BR112014022909B1

BR112014022909B1 - Processo para preparação de espiroindolonas e de seus intermediários

Info

Publication number: BR112014022909B1
Application number: BR112014022909-0A
Authority: BR
Inventors: Michael Crowe; Michael Foulkes; Giancarlo Francese; Dominique Grimler; Ernst Kuesters; Kurt Laumen; Yunzhong Li; Changxue Lin; Jovana Nazor; Thomas Ruch; Derek Smith; Shiwei Song; Shangjun Teng
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2021-11-03
Also published as: SI2828256T1; KR102057590B1; HRP20191632T1; RU2014142621A; US20150045562A1; AU2013237330A1; BR112014022909A2; HK1202289A1; DK2828256T3; EP3578557B1; ES2748460T3; CA2866222A1; CY1122087T1; RU2662815C2; AU2013237330C1; AU2013237330B2; JP2015512381A; EP3578557A1; JP6117906B2; MX354023B

Abstract

resumo patente de invenção: "processo químico para preparo de espiroindolonas e intermediários deste". a presente invenção referese a processos e intermediários úteis para a produção de compostos de espiroindolona tal como (1'r,3's)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra-hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-ona, sais, hidratos e solvatos deste. 22398129v1 1/1 22398129v1

Description

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIA, TABELA OU PROGRAMA DE COMPUTADOR

[001] A cópia oficial da Listagem de Sequência é submetida concomitantemente com a especificação como um arquivo de texto formatado ASCII por meio de EFS-Web, com um nome de arquivo de "PAT055051_seql2.txt", uns dados de criação de 22 de março de 2013, e um tamanho de 447 quilobytes. A Listagem de Sequência depositada por meio de EFS-Web é parte da especificação e é incorporada em sua totalidade por referência aqui.

Técnica anterior:

[002] (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra- hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-ona (por exemplo, um composto de Fórmula (IV), que compreende uma porção de espiroindolona) e um método sintético de 6 etapas para preparo de, composto intermediários de amina quiral conhecido (IIA) são conhecidos (WO 2009/132921):

Invenção:

[003] A presente invenção é direcionada a um método melhorado de sintetização de compostos de espiroindolona, em particular, (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra- hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-ona, e intermediários usados no método melhorado.

[004] Em uma primeira modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (II), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[005] compreendendo conversão de um composto de Fórmula (I) a composto de Fórmula (II), ou um sal, solvato ou hidrato deste,

[006] em que: a linha pontilhada é uma ligação ou ausência; A é selecionado de C=O e C=NH; ou quando a linha pontilhada é uma ligação dupla A-R8é:

[007]

[008] R4e R7são cada um, independentemente, H ou -Cl; R5é H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 ou -CN; R6é H, -OH, -OCH3, -F ou -Cl; R8é H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 ou - CF3; e n é 1 ou 2.

[009] Em uma segunda modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IIA) ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0010] compreendendo enzimaticamente transaminação de um composto de Fórmula (IA) ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0011] para fornecer o composto de Fórmula (IIA).

[0012] Em uma terceira modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0013] compreendendo, reação de um composto de Fórmula (III), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0014] com um composto de Fórmula (II), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0015] em que o composto de Fórmula (II), ou um sal ou hidrato ou solvato deste, é preparado de um composto de Fórmula (I), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0016] em que: a linha pontilhada é uma ligação ou ausência; A é selecionado de C=O e C=NH; ou quando a linha pontilhada é uma ligação dupla A-R8é:

[0017]

; Raé C1-6 alquila; R1é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com um amino, (C1-C6) alquilamino, (C1-C6) alquila di-alquilamino ou (C1-C6) alquila C(O)NH (C1-6) alquila; R4e R7 são cada um, independentemente, H ou halo; R5e R6são cada um, independentemente hidrogênio, halo, hidroxila, (C1-C6) alquila, trihalo (C1) alquila, ciano ou (C1-C6) alcóxi; R8é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com uma hidroxila; n é 1 ou 2; R1'é hidrogênio ou (C1-C6)alquila; e R4', R5', R6'e R7', são cada um, independentemente hidrogênio, halo, hidróxi, amino, alquilamino, dialquilamino, (C1-C6)alquila, e (C1-C6)alquilóxi.

[0018] Em uma quarta modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0019] compreendendo: reação de um composto de Fórmula (IIIA) ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0020] com um composto de Fórmula (II) ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0021] para fornecer o composto de Fórmula (IVA), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0022] em que o composto de Fórmula (IIA) é preparado do composto de Fórmula (IA), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0023] Em uma quinta modalidade, a invenção é um composto de Fórmula (IC):

[0024] em que: R1é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com um amino, (C1-C6) alquilamino, di-alquilamino de (C1-C6) alquila ou C(O)NH (C1-6) alquila de (C1-C6) alquila; R5e R6são cada um, independentemente hidrogênio, halo, hidroxila, (C1-C6) alquila, trihalo (C1) alquila, ciano ou (C1-C6) alcóxi; R8é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com uma hidroxila; n é 1 ou 2; ou um sal ou hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável deste.

[0025] Em uma sexta modalidade a invenção é um composto selecionado de:

sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável deste.

Campo da Invenção

[0026] A invenção referese a novos processos, uma nova etapa de processo e um novo intermediário útil para a preparação de compostos de espiroindolona úteis pela tratamento de doenças parasíticas compreendendo, por exemplo, uma porção de espiroindolona, tal como (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra- hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-ona.

Antecedentes da Invenção

[0027] A presente invenção referese a processos para a preparação de compostos de espiroindolona, tal como (1'R,3'S)-5,7'- dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra-hidroespiro[indolina-3,1'- pirido[3,4-b]indol]-2-ona.

[0028] (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra- hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-onaé útil no tratamento e/ou prevenção de infecções tais como aquelas causadas por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Trypanosoma cruzi e parasitas do gênero Leishmania tal como, por exemplo, Leishmania donovani., e possui a seguinte estrutura:

[0029] (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra- hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-ona e uma síntese desta são descritos em WO 2009/132921 Al em particular no Exemplo 49 nesta.

[0030] Há uma necessidade de fornecer novo processo para a preparação de (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-flúor-3'-metil-2',3',4',9'-tetra- hidroespiro[indolina-3,1'-pirido[3,4-b]indol]-2-ona a fim de melhorar a eficiência total da síntese para torná-la adequada para produção. Em particular, há uma necessidade de aumentar a eficiência de sintetização do intermediários de amina quiral (IIA):

Descrição Detalhada da Invenção

[0031] Os processo(s), de acordo com a presente invenção, para produção de compostos de espiroindolona, tal como compostos de acordo com a Fórmula (IV), ou sal ou hidrato ou solvato deste, e intermediários, tal como definido aqui, são resumidos no Esquema

Esquema 1

[0032] Isto é, um composto de Fórmula (I), ou sal ou hidrato ou solvato deste, é convertido em um composto de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste, de acordo com métodos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 em que

[0033] - método 1 compreende

[0034] Transaminação enzimática para converter um composto de Fórmula (I), ou sal ou hidrato ou solvato deste, em um composto de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste

[0035] - método 2 compreende

[0036] Catálise assimétrica química para converter um composto de Fórmula (I), ou sal ou hidrato ou solvato deste, em um composto de Fórmula (II), ou sal deste;

[0037] - método 3 compreende

[0038] Redução assimétrica química para converter um composto de Fórmula (I), ou sal ou hidrato ou solvato deste, em um composto de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste;

[0039] - método 4 compreende

[0040] Redução seguida por resolução quiral para converter um compo2sto de Fórmula (I), ou sal ou hidrato ou solvato deste, em um composto de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste;

[0041] - método 5 compreende

[0042] Resolução de lipase para converter um racemato de um composto de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste, em um composto de enantiômero único de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste;

Novozym 435: Lipase B de Candida antarctica imobilizada em uma resina acrílica

[0043] - método 6 compreende

[0044] Uma combinação de dois ou mais dos métodos 1-5 para converter um composto de Fórmula (I), ou sal ou hidrato ou solvato deste, em um composto de Fórmula (II), ou sal ou hidrato ou solvato deste.

[0045] Um composto de Fórmula (II), ou sal deste, pode ser convertido em uma Fórmula de composto (IV), ou sal deste, por exemplo, tal como descrito no WO 2009/132921 em particular tal como descrito nos relevantes reivindicações e exemplos, que são incorporados por referência aqui.

[0046] A invenção especialmente referese aos processos descritos em cada seção. A invenção também referese, independentemente, a cada etapa única descrita em uma sequência de processo dentro da correspondente seção. Por esse motivo, cada e toda etapa única de qualquer processo, consistindo em uma sequência de etapas, descrito aqui é em si próprio uma modalidade preferida da presente invenção. Desta forma, a invenção também referese àquelas modalidades do processo, de acordo com que um composto obtenível como um intermediários em qualquer etapa do processo é usado como um material de partida.

[0047] A invenção também referese a novos materiais de partida que foram especificamente desenvolvidos para a preparação dos compostos de acordo com a invenção, a seu uso e a processos para sua preparação.

[0048] A invenção também referese a intermediários que foram especificamente desenvolvidos para a preparação dos compostos de acordo com a invenção, a seu uso e a processos para sua preparação.

[0049] É notado que no presente pedido geralmente explicações feitas em uma seção são também aplicáveis para outras seções, a não ser que de outra forma especificado. Por exemplo, as explicações pelo resíduo R1na Fórmula (I) dada na seção A também aplicam-se se Fórmula (I) ocorre em outras seções, tal como Seção B, a não ser que de outra forma especificado.

Seção A: Preparação de um composto de Fórmula (I)

[0050] Um composto de Fórmula (I), ou sal deste, ou hidrato ou solvato deste, pode ser preparado tal como descrito abaixo e/ou de acordo com os Exemplos 1 a 3 contidos aqui.

Seção B: Conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II).

[0051] Em uma primeira modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (II), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0052] compreendendo conversão de um composto de Fórmula (I)

a composto de Fórmula (II), ou um sal, solvato ou hidrato deste,

[0053] em que: a linha pontilhada é uma ligação ou ausência; A é selecionado de C=O e C=NH; ou quando a linha pontilhada é uma

[0054] R4e R7são cada um, independentemente, H ou -Cl; R5é H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 ou -CN; R6é H, -OH, -OCH3, -F ou -Cl; R8é H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 ou - CF3; e n é 1 ou 2.

[0055] Em uma primeira modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, R5e R6são flúor quando: R8é - CH3, e n é 1.

[0056] Em uma segunda modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que,R5e R6são flúor e cloro, quando: R8 é -CH3, e n é 1.

[0057] Em uma terceira modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, R5e R6são hidrogênio quando: R8é - CH3 e n é 1.

[0058] Em uma quarta modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, R5é flúor quando: n é 1, e R6é hidrogênio.

[0059] Em uma sexta modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, o composto de Fórmula (II) é de Fórmula (IIA), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0060] Em uma sétima modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, o composto de Fórmula (II) é convertido do composto de Fórmula (I) sob uma condição selecionada de transaminação enzimática, catálise assimétrica química, redução assimétrica e resolução quiral, ou uma combinação de duas ou mais condições.

[0061] Em uma oitava modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, A é C=O.

[0062] Em uma nona modalidade alternativa, a invenção é um processo para conversão de um composto de Fórmula (I) em um composto de Fórmula (II), em que, o composto de Fórmula (I) é um composto de Fórmula (IA) ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0063] Em uma modalidade exemplar, a enzima é SEQ ID NO:

[0064] Em uma segunda modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IIA) ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0065] compreendendo enzimaticamente transaminação de um composto de Fórmula (IA) ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0066] para fornecer o composto de Fórmula (IIA).

[0067] Tipicamente, a cetona, composto (I) é dissolvido em um solvente orgânico, por exemplo, glicol, e adicionado a uma mistura aquosa de HCL de amina de isopropila e piridoxalfosfato, seguido pela adição de tampão de TEA. O pH é em seguida ajustado a neutro com uma base apropriada, por exemplo, NaOH seguido por aquecimento e adição da transaminase. A reação é deixada agitar a temperatura durante aproximadamente 24 h. O produto de amina quiral sólido (composto de Fórmula (II)) é isolado por mecanismos conhecidos àquele de versatilidade na técnica, e/ou de acordo com os Exemplos 10-12.

[0068] Em uma modalidade exemplar, a enzima é SEQ ID NO: 134.

Seção C: Conversão de um composto de Fórmula (II) em um composto de Fórmula (IV)

[0069] Em uma terceira modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0070] compreendendo, reação de um composto de Fórmula (III), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0071] com um composto de Fórmula (II), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0072] em que o composto de Fórmula (II), ou um sal ou hidrato ou solvato deste, é preparado de um composto de Fórmula (I), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0073] em que: a linha pontilhada é uma ligação ou ausência; A é selecionado de C=O e C=NH; ou quando a linha pontilhada é uma ligação dupla A-R8é:

[0074]

; Raé C1-6 alquila; R1é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com um amino, (C1-C6) alquilamino, di- alquilamino de (C1-C6) alquila ou C(O)NH (C1-C6) alquila de (C1-C6) alquila; R4e R7são cada um, independentemente, H ou halo; R5e R6 são cada um, independentemente hidrogênio, halo, hidroxila, (C1-C6) alquila, trihalo (C1) alquila, ciano ou (C1-C6) alcóxi; R8é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com uma hidroxila; n é 1 ou 2, R1'é hidrogênio ou (C1-C6)alquila; e R4', R5', R6'e R7', são cada um, independentemente hidrogênio, halo, hidróxi, amino, alquilamino, dialquilamino, (C1-C6)alquila, e (C1-C6)alquilóxi.

[0075] Em uma décima modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, R5e R6são flúor quando: R8é -CH3, e n é 1.

[0076] Em uma décima primeira modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, R5e R6são flúor e cloro quando: R8é -CH3, e n é 1.

[0077] Em uma décima segunda modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, R5e R6são hidrogênio quando: R8é -CH3 e n é 1.

[0078] Em uma décima quarta modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, R5é flúor quando: n é 1, e R6é hidrogênio.

[0079]

[0080] R4e R7são cada um, independentemente, H ou -Cl; R5é H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 ou -CN; R6é H, -OH, -OCH3, -F ou -Cl; R8é H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3 ou - CF3; e n é 1 ou 2.

[0081] Em uma décima quinta modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, o composto de Fórmula (II) é de Fórmula (IIA), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0082] Em uma décima sexta modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, em que R5'é um halo.

[0083] Em uma décima sétima modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, R5'é um cloro, e R1', R4', R6'e R7'são cada um hidrogênio.

[0084] Em uma décima oitava modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IV) em que, o composto de Fórmula (III) é de Fórmula (IIIA), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0085] Em uma modalidade exemplar, a enzima é SEQ ID NO: 134.

[0086] Em uma quarta modalidade, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0087] compreendendo: reação de um composto de Fórmula (IIIA) ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0088] com um composto de Fórmula (II) ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0089] para fornecer o composto de Fórmula (IVA), ou um sal ou solvato ou hidrato deste,

[0090] em que o composto de Fórmula (IIA) é preparado do composto de Fórmula (IA), ou um sal ou hidrato ou solvato deste,

[0091] Em uma décima nona modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, o composto de Fórmula (IIA) é convertido a um sal de Fórmula (IIB):

[0092] antes de reação com o composto de Fórmula (IIIA).

[0093] Em uma modalidade exemplar, a enzima é SEQ ID NO: 134.

[0094] Em uma vigésima modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, a reação é realizada sob condições básicas.

[0095] Em uma vigésima primeira modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, a reação é realizada na presença de trietilamina.

[0096] Em uma vigésima segunda modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, o composto de Fórmula (IVA) é isolado como um sal de Formula (IVB)

[0097] Em uma vigésima terceira modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, o sal de Fórmula (IVB) é convertido ao composto de Fórmula (IVA) em base livre.

[0098] Em uma vigésima quarta modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, o sal de Fórmula (IVB) é convertido ao composto de Fórmula (IVA) em base livre com carbonato de sódio.

[0099] Em uma vigésima quinta modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, o composto de Fórmula (IVA) é um hidrato.

[00100] Em uma vigésima sexta modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) em que, o composto de Fórmula (IVA) é um % hidrato.

[00101] Em uma vigésima sétima modalidade alternativa, a invenção é um processo para preparo de um composto de Fórmula (IVA) % hidrato em que, o composto de Fórmula (IVA) % hidrato é moído depois de isolamento.

Seção D: Uso dos Compostos Novos e Inventivos de Fórmula (IC).

[00102] Em uma quinta modalidade, a invenção é um composto de Fórmula (IC):

[00103] em que: R1é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com um amino, (C1-C6) alquilamino, di-alquilamino de (C1-C6) alquila ou C(O)NH (C1-6) alquila de (C1-C6) alquila; R5e R6são cada um, independentemente hidrogênio, halo, hidroxila, (C1-C6) alquila, trihalo (C1) alquila, ciano ou (C1-C6) alcóxi; R8 é (C1-C6) alquila, opcionalmente substituída com uma hidroxila; n é 1 ou 2; ou um sal ou hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável deste.

[00104] Em uma vigésima oitava modalidade alternativa, a invenção é um composto de Fórmula (IC) em que, R5e R6são flúor quando: R8 é -CH3, e n é 1.

[00105] Em uma vigésima nona modalidade alternativa, a invenção é um composto de Fórmula (IC) em que, R5e R6são flúor e cloro, quando: R8é -CH3, e n é 1.

[00106] Em uma trigésima modalidade alternativa, a invenção é um composto de Fórmula (IC) em que, R5e R6são hidrogênio quando: R8 é -CH3 e n é 1.

[00107] Em uma trigésima primeira modalidade alternativa, a invenção é um composto de Fórmula (IC) em que, R5é flúor quando: n é 1, e R6é hidrogênio.

[00108] Em uma trigésima segunda modalidade alternativa, a invenção é um composto de Fórmula (IC) em que, R1é H, -CH3,

[00109] R5é H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 ou -CN; R6é H, - OH, -OCH3, -F ou -Cl; R8é H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, - CO2CH3, -CO2CH2CH3 ou -CF3; e n é 1 ou 2.

[00110] Em uma trigésima terceira modalidade alternativa, a invenção é um composto de Fórmula (I) em que, o composto é de Fórmula (IA):

[00111] ou um sal ou hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável deste.

[00112] Em uma sexta modalidade, a invenção é um composto selecionado de:

um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável deste.

Seção I: Termos gerais

[00113] Listadas abaixo são definições de vários termos usados para descrever as novas etapas intermediárias e sintéticas da presente invenção. Estas definições, seja por substituição de uma, mais do que uma ou todas as expressões ou símbolos gerais usados na presente descrição e desta forma produzindo modalidades da invenção, em particular aplicam-se aos termos como eles são usados ao longo da especificação a não ser que eles sejam de outra forma definido em exemplos específicos seja individualmente ou como parte de um grupo maior. Desta forma, as definições gerais usadas acima e abaixo, a não ser que definido diferentemente, possuem os seguintes significados:

[00114] O termo "C1-C20-" define uma porção com até e incluindo maximamente 20, especialmente até e incluindo maximamente 7 átomos de carbono, a referida porção sendo de cadeia ramificada (uma ou mais vezes) ou liquase e ligada por meio de um carbono terminal ou um não terminal.

[00115] Alquila sendo um radical ou parte de um radical é uma cadeia de carbono liquase ou ramificada (uma ou, se desejado e possível, mais vezes), e é especialmente C1-C7-alquila, tal como C1- C4-alquila, em particular C1-C4-alquila ramificada, tal como isopropila. O termo "inferior" ou "C1-C7-" define uma porção com até e incluindo maximamente 7, especialmente até e incluindo maximamente 4, átomos de carbono, a referida porção sendo de cadeia ramificada (uma ou mais vezes) ou liquase e ligada por meio de um carbono terminal ou um não terminal. Inferior ou C1-C7-alquila, por exemplo, é n-pentila, n-hexila ou n-heptila ou de preferência C1-C4-alquila, especialmente como metila, etila, n-propila, iso-propila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, em particular metila, etila, n-propila, iso-propila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila; de preferência metila.

[00116] Alquilamino e dialquilamino referese a alquil-NH- e (alquil)2N-, respectivamente, em que alquila pode ser liquase ou ramificada. O grupo de alquila, por exemplo, compreende 1 a 7 e em particular 1 a 4 átomos de C. Alguns exemplos são metilamino, dimetilamino, etilamino, e dietilamino; de preferência metilamino.

