pMStr121, foi sequenciado, e a porção codificante de protease da sequência foi confirmada de modo a concordar com a sequência codificante original de SEQ ID NO: 1. A fusão na estrutura à sequência codificante da cauda também foi confirmada, originando a sequência na SEQ ID NO: 3, que codifica a sequência peptídica em SEQ ID NO: 4.
[00550] A cepa de Aspergillus oryzae BECh2 (WO 00/39322) foi transformada com pMStr121 usando técnicas comuns, como descrito por Christensen et al., 1988, Biotechnology 6, 1419-1422 e WO 04/032648. Para identificar transformantes produtores da protease recombinante, os transformantes e BECh2 foram cultivados em 10 mL de meio YP+2 % glucose a 30 °C e 200 RPM. Amostras foram tiradas após 3 dias de crescimento e resolvidas com SDS-PAGE para identificar a produção de protease recombinante. Foi observada uma nova banda entre 35 e 50 kDa em culturas de transformantes que não foi observada em culturas de BECh2 não transformada. Vários transformantes que aparentaram expressar a protease recombinante em níveis elevados foram adicionalmente cultivados em 100 mL de meio YP+2 % glucose em balões agitados de 500 mL a 30 °C e 200 RPM. Foram coletadas amostras após 2, 3, e 4 dias de crescimento e os níveis de expressão foram comparados resolvendo as amostras com SDS-PAGE. Um único transformante que expressou a protease recombinante em níveis relativamente elevados foi selecionado e denominado EXP01737. EXP01737 foi isolado duas vezes usando estriamento por diluição de conídios em meio seletivo contendo TRITON® X-100 0,01 %, para limitar a dimensão das colônias, e fermentado em meio YP+2 % glucose em balões agitados como descrito acima para proporcionar material para a purificação. As culturas em balões agitados foram coletadas passados 4 dias de cultivo e micélios fúngicos foram removidos filtrando o caldo de fermentação através de Miracloth (Calbiochem) e então foram purificados como descrito no exemplo 2. Meio YP+2 % Glucose 10 g de extrato de levedura 20 g de peptona água até 1 L autoclave a 121 °C, 20 minutos adicionar 100 mL de solução de glucose 20 % estéril Exemplo 2: Purificação da protease S53 3 de Meripilus giganteus com cauda C-terminal de HQ
[00551] O caldo de cultura foi centrifugado (20000 x g, 20 min) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado do precipitado. O sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 μm Nalgene de modo a se remover o resto das células hospedeiras de Aspergillus . O filtrado de 0,2 μm foi transferido para Ácido succínico/NaOH a 10 mM, pH 3,5 em uma coluna G25 Sephadex (da GE Healthcare). A enzima transferida para G25 sephadex foi aplicada a uma coluna Q-sefarose FF (da GE Healthcare) equilibrada em Ácido succínico/NaOH a 10 mM, pH 3,5. A fração de passagem e lavagem com Ácido succínico/NaOH 10 mM, pH 3,5, foi coletada e continha a protease S53 (atividade confirmada usando o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA a pH 4). O pH da fração de passagem e lavagem foi ajustado para pH 3,25 com HCl 1 M com mistura extensa da fração. A solução de pH ajustado foi aplicada em uma coluna de SP-sefarose FF (da GE Healthcare) equilibrada em Ácido succínico/NaOH 10 mM, pH 3,25. Após lavagem extensa da coluna com o tampão de equilibração, a protease eluiu com um gradiente linear de NaCl (0 --> 0,5 M) no mesmo tampão ao longo de dez volumes da coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto a atividade de protease (usando o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA a pH 4) e as frações-pico foram reunidas. Adicionou-se à reunião sulfato de amônio sólido para uma concentração final de 2,0 M de (NH4)2SO4. A solução enzimática foi aplicada em uma coluna Fenil-Toyopearl (da TosoHaas) equilibrada em Ácido succínico/NaOH 10 mM, (NH4)2SO4 2,0 M, pH 3,25. Após lavagem extensa da coluna com o tampão de equilibração, a protease S53 eluiu com um gradiente linear entre o tampão de equilibração e Ácido succínico/NaOH 10 mM, pH 3,25 ao longo de dez volumes da coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto a atividade de protease (usando o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA a pH 4). Frações