[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

MX2014011489A - Proceso quimico para preparar espiroindolonas e intermediarios de las mismas. - Google Patents

Proceso quimico para preparar espiroindolonas e intermediarios de las mismas.

Info

Publication number
MX2014011489A
MX2014011489A MX2014011489A MX2014011489A MX2014011489A MX 2014011489 A MX2014011489 A MX 2014011489A MX 2014011489 A MX2014011489 A MX 2014011489A MX 2014011489 A MX2014011489 A MX 2014011489A MX 2014011489 A MX2014011489 A MX 2014011489A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
compound
formula
percent
hydrate
salt
Prior art date
Application number
MX2014011489A
Other languages
English (en)
Other versions
MX354023B (es
Inventor
Michael Crowe
Michael Foulkes
Giancarlo Francese
Dominique Grimler
Ernst Kuesters
Kurt Laumen
Yunzhong Li
Changxue Lin
Jovana Nazor
Thomas Ruch
Derek Smith
Shiwei Song
Shangjun Teng
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of MX2014011489A publication Critical patent/MX2014011489A/es
Publication of MX354023B publication Critical patent/MX354023B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/12—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/34—Oxygen atoms in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/38—Oxygen atoms in positions 2 and 3, e.g. isatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D471/20—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a procesos y productos intermediarios útiles para la elaboración de compuestos de espiroindolona tales como la (1'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-fluoro-3'-m etil-2',3',4',9'-tetrahidro-espiro-[indolina-3,1'-pirido-[3,4-b]- indol]-2-ona y sales e hidratos y solvatos de los mismos.

Description

PROCESO QUÍMICO PARA PREPARAR ESPIROINPOLONAS E INTERMEDIARIOS DE LAS MISMAS REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS. TABLA O PROGRAMA PARA COMPUTADORA La copia oficial de la lista de secuencias se presenta simultáneamente con la especificación como un archivo de texto con formato ASCII a traves de EFS-Web, con el nombre de archivo de "PAT055051_seql2.txt", una fecha de creación de 22 de marzo de 2013, y un tamaño de 447 kilobytes. La lista de secuencias presentada a través de EFS-Web es parte de la especificación y se incorpora en su totalidad como referencia en el presente documento.
Téenica Anterior: Se conoce (1’R, 3'S)-5, 7'-dicloro-6'-fluoro-3'-metil-2',3', 4', 9'-tetrahidro-espiro-[indolina-3, 1 '-pirido-[3, 4-b]-indol]-2-ona (por ejemplo, un compuesto de la fórmula (IV), que comprende una fracción de espiromdolona) y un método sintético de 6 pasos para su preparación, incluyendo el compuesto del intermediario conocido como amina quiral (NA) (WO 2009/132921 ): L-aminoacilasa resolución ¥ ·· Invención: La presente invención está dirigida a un metodo mejorado para sintetizar compuestos de espiromdolonas, en particular, la (1 'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-fluoro-3,-metil-2',3',4,,9,-tetrahidro-espiro-[indolina-3, 1 '-pirido-[3,4-b]-indol]-2-ona, y los intermediarios utilizados en el método mejorado.
En una primera modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (II), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (M) que comprende convertir un compuesto de ia Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), o una sal, solvato o hidrato del mismo (I) en donde: la línea discontinua es un enlace o una ausencia; A se selecciona a partir de C = O y C = NH ; o cuando I línea discontinua es un enlace A-R8 doble es: Ra es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es H, CH3, R4 y R7 son cada uno, independientemente, H o Cl; R5 es H, OH, CH3, OCH3 F, Cl, CF3 O CN; R6 es H, OH, -OCH3, -F o Cl; R8 es H, CH3, CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -C02C H3 -C02CH2CH3 O -CF3; y n es 1 o 2.
En una segunda modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IIA), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (IIA) que comprende transaminar enzimáticamente un compuesto de la fórmula (IA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (IA). para formar el compuesto de la fórmula (IIA).
En una tercera modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (IV) que comprende hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula (III) o una sal o hidrato o solvato del mismo (III) con un compuesto de la Fórmula (II) o una sal o hidrato o solvato del mismo, (II) en donde el compuesto de la Fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo, se prepara a partir de un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (l) en donde: la línea discontinua es un enlace o una ausencia; A se selecciona a partir de C = O y C = NH ; o cuando la línea discontinua es un enlace A-R8 doble es R8 Ra es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un amino, alquilamino (de 1 a 6 átomos de carbono), alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono)-dialquilamino o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono) C(O)NH-alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R4 y R7 son cada uno, independientemente, H o halo; R5 y R6 son cada uno, independientemente, hidrógeno, halo, hidroxilo, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), trihaloalquilo (de un átomo de carbono), ciano o alcoxilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R8 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un hidroxilo; n es 1 o 2; R1 es hidrógeno o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); y R4', R5', R6 y R7 , son cada uno, independientemente, hidrógeno, halo, hidroxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), y alquiloxilo (de 1 a 6 átomos de carbono).
En una cuarta modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (IVA) que comprende: hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula (M IA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, con un compuesto de la Fórmula (II) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (NA) para proporcionar el compuesto de la Fórmula (IVA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, en donde el compuesto de la Fórmula (NA) se prepara a partir del compuesto de la Fórmula (IA), o una sal o hidrato o solvato del mismo, En una qumta modalidad, la invención es un compuesto de la fórmula (IC): (ic) en donde: R1 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un amino, alquil-amino (de 1 a 6 átomos de carbono), alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono) di-alquil-amino o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono)-C(O)NH-alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R5 y R6 son cada uno, independientemente, hidrógeno, halo, hidroxilo, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono) alquilo, trihaloalquilo (de un átomo de carbono), ciano o alcoxilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R8 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido con un hidroxilo; n es 1 o 2; o una sal o hidrato o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.
En una sexta modalidad, la invención es un compuesto seleccionado a partir de: o , , hidrato farmacéuticamente aceptable de los mismos.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a nuevos procesos, un nuevo paso de procedimiento y un nuevo intermediario útil en la preparación de compuestos de espiromdolona útiles para el tratamiento de enfermedades parasitarias que comprenden por ejemplo, una fracción de espiroindolona, tales como la (l’R.S'Sj-S.y-dicloro-e'-fluoro-3'-metil-2',3',4,,9'-tetrahidro-espiro-[indolina-3, 1’-pirido-[3,4-b]-indol]-2-ona.
Antecedentes de la Invención La presente invención se refiere a procedimientos para la preparación de los compuestos de espiroindolona, tales como la (1 ,R,3'S)-5,7,-dicloro-6,-fluoro-3'-metil-2,,3,,4',9,-tetrahidro-espiro-[indolina-3, 1 '-pirido-[3,4-b]-indol]-2-ona.
La (1 'R,3'S)-5,7'-dicloro-6'-fluoro-3'-metil-2',3',4',9'-tetrahidro-espiro-[indolina-3, 1 '-pirido-[3,4-b]-indol]-2-ona es útil en el tratamiento y/o prevención de infecciones tales como aquellas causadas por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Trypanosoma cruzi y parásitos del género Leishmanla, tales como, por ejemplo, Leishmania donovani., y tiene la siguiente estructura (IVA) La (1 'R,3'S)-5,7,-dicloro-6,-fluoro-3,-metil-2',3',4',9,-tetrahiclro-espiro-[indolina-3,1’-p¡rido-[3,4-b]-indol]-2-ona y una síntesis de la misma se describen en la Publicación Internacional número WO 2009/132921 Al, en particular en el Ejemplo 49 del mismo.
Hay una necesidad de proporcionar procesos nuevos para la preparación de la (1 'R.S'S^S.y'-dicloro-e'-fluoro-S'-metil^'.S'^'.g'-tetrahidro-espiro-[indolina-3,1 '-pirido-[3,4-b]-indol]-2-ona con el fin de mejorar la eficacia general de la síntesis para que sea adecuada para la elaboración. En particular, hay una necesidad de aumentar la eficiencia de la síntesis del Intermediario de amina quiral (NA): El (los) proceso(s), de acuerdo con la presente invención, para la producción de compuestos de espiromdolona, tales como los compuestos según la fórmula (IV), o una sal o hidrato o solvato de los mismos, e intermediarios, tal como se definen en la presente, se resumen en el Esquema 1 .
Esquema 1 A saber, un compuesto de la fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, se convierte en un compuesto de la Fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo, de acuerdo con los métodos 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 en donde El método 1 comprende a) Transaminación enzimática para convertir un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, en un compuesto de la fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo Transaminación enzimatica El método 2 comprende a) Catálisis asimétrica química para convertir un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, en un compuesto de la fórmula (II), o una sal del mismo; , , , , , Ra O Catalizador qui ral Hj HCOOH, NaBH4 etc El método 3 comprende a) Reducción asimétrica química para convertir un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, en un compuesto de la fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo; .
. . . ’ El método 4 comprende a) Reducción seguida por resolución quiral para convertir un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, en un compuesto de la fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo; i i .
Níquel Rancy Resolución Quiral El metodo 5 comprende a) Resolución de lipasa para convertir un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, en un compuesto de la fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo ee>99 ee¾85 Novozyn 435: Lipasa B de candida antartica inmoviulizada en una resina acrílica El método 6 comprende a) Una combinación de dos o más métodos de 1 a 5 para convertir un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, en un compuesto de la fórmula (I I), o una sal o hidrato o solvato del mismo.
Un compuesto de la Fórmula (II), o sal del mismo, se puede convertir en un compuesto de la Fórmula (IV), o sal del mismo, por ejemplo, como se describe en la Publicación Internacional número WO 2009/132921 , en particular, como se describe en las reivindicaciones y ejemplos relevantes, que se incorporan como referencia en la presente.
La invención se refiere especialmente a los procesos descritos en cada sección. La invención se refiere igualmente, de forma independiente, a cada paso descrito en una secuencia de proceso dentro de la sección correspondiente. Por lo tanto, todos y cada uno de los pasos de cualquier proceso, que consisten en una secuencia de pasos, descritos en la presente es en sí una modalidad preferida de la presente invención. Por lo tanto, la invención se refiere tambien a aquellas modalidades del proceso, según las cuales un compuesto obtenible como un intermediario en cualquier paso del proceso se utiliza como un material de partida.
La invención se refiere igualmente a nuevos materiales de partida que se han desarrollado específicamente para la preparación de los compuestos de acuerdo con la invención, sus usos y procedimientos para su preparación.
La invención se refiere igualmente a intermediarios que se han desarrollado específicamente para la preparación de los compuestos de acuerdo con la invención, sus usos y procedimientos para su preparación.
Se observa que en la presente solicitud generalmente las explicaciones hechas en una sección son también aplicables para otras secciones, a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, las explicaciones para el residuo R1 en la fórmula (I) proporcionadas en la sección A también se aplican si la fórmula (I) se produce en otras secciones, como la Sección B, a menos que se indique lo contrario.
Sección A: Preparación de un compuesto de la Fórmula (I) Un compuesto de la fórmula (I), o sal del mismo, o un hidrato o solvato del mismo, se puede preparar como se describe a continuación y/o de acuerdo con los Ejemplos 1-3 que figuran en la presente. ó - , Etapa de aiquilación Rojo de-protección l de cetona Sección B: Conversión de un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II).
En una primera modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (II), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (II) que comprende convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), o una sal, solvato o hidrato del mismo, (l) en donde: la línea discontinua es un enlace o una ausencia; A se selecciona a partir de C = O y C = NH ; o cuando línea discontinua es un enlace A-R8 doble es: Ra es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es H, CH3, R4 y R7 son cada uno, independientemente, H o Cl; R5 es H, H, CH3, CH2CH3 -CH2OH, -CO2H, -C02CH3 -C02CH2CH3 O -CF3; y n es 1 o 2.
En una primera modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, R5 y R6 son flúor cuando: R8 = -CH3, y n es 1.
En una segunda modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, R5 y R6 son flúor y cloro, cuando: R8 = -CH3, y n es 1.
En una tercera modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, R5 y R6 son hidrógeno cuando: R8 es -CH3, y n es 1.
En una cuarta modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (I I), en donde, R5 es flúor cuando: n es 1 , y R6 es hidrógeno.
En una sexta modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, el compuesto de la Fórmula (II) es de la Fórmula (NA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (HA).
En una septima modalidad alternativa, la invención es un procedimiento para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, el compuesto de fórmula (II) se convierte a partir del compuesto de fórmula (I) bajo una condición seleccionada a partir de la transaminación enzimática, catálisis asimétrica química, reducción asimétrica y resolución quiral, o una combinación de dos o más condiciones.
En una octava modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, A es C = 0.
En una novena modalidad alternativa, la invención es un proceso para convertir un compuesto de la Fórmula (I) en un compuesto de la Fórmula (II), en donde, el compuesto de la Fórmula (I) es un compuesto de la Fórmula (IA), o una sal o hidrato o solvato del mismo (IA).
En una modalidad de ejemplo, la enzima es la SEQ ID NO: 134. En una segunda modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (NA), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (HA) que comprende un compuesto que se transamina enzimáticamente de la fórmula (IA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (IA). para formar el compuesto de la fórmula (IIA).
Típicamente, la cetona, el compuesto (I) se disuelve en un disolvente orgánico, por ejemplo, glicol, y se agrega a una mezcla acuosa de clorhidrato de isopropilamina y piridoxalfosfato, seguido por la adición de un búfer de trietanolamina (TEA). El pH se ajusta luego a la posición neutra con una base apropiada, por ejemplo, NaOH seguido por el calentamiento y adición de la transaminasa. La reacción se deja en agitación a temperatura durante 24 horas aproximadamente. El producto amino quiral sólido (compuesto de la Fórmula (II))) se aísla por medios conocidos por un experto en la téenica, y/o de acuerdo con los Ejemplos 10-12.
En una modalidad de ejemplo, la enzima es la SEQ ID NO: 134.
