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JP7489316B2 - Ｐｄ－ｌｉ抗原結合部位を有するｆｃ結合断片 - Google Patents

Ｐｄ－ｌｉ抗原結合部位を有するｆｃ結合断片 Download PDF

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Description

技術分野
本発明は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する特異的結合メンバーに関する。特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーの定常ドメインの構造ループ中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む。本発明の特異的結合メンバーは、例えば、癌、並びに感染性疾患及び炎症の治療において適用される。
本発明の背景
プログラム細胞死１（ＰＤ－１）及びそのリガンドＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）は、Ｔ細胞活性化、寛容、及び免疫病理間の平衡を調節する阻害シグナルを送達する。ＰＤ－Ｌ１は、複数の免疫細胞タイプ及びある腫瘍細胞上で構成的に又は一過的に発現される。
ＰＤ－Ｌ１は、細胞内領域内の２つのＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン及び短鎖細胞質ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。完全ヒトＰＤ－Ｌ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のもと見出すことができる。細胞質ドメインは、既知のシグナル伝達モチーフを有さず、リガンドとその受容体との相互作用に基づくＰＤ－Ｌ１によるシグナリングが存在しないことを示唆する。ヒトＰＤ－Ｌ１の分子量は４０ｋＤａ（２９０アミノ酸）であり、それは、ＰＤ－Ｌ１のネズミ及びカニクイザルオルソログとそれぞれ７０％及び９３％のアミノ酸同一性を共有する。
ヒトＰＤ－Ｌ１は、その受容体ＰＤ－１に７７０ｎＭの親和性（ＫＤ）で結合する。ＰＤ－１は活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞上で発現され、細胞免疫応答の活性又は阻害をモジュレートする。ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合は、阻害シグナルを送達し、サイトカイン産生及びＴ細胞の増殖を低減させる。結果的に、細胞によるＰＤ－Ｌ１発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）殺傷からの保護を媒介し得、ウイルス感染の間の慢性免疫応答を減衰させる調節機序である。癌は、慢性及び炎症促進性疾患と同様、ＰＤ－Ｌ１発現の上方調節を介してこの免疫保護経路を破壊して宿主免疫応答を回避する。活性免疫応答に関して、ＩＦＮγもＰＤ－Ｌ１の発現を上方調節する。
ＰＤ－Ｌ１は、別のタンパク質Ｂ７．１（ＣＤ８０としても公知）との相互作用を介して免疫抑制も媒介し、ＣＤ２８を介してＴ細胞に対する活性化の二次シグナルの１つを送達するその能力を遮断する。
ＰＤ－Ｌ１発現は、広範な固形腫瘍において示されている。ある研究において試験された異なる部位からの１９個の腫瘍に及ぶ６５４個の試料のうち、１４％がＰＤ－Ｌ１陽性であった。最大ＰＤ－Ｌ１陽性頻度は、頭頸部（３１％）、子宮頸部（２９％）、原発不明癌（ＣＵＰ；２８％）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ；２５％）、膀胱癌（２１％）、食道癌（２０％）、トリプルネガティブ（ＴＮ）乳癌（１８％）、及び肝細胞癌（１５％）において確認された（Grosso et al,2013）。ＰＤ－Ｌ１の腫瘍関連発現は、免疫耐性を付与し、腫瘍細胞をＴ細胞媒介アポトーシスから潜在的に保護することが示されている。
ＰＤ－Ｌ１を標的化する治療剤は、ネズミインビボ試験において優れた結果を示している。黒色腫のＢ１６ネズミモデルにおいて、ＧＶＡＸ又はＦＶＡＸワクチン接種方針のいずれかとの組合せの抗ＰＤ－Ｌ１による処理は、試験完了時の生存率（対照についての３０日間対ＰＤ－Ｌ１処理についての５２日間）及び無腫瘍（５％）動物の割合の両方に対して有意な効果をもたらした（Curran et al.,2010）。抗ＰＤ－Ｌ１療法は、Ｐ８１５ネズミ脂肪細胞腫（mastoma）モデルにおける免疫抑制の機序を試験するためにも使用されている。マウス中に注射されたＰ８１５細胞は、通常、それらの拒絶をもたらす強力な免疫応答をトリガーする。ＰＤ－Ｌ１がＰ８１５細胞上で発現された場合、それらの細胞は免疫攻撃を逃れ、それは次いで抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与を介して無効にすることができる（Iwai et al,2002）。免疫原性ヒト癌におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の標的化（Herbst et al.,2014）は、抗癌免疫応答の刺激を介して生存の利点をもたらすことが明白である（Wolchok et al.,2013; Larkin et al.,2015）。
臨床試験は、患者におけるＰＤ－Ｌ１の標的化の臨床的利益を示しており、これまで３つの抗ＰＤ－Ｌ１標的化モノクローナル抗体の承認をもたらしている。
アテゾリズマブ（Tecentriq（商標））は、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。これは固形癌、例として、結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、及び腎細胞癌の治療のための単剤療法として、並びに他の生物剤及び／又は小分子療法との組合せでも臨床試験中である。
アベルマブ（Bavencio（商標））は、ＰＤ－Ｌ１に結合する完全ヒトＩｇＧ１抗体であり、多数の癌、例として、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、メルケル細胞癌、及び転移性尿路上皮癌（ＵＣ）において臨床試験を受けている。
デュルバルマブ（Imfinzi（商標））は、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒトＩｇＧ１抗体であり、臨床試験において頭頸部の扁平上皮癌、膀胱癌、膵臓癌において単独又はトレメリムマブとの組合せで、及び追加の固形癌、例えば、胃癌、黒色腫及び切除不能な肝細胞癌についての試験において他の生物剤及び小分子との組合せで試験されている。
デュルバルマブは、局所進行性又は転移性尿路上皮癌及び切除不能なステージＩＩＩのＮＳＣＬＣを有する患者の治療のために承認されている。
さらなる抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例として、ＢＭＳ－９３６５５９（ＮＣＴ００７２９６６４）が、臨床試験において試験されており、他のものは、前臨床試験中である。
感染性疾患は、癌と多くの類似点を示す。免疫調節におけるＰＤ－Ｌ１の役割を利用して病原体に対する免疫応答を最大化することができることが考えられる。感染性疾患における免疫調節は、新興の医薬分野であり、早期の概説は、ＰＤ－Ｌ１遮断が感染に対する生物学的応答を改善し得、特に、Ｔ細胞疲弊に対抗し、免疫媒介クリアランスを管理し、長期免疫を生成するのに役立つことを示唆している（Wykes,M.N.and Lewin,S.R.,2018）。
さらに、近年の研究は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路が炎症、炎症と関連する疾患及び病態、並びに炎症性疾患、例えば、脳卒中及び脳卒中関連炎症（Bodhankar et al.,2015）、並びに血管炎症又は血管炎、例えば、中血管及び大血管血管炎、又は中枢及び／又は末梢神経系の血管炎（Hid Cadena et al.,2018及びDaxini et al.,2018）の治療のための治療標的であり得ることも示唆している。
種々の抗ＰＤ－Ｌ１治療剤が開発中である一方、現行のデータは、既存の抗ＰＤ－Ｌ１単剤療法による治療全体が、癌患者の５０％未満における応答をもたらすことを示す。報告される有害反応の薬効範囲及び重症度は、臨床試験中の抗体間で異なる。客観的奏効率（ＯＲＲ）を増加させるため、及び／又は有害効果の低減を求めるため、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を他の生物剤、例えば、他のチェックポイント調節因子に対する抗体と、並びに小分子療法及び他の免疫系活性化アプローチ、例えば、腫瘍ワクチンと組み合わせることができる。
したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的化し得、癌療法において適用される追加の分子が当技術分野において依然として必要とされている。
さらに、ＰＤ－Ｌ１を標的化し得、感染性疾患の治療において適用される追加の分子も当技術分野において依然として必要とされている。
さらに、ＰＤ－Ｌ１を標的化し得、炎症、炎症と関連する疾患及び病態、並びに炎症性疾患の治療において適用される追加の分子も当技術分野において依然として必要とされている。
本発明の記述
本発明者らは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中のＰＤ－Ｌ１についての非天然結合部位を含む多数の特異的結合メンバーを調製した。これらの特異的結合メンバーは、ナイーブＣＨ３ドメインファージライブラリーの初回スクリーンを介して単離し、次いで突然変異、スクリーニング及び選択の反復ラウンドの複合プログラムを行って、改善された活性及びＰＤ－Ｌ１についての親和性を有する初回選択された特異的結合メンバーのバリアントを単離した。
本発明者らは、ナイーブＣＨ３ドメインファージライブラリーの初回スクリーン後の初回親和性成熟プログラムから同定された特異的結合メンバーが、ＰＤ－Ｌ１についての増加した親和性、並びにＰＤ－Ｌ１とそのリガンドＰＤ－１との間の相互作用の増加した遮断を示すことを見出した。しかしながら、選択された特異的結合メンバーは、予想外に、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて極めて弱い活性を有した。
突然変異誘発、スクリーニング及び選択の追加ラウンド後、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１についての高い親和性だけでなく、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて優れた活性も有する特異的結合メンバーを同定した。これらの特異的結合メンバーは、驚くべきことに、ＡＢ構造ループ配列中の欠失（ＡＢ構造ループの１４、１５又は１６のいずれかの残基において局在）を有するＣＨ３ドメインを含んだ。欠失は、偶発的にトランケートされた突然変異誘発プライマーから生じるアーティファクトであると考えられる。構造ループ領域中のこのような欠失を含む特異的結合メンバーは、通常、選択プロセスの間に除外される。それというのも、欠失は、ほとんど、抗原結合活性を保持する特異的結合メンバーをもたらさないためである。しかしながら、本発明者らにより用いられた突然変異誘発アプローチの特定の配列の結果として、ＡＢループの突然変異誘発後に同定されなかったこのトランケートＡＢループ配列は、希少なクローン又はより低親和性のバインダーとして選択からのアウトプットプール中に存在したと考えられる。このトランケートＡＢ構造ループ配列を他の構造ループとシャッフルした場合、それはドミナントＡＢ構造ループ配列になり、構造ループ配列のシャッフリング後の特異的結合メンバーの抗原結合活性及び／又は構造へのこの欠失の強力な寄与を示唆した。ＡＢ構造ループ中のこのような欠失を含む特異的結合メンバーは、ＡＢ構造ループ選択から同定された最も有望な配列を、ＣＤ構造ループ選択からの最も有望な配列と組み合わせるより定向のシャッフルアプローチが本発明者らにより用いられた場合には同定されなかった。本発明者らは、ＡＢ構造ループ中の欠失残基の復元が、予想外に、ＰＤ－Ｌ１についての得られる特異的結合メンバーの親和性の有意な低減をもたらすことを見出し、ＡＢループ中の欠失がＰＤ－Ｌ１への結合に重要であることを実証した。
突然変異誘発、スクリーニング及び選択のさらなるラウンドを本発明者らにより実施して潜在的な製造の配列負担を除去し、選択された特異的結合メンバーの生物物理学的特性を改善した。
上記のアプローチにより、本発明者らは、ＣＨ３ドメイン中のＰＤ－Ｌ１についての結合部位を含み、ＰＤ－Ｌ１への優れた結合を示し、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて高い活性を有することを示し、又はそれが予測される多数の特異的結合メンバーを同定することができた。これらの特徴に基づき、本発明の特異的結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１の阻害を介してヒト癌、並びに感染性疾患、炎症、炎症と関連する疾患及び病態、並びに炎症性疾患の治療において適用されることが予測される。
特異的結合メンバーは、カニクイザルＰＤ－Ｌ１についての高い親和性を有することも示され、それはヒトＰＤ－Ｌ１についての親和性と同等であり、カニクイザル疾患モデルにおける特異的結合メンバーの特性の評価において有用であることが予測される。この理由は、得られる結果が、ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１についての親和性のより高度な変動性を有する特異的結合メンバーをカニクイザルモデルにおいて試験する場合よりも、ヒト患者における特異的結合メンバーの効果を予測する可能性が高いためである。
したがって、第１の態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えば、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを提供する。
本発明の特異的結合メンバーのＰＤ－Ｌ１結合部位は、好ましくは、
（ｉ）ＣＨ３ドメインの１４から１８位におけるＡＢ構造ループ中に局在する第１の配列であって、当該特異的結合メンバーが、ＣＨ３ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失を含み、第１の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又は
（ｂ）配列番号２３のバリアント
からなり、
セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されている、
第１の配列；
（ｉｉ）ＣＨ３ドメインの４５．１から７８位におけるＣＤ構造ループ中に局在する第２の配列であって、第２の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）、又は
（ｂ）配列番号１１のバリアント
からなり、
グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されており、及び／又は
プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｈ、又はＮにより置換されており、及び／又は
チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、又はＶにより置換されており、及び／又は
アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されている、
第２の配列；及び
（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインの９２から１００位におけるＥＦ構造ループ中に局在する第３の配列であって、第３の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤＤ（配列番号１９）、又は
（ｂ）配列番号１９のバリアント
からなり、
９２位におけるセリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、又はＧにより置換されており、及び／又は
９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、又はＹにより置換されており、及び／又は
９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、又はＶにより置換されており、及び／又は
９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｅ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されている、
第３の配列；
を含み、
ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）又は不存在であり；
アミノ酸残基ナンバリングが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）ナンバリングスキームに従う。
したがって、本発明は、以下を提供する：
［１］ＰＤ－Ｌ１に結合し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、ＰＤ－Ｌ１結合部位が、
（ｉ）ＣＨ３ドメインの１４から１８位におけるＡＢ構造ループ中に局在する第１の配列であって、特異的結合メンバーが、ＣＨ３ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失を含む、第１の配列、
（ｉｉ）ＣＨ３ドメインの４５．１から７８位におけるＣＤ構造ループ中に局在する第２の配列、及び
（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインの９２から１００位におけるＥＦ構造ループ中に局在する第３の配列
を含む特異的結合メンバー。
［２］第１の配列が、アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又はそのバリアントからなる、［１］に記載の特異的結合メンバー。
［３］第２の配列が、アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）、又はそのバリアントからなる、［１］又は［２］に記載の特異的結合メンバー。
［４］第３の配列が、アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤＤ（配列番号１９）、又はそのバリアントからなる、［１］から［３］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｆにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｉにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１２］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｐにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１３］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１４］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｔにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１５］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１６］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１７］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１８］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｄにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１９］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２０］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｆにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２１］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２２］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｋにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２３］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２４］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｎにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２５］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｐにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２６］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２７］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｔにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２８］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［２９］第１の配列が、配列番号２３のバリアントからなり、グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３０］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３１］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３２］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３３］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｉにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３４］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３５］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｎにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３６］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｑにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３７］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３８］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｓにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［３９］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ｗにより置換されている、［１］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４０］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４１］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｄにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４２］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４３］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４４］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４５］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｎにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４６］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｑにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４７］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｗにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４８］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［４９］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［４８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５０］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｎにより置換されている、［１］から［４８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５１］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［５０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５２］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ｄにより置換されている、［１］から［５０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５３］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［５０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５４］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ｔにより置換されている、［１］から［５０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５５］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［５０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５６］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｄにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５７］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５８］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［５９］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６０］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６１］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｓにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６２］第２の配列が、配列番号１１のバリアントからなり、アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｗにより置換されている、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６３］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９２位におけるセリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［６２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６４］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９２位におけるセリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［６２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６５］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６６］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６７］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｆにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６８］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［６９］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７０］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｉにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７１］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｋにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７２］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７３］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｑにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７４］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７５］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｓにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７６］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｔにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７７］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９３位におけるアスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７８］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［７９］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｄにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８０］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８１］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｆにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８２］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８３］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｈにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８４］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｋにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８５］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８６］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｎにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８７］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８８］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｓにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［８９］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９７位におけるグルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［７７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９０］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｆにより置換されている、［１］から［８９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９１］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｉにより置換されている、［１］から［８９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９２］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［８９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９３］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［８９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９４］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｗにより置換されている、［１］から［８９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９５］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［８９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９６］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９７］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９８］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｉにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［９９］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１００］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０１］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｓにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０２］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｔにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０３］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０４］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｗにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０５］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［９５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０６］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ａにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０７］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｅにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０８］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｆにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１０９］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｉにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１０］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｋにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１１］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１２］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｎにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１３］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｒにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１４］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｖにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１５］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｗにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１６］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｙにより置換されている、［１］から［１０５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１７］ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）である、［１］から［１１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１８］ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、不存在である、［１］から［１１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１１９］ＣＨ３ドメインの３８位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）である、［１］から［１１８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１２０］ＣＨ３ドメインの３８位におけるアミノ酸が、アラニン（Ａ）である、［１］から［１１８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