com alta atividade foram agrupadas e transferidas para Ácido succínico/NaOH a 10 mM, pH 3,5 em uma coluna G25 Sephadex (da GE Healthcare). A protease transferida para G25 sephadex foi aplicada a uma coluna SP-sefarose HP (da GE Healthcare) equilibrada em Ácido succínico/NaOH a 10 mM, pH 3,5. Após lavagem extensa da coluna com o tampão de equilibração, a protease eluiu com um gradiente linear de NaCl (0 --> 0,5 M) no mesmo tampão ao longo de cinco volumes da coluna. As frações que constituíram o pico principal da coluna foram reunidas, constituindo o produto purificado. O produto purificado foi analisado por SDS-PAGE e no gel foi observada uma banda principal e três bandas menores. O sequenciamento N-terminal de EDMAN das bandas mostrou que todas as bandas estavam relacionadas à protease S53 e, em consequência, esperamos que as bandas menores representem cortes de algumas das moléculas da protease S53. O produto purificado foi usado para caracterização adicional. Exemplo 3: Caracterização da protease S53 3 de Meripilus giganteus com cauda C-terminal de HQ
[00552] O ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA foi usado para obtenção do perfil de pH-atividade e do perfil de pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas aos valores de pH indicados). Para o perfil de pH-estabilidade, a protease foi diluída 10x nos diferentes tampões de ensaio para alcançar os valores de pH destes tampões e depois incubada durante 2 horas a 37 oC. Após incubação, o pH das incubações de protease foi transferido para o mesmo valor de pH, antes de ensaio quanto a atividade residual, por diluição no Tampão de ensaio a pH 4,0. O ensaio de Ponto final de Suc-AAPF-pNA foi usado para obtenção do perfil de temperatura-atividade a pH 4,0. O ensaio Cinético de Suc-AAPX-pNA e dez substratos diferentes de Suc-AAPX-pNA foram usados para obtenção da especificidade para P1 da enzima a pH 4,0.
[00553] Os resultados são mostrados nas tabelas 2-5 embaixo. Dados para a Protease 10R estão incluídos nas tabelas. Para a tabela 2, as atividades são relativas ao pH ótimo para as enzimas. Para a tabela 3, as atividades são atividades residuais relativas a amostras, que foram mantidas em condições estáveis (5 oC, pH 4,0 para a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2); 5 oC, pH 9,0 para a Protease 10R). Para a tabela 4, as atividades são relativas à temperatura ótima para a enzima (pH 4,0 para a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2); pH 6,5 para a Protease 10R). Para a tabela 5, as atividades são relativas ao melhor substrato para as enzimas (Suc- AAPL-pNA para a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2)). O ensaio de Protazyme AK foi usado para obtenção do perfil de temperatura- atividade a pH 6,5 para a Protease 10R.
[00554] O perfil pH-atividade no substrato Suc-AAPF-pNA, o perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas a 37 oC), o perfil temperatura atividade em Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 e a especificidade para P1 em 10 substratos Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 para a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em comparação com os dados para a Protease 10R também são apresentados nas figuras 1-4. Para a Protease 10R, o perfil temperatura atividade é obtido em Protazyme AK a pH 6,5 e a especificidade para P1 é obtida a pH 9,0. Tabela 2: Perfil pH-atividade a 25 oC determinado usando o ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA
Figure img0004
Tabela 3: Perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas a 37 oC) determinado usando o ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA
Figure img0005
Tabela 4: Perfil temperatura atividade a pH 4,0 ou pH 6,5 determinado usando o ensaio de ponto final de Suc-AAPF-pNA
Figure img0006
Tabela 5: Especificidade para P1 em 10 substratos Suc-AAPX-pNA a pH 4,0 ou pH 9,0 a 37 oC determinada usando o ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA
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Outras características da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2)
[00555] A determinação da sequência N-terminal foi: AIPASCASTI.
