BR112014032999B1

BR112014032999B1 - Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se ligam ao gene de ativação de linfócito 3 (lag-3), seu uso e seu método de preparação, molécula biespecífica, imunoconjugado, composição compreendendo os mesmos, ácido nucleico isolado e vetor de expressão

Info

Publication number: BR112014032999B1
Application number: BR112014032999-0A
Authority: BR
Inventors: Nils Lonberg; Mohan Srinivasan
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2022-10-18
Also published as: PH12014502854A1; DK3795592T3; HRP20171315T1; HUE052406T2; TWI771721B; KR102126596B1; EP3795592A1; TWI617581B; AU2019204803A1; PT3795592T; AU2017221874A1; NO2023008I1; JP2015527880A; PT2867258T; HRP20201852T8; AU2017221874B2; KR20210102485A; DK2867258T3; EP3275899B1; PE20191759A1

Abstract

ANTICORPO OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO QUE SE LIGAM AO GENE DE ATIVAÇÃO DE LINFÓCITO 3 (LAG-3), SEU USO E SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO, MOLÉCULA BIESPECÍFICA, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, E CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE. A presente invenção refere-se anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente as propriedades funcionais da LAG-3, e foram optimizados em relação ao anti-LAG-3 anteriormente descrito, tais como anticorpos anticorpo 25F7 (US 2011/0150892 A1). Essas propriedades incluem a redução de locais de desamidação, mantendo a ligação de LAG-3 humano, e estabilidade física (isto é, térmica e química) de alta afinidade. As moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da presente invenção, os vetores de expressão, as células hospedeiras e os métodos para expressar os anticorpos da presente invenção também são fornecidos, bem como os imunoconjugados, moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas que compreende os anticorpos. A presente invenção também refere-se aos métodos para a deteção de LAG-3, bem como métodos para o tratamento que estimula as respostas imunitárias usando um anticorpo anti-LAG-3 de anticorpo da presente invenção. A terapia de combinação, em que os anticorpos são co-administrados com pelo menos um anticorpo adicional imunoestimulante,(...).

Description

Antecedentes da Presente Invenção

[001] Os anticorpos terapêuticos são um dos segmentos da indústria farmacêutica que mais crescem. Para manter potência (isto é, atividade) e minimizar a imunogenicidade, os anticorpos e outros fár- macos de proteína devem ser protegidos contra a degradação física e química durante a fabricação e armazenamento. De fato, uma das principais dificuldades no desenvolvimento de terapêuticas de anticorpos é o potencial de resposta imunogênica quando administrada a um indivíduo, o que pode levar à rápida eliminação, ou até mesmo induzir efeitos secundários com risco de vida, incluindo o choque anafilático. Vários fatores influenciam a imunogenicidade de um anticorpo, tal como as suas propriedades físico-químicas (por exemplo, pureza, estabilidade ou solubilidade), os fatores clínicos (por exemplo, a dose, via de administração, a heterogeneidade da doença, ou características do paciente), e o tratamento concomitante com outros agentes (Swann et al (2008) Curr Opinion Immuol 20: 493 a 499).

[002] A imunogenicidade de anticorpos e/ou perda de atividade de anticorpo é muitas vezes devido a desamidação. A desamidação é um processo de degradação química que ocorre espontaneamente em proteínas (por exemplo, anticorpos). A desamidação remove um grupo funcional amida a partir de um resíduo de aminoácido, tais como glu- tamina e asparagina, danificando, dessa maneira, as suas cadeias laterais contendo amida. Este, por sua vez, faz com que hajam alterações estruturais e biológicas ao longo da proteína, criando, dessa ma- neira, as formas heterogêneas do anticorpo. A desamidação é uma das modificações pós-tradução mais comuns que ocorrem em anticorpos terapêuticos produzidos de forma recombinante.

[003] Por exemplo, a heterogeneidade da cadeia pesada do anticorpo monoclonal h1B4 (um anticorpo anti-CD18 humanizado), devido à desamidação durante a cultura de células foi relatada por Tsai et al. (Pharm Res 10 (11): 1580 (1993)). Além disso, a redução/perda de atividade biológica devido à desamidação tem sido um problema reconhecido. Por exemplo, Kroon et al. caracterizaram os vários locais de desamidação no anticorpo OKT3 terapêutico, e informou que amostras de lotes de produção de OKT3 (com idade entre 14 meses e 3 anos) havia caído abaixo de 75 % de atividade (Pharm Res 9 (11): 1386 (1992), página 1389, segunda coluna). Além disso, as amostras de OKT3 mostraram grandes quantidades de peptídeos oxidados nos seus mapas tinham reduzido significativamente a atividade no ensaio de potência de ligação ao antígeno (página 1390, primeira coluna). Os autores concluíram que os locais específicos de modificações químicas que ocorrem durante o armazenamento de OKT3 foram identificados por meio do mapeamento peptídico e correlacionada com as alterações observadas nos ensaios de análises químicas e biológicas do anticorpo (página 1392, primeira coluna). A perda de atividade biológica também tem sido relatada para uma variedade de outras proteínas terapêuticas, incluindo DNAase desamidada humana recombinante (Cacia et al (1993) J. Chromatogr 634: 229 a 239). E CD4 solúvel re- combinante (Teshima et al (1991 ) Biochemistry 30: 3.916 a 3.922).

[004] Em geral, a desamidação coloca um problema significativo e imprevisível para a indústria farmacêutica. Esforços relacionados com o controle da variabilidade causada por meio da desamidação dentro de terapêuticas de anticorpos, em particular, bem como as preocupações da FDA associada com esta variabilidade, aumentam os custos e atrasam os ensaios clínicos. Além disso, as modificações para resolver esta questão, incluindo as mudanças de condições (por exemplo, temperatura, pH e tipo de célula) associadas com a produção e/ou alteração de aminoácidos que são susceptíveis à desamida- ção recombinante (por exemplo, mutagênese dirigida ao local) pode impactar de forma negativa a estabilidade e da atividade, especialmente quando são feitas alterações nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) do anticorpo. Por conseguinte, existe a necessidade de versões mais estáveis de anticorpos terapêuticos.

Sumário

[005] A presente invenção refere-se aos anticorpos monoclonais isolados (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos) que ligam a LAG-3 (por exemplo, o LAG-3 humano) e tem estabilidade física opti- mizada em comparação com anticorpos anti-LAG-3 anteriormente descritos. Em particular, a presente invenção refere-se a uma forma modificada do anticorpo 25F7 (US 2011/0150892 A1), que apresenta melhora significativa em relação a estabilidade química e térmica em relação ao anticorpo não modificado. Especificamente, através da alteração da região de ligação crítica do domínio CDR2 da cadeia pesada de anticorpo 25F7, foi mostrado que o anticorpo modificado exibiu significativamente maior estabilidade física e térmica, redução da desa- midação, a reversibilidade térmica mais alta e menor agregação. Ao mesmo tempo, foi inesperadamente observado que o anticorpo modificado manteve a mesma afinidade de ligação alta para o LAG-3 humano e atividade funcional do anticorpo não modificado, incluindo a capacidade de inibir a ligação de LAG-3 às moléculas de principal histo- compatibilidade (MHC) de Classe II e estimulam as respostas de células T específicas de antígeno. O aumento substancial na estabilidade combinada e retenção da atividade de ligação/biológica do anticorpo modificado foi surpreendente, particularmente tendo em vista a critici- dade de regiões CDR à função dos anticorpos.

[006] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados pa ra uma variedade de aplicações, incluindo a deteção da proteína LAG- 3 e a estimulação de respostas de células T específicas para o antíge- no tumoral em indivíduos portadores do tumor ou indivíduos portadores de vírus.

[007] Deste modo, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado (por exemplo, um anticorpo humano), ou uma porção do mesmo, tendo uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO de ligação ao antígeno: 12. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui ainda uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em outra modalidade, o anticorpo, ou a porção de ligação ao antígeno dos mesmos, inclui as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 de uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (por exemplo, SEQ ID NOs: 15, 16, e 17, respectivamente). Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui ainda as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 de uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (por exemplo, SEQ ID NOs: 18, 19, e 20, respectivamente).

[008] Em uma modalidade preferida, o anticorpo exibe proprieda des físicas melhoradas (isto é, estabilidade térmica e química), em comparação com o anticorpo 25F7, enquanto continua a reter pelo menos a mesma afinidade de ligação para o LAG-3 humano como 25F7. Por exemplo, as exposições de anticorpos diminuiu a variabilidade de sequência na região da cadeia pesada CDR2 devido à desa- midação, em comparação com o anticorpo 25F7, por exemplo, cerca de 2,5 % ou menos modificação da sequência de aminoácidos após 12 semanas a 4 °C (isto é, sob estudos "em tempo real " de estabilidade de tempo, tal como descrito na presente invenção) e/ou cerca de 12,0 % ou menos modificação da sequência de aminoácidos após 12 semanas a 40 °C (isto é, sob condições de stress aceleradas, tal como descrito na presente invenção), mantendo uma afinidade de ligação para LAG humano -3 de pelo menos cerca de 1 KD x 10-7 M ou menos (mais de preferência, um KD de 1 x 10-8 M ou menos, um KD de 5 x 10-9 M ou inferior, ou um KD de 1 x 10-9 M ou menos). Em uma outra modalidade, o anticorpo apresenta reversibilidade térmica de pelo menos cerca de 40 % em PBS a pH 8,0.

[009] Em uma outra modalidade, o anticorpo possui uma temperatura de fusão mais alta (indicando uma maior estabilidade global in vivo), em comparação com o anticorpo não modificado (Krishnamurthy e R Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3: 361 a 71). Em uma modalidade, o anticorpo apresenta um TM1 (a temperatura de desdobramento inicial) superior a 60 °C, por exemplo, maior do que 65 °C, ou maior do que 70 °C. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando calorimetria diferencial de varrimento (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952 a 1960; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47 a 52) ou o dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chro- matogr Sci 40: 343 a 9).

[0010] Em uma outra modalidade, o anticorpo é caracterizado pela sua resistência à degradação rápida. A degradação de um anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander AJ e Hughes DE (1995) Anal Chem 67: 3626 a 32).

[0011] Em uma outra modalidade, o anticorpo apresenta efeitos mínimos de agregação, por exemplo, a agregação de 25 % ou menos, tal como 20 % ou menos, ou menos de 15 %, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 4 % ou menos. A agregação pode conduzir ao desencadeamento de uma resposta imunitária indesejada e/ou alterada ou propriedades farmacocinéticas desfavoráveis, a agregação pode ser me- dida por meio de várias técnicas, incluindo a coluna de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), e a dispersão de luz.

[0012] Em uma outra modalidade, os anticorpos apresentam ain da, pelo menos, uma das seguintes propriedades:

[0013] (a) ligação ao LAG-3 de macaco;

[0014] (b) ausência de ligação ao LAG-3 de camundongo;

[0015] (c) inibição da ligação de LAG-3 às moléculas de principal histocompatibilidade (MHC) de classe II; e

[0016] (d) estimulação de respostas imunitárias, em especial as respostas de células T específicas de antígeno.

[0017] De preferência, o anticorpo exibe, pelo menos, duas das propriedades de (a), (b), (c) e (d). Mais de preferência, o anticorpo exibe pelo menos três das propriedades de (a), (b), (c) e (d). Ainda mais de preferência, o anticorpo exibe todas as quatro propriedades (a), (b), (c) e (d).

[0018] Em uma outra modalidade, o anticorpo estimula uma resposta das células T específica de antígeno, tais como a produção de interleucina-2 (IL-2) de uma resposta de células T específica de antí- geno. Em outras modalidades, o anticorpo estimula uma resposta imunitária, tal como uma resposta anti-tumor (por exemplo, inibição do crescimento do tumor em um modelo in vivo de transplante de tumor) ou uma resposta autoimune (por exemplo, o desenvolvimento de diabetes em camundongos NOD).

[0019] Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga a um epitope do LAG-3 humano que compreende a sequência de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 21). Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga a um epitopo do LAG-3 humano que compreende a HPAAP- SSW sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) ou PAAPSSWG (SEQ ID NO: 23).

[0020] Em outras modalidades, o anticorpo mancha o tecido pituitário por meio da imuno-histoquímica, ou não mancha o tecido pituitário por meio da imuno-histoquímica.

[0021] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos de comprimento completo, por exemplo, de um isotipo IgG1, IgG2 ou IgG4 de, opcionalmente com uma serina para mutação de prolina na região dobradiça da região constante da cadeia pesada (a uma posição que corresponde à posição 241, como descrito em Angal et al (1993) Mol Immunol 30: 105 a 108), de tal modo que a heterogeneidade da ponte dissulfureto de inter-cadeia pesada é reduzida ou abolida. Em um aspecto, o isotipo da região constante é IgG4 com uma mutação nos 228 resíduos de aminoácidos, por exemplo, S228P. De uma maneira alternativa, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab, Fab 'ou Fab'2, ou anticorpos da cadeia simples.

[0022] Em um outro aspecto da presente invenção, o anticorpo (ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos) é parte de um imunocon- jugado que inclui um agente terapêutico, por exemplo, uma citotoxina ou um isótopo radioativo, ligado ao anticorpo. Em um outro aspecto, o anticorpo é parte de uma molécula biespecífica que inclui uma segunda unidade funcional (por exemplo, um segundo anticorpo) que tem uma especificidade de ligação diferente do que a referida ligação do anticorpo, ou porção do mesmo antígeno.

[0023] As composições que compreendem os anticorpos, ou as porções de ligação ao antígeno dos mesmos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da presente invenção, opcionalmente formulado em um veículo farmaceuticamente aceitável, são também fornecidas.

[0024] As moléculas de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, ou as porções de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, as regiões variáveis e/ou CDR), da presente invenção, também são fornecidas, bem como vetores de expressão que compreende tais ácidos nucleicos e as células hospedeiras que compreendem tais vetores de expressão. Os métodos para a preparação de anticorpos 3-anti- LAG usando as células hospedeiras que compreendem tais vetores de expressão são também fornecidos, e podem incluir as etapas de (i) que expressam o anticorpo na célula hospedeira e (ii) o isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.

[0025] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona os métodos para estimular respostas imunes, usando os anticorpos antiLAG da presente invenção 3. Em uma modalidade, o método envolve a estimulação de uma resposta de células T específica de antígeno fazendo contactar as células T com um anticorpo da presente invenção, de tal modo que uma resposta das células T específicas do antí- geno é estimulada. Em uma modalidade preferida, a produção de in- terleucina-2 por meio da célula T específica do antígeno é estimulada. Em uma outra modalidade, o indivíduo é um indivíduo portador de um tumor e uma resposta imune contra o tumor é estimulada. Em uma outra modalidade, o indivíduo é um indivíduo que possui o vírus e uma resposta imune contra o vírus é estimulada.

[0026] Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, da presente invenção, de tal modo que o crescimento do tumor é inibido no indivíduo. Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de infeção viral em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, da presente invenção de modo a que a infeção viral é tratada no indivíduo. Em uma outra modalidade, estes métodos compreendem a administração de uma composição,biespecíficos ou imunoconjugado da presente invenção.

[0027] Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para estimulação de uma resposta imunitária em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, da presente invenção e pelo menos um anticorpo adicional imunoestimulante, tal como um anticorpo anti-PD -1, um anticorpo anti PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA-4, de tal modo que uma resposta imune é estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir o crescimento de tumores ou para estimular uma resposta anti-viral. Em uma modalidade, o anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-PD-1. Em uma outra modalidade, o agente imunoestimulador adicional é um anticorpo anti- PD-L1. Em ainda outra modalidade, o agente imunoestimulador adicional é um anticorpo anti-CTLA-4. Em ainda outra modalidade, um anti-corpo, ou uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos, da presente invenção é administrado com uma citoquina (por exemplo, IL-2 e/ou IL-21), ou um co-estimulador anticorpo (por exemplo, um anti-CD137 e/ou anticorpo anti-GITR). Os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados.

[0028] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona os anticorpos anti-LAG-3 e composições da presente invenção paro uso nos métodos anteriores, ou para a fabricação de um medicamento paro uso nos métodos anteriores (por exemplo, para o tratamento).

[0029] Outras características e vantagens da presente descrição serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos, que não devem ser interpretados como limitativos. Os conteúdos de todas as referências, entradas de Genbank, patentes e pedidos de patentes publicados, citados ao longo deste pedido são expressamente incorporados por meio de referência na presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

[0030] A Figura 1A mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 25F7. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) e CDR3 (SEQ ID NO: 7) são delineadas e as derivações V, D e J da linha germinal são indicadas. As regiões CDR são delineadas usando o sistema Kabat (Kabat et al. (1991) das Sequências de Proteínas de Interesse imuno- lógica, Fifth Edition, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH Publication No. 91-3242 US).

[0031] A Figura 1B mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 3) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) da região variável da cadeia leve capa do anticorpo monoclonal humano 25F7. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 8), CDR2 (SEQ ID NO: 9) e CDR3 (SEQ ID NO: 10) são delineadas e as derivações V e J da linha germinal são indicadas. As sequências de aminoácidos de comprimento total das cadeias pesadas e leves da de anticorpo 25F7 são mostradas na SEQ ID NOs: 32 e 34, respectivamente.

[0032] A Figura 2A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal LAG3.5. A CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 16) e as regiões CDR3 (SEQ ID NO: 17) são delineadas. As sequências de aminoácidos de comprimento total das cadeias pesadas e leves da de anticorpo LAG3.5 são mostradas em SEQ ID NOs: 35 e 37, respectivamente.