アミノ酸は、それらの１文字若しくは３文字コードにより、又はそれらの完全名称により指すことができる。２０個の標準的アミノ酸のそれぞれの１及び３文字コード、並びに完全名称は、以下に記載される。
本発明の特異的結合メンバーのＰＤ－Ｌ１結合部位は、好ましくは、第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、
第１の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又は
（ｂ）配列番号２３のバリアント
からなり、セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｅ、又はＴにより置換されており；
第２の配列が、アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）からなり；
第３の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤＤ（配列番号１９）、又は
（ｂ）配列番号１９のバリアントからなり、９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｉ、Ｌ、又はＶにより置換されており；及び／又は
ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）であり、又は不存在である。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号１９に記載の配列を有する。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８８の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号２７に記載の配列を有する。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８９及びＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－３３４の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３１に記載の配列を有する。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２９６の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３５に記載の配列を有する。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４４９の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有する。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４５１の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有する。
上記の実験的作業に加え、本発明者らは、さらなる突然変異誘発プログラムを実施して向上した融解温度を有し、したがって、より安定的であると予測される特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中のＰＤ－Ｌ１についての非天然結合部位を含む特異的結合メンバーを同定した。この向上した安定性は、特異的結合メンバーの製造及び貯蔵において有益であると予測される。
具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）残基の、野生型グリシン（Ｇ）残基への復帰が、特異的結合メンバーの融解温度を増加させることを見出した。融解温度の増加に加え、このアミノ酸復帰は、それが得られる特異的結合メンバーの突然変異負荷を低減させるという点で追加の利点を有する。本発明者らは、９９位における復帰に加えて特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位におけるヒスチジン（Ｈ）残基の、アルギニン（Ｒ）残基による置換も、特異的結合メンバーの増加した融解温度を有する特異的結合メンバーをもたらすことをさらに見出した。これらの突然変異の両方は独立して２回生じ、それらのアミノ酸変化が特異的結合メンバーの融解温度の増加に重要であり得ることを示した。
したがって、好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、本明細書に開示の本発明の第１、第２及び第３の配列を含むＰＤ－Ｌ１結合部位を含み、第３の配列が、ＥＦ構造ループ中、好ましくは、ＣＨ３ドメインの９２から１００位において局在し、配列番号１９のバリアントからなり、９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、グリシン（Ｇ）により置換されており、より好ましくは、９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、グリシン（Ｇ）により置換されており、９８位におけるメチオニン（Ｍ）が、ロイシン（Ｌ）により置換されている。さらに、本発明の特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位におけるヒスチジン（Ｈ）が、アルギニン（Ｒ）により置換されていてよい。特異的結合メンバーは、ＣＨ３ドメイン中の以下の追加の突然変異をさらに含み得る：
（ｉ）８４．１位におけるロイシン（Ｌ）が、プロリン（Ｐ）により置換されていてよく；及び／又は
（ｉｉ）８５．３位におけるセリン（Ｓ）が、トレオニン（Ｔ）により置換されていてよく；及び／又は
（ｉｉｉ）１０１位におけるアミノ酸が、アラニン（Ａ）であり得る。
したがって、本発明は、さらに以下を提供する：
［１２１］第３の配列が、配列番号１９のバリアントからなり、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ｇにより置換されている、上記［１］から［９５］又は［１０６］から［１２０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１２２］ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、アラニン（Ａ）である、上記［１］から［１１６］又は［１１９］から［１２１］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１２３］ＣＨ３ドメインの１１３位におけるアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）である、上記［１］から［１２２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１２４］ＣＨ３ドメインの８４．１位におけるアミノ酸が、プロリン（Ｐ）である、上記［１］から［１２３］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
［１２５］ＣＨ３ドメインの８５．３位におけるアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）である、上記［１］から［１２４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーのＰＤ－Ｌ１結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７０に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの８４．１、８５．３、１０１及び１１３位における残基は、それぞれプロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、及びアルギニン（Ｒ）である。
さらなる好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーのＰＤ－Ｌ１結合部位は、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－５３９の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７４に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位における残基は、アルギニン（Ｒ）である。
いっそうさらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－５４８の第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７８に記載の配列を有する。
本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、本明細書に開示の第１、第２及び第３の配列中の合計１２個まで、１１個まで、１０個まで、９つまで、８つまで、７つまで、６つまで、５つまで、４つまで、３つまで、２つまで、又は１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、本明細書に開示の第１、第２及び第３の配列中の合計３つまで、２つまで、又は１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。より好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、本明細書に開示の第１、第２及び第３の配列中の合計２つまで、又は１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。第１、第２及び第３の配列中の改変の総数は、組み合せたそれらの配列中で作製された改変の総数を指す。
本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、本明細書に開示の第１の配列中の２つまで、又は１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。さらに、又は或いは、特異的結合メンバーは、本明細書に開示の第２の配列中の５つまで、４つまで、３つまで、２つまで、又は１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、本明細書に開示の第３の配列中の６つまで、５つまで、４つまで、３つまで、２つまで、又は１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、本明細書に開示の第１の配列中の２つまで、若しくは１つの（さらなる）アミノ酸改変及び／又は第３の配列中の２つまで、若しくは１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。より好ましい実施形態において、結合メンバーは、本明細書に開示の第１の配列中の１つの（さらなる）アミノ酸改変及び／又は第３の配列中の１つの（さらなる）アミノ酸改変を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、本明細書に開示の第１、第２又は第３の配列中の１つの（さらなる）アミノ酸改変を含む。
本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、９８位におけるメチオニン（Ｍ）がアミノ酸Ｌにより置換されている第３の配列を含み得る。さらに、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、第１、第２又は第３の配列中の１、２又は３つ、好ましくは、１又は２つ、より好ましくは、１つのさらなるアミノ酸改変を含み得る。
本発明の特異的結合メンバーが第１の配列中の１つ以上の追加の改変を含む場合、ＣＨ３ドメインの１４、１５若しくは１６位におけるアミノ酸欠失は、好ましくは、維持され、及び／又はＣＨ３ドメインの１７、１８位におけるアミノ酸は、好ましくは、親配列と比較して非改変である。
本発明の特異的結合メンバーが第２の配列中の１つ以上の追加の改変を含む場合、ＣＨ３ドメインの７７位、及び任意で４５．３位におけるアミノ酸は、好ましくは、親配列と比較して非改変である。
本発明の特異的結合メンバーが第３の配列中の１つ以上の追加の改変を含む場合、ＣＨ３ドメインの９４位、及び任意で９２位におけるアミノ酸は、好ましくは、親配列と比較して非改変である。
改変は、アミノ酸置換、欠失又は挿入であり得る。好ましくは、改変は、置換である。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）である。
代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸は、アラニン（Ａ）である。
本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合の特異的結合メンバーのオフ速度（ｋｏｆｆ）に対する影響を最小にした一方、特異的結合メンバーの突然変異負荷を低減させてＡＢ及びＥＦループ、並びにフレームワーク領域中のある残基を野生型（ＷＴ）残基に戻して変換することができたことを示した（図１参照）。
したがって、好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、
アミノ酸Ｔによるセリン（Ｓ）の置換及び／又は
アミノ酸Ｋによるグリシン（Ｇ）の置換
を有する第１の配列を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーの結合部位は、
アミノ酸Ｋによる９３位におけるアスパラギン（Ｎ）の置換、及び／又は
アミノ酸Ｎによる１００位におけるアスパラギン酸（Ｄ）の置換
を有する第３の配列を含む。
特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの３８位におけるアミノ酸は、バリン又はアラニン残基、好ましくは、アラニン残基であり得る。
ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位の配列以外の特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの配列は、特に限定されない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒト免疫グロブリンＧドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの配列は、当技術分野において公知である。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、又は４８に記載のＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、又は４８に記載のＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号３２、４４、又は４８に記載のＣＨ３ドメインを含む。
さらなる最も好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメインを含む。
或いは、特異的結合メンバーは、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、又は４８、好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、又は４８に記載の配列、最も好ましくは、配列番号３２、４４、又は４８に記載のＣＨ３ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ３ドメインを含み得る。
さらなる最も好ましい実施形態として、特異的結合メンバーは、配列番号７１、７５又は７９に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ３ドメインを含む。
特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインをさらに含み得る。ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ分子と同様に、好ましくは、ＣＨ３ドメインのＮ末端において局在する。特異的結合メンバーのＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は、当技術分野において公知である。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号５若しくは６に記載の配列を有するＩｇＧ ＣＨ２ドメイン、又は配列番号５若しくは６に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ２ドメインを含む。或いは、特異的結合メンバーは、配列番号８２に記載の配列を有するＩｇＧ ＣＨ２ドメイン、又は配列番号８２に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ２ドメインを含む。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、（ｉ）配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号３２、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、及び（ｉｉ）配列番号５に記載のＣＨ２ドメインを含む。
代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、（ｉ）配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号３２、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、及び（ｉｉ）配列番号６に記載のＣＨ２ドメインを含む。
好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部を含む。免疫グロブリンヒンジ領域は、２つのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列が会合し、二量体を形成するのを可能とする。好ましくは、ヒンジ領域、又はその一部は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその一部である。より好ましくは、ヒンジ領域、又はその一部は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその一部である。ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の配列は、配列番号６９に示される。特異的結合メンバーの一部を形成し得る好適なトランケートヒンジ領域は、配列番号７に示される。このヒンジ領域は、実施例において試験されたＦｃａｂ分子中に存在した一方、全長ヒンジ領域は、モックｍＡｂ２フォーマット中に存在した。したがって、特異的結合メンバーは、好ましくは、ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部を含み、ヒンジ領域は、配列番号６９若しくは配列番号７に記載の配列を有し、又はヒンジ領域は、配列番号６９若しくは７に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。或いは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部を含み得、ヒンジ領域は、配列番号６９に記載の配列、又はその断片を含み、前記断片は、配列番号６９のアミノ酸残基の少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ以上、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、又は少なくとも１４個を含む。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、（ｉ）配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号３２、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、（ｉｉ）配列番号５に記載のＣＨ２ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部を含み、免疫グロブリンヒンジ領域は、配列番号６９に記載の配列を有する。
代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、（ｉ）配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号３２、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン、（ｉｉ）配列番号６に記載のＣＨ２ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部を含み、免疫グロブリンヒンジ領域は、配列番号６９に記載の配列を有する。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２５、２６、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、若しくは５０に記載の配列、又は配列番号２５、２６、２９、３３、３４、３０、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、若しくは５０に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。より好ましくは、特異的結合メンバーは、配列番号２９、３０、３３、３４、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、若しくは５０に記載の配列、又は配列番号２９、３０、３３、３４、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、若しくは５０に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。最も好ましくは、特異的結合メンバーは、配列番号４５、４６、４９、若しくは５０に記載の配列、又は配列番号４５、４６、４９、若しくは５０に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。代替的な最も好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号３３、若しくは３４に記載の配列、又は配列番号３３、若しくは３４に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
さらなる最も好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号７２、７３、７６、７７、８０、若しくは８１に記載の配列、又は配列番号７２、７３、７６、７７、８０、又は８１に記載の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
モノクローナル抗体ベース癌免疫療法、例えば、抗ＣＴＬＡ－４又は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体は、近年における癌患者の治療において有意な影響を与えた。しかしながら、多数の悪性腫瘍におけるこれらの単剤療法の顕著な臨床効力にもかかわらず、ごく一部の癌患者がそれらの治療に応答するにすぎない。近年、黒色腫及び非小細胞肺癌におけるＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の組合せ阻害が、補完的な作用機序を有する他の薬剤とそれらを組み合わせることによりそのような単剤療法の臨床利益をさらに向上させる潜在性を強調した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位に加え、イピリムマブからのＣＴＬＡ－４についてのＣＤＲベース抗原結合部位を含む本発明の特異的結合メンバーを調製し、それらをブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）アッセイ（ＳＥＢアッセイ）において試験した場合、特異的結合メンバーは、（ｉ）ＣＨ３ドメイン中の同一のＰＤ－Ｌ１抗原結合部位及び無関連抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位を含む特異的結合メンバー、（ｉｉ）イピリムマブ、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せよりも大きいＴ細胞活性化を示すことを見出した。これは、ＣＨ３ドメイン中への抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位の、及び同一の特異的結合メンバー中への第２の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位の両方の取り込みが、同一の抗原結合部位を含む２つの別個の分子の組合せ使用と比較して特異的結合メンバーの活性の相乗的増加をもたらし得ることを実証する。
したがって、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中のＰＤ－Ｌ１抗原結合部位に加え、特異的結合メンバーは、二重又は多重特異的分子を作出するための１つ以上の追加の抗原結合部位をさらに含み得る。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＤＲベース抗原結合部位を含む。ＣＤＲベース抗原結合部位は、天然発生免疫グロブリン分子中に見出され、それらの構造は当技術分野において周知である。特異的結合メンバーがＣＤＲベース抗原結合部位を含む場合、特異的結合メンバーは、好ましくは、抗体分子である。抗体分子は、特に限定されず、但し、それが本明細書に定義されるＣＨ３ドメイン及びＣＤＲベース抗原結合部位を含むことを条件とする。好ましい実施形態において、抗体分子は、ヒト免疫グロブリンＧ分子、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１分子である。ヒト免疫グロブリンＧ分子の配列は当技術分野において公知であり、本明細書に開示のＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン配列の、そのような分子中への導入は、当業者にいかなる困難も提示しない。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、（ｉ）配列番号４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、８１、３３、３４、２５、２６、２９、３０、３７、３８、４０、又は４１に記載の配列、好ましくは、配列番号４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、８１、３３、又は３４に記載の配列、及び（ｉｉ）ＣＤＲベース抗原結合部位を含む。
ＣＤＲベース抗原結合部位は抗原に結合し得、前記抗原の結合は癌治療に関して有益であると予測される。
一実施形態において、特異的結合メンバーがＣＤＲベース抗原結合部位を含む場合、ＣＤＲベース抗原結合部位は、非冗長及び補完的チェックポイントインヒビター、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７３、ＣＳＦ－１Ｒ、ＫＩＲ．Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、ＢＴＬＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２００Ｒ、又はＴＧＦベータに結合し得る。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の阻害及び共刺激分子の刺激は、ヒト患者における免疫応答を向上させるための補完的な方針を表す。チェックポイント遮断を介するＴ細胞疲弊の復帰は、それらの細胞がより強力に活性化され、完全な抗腫瘍活性を発現することを可能とし得る。したがって、別の実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、Ｔ細胞により発現される共刺激分子、例えば、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＴＮＦＲ２に結合し、それについてのアゴニストであるＣＤＲベース抗原結合部位を含み得る。
さらなる実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するＣＤＲベース抗原結合部位を含み得る。このような特異的結合メンバーは、局在化する免疫活性化を介して腫瘍特異的Ｔ細胞応答をもたらすことが予測される。ＴＡＡの例は、ｃ－Ｍｅｔ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＥＰＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦ、ＭＳＬＮ、ＧＰＣ３、ＣＤ３８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０である。
上記詳述のとおり、感染性疾患は、癌と多くの類似点を示す。免疫調節におけるＰＤ－Ｌ１の役割を利用して病原体に対する免疫応答を最大化することができる。感染性疾患の治療に関する免疫調節は、新興の医薬分野であり、早期の概説は、ＰＤ－Ｌ１遮断が感染に対する生物学的応答を改善し得、特に、Ｔ細胞疲弊に対抗し、免疫媒介クリアランスを管理し、長期免疫を生成するのに役立つことを示唆している（Wykes and Lewin,2018）。
一部の感染性疾患において、炎症促進性応答の増大及び最適未満の抗原特異的Ｔ細胞活性が重度組織損傷の原因である（Rao M.et al.,2017）。理論により拘束されるものではないが、ＣＤＲベース抗原結合部位を含む本発明の特異的結合メンバーの使用は、有益な免疫調節活性を病原体環境に局在化させることによりそれらの疾患の治療において適用され得ることが考えられる。
或いは、アゴニズム又はアンタゴニズムのいずれかのための、免疫細胞標的に結合するＣＤＲベース抗原結合部位を含む本発明の特異的結合メンバーの使用は、増加したＴ細胞特異性及び活性をもたらし得る。
したがって、一実施形態において、特異的結合メンバーがＣＤＲベース抗原結合部位を含む場合、ＣＤＲベース抗原結合部位は、免疫細胞標的、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、又はＣＤ８０に結合し得る。
或いは、特異的結合メンバーがＣＤＲベース抗原結合部位を含む場合、ＣＤＲベース抗原結合部位は、病原性標的、すなわち、ヒト病原体により発現される抗原に結合し得る。病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫であり得る。好ましくは、病原体は、ウイルス、細菌又は真菌である。より好ましくは、病原体は、ウイルス又は細菌である。最も好ましくは、病原体は、ウイルスである。ウイルス抗原の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により発現されるタンパク質ｐ２４、ｇｐ１２０、及びｇｐ４１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により発現されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、並びにインフルエンザウイルスにより発現されるヘマグルチニン及びノイラミニダーゼが挙げられる。細菌抗原の例としては、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）により発現されるＲｖ１７３３、Ｒｖ２３８９及びＲｖ２４３５ｎが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、ＯＸ４０に結合し得ない。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、ＣＤ１３７に結合し得ない。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、ＣＤ２７に結合し得ない。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）に結合し得ない。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）に結合し得ない。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（Inducible T-cell COStimulator）（ＩＣＯＳ）に結合し得ない。例えば、本発明の特異的結合メンバーのＣＤＲベース抗原結合部位は、ＩＣＯＳに結合し得ず、（ｉ）特異的結合メンバーのＰＤ－Ｌ１結合部位は、ＣＨ３ドメインの１４から１８位におけるＡＢ構造ループ中に局在する第１の配列を含み、特異的結合メンバーが、ＣＨ３ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失を含み、第１の配列が、配列番号２３に記載の配列からなる、第１の配列、ＣＨ３ドメインの４５．１から７８位におけるＣＤ構造ループ中に局在する第２の配列であって、配列番号１１に記載の配列からなる第２の配列、及びＣＨ３ドメインの９２から１００位におけるＥＦ構造ループ中に局在する第３の配列であって、配列番号３１に記載の配列からなる第３の配列を含み；（ｉｉ）特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインは、配列番号３２に記載の配列を含み；及び／又は（ｉｉｉ）特異的結合メンバーは、配列番号３３若しくは３４に記載の配列を含む。
特異的結合メンバーは、免疫系モジュレーター、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は検出可能な標識にさらにコンジュゲートさせることができる。免疫系モジュレーターは、細胞傷害性分子、例えば、サイトカインであり得る。
本発明はまた、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子をコードする核酸、並びにそのような核酸を含むベクターを提供する。
本発明の核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。このような組換え宿主細胞を使用して本発明の特異的結合メンバーを産生することができる。したがって、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子を産生する方法であって、特異的結合メンバー又は抗体分子の産生のための条件下で組換え宿主細胞を培養することを含む方法も提供される。方法は、特異的結合メンバー又は抗体分子を単離し、及び／又は精製するステップをさらに含み得る。
本発明の特異的結合メンバー及び抗体は、治療用途において、特に、ヒトにおける治療用途、例えば、癌治療、感染性疾患の治療、並びに炎症、炎症と関連する疾患及び病態、及び炎症性疾患の治療において適用されることが予測される。したがって、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も提供される。
本発明はさらに、治療方法における使用のための、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子を提供する。患者を治療する方法であって、患者に治療有効量の本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子を投与することを含む方法も提供される。医薬品の製造における使用のための、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子の使用がさらに提供される。本明細書において言及される患者は、好ましくは、ヒト患者である。
本発明はまた、患者における癌を治療する方法における使用のための、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子を提供する。患者における癌を治療する方法であって、患者に治療有効量の本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子を投与することを含む方法も提供される。患者における癌の治療のための医薬品の製造における使用のための、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子の使用がさらに提供される。治療は、患者に第２の抗癌剤及び／又は治療剤、例えば、抗腫瘍ワクチン及び／又は化学療法剤を投与することをさらに含み得る。第２の抗癌剤及び／又は治療剤は、患者に本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子と同時に、それと別個に、又はそれと連続的に投与することができる。