[00556] O peso molecular relativo, determinado por SDS-PAGE, foi aproximadamente Mr = 43 kDa. Confirmação da cauda HQ C-terminal ligada à sequência madura
[00557] O tamp„o dessa amostra foi trocado com tamp„o de acetato de sÛdio 50 mM pH 5,5 usando uma unidade de ultrafiltraÁ„o Vivaspin equipada com um filtro de corte a 10 kDa. ApÛs a troca do tamp„o adicionaram-se 2 µL de endoglicosidase H e a amostra foi ent„o incubada a 5 °C por uma noite. Nota: Para cada local N-ligado desglicosilado permanece um resÌduo N-acetil hexosamina na cadeia principal da proteÌna, aumentando o peso molecular em 203,19 Da por local. A amostra foi ent„o analisada por espectrometria de massa.
[00558] O peso molecular determinado por an·lise do peso molecular intato do pico principal foi: 38088,6 Da, correspondente a um valor dentro de 1,8 Da da sequÍncia madura mais –RHQHQ mais uma ˙nica acetil hexosamina e um resÌduo cisteÌna n„o reticulado.
[00559] O peso molecular determinado por análise do peso molecular intato do pico secundário foi: 37961 Da, correspondente a um valor dentro de 2,3 Da da sequência madura mais -RHQH mais uma única acetil hexosamina e um resíduo cisteína não reticulado.
[00560] A sequência madura (dos dados do sequenciamento N-terminal de EDMAN e análise do peso molecular intato):
[00561] AIPASCASTITPACLQAIYGIPTTKATQSSNKLAVSGFIDQ FANKADLKSFLAQFRKDISSSTTFSLQTLDGGENDQSPSEAGIEANLDI QYTVGLATGVPTTFISVGDDFQDGNLEGFLDIINFLLGESNPPQVLTTS YGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGVSGSQSAHC SNFVPTFPSGCPFMTSVGATQGVSPETAAAFSSGGFSNVFGIPSYQASA VSGYLSALGSTNSGKFNRSGRGFPDVSTQGVDFQIVSGGQTIGVDGTS CASPTFASVISLVNDRLIAAGKSPLGFLNPFLYSSAGKAALNDVTSGSN PGCSTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLLTAVGLRHQHQ (SEQ ID NO: 6).
[00562] O peso molecular calculado dessa sequência madura é 37882,6 Da.
Exemplo 4: Ensaio de atividade em farinha de soja-milho
[00563] Um ensaio de ponto final usando farinha de soja-milho como substrato foi usado para obtenção do perfil de atividade das proteases a pH 37.
[00564] Substrato: Farinha de soja-farinha de milho misturadas em uma razão 30:70.
[00565] Tampões do ensaio: 9 tampões contendo ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CAPS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 % foram preparados e ajustados, usando HCl ou NaOH, até um valor de pH tal que, após o substrato de farinha de soja-milho (1 g) ter sido misturado com tampão de ensaio (10 mL) para dar uma pasta, o pH final da pasta seja um dos seguintes pHs: 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0.
[00566] A pasta de substrato (2 mL) foi misturada durante 30 minutos antes da adição de protease e foi incubada durante 3 horas a 40 °C (500 rpm). A protease (200 mg de proteína enzimática/kg de matéria seca) foi dissolvida em 100 μL de tampão de acetato de sódio a 100 mM (9,565 g/L de NaOAc, 1,75 g/L de ácido acético, CaCl2 a 5 mM, BSA a 0,01 %, Tween20 a 0,01 %, pH 6,0) e adicionada. As amostras foram centrifugadas (10 min, 4000 rpm, 0 °C) e os sobrenadantes recolhidos para análise usando o ensaio o- Ftaldialdeído (OPA).
[00567] Os resultados estão apresentados na Tabela 6 embaixo. A atividade proteolítica da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em farelo de soja-milho é máxima a pH 3 e decresce com pH crescente. A pH 5, a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) é tão ativa em farelo de soja-milho quanto a Protease 10R, ao passo que a pH 3 e pH 4 a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) é muito mais ativa do que a Protease 10R. Esses resultados indicam que a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) pode ser eficiente para obter hidrólise de proteínas no trato gastrointestinal superior de animais monogástricos, tais como, por exemplo, porcos e aves domésticas, conduzindo a uso melhorado das proteínas da ração nessas espécies. Tabela 6: Atividade de protease (OD340 x fator de diluição) em farelo de soja-milho a pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 7,0
Figure img0008
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[00568] A Figura 5 mostra a atividade (OD340 x fator de diluição), em farelo de soja-milho, da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) em comparação com a protease 10R.