[0033] A Figura 2B mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 13) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) da região variável da cadeia leve capa do anticorpo monoclonal LAG3.5. A CDR1 (SEQ ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 19) e as regiões CDR3 (SEQ ID NO: 20) são delineadas. A Figura 3 mostra as sequências de aminoácidos das sequências das regiões variáveis da cadeia pesada CDR2 das variantes LAG3.5 LAG- 3 (SEQ ID NO: 42), LAG3.6 (SEQ ID NO: 43), LAG3.7 (SEQ ID NO: 44), e LAG3.8 (SEQ ID NO: 45), em comparação com a sequência de aminoácidos da sequência da região variável da cadeia pesada CDR2 de anticorpo 25F7 (LAG3.1) (SEQ ID NO: 41) e a correspondente sequência da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 27). A região variável da cadeia pesada CDR2 de LAG3.5 difere da região variável da cadeia pesada CDR2 da 25F7 por arginina (R) na posição 54 (em vez de asparagina (N)) e serina (S) na posição 56 (em vez de asparagina (N)). Os demais CDRs de LAG3.5 anf 25F7 são idênticos. A Figura 3 também descreve SEQ ID NO: 40.

[0034] As Figuras 4A e 4B são gráficos que mostram a atividade de ligação e afinidade (EC50), respectivamente, de anticorpos LAG3.1 (25F7), LAG3.2, LAG3.5, LAG3.6, LAG3.7, e LAG3.8 para as células T CD4 + ativadas humanas. A Figura 4B descreve SEQ ID NOs: 41, 42, 45, 44 e 43, respectivamente, em ordem de aparição.

[0035] As Figuras 5A, B, C, D, e E são gráficos que mostram as curvas de fusão térmica (isto é, estabilidade térmica) de anticorpos LAG3.1 (25F7), LAG3.5, LAG3.6, LAG3.7, e LAG3.8, respectivamente.

[0036] As Figuras 6A, B, C, D, e E são gráficos que mostram as curvas de reversibilidade térmica (isto é, estabilidade térmica) de anticorpos LAG3.1 (25F7), LAG3.5, LAG3.6, LAG3.7, e LAG3.8, respectivamente.

[0037] A Figura 7 é um gráfico, que mostra a atividade de ligação de anticorpos LAG3.1 (25F7) e LAG3.5 de células T CD4 + humanas ativadas e de ligação de antígeno (Biacore).

[0038] A Figura 8 mostra os resultados do mapeamento de peptí-deos usando a espectrometria de massa (modificações quími- cas/estabilidade molecular) para anticorpos LAG3.1 (25F7) e LAG3.5 refletindo a desamidação e isomerização após incubação durante 5 dias nas condições de stress acelerado, como descrito na presente invenção. A Figura 8 descreve SEQ ID NOs: 46 a 52, respectivamente, em ordem de aparição. A Figura 9 é um gráfico que compara os perfis de hidrofilicidade de anticorpos LAG3.1 (25F7) e LAG3.5.

[0039] As Figuras 10 A, B, C, e D são gráficos que comparam a afinidade e a estabilidade física (isto é, a estabilidade térmica e química) e de anticorpos LAG3.1 LAG3.5 na 4 °C e 40 °C, ou seja, ambas as condições de stress e aceleradas estudos de estabilidade "em tempo real ", tal como descrito na presente invenção.

[0040] As Figuras 11 A e B são gráficos que comparam a porcentagem de modificação das sequências de aminoácidos de anticorpos LAG3.1 e LAG3.5 a 4 °C e 40 °C.

Descrição Detalhada da presente invenção

[0041] A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos primeiro. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

[0042] Os termos "25F7", "anticorpo 25F7," "Anticorpo LAG3.1", e "LAG3.1" referem-se ao anticorpo LAG-3 anti-humano descrito em US2011/0150892 A1. A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) que codifica para a região variável da cadeia pesada de 25F7 (LAG3.1) e a correspondente sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) é mostrada na Figura 1A (com sequências de CDR designadas como SEQ ID NOs: 4, 5, e 7, respectivamente). A sequência de nucleotí- deos (SEQ ID NO: 3) que codifica a região variável da cadeia leve de 25F7 (LAG3.1) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 4) é apresentada na Figura 1B (com sequências de CDR designadas como SEQ ID NOs: 8, 9, e 10, respectivamente).

[0043] O termo "LAG-3" refere-se a ativação do gene de Linfóci-tos-3. O termo "LAG-3" inclui variantes, homólogos, isoformas, ortólo- gos e parálogos. Por exemplo, os anticorpos específicos para uma proteína LAG-3 humano podem, em certos casos, reagirem de forma cruzada com uma proteína LAG-3 a partir de espécies diferentes da humana. Em outras modalidades, os anticorpos específicos para uma proteína LAG-3 humano pode ser completamente específico para a proteína LAG-3 humano e não podem apresentar as espécies ou outros tipos de reatividade cruzada, ou podem reagir de forma cruzada com a LAG-3 a partir de certos outros espécies, mas não todas as outras espécies (por exemplo, reagem de forma cruzada com o LAG-3 de macaco, mas não do LAG-3 de camundongo). O termo "LAG-3 humano" refere-se a sequência do LAG-3 humano, tal como a sequência de aminoácidos completa do LAG-3 humano possuindo Genbank No de Acesso NP_002277 (SEQ ID NO: 29). O termo "LAG-3 de camundongo" refere-se a sequência de camundongo LAG-3, tal como a sequência de aminoácidos completa de LAG-3 de camundongo que tem Genbank No de Acesso NP_032505. LAG-3 também é conhecido na técnica como, por exemplo, CD223. A sequência do LAG-3 humano pode diferir de LAG-3 humano de Genbank No de Acesso NP_002277 por ter, por exemplo, mutações conservadas ou mutações em regiões não conservadas e a LAG-3 tem substancialmente a mesma função biológica como o LAG-3 humano de Genbank No de Acesso NP_002277. Por exemplo, uma função biológica da LAG-3 está a ter um epitopo no domínio extracelular da LAG-3, que é ligado especificamente por meio de um anticorpo da presente descrição ou uma função biológica do LAG-3 humano é a ligação a moléculas do MHC de Classe II.

[0044] O termo "LAG-3 de macaco" destina-se a abranger as proteínas 3-LAG expressas por macacos do Velho Mundo e do Novo Mundo, incluindo, mas não se limitando a, macacos cinamólogos LAG- 3 e macaco rhesus LAG-3. Uma sequência representativa de aminoá- cidos para o LAG-3 de macaco é a sequência de aminoácidos do macaco rhesus LAG-3, que também é depositada como Genbank No de Acesso XM_001108923. Outra sequência representante de aminoáci- dos para o LAG-3 de macaco é a sequência de macaco rhesus alternativa do clone pa23-5 como descrito em US 2011/0150892 A1. Esta sequência de Rhesus alternativa exibe uma única diferença de amino- ácidos, na posição 419, em comparação com a sequência do Genbank depositada.

[0045] Uma sequência particular de LAG-3 humano será geralmente pelo menos 90 % idêntica na sequência de aminoácidos para LAG-3 humano de Genbank No de Acesso NP_002277 e contém os resíduos de aminoácidos que identificam a sequência de aminoácidos tal como o ser humano, quando comparado com as sequências de aminoácidos LAG-3 de outras espécies (por exemplo, murinos). Em certos casos, um LAG-3 humano pode ser pelo menos 95%, ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticos na sequência de aminoácidos para a LAG-3 de Genbank No de Acesso NP_002277. Em certas modalidades, uma sequência do LAG-3 humano irá exibir não mais do que 10 diferenças de aminoácidos da sequência da LAG- 3 de Genbank No de Acesso NP_002277. Em certas modalidades, o LAG-3 humano pode exibir mais do que 5, ou até mesmo não mais do que 4, 3, 2, 1 ou diferença de aminoácidos a partir da sequência da LAG-3 de Genbank No de Acesso NP_002277. A porcentagem de identidade pode ser determinada como descrito na presente invenção.

[0046] O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células que apresentam antígenos, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidos por meio das células acima ou o fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta em seletivos danos a, destruição ou eliminação do corpo humano de patogênios invasores, células ou tecidos infectados com patogênios, células cancerígenas, ou, nos casos de autoimunidade e inflamação patológica, as células ou tecidos humanos normais.

[0047] Uma "resposta de células T específica para o antígeno" re- fere-se a respostas por meio de uma célula T que resulta da estimulação da célula T com o antígeno para o qual a célula T é específica. Exemplos de respostas por meio de uma célula T após estimulação por antígenos específicos não limitantes incluem a proliferação e produção de citocinas (por exemplo, a produção de IL-2).

[0048] O termo "anticorpo" tal como referido na presente invenção inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antígeno (isto é, "porção de ligação ao antígeno") ou cadeias simples dos mesmos. Os anticorpos completos são glicoproteínas que compreendem pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por meio das ligações dissulfureto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (abreviada na presente invenção como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida por meio de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável da cadeia leve (abreviada na presente invenção como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas por regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interaje com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico.

[0049] O termo de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), tal como usado na presente invenção, "porção de ligação ao antígeno" refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, uma proteína LAG-3). Tem sido demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser executada por meio de fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por meio de uma ponte dissulfureto na região dobradi-ça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (vi) um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341: 544 a 546), que consiste de um domínio VH; (vii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável da cadeia pesada contendo um único domínio variável e dois domínios constantes. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por meio dos genes separados, eles podem ser ligados, usando os métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitos como uma cadeia de proteína única, em que o VL e regiões VH emparelham para formar moléculas mono valentes (conhecido como Fv da cadeia simples (scFv); vide, por exemplo, Bird et al (1988) Science 242: 423 a 426; e Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci.. EUA 85: 5879 a 5883). Tais anticorpos da cadeia simples também se destinam a ser englobados no termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando as técnicas convencionais conheci- das para aquelas pessoas que são versadas na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo como os anticorpos são intactos.

[0050] Um "anticorpo isolado", como usado na presente invenção, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que possuem diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína LAG-3 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente aos antígenos que não as proteínas LAG-3). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína LAG-3 humano pode, no entanto, ter uma reatividade cruzada a outros antíge- nos, tais como proteínas de outras espécies de LAG-3. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

[0051] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" tal como usado na presente invenção referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpos da composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epitopo.

[0052] O termo "anticorpo humano", tal como usado na presente invenção, pretende incluir os anticorpos com regiões variáveis, em que tanto a estrutura quanto as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante é também derivada de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos humanos da presente invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por meio das sequências de imunoglobu- linas da linha germinal humana (por exemplo, as mutações introduzidas por mutagênese ao acaso, ou específicas do local in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", tal como usado na presente invenção, não pretende incluir anticorpos em que as sequências CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas.

[0053] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma única especificidade de ligação, que têm regiões variáveis, em que tanto a estrutura quanto as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por meio de um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, possuindo um genoma que compreende um transgene da cadeia pesada humana e um transgene da cadeia leve fundida com uma célula imortalizada.

[0054] O termo "anticorpo humano recombinante", como usado na presente invenção, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como: (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imu- noglobulina humana ou de um hibridoma preparado a partir dos mesmos (descrito mais abaixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) os anticorpos isolados a partir de um recombinante, biblioteca de anticorpos humanos combinatórios, anticorpos e (d) preparados, expressos, criados ou isolados por meio de quaisquer outros meios que envolvem o fatiamento das sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais o modalidade e regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humanas é usado, a mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências da linha germinativa humana de VH e VL, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[0055] O termo "isotipo" refere-se a classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por meio dos genes das regiões constantes da cadeia pesada.

[0056] As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas na presente invenção indiferentemente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[0057] O termo "derivados de anticorpos humanos" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado de anticorpo e o outro agente ou anticorpo.

[0058] O termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se a anticorpos em que as sequências CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. As modificações adicionais da região de estrutura podem ser feita dentro das sequências de estrutura humana.

[0059] O termo "anticorpo quimérico" destina-se a referir-se a anticorpos em que as sequências da região variável são derivadas de uma espécie e as sequências da região constante são derivadas de outras espécies, tais como um anticorpo em que as sequências da região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequências da região constante são derivadas de um anticorpo humano.

[0060] Tal como usado na presente invenção, um anticorpo que "se liga especificamente o LAG-3 humano" destina-se a referir-se a um anticorpo humano que se liga a proteína LAG-3 (e possivelmente uma proteína LAG-3 a partir de uma ou mais espécies não humanas), mas não se ligam substancialmente às proteínas não 3-GAL. De preferência, o anticorpo liga-se a um ser humano proteína LAG-3 com "alta afinidade", isto é, com um KD de 1 x 10-7 M ou inferior, mais de preferência 1 x 10-8 M ou inferior, mais de preferência 5 x 10-9 M ou menos, mais de preferência 1 x 10-9 M ou menos.

[0061] O termo "não se liga substancialmente" a uma proteína ou células, tal como usado na presente invenção, significa que não se liga ou não se liga com uma alta afinidade para a proteína ou células, ou seja, liga-se a proteínas ou células com um KD de 1 x 10 -6 M ou mais, mais de preferência 1 x 10-5 M ou mais, mais de preferência 1 x 10-4 M ou mais, mais de preferência 1 x 10-3 M ou mais, ainda mais de preferência 1 x 10-2 M ou mais.

[0062] O termo "Kassoc" ou "Ka", tal como usado na presente invenção, pretende referir-se à taxa de associação de uma interação anticor- po-antígeno particular, enquanto que o termo "kdis" ou "Kd", tal como usado na presente invenção, pretende referir-se a a taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. O termo "KD", tal como usado na presente invenção, destina-se a referir a constante de dissociação, o qual é obtido a partir da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka), e é expressa como a concentração molar (M). Valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferido para determinar KD de um anticorpo é por meio de ressonância de superfície plasmônica, de preferência, usando um sistema biosensor, tais como um sistema BIAcore®.

[0063] O termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de 1 x 10-7 M ou inferior, mais de pre- ferência 5 x 10-8 M ou inferior, ainda mais de preferência, 1x10-8 M ou inferior, ainda mais de preferência entre 5 x 10-9 M ou inferior e ainda mais de preferência 1 x 10-9 M ou inferior para um antígeno alvo. No entanto, "alta afinidade" de ligação pode variar para outros isotipos do anticorpo. Por exemplo, "alta afinidade" de ligação para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de 10-6 M ou inferior, mais de preferência de 10-7 M ou inferior, ainda mais de preferência de 10-8 M ou menos.

[0064] O termo "desamidação" refere-se a um processo degredati- vo químico que ocorre espontaneamente em proteínas (por exemplo, anticorpos). A desamidação remove um grupo funcional amida a partir de um resíduo de aminoácido, tais como glutamina e asparagina, danificando, dessa maneira, as suas cadeias laterais contendo amida. Especificamente, a cadeia lateral de asparagina ataca o grupo peptídeo adjacente, formando uma succinimida intermediária simétrica. A simetria dos intermediários resulta em dois produtos de hidrólise, ou aspar- tato ou isoaspartate. Uma reação semelhante pode também ocorrer em cadeias laterais de aspartato, obtendo-se uma conversão parcial para isoaspartato. No caso de glutamina, a taxa de desamidação é geralmente dez vezes menos do que a asparagina, no entanto, o mecanismo é essencialmente o mesmo, necessitando apenas de moléculas de água para prosseguir.

[0065] O termo "indivíduo" compreende qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios, répteis e, embora sejam preferidos os mamíferos, tais como os primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas e cavalos.

[0066] Vários aspectos da presente invenção são descritos.Anticorpos Anti-LAG-3 tem maior estabilidade e propriedades funcio-nais vantajosas

[0067] Os anticorpos da presente invenção ligam-se especificamente para o LAG-3 humano e otimizaram a estabilidade em relação aos anticorpos anti-LAG-3 anteriormente descritos, particularmente em comparação com o anticorpo 25F7 (LAG3.1). Esta optimização inclui a desamidação reduzida (por exemplo, aumento de estabilidade química) e aumento da redobragem térmica (por exemplo, aumento da estabilidade física), mantendo a ligação de alta afinidade a LAG-3 humano.

[0068] Os métodos para a identificação de locais de desamidação são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, de troca iônica, fase reversa, e cromatografia de interação hidrofóbica, e mapeamento de peptídeos de digestões proteolíticas (LC-MS)). Os ensaios adequados para medir a estabilidade física incluem, por exemplo, análise de pontos de fusão e/ou de redobramento de estrutura do anticorpo seguinte desnaturação (por exemplo, porcentagem de reversibilidade tal como descrito, por exemplo, no Exemplo 3, ponto 3).

[0069] A ligação para o LAG-3 humano pode ser avaliada usando um ou mais técnicas também bem estabelecidos na literatura. Por exemplo, um anticorpo pode ser testado por um ensaio de citometria de fluxo, em que o anticorpo reage com uma linhagem celular que expressa o LAG-3 humano, tal como as células CHO que foram transfec- tadas para expressar a LAG-3 (por exemplo, o LAG-3 humano ou LAG-3 de macaco (por exemplo, macaco rhesus ou cinamólogo) ou LAG-3 de camundongo) na sua superfície celular. Outras células apropriadas paro uso nos ensaios de citometria de fluxo incluem células T anti-CD3-CD4 + estimuladas ativadas, que expressam LAG-3 nativo. De uma maneira adicional ou em alternativa, a ligação do anticorpo, incluindo a cinética de ligação (por exemplo, valor de KD), pode ser testada em ensaios de BIAcore. Ainda outros ensaios de ligação adequados incluem ensaios de ELISA, por exemplo, usando uma proteína LAG-3 recombinante.

[0070] Os anticorpos da presente invenção ligam-se de preferência à proteína LAG-3 humano com um KD de 1 x 10-7 M ou menos, e mais de preferência 1 x 10-8 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos, ou 1 x 10-9 M ou menos.

[0071] Tipicamente, o anticorpo liga-se a LAG-3 em tecidos linfói-des, das amígdalas, tais como, baço ou timo, que pode ser detectado por meio da imuno-histoquímica. Em uma modalidade, o anticorpo mancha o tecido pituitário (por exemplo, são retidos na pituitária) como medido por imuno-histoquímica. Em uma outra modalidade, o anticorpo não mancha o tecido pituitário (isto é, não é retido na pituitária) como medido por imuno-histoquímica.