Sección C: Conversión de un compuesto de la Fórmula (II) en un compuesto de la Fórmula (IV) En una tercera modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (IV) que comprende hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula (III) o una sal o hidrato o solvato del mismo, (III) con un compuesto de la Fórmula (I I) o una sal o hidrato o solvato del mismo, (II) en donde el compuesto de la Fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo, se prepara a partir de un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (I) en donde: la línea discontinua es un enlace < una ausencia; A se selecciona a partir de C = O y C = NH ; o cuando la línea discontinua es un enlace A-R8 doble es: R8 ; Ra es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un amino, alquilamino (de 1 a 6 átomos de carbono), alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono) dialquilo-amino o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono)-C(O)NH-alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R4 y R7 son cada uno, independientemente, H o halo; R5 y R6 son cada uno, independientemente, hidrógeno, halo, hidroxilo, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), trihaloalquilo (de un átomo de carbono), clano o alcoxilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R8 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un hidroxilo; n es 1 o 2; R1 es hidrógeno o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); y R4', R5 , R6 y R7 , son cada uno, independientemente, hidrógeno, halo, hidroxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), y alquiloxilo (de 1 a 6 átomos de carbono).
En una décima modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, R5 y R6 son flúor cuando: R8 = -CH3, y n es 1.
En una undécima modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, R5 y R6 son flúor y cloro cuando: R8 = -CH3, y n es 1 .
En una duodécima modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, R5 y R6 son hidrógeno cuando: R8 es -CH3, y n es 1 .
En una decimocuarta modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, R5 es flúor cuando: n es 1 , y R6 es hidrógeno.
R1 es H, -CH3, R4 y R7 son cada uno, independientemente, H o Cl; R5 es H, H, CH3, CH2C H3 -CH2OH, -CO2H, -C02C H3 -C02CH2CH3 O -CF3; y n es 1 o 2.
En una decimoqumta modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, el compuesto de la Fórmula (II) es de la Fórmula (IIA), o una sal o solvato o hidrato del mismo (IIA).
En una decimosexta modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, R5 y R6 es un halo.
En una decimoseptima modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, R5 es un cloro y R1 , R4 , R6 y R7 son cada uno hidrógeno.
En una decimoctava modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, el compuesto de la Fórmula (III) es de la Fórmula (MIA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (MIA).
En una modalidad de ejemplo, la enzima es la SEQ ID NO: 134. En una cuarta modalidad, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, que comprende: hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula (M IA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (MIA) con un compuesto de la Fórmula (II) o una sal solvato o hidrato del mismo, (HA) para proporcionar el compuesto de la Fórmula (IVA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, en donde el compuesto de la Fórmula (NA) se prepara a partir del compuesto de la Fórmula (IA), o una sal o hidrato o solvato del mismo, En una decimonovena modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IV) en donde, el compuesto de la Fórmula (HA) se convierte en una sal de la Fórmula (MB): (MB) antes de la reacción con el compuesto de fórmula (MIA).
En una modalidad de ejemplo, la enzima es la SEQ ID NO: 134. En una vigesima modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, la reacción se lleva a cabo bajo condiciones básicas, En una vigesimoprimera modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, la reacción se lleva a cabo en la presencia de trietilamina.
En una vigesimosegunda modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, el compuesto de la Fórmula (IVA) se aísla como una sal de la Fórmula (IVB): (IVB) En una vigesimotercera modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, la sal de la Fórmula (IVB) se convierte en una sal de la Fórmula (IVA) en base libre: En una vigesimocuarta modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, la sal de la Fórmula (IVB) se convierte en el compuesto de la Fórmula (IVA) en base libre con carbonato de sodio.
En una vigesimoqumta modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, el compuesto de la Fórmula (IVA) es un hidrato.
En una vigesimosexta modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) en donde, el compuesto de la Fórmula (IVA) es un ½ hidrato.
En una vigesimoséptima modalidad alternativa, la invención es un proceso para preparar un compuesto de la Fórmula (IVA) ½ hidrato en donde, el compuesto de la Fórmula (IVA) ½ hidrato se muele después de su aislamiento.
Sección D: Uso de los compuestos novedosos e inventivos de la Fórmula (IC).
En una quinta modalidad, la invención es un compuesto de la fórmula (IC): (IC) en donde: R1 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un amino, alquil-amino (de 1 a 6 átomos de carbono), alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono) di-alquil-amino o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono)-C(O)NH-alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R5 y R6 son cada uno, independientemente, hidrógeno, halo, hidroxilo, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono) alquilo, trih a loalq u i I o (de un átomo de carbono), ciano o alcoxilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R8 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido con un hidroxilo; n es 1 o 2; o una sal farmacéuticamente aceptable o hidrato o solvato del mismo.
En una vigesimoctava modalidad alternativa, la invención es un compuesto de la Fórmula (IC) en donde, R5 y R6 son flúor cuando: R8 = -CH3, y n es 1.
En una vigesimonovena modalidad alternativa, la invención es un compuesto de la Fórmula (IC) en donde, R5 y R6 son flúor y cloro, cuando: R8 es -CH3, y n es 1.
En una trigésima modalidad alternativa, la invención es un compuesto de la Fórmula (IC) en donde, R5 y R6 son hidrógeno cuando: R8 es -CH3, y n es 1.
En una trigésimo primera modalidad alternativa, la invención es un compuesto de la Fórmula (IC) en donde, R5 es flúor cuando: n es 1 , y R6 es hidrógeno.
En una trigesimo segunda modalidad alternativa, la invención es un compuesto de la Fórmula (IC) en donde, R1 es H, - -OCH3, -F O -Cl; R8 es H, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, -CO2H, -C02CH3, -C02CH2CH3 o -CF3; y n es 1 o 2.
En una trigésimo tercera modalidad alternativa, la invención es un compuesto de la Fórmula (I) en donde, el compuesto es de la Fórmula (IA): (IA); o una sal o solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una sexta modalidad, la invención es un compuesto seleccionado a partir de: , o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Sección i: Condiciones generales A continuación se listan las definiciones de diversos términos utilizados para describir los nuevos intermediarios y pasos sintéticos de la presente invención. Estas definiciones, ya sea mediante la sustitución de una, más de una o todas los expresiones generales o símbolos utilizados en la presente descripción y por lo tanto, las modalidades de mayor rendimiento de la invención, en particular, se aplican a los términos tal como se utilizan a lo largo de la especificación a menos que se definan de otro modo en casos específicos, ya sea individualmente o como parte de un grupo más grande. Por lo tanto, las definiciones generales utilizadas anteriormente y a continuación, a menos que se defina de otra manera, tienen los siguientes significados: El termino “de 1 a 20 átomos de carbono” define una fracción con hasta e incluyendo como máximo 20, especialmente hasta y que incluye máximo 7 átomos de carbono, dicha fracción está ramificada (una o más veces) o es de cadena lineal y unida a través de un carbono terminal o un carbono no terminal.
Alquilo que es un radical o parte de un radical es una cadena de carbono lineal o ramificada (una o, si se desea y es posible, más veces), y es especialmente alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tal como alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, en particular alquilo de 1 a 4 átomos de carbono ramificado, tal como isopropilo. El término "inferior" o “de 1 a 7 átomos de carbono” define una fracción con hasta y que incluye como máximo 7, especialmente hasta y que incluye como máximo 4 átomos de carbono, dicha fracción siendo ramificada (una o más veces) o de cadena lineal y unida a través de un terminal o un carbono no terminal. Inferior o alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, por ejemplo, es n-pentilo, n-hexilo o p-heptilo o preferiblemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, especialmente como metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terbutilo, en particular metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terbutilo; preferiblemente metilo.
Alquilam ¡no y dialquilamino se refieren a alquil-NH- y (alquil)2N-, respectivamente, en donde alquilo puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo, por ejemplo, comprende de 1 a 7 y en particular de 1 a 4 átomos de carbono. Algunos ejemplos son metilamino, dimetilamino, etilamino, y dietilamino; preferentemente metilamino.
Halo o halógeno es preferiblemente flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente fluoro o cloro; donde halo es mencionado como un sustituyente, donde sea posible, uno o más (por ejemplo, hasta tres o uno) átomos de halógeno pueden estar presentes, por ejemplo, en-halo-alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tal como trifluorometilo, 2,2-difluoroetilo o 2,2,2-trifluoroetilo.
Halo-alquilo de 1 a 7 átomos de carbono puede ser lineal o ramificado y, en particular, comprende de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo 1 o 2 átomos de carbono. Ejemplos son fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, 2-cloroetilo y 2,2,2-trifluoroetilo; preferiblemente trifluorometilo.
Alcoxilo, siendo un radical o parte de un radical, se refiere a alquilo-O-, en donde el termino alquilo es como se define en la presente, e incluye, por ejemplo, alcoxilo de 1 a 20 átomos de carbono (-O-alquilo de 1 a 20 átomos de carbono), preferiblemente alcoxilo de 1 a 7 átomos de carbono (-O-alquilo de 1 a 7 átomos de carbono). En particular, alcoxilo incluye, por ejemplo, radicales de metoxilo, etoxilo, n-propiloxilo, isopropiloxilo, n-butiloxilo, isobutiloxilo, sec-butiloxilo, terbutiloxilo, pentiloxilo, hexiloxilo y heptiloxilo; preferiblemente metoxilo.
El término "base ópticamente activa" describe, por ejemplo, aminas quirales, preferiblemente aminas terciarias quirales, más preferiblemente alcaloides de la cincona, tales como qumidina y quinina, más preferiblemente alcaloides de cincona (quina) modificados. Ejemplos de tales alcaloides de cincona modificados se describen de manera detallada, por ejemplo, en Tian, S.-K. ; Chen, Y. ; Hang, J.; Tang, L; McDiad, P. ; Deng, L. Acc. Chem . Res. 2004, 37, 621 -631 y referencias citadas en el mismo.
El término "catalizador de transferencia de fase" tal como se utiliza aquí se refiere a una cantidad catalítica de un agente químico que aumenta la velocidad de una reacción entre las especies químicas situadas en diferentes fases (por ejemplo, líquidos inmiscibles o sólido y líquido) mediante la extracción de uno de los reactivos, más comúnmente un anión, a través de la interfaz en la otra fase. Estos catalizadores incluyen sales cuaternarias de amonio o fosfonio (por ejemplo, sales de tetra-alquilamonio, en el que alquilo pueden ser iguales o diferentes), o agentes que acomplejan cationes inorgánicos (por ejemplo éteres corona u otros criptandos). El catión catalizador no se consume en la reacción, aunque se produce un intercambio de aniones. En particular, los catalizadores de transferencia de fase adecuados para ser usados según la presente invención son sales de amonio cuaternario, por ejemplo de la fórmula RmRnR RkNX, en el que RmRnR Rk son, ya sea el mismo o diferentes, alquilo, y X es halógeno (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro) o hidróxido, por ejemplo, hidróxido de tetra-n-butilamonio.
Un catalizador "heterogéneo" tal como se utiliza aquí, se refiere a un catalizador soportado sobre un vehículo, por lo general aunque no necesariamente un sustrato compuesto de un material inorgánico, por ejemplo, un material poroso tal como carbono, silicio y/o óxido de aluminio.
Un catalizador "homogéneo" como se usa aquí, se refiere a un catalizador que no está soportado sobre un vehículo.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no poder ser superpuestas sobre su imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a las moléculas que son superpuestas sobre su imagen especular.
El término "catalizador", significa cualquier sustancia que afecta la velocidad de una reacción química mediante la reducción de la energía de activación de la reacción química.
El término "catalizador en polvo" significa un catalizador con un contenido de agua de 0 a 30 por ciento en masa.
El término "tasa de sustrato a catalizador" (S/C) se refiere a la tasa molar de los compuestos de partida, o sales de los mismos, a "catalizador de metal de transición".
El término "tratamiento" significa el trabajo de aislamiento y/o purificación que se realiza una vez que la reacción se termina.
Como se usa en la presente, a menos que se especifique lo contrario, el término "temperatura ambiente" significa una temperatura de 15 a 30°C, tal como de 20 a 30°C, tal como de 20 a 25°C .
El término "inerte" tal como se utiliza a través de esta solicitud, significa no reactivo con ninguno de los reactivos, disolventes u otros componentes de la mezcla de reacción. Tales condiciones inertes se realizan generalmente mediante el uso de gas inerte tal como dióxido de carbono, helio, nitrógeno, argón, entre otros gases.
Los enlaces con el asterisco (*) indican el punto de unión al resto de la molécula.
Los compuestos de la presente invención pueden poseer uno o más centros asimétricos. Las configuraciones absolutas preferidas son las indicadas en la presente específicamente. Sin embargo, cualquier posible enantiómero puro, diaestereoisómero puro, o mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de enantiómeros, tales como racematos, se abarcan en la presente invención.
En las fórmulas de la presente solicitud, el término " v/WV',, " " o "— " sobre un C-sp3 representa un enlace covalente en el que la estereoquímica del enlace no está definida. Esto significa que el término " /vw'" o "— " sobre un C-sp3 comprende una configuración (S), así como una configuración (R) del respectivo centro quiral. Además, las mezclas también se incluyen, por ejemplo, mezclas de enantiómeros, tales como racematos, se abarcan en la presente invención.
En las fórmulas de la presente solicitud, el término i' ?A/n'" 0 sobre un C-sp2 representa un enlace covalente en el que la estereoquímica o la geometría del enlace no están definidas. Esto significa que el término " v/wv'" sobre un C-sp2 comprende una configuración cis (Z), así como una configuración trans (E) del respectivo centro quiral. Además, las mezclas también se incluyen, por ejemplo, mezclas de isómeros de enlace doble se abarcan en la presente invención.
En las fórmulas de la presente solicitud, el término " . " indica un enlace Csp3-Csp3 o un enlace Csp2-Csp2.
Los compuestos de la presente invención pueden poseer uno o más centros asimétricos. Las configuraciones absolutas preferidas son las indicadas en la presente específicamente.
En las fórmulas de la presente solicitud, el término sobre un C-sp3 indica la estereoquímica absoluta, o bien (R) o (S).
En las fórmulas de la presente solicitud, el término sobre un C-sp3 índica la estereoquímica absoluta, o bien (R) o (S).