Exemplo 5: Atividade proteolítica no digerido do papo, moela e íleo de frangos de corte
[00569] Material do digerido do papo, moela e íleo de frangos de corte de 21 dias de idade aos quais foi alimentado um regime alimentar de milho- soja foi coletado; liofilizado e triturado usando um pequeno moinho de café. As amostras trituradas foram suspensas (47 % p/v) nos seguintes tampões e deixadas a hidratar a 4 °C durante a noite (nenhuma agitação): Tampão para o papo: HEPES a 100 mM, CaCl^2 H2O a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 %, ajustado até pH 5 usando HCl Tampão para a moela: Ácido succínico a 100 mM, CaCl^2 H2O a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 %, ajustado até pH 1,67 usando HCl Tampão para o íleo: HEPES a 100 mM, CaCl^2 H2O a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01 %, ajustado até pH 7,2 usando HCl
[00570] O pH resultante foi: pH 5 em amostras do papo; pH 3 em amostras da moela; e pH 7 em amostras do íleo. As suspensões foram aquecidas até 40 °C e 1 mL foi dispensado em tubos mantidos a 40 °C. Três tubos representado branco (T0) foram imediatamente centrifugados (3000 x g, 0 °C, 10 min) e os sobrenadantes congelados. Qualquer uma das enzimas (200 mg de proteína enzima/kg de substrato) em 50 μL de tampão de acetato de sódio a 100 mM (NaOAc a 9,565 g/L, ácido acético a 1,75 g/L, CaCl2 a 5 mM, BSA a 0,01 %, Tween20 a 0,01 %, pH 6,0) ou somente tampão de acetato de sódio (50 μL) para as amostras de branco foi adicionada aos tubos e as amostras do papo e do íleo foram incubadas durante 3 horas (T3) enquanto as amostras da moela foram incubadas durante 1 hora (T1) a 40 °C enquanto se agitava (500 rpm). As amostras foram centrifugadas (3000 x g, 0 °C, 10 min) e os sobrenadantes recuperados e congelados. A atividade proteolítica foi determinada por análise de aminas primárias usando o ensaio de o-ftaldialdeído (OPA).
[00571] Os resultados são mostrados na Tabela 7. Para cada um tipos de digerido (papo, moela e íleo), existiu uma diferença significativa entre o nível de aminas primárias na amostra T0 em branco e as amostras em branco incubadas durante 1 ou 3 horas. Esta diferença pode ser atribuída à atividade de proteases presentes no substrato e tendo origem nas matérias-primas do regime alimentar ou no animal. Durante a incubação do digerido do papo e moela, a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) aumentou ainda mais o nível de aminas primárias em comparação com a amostra em branco, demonstrando que a protease tinha uma atividade proteolítica sobre este substrato sob as condições dadas. A protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) teve um desempenho significativamente melhor durante a incubação do digerido do papo e moela do que a Protease 10R, indicando que a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) pode ser mais eficiente para hidrólise de proteínas da ração no trato gastrointestinal superior de aves domésticas, conduzindo a digestibilidade melhorada de proteínas. Como esperado, a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) não aumentou significativamente o nível de aminas livres durante a incubação do digerido do íleo a pH 7.
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a,b,c,Os valores dentro de uma coluna que não estão conetados pelas mesmas letras sobrescritas são estatisticamente diferentes como determinado pelo teste de Tukey-Mtcogt"*g?2.27+"rtqrqtekqpcfq" pelo procedimento ANOVA (SAS Institute Inc.).
[00572] A Figura 6 mostra o nível de aminas livres (OD340 x fator de diluição) em branco de amostras T0, branco de amostras e amostras incubadas com a protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) ou a protease 10R. O substrato para a incubação foi material digerido do papo, moela ou íleo de frangos de corte.