[0072] As propriedades funcionais adicionais incluem a reatividade cruzada com a LAG-3 a partir de outras espécies. Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se a LAG-3 de macaco (por exemplo, macaco cina- mólogo, macaco rhesus), mas não se ligam substancialmente a LAG-3 de LAG-3 de camundongo. De um modo preferido, um anticorpo da presente invenção liga-se o LAG-3 humano com alta afinidade.

[0073] Outras propriedades funcionais incluem a capacidade do anticorpo para estimular uma resposta imune, tal como uma resposta de células T específica de antígeno. Isto pode ser testado, por exemplo, através da avaliação da capacidade do anticorpo para estimular a produção de interleucina-2 (IL-2) em uma resposta de células T específica de antígeno. Em certas modalidades, o anticorpo liga-se o LAG- 3 humano e estimula uma resposta das células T específicas do antí- geno. Em outras variantes, o anticorpo liga-se o LAG-3 humano, mas não estimula uma resposta das células T específicas do antígeno. Outros meios para a avaliação da capacidade do anticorpo para estimular uma resposta imune incluem testar a sua capacidade para inibir o crescimento tumoral, tal como em um modelo de tumor in vivo do en- xerto (vide, por exemplo, Exemplo 6) ou a capacidade de estimular uma resposta autoimune, tais como a capacidade de promover o desenvolvimento de uma doença autoimune em um modelo autoimune, por exemplo, a capacidade de promover o desenvolvimento de diabetes no modelo de camundongo NOD.

[0074] Os anticorpos preferidos da presente invenção são os anticorpos monoclonais humanos. De uma maneira adicional ou em alternativa, os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos monoclonais, quiméricos ou humanizados.

Anticorpo Monoclonal LAG3.5

[0075] Um anticorpo preferido da presente invenção é o anticorpo monoclonal humano, LAG3.5, estruturalmente e quimicamente caracterizada como descrito abaixo e nos Exemplos seguintes. A sequência de aminoácidos de VH de LAG3.5 é mostrada em SEQ ID NO: 12 (Figura 2A). A sequência de aminoácidos da VL LAG3.5 é mostrada em SEQ ID NO: 14 (Figura 2B).

[0076] As sequências de VH e VL (ou sequências de CDR) de outros anticorpos anti-LAG- 3 que se ligam humano LAG-3 podem ser "misturadas e combinadas" com as sequências VH e VL (ou sequências de CDR de anticorpo LAG3.5). De preferência, quando as cadeias VH e VL (ou as CDRs dentro de tais cadeias) são misturadas e combinadas, uma sequência de VH a partir de um determinado emparelhamen- to VH/VL é substituída com uma sequência VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma, de preferência uma sequência de VL a partir de um determinado emparelhamento VH/VL é substituída por meio de uma sequência de VL estruturalmente semelhante.

[0077] Por conseguinte, em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção, ou partes de ligação de antígeno dos mesmos, compreendem:

[0078] (a) uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 12 (ou seja, o VH de LAG3.5); e

[0079] (b) uma sequência de aminoácidos que compreende a regi ão variável de uma cadeia leve de SEQ ID NO: 14 (ou seja, a VL de LAG3.5) ou VL de outro anticorpo anti-LAG3 (isto é, que difere da LAG3.5);

[0080] em que o anticorpo se liga especificamente a LAG-3 humano.

[0081] Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção, ou partes de ligação de antígeno dos mesmos, compreendem:

[0082] (a) as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 (ou seja, as sequências de CDR de LAG3.5, SEQ ID NOs: 15, 16, e 17, respectivamente); e

[0083] (b) As regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14 (ou seja, as sequências de CDR de LAG3.5, SEQ ID NOs: 18, 19, e 20, respectivamente) ou as CDR de outro anticorpo anti-LAG3 (isto é, que difere da LAG3.5);

[0084] em que o anticorpo se liga especificamente a LAG-3 humano.

[0085] Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, inclui a região variável da cadeia pesada CDR2 de LAG3.5 combinada com CDR de outros anticorpos que se ligam a LAG-3 humano, por exemplo, uma CDR1 ou CDR3 a partir da região variável da cadeia e/ou uma CDR1, CDR2 e/ou CDR3 a partir da região variável da cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3 diferente.

[0086] Além disso, é bem conhecido na técnica que o domínio CDR3, independentemente do(s) domínio(s) CDR1 e/ou CDR2, só é possível determinar a especificidade de ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que vários anticorpos podem previsivelmente ser geraos tendo a mesma especificidade de ligação com base em uma sequência de CDR3 comum. Vide, por exemplo, Klimka et al, British J. of Cancer 83 (2): 252 a 260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296: 833 a 849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8910 a 8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soe. 116: 2161 a 2162 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2529 a 2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157: 739 a 749 (1996); Berezov et al, BIAjournal. 8: Scientific Review 8 (2001);. Igarashi et al, J. Bio- chem (Tokyo) 117: 452-7 (1995); Bourgeois et al, J. Virol 72:. 807-10 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 90: 4374 a 8 (1993); Polymenis e Stoller, J. Immunol. 152: 5218 a 5329 (1994) e Xu e Da-vis, Immunity 13: 37 a 45 (2000). Vide também, patentes US Nos 6.951.646.; 6.914.128; 6.090.382; 6.818.216; 6.156.313; 6.827.925;5.833.943; 5762905 e 5760185. Cada uma destas referências é incorporada na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[0087] Consequentemente, em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção incluem a CDR2 da região variável da cadeia pesada de LAG3.5 e pelo menos a CDR3 da região variável da cadeia pesada e/ou leve de LAG3.5 (SEQ ID NOs: 17 e/ou 20), ou a CDR3 da região variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve de um outro anticorpo a LAG-3, em que o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a LAG-3 humano. Estes anticorpos de preferência (a) competem pela ligação com; (b) mantêm as características funcionais; (c) se ligam ao mesmo epítopo; e/ou (d) tem uma afinidade de ligação semelhante ao LAG3.5. Em ainda outra modalidade, os anticorpos podem ainda incluir a CDR2 da região variável da cadeia leve de LAG3.5 (SEQ ID NOs: 17 e/ou 20), ou a CDR2 da região variável da cadeia leve de um outro anticorpo a LAG-3, em que o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a LAG-3 humano. Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção podem ainda incluir a CDR1 da região variável pesada e/ou cadeia leve de LAG3.5 (SEQ ID NOs: 17 e/ou 20), ou a CDR1 da região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de um outro anticorpo a LAG-3, em que o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a LAG-3 humano.

Modificações conservadoras

[0088] Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção compreendem as sequência da região variável da cadeia pesados e/ou da cadeia leve das sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, que diferem das de LAG3.5 por meio de uma ou mais modificações conservadoras. Em uma modalidade preferida, no entanto, os resíduos 54 e 56 de VH CDR2 permanecem como arginina e serina, respectivamente, (isto é, não são mutados). É entendido na técnica que determinadas modificações conservadoras da sequência podem ser feitas de modo que não remova a ligação ao antígeno. Vide, por exemplo, Brummel et al. (1993) Biochem 32: 1180 a 8; De Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10: 835 a 41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 26864 a 26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149: 1605-1612; Kelley e O'Connell (1993) Biochem. 32: 6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10: 341-6 e Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6: 2835 a 43. Por conseguinte, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 e/ou uma região variável da cadeia leve que compreende CDR1, CDR2 e CDR3, em que:

[0089] (a) a sequência de CDR1 da região variável da cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 15, e/ou modificações conservadoras dos mesmos, exceto nas posições 54 e 56; e/ou

[0090] (b) a sequência de CDR3 da região variável da cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 17, e suas modificações conservadoras; e/ou

[0091] (c) as sequências de CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da região variável da cadeia leve compreendem SEQ ID NO: 18, e/ou, SEQ ID NO: 19, e/ou SEQ ID NO: 20, e/ou as modificações conservadoras do mesmo; e

[0092] (d) o anticorpo se liga especificamente a LAG-3 humano.

[0093] De uma maneira adicional ou de uma maneira alternativa, o anticorpo pode possuir uma ou mais das seguintes propriedades funcionais descritas acima, tais como a ligação de alta afinidade para o LAG-3 humano, ligação a LAG-3 de macaco, a ausência de ligação de LAG-3 de camundongo, a capacidade de inibir ligação de LAG-3 as moléculas de MHC de Classe II e/ou a capacidade de estimular respostas de células T específicas de antígeno.

[0094] Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo,um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

[0095] Tal como usado na presente invenção, o termo "modificações da sequência conservativas" pretende referir-se a modificações de aminoácidos que não afetem significativamente ou alterem as características de ligação do anticorpo, contendo a sequência de amino- ácidos. Tais modificações conservadoras incluem as substituições de aminoácidos, adições e deleções. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da presente invenção por meio de técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida ao local e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por meio de um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido, aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cis- teína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, tripto- fano, histidina). Dessa maneira, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR de um anticorpo da presente invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos a partir da mesma família das cadeias laterais e o anticorpo alterado pode ser testado para a função retido (isto é, as funções estabelecidas acima) usando os ensaios funcionais descrito na presente invenção.

Os anticorpos manipulados e modificados

[0096] Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados usando um anticorpo com uma ou mais das VH e/ou VL das sequências LAG3.5 como material de partida para engendrar um anticorpo modificado. Um anticorpo pode ser manipulado por meio da modificação de um ou mais resíduos entre uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. De uma maneira adicional ou em alternativa, um anticorpo pode ser manipulado por meio da modificação de resíduos no interior da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

[0097] Em certas modalidades, o enxerto de CDR pode ser usado para manipular as regiões variáveis de anticorpos. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas regiões determinantes de complementaridade de seis cadeias pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora dos CDRs. Uma vez que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos através da construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo que ocorre naturalmente específico enxertado em sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann et al (1998) Nature 332: 323 a 327; Jones et al (1986) Nature 321: 522 a 525; queen et al (1989) Proc Natl Acad. Vide. EUA 86: 10029 a 10033; Patente U.S. n ° s 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370).

[0098] Por conseguinte, uma outra modalidade da presente invenção diz respeito a um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2, e CDR3 que compreende a SEQ ID NOs: 15, 16, 17, respectivamente, e/ou uma região variável da cadeia leve que compreende as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 que compreende a SEQ ID NOs: 18, 19, 20, respectivamente (ou seja, os CDRs de LAG3.5). Embora estes anticorpos contêm as sequências de VH e VL de CDR de anticorpo monoclonal LAG3.5, eles podem conter diferentes sequências estruturais.

[0099] Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas, que incluem as sequências de genes de anticorpos da linha germinativa. Por exemplo, as sequências de DNA da linha germinativa de genes de regiões variáveis da cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas na base de dados de sequência da linha germinativa humana "Vbase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat et al. (1991), citado acima; Tomlinson et al. (1992) "Repertório das Sequências VH da linha germinal humana revela sobre Cinquenta Grupos de segmentos VH com Diferentes alças hi- pervariáveis " J. Mol. Biol. 227: 776-798; e Cox et al. (1994) "Diretório de Segmentos VH da linha germinal Humana revela uma forte inclina- ção no seu uso" Eur. J. Immunol. 24: 827 a 836; o conteúdo de cada um dos quais são expressamente incorporados na presente invenção por meio de referência. Como outro exemplo, as sequências de DNA da linha germinativa a partir dos genes de regiões variáveis da cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas na base de dados Genbank. Por exemplo, as seguintes sequências da linha germinativa da cadeia pesada encontradas no camundongo HCo7 AcMHu estão disponíveis no Genbank que acompanha Nos: 1 a 69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333), 3-33 (NG_0010109 & NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 & NT_024637). Como outro exemplo, as seguintes sequências da linha germinativa da cadeia pesada encontradas no camundongo HCo12 AcMHu estão disponíveis no Genbank que acompanha Nos.: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333), 5-51 (NG_0010109 & NT_024637), 4-34 (NG_0010109 & NT_024637), 330.3 (CAJ556644) & 3-23 (AJ406678).

[00100] As sequências de proteína de anticorpo são comparadas com uma base de dados de sequência de proteínas compiladas usando um dos métodos de pesquisa de similaridade de sequência denominadas Gapped BLAST (Altschul et al. (1997), supra), que é bem conhecida por meio daqueles que são versados na técnica.

[00101] As sequências de estrutura principal preferidas para o uso nos anticorpos da presente invenção são aquelas que são estruturalmente semelhantes às usadas por meio das sequências estruturais de anticorpos selecionadas da presente invenção, por exemplo, semelhantes às sequências de estrutura principal VH 4-34 e/ou as sequências de estrutura principal VK L6 usadas por meio dos anticorpos monoclonais preferidos da presente invenção. A CDR1 de VH, CDR2 e CDR3, e VK CDR1, CDR2 e CDR3, podem ser enxertadas em regiões estruturais que têm a sequência idêntica à encontrada no gene de imunoglobulina da linha germinal da qual deriva a sequência de estru-tura, ou a CDR das sequências podem ser enxertadas em regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações em comparação com as sequências da linha germinativa. Por exemplo, verificou-se que, em certos casos, é benéfico mutar os resíduos nas regiões de estrutura para manter ou melhorar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo (vide, por exemplo, Patentes US Nos 5530101; 5.585.089;5.693.762 e 6.180.370).

[00102] Outro tipo de modificação da região variável é a mutar os resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR3 de VH e/ou VL CDR1, CDR2 e/ou melhorar, dessa maneira, uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese dirigida ao local ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada in vitro ou em ensaios in vivo, tal como descrito na presente invenção e fornecida nos Exemplos. De preferência, as modificações conservadoras (como discutido acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições de aminoácidos, adições ou dele- ções, mas são de preferência substituições. Além disso, normalmente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos em uma região CDR são alterados.

[00103] Consequentemente, em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona os anticorpos anti-LAG-3 monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende: (a) uma região CDR1 VH que compreende a SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácido possuindo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15; (b) uma região CDR2 da VH que compreende SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos possuindo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 16 (de preferência em que as posições 54 e 56 é o mesmo que na SEQ ID NO: 16); (c) uma região CDR3 de VH que compreende SEQ ID NO: 17, ou uma sequência de aminoácidos possuindo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 17; (d) uma região VL CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 18, ou uma sequência de aminoácidos possuindo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de ami- noácidos em relação à SEQ ID NO: 18; (e) uma região VL CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 19, ou uma sequência de aminoácidos possuindo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 19; e (f) uma região CDR3 de VL que compreende SEQ ID NO: 20, ou uma sequência de aminoácidos possuindo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidosem relação à SEQ ID NO: 20.

[00104] Os anticorpos manipulados da presente invenção incluem aqueles nos quais as modificações foram feitas para os resíduos estruturais dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações estruturais são feitos para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "mutada de novo" em um ou mais resíduos de modalidade com a sequência da linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura principal que diferem da sequência da linha germi- nativa a partir do qual o anticorpo é derivado. Estes resíduos podem ser identificados por meio da comparação das sequências de estrutura de anticorpo para as sequências da linha germinativa do anticorpo a partir do qual é derivado.

[00105] Outro tipo de modificação da estrutura principal envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região da estrutura, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover os epíto- pos de células T para, desse modo, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem também é conhecida como "desi- munização" e é descrita em mais pormenores na Patente US No. de publicação 20030153043.

[00106] Em alternativa ou além de modificações feitas dentro das regiões de estrutura principal ou de CDR, os anticorpos da presente invenção podem ser concebidos de modo a incluir as modificações dentro da região Fe, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como a semi-vida sérica, fixação do complemento, a ligação ao receptor Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da presente invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais partes químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou podem ser modificadas para alterar a sua glicosilaçãp, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é tal qual índice de Kabat UE.

[00107] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo do isotipo IgG4 que compreende uma serina para mutação de prolina na posição correspondente à posição 228 (S228P; índice UE) na região de dobradiça da região constante da cadeia pesada. Esta mutação tem sido relatada para abolir a heterogeneidade de inter-cadeia pesada de pontes dissulfureto na região da dobradiça (Angal et al supra;. Posição 241 é baseada no sistema de numeração de Kabat).

[00108] Em uma modalidade, a região dobradiça de CH1 é modificada de tal modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita de uma maneira adicional na Patente US No. 5.677.425. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00109] Em uma outra modalidade, a região de dobradiça de Fc de um anticorpo é mutado para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc de modo a que o anticorpo tem prejudicado a proteína Staphylococcyl A (SpA) de se ligar em relação ao domínio de ligação de dobradiça Fc SpA nativo. Esta abordagem está descrita em mais pormenores na Patente US No. 6.165.745.

[00110] Em uma outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar a sua semi-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, tal como descrito na patente US No. 6.277.375. De uma maneira alternativa, para aumentar a meia vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de receptor de salvamento feito a partir de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de IgG, tal como descrito nas Patentes US Nos. 5869046 e 6121022.

[00111] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada por meio da substituição de um resíduo de aminoácido, pelo menos um aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoá- cidos selecionados de entre os resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retém a capacidade de ligação ao antíge- no do anticorpo progenitor. O ligante efetor para que a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em pormenores na Patente US 5.624.821 e 5.648.260 Nos..

[00112] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de entre os resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo foi alterado de ligação C1q e/ou reduziu ou aboliu a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Esta abordagem está descrita em mais pormenores na Patente US No. 6.194.551.

[00113] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro de aminoácidos nas posições 231 e 239 estão alterados para assim alterar a capacidade do anticorpo para fixar o complemento. Esta abordagem é descrita de uma maneira adicional na Publicação PCT WO 94/29351.