[00117] Halo ou halogênio é de preferência flúor, cloro, bromo ou iodo, de preferência flúor ou cloro; onde halo é mencionado como uma substituinte, onde possível, um ou mais (por exemplo, até três ou um) átomos de halogênio podem estar presentes, por exemplo, em halo- C1-C7-alquila, tal como trifluorometila, 2,2-difluoroetila ou 2,2,2- trifluoroetila.

[00118] Halo-C1-C7-alquila pode ser linear ou ramificada e em particular compreende 1 a 4 átomos de C, por exemplo, 1 ou 2 átomos de C. Exemplos são fluorometila, difluorometila, trifluorometila, clorometila, diclorometila, triclorometila, 2-cloroetila e 2,2,2- trifluoroetila; de preferência trifluorometila.

[00119] Alcóxi, sendo um radical ou parte de um radical, referese a alquil-O-, em que o termo alquila é tal como definido aqui, e inclui, por exemplo, C1-C20-alcóxi (-O-C1-C20alquila), de preferência C1-C7-alcóxi (-O-Ci-C7alquila). Em particular, alcóxi inclui, por exemplo, radicais metóxi, etóxi, n-propilóxi, isopropilóxi, n-butilóxi, isobutilóxi, sec- butilóxi, terc-butilóxi, pentilóxi, hexilóxi e heptilóxi; de preferência metóxi.

[00120] O termo "base opticamente ativa" descreve, por exemplo, aminas quirais, de preferência aminas terciárias quirais, mais preferivelmente alcaloides de quinquina, tais como quinidina e quinina, mais preferivelmente modificado alcaloides de quinquina. Exemplos de tais alcaloides de quinquina modificados são detalhados, por exemplo, em Tian, S.-K.; Chen, Y.; Hang, J.; Tang, L.; McDiad, P.; Deng, L. Acc. Chem. Res. 2004, 37, 621-631 e referências citadas nesta.

[00121] O termo "catalisador de transferência de fase" tal como usado aqui referese a uma quantidade catalítica de um agente químico que realça a taxa de uma reação entre espécies químicas localizadas em diferentes fases (por exemplo, líquidos imiscíveis ou sólido e líquido) por extração de um dos reagentes, mais comumente um ânion, através da interface na outra fase. Estes catalisadores incluem sais de fosfônio ou amônio quaternário (por exemplo, sais de tetraalquilamônio, em que alquila pode ser igual ou diferente), ou agentes que complexam cátions inorgânicos (por exemplo, éteres de coroa ou outros criptandos). O cátion do catalisador é não consumido na reação ainda que uma permuta de ânion ocorra. Em particular, catalisadores de transferência de fase adequados a ser usados de acordo com a presente invenção são sais de amônio quaternário, por exemplo, da Fórmula RmRnRlRkNX, em que RmRnRlRk são, alquila ou igual ou diferente, e X é halo (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto) ou hidróxido, por exemplo, hidróxido de tetra-n-butilamônio.

[00122] Um catalisador "heterogêneo"tal como usado aqui referese a um catalisador suportado em um portador, tipicamente ainda que não necessariamente um substrato compreendido de um material inorgânico, por exemplo, um material poroso tal como óxido de carbono, silício e/ou alumínio.

[00123] Um catalisador "homogêneo"tal como usado aqui referese a um catalisador que é não suportado em um portador.

[00124] O termo "quiral" referese a moléculas que possuem a propriedade de não sobreponibilidade em seu parceiro de espelhamento, enquanto o termo "aquiral" referese a moléculas que são sobreponíveis em seu parceiro de espelhamento.

[00125] O termo "catalisador" significa qualquer substância que afete a taxa de uma reação química por diminuição da energia de ativação para a reação química.

[00126] O termo "catalisador em pó"significa um catalisador com um conteúdo de água de 0 a 30% em massa.

[00127] O termo "relação de substrato para catalisador" (S/C) referese à relação molar de compostos de partida, ou sais deste, para " catalisador de metal de transição".

[00128] O termo "preparação"significa o trabalho de isolamento e/ou purificação que é realizado uma vez que a reação é concluída.

[00129] Tal como usado aqui, a não ser que especificado de outra forma, o termo "temperatura ambiente" ou "temperatura ambiente" significa uma temperatura de 15 a 30°C, tal como de 20 a 30°C, tal como de 20 a 25°C.

[00130] O termo "inerte" tal como usado ao longo deste pedido, significa não reativo com qualquer dos reagentes, solventes, ou outro componentes da mistura de reação. Tais condições inertes são geralmente realizadas por utilização de gás inerte tal como dióxido de carbono, hélio, nitrogênio, argônio, entre outros gases.

[00131] Ligações com o asterisco (*) denotam ponto de ligação ao resto da molécula.

[00132] Os compostos da presente invenção podem possuir um ou mais centros assimétricos. As configurações absolutas preferidas são tal como indicado aqui especificamente. No entanto, qualquer possível enantiômero puro, diastereoisômero puro, ou misturas deste, por exemplo, misturas de enantiômeros, tal como racematos, são abrangidos pela presente invenção.

[00133] Nas Fórmulas do presente pedido, o termo "^w'"," " ou "—" em uma C-sp3representa uma ligação covalente em que a estereoquímica da ligação não é definida. Isto significa que o termo "^/v'" ou "—" em uma C-sp3compreende uma (S) configuração assim como uma (R) configuração do respeitoivo centro quiral. Além disso, misturas são também abrangidas, por exemplo, misturas de enantiômeros, tal como racematos, são abrangidas pela presente invenção.

[00134] Nas Fórmulas do presente pedido o termo "^^" ou " ^ " em uma C-sp2representa uma ligação covalente, em que a estereoquímica ou a geometria da ligação não está definida. Isto significa que o termo "MW" em uma C-sp2compreende uma cis(Z) configuração assim como uma trans (E) configuração da respeitiva ligação dupla. Além disso, misturas são também abrangidas, por exemplo, misturas de isômeros de ligação dupla são abrangidas pela presente invenção.

[00135] Nas Fórmulas do presente pedido, o termo "=" indica uma ligação Csp3-Csp3ou uma ligação Csp2-Csp2.

[00136] Os compostos da presente invenção podem possuir um ou mais centros assimétricos. As configurações absolutas preferidas são tal como indicado aqui especificamente.

[00137] Nas Fórmulas do presente pedido o termo "/" em uma C- sp3indica a estereoquímica absoluta, seja (R) ou (S).

[00138] Nas Fórmulas do presente pedido o termo "z*" em uma C- sp3indica a estereoquímica absoluta, seja (R) ou (S).

[00139] O termo "pureza estereomérica" a uma porcentagem dada significa que o estereoisômero designado predomina nesta porcentagem dada em uma mistura de estereoisômeros.

[00140] O termo "estereoisômero" significa uma das configurações absolutas de uma molécula orgânica única possuindo pelo menos um carbono assimétrico. Incluídos dentro da definição de um estereoisômero estão enantiômeros e diastereômeros.

[00141] O termo "resolução" referese à separação ou concentração ou depleção de um dos estereoisômeros de uma molécula.

[00142] Sais são especialmente sais farmaceuticamente aceitáveis ou geralmente sais de qualquer dos intermediários mencionados aqui, onde sais não são excluídos por razões químicas, a pessoa versada facilmente entenderá. Eles podem ser formados onde grupos de formação de sal, tal como grupos básicos ou acídicos, estão presentes que pode existir em forma dissociada pelo menos parcialmente, por exemplo, em uma faixa de pH de 4 a 10 em soluções aquosas, ou pode ser isolado especialmente em forma sólida, especialmente cristalina.

[00143] Tais sais são formados, por exemplo, como sais de adição de ácido, de preferência com ácidos orgânicos ou inorgânicos, de compostos ou qualquer dos intermediários mencionados aqui com um átomo de nitrogênio básico (por exemplo, imino ou amino), especialmente os sais farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos inorgânicos adequados são, por exemplo, ácidos de halogênio, tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ou ácido fosfórico. Ácidos orgânicos adequados são, por exemplo, ácidos carboxílicos, fosfônicos, sulfônicos ou sulfâmicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido lático, ácido fumárico, ácido sucínico, ácido cítrico, aminoácidos, tais como ácido glutâmico ou ácido aspártico, ácido maléico, ácido hidroximaléico, ácido metilmaléico, ácido benzoico, ácido metano- ou etano-sulfônico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido benzenosulfônico, ácido 2-naftalenosulfônico, ácido 1,5-naftaleno- dissulfônico, ácido N-ciclo-hexilsulfâmico, ácido N-metil-, N-etil- ou N- propil-sulfâmico, ou outros ácidos protônicos orgânicos, tal como ácido ascórbico.

[00144] Na presença de radicais negativamente carregados, tal como carbóxi ou sulfo, sais podem também ser formados com bases, por exemplo, sais de metal ou amônio, tal como metal de álcali ou sais de metal alcalinoterroso, por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou sais de amônio com amônia ou aminas orgânicas adequadas, por exemplo, trietilamina ou tri(2- hidroxietil)amina, N-etil-piperidina, N,N'-dimetilpiperazina, t-butilamina, n-butilamina, feniletilamina, diciclo-hexilamina ou ciclo-hexilamina.

[00145] Quando um grupo básico e um grupo ácido estão presentes na mesma molécula, qualquer dos intermediários mencionados aqui pode também formar sais internos.

[00146] Para propósitos de isolamento ou purificação de qualquer dos intermediários mencionados aqui é também possível usar sais farmaceuticamente inaceitáveis, por exemplo, picratos ou percloratos.

[00147] Formas de sais preferidos incluem, por exemplo, sais de adição de ácido. Os compostos possuindo pelo menos um grupo ácido (por exemplo, COOH ou 5-tetrazolila) podem também formar sais com bases. Sais com bases adequados são, por exemplo, sais de metal, tal como sais de metal de álcali ou metal alcalinoterroso, por exemplo, sais de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, ou sais com amônia ou uma amina orgânica, tal como morfolina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, uma mono-, di- ou tri-inferior, por exemplo, etil-, terc-butil-, dietil-, di-isopropil-, trietil-, tributil- ou dimetilpropilamina, ou uma alquilamina mono-, di- ou tri-hidróxi inferior, por exemplo, mono-, di- ou tri-etanolamina. Correspondentes sais internos podem além disso ser formados. Sais que são inadequados para usos farmacêuticos mas que podem ser empregados, por exemplo, pela isolamento ou purificação de compostos livres I ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são também incluídos. Mais preferivelmente o sal de Fórmula (IV) é o sal de ácido canforsulfônico.

[00148] Em particular, o termo "sal de um composto de Fórmula (IV)" referese, por exemplo, a um sal de amina deste, um sal de álcali deste ou um sal de metal alcalinoterroso deste (por exemplo, sal de sódio, sal de potássio, sal de cálcio, sal de magnésio, etc). Em particular, o termo "amina" na expressão "sal de amina deste", por exemplo, quando referindo-se a um sal de amina do composto de Fórmula (IV), significa amina terciária de Fórmula NR9R10R11, amina secundária de Fórmula NHR9R10R ou amina primária de Fórmula NH2R9, em que R9, R10 e R11 são, independentemente um do outro, alquila, arila, cicloalquila ou heterociclila, tal como definido aqui, de preferência alquila ou cicloalquila. O termo "amina"é, por exemplo, difenilamina, di-isopropilamina, dimetilamina, trietilamina, di- isopropiletilamina, diciclo-hexilamina, t-butilamina, n-butilamina ou ciclo-hexilamina, em particular, t-butilamina, n-butilamina ou ciclo- hexilamina, mais preferivelmente n-butilamina ou ciclo-hexilamina.

[00149] Tal como usado nesta especificação e as reivindicações anexadas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais a não ser que o contexto claramente indique de outra forma. Desta forma, por exemplo, referência a "um polipeptídeo"inclui mais do que um polipeptídeo.

[00150] Similarmente, "compreendem,""compreende,""compreendendo""incluem,""inclui," e "incluindo"são alternáveis e não pretendido ser limitantes.

[00151] Deve ser também entendido que onde descrições de várias modalidades usam o termo "compreendendo," aqueles versados na técnica entenderiam que em alguns exemplos específicos, uma modalidade pode ser alternativamente descrita utilizando de linguagem "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em".

[00152] Deve ser entendido que ambas a antecedente descrição geral, incluindo os desenhos, e a seguinte descrição detalhada são exemplares e explicativos apenas e não são restritivos desta descrição.

[00153] Os cabeçalhos de seção usados aqui são para propósitos organizacionais apenas e não ser interpretados como limitantes do tema descrito.

[00154] As abreviações usadas para os aminoácidos geneticamente codificados são convencionais e são como segue:

[00155] Quando as abreviações de três letras são usadas, a não ser que especificamente precedido por um "L" ou um "D" ou claro do contexto em que a abreviação é usado, o aminoácido pode ser em ou a L- ou D-configuração sobre α-carbono (Cα). Por exemplo, enquanto que "Ala" designa alanina sem especificação da configuração sobre o α-carbono, "D-Ala" e "L-Ala"designam D-alanina e L-alanina, respectivamente. Quando as abreviações de uma letra são usadas, letras em caixa alta designam aminoácidos na L-configuração sobre o α-carbono e letras em caixa baixa designam aminoácidos na D- configuração sobre o α-carbono. Por exemplo, "A" designa L-alanina e "a" designa D-alanina. Quando sequências de polipeptídeo são apresentadas como uma série de abreviações de uma letra ou três letras (ou misturas destas), as sequências são apresentadas na direção de amino (N) para carbóxi (C) de acordo com convenção comum.

[00156] As abreviações usadas para os nucleosídeos geneticamente codificantes são convencionais e são como segue: adenosina (A); guanosina (G); citidina (C); timidina (T); e uridina (U). A não ser que especificamente delineado, os nucleotídeos abreviados podem ser ou ribonucleosídeos ou 2'-desoxirribonucleosídeos. Os nucleosídeos podem ser especificados como sendo ou ribonucleosídeos ou 2'-desoxirribo- nucleosídeos em uma base individual ou em uma base agregada. Quando sequências de ácido nucléico são apresentadas como uma série de abreviações de uma letra, as sequências são apresentadas na direção de 5' a 3' de acordo com convenção comum, e os fosfatos não são indicados.

[00157] Em referência à presente descrição, os termos técnicos e científicos usados nas descrições aqui possuirão os significados comumente entendidos por aquele de ordinária versatilidade na técnica, a não ser que especificamente definido de outra forma. Por conseguinte, os seguintes termos pretende-se possuir os seguintes significados:

[00158] "Proteína", "polipeptídeo,"e "peptídeo" são usados alternadamente aqui para denotar um polímero de pelo menos dois aminoácidos covalentemente ligados por uma ligação de amida, independente de tamanho ou modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação, fosforilação, lipidação, miristilação, ubiquitinação, etc.). Incluídos dentro desta definição estão D- e L- aminoácidos, e misturas de D- e L-aminoácidos.

[00159] "Polinucleotídeo"ou "ácido nucléico'referese a dois ou mais nucleosídeos que são covalentemente ligados juntos. O polinucleotídeo pode ser integralmente compreendido ribonucleosídeos (isto é, um RNA), integralmente compreendido de 2'desoxirribonucleotídeos (isto é, um DNA) ou misturas de ribo- e 2'desoxirribonucleosídeos. Enquanto os nucleosídeos tipicamente serão ligados juntos por meio de ligações de fosfodiéster padrões, os polinucleotídeos podem incluir uma ou mais ligações não padrões. O polinucleotídeo pode ser de filamento único ou de filamento duplo, ou pode incluir tanto regiões de filamento único quanto regiões de filamento duplo. Além do mais, enquanto um polinucleotídeo tipicamente será composto das nucleobases codificantes de ocorrência natural (isto é, adenina, guanina, uracila, timina e citosina), ele pode incluir uma ou mais nucleobases modificadas e/ou sintéticas, tal como, por exemplo, inosina, xantina, hipoxantina, etc. De preferência, tais nucleobases modificadas ou sintéticas serão nucleobases codificantes.

[00160] "Aminotransferase" e "transaminase"são usados alternadamente aqui para referir-se a um polipeptídeo possuindo uma capacidade enzimática de transferência de um grupo de amino (NH2) de uma amina primária a um grupo de carbonila (C=O) de uma molécula receptora. Transaminases tal como usado aqui incluem transaminase de ocorrência natural (tipo silvestre) assim como polipeptídeos planejados como de ocorrência não natural gerados por manipulação humana.

[00161] "Receptor de amino" e "receptor de amina,""ceto substrato,""ceto," e "cetona"são usados alternadamente aqui para referir-se a um composto de carbonila (ceto, ou cetona) que aceita um grupo de amino de um doador de amina. Em algumas modalidades, receptores de amino são moléculas da seguinte Fórmula geral,

[00162] em que cada um de Rαe Rβ, quando tomados independentemente, é uma alquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila, que pode ser não substituída ou substituída com um ou mais grupos enzimaticamente aceitáveis. Rαpode ser igual ou diferente de Rβem estrutura ou quiralidade. Em algumas modalidades, Rαe Rα, tomados juntos, podem formar um anel que é não substituído, substituído, ou fundido a outros anéis. Receptores de amino incluem ácidos ceto carboxílicos e alcanonas (cetonas). Típicos ácidos ceto carboxílicos são a-ácidos ceto carboxílicos tal como glioxálico ácido, ácido pirúvico, ácido oxaloacético, e outros mais, assim como sais destes ácidos. Receptores de amino também incluem substâncias que são convertidas a um receptor de amino por outras enzimas ou processos celulares integrais, tal como ácido fumárico (que pode ser convertido a ácido oxaloacético), glicose (que pode ser convertido a piruvato), lactato, ácido maléico, e outros. Receptores de amino que podem ser usados incluem, a título de exemplo e não limitação, 3,4-di- hidronaftalen-1(2H)-ona, 1-fenilbutan-2-ona, 3,3-dimetilbutan-2-ona, octan-2-ona, 3-oxobutanoato de etila, 4-fenilbutan-2-ona, 1-(4- bromofenil)etanona, 2-metil-ciclo-hexamona, 7-metóxi-2-tetralona, 1- hidroxibutan-2-ona, ácido pirúvico, acetofenona, 3'-hidroxiacetofenona, 2-metóxi-5-fluoroacetofenona, ácido levulínico, 1-fenilpropan-1-ona, 1- (4-bromofenil)propan-1-ona, 1-(4-nitrofenil)propan-1-ona, 1-fenilpropan- 2-ona, ácido 2-oxo-3-metilbutanoico, 1-(3-trifluorometilfenil)propan-1- ona, hidroxipropanona, metoxioxipropanona, 1-fenilbutan-1-ona, 1-(2,5- dimetoxi-4-metilfenil)butan-2-ona, 1-(4-hidroxifenil)butan-3-ona, 2- acetilnaftaleno, ácido fenilpirúvico ácido, 2-cetoglutárico, e ácido 2- cetosucínico, incluindo isômeros únicos tanto (R) quanto (S) onde possível.

[00163] "Doador de amino" ou "doador de amina" referese a um composto de amino que doa um grupo de amino ao receptor de amino, desse modo tornando-se uma espécie de carbonila. Em algumas modalidades, doadores de amino são moléculas da seguinte Fórmula geral,

[00164] em que cada um de Rεe Rδ, quando tomados independentemente, é uma alquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila, que é não substituída ou substituída com um ou mais grupos enzimaticamente não inibidores. Rεpode ser igual ou diferente de Rδem estrutura ou quiralidade. Em algumas modalidades, Rεe Rδ, tomados juntos, podem formar um anel que é não substituído, substituído, ou fundido a outros anéis. Típicos doadores de amino que podem ser usados incluem aminoácidos quirais e aquirais, e aminas quirais e aquirais. Doadores de amino que podem ser usados incluem, a título de exemplo e não limitação, isopropilamina (também referida como 2-aminopropano), α-fenetilamina (também denominado 1- feniletanamina), e seus enantiômeros (S)-1-feniletanamina e (R)-1- feniletanamina, 2-amino-4-fenilbutano, glicina, ácido L-glutâmico, L- glutamato, glutamato de monosódio, L-alanina, D-alanina, D,L-alanina, ácido L-aspártico, L-lisina, D,L-ornitina, β-alanina, taurina, n-octilamina, ciclo-hexilamina, 1,4-butanodiamina (também referido como putrescina), 1,6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutírico, tiramina, e amina de benzila, 2-aminobutano, 2-amino-1-butanol, 1- amino-1-feniletano, 1-amino-1-(2-metóxi-5-fluorofenil)etano, 1-amino-1- fenilpropano, 1-amino-1-(4-hidroxifenil)propano, 1-amino-1-(4- bromofenil)propano, 1-amino-1-(4-nitrofenil)propano, 1-fenil-2- aminopropano, 1-(3-trifluorometilfenil)-2-aminopropano, 2-aminopropanol, 1-amino-1-fenilbutano, 1-fenil-2-aminobutano, 1-(2,5-dimetoxi-4- metilfenil)-2-aminobutano, 1-fenil-3-aminobutano, 1-(4-hidroxifenil)-3- aminobutano, 1-amino-2-metilciclopentano, 1-amino-3-metilciclopentano, 1-amino-2-metilciclo-hexano, 1-amino-1-(2-naftil)etano, 3- metilciclopentilamina, 2-metilciclopentilamina, 2-etilciclopentilamina, 2- metilciclo-hexilamina, 3-metilciclo-hexilamina, 1-aminotetralina, 2- aminotetralina, 2-amino-5-metoxitetralina, e 1-aminoindano, incluindo isômeros únicos tanto (R) quanto (S) onde possível e incluindo todos os possíveis sais das aminas.