Exemplo 6: Termoestabilidade
[00573] Uma alíquota da amostra de proteína da protease (purificada como descrito no Exemplo 2 ou 12) é dessalinizada ou submetida a troca de tampão em acetato de Na a 20 mM, pH 4,0 usando uma coluna pré- empacotada PD-10 ou dialisada contra 2 x 500 mL de acetato de Na a 20 mM, pH 4,0 a 4 °C em um passo de 2-3 h seguido por um passo durante a noite. A coquVtc fi hknvtcfc eqo 2.67 μo g füwífc eqo Vcor«q cVfi crtqZo 4 wpkfcfgu A280. O tampão de diálise é usado como referência na Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC). As amostras são desgaseificadas usando sucção por vácuo e são agitadas durante aproximadamente 10 minutos.
[00574] Uma varredura de DSC é realizada em um MicroCal VP-DSC a uma taxa de varredura constante de 1,5 °C/minuto a partir de 20-90 °C. O manuseamento dos dados é realizado usando o software MicroCal Origin (versão 4.10), e a temperatura de desnaturação, Td (também chamada a temperatura de fusão, Tm), é definida como a temperatura no vértice do pico no termograma.
Exemplo 7: Estabilidade ao vapor
[00575] A atividade residual da protease após tratamento com vapor pode ser avaliada usando o seguinte ensaio.
[00576] Em esses experimentos é usada uma preparação modificada na qual o vapor é proporcionado por um gerador de vapor e conduzido para o interior da caixa. As amostras colocadas em uma placa são inseridas na caixa através de uma gaveta quando a temperatura alcançou ca. 93-94 °C. Após a inserção das amostras, a temperatura cai 4 °C. A incubação é realizada durante 30 segundos enquanto a temperatura permanece aproximadamente constante a 90 °C. Depois disso, a placa é rapidamente removida da caixa, as amostras são colocadas em gelo, ressuspensas e avaliadas no que diz respeito à atividade de protease usando, por exemplo, o ensaio de Suc-AAPF-pNA ou o-Ftaldialdeído (OPA). Cada amostra de enzima é comparada com uma amostra similar que não havia sido tratada com vapor para calcular a atividade residual.
Exemplo 8: Testes de estabilidade à peletização
[00577] A granulação da enzima é realizada de um modo como descrito na Patente dos EUA No. 4,106,991, Exemplo 1. O granulado obtido é seco em um leito fluido até um conteúdo de água abaixo de 1 % e peneirado para obter um produto com a gama de partículas de 250 μm a 850 μm. Finalmente, o produto é revestido com óleo de palma e carbonato de cálcio de um modo como descrito na Patente dos EUA No. 4,106,991, Exemplo 22.
[00578] Aproximadamente 50 g de granulado de enzima são pré- misturados com 10 kg de ração durante 10 minutos em um pequeno misturador horizontal. Essa pré-mistura é misturada com 90 kg de ração durante 10 minutos em um misturador horizontal maior. A partir do misturador, a ração é levada ao condicionador (um misturador em cascata com injeção de vapor) a uma taxa de aproximadamente 300 kg/hora. O condicionador aquece a ração até 95 °C (medida à saída) por injeção de vapor. O tempo de residência no condicionador é 30 segundos. A partir do condicionador, a ração é levada a uma prensa Simon Heesen equipada com uma matriz horizontal de 3,0x35 mm e comprimida em péletes com um comprimento de em torno de 15 mm. Após a prensa, os péletes são colocados em um refrigerador de ar e resfriados durante 15 minutos.