[00114] Ainda em um outro exemplo, a região Fe está modificada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy por meio da modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280,283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305,307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334,335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416,419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é descrita adiante na publicação PCT WO 00/42072. Além disso, os locais de ligação na IgG1 humana para FCYRI, FcyRII, e FcyRIII FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada têm sido descritas (vide Shields et al (2001) J. Biol Chem 276: 6591 a 6604). As mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas para melhorar a ligação a FcyRIII. Além disso, os seguintes mutantes de combinação foram mostradas para melhorar FcyRIII obrigatório: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

[00115] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo glicosilado pode ser feito (ou seja, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, aumentando a afinidade do anticorpo para o antí- geno. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser conseguidas por, por exemplo, alterar um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas, que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação da estrutura da região variável para eliminar assim a glicosilação nesse local. Tal glicolisação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.714.350 e 6.350.861.

[00116] De uma maneira adicional ou em alternativa, um anticorpo pode ser criado, que tem um tipo de glicosilação alterado, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosilo ou um anticorpo tendo estruturas GlcNAc bissectoras aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados para aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser conseguidas por, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glico- silação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada têm sido descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção, para desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709 faltam o gene de fucosiltransferase, FUT8 (α (1,6) -fucosiltransferase), de tal modo que os anticorpos expressos em linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709 faltam fucose em seus hidratos de carbono. As linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709 FUT8 -/- foram criadas pela ruptura direcionada do gene FUT8 em células CHO/DG44 usando dois vetores de substituição (vide Publicação de Patente US. No. 20040110704 e Yamane-Ohnuki et al (2004). Biotechnol Bioeng 87: 614 a 22). Como outro exemplo, o documento EP 1176195 descreve uma linhagem celular com um gene funcionalmente corrompido FUT8, que codifica uma transferase de fucose, tal que os anticorpos expressos de tal linhagem celular expõem a hipofucosilação, reduzindo ou eliminando a enzima relacionada com ligação α-1,6. EP 1176195 também descreve as linhagens celulares que possuem uma baixa atividade de enzima para adicionar a fucose a N-acetilglicosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não tem a atividade enzimática, por exem-plo, a linhagem celular de mieloma de camundongo YB2/0 (ATCC CRL 1662). Publicação PCT WO 03/035835 descreve uma linhagem celular CHO variante, as células Lec13, com capacidade reduzida para fixar a fucose para Asn (297) -ligada aos hidratos de carbono, resultando também em hipofucosilação de anticorpos expressos na célula hospedeira (vide também Shields et al. (2002) J. Biol Chem 277: 26.733 a 26.740). Os anticorpos com um perfil de glicosilação modificado também podem ser produzidos em ovos de galinha, como descrito na Publicação PCT WO 06/089231. De uma maneira alternativa, os anticorpos com um perfil de glicosilação modificado podem ser produzidos em células de plantas, tais como Lemna. Os métodos para a produção de anticorpos em um sistema de planta são descritos no pedido de patente U.S. correspondente a Alston & Bird LLP Attorney Docket No. 040989/314911, depositado em 11 de Agosto de 2006. A publicação PCT WO 99/54342 descreve as linhagens celulares manipuladas para expressar glicosil-transferases modificando as glicoproteínas (por exemplo, β (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de tal modo que os anticorpos expressos na engenharia de linhagens celulares apresentam aumento de estruturas GlcNAc bissectoras o que re- sulta em um aumento da atividade de CCDA dos anticorpos (vide também Umana et al (1999) Nat Biotech. 17: 176 a 180). De uma maneira alternativa, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser removidos por meio da clivagem usando uma enzima fucosidase; por exemplo, a fucosidase α-L-fucosidase remove os resíduos de fucosila a partir dos anticorpos (Tarentino et al (1975) Biochem. 14: 5516 a 23).

[00117] Outra modificação dos anticorpos descrita na presente invenção, que é contemplada por meio desta invenção é a peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumentar a biológica (por exemplo, soro) semi-vida do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou um fragmento do mesmo, tipicamente faz-se reagir com polietilenoglicol (PEG), tal como um éster ou aldeído reativos derivados de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG tornam-se ligados ao fragmento de anticorpo ou anticorpo. De preferência, a peguilação é realizada através de uma reação de acila- ção ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Tal como usado na presente invenção, o termo "polietileno glicol" pretende englobar qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno-glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para proteínas de PEGuilação são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da presente invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 e EP 0 401 384.

Propriedades Físicas do Anticorpo

[00118] Os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados por meio das suas propriedades físicas diferentes, para detectar e/ou diferenciar as diferentes classes dos mesmos.

[00119] Por exemplo, os anticorpos podem conter um ou mais lo- cais de glicosilação em ambas as regiões variáveis da cadeia pesada quanto da cadeia leve. Tais locais de glicosilação podem resultar em um aumento da imunogenicidade do anticorpo ou de uma alteração do pK do anticorpo devido à ligação ao antígeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673 a a 702; Gala e Morrison (2004) J Immunol 172: 5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099 a 109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R a 56R; Parekh et al (1985) Nature 316: 452 a 7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37: 697 a 706). A glicosilação tem sido conhecida para ocorrer em motivos contendo uma sequência NXS/T. Em alguns casos, prefere-se ter um anticorpo anti-LAG-3 que não contém a região variável de glicosilação. Isto pode ser conseguido através da seleção de anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou por meio da mutação de resíduos dentro da região de glicosilação.

[00120] Em uma modalidade preferida, os anticorpos não contêm os locais de isomerismo asparagina. A desaminação da asparagina pode ocorrer em sequências N-G ou D-G e resultará na criação de um resíduo de ácido isoaspártico que introduz uma torção na cadeia poli- peptídica e diminui a sua estabilidade (efeito do ácido isoaspártico).

[00121] Cada anticorpo terá um único ponto isoeléctrico (pI), que geralmente desce no intervalo de pH entre 6 e 9,5. O pI de um anticorpo IgG1 cai tipicamente dentro da gama de pH de 7 a 9,5 e o pI de um anticorpo IgG4 cai tipicamente dentro da gama de pH 6 a 8. Especula- se que os anticorpos com um pi fora do intervalo normal podem ter algum desdobramento e instabilidade em condições in vivo. Dessa maneira, é preferível ter um anticorpo anti-LAG-3 que contém um valor de pI que cai dentro dos limites normais. Isto pode ser conseguido através da seleção de anticorpos com um pi no intervalo normal, ou por meio da mutação de resíduos de superfície carregados.

Moléculas de Ácido Nucleico Codificando os Anticorpos da presente invenção

[00122] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona as moléculas de ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve, ou CDRs, dos anticorpos da presente invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico está "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado a partir de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por meio das técnicas con-vencionais, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cro- matografia em coluna, agarose eletroforese em gel e outros bem conhecidos na técnica. Vide, Ausubel, et al., Ed. (1987) Protocolos Atuais na Biologia Molecular, Greene Publishing e Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da presente invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou podem não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[00123] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser obtidos usando as técnicas de biologia molecular padrão. Para os anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, os hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de imuno- globulinas humanas tal como descrito mais abaixo), os cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feitos pelo hibridoma podem ser obtidos por meio da amplificação por PCR convencional ou técnicas de clonagem de cDNA. Para os anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando as técnicas de exibição em fagos), um ácido nucleico que codifica esses anticorpos pode ser recuperado a partir da biblioteca de genes.

[00124] Moléculas de ácidos nucleicos preferidos da presente invenção incluem aqueles que codificam as sequências de VH e VL de anticorpo monoclonal LAG3.5 (SEQ ID NOs: 12 e 14, respectivamente) ou as CDRs. Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam para os segmentos VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser ainda manipulados por meio das técnicas de DNA recombinante, convencionais, por exemplo, para converter os genes da região variável para os genes da cadeia de anticorpo de comprimento total, os genes de fragmentos Fab, ou em um gene de scFv. Nestas manipulações, um VL ou VH que codifica o fragmento de DNA é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica para outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado", tal como usado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são ligados de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem em estrutura.

[00125] O DNA isolado que codifica para a região VH pode ser convertido em um gene da cadeia pesada de comprimento total ligando de forma operacional o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica para regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat et al. (1991), supra) e os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos por meio da amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser umaegião IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD r constante, mas mais de preferência é uma região IgG1 ou IgG4 constante. Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operacionalmente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 da cadeia pesada.

[00126] O DNA isolado que codifica para a região VL pode ser convertido em um gene da cadeia leve de comprimento total (bem como um gene da cadeia leve Fab), ligando de forma operacional o DNA que codifica para VL para a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve CL. As sequências dos genes da região constante da cadeia leve humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat et al., Supra) e os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos por meio da amplificação por PCR padrão. Em modalidades preferidas, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

[00127] Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA de codificação de VH e VL estão operacionalmente ligados a um outro fragmento que codifica para um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4 -Ser) 3 (SEQ ID NO: 28), de tal modo que o sequências de VH e VL podem ser expressas como uma proteína contígua da cadeia simples, com as regiões VL e VH ligadas por meio do ligante flexível (vide por exemplo, Bird et al (1988) Science 242: 423-426; Huston et al (1988 ) Proc Natl Acad Sci EUA. 85: 5879 a 5883; McCafferty et al, (1990) Nature 348: 552 a 554).

Produção de Anticorpos Monoclonais da presente invenção

[00128] Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos usando a bem conhecida técnica de hibridação de células somáticas (hibridoma) de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Outras modalidades para a produção de anticorpos mono- clonais incluem a transformação oncogênica viral ou de linfócitos B e as técnicas de exibição em fagos. Os anticorpos quiméricos ou humanizados são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 4,816,567.; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370, os conteúdos das quais são incorporados na presente invenção especificamente por meio de referência na sua totalidade.

[00129] Em uma modalidade preferida, os anticorpos da presente invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos mo- noclonais humanos dirigidos contra o LAG-3 humano podem ser gerados usando camundongos transgênicos que transportam as partes transcromossômicas ou do sistema imunitário humano em vez do sistema do camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcro- mossômicos incluem camundongos referidos na presente invenção como o AcMHu Mouse® e KM Mouse®, respectivamente, e são colec- tivamente referidos na presente invenção como "camundongos Ig humanos."

[00130] O HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contém minilocais de genes humanos que codificam a imunoglobulina humana não rearran- jada pesada (μ e Y) e sequências de imunoglobulina da cadeia leve K, juntamente com mutações alvo que inativam os locais endógenos da cadeia μ e k (vide, por exemplo,. Lonberg et al (1994) Nature 368 (6474): 856 a 859). Por conseguinte, os camundongos exibem expressão reduzida de camundongos IgM ou k, e em resposta à imunização, os transgenes da cadeia pesada e leve humanas introduzidas sofrem troca de classe e de mutação somática para gerar os anticorpos mo- noclonais humanos de alta afinidade IgGk (Lonberg et al. (1994), supra; revisto em Lonberg (1994) Manual de Farmacologia Experimental 113: 49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern Rev. Immunol 13: 65 a 93, e Harding e Lonberg (1995) Ann. NY Acad Sci 764: 536 a 546). A preparação e uso da AcMHu Mouse®, e as modificações ge- nômicas transportadas por esses camundongos, são ainda descritas em Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287 a 6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647 a 656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 3720 a 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117 a 123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912 a 2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579 a 591; e Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são incorporados na presente invenção especificamente por meio de referência na sua totalidade. Vide ainda, Patentes U.S. N ° s 5.545.806.; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397;5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429; e 5.545.807; Publicação PCT N ° s WO 92/03918.; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 e WO 01/14424, cujos conteúdos são incorporados na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[00131] Em uma outra modalidade, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser levantados usando um camundongo que transporta as sequências de imunoglobulinas humanas e em transgenes transcromossomas, tais como um camundongo que transporta um transgene da cadeia pesada humana e uma cadeia leve de transcro- mossoma humano. Este camundongo é referido na presente invenção como um "KM mouse®", e é descrito em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478. Uma forma modificada deste camundongo, que compreende ainda uma perturbação homozigótica do gene do receptor endógeno FCYRIIB, é também descrito na Publicação PCT WO 02/43478 e referido na presente invenção como um "KM Mouse®/FCGR2D". Além disso, os camundongos tanto com os transgenes da cadeia pesada HCo7 quanto HCo12 ou ambos podem ser usados.

[00132] Modalidades animais transgênicas incluem Xenomouse (Abgenix, Inc., Patentes U.S. Nos 5939598;. 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963). Outras modalidades incluem "camundongos TC" (Tomizuka et al (2000) Proc Natl Acad Sci EUA 97: 722 a 727) e vacas transportando os transcromossomas da cadeia pesada e leve humanas (Kuroiwa et al (2002) Nature Biotechnology 20: 889 a 894; publicação PCT WO 02/092812). Os conteúdos destas patentes e publicações são especificamente incorporados na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[00133] Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção são preparados usando os métodos de apresentação em fagos para o rastreio de bibliotecas de genes de imunoglobu- lina humana. Vide, por exemplo Patente U.S. Nos 5.223.409.; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5969108; 6172197;5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; e 6.593.081, cujos conteúdos são incorporados na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[00134] Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção também podem ser preparados usando camundongos SCID no qual as células imunitárias humanas foram reconstituídas de tal modo que uma resposta de anticorpo humano pode ser gerada por meio da imunização. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.476.996 e 5.698.767, os conteúdos das quais são incorporados na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[00135] Em uma outra modalidade, anti-LAG-3 humano são preparados usando anticorpos de apresentação de fagos em que os fagos compreendem ácidos nucleicos que codificam os anticorpos gerados nos animais transgênicos previamente imunizados com a LAG-3. Em uma modalidade preferida, o animal transgênico é um camundongo AcMHu, KM, ou Kirin. Vide, por exemplo, a Patente US No. 6.794.132, cujos conteúdos são incorporados na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

A Imunização de Camundongos Ig Humanos

[00136] Em uma modalidade da presente invenção, os camundongos Ig humanos são imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de um antígeno de LAG-3, LAG-3 recombinante de proteína, ou células que expressam uma proteína LAG-3. Vide, por exemplo, Lonberg et al. (1994), supra; Fishwild et al. (1996), supra; Publicações PCT WO 98/24884 ou WO 01/14424, cujos conteúdos são incorpora- dos na presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Em uma modalidade preferida, camundongos de 6 a 16 semanas de idade são imunizados com 5 a 50 ug de proteína LAG-3. De uma maneira alternativa, uma porção da LAG-3 fundida com um polipeptídeo não LAG-3 é usada.

[00137] Em uma modalidade, os camundongos transgênicos são imunizados intraperitonealmente (IP) ou por via intravenosa (IV) com antígeno LAG-3 em adjuvante de Freund completo, seguido por meio das imunizações IP ou IV subsequentes com o antígeno em adjuvante incompleto de Freund. Em outras modalidades, exceto as células inteiras na ausência de adjuvante de Freund ou adjuvantes são usados. O plasma pode ser rastreado por ELISA e as células de camundongos com títulos suficientes de anti-LAG-3 de imunoglobulina humana podem ser usadas para as fusões.

Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais Humanos da presente invenção

[00138] Para gerar os hibridomas que produzem anticorpos mono- clonais humanos da presente invenção, os esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser rastreados quanto à produção de anticorpos específicos para o antígeno. A geração de hibridomas é bem conhecida na técnica. Vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Anticorpos: Um Manual Laboratorial, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque.

Geração de transfectomas Produzindo os Anticorpos Monoclonais da presente invenção

[00139] Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinantes e mé- todos de transfeção de genes, como é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). Em uma modalidade, o DNA que codifica as cadeias leves ou as cadeias pesadas de comprimento parcial ou completo obtido por meio de técnicas padrão de biologia molecular, é inserido em um ou mais vetores de expressão de tal forma que os genes sejam operacionalmente ligados às sequências reguladoras transcricionais e translacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo está ligado em um vetor de modo a que as sequências de controle da transcrição e da tradução dentro do vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene do anticorpo.

[00140] O termo "sequência reguladora" pretende incluir promotores, estimuladores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel (Tecnologia da expressão genética. Métodos em Enzimologia 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). As sequências reguladoras preferidas para expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que tem níveis altamente diretos de expressão de proteínas em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de ci- tomegalovírus (CMV), vírus símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o adenovirus o promotor tardio principal (AdMLP) e polioma. Como alternativa, as sequências reguladoras não virais podem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitina ou o promotor β-globina. Ainda de uma maneira adicional, os elementos de regulação, compostos por meio das sequências de diferentes fontes, tais como o sistema promotor SRa, que contém sequências do promotor precoce de SV40 e a repetição terminal longa do vírus da leucemia de células T humanas do tipo 1 (Takebe et al (1988) Mol Cell Biol. 8: 466 a 472). As sequên- cias do vetor de expressão e de controle de expressão são escolhidas a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada.

[00141] O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos nos mesmos ou em diferentes vetores de expressão. Em modalidades preferidas, as regiões variáveis são usadas para criar os genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo, inserindo-os em vetores de expressão que já codificam a região constante da cadeia pesada e a região constanteda cadeia leve do isotipo desejado de tal modo que o segmento VH seja operacionalmente ligado ao(s) segmento(s) CH no vetor e o segmento VL seja operacionalmente ligado ao segmento CL no vetor. De uma maneira adicional ou de uma maneira alternativa, o vetor de expressão recombinante pode codificar para um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo a que o peptídeo de sinal esteja ligado à estrutura ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal hete- rólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não imunoglobulina).

[00142] Além dos genes da cadeia de anticorpo e das sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção podem transportar as sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e os genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, Pa-tente U.S. Nos 4,399,216; 4634665 e 5179017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência aos fárma- cos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecio- náveis preferidos incluem o gene da redutase de di-hidrofolato (DHFR) (paro uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção com G418).

[00143] Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) ve- tor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias leve e pesada é/são transfectado(s) em uma célula hospedeira por meio das técnicas padrão. As várias formas do termo "transfeção" destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas vulgarmente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou euca- riótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfeção com DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da presente invenção, quer em células hospedeiras procariotas, quer eucariotas, a expressão de anticorpos em células eucariotas, e mais de preferência células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida porque estas células euca- riotas, e em particular, as células de mamíferos, são mais propensas do que as células procariotas de montar e secretar um anticorpo devidamente dobrado e imunologicamente ativo.