El término "pureza estereoisomérica" en un porcentaje dado significa que el estereoisómero designado predomina en ese porcentaje dado en una mezcla de estereoisómeros.
El término "estereoisómero" significa una de las configuraciones absolutas de una sola molécula orgánica que tiene al menos un carbono asimétrico. Incluidas dentro de la definición de un estereoisómero están los enantiómeros y diaestereoisómeros.
El término "resolución" se refiere a la separación o concentración o agotamiento de uno de los estereoisómeros de una molécula.
Las sales son especialmente las sales farmacéuticamente aceptables o en general sales de cualquiera de los intermediarios mencionados en la presente, donde las sales no están excluidas por razones químicas que el experto entenderá fácilmente. Ellas se pueden formar donde grupos de formadores sal, tales como grupos básicos o ácidos, están presentes que pueden existir en forma disociada por lo menos parcialmente, por ejemplo, en un rango de pH de 4 a 10 en soluciones acuosas, o se puede aislar especialmente en forma sólida, especialmente en forma cristalina.
Tales sales se forman, por ejemplo, como sales de adición de ácido, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, a partir de compuestos de cualquiera de los intermediarios mencionados en la presente con un átomo de nitrógeno alcalino, especialmente sales farmacéuticamente aceptables. Los ácidos inorgánicos adecuados son por ejemplo, ácidos de halógeno, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos carboxílico, fosfónico, sulfónico o sulfámico, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, tales como ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroxi-maleico, ácido metilmaleico, ácido benzoico, ácido metano o etano- sulfónico, ácido etano-1 2-disulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido 1 .5-naftaleno-disulfónico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metil-, N-etil-o N-propil-sulfámico, u otros ácidos protónicos orgánicos, tales como ácido ascórbico.
En la presencia de radicales cargados negativamente, tales como carboxi o sulfo, las sales tambien se pueden formar con bases, por ejemplo sales metálicas o amónicas, tales como sales de metal alcalino o de metal alcalinotérreo, por ejemplo sales de sodio, potasio, magnesio o calcio, o sales de amonio con amoniaco o aminas orgánicas adecuadas, por ejemplo trietilamina o tri- (2-hidroxietil) amina, N-etil-piperidina, N ,N'-dimetilpiperazina, t-butilamina, n-butilamina, feniletilamina, diciclohexilamina o ciclohexilamina.
Cuando un grupo alcalino y un grupo ácido están presentes en la misma molécula, cualquiera de los intermediarios mencionados en la presente también pueden formar sales internas.
Para fines de aislamiento o purificación de cualquiera de los intermediarios mencionados en la presente también es posible usar sales farmacéuticamente inaceptables, por ejemplo picratos o percloratos.
Las formas de sales preferidas incluyen, por ejemplo, sales de adición de ácido. Los compuestos que tienen al menos un grupo ácido (por ejemplo, COOH o 5-tetrazolilo) también pueden formar sales con bases. Las sales adecuadas con bases son, por ejemplo, sales metálicas, tales como sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, por ejemplo, de sodio, de potasio, de calcio o sales de magnesio, o sales con amoniaco o una amina orgánica, tal como morfolina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, una mono-, di-o tri-alquilamina inferior, por ejemplo, etil-, terbutil-, dietil-, diisopropil-, trietil-, tributil-o dimetilpropilamina, o una mono-, di-o trihidroxi alquilamina inferior, por ejemplo, , mono-, di-o tri-etanolamina. Además pueden formarse las sales internas correspondientes. Las sales que no son adecuadas para usos farmacéuticos pero que se pueden emplear, por ejemplo, para el aislamiento o purificación de compuestos I libres o sus sales farmacéuticamente aceptables, también se incluyen. Más preferiblemente la sal de la fórmula (IV) es la sal de ácido canforsulfónico.
En particular, el término "sal de un compuesto de fórmula (IV)" se refiere, por ejemplo, a una sal de amina del mismo, una sal alcalina del mismo o una sal de metal alcalinotérreo de los mismos (por ejemplo sal de sodio, sal de potasio, sal de calcio, sal de magnesio, etc.). En particular, el término "amina" en la expresión "sal de amina de los mismos", por ejemplo cuando se refiere a una sal de amina del compuesto de fórmula (IV), significa amina terciaria de fórmula NR9R10R11 , amina secundaria de fórmula NHR9R10R o amina primaria de fórmula NH2R9, en el que R9, R10 y R1 1 son, independientemente uno del otro, alquilo, arilo, cicloalquilo o heterociclilo, como se define aquí, preferiblemente alquilo o cicloalquilo. El término "amina" es, por ejemplo, difenilamina, diisopropilamina, dimetilamina, trietilamina, diisopropiletilamina, diciclohexilamina, t-butilamina, n-butilamina o ciclohexilamina, en particular, t-butilamina, n-butilamina o ciclohexilamina, más preferiblemente n-butilamina o ciclohexilamina.
Como se utilizan en la presente y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido claramente indique lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye más de un polipéptido.
Del mismo modo, "comprender", "comprende", "que comprende" "incluir", "incluye" y "que incluye" son intercambiables y no pretenden ser limitantes.
Es de entenderse que donde descripciones de diversas modalidades usan el término "que comprende", los expertos en la téenica entenderán que en algunos casos específicos, una modalidad puede, alternativamente, describirse usando el lenguaje "que consiste esencialmente de" o "que consiste de".
Se debe entender que tanto la anterior descripción general, incluyendo los dibujos, y la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de esta descripción.
Los títulos de las secciones que aparecen aquí son para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes de la materia descrita.
Las abreviaturas empleadas para los aminoácidos codificados genéticamente son convencionales y son como sigue: Abreviación de Abreviación de Una Aminoácido Tres Letras Letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Aspartato Asp D Cisteína Cys C Glutamato Glu E Glutamina Gln Q Glicina: Gly G Histidina His H Isoleucina lie I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Abreviación de Abreviación de Una Aminoácido Tres Letras Letra Serina Ser S T reonina Thr T T riptófano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Cuando se usan las abreviaturas de tres letras, a menos que se preceda específicamente por una "L" o una "D" o sea claro por el contexto en el que se utiliza la abreviatura, el aminoácido puede estar en la configuración L- o D- con respecto a a-carbono (Ca). Por ejemplo, mientras que "Ala" designa alanina sin especificar la configuración del a-carbono, "D-Ala" y "L-Ala" designan D-alanina y L-alanina, respectivamente. Cuando se usan las abreviaturas de una letra, las letras mayúsculas designan aminoácidos en la configuración L sobre el a-carbono y las letras minúsculas designan aminoácidos en la configuración D sobre el a-carbono. Por ejemplo "A" designa L-alanina y "a" designa D-Alanina. Cuando las secuencias polipeptídicas se presentan como una cadena de abreviaturas de una letra o de tres letras (o mezclas de los mismos), las secuencias se presentan en la dirección de amino (N) a carboxilo (C) en conformidad con la convención común.
Las abreviaturas utilizadas para los nucleósidos que codifican geneticamente son convencionales y son como sigue: adenosina (A); guanosina (G); citidina (C); timidina (T); y uridina (U). A menos que se indique específicamente, los nucleótidos abreviados pueden ser ya sea ribonucleósidos o 2'-desoxirribonucleósidos. Los nucleósidos pueden especificarse ya sea como ribonucleósidos o 2'-desoxirribonucleósidos de forma individual o de forma agregada. Cuando las secuencias de ácidos nucleicos se presentan como una serie de abreviaturas de una sola letra, las secuencias se presentan en la dirección 5 'a 3' según la convención común, y los fosfatos no están indicados.
En referencia a la presente descripción, los términos téenicos y científicos usados en las descripciones en la presente tendrán los significados comúnmente entendidos por un experto normal en la técnica, salvo que se defina específicamente lo contrario. En consecuencia, los siguientes términos están destinados a tener los siguientes significados: "Proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente en la presente para denotar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente mediante un enlace de amida, independientemente de la longitud o modificación posterior a la traducción (por ejemplo, glicosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). Los D y L-aminoácidos, y mezclas de D-y L-aminoácidos están incluidos dentro de esta definición.
Polinucleótido" o ácido nucleico" se refiere a dos o más nucleósidos que están unidos covalentemente entre sí. El polinucleótido puede ser completamente comprendido por ribonucleósidos (es decir, un ARN), completamente comprendido por 2 ’desoxirribonucleótidos (es decir, un ADN) o mezclas de ribo- y 2' desoxirribonucleósidos. Mientras que los nucleósidos normalmente estarán unidos a través de enlaces fosfodiéster estándar, los polinucleótidos pueden incluir uno o más enlaces no estándar. El polinucleótido puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, o puede incluir tanto regiones de cadena sencilla como regiones de cadena doble. Por otra parte, mientras que un polinucleótido que típicamente se compone de las nucleobases de codificación de origen natural (es decir, adenina, guanina, uracilo, timina y citosina), puede incluir una o más nucleobases modificadas y/o sintéticas, tales como, por ejemplo, inosina, xantina, hipoxantina, etc. Preferiblemente, tales nucleobases modificadas o sintéticas codificaran nucleobases.
"Aminotransferasa" y "transaminasa" se usan indistintamente en la presente para referirse a un polipéptido que tiene una capacidad enzimática de transferencia de un grupo amino (NH2) de una amina primaria a un grupo carbonilo (C = O) de una molécula aceptora. Las transaminasas como se usa aquí incluyen transaminasas de origen natural (tipo silvestre), así como polipéptídos diseñados que no son de origen natural.
"Aceptor amino" y "aceptor de amina", "sustrato ceto", "ceto" y "cetona" se usan indistinta mente en la presente para referirse a un compuesto carbonilo (ceto, o cetona) que acepta un grupo amino de un donante de amina. En algunas modalidades, los aceptores de aminoácidos son moléculas de la siguiente fórmula general, aceptor de amino en el que cada uno de Ra y Rp, cuando se toma independientemente, es un grupo alquilo, cicloalqullo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, que puede sustituirse o no sustituirse con uno o más grupos enzimáticamente aceptables. Ra puede ser el mismo o diferente de Rp en estructura o quiralidad. En algunas modalidades, Ra y Rp, tomados juntos, pueden formar un anillo que es no sustituido, sustituido o fusionado con otros anillos. Los aceptores de amino incluyen ácidos ceto carboxílicos y alcanonas (cetonas). Los ácidos ceto carboxílicos típicos son ácidos a-ceto carboxílicos tales como el ácido glioxálico, el ácido pirúvico, el ácido oxalacético, y similares, así como las sales de estos ácidos. Los aceptores de aminoácidos también incluyen sustancias que se convierten a un aceptor amino por otras enzimas o procesos de células enteras, tales como ácido fumárico (que pueden ser convertidos a ácido oxalacético), glucosa (que se puede convertir en piruvato), lactato, ácido maleico, y otros. Aceptores de aminoácidos que se pueden utilizar incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación , 3,4-dihidronaftalen-1 (2H)-ona, 1-fenilbutan-2-ona, 3,3-dimetilbutan-2-ona, octan-2-ona, 3-oxobutanoato de etilo, 4-fenilbutan-2-ona, 1 -(4-bromofenil)-etanona, 2-metil-ciclohexanona, 7-metoxi-2-tetralona, 1-hidroxibutan-2-ona, ácido pirúvico, acetofenona, 3'-hidroxiacetofenona, 2-metoxi-5-fluoroaceto-fenona, ácido levulínico, 1 -fenil-propan-1 -ona, 1 -(4-bromofenil)-propan-1 -ona, 1 -(4-nitrofenil)-propan-1 -ona, 1 -fenil-propan-2-ona, ácido 2-oxo-3-metilbutanoico, 1 -(3-trifluorometil-fenil)-propan-1 -ona, hidroxipropanona, metoxioxipropanona, 1 -fenilbutan-1 -ona, 1 -(2.5 dimetoxi-4-metilfenil)-butan-2-ona, 1 -(4-hidroxifenil)-butan-3-ona, 2-acetilnaftaleno, ácido fenilpirúvico, ácido 2-cetoglutárico, y el ácido 2-cetosuccínico, incluyendo isómeros individuales tanto ( R ) como (S) cuando sea posible.
"Donante amino" o "donante de amina" se refieren a un compuesto amino que dona un grupo amino al aceptor amino, convirtiendose así en una especie de carbonilo. En algunas modalidades, los donantes de amino son moléculas de la siguiente fórmula general, donante amino en el que cada uno de RE y Ra, cuando se toma ndependientemente, es un grupo alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, que se sustituye o no se sustituye con uno o más grupos enzimáticamente no inhibidores. Re puede ser el mismo o diferente de R6 en estructura o quiralidad. En algunas modalidades, Re y R®, tomados juntos, pueden formar un anillo que es no sustituido, sustituido o fusionado con otros anillos. Donantes amino típicos que se pueden usar incluyen los aminoácidos quirales y aquirales, y las aminas quirales y aquirales. Donantes de amino que se pueden utilizar incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, isopropilamina (tambien conocida como 2-aminopropano), a-fenetilamina (también denominado 1 -feniletanamina), y sus enantiómeros (S)-l -feniletanamina y (R)-1 -feniletanamina, 2-amino-4-fenilbutano, glicina, ácido L-glutámico, L-glutamato, glutamato monosódico, L-alanina, D-alanina, D,L-alanina, ácido L-aspártico, L-lisina, D,L-ornitina, b-alanina, taurina, n-octilamina, ciclohexilamina, 1 ,4-butandiamina (también conocida como putrescina), 1 ,6-hexandiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutírico, tiramina, y amina de bencilo, 2-aminobutano, 2-amino-1 -butanol, 1 -amino-1 -fen Metano, 1 -amino- 1 -(2-metoxi-5-fluorofenil)eta no, 1 -amino-1 -fenilpropano, 1 -amino- 1 -(4-h id roxifenilj-propano, 1 -amino-1 -(4-bromofenil)-propano, 1 -amino-1-(4-nitrofenil)-propano, 1 -fenil-2-aminopropano, 1 -(3-trifluorometil-fenil)-2-aminopropano, 2-aminopropanol, 1 -amino-1-fenilbutano, 1 -fenil-2-aminobutano, 1 -(2.5-dimetoxi-4-metilfenil)-2-aminobutano, 1 -fenil-3-aminobutano, 1-(4-hidroxifenil) -3-aminobutano, 1 -amino-2-metilciclopentano, 1 -amino-3-metilciclopentano, 1-amino-2-metilciclohexano, 1 -amino-1 -(2- naft¡l)etano, 3-met¡lciclopent¡lamina, 2-metilciclopentilamina, 2-etilciclopentilamina, 2-metilciclohexilamina, 3-metilciclohexilamina, 1 -aminotetralina, 2-aminotetralina, 2-amino-5-metoxitetralina, y 1 -aminomdano, incluyendo isómeros individuales tanto ( R ) como (S) cuando sea posible e incluyendo todas las posibles sales de las aminas.