[00579] A atividade de protease é medida usando o ensaio de Suc- AAPF-pNA antes da peletização e nos péletes de ração após peletização. A estabilidade à peletização é determinada por comparação da atividade de protease em ração peletizada em relação à atividade em ração não peletizada. Exemplo 9: Clonagem de dois genes de protease de Trametes cf. versicolor e Trametes versicolor
[00580] Com base nas sequências genéticas identificadas, SEQ ID NO: 15 de uma cepa de Trametes cf. versicolor (ver seção das cepas) e SEQ ID NO: 20 de uma cepa de Trametes versicolor (ver seção das cepas) foram planejadas duas sequências codificantes sintéticas de DNA (CDS) com otimização de códons para expressão em Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 22, respectivamente). Essas duas sequências CDS foram sintetizadas por GeneArt® (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) em um vetor pMA-T, a uma escala de 5 μg, com dois locais flanqueadores de BamHI go 5’ g HindIII go 50 eqorcVíxgku eqo q xgVqt fg gzrtguu«q rFCw32; *YQ 2005042735). 1 μg de tais plasmídeos foi subsequentemente digerido com as enzimas de restrição BamHI e HindIII da NEB (New England Biolabs, Frankfurt am Main Alemanha) seguindo recomendações do fabricante, e os fragmentos resultantes foram separados por eletroforese em gel de agarose 1 % usando tampão TAE. O fragmento de 1,7 kb correspondente aos genes de protease sintéticos foi excisado do gel e purificado usando um Kit de Purificação de DNA de PCR e Banda de Gel GFX® (GE Healthcare, I lillerod. Dinamarca) seguindo as instruções do fabricante. 100 ng de tais insertos foram clonados no vetor de expressão pDAu109 (WO 2005042735) previamente digerido com BamHI e HindIII por ligação com uma ligase de T4 da NEB (New England Biolabs, Frankfurt am Main Alemanha) seguindo instruções do fabricante.
[00581] Um volume de 2,5 μL da mistura de ligação diluída foi usado para transformar células quimicamente competentes TOP10 de E. coli (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Três colônias foram selecionadas de placas de ágar LB contendo 100 μg de ampicilina por mL de cada construção e foram cultivadas durante a noite em 3 mL de meio LB suplementado com 100 μg de ampicilina por mL. O DNA plasmídico foi purificado usando um kit Qiagen Spin Miniprep (Cat. 27106) (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de protease sintéticas de Trametes cf. versicolor e Trametes versicolor foram verificadas por sequenciamento de Sanger antes da expressão heteróloga. Os plasmídeos denominados MDQM0673-1 e MDQM0584-1 (mantendo a CDS SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 22, respectivamente) foram selecionados para transformação com protoplastos e expressão heteróloga de suas proteases codificadas em uma célula hospedeira de Aspergillus oryzae MT3568 (descrita no capítulo sobre cepas).
Exemplo 10: Transformação de Aspergillus oryzae com o gene codificando proteases de Trametes cf. versicolor e Trametes versicolor e seleção dos melhores transformantes
[00582] Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 (ver capítulo sobre cepas) foram preparados de acordo com WO 95/002043. Cem μL de protoplastos foram misturados com 2,5-10 μg de qualquer um dos vetores de expressão de Aspergillus MDQM0673-1 e MDQM0584-1 (Exemplo 9), 250 μL de PEG 4000 60 % (Applichem, Darmstadt, Alemanha) (polietileno glicol, peso molecular 4 000), CaCl2 10 mM, e Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e o sistema foi suavemente misturado. A mistura foi incubada a 37 °C durante 30 minutos e os protoplastos foram espalhados sobre placas COVE para seleção. Após incubação por 4-7 dias a 37 °C, esporos de oito transformantes foram inoculados em 0,5 mL de meio DAP4C-1 suplementado com ácido lático e com fosfato de diamônio em placas de 96 poços profundos. Após 4 dias de cultura a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE usando Gel de Tris-Glicina Novex® 4-20 % (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) para identificar os transformantes produzindo a maior quantidade de protease recombinante de Trametes versicolor.
[00583] Com base na intensidade das bandas do gel de SDS-PAGE, esporos do melhor transformante foram espalhados sobre placas de Sacarose- T COVE contendo TRITON® X-100 a 0,01 % de modo a isolar colônias únicas. O espalhamento foi repetido duas vezes em total em placas Sacarose- T COVE, e depois uma única colônia foi espalhada em um tubo N-Ágar COVE até esporulação.
Exemplo 11: Fermentação de Aspergillus oryzae transformado com o gene codificando proteases de Trametes cf. versicolor e Trametes versicolor
[00584] 150 mL de meio DAP4C-1 suplementado com 5 mL de ácido láctico a 20 % e 3,5 mL de fosfato de diamônio a 50 % e esporos dos melhores transformantes foram cultivados em frascos de agitação durante 4 dias a uma temperatura de 30 °C sob 100 rpm de agitação. Os caldos de cultura foram coletados por filtração usando um dispositivo de filtro de 0,2 μm e foram usados para caracterização adicional.