本発明はまた、患者における感染性疾患を治療する方法における使用のための、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子を提供する。患者における感染性疾患を治療する方法であって、患者に治療有効量の本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子を投与することを含む方法も提供される。患者における感染性疾患の治療のための医薬品の製造における使用のための、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子の使用がさらに提供される。治療は、患者に感染性疾患の治療のための第２の薬剤及び／又は治療剤を投与することをさらに含み得る。第２の薬剤及び／又は治療剤は、患者に本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子と同時に、それと別個に、又はそれと連続的に投与することができる。
本発明はまた、患者における炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患を治療する方法における使用のための、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子を提供する。患者における炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患を治療する方法であって、患者に治療有効量の本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子を投与することを含む方法も提供される。患者における炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患の治療のための医薬品の製造における使用のための、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子の使用がさらに提供される。治療は、患者に炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患の治療のための第２の薬剤及び／又は治療剤を投与することをさらに含み得る。第２の薬剤及び／又は治療剤は、患者に本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子と同時に、それと別個に、又はそれと連続的に投与することができる。
図面の簡単な説明
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３、ＦＳ１７－３３－３７、ＦＳ１７－３３－１１６；ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２９６、ＦＳ１７－３３－３３４、ＦＳ１７－３３－４４９、ＦＳ１７－３３－４５１、ＦＳ１７－３３－４８８、ＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７－３３－５４８、並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの３８、８４．１、８５．３及び１１３位のＡＢ、ＣＤ及びＥＦループ並びにフレームワークの配列を示す。ＩＭＧＴナンバリングシステムによる残基のナンバリングを示す。 ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのＣＨ３ドメイン残基についての抗体残基ナンバリングシステム、例として、ＩＭＧＴ、連続ナンバリング（ＩＭＧＴエキソンナンバリング）、ＥＵナンバリング、及びKabatナンバリングシステム、並びに野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインアミノ酸配列の一致を示す。 ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのＣＨ３ドメイン残基についての抗体残基ナンバリングシステム、例として、ＩＭＧＴ、連続ナンバリング（ＩＭＧＴエキソンナンバリング）、ＥＵナンバリング、及びKabatナンバリングシステム、並びに野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインアミノ酸配列の一致を示す。 ＦｃａｂのＦＳ１７－３３、ＦＳ１７－３３－３７、ＦＳ１７－３３－１１６；ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２９６、ＦＳ１７－３３－３３４、ＦＳ１７－３３－４４９、ＦＳ１７－３３－４５１、ＦＳ１７－３３－４８８、ＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７－３３－５４８、並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメイン配列のアラインメントを示す。 ２つのＦｃａｂ（Ａ及びＢ）及びｍＡｂ２（Ｃ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。親Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３は、ショルダーを有する単一ピークを示す（Ａ）。Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６は、スプリットピークを示す（Ｂ）。ＳＥＣ分析は、ｍＡｂ２ ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０（Ｃ）が少量の凝集を有したことを示し、その典型例は、親４４２０ｍＡｂについて見られる。Ｆｃａｂとは異なり、明らかなスプリットピークもショルダーも存在しない。 抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂ、ＦＳ１７－３３－１１６ＡＡがヒトＰＤ－Ｌ１活性を阻害し、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ－２の放出をもたらすことを示す。この放出は、陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂのＹＷ２４３．５５．Ｓ１（Ｓ１）と同等であった。抗ＰＤ－Ｌ１ ＦｃａｂのＦＳ１７－３３－３７ＡＡ、及び野生型（ＷＴ）Ｆｃａｂは、このアッセイにおいて有意なＴ細胞活性化を示さなかった。 抗ＰＤ－Ｌ１ ＦｃａｂのＦＳ１７－３３－２８８ＡＡ、ＦＳ１７－３３－２８９ＡＡ及びＦＳ１７－３３－２９６ＡＡが全て、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ－２放出を示し、それは、陽性対照ｍＡｂ、Ｓ１のものと同等であったことを示す。試験された全てのＦｃａｂは、ＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異を含有し、クローン名中の「ＡＡ」により示される。 Ｆｃａｂ及びモックｍＡｂ２フォーマットの抗ＰＤ－Ｌ１ ＦｃａｂのＦＳ１７－３３－２８８ＡＡ、ＦＳ１７－３３－２８９ＡＡ及びＦＳ１７－３３－２９６ＡＡ及びＦＳ１７－３３－３３４ＡＡが、ヒトＰＤ－Ｌ１を阻害し、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ－２の放出をもたらすことを示す。モックｍＡｂ２フォーマットへのＦｃａｂの変換は、このアッセイにおいてＩＬ－２放出の部分的低減をもたらした。 モックｍＡｂ２フォーマットの抗ＰＤ－Ｌ１ ＦｃａｂのＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１もＰＤ－Ｌ１を阻害し、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ－２を放出し得たことを示す。 ＳＥＢアッセイからの代表的なプロットを示す。Ｆｃａｂ及びモックｍＡｂ２の両方は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂのＨｅｌＤ１．３と比較してＴ細胞による向上したＩＦＮγ放出を示した（Ａ及びＢ）。Ｆｃａｂの活性は、抗ＰＤ－Ｌ１陽性対照ｍＡｂのＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（Ｓ７０）と近く、又は同等であった。モックｍＡｂ２フォーマットのＦｃａｂは、このアッセイにおいてＩＦＮγ放出のわずかな低減を示した。図５Ｃは、Ｆｃａｂ中のＬＡＬＡ突然変異（ＡＡ）の存在がＳＥＢアッセイにおいてそれらの活性を妨害しなかったことを示す。 ＳＥＢアッセイからの代表的なプロットを示す。イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）と比較して、モックｍＡｂ２及びＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ２の両方は、Ｔ細胞による向上したＩＦＮγ放出を示した。 ＳＥＢアッセイからの代表的なプロットを示す。イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）と比較して、モックｍＡｂ２及びＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ２の両方は、Ｔ細胞による向上したＩＦＮγ放出を示した。
詳細な説明
本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合する特異的結合メンバーに関する。具体的には、本発明の特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む。用語「ＰＤ－Ｌ１」は、特に文脈が要求しない限り、ヒトＰＤ－Ｌ１、及び／又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１を指し得る。好ましくは、用語「ＰＤ－Ｌ１」は、ヒトＰＤ－Ｌ１を指す。
用語「特異的結合メンバー」は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン、又はその断片を説明する。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部をさらに含む。このような分子は、本明細書において抗原結合Ｆｃ断片、又はＦｃａｂ（商標）とも称される。特異的結合メンバーは、部分的又は全体的に合成により産生することができる。
したがって、本明細書において使用される用語「特異的結合メンバー」は、断片を含み、但し、前記断片が、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えば、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含むことを条件とする。したがって、文脈が特に要求しない限り、本明細書において使用される用語「特異的結合メンバー」は、「特異的結合メンバー又はその断片」と同等である。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、抗体分子である。用語「抗体分子」は、抗体分子の断片を包含し、但し、そのような断片が、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインを含むことを条件とする。抗体分子は、ヒト又はヒト化であり得る。抗体分子は、好ましくは、モノクローナル抗体分子である。抗体分子の例は、免疫グロブリンアイソタイプ、例えば、免疫グロブリンＧ、及びそれらのアイソタイプサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにそれらの断片である。
モノクローナル及び他の抗体を採用し、組換えＤＮＡ技術の技術を使用して元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ抗体を産生することが可能である。このような技術は、異なる免疫グロブリン中へのＣＤＲ、又は可変領域の導入を含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの、別の免疫グロブリン中への導入は、例えば、欧州特許出願公開第１８４１８７号、英国特許第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第２３９４００号に記載されている。ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を別の定常ドメイン、例えば、異なるＣＨ３ドメイン、又はＣＨ１若しくはＣＨ２ドメイン中に導入することにより、関連定常ドメイン配列に類似の技術を用いることができる。
抗体は多数の手法で改変することができるため、「特異的結合メンバー」は、天然であるか全体又は部分的に合成であるかを問わず、抗体の抗体断片、誘導体、機能的同等物及びホモログを包含すると解釈すべきである。ＣＨ３ドメインを含む抗体断片の一例は、抗体のＦｃドメインである。ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の一例は、ＣＨ３ドメインに結合しているｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al.,1996）。
本発明の特異的結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に結合する。この文脈における結合は、特異的結合を指し得る。用語「特異的」は、特異的結合メンバーが、その特異的結合パートナー、ここではＰＤ－Ｌ１以外の分子へのいかなる有意な結合も示さない状況を指し得る。用語「特異的」は、特異的結合メンバーが、多数の抗原により担持される特定のエピトープ、例えば、ＰＤ－Ｌ１上のエピトープについて特異的である場合にも当てはまり、その場合において、特異的結合メンバーは、そのエピトープを担持する種々の抗原に結合し得る。特異的結合メンバーは、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－１）及びＣＤ８０、例えば、ヒト及びマウスＣＤ８０、並びにヒト及びマウスＰＤ－１に結合し得ず、それらへのいかなる有意な結合も示し得ない。
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む。ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位は、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４ドメイン中に局在する。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に局在する。
ＰＤ－Ｌ１結合部位は、好ましくは、
（ｉ）ＡＢ構造ループ中に局在する第１の配列であって、特異的結合メンバーが、定常ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失を含み、第１の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又は
（ｂ）配列番号２３のバリアント
からなり、
セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されている、
第１の配列；
（ｉｉ）ＣＤ構造ループ中に局在する第２の配列であって、第２の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）、又は
（ｂ）配列番号１１のバリアント
からなり、
グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されており、及び／又は
プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｈ、又はＮにより置換されており、及び／又は
チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、又はＶにより置換されており、及び／又は
アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されている、
第２の配列；及び
（ｉｉｉ）ＥＦ構造ループ中に局在する第３の配列であって、第３の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤ１Ｄ２（配列番号１９）、又は
（ｂ）配列番号１９のバリアント
からなり、
セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、又はＧにより置換されており、及び／又は
アスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、又はＶにより置換されており、及び／又は
メチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｈ、Ｓ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
アスパラギン酸（Ｄ１）が、アミノ酸Ｅ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、又はＧにより置換されており、及び／又は
アスパラギン酸（Ｄ２）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されている、
第３の配列
を含み、
ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）であり、又は不存在である。
代替的な好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合部位は、
（ｉ）ＡＢ構造ループ中に局在する第１の配列であって、特異的結合メンバーが、定常ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失を含み、第１の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又は
（ｂ）配列番号２３に記載のバリアント
からなり、
セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されている、
第１の配列；
（ｉｉ）ＣＤ構造ループ中に局在する第２の配列であって、第２の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）、又は
（ｂ）配列番号１１のバリアント
からなり、
グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されており、及び／又は
プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｈ、又はＮにより置換されており、及び／又は
チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、又はＶにより置換されており、及び／又は
アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されている、
第２の配列；及び
（ｉｉｉ）ＥＦ構造ループ中に局在する第３の配列であって、第３の配列が、
（ａ）アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤ１Ｄ２（配列番号１９）、又は
（ｂ）配列番号１９のバリアント
からなり、
セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、又はＧにより置換されており、及び／又は
アスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、又はＹにより置換されており、及び／又は
グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、又はＶにより置換されており、及び／又は
メチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｈ、Ｓ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
アスパラギン酸（Ｄ１）が、アミノ酸Ｅ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
アスパラギン酸（Ｄ２）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されている、
第３の配列
を含み、
ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）であり、又は不存在である。
本発明の特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位におけるアルギニン（Ｒ）をさらに含み得る。さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーは、以下の追加の突然変異を含み得る：
（ｉ）ＣＨ３ドメインの８４．１位におけるアミノ酸は、プロリン（Ｐ）であり得；及び／又は
（ｉｉ）ＣＨ３ドメインの８５．３位におけるアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）であり得；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸は、アラニン（Ａ）であり得る。
アミノ酸残基は、本明細書において特に示されない限り、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）ナンバリングスキームに従ってナンバリングされる。ＩＭＧＴナンバリングスキームは、Lefranc et al.,2005に記載されている。
好ましくは、第１の配列は、ＣＨ３ドメインの残基１４から１８において局在し、第２の配列は、ＣＨ３ドメインの４５．１から７８位において局在し、及び／又は第３の配列は、ＣＨ３ドメインの９２から１００位、又は９２から１０１位において局在し、アミノ酸残基ナンバリングは、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）ナンバリングスキームに従う。
ＩＭＧＴナンバリングの代替例として、本明細書に記載の改変を含むＣＨ３ドメインの残基の位置は、配列番号４に記載の野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン配列中の残基のＩＭＧＴエキソンナンバリングとも称される連続ナンバリング、ＥＵナンバリング、又はKabatナンバリングに従って代替的に示すことができる。
ＷＴ ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（配列番号４）の残基のＩＭＧＴナンバリング、連続ナンバリング（ＩＭＧＴエキソンナンバリング）、ＥＵナンバリング、及びKabatナンバリング間の一致は、図１Ｂ及びＣに示される。
配列番号４に記載の野生型ＣＨ３ドメイン配列に対するＦｃａｂのＦＳ１７－３３、ＦＳ１７－３３－３７、ＦＳ１７－３３－１１６；ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２９６、ＦＳ１７－３３－３３４、ＦＳ１７－３３－４４９、ＦＳ１７－３３－４５１、ＦＳ１７－３３－４８８、ＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７－３３－５４８のＣＨ３ドメイン中の改変残基位置のＩＭＧＴナンバリング及び連続ナンバリング間の一致は、図１Ａに示される。
したがって、例えば、本出願がＣＨ３ドメインの１４から１８位におけるＡＢ構造ループ、４５．１から７８位におけるＣＤ構造ループ、及び／又は９２から１００位におけるＥＦ構造ループの改変を指す場合、残基ナンバリングがＩＭＧＴナンバリングスキームに従う場合、配列番号４のアミノ酸残基の連続ナンバリングと一致する改変位置は、図１Ａに示されるとおり、それぞれＣＨ３ドメインの１８から２２、４６から５１、及び７３から８１位である。
好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合部位は、ＡＢループ中に局在する第１の配列、ＣＤループ中に局在する第２の配列及びＥＦループ中に局在する第３の配列を含み、
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号１９に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号２７に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３１に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３５に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７８に記載の配列を有し；又は
第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７４に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位における残基は、アルギニン（Ｒ）である。
より好ましくは、ＰＤ－Ｌ１結合部位は、ＡＢループ中に局在する第１の配列、ＣＤループ中に局在する第２の配列及びＥＦループ中に局在する第３の配列を含み、
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３１に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有し；又は
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有する。
代替的な最も好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーのＰＤ－Ｌ１結合部位は、ＡＢループ中に局在する第１の配列、ＣＤループ中に局在する第２の配列及びＥＦループ中に局在する第３の配列を含み得、
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７８に記載の配列を有し；又は
第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７４に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位における残基は、アルギニン（Ｒ）であり；又は
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７０に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの８４．１、８５．３、１０１及び１１３位における残基は、それぞれプロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）及びアルギニン（Ｒ）である。
第１、第２及び第３の配列は、好ましくは、特異的結合メンバーの定常ドメインの構造ループ中に局在する。新たな抗原結合部位を作出するための抗体定常ドメインの構造ループ領域中への配列の導入は、例えば、国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。
抗体定常ドメインの構造ループは、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含む。ＣＨ３ドメインにおいて、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８、４３から７８及び９２から１０１において局在する。好ましくは、第１の配列は、ＣＨ３ドメインの残基１４から１８位において局在し、第２の配列は、ＣＨ３ドメインの４５．１から７８位において局在し、及び／又は第３の配列は、ＣＨ３ドメインの９２から１００又は９２から１０１位において局在する。
本発明の特異的結合メンバーは、３８位におけるアラニン又はバリン残基、好ましくは、アラニン残基をさらに含み得る。特に、特異的結合メンバーは、第１、第２及び第３の配列を含み、
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３１に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号４３に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７８に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号４２に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７４に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１３位における残基は、アルギニン（Ｒ）であり；又は
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７０に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの８４．１、８５．３、１０１及び１１３位における残基は、それぞれプロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）及びアルギニン（Ｒ）であり；
３８位におけるアラニン残基をさらに含み得る。
同様に、特異的結合メンバーは、第１、第２及び第３の配列を含み、
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号１９に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号２７に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３１に記載の配列を有し；又は
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３５に記載の配列を有し；
３８位におけるバリン残基をさらに含み得る。
さらに、又は或いは、本発明の特異的結合メンバーは、（図１Ａに示される）ＣＨ３の１０１位におけるバリン残基、又はアミノ酸欠失をさらに含み得る。特に、特異的結合メンバーは、第１、第２及び第３の配列を含み、
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号１９に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号２７に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３１に記載の配列を有し；
第１の配列は、配列番号２３に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号３５に記載の配列を有し；
ＣＨ３ドメインの１０１におけるアミノ酸欠失を含み得る。
或いは、本発明の特異的結合メンバーは、（図１Ａに示される）ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアラニン残基（Ａ）をさらに含み得る。特に、特異的結合メンバーは、第１、第２及び第３の配列を含み、
第１の配列は、配列番号４７に記載の配列を有し、第２の配列は、配列番号１１に記載の配列を有し、第３の配列は、配列番号７０に記載の配列を有し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの８４．１、８５．３、及び１１３位における残基は、それぞれプロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、及びアルギニン（Ｒ）であり、ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアラニン残基（Ａ）を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載の配列を含み、それを有し、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、４８、７５又は７９に記載の配列を有するＣＨ３ドメインを含む。
本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載の配列を含み、それを有し、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み得、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に示される配列の直接のＣ末端におけるリジン残基（Ｋ）は欠失している。
さらに、本発明の特異的結合メンバーは、免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号６に記載の配列を有し得る。
特異的結合メンバーのＣＨ２ドメインは、１つ以上のＦｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩへの、及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を低減させ、又は停止させる１つ以上の突然変異を含み得る。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合の低減又は停止が、抗体分子により媒介される抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＣ）を減少させ、又は排除することを仮定する。同様に、補体への結合の低減又は停止は、抗体分子により媒介される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減させ、又は排除することが予測される。１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を低減させ、又は停止させるための突然変異は、当技術分野において公知である（Wang et al.,2018）。これらの突然変異としては、Bruhns,et al.,2009及びHezareh et al.,2001に記載されている「ＬＡＬＡ突然変異」が挙げられ、それは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ１．３及び１．２位におけるロイシン残基の、アラニンによる置換（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）を含む。或いは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ８４．４位におけるアスパラギン（Ｎ）をアラニン、グリシン又はグルタミンに突然変異させる（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ又はＮ８４．４Ｑ）ことによる保存Ｎ結合グリコシル化部位の突然変異を介する非グリコシル化抗体の生成も、ＩｇＧ１エフェクター機能を減少させることが公知である（Wang et al.,2018）。さらなる代替例として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ１１４位におけるプロリンの、アラニン又はグリシンへの突然変異（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）を介して低減されることが公知である（Idusogie et al.,2000；Klein et al.,2016）。これらの突然変異を組み合わせてさらに低減したＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有し、又はＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も有さない抗体分子を生成することもできる。
したがって、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み得、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン又はグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位におけるアラニン、グルタミン又はグリシン；
を含み、
アミノ酸残基ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従う。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基；
を含み、
アミノ酸残基ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従う。
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号５に記載の配列を有し得る。
代替的な好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位におけるアラニン；
を含み、
アミノ酸残基ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従う。
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号８２に記載の配列を有し得る。
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１結合部位に加え、１つ以上のさらなる抗原に結合する１つ以上のさらなる抗原結合部位を含み得る。１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、それらのコグネイト抗原に特異的に結合する。
１つ以上のさらなる抗原結合部位は、ＰＤ－Ｌ１又は別の抗原に結合し得る。したがって、特異的結合メンバーは、多重特異的、例えば、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的分子、好ましくは、二重特異的分子であり得る。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１及び１つ以上のさらなる抗原に同時に結合し得る。
抗体分子は、区別されるドメインを含むモジュラーアーキテクチャを有することが公知であり、それらを複数の異なる手法で組み合わせて多重特異的、例えば、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的抗体フォーマットを作出することができる。例示的な多重特異的抗体フォーマットは、例えば、Spiess et al.(2015)及びKontermann(2012)に記載されている。本発明の特異的結合メンバーは、そのような多重特異的抗体フォーマットで用いることができる。これは、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えば、ＣＨ３ドメイン中の抗原結合部位の存在を介してさらなる抗原結合部位をそのような多重特異的抗体フォーマット中に導入する追加の利点を有する。
例えば、本発明の特異的結合メンバーは、へテロ二量体抗体分子、例えば、へテロ二量体完全免疫グロブリン分子、又はその断片であり得る。この場合、抗体分子の一部分は、本明細書に記載の１つ又は複数の配列を有する。例えば、本発明の特異的結合メンバーが二重特異的へテロ二量体抗体分子である場合、特異的結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１以外の抗原に結合する重鎖と対合している本明細書に記載のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含み得る。へテロ二量体抗体を調製する技術は当技術分野において公知であり、それとしては、ノブイントゥホール（ＫＩＨ）技術が挙げられ、それは、抗体分子のＣＨ３ドメインを遺伝子操作して「ノブ」又は「ホール」のいずれかを作出して鎖へテロ二量体化を促進することを含む。或いは、へテロ二量体抗体は、抗体分子への電荷対の導入を介して調製して静電反発によりＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避し、静電誘引によりへテロ二量体化を指向することができる。へテロ二量体抗体フォーマットの例としては、CrossMab、ｍＡｂ－Ｆｖ、シードボディ（SEED-body）、及びＫＩＨ ＩｇＧが挙げられる。