[00165] "Amina quiral" referese a aminas de Fórmula geral R1- CH(NH2)- R1e é empregado aqui em seu sentido mais amplo, incluindo uma ampla variedade de compostos alifáticos e alicíclicos de tipos funcionais diferentes e mistos, caracterizado pela presença de um grupo de amino primário ligado a um átomo de carbono secundário que, além de um átomo de hidrogênio, porta ou (i) um grupo divalente formando uma estrutura cíclica quiral, ou (ii) dois substituintes (diferente de hidrogênio) diferenciando um do outro em estrutura ou quiralidade. Grupos divalentes formando uma estrutura cíclica quiral incluem, por exemplo, 2-metilbutano-1,4-diila, pentano-1,4-diila, hexano-1,4-diila, hexano-1,5-diila, 2-metilpentano-1,5-diila. O dois diferentes substituintes no átomo de carbono secundário (R1e R2 acima) também pode variar amplamente e incluem alquila, aralquila, arila, halo, hidróxi, alquila inferior, alcóxi inferior, alquiltio inferior, cicloalquila, carbóxi, carbalcóxi, carbamoila, carbamoila substituída por mono- e di-(alquila inferior), trifluorometila, fenila, nitro, amino, amino substituído por mono- e di-(alquila inferior), alquilsulfonila, arilsulfonila, alquilcarboxamido, arilcarboxamido, etc., assim como alquila, aralquila, ou arila substituída pelo antecedente.

[00166] "Piridoxal-fosfato,""PLP,""piridoxal-5'-fosfato,""PYP," e "P5P"são usados alternadamente aqui para referir-se ao composto que age como uma coenzima em reações de transaminase. Em algumas modalidades, fosfato piridoxal é definido pela estrutura ácido 1-(4'-formil-3'-hidróxi-2'-metil-5'-piridil)metoxifosfônico, número de CAS [54-47-7], Piridoxal-5'-fosfato pode ser produzido in vivo por fosforilação e oxidação de piridoxol (também conhecido como Vitamina B6). Em reações de transaminação usando enzimas de transaminase, o grupo de amina do doador de amino é transferido à coenzima para produzir um subproduto de ceto, enquanto piridoxal-5'-fosfato é convertido a fosfato de piridoxamina. Piridoxal-5'-fosfato é regenerado por reação com um diferente composto de ceto (o receptor de amino). A transferência do grupo de amina de fosfato de piridoxamina ao receptor de amino produz uma amina quiral e regenera a coenzima. Em algumas modalidades, o piridoxal-5'-fosfato pode ser substituído por outros membros da família da vitamina B6, incluindo piridoxina (PN), piridoxal (PL), piridoxamina (PM), e suas contrapartes fosforiladas; fosfato de piridoxina (PNP), e fosfato de piridoxamina (PMP).

[00167] "Sequência de codificação"referese àquela porção de um ácido nucléico (por exemplo, um gene) que codifica uma sequência de aminoácido de uma proteína.

[00168] "De ocorrência natural" ou "tipo silvestre" referese à forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo de ocorrência natural ou tipo silvestre é uma sequência presente em um organismo que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado por manipulação humana.

[00169] "Recombinante" ou "planejado" ou "de ocorrência não natural" quando usados com referência a, por exemplo, uma célula, ácido nucléico, ou polipeptídeo, referese a um material, ou um material correspondente à forma natural ou nativa do material, que foi modificado de uma maneira que não existiria de outra forma na natureza, ou é idêntico a este, mas produzido ou derivado de materiais sintéticos e/ou por manipulação usando técnica recombinante. Exemplos não limitantes incluem, entre outros, células recombinantes expressando genes que não são encontradas dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra forma expressados a um diferente nível.

[00170] "Porcentagem de identidade de sequência"e "homologia de porcentagem"são usados alternadamente aqui para referir-se a comparações entre polinucleotídeos e polipeptídeos, e são determinados por comparação de duas sequências optimamente alinhadas durante uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) quando comparado à sequência de referência para alinhamento ótimo do duas sequências. A porcentagem pode ser calculada por determinação do número de posições a que o resíduo de aminoácido ou base de ácido nucléico idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Alternativamente, a porcentagem pode ser calculada por determinação do número de posições a que ou o idêntico resíduo de aminoácido ou base de ácido nucléico ocorre em ambas as sequências ou um resíduo de aminoácido ou base de ácido nucléico é alinhado com um intervalo para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Aqueles versados na técnica apreciarão que há muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências. Ótimo alinhamento de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, by the local homology algorithm of Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, by the homology alignment algorithm of Necessitamleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, by the search for similarity method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, by computadorized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA in the GCG Wisconsin Software Pacote), or by visual inspeção (veja geralmente, Current Protocolos in Molecular Biology, F. M. Ausubel e outros, eds., Current Protocolos, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)). Exemplos de algoritmos que são adequados para determinação de identidade de sequência em porcentagem e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2,0, que são descritos em Altschul e outros, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul e outros, 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402, respectivamente. Software para desenvolvimento de análises de BLAST está publicamente disponível através do website Centro Nacional para Informação de Biotecnologia. Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de sequência de alto escore (HSPs) por identificação de palavras curtas de tamanho W na sequência questão, que ou emparelha ou satisfaz algum limiar de escore de valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo tamanho em uma sequência de base de dados. T é referido como, o limiar de escore de palavra de vizinhança (Altschul e outros, supra). Estes tiros de palavra de vizinhança iniciais agem como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-os. Os tiros de palavra são em seguida estendidos em ambas as direções junto a cada sequência para até que o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. Escores cumulativos são calculados utilizando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos de emparelhamento; sempre >0) e N (escore de penalidade para resíduos de desemparelhamento; sempre <0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de escore é usada para calcular o escore cumulativo. Extensão dos tiros de palavra em cada direção são detidos quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor obtido máximo; o escore cumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore negativo; ou o terminal de ou sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como padrões um tamanho de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrões um tamanho de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a BLOSUM62 matriz de escore (veja Henikoff e Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). Determinação exemplar de alinhamento de sequência e % de identidade de sequência podem empregar os programas BESTFIT ou GAP no GCG pacote de Software Wisconsin (Accelrys, Madison WI), utilizando parâmetros padrão fornecidos.

[00171] "Sequência de referência"referese a uma sequência definida usada como uma base para uma comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subgrupo de uma sequência mais larga, por exemplo, um segmento de um gene ou sequência de polipeptídeo de tamanho natural. Geralmente, uma sequência de referência é pelo menos 20 resíduos de nucleotídeo ou aminoácido de tamanho, pelo menos 25 resíduos de tamanho, pelo menos 50 resíduos de tamanho, ou o tamanho natural do ácido nucléico ou polipeptídeo. Uma vez que dois polinucleotídeos ou polipeptídeos podem cada um (1) compreender uma sequência (isto é, uma porção da sequência completa) que é similar entre as duas sequências, e (2) pode também compreender uma sequência que é divergente entre as duas sequências, comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleotídeos ou polipeptídeo são tipicamente desempenhadas por comparação de sequências dos dois polinucleotídeos ou polipeptídeos sobre uma "janela de comparação"para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Em algumas modalidades, uma "sequência de referência"pode ser com base em uma sequência de aminoácido primária, onde a sequência de referência é uma sequência que pode possuir uma ou mais mudanças na sequência primária. Por exemplo, uma "sequência de referência com base em SEQ ID NO:4 possuindo o resíduo correspondente a X14 uma valina" ou X14V referese a uma sequência de referência em que o correspondente resíduo a X14 em SEQ ID NO:4, que é uma tirosina, foi mudado a valina.

[00172] "Janela de comparação"referese a um segmento conceitual de pelo menos cerca de 20 resíduos de posições de nucleotídeo ou aminoácidos contíguos em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência de pelo menos 20 nucleotídeos ou aminoácidos contíguos e em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos quando comparado à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para ótimo alinhamento das duas sequências. A janela de comparação pode ser mais longa do que 20 resíduos contíguos, e inclui, opcionalmente 30, 40, 50, 100, ou janelas mais longas.

[00173] "Identidade substancial" referese a uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo que possui pelo menos 80 identidade de sequência em porcentagem, pelo menos 85 por cento de identidade e 89 a 95 identidade de sequência em porcentagem, mais geralmente pelo menos 99 identidade de sequência em porcentagem quando comparado a uma sequência de referência sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de resíduo, frequentemente sobre uma janela de pelo menos 30 a 50 resíduos, em que a porcentagem de identidade de sequência é calculada por comparação da sequência de referência a uma sequência que inclui deleções ou adições cujo total de 20 por cento ou menos da sequência de referência sobre a janela de comparação. Em modalidades específicas aplicadas aos polipeptídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências de polipeptídeo, quando optimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando pesos de intervalo padrão, compartilham pelo menos 80 identidade de sequência em porcentagem, de preferência pelo menos 89 identidade de sequência em porcentagem, pelo menos 95 identidade de sequência em porcentagem ou mais (por exemplo, 99 identidade de sequência em porcentagem). De preferência, posições de resíduo que não são idênticas diferem por substituições de aminoácido conservadoras.

[00174] "Correspondente a", "referência a" ou "relativo a" quando usados no contexto da numeração de uma dada sequência de aminoácido ou polinucleotídeo referese à numeração dos resíduos de uma sequência de referência especificada quando a dada sequência de aminoácido ou polinucleotídeo é comparada à sequência de referência. Em outras palavras, o número de resíduo ou posição de resíduo de um dado polímero é designado com respeito à sequência de referência em vez de pela atual posição númerica do resíduo dentro da dada sequência de aminoácido ou polinucleotídeo. Por exemplo, uma dada sequência de aminoácido, tal como esta de uma transaminase planejada, pode ser alinhada a uma sequência de referência por introdução de intervalos para otimizar pares de resíduo entre as duas sequências. Nestes casos, ainda que os intervalos estejam presentes, a numeração do resíduo na dada sequência de aminoácido ou polinucleotídeo é feita com respeito à sequência de referência a que ela foi alinhada.

[00175] "Diferença de aminoácido"ou "diferença de resíduo"referese a uma mudança no resíduo de aminoácido a uma posição de uma sequência de polipeptídeo relativo ao resíduo de aminoácido a uma correspondente posição em uma sequência de referência. As posições de diferenças de aminoácido geralmente são referidas aqui como "Xn," onde n referese à correspondente posição na sequência de referência em que a diferença de resíduo é com base. Por exemplo, uma "diferença de resíduo a posição X14 quando comparado a SEQ ID NO: 4" referese a uma mudança do resíduo de aminoácido ao polipeptídeo posição correspondente a posição 14 de SEQ ID NO:4. Desta forma, se o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 4 possui uma tirosina a posição 14, em seguida uma "diferença de resíduo a posição X14 quando comparado a SEQ ID NO:4" uma substituição de aminoácido de qualquer resíduo diferente de tirosina na posição do polipeptídeo correspondente a posição 14 de SEQ ID NO: 4. Na maior parte dos exemplos aqui, a diferença de resíduo de aminoácido específico a uma posição é indicada como "XnY" onde "Xn" especificava a correspondente posição tal como descrito acima, e "Y"é o único identificador de letra do aminoácido encontrado no polipeptídeo planejado (isto é, o diferente resíduo do que no polipeptídeo de referência). Em algumas modalidades, nesse sentido mais do que um aminoácido pode aparecer em uma posição de resíduo especificado, os aminoácidos alternativos podem ser listados na forma XnY/Z, onde Y e Z representa resíduos de aminoácido alternado. Em alguns exemplos (por exemplo, na Tabela 2A e 2B), a presente descrição também fornece diferenças específicas de aminoácido denotadas pela notação convencional "AnB", onde A é o único identificador de letra do resíduo na sequência de referência, "n"é o número da posição de resíduo na sequência de referência, e B é o único identificador de letra da substituição de resíduo na sequência do polipeptídeo planejado. Além disso, em alguns exemplos, um polipeptídeo da presente descrição pode incluir uma ou mais diferenças de resíduo de aminoácido relativas a uma sequência de referência, que é indicada por uma lista das posições especificadas onde mudanças são feitas relativas à sequência de referência. A presente descrição inclui sequências de polipeptídeo planejado compreendendo uma ou mais diferenças de aminoácido que incluem cada/ou ambas as substituições de aminoácido conservadoras e não conservadoras.

[00176] "Substituição de aminoácido conservador" referese a uma substituição de um resíduo com um diferente resíduo possuindo uma cadeia lateral similar, e desta forma tipicamente envolve substituição do aminoácido no polipeptídeo com aminoácidos dentro da mesma ou similar classe definida de aminoácidos. A título de exemplo e não limitação, um aminoácido com uma cadeia lateral alifática pode ser substituído com outro aminoácido alifático, por exemplo, alanina, valina, leucina, e isoleucina; um aminoácido com cadeia lateral de hidroxila é substituído com outro aminoácido com uma cadeia lateral de hidroxila, por exemplo, serina e treonina; um aminoácido possuindo cadeias laterais aromáticas é substituído com outro aminoácido possuindo uma cadeia lateral aromática, por exemplo, fenilalanina, tirosina, triptofano, e histidina; um aminoácido com uma cadeia lateral básica é substituído com outro aminoácido com uma cadeia lateral básica, por exemplo, lisina e arginina; um aminoácido com uma cadeia lateral acídica é substituído com outro aminoácido com uma cadeia lateral acídica, por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico; e um aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico é substituído com outro aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico, respectivamente. Substituições conservadoras exemplares são fornecidas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1

[00177] "Substituição não conservadora" referese à substituição de um aminoácido no polipeptídeo com um aminoácido com propriedades de cadeia lateral significantemente diferentes. Substituições não conservadoras podem usar aminoácidos entre, em vez de dentro de, os grupos definidos e afeta (a) a estrutura do esqueleto de peptídeo na área da substituição (por exemplo, prolina para glicina), (b) a carga ou hidrofobicidade, ou (c) a carga da cadeia lateral. A título de exemplo e não limitação, uma substituição não conservadora exemplar pode ser um aminoácido acídico substituída com um aminoácido básico ou alifático; um aminoácido aromático substituído com um pequeno aminoácido; e um aminoácido hidrofílico substituído com um aminoácido hidrofóbico.

[00178] "Deleção"referese à modificação ao polipeptídeo por remoção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência. Deleções podem compreender remoção de 1 ou mais aminoácidos, 2 ou mais aminoácidos, 5 ou mais aminoácidos, 10 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos, ou 20 ou mais aminoácidos, até 10% do número total de aminoácidos, ou até 20% do número total de aminoácidos produzindo a enzima de referência enquanto retendo atividade enzimática e/ou retendo as propriedades melhoradas de uma transaminase de enzima planejada. Deleções podem ser direcionadas às porções internas e/ou porções terminais do polipeptídeo. Em várias modalidades, a deleção pode compreender um segmento contínuo ou pode ser discontínuo.

[00179] "Inserção"referese à modificação ao polipeptídeo por adição de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, as enzimas de transaminases planejadas melhoradas compreendem inserções de um ou mais aminoácidos ao polipeptídeo de transaminase de ocorrência natural assim como inserções de um ou mais aminoácidos a outros polipeptídeos de transaminase melhorados. Inserções podem ser nas porções internas do polipeptídeo, ou ao terminal carbóxi ou amino. Inserções tal como usado aqui incluem proteínas de fusão como é conhecido na técnica. A inserção pode ser um segmento contíguo de aminoácidos ou separado por um ou mais dos aminoácidos no polipeptídeo de ocorrência natural.

[00180] "Fragmento" tal como usado aqui referese a um polipeptídeo que possui uma deleção de amino-terminal e/ou carboxi- terminal, mas onde a sequência de aminoácido restante é idêntica às correspondentes posições na sequência. Fragmentos podem ser pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais longos, e até 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, e 99% do polipeptídeo de transaminase de tamanho natural, por exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou transaminase planejada de SEQ ID NO:34.

[00181] "Polipeptídeo isolado" referese a um polipeptídeo que é substancialmente separado de outros contaminantes que naturalmente acompanham, por exemplo, proteína, lipídeos, e polinucleotídeos. O termo abrange polipeptídeos que foram removidos ou purificados de seu de ambiente de ocorrência natural ou sistema de expressão (por exemplo, célula hospedeira ou síntese in vitro). As enzimas de transaminase melhoradas podem estar presentes dentro de uma célula, presentes no meio celular, ou preparadas em várias formas, tal como lisados ou preparações isoladas. Como tal, em algumas modalidades, a transaminase de enzima melhorada pode ser um polipeptídeo isolado.

[00182] "Polipeptídeo substancialmente puro" referese a uma composição em que a espécie de polipeptídeo é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar ou peso é mais abundante do que qualquer outra espécie macromolecular individual na composição), e é geralmente uma composição substancialmente purificada quando a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50 por cento da espécie macromolecular presente por mole ou % em peso. Geralmente, uma composição de transaminase substancialmente pura compreenderá cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, cerca de 95% ou mais, e cerca de 98% ou mais de todas as espécies macromoleculares por mole ou % em peso presente na composição. Em algumas modalidades, a espécie objeto é purificada a homogeneidade essencial (isto é, espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de detecção convencional) em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Espécie de solvente, moléculas pequenas (<500 Dáltons), e espécie de íon elemental não são consideradas espécies macromolecular. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase melhorado isolado é uma composição de polipeptídeo substancialmente puro.

[00183] "Estereoseletividade" referese à formação preferencial em uma reação química ou enzimática de um estereoisômero sobre outro. Estereoseletividade pode ser parcial, onde a formação de um estereoisômero é favorecida sobre o outro, ou ela pode ser completa onde apenas um estereoisômero é formado. Quando os estereoisômeros são enantiômeros, a estereoseletividade é referida como enantioseletividade, a fração (tipicamente relatada como uma porcentagem) de um enantiômero na soma de ambos. É comumente alternativamente relatada na técnica (tipicamente como uma porcentagem) como o excesso enantiomérico (e.e.) calculado deste de acordo com a Fórmula [enantiômero maior - enantiômero menor]/[enantiômero maior + menor enantiômero]. Onde os estereoisômeros são diastereoisômeros, a estereoseletividade é referida como diaestereoseletividade, a fração (tipicamente relatada como uma porcentagem) de um diastereômero em uma mistura de dois diastereômeros, comumente alternativamente relatada como o excesso diastereomérico (d.e.). Excesso enantiomérico e excesso diastereomérico são tipos de excesso estereomérico.

[00184] "Altamente estereoseletivo" referese a uma reação química ou enzimática que é capaz de conversão de um substrato, por exemplo, Composto (IA), a seu correspondente produto de amina quiral, por exemplo, Composto (IIA), com pelo menos cerca de 85% de excesso estereomérico.

[00185] "Propriedade de enzima melhorada" referese a um polipeptídeo de transaminase que exibe uma melhora em qualquer propriedade de enzima quando comparado a uma transaminase de referência. Para os polipeptídeos de transaminase planejada descritos aqui, a comparação é geralmente feita à transaminase de enzima do tipo silvestre, ainda que em algumas modalidades, a transaminase de referência pode ser outra transaminase planejada melhorada. Propriedades de enzima para que a melhora seja desejável incluem, mas não são limitadas a, atividade enzimática (que pode ser expressada em termos de conversão em porcentagem do substrato), termo estabilidade, estabilidade de solvente, perfil de atividade de pH, requerimentos de cofator, refratariedade a inibidores (por exemplo, inibição de substrato ou produto), estereospecificidade, e estereoseletividade (incluindo enantioseletividade).