"Amina quiral" se refiere a aminas de fórmula general Ri-CH(NH2)- R1 y se emplea aquí en su sentido más amplio, que incluye una amplia variedad de compuestos alifáticos y alicíclicos de tipos funcionales diferentes, y mixtos, que se caracterizan por la presencia de un grupo amino primario unido a un átomo de carbono secundario que, además de un átomo de hidrógeno, lleva ya sea (i) un grupo divalente que forma una estructura cíclica quiral, o (ii) dos sustituyentes (distintos de hidrógeno) que difieren unos de otros en estructura o quiralidad. Grupos divalentes que forman una estructura cíclica quiral incluyen, por ejemplo, 2-metilbutan-1 ,4-diilo, pentano-1 ,4-diilo, hexano-1 ,4-diilo, hexano-1.5-diilo, 2-metilpentan-1.5-diilo. Los dos sustituyentes diferentes en el átomo de carbono secundario (R1 y R2 arriba) tambien puede variar ampliamente e incluyen alquilo, aralquilo, arilo, halo, hidroxilo, alquilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, cicloalquilo, carboxilo, carbalcoxilo, carbamoílo, carbamoilo mono- y di- sustituido (alquilo inferior), trifluorometilo, fenilo, nitro, amino, amino mono- y di- sustituido (alquilo inferior), alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilcarboxamido, arilcarboxamido, etc., así como alquilo, aralquilo, o arilo sustituido por los anteriores.
"Piridoxal-fosfato, " "PLP", "piridoxal-5'-fosfato", "PYP", y "P5P" se utilizan indistintamente en la presente para referirse al compuesto que actúa como una coenzima en reacciones de transaminasa. En algunas modalidades, el fosfato de piridoxal se define por la estructura ácido 1 - (4’-form i l-3'-h i droxi-2'-metil-5,-piridil) metoxifosfónico, número CAS [54-47-7], Piridoxal-5'-fosfato se puede producir in vivo mediante la fosforilación y la oxidación de piridoxol (también conocido como vitamina B6). En las reacciones de transaminación que utilizan enzimas de transaminasa, el grupo amina del donante de amino se transfiere a la coenzima para producir un subproducto ceto, mientras que piridoxal-5'-fosfato se convierte en fosfato de piridoxamina. Piridoxal-5'-fosfato se regenera por reacción con un compuesto ceto diferente (el aceptor amino). La transferencia del grupo amina de fosfato de piridoxamina al aceptor amino produce una amina quiral y regenera la coenzima. En algunas modalidades, el piridoxal-5'-fosfato puede ser sustituido por otros miembros de la familia de la vitamina B6, incluyendo piridoxina (PN), piridoxal (PL), piridoxamina (PM), y sus homólogos fosforilados; fosfato de piridoxina (PNP), y fosfato de piridoxamina (PMP).
"Secuencia codificante" se refiere a aquella porción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína.
"De origen natural" o "de tipo silvestre" se refiere a la forma encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótido de origen natural o de tipo silvestre es una secuencia presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por manipulación humana.
"Recombinante" o "diseñado" o "de ocurrencia no natural" cuando se usa con referencia a, por ejemplo, una célula, ácido nucleico, o polipéptido, se refiere a un material, o un material correspondiente a la forma natural o nativa del material, que ha sido modificado de una manera que de lo contrario no existiría en la naturaleza, o es idéntica a la misma, pero producida o derivada a partir de materiales sintéticos y/o mediante manipulación usando téenicas recombinantes. Los ejemplos no limitantes incluyen, entre otros, las células recombinantes que expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se expresan de otro modo a un nivel diferente.
"Porcentaje de identidad de secuencia" y "porcentaje de homología" se usan indistintamente en la presente para referirse a las comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que la base idéntica de ácido nucleico o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones comcidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Alternativamente, el porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que la base idéntica de ácido nucleico o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias o una base de ácido nucleico o residuo aminoácido se alinea con un hueco para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los expertos en la téenica apreciarán que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981 , Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU . 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el GCG Wisconsin Software Package), o mediante inspección visual (véase en general, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al. , eds. , Current Protocole, una empresa conjunta entre Greene Rubí íshing Associates, Inc. y John Wilcy & Sons, Inc. , (1995 Suplemento) (Ausubel)). Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al, 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402, respectivamente. El software para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través de la página web del Centro Nacional de Información de Bioteenología. Este algoritmo implica primero la identificación de pares de secuencias de alta puntuación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que bien sea corresponden o satisfacen algunos puntajes T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T conocido como el umbral de puntuación de palabra adyacente (Altschul et al, supra). Estas comcidencias de palabra adyacente inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los hits de palabra se extienden luego en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como la puntuación de alineamiento acumulativa pueda ser aumentada. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre> 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, una matriz de puntuación se utiliza para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o el final de cada secuencia es alcanzado. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 1 1 , una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati Acad Sci EE. UU. 89: 10915). Determinación ejemplar de alineación de secuencias y porcentaje de identidad de secuencia puede emplear los programas BESTFIT o GAP en el paquete GCG Wisconsin Software (Accelrys, Madison Wl), utilizando parámetros proporcionados por defecto.
"Secuencia de referencia" se refiere a una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, un segmento de un gen de longitud completa o secuencia de polipéptido. En general, una secuencia de referencia es de al menos 20 nucleótidos o residuos de aminoácidos de longitud, al menos 25 residuos de longitud, al menos 50 residuos de longitud, o la longitud total del ácido nucleico o polipéptido. Puesto que dos polinucleótidos o polipéptidos pueden cada uno (1 ) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa) que es similar entre las dos secuencias, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos o polipéptidos a través de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. En algunas modalidades, una "secuencia de referencia" puede basarse en una secuencia de aminoácidos primaria, donde la secuencia de referencia es una secuencia que puede tener uno o más cambios en la secuencia primaria. Por ejemplo, una "secuencia de referencia basado en la SEQ ID NO: 4 que tiene en el residuo correspondiente a X14 una valina" o X14V se refiere a una secuencia de referencia en la que el residuo correspondiente a X14 en la SEQ ID NO: 4, que es una tirosina, se ha cambiado a valina.
"Ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 20 posiciones de nucleótidos contiguos o residuos de aminoácidos en la que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos o aminoácidos y donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La ventana de comparación puede ser superior a 20 residuos contiguos, e incluye, opcionalmente 30, 40, 50, 100, o ventanas más largas.
“Identidad sustancial" se refiere a una secuencia de polinucleótido o polipéptido que tiene al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, al menos 85 por ciento de identidad y 89 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más habitualmente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de residuos, con frecuencia más de una ventana de al menos 30-50 residuos, en el que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia a una secuencia que incluye supresiones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. En modalidades específicas aplicadas a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando se alinean óptimamente, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 89 por ciento de identidad de secuencia, al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, el 99 por ciento de identidad de secuencia).
Preferiblemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas.
"Correspondiente a", "en referencia a" o "en relación con" cuando se utiliza en el contexto de la numeración de una secuencia de aminoácidos o de polinucleótidos dada se refiere a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia especificada cuando la secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos dada se compara con la secuencia de referencia. En otras palabras, el número de residuo o posición de residuo de un polímero dado se designa con respecto a la secuencia de referencia en lugar de la posición numérica real del residuo dentro de la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos dada, tal como la de una transaminasa genéticamente modificada, se puede alinear a una secuencia de referencia mediante la introducción de huecos para optimizar paridad de residuos entre las dos secuencias. En estos casos, aunque los huecos están presentes, la numeración del residuo en la secuencia de aminoácidos o de polinucleótidos dada se hace con respecto a la secuencia de referencia a la que se ha alineado.
"Diferencia de aminoácido" o "diferencia de residuo" se refiere a un cambio en el residuo aminoácido en una posición de una secuencia de polipéptido en relación con el residuo de aminoácido en una posición correspondiente en una secuencia de referencia. Las posiciones de diferencias de aminoácidos generalmente se denominan aquí como "Xn", donde n se refiere a la posición correspondiente en la secuencia de referencia sobre la cual se basa la diferencia de residuo. Por ejemplo, una "diferencia residuo en la posición X14 en comparación con la SEQ ID NO: 4" se refiere a un cambio del residuo de aminoácido en la posición de polipéptido correspondiente a la posición 14 de la SEQ ID NO: 4. Por lo tanto, es el polipéptido de referencia de SEQ ID NO: 4 tiene una tirosina en la posición 14, luego una "diferencia de residuo en la posición X14 en comparación con la SEQ ID NO: 4" una sustitución de aminoácidos de cualquier residuo que no sea tirosina en la posición del polipéptido correspondiente a la posición 14 de la SEQ ID NO: 4. En la mayoría de los casos en la presente, la diferencia de residuo de aminoácido específico en una posición se indica como "XnY", donde "Xn" especifica la posición correspondiente como se describe anteriormente, y "Y" es el identificador de una sola letra del aminoácido que se encuentra en el polipéptido diseñado (es decir, el residuo diferente al del polipéptido de referencia). En algunas modalidades, más de un aminoácido puede aparecer en una posición de residuo especificado, los aminoácidos alternativos pueden ser listados en la forma XnY / Z, donde Y y Z representan residuos de aminoácidos alternativos. En algunas instancias (por ejemplo, en la Tabla 2A y 2B), la presente descripción también proporciona diferencias de aminoácidos específicos denotados por la notación convencional "AnB", donde A es el identificador de una sola letra del residuo en la secuencia de referencia, "n" es el número de la posición de residuo en la secuencia de referencia, y B es el identificador de una sola letra de la sustitución de residuo en la secuencia del polipéptido diseñado. Además, en algunos casos, un polipéptido de la presente divulgación puede incluir una o más diferencias de residuos de aminoácidos con relación a una secuencia de referencia, que se indica por una lista de las posiciones especificadas donde los cambios se hacen en relación con la secuencia de referencia. La presente descripción incluye secuencias de polipéptidos diseñadas que comprenden una o más diferencias de aminoácidos que incluyen cualquiera / o ambas sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas.
"Sustitución de aminoácidos conservadora" se refiere a una sustitución de un residuo con un residuo diferente que tiene una cadena lateral similar, y por lo tanto implica típicamente la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos dentro de la misma o similar clase definida de aminoácidos. A modo de ejemplo y no de limitación, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede estar sustituido con otro aminoácido alifático, por ejemplo, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un aminoácido con la cadena lateral de hidroxilo está sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral de hidroxilo, por ejemplo, serina y treonina; un aminoácido que tiene cadenas laterales aromáticas es sustituido con otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática, por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina; un aminoácido con una cadena lateral básica es sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral básica, por ejemplo, lisina y arginina; un aminoácido con una cadena lateral ácida es sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral ácida, por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico; y un aminoácido hidrófobo o hidrófilo se sustituye con otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente. Ejemplos de sustituciones conservadoras se proporcionan en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1 Sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en el polipeptido con un aminoácido con propiedades de la cadena lateral significativamente diferentes. Las sustituciones no conservativas pueden utilizar aminoácidos entre, en lugar de grupos dentro de, los grupos definidos y afectan (a) la estructura del esqueleto peptídico en el área de la sustitución (por ejemplo, prolina por glicina), (b) la carga o hidrofobicidad, o (c) el grueso de la cadena lateral. A modo de ejemplo y no de limitación, una sustitución no conservadora ejemplar puede ser un aminoácido ácido sustituido con un aminoácido básico o alifático; un aminoácido aromático sustituido con un aminoácido pequeño; y un aminoácido hidrófilo sustituido con un aminoácido hidrófobo.
"Eliminación" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las eliminaciones pueden comprender eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos, hasta un 10 por ciento del número total de aminoácidos, o hasta el 20 por ciento del número total de aminoácidos que componen la enzima de referencia al tiempo que conserva la actividad enzimática y/o conserva las propiedades mejoradas de una enzima transaminasa genéticamente modificada. Las eliminaciones pueden ser dirigidas a las porciones internas y/o porciones terminales del polipéptido. En diversas modalidades, la eliminación puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinuo.
"Inserción" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, las enzimas de transaminasa genéticamente modificadas mejoradas comprenden inserciones de uno o más aminoácidos al polipéptido de transaminasa de origen natural, así como inserciones de uno o más aminoácidos a otros polipéptidos de transaminasas mejoradas. Las inserciones pueden estar en las porciones internas del polipéptido, o al extremo carboxilo o amino. Inserciones como se usa en la presente incluyen proteínas de fusión como se conoce en la téenica. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separados por uno o más de los aminoácidos en el polipéptido de origen natural.
"Fragmento" tal como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación en el extremo amino y/o el extremo carboxilo, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia. Los fragmentos pueden ser de al menos 14 aminoácidos de longitud, al menos 20 aminoácidos de longitud, al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y hasta el 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 98 por ciento y 99 por ciento del polipéptido de transaminasa de longitud total, por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o la transaminasa genéticamente modificada de la SEQ ID NO: 34.
"Polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está separado sustancialmente de otros contaminantes que lo acompañan de manera natural, por ejemplo, proteínas, lípidos, y polinucleótidos. El término abarca polipéptidos que se han eliminado o purificado a partir de su medio ambiente o sistema de expresión de origen natural (por ejemplo, célula huésped o en síntesis in vitro). Las enzimas de transaminasa mejoradas pueden estar presentes dentro de una célula, presentes en el medio celular, o preparados en diversas formas, tales como Usados o preparaciones aisladas. Como tal, en algunas modalidades, la enzima de transaminasa mejorada puede ser un polipéptido aislado.
"Polipéptido sustancialmente puro" se refiere a una composición en la que la especie de polipéptido es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar o de peso es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y es generalmente una composición sustancialmente purificada cuando la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento de las especies macromoleculares presentes en moles o por ciento de peso. Generalmente, una composición sustancialmente pura de transaminasa comprenderá aproximadamente 60 por ciento o más, aproximadamente 70 por ciento o más, aproximadamente 80 por ciento o más, aproximadamente 90 por ciento o más, aproximadamente 95 por ciento o más, y aproximadamente 98 por ciento o más de todas las especies macromoleculares por mol o por ciento de peso presente en la composición. En algunas modalidades, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Especies de disolventes, moléculas pequeñas (<500 Dáltones), y especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares. En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa aislado mejorado es una composición de polipéptido sustancialmente pura.
"Estereoselectividad" se refiere a la formación preferencial en una reacción química o enzimática de un estereoisómero sobre otro. Estereoselectividad puede ser parcial, donde la formación de un estereoisómero es favorecido sobre el otro, o puede ser completa donde se forma un solo estereoisómero. Cuando los estereoisómeros son enantiómeros, la estereoselectividad se conoce como enantioselectividad, la fracción (típicamente reportada como un porcentaje) de un enantiómero en la suma de ambos. Comúnmente se informa alternativamente en la téenica (típicamente como un porcentaje) como el exceso enantiomérico (ee) calculado del mismo según la fórmula [enantiómero principal - enantiómero menor] / [enantiómero principal + enantiómero menor]. Cuando los estereoisómeros son diaestereoisómeros, la estereoselectividad se conoce como diaestereoselectividad, la fracción (típicamente como un porcentaje) de un diaestereoisómero en una mezcla de dos diaestereoisómeros, comúnmente se informa alternativamente como el exceso diaestereomérico (de). El exceso enantiomérico y el exceso diaestereomérico son tipos de exceso estereoisomérico.
"Altamente estereoselectivo" se refiere a una reacción química o enzimática que es capaz de convertir un sustrato, por ejemplo, el Compuesto (I A) , a su producto de amina quiral correspondiente, por ejemplo, Compuesto (NA), con al menos aproximadamente 85 por ciento de exceso estereoisomérico.
Propiedad enzimática mejorada" se refiere a un polipéptido de transaminasa que exhibe una mejora en cualquier propiedad enzimática en comparación con una transaminasa de referencia. Para los polipéptidos de transaminasas diseñados en la presente, la comparación se hace generalmente a la enzima de transaminasa de tipo silvestre, aunque en algunas modalidades, la transaminasa de referencia puede ser otra transaminasa genéticamente modificada mejorada. Las propiedades enzimáticas para las que la mejora es deseable incluyen , pero no se limitan a, actividad enzimática (que se puede expresar en términos de porcentaje de conversión del sustrato), estabilidad térmica, estabilidad disolvente, perfil de actividad de pH, requisitos de cofactor, refractariedad a los inhibidores (por ejemplo, inhibición de sustrato o producto), estereoespecificidad y estereoselectividad (que incluye enantioselectividad).
"Aumento de la actividad enzimática" se refiere a una propiedad mejorada de los polipéptidos de transaminasa diseñados, que puede representarse por un aumento en la actividad específica (por ejemplo, producto obtenido / tiempo / peso de la proteína) o un aumento en el porcentaje de conversión del sustrato al producto (por ejemplo, porcentaje de conversión a partir de la cantidad de partida del sustrato al producto en un período de tiempo especificado utilizando una cantidad especificada de transaminasa) en comparación con la enzima de transaminasa de referencia. Los métodos ejemplares para determinar la actividad enzimática se proporcionan en los Ejemplos. Cualquier propiedad relacionada con la actividad enzimática puede verse afectada, incluyendo las propiedades enzimáticas clásicas de Km, Vmax o kcat, cambios de los que pueden conducir a un aumento de la actividad enzimática. Las mejoras en la actividad enzimática pueden ser de aproximadamente 1.2 veces la actividad enzimática de la enzima transaminasa correspondiente de tipo silvestre, a tanto como 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, o más actividad enzimática que la transaminasa de origen natural u otra transaminasa genéticamente modificada a partir del cual los polipéptidos de transaminasa se derivaron. La actividad de transaminasa puede medirse por cualquiera de los ensayos estándar, tales como mediante el control de cambios en las propiedades espectrofotométricas de los reactivos o productos. En algunas modalidades, la cantidad de productos producidos se puede medir mediante una separación por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) combinada con una absorbancia UV o detección de fluorescencia posterior a la derivación, tal como con o-ftaldialdehído (OPA). Las comparaciones de las actividades enzimáticas se realizan utilizando una preparación definida de la enzima, un ensayo definido bajo un conjunto de condiciones, y uno o más sustratos definidos, como se describe adicionalmente en detalle en la presente.
Generalmente, cuando se comparan Usados, el número de células y la cantidad de proteína ensayada se determinan así como el uso de sistemas de expresión y células huésped idénticos para reducir al mínimo las variaciones en la cantidad de enzima producida por las células huésped y presente en los Usados.
"Conversión" se refiere a la conversión enzimática del sustrato(s) al producto correspondiente(s). "Porcentaje de conversión" se refiere al porcentaje del sustrato que se convierte en el producto dentro de un período de tiempo bajo condiciones especificadas. Así, la "actividad enzimática" o "actividad" de un polipéptido de transaminasa pueden expresarse como "porcentaje de conversión" del sustrato al producto.
"Termoestable" se refiere a un polipéptido de transaminasa que mantiene la actividad similar (más de 60 por ciento a 80 por ciento por ejemplo) después de la exposición a temperaturas elevadas (por ejemplo, 40-80°C) durante un período de tiempo (por ejemplo, 0.5-24 horas) en comparación con la enzima de tipo silvestre.
"Estable al solvente" se refiere a un polipéptido de transaminasa que mantiene actividad similar (más de por ejemplo, 60 por ciento a 80 por ciento) después de la exposición a concentraciones variables (por ejemplo, 5-99 por ciento) de disolvente (etanol, alcohol isopropílico, dimetilsulfóxido (D SO), tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, acetona, tolueno, acetato de butilo, éter terbutil metílico, etc) durante un período de tiempo (por ejemplo, 0.5-24 horas) en comparación con la enzima de tipo silvestre.
"Termoestable y estable frente a solventes" se refiere a un polipéptido de transaminasa que es termoestable y estable a disolvente.
"Hibridación rigurosa" se utiliza aquí para referirse a condiciones bajo las cuales los híbridos de ácidos nucleicos son estables. Como es conocido por los expertos en la téenica, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión ( Tm ) de los híbridos. En general, la estabilidad de un híbrido es una función de la fuerza iónica, temperatura, contenido de G / C, y la presencia de agentes caotrópicos. Los valores de Tm para los polinucleótidos se pueden calcular usando métodos conocidos para predecir temperaturas de fusión (véase, por ejemplo, Baldino et al., Methods Enzymology 168:761 -777; Bolton et al., 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 48:1390; Bresslauer et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci EE.UU. 83:8893-8897; Freier et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci EE.UU. 83:9373-9377; Kierzek et al. , Biochemistry 25:7840-7846; Rychlik et al., 1990, Nucleic Acids Res 18:6409-6412 (erratum, 1991 , Nucleic Acids Res 19:698); Sambrook et al., supra); Suggs et al., 1981 , In Developmental Biology Using Purified Genes (Brown et al., eds.), pp. 683-693, Academic Press; y Wetmur, 1991 , Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227-259. Todas las publicaciones incorporadas en la presente por referencia). En algunas modalidades, el polinucleótido codifica el polipéptido divulgado en la presente y se hibridiza en condiciones definidas, tales como condiciones moderadamente rigurosas o altamente rigurosas, con el complemento de una secuencia que codifica una enzima de transaminasa genéticamente modificada de la presente divulgación.
"Rigurosidad de hibridación" se refiere a condiciones de hibridación, tales como las condiciones de lavado, en la hibridación de ácidos nucleicos. Generalmente, las reacciones de hibridación se llevan a cabo bajo condiciones de baja rigurosidad, seguido de lavados de rigor variable, pero superior. El término "hibridación moderadamente rigurosa" se refiere a condiciones que permiten que el ADN diana se una a un ácido nucleico complementario que tiene aproximadamente 60 por ciento de identidad, preferiblemente aproximadamente 75 por ciento de identidad, aproximadamente 85 por ciento de identidad con el ADN diana, con identidad mayor que aproximadamente 90 por ciento de identidad al polinucleótido diana. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas son condiciones equivalentes a la hibridación en formamida al 50 por ciento, 5 x solución de Denhart, 5 x SSPE, SDS al 0.2 por ciento a 42°C, seguido de lavado en 0.2 x SSPE, SDS al 0.2 por ciento, a 42°C. "Alta rigurosidad de hibridación" se refiere generalmente a condiciones que son alrededor de 10°C o menos de la temperatura de fusión térmica Tm tal como se determina bajo la condición de solución para una secuencia de polinucleótido definida. En algunas modalidades, una condición de alta rigurosidad se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solamente aquellas secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en NaCI a 0.018 M a 65°C (es decir, si un híbrido no es estable en NaCI 0.018 M a 65°C, no será estable en condiciones de alta rigurosidad, como se contempla en la presente). Condiciones de alta rigurosidad se pueden proporcionar, por ejemplo, por hibridación en condiciones equivalentes a formamida al 50 por ciento, 5x solución de Denhart, 5x SSPE, SDS al 0.2 por ciento a 42°C, seguido de lavado en 0.1 x SSPE, y SDS al 0.2 por ciento a 65°C. Otra condición de alta rigurosidad se híbrida en condiciones equivalentes a la hibridación en 5X SSC que contiene 0.2 por ciento (peso:volumen) de SDS a 65°C y lavado en 0.1 x SSC que contiene 0.2 por ciento de SDS a 65°C . Otras condiciones de hibridación de alta rigurosidad, así como condiciones moderadamente rigurosas, se describen en las referencias citadas anteriormente.
Polinucleótido "heterólogo" se refiere a cualquier polinucleótido que se introduce en una célula huésped mediante téenicas de laboratorio, e incluye polinucleótidos que se retiran de una célula huésped, se someten a manipulación de laboratorio, y luego se introducen de nuevo en una célula huésped.
"Codón optimizado" se refiere a cambios en los codones del polinucleótido que codifica una proteína a aquellos utilizados preferentemente en un organismo particular de tal modo que la proteína codificada se expresa de manera eficiente en el organismo de interés. Aunque el código genético es degenerado en el sentido en que la mayoría de los aminoácidos están representados por varios codones sinónimos, llamados "sinónimos" o codones "sinónimos", es bien conocido que el uso de codones por organismos particulares es no aleatorio y sesgado hacia tripletes de codones particulares. Este sesgo de uso de codones puede ser mayor en referencia a un gen dado, los genes de función común o de origen ancestral, proteínas altamente expresadas frente a las proteínas de bajo número de copias, y las regiones de codificación de proteína agregada del genoma de un organismo. En algunas modalidades, los polinucleótidos que codifican las enzimas de transaminasa pueden ser de codones optimizados para la producción óptima del organismo huésped seleccionado para la expresión.
"Codones sesgo de uso alto, óptimo, o preferido de codones" se refiere indistintamente a los codones que se utilizan con mayor frecuencia en las regiones de codificación de proteína que otros codones que codifican para el mismo aminoácido. Los codones preferidos pueden ser determinados en relación con el uso de codones en un gen único, un conjunto de genes de función común u origen, genes altamente expresados, frecuencia de codones en regiones de codificación de proteína agregada de todo el organismo, frecuencia de codones en las regiones de codificación de proteína agregada de organismos relacionados, o combinaciones de los mismos. Los codones cuya frecuencia aumenta con el nivel de expresión génica son típicamente los codones óptimos para la expresión. Una variedad de métodos son conocidos para determinar la frecuencia de codones (por ejemplo, uso de codones, uso de codones sinónimos relativos) y la preferencia de codones en organismos específicos, incluyendo el análisis multivariante, por ejemplo, utilizando análisis de clúster o análisis de correspondencia, y el número efectivo de los codones utilizados en un gen (véase GCG CodonPreference, Qenetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham; Mclnerncy, J. O, 1998, Biomformatics 14:372-73; Stenico et al, 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F. , 1990, Gene 87:23-29). Tablas de uso de codones están disponibles para una lista cada vez mayor de organismos (véase, por ejemplo, Wada et al, 1992, Nucleic Acids Res. 20:21 1 1 -21 18; Nakamura et al. , 2000, Nucí. Acids Res. 28:292; Duret, et al., supra; Henaut y Danchin, “Escherichia coli and Salmonella,” 1996, Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066. La fuente de datos para la obtención de uso de codones puede confiar en cualquier secuencia de nucleótidos disponible capaz de codificar para una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácidos nucleicos que se sabe que codifican proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias de codificación de la proteína completa-CDS), etiquetas de secuencia expresada (EST), o regiones de codificación predichas de secuencias genómicas (véase, por ejemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Capítulo 8, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York, 2001 ; Uberbacher, EC, 1996, Methods Enzymol. 266:259-281 ; Tiwari et al. , 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270).
"Secuencia de control" se define aquí para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido de la presente divulgación. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y de traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido.
"Unido operativamente" se define aquí como una configuración en la que se coloca apropiadamente una secuencia de control (es decir, en una relación funcional) en una posición relativa a un polinucleótido de interés de tal manera que la secuencia de control dirige o regula la expresión del polinucleótido y/o polipéptido de interés.
"Secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido de interés, tal como una secuencia de codificación. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales, que median la expresión de un polinucleótido de interés. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.