或いは、本発明の多重特異的特異的結合メンバーは、完全免疫グロブリン分子又はその断片及び追加の１つ又は複数の抗原結合部分を含み得る。抗原結合部分は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体であり得、完全免疫グロブリン分子又はその断片に融合させることができる。完全免疫グロブリン分子に融合している追加の抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＤＶＩ－ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ－ＩｇＧ分子が挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン断片に融合している追加の抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、例えば、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、ダイアボディ－ＣＨ３、及びｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨが挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。
他の好適な多重特異的フォーマットは、当業者に容易に明らかである。
好ましい実施形態において、本発明による特異的結合メンバーは、第２の抗原結合部位を含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＣＤＲベース抗原結合部位である。用語「ＣＤＲベース抗原結合部位」は、６つのＣＤＲ残基から構成される特異的結合メンバー可変領域の抗原結合部位を指す。
第２の抗原結合部位は、好ましくは、チェックポイントインヒビター、共刺激分子又は腫瘍関連抗原に特異的である。
所与の抗原、例えば、腫瘍関連抗原に対する抗体分子、及びそのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は当業者の能力の十分範囲内であり、多くの好適な技術が当技術分野において公知である。さらに、種々の免疫系モジュレーターに対するＣＤＲ配列を含む抗体は、当技術分野において公知である。したがって、当業者は、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合部位に加え、第２の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位を含む特異的結合メンバーの調製にあたり困難を有さない。
ある例において、本発明の特異的結合メンバーは、ＣＤＲベース抗原結合部位を含まない。
本発明の特異的結合メンバーは、本明細書に開示の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列のバリアントも含み得る。好適なバリアントは、配列変更、又は突然変異、及びスクリーニングの方法により得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上のバリアント配列を含む特異的結合メンバーは、親特異的結合メンバーの機能的特徴、例えば、ＰＤ－Ｌ１についての結合特異性及び／又は結合親和性の１つ以上を保持する。例えば、１つ以上のバリアント配列を含む特異的結合メンバーは、好ましくは、（親）特異的結合メンバーと同一の親和性、又はそれよりも高い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合する。親特異的結合メンバーは、バリアント特異的結合メンバー中に取り込まれたアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない特異的結合メンバーである。
例えば、本発明の特異的結合メンバーは、本明細書に開示の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９、好ましくは、配列番号２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９、最も好ましくは、３２、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。特に、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２４に記載のＣＨ３ドメイン配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するＣＨ３ドメインを含む。
さらなる好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号５又は６に記載のＣＨ２ドメイン配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ２ドメイン配列を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２５、２６、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、又は８１、最も好ましくは、配列番号４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、又は８１に記載の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる。代替的な最も好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号３３又は３４に記載の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる。
表９Ａ、Ｂ及びＣは、実施例において調製された分子に関して、構造ループ中のある残基を改変すると、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合、親分子のオフ速度と比較してＦｃａｂのオフ速度が必ず増加し得たことを示す。
したがって、特異的結合メンバーが、
（ｉ）配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５若しくは７９に記載の（親）配列とのその配列同一性により規定されるＣＨ３ドメイン配列を含み；又は
（ｉｉ）上記段落及び本明細書の他箇所に記載のとおり、配列番号２５、２６、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、若しくは８１に記載の（親）配列とのその配列同一性により規定される配列を含み、若しくはそれからなる場合、
ＣＨ３ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失は、好ましくは、維持され、及び／又はＣＨ３ドメインの１７、１８位におけるアミノ酸は、好ましくは、親配列と比較して非改変であり；
ＣＨ３ドメインの７７位、及び任意で４５．３位におけるアミノ酸は、好ましくは、親配列と比較して非改変であり；及び／又は
ＣＨ３ドメインの９４位、及び任意で９２位におけるアミノ酸は、好ましくは、親配列と比較して非改変である。
配列同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys Inc,San Diego USA）を参照して定義される。ＧＡＰは、ニードルマン・ブンシュアルゴリズムを使用して２つの完全配列をアラインし、マッチの数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップクリエーションペナルティは１２であり、ギャップ伸長ペナルティは４である。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.,1990の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman,1988の方法を使用する）、又はスミス・ウォーターマンアルゴリズム（Smith and Waterman,1981）、又はAltschul et al.,1990前掲のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを、一般にデフォルトパラメータを用いて使用することができる。特に、ｐｓｉ－Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Altschul et al.,1997）を使用することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、本明細書に開示の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列も含み得る。特に、変更は、特異的結合メンバーの１つ以上のフレームワーク領域中で作製することができる。
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２４、２８、３２、３６、３９、４４、４８、７１、７５又は７９に記載のＣＨ３ドメイン配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有するＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
さらなる好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号５又は６に記載のＣＨ２ドメイン配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有するＣＨ２ドメイン配列を含む。
さらなる好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２５、２６、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４０、４１、４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０，又は８１に記載の配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、好ましくは、４０個以下の変更、３０以下の変更、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有する配列を含むか、又はそれからなる。
ＰＤ－Ｌ１への結合について本発明の特異的結合メンバーと競合し、又は本発明の特異的結合メンバーと同一のＰＤ－Ｌ１上のエピトープに結合する特異的結合メンバーも企図され、その特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含む。２つの抗体による抗原についての競合を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、２つの抗体による抗原への結合の競合は、表面プラズモン共鳴、例えば、Biacoreを使用して決定することができる。抗体により結合されるエピトープをマッピングする方法は、同様に当技術分野において公知である。
本発明の特異的結合メンバーは、ヒトＰＤ－Ｌ１に、及び／又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合し得る。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、細胞の表面上で発現されるＰＤ－Ｌ１に結合し得る。細胞は、好ましくは、癌細胞である。
特異的結合メンバーが第２の抗原について特異的な第２の抗原結合部位、例えば、ＣＤＲベース抗原結合部位を含む場合、特異的結合メンバーは、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１及び第２の抗原に同時に結合し得る。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１及び第２の抗原に同時に結合し得、ＰＤ－Ｌ１及び第２の抗原は、単一細胞の表面上で、又は２つの別個の細胞の表面上で発現される。
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、若しくは２ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はより大きい親和性で、単量体ＰＤ－Ｌ１、好ましくは、ヒト単量体ＰＤ－Ｌ１に結合する。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、２ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はより大きい親和性で、ＰＤ－Ｌ１、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１８ｎＭ、１７ｎＭ、若しくは１６ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はより大きい親和性で、細胞の表面上で発現されるＰＤ－Ｌ１、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、１６ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はより大きい親和性で、細胞の表面上で発現されるＰＤ－Ｌ１、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。
コグネイト抗原、例えば、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合メンバーの結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Biacoreにより決定することができる。細胞表面上で発現されるコグネイト抗原、例えば、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合メンバーの結合親和性は、フローサイトメトリーにより決定することができる。
Ｆｃａｂは、モノクローナル抗体よりも小さい結合界面を有する。それというのも、Ｆｃａｂの結合部位は、近接して位置する２つの結合部位を有する比較的コンパクトな抗体断片を形成するためである。対照的に、典型的なｍＡｂのＦａｂアームは、フレキシブルヒンジ領域により離隔される。Ｆｃａｂの２つの抗原結合部位はまた、典型的なｍＡＢのものと比較して互いに空間的に近い。２つの結合部位のこのより小さい結合界面及び低減したフレキシビリティに基づくと、抗ＰＤ－Ｌ１ ＦｃａｂがＰＤ－Ｌ１に特異的なモノクローナル抗体と類似の親和性及びポテンシーでＰＤ－Ｌ１に結合し、それを阻害し得ることは驚くべきことであった。
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーが本明細書においてｍＡｂ２とも称される完全免疫グロブリン分子の形態である場合、Ｔ細胞活性化アッセイ、例えば、ＤＯ１１．１０アッセイにおいて、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、又は２ｎＭ以下、好ましくは、２ｎＭ以下のＥＣ５０を有し得る。
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーがＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ２ドメインのＮ末端において局在するトランケート免疫グロブリンヒンジ領域からなるＦｃａｂの形態である場合、Ｔ細胞活性化アッセイ、例えば、ＤＯ１１．１０アッセイにおいて、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下、好ましくは、０．５ｎＭ以下のＥＣ５０を有し得る。
ＤＯ１１．１０アッセイは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球ハイブリドーマ細胞系をベースとするＩＬ－２放出アッセイであり、本発明の特異的結合メンバーの機能的スクリーニングに使用することができる。ＩＬ－２放出は、Ｔ細胞活性化のマーカーである。ＤＯ１１．１０アッセイは、本明細書の実施例６に記載のＤＯ１１．１０アッセイであり得る。
例えば、ＤＯ１１．１０アッセイは、例えば、実験培地、例えば、ピューロマイシンを有さない完全ＤＯ１１．１０培養培地中の目的特異的結合メンバーの希釈物を調製することを含み得る。特異的結合メンバーは、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現させるためのヒトＰＤ－Ｌ１を含有するレンチウイルスベクターにより形質導入された４×１０５個／ｍｌのＢ細胞ハイブリドーマ細胞（「Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞」と称される）（例えば、ＬＫ３５．２ ｈＰＤ－Ｌ１細胞）と１：１で、２．４６μＭのＯＶＡぺプチドの存在下で実験培地中で混合することができ（例えば、９６丸底プレート中でウェル当たり例えば、１００μＬのＢ細胞ハイブリドーマ細胞／特異的結合メンバーミックス）、３７℃、５％のＣＯ２において１時間インキュベートすることができる。１００μｌの容量の実験培地中の１ｍｌ当たり空のレンチウイルスベクターにより形質導入された２×１０５個のＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞（「ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞」と称される；（例えば、ＤＯ１１．１０ ｐＬＶＸ細胞）を、１００μｌのＢ細胞ハイブリドーマ細胞／特異的結合メンバーミックスに添加することができる。次いで、細胞を混合してから３７℃、５％のＣＯ２において２４時間インキュベートすることができる。上清を回収し、マウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（例えば、eBioscience製、88-7024-88又はR&D systems製、SM2000）を用いてアッセイすることができる。プレートリーダー、例えば、Gen5ソフトウェア、BioTekを有するプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取ることができる。補正目的のために５７０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算することができる。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（例えば、Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づき得る。マウスＩＬ－２の濃度は、特異的結合メンバーの対数濃度に対してプロットすることができる。得られた曲線は、対数（アゴニスト）対応答の式を使用して、例えば、GraphPad Prismを使用してフィットさせることができる。
ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイに関して、空のレンチウイルスベクターにより形質導入されたＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞は、例えば、レンチウイルス形質導入法を使用して調製してLenti-X HTXパッケージングシステムを使用して空のレンチウイルスベクターｐＬＶＸを含有するＤＯ１１．１０細胞を生成することができる。Lenti-X発現ベクター（ｐＬＶＸ）は、Lenti-X HTXパッケージングミックスとLenti-X２９３ Ｔ細胞系中に同時形質移入してウイルスを生成することができる。ＤＯ１１．１０細胞系は、Lenti-X HTXパッケージングシステムを用いて産生されたレンチウイルス粒子を使用して形質導入することができる。
ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイに関して、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現させるためのヒトＰＤ－Ｌ１を含有するレンチウイルスベクターにより形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ細胞、例えば、ＬＫ３５．２ Ｂ細胞リンパ腫細胞（ATCC、HB-98）は、レンチウイルス形質導入法を使用して、例えば、Lenti-X HTXパッケージングシステムを使用して調製することができる。ヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡを含有するＬｅｎｔｉ－Ｘ発現ベクター（ｐＬＶＸ）は、Lenti-X HTXパッケージングミックスとLenti-X２９３ Ｔ細胞系中に同時形質移入してウイルスを生成することができる。Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞系は、Lenti-X HTXパッケージングシステムを用いて産生されたレンチウイルスベクターを使用して形質導入することができる。
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーが本明細書においてｍＡｂ２とも称される完全免疫グロブリン分子の形態である場合、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）（ＳＥＢ）アッセイにおいて、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、又は２ｎＭ以下、好ましくは、２ｎＭ以下のＥＣ５０を有し得る。
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーがＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ２ドメインのＮ末端において局在するトランケート免疫グロブリンヒンジ領域からなるＦｃａｂの形態である場合、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）（ＳＥＢ）アッセイにおいて、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、又は０．２ｎＭ以下、好ましくは、０．２ｎＭ以下のＥＣ５０を有し得る。
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）は、超抗原であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のｖβ鎖に結合し、Ｔ細胞の非特異的活性化及びサイトカイン放出を引き起こす。Ｔ細胞活性化のために抗原特異的ＴＣＲの存在は要求されない。ＳＥＢアッセイは、刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生理学的レベルのチェックポイントインヒビターと使用し、そのアッセイを使用してＴ細胞活性化がヒト系において特異的結合メンバーにより向上されることを確認することができる。
ＳＥＢアッセイは、本明細書の実施例７に記載のＳＥＢアッセイであり得る。
例えば、ＳＥＢアッセイは以下を含み得る：
（ｉ）例えば、白血球コーン（leukocyte cone）からFicoll勾配分離によりＰＢＭＣを単離すること。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、例えば、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞単離キット（例えば、Miltenyi Biotec Ltd製、130-096-533）を使用して単離することができる。ヒトＴ－アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８Dynabeads（例えば、Life technologies製、11131D）を、ボルテックスに供することにより再懸濁させることができる。ビーズを無菌１５ｍｌチューブに移すことができ、１０％のＦＢＳ（例えば、Life Technologies製、10270106）及び１×ペニシリンストレプトマイシン（例えば、Life Technologies製、15140122）を有する１０ｍｌのＲＰＭＩ（例えば、Life Technologies製、61870044）を添加してDynabeadsを洗浄することができる。上清を廃棄することができる。１０％のＦＢＳ及び１×ペニシリンストレプトマイシン溶液及び５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ２（例えば、Peprotech製、200-02-50μg）を有するＲＰＭＩ中の１．０×１０６個の細胞／ｍｌにおける要求量のＣＤ４＋ Ｔ細胞（ビーズと細胞との比３：１）を、Ｔ７５フラスコ（例えば、Greiner Bio-one製、690195）に移し、３７℃＋５％のＣＯ２においてインキュベートすることができる。３日後、細胞を穏やかに再懸濁させ、計数することができる。新鮮培地（例えば、ＲＰＭＩ－１０％のＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１×＋５０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ２）を添加することにより、細胞密度を０．８から１×１０６個の細胞／ｍｌで維持することができる。７又は８日目、ＣＤ３／２８ビーズを除去することができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、１ｍｌの新鮮培地ＲＰＭＩ－１０％のＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１×と低減した１０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ２当たり１×１０６個の細胞において一晩レストさせることができる；
（ｉｉ）例えば、ヒト汎単球単離キット（例えば、Miltenyi Biotec Ltd製、130-096-537）を使用して、例えば、（ｉ）に記載の方法を使用してヒトＰＢＭＣから非付着単球を単離すること。単球は、例えば、ヒトＭｏ－ＤＣ分化培地（例えば、Miltenyi Biotec Ltd製、130-094-812）を使用してｉＤＣに分化させることができる；及び／又は
（ｉｉｉ）例えば、ＡＩＭ培地（例えば、Gibco製、12055-091）中の目的特異的結合メンバーの希釈物を調製すること。例えば、（ｉｉ）に記載のとおり調製されたＭｏｉＤＣを、同一ドナーからのＴ細胞と１：１０の比において混合することができる（２×１０５個の細胞／ｍｌにおける５ｍｌのｉＤＣを、２×１０６個の細胞／ｍｌにおける５ｍｌのＴ細胞と合わせることができる）。２０μｌの０．１μｇ／ｍｌにおけるＳＥＢ（例えば、Sigma製、S4881）を、１０ｍｌの細胞に添加することができる。丸底９６ウェルプレート中で、１００μｌの細胞／ＳＥＢ混合物を１００μｌの特異的結合メンバー希釈物に添加することができ、ウェル当たり２００μｌの培地（例えば、ＡＩＭ培地）中で０．１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを用いて１０４個のｉＤＣ細胞と１０５個のＴ細胞との比を得る。細胞は、３７℃、５％のＣＯ２において４日間インキュベートすることができる。ＥＬＩＳＡ、例えば、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキット（例えば、R&D Systems製、PDIF50）を使用して上清をＩＦＮγについてアッセイすることができる。アッセイは、ＰＢＡ（ＤＰＢＳ、２％のＢＳＡ（例えば、Sigma製、A7906-100G））により１：３０希釈された上清を使用して実施することができる。ヒトＩＦＮγの濃度を、特異的結合メンバーの対数濃度に対してプロットすることができる。得られた曲線は、対数（アゴニスト）対応答の式を使用して、例えば、GraphPad Prismソフトウェアにおいてフィットさせることができる。
特異的結合メンバーは、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１３ｎＭ以下、１２ｎＭ以下、又は１１ｎＭ以下、好ましくは、１１ｎＭ以下のＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１との間の相互作用を遮断し得る。
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーが本明細書においてｍＡｂ２とも称される完全免疫グロブリン分子の形態である場合、５０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、又は３０ｎＭ以下、好ましくは、３０ｎＭ以下のＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１とＣＤ８０との間、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＣＤ８０との間の相互作用を遮断し得る。
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーがＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ２ドメインのＮ末端において局在するトランケート免疫グロブリンヒンジ領域からなるＦｃａｂの形態である場合、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１３ｎＭ以下、１２ｎＭ以下、１１ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下、好ましくは、１０ｎＭ以下のＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１とＣＤ８０との間、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＣＤ８０との間の相互作用を遮断し得る。
ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１又はヒトＣＤ８０との間の相互作用を遮断する本発明の特異的結合メンバーの能力を試験する方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１又はヒトＣＤ８０との間の相互作用の遮断は、細胞ベース受容体結合アッセイを使用して試験することができる。２μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１を、４００ｎＭから３ｐＭに及ぶ力価測定濃度のＦｃａｂと１時間インキュベートすることができる。ミックスを、ヒトＰＤ－１又はヒトＣＤ８０のいずれかを過剰発現する細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞とさらに１時間インキュベートすることができる。細胞上の結合ビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１のレベルは、ストレプトアビジン６４７を使用して検出することができ、蛍光レベルは、ＦＡＣＳを使用して計測することができ、検出される蛍光のレベルは、細胞上で発現されるＰＤ－１又はヒトＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１の結合のレベルを示す。
特異的結合メンバーは、６０℃以上、６１℃以上、６２℃以上、６３℃以上、６４℃以上、６５℃以上、６６℃以上、６７℃以上、又は６８℃以上、好ましくは、６５℃以上、６６℃以上、６７℃以上、又は６８℃以上、より好ましくは、６６℃以上、６７℃以上、又は６８℃以上の融解温度を有し得る。融解温度を計測する場合、特異的結合メンバーは、本明細書においてｍＡｂ２とも称される完全免疫グロブリン分子の形態であり得る。
本発明の特異的結合メンバーの融解温度は、公知の方法により計測することができる。例えば、本発明の特異的結合メンバーの融解温度は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）により計測することができる。
治療抗体の凝集は、薬物ポテンシーの損失をもたらし得、不要な免疫原性を引き起こし得る。したがって、この目的のため、凝集をほとんど示さず、又は凝集を示さない抗体が好ましい。特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーが水溶液中に存在する場合、５％、４％、又は３％、好ましくは、３％以下の凝集を示し得る。水溶液中の特異的結合メンバーの凝集は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して決定することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、生物活性剤、治療剤又は検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。この場合、特異的結合メンバーは、コンジュゲートと称することができる。このようなコンジュゲートは、本明細書に記載の疾患及び病態の治療において適用される。
例えば、特異的結合メンバーは、免疫系モジュレーター、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。免疫系モジュレーター又は細胞傷害性分子は、サイトカインであり得る。免疫系モジュレーターは、細胞表面受容体、又は生物学的に活性なその断片、例えば、受容体のリガンド結合ドメインを含み、若しくはそれからなる断片であり得る。或いは、免疫系モジュレーターは、細胞表面受容体のリガンド、例えば、ぺプチドリガンド、又はリガンドの生物学的に活性な断片、例えば、リガンドの受容体結合ドメインを含み、若しくはそれからなる断片であり得る。検出可能な標識は、放射性同位体、例えば、非治療放射性同位体であり得る。
特異的結合メンバーは、ぺプチド結合又はリンカーにより、生物活性剤、治療剤又は検出可能な標識に、すなわち、前記生物活性剤、治療剤又は検出可能な標識及び特異的結合メンバー又はそのポリペプチド鎖構成成分を含む融合ポリペプチド内でコンジュゲートさせることができる。他のコンジュゲーションの手段としては、二官能性試薬（例えば、DOUBLE-REAGENTS（商標）Cross-linking Reagents Selection Guide、Pierceを用いる）を使用する化学的コンジュゲーション、特に架橋が挙げられる。
したがって、特異的結合メンバー及び生物活性剤、治療剤又は検出可能な標識は、例えば、任意の好適な化学結合を介して、又はリンカー、例えば、ぺプチドリンカーを介して互いに直接連結させることができる。
ぺプチドリンカーは、短鎖（アミノ酸の２から２０、好ましくは、２から１５個の残基ストレッチ）であり得る。ぺプチドリンカー配列の好適な例は、当技術分野において公知である。１つ以上の異なるリンカーを使用することができる。リンカーは、約５アミノ酸長であり得る。
化学結合は、例えば、共有又はイオン結合であり得る。共有結合の例としては、ぺプチド結合（アミド結合）及びジスルフィド結合が挙げられる。例えば、特異的結合メンバー及び生物活性剤、治療剤、又は検出可能な標識（診断剤）は、例えば、ぺプチド結合（アミド結合）により共有結合させることができる。生物活性剤、治療剤、又は検出可能な標識は、共有結合、例えば、ぺプチド結合（アミド結合）により、特異的結合メンバーのＣ末端又はＮ末端に直接連結させることができる。特定の実施形態において、生物活性剤、治療剤、又は検出可能な標識は、ぺプチド結合（アミド結合）により、特異的結合メンバーのＮ末端に直接連結している。したがって、特異的結合メンバー及び生物活性剤、治療剤、又は検出可能な標識（診断剤）は、単鎖ポリペプチドとして産生する（分泌させる）ことができる。
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする単離核酸を提供する。当業者は、当技術分野において周知の方法を使用してそのような核酸の調製にあたり困難を有さない。単離核酸を使用して、例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞中での発現により本発明の特異的結合メンバーを発現させることができる。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ又はＮＳ０細胞である。核酸は、一般に、発現用組換えベクターの形態で提供される。
このような核酸及びベクターを含むインビトロ宿主細胞は、続いて細胞培養物から精製し、任意で、医薬組成物中に配合することができる本発明の特異的結合メンバーを発現させるためのそれらの使用と同様、本発明の一部である。したがって、本発明は、本発明の特異的結合メンバーを産生する方法であって、特異的結合メンバーの産生のための条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することを含む方法をさらに提供する。上記の好適な宿主細胞を培養する方法は、当技術分野において周知である。方法は、特異的結合メンバーを単離し、及び／又は精製することをさらに含み得る。方法は、特異的結合メンバーを医薬組成物中に、任意で、下記の薬学的に許容可能な賦形剤又は他の物質と配合することも含み得る。
ＰＤ－Ｌ１は、多くの癌細胞、及び免疫系の細胞上で発現されることが公知である。
したがって、本発明の特異的結合メンバーは、患者における癌を治療する方法において使用することができる。患者は、好ましくは、ヒト患者である。
本発明の特異的結合メンバーを使用して治療することができる癌の細胞は、例えば、それらの細胞表面上でＰＤ－Ｌ１を発現し得る。一実施形態において、治療することができる癌の細胞は、例えば、それらの細胞表面上でＰＤ－Ｌ１を発現することが決定されている。細胞表面上の抗原の発現を決定する方法は当技術分野において公知であり、それとしては、例えば、フローサイトメトリーが挙げられる。
抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＰＤ－１抗体を使用する種々のタイプの癌に対する治療は、臨床試験において調査されており、有望な結果を示している。これらとしては、固形腫瘍、例えば、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、線維肉腫、腎細胞癌、黒色腫（進行性及び転移性黒色腫）、膵臓癌、乳癌、多形性膠芽腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、胃癌（stomach cancer）（胃癌（gastric cancer））、膀胱癌、子宮頸癌（cervical cancer）、子宮癌（子宮内膜癌、子宮頸癌（uterine cervical cancer））、外陰癌、精巣癌、陰茎癌、食道癌、肝細胞癌、鼻咽頭癌、メルケル細胞癌、中皮腫、ＤＮＡミスマッチ修復欠損結腸直腸癌、ＤＮＡミスマッチ修復欠損子宮内膜癌、甲状腺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、又は慢性リンパ芽球性白血病）、多発性骨髄腫、及び末梢Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。したがって、本発明の特異的結合メンバーは、それらの癌の治療において適用され得る。これらの癌の腫瘍は公知であり、又はＰＤ－Ｌ１を発現する免疫細胞、例えば、ＴＩＬを含有することが予測される。