[00144] As células hospedeiras de mamífero preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes da presente invenção incluem ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin (1980) Proc Natl Acad Sci EUA 77: 4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em RJ Kaufman e PA Sharp (1982) J. Mol Biol 159: 601 a 621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, paro uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão do gene de GS revelados em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam para genes do anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticor- pos são produzidos fazendo a cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais de preferência, a secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando os métodos de purificação de proteínas padrão.

Imunoconjugados

[00145] Os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados com um agente terapêutico para formar um imunoconjugado tal como um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Os agentes terapêuticos adequados incluem anti-metabolitos, agentes alquilantes, DNA aglutinan- tess do sulco menor, intercaladores de DNA, agentes de reticulação deDNA, inibidores de histona deacetilase, inibidores de exportação nuclear, inibidores do proteassoma, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores da proteína de choque térmico, inibidores de tirosina qui- nase, antibióticos, e agentes antimitóticos. No ADC, o anticorpo e o agente terapêutico são de preferência conjugados através de um ligan- te clivável, tal como um peptidilo, dissulfureto, ou hidrazona ligante. Mais de preferência, o ligante é um ligante peptídico, tais como Val-Cit, Ala-Val, Ala-Val-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 39), Ala-Asn Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser ou Glu. Os ADCs podem ser preparados como descrito nas Patentes US Nos 7.087.600.; 6.989.452; e 7.129.261; Publicações PCT WO02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; e WO 08/103693; Publicações de Patente U.S. 20060024317; 20060004081; e 20060247295; cujas descrições são incorporadas na presente invenção por meio de referência.

Molécules Bispecíficas

[00146] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta as moléculas biespecíficas que compreendem um ou mais anticorpos da presente invenção ligados a pelo menos uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um outro anticorpo ou um ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que liga-se a pelo menos dois locais de ligação diferentes ou moléculas-alvo. Dessa maneira, tal como usado na presente invenção, o termo "molécula biespecífica" inclui as moléculas que têm três ou mais especificidades. Em uma modalidade preferida, a molécula biespecífica compreende uma primeira especificidade de ligação para a LAG-3 e uma segunda especificidade de ligação para uma molécula desencadeadora que recruta células efetoras citotóxicas que podem matar uma célula alvo que expressa a LAG-3. Exemplos de moléculas desencadeadoras adequadas são CD64, CD89, CD16, e CD3. Vide, por exemplo, Kufer et al., Trends in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004).

[00147] Em uma modalidade, uma molécula biespecífica tem, além de um anti-Fc e uma especificidade de ligação a especificidade de ligação anti-LAG-3, uma terceira especificidade. A terceira especificidade pode ser para um fator antireforço (FE), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína da superfície envolvida na atividade citotó- xica e, deste modo, aumenta a resposta imunitária contra a célula alvo. Por exemplo, o fator antireforço pode ligar-se uma célula T citotóxica (por exemplo, através do CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ou ICAM-1) ou outra célula imunitária, resultando no aumento da resposta imunitária contra a célula alvo.

[00148] As moléculas biespecíficas podem vir em diversos formatos e tamanhos diferentes. Em uma extremidade do espectro de tamanho, uma molécula biespecífica retém o formato de anticorpo tradicional, exceto que, em vez de ter dois braços de ligação de especificidade idêntica, tem dois braços de ligação, tendo cada especificidade diferente. No outro extremo encontram-se as moléculas biespecíficas que consistem em dois fragmentos de anticorpo da cadeia simples (scFv's) ligados por meio de uma cadeia peptídica, um assim chamado cons- tructo Bs (scFv)2. As moléculas biespecíficas de tamanho intermediário incluem dois fragmentos diferentes F(ab) ligados por meio um ligante peptídico. As moléculas biespecíficas destes e de outros formatos podem ser preparadas por meio da engenharia genética, hibridação somática, ou por meio dos métodos químicos. Vide, por exemplo, Kufer et al, citado supra; Cao e Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635 a 644 (1998); e van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391 a 397 (2000), e as referências aí citadas.

Composições Farmacêuticas

[00149] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos da presente invenção formulados em conjunto com um veículo farmaceu- ticamente aceitável. A composição pode opcionalmente conter um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos adicionais, tais como outro anticorpo ou um fármaco. As composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser administradas em uma terapia de combinação com, por exemplo, um outro agente imunoestimulador, um agente anticâncer, um agente anti-viral, ou uma vacina, de modo que o anticorpo anti-LAG-3 aumenta a resposta imune contra a vacina.

[00150] A composição farmacêutica pode compreender qualquer número de excipientes. Excipientes que podem ser usados incluem veículos, agentes ativos de superfície, agentes espessantes ou emul- sionantes, ligantes sólidos, de dispersão ou de suspensão auxiliares, solubilizantes, corantes, agentes aromatizantes, revestimentos, agentes desintegrantes, lubrificantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotônicos e as combinações dos mesmos. A seleção e uso de excipi- entes adequados é ensinado em Gennaro, ed, Remington: A Ciência e a Prática da Farmácia, 20 Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 2003), a descrição a qual é incorporada na presente invenção por meio de referência.

[00151] De preferência, a composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentéri- ca, administração espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser revestido em um material para proteger da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativá-lo. A frase "administração pa- rentérica" tal como usado na presente invenção, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardí- aca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraspinal, injeção e infusão epidural e intrasternal. De uma maneira alternativa, um anticorpo da presente invenção pode ser administrado através de uma via não parentérica, tal como tópica, epidérmica ou via mucosa de administração, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.

[00152] As composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceutica- mente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxico- lógicos indesejáveis. Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos não tóxicos, como o clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e outros semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N, N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroproca, colina, dietano- lamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.

[00153] As composições farmacêuticas podem estar na forma de soluções aquosas estéreis ou dispersões. Elas também podem ser formuladas em uma microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura adequada para alta concentração de fármaco.

[00154] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo particular de administração e será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, fora dos cem por cento, esta quantidade irá variar desde cerca de 0,01 % a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de preferência desde cerca de 0,1% a cerca de 70%, mais de preferência de cerca de 1% a cerca de 30% do ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuti- camente aceitável.

[00155] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta óptima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado por meio das exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular as composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, como usada na presente invenção, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. De uma maneira alternativa, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, em que é necessária os casos de uma administração menos frequente.

[00156] Para a administração do anticorpo, a dosagem varia de a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, de 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, de 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou no intervalo de 1 a 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada três a seis meses. Os regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-LAG-3 da presente invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por administração por via intravenosa, com o anticorpo a ser determinado usando um dos seguintes programas de dosagem: (i) todas as quatro semanas para seis doses, em seguida, a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) a 3 mg/kg de peso corporal, uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal de três em três semanas. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para se obter uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 a 1000 ng/ml e, em alguns métodos de cerca de 25 a 300 ug/ml.

[00157] Uma "dose terapeuticamente eficaz" de um anticorpo antiLAG-3 da presente invenção de preferência resulta em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento da frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou uma preven- ção de insuficiência ou incapacidade provocada por meio da aflição doença. Por exemplo, para o tratamento de pacientes portadores de tumores, uma "dose terapeuticamente eficaz" de preferência inibe o crescimento tumoral em, pelo menos, cerca de 20 %, mais de preferência em pelo menos cerca de 40 %, ainda mais de preferência em pelo menos cerca de 60 %, e ainda mais de preferência em pelo menos cerca de 80 % em relação a indivíduos não tratados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar os sintomas em um indivíduo, o qual é tipicamente um ser humano ou pode ser outro mamífero.

[00158] A composição farmacêutica pode ser uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Vide, por exemplo, Sistemas de Entrega de Fármaco de Liberação sustentada e controlada, JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00159] As composições terapêuticas podem ser administradas através de dispositivos médicos, tais como (1) dispositivos de injeção sem agulha hipodérmica (por exemplo, US 5.399.163; 5.383.851;5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; e 4.596.556); (2) Bombas de micro-infusão (US 4.487.603); (3) Os dispositivos transdérmicos (US 4.486.194); (4) A infusão apparati (US 4.447.233 e 4.447.224); e (5) os dispositivos osmóticos (US 4.439.196 e 4.475.196); cujas descrições são incorporadas na presente invenção por meio de referência.

[00160] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, para assegurar que os com-postos terapêuticos da presente invenção atravessem a barreira sangue-cérebro, os mesmos podem ser formulados em lipossomas, que podem de uma maneira adicional compreender as porções de direcionamento para melhorar o transporte seletivo para as células ou os órgãos específicos. Vide, por exemplo US 4522811; 5.374.548;5.416.016; e 5.399.331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen e Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; e Killion e Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

Usos e Métodos da presente invenção

[00161] Os anticorpos (composições, biespecíficos, e imunoconju- gados) da presente invenção têm numerosas utilidades in vitro e in vivo, por exemplo, a detecção de LAG-3 ou aumento de respostas imunes através do bloqueio da LAG-3. Em uma modalidade preferida, os anticorpos são anticorpos humanos. Tais anticorpos podem ser administrados a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a seres humanos, por exemplo, in vivo, para aumentar a imunidade, em uma variedade de situações. Deste modo, em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para modificar uma resposta imunitária em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, da presente invenção, tal que a resposta imune do indivíduo seja modificada. De preferência, a resposta é reforçada, estimulada ou sobre-regulada.

[00162] Os indivíduos preferidos incluem pacientes humanos que necessitam de reforço de uma resposta imunitária. Os métodos são particularmente adequados para o tratamento de pacientes humanos com uma doença que pode ser tratada por aumentar uma resposta imune (por exemplo, a resposta imune mediada por meio das células T). Em uma modalidade particular, os métodos são particularmente adequados para o tratamento de câncer in vivo. Para alcançar a melhoria específica de antígeno de imunidade, os anticorpos anti-LAG-3 podem ser administrados juntamente com um antígeno de interesse ou antígeno pode já estar presente no indivíduo a ser tratado (por exemplo, um objeto de suporte de tumor ou de suporte de vírus). Quando os anticorpos para a LAG-3 são administrados em conjunto com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente.

[00163] A presente invenção fornece de uma maneira adicional os métodos para detectar a presença de antígeno de LAG-3 humano em uma amostra, ou medindo a quantidade de antígeno de LAG-3 humano, que compreende contactar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que se liga especificamente o LAG-3 humano, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou parte dele e a LAG-3 humano. A formação de um complexo é então detectada, em que a diferença de formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle, é indicativa da presença de antígeno de LAG-3 humano na amostra. Além disso, os anticorpos anti-LAG-3 da presente invenção podem ser usados para purificar o LAG-3 humano através de purificação por meio da imunoafini- dade.

[00164] Dada a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 da presente invenção para inibir a ligação de LAG-3 e as moléculas de MHC de Classe II e para estimular as respostas das células T específicas do antígeno, a presente invenção também fornece os métodos de uso in vitro e in vivo dos anticorpos para estimular, aumentar ou regular positivamente as respostas das células T específicas de antígeno. Por exemplo, a presente invenção proporciona um método de estimulação de uma resposta de células T específicas do antígeno que compreende o contato da referida célula T com um anticorpo da presente invenção, de tal modo que uma resposta das células T específica do antí- geno é estimulada. Qualquer indicador apropriado de uma resposta de células T específica para o antígeno pode ser usada para medir a resposta de células T específica de antígeno. Exemplos não limitativos de tais indicadores adequados incluem o aumento da proliferação de células T na presença do anticorpo e/ou aumenta a produção de citoqui- nas, na presença do anticorpo. Em uma modalidade preferida, a inter- leucina-2 por meio da célula T específica do antígeno é estimulada.

[00165] A presente invenção também proporciona um método para estimular uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de células T específicas do antígeno) em um indivíduo, que compreende administrar um anticorpo da presente invenção para o indivíduo de tal modo que uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de células T específicas do antígeno) no indivíduo seja estimulado. Em uma modalidade preferida, o indivíduo é um indivíduo portador do tumor e uma resposta imune contra o tumor é estimulada. Em uma outra modalidade preferida, o indivíduo é um indivíduo que possui o vírus e uma resposta imune contra o vírus é estimulada.

[00166] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona os métodos para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo da presente invenção, tal que o crescimento do tumor seja inibido no indivíduo. Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona métodos para o tratamento de uma infeção viral em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo da presente invenção de modo a que a infeção viral seja tratada no indivíduo.

[00167] Estes e outros métodos da presente invenção são discutidos com mais detalhe abaixo.

Câncer

[00168] O bloqueio da LAG-3 por meio dos anticorpos pode aumentar a resposta imunitária a células cancerígenas no paciente. Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao tratamento de um indivíduo in vivo usando um anticorpo anti-LAG-3, tais que o crescimento dos tumores cancerígenos seja inibido. Um anticorpo anti-LAG-3 pode ser usado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerígenos. De uma maneira alternativa, um anticorpo anti-LAG-3 pode ser usado em conjunto com outros agentes imunogênicos, os tratamentos do câncer convencionais, ou outros anticorpos, como descrito abaixo.

[00169] Por conseguinte, em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-LAG-3, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos. De preferência, o anticorpo é um anticorpo anti-LAG-3 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-humanos LAG 3 humanos descrito na presente invenção). De uma maneira adicional ou de uma maneira alternativa, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-LAG-3quimérico ou humanizado.

[00170] Os cânceres preferidos cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da presente invenção incluem os cânceres tipicamente sensíveis à imunoterapia. Exemplos não limitativos de cânceres preferidos para tratamento incluem melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer da próstata (por exemplo, hormona refractário adenocarcinoma da próstata), câncer da mama, câncer do cólon e câncer do pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas). Além disso, a presente invenção inclui as malignidades refra- tárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da presente invenção.

[00171] Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usando os métodos da presente invenção incluem o câncer do osso, câncer pancreático, câncer da pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular maligno, câncer uterino, câncer do ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endo- métrio, carcinoma do colo uterino, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tiróide, câncer da glândula paratiróide, câncer da glândula supra-renal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocí- tica crônica, tumores sólidos da infância, linfomas, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), primário linfoma do SNC, angiogênese de tumor, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, carcinoma epidermóide, carcinoma de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidos ambientalmente, incluindo os provocados pelo amianto, e combinações dos referidos cânceres. A presente invenção também é útil para o tratamento de cânceres metastáticos, especialmente cânceres metastáti- cos que expressam PD-L1 (Iwai et al (2005) Int Immunol 17: 133 a 144).

[00172] Opcionalmente, os anticorpos para a LAG-3 podem ser combinados com um agente imunogênico, tal como as células cancerígenas, antígenos tumorais purificados (incluindo proteínas recombi- nantes, peptídeos e as moléculas de hidratos de carbono), e as célu- las, as células transfectadas com os genes que codificam citoquinas estimulantes imunes (He et al (2004) J. Immunol. 173: 4919 a 28). Exemplos de vacinas contra tumores que podem ser usados incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como os peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, ou células de tumor transfectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutido adiante abaixo).

[00173] Em seres humanos, alguns tumores demonstraram ser imunogênicos, tais como melanomas. Ao elevar o limiar de ativação de células T por bloqueio da LAG-3, as respostas tumorais no hospedeiro podem ser ativadas.

[00174] O bloqueio de LAG-3 tende a ser mais eficaz quando combinado com um protocolo de vacinação. Muitas estratégias experimentais para a vacinação contra tumores foram planejadas (vide Rosenberg, S., 2000, Desenvolvimento de Vacinas contra o câncer, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000 ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414 a 428; Fone, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; vide também Restifo, N. e Sznol, M., Vacinas contra Cânceres, Ch 61, pp..3023 a 3043 em DeVita et al (eds.), 1997, Câncer:. Princípios e Práticas de Oncologia, Quinta edição). Em uma destas estratégias, uma vacina é preparada usando as células tumorais autó- logas ou alogênicas. Estas vacinas celulares demonstraram ser mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. GM-CSF demonstrou ser um ativador potente da apresentação de antígeno por meio da vacinação tumoral (Dranoff et al (1993) Proc Natl Acad Sci EUA 90: 3539 a 43).

[00175] O estudo de expressão de genes e padrões de expressão de genes em grande escala em vários tumores levou à definição de antígenos específicos de tumor denominado (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281 a 7). Em muitos casos, estes antígenos específicos de tumores são antígenos de diferenciação expressos nos tumores e na célula a partir da qual surgiu o tumor, por exemplo, antígenos me- lanócitos gp100 e antígenos MAGE Trp-2. Mais importante, muitos destes antígenos podem ser demonstrados os alvos de células T específica do tumor encontradas no hospedeiro. O bloqueio LAG-3 pode ser usado em conjunto com uma coleção de proteínas e/ou peptídeos expressos em um tumor recombinante, a fim de gerar uma resposta imune a estas proteínas. Estas proteínas são normalmente vistas por meio do sistema imunológico como auto-antígenos e, portanto, são tolerantes a eles. O antígeno tumoral pode incluir a proteína de telomerase, que é necessária para a síntese dos telômeros de cromossomas e que expressa em mais do que 85 % dos cânceres humanos e em apenas um número limitado de tecidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011 a 2013). (Estes tecidos somáticos podem ser protegidos do ataque imunológico através de vários meios). O antígeno tumoral também pode ser "neo-antígeno", expresso em células de câncer devido a mutações somáticas que alteram a sequência da proteína ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (isto é, bcr-abl no cromossoma Philadelphia), ou idiotipo de tumores de células B.

[00176] Outras vacinas de tumor podem incluir as proteínas de vírus implicadas em cânceres humanos, tais como um Vírus do Papilo- ma Humano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Virus do Sarcoma Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma de antígenos específicos de tumor que pode ser usada em conjunto com o bloqueio LAG-3 é purificado das proteínas de choque térmico (HSP) isoladas do próprio tecido do tumor. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas a partir de células tumorais e estas HSPs são altamente eficientes na entrega de células apresentadoras de antígeno para a indução de imunidade de tumor (Suot & Srivastava (1995) Science 269:. 1585 a 1588; Tamura et al (1997) Science 278: 117 120).