"Condiciones de reacción adecuadas" se refieren a aquellas condiciones en la solución de reacción biocatalítica (por ejemplo, los rangos de carga de enzima, carga del sustrato, cofactor de carga, temperatura, pH , búfers, co-disolventes, etc.) bajo las cuales un polipéptido de transaminasa de la presente divulgación es capaz de convertir un compuesto de sustrato a un compuesto producto (por ejemplo, la conversión del Compuesto (IA) en el compuesto (NA)). "Condiciones adecuadas de reacción" a modo de ejemplo se proporcionan en la presente divulgación y se ilustran por los ejemplos.
"Carga", como en "carga de compuesto" o "carga de enzima" o "carga de cofactor" se refiere a la concentración o cantidad de un componente en una mezcla de reacción al comienzo de la reacción.
"Sustrato" en el contexto de un proceso mediado por biocatalizador se refiere al compuesto o molécula sobre el cual actúa el biocatalizador. Por ejemplo, un sustrato ejemplar para el biocatalizador de transaminasa en el procedimiento descrito en la presente es el compuesto (IA).
"Producto" en el contexto de un proceso mediado por biocatalizador se refiere al compuesto o molécula que resulta de la acción del biocatalizador. Por ejemplo, un producto ejemplar para el biocatalizador de transaminasa en el procedimiento descrito en la presente es el compuesto (IIA).
La presente divulgación proporciona metodos de uso de polipéptidos que tienen actividad de transaminasa para la síntesis de (S)-1 -(1 /-/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina en exceso enantiomérico de ( )-1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina. Cuando la descripción se refiere a polipéptidos, es de entenderse que también describe los polinucleótidos que codifican los polipéptidos.
Aminotransferasas, también conocidas como transaminasas, catalizan la transferencia de un grupo amino de una amina primaria de un sustrato donante de amino al grupo carbonilo (por ejemplo, un grupo ceto o aldehido) de una molécula de aceptor amino. Se han identificado aminotransferasas de diversos organismos, tales como Alcaligenes denitrificans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Brucella melitensis, Burkholderia malle, Burkholderia pseudomallei, Chromobacterium violaceum, Oceanicola granulosus HTCC251 b, Oceanobacter sp. RED65, Oceanospirillum sp. MED92, Pseudomonas putida, Ralstonia solanacearum, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp. (cepa NGR234), Vibrio fluvialis, Bacillus thuringensis, y Klebsiella pneumoniae (Shin et al., 2001 , Biosci. Biotechnol, Biochem. 65:1782-1788).
Las transaminasas son útiles para la resolución quiral de aminas racémicas mediante la explotación de la capacidad de las transaminasas para realizar la reacción de manera estereoespecífica, es decir, la conversión preferencial de un enantiómero a la cetona correspondiente, con lo que resulta en una mezcla enriquecida en el otro enantiómero (véase, por ejemplo, Koselewski et al, 2009, Org Lett. 1 1 (21 ):4810-2). La estereoselectividad de las transaminasas en la conversión de una cetona a la amina correspondiente también hace que estas enzimas útiles en la síntesis asimétrica de aminas ópticamente puras a partir de los correspondientes compuestos ceto (véase, por ejemplo, Hóhne et al. , "Biocatalytic Routes to Optically Active Amines, "Chem Cat Chem 1 (1 ): 42 - 51 ; Zúa y Hua, 2009, Biotechnol J. 4 (10): 1420-1431 ).
La w-transaminasa de Vibrio fluvialis w-VfT) muestra alta enantioselectividad para (S)-enantiómero de aminas quirales y tiene especificidad de sustrato distintivo para aminas aromáticas quirales (Shin y Kim, 2001 , J. Org. Chem. 67:2848-2853). La alta enantioselectividad de u>-V/T se ha aplicado a la resolución quiral de aminas (H. Yun, B. K.-CHO,-B. G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 2004, 87, 772-778; J.-S. Shin, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 1997, 55, 348-358; M. Hghne, K. Robins, U. T. Bornscheuer, Adv. Synth. Catal. 2008, 350.802-807). La enzima también se ha utilizado en la síntesis asimétrica de aminas ópticamente puras utilizando un sustrato de cetona proquiral. Sin embargo, la limitación en la síntesis asimétrica es el equilibrio desfavorable de la reacción inversa (Shin y Kim, 1999, Biotechnol. Bioeng. 65, 206-21 1 ), la inhibición de enzima w- VfT por el producto de amina (Shin et al. , 2001 , Biotechnol Bioeng 73: 179-187; Yun y Kim , 2008, Biosci Biotechnol. Biochem . 72 (1 1 ): 3030-3033); baja actividad en aceptores amino que tienen cadenas laterales voluminosas, tales como grupos aromáticos (Shin y Kim, 2002, J . Org. Chem. 67:2848-2853) y baja estabilidad enzimática (Yun y Kim, supra).
Las transaminasas genéticamente modificadas derivadas de la transaminasa de Vibrio fluvialis habiendo aumentado la resistencia a cetonas alifáticas se describen en Yun et al, 2005, Appl Environ Micriobiol, 71 (8):4220-4.224), mientras que w-WTs con especificidad de sustrato de donante amino ampliado se describe en Cho et al. , 2008, Biotechnol Bioeng. 99(2):275-84. Las publicaciones de patente W02010081053 y US20100209981 , que se incorporan aquí como referencia, describen w-VfTs genéticamente modificadas que tienen estabilidad aumentada a la temperatura y/o disolvente orgánico y actividad enzimática con respecto a moléculas aceptoras amino estructuralmente diferentes.
La presente descripción se refiere a métodos de uso de polipéptidos de transaminasa genéticamente modificada derivados de V. fluvialis que median de manera eficiente la conversión de 1 -(1 /-/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-ona, en el compuesto producto (S)-1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina en exceso enantiomérico. Significativamente, la divulgación identifica posiciones de residuos de aminoácidos y mutaciones correspondientes en el polipéptido de transaminasa que aumentan la actividad enzimática, la enantioselectividad, la estabilidad y la refractariedad a la inhibición del producto en la conversión de 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol 3-¡l)-propan-2-ona, al compuesto producto (S)-1 -(1 /-/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a metodos para usar polipéptidos que son capaces de convertir el compuesto sustrato (IA), 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-ona, al compuesto producto (II A), (S)-1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina, Esquema 1 (IA) (HA) (HC) en presencia de un donante amino, en donde la (S)-1 -(1 W-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina se produce en exceso enantiomérico del compuesto (IIC), (R)-1 -(1 -/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina.
En algunas modalidades, los polipéptidos usados en los métodos son transaminasas de origen no natural genéticamente modificadas para propiedades mejoradas en comparación con el tipo silvestre del polipéptido V. fluvialis de la SEQ ID NO: 2, u otro polipéptido diseñado, por ejemplo SEQ ID NO: 4. Estos polipéptidos de transaminasas diseñados adaptados para la conversión eficiente de conversión de 1 -(1 W-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il) propan-2-ona a (S)-1 -(1 H-5-fluoro-6 -cloro-indol-3-il)-propan-2-amina tiene una o más diferencias de residuos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o un polipeptido de transaminasa diseñado de referencia, tal como el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 4. Las diferencias de residuos están asociadas con mejoras en las propiedades de la enzima, incluyendo la actividad enzimática, estabilidad enzimática, y la resistencia a la inhibición por la amina producto.
En algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasas diseñados utilizados en la divulgación instantánea muestran actividad aumentada en la conversión del sustrato 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-ona al producto (S)-1-(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina en exceso enantiomérico en un tiempo definido con la misma cantidad de enzima en comparación con el tipo silvestre o una enzima genéticamente modificada de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa diseñado tiene al menos aproximadamente 1 .2 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, o 50 veces o más la actividad en comparación con el polipéptido representado por la SEQ ID NO:4 bajo condiciones de reacción adecuadas.
En algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasas diseñados utilizados en la presente divulgación han aumentado la estabilidad a la temperatura y/o disolventes utilizados en la reacción de conversión en comparación con el tipo silvestre o una enzima genéticamente modificada de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa diseñado tiene al menos 1 .2 veces, 1 .5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, o más la estabilidad en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO:4 bajo condiciones de reacción adecuadas.
En algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasas diseñados utilizados en la presente divulgación han aumentado la refractariedad o resistencia al producto de amina (S-1 -(1 /-/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina en comparación con el tipo silvestre o una enzima genéticamente modificada de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado tiene al menos 1 .2 veces, 1 .5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, o más resistencia a la inhibición por 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol 3-il) propan-2-amina, en particular, (S)-1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina, en comparación con el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 4 bajo condiciones de reacción adecuadas, como se describe adicionalmente a continuación.
En algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasa diseñados utilizados en la presente descripción son capaces de convertir el sustrato 1 -(1 /-/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-ona a la (S)-1 -(1 /-/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina producto en exceso enantiomérico mayor que 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, 99.5 o más sobre (f?)-1 -(1 H- 5-fluoro-6-cloro-¡ndol-3-il)-propan-2-en condiciones de reacción adecuadas.
En algunas modalidades, los polipeptidos de transaminasas diseñados utilizados en la presente divulgación son capaces de convertir el compuesto (IA) en el compuesto (I I A) con un aumento de la tolerancia para la presencia de sustrato en relación con el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 4 bajo condiciones de reacción adecuadas. Así, en algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasa diseñados son capaces de convertir el compuesto sustrato (I I A) a compuesto producto (IA) en presencia de una concentración de carga de sustrato de al menos aproximadamente 1 gramo/litro, aproximadamente 5 gramos/litro, aproximadamente 10 gramos/litro, aproximadamente 20 gramos/litro, aproximadamente 30 gramos/litro, aproximadamente 40 gramos/litro, aproximadamente 50 gramos/litro, aproximadamente 70 gramos/litro, aproximadamente 100 gramos/litro, aproximadamente 125 gramos/litro, aproximadamente 150 gramos/litro. aproximadamente 175 gramos/litro o aproximadamente 200 gramos/litro o más, con un porcentaje de conversión de al menos aproximadamente 50 por ciento, al menos aproximadamente 60 por ciento, al menos aproximadamente 70 por ciento, al menos aproximadamente 80 por ciento, al menos aproximadamente 90 por ciento, al menos aproximadamente 95 por ciento, al menos aproximadamente 98 por ciento, o al menos aproximadamente 99 por ciento, en un tiempo de reacción de aproximadamente 72 horas o menos, aproximadamente 48 horas o menos, aproximadamente 36 horas o menos, o aproximadamente 24 horas o menos, bajo condiciones de reacción adecuadas.
Las condiciones de reacción adecuadas en las que las propiedades mejoradas de los polipéptidos diseñados descritos anteriormente realizan la conversión se pueden determinar con respecto a las concentraciones o cantidades de polipéptido, sustrato, cofactor, búfer, co-disolvente, pH, y/o condiciones que incluyen la temperatura y tiempo de reacción, como se describe a continuación y en los Ejemplos.
Los polipéptidos diseñados de ejemplo utilizados en la presente descripción han asociado con sus propiedades mejoradas para la conversión del compuesto (IA) al compuesto (IIA) y que incluyen una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 2 en las siguientes posiciones de residuos: X9; X14; X18; X21 ; X26; X31 ; X33; X41 ; X45; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X1 13; X132; X133; X146; X147; X148; X153; X163; X168; X173; X177; X203; X21 1 ; X233T; X235; X244; X250; X284; X294; X314; X315; X318; X323; X324; X324; X346; X383; X391 ; X395; X398; X400; X417; X419; X420; X423; X424; X427; X448; y X451 . Las diferencias de aminoácidos específicos en cada una de estas posiciones que están asociadas con las propiedades mejoradas de los polipéptidos ejemplares de la Tabla 2A y 2B incluyen: X9T; X14V; X18A; X21 H; X26R; X31 M; X31 S; X33T; X41 L; X45H; X47N; X57F; X57Y; X70A; X86D; X86Y; X88A; X88L; X107P; X1 13L; X1 13V; X132F; X133R; X146L; X147K; X148Q; X148R; X153S; X163F; X163I ; X163L; X163R; X163V; X168K; X168S; X173A; X177L; X203S; X21 1 K; X233T ; X235P; X244T; X250A; X284A; X294V; X314N ; X315G; X318D; X323T; X324G; X324H; X346L; X383V; X391 A; X395P; X398L; X398V; X398W; X400G; X417M ; X419S; X420N ; X423I; X424V; X424A; X427Y; X448E; y X451 D.
Las diferencias de residuos en comparación con la transaminasa genéticamente modificada representada por SEQ ID NO: 4 incluye aquellos en posiciones de residuos: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X1 13; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X420; X423; X424; X448; y X451 . Las diferencias específicas de aminoácidos en estas posiciones incluyen: X14V; X26R; X31 S; X33T; X41 L; X47N; X57F; X57Y; X70A; X86D; X88A; X88L; X107P; X1 13L; X1 13V; X132F; X148Q; X148R; X163I; X163L; X163R; X163V; X168K; X168S; X173A; X203S; X250A; X284A; X314N; X315G; X324H; X346L; X395P; X398L; X398V; X398W; X400G; X417M ; X419S; X420N ; X423I; X424V; X448E; y X451 D. Aunque las diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 también se producen en las posiciones de residuos X153 y X383, estas diferencias representan reversiones al residuo de aminoácido presente en la secuencia de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2, lo que indica que las interconversiones entre los aminoácidos S y V en la posición de residuo X153 y entre los aminoácidos A y V en la posición residuos X383 no tienen efectos nocivos significativos en las propiedades de las enzimas genéticamente modificadas.