[00186] "Atividade enzimática aumentada" referese a uma propriedade melhorada dos polipeptídeos de transaminase planejada, que pode ser representada por um aumento em atividade específica (por exemplo, produto produzido/tempo/proteína em peso) ou um aumento na conversão em porcentagem do substrato ao produto (por exemplo, conversão em porcentagem de quantidade de partida de substrato a produto em um período de tempo especificado utilizando uma quantidade especificada de transaminase) quando comparado à transaminase de enzima de referência. Métodos exemplares para determinar atividade de enzima são fornecidos nos Exemplos. Qualquer propriedade referindo-se a atividade de enzima pode ser afetada, incluindo as propriedades de enzima clássicas de Km, Vmax ou kcat, mudanças das quais podem resultar em atividade enzimática aumentada. Melhoras na atividade de enzima pode ser de cerca de 1,2 vezes a atividade enzimática da correspondente transaminase de enzima do tipo silvestre, a tanto quanto 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, ou mais atividade enzimática do que a transaminase de ocorrência natural ou outra transaminase planejada da qual os polipeptídeos de transaminase foram derivados. Atividade de transaminase pode ser medida por qualquer um dos ensaios padrões, tal como por monitoramento de mudanças em propriedades espectrofotométricas de reagentes ou produtos. Em algumas modalidades, a quantidade de produtos produzidos pode ser medida por separação por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) combinada com detecção por fluorescente ou absorvência de UV em seguida a derivação, tal como com o-ftaldialdeído (OPA). Comparações de atividades de enzima são feitas utilizando uma preparação definida de enzima, um ensaio definido sob uma condição estabelecida, e um ou mais substratos definidos, como também descrito em detalhe aqui. Geralmente, quando lisados são comparados, os números de células e a quantidade de proteína ensaiada são determinados assim como o uso de sistemas de expressão idênticos e células hospedeiras idênticas para minimizar variações em quantidade de enzima produzida pelas células hospedeiras e presente nos lisados.

[00187] "Conversão"referese à conversão enzimática do(s) substrato(s) ao(s) produto(s) correspondente(s). "Conversão em porcentagem" referese à porcentagem do substrato que é convertida ao produto dentro de um período de tempo sob condições especificadas. Desta forma, a "atividade enzimática"ou "atividade" de um polipeptídeo de transaminase pode ser expressada como "conversão em porcentagem" do substrato ao produto.

[00188] "Termostável"referese a um polipeptídeo de transaminase que mantém atividade similar (mais do que 60% a 80% por exemplo) depois de exposição em temperaturas elevadas (por exemplo, 4080°C) durante um período de tempo (por exemplo, 0,5-24 h) comparado à enzima do tipo silvestre.

[00189] "Estável em solvente" referese a um polipeptídeo de transaminase que mantém atividade similar (maior do que, por exemplo, 60% a 80%) depois exposição a concentrações variantes (por exemplo, 5-99%) de solvente (etanol, álcool de isopropila, dimetilsulfóxido (DMSO), tetra-hidrofurano, 2-metiltetra-hidrofurano, acetona, tolueno, acetato de butila, éter de terc-butila de metila, etc.) durante um período de tempo (por exemplo, 0,5-24 h) comparado à enzima do tipo silvestre.

[00190] "Termo- e estável em solvente" referese a um polipeptídeo de transaminase que é tanto termostável quanto estável em solvente.

[00191] "Hibridização severa"é usada aqui para referir-se as condições sob as quais híbridos de ácido nucléico são estáveis. Tal como conhecido àqueles de versatilidade na técnica, a estabilidade de híbridos é refletida na temperatura de fusão (Tm) dos híbridos. Em geral, a estabilidade de um híbrido é uma função de força de íon, temperatura, conteúdo G/C, e a presença de agentes caotrópicos. Os valores de Tm para polinucleotídeos podem ser calculados utilizando de métodos conhecidos para previsão de temperaturas de fusão (veja, por exemplo, Baldino e outros, Methods Enzymology 168:761-777; Bolton e outros, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390; Bresslauer e outros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:8893-8897; Freier e outros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9373-9377; Kierzek e outros, Biochemistry 25:7840-7846; Rychlik e outros, 1990, Nucleic Acids Res 18:6409-6412 (erratum, 1991, Nucleic Acids Res 19:698); Sambrook e outros, supra); Suggs e outros, 1981, in Developmental Biology Using Purified Genes (Brown e outros, eds.), pp. 683-693, Academic Press; e Wetmur, 1991, Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227259. Todas as publicações incorporadas aqui por referência). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo descrito aqui e hibridiza sob condições definidas, tal como condições moderadamente severas ou altamente severas, ao complemento de uma sequência codificando uma transaminase de enzima planejada da presente descrição.

[00192] "Severidade da hibridização"referese às condições de hibridização, tal como condições de lavagem, na hibridização de ácidos nucléicos. Geralmente, reações de hibridização são desempenhadas sob condições de severidade inferior, seguida por lavagens de variante, mas severidade elevada. O termo "hibridização moderadamente severa" referese às condições que permitem DNA alvo ligar-se a um ácido nucléico complementar que possui cerca de 60% de identidade, de preferência sobre 75% de identidade, sobre 85% de identidade ao alvo DNA, com mais do que cerca de 90% de identidade para polinucleotídeo-alvo. Condições moderadamente severas exemplares são condições equivalentes a hibridização em 50% de formamida, 5x Solução de Denhart, 5*SSPE, 0,2% SDS a 42°C, seguido por lavagem em 0,2xSSPE, 0,2% SDS, a 42°C. "Hibridização de alta severidade" referese geralmente as condições que são cerca de 10°C ou menos da temperatura de fusão térmica Tm tal como determinado sob a condição de solução para uma sequência de polinucleotídeo definida. Em algumas modalidades, uma condição de alta severidade referese às condições que permitem hibridização de apenas aquelas sequências de ácido nucléico que forma híbridos estáveis em NaCl a 0,018M a 65°C (isto é, se um híbrido é não estável em NaCl a 0,018M a 65°C, ele não será estável sob condições de alta severidade, como contemplado aqui). Condições de alta severidade podem ser fornecidas, por exemplo, por hibridização em condições equivalentes a 50% de formamida, 5x Solução de Denhart, 5xSSPE, 0,2% SDS a 42°C, seguido por lavagem em 0,1xSSPE, e 0,1% SDS a 65°C. Outra condição de alta severidade é hibridização em condições equivalentes a hibridização em 5X SSC contendo 0,1% (p:v) SDS a 65°C e lavagem em 0,1x SSC contendo 0,1% SDS a 65°C. Outras condições de alta severidade de hibridização, assim como condições moderadamente severas, são descritas nas referências citadas acima.

[00193] Polinucleotídeo "heterólogo" referese a qualquer polinucleotídeo que é introduzido em uma célula hospedeira por técnica de laboratório, e inclui polinucleotídeos que são removidos de uma célula hospedeira, submetida à manipulação de laboratório, e em seguida reintroduzidos em uma célula hospedeira.

[00194] "Códon otimizado" referese a mudanças nos códons do polinucleotídeo codificando uma proteína àqueles preferencialmente usados em um organismo particular de modo que a proteína codificada seja eficientemente expressada no organismo de interesse. Ainda que o código genético seja degenerado em que mais aminoácidos são representados por diversos códons, chamados "sinônimos" ou códons "sinônimos", é bem conhecido que uso de códon por organismos particulares é não aleatório e influenciado por tripletos de códon particulares. Este viés de uso de códon pode ser elevado em referência a um dado gene, genes de função comum ou origem ancestral, proteínas altamente expressadas versus proteínas de baixo número de cópia, e as regiões de codificação de proteína agregadas de um genoma. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos codificando as enzimas de transaminase podem ser otimizados por códon para produção ideal do organismo hospedeiro selecionado para expressão.

[00195] "Códons de viés de uso de alto códon ideal preferido" referese alternadamente a códons que são usados em frequência elevada nas regiões de codificação de proteína do que outros códons que codificam pelo mesmo aminoácido. Os códons preferidos podem ser determinados em relação a uso de códon em um único gene, um grupo de genes de função ou origem comum, genes altamente expressados, a frequência de códon nas regiões de codificação de proteína agregadas do organismo integral, frequência de códon nas regiões de codificação de proteína agregada de organismos relacionados, ou combinações deste. Códons cuja frequência aumenta com o nível de expressão de gene são tipicamente códons ideais para expressão. Uma variedade de métodos é conhecida para determinação da frequência de códon (por exemplo, uso de códon, uso de códon sinônimo relativo) e preferência de códon em organismos específicos, incluindo análise multivariada, por exemplo, utilização de análise de agregação ou análise de correspondência, e o número eficaz de códons usados em um gene (veja GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University de Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73; Stenico e outros, 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29). Uso de tabelas de códon são disponíveis para uma lista de desenvolvimento de organismos (veja por exemplo, Wada e outros, 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura e outros, 2000, Nucl. Acids Res. 28:292; Duret, e outros, supra; Henaut e Danchin, "Escherichia coli e Salmonella," 1996, Neidhardt, e outros Eds., ASM Press, Lavagemton D.C., p. 2047-2066. A fonte de dados para obtenção de uso de códon pode contar com qualquer sequência de nucleotídeo disponível capaz de codificação a uma proteína. Estes grupos de dados incluem sequências de ácido nucléico atualmente conhecidas para codificar proteínas expressadas (por exemplo, sequências de codificaçãos de proteína completas-CDS), rótulos de sequência expressada (ESTS), ou regiões de codificação preditas de sequências genômicas (veja por exemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari e outros, 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270).

[00196] "Sequência de controle"é definida aqui incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo e/ou polipeptídeo da presente descrição. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estrangeira para a sequência de ácido nucléico codificando o polipeptídeo. Tais sequências de controle incluem, mas não são limitadas a, uma sequência de poliadenilação, líder, sequência de propeptídeo, promotor, sequência peptídeo sinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem uma promotora, e sinais de interrupção transcricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligadores pelo propósito de introdução de sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação de sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo.

[00197] "Operavelmente ligados"é definido aqui como uma configuração em que uma sequência de controle é apropriadamente colocada (isto é, em uma ligação funcional) em uma posição com relação a um polinucleotídeo de interesse de modo que a sequência de controle oriente ou regule a expressão do polinucleotídeo e/ou polipeptídeo de interesse.

[00198] "Sequência promotora" se refere a uma sequência de ácido nucléico que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo de interesse, tal como uma sequência de codificação. A sequência promotora contém sequências de controle transcricionais, que mediam a expressão de um polinucleotídeo de interesse. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucléico que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00199] "Condições de reação adequadas" se refere àquelas condições na solução de reação biocatalítica (por exemplo, faixas de carga de enzima, carga de substrato, carga de cofator, temperatura, pH, tampões, cossolventes, etc.) sob as quais um polipeptídeo de transaminase da presente descrição é capaz de conversão de um composto de substrato em um composto de produto (por exemplo, conversão de composto (IA) em composto (IIA)). Exemplos de "condições de reação adequadas"são fornecidos na presente descrição e ilustrados pelos exemplos.

[00200] "Carregamento", tal como em "carregamento de composto" ou "enzima carga" ou "cofator carga" se refere à concentração ou quantidade de um componente em uma mistura de reação ao iniciar a reação.

[00201] "Substrato" no contexto de um processo mediado por biocatalisador se refere ao composto ou molécula utilizado pelo biocatalisador. Por exemplo, um exemplo de substrato para o biocatalisador de transaminase no processo descrito aqui é o composto (IA).

[00202] "Produto" no contexto de uma biocatalisador mediados processo se refere ao composto ou molécula resultante da ação do biocatalisador. Por exemplo, um exemplo de produto para o biocatalisador de transaminase no processo descrito aqui é o composto (IIA).

[00203] A presente descrição fornece métodos de utilização de polipeptídeos possuindo atividade de transaminase pela síntese de (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina em excesso enantiomérico de (R)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina. Onde a descrição se refere aos polipeptídeos, deve ser entendido que ela também descreve os polinucleotídeos codificando os polipeptídeos.

[00204] Aminotransferases, também conhecido como transaminases, catalisa a transferência de um grupo de amino de uma amina primária de um doador de substrato amino para o grupo carbonila (por exemplo, um grupo ceto ou aldeído) de uma molécula receptora de amino. Aminotransferases foram identificada de vários organismos, tal como Alcaligenes denitrificans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Brucélulaa melitensis, Burkholderia malle, Burkholderia pseudomallei, Chromobacterium violaceum, Oceanicola granulosus HTCC2516, Oceanobacter sp. RED65, Oceanospirillum sp. MED92, Pseudomonas putida, Ralstonia solanacearum, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp. (strain NGR234), Vibrio fluvialis, Bacillus thuringensis, e Klebsiella pneumoniae (Shin e outros, 2001, Biosci. Biotechnol, Biochem. 65:1782-1788).

[00205] Transaminases são úteis pela resolução quiral de aminas racêmicas explorando a capacidade das transaminases de realizarem a reação de uma maneira estereoespecífica, isto é, conversão preferencial de um enantiômero na correspondente cetona, desse modo resultando em uma mistura enriquecida no outro enantiômero (veja, por exemplo, Koselewski e outros, 2009, Org Lett. 11(21):4810- 2). A estereoseletividade de transaminases na conversão de uma cetona na correspondente amina também produz estas enzimas úteis na síntese assimétrica de aminas opticamente puras dos correspondentes compostos de ceto (veja, por exemplo, Hohne e outros, "Biocatalítica Routes at Optically Active Amines," Chem Cat Chem 1(1):42 - 51; Zua e Hua, 2009, Biotechnol J. 4(10):1420-31).

[00206] A w-transaminase de Vibrio fluvialis w-VfT) apresenta alta enantiosseletividade para (S)-enantiômero de aminas quirais e possui especificidade de substrato distinta para aminas aromáticas quirais (Shin e Kim, 2001, J. Org. Chem. 67:2848-2853). A alta enantiosseletividade de w-VfT foi aplicada a resolução quiral de aminas (H. Yun, B.-K. Cho, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 2004, 87, 772-778; J.-S. Shin, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 1997, 55, 348358; M. Hçhne, K. Robins, U. T. Bornscheuer, Adv. Synth. Catal. 2008, 350,802-807). A enzima possui também usada na síntese assimétrica de aminas opticamente puras utilizando um substrato de cetona proquiral. No entanto, limitação em síntese assimétrica é o equilíbrio ds reação reversa desfavorável (Shin e Kim, 1999, Biotechnol. Bioeng. 65, 206-211), inibição de w-VfT enzima pelo Produto de Amina (Shin e outros, 2001, Biotechnol Bioeng 73:179-187; Yun e Kim, 2008, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(11):3030-3033); baixa atividade em receptores de amino possuindo cadeias laterais volumosas, tal como grupos aromáticos (Shin e Kim, 2002, J. Org. Chem. 67:2848-2853); e baixa estabilidade de enzima (Yun e Kim, supra).

[00207] Transaminases construídas derivadas da transaminase de Vibrio fluvialis possuindo resistência aumentada a cetonas alifáticas são descritas em Yun e outros, 2005, Appl Environ Micriobiol., 71(8):4220- 4224) enquanto w-VfTs com especificidade de substrado de doador de amino ampliada são descritas em Cho e outros, 2008, Biotechnol Bioeng. 99(2):275-84. As publicações de patente WO2010081053 e US20100209981, incorporadas por referência aqui, descrevem w-VfTs construídas possuindo estabilidade aumentada em temperatura e/ou solvente orgânico e atividade enzimática para moléculas receptoras de amino estruturalmente diferentes.

[00208] A presente descrição se refere a métodos de utilização de polipeptídeos de transaminase construída derivados de V. fluvialis que eficientemente mediate a conversão de 1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3- il)propan-2-ona, em composto de produto (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro- indol-3-il)propan-2-amina em excesso enantiomérico. Significantemente, a descrição identifica as posições de resíduo de aminoácido e correspondentes mutações no polipeptídeo de transaminase que aumentar a atividade enzimática, enantioseletividade, estabilidade e refratariedade para a inibição de produto na conversão de 1-(1H-5-flúor- 6-cloro-indol-3-il)propan-2-ona, no composto de produto (S)-1-(1H-5- flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina.

[00209] Por conseguinte, em um aspecto, a presente descrição referese a métodos de utilização de polipeptídeos que são capazes de conversão do substrato conversão de Composto de substrato (IA), 1- (1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-ona, a Composto de produto (IIA), (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina, Esquema 1

em a presença de um doador de amino, onde o (S)-1-(1H-5-flúor-6- cloro-indol-3-il)propan-2-amina é produzido em excesso enantiomérico de composto (IIC), (R)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina.

[00210] Em algumas modalidades, os polipeptídeos usados nos métodos não são transaminase de ocorrência naturals planejado para propriedades melhoradas quando comparado ao tipo silvestre V. fluvialispolipeptídeo de SEQ ID NO:2, ou outro polipeptídeo planejado, por exemplo, SEQ ID NO:4. Estas polipeptídeos de transaminase planejada adapted para efficient conversão de conversão de 1-(1H-5- flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-ona a (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3- il)propan-2-amina possuem uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado ao sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 ou uma transaminase de referência planejada polipeptídeo, tal como o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO:4. As diferenças de resíduo são associadas com enhancements em propriedades de enzima, incluindo atividade enzimática, enzima estabilidade, e resistência a inibição pelo amina de produto.

[00211] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase planejada usados na presente descrição mostram atividade aumentada na conversão do substrato 1-(1H-5-flúor-6-cloro- indol-3-il)propan-2-ona a produto (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3- il)propan-2-Produto de Amina em excesso enantiomérico em uma definido tempo com o mesmo quantidade de enzima quando comparado ao tipo silvestre ou uma referência enzima planejada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada possui pelo menos cerca de 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vez, 20 vez, 30 vez, 40 vez, ou 50 vez ou mais a atividade quando comparado ao polipeptídeo representado por SEQ ID NO:4 sob condições de reação adequadas.

[00212] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase planejada usados na presente descrição possuem estabilidade aumentada a temperatura e/ou solventes usados na conversão reação quando comparado ao tipo silvestre ou uma referência enzima planejada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada possui pelo menos 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vez ou mais a estabilidade quando comparado ao polipeptídeo de SEQ ID NO:4 sob condições de reação adequadas.

[00213] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase planejada usados na presente descrição possuem aumentado refratariedade ou resistência a amina de produto (S)-1- (1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina quando comparado ao tipo silvestre ou uma referência enzima planejada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada possui pelo menos 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou mais resistant a inibição por 1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2- amina, em particular (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2- amina, quando comparado ao polipeptídeo representado por SEQ ID NO:4 sob condições de reação adequadas, como também descrito abaixo.

[00214] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase planejada usados na presente descrição são capazes de conversão do substrato 1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-ona a produto (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina em excesso enantiomérico de mais do que 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 ou maior sobre (R)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3- il)propan-2- sob condições de reação adequadas.

[00215] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase planejada usados na presente descrição são capazes de conversão de composto (IA) a composto (IIA) com tolerância aumentada para a presença de substrato relativo ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 4 sob condições de reação adequadas. Desta forma, em algumas modalidades os polipeptídeos de transaminase planejada são capazes de conversão do Composto de substrato (IIA) a Composto de produto (IA) na presença de um carregamento de concentração de substrato de pelo menos cerca de 1 g/L, cerca de 5 g/L, cerca de 10 g/L, cerca de 20 g/L, cerca de 30 g/L, cerca de 40 g/L, cerca de 50 g/L, sobre 70 g/L, cerca de 100 g/L, cerca de 125 g/L, cerca de 150 g/L. cerca de 175 g/L ou cerca de 200 g/L ou mais com uma conversão em porcentagem de pelo menos cerca de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, em um tempo de reação de cerca de 72 h ou menos, cerca de 48 h ou menos, cerca de 36 h ou menos, ou cerca de 24 h menos, sob condições de reação adequadas.

[00216] As condições de reação adequadas sob as quais as propriedades melhoradas acima descritas dos polipeptídeos planejados realizam a conversão podem ser determinadas com respeito a concentrações ou quantidades de polipeptídeo, substrato, cofator, tampão, cossolvente, pH, e/ou condições incluindo temperatura e tempo de reação, como também descrito abaixo e nos Exemplos.