[00177] As células dendríticas (DC) são potentes células de apresentação de antígeno que podem ser usadas para as respostas específicas de antígenos principais. DC podem ser produzidas ex vivo e carregadas com várias proteínas e peptídeos antigênicos, bem como extractos de células de tumor (Nestle et al (1998) Nature Medicine 4: 328 a 332). DCs também podem ser transduzidas por meios genéticos para expressar muito bem esses antígenos tumorais. DCs também foram fundidas diretamente para células tumorais para os efeitos da imunização (Kugler et al (2000) Nature Medicine 6: 332 a 336). Como um método de vacinação, a vacinação DC pode ser combinada efi-cazmente com o bloqueio LAG-3 para ativar as respostas antitumorais mais potentes.

[00178] O bloqueio LAG-3 também pode ser combinado com tratamentos do câncer convencionais. O bloqueio LAG-3 pode ser combinado eficazmente com regimes quimioterapêuticos. Nestes casos, pode ser possível reduzir a dose de reagente quimioterapêutico administrado (Mokyr et al (1998) Cancer Research 58: 5.301 a 5.304). Um exemplo de uma tal combinação é um anticorpo anti-LAG-3 em combinação com decarbazina para o tratamento de melanoma. Outro exemplo de uma tal combinação é um anticorpo anti-LAG-3 em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento do melanoma. A fundamentação científica por detrás do uso combinado de bloqueio LAG-3 e quimioterapia que é a morte celular, que é uma consequência da ação citotóxica da maioria dos compostos quimioterapêuticos, deve resultar em um aumento dos níveis de antígeno de tumor na via de apresentação de antígeno. Outras terapias de combinação que podem resultar em sinergia com Bloqueio LAG-3 por meio de morte celular são a radiação, cirurgia e privação hormonal. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antígeno tumoral no hospedeiro. Inibidores da angiogê- nese podem também ser combinados com a Bloqueio LAG-3. A inibição da angiogênese leva à morte das células tumorais que possam alimentar o antígeno tumoral em vias de apresentação de antígeno do hospedeiro.

[00179] Os anticorpos bloqueadores de LAG-3 também podem ser usados em combinação com os anticorpos biespecíficos que se destinam a Fcα ou Fcy que expressam receptores de células efetoras para células tumorais (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.922.845 e 5.837.243). Os anticorpos biespecíficos podem ser usados para visar dois antígenos diferentes. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos antireceptor Fc/antígeno antitumoral (por exemplo, Her-2/neu) foram usados para direcionar macrófagos para os locais de tumor. Este direcionamento pode ativar mais eficazmente respostas específicas de tumor. O braço de células T destas respostas seria aumentado por meio do uso de Bloqueio LAG-3. De uma maneira alternativa, o antí- geno pode ser entregue diretamente a DCs por meio do uso de anticorpos biespecíficos que se ligam ao antígeno tumoral e um marcador de superfície celular específico de células dendríticas.

[00180] Os tumores evadem a vigilância imunológica hospedeira por meio de uma grande variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser superados por meio da inativação de proteínas que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. Estes incluem, entre outros, o TGF-β (Kehrl et al (1986) J. Exp Med. 163: 1037 a 1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198 a 200), e Fas ligand (Hahne et al (1996) Science. 274: 1363 a 1365). Anticorpos para cada uma destas entidades podem ser usados em combinação com anti-LAG-3 para neutralizar os efeitos do agente imunossupressor e favorecer as respostas imunitárias do tumor por meio do hospedeiro.

[00181] Outros anticorpos que ativam a receptividade da resposta imunitária podem ser usados em combinação com anti-LAG-3. Estes incluem moléculas na superfície de células dendríticas que ativam a função DC e apresentação de antígenos. Os anticorpos anti-CD40 são capazes de substituir eficazmente a atividade auxiliar de células T (de Ridge et al (1998) Nature 393: 474 a 478). E pode ser usado em conjunto com os anticorpos LAG-3 (Ito et al (2000) Immunobiology 201 (5) 527 a 40). (Weinberg et al (2000) Immunol 164: 2160 a 2169). A ativação dos anticorpos para moléculas co-estimuladoras de células T, tais como CTLA-4 (por exemplo, Patente US No. 5.811.097), OX-40., 4- 1BB (Melero et al (1997) Nature Medicine 3: 682 a 685 (1997), e ICOS (Hutloff et al (1999) Nature 397: 262 a 266) também pode fornecer o aumento dos níveis de ativação das células T.

[00182] O transplante de medula óssea é atualmente a ser usado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Enquanto a doença enxerto versus hospedeiro é uma consequência deste tratamento, o benefício terapêutico pode ser obtido a partir do enxerto contra as respostas de tumor. O bloqueio LAG-3 pode ser usado para aumentar a eficácia dos doadores de células T específicas do tumor enxertado.

[00183] Existem também vários protocolos de tratamento experimentais que envolvem a ativação ex vivo e a expansão de células T específica de antígeno e a transferência adotiva destas células em recipientes, a fim de estimular as células T específicas de antígeno contra tumor (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546 a 51). Estes métodos também podem ser usados para ativar as respostas de células T para agentes infecciosos, tais como CMV. A ativação ex vivo na presença de anticorpos anti-LAG-3 pode aumentar a frequência e a atividade das células T transferidas adotivamente.

Doenças Infecciosas

[00184] Outros métodos da presente invenção são usados para tratar pacientes que foram expostos a toxinas ou agentes patogênicos específicos. Por conseguinte, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-LAG-3, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, de tal modo que o indivíduo é tratado para a doença infecciosa. De preferência, o anticorpo é um anticorpo anti-LAG-3 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-LAG-3 humanos descritos na presente invenção). De uma maneira adicional ou de uma maneira alternativa, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado.

[00185] Semelhante à sua aplicação a tumores como discutido acima, o bloqueio LAG-3 mediado por anticorpos pode ser usado sozinho, ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para estimular a resposta imunitária aos agentes patogênicos, toxinas, e auto- antígenos. Exemplos de agentes patogênicos para os quais esta abordagem terapêutica pode ser particularmente útil incluem agentes patogênicos para o qual não existe atualmente uma vacina eficaz, ou agentes patogênicos para os quais vacinas convencionais são menos do que completamente eficazes. Estes incluem, mas não estão limitados a HIV, Hepatite (A, B, e C), Influenza, Herpes, Giardia, malária, Leish- mania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. O bloqueio LAG-3 é particularmente útil contra as infeções estabelecidas por meio dos agentes, tais como HIV que apresentam antígenos alterados ao longo do curso das infeções. Estes novos epitopos são reconhecidos como estranhos no momento da administração de anti-LAG-3 humano, provocando assim uma resposta forte de células T que não é umede- cida por meio dos sinais negativos por meio de LAG-3.

[00186] Alguns exemplos de vírus patogênicos que provocam infeções tratáveis com os métodos da presente invenção incluem o HIV, hepatite (A, B, ou C), virus herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, e CMV, vírus Epstein Barr), adenovírus, vírus de influenza, fla- vivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavírus, vírus sincicial respiratório, vírus da papeira, rotavirus, vírus do sarampo, vírus da ru- béola, parvovírus, vírus vaccinia, vírus HTLV, vírus dengue, papillomavirus, molluscum virus, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus da encefalite por arbovírus.

[00187] Alguns exemplos de bactérias patogênicas que causam infeções tratáveis com os métodos da presente invenção incluem chlamydia, rickettsial bactéria, mycobacteria, staphylococci, streptococci, pneumonococci, meningococos e gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonelas, bacilos, cólera, tétano, bactérias botulismo, antraz, praga, leptospirose e doenças Lymes.

[00188] Alguns exemplos de fungos patogênicos que causam infeções tratáveis com os métodos da presente invenção incluem Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces, Paracoccidioides brasili- ensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

[00189] Alguns exemplos de parasitas patogênicos que causam infeções tratáveis com os métodos da presente invenção incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Gi- ardia lamblia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leish- mania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.

[00190] Em todos os métodos acima, o Bloqueio LAG-3 pode ser combinado com outras formas de imunoterapia, tais como tratamento de citocinas (por exemplo, interferões, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ou a terapia de anticorpo biespecífico, que fornece maior apresentação de antígenos tumorais (vide, por exemplo, Holliger (1993) Proc Natl Acad Sci EUA 90: 6444 a 6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121 a 1123).

Reações autoimunes

[00191] Os anticorpos anti-LAG-3 podem provocar e amplificar respostas autoimunes. De fato, a indução de respostas antitumorais usando células tumorais e vacinas peptídicas revela que muitas respostas antitumorais envolvem anti-auto reatividades (van Elsas et al (2001) J. Exp Med 194: 481-489; Overwijk, et al (1999) Proc Natl Acad Sci EUA 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother EmphasisTumor Immunol 19 (1): 81 a 4). Portanto, é possível considerar o uso de anti-Bloqueio LAG-3 em conjunção com várias proteínas próprias a fim de conceber Protocolos de vacinação para gerar eficientemente as respostas imunitárias contra estas proteínas próprias para o tratamento da doença. Por exemplo, a doença de Alzheimer envolve a acumulação inadequada de peptídeo AB em depósitos amilóides no cérebro; as respostas de anticorpos contra amilóide são capazes de limpar esses depósitos amilóides (Schenk et al, (1999) Nature 400: 173 a 177).

[00192] Outras proteínas próprias também podem ser usadas como alvos tais como IgE para o tratamento de alergia e asma, e TNF para artrite reumatóide. Finalmente, as respostas de anticorpos para várias hormônios podem ser induzidas pelo uso de anticorpo anti-LAG-3. As respostas de anticorpos neutralizantes para as hormônios reprodutivos podem ser usadas para contracepção. Respostas de anticorpos neu- tralizantes de hormônios e de outros fatores solúveis que são necessários para o crescimento de tumores particulares também podem ser consideradas como possíveis alvos para vacinação.

[00193] Os métodos análogos aos descritos acima para o uso de anticorpos anti-LAG-3 pode ser usado para a indução de respostas terapêuticas autoimunes para tratar os pacientes possuindo uma acu- mulação inadequada de outros auto-antígenos, tais como depósitos amilóides, incluindo Ap na doença de Alzheimer, citocinas tais como TNFα, e IgE.

Vacinas

[00194] Os anticorpos anti-LAG-3 podem ser usados para estimular as respostas imunitárias específicas para o antígeno por meio da co- administração de um anticorpo anti-LAG-3 com um antígeno de interesse (por exemplo, uma vacina). Deste modo, em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de melhorar uma resposta imune a um antígeno em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de: (i) um antígeno; e (ii) um anticorpo anti-LAG-3 do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, de tal modo que uma resposta imune ao antígeno no indivíduo seja aumentada. De preferência, o anticorpo é um anticorpo anti-LAG-3 humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-LAG-3 humanos descrito na presente invenção). De uma maneira adicional ou de uma maneira alternativa, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado. O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno de um agente patogênico. Exemplos não limitativos de tais antígenos incluem os discutidos nas seções anteriores, tais como os antígenos tumorais, ou vacinas tumorais (discutidas acima), ou os antígenos de vírus, bactérias ou outros agentes patogênicos descritos acima.

[00195] As vias apropriadas de administração das composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da presente invenção in vivo e in vitro são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionadas por meio daqueles que são versados na técnica. Por exemplo, as composições de anticorpos podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). As dosagens apro- priadas das moléculas usadas irão depender da idade e peso do indivíduo e a concentração e/ou formulação da composição de anticorpos.

[00196] Tal como descrito anteriormente, os anticorpos anti-LAG-3 humanos da presente invenção podem ser co-administrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxi- co, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. O anticorpo pode ser ligado ao agente (tal como um imuno-complexo) ou pode ser administrado em separado do agente. Neste último caso (administração separado), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti-neoplásicos, tais como doxorubicina (adriamicina), sulfato de ble- omicina, carmustina, cisplatina, clorambucil, dacarbazina, ciclofosfami- da e hidroxiureia, que, por si só, são somente eficazes a níveis que são tóxicos ou subtóxicos a um paciente. A cisplatina é administrada por via intravenosa, como um 100 mg/mL de dose, uma vez a cada quatro semanas e adriamicina é administrada por via intravenosa como uma de 60 a 75 mg/ml de dose, uma vez a cada 21 dias. A co- administração de anticorpos anti-LAG-3humanos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, da presente invenção com agentes quimioterapêuticos fornece dois agentes anticâncer que operam via diferentes mecanismos que produzem um efeito citotóxico para as células tumorais humanas. Tal co-administração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma alteração da antigenicidade das células tumorais, o que tornaria eles não reativos com o anticorpo.

[00197] Também dentro do escopo da presente invenção estão os kits que compreendem as composições de anticorpos da presente invenção (por exemplo, anticorpos humanos, biespecíficos ou moléculas multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções de uso. O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da presente invenção (por exemplo, um anticorpo humano possuindo uma atividade complementar que se liga a um epitopo no antígeno LAG-3 distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits incluem tipicamente uma etiqueta indicando o uso pretendido dos componentes do kit. O termo etiqueta inclui qualquer escrita, ou material gravado fornecido em ou com o kit, ou que acompanha o kit de outra forma.

A terapia de combinação

[00198] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de terapia de combinação em que um anticorpo anti-LAG-3 (ou porção de ligação de antígeno dos mesmos) da presente invenção é co-administrado com um ou mais anticorpos adicionais que são eficazes para estimular as respostas imunitárias a assim reforçar, estimular ou sobre regular as respostas imunes em um indivíduo. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método para estimulação de uma resposta imunitária em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-LAG-3 e um ou mais anticorpos adicionais imunoestimulantes, tais como um anticorpo anti- PD-1, um anticorpo anti anticorpo PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA- 4, de tal modo que uma resposta imune é estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir o crescimento de tumores ou para estimular uma resposta anti-viral. Em um outro modalidade, o indivíduo é administrado um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-1. Em ainda outra modalidade, o indivíduo é administrado um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-PD-L1. Em ainda outra modalidade, o indivíduo é administrado um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-CTLA-4. Em uma modalidade, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo humano, tal como um anticorpo da presente descrição. De uma maneira alternativa, o anticorpo anti-LAG-3 pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado a partir de um anticorpo de camundongo anti-LAG-3 mAb). Em uma outra modalidade, pelo menos um anticorpo adicional imunoestimulante (por exemplo, anti-PD-1, anti- PD-L1 e/ou anti-CTLA-4) é um anticorpo humano. De uma maneira alternativa, pelo menos um anticorpo adicional imunoestimulante pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado a partir de um anticorpo de camundongo anti-PD-1, an- ti-PD-L1 e/ou anti-CTLA-4).

[00199] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), que compreende a administração de um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo de CTLA-4 a um indivíduo. De acordo com outras variantes, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado a uma dose sub-terapêutica, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado em uma dose sub-terapêutica, ou ambos, são administrados a uma dose sub- terapêutica. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para alterar um caso adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa, com um agente imunoestimulador, que compreende a administração de uma LAG-3 e o anticorpo anti uma dose sub-terapêutica de anticorpos anti-CTLA-4 a um indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é a sequência humana de anticorpo monoclonal 10D1 (descrito na Publicação PCT WO 01/14424) e o anticorpo anti-LAG-3 é a sequência humana de anticorpo monoclona LAG3.5, tal como descrito na presente invenção. Outros anticorpos anti-CTLA-4 englobados por meio dos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, os descritos em: WO 98/42752; WO 00/37504; Patente U.S. N ° 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95 (17): 10.067 a 10.071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (145): Abstract No. 2505 (anticorpo CP-675,206); e Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58: 5301 a 5304. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 liga-se a CTLA-4 humano com um KD de 5 x 10-8 M ou inferior, liga-se a CTLA-4 humano com um KD de 1 x 10-8 M ou inferior, liga-se a CTLA-4 humana com um KD de 5 x 10-9 M ou inferior, ou liga-se a CTLA-4 humano com um KD de entre 1 x 10-8 M e 1 x 10-10 M ou inferior.

[00200] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), que compreende a administração de um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo PD-1 a um indivíduo. De acordo com outras variantes, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado a uma dose sub- terapêutica, o anticorpo anti-PD-1 é administrado a uma dose sub- terapêutica, ou ambos, são administrados a uma dose sub-terapêutica. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para alterar um caso adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa, com um agente imunoestimulador, que com-preende a administração de um anticorpo anti-LAG-3 e de uma dose sub-terapêutica de anticorpos anti-PD-1 de anticorpo a um indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é um serhumano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é a sequência humana de anticorpo monoclonal e o anticorpo anti-LAG-3 é a sequência humana de anticorpo monoclonal LAG3.5, tal como descrito na presente invenção. Exemplos de sequências de anticorpos humanos anti-PD-1 incluem 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 e 4A11, os quais são descritos na Publicação PCT WO 06/121168. Outros anticorpos anti-PD-1 incluem, por exemplo, lambrolizumab (WO2008/156712), e AMP514 (WO2010/027423, WO2010/027827, WO2010/027828, WO2010/098788). Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 liga-se a PD-1 humano com um KD de 5 x 10-8 M ou inferior, liga-se a PD-1 humano com um KD de 1 x 10- 8 M ou inferior, liga-se para PD-1 humano com um KD de 5 x 10-9 M ou inferior, ou liga-se a PD-1 humano com um KD de entre 1 x 10-8 M e 1 x 10-10 M ou inferior.