特に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用する黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部の扁平上皮癌）、中皮腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、卵巣癌、メルケル細胞癌、膵臓癌、黒色腫及び肝細胞癌の治療が臨床試験において調査されており、有望な結果を示している。したがって、本発明の抗体分子を使用して治療することができる癌は、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部の扁平上皮癌）、中皮腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、卵巣癌、メルケル細胞癌、膵臓癌、黒色腫、又は肝細胞癌であり得る。
本出願が特定のタイプの癌、例えば、乳癌を指す場合、これは、関連組織、この場合、乳房組織の悪性転化を指す。異なる組織、例えば、卵巣組織の悪性転化から生じる癌は、体内の別の位置、例えば、乳房における転移性病変をもたらし得るが、それに関しては本明細書において称される乳癌ではなく卵巣癌である。
癌は、原発又は続発癌であり得る。したがって、本発明の特異的結合メンバーは、患者における癌を治療する方法であって、癌は、原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である方法において使用することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、感染性疾患、例えば、ウイルス、細菌、真菌及び／又は寄生虫感染の治療において適用されることも予測される。好ましくは、感染性疾患は、ウイルス、細菌又は真菌疾患、より好ましくは、ウイルス又は細菌疾患、最も好ましくは、ウイルス疾患である。感染性疾患は、慢性でも急性でもよいが、好ましくは、慢性である。
本発明による特異的結合メンバーを用いて治療することができるウイルス疾患の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、並びにパピローマウイルス感染が挙げられる。
本発明による特異的結合メンバーを用いて治療することができる細菌疾患の例としては、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、グラム陰性細菌（例えば、アシネトバクター属（Acinetobacter）、クレビセラ属（Klebisella）、エンテロバクター属（Enterobacter））、グラム陽性細菌（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、及びリステリア属（Listeria）（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Listeriamonocytogenes））感染が挙げられる。
本発明による特異的結合メンバーを用いて治療することができる真菌疾患の例としては、アスペルギルス属（Aspergillus）及びカンジダ属（Candidia）感染が挙げられる。
本発明による特異的結合メンバーを用いて治療することができる寄生虫疾患の例としては、マラリア属（Malaria）、トキソプラズマ属（Toxoplasma）、及びリーシュマニア属（Leishmania）感染が挙げられる。
本発明の特異的結合メンバーは、炎症、炎症と関連する疾患及び病態、並びに炎症性疾患、例えば、脳卒中、脳卒中関連炎症、及び血管炎症又は血管炎、例えば、中及び大血管血管炎、又は中枢及び／又は末梢神経系の血管炎の治療において適用されることも予測される。
本発明の特異的結合メンバーは、患者、好ましくは、ヒト患者の治療の方法において使用されるように設計される。特異的結合メンバーは、通常、特異的結合メンバーに加え、少なくとも１つの構成成分、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る医薬組成物の形態で投与される。例えば、本発明の医薬組成物は、活性成分に加え、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨害すべきでない。担体又は他の材料の正確な性質は、注射、例えば、静脈内又は皮下注射によるものであり得る投与経路に依存する。特異的結合メンバーは、静脈内、又は皮下投与することができる。
液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油を含む。生理食塩溶液、デキストロース若しくは他の糖溶液又はグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールを含めることができる。
静脈内注射のため、又は患部における注射のため、特異的結合メンバー、又は特異的結合メンバーを含む医薬組成物は、好ましくは、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸化リンゲル注射液を使用して好適な溶液を十分に調製することができる。適宜、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／又は他の添加剤を用いることができる。医薬組成物を調製する多くの方法が当業者に公知である。例えば、Robinson ed.,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978参照。
本発明による特異的結合メンバーを含む組成物は、治療すべき病態に応じて単独で又は他の治療との組合せで、同時に若しくは連続的に、又は別の１つ若しくは複数の治療剤との組合せ製剤として投与することができる。例えば、本発明の特異的結合メンバーは、治療すべき疾患、例えば、上記の癌のための既存の治療剤との組合せで投与することができる。例えば、本発明の特異的結合メンバーは、患者に、第２の抗癌療法、例えば、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種（癌ワクチン接種とも称される）、放射線療法、免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、又はホルモン療法との組合せで投与することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、抗癌療法、例えば、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線療法におけるアジュバントとして作用し得ることが予測される。理論により拘束されるものではないが、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線療法の一部としての患者への特異的結合メンバーの投与は、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線療法を単独で用いて達成されるものよりも癌関連抗原ＰＤ－Ｌ１に対する大きい免疫応答をトリガーすることが考えられる。
したがって、患者における癌を治療する方法は、患者に、治療有効量の本発明による特異的結合メンバーを、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はホルモン療法のための薬剤との組合せで投与することを含み得る。化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はホルモン療法のための薬剤は、好ましくは、当該癌のための化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はホルモン療法のための薬剤、すなわち、当該癌の治療において有効であることが示されている化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はホルモン療法のための薬剤である。当該癌に有効であることが示されている好適な化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はホルモン療法のための薬剤の選択は、十分に担当医の能力の範囲内である。
例えば、方法が、患者に治療有効量の本発明による特異的結合メンバーを化学療法剤との組合せで投与することを含む場合、化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ＿ＲＡＦ酵素阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、サリドマイド誘導体、抗腫瘍化学療法剤などからなる群から選択することができる。タキサンとしては、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ－パクリタキセルが挙げられ；細胞傷害性抗生物質としては、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン及びバルルビシンが挙げられ；チロシンキナーゼ阻害剤としては、スニチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ及びトラメチニブが挙げられ；ＰＡＲＰ阻害剤としては、ピラパリブが挙げられ；Ｂ－Ｒａｆ酵素阻害剤としては、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられ；アルキル化剤としては、ダカルバジン、シクロホスファミド、テモゾロミドが挙げられ；白金類似体としては、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられ；ヌクレオシド類似体としては、ゲムシタビン及びアザシチジンが挙げられ；抗腫瘍剤としては、フルダラビンが挙げられる。本発明における使用に好適な他の化学療法剤としては、メトトレキサート、デファクチニブ、エンチノスタット、ペメトレキセド、カペシタビン、エリブリン、イリノテカン、フルオロウラシル、及びビンブラスチンが挙げられる。
癌の治療のためのワクチン接種方針は、診療所で実施されており、科学文献内でも詳細に考察されている（例えば、Rosenberg,S.,2000）。これは主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を用いて又は用いずに自己又は同種異系癌細胞をワクチン接種法として使用することにより、自己又は同種異系癌細胞により発現される種々の細胞マーカーに対して免疫系を応答させるように促す方針を含む。ＧＭ－ＣＳＦは、抗原提示において強力な応答を誘発し、前記方針と用いられる場合に特に十分に機能する。
方法が患者に治療有効量の本発明による特異的結合メンバーを免疫療法剤との組合せで投与することを含む場合、免疫療法剤は、チェックポイントインヒビター、共刺激分子又は可溶性因子に結合する抗体、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７３、ＣＳＦ－１Ｒ、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＴＧＦＢ、ＩＬ－１０、ＣＳＦ－１に結合する抗体からなる群から選択することができる。或いは、免疫療法剤は、ＩＬ－２、コンジュゲートＩＬ２のプロドラッグ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択される１つ以上のサイトカイン又はサイトカインベース治療剤であり得る。
投与は、「治療有効量」であり得、これは、患者に対する利益を示すために十分な量である。このような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。したがって、規定の疾患の「治療」は、少なくとも１つの症状の改善を指す。投与される実際量、並びに投与頻度及びタイムコースは、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の患者、個々の患者の臨床的病態、障害の原因、組成物の送達部位、特異的結合メンバーのタイプ、投与方法、投与のスケジューリング並びに医師に公知の他の因子に依存する。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、総合診療医及び他の医師の責任の範囲内であり、治療される疾患の症状及び／又は進行の重症度に依存し得る。特異的結合メンバーの適切な用量は、当技術分野において周知である（Ledermann et al.,1991；及びBagshawe et al.,1991）。投与される特異的結合メンバーに適切であると本明細書において、又はPhysician’s Desk Reference(2003)に示される具体的な投与量を使用することができる。特異的結合メンバーの治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性及びインビボ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿する方法は、公知である。正確な用量は、多数の因子、例として、治療すべき区域のサイズ及び位置、並びに特異的結合メンバーの正確な性質に依存する。治療は、医師の裁量において毎日、週２回、週１回又は月１回の間隔において繰り返すことができる。治療は、術前及び／又は術後に与えることができ、手術による治療の解剖学的部位において直接投与し、又は施与することができる。
本発明のさらなる態様及び実施形態は、本開示、例として、以下の実験的例示を考慮して当業者に明らかである。
「及び／又は」は、本明細書において使用される場合、他方の有無にかかわらず２つの規定の特徴又は構成成分のそれぞれの具体的な開示として解釈すべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個別的に記載されるのと同様、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈すべきである。
文脈が特に示さない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明のいかなる特定の態様にも実施形態にも限定されるものではなく、記載される全ての態様及び実施形態に等しく当てはまる。
本発明のある態様及び実施形態は、目下、例として、及び上記の図面を参照して説明される。
実施例
実施例１－抗ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂのナイーブ選択
１．１ タンパク質ビオチン化
Ｃ末端ヒトＩｇＧタグを有する組換えヒトＰＤ－Ｌ１（R&D Systems、157-B7）、ヒトＰＤ－１（R&D Systems、1086-PD）及びマウスＰＤ－Ｌ１（R&D Systems、1019-B7）を購入し、Lightning Link Type Aビオチン化キット（Innova Biosciences、370-0010）を使用してビオチン化した。簡潔に述べると、１００μｇの凍結乾燥タンパク質を１００μｌのＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に再構成し、１０μｌのモディファイヤー試薬を希釈タンパク質に添加し、穏やかに混合した。溶液をLightning-Linkミックスバイアルに添加し、穏やかに再懸濁させ、混合物を室温において一晩インキュベートした。クエンチャー溶液（１０μｌ）を添加し、室温において３０分間インキュベートしてからビオチン化タンパク質を－８０℃において１０μｌのアリコート中で貯蔵した。
１．２ ファージライブラリー
ＡＢ（残基１１から１８）及びＥＦ（残基９２から１０１）ループ内の無作為化を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（ＩＭＧＴナンバリング１．４から１３０）をディスプレイするナイーブファージライブラリーを、上記のＰＤ－Ｌ１抗原を用いる選択に使用した。ストレプトアビジンDynabeads（Thermo Fisher、11205D）及びDynabeadsにカップリングしているNeutravidin結合タンパク質（Thermo Fisher、31000）を使用してライブラリーを３回のラウンドで選択してビオチン化ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃに結合しているファージを単離した。さらに、過剰のヒト血漿のＩｇＧ Ｆｃ断片をそれぞれの選択ステップに添加してＦｃバインダーの単離を回避した。
アウトプットをＥＬＩＳＡによりＰＤ－Ｌ１への結合についてスクリーニングし、陽性バインダーをサブクローニングし、EasySelect Pichia発現キット（Life Technologies、K1740-01）を使用してピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で可溶性Ｆｃａｂ（トランケートヒンジを含有）として発現させた。選択された３０個のユニークＦｃａｂクローンのうち、１８個のクローンが、ファージから可溶性発現プラットフォームに移された場合に可溶性タンパク質として発現された。
１．３ ＥＬＩＳＡベース遮断アッセイ
ヒトＰＤ－Ｌ１ ＦｃとＰＤ－１又はＣＤ８０との間の相互作用を遮断するヒトＰＤ－Ｌ１結合Ｆｃａｂの能力を、ＥＬＩＳＡベース受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）において組換えビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１（実施例１．１に記載）及び組換えヒトＰＤ－１ Ｆｃ（R&D Systems、1086-PD）又はＣＤ８０ Ｆｃ（R&D Systems、140-B1）を使用して試験した。
簡潔に述べると、組換えヒトＰＤ－１ Ｆｃ又はＣＤ８０ ＦｃをMaxisorpプレート（Thermo Scientific、439454）上にそれぞれ０．５又は１．０μｇ／ｍｌにおいてコーティングした。プレートを４℃において一晩インキュベートし、ＰＢＳ中で１回洗浄し、続いて１％のTweenを含有する３００μｌのＰＢＳにより室温において２時間ブロッキングした。関連濃度のＦｃａｂ（０．５から５００ｎＭ、２倍希釈）、対照ＩｇＧ Ｆｃ（１０から１００００ｎＭ、２倍希釈）又は対照抗体（０．０１０から１０ｎＭ、２倍希釈）を、４５０ｒｐｍにおいて振盪させながら１００μｌのＰＢＳ中で２５０ｎｇ／μｌのビオチン化ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃと室温において１時間インキュベートした。対照ＩｇＧ Ｆｃを１００００ｎＭの濃度まで試験してあらゆる非特異的遮断活性を決定した。使用された対照ｍＡｂは、抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（MIH1、Affymetrix eBioscience、14-5983-82）及びＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（「Ｓ７０」）（米国特許出願公開第２０１３／００４５２０２Ａ１号）であった。
ブロッキング溶液を廃棄し、ビオチン化ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ／Ｆｃａｂ又は対照抗体ミックスをmixisorpプレートに添加し、４５０ｒｐｍにおいて振盪させながら室温において１時間インキュベートした。プレートを３００μｌのＰＢＳ／Tween０．０５％により３回洗浄し、次いで１×ＰＢＳにより３回洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしているストレプトアビジンをＰＢＳ中で１：１０００希釈し、１００μｌをウェルに添加し、４５０ｒｐｍにおいて振盪させながら４℃において１時間インキュベートした。プレートを３００μｌのＰＢＳ／Tween０．０５％により３回洗浄し、次いで１×ＰＢＳにより３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質（eBioscience、00-4201-56）をそれぞれのウェルに添加した。反応をＴＭＢの添加の２から１０分後に、５０μｌの１Ｍ硫酸溶液の添加により停止させた。ＯＤを、硫酸添加の３０分以内に９６ウェルプレートリーダーにおいて４５０から６３０ｎｍにおいて読み取り、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc.）を使用して分析した。
１８個のクローンを試験し、そのうちの３つ、ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３が、ヒトＰＤ－Ｌ１ ＦｃとＰＤ－１との間の相互作用を遮断し得た。これらのクローンについて、全用量応答ＲＢＡを実施し、ＣＤ８０とのＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するそれらの能力を分析した。ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３は、全て、ＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１相互作用及びＰＤ－Ｌ１：ＣＤ８０相互作用の両方に対する強力な遮断活性を示した（データ示さず）。
１．４ 組換えＰＤ－Ｌ１へのＦｃａｂの結合
ヒト及びマウスＰＤ－Ｌ１ ＦｃへのＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３の結合を、BIAcore 3000（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴により計測した。
簡潔に述べると、ストレプトアビジンセンサーチップ（GE Healthcare、BR100032）を使用してヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ（実施例１．１に記載）をフローセル２上にコーティングし、マウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ（実施例１．１に記載）をフローセル４上にコーティングし、フローセル１はコーティングせず、参照として使用した。ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ及びマウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃを約１００００ＲＵにおいてカップリングさせた。ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、BR100669）中で希釈されたＦｃａｂを、１０μＭ又は３．３μＭ及び３倍希釈において５分間インジェクトし、次いで緩衝液中で３分間解離させた。再生は要求されなかった。それというのも、Ｆｃａｂは緩衝液中で完全に解離したためである。BIAevaluation 3.2を使用して減算されたデータ（フローセル２－フローセル１又はフローセル４－フローセル１）を分析して結合を同定した。
結合データ（示さず）は、ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３がヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃに結合することを実証した。ＦＳ１７－１９は、マウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃに対して弱く交差反応性であるが、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３は交差反応性でないことも見出された。
１．５ ヒトＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１、マウスＰＤ－Ｌ１、ヒトＣＤ８０、マウスＣＤ８０及びヒトＰＤ－１を発現するＨＥＫ２９３細胞の開発
ヒト、マウス、及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１配列（配列番号６１、６２及び６３）を、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies）中にＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用してサブクローニングした。ヒト及びマウスＣＤ８０並びにヒトＰＤ－１（配列番号６５、６６及び６４）については、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用した。次いで、これらのベクターをFlp-In T-REx293細胞系（Life Technologies、R780-07）中にLipofectamine 2000（Life Technologies、11668-019）を使用して形質転換した。細胞を、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）及び１５μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ中で、安定的に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３から４週間増殖させた。これらのコロニーを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、D9891）の存在下で増幅させ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８０又はＰＤ－１の発現についてＰＥコンジュゲート抗ヒトＰＤ－Ｌ１（MIH1）抗体（BD Biosciences、557924）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＰＤ－Ｌ１（MIH5）抗体（BD Biosciences、558091）、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ８０抗体（L307.4、BD Biosciences 557227）、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＰＤ－１抗体（MIH4、BD Biosciences、557946）、又はＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（16-10A1、BD Biosciences、553768）を使用して試験した。細胞解離緩衝液を使用して細胞を剥離させ、ＰＢＳにより１回洗浄し、２×１０５個の細胞を９６ウェルプレートのウェル中でプレーティングし、次いでＰＢＳ中で１：２０希釈された抗体と４℃において１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いでAccuri C6サイトメーター（BD Biosciences）上で計測し、FlowJoXを使用してデータを分析した。ヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１、並びにヒトＣＤ８０、マウスＣＤ８０及びヒトＰＤ－１の発現を、それぞれの細胞系中で検出した。
１．６ 細胞ベース結合アッセイ
次いで、ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３ Ｆｃａｂを、ＨＥＫ２９３細胞により発現されるヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＣＤ８０、ヒトＰＤ－１、マウスＣＤ８０又はマウスＰＤ－Ｌ１への結合について試験した（これらの細胞系の産生に関する詳細については実施例１．５参照）。
簡潔に述べると、これらのタンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で増殖させ、細胞解離緩衝液（Life Technologies、13151-014）を使用して組織培養フラスコから剥離させ、Ｖ字底９６ウェルプレート中で２×１０５個の細胞／ウェルにおいて播種した。Ｆｃａｂを細胞と１００μｌの容量で１μＭにおいて４℃において１時間インキュベートした。ＰＥ又はＦＩＴＣコンジュゲート対照ｍＡｂを、１００μｌの容量中で製造業者により推奨される濃度において４℃において１時間添加した。実施例１．５において使用された抗体を、この実験において対照抗体として使用した。プレートを１５００ｒｐｍにおいて４℃において３分間遠心分離することにより、プレートをＰＢＳにより１回洗浄し、上清を除去した。二次抗体（ヤギ抗ヒトFc Alexa Fluor 488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中で１：１０００希釈し、１００μｌを細胞に４℃において３０分間添加した（プレートを暗所に保持した）。プレートをＰＢＳにより１回洗浄した後、前述と同様、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有する１００μｌのＰＢＳ中でペレットを再懸濁させた。プレートをAccuri C6サイトメーター（BD Bioscience）上で読み取り、FlowJoXを使用してデータを分析した。
ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３は、細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ヒトＰＤ－１にも、ヒトＣＤ８０にも、マウスＰＤ－Ｌ１にも、マウスＣＤ８０にも特異的に結合しないことが見出された。
１．７ 細胞ベース遮断アッセイ
細胞結合ＰＤ－１への組換えＰＤ－Ｌ１の結合を遮断するＦｃａｂ ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３の能力を、細胞ベース遮断アッセイにおいて決定した。
簡潔に述べると、ヒトＰＤ－１を発現するＨＥＫ２９３細胞（実施例１．５参照）を、Ｖ字底９６ウェルプレート中でウェル当たり１×１０５個の細胞においてＰＢＳ中で播種した。関連濃度のＦｃａｂ（７８から１００００ｎＭ、２倍希釈）、対照ＩｇＧ Ｆｃ（１００００ｎＭ）又は対照抗体（５００ｎＭ）を、４５０ｒｐｍにおいて振盪させながら、１００μｌの１×ＰＢＳ中で２５０ｎｇ／μｌのビオチン化ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃと室温において１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（ＭＩＨ１）を対照として使用した。プレートを１５００ｒｐｍにおいて４℃において３分間遠心分離して細胞をペレット化した。ＰＢＳを廃棄し、プレインキュベートされたＦｃａｂ又は対照抗体／ビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ混合物をウェルに４℃において１時間添加した。プレートを１５００ｒｐｍにおいて４℃において３分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ中で再懸濁させた。Alexa 647にコンジュゲートしているストレプトアビジンをＰＢＳ中で１：１０００希釈し、１００μｌをウェルに４℃において３０分間添加した。既に実施したとおり、プレートを遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ中で再懸濁させた。プレートをAccuri C6サイトメーター（BD Bioscience）上で読み取り、FlowJoXを使用してデータを分析した。
ＥＬＩＳＡベース遮断アッセイの結果と一致して、ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３は、試験濃度において強力な遮断活性を示した。ＦｃａｂのＦＳ１７－１９及びＦＳ１７－３３は、ＦＳ１７－２６よりも高い遮断活性を示し、したがって、それらを親和性成熟のために選択した。
１．８ ナイーブ選択手順のまとめ
ナイーブファージライブラリーの初回スクリーンにより同定された３０個のＦｃａｂから、３つの抗ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂ（ＦＳ１７－１９、ＦＳ１７－２６及びＦＳ１７－３３）が、強力なＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０遮断活性を示した。ＦｃａｂのＦＳ１７－１９及びＦＳ１７－３３の両方が、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－２６よりも、ＥＬＩＳＡアッセイ及び細胞ベースアッセイの両方で高い遮断活性、並びに組換え及び細胞表面ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃへの特異的結合を示し、したがって、以下の実施例２に記載のさらなる親和性成熟のために選択した。
実施例２－実施例１において同定されたＦｃａｂクローンの親和性成熟及び機能的改善
２．１ Ｆｃａｂ ＦＳ１７－１９の親和性成熟及び機能的改善
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－１９は、以下の２．２．１に記載のものと同様の方法を使用してＡＢ及びＥＦループのＮＮＫウォークから出発して複数ラウンドの親和性成熟を受けた。ＮＮＫウォークは、ＤＯ１１ Ｔ細胞活性化アッセイ（方法については実施例６参照）において計測した場合に極めて低い機能的活性を有するＦＳ１７－１９に由来するクローンをもたらし、ＥＣ５０は陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｓ１よりも３００倍低かった。機能的活性の改善に関して、以下の３．１に記載のものと同様の方法を使用してＡＢ、ＣＤ及びＥＦループの無作為化を実施した。ＡＢループ中の突然変異を含有するクローンは、ＤＯ１１ Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、対照抗体Ｓ１の８０倍以内まで改善された活性を示した。ＡＢループライブラリーから選択された１つのＦｃａｂクローンは、ＣＤ及びＥＦループのみにフォーカスするさらなるラウンドの親和性成熟を受けた。この成熟からのクローンは、前ラウンドのクローンに対して機能的活性のいかなる改善も示さなかった。
上記の広範な親和性成熟方針にもかかわらず、Ｄ０１１ Ｔ細胞活性化アッセイにおいて許容可能なレベルの機能的活性を有するＦＳ１７－１９系統からのクローンを同定することができず、したがって、この系統に対する作業は中止した。
２．２ Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３の親和性成熟及び機能的改善
抗ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３を、上記の実施例１に記載のとおりナイーブファージ選択から単離した。この試験の目的は、ＡＢからＥＦループまでＮＮＫウォークを実施することにより結合ループ中の個々の残基を無作為化することによりＦＳ１７－３３活性の改善を得ることであった。
２．２．１ 結合ループのＮＮＫウォーク
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断活性を改善したＦｃａｂ ＦＳ１７－３３中の突然変異を同定するため、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３のＡＢ又はＥＦループ中の１つのアミノ酸残基を一度に多様化させることにより倹約的突然変異誘発（parsimonious mutagenesis）ライブラリーを生成し、合計１２個の個々のライブラリーをもたらした（以下の表１参照）。このライブラリーは、目的位置における全ての考えられるアミノ酸を表すために低冗長性ＮＮＫコドンを用いて作製した。フォワード及びリバースプライマーをQuickchange Lightning部位特異的突然変異誘発キット（Agilent、200518）の指針に従って設計し、それを使用してライブラリーを作出した。
簡潔に述べると、ＦＳ１７－３３ Ｆｃａｂ配列（ＣＨ３、ＣＨ２及びトランケートヒンジ、さらにＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異を含有する）を、ｐＴＴ５発現ベクター（National Research Council of Canada）中にクローニングし、ベクターｐＴＴ５－ＦＳ１７－３３ＡＡをもたらした。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異の導入は、Ｆｃγ受容体結合を低減させることが公知である（Bruhns,P.,et al.,2009及びHezareh et al.,2001）。これを突然変異誘発ライブラリーのためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応物をＤｐｎＩにより３７℃において５分間処理していかなる親ＤＮＡも除去してから大腸菌（E.coli）（Mix and Go、Zymo research、T3009）中に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢプレート上でプレーティングした。翌日、形質転換体をピックし、シーケンシングして突然変異を確認した。
形質移入のためのＤＮＡは、標準的なＤＮＡ単離法を使用して調製し、倹約的ライブラリーをHEK Expi293細胞中で発現させた（ExpiFectamine 293形質移入キット（Life Technologies、A14524）を使用してExpi293F細胞（Life technologies、A14527）中にＤＮＡを形質移入した。形質移入ＨＥＫ上清中のＦｃａｂ濃度は、Octet（ForteBio）を使用してＢＬＩにより決定した。mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用してＦｃａｂを精製した。
続いて、ＨＥＫ２９３上清をＥＬＩＳＡベースＲＢＡにおいて２つの濃度（１０ｎＭ及び５０ｎＭ、方法については実施例１．３参照）において分析した。このアッセイにおいてＦＳ１７－３３タンパク質と比較して潜在的に改善されたＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断活性を有するＦｃａｂを選択し、シーケンシングした。これは、ＰＤ－Ｌ１への結合に重要なＦＳ１７－３３の配列中の特定の位置、すなわち、代替アミノ酸が好適な置換としてほとんど又は全く同定されなかった位置（表２参照）、及びいくつかの潜在的な代替アミノ酸が考えられる位置を同定した。いくつかの突然変異体を複数回同定し、アッセイ結果の信頼性を強化した。
ＥＬＩＳＡベース遮断アッセイにおいて最大活性を有する２７個のＦｃａｂを、発現させ、精製し、細胞ベース遮断アッセイ（方法については実施例２．２．２参照）において試験した。次いで、４つのＡＢループ及び３つのＥＦループクローンをスプライス重複伸長ＰＣＲによりシャッフルして新たな組合せを生成した（Horton et al.,2013）。シャッフルされたＦｃａｂをｐＴＴ５発現ベクター中にクローニングし、発現させ、ＥＬＩＳＡベース遮断（１．３に記載）及び細胞ベース遮断アッセイ（以下の２．２．２に記載）の両方においてＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断について再度試験した。
ループシャッフリング後に同定されたクローンの１つは、ＦＳ１７－３３－３７であり、それはＦＳ１７－３３と競合し、ＡＢループ中の単一変化（Ｓ１５Ｖ）及びＥＦループ中の単一変化（Ｇ９９Ｄ）を有した。クローンＦＳ１７－３３－３７のＡＢ及びＥＦループを表３に示す。