Exemplo 12: Purificação da protease S53 1 de Trametes cf versicolor
[00585] O caldo de cultura foi centrifugado (20000 x g, 20 min) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado do precipitado. O sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 μm Nalgene de modo a se remover o resto das células hospedeiras de Aspergillus . O filtrado de 0,2 μm foi transferido para Ácido succínico/NaOH a 10 mM, pH 3,5 em uma coluna G25 Sephadex (da GE Healthcare). A enzima transferida para G25 sephadex foi aplicada a uma coluna SP-sefarose FF (da GE Healthcare) equilibrada em Ácido succínico/NaOH a 10 mM, pH 3,5. Após lavagem extensa da coluna com o tampão de equilibração, a protease eluiu com um gradiente linear de NaCl (0 --> 1,0 M) no mesmo tampão ao longo de dez volumes da coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto a atividade de protease (usando o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA a pH 4) e as frações-pico foram analisadas por SDS-PAGE. Frações apenas com uma banda no gel de SDS-PAGE corado com Coomassie foram reunidas, constituindo o produto purificado. O produto purificado foi usado para caracterização adicional.
Exemplo 13: Caracterização da protease S53 1 de Trametes cf versicolor (SEQ ID NO: 19)
[00586] O ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA foi usado para obter o perfil pH-atividade. O ensaio de Ponto Final de Suc-AAPF-pNA foi usado para obter o perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas a valores de pH indicados) e o perfil temperatura-atividade a pH 4,0. Para o perfil pH- estabilidade, a protease foi diluída 7x nos diferentes tampões de Ensaio até alcançar os valores de pH desses tampões e então foi incubada por 2 horas a 37 oC. Após incubação, o pH das incubações de protease foi transferido para o mesmo valor de pH, antes de ensaio quanto a atividade residual, por diluição no Tampão de ensaio a pH 4,0. O ensaio Cinético de Suc-AAPX-pNA e dez substratos diferentes de Suc-AAPX-pNA foram usados para obtenção da especificidade para P1 da enzima a pH 4,0.
[00587] Os resultados são mostrados nas Tabelas 8-11 em baixo. Dados da protease S53 3 de Meripilus giganteus (do exemplo 2) e protease 10R estão incluídos nas tabelas. Para a Tabela 8, as atividades são relativas ao pH ótimo para as enzimas. Para a Tabela 9, as atividades são atividades residuais relativas a amostras, que foram mantidas em condições estáveis (5 oC, pH 4,0). Para a Tabela 10, as atividades são em relação à temperatura ótima a pH 4,0 para a enzima. Para a Tabela 11, as atividades são relativas ao melhor substrato para as enzimas (Suc-AAPL-pNA para a protease S53 1 de Trametes cf versicolor). Tabela 8: Perfil pH-atividade a 25 oC determinado usando o ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA
Figure img0012
Figure img0013
Tabela 9: Perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas a 37 oC) determinado usando o ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA
Figure img0014
Tabela 10: Perfil temperatura atividade a pH 4,0 ou pH 6,5 determinado usando o ensaio de ponto final de Suc-AAPF-pNA
Figure img0015
Tabela 11: Especificidade para P1 em 10 substratos Suc-AAPX-pNA a pH 4,0 ou pH 9,0 a 37 oC determinada usando o ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA
Figure img0016
[00588] O perfil pH-atividade no substrato Suc-AAPF-pNA, o perfil pH-estabilidade (atividade residual após 2 horas a 37 oC), o perfil temperatura atividade em Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 e a especificidade para P1 em 10 substratos Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 para a protease S53 1 de Trametes cf versicolor em comparação com os dados para a protease S53 3 de Meripilus giganteus também são apresentados nas Figuras 1-4 embaixo. Outras características da protease S53 1 de Trametes cf versicolor
[00589] A determinação da sequência N-terminal foi: AIPASCASTI.