[00201] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), que compreende a administração de um anticorpo de LAG-3 e um anticorpo PD-L1 para um indivíduo. De acordo com outras variantes, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado a uma dose sub-terapêutica, o anticorpo anti-PD-L1 é administrado a uma dose sub-terapêutica, ou ambos, são administrados a uma dose sub- terapêutica. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para alterar um caso adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa, com um agente imunoestimulador, que compreende a administração de um anticorpo anti-LAG-3 e de uma dose sub-terapêutica de anticorpos anti-PD-L1 para um indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é humano. Em outras modalida-des, o anticorpo anti-PD-L1 é a sequência humana de anticorpo monoclonal e o anticorpo anti-LAG-3 é a sequência humana de anticorpo monoclonal, LAG3.5 tal como descrito na presente invenção. Exemplos de anticorpos anti-sequência humana PD-L1 incluem 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7h1, 11E6, e 13G4 12B7, que são descritos na Publicação PCT WO 07/005874. Outros anticorpos anti-PD-L1 incluem, por exemplo, MPDL3280A (RG7446) (WO2010/077634), ME- DI4736 (WO2011/066389), e MDX1105 (WO2007/005874). Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 humano liga-se a PD-L1 com um KD de 5 x 10-8 M ou inferior, liga-se ao PD-L1 humano com um KD de 1 x 10-8 M ou inferior, liga-se a PD-L1 humano com um KD de 5 x 10-9 M ou inferior, ou liga-se a PD-L1 humano com um KD de entre 1 x 10-8 M e 1 x 10-10 M ou inferior.

[00202] O bloqueio de LAG-3 e um ou mais segundo antígeno alvo tal como anticorpos CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 pode aumentar a resposta imunitária a células cancerígenas no paciente. Os cânceres cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da presente descrição incluem cânceres tipicamente sensíveis a imunoterapia. Exemplos representativos de cânceres para o tratamento com a terapia de combinação da presente descrição incluem os cânceres especificamente listados acima na discussão da monoterapia com anticorpos anti-LAG-3.

[00203] Em certas modalidades, a combinação de anticorpos terapêuticos discutidos na presente invenção pode ser administrada simultaneamente, como uma única composição em um veículo farmaceuti- camente aceitável, simultaneamente ou como composições separadas com cada anticorpo em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade, a combinação de anticorpos terapêuticos pode ser administrada sequencialmente. Por exemplo, um anticorpo anti- CTLA-4 e um anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tais como avticorpo anti-CTLA-4 a ser administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo, ou anticorpo anti-LAG-3 a ser administrado primeiro e anticorpo anti-CTLA-4 em segundo. De uma maneira adicional ou em alternativa, um anticorpo anti-PD-1 e anticorpo anti-LAG-3 podem ser administrados sequencialmente, tais como avticorpo anti-PD-1 a ser administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo, ou anticorpo anti-LAG-3 a ser administrado primeiro e anticorpo anti-PD-1 em segundo. De uma maneira adicional ou em alternativa, um anticorpo anti-PD-L1 e um anticorpo anti-LAG-3 pode ser administrado sequencialmente, tal como anticorpo anti-L1-DP a ser administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo, ou antiLAG-3 anticorpo a ser administrado primeiro e anticorpo anti-PD-L1 em segundo.

[00204] Além disso, se mais do que uma dose da terapia de combi- nação foradministrada sequencialmente, a fim de a administração sequencial poder ser invertida ou mantida na mesma ordem em cada ponto de tempo de administração, as administrações sequenciais podem ser combinadas com administração concomitante, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e anticorpo anti-LAG-3 pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-CTLA-4 primeiro e anti-LAG-3 segundo, e terceiro a administração pode ser sequencial com anticorpo anti-LAG-3 primeiro e anti-CTLA-4 segundo, etc. Além disso, ou de uma maneira alternativa, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-PD-1 e anti-LAG-3 pode ser concomitante, segundo a administração pode ser sequencial com anticorpo anti-PD-1 primeiro e anti-LAG-3 segundo, e terceiro a administração pode ser sequencial com anticorpo anti-LAG-3 primeiro e anti-PD-1 segundo, etc.. Além disso, ou de uma maneira alternativa, a primeira administração combinação de um anticorpo anti- PD-L1 e anticorpo anti-LAG-3 pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-PD-L1 primeiro e anti-LAG-3 segundo, e a terceiro a administração pode ser sequencial com anti-LAG-3 primeiro e anti-PD-L1 segundo, etc. Outro esquema representativo de dosagem pode envolver a primeira administração que é sequencial com anticorpo anti-LAG-3 primeiro e anti-CTLA-4 (e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1) em segundo, e as administrações subsequentes podem ser concomitantes.

[00205] Opcionalmente, a combinação de anticorpos e um ou mais anti-LAG-3 adicionais (por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti- PD-1 e/ou anti-L1-PD) pode ser ainda combinada com um agente imu- nogênico, tais como as células cancerígenas, antígenos tumorais purificados (incluindo proteínas recombinantes, peptídeos e as moléculas de hidratos de carbono), células, e as células transfectadas com os genes que codificam citoquinas estimulantes imunes (He et al (2004) J. Immunol. 173:. 4919-28). Exemplos de vacinas contra tumores que podem ser usadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como os peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, ou células de tumor transfectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutido adiante abaixo). Um bloqueio combinado de LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 pode ser ainda combinado com um protocolo de vacinação, tais como qualquer um dos protocolos de vacinação discutidos em detalhe acima em relação à monoterapia com anticorpos anti-LAG -3.

[00206] Um bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado também pode ainda ser combinado com tratamentos do câncer convencionais. Por exemplo, um bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado pode ser combinado eficazmente com regimes quimioterapêuticos. Nestes casos, é possível reduzir a dose de quimio- terapêutico administrado outro reagente, com a combinação da presente descrição (Mokyr et al (1998) Cancer Research 58:. 5301 a 5304). Um exemplo de uma tal combinação é uma combinação de anticorpos anti-CTLA-4 anti-LAG-3 e e/ou anticorpos e/ou anticorpos anti- PD-L1 ainda em combinação com decarbazina para o tratamento de melanoma de um anti-PD. Outro exemplo é uma combinação de anticorpos anti-CTLA-4 anti-LAG-3 e e/ou anticorpos anti-1-DP e/ou anti- PD-L1 mais anticorpos em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de melanoma. A fundamentação científica por detrás do uso combinado de bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 com quimioterapia é a morte celular, o que é uma consequência da ação citotóxica da maioria dos compostos quimioterapêuticos, que deve resultar em um aumento dos níveis de antígeno de tumor na via de apresentação de antígeno. Outras terapias de combinação que podem resultar em sinergia com o bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado através da morte celular incluem radiação, cirurgia, ou privação hormonal. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antígeno tumoral no hospedeiro. Inibidores da angiogênese também podem ser combinados com um bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado. A inibição da angiogênese leva à morte das células tumorais, o que pode ser uma fonte de antígeno de tumor alimentada em vias de apresentação de antígenos do hospedeiro.

[00207] Uma combinação de bloqueio de anticorpos LAG-3 e CTLA- 4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 também podem ser usados em combinação com anticorpos biespecíficos que alvidem as células efetoras que expressam os receptores Fcy ou Fcα expressando as células de tumor (vide, por exemplo,, Patente U.S. Nos. 5922845 e 5837243). Os anticorpos biespecíficos podem ser usados para visar dois antígenos diferentes. O braço de células T destas respostas seria aumentado por meio do uso de um bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado.

[00208] Em outro exemplo, uma combinação de anticorpos antiLAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti-1-DP e/ou anticorpos anti- PD-L1 pode ser usada em conjunto com anticorpos anti-neoplásicos, tais como Rituxan ® (rituximab), Herceptin (trastuzumab), Bexxar® (to- situmomab), ZEVALIN® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin (bevacizumab), e Tarceva (erlotinib), eo like. A título de exemplo, e não desejando estar limitado por meio da teoria, o tratamento com um anticorpo anticâncer ou um anticorpo anticâncer conjugado com uma toxina pode conduzir à morte de células de câncer (por exemplo, células tumorais), o que pode poten- ciar uma resposta imune mediada pela CTLA-4, PD-1, PD-L1 ou LAG- 3. Em uma modalidade exemplar, um tratamento de uma doença hi- perproliferativa (por exemplo, um tumor de câncer) pode incluir um anticorpo anticâncer em combinação com anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou os anticorpos anti-PD-L1, concorrentemente ou se-quencialmente ou qualquer combinação dos mesmos, o que pode potencializar antitumorais por meio das respostas imunes do hospedeiro.

[00209] Os tumores evadem a vigilância imunológica hospedeira por meio de uma grande variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser superados por meio da inativação das proteínas e que são expressos por tumores e os que são imunossupresso- res. Estes incluem, entre outros, o TGF-β (Kehrl et al (1986) J. Exp Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), e Fas Ligand (Hahne et al (1996) Science. 274: 1363-1365). Em outro exemplo, os anticorpos para cada uma dessas entidades podem ser ainda combinados com um anti-LAG-3 e anti- CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e combinação de anticorpo/ou anti-PD-L1 para contrariar os efeitos de agentes imunossupressores e favorecer as respostas imunes antitumorais por meio do hospedeiro.

[00210] Outros anticorpos que podem ser usados para ativar a capacidade de resposta imunitária de acolhimento podem ainda ser usados em combinação com um anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou a combinação de anticorpo anti-PD-L1. Estes incluem moléculas na superfície de células dendríticas que ativam a função de DC e apresentação de antígenos. Os anticorpos anti-CD40 (de Ridge et al., Supra) podem ser usados em conjunto com um anti-LAG-3 e anti- CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou combinação de anti-L1-PD (Ito et al., supra). Outros anticorpos ativadores para moléculas co-estimulatórias de células T Weinberg et al., Supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra) também podem fornecer para o aumento dos níveis de ativação de células T.

[00211] Como discutido acima, o transplante de medula óssea está atualmente a ser usado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Um bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 combinado pode ser usado para aumentar a eficácia das células T específicas do tumor enxertado dos doadores.

[00212] Vários protocolos de tratamento ex vivo experimentais envolvem a ativação e expansão das células T específica de antígeno e a transferência adotiva destas células em recipientes, a fim ter como avo as células T específicas de antígeno contra tumor (Greenberg & Riddell, supra). Estes métodos também podem ser usados para ativar respostas de células T para agentes infecciosos, tais como CMV. A ativação ex vivo na presença de anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-L1 pode ser esperada por meio de um aumento da frequência e da atividade das células T transferidas adotivamente.

[00213] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método para alterar um caso adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer) com um agente imunoestimulador, que compreende a administração de um anticorpo anti-LAG-3 e de uma dose sub-terapêutica de anti-CTLA- 4 e/ou anti- PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 a um indivíduo. Por exemplo, os métodos da presente invenção proporcionam um método para reduzir a incidência de colite induzida por meio do anticorpo terapêutico imunoes- timulante ou diarréia através da administração de um esteróide não absorvível para o paciente. Uma vez que qualquer paciente que vai receber um anticorpo terapêutico imunoestimulante está em risco para o desenvolvimento de colite ou diarréia induzida por meio de um tal anticorpo, toda esta população de pacientes é adequada para a terapia de acordo com os métodos da presente invenção. Embora os este- róides tenham sido administrados para tratar a doença inflamatória do intestino (IBD) e impedir as exacerbações da DII, eles não têm sido usados para evitar (diminuir a incidência de) DII em pacientes que não tenham sido diagnosticados com IBD. Os efeitos colaterais significati- vos associados com esteróides, mesmo os esteróides não absorvíveis, têm desencorajado o uso profilático.

[00214] Em outras modalidades, uma combinação de bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 (ou seja, anticorpos terapêuticos imunoestimulantes anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anticorpos anti- PD-1 e/ou anticorpos anti-PD-L1) pode ainda ser combinada com o uso de qualquer esteróide não absorvível. Tal como usado na presente invenção, um "esteróide não absorvível" é um glucocorticóide que exibe extenso metabolismo de primeira passagem de tal modo que, seguindo o metabolismo no fígado, a biodisponibilidade do esteróide é baixa, isto é, menos do que cerca de 20 %. Em uma modalidade da presente invenção, o esteróide não absorvível é budesonida. Bude- sonida é um glucocorticosteróide localmente na qualidade, que é extensivamente metabolizado, principalmente pelo fígado, após a admi-nistração oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) é uma formulação oral de pH e tempo-dependente de budesonida desenvolvida para op- timizar a liberação de fármacos para o íleo e ao longo do cólon. EN- TOCORT EC® é aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de leve a moderada doença de Crohn envolvendo o íleo e/ou cólon ascendente. A dosagem oral usual de ENTOCORT EC® para o tratamento da doença de Crohn é de 6 a 9 mg/dia. ENTOCORT EC® é libertado nos intestinos, antes de ser absorvido e retido na mucosa do intestino. Uma vez que passa através do tecido alvo da mucosa do intestino, ENTOCORT EC® é extensivamente metabolizado por meio do sistema do citocromo P450 no fígado em metabolitos com atividade glucocorticóide negligenciável. Por conseguinte, a biodisponibilidade é baixa (cerca de 10 %). A baixa biodisponibilidade de budesonida resulta em uma razão terapêutica melhorada em comparação com outros glucocorticóides com um menos extenso metabolismo de primeira passagem. Budesonida resulta em menos efeitos adversos, incluindo uma menor supressão hipotálamo-hipófise, que os corticosteróides sistemicamente em ação. No entanto, a administração crônica de EN- TOCORT EC® pode resultar em efeitos glicocorticóides sistêmicos como hipercorticismo e supressão adrenal. Vide PDR 58a ed. 2004; 608 a 610.

[00215] Em ainda outras modalidades, uma combinação de bloqueio LAG-3 e CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 (ou seja, anticorpos imunoestimulantes terapêuticos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD -1 e/ou anticorpos anti-PD-L1), em conjugação com um esteróide não absorvível pode ser ainda combinado com um salicilato. Salicilatos incluem os agentes 5-ASA, tais como, por exemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazide (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); e mesalamine (Asacol®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

[00216] Em conformidade com os métodos da presente invenção, um salicilato administrado em combinação com anticorpos anti-LAG-3 e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e um esteróide não absorvível pode incluir qualquer sobreposição ou administração sequencial do salicilato e o esteróide não absorvível com a finalidade de diminuir a incidência de colite induzida por meio dos anticorpos imunoesti- mulantes. Dessa maneira, por exemplo, os métodos para reduzir a incidência de colite induzida por meio dosanticorpos imunoestimulantes de acordo com a presente invenção englobam a administração de uma salicilato e um não absorvível concorrentemente ou sequencialmente (por exemplo, um salicilato é administrado 6 horas após um esteróide não absorvível), ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, de acordo com a presente invenção, um salicilato e um esteróide não ab-sorvível pode ser administrado pela mesma via (por exemplo, ambos são administrados por via oral) ou por vias diferentes (por exemplo, um salicilato é administrado por via oral e um esteróide não absorvível é administrado por via retal), que pode ser diferente da (s) rota (s) usada (s) para administrar os anticorpos anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3 e anti- CTLA-4 e/ou anti-PD-1.

[00217] A presente descrição é ainda ilustrada por meio dos exemplos seguintes, que não devem ser interpretados como limitando ainda mais. O conteúdo de todos os valores e todas as referências, sequências de Genbank, patentes e pedidos de patentes publicados, citados ao longo deste pedido são expressamente incorporados na presente invenção por meio de referência. Em particular, as descrições de publicações PCT WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, WO 09/054863 são expressamente incorporadas na presente invenção por meio de referência.

Exemplos Exemplo 1: Projeto de variantes de LAG3.1 (Anticorpo 25F7)

[00218] As variantes de anticorpos do anticorpo anti-LAG-3, 25F7 anteriormente descrito, referido na presente invenção como LAG3.1, foram criadas pela primeira análise da sequência de aminoácidos do anticorpo para os locais potenciais de degradação. Expressão de mu- tagênese dirigida a um local da região VH LAG3.1 foi realizada usando um Kit de Mutagênese dirigida ao local QuikChange II XL (Agilent Technologies). As regiões VH alteradas foram então subclonadas em vetores UCOE (Merck Millipore) que contêm a região constante IgG4 S228P humana. Os vários vetores das cadeias pesadas foram cada um co-transfectados com um vetor que expressa a cadeia kappa LAG3.1 em células CHO-S, e piscinas estáveis foram selecionadas para expressão.

[00219] Cinco potenciais motivos de desamidação foram identificados dentro da cadeia pesada da região variável CDR2. Estes locais foram localizados nas posições 52, 54, 56, 58, e 60 da região variável da cadeia pesada de LAG3.1 (SEQ ID NO: 2) (vide a Figura 1A). Em particular, a desamidação da sequência "NG" na CDR2 de VH (SEQ ID NO: 6) foi ob-servada em todas as condições, e também a sequência de isomerização. A desamidação do material de partida era de cerca de 10 %. Além disso, verificou-se que esta sequência "NG" não corresponde a uma sequência da linha germinal (vide a Figura 3). No entanto, a sequência de consenso da linha germinal foi um local de glicosilação potencial e, portanto, não foi incluída entre as variantes de anticorpos.

[00220] Quatro variantes (referido na presente invenção como LAG3.5, LAG3.6, LAG3.7, e LAG3.8) foram concebidas as quais se debruçaram sobre dois dos potenciais motivos de desamidação (posições 54 e 56), como mostrado na Figura 3. Estas variantes eram submetidas a uma matriz de condições tal como resumido na Tabela 1 abaixo e foram analisadas as seguintes características: (a) estabilidade térmica (a estabilidade física e química); (b) cromatografia por exclusão de tamanho (agregação); (c) Focagem Isoelétrica em gel (IEF) (heterogeneidade de carga); (d) A atividade de análise Biacore (ligação e atividade funcional); e (e) mapeamento de peptídeos por meio da espectrometria de massa (modificações químicas/estabilidade molecular).Tabela 1

Exemplo 2: Caracterização das Variantes LAG-3 1. Ligação da célula T CD4+ humana

[00221] Para testar a capacidade das variantes de anticorpo para se ligar a LAG-3 nativa humana na superfície de células T humanas ativadas, doadores saudáveis de células mononucleares de sangue periférico normais foram estimuladas em placas de cultura de 15 centímetros de tecidos a uma densidade de 2x10e6 células/mL, com uma combinação de anticorpos presentes em solução a 5 ug/ml e 3 ng/ml, respectivamente, de anti-CD3 (eBioscience, Cat No. 16-0037-85) e anti-CD28 (BD Bioscience, Cat No. 555725). Após três dias de estimulação as células foram colhidas, lavadas com 1X tampão 1x PFAE (1x PBS + 2 % FBS, 0,02 % de azida de sódio, Na-EDTA a 2 mM ), e res- suspensas em tampão 1x PFAE para coloração.