[00217] Os polipeptídeos exemplares planejados usados na presente descrição possuem associados com suas propriedades melhoradas para conversão de composto (IA) a composto (IIA) e que incluem uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:2 às seguinte posições de resíduo: X9; X14; X18; X21; X26; X31; X33; X41; X45; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X113; X132; X133; X146; X147; X148; X153; X163; X168; X173; X177; X203; X211; X233T; X235; X244; X250; X284; X294; X314; X315; X318; X323; X324; X324; X346; X383; X391; X395; X398; X400; X417; X419; X420; X423; X424; X427; X448; e X451. As diferenças específicas de aminoácido em cada uma destas posições que são associadas com as propriedades melhoradas dos polipeptídeos exemplares de Tabela 2A e 2B incluem: X9T; X14V; X18A; X21H; X26R; X31M; X31S; X33T; X41L; X45H; X47N; X57F; X57Y; X70A; X86D; X86Y; X88A; X88L; X107P; X113L; X113V; X132F; X133R; X146L; X147K; X148Q; X148R; X153S; X163F; X163I; X163L; X163R; X163V; X168K; X168S; X173A; X177L; X203S; X211K; X233T; X235P; X244T; X250A; X284A; X294V; X314N; X315G; X318D; X323T; X324G; X324H; X346L; X383V; X391A; X395P; X398L; X398V; X398W; X400G; X417M; X419S; X420N; X423I; X424V; X424A; X427Y; X448E; e X451D.

[00218] As diferenças de resíduo quando comparadas à transaminase planejada representada por SEQ ID NO:4 inclui aquelas em posições de resíduo: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X113; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X420; X423; X424; X448; e X451. As diferenças específicas de aminoácido a estas posições incluem: X14V; X26R; X31S; X33T; X41L; X47N; X57F; X57Y; X70A; X86D; X88A; X88L; X107P; X113L; X113V; X132F; X148Q; X148R; X163I; X163L; X163R; X163V; X168K; X168S; X173A; X203S; X250A; X284A; X314N; X315G; X324H; X346L; X395P; X398L; X398V; X398W; X400G; X417M; X419S; X420N; X423I; X424V; X448E; e X451D. Ainda que diferenças de resíduo comparado a SEQ ID NO:4 também ocorram em posições de resíduo X153 e X383, estas diferenças representam reversões ao resíduo de aminoácido presente no tipo silvestre sequência de SEQ ID NO:2, indicando que interconversões entre aminoácidos S e V em posição de resíduo X153 e entre aminoácidos A e V a posição de resíduo X383 não possui nenhum efeito deletério significante nas propriedades de enzima planejadas.

[00219] A estrutura e informação de função para polipeptídeos de transaminase exemplares de ocorrência não natural (ou planejados) usados no método da presente descrição são mostrados abaixo na Tabela 2A e 2B. Os identificadores de sequência numerada avulsos (isto é, SEQ ID NOs) referem-se à sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido fornecido pelas SEQ ID NOs ainda numeradas, e as sequências são fornecidas na listagem eletrônica de arquivo de sequência acompanhando esta descrição, que é por meio desta incorporada por referência aqui. As diferenças de resíduo de aminoácido são com base em comparação à sequência de referência de SEQ ID NO: 4, que é uma transaminase planejada derivada do polipeptídeo do tipo silvestre w-VfT possuindo as seguintes 24 diferenças de resíduo de aminoácido A9T; G18A; D21H; V31M; N45H; F86Y; A133R; R146L; W147K; V153S; K163F; V177L; R211K; P233T; A235P; P244T; M294V; P318D; A323T; S324G; A383V; T391A; C424A; F427Y relativo a SEQ ID NO:2. A atividade de cada polipeptídeo planejado relativo ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 4 foi determinada como conversão do substrato de cetona 1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-ona, a amina de produto composto (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina durante um período de tempo estabelecido e temperatura em um ensaio de alto rendimento (HTP), que foi usado como a análise primária. Os valores de ensaio de HTP na Tabela 2A foram determinados utilizando lisados celulares claros de E. coli. em formato de placa de 96 cavidades de ~200 μL volume por cavidade seguinte a condições de reação de ensaio como notado na tabela e nos Exemplos. Em alguns exemplos, um pó de frasco de agitação (SFP) e/ou ensaio de pó processado a jusante (DSP) foram usados como uma análise secundária para avaliar as propriedades das transaminases planejadas, os resultados dos quais são fornecidos na Tabela 2B. As formas SFP e DSP fornecem uma preparação de pó mais purificada dos polipeptídeos planejados. Por exemplo, a transaminase planejada nas preparações de SFP é aproximadamente 30% da proteína total enquanto as preparações de DSP podem conter as transaminases planejadas que são aproximadamente 80% de proteína total.

[00220] Os níveis de atividade (isto é, "+""++", etc.) são definidos como segue: "+" indica 1,2 vez ou maior atividade quando comparado a esta de SEQ ID NO: 4 para polipeptídeo de transaminase planejada SEQ ID NO: 6 a 14, e 1,2 ou maior atividade quando comparado a esta de SEQ ID NO: 8 para polipeptídeo de transaminase planejada SEQ ID NO: 16 a 154; e uma"++" indica 5 vezes ou maior atividade quando comparado a esta de SEQ ID NO:4 para polipeptídeos de transaminase planejada SEQ ID NO: 6-14, e 5 vezes ou maior atividade quando comparado que de SEQ ID NO:8 para polipeptídeos de transaminase planejada SEQ ID NO: 16 a 154. O dado de estabilidade é obtido incluindo as seguintes quantidades de produto (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina no ensaio e comparação da atividade àquela de uma enzima de referência sob as mesmas condições: 14 g/L para análise dos polipeptídeos de transaminase planejada de SEQ ID NO. 6 a 14, e 16 g/L para análise das polipeptídeo de transaminases planejadas SEQ ID NO. 16 a 154. Avaliação de estabilidade foi feita por comparação de atividades a duas diferentes temperaturas, 55°C e 50°C. Tabela 2A: Polipeptídeos planejados e Melhoras de Enzima Relativas Utilizando Preparações de HTP

Tabela 2B: Polipeptídeos planejados e Melhoras de Enzima Relativas Utilizando Frasco de agitação e Preparações de DSP

[00221] De uma inspeção dos polipeptídeos exemplares úteis nos métodos da presente invenção, melhoras em propriedades de enzima são associadas com diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X113; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X420; X423; X424; X448; e X451. As diferenças de resíduo específicas em cada uma destas posições que são associadas com as propriedades melhoradas incluem: X14V; X26R; X31S; X33T; X41L; X47N; X57F; X57Y; X70A; X86D; X88A; X88L; X107P; X113L; X113V; X132F; X148Q; X148R; X163I; X163L; X163R; X163V; X168K; X168S; X173A; X203S; X250A; X284A; X314N; X315G; X324H; X346L; X395P; X398L; X398V; X398W; X400G; X417M; X419S; X420N; X423I; X424V; X448E; e X451D.

[00222] Por conseguinte, em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada útil nos métodos da presente descrição é capaz de conversão de Composto de substrato (IA), 1-(1H-5-flúor-6- cloro-indol-3-il)propan-2-ona, ao Composto de produto (IIA), (S)-1-(1H- 5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina com propriedades melhoradas quando comparado a SEQ ID NO:4, compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência a sequência de referência SEQ ID NO:2 e uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo selecionadas de: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; e X451, onde as diferenças de resíduo em posições de resíduo X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; e X417 são selecionadas de: X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; e X417M.

[00223] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada útil nos métodos instantaneamente descritos é capaz de conversão de Composto de substrato (IA) ao Composto de produto (IIA) com propriedades melhoradas quando comparado a SEQ ID NO:4, compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência a sequência de referência SEQ ID NO:4 e uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo selecionadas de: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; e X451, em que as diferenças de resíduo em posições de resíduo X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; e X417 são selecionadas de: X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; e X417M. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase planejada são capazes de realizar a conversão com o enantioseletividades descritas acima, por exemplo, > 90% ee.

[00224] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase útil nos métodos instantaneamente descritos é capaz de conversão de Composto de substrato (IA) a Composto de produto (IIA) com propriedades melhoradas quando comparado a SEQ ID NO:4, compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade a uma sequência de referência selecionada de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154, e uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo selecionadas de: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; e X451, onde as diferenças de resíduo em posições de resíduo X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; e X417 são selecionadas de: X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; e X417M. Em algumas modalidades, a sequência de referência é selecionada de SEQ ID NO: 4, 8, 14, 16, 132, 134, e 146. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:134. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:146.

[00225] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase capaz de conversão de Composto de substrato (IA) a Composto de produto (IIA) com propriedades melhoradas quando comparado a SEQ ID NO:4, compreende uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154, e possuindo uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo selecionadas de: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; e X451, onde as diferenças de resíduo em posições de resíduo X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; e X417 são selecionadas de: X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; e X417M. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido é selecionada de SEQ ID NO: 4, 8, 14, 16, 132, 134, e 146. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido é SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido é SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido é SEQ ID NO:134. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido é SEQ ID NO:146.

[00226] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada é capaz de conversão do Composto de substrato (IA) ao Composto de produto (IIA) com pelo menos 1,2 vez a atividade relativa a SEQ ID NO:4 compreende uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 28, 30, 32, 48, 52, 56, 62, 64, 66, 68, 86, 88, 90, 92, 98, 100, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 124, 126, 128, 132, 134, 136, 142, 144, 148, e 154.

[00227] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada é capaz de conversão do Composto de substrato (IA) ao Composto de produto (IIA) com pelo menos 5 vezes a atividade relativa a SEQ ID NO:4 e compreende uma sequência de aminoácido possuindo uma ou mais diferenças de resíduo selecionado de: X14V, X26R; X33T; X88A/L; X163I/L; e X284A.

[00228] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada útil nos métodos instantaneamente descritos é capaz de conversão do Composto de substrato (IA) ao Composto de produto (IIA) com pelo menos 5 vezes a atividade relativa a SEQ ID NO:4 compreende uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NO: 6, 8, 10, 14, 16, 22, 24, 28, 30, 32, 48, 52, 56, 62, 64, 86, 88, 90, 92, 98, 100, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 124, 126, 128, 132, 134, 136, 142, 144, 148, e 154.

[00229] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada possui pelo menos 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou mais refratariedade a inibição por 1-(1H-5-flúor-6- cloro-indol-3-il)propan-2-amina, em particular (S)-1-(1H-5-flúor-6-cloro- indol-3-il)propan-2-amina, quando comparado ao polipeptídeo representado por SEQ ID NO:4 na conversão de Compostod (IA) a composto (IIA). Geralmente, o aumento em refratariedade ou resistência a inibição pelo Composto de produto pode ser medido sob condições de ensaio de HTP em presença de 14 g/L ou 16 g/L de Composto (IIA), tal como descrito na Tabela 2A e 2B e os Exemplos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada possuindo refratariedade de pelo menos 1,2 vez ou maior a inibição por 1-(1H-5-flúor-6-cloro-indol-3-il)propan-2-amina compreende uma sequência de aminoácido possuindo uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 selecionado de: X26R; X70A; X86D; X88A/L; X132F; X163L; X315G; X395P; X398L; e X419S.

[00230] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase planejada com propriedades melhoradas na conversão de Composto (IA) a composto (IIA) possui uma sequência de aminoácido compreendendo uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154.

[00231] Em algumas modalidades, a transaminase planejada capaz de conversão de Composto (IA) a composto (IIA) sob condições de reação adequadas, compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade a um de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154, e as diferenças de resíduo de aminoácido quando comparado a SEQ ID NO:4 presente em qualquer um de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154, como fornecido na Tabelas 2A e 2B.

[00232] Em algumas modalidades, os polipeptídeos planejados podem ser em várias formas, por exemplo, tal como uma preparação isolada, como uma enzima substancialmente purificada, células integrais transformadas com gene(s) codificando a enzima, e/ou como extratos celulares e/ou lisados de tais células. As enzimas podem ser liofilizadas, secadas por spray, precipitadas ou estar na forma de uma pasta crua, como também discutido abaixo.

[00233] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de transaminase podem ser ligados em um substrato físico. O polipeptídeo de transaminase pode ser ligado não covalentemente ou covalentemente em um substrato físico de modo que eles retenham sua atividade melhorada, estereoseletividade, tolerância de produto, estabilidade, e/ou outras propriedades melhoradas relativas ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 4. Em tais modalidades, os polipeptídeos imobilizados podem facilitar a conversão biocatalítica dos substratos de cetona adequados, por exemplo, Composto (IA) ou análogos estruturais destes, ao correspondente Produto de Amina, por exemplo, Composto (IIA) ou correspondentes análogos estruturais, e depois que a reação é completa são facilmente retidos (por exemplo, por contas de retenção em que polipeptídeo é imobilizado) e em seguida reutilizados ou reciclados em subsequentes reações. Tais processos de enzima imobilizados permitem também eficiência e redução de custo. Métodos de imobilização de enzima são bem conhecidos na técnica. Vários métodos para conjugação dos substratos, por exemplo, membranas, contas, vidro, etc. são descritos em, entre outros, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition, Academic Press; (2008), e Bioconjugation Protocolos: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, C.M. Niemeyer ed., Humana Press (2004); as descrições das quais são incorporadas aqui por referência. Polinucleotídeos Codificando Transaminases Planejadas, Vetores de Expressão e Células Hospedeiras

[00234] Em outro aspecto, a presente descrição fornece polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de transaminase planejada descritos aqui. Os polinucleotídeos podem ser operativamente ligados a uma ou mais sequências reguladoras heterólogas que controlam expressão de gene para criar um polinucleotídeo recombinante capaz de expressar o polipeptídeo. Construções de expressão contendo um polinucleotídeo heterólogo codificando a transaminase planejada podem ser introduzidas em células hospedeiras apropriadas para expressar o correspondente polipeptídeo de transaminase.

[00235] Como será evidente ao artesão versado, disponibilidade de uma sequência de proteína e o conhecimento dos códons correspondentes ao vários aminoácidos fornece uma descrição de todos os polinucleotídeos capazes de codificar os polipeptídeos submetidos. A degeneração do código genético, onde os mesmos aminoácidos são codificados por códons alternativos ou sinônimos, permite um número extremamente grande de ácidos nucléicos ser produzido, a totalidade da qual codifica as enzimas de transaminase melhoradas. Desta forma, possuindo conhecimento de uma particular sequência de aminoácido, aqueles versados na técnica poderiam produzir qualquer número de diferentes ácidos nucléicos por modificação simplesmente da sequência de um ou mais códons de um modo que não mude a sequência de aminoácido da proteína. A este respeito, a presente descrição especificamente contempla qualquer e cada possível variação de polinucleotídeos que poderiam ser produzidos codificando os polipeptídeos descrito aqui por seleção de combinações com base nas possíveis escolhas de códon, e todas tais variações devem ser consideradas especificamente descritas para qualquer polipeptídeo descrito aqui, incluindo as sequências de aminoácido apresentadas nas Tabelas 2A e 2B, e descritas na listagem de sequência incorporada por referência aqui como SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154.

[00236] Em várias modalidades, os códons são de preferência selecionados para ajustar a célula hospedeira em que a proteína está sendo produzida. Por exemplo, códons preferidos usados em bactérias são usados para expressar o gene em bactérias; códons preferidos usados em levedura são usados para expressão em levedura; e códons preferidos usados em mamíferos são usados para expressão em células mamíferas. Em algumas modalidades, todos os códons necessitam não serem substituídos para otimizar o uso de códon das transaminases uma vez que a sequência natural compreenderá códons preferidos e porque uso de códons preferidos pode não ser requerido para todos os resíduos de aminoácido. Consequentemente, polinucleotídeos otimizados por códon codificando as enzimas de transaminase podem conter códons preferidos em cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou mais do que 90% de posições de códon região de codificação do tamanho natural.

[00237] Um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo de transaminase melhorado pode ser manipulado em uma variedade de modos para fornecer expressão do polipeptídeo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos codificando os polipeptídeos podem ser fornecidos como vetores de expressão onde uma ou mais sequências de controle está presente para regular a expressão dos polinucleotídeos e/ou polipeptídeos. Manipulação do polinucleotídeo isolado antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessário dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos e sequências de ácido nucléico utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica. Guia é fornecido em Sambrook e outros, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Current Protocolos in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates a 2006.

[00238] Nas modalidades aqui, os polipeptídeos melhorados e correspondentes polinucleotídeos podem ser obtidos utilizando métodos usados por aqueles versados na técnica. A sequência de polinucleotídeo parental codificando o polipeptídeo do tipo silvestre de Vibrio fluvialisé descrita em Shin e outros, 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 61(5-6):463-471, e métodos de geração de polipeptídeos de transaminase planejada com estabilidade melhorada e propriedades de reconhecimento de substrato são descritos em Publicações de Pedido de Patente WO2010081053 e US20100209981, incorporadas aqui por referência.

[00239] Onde a sequência do polipeptídeo planejado é conhecida, os polinucleotídeos codificando a enzima podem ser preparados por métodos de fase sólida padrões, de acordo com métodos sintéticos conhecidos. Em algumas modalidades, fragmentos de até cerca de 100 bases podem ser individualmente sintetizados, em seguida ligados (por exemplo, por métodos de litigação enzimática ou química, ou métodos mediados por polimerase) para formar qualquer sequência contínua desejada. Por exemplo, polinucleotídeos e oligonucleotídeos da invenção podem ser preparados por síntese química utilizando, por exemplo, o método de fosforamidita clássico descrito por Beaucage e outros, 1981, Tet Lett 22:1859-69, ou o método descrito por Matthes e outros, 1984, EMBO J. 3:801-05, por exemplo, como é tipicamente praticado em métodos sintéticos automatizados. De acordo com o método de fosforamidita, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificado, anelado, ligado e clonado em vetores apropriados. Em adição, essencialmente qualquer ácido nucléico pode ser obtido de qualquer de uma variedade de fontes comerciais.

[00240] Por conseguinte, em algumas modalidades, um método para preparo das polipeptídeo de transaminases planejadas pode compreender: (a) sintetização de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154 e possuindo uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo selecionadas de: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; e X451, em que as diferenças de resíduo em posições de resíduo X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; e X417 são selecionadas de: X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; e X417M.; e (b) expressando o polipeptídeo de transaminase codificado pelo polinucleotídeo.

[00241] A transaminase planejada expressada pode ser medida pela propriedade melhorada desejada, por exemplo, atividade, enantioseletividade, estabilidade, e tolerância de produto, na conversão de composto (IA) a composto (IIA) por qualquer das condições de ensaio descritas aqui.

[00242] Em algumas modalidades, qualquer das enzimas de transaminases planejadas expressadas em uma célula hospedeira pode ser recuperada das células e ou o meio de cultura utilizando qualquer uma ou mais da técnica bem conhecida para purificação de proteína, incluindo, entre outros, tratamento de lisozima, sonicação, filtragem, precipitação por saturação, ultra-centrifugação, e cromatografia. Soluções adequadas para lise e a extração de alta eficiência de proteínas de bactérias, tal como E. coli, são comercialmente disponíveis sob o marca registrada CelLytic BTMde Sigma-Aldrich de St. Louis MO.

[00243] Cromatográfica técnica para isolamento do polipeptídeo de transaminase incluem, entre outros, cromatografia de fase reversa, cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia de permuta de íons, eletroforese por gel, e cromatografia de afinidade. Condições para purificação de uma enzima particular dependerá, em parte, de fatores tal como carga de rede, hidrofobicidade, hidrofilicidade, peso molecular, forma molecular, etc., e serão evidentes àqueles possuindo versatilidade na técnica.

[00244] Em algumas modalidades, afinidade técnica pode ser usada pra isolar as enzimas de transaminase melhoradas. Para purificação por cromatografia de afinidade, qualquer anticorpo que especificamente liga-se ao polipeptídeo de transaminase pode ser usado. Pela produção de anticorpos, vários animais hospedeiros, incluindo, mas não limitados a coelhos, camundongo, ratos, etc., pode ser imunização por injeção com um polipeptídeo de transaminase, ou um fragmento deste. O polipeptídeo de transaminase ou fragmento pode ser ligado a um portador adequado, tal como BSA, por meio de um grupo funcional de cadeia lateral ou ligadores ligados a um grupo funcional de cadeia lateral. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo, mas não limitado a Freund's (completa e incompleta), géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tal como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa em buraco de fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tal como BCG (bacilos Calmette Guerin) e Corynebacterium parvum.