２．２．２ 遮断活性
実施例２．２．１において産生されたクローンの遮断活性を、細胞ベース遮断アッセイにおいてヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（細胞系の開発については１．５参照）を使用して分析した。簡潔に述べると、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞をＶ字底９６ウェルプレート中でウェル当たり１×１０５個の細胞においてＰＢＳ中で播種した。関連濃度のＦｃａｂ又は陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ ＹＷ２４３．５５．Ｓ１（「Ｓ１」）（米国特許出願公開第２０１３／００４５２０２Ａ１号）を、４５０ｒｐｍにおいて振盪させながら１００μｌの１×ＰＢＳ中で５００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＰＤ－１と４５分間インキュベートした。プレートを１５００ｒｐｍにおいて４℃において３分間遠心分離して細胞をペレット化した。ＰＢＳを廃棄し、プレインキュベートされたＦｃａｂ又は陽性対照／ビオチン化ｈＰＤ－１ Ｆｃ混合物をウェルに４℃において１時間添加した。プレートを１５００ｒｐｍにおいて４℃において３分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ中で再懸濁させた。Alexa 488にコンジュゲートしているストレプトアビジンをＰＢＳ中で１：１０００希釈し、１００μｌをウェルに４℃において３０分間添加した。プレートを１５００ｒｐｍにおいて４℃において３分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、ＤＡＰＩを有するＰＢＳ中で細胞を再懸濁させた。プレートをFACS Canto（BD Bioscience）上で読み取り、FlowJoXを使用してデータを分析した。
ＦＳ１７－３３と比較して改善された活性を有するＦｃａｂクローンを同定した。この一例を以下の表４に説明し、それは、親ＦＳ１７－３３クローンと比較したＦＳ１７－３３－３７についての改善された遮断活性を示す。この結合活性は、陽性対照Ｓ１ ｍＡｂと類似であった。
２．２．３ ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１への細胞結合
細胞表面ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１への結合を試験するため、細胞ベース遮断アッセイにおいて最大活性を有する１１個のＦｃａｂクローン、例として、ＦＳ１７－３３－３７を、ヒト又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（方法については実施例１．５参照）への結合について試験した。全てのＦｃａｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１への用量依存的結合を約５から１０ｎＭのＥＣ５０値で示し、カニクイザルＰＤ－Ｌ１には約１００から２００ｎＭのＥＣ５０値で結合した。
２．２．４ ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイ
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の阻害は、Ｔ細胞活性化の増加をもたらすことが公知である（Stewart et al.,2015）。ＦＳ１７－３３由来Ｆｃａｂは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の強力な遮断活性を示したため、それらは、Ｔ細胞活性化を増加させることも予測された。これを試験するため、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイを使用して２０個のＦＳ１７－３３由来Ｆｃａｂを試験し、陽性対照としての抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ Ｓ１と比較した。実施例６にアッセイをより詳細に記載する。
結果は、ＦＳ１７－３３由来クローンがこのアッセイにおいてＴ細胞活性化を向上させ得ることを示したが、活性は、抗ＰＤ－Ｌ１陽性対照抗体Ｓ１と比較して極めて弱かった（データ示さず）。これは、予想外であった。それというのも、試験されたＦｃａｂクローンのＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断活性の差は、陽性対照の３から１０倍以内であったためである。
２．２．５ ＦＳ１７－３３－３７の特徴付け
ＦｃａｂクローンＦＳ１７－３３－３７を、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるその低い／最小の非特異的活性（ＯＶＡぺプチドなし）に基づき、及びそのサイズ排除（ＳＥ）－ＨＰＬＣプロファイルに基づきさらなる親和性成熟のために選択した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルは、単量体タンパク質の割合及び溶出時間について評価し、野生型ＩｇＧ Ｆｃのものに近い溶出時間を有するクローンを優先した（図２参照）。細胞結合におけるＦＳ１７－３３－３７の全用量力価測定、細胞ベース遮断アッセイ及びＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイを実施してＦＳ１７－３３－３７をさらに特徴付けた（データ示さず）。結果は、ＦＳ１７－３３－３７が強力な細胞結合及び遮断活性を示すが、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいて弱い活性を示すことを裏付けた。
２．２．６ Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３の親和性成熟及び機能的改善のまとめ
ＦＳ１７－３３ ＦｃａｂのＮＮＫウォーク突然変異誘発は、抗ＰＤ－Ｌ１陽性対照Ｓ１ ｍＡｂと類似するレベルまで増加したＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１遮断活性を有する複数のクローンの同定をもたらした。さらに、抗ヒトＰＤ－Ｌ１結合ＦＳ１７－３３由来Ｆｃａｂは、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対して交差反応性であった。
しかしながら、驚くべきことに、Ｄ０１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＦＳ１７－３３系統の活性は、陽性対照Ｓ１ ｍＡｂと比較して極めて弱かった。このデータは、遮断データと不一致であると考えられた。Ｄ０１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイは遮断アッセイよりも生理学的に関連するポテンシーアッセイであるため、ＦＳ１７－３３由来Ｆｃａｂクローンは、陽性対照抗体と比較して機能的活性が１０００倍超低かった。
理論により拘束されるものではないが、ＦＳ１７－３３由来Ｆｃａｂは、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにより計測した場合に機能的活性をもたらすために十分高い親和性で単量体ＰＤ－Ｌ１に結合し得ないことが仮定された。遮断及び結合アッセイから得られた結果は、それらのアッセイにおいて使用された高レベルのヒトＰＤ－Ｌ１の結果であるアビディティ効果により影響を受け得た。
したがって、ＰＤ－Ｌ１についてのより高い親和性及び機能的活性を有するＦｃａｂを同定する目的で結合ループのより実質的な無作為化を実施した。ＦＳ１７－３３－３７を、この特異的活性及びＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイルに基づき、以下の実施例３に記載のさらなる親和性成熟のための親クローンとして選択した。
実施例３－ＦｃａｂクローンＦＳ１７－３３－３７の親和性成熟及び機能的改善
３．１ 親和性成熟
改善された活性を有するＦｃａｂを得るため、ＦＳ１７－３３－３７を親和性成熟させて最大の多様性を導入した。具体的には、ＦＳ１７－３３－３７ ＰＴＴ５プラスミドＤＮＡ（２．２．１参照）をテンプレートとして使用して無作為化ループを含有するライブラリーを調製した。ＡＢループ（残基１４から１８）、ＣＤループ（残基４５．１から７８）、及びＥＦループ（残基９２から９４、及び９７から１０１）の一部を、ＮＮＫプライマー（ＡＢループ）又はＥＬＬＡプライマー（ＣＤ及びＥＦループ）を使用して無作為化した。ＥＬＬＡプライマーは、それぞれのアミノ酸に使用されるコドン及びミックス内のそれらの相対的存在量を規定する。システインのみがミックスから排除され、バイアスはいかなる他のアミノ酸にも与えられなかった。個々のループライブラリー（ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループのそれぞれについて１つのライブラリー）は、親クローンＦＳ１７－３３－３７と比較してビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（ｈｉｓタグを含む）への改善された結合を有するＦｃａｂクローンを濃縮するための数ラウンドの選択を受けた。
ＰＤ－Ｌ１についての成熟クローンの親和性をさらに改善するため、それぞれの単一ループライブラリーからのアウトプットを非バイアス様式でシャッフルしてｈＰＤ－Ｌ１についての最大親和性を有するループ組合せを同定した。単一ループライブラリーのそれぞれからの選択細胞からＤＮＡを単離し、スプライス重複伸長ＰＣＲによりＤＮＡをシャッフルすることにより、選択からのアウトプットをシャッフルして非バイアスループ組換え物を生成した。次いで、このＤＮＡを使用して新たな酵母ディスプレイライブラリーを作出した。増幅させたＰＣＲ産物を酵母ベクター（pYD1dem、Invitrogen V835-01）とともに使用して酵母細胞（EBY100、Invitrogen V835-01）を形質転換した。次いで、シャッフルされたライブラリーは、単量体ＰＤ－Ｌ１についての最大親和性を有するクローンを濃縮するための複数ラウンドの選択を受けた。
選択Ｆｃａｂを、単量体及び二量体ＰＤ－Ｌ１抗原の両方の組換えタンパク質への結合についてスクリーニングした。単量体Ｈｉｓタグ化抗原（Acro biosystemsカタログ番号PD1-H5229）はPierce LC-LCビオチン化キット（Thermo Fisher Scientific 21338）を使用してビオチン化した一方、ビオチン化二量体抗原は市販品である（BPS Bioscience番号71105）。
スクリーニングから、１０４個のＦｃａｂクローンを可溶性発現のために選択した。可溶性ＦｃａｂをＨＥＫ細胞中でｐＴＴ５ Ｆｃａｂ発現ベクターから発現させ、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
３．２ ＳＥＣプロファイル
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施して３．１において同定された親和性成熟Ｆｃａｂのいずれかが凝集を示すか否かを決定した。Zorbax GF-250カラム（Agilent）を有するAgilent 1100シリーズＨＰＬＣを使用するＳＥ－ＨＰＬＣにより、全ての精製Ｆｃａｂを分析した。ＥＦループ中のＭＦＹＧＰモチーフを含有する全てのクローンは、過剰の凝集を示し、又はカラムに全く流入しなかった。結果として、これらのクローンを好適な候補Ｆｃａｂであるとみなさず、さらに試験しなかった。残りの４０個のクローンは凝集ピークを示さなかったが、それらはスプリットピーク又はショルダーを有した。例えば、図２に示されるとおり、クローンＦＳ１７－３３－１１６は親ＦＳ１７－３３－３７クローン（Ａ）に存在しないスプリットピーク（Ｂ）を示した。これらの逸脱の潜在的な原因は後に考察するが、それらのＦｃａｂクローンを候補選択プロセスから除外する理由とみなさなかった。
３．３ 発現Ｆｃａｂのオフ速度スクリーニング
ＨＥＫ細胞中での可溶性発現後、単量体Ｈｉｓタグ化抗原を使用する選択からのＦｃａｂを、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合した場合のそれらのオフ速度についてBIAcoreを使用してスクリーニングした。簡潔に述べると、ビオチン化抗原をチップ上に１０μｇ／ｍＬにおいて５８５ＲＵまでコーティングし、発現クローンからの上清をチップ上で３０μＬ／分において流動させた。このアッセイは、単量体及び二量体ＰＤ－Ｌ１抗原の両方を用いて実施した。解離を６分間実施した。BIAevaluateソフトウェアを使用して分析を実施した。曲線をブランクフローセルから、及びＦｃａｂを用いないランから二重減算した。次いで、曲線を比較のためにアラインし、正規化した。ＰＤ－Ｌ１に結合した場合により遅いオフ速度を有するクローンは、ＰＤ－Ｌ１のそのリガンドへの結合の連続的な遮断に起因して向上したＴ細胞活性化活性を有することが仮定された。試験された４０個のＦｃａｂクローンの３３個は、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合に親クローンＦＳ１７－３３－３７と比較して有意に改善された（より遅い）解離（オフ）速度を示し、以下の３．４に記載のさらなる機能的スクリーニングのために選択した。
３．４ 機能的スクリーニング
３．１に記載の親和性成熟が機能的活性の改善をもたらしたか否かを決定するため、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイを使用して３．３において同定された３３個のＦｃａｂクローンを活性について試験し、陽性対照としての抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｓ７０と比較した（実験詳細については実施例６．１参照）。それぞれのＦｃａｂの力価測定を使用してこのアッセイにおけるそれぞれのＦｃａｂについてのＥＣ５０値を計算して比較を容易にした。５つのクローン（ＦＳ１７－３３－８５、ＦＳ１７－３３－８７、ＦＳ１７－３３－１１４及びＦＳ１７－３３－１１６）は全て、０．２８から０．５ｎＭのＥＣ５０値を有し、それは陽性対照Ｓ７０抗体と同等である。
クローンＦＳ１７－３３－８５、ＦＳ１７－３３－８７、ＦＳ１７－３３－１１４及びＦＳ１７－３３－１１６は、１又は２つのアミノ酸差異のみを有する極めて類似の配列を有し、その差異はＡＢループにもＣＤループにも存在しない（表５参照、表はそれらのクローン間の配列の差異を同定し、それらの全てはＥＦループ又はフレームワーク領域中に局在する）。驚くべきことに、シャッフルライブラリー（３．１参照）からの全てのクローン中に存在するＡＢループ配列は、個々のＡＢループライブラリーのスクリーニングにおいて同定されず、アミノ酸欠失を含有し、その結果、残基１４から１８のＡＢループ配列は、５ではなく４アミノ酸長にすぎなかった。欠失の正確な局在は、不明であった。ＡＢループの１７及び１８位における残基を別のアミノ酸により置換すると、ＦｃａｂがＰＤ－Ｌ１に結合した場合にオフ速度の有意な悪化（より速い）をもたらし得たため（以下の表９Ａ参照）、欠失はＡＢループの残基１４、１５又は１６のいずれかにおいて局在しなければならなかった。欠失は、偶発的にトランケートされた突然変異誘発プライマーから生じるシャッフルライブラリーにおけるアーティファクトであると考えられる。ループ領域中のこのような欠失を含むＦｃａｂクローンは、通常、選択プロセスの間に除外される。それというのも、欠失は、ほとんど、抗原結合活性を保持するＦｃａｂをもたらさないためである。欠失を有するＡＢ配列はＡＢクローンのスクリーニングから同定されなかったが、この配列は、選択からのアウトプットプール中に希少クローン又はより低親和性のバインダーとして存在したはずである。しかしながら、このトランケートＡＢ配列を他のループとシャッフルした場合、それは、ドミナントＡＢループになり、新たなＣＤループ配列を含有するＦｃａｂに関してシャッフルされたＦｃａｂクローンの抗原結合活性及び／又は構造へのこの欠失の強力な寄与を示唆した。ＡＢループ中のそのような欠失を含むＦｃａｂクローンは、ＡＢループ選択から同定された最良の配列をＣＤループ選択からの最良の配列と組み合わせる、より定向のシャッフルアプローチが実行された場合に同定されなかった。野生型Ｆｃａｂ配列と比較した代表的なＦＳ１７－３３－１１６クローンのＡＢループ中の欠失を、図１に示す。さらに、以下の４．３により詳細に記載するとおり、ＡＢループ中のこの欠失残基の復元は、結合親和性の有意な損失を生じさせた。したがって、ＡＢループ中のこの欠失の存在は、ＰＤ－Ｌ１へのＦｃａｂの結合に重要であった。
３．５ Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６のさらなる特徴付け
３．４において同定されたＦｃａｂクローンの全てが極めて類似の配列を含有したため、代表的なクローン（ＦＳ１７－３３－１１６）をさらなる特徴付けのために選択した。表５に列記される他のＦｃａｂクローンのいずれも、それらのＦｃａｂクローンの全てがＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいて陽性対照Ｓ７０抗体のものと同等のＥＣ５０を有したことを考慮すると、さらなる特徴付けのために同等に選択することができた。Biacoreを使用して、Ｆｃａｂを捕捉するためのプロテインＡを用いてＰＤ－Ｌ１についてのＦＳ１７－３３－１１６の親和性を計測した。単量体ＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓヒト抗原を、物質輸送限界を最小化するための高い流量における力価測定濃度においてチップ上で流動させた。１：１フィッティング分析を使用してＫＤを計測し、屈折率補正なしで、Ｒｍａｘをローカルに設定した。ＦｃａｂクローンＦＳ１７－３３－１１６は、親クローンＦＳ１７－３３－３７と比較して親和性の強力な改善、並びに陽性対照抗体Ｓ７０と比較して改善された親和性を示した（表６参照）。これは主に、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合のＦｃａｂのより遅いオフ速度に起因する。
クローンＦＳ１７－３３－１１６のＰＤ－Ｌ１についての特異性を試験するため、ＰＤ－１（R&D systems 1086-PD）及びＰＤ－Ｌ２（R&D systems 1224-PL）をBiacoreチップ上にＰＤ－Ｌ１とともにコーティングした。次いで、Ｆｃａｂをチップ上で１０００倍濃度範囲において流動させた。それらの濃度においてはＰＤ－１への結合もＰＤ－Ｌ２への結合も観察されなかった。しかしながら、ＦｃａｂはＰＤ－Ｌ１に結合した。これは、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６がＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することを示す。
ＦＳ１７－３３－１１６の機能的活性をさらに評価するため、ＦｃａｂをＳＥＢアッセイにおいて試験した（実験詳細については実施例７．１参照）。このアッセイは、患者から供与された細胞を使用するため、細胞は、内因性レベルのＰＤ－Ｌ１を発現している。これらの発現レベルは、ＤＯ１１．１０アッセイにおいて使用されるＬＫ３５．２細胞よりもかなり低い。ＳＥＢアッセイにおいて、ＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂは、陽性対照Ｓ７０抗体と、ポテンシー及び効力の両方で一致した（表７参照）。活性は、陰性対照として機能する抗ＦＩＴＣ抗体４４２０について見られなかった。Ｓ７０抗体が診療所において効力を有することが示されているため、ＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂが同様に臨床効力を有することが予測される。
３．６ ｍＡｂ２フォーマットのＦＳ１７－３３－１１６の構築及び発現
Ｆｃａｂは、慣用の免疫グロブリン分子中に取り込んで、Ｆｃａｂの取り込みの結果として免疫グロブリン分子のＣＤＲベース抗原結合部位及び免疫グロブリンの定常ドメイン中の追加の結合部位の両方を含む二重特異的抗体を提供することができる。このような分子は、ｍＡｂ２分子とも称される。「モック」ｍＡｂ２を調製することもできる。「モック」ｍＡｂ２は、目的のＦｃａｂが、「モック」ｍＡｂ２を使用すべき状況において結合することが予測されない抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子中に取り込まれたｍＡｂ２である。これは、Ｆｃａｂを、分子のＣＤＲベース抗原結合部位からのいかなる影響も受けずにインタクト免疫グロブリン分子と同等であるフォーマットで試験することを可能とする。
上記のＦＳ１７－３３－１１６抗ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂを含むＩｇＧ１からなる「モック」ｍＡｂ２を調製してｍＡｂ２フォーマットのこのＦｃａｂの特徴付けを可能とした。このモックｍＡｂ２は、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＦＳ１７－３３－１１６ ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの一部を、抗ＦＩＴＣ抗体４４２０のＣＨ３ドメインの対応する領域に代えて用いることにより調製し、抗体の重鎖のＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異も含んだ。抗体４４２０の重鎖及び軽鎖配列を、それぞれ配列番号５１及び５２に示す（Bedzyk,W.D.,et al.,1989及びBedzyk,W.D.,et al.,1990）。モックｍＡｂ２を、ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２と称した。モックｍＡｂ２は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中での一過的発現により産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
「モック」ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２を、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６と比較して所望の質が維持されることを確保した。ｍＡｂ２についてのＳＥＣプロファイルは、ｍＡｂ２がもはやスプリットピークもショルダーも有さないことを示した（図２Ｃ参照）。４４２０ ｍＡｂについて予測されるとおり、少量の凝集が観察された。それというのも、この抗体は凝集することが公知であるためである。次いで、ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２を結合及び機能的活性について試験した。
ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２を、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイ（方法については実施例６参照）において試験した。ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２は、ＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂと比較してこのアッセイにおける活性の降下を示した。この降下は有意であったが、小さかった。ＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２についてのＥＣ５０は、１ｎＭ未満のままであった。ＰＤ－Ｌ１についてのＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２及びＦＳ１７－３３－１１６の固有の親和性が同一であったため、ＤＯ１１．１０アッセイにおいてＦＳ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２について観察された活性降下の最も可能性が高い原因は、Ｓ１７－３３－１１６／４４２０ ｍＡｂ２と比較したＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂのより高いアビディティに起因したことが考えられる。ＳＥＣを使用して分析した場合、Ｆｃａｂはスプリットピークを示したが、ｍＡｂ２は示さなかったため、Ｆｃａｂは、細胞ベースアッセイ、例えば、ＤＯ１１．１０アッセイに関してアビディティを介してＦｃａｂの活性を増強し得る二量体を形成していたことが仮定される。これに対処するため、Beckman Optima XL-1装置を使用する分析的超遠心分離を介して分子を分析した。
この実験からのデータは、Ｆｃａｂについての２つのピーク及びｍＡｂ２についての単一ピークのみを示した。Ｆｃａｂについての計算質量は、第１のピークについての単量体及び第２のピークについての二量体と一致した。二量体化の量は濃度依存的であり、相互作用についてのＫＤは２μＭと推定された。この相互作用は弱いが、それらのデータは、Ｆｃａｂが細胞ベース機能アッセイにおいて自己相互作用を介して媒介される細胞表面上のアビディティを介して活性が増強された概念を支持する。さらに、陽性対照抗体Ｓ７０は、ＦＳ１７－３３－１１６と類似のＰＤ－Ｌ１についての固有の親和性及びＦＳ１７－３３－１１６と同等の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける活性を有した。抗体は二価であるため、一価Ｆａｂはアビディティの損失の結果としてｍＡｂ２と類似の活性を有することが仮定される。この仮定を試験するため、Ｓ７０ Ｆａｂアームを、ヒンジ上方のＦｃ部分から遠くで消化し、一価Ｆａｂドメインをもたらした。次いで、Ｆｃドメインを除去するためのプロテインＡ、酵素を除去するための抗ｈｉｓを使用してこれらのドメインを精製し、最後にＳＥＣに供して単量体分画を精製した。次いで、これらのＦａｂアームをＭＬＲアッセイにおいて試験し、このアッセイにおいてＦｃａｂとｍＡｂ２との間で観察された活性の降下と同等の活性の損失を示し、ＦｃａｂとｍＡｂ２との間の活性の低減がＦｃａｂのアビディティに起因したという仮定についての追加の支持を提供した。
３．７ ＦｃａｂクローンＦＳ１７－３３－３７の親和性成熟及び機能的改善のまとめ
ＦＳ１７－３３－３７の親和性成熟は、オフ速度及び機能的活性における有意な改善を有するＦｃａｂクローンを産生した。これらのクローンの１つ、ＦＳ１７－３３－１１６は、ＤＯ１１．１０及びＳＥＢアッセイの両方において臨床的に検証された陽性対照Ｓ７０抗体と類似の活性を示した。陽性対照ｍＡｂは診療所における効力を有することが示されているため、ＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂ及びこのＦｃａｂを含む分子、例えば、ｍＡｂ２分子も臨床効力を有することが予測される。
ＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂを「モック」ｍＡｂ２フォーマットにも挿入し、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいて計測した場合に活性のわずかな低減を伴うものの、Ｆｃａｂについて報告されたものと類似の結果が得られた。理論により拘束されるものではないが、Ｆｃａｂは、細胞ベースアッセイに関して自己会合し、二量体を形成するが、ｍＡｂ２は自己会合せず、二量体を形成しないこと、及びこれはＦＳ１７－３３－１１６のＦｃａｂとモックｍＡｂ２フォーマットとの間の活性の差を説明し得たことが考えられる。
実施例４－ＦｃａｂクローンＦＳ１７－３３－１１６のさらなる改善
実施例３に記載のＦＳ１７－３３－１１６ ＦｃａｂがＰＤ－Ｌ１についての高い親和性及びＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおける高い活性を示す一方、さらなる改善をＦｃａｂに行って潜在的な製造の配列負担を除去し、生物物理学的特性を改善することができることが考慮された。特に、ＦＳ１７－３３－１１６ Ｆｃａｂは、ＥＦループ中のメチオニンを含有し、小程度の二量体化を示した。したがって、これらの問題に対処するためにＦＳ１７－３３－１１６クローンをさらに遺伝子操作した。
４．１ メチオニン置換
メチオニンは、ナイーブ選択段階においてＦＳ１７－３３系統のＥＦループ中に現れた。これは配列負担であり得、この残基は、複数ラウンドの親和性成熟を介して保持されたため、活性を改善する置換を見出す可能性は、極めてわずかであった。代わりに、目的は、最小の活性の損失及びＰＤ－Ｌ１への得られるＦｃａｂの結合の悪化でメチオニンを置き換えることができる残基を見出すこととした。
ＦＳ１７－３３－１１６のＥＦループ中のＩＭＧＴのＭ９８位における縮重コドンＮＮＫを含有するプライマーを使用して部位特異的突然変異誘発を実施した。プライマーは、システイン及びグリシンをコードするコドンを含まなかった。それというのも、それらのアミノ酸も潜在的な配列負担とみなされるためである。
Ｍｅｔ置換クローンをＦｃａｂとして発現させ、オフ速度スクリーンにおいて試験してクローンＦＳ１７－３３－１１６と類似のヒトＰＤ－Ｌ１への結合キネティクスを有するクローンを同定した。この実験から、疎水性残基は、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合のＦｃａｂのオフ速度の最小の増加でＭｅｔと置き換わることが確認された（親クローンＦＳ１７－３３－１１６のオフ速度の２倍以内）。唯一の例外はプロリンであり、それは試験されたＦｃａｂクローンの全ての最速のオフ速度を示した。
次いで、Ｆｃａｂクローンの全てを、さらなる試験のためにプロテインＡカラム上で精製した。Ｆｃａｂクローンの１０個は、プロテインＡカラムから溶出せず、したがって、さらなる分析に含めなかった。これは、親クローンの２倍以内のオフ速度を示したメチオニンに代えてトリプトファンが用いられたＦｃａｂを含んだ。
次いで、精製ＦｃａｂクローンをＳＥＣカラム上に載せて凝集を評価した。この分析から、メチオニンがフェニルアラニン又はチロシンにより置換されたＦｃａｂは、カラム上の有意な凝集及び保持を示した。したがって、これらのクローンはさらなる分析から除外した。親クローンの２倍以内のオフ速度を有する３つのＦｃａｂクローンを同定した。これらは、９８位におけるメチオニンに代えてロイシン、イソロイシン又はバリンを含有した。これらは、それぞれＦｃａｂのＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２８８、及びＦＳ１７－３３－２９６であり、図１並びに以下の配列番号３１、２７及び３５に示される。
さらに、フレームワーク突然変異Ａ３８Ｖを野生型アラニンに復帰させてＦｃａｂの突然変異負荷を低減させたＦｃａｂクローンを調製した。Ａ３８Ｖ突然変異は、クローンＦＳ１７－３３－１１６中で観察されたが、類似の活性を有する同種クローンにおいて観察されなかった（表５参照）。ＦＳ１７－３３－２８９ Ｆｃａｂをベースにこの復帰突然変異を作製し、得られたＦｃａｂをＦＳ１７－３３－３３４と称した。ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループについての配列のまとめ並びにそれらのクローンについての３８位における残基を、図１に提供する。
次いで、ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２９６、及びＦＳ１７－３３－３３４を、ＰＤ－Ｌ１へのそれらの結合親和性、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する能力及びＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおける活性について、以下の実施例６及び７にさらに記載のとおり、Ｆｃａｂ及びモックｍＡｂ２フォーマット（モックｍＡｂ２の生成に関する詳細については４．２参照）の両方で試験した。
４．２ ｍＡｂ２フォーマットのＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２９６、ＦＳ１７－３３－３３４、ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１の構築及び発現
完全免疫グロブリン分子のフォーマットのＦｃａｂのＰＤ－Ｌ１結合親和性、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性、及びＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおける機能的活性を試験するため、Ｆｃａｂを含む種々のｍＡｂ２を下記のとおり構築し、発現させた。
４．２．１ 「モック」ｍＡｂ２構築及び発現
Ｆｃａｂ、例として、上記４．１に記載のＦａｃｂ ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２９６、ＦＳ１７－３３－３３４、並びに以下の４．３に記載のＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１を含むＩｇＧ１からなる「モック」ｍＡｂ２を調製してｍＡｂ２フォーマットのそれらのＦｃａｂの特徴付けを可能とした。これらのモックｍＡｂ２は、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＦｃａｂのＣＨ３ドメインの一部を、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｅｌＤ１．３のＣＨ３ドメインの対応領域に代えて用いることにより、抗体の重鎖のＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異あり又はなしのいずれかで調製した。ＬＡＬＡ突然変異を有する抗体ＨｅｌＤ１．３の重鎖及び軽鎖配列を、それぞれ配列番号５３及び５４に示す。ＨｅｌＤ１．３抗体の生成は、Tello et al.1993に記載されている。モックｍＡｂ２は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中での一過的発現により産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。産生されたモックｍＡｂ２を表８に列記する。
さらに、以下の４．３に記載のＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１抗ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂを含む「モック」ｍＡｂ２を、上記段落に記載のとおり調製したが、抗サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＨ糖タンパク質抗体ＭＳＬ１０９を使用した。ＭＳＬ１０９抗体の生成は、国際公開第１９９４／０１６７３０Ａ１号に記載されている。これらのｍＡｂ２は、ＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異ありで調製した。ＬＡＬＡ突然変異を有する抗体ＭＳＬ１０９の重鎖及び軽鎖配列を、配列番号５５及び５６に示す。ｍＡｂ２は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中での一過的発現により産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
４．２．２ 抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ２構築及び発現
４．１及び４．３に記載のＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１抗ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２を、上記のとおり調製したが、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂイピリムマブを使用した。これらのｍＡｂ２は、ＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異なしで調製した。イピリムマブの重鎖及び軽鎖配列を、配列番号６７及び６８に示す。ＣＴＬＡ－４含有ｍＡｂ２は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中での一過的発現により産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
生成し、発現させたｍＡｂ２のまとめを、表８に提供する。
４．３ 結合ループのＮＮＫウォーク
改善された生物物理学的特性、低減した突然変異負荷、及びＰＤ－Ｌ１についての最適化された親和性を有するＦｃａｂを同定するため、親Ｆｃａｂクローン（ＡＢ及びＥＦループについてはＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６、及びＣＤループについてはモックｍＡｂ２ Ｆ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）のＡＢ、ＣＤ及びＥＦループ中のそれぞれの位置を、全ての考えられるアミノ酸置換に突然変異させ、得られたＦｃａｂをＰＤ－Ｌ１への結合及び機能的活性についてスクリーニングし、次いでそれらの生物物理学的特性を評価した。
表９ＡからＣは、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループのそれぞれの位置における異なるアミノ酸置換の数、並びに親Ｆｃａｂ、ＡＢ及びＥＦループ突然変異体についてのＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６並びにＣＤループ突然変異体についてのモックｍＡｂ２ Ｆ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と比較して２倍超のＰＤ－Ｌ１に対するＦｃａｂ／ｍＡｂ２のオフ速度の低減をもたらさなかった関連位置における具体的なアミノ酸置換を列記する。ＥＦループ中の９５及び９６位における残基は、それらの位置における残基がＥＦループの構造的統合性に重要であることが公知であるため、ナイーブライブラリーでも親和性成熟ライブラリーでも突然変異させなかったことに留意されたい（Hasenhindl et al.,2013）。
ＰＤ－Ｌ１への結合は、Octetシステムを使用して計測した。ＰＤ－Ｌ１へのＡＢ及びＥＦループ突然変異体の結合をＦｃａｂフォーマットで試験した一方、ＣＤループ突然変異体は、抗体ＨｅｌＤ１．３をベースとするモックｍＡｂ２フォーマットで試験した。これらのモックｍＡｂ２は、上記実施例４．２．１に記載のとおり構築した。
プロテインＡチップを介してＦｃａｂ及びモックｍＡｂ２を捕捉し、次いで単量体ＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓに曝露させた。次いで、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合のＦｃａｂ／モックｍＡｂ２のオフ速度を、Octet分析ソフトウェアを使用して計算し、親クローン、ＦＳ１７－３３－１１６又はＦ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と比較した。一般に、オフ速度の２倍の差は、このタイプのアッセイの誤差の範囲内であり、したがって、この範囲内に収まったクローンは、親クローン、ＦＳ１７－３３－１１６又はＦ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と同等の、ＰＤ－Ｌ１に結合した場合のオフ速度を有するとみなした。