[00222] Para a reação de ligação, as variantes LAG3.1 foram diluídos em série com tampão 1x PFAE frio, em seguida, 50 ul de solução diluída de anticorpo foi misturado com 50 uL de FITC anti-CD4 humano (BD Bioscience, Cat No. 555346) diluído 1: 16 em tampão 1x PFAE. Para a reação de ligação, 100 ul desta mistura de anticorpo diluído foi adicionado a células 2 x 105 e a mistura foi incubada a 4 ° C em 30 minutos. As células foram então lavadas duas vezes com tampão 1x PFAE. A diluição 1: 200 de cabra marcada com PE anticorpo específico Fcy-anti-humano (Jackson ImmunoResearch, Cat No. 109116-170.) foi adicionada e a mistura foi incubada durante 30 minutos a 4 ° C, seguido por duas lavagens com 1x frio tampão PFAE. A ligação após a lavagem final, 150 ul de 1x frio PFAE foi adicionada a cada solução e análise de anticorpo foi realizada por meio da citometria de fluxo usando um citômetro de fluxo FACSCanto (BD Bioscience).

[00223] Os resultados da análise de citometria de fluxo encontram-se resumidos na Figura 4A, que é um gráfico que mostra o EC50 para a ligação do anticorpo a células humanas ativadas T CD4+. A Figura 4B é um gráfico que mostra a ligação do anticorpo ao antígeno solúvel/Fc LAG-3 humano por BIACORE. Como mostrado, as afinidades de ligação de LAG3.5 e LAG3.8 são ligeiramente inferiores, em comparação com LAG3.1, enquanto as suas cons-tantes de taxa de dissociação são ligeiramente mais altas em com-paração com LAG3.1.

2. Estabilidade Física

[00224] A estabilidade térmica e a desnaturação térmica das variantes foram testadas usando Microcal VP-DSC. Especificamente, cada variante foi diluída em PBS (cat No. 21-040 Mediatech-CV lote No. 21040139). A concentração final da amostra era de 250 ug/ml após diluição em PBS. A amostra foi digitalizada para 74°C, resfriada a 25 ° C, e reaquecida a 74°C. Tampão PBS foi usado como um controle em branco. Dados estavam aptos para um modelo não 2-estado e ajuste de curva realizado por software Origin.

[00225] Conforme resumido na Tabela 2 e ilustrado na Figura 5, LAG3.5 tinha uma temperatura de fusão TM2 mais alta do que LAG3.1, indicando uma maior estabilidade global.Tabela 2

[00226] O anticorpo de redobragem seguindo a desnaturação é uma medida inversa de potencial de agregação de longo prazo. Por conseguinte, os variantes de LAG-3 também foram testados e comparados em termos de reversibilidade térmica. Especificamente, os anticorpos foram aquecidos a 74°C e resfriados até à temperatura ambiente antes de voltar a ser aquecido a 74°C. A proporção de área sob a curva do segundo para o primeiro termograma fornece a estimativa de reversibilidade térmica, que é uma medida direta de reversibilidade conformacional.

[00227] Como é resumido na Tabela 3 e mostrado na Figura 6, LAG3.5 tinha substancialmente reversibilidade térmica mais alta do que todas as outras variantes. Notavelmente, o percentual de reversibilidade para LAG3.5 (47%) foi mais que o dobro da LAG3.1 (20 %). A reversibilidade térmica está fortemente correlacionada com o potencial de agregação de longo prazo. Baixa reversibilidade corresponde ao maior potencial de agregação. Com base nesta observação, LAG3.1 potencialmente apresentaria maior agregação ao longo do tempo, em comparação com LAG3.5. Do mesmo modo, todas as outras variantes poderiam potencialmente exibir substancialmente maior agregação ao longo do tempo em comparação com LAG3.5.Tabela 3

3. Agregação

[00228] As variantes também foram testadas para estabilidade, como uma medida de agregação de proteínas usando o padrão de HPLC de exclusão de dimensão (SEC-HPLC) de acordo com o seguinte protocolo: As amostras de ensaio de anticorpos foram diluídas para 1,0 mg/ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 10 ul foi aplicado para um sistema de HPLC (Waters, modelo 2795). A separação foi realizada em uma coluna de filtração em gel (TOSOH Bioscience, TSKgel G3000 SWXL, 7,8 milímetros x 300 mm, produto No. 08541) usando uma fase móvel de fosfato de sódio a 0,1 M, cloreto de sódio a 0,15M, sulfato de sódio a 0,1 M, pH 7,2. O analito foi detectado por meio da monitorização da absorvância de UV a 280 nm, e a porcentagem da composição da área do pico de anticorpos foi determinada usando o software Empower. Como mostrado na Tabela 4, LAG3.5 exibiu substancialmente agregação redu-zida em comparação com LAG3.1.Tabela 4

Exemplo 3: Seleção da Variante

[00229] Com base nos estudos descritos acima, o anticorpo variante LAG3.5 foi selecionado para posterior análise, em vista da sua melhoria significativa da estabilidade física e química em comparação com a sua forma não modificada (LAG3.1), em particular a sua alta capacidade de re-dobramento conformacional (reversibilidade térmica). Esta análise incluiu uma abordagem em duas fases de (a) por meio da solicitação acelerada, (b) seguido de 12 semanas de avaliação da estabilidade em tempo real. Especificamente, LAG3.5 foi incubado a 1,0 mg/ml em pH 8,0, bicarbonato de amônio a 50 mM, durante 5 dias a 40°C. O grau de modificações após 5 dias, foi analisado, bem como os efeitos sobre a atividade e estabilidade. A variante LAG3.5 foi então submetido a estabilidade em tempo real em PBS, durante uma duração de 12 semanas e posteriormente analisados. Os resultados destes estudos encontram-se descritos abaixo.

1. Ligação ao antígeno

[00230] Como mostrado na Figura 7 (e Tabela 5), nenhuma alteração na ligação ao antígeno foi observada após 5 dias. Como também é mostrado nas Figuras 10 A e B, LAG3.5 não houve nenhuma alteração na ligação a antígeno ou a sua estabilidade física, após 12 semanas. Em particular, LAG3.5 mantém uma afinidade mais alta do que LAG3.8 ao longo de todo o período de 12 semanas tanto a 4 °C e 40 °C.Tabela 5

2. Modificação química/Estabilidade molecular

[00231] O mapeamento de peptídeos por meio da espectrometria de massa foi usado para analisar a estabilidade química/molecular de LAG3.5 em comparação com LAG3.1. Especificamente, o anticorpo purificado foi reduzido, alquilado, dialisado, e digerido com tripsina (Promega Cat. V5111) e GLIC (Roche Cat. 11047817001). Os digeridos foram analisados por meio da espectrometria de massa nano LC- MSMS (Thermo Fisher Orbitrap LTQ).

[00232] Como mostrado na Figura 8, LAG3.1 mostrou um aumento da heterogeneidade na VH em comparação com LAG3.5 quando submetido a estabilidade acelerada a pH mais alto, o que deamidou os resíduos de asparagina (etapa 1). A mudança em massa devido à isomerização não poderia ser detectada sob as condições experimentais atuais. A variação percentual é expressa como uma razão de todas as alterações combinadas para o pico parental.

[00233] Além disso, como mostrado na Figura 11, LAG3.1 mostrou um aumento da heterogeneidade na VH em comparação com LAG3.5 quando submetido a estabilidade prolongada em tempo real de 12 semanas, com ambos 4 °C e 40 °C (etapa 2).

3. Estabilidade Física

[00234] A reversibilidade térmica foi medida em PBS e a pH 8,0 em ambas as condições, LAG3.5 novamente exibiu aproximadamente o dobro do nível de re-dobramento em comparação com LAG3.1. Especificamente, como mostrado nas Tabelas 6 a 8, LAG3.5 exibiu 43% dere-dobramento em comparação com 18% para LAG3.1 em PBS. LAG3.5 também exibiu 48% de re-dobramento em comparação com 29% de re-dobramento para LAG3.1 a pH 8,0.Tabela 6 - DSC: fusão

Tabela 7 - Fluoró ogo-2: desdobramento

Tabela 8: DSC: redobramento

4. Heterogeneidade de Carga

[00235] Para avaliar a heterogeneidade de cargas, as variantes foram analisadas usando isoeletrofoco (IEF) com marcadores padrão de pi 5,5 e pI 10,0, em comparação com LAG3.1. Resumidamente, as soluções de anticorpos foram aplicadas sobre uma espessura de 1 mm FIE pi 3-7 pré-fabricadas em gel (Invitrogen, Cat No. EC6648BOX) juntamente com marcadores pI 3-10 (SERVA, Cat No. 39212). A eletrofo- rese foi levada a cabo usando tampão IEF 3-7 de cátodo (Invitrogen, Cat No. LC5370) e tampão de IEF de ânodo (Invitrogen, Cat No. LC5300) e a aplicação de corrente eléctrica da ordem de 100 V constante durante 1 hora, a 200 V constante durante 1 hora, e 500 V constante durante 30 min. Os géis de IEF foram corados com azul de Co- omassie para detectar as bandas de proteína e descorados com uma solução de ácido metanol acético. Os géis de IEF foram então analisados por software ImageQuant TL. Com base nesta análise (dados não mostrados), LAG3.5 exibiu significativamente menos heterogeneidade em comparação com LAG3.1.

5. HIC-HPLC

[00236] Para avaliar a solubilidade, as variantes foram analisadas por meio de cromatografia padrão de interação hidrofóbica (HIC- HPLC) de acordo com o seguinte protocolo: 50 uL de sulfato de amô- nio a 2M foi adicionado a 50 uL de amostra de teste de anticorpo a 1 mg/ml. 80 uL da amostra de teste foi então aplicada a um sistema de HPLC (Waters, modelo 2795) ligados em linha a uma coluna de HIC (TOSOH Bioscience, Éter-5PW TSK-gel, 7,5 milímetros x 75 milímetros, produto No. 07573). A amostra foi eluída a um caudal de 1,0 ml/min com um gradiente de 100 % de tampão A (sulfato de amónio 2 M, fosfato de sódio a 0,1 M, pH 7,0) até 100 % de tampão B (fosfato de sódio a 0,1M, pH 7,0) ao longo de 50 minutos. O anticorpo foi detectado por meio da monitorização da absorvância de UV a 280 nm e os dados foram analisados usando o software Enpower. Como mostrado na Figura 9, a hidrofilicidade de LAG3.5 exibiu solubilidade a concentrações altas de sulfato de amônio.

Exemplo 4: Reversão de Células T Mediadas por meio da Inibição da Resposta Imunitária

[00237] A atividade de LAG3.5 foi determinada por meio de um ensaio funcional que utilizou um hibridoma de células T de camundongo específicas para o antígeno (3A9). Hibridoma 3A9 expressa um receptor de células T específico para um peptídeo de lisozima de ovo de galinha (HEL48-62) e segrega IL-2 quando co-cultivadas com, semelhantes em MHC, células apresentadoras de antígenos pulsadas com peptídeo (LK35.2). Uma vez que huLAG-3-Fc é capaz de se ligar a linhas de Classe II das células B CPH-positivas de camundongo, a expressão de hu- LAG-3 na linha 3A9 poderia exercer um efeito inibitório através do envolvimento de Classe II na linha de apresentação de murino. Uma comparação do perfil da resposta do peptídeo progenitor 3A9 com que as células 3A9 LAG-3 humanas transduzidas co-cultivadas com células de apresentação de antígeno de MHC emparelhadas demonstrado que a expressão de LAG-3 humano inibiu a capacidade de resposta de peptídeo em comparação com as células 3A9 de controle. Esta inibição foi revertida pelo Bloqueio LAG-3 usando LAG3.5. Portanto, foi demonstrado o bloqueio da inibição da LAG-3 mediado por LAG3.5.

Exemplo 5: A ativação de células T por LAG3.5

[00238] A atividade funcional dos LAG3.5 em células T primárias humanas foi avaliada usando Culturas de CMSP estimuladas por meio do superantígeno SEB. Total de PBMC foi isolado do sangue de dezoito dadores humanos e estimulado durante 72 horas em um dos dois ensaios de formatos: (i) uma quantidade fixa de anticorpo (20 ug/ml) e diluições em série de SEB, ou (ii) uma quantidade fixa de SEB (85 ng/ml) e diluições em série de anticorpo. A secreção de IL-2, como uma medida da atividade das células T, foi monitorizado por ELISA. Anticorpo an- ti-PD-1 e anticorpo ipilimumab foram usados como controles positivos e a atividade de LAG3.5 em combinação com anti-PD-1 ou anti-CTLA-4 foi também avaliada para um subconjunto de doadores.

[00239] A secreção de IL-2 reforçada foi observada ao longo de uma gama de concentrações SEB de quinze dos dezoito doadores tratados com LAG3.5 sozinho, em comparação com o tratamento com o anticorpo do controle de isotipo. Na maioria dos casos, a estimulação era menos do que a observada para o tratamento com anti-PD-1 ou ipilimumab. No que diz respeito ao LAG3.5, os resultados dos dois formatos de ensaio (acima descritas) estavam de acordo com um outro. Além disso, em 5 de 6 dadores testados, combinando LAG3.5 com anti-PD-1 ou ipilimumab resultou em níveis mais altos de estimulação do que os observados para o anticorpo de controle de isotipo combinado com anticorpo anti-PD-1 ou ipilimumab. Estes dados revelaram que LAG3.5 pode funcionar em ensaios de células T humanas normais e pode ativar mais respostas mediadas por meio da inibição da PD-1 e função de CTLA-4.SUMÁRIO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Claims

1. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga ao LAG-3 humano, caracterizado pelo fato de que as regiões da cadeia pesada de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15, 16, e 17, respectivamente, e as regiões da cadeia leve de CDR1, CDR2 e CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18, 19, e 20, respectivamente.

2. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 12, e a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

3. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que exibe um ou uma combinação das seguintes propriedades: (a) ligação ao LAG-3 de macaco; (b) ausência de ligação ao LAG-3 de camundongo; (c) inibição da ligação de LAG-3 às moléculas principais de histocompatibilidade (MHC) de classe II; ou (d) estimulação de uma resposta imune.

4. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que estimula a produção de interleucina-2 (IL-2) em uma resposta de células T específica de antígeno e/ou estimula uma resposta imune antitumoral.

5. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 4, caracterizado pelo fato de que se liga ao LAG-3 humano com um KD de 0,27 x 10-9 M ou menos conforme determinado pela ressonância de plasmon de superfície.

6. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humano.

7. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é um isotipo IgG1, IgG2 ou IgG4.

8. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é um isotipo IgG4.

9. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo da cadeia simples.

10. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo de comprimento completo.

11. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano IgG4 de comprimento completo isolado que se liga ao LAG-3 humano com um KD de 0,27 x 10-9 M ou menos conforme determinado pela ressonância de plasmon de superfície.

12. Molécula biespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um segundo anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo.

13. Molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA-4, ou uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos.

14. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ligado a um agente terapêutico.

15. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 14, ca-racterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma citotoxina ou um isótopo radioativo.

16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, a molécula bies- pecífica, como definida na reivindicação 12 ou 13, ou o imunoconjuga- do, como definido na reivindicação 14 ou 15, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente anticâncer.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o agente anticâncer é um segundo anticorpo ou um agente quimioterapêutico.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é um anticorpo de comprimento completo.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é um isotipo IgG4.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20, caracterizada pelo fato de que o segundo anticorpo é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, ou um anticorpo an- ti-CTLA-4.

22. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica para a região variável da cadeia pesada do anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 2, compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 11.

23. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 2, compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13.

24. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 22.

25. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 23.

26. Método para a preparação de um anticorpo anti-LAG-3, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a expressão do anticorpo em uma célula hospedeira, compreendendo: i) a expressão do vetor como definido na reivindicação 24, e uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido nas reivindicações 1 e 2, compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13; ou ii) a expressão do vetor como definido na reivindicação 25; , e (b) o isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.

27. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, molécula biespecí- fica, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, ou a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-21 caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para estimular uma resposta imune em um indivíduo.

28. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula biespe- cífica, imunoconjugado, ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo portador de um tumor e uma resposta imune contra o tumor é estimulada.

29. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, imunoconjugado, ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo que possui um vírus e uma resposta imune contra o vírus é estimulada.

30. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, imunoconjugado, ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é uma resposta de células T específica de antígeno, de tal modo que uma resposta das células T específicas do antígeno é estimulada.

31. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, imunoconjugado, ou composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a produção de interleucina-2 por meio das células T específicas do antígeno é estimulada.

32. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, ou imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional.

33. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, ou imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-PD-1.

34. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, ou imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-PD-L1.

35. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, molécula bies- pecífica, ou imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo imunoestimulante adicional é um anticorpo anti-CTLA-4.

36. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, ou a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo.

37. Anticorpo, porção de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, molécula biespecífica, de acordo com as reivindicações 12 ou 13, imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método para tratar uma infeção viral em um indivíduo.

38. Uso do anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, a molécula biespecífica, como definida na reivindicação 12 ou 13, ou o imunoconjugado, como definido na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para estimular uma resposta imune, opcionalmente, uma resposta de célula T específica para antígeno, ou para inibir o crescimento de células tumorais, ou para tratar uma infeção viral em um indivíduo.