Métodos de Utilização das enzimas de transaminases planejadas

[00245] Em outro aspecto, as transaminases descritas aqui podem ser usadas em um processo para realizar reações de transaminase em que um grupo de amino de um doador de amino é transferido a um receptor de amino, por exemplo, substrato de cetona, para produzir uma amina. Uso de um receptor de cetona proquiral pode resultar na produção de uma amina quiral em excesso enantiomérico. Geralmente, o processo para desenvolvimento da reação de transaminação compreende contato ou incubação de um doador de amino e um receptor de amino com um polipeptídeo de transaminase planejada da descrição sob condições de reação adequadas para conversão do receptor de amino a uma amina.

[00246] Em algumas modalidades, as transaminases podem ser usadas na conversão de Composto de substrato de Fórmula (I) a Composto de produto de Fórmula (II). Por conseguinte, em algumas modalidades, um processo para preparo do composto de Fórmula (II) em excesso enantiomérico compreende contato do composto de Fórmula (I) na presença de um doador de amino sob condições de reação adequadas com um polipeptídeo de transaminase planejada descrito aqui. Em algumas modalidades do processo, o composto de Fórmula (II) pode ser formado em pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou excesso enantiomérico maior.

[00247] Para os processos antecedentes, qualquer das transaminases planejadas descritas aqui podem ser usadas. A título de exemplo e sem limitação, em algumas modalidades, o processo pode usar um polipeptídeo de transaminases planejadas compreendendo uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade a uma sequência de referência selecionada de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154, e uma ou mais diferenças de resíduo quando comparado a SEQ ID NO:4 em posições de resíduo selecionadas de: X14; X26; X31; X33; X41; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; e X451, em que as diferenças de resíduo em posições de resíduo X31; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; e X417 são selecionadas de: X31S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; e X417M. Em algumas modalidades, a sequência de referência é selecionada de SEQ ID NO: 4, 8, 14, 16, 132, 134, e 146. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:134. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO:146.

[00248] Em algumas modalidades, transaminases exemplares capazes de realizar os processos aqui podem ser um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, e 154. Guia na escolha e uso das transaminases planejadas são fornecidos nas descrições aqui, por exemplo, Tabela 2 e os Exemplos.

[00249] Nas modalidades aqui e ilustradas nos Exemplos, várias faixas de condições de reação adequadas que podem ser usadas nos processos, incluindo, mas não limitadas, a faixas de doador de amino, pH, temperatura, tampão, sistema de solvente, carregamento de substrato, carregamento de polipeptídeo, carregamento de cofator, tempo de pressão, e reação. Outras condições de reação adequadas para realizar o processo para conversão biocatalítica de Composto de substratos a Composto de produtos utilizando um polipeptídeo de transaminase planejada descrito aqui podem ser facilmente otimizadas em vista do guia fornecido aqui por experimentação de rotina que inclui, mas não está limitado a, contato do polipeptídeo de transaminase planejada e Composto de substrato sob condições de reação experimentais de concentração, pH, temperatura, condições de solvente, e detecção do Composto de produto.

[00250] Nas modalidades descritas aqui, o polipeptídeo de transaminase usa um doador de amino para formar o Composto de produtos. Em algumas modalidades, o doador de amino na condição de reação pode ser selecionado de isopropilamina (também referido aqui como "IPM"), putrescina, L-lisina, α-fenetilamina, D-alanina, L- alanina, ou D,L-alanina, ou D,L-ornitina. Em algumas modalidades, o doador de amino é selecionado do grupo consistindo em IPM, putrescina, L-lisina, D- ou L-alanina. Em algumas modalidades, o doador de amino é IPM. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem o doador de amino, em particular IPM, presente a uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 a cerca de 3,0 M, 0,2 a cerca de 2,5 M, cerca de 0,5 a cerca de 2 M ou cerca de 1 a cerca de 2 M. Em algumas modalidades, o doador de amino está presente a uma concentração de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 1, 1,5, 2, 2,5 ou 3 M. Concentrações elevadas de doador de amino, por exemplo, IPM, pode ser usada para desviar o equilíbrio para formação de produto de amina.

[00251] Condições de reação adequadas utilizando os polipeptídeos de transaminase planejada também tipicamente compreendem um cofator. Cofatores úteis nos processos utilizando as enzimas de transaminases planejadas incluem, mas não são limitados a, piridoxal-5'-fosfato (também conhecido como piridoxal-fosfato, PLP, P5P), piridoxina (PN), piridoxal (PL), piridoxamina (PM), e suas contrapartes fosforiladas; fosfato de piridoxina (PNP), e fosfato de piridoxamina (PMP). Em algumas modalidades, o cofator PLP está presente naturalmente no extrato celular e não necessita ser suplementado. Em algumas modalidades dos métodos, as condições de reação adequadas compreendem cofator adicionado à mistura de reação de enzima, por exemplo, quando utilizando transaminase de enzima parcialmente purificada ou purificada. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas podem compreender a presença de um cofator selecionado de PLP, PN, PL, PM, PNP, e PMP, a uma concentração de cerca de 0,1 g/L a cerca de 10 g/L, cerca de 0,2 g/L a cerca de 5 g/L, cerca de 0,5 g/L a cerca de 2,5 g/L. Em algumas modalidades, as condições de reação compreendem uma concentração de PLP de cerca de 0,1 g/L ou menos, 0,2 g/L ou menos, 0,5 g/L ou menos, 1 g/L ou menos, 2,5 g/L ou menos, 5 g/L ou menos, ou 10 g/L ou menos. Em algumas modalidades, o cofator pode ser adicionado ou ao início da reação e/ou cofator adicional é adicionado durante a reação.

[00252] Composto de substrato nas misturas de reação pode ser variado, levando em consideração, por exemplo, a quantidade desejada de composto de produto, o efeito de concentração de substrato em atividade de enzima, estabilidade de enzima sob condições de reação, e a conversão em porcentagem de substrato a produto. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem um carregamento de composto de substrato de pelo menos cerca de 0,5 a cerca de 200 g/L, 1 a cerca de 200 g/L, 5 a cerca de 150 g/L, cerca de 10 a cerca de 100 g/L, 20 a cerca de 100 g/L ou cerca de 50 a cerca de 100 g/L. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem um carregamento de composto de substrato de pelo menos cerca de 0,5 g/L, pelo menos cerca de 1 g/L, pelo menos cerca de 5 g/L, pelo menos cerca de 10 g/L, pelo menos cerca de 15 g/L, pelo menos cerca de 20 g/L, pelo menos cerca de 30 g/L, pelo menos cerca de 50 g/L, pelo menos cerca de 75 g/L, pelo menos cerca de 100 g/L, pelo menos cerca de 150 g/L ou pelo menos cerca de 200 g/L, ou ainda maior.

[00253] A atividade e/ou estereoseletividade melhorada dos polipeptídeos de transaminase planejada descritos aqui fornece processos em que conversão de porcentagem elevada pode ser obtida com concentrações inferiores do polipeptídeo planejado. Em algumas modalidades do processo, as condições de reação adequadas compreendem uma concentração de polipeptídeo planejado de cerca de 0,01 a cerca de 50 g/L; cerca de 0,05 a cerca de 50 g/L; cerca de 0,1 a cerca de 40 g/L; cerca de 1 a cerca de 40 g/L; cerca de 2 a cerca de 40 g/L; cerca de 5 a cerca de 40 g/L; cerca de 5 a cerca de 30 g/L; cerca de 0,1 a cerca de 10 g/L; cerca de 0,5 a cerca de 10 g/L; cerca de 1 a cerca de 10 g/L; cerca de 0,1 a cerca de 5 g/L; cerca de 0,5 a cerca de 5 g/L; ou cerca de 0,1 a cerca de 2 g/L. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de transaminase é concentração a cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ou 50 g/L.

[00254] Durante o curso das reações de transaminação, o pH da mistura de reação pode mudar. O pH da mistura de reação pode ser mantido a um pH desejado ou dentro de uma faixa de pH desejado. Isto pode ser feito pela adição de um ácido ou uma base, antes e/ou durante o curso da reação. Alternativamente, o pH pode ser controlado por utilização de um tampão. Por conseguinte, em algumas modalidades, a condição de reação compreende um tampão. Tampões adequados para manter faixas de pH desejadas são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo e não limitação, borato, carbonato, fosfato, tampão de trietanolamina, e outros mais. Em algumas modalidades, o tampão é borato. Em algumas modalidades do processo, as condições de reação adequadas compreendem uma solução de tampão de trietanolamina, onde a concentração de trietanolamina é de cerca de 0,01 a cerca de 0,4 M, 0,05 a cerca de 0,4 M, 0,1 a cerca de 0,3 M, ou cerca de 0,1 a cerca de 0,2 M. Em algumas modalidades, a condição de reação compreende uma concentração de trietanolamina de cerca de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,07, 0,1, 0,12, 0,14, 0.16, 0,18, 0,2, 0,3, ou 0,4 M. Em algumas modalidades, as condições de reação compreendem água como um solvente adequado sem tampão presente.

[00255] Nas modalidades do processo, as condições de reação podem compreender um pH adequado. O pH desejado ou faixa de pH desejada pode ser mantido por uso de um ácido ou base, um tampão apropriado, ou uma combinação de tamponamento e adição de ácido ou base. O pH da mistura de reação pode ser controlado antes e/ou durante o curso da reação. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem um pH de solução, compreendem um pH de cerca de 6 a cerca de 12, pH de cerca de 6 a cerca de 10, pH de cerca de 6 a cerca de 8, pH de cerca de 7 a cerca de 10, pH de cerca de 7 a cerca de 9, ou pH de cerca de 7 a cerca de 8. Em algumas modalidades, as condições de reação compreendem um pH de solução de cerca de 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5 ou 12.

[00256] Nas modalidades dos processos aqui, uma temperatura adequada pode ser usada para as condições de reação, por exemplo, levando em consideração o aumento na taxa de reação em temperaturas elevadas, e a atividade da enzima durante o período de tempo de reação. Por exemplo, os polipeptídeos planejados da presente descrição possuem estabilidade aumentada relativa ao polipeptídeo de transaminase de ocorrência natural, por exemplo, o polipeptídeo do tipo silvestre de SEQ ID NO: 2, que permitem os polipeptídeos planejados serem usados em temperaturas elevadas para taxas de conversão aumentadas e características de solubilidade de substrato melhoradas para a reação. Por conseguinte, em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem uma temperatura de cerca de 10°C a cerca de 70°C, cerca de 10°C a cerca de 65°C, cerca de 15°C a cerca de 60°C, cerca de 20°C a cerca de 60°C, cerca de 20°C a cerca de 55°C, cerca de 30°C a cerca de 55°C, ou cerca de 40°C a cerca de 50°C. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem uma temperatura de cerca de 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, ou 70°C. Em algumas modalidades, a temperatura durante a reação enzimática pode ser mantida a uma temperatura ao longo do curso da reação. Em algumas modalidades, a temperatura durante a reação enzimática pode ser ajustada sobre um perfil de temperatura durante o curso da reação.

[00257] Os processos da descrição são geralmente realizados em um solvente. Solventes adequados incluem água, soluções de tampão aquosas, solventes orgânicos, solventes poliméricos, e/ou sistemas de cossolvente, que geralmente compreendem solventes aquosos, solventes orgânicos e/ou solventes poliméricos. O solvente aquoso (água ou sistema de cossolvente aquoso) pode ser tamponado por pH ou não tamponado. Em algumas modalidades, os processos utilizando os polipeptídeos de transaminase planejada são geralmente realizados em um sistema de cossolvente aquoso compreendendo um solvente orgânico (por exemplo, etanol, isopropanol (IPA), sulfóxido de dimetila (DMSO), acetato de etila, acetato de butila, 1-octanol, heptano, octano, éter de t butila de metila (MTBE), tolueno, e outros mais), solventes iônicos ou polares (por exemplo, tetrafluoroborato de 4-metilimidazólio de 1-etila, tetrafluoroborato de 3-metilimidazólio de 1-butila, hexafluorofosfato de 3-metilimidazólio de 1-butila, glicerol, polietileno glicol, e outros mais). Em algumas modalidades, o cossolvente pode ser um solvente polar, tal como um poliol, dimetilsulfóxido, DMSO, ou álcool inferior. O componente de cossolvente não aquoso de um sistema de cossolvente aquoso pode ser miscível com o componente aquoso, fornecendo uma fase líquida única, ou pode ser parcialmente miscível ou imiscível com o componente aquoso, fornecendo duas fases líquidas. Sistemas de cossolvente aquosos exemplares podem compreender água e um ou mais cossolventes selecionados de um solvente orgânico, solvente polar, e solvente de poliol. Em geral, o componente de cossolvente de um sistema de cossolvente aquoso é escolhido de modo que não inativa o adversamente a enzima de transaminase sob as condições de reação. Sistemas de cossolvente apropriados podem ser facilmente identificados por medição da atividade enzimática da enzima de transaminase planejada especificada com um definido substrato de interesse no candidate sistema de solvente, utilizando um ensaio de atividade de enzima, tal como aqueles descrito aqui.

[00258] Em algumas modalidades do processo, as condições de reação adequadas compreendem um cossolvente aquoso, onde o cossolvente compreende um solvente de poliol, particularmente glicóis. Exemplos de solventes de poliol adequados incluem, a título de exemplo e não limitação, polietileno glicol, éter de metila de polietileno glicol, diéter de metila de dietileno glicol, diéter de metila de trietileno glicol, e polipropileno glicol. Em algumas modalidades, o cossolvente aquoso compreende polietileno glicol, que está disponível em diferentes pesos moleculares. Particularmente úteis são glicóis de peso molecular inferior, tal como PEG200 a PEG600. Por conseguinte, em algumas modalidades, o cossolvente aquoso compreende PEG200 de cerca de 1% a cerca de 40% de v/v; cerca de 1% a cerca de 40% de v/v; cerca de 2% a cerca de 40% de v/v; cerca de 5% a cerca de 40% de v/v; 2% a cerca de 30% de v/v; 5% a cerca de 30% de v/v; 1 a cerca de 20% de v/v; cerca de 2% a cerca de 20% de v/v; cerca de 5% a cerca de 20% de v/v; cerca de 1% a cerca de 10% de v/v; cerca de 2% a cerca de 10% de v/v. Em algumas modalidades, as condições de reação adequadas compreendem um cossolvente aquoso compreendendo PEG200 a cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%; 25%; 30%; 35%; 35% ou cerca de 40% de v/v.

[00259] Em algumas modalidades do processo, as condições de reação adequadas compreendem um cossolvente aquoso, onde o cossolvente compreende DMSO a cerca de 1% a cerca de 80% (v/v), cerca de 1 a cerca de 70% (v/v), cerca de 2% a cerca de 60% (v/v), cerca de 5% a cerca de 40% (v/v), 10% a cerca de 40% (v/v), 10% a cerca de 30% (v/v), ou cerca de 10% a cerca de 20% (v/v). Em algumas modalidades do processo, as condições de reação adequadas compreendem um cossolvente aquoso compreendendo DMSO pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% (v/v).

[00260] As quantidades de reagentes usados na reação de transaminação geralmente variarão dependendo das quantidades de produto desejado, e concomitantemente a quantidade de substrato de transaminase empregada. Aqueles possuindo ordinária versatilidade na técnica facilmente entenderão como variar estas quantidades para ajustá-las ao nível desejado de produtividade e escala de produção.

[00261] Em algumas modalidades, a ordem de adição de reagentes não é crítica. Os reagentes podem ser adicionados juntos ao mesmo tempo a um solvente (por exemplo, solvente monofásico, sistema de cossolvente aquoso bifásico, e outros mais), ou alternativamente, alguns dos reagentes podem ser adicionados separadamente, e alguns juntos em diferentes momentos. Por exemplo, o cofator, transaminase, e substrato de transaminase podem ser adicionados primeiro ao solvente.

[00262] Os reagentes sólidos (por exemplo, enzima, sais, etc.) podem ser fornecidos à reação em uma variedade de diferentes formas, incluindo pó (por exemplo, liofilizados, secados por spray, e outros mais), solução, emulsão, suspensão, e outros mais. Os reagentes podem ser facilmente liofilizados ou secados por spray utilização de métodos e equipmento que são conhecidos àqueles possuindo ordinária versatilidade na técnica. Por exemplo, a solução de proteína pode ser congelada a -80°C em pequenas alíquotas, em seguida adicionada a uma câmara de liofilização pré-resfriada, seguido pela aplicação de um vácuo.

[00263] Para eficiência de misturação melhorada quando um sistema de cossolvente aquoso é usado, a transaminase, e cofator podem ser adicionados e misturados na fase aquosa primeiro. A fase orgânica pode em seguida ser adicionada e misturada, seguido por adição do substrato de transaminase. Alternativamente, o substrato de transaminase pode ser pré-misturado na fase orgânica, antes de adição à fase aquosa.

[00264] A reação de transaminação é geralmente deixada prosseguir até que conversão adicional de substrato de cetona a produto de amina não mude significantemente com o tempo de reação, por exemplo, menos do que 10% de substrato sendo convertido, ou menos do que 5% de substrato sendo convertido). Em algumas modalidades, a reação é deixada prosseguir até que haja conversão completa ou quase completa de cetona de substrato a amina de produto. Transformação de substrato a produto pode ser monitorada utilizando métodos conhecidos por detecção de substrato e/ou produto. Métodos adequados incluem cromatografia gasosa, HPLC, e outros mais. Rendimentos da conversão do produto de amina quiral gerado na mistura de reação são geralmente mais do que cerca de 50%, pode também ser mais do que cerca de 60%, pode também ser mais do que cerca de 70%, pode também ser mais do que cerca de 80%, pode também ser mais do que 90%, e são frequentemente mais do que sobre 97%. Em algumas modalidades, os métodos para preparo de compostos de Fórmula (II) utilizando um polipeptídeo de transaminase planejada sob condições de reação adequadas resulta em pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou conversão maior de substrato de cetona, por exemplo, composto de Fórmula (I), ao composto de produto de amina, por exemplo, composto de Fórmula (II) em cerca de 48h ou menos, em cerca de 36 h ou menos, em cerca de 24 h ou menos, ou ainda menos tempo.

[00265] Em algumas modalidades do processo, as condições de reação adequadas compreendem um carregamento de substrato de composto de substrato de pelo menos cerca de 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 100 g/L, ou mais, e em que o método resulta em pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior conversão de composto de substrato a composto de produto em cerca de 48h ou menos, em cerca de 36 h ou menos, ou em cerca de 24 h ou menos.

[00266] Os polipeptídeos de transaminase planejada da presente descrição quando usados no processo sob condições de reação adequadas resultava em um excesso enantiomérico da amina quiral em pelo menos 97%, 98, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, ou 99,9%. de e.e.

[00267] Em uma modalidade adicional dos métodos para conversão de Composto de substrato a Composto de Produto de Amina utilizando os polipeptídeos de transaminase planejada, as condições de reação adequadas compreendem um carregamento de substrato inicial à solução de reação que é em seguida contactada pelo polipeptídeo. Esta solução de reação é o também suplementado com substrato adicional de composto como uma adição contínua durante o tempo a uma taxa de pelo menos cerca de 1 g/L/h, pelo menos cerca de 2 g/L/h, pelo menos cerca de 4 g/L/h, pelo menos cerca de 6 g/L/h, ou maior. Desta forma, de acordo com estas condições de reação adequadas, polipeptídeo é adicionado a uma solução possuindo um carregamento de substrato inicial de pelo menos cerca de 20 g/L, 30 g/L, ou 40 g/L. Esta adição de polipeptídeo é em seguida seguido por adição contínua de também substrato à solução a uma taxa de cerca de 2 g/L/h, 4 g/L/h, ou 6 g/L/h até que um carregamento de substrato final muito elevado de pelo menos cerca de 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 100 g/L, 150 g/L, 200 g/L ou mais, é alcançado. Por conseguinte, em algumas modalidades do método, as condições de reação adequadas compreendem adição do polipeptídeo a uma solução possuindo um carregamento de substrato inicial de pelo menos cerca de 20 g/L, 30 g/L, ou 40 g/L seguida por adição de também substrato à solução a uma taxa de cerca de 2 g/L/h, 4 g/L/h, ou 6 g/L/h até que um carregamento de substrato final de pelo menos cerca de 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 100 g/L ou mais, é alcançado. Esta condição de reação de suplementação de substrato permite carregamentos de substrato elevados serem obtidos enquanto mantendo altas taxas de conversão de substrato de cetona a produto de amina de pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior. Em algumas modalidades deste método, o substrato adicional adicionado está em uma solução compreendendo isopropilamina ou acetato de isopropilamina a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 M, pelo menos cerca de 1,0 M, pelo menos cerca de 2,5 M, pelo menos cerca de 5,0 M, pelo menos cerca de 7,5 M, pelo menos cerca de 10,0 M.