La información de la estructura y función de los polipéptidos de transaminasas de origen no natural (o genéticamente modificados) ejemplares, utilizados en el método de la presente divulgación, se muestran a continuación en la Tabla 2A y 2B. Los identificadores de secuencia impares (es decir, SEQ ID NOs) se refieren a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada por los SEQ ID NOs de número par, y las secuencias se proporcionan en el archivo de lista de secuencia electrónica que acompaña esta divulgación, que se incorpora aquí como referencia. Las diferencias de residuos de aminoácidos se basan en la comparación con la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 4, que es una de las transaminasas genéticamente modificadas derivadas del polipéptido w-VfT de tipo silvestre que tiene las siguientes 24 diferencias de residuos de aminoácidos A9T; G18A; D21 H; V31 M; N45H; F86Y ; A133R; R146L; W147K; V153S; K163F; V177L; R211 K; P233T; A235P; P244T; M294V; P318D; A323T; S324G; A383V; T391A; C424A; F427Y en comparación con la SEQ ID NO: 2. La actividad de cada polipéptido diseñado en relación con el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 4 se determinó como la conversión del sustrato de cetona 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-ona, al compuesto de amina producto (S)-1 -(1 /7-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina durante un período de tiempo y temperatura establecidos en un ensayo de alto rendimiento (HTP), el cual se utilizó como la detección primaria. Los valores de ensayo de HTP en la Tabla 2A se determinaron utilizando E. coli. Los valores de ensayo de HTP en la Tabla 2A se determinaron utilizando Usados de celulas claras de E. coli. en formato de placa de 96 pozos de ~ 200 mI de volumen por pozo siguiendo las condiciones de reacción de ensayo como se indica en la tabla y los Ejemplos. En algunos casos, un ensayo de polvo de matraz de agitación (SFP) y/o de polvo procesado corriente abajo (DSP) se utilizaron como una criba secundaria para evaluar las propiedades de las transaminasas genéticamente modificadas, cuyos resultados se proporcionan en la Tabla 2B. Las formas SFP y DSP proporcionan una preparación en polvo más purificada de los polipéptidos diseñados. Por ejemplo, la transaminasa genéticamente modificada en las preparaciones SFP es de aproximadamente 30 por ciento de la proteína total, mientras que las preparaciones de DSP pueden contener transaminasas genéticamente modificadas que son aproximadamente el 80 por ciento de la proteína total.
Los niveles de actividad (es decir, "+" "++", etc.) se definen como sigue: "+" indica 1.2 veces o más actividad en comparación con la de la SEQ ID NO: 4 para el polipéptido de transaminasa genéticamente modificada SEQ ID NO: 6 a 14, y 1.2 veces o más actividad en comparación con la de la SEQ ID NO: 8 para el polipéptido de transaminasa genéticamente modificada SEQ ID NO: 6 a 154; y un "++" indica 5 veces o más actividad en comparación con la de la SEQ ID NO: 4 para los polipéptidos de transaminasas diseñados de SEQ ID NO: 6-14; y 5 veces o más actividad en comparación con la de la SEQ ID NO: 8 para los polipeptidos de transa inasa diseñados de SEQ ID NO: 16 a 154. Los datos de estabilidad se obtiene mediante la inclusión de las siguientes cantidades de producto (S)-1 -(1 A/-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina en el ensayo y comparando la actividad a la de una enzima de referencia bajo las mismas condiciones: 14 gramos/litro para el análisis de los polipéptidos de transaminasas diseñados de la SEQ ID NO: 6 a 14, y 16 gramos/litro para el análisis de los polipéptidos de transaminasas diseñados de la SEQ ID NO: 16 a 154. La evaluación de la estabilidad se hizo comparando las actividades a dos temperaturas diferentes, 55°C y 50°C.
Tabla 2A: Polipéptidos Diseñados y Mejoras de Enzimas Relativas Usando Preparaciones de HTP 5 5 5 5 placas de 96 pozos se Usaron con 200 microlitros de Búfer de Lisis (1 mg / mi de lisozima, 0.5 mg / mi de sulfato de polimixina B, PLP a 1 mM, trietanolamina (TEA) a 0.1 M, pH 7.0). Las condiciones de reacción comprendieron: 10 gramos/litro (44,4 mM) Compuesto (IA) piridoxal-5-fosfato a 1 mM (PLP); isopropilamina a 2 M (IPM), pH 7.0 trietanolamina a 100 mM (TEA), pH 7.0; PEG 200 al 5 por ciento v / v 10 microlitros de Lisado; y 50°C durante 24 h. trietanolamina a 0.1 M (TEA), pH 7.0. Las condiciones de reacción comprendieron: 10 gramos/litro (44,4 mM) Compuesto (IA); piridoxal-5-fosfato a 1 mM (PLP); isopropilamina a 2 M (IPM), pH 7.0; trietanolamina a 100 mM (TEA), pH 7.0; PEG 200 al 5 por ciento v / v; 10 microlitros de Lisado; y 50°C durante 24 h. c Condiciones de estabilidad de Ensayo: 10 gramos/litro (44,4 mM) Compuesto (la); piridoxal-5-fosfato (PLP) a 1 mM; isopropilamina (IPM) a 2 M, pH 7.0; 100 mM de trietanolamina (TEA), pH 7.0; 5 por ciento de PEG 200 v / v; 10 microlitros de Lisado (preparado según la Condición de Ensayo de HTP 1 o 2); y 55°C durante 24 h. Los Usados se prepararon según las Condiciones de Ensayo de HTP 1 (para SEQ ID NO: 4-90) o Condición de Ensayo de HTP 2 (para SEQ ID NO:92- 230). d Condición de Ensayo de Inhibición de Producto 1 : 10 gramos/litro (44,4 mM) Compuesto (IA); 14 gramos/litro Compuesto ( 11 A) ; piridoxal-5-fosfato (PLP) a 1 mM; isopropilamina (IPM) a 2 M, pH 7.0; trietanolamina (TEA) a 100 mM, pH 7.0; PEG 200 al 5 por ciento v / v; 10 microlitros de Lisado; y 50°C. Los Usados se prepararon según la Condición de Ensayo de HTP 1. , gramos/litro (44,4 mM) Compuesto (IA); 16 gramos/litro Compuesto (IIA); piridoxal-5-fosfato (PLP) a 1 mM; isopropilamina (IPM) a 2 M, pH 7.0; trietanolamina (TEA) a 100 mM, pH 7.0; PEG 200 al 5 por ciento v / v; 10 microlitros de Lisado; y 50°C. Los Usados se prepararon según la Condición de Ensayo de HTP 2.
Tabla 2B: Polipeptidos Diseñados y Mejoras de Enzimas Relativas Usando Preparaciones de Matraz de Agitación y DSP gramos/litro (o 50 o 100 gramos/litro) Compuesto (IA); piridoxal-5-fosfato (PLP) a 1 mM; isopropilamina (IPM) a 2 M, pH 7.0; PEG200 al 5 por ciento v / v; trietanolamina (TEA) a 100 mM, pH 7.0; 2 gramos/litro de la preparación de matraz de agitación que contiene proteína de transaminasa; y 50°C durante un tiempo de reacción de 24 h. b Condiciones de Ensayo de DSP: 25 gramos/litro (o 50 o 100 gramos/litro) Compuesto (IA); piridoxal-5-fosfato (PLP) a 1 mM; isopropilamina (IPM) a 2 M, pH 7; PEG200 al 5 por ciento v / v; trietanolamina (TEA) a 100 mM, pH 7; 2 gramos/litro de la preparación de DSP que contiene proteína a partir de transaminasa; y 50°C durante un tiempo de reacción de 24 h.
A partir de una inspección de los polipéptidos de ejemplos útiles en los métodos de la presente invención, las mejoras en las propiedades de la enzima están asociadas con diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en las posiciones de residuos X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X 1 13 ; X 132 ; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X31 5; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X420; X423; X424; X448; y X451 . Las diferencias de residuos específicos en cada una de estas posiciones que están asociadas con las propiedades mejoradas incluyen: X14V; X26R; X31 S; X33T; X41 L; X47N ; X57F; X57Y ; X70A; X86D; X88A; X88L; X107P; X1 13L; X1 13V; X132F; X148Q; X148R; X163I; X163L; X163R; X163V; X168K; X168S; X173A; X203S; X250A; X284A; X314N; X315G; X324H ; X346L; X395P; X398L; X398V; X398W; X400G; X417M ; X419S; X420N; X423I ; X424V; X448E; y X451 D.
Por consiguiente, en algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado útil en los métodos de la presente divulgación es capaz de convertir el compuesto de sustrato (IA), 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il) propan-2-ona, en el compuesto de producto ( 11 A) , (S)-1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il)-propan-2-amina con propiedades mejoradas en comparación con la SEQ ID NO: 4, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento o más identidad de secuencia con la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 2 y una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en las posiciones de residuos seleccionadas a partir de: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57 ; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; y X451 , donde las diferencias de residuos en las posiciones de residuos X31 ; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; y X417 se selecciona a partir de: X31 S; X57Y; X86D; X 1631 ; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N ; X324H ; X398L; X398V; X398W; y X417M .
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado útil en los métodos divulgados en la presente es capaz de convertir el Compuesto de sustrato (IA) en el compuesto de producto (NA) con propiedades mejoradas en comparación con la SEQ ID NO: 4, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento o más secuencias de identidad para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4 y una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en las posiciones de residuos seleccionas a partir de: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X 148; X163; X 168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; y X451 , en donde las diferencias de residuos en las posiciones de residuos X31 ; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; y X417 se selecciona a partir de: X31 S; X57Y; X86D; X 1631 ; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; y X417M . En algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasas modificados son capaces de llevar a cabo la conversión con las enantioselectividades descritas anteriormente, por ejemplo, ³ 90 por ciento ee.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa útil en los métodos divulgados en la presente es capaz de convertir el Compuesto de sustrato (IA) en el compuesto de producto ( 11 A) con propiedades mejoradas en comparación con la SEQ ID NO: 4, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento o más de identidad para hacer referencia a las secuencias SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154, y una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en posiciones de residuos seleccionadas a partir de: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X 163 ; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; y X451 , donde las diferencias de residuos en las posiciones de residuos X31 ; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; y X417 se selecciona a partir de: X31 S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H ; X398L; X398V; X398W; y X417M . En algunas modalidades, la secuencia de referencia se selecciona de la SEQ ID NO: 4, 8, 14, 16, 132, 134, y 146. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 134. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 146.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa capaz de convertir el Compuesto de sustrato (IA) en el Compuesto de producto (I I A) con propiedades mejoradas en comparación con la SEQ ID NO: 4, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de la SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154, y que tiene una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en posiciones de residuos seleccionadas a partir de: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88, X 107 ; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398, X400; X417; X419; X423; X448; y X451 , donde las diferencias de residuos en las posiciones de residuos X31 ; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; y X417 se selecciona a partir de: X31 S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N ; X324H ; X398L; X398V; X398W; y X417M. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de la SEQ ID NO: 4, 8, 14, 16, 132, 134, y 146. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácido es la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácido es la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácido es la SEQ ID NO: 134. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácido es la SEQ ID NO: 146.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado capaz de convertir el Compuesto de sustrato (IA) en el Compuesto de producto (HA) con al menos 1 .2 veces la actividad relativa a la SEQ ID NO: 4 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de: SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 28, 30, 32, 48, 52, 56, 62, 64, 66, 68, 86, 88, 90, 92, 98, 100, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 124, 126, 128, 132, 134, 136, 142, 144, 148, y 154.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado capaz de convertir el Compuesto de sustrato (IA) en el Compuesto de producto (HA) con al menos 5 veces la actividad relativa a la SEQ ID NO: 4 y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o mas diferencias de residuos seleccionadas a partir de: X14V, X26R; X33T; X88A/L; X163I/L; y X284A.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado útil en los métodos divulgados en la presente es capaz de convertir el compuesto de sustrato (IA) al Compuesto de producto (NA) con al menos 5 veces la actividad relativa a la SEQ ID NO: 4 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado a partir de: SEQ ID NO: 6, 8, 10, 14, 16, 22, 24, 28, 30, 32, 48, 52, 56, 62, 64, 86, 88, 90, 92, 98, 100, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 124, 126, 128, 132, 134, 136, 142, 144, 148, y 154.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado tiene al menos 1 .2 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, o más refractariedad a la inhibición por 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol 3-i I ) propan-2-amina, en particular, (S)-1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il) propan-2-amina, en comparación con el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 4 en la conversión del compuesto (IA) al Compuesto ( 11 A) . En general, el aumento de la refractariedad o resistencia a la inhibición por el compuesto del producto puede ser medido bajo condiciones de ensayo HTP en presencia de 14 gramos/litro o 16 gramos/litro del compuesto (IIA), como se describe en la Tabla 2A y 2B y los ejemplos. En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado que tiene al menos 1 .2 veces o más refractariedad a la inhibición por 1 -(1 H-5-fluoro-6-cloro-indol-3-il) propan-2-amina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 seleccionada a partir de: X26R; X70A; X86D; X88A/L; X132F; X163L; X315G; X395P; X398L; y X419S .
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado con propiedades mejoradas en la conversión del compuesto (IA) al compuesto ( II A ) tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada a partir de la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154.
En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa modificado capaz de convertir el Compuesto (IA) al compuesto ( 11 A) bajo condiciones de reacción adecuadas, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, o 99 por ciento de identidad con una de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154, y las diferencias de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO:4 presente en cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154, como se proporciona en las Tablas 2A y 2B.
En algunas modalidades, los polipeptidos modificados pueden estar en diversas formas, por ejemplo, como una preparación aislada, como una enzima sustancialmente purificada, células enteras transformadas con el gen que codifica la enzima, y/o como extractos de células y/o Usados de tales células. Las enzimas pueden ser liofilizadas, secadas por pulverización, precipitadas o estar en la forma de una pasta en bruto, como se discute más adelante.