ＡＢループ中の２つの位置、ＣＤループ中の２つの位置及びＥＦループ中の３つの位置（残基１５、１６、４５．１、４５．２、９３、９７及び１００）を、試験アミノ酸の半分超により置換することができ、関連親Ｆｃａｂ／モックｍＡｂ２と比較して２倍超の、Ｆｃａｂ／モックｍＡｂ２がＰＤ－Ｌ１に結合した場合のオフ速度の悪化（より早い）をもたらさなかった。したがって、これらの位置は許容的であるとみなす。他の位置においてより少数の置換が容認され、一部の位置は置換を全く容認しなかった（表９ＡからＣ）。関連親クローンと比較してＰＤ－Ｌ１への結合、又は機能的活性を改善する突然変異は、見出されなかった。
次に、親クローンが野生型（ＷＴ）アミノ酸を既に含まなかったそれぞれの許容位置（残基１５、１６、４５．１、９３及び１００；「ＷＴ Ｆｃａｂ」の配列については図１参照）において、その位置におけるＷＴアミノ酸を有するＦｃａｂクローンをモックｍＡｂ２フォーマットで試験してＰＤ－Ｌ１に結合した場合のそれらのオフ速度を決定した。モックｍＡｂ２は、上記の実施例４．２．１に記載のとおりＨｅｌＤ１．３抗体をベースとして構築した。モックｍＡｂ２をプロテインＡチップ上で捕捉し、単量体ｈＰＤ－Ｌ１を捕捉抗体上で流動させるBiacore 3000装置を使用してオフ速度を決定した。次いで、GE製のBiaevaluateソフトウェアを使用してオフ速度を計算した。ＡＢループの１５及び１６位並びにＥＦループの９３及び１００位におけるＷＴ復帰は、同一モックｍＡｂ２フォーマットの親クローンと比較してＰＤ－Ｌ１に結合した場合のモックｍＡｂ２のオフ速度に対して最小の影響を有することが見出された。
さらに、ＡＢ及びＥＦループ中の欠失残基１４及び１０１をＷＴ残基に復元させたＦｃａｂを調製し、試験した。ＰＤ－Ｌ１に結合した場合のモックｍＡｂ２のオフ速度の最小の悪化（より早い）又は悪化なしを示すＷＴ復帰を有するＦｃａｂを、ＡＢ及びＥＦループ中の残基１４及び１０１における欠失とも組み合わせた。驚くべきことに、ＡＢループ中の１４位における欠失残基の復元は、モックｍＡｂ２がＰＤ－Ｌ１に結合した場合のオフ速度の有意な悪化（より早い）をもたらし、それらのＦｃａｂクローンを用いてさらなる試験を行わなかった。しかしながら、ＥＦループ中の欠失残基の復元は、ＰＤ－Ｌ１結合に対する影響をそれ自体有さなかったが、これと、ＥＦループ中の他の任意のＷＴ復帰との組合せは、親和性の有意な降下をもたらした。最後に、１５及び１６位におけるＡＢループ中のＷＴ復帰をＥＦループの１０１位の欠失の復元と組み換えた。これらのクローンの１つ、ＡＢループ中の１５位及びＥＦループ中の１０１位におけるＷＴ復帰を含むＦＳ１７－３３－４４９は、親クローンと同等のＰＤ－Ｌ１への結合を示し、下記のとおりさらに分析した。
モックｍＡｂ２フォーマット（モックｍＡｂ２は、ＦＳ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３をベースとして調製した）のＦｃａｂクローンのサブセットを、親クローンＦＳ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３（このモックｍＡｂ２の調製については４．２．１参照）と比較してＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイ（実験詳細については実施例６参照）において計測してクローンが２倍超の活性の損失を示さなかったことに基づき上記のＮＮＫウォーク突然変異誘発スクリーンから選択した。活性の２倍の差はこのアッセイの誤差の範囲内であり、したがって、この範囲内に収まったモックｍＡｂ２を、親クローンＦＳ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３と同等のＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおける活性を有するとみなした。モックｍＡｂ２クローンのこのサブセットも、ＳＥＣ分析（実験詳細については３．２参照）により計測して総タンパク質の３％超の凝集の指標を示さなかった。結果を表９Ｄに示す。
Ｆｃａｂのサブセットは、ＡＢループの１５位並びにＥＦループの９３、９７及び１００位における突然変異を有し、１５位においてＳがＥ、Ｈ、Ｌ、Ｆ又はＹに変化され得、９３位においてＮがＡ、Ｑ又はＨに変化され得、９７位においてＱがＲ、Ｈ又はＳに変化され得、１００位においてＤがＡに変化され得るＦｃａｂを含んだ。
次いで、ＥＦループ中の１０１位における欠失アミノ酸を置き換えることにより上記のモックｍＡｂ２のサブセットをさらに改変し、それによりＷＴ Ｆｃａｂ（図１参照）と比較して低減数の突然変異を含み、したがって、低減した突然変異負荷を有するモックｍＡｂ２分子の第２のパネルを作出した。許容１５位における野生型復帰を含有するモックｍＡｂ２のこの第２のパネル、例として、ＦＳ１７－３３－４４９ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３を、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイ（実験設定については実施例６参照）において機能について、及びｈＰＤ－Ｌ１への結合について試験した。結果を表９Ｅに示す。全てのクローンは、親ｍＡｂ２ ＦＳ１７－３３－３３４ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３（ＦＳ１７－３３－４５６ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３、ＦＳ１７－３３－４５７ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３及びＦＳ１７－３３－４６２ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３以外、それらはさらなる分析から除外した）と、ＤＯ１１．１０アッセイにおける同等の機能的活性を示し、ＣＨ３ドメイン中のＥＦループの１０１位におけるバリンの導入が十分容認されることを実証した。２つのクローンは、動的光散乱（ＤＬＳ）、プロテインＡ精製及び溶解度分析により分析した場合に改善された生物物理学的特徴を示した。これらのクローンは、ＦＳ１７－３３－４４９ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３及びＦＳ１７－３３－４５１ＡＡ／ＨＥＬＤ１．３であり、したがって、それらをこの最終パネルからのリード候補として選択した。
実施例５－Ｆｃａｂ及びｍＡｂ２の結合親和性及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性
次いで、ＦＳ１７－３３－２８８、ＦＳ１７－３３－２８９、ＦＳ１７－３３－２９６、ＦＳ１７－３３－３３４、ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１ Ｆｃａｂクローンを、Ｆｃａｂ（詳細については４．１及び４．２参照）及びｍＡｂ２フォーマット（詳細については実施例４参照）の両方で、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するそれらの能力について試験した。実施例４に記載のとおり、これらのＦｃａｂ及びｍＡｂ２を生成する目的は、配列負担を除去すること、及び生物物理学的特性を改善する一方、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６の結合、遮断及び機能的特性を維持することであった。
５．１ ＰＤ－Ｌ１への結合
ヒトＰＤ－Ｌ１へのＦｃａｂ及びｍＡｂ２結合は、BIAcore及び細胞結合アッセイの両方により評価した。単量体ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓに対するクローンの親和性を計測するため、CM5チップ（GE 28-9582-20 AC）上にコーティングされた抗Ｆａｂ抗体を使用してｍＡｂ２を捕捉し、プロテインＡチップ（GE 29127556）を使用してBiacore T200（GE）を使用してＦｃａｂを捕捉した。物質輸送効果を最小化するため、捕捉レベルを２００ＲＵに最小化し、７５μｌ／分の高速流量を使用した。ヒト（Acro biosciences PD1-H5229）及びカニクイザル（Acro Biosciences PD1-C52H4）単量体抗原の両方を力価測定し、捕捉ｍＡｂ２上で流動させた。Biacore T200評価ソフトウェアを使用してデータの分析を行った。バルク分析を用いない１：１フィッティングモデルを使用してブランクフローセル及び抗原を用いないランに対して減算された曲線を分析し、Ｒｍａｘをローカルで分析した。
Ｆｃａｂ又はｍＡｂ２タンパク質を、対照ＨＥＫ２９３細胞又はｈＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１細胞のいずれかと４℃において１時間インキュベートすることにより、細胞結合アッセイを実施した。続いて、抗ヒトＦｃ ４８８検出抗体を使用してＦｃａｂ／ｍＡｂ結合を検出した。FACS cantoを使用して蛍光シグナル強度を計測した。
これらの結合実験の結果を表１０にまとめる。表１０は、試験クローンの全てが単量体及び細胞発現ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１についての高い親和性を有したことを示す。
５．２ 遮断活性
ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１及びｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ８０相互作用を遮断するＦｃａｂ及びモックｍＡｂ２の能力を、細胞ベース受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）において試験した。簡潔に述べると、ビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ－Ａｖｉを、４００ｎＭから３ｐＭに及ぶ力価測定濃度のＦｃａｂと１時間インキュベートした。ミックスを、ｈＰＤ－１又はｈＣＤ８０のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞とさらに１時間インキュベートした。ストレプトアビジン６４７を使用してＨＥＫ２９３細胞上の結合したビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ－Ａｖｉのレベルを検出し、FACS Canto（BD Biosciences）を使用して蛍光レベルを計測した。
これらの遮断実験の結果を表１１に示す。表１１は、試験クローンの全てがｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１及びｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ８０相互作用を強力に遮断し得たことを示す。
実施例６－ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＦｃａｂ分子の活性
６．１ ヒトＰＤ－Ｌ１ ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＦｃａｂの活性
ＬＡＬＡ突然変異を含有するＦｃａｂのパネルを、ＤＯ１１．１０ベースＴ細胞活性化アッセイにおいてＦｃａｂ及びｍＡｂ２フォーマットで試験した。ｍＡｂ２を実施例４に記載のとおり産生し、下記のとおりＤＯ１１．１０ Ｔ細胞アッセイにおいて試験した。
ＤＯ１１．１０ ＯＶＡ特異的Ｔリンパ球及びＬＫ３５．２ Ｂリンパ球ハイブリドーマ細胞系をベースとするＩＬ－２放出アッセイを、ｍＡｂ２の機能的スクリーニングに使用した。ＩＬ－２放出は、Ｔ細胞活性化のマーカーである。内因性ネズミＰＤ－１を発現するＴ細胞を、空のベクター（ｐＬＶＸ）により形質移入した。Ｂ細胞を、ヒトＰＤ－Ｌ１構築物により形質移入した。
当該ｍＡｂ２に応じて、ＬＡＬＡ突然変異（ＡＡ）を有し、及び有さないｍＡｂ２を試験した。ｍＡｂ２のＦａｂ部分は、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨｅｌＤ１．３）、ＦＩＴＣ分子（４４２０）、ヒトＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）に対して指向されるモノクローナル抗体の可変領域のいずれかであった。これらのｍＡｂ２の構築に関する詳細を実施例４に提供する。
６．１．１ 空のベクターを用いるＴ細胞系の産生
レンチウイルス形質導入法を使用してLenti-X HTXパッケージングシステム（カタログ番号631249）を使用して空のレンチウイルスベクターｐＬＶＸを含有するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を生成した。Lenti-X発現ベクター（ｐＬＶＸ）（カタログ番号631253）を、Lenti-X HTXパッケージングミックスとLenti-X２９３ Ｔ細胞系（カタログ番号632180）中に同時形質移入してウイルスを生成した。Lenti-X HTXパッケージングシステムを用いて産生されたレンチウイルス粒子を使用してＤＯ１１．１０細胞系を形質導入した。
６．１．２ ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する抗原提示細胞の産生
レンチウイルス形質導入法を使用してLenti-X HTXパッケージングシステム（カタログ番号631249）を使用してヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＬＫ３５．２ Ｂ細胞リンパ腫細胞（ATCC、HB-98）を生成した。ヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡを含有するLenti-X発現ベクター（ｐＬＶＸ）（カタログ番号631253）を、Lenti-X HTXパッケージングミックスとLenti-X２９３ Ｔ細胞系（カタログ番号632180）中に同時形質移入してウイルスを生成した。Lenti-X HTXパッケージングシステムを用いて産生されたレンチウイルスベクターを使用してＬＫ３５．２細胞系を形質導入した。
６．１．３ 培地及びぺプチド
細胞培養培地：ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）１０％のＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070)、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Gibco、A11138-03）
実験培地：ピューロマイシンを有さない完全ＤＯ１１．１０培養培地。
ＯＶＡぺプチド（ＭＷ＝１７７３．９Ｄａ）：Ｈ－ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ－ＯＨ（Pepscan）
細胞：
・空のレンチウイルスベクターにより形質導入されたＤＯ１１．１０ ｐＬＶＸ：ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ；
・ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現させるようにｈＰＤ－Ｌ１を含有するレンチウイルスベクターにより形質導入されたＬＫ３５．２ ｈＰＤ－Ｌ１：Ｂ細胞ハイブリドーマ
Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、抗ヒト陽性対照ｍＡｂ（Ｓ１又はＳ７０）又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（抗ＨＥＬＤ１．３又はＭＳＬ）の希釈物を、実験培地中で調製した。Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２又は対照ｍＡｂを、４×１０５個／ｍｌのＬＫ３５．２ ｈＰＤ－Ｌ１細胞と１：１で、２．４６μＭのＯＶＡぺプチドの存在下で実験培地中で混合し（９６丸底プレート中でウェル当たり１００μＬのＬＫ３５．２ ｈＰＤ－Ｌ１／（Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２又は対照ｍＡｂ）ミックス）、３７℃、５％のＣＯ２において１時間インキュベートした。１００μｌの容量の実験培地中２×１０５個のＤＯ１１．１０ ｐＬＶＸ細胞／ｍｌを、１００μｌのＬＫ３５．２ ｈＰＤ－Ｌ１／（Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２又は対照ｍＡｂ）ミックスに添加した。次いで、細胞を混合してから３７℃、５％のＣＯ２において２４時間インキュベートした。上清を回収し、マウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88又はR&D systems、SM2000）を製造業者の説明書に従って用いてアッセイした。Gen5ソフトウェア、BioTekを有するプレートリーダーを使用してプレートを４５０ｎｍにおいて読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィットをベースとした（Gen5ソフトウェア、BioTek）。マウスＩＬ－２の濃度をＦｃａｂ、ｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、GraphPad Prismにおいて対数（アゴニスト）対応答の式を使用して得られた曲線をフィッティングした。
結果を図３及び４並びに表１２に示す。ヒトＦｃａｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて有意な活性を示し、ポテンシー（ＥＣ５０）は、０．２ｎＭの範囲内であり、陽性対照ｍＡｂＳ１抗体と同等であった。Ｆｃａｂ及びモックｍＡｂ２の両方は、Ｔ細胞のＰＤ－Ｌ１媒介阻害を放出した。しかしながら、モックｍＡｂ２フォーマットへのＦｃａｂの変換は、ＩＬ－２放出の部分的低減をもたらした。
実施例７－ＳＥＢアッセイにおけるｍＡｂ２分子の活性
次に、ｍＡｂ２フォーマットのこれらのＦｃａｂの活性を、ＳＥＢアッセイにおいて試験した。ｍＡｂ２は、実施例４に記載のとおり産生した。
７．１ ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）アッセイ
Ｆｃａｂ、ＰＤ－Ｌ１モックｍＡｂ２及びＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ２を、ヒトＰＢＭＣベースブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）アッセイ（ＳＥＢアッセイ）において試験した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B）は超抗原であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のｖβ鎖に結合し、Ｔ細胞の非特異的活性化及びサイトカイン放出を引き起こす。Ｔ細胞活性化を確認するために抗原の存在は要求されない。ＳＥＢアッセイは、刺激ヒト細胞（ＰＢＭＣ）を生理学的レベルのチェックポイントインヒビターと使用し、そのアッセイを使用してＴ細胞活性化がヒト系においてｍＡｂ２により向上されることを確認することができる。
７．１．１ 拡大Ｔ細胞の生成
白血球コーンからFicoll勾配分離によりＰＢＭＣを単離した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec Ltd、１３０－０９６－５３３）を製造業者の説明書に従って使用して単離した。ヒトＴ－アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８Dynabeads（Life technologies、11131D）をボルテックスに供することにより再懸濁させた。ビーズを無菌１５ｍｌチューブに移し、１０％のＦＢＳ（Life Technologies、10270106）及び１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）を有する１０ｍｌのＲＰＭＩ（Life Technologies、61870044）を添加してDynabeadsを洗浄した。上清を廃棄した。１０％のＦＢＳ及び１×ペニシリンストレプトマイシン溶液及び５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ２（Peprotech、200-02-50μg）を有するＲＰＭＩ中の１．０×１０６個の細胞／ｍｌにおける要求量のＣＤ４＋ Ｔ細胞（ビーズと細胞との比３：１）を、Ｔ７５フラスコ（Greiner Bio-one、690195）に移し、３７℃＋５％のＣＯ２においてインキュベートした。３日後、細胞を穏やかに再懸濁させ、計数した。必要により新鮮培地（ＲＰＭＩ－１０％のＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１× ＋５０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ２）を添加することにより、細胞密度を０．８から１×１０６個の細胞／ｍｌで維持した。７又は８日目、ＣＤ３／２８ビーズを除去し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、１ｍｌの新鮮培地ＲＰＭＩ－１０％のＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１×と低減した１０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ２当たり１×１０６個の細胞において一晩レストさせた。細胞を要求されるまで冷凍貯蔵した。
７．１．２ ＭｏｉＤＣの生成
ヒト汎単球単離キット（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-537）を製造業者の説明書に従って使用してヒトＰＢＭＣから非付着単球を単離した。ヒトＭｏ－ＤＣ分化培地（Miltenyi Biotec Ltd、130-094-812）を製造業者の説明書に従って使用して単球をｉＤＣに分化させた。
７．１．３ ＳＥＢアッセイ
拡大Ｔ細胞及びＭｏｉＤＣを実験前に解凍し、ＡＩＭ培地（Gibco、12055-091）により洗浄し、ＡＩＭ培地中で３７℃、５％のＣＯ２においてインキュベートした。
Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、抗ヒト陽性対照ｍＡｂ（Ｓ１（ＬＡＬＡ突然変異あり又はなし）又はＳ７０）又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ（抗ＨＥＬＤ１．３又は抗ＦＩＴＣクローン４４２０）の希釈物を、ＡＩＭ培地中で調製した。ＭｏｉＤＣを同一ドナーからのＴ細胞と１：１０の比において混合した（２×１０５個の細胞／ｍｌにおける５ｍｌのｉＤＣを、２×１０６個の細胞／ｍｌにおける５ｍｌのＴ細胞と合わせた）。０．１μｇ／ｍｌにおける２０μｌのＳＥＢ（Sigma、S4881）を、１０ｍｌの細胞に添加した。丸底９６ウェルプレート中で、１００μｌの細胞／ＳＥＢ混合物を１００μｌの抗体希釈物に添加し、ウェル当たり２００μｌのＡＩＭ培地中で０．１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを用いて１０４個のｉＤＣ細胞と１０５個のＴ細胞との比を得た。細胞を３７℃、５％のＣＯ２において４日間インキュベートした。上清を回収し、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems、PDIF50）を用いて直ちにアッセイし、又はさらなる分析のために－２０℃に冷凍した。アッセイは、キットの製造業者の説明書に従ってＰＢＡ（ＤＰＢＳ、２％のＢＳＡ（Sigma、A7906-100G））により１：３０希釈した上清を使用して実施した。ヒトＩＦＮγの濃度を、ｍＡｂ２又はｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、GraphPad Prismソフトウェアにおいて対数（アゴニスト）対応答の式を使用して得られた曲線をフィッティングした。表１３は、個々の細胞ドナーからの細胞を用いたＳＥＢアッセイにおけるＥＣ５０値及びＩＦＮγ放出のスパンを示す。図５は、単一ドナーについてのＳＥＢアッセイの代表的なプロットを示す。ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいて示されるとおり、Ｆｃａｂクローンの一部は、抗ＰＤ－Ｌ１陽性対照（Ｓ７０）に近い活性を示した。しかしながら、モックｍＡｂ２フォーマットへのＦｃａｂの変換は、ＩＦＮγ放出の部分的低減をもたらした。さらに、結果は、図５Ｃに示されるとおり、Ｆｃａｂ中のＬＡＬＡ突然変異の存在が、それらの活性を妨害しなかったことを実証する。上記３．６に説明されるとおり、Ｆｃａｂは自己会合し、二量体の形成をもたらす。モックｍＡｂ２フォーマットにおいて、この自己会合は停止される。理論により拘束されるものではないが、二量体Ｆｃａｂの形成は、細胞ベースアッセイ、例えば、ＳＥＢアッセイにおいてアビディティを介してＦｃａｂの活性を増強し得たことが考えられる。
ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂ、ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１を、抗ＣＴＬＡ－４ Ｆａｂイピリムマブとも対合させ（構築の詳細については実施例４参照）、ｍＡｂ２の活性をＳＥＢアッセイにおいてモックｍＡｂ２（ＦＳ１７－３３－４４９／ＨＥＬＤ１．３又はＦＳ１７－３３－４５１／ＨＥＬＤ１．３を用いる）及びイピリムマブ単独又はモックｍＡｂ２及びイピリムマブの組合せと比較して評価した。ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ２は、単一薬剤として又は組合せでモックｍＡｂ２及びイピリムマブよりも大きい活性化を示した。３つのうち１つのアッセイにおいて、ＦＳ１７－３３－４４９／ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ２は、モックｍＡｂ２及びイピリムマブの組合せよりも大きくはないが、それと同等の活性を示した。この結果は、ｍＡｂ２を用いてより良好な相乗的活性を達成することができることを示した。これらの結果を説明するＳＥＢアッセイにおける代表的なプロットを図６Ｂに提供する。
実施例８－改善された安定性を有する抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂ分子の選択
Ｆｃａｂ分子、ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１は、動的光散乱（ＤＬＳ）、プロテインＡ精製及び溶解度分析（実施例４．３参照）により決定されたとおり、改善された生物物理学的特性を有する。しかしながら、これらの分子のＦｃドメインの融解温度（Ｔｍ）は、野生型Ｆｃドメインよりも低い。融解温度の低減は、これらの分子が野生型Ｆｃドメインよりも安定的でない場合があり、そのことが製造の間のそれらの分子の統合性及び溶解度及び／又は長期貯蔵の間のそれらの分子の安定性に潜在的に影響し得ることを示唆する。
増加した融解温度を有する分子を同定するため、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１を、下記のとおりエラープローンファージディスプレイライブラリーの選択の間に熱ストレスを付与した。この選択方針の目的は、Ｆｃａｂの標的結合及び活性を低減させずにＦｃａｂ分子の融解温度及びしたがってそれらの熱安定性を増加させる突然変異を同定することであった。
８．１ エラープローンライブラリーからの改善された安定性を有する抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃａｂ分子の選択
結合ループ及びフレームワーク中の突然変異はクローンの安定性を潜在的に改善し得たため、エラープローンＰＣＲ（Diversify（登録商標）ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（Takara Clontech、630703）をＣＨ３ドメイン全体にわたり実施してＦｃａｂクローン、ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１のそれぞれからＣＨ３ドメインライブラリーを生成した。２つの連続ラウンドのＰＣＲを実施してＣＨ３断片当たり平均６±２つの突然変異を達成した。次いで、突然変異ＣＨ３ドメインをファージミドベクターｐＡＤＬ－２３ｃ（Antibody Design Laboratoriesから許諾）中にライゲートし、大腸菌（E.Coli）（ＴＧ１、Lucigen、60502-PQ997-A）中に形質転換した。次いで、最初にファージを８０℃に１０分間加熱し、次いで２０ｎＭの濃度におけるヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）抗原への結合について選択することにより、より高い融解温度を有するＣＨ３ドメインライブラリーをＣＨ３ドメインについての選択に供した。実施例３．１に記載のとおりビオチン化されたヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（Acro biosciences、PD1-H5229）を、選択のための抗原資源として使用した。１ラウンドの選択後、アウトプットをファージＥＬＩＳＡにおいてｈＰＤ－Ｌ１についての結合についてスクリーニングし、ヒットをシーケンシングした。８６個のユニークＣＨ３ドメイン配列を同定した。１つの突然変異、ＣＨ３ドメインの９９位（ＥＦループ中）におけるアスパラギン酸残基（Ｄ）のグリシン残基（Ｇ）への変化は、得られたクローン集団において過剰であった。興味深いことに、この突然変異は、ＣＨ３ドメインの９９位における野生型配列への復帰を表す（例えば、図１Ａ参照）。
選択ＣＨ３ドメイン配列をサブクローニングし、さらなるスクリーニングのために実施例４．２．１に記載のとおりＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異を有する「モック」（ＭＳＬ１０９）ｍＡｂ２フォーマットで発現させた。ＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異を有する「モック」（ＭＳＬ１０９）ｍＡｂ２フォーマットの親ＦＳ１７－３３－４４９及びＦＳ１７－３３－４５１クローンを、対照として使用した。次いで、Octetシステムを使用して上清をｈＰＤ－Ｌ１抗原についての結合について試験し、２９個のクローンが、この抗原への結合を保持することが示された。次いで、これらのクローンをより大きいスケールで発現させ、クローンの２１個を発現後に精製することができた。次いで、これらの２１個のクローンについてのＫＤ値を実施例５．１に記載のとおり計測し、結果を表１４にまとめる。２１個のクローンのうち１７個を、それらが１ｎＭ未満のｈＰＤ－Ｌ１への結合についてのＫＤ値を有することに基づき選択し、実施例６に記載の方法を使用してＤＯ１１．１０ Ｔ細胞活性化アッセイにおいてそれらの活性について試験した（アッセイ結果については表１４参照）。次いで、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用してこれらのＦｃａｂの融解温度を決定することにより、ＤＯ１１．１０アッセイにおけるＥＣ５０値に基づく最大活性を有する６つのＦｃａｂクローンの熱安定性を評価した（結果については表１４参照）。ＦｃａｂクローンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＴｍはわずかな差を示すにすぎないため、ピークがそれぞれＣＨ２ドメインを表し、ＣＨ３ドメインを表すプロファイルからそれを決定することはできなかった。したがって、表１４は、ピーク１及びピーク２についてのＴｍを報告し、最小転移温度は、分子全体のＴｍの最も代表的なものであった。Ｆｃａｂの３つは、親Ｆｃａｂ、すなわち、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８、ＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７－３３－５４８と比較して融解温度の有意な増加を示した。表１５は、これらの３つのＦｃａｂのＥＦループ配列及びそれらのＦｃａｂが含有したＣＨ３ドメイン中の任意の追加のフレームワーク突然変異を示す。このＦｃａｂの３つ全ては、ＣＨ３ドメインの９９位におけるアスパラギン酸（Ｄ）の、野生型グリシン（Ｇ）への復帰を含有した。さらに、Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８及びＦＳ１７－３３－５３９は両方とも、ＣＨ３ドメインの１１３位におけるヒスチジン（Ｈ）の、アルギニン（Ｒ）残基への突然変異を含有した。これら２つのＦｃａｂは異なる親クローンを有するため（詳細については表１５参照）、この突然変異、及びさらにはＤ９９Ｇ復帰は独立して２回生じ、それらのＦｃａｂの融解温度、及びしたがって安定性の増加においてそれらの突然変異が重要な役割を担い得ることを示した。Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８は、１０１位におけるアラニン残基、及びＣＨ３ドメインフレームワーク中の追加の突然変異も含んだ（詳細については表１５参照）。
ＦｃａｂクローンＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７－３３－５４８を試験Ｆｃａｂのパネルからさらなる分析のために選択した。それというのも、それらはより多数の突然変異を含むＦＳ１７－３３－４８８ Ｆｃａｂと比較して改善された融解温度と低い突然変異負荷とを合わせたためである。さらに、関連親クローン（ＦＳ１７－３３－４４９又はＦＳ１７－３３－４５１；詳細については表１５参照）の融解温度と比較してＦＳ１７－３３－４８８クローン（約２℃の増加）よりも融解温度の大きい改善が、それら２つのクローンについて観察された（３から４℃の増加）（表１４）。
８．２ 改善された安定性を有するＦｃａｂ分子のＰＤ－Ｌ１への結合
実施例８．１において同定されたＦｃａｂ、ＦＳ１７－３３－５３９ＡＡ／ＭＳＬ１０９及びＦＳ１７－３３－５４８ＡＡ／ＭＳＬ１０９をより大きいスケールで産生し、実施例４．２．１に記載のとおり精製した。ｈＰＤ－Ｌ１へのモックｍＡｂ２の結合を、Biacore T200システム（GE Healthcare）を使用するＳＰＲ及び実施例５．１に記載の細胞結合アッセイの両方により評価した。単量体ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓに対するクローンの親和性を計測するため、Biacore T200システムを使用してCM5チップ（GE 28-9582-20 AC）上でコーティングされた抗Ｆａｂ抗体を使用してモックｍＡｂ２を捕捉した。物質移動効果を最小化するため、捕捉レベルを２００ＲＵに最小化し、７５μｌ／分の高速流量を使用した。ヒト（Acro biosciences、PD1-H5229）及びカニクイザル（Acro Biosciences、PD1-C52H4）単量体抗原の両方を力価測定し、捕捉モックｍＡｂ２上で流動させた。Biacore T200評価ソフトウェアを使用してデータの分析を行った。バルク分析を用いない１：１フィッティングモデルを使用してブランクフローセル及び抗原を用いないランに対して減算した曲線を、分析し、Ｒｍａｘをローカルで分析した。
モックｍＡｂ２を、対照ＨＥＫ２９３細胞又はｈＰＤ－Ｌ１若しくはカニクイザルＰＤ－Ｌ１細胞を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞のいずれかと４℃において１時間インキュベートすることにより、細胞結合アッセイを実施した。続いて、抗ヒトＦｃ４８８検出抗体を使用してモックｍＡｂ２結合を検出した。FACS Cantoフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して蛍光シグナル強度を計測した。
これらの結合実験の結果を表１６にまとめる。表１６は、試験モックｍＡｂ２の全てが、単量体及び細胞発現ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１についての高い親和性を有したことを示す。
８．３ 改善された安定性を有するＦｃａｂ分子の遮断活性
ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１及びｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ８０相互作用を遮断するモックｍＡｂ２の能力を、細胞ベース受容体遮断アッセイ（ＲＢＡ）において試験した。ＩｇＧ１フレームワーク中のＬＡＬＡ突然変異を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｓ７０（Ｇ１ＡＡ／Ｓ７０）を、陽性対照として使用した。簡潔に述べると、ビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ－Ａｖｉを、２０００ｎＭから３ｐＭに及ぶ力価測定濃度のモックｍＡｂ２と１時間インキュベートした。ミックスを、ｈＰＤ－１又はｈＣＤ８０のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞とさらに１時間インキュベートした。ストレプトアビジン６４７を使用してＨＥＫ２９３細胞上の結合したビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ－Ａｖｉのレベルを検出し、FACS Cantoフローサイトメーターを使用して蛍光レベルを計測した。
これらの遮断実験の結果を表１７に示す。表１７は、試験された全てのクローンが、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１及びｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ８０相互作用を完全に遮断し得たことを示す。
８．４ ヒトＴ細胞活性化アッセイにおける改善された安定性を有するＦｃａｂの活性
モックｍＡｂ２の活性を、実施例６．１に記載のＤＯ１１．１０細胞ベースＴ細胞活性化アッセイにおいて、及び実施例７．１に記載のＳＥＢアッセイにおいて試験した。結果を表１８に示す。例えば、ＳＥＢアッセイにおいて使用された刺激ＰＢＭＣのドナー資源に応じてアッセイ間で見られる変動の潜在性に起因して、親クローンの１つ、ＦＳ１７－３３－４５１（「モック」ＭＳＬ１０９ ｍＡｂ２フォーマットで、ＬＡＬＡ突然変異を含む）も、直接的な比較基準として両方のアッセイに含めた。試験モックｍＡｂ２の両方は、両方のアッセイにおいてＴ細胞活性化活性を保持した。これらのアッセイにおけるモックｍＡｂ２のＥＣ５０は、親クローンＦＳ１７－３３－４５１ＡＡ／ＭＳＬ１０９のものよりも改善され、又はそれと同等であった。
８．５ 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱安定性の評価