[00268] Em algumas modalidades dos processos, a reação de transaminação utilizando um polipeptídeo de transaminase planejada pode compreender as seguintes condições de reação adequadas: (a) carregamento de substrato a cerca de 5 g/L a 200 g/L; (b) cerca de 0,1 a 50 g/L de polipeptídeos de transaminase; (c) cerca de 0,1 a 4 M de isopropilamina (IPM); (d) cerca de 0,1 a 10 g/L de cofator de fosfato piridoxal (PLP); (e) pH de cerca de 6 a 9; e (f) temperatura de cerca de 30 a 60°C.

[00269] Em algumas modalidades dos processos, a reação de transaminação utilizando polipeptídeo de transaminase planejada pode compreender as seguintes condições de reação adequadas: (a) carregamento de substrato a cerca de 5 a cerca de 20 g/L; (b) sobre 0,05 a 2 g/L de polipeptídeos de transaminase; (c) cerca de 1 a 10% de v/v de PEG200; (d) cerca de 1 a 2 M de isopropilamina (IPM); (e) cerca de 0,1 a 1 g/L de cofator de fosfato piridoxal (PLP); (f) cerca de 0,1 a cerca de 0,5 M de trietanolamina (TEA); (g) pH de cerca de 6 a 8; e (h) temperatura de cerca de 45 a 55°C.

[00270] Em algumas modalidades dos processos, a reação de transaminação utilizando um polipeptídeo de transaminase planejada pode compreender as seguintes condições de reação adequadas: (a) carregamento de substrato de cerca de 25 a cerca de 100 g/L; (b) cerca de 0,5 a 10 g/L de polipeptídeos de transaminase; (c) cerca de 1 a 10% de v/v de PEG200; (d) cerca de 1 a 2 M de isopropilamina (IPM); (e) cerca de 0,1 a 1 g/L de cofator de fosfato piridoxal (PLP); (f) cerca de 0,1 a cerca de 0,5 M de trietanolamina; (g) pH de cerca de 6 a 8; e (h) temperatura de cerca de 45 a 55°C.

[00271] Em algumas modalidades, componentes de reação adicionais ou técnica adicional realizada para suplementar as condições de reação. Isto pode incluir tirar medições para estabilizar ou prevenir inativação da enzima, reduzir inibição de produto, desviar equilíbrio de reação para produzir formação de amina.

[00272] Por conseguinte, em algumas modalidades do processo para preparo de uma amina, tal como uma amina quiral, quantidades adicionais do receptor de amino podem ser adicionadas (até saturação) e/ou o receptor de amino (cetona) formado pode ser continuamente removido da mistura de reação. Por exemplo, uma ponte de solvente ou um sistema de cossolvente de duas fases pode ser usado para mover o produto de amina a uma solução de extração, e desse modo reduzir inibição por produto de amina e também desviar o equilíbrio para formação de produto (veja, por exemplo, Yun e Kim, 2008, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(11):3030-3033).

[00273] Em algumas modalidades dos processos, as condições de reação adequadas compreendem a presença do cofator reduzido, dinucleotídeo de adenina de nicotinamida (NADH), que pode agir para limitar a inativação da transaminase de enzima (veja, por exemplo, van Ophem e outros, 1998, Biochemistry 37(9):2879-88). Em tais modalidades onde NADH está presente, um sistema de regeneração de cofator, tal como glicose desidrogenase (GDH) e glicose ou formato desidrogenase e formato pode ser usado para regenerar o NADH na meio de reação.

[00274] Em algumas modalidades, o processo pode também compreender remoção do subproduto de carbonila formado do doador de grupo de amino quando o grupo de amino é transferido ao receptor de grupo de amino. Tal remoção in situ pode reduzir a taxa da reação reversa de modo que a reação dianteira domine e mais substrato seja em seguida convertido a produto. Remoção do subproduto de carbonila pode ser realizada de vários modos. Onde o doador de grupo de amino é um aminoácido, tal como alanina, o subproduto de carbonila, um ceto ácido, pode ser removido por reação com um peróxido (veja, por exemplo, US 2008/0213845, incorporada aqui por referência). Peróxidos que podem ser usados incluem, entre outros, peróxido de hidrogênio; peroxiácidos (perácidos) tal como ácido peracético (CH3CO3H), ácido trifluoroperacético e ácido metacloroperoxibenzoico; peróxidos orgânicos tal como peróxido de t-butila ((CH3)3COOH), ou outros oxidantes seletivos tais como perrutenato de tetrapropilamônio, MnO2, KMnO4, tetróxido de rutênio e compostos relacionados. Alternativamente, remoção de piruvato pode ser obtida por meio de sua redução a lactato por emprego de lactato desidrogenase para desviar equilíbrio à amina de produto (veja, por exemplo, Koszelewski e outros, 2008, Adv. Syn. Catal. 350: 2761-2766). Remoção de piruvato pode também ser obtida por meio de sua descarboxilação por emprego de piruvato descarboxilase (veja, por exemplo, Hohne e outros, 2008, Chem BioChem 9: 363-365) ou acetolactato sintase (veja, Yun e Kim, supra).

[00275] Alternativamente, em modalidades onde um aminoácido é usado como doador de grupo de amino, o subproduto de carbonila de ceto ácido pode ser reciclado novamente ao aminoácido por reação com amônia e NADH utilizando uma enzima desidrogenase apropriada, por exemplo, aminoácido desidrogenase, em presença de um doador de amina, tal como amônia, desse modo reabastecendo o doador de grupo de amino.

[00276] Em algumas modalidades, onde a escolha do doador de amino resulta em um subproduto de carbonila que possui uma pressão de vapor maior do que água (por exemplo, um coproduto de baixa ebulição tal como um composto de carbonila orgânica volátil), o subproduto de carbonila pode ser removido por espargimento da solução de reação com um gás não reativo ou por aplicação de um vácuo para reduzir a pressão de reação e remoção do subproduto de carbonila presente na fase de gás. Um gás não reativo é qualquer gás que não reaja com os componentes de reação. Vários gases não reativos incluem nitrogênio e gases nobres (por exemplo, gases inertes). Em algumas modalidades, o gás não reativo é gás de nitrogênio. Em algumas modalidades, o doador de amino usado no processo é isopropilamina (IPM), que forma o subproduto de carbonila acetona em transferência do grupo de amino ao receptor de grupo de amino. A acetona pode ser removida por espargimento com gás de nitrogênio ou aplicação de um vácuo à solução de reação e remoção da acetona da fase de gás por um coletor de acetona, tal como um condensador ou outro coletor gelado. Alternativamente, a acetona pode ser removida por redução a isopropanol utilizando uma transaminase.

[00277] Em algumas modalidades dos processos acima onde o subproduto de carbonila é removido, o correspondente doador de grupo de amino pode ser adicionado durante a reação de transaminação para reabastecer o doador de grupo de amino e/ou manter o pH da reação. Reabastecimento do doador de grupo de amino também desvia o equilíbrio para formação de produto, desse modo aumentando a conversão de substrato a produto. Desta forma, em algumas modalidades em que o doador de grupo de amino é isopropilamina e o produto de acetona é removido em situ, isopropilamina pode ser adicionada à solução para reabastecer o doador de grupo de amino perdido durante a remoção de acetona e para manter o pH da reação (por exemplo, a cerca de 8,5).

[00278] Em modalidades adicionais, qualquer um dos processos acima descritos para a conversão de composto de substrato a composto de produto pode também compreender uma ou mais etapas selecionadas de: extração; isolamento; purificação; e cristalização de composto de produto. Métodos, técnica, e protocolos para extração, isolamento, purificação, e/ou cristalização da amina de produto de misturas de reação biocatalítica produzidas pelos métodos acima descritos são conhecidos ao ordinário artesão e/ou acessados através de experimentação de rotina. Adicionalmente, métodos ilustrativos são fornecidos nos Exemplos abaixo.

Seção J: Exemplos

[00279] Os seguintes Exemplos servem para ilustrar a invenção sem limitar o escopo desta, enquanto eles por outro lado representam modalidade preferidas das etapas de reação, intermediários e/ou o processo da presente invenção. Abreviações:

Exemplo 1: Síntese de Intermediário de Cetona 6-Cloro-5-flúor-3-hidróxi-3-(2-oxo-propil)-1,3-di-hidro-indol-2-ona

[00280] À suspensão de 6-Cloro-5-flúor-isatina (25 g, 125 mmol) em acetona (620 ml), Et2NH (0,9 g, 12,5 mmol ) e K2CO3 (1,7g, 12,5 mmol ) foram adicionados. A mistura de reação foi aquecida até o refluxo durante 2 horas. Depois de resfriado à temperatura ambiente, a mistura de reação foi filtrada e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi redissolvido em MeOH (300 ml) a 50oC e água (300 ml) foi adicionada. Com adição de água, o sólido foi precipitado. MeOH (250 mL) foi removido sob pressão reduzida a 50oC; A mistura foi resfriada a 0-5oC e agitada durante 30 min; O sólido foi filtrado e secado para produzir 6-Cloro-5-flúor-3-hidróxi-3-(2- oxo-propil)-1,3-di-hidro-indol-2-ona (27g). 1H RMN (DMSO-d6): 2,00(3H, s, CH3), 3,09(1H, d, CH, J =16Hz), 3,39(1H, d, CH, J =16Hz), 6,16(1H, s, OH); 6,88(1H, d, CH, J =8Hz), 7,36(1H, d, CH, J =12Hz), 10,37(1H, s, NH). MS (ESI) m/z 258,0 (M+H)+

[00281] Método de HPLC: Coluna: Agilent Extend-C18; 150x3,0mm; 3,5 μm. Fase Móvel A (0,1% H3PO4) em água; Fase Móvel B (Acetonitrila). Gradiente: 0 min (95% A); 0,5 min (95% A), 14 min (5% A), 19,5 min (5% A),. Taxa de fluxo: 0,5 mL min-1. Comprimento de onda: 210 nm. Temperatura: 40oC. Tempo de retenção: 7,52 min. 6-Cloro-5-flúor-3-hidróxi-3-(2-metil-[ 1,3]dioxolan-2-ilmetil)-1,3-di-hidro- indol-2-ona

[00282] À suspensão de 6-cloro-5-flúor-3-hidróxi-3-(2- oxopropil)indolin-2-ona (25g, 97 mmol) em etileno glicol (250 mL), ortoformato de trietila (43g, 291mmol) e monohidrato de ácido tolueno- 4-sulfônico (0,9g, 4,8mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi aquecida a 40-50oC durante 2 horas. MeTHF (500 mL) e solução aquosa de NaCl a 10% (500 mL) foram sucessivamente adicionados. A camada orgânica foi separada e lavada com água duas vezes. Depois que o solvente foi evaporado sob vácuo, o sólido branco foi lavado com TBME (400 mL) e secado para produzir 6-cloro-5-flúor-3- hidróxi-3-(2-metil-[1,3]dioxolan-2-ilmetil)-1,3-di-hidro-indol-2-ona (27,8 g). 1H RMN (DMSO-d6): 1,00(3H, s, CH3), 2,37(2H, d, CH2,), 3,13(1H, q, CHH,), 3,58(1H, q, CHH,), 3,59(1H, q, CHH,), 3,68(1H, q, CHH,), 6,00(1H, s, OH); 6,85(1H, d, CH, J =8Hz), 7,31(1H, d, CH, J =12Hz), 10,24(1H, s, NH). MS (ESI) m/z 302,0 (M+H)+Método de HPLC:Coluna: Agilent Extend-C18; 150*3,0mm; 3,5 μm. Fase Móvel A (0,1% H3PO4) em água; Fase Móvel B (Acetonitrila). Gradiente: 0 min (95% A); 0,5 min (95% A), 14 min (5% A), 19,5 min (5% A),. Taxa de fluxo: 0,5 mL min-1. Comprimento de onda: 210 nm. Temperatura: 40oC. Tempo de retenção: 7,94 min. 1 -(6-Cloro-5-flúor-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona

[00283] À solução de 6-cloro-5-flúor-3-hidróxi-3-((2-metil-1,3- dioxolan-2-il)metil)indolin-2-ona (27,8g, 92mmol) em THF (250 mL), Al Vermelho (79,8g, 276mmol) em THF (100 mL) foi adicionado lentamente a 60oC sob atmosfera de N2. Depois da adição, a mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. HCl a 20% (400 mL) foi adicionado e a mistura foi agitada durante 20 min. Acetato de Etila (500 mL) foi adicionado e agitado durante 10 min. A camada orgânica foi separada e lavada com água (100 mL x 2); Depois tratada com Na2SO4 (50 g) e carbono ativo (5 g) a temperatura ambiente, a mistura foi filtrada e a filtragem foi concentrada. O produto bruto foi recristalizado com MeOH (80 mL) e água (60 mL) para produzir 1-(6- Cloro-5-flúor-1H-indol-3-il)-propan-2-ona (15.5 g).

[00284] 1H RMN (DMSO-d6): 2,21(3H, s, CH3), 3,78(2H, s, CH2,), 7,13(1H, d, CH, J = 4Hz); 7,23(1H, d, CH, J =8Hz), 7,33(1H, d, CH, J =8Hz), 8,23(1H, s, NH).

[00285] MS (ESI) m/z 226,0 (M+H)+

[00286] Método de HPLC:Coluna: Agilent Extend-C18; 150x3,0mm; 3,5 μm. Fase Móvel A (0,1% H3PO4) em água; Fase Móvel B (Acetonitrila). Gradiente: 0 min (95% A); 0,5 min (95% A), 14 min (5% A), 19,5 min (5% A),. Taxa de fluxo: 0,5 mL min-1. Comprimento de onda: 210 nm. Temperatura: 40 C Tempo de retenção: 10,75 min. Exemplo 2: Segunda Síntese Alternativa de Material de Partida de Cetona 1 -(6-Cloro-5-flúor-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona

[00287] Sob N2, Pt/C (10 g, Pt a 5% em Carbono) foi carregado à suspensão de 6-Cloro-5-flúor-3-((Z)-2-nitro-propenil)-1H-indol (100 g, 0,39 mol) em acetato de etila (500 mL). A mistura de reação evacuada e purgada com H2 três vezes e agitada a temperatura ambiente durante a noite. O catalisador foi filtrado e o solvente orgânico foi removido sob pressão reduzida para produzir óleo castanho. O óleo foi redissolvido em EtOH (500 mL) e bisulfito de sódio (81,7 g, 0,79 mol) em H2O () foi adicionado. A suspensão foi aquecida até 80oC durante a noite. O precipitado foi filtrado e etanol foi removido sob pressão. O resíduo foi diluído com água (500 mL) e extraído com acetato de etila (300mL X2). A camada orgânica combinada foi secada sobre Na2SO4 e condensada no vapor de rota para produzir óleo castanho (53 g, 60% de rendimento). Exemplo 3: Segunda Síntese Alternativa de Intermediário de Cetona 1 -(6-Cloro-5-flúor-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona

[00288] Raney/Ni (0,75g) e ácido acético (1,1 mL, 19,6 mmol) foram carregados à suspensão de 6-Cloro-5-flúor-3-((Z)-2-nitro-propenil)-1H- indol (5g, 19,6 mmol) na mistura de MeOH e H2O (2:1, 50 mL) a temperatura ambiente A mistura de reação evacuada e purgada com H2 três vezes e aquecida a 50oC durante a noite. MeOH (50 mL) foi adicionado à mistura de reação e o catalisador foi filtrado sobre celita. O solvente foi concentrado a 50 mL e H2O (300 ml) foi adicionado. Com a adição de H2O, sólido quase branco foi produzido. O sólido foi filtrado e lavado por água. Depois de secado no forno, 2,53 g de sólido quase branco foi isolado. Exemplo 4: Síntese, Otimização, e Análise de Polipeptídeos de Transaminase Planejada

[00289] Síntese e otimização de gene: A sequência de polinucleotídeo codificando o relatado polipeptídeo de transaminase ômega de tipo silvestre de Vibrio fluvialis de SEQ ID NO: 2 foi códon otimizado e sintetizado como o gene de SEQ ID NO: 1. O gene sintético de SEQ ID NO: 1 foi clonado em um sistema de vetor pCK110900 (veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados 20060195947, que é por meio deste incorporada por referência aqui) e subsequentemente expressado em E. coli W3110fhuA. A E. coli W3110 expressa os polipeptídeos de transaminase como uma proteína intracelular sob o controle do promotor lac. O polinucleotídeo (SEQ ID NO:3) codificando o polipeptídeo de transaminase planejada de SEQ ID NO: 4 foi obtido por evolução direcionada do códon-otimizado gene SEQ ID NO:1. O polipeptídeo de SEQ ID NO:4 possui 24 diferenças de resíduo de aminoácido (A9T; G18A; D21H; V31M; N45H; F86Y; A133R; R146L; W147K; V153S; K163F; V177L; R211K; P233T; A235P; P244T; M294V; P318D; A323T; S324G; A383V; T391A; C424A; F427Y) relativo a SEQ ID NO:2. Este gene sintético SEQ ID NO: 3 (codificando o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4) foi usado como o esqueleto de partida para também otimização utilizando métodos padrões de evolução direcionada por meio de geração de biblioteca variante iterativa por síntese de gene seguida por análise e sequenciamento do tiros para gerar genes codificando transaminases planejadas capazes de conversão de composto (IA) a composto (IIA) com propriedade de enzima melhoradas relativas aos polipeptídeos SEQ ID NOs: 2 e 4. As resultantes sequências de polipeptídeo de transaminase planejada e mutações específicas e atividades relativas são listadas na Tabela 2A.

Exemplo 5: Produção de Transaminases Planejadas

[00290] Os polipeptídeos de transaminase planejada foram produzidos em E. coli W3110 como uma proteína intracelular expressada sob o controle do promotor lac. O polipeptídeo acumula primariamente como uma enzima ativa citosólica solúvel. Um procedimento de frasco de agitação é usado para gerar pós de polipeptídeo planejado que podem ser usados em ensaios de atividade ou processo biocatalítico descrito aqui.

[00291] Alto rendimento & expressão. Células foram escolhidas e desenvolvidas durante a noite em meios de LB contendo glicose a 1% e 30 μg/mL de cloranfenicol (CAM), 30°C, 200 rpm, 85% de umidade. 20 μL de cultivo durante a noite foram transferidos a uma placa de cavidade profunda contendo 380 μL de meios de cultivo 2xYT contendo 30 μg/mL CAM, 1 mM IPTG, 1 mM MgSO4, e incubados durante ~18 h a 30°C, 200 rpm, 85% de umidade. Meios de TB de subcultura foram produzidos de meios de TB (380 uL/cavidade), 30 ug/mL CAM, 1mM MgSO4, e 1mM IPTG. Culturas celulares foram centrifugadas a 4000 rpm, 4°C durante 10 min., e os meios descartados. Pelotas celulares foram resuspensas em 200 ou 400 μL de Tampão de Lise (0,1 M tampão de trietanolamina (TEA), pH 9,0, contendo 1 mM MgSO4, 400 μg/mL PMBS e 500 μg/mL de Lisozima), tal como descrito abaixo.