[00590] O peso molecular relativo, determinado por SDS-PAGE, foi aproximadamente Mr = 42 kDa. Confirmação da sequência madura da protease S53 1 de Trametes cf versicolor
[00591] O tampão da amostra purificada foi trocado com tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,5 usando uma unidade de ultrafiltração Vivaspin equipada com um filtro de corte a 10 kDa. Após a troca do tampão adicionou-se Endoglicosidase H e a amostra foi incubada a 30oC por 3 horas. Nota: Para cada local N-ligado desglicosilado permanece um resíduo N-acetil hexosamina na cadeia principal da proteína, aumentando o peso molecular em 203,19 Da por local. A amostra foi então analisada por espectrometria de massa.
[00592] O peso molecular determinado por análise do peso molecular intato do pico principal foi: 37467,6 Da, correspondente a um valor dentro de 0,41 Da da sequência madura mais uma única acetil hexosamina e um resíduo cisteína não reticulado.
[00593] A sequência madura (dos dados do sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS intato):
[00594] AVPASCASTITPACLQALYGIPTTKATQSSNKLAVSGFID QFANSADLKTFLGKFRTDISSSTTFTLQTLDGGSNSQSSSQAGVEANL DIQYTVGLASAVPTIFISVGDDFQDGDLEGFLDIINFLLNESAPPQVLTT SYGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGVSGSQSSSC SKFVPTFPSGCPFMTSVGATQGINPETAADFSSGGFSNVFARPSYQSTA VSSYLTALGSTNSGKFNTSGRAFPDIATQGVDFEIVVSGRTEGVDGTS CASPTLAAIISLLNDRLIAAGKSPLGFLNPFLYSAAGTAALTDITSGSNP GCNTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLLTAVGL (SEQ ID NO: 19). O peso molecular calculado dessa sequência madura é 37263,0 Da.

Claims (16)

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo que tem atividade de protease, e compreendendo ainda pelo menos uma proteína vegetal, proteína animal, uma ou mais amilases, fitases, xilanases, galactanases, alfa-galactosidases, proteases, fosfolipases, beta- glucanases ou qualquer mistura das mesmas, em que o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; e (c) um polipeptídeo tendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeoque tem atividade de protease consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24..
3. Uso de um polipeptídeo isolado com atividade de protease, caracterizado pelo fato de ser em ração animal, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo tendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo tendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 19, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18; e (c) um polipeptídeo tendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
4. Construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que tem atividade de protease operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam à produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira de expressão, em que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo com atividade de protease é selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (b) um polinucleotídeo possuindo a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; e (c) um polinucleotídeo com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22.
5. Célula hospedeira de expressão recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo, em que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo com atividade de protease é selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (b) um polinucleotídeo possuindo a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; e (c) um polinucleotídeo com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 22; e o hospedeiro é selecionado do grupo consistindo de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, e Trichoderma, ou em que o hospedeiro é uma levedura, como Pichia ou Saccharomyces, ou um Bacillus, como Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.
6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o hospedeiro é um Aspergillus, como Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae.
7. Método para produção do polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula que, em sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, em condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
8. Método para produção do polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 6 em condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
9. Composição de ração animal caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 e compreendendo adicionalmente uma ou mais amilases, fitases, xilanases, galactanases, alfa-galactosidases, proteases, fosfolipases, beta-glucanases, ou qualquer mistura dos mesmos.
10. Uso de pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de ser em rações animais; em aditivos de rações animais; na preparação de uma composição para uso em rações animais; para melhoria do valor nutricional de uma ração animal; para aumento da proteína digestível e/ou solúvel em rações animais; para aumento do grau de hidrólise de proteínas em regimes alimentares animais; e/ou para o tratamento de proteínas.
11. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 é adicionado à ração.
12. Aditivo de ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2; e pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral vestigial.
13. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais amilases; fitases; xilanases; galactanases; alfa-galactosidases; proteases, fosfolipases, beta-glucanases, ou qualquer sua mistura.
14. Ração animal, caracterizada pelo fato de que tem um teor de proteína bruta de 50 até 800 g/kg e compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de protease como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.
15. Método para tratamento de proteínas, caracterizado pelo fato de que compreende o passo de adicionar pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 a pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que soja ou farelo de soja está incluído na pelo menos uma fonte de proteína.
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