Microcal VPキャピラリー示差走査熱量測定計を使用してＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７３３－５４８ Ｆｃａｂ（モックＭＳＬ１０９ ｍＡｂ２フォーマットで、ＬＡＬＡ突然変異を有する）の融解温度（Ｔｍ）を計測した。Ｇ１ＡＡ／ＭＳＬ１０９ ｍＡｂ２を、それが野生型ＣＨ３ドメイン及びＬＡＬＡ含有ＣＨ２ドメインを含有するため、この分析において陽性対照として含めた。試料を試料緩衝液中で０．２ｍｇ／ｍｌの濃度において計測した。走査速度を６０℃／時間に設定し、データを３５から１００℃で収集した。Origin 7.0ソフトウェアを用いてデータ分析を実施した。結果を表１９に示す。クローンをより小さいスケールにおいて産生した場合に見られたとおり（表１４参照）、モックｍＡｂ２フォーマットのＦＳ１７－３３－５３９及びＦＳ１７３３－５４８ Ｆｃａｂ分子は、関連親クローンと比較して３から４℃だけのＦｃドメインの融解温度の改善を示した。
参照文献
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配列表
ＷＴ Ｆｃａｂ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＷＴ Ｆｃａｂ ＡＢループ－ＬＴＫＮＱ（配列番号１）
ＷＴ Ｆｃａｂ ＣＤループ－ＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＷＴ Ｆｃａｂ ＥＦループ－ＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶ（配列番号３）
ＷＴ Ｆｃａｂ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＷＴ Ｆｃａｂ、ＦＳ１７－３３、及びＦＳ１７－３３－３７／１１６／２８８／２８９／２９６／３３４／４４９／４５１／４８８／５３９／５４８のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）
ＬＡＬＡ突然変異の位置に下線を付す。
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６／２８８／２８９／２９６／３３４／４４９／４５１ ＣＨ３ドメイン構造ループのコンセンサス配列
ＡＢループ－Ｘ１ＧＹＷ（配列番号１０）
ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＸ２ＤＤＸ３（配列番号１２）
Ｘ１＝Ｖ、Ｓ、Ｔ、又はＥ
Ｘ２＝Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ
Ｘ３＝Ｖ又は不存在
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３ ＡＢループ－ＱＳＧＹＷ（配列番号１３）
ＦＳ１７－３３ ＣＤループ－ＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＦＳ１７－３３ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＭＧＤ（配列番号１４）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３のアミノ酸配列（配列番号１６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３のアミノ酸配列（配列番号１７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＷＴ Ｆｃａｂ、ＦＳ１７－３３、及びＦＳ１７－３３－３７／１１６／２８８／２８９／２９６／３３４／４４９／４５１／４８８／５３９／５４８のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号６）
ＷＴ Ｆｃａｂ、ＦＳ１７－３３、及びＦＳ１７－３３－３７／１１６／２８８／２８９／２９６／３３４／４４９／４５１／４８８／５３９／５４８のトランケートヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号７）
ＴＣＰＰＣＰ
ＬＡＬＡ突然変異を有するＷＴ Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＷＴ Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－３７ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３ ＡＢループ－ＱＶＧＹＷ（配列番号１８）
ＦＳ１７－３３ ＣＤループ－ＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＦＳ１７－３３ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＭＤＤ（配列番号１９）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－３７ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－３７のアミノ酸配列（配列番号２１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－３７のアミノ酸配列（配列番号２２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－１１６ ＡＢループ－ＳＧＹＷ（配列番号２３）
ＦＳ１７－３３－１１６ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－１１６ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＭＤＤ（配列番号１９）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６のアミノ酸配列（配列番号２５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－１１６のアミノ酸配列（配列番号２６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８８ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－２８８ ＡＢループ－ＳＧＹＷ（配列番号２３）
ＦＳ１７－３３－２８８ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－２８８ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＩＤＤ（配列番号２７）
ＦＳ１７－３３－２８８ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２８）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８８のアミノ酸配列（配列番号２９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８８のアミノ酸配列（配列番号３０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８９ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－２８９ ＡＢループ－ＳＧＹＷ（配列番号２３）
ＦＳ１７－３３－２８９ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－２８９ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＤＤ（配列番号３１）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８９ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３２）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８９のアミノ酸配列（配列番号３３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２８９のアミノ酸配列（配列番号３４）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２９６ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－２９６ ＡＢループ－ＳＧＹＷ（配列番号２３）
ＦＳ１７－３３－２９６ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－２９６ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＶＤＤ（配列番号３５）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－２９６ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３６）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２９６のアミノ酸配列（配列番号３７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－２９６のアミノ酸配列（配列番号３８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－３３４ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－３３４ ＡＢループ－ＳＧＹＷ（配列番号２３）
ＦＳ１７－３３－３３４ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－３３４ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＤＤ（配列番号３１）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－３３４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－３３４のアミノ酸配列（配列番号４０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－３３４のアミノ酸配列（配列番号４１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４４９ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－４４９ ＡＢループ－ＴＧＹＷ（配列番号４２）
ＦＳ１７－３３－４４９ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－４４９ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＤＤＶ（配列番号４３）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４４９ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４４）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－４４９のアミノ酸配列（配列番号４５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－４４９のアミノ酸配列（配列番号４６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４５１ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－４５１ ＡＢループ－ＥＧＹＷ（配列番号４７）
ＦＳ１７－３３－４５１ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－４５１ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＤＤＶ（配列番号４３）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４５１ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４８）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－４５１のアミノ酸配列（配列番号４９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－４５１のアミノ酸配列（配列番号５０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＩｇＧ１ ４４２０抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５１）
以下の重鎖配列、並びに以下に列記の抗体ＨｅｌＤ１．３、ＭＳＬ１０９、Ｓ７０、及びＳ１についての重鎖配列において、可変ドメインの配列をイタリックで示し、ＣＨ１ドメインの配列に下線を付し、ヒンジ領域の配列に二重下線を付し、ＣＨ２ドメインの配列を太字で示し、ＣＨ３ドメインの配列を通常のフォントで示す。
ＬＡＬＡ突然変異を有するＩｇＧ１ ４４２０抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）
以下の軽鎖配列、並びに以下に列記の抗体ＨｅｌＤ１．３、ＭＳＬ１０９、Ｓ７０、及びＳ１についての軽鎖配列において、可変ドメインの配列をイタリックで示し、定常ドメインの配列に下線を付す。
ＬＡＬＡ突然変異を有するＨｅｌＤ１．３抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５３）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＨｅｌＤ１．３抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５４）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＭＳＬ１０９抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５５）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＭＳＬ１０９抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５６）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＳ７０抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５７）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＳ７０抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５８）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＳ１抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５９）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＳ１抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６０）
ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号６１）
ネズミＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号６２）
カニクイザルＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号６３）
ヒトＰＤ－１のアミノ酸配列（配列番号６４）
ヒトＣＤ８０のアミノ酸配列（配列番号６５）
マウスＣＤ８０のアミノ酸配列（配列番号６６）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないイピリムマブ抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６７）
ＣＤＲに下線を付す。ＣＨ３配列を太字で示す。
ＬＡＬＡ突然変異を有さないイピリムマブ抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６８）
ＣＤＲ配列に下線を付す。
ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号６９）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－４８８ ＡＢループ－ＥＧＹＷ（配列番号４７）
ＦＳ１７－３３－４８８ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－４８８ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＧＤＡ（配列番号７０）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７１）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８のアミノ酸配列（配列番号７２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－４８８のアミノ酸配列（配列番号７３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－５３９ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－５３９ ＡＢループ－ＴＧＹＷ（配列番号４２）
ＦＳ１７－３３－５３９ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－５３９ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＧＤＶ（配列番号７４）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－５３９ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７５）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－５３９のアミノ酸配列（配列番号７６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－５３９のアミノ酸配列（配列番号７７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－５４８ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＦＳ１７－３３－５４８ ＡＢループ－ＥＧＹＷ（配列番号４７）
ＦＳ１７－３３－５４８ ＣＤループ－ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）
ＦＳ１７－３３－５４８ ＥＦループ－ＳＮＷＲＷＱＬＧＤＶ（配列番号７８）
Ｆｃａｂ ＦＳ１７－３３－５４８ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７９）
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－５４８のアミノ酸配列（配列番号８０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ ＦＳ１７－３３－５４８のアミノ酸配列（配列番号８１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（イタリック）
ＬＡＬＡ突然変異及びＰ１１４Ａ突然変異を有するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）
ＬＡＬＡ突然変異に下線を付し；Ｐ１１４Ａ突然変異を太字で示し、それに下線を付す。

Claims (59)

  1. プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する特異的結合メンバーであって、
    当該特異的結合メンバーは、ＣＨ３ドメインを含み、かつ、当該特異的結合メンバーは、前記ＣＨ３ドメイン中に局在するＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を含み、
    前記ＣＨ３ドメインが、当該ＣＨ３ドメインの１１から１８位に局在するＡＢ構造ループと、当該ＣＨ３ドメインの４３から７８位に局在するＣＤ構造ループと、当該ＣＨ３ドメインの９２から１０１位に局在するＥＦ構造ループと、を含み、
    前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位が、
    （ｉ）前記ＣＨ３ドメインの１４から１８位におけるＡＢ構造ループ中に局在する第１の配列であって、前記特異的結合メンバーが、前記ＣＨ３ドメインの１４、１５又は１６位におけるアミノ酸欠失を含み、当該第１の配列が、
    （ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又は
    （ｂ）配列番号２３のバリアントからなり、
    前記セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されており、及び／又は
    前記グリシン（Ｇ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、又はＹにより置換されている、
    第１の配列；
    （ｉｉ）前記ＣＨ３ドメインの４５．１から７８位におけるＣＤ構造ループ中に局在する第２の配列であって、当該第２の配列が、
    （ａ）アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）、又は
    （ｂ）配列番号１１のバリアントからなり、
    前記グルタミン酸（Ｅ）が、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されており、及び／又は
    前記プロリン（Ｐ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
    前記グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ｈ、又はＮにより置換されており、及び／又は
    前記チロシン（Ｙ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、又はＶにより置換されており、及び／又は
    前記アラニン（Ａ）が、アミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、又はＷにより置換されている、
    第２の配列；及び
    （ｉｉｉ）前記ＣＨ３ドメインの９２から１００位又は９２から１０１位におけるＥＦ構造ループ中に局在する第３の配列であって、当該第３の配列が、
    （ａ）アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤＤ（配列番号１９）、又は
    （ｂ）配列番号１９のバリアントからなり、
    ９２位における前記セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ａ、又はＧにより置換されており、及び／又は
    ９３位における前記アスパラギン（Ｎ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、又はＹにより置換されており、及び／又は
    ９７位における前記グルタミン（Ｑ）が、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、又はＶにより置換されており、及び／又は
    ９８位における前記メチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されており、及び／又は
    ９９位における前記アスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、又はＧにより置換されており、及び／又は
    １００位における前記アスパラギン酸（Ｄ）が、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、又はＹにより置換されている、
    第３の配列；
    を含み、
    前記ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）であり、又は不存在であり；
    前記アミノ酸残基ナンバリングが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）ナンバリングスキームに従う、
    特異的結合メンバー。
  2. 請求項１に記載のアミノ酸置換基から選択される前記第１、第２及び第３の配列中の合計５つまでのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の特異的結合メンバー。
  3. ９８位における前記メチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｌにより置換されている、請求項１又は２に記載の特異的結合メンバー。
  4. 請求項１に記載のアミノ酸置換基から選択される前記第１の配列中の２つまでのアミノ酸置換及び／又は請求項１に記載のアミノ酸置換基から選択される前記第３の配列中の３つまでのアミノ酸置換を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  5. 前記第１の配列が、
    （ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＷ（配列番号２３）、又は
    （ｂ）配列番号２３のバリアントであって、前記セリン（Ｓ）が、アミノ酸Ｅ、又はＴにより置換されているバリアント
    からなり；
    前記第２の配列が、アミノ酸配列ＥＰＱＹＷＡ（配列番号１１）からなり；
    前記第３の配列が、
    （ａ）アミノ酸配列ＳＮＷＲＷＱＭＤ１Ｄ２（配列番号１９）、又は
    （ｂ）配列番号１９のバリアントであって、前記メチオニン（Ｍ）が、アミノ酸Ｉ、Ｌ、又はＶにより置換されており、前記アスパラギン酸（Ｄ１）が、任意でグリシン（Ｇ）により置換されているバリアント
    からなり；
    前記ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）であり、又は不存在である、
    請求項１から４のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  6. 前記第１の配列が、配列番号４２に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号４３に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  7. 前記第１の配列が、配列番号４７に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号４３に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  8. 前記第１の配列が、配列番号４７に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号７８に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  9. 前記第１の配列が、配列番号４２に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号７４に記載の配列を有し、前記特異的結合メンバーの前記ＣＨ３ドメインの１１３位における残基が、アルギニン（Ｒ）である、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  10. 前記第１の配列が、配列番号４７に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号７０に記載の配列を有し、前記特異的結合メンバーの前記ＣＨ３ドメインの８４．１、８５．３、１０１及び１１３位における残基が、それぞれプロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）及びアルギニン（Ｒ）である、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  11. 前記第１の配列が、配列番号２３に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号３１に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  12. 前記第１の配列が、配列番号２３に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号１９に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  13. 前記第１の配列が、配列番号２３に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号２７に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  14. 前記第１の配列が、配列番号２３に記載の配列を有し、前記第２の配列が、配列番号１１に記載の配列を有し、前記第３の配列が、配列番号３５に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  15. 前記ＣＨ３ドメインの１０１位におけるアミノ酸が、バリン（Ｖ）である、請求項６から９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  16. 前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  17. 前記ＣＨ３ドメインの３８位におけるアミノ酸が、バリン又はアラニン残基である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  18. 前記ＣＨ３ドメインの３８位におけるアミノ酸が、アラニン残基である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  19. 配列番号４４、４８、７１、７５、７９、３２、２４、２８、３６、又は３９に記載のＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１８のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  20. 配列番号４４、４８、７１、７５、７９、又は３２に記載のＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  21. 配列番号４４、４８、７１、７５、７９、又は３２に示される配列の直近のＣ末端のリジン残基（Ｋ）が欠失されている、請求項２０に記載の特異的結合メンバー。
  22. ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  23. ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  24. ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインを含む、請求項１から２３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  25. 前記ＣＨ２ドメインが、配列番号５、６、又は８２に記載の配列を有する、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  26. 前記ＣＨ２ドメインのＮ末端における免疫グロブリンヒンジ領域、又はその一部をさらに含む、請求項２２から２５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  27. 前記ヒンジ領域、又はその一部が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその一部である、請求項２６に記載の特異的結合メンバー。
  28. 前記ヒンジ領域、又はその一部が、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその一部である、請求項２７に記載の特異的結合メンバー。
  29. 前記ヒンジ領域が、配列番号７に記載の配列を含むか、又はそれからなる、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  30. 配列番号４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、８１、３３、３４、２５、２６、２９、３０、３７、３８、４０、又は４１に記載の配列を含むか、又はそれからなる、請求項１から２９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  31. 配列番号４５、４６、４９、５０、７２、７３、７６、７７、８０、８１、３３、又は３４に記載の配列を含むか、又はそれからなる、請求項１から２９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  32. 第２の抗原結合部位をさらに含む、請求項１から３１のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  33. 前記第２の抗原結合部位が、ＣＤＲベース抗原結合部位である、請求項３２に記載の特異的結合メンバー。
  34. 前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、チェックポイントインヒビター、共刺激分子、又は腫瘍関連抗原に結合する、請求項３３に記載の特異的結合メンバー。
  35. 前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、ＯＸ４０にも、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）にも、ＣＤ１３７にも結合しない、請求項３３又は３４に記載の特異的結合メンバー。
  36. 前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、ＣＤ２７にも、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）にも結合しない、請求項３３から３５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  37. 前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）に結合しない、請求項３３から３６のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  38. 前記特異的結合メンバーが、抗体分子である、請求項１から３７のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  39. 前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子である、請求項３８に記載の特異的結合メンバー。
  40. 前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ１である、請求項３９に記載の特異的結合メンバー。
  41. 前記特異的結合メンバーが、免疫系モジュレーター、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項１から４０のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  42. 前記免疫系モジュレーター又は細胞傷害性分子が、サイトカインである、請求項４１に記載の特異的結合メンバー。
  43. 前記免疫系モジュレーターが、細胞表面受容体、若しくは生物学的に活性なその断片；又は細胞表面受容体のリガンド、若しくは生物学的に活性な前記リガンドの断片である、請求項４１に記載の特異的結合メンバー。
  44. 請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーをコードする核酸。
  45. 請求項４４に記載の核酸を含むベクター。
  46. 請求項４４に記載の核酸、又は請求項４５に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
  47. 請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーを産生する方法であって、前記特異的結合メンバーの産生のための条件下で請求項４６に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む方法。
  48. 前記特異的結合メンバーを単離し、及び／又は精製することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
  50. 患者における癌を治療する方法における使用のための、請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  51. 患者における癌を治療するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーを含む医薬組成物。
  52. 前記方法が、第２の抗癌治療剤を前記患者に投与することをさらに含む、請求項５０に記載の使用のための特異的結合メンバー。
  53. 前記医薬組成物が、第２の抗癌治療剤をさらに含む、請求項５１に記載の医薬組成物。
  54. 感染性疾患を治療する方法における使用のための、請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  55. 患者における感染性疾患を治療するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーを含む医薬組成物。
  56. 前記感染性疾患が、慢性感染性疾患である、請求項５４又は５５に記載の使用のための特異的結合メンバー、又は医薬組成物。
  57. 炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患を治療する方法における使用のための、請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  58. 患者における炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１から４３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーを含む医薬組成物。
  59. 前記炎症、炎症と関連する疾患若しくは病態、又は炎症性疾患が、脳卒中、脳卒中関連炎症、又は血管炎症である、請求項５７又は５８に記載の使用のための特異的結合メンバー、又は医薬組成物。
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