[00292] Produção de pós de frasco de agitação (SFP): Um procedimento de frasco de agitação foi usado para gerar pós de polipeptídeo de transaminase planejada usados em ensaios de análise secundária ou no processo biocatalítico descrito aqui. Pó de frasco de agitação (SFP) inclui aproximadamente 30% de proteína total e por conseguinte fornecer uma preparação mais purificada de uma enzima planejada quando comparado ao lisado celular usado em ensaios de HTP. Uma colônia microbiana única de E. coli contendo um plasmídeo codificando uma transaminase planejada de interesse é inoculada em 50 mL de caldo Luria Bertani contendo 30 μg/mL de cloranfenicol e glicose a 1%. Células são desenvolvidas durante a noite (pelo menos 16 horas) em uma incubadora a 30°C com agitação a 250 rpm. A cultura é diluída em 250 mL de Caldo Terrífico (12 g/L de bacto- triptona, 24 g/L de extrato de levedura, 4 mL/L de glicerol, 65 mM fosfato de potássio, pH 7,0, 1 mM MgSO4) contendo 30 μg/mL de cloranfenicol, em um frasco de 1 litro a uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,2 e deixada desenvolver a 30°C. Expressão do gene de transaminase é induzida por adição de isopropil-β -D- tiogalactosídeo ("IPTG") a uma concentração final de 1 mM quando o OD600 da cultura é 0,6 a 0,8 e incubação é em seguida continuada durante a noite (pelo menos 16 horas). Células são colhidas por centrifugação (5000 rpm, 15 min, 4°C) e o sobrenadante descartado. A pelota celular é resuspensa com um volume igual de tampão de trietanolamina (cloreto) gelado (4°C) 100 mM, pH 7,0 (opcionalmente incluindo 2 mM MgSO4), e colhida por centrifugação como acima. As células lavadas são resuspensas em dois volumes do tampão de trietanolamina (cloreto) gelado e passadas através de uma Prensa Francesa duas vezes a 82737,11 kPa (12.000 psi) enquanto mantidas a 4°C. Resíduo celular é removido por centrifugação (9.000 rpm, 45 minutos, 4°C). O sobrenadante lisado claro foi coletado e armazenado a -20°C. Liofilização de lisado claro congelado fornece uma pó de frasco de agitação seco de polipeptídeo de transaminase bruto. Alternativamente, a pelota celular (antes ou depois da lavagem) pode ser armazenada a 4°C ou -80°C.

[00293] Produção de pós de processo a jusante (DSP):Pós de DSP contém aproximadamente 80% de proteína total e por conseguinte fornece uma preparação mais purificada da transaminase de enzima planejada quando comparado ao lisado celular usado no ensaio de alto rendimento. Fermentação em larga escala (~100 - 120 g) da transaminase planejada para produção de pós de DSP pode ser realizada como uma batelada curta seguida por um processo de batelada alimentada de acordo com métodos de bioprocesso padrão. Brevemente, expressão de transaminase é induzida por adição de IPTG a uma concentração final de 1 mM. Em seguida a fermentação, as células são colhidas e resuspensas em 100 mM tampão de trietanolamina-H2SO4, em seguida mecanicamente rompida por homogenização. O resíduo celular e ácido nucléico são floculados com polietilenimina (PEI) e a suspensão clarificada por centrifugação. O sobrenadante claro resultante é concentrado utilizando uma membrana de ultrafiltragem de fluxo cruzado tangencial para remover sais e água. O concentrado e concentrado de enzima parcialmente purificado pode em seguida ser secado em um liofilizador e embalado (por exemplo, em recipientes de polietileno).

Exemplo 6: Procedimentos Analíticos

[00294] Análise de HPLC de Reações de HTP: Uma alíquota da reação extinguida foi submetida à Análise de HPLC sob as seguintes condições.

[00295] Conversão de composto (IA) a composto (IIA) foi determinada dos resultantes cromatogramas como segue:

[00296] Análise de HPLC de reações em escala de 5 mL e 100 mL: Alíquotas da reação extinguida foi submetida a Análise de HPLC sob as seguintes condições.

[00297] Conversão de composto (IA) a composto (IIA) foi determinada do cromatogramas como segue:

[00298] Determinação de pureza quiral de produto (%ee): A pureza quiral ou excesso enantiomérico de composto (IIA) foi avaliado por HPLC utilização das seguintes condições.

[00299] Determinação de pureza de produto: A pureza de produto foi determinada por HPLC utilizando as seguintes condições.

Exemplo 7: Análise de Alto Rendimento (HTP) de Transaminases para Conversão de Composto (IA) a Composto (IIA)

[00300] Ensaios de análise de HTP: Análise de alto rendimento usada para guiar seleção primária de variantes foi realizada em placas de 96 cavidades utilizando lisados celulares sob condições de ensaio de 10 g/L de composto (IA); 1 mM fosfato piridoxal (PLP); 2 M isopropilamina (IPM), pH 7,0); trietanolamina a 0,1 M (TEA), pH 7; 5% de v/v de PEG200; 10 uL de lisado; e 50 ou 55°C.

[00301] Células foram desenvolvidas em placas de 96 cavidades tal como descrito acima e os lisados preparados por administração de 200 uL (durante a Rodada 1) ou 400 uL (durante a Rodada 2) de Tampão de Lise (1 mg/mL de Lisozima, 0,5 mg/mL de de polimixina B, PLP a 1 mM, trietanolamina a 0,1 M (TEA), pH 7,0) em cada cavidade. Placas foram seladas, agitadas durante 2 h, e em seguida centrifugadas durante 20 min a 4.000 rpm a 4°C para peletizar o resíduo celular.

[00302] Uma 10 uL de solução de substrato de matéria-prima (200 g/L de composto (IIA) dissolvido em PEG200) foi adicionada a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades seguido por 180 uL de uma solução de matéria-prima de isopropilamina (IPM)/fosfato piridoxal (PLP) (IPM a 2,2 M e PLP a 1,06 mM em TEA a 100 mM, pH 7,0. Para avaliação de refratariedade para produzir inibição de composto (IIA), composto (IIA) foi adicionado à mistura de reação a uma 14 g/L final durante os ensaios de Rodada 1 e 16 g/L de Rodada 2. Reações foram iniciadas por adição de 10 uL de lisado celular/cavidade. Placas foram seladas e incubadas com agitação a 50 ou 55°C durante 24 h. Reações foram extinguidas com 600 uL de acetonitrila e amostras examinadas por HPLC tal como descrito no Exemplo 5.

Exemplo 8: Processo para Conversão de Composto (IA) a Composto (IIA) em Escala de 5 mL

[00303] Reações em escala de 5 mL foram realizadas como segue. A um frasco de vidro de 20 mL equipado com uma barra de agitação magnética em forma de cruz foi adicionado 0,75 mL (ou 0,5 mL em caso de 10% de v/v de concentração de PEG 200) de tampão de TEA a 100 mM (pH 7,0). 2 mL de solução de matéria-prima de IPM^HCl a 5 M foi adicionada ao frasco seguido por1 mL de solução de matéria-prima de PLP a 5 mM. A mistura foi agitada a 500 rpm (agitação magnética). O pH da mistura foi em seguida ajustado a 7,0 utilizando solução de NaOH a 1 M. 125 mg (ou 250 mg para 50 g/L ou 500 mg para 100 g/L de concentração) de substrato (sólido) foram em seguida adicionados ao frasco. 0,25 mL (ou 0,5 mL para 10% de v/v) de PEG 200 foi em seguida adicionado à mistura. Concentrações finais de componentes foram: 25 g/L (ou 50 ou 100 g/L) de composto (IA); PLP a 1 mM; IPM a 2 M; 5% de v/v (ou 10%) de PEG 200; 2 g/L de enzima de TA; TEA a 100 mM, pH 7,0). A mistura foi em seguida agitada e aquecida a 50°C.

[00304] Reações foram iniciadas por adição de 1 mL da solução de matéria-prima de enzima (10 g/L). 20 uL de amostras foram tomados em diferentes momentos e diluídos com 750 uL de metanol e analisados por HPLC. Depois de 24 h, as misturas de reação foram extinguidas com 5 mL de acetonitrila e amostras analisadas por HPLC para obter a conversão em% final.

Exemplo 9: Processo para Conversão de Composto (IA) a Composto (IIA) em Escala de 100 mL

[00305] Uma reação de escala de 100 mL foi realizada como segue. A um frasco de fundo redondo de 250 mL com uma lâmina de agitação em forma de âncora foram adicionados 15 mL de tampão de TEA a 100 mM (pH 7). 40 mL da solução de matéria-prima de IPM^HCl a 5 M foram adicionados ao frasco de fundo redondo seguido por 20 mL da solução de matéria-prima de PLP a 5 mM. A mistura foi agitada a 100 rpm (agitação suspensa) e o pH ajustado a 7,0 utilizando NaOH a 10 M. Composto de substrato sólido (IA) foi em seguida adicionado ao frasco de fundo redondo durante ~5 min com agitação. PEG 200 (5 mL) foi em seguida adicionado e a mistura aquecida a 50°C. 20 mL da solução de matéria-prima de enzima (10 g/L) foram em seguida adicionados para iniciar a reação. A reação foi agitada a 200 rpm (agitação suspensa). 20 uL de amostras foram tomados em diferentes momentos e diluídos com 750 uL de metanol e analisados por HPLC. Em alguns casos, onde a preparação não foi prosseguida, depois de 24 h, as misturas de reação foram extinguidas com 100 mL de acetonitrila e amostras analisadas por HPLC para obter a conversão em% final (Figure 9). Concentração de diferentes componentes na reação: cetona: 25 g/L (ou 50 ou 100 g/L); PLP: 1 mM; IPM: 2 M; PEG200: 5% de v/v; enzima de TA:2 g/L; tampão: TEA a 100 mM, pH 7,0. Conversão de substrato a produto foi analisado por HPLC tal como descrito no Exemplo 3.

[00306] Preparação de Produto:. Depois de reação de 24 h sob as condições descritas acima (até o ponto 11), a mistura de reação foi resfriada a temperatura ambiente. A mistura foi filtrada através de um funil de vidro sinterizado G4 padrão com um pedaço de papel de filtro (Whatman 1, tamanho de poro de 11 μm). O frasco de fundo redondo foi enxaguado com água desionizada de 20 mL que foi em seguida filtrado através do mesmo funil. A massa filtrada foi lavada duas vezes com água desionizada de 20 mL. O pH do filtrado foi ajustado de 6,8 a 3 utilizando uma solução de HCl a 5 M. O filtrado foi em seguida transferido em um funil separador e extraído com 100 mL de MTBE. A mistura bifásica foi deixada separar. A camada de MTBE contendo substrato não reagido e impurezas foi descartada. A camada aquosa foi transferida em um béquer e 100 mL de MTBE foram adicionados. O pH da camada aquosa foi em seguida ajustado de 3 a 10 utilizando Solução de NaOH a 10 M. A mistura foi transferida em um funil separador e as fases deixadas separar. A camada aquosa foi em seguida extraída com 100 mL de MTBE três vezes (nb: repetido até que produto não estivesse presente na camada aquosa). As fases de MTBE das três extrações foram combinadas e evaporadas até a secura utilizando um evaporador giratório. O produto bruto foi também secado sob vácuo durante 48 h. Exemplo 10: Processo para Conversão de Composto (IA) a Composto (IIA) em Escala de 30g

[00307] 152,48g de cloridrato de iso-propilamina e 0,204g de monohidrato de piridoxalfosfato foram dissolvidos em 495mL de água enquanto agitando. A esta solução clara amarela, uma solução de 30,0g de cetona em 85mL de polietileno glicol (peso em mol médio de 200) dentro de 15 minutos. Na adição, a cetona precipita-se como partículas finas que são uniformemente distribuídos nos meios de reação. À suspensão, 180mL de tampão de trietanolamina (0,1 mol/L, pH 7) foram adicionados e o pH foi ajustado a 7 por adição de solução de hidróxido de sódio aquosa (1 mol/L). A mistura de reação é aquecida a 50°C e uma solução de 1,62g de transaminase SEQ ID NO: 134 dissolvida em 162mL de tampão de trietanolamina (0,1 mol/L, pH 7) é adicionada. A mistura de reação é continuamente mantida a pH 7 por adição de 1 mol/L de solução de hidróxido de sódio aquosa. A mistura de reação é agitada 24h a 50°C e um fluxo de Nitrogênio é soprado sobre a superfície da mistura de reação para extrair a acetona formada. A mistura de reação é em seguida resfriada a 25°C e filtrada sobre um leito de floco de celulose. O pH do filtrado é ajustado a ®1 por adição de ácido sulfúrico concentrado. O filtrado acidificado é extraído com 250 mL de acetato de iso- Propila. As camadas são separadas e o pH da fase aquosa é ajustado a ®10 por adição de solução de hidróxido de sódio concentrada aquosa. A fase aquosa basificada é extraída com acetato de iso-propila. As camadas são separadas e a fase orgânica é lavada com 100 mL de água. A fase orgânica é concentrada por destilação a 2/3 de seu volume de origem. Em um segundo reator 33,98g, ácido (+)-canforsulfônico é dissolvido em 225 mL de acetato de iso-propila em refluxação e a fase concentrada orgânica é adicionada dentro de 10 minutos. Depois de adição completa, a suspensão fina formada é resfriada a 0°C dentro de 2 horas e mantida a 0°C durante 15 horas. O sal de sulfonato de amina-(+)- cânfora precipitado é filtrado, lavado com 70 mL de acetato de iso- propila e secado a 40°C em vácuo produzindo 51,57g de cristais incolores (84,5% de rendimento t.q.) Dados Analíticos IV:

[00308] (cm-1)=3296, 3061, 2962, 2635, 2531, 2078, 1741, 1625, 1577, 1518, 1461, 1415, 1392, 1375, 1324, 1302, 1280, 1256, 1226, 1170, 1126, 1096, 1041, 988, 966, 937, 868, 834, 814, 790, 766, 746, 719, 669, 615. LC-MS (ESI +):

[00309] Íon de amônio: m/z =227 ([M+H]), 268 ([M+H+CH3CN]), 453 ([2M+H]).

[00310] Íon de canforsulfonato: m/z =250 ([M+NH4]), 482 ([2M+NH4]). LC-MS (ESI -):

[00311] Íon de canforsulfonato: m/z=231 ([M-H]), 463 ([2M-H]). 1H-RMN (DMSO-d6, 400 MHz):

[00312] 11,22 (br. s., 1H), 7,75 (br. s., 3H), 7,59 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 3,37 - 3,50 (m, 1H), 2,98 (dd, J = 14,3, 5,8 Hz, 1H), 2,91 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 2,81 (dd, J = 14,3, 8,0 Hz, 1H), 2,63 - 2,74 (m, 1H), 2,41 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 2,24 (dt, J = 18,3, 3,8 Hz, 1H), 1,94 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 1,86 (dt, J = 7,4, 3,6 Hz, 1H), 1,80 (d, J = 18,1 Hz, 1H), 1,23 - 1,35 (m, 2H), 1,15 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 1,05 (s, 3H), 0,74 (s, 3H)

[00313] Amina Livre (obtida por evaporação da camada de iso- Propilacetato depois de extração da camada aquosa basificada): 1H RMN (400MHz, DMSO-dβ):

[00314] 11,04 (br. s., 1H), 7,50 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,25 (s, 1H), 3,03 (sxt, J = 6,3 Hz, 1H), 2,61 (dd, J = 14,3, 6,5 Hz, 1H), 2,57 (dd, J = 14,1, 6,5 Hz, 1H), 1,36 (br. s., 2H), 0,96 (d, J = 6,3 Hz, 3H) Exemplo 11: Processo para Conversão de Composto (IIA) a Composto (IVB)

[00315] 13,62 g de 5-cloroisatina são suspensos em 35 mL de iso propanol e 2,3 g de trietilamina são adicionados. A suspensão é aquecida até o refluxo e uma solução de 34,42g de sal de sulfonato de amina-(+)-cânfora dissolvido em 300 mL de iso-propanol são adicionados dentro de 50 minutos. A mistura de reação é agitada até o refluxo durante 17 horas. A mistura de reação é resfriada a 75°C e 17,4g de ácido (+)-canforsulfônico são adicionados à mistura de reação. Aproximadamente 300 mL de iso-propanol são removidos por destilação a vácuo. Iso-propanol destilado é substituído por acetato de iso-propila e destilação a vácuo é continuada. Isto é destilação é repetida uma segunda vez. Ao resíduo de destilação, 19 mL de etanol e 265 mL de acetato de etila são adicionados e a mistura é aquecida até o refluxo. A mistura é resfriada em rampas a 0°C e mantida a 0°C durante 24 horas. Os cristais beges a quase brancos são filtrados, lavados com 3 porções (cada uma de 25 ml) etilacetato pré-resfriados (0°C) e secados em vácuo produzindo 40,3 g de cristais beges a quase brancos. (86,3% de rendimento t.q.) IV:

[00316] (cm-1)= 3229, 3115, 3078, 3052, 2971, 2890, 2841, 2772, 2722, 2675, 2605, 2434, 1741, 1718, 1621, 1606, 1483, 1460, 1408, 1391, 1372, 1336, 1307, 1277, 1267, 1238, 1202, 1184, 1162, 1149, 1128, 1067, 1036, 987, 973, 939, 919, 896, 871, 857, 843, 785, 771, 756, 717, 690, 678, 613. LC-MS (ESI +):

[00317] Íon de amônio: m/z =390 ([M+H]), 431 ([M+H+CH3CN])

[00318] Íon de canforsulfonato: m/z =250 ([M+NH4]), 482 ([2M+NH4]) LC-MS (ESI -):

[00319] Íon de canforsulfonato: m/z=231 ([M-H]), 463 ([2M-H]) 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz):

[00320] 11,49 (s, 1H), 11,23 (s, 1H), 10,29 - 10,83 (m, 1H), 9,78 - 10,31 (m, 1H), 7,55 - 7,60 (m, 2H), 7,52 (s, 1H), 7,40 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,52 - 4,63 (m, 1H), 3,20 (dd, J = 16,3, 4,2 Hz, 1H), 2,96 (dd, J = 16,1, 11,3 Hz, 1H), 2,90 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 2,56 - 2,63 (m, 1H), 2,39 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 2,21 (dt, J = 18,0, 3,8 Hz, 1H), 1,89 - 1,93 (m, 1H), 1,81 (ddd, J = 15,3, 7,8, 3,7 Hz, 1H), 1,76 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 1,53 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,20 - 1,33 (m, 2H), 0,98 (s, 3H), 0,70 (s, 3H) Exemplo 12: Processo para Preparo de um Composto de Fórmula (IVA) 1/2Hidrato

[00321] Em um 750mL de reator com agitador de impulsor, 50g de sal de composto (IVB) foram dissolvidos em 300mL de etanol (ALABD) e 100 mL de água desionizada (WEM). A solução amarelada clara foi aquecida a temperatura interna de 58°C. À solução, 85 g de uma solução de carbonato de sódio aquosa a 10% foram adicionados dentro de 10 minutos. A solução clara foi filtrada por partícula em um segundo vaso de reação. Vaso e filtro de partícula foram cada um enxaguados com 25 mL de uma mistura de etanol:água (3:1 v/v) no segundo vaso de reação. A solução filtrada por partícula combinada é aquecida a 58°C de temperatura interna e 200mL de água (WEM) foram adicionados em gotas dentro de 15 minutos. Pela final da adição, a solução torna-se turva. A mistura é agitada durante 10 minutos a 58°C de temperatura interna e é em seguida resfriada lentamente a temperatura ambiente dentro de 4 horas e 30 minutos formando uma suspensão branca bem agitável espessa. À suspensão, 200 mL de água são adicionados e a mistura é agitada durante adicional de 15horas e 20 minutos a temperatura ambiente. A suspensão é filtrada e a massa filtrada é lavada duas vezes com porções de 25 mL de uma mistura de etanol:água 9:1 (v/v). Os cristais incolores são secados a 60°C em vácuo produzindo 26,23g (=91,2% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)

[00322] 10,70 (s, 1H), 10,52 (s, 1H), 7,44 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 7,33 (dd, J = 8,4, 2,1 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,83 - 4,00 (m, 1H), 3,13 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 2,77 (dd, J = 15,1, 3,8 Hz, 1H), 2,38 (dd, J = 15,1, 10,5 Hz, 1H), 1,17 (d, J = 6,3 Hz, 3H).

Claims

1. Processo para preparação de um composto de Fórmula (II), ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo,

caracterizado pelo fato de que compreende enzimaticamente converter um composto de Fórmula (I) a composto de Fórmula (II), ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo,

na qual a linha tracejada está ausente; A é selecionado dentre C=O ou C=NH; R1é H, -CH3,

R4e R são cada um, independentemente, H ou -Cl; R5é H, -OH, -CH3, -OCH3, -F, -Cl, -CF3 ou -CN; R6é H, -OH, -OCH3, -F ou -Cl; R é H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -CO2CH2CH3 ou -CF3; e n é 1 ou 2; e a enzima é SEQ ID NO: 134.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R5e R6são flúor quando: R8é -CH3, e n é 1.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de queR5e R6são cada, independentemente, flúor e cloro, quando: R8é -CH3, e n é 1.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R5e R6são hidrogênio quando: R8é -CH3, e n é 1.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R5é flúor quando: n é 1, e R6é hidrogênio.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de Fórmula (II) apresenta a Fórmula (IIA), ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo,

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado pelo fato de que o composto de Fórmula (I) é um compost de Fórmula (IA), ou um sal, hidrato ou solvente do mesmo,