En algunas modalidades, los polipéptidos de transaminasas se pueden unir en un sustrato físico. El polipéptido de transaminasa puede estar unido de forma no covalente o covalente sobre un sustrato físico de manera tal que conserve su actividad, estereoselectividad, tolerancia del producto, estabilidad mejorada, y / u otras propiedades mejoradas en relación con el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 4. En tales modalidades, los polipéptidos inmovilizados pueden facilitar la conversión biocatalítica de los sustratos de cetona adecuados, por ejemplo, el Compuesto (IA) o análogos estructurales de los mismos, al producto amina correspondiente, por ejemplo, el Compuesto (I I A) o los análogos estructurales correspondientes, y después de que la reacción se completa se retienen con facilidad (por ejemplo, mediante perlas de retención en las que el polipéptido se inmoviliza) y luego se reutilizan o recielan en reacciones posteriores. Tales procesos de enzimas inmovilizadas permiten la eficiencia y reducción de costes adicionales. Los métodos de inmovilización de enzimas son bien conocidos en la téenica. Varios métodos para la conjugación de sustratos, por ejemplo, membranas, perlas, vidrio, etc se describen en, entre otros, Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, Segunda edición, Academic Press; (2008) y Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, C.M . Niemcyer ed, Humana Press (2004). ; cuyas divulgaciones se incorporan en la presente como referencia.
Polinucleótidos que codifican transaminasas, vectores de expresión y células huésped modificadas En otro aspecto, la presente divulgación proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos de transaminasas modificados descritos en la presente. Los polinucleótidos pueden estar operativamente unidos a una o más secuencias reguladoras heterólogas que controlan la expresión génica para crear un polinucleótido recombinante capaz de expresar el polipéptido. Los constructos de expresión que contiene un polinucleótido heterólogo que codifica la transaminasa modificada se pueden introducir en células huésped apropiadas para expresar el polipéptido de transaminasa correspondiente.
Como será evidente para el experto en la técnica, la disponibilidad de una secuencia de proteína y el conocimiento de los codones correspondientes a los diversos aminoácidos proporcionan una descripción de todos los polinucleótidos capaces de codificar los polipéptidos en cuestión. La degeneración del código genético, en donde los mismos aminoácidos se codifican por los codones alternativos o sinónimos, permite un número extremadamente grande de ácidos nucleicos para ser elborados, todos los cuales codifican las enzimas de transaminasas mejoradas. Por lo tanto, teniendo el conocimiento de una secuencia de aminoácidos particular, los expertos en la téenica podrían hacer cualquier número de ácidos nucleicos diferentes, simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de una forma que no cambia la secuencia de aminoácidos de la proteína. En este sentido, la presente divulgación contempla específicamente cada y toda posible variación de polinucleótidos que se podrían hacer codificando los polipéptidos descritos en la presente mediante la selección de combinaciones basadas en las posibles elecciones de codones, y todas estas variaciones se deben considerar divulgadas específicamente para cualquier polipéptido descrito en la presente, incluyendo las secuencias de aminoácidos presentadas en las Tablas 2A y 2B, y divulgadas en la lista de secuencias incorporadas por referencia en la presente como SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154.
En diversas modalidades, los codones se seleccionan preferiblemente para adaptarse a la célula huésped en la que se produce la proteína. Por ejemplo, los codones preferidos utilizados en bacterias se utilizan para expresar el gen en bacterias; los codones preferidos utilizados en la levadura se utilizan para la expresión en la levadura; y los codones preferidos utilizados en los mamíferos se utilizan para la expresión en células de mamífero. En algunas modalidades, todos los codones no necesitan ser reemplazados para optimizar el uso de codones de las transaminasas debido a que la secuencia natural comprenderá codones preferidos y porque el uso de codones preferidos puede no ser necesario para todos los residuos de aminoácidos. En consecuencia, los polinucleótidos optimizados de codones que codifican las enzimas de transaminasas pueden contener codones preferidos en un 40 por ciento, 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, o mayor que 90 por ciento aproximadamente de las posiciones de codones de la región codificante de longitud completa.
Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de transaminasa mejorado puede ser manipulado en una variedad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. En algunas modalidades, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos se pueden proporcionar como vectores de expresión, donde una o más secuencias de control está presente para regular la expresión de los polinucleótidos y/o polipéptidos. La manipulación del polinucleótido aislado antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las teenicas para modificar los polinucleótidos y secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de ADN recombinantes son bien conocidas en la técnica. Se ofrece orientación en Sambrook et al, 2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press; y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, cambios a 2006 En las modalidades en la presente, los polipéptidos mejorados y los polinucleótidos correspondientes se pueden obtener usando métodos utilizados por los expertos en la técnica. La secuencia parental de polinucleótidos que codifica el polipéptido tipo silvestre de Vibrio fluvialis se describe en Shin et al., 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 61 (5-6):463-471 , y los métodos de generación de polipéptidos de transaminasas modificados con propiedades mejoradas de reconocimiento de estabilidad y de sustrato se describen en las publicaciones de solicitud de patente W02010081053 y US20100209981 , que se incorporan en la presente como referencia.
Cuando se conoce la secuencia del polipéptido modificado, los polinucleótidos que codifican la enzima se pueden preparar por métodos en fase sólida estándar, de acuerdo con métodos sintéticos conocidos. En algunas modalidades, los fragmentos de hasta 100 bases aproximadamente pueden ser sintetizados individualmente, luego pueden unirse (por ejemplo, por métodos de ligación enzimática o química, o métodos mediados por polimerasa) para formar cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos y oligonucleótidos de la invención se pueden preparar mediante síntesis química utilizando, por ejemplo, el método de la fosforamidita descrito por Beaucage et al, 1981 , Tet Lett 22: 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al, 1984, EMBO J. 3: 801 -05, por ejemplo, como se practica típicamente en métodos de síntesis automatizados. De acuerdo con el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificados, recocidos, ligados y clonados en vectores apropiados. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede obtenerse a partir de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales.
Por consiguiente, en algunas modalidades, un método para preparar el polipéptido de transaminasas modificado puede comprender: (a) sintetizar un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154 y que tiene una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO : 4 en las posiciones de residuos seleccionadas a partir de: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X163; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; y X451 , en donde las diferencias de residuos en las posiciones de residuos X31 ; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; y X417 se selecciona a partir de: X31 S; X57Y; X86D; X163I; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; y X417M .; y (b) expresar el polipéptido de transaminasa codificado por el polinucleótido.
La transaminasa modificada expresada se puede medir para la propiedad mejorada deseada, por ejemplo, la actividad, la enantioselectividad, la estabilidad, y la tolerancia del producto, en la conversión del compuesto (IA) al compuesto (IIA) mediante cualquiera de las condiciones de ensayo descritas en la presente.
En algunas modalidades, cualquiera de las enzimas transaminasas modificadas expresadas en una célula huésped pueden ser recuperadas de las células y lo medios de cultivo utilizando cualquiera o más de las téenicas bien conocidas para la purificación de proteínas, incluyendo, entre otros, el tratamiento de lisozima, sonicación, filtración, precipitación por sales, ultra-centrifugación y cromatografía. Las soluciones adecuadas para la lisis y la extracción de alta eficacia de las proteínas a partir de bacterias, tales como E. coli, están disponibles comercialmente bajo el nombre comercial de CelLytic BTM de Sigma-Aldrich de St. Louis MO.
Las técnicas cromatográficas para el aislamiento del polipeptido de transaminasa incluyen, entre otros, cromatografía de fase inversa, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, y cromatografía de afinidad. Condiciones para la purificación de una enzima en particular dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, hidrofobicidad, hidrofilicidad, peso molecular, forma molecular, etc, y serán evidentes para los expertos en la téenica.
En algunas modalidades, las técnicas de afinidad se pueden utilizar para aislar las enzimas de transaminasas mejoradas. Para la purificación de la cromatografía de afinidad, cualquier anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de transaminasa puede ser utilizado. Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadores, incluyendo pero no limitado a conejos, ratones, ratas, etc. , pueden ser inmunizados por inyección con un polipéptido de transaminasas, o un fragmento del mismo. El polipéptido o fragmento de transaminasa puede unirse a un portador adecuado, tal como BSA, por medio de un grupo funcional de cadena lateral o enlazadores unidos a un grupo funcional de cadena lateral. Varios adyuvantes pueden ser utilizados para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo pero no limitado a geles minerales (completos e incompletos) de Freund tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilos de Calmette Guerin) y Corynebacterium parvum.
Metodos de Uso de las Enzimas de Transaminasa Genéticamente Modificadas En otro aspecto, las transaminasas descritas en la presente pueden usarse en un procedimiento para llevar a cabo las reacciones de transaminasas en las que un grupo amino de un donante amino se transfiere a un aceptor amino, por ejemplo, sustrato cetona, para producir una amina. El uso de un aceptor de cetona proquiral puede resultar en la producción de una amina quiral en exceso enantiomérico. Generalmente, el proceso para realizar la reacción de transaminación comprende poner en contacto o incubar un donante amino y un aceptor amino con un polipéptido de transaminasa modificado de la divulgación en condiciones de reacción adecuadas para la conversión del aceptor amino a una amina.
En algunas modalidades, las transaminasas se pueden utilizar en la conversión del compuesto de sustrato de la Fórmula (I) al compuesto de producto de la fórmula (II). Por consiguiente, en algunas modalidades, un procedimiento para preparar el compuesto de la fórmula (II) en exceso enantiomérico comprende poner en contacto el compuesto de la fórmula (I) en presencia de un donante de amino en condiciones de reacción adecuadas con un polipéptido de transaminasa modificado descrito en la presente. En algunas modalidades del proceso, el compuesto de la fórmula (II) se puede formar en al menos un 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento o mayor de exceso enantiomérico.
Para los procedimientos anteriores, cualquiera de las transaminasas modificadas descritas en la presente pueden ser utilizadas. A modo de ejemplo y sin limitación, en algunas modalidades, el proceso puede utilizar un polipéptido de transaminasas modificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento o más de identidad con una secuencia de referencia seleccionada a partir de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154, y una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en posiciones de residuos seleccionadas a partir de: X14; X26; X31 ; X33; X41 ; X47; X57; X70; X86; X88; X107; X132; X148; X 163 ; X168; X173; X203; X250; X284; X314; X315; X324; X346; X395; X398; X400; X417; X419; X423; X448; y X451 , en donde las diferencias de residuos en las posiciones de residuos X31 ; X57; X86; X163; X168; X314; X324; X398; y X417 se selecciona a partir de: X31 S; X57Y; X86D; X163I ; X163L; X163R; X163V; X168S; X314N; X324H; X398L; X398V; X398W; y X417M . En algunas modalidades, la secuencia de referencia se selecciona de la SEQ ID NO: 4, 8, 14, 16, 132, 134, y 146. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 134. En algunas modalidades, la secuencia de referencia es la SEQ ID NO: 146.
En algunas modalidades, las transaminasas de ejemplo capaces de llevar acabo los procedimientos de la presente pueden ser un polipeptido que comprende una secuencia amino acida selecciona a partir de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, y 154. Guía para la elección y utilización de las transaminasas modificadas se proporcionan en las descripciones de la presente, por ejemplo, la Tabla 2 y los Ejemplos.
En las modalidades de la presente e ilustradas en los Ejemplos, diversos rangos de condiciones de reacción adecuadas que se pueden utilizar en los procesos, incluyendo pero no limitándose, a los rangos de donante amino, pH, temperatura, tampón, sistema de disolventes, carga sustrato, carga polipéptido, cofactor de carga, presión y tiempo de reacción. Condiciones de reacción adecuadas adicionales para llevar a cabo el proceso para la conversión biocatalítica de compuestos de sustrato a compuestos de productos usando un polipéptido de transaminasa modificado descrito en la presente se pueden optimizar fácilmente en vista de la orientación proporcionada en la presente mediante experimentación de rutina que incluye, pero no se limita a, poner en contacto el polipéptido de transaminasa modificado y el compuesto de sustrato bajo condiciones de reacción experimentales de concentración, pH, temperatura, condiciones disolventes, y detectar el compuesto de producto.
En las modalidades descritas en la presente, el polipéptido de transaminasa utiliza un donante amino para formar los compuestos de productos. En algunas modalidades, el donante amino en las condiciones de reacción se puede seleccionar a partir de isopropilamina (también denominado en la presente como "IPM"), putrescina, L-lisina, a-fenetilamina, D-alanina, L-alanina, o D, L alanina o D, L-ornitina. En algunas modalidades, el donante amino se selecciona a partir del grupo que consta de IPM , putrescina, L-lisina, D-o L-alanina. En algunas modalidades, el donante amino es MIP. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden el donante amino, en particular IPM , presente en una concentración de al menos 0.1 a 3.0 M aproximadamente, 0.2 a 2.5M aproximadamente, 0.5 a 2 M aproximadamente o 1 a 2 M aproximadamente. En algunas modalidades, el donante amino está presente en una concentración de 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 1 , 1 .5, 2, 2.5 o 3M aproximadamente. Concentraciones más altas de donante amino, por ejemplo, IPM , se puede utilizar para desplazar el equilibrio hacia la formación de producto de amina.
Condiciones de reacción adecuadas utilizando los polipéptidos de transaminasas modificados comprenden también típicamente un cofactor. Los cofactores útiles en los procesos que utilizan las enzimas de transaminasas modificadas incluyen, pero no se limitan a, piridoxal-5'-fosfato (también conocida como piridoxal-fosfato, PLP, P5P), piridoxina (PN), piridoxal (PL), piridoxamina (PM), y sus homólogos fosforilados; fosfato de piridoxina (PNP), y fosfato de piridoxamina (PM P). En algunas modalidades, el PLP cofactor está presente naturalmente en el extracto celular y no necesita ser complementado. En algunas modalidades de los métodos, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un cofactor agregado a la mezcla de reacción de la enzima, por ejemplo, cuando se utiliza parcialmente purificada, o enzima de transaminasa purificada. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas pueden comprender la presencia de un cofactor seleccionado a partir de PLP, PN, PL, PM , PNP, y PM P, a una concentración de 0.1 gramos/litro hasta 10 gramos/litro aproximadamente, 0.2 gramos/litro a 5 gramos/litro aproximadamente, 0.5 gramos/litro a 2.5 gramos/litro aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción comprenden una concentración PLP de 0.1 gramos/litro aproximadamente o menos, 0.2 gramos/litro aproximadamente o menos, 0.5 gramos/litro aproximadamente o menos, 1 gramos/litro aproximadamente o menos, 2.5 gramos/litro aproximadamente o menos, 5 gramos/litro aproximadamente o menos, o 10 gramos/litro aproximadamente o menos. En algunas modalidades, el cofactor se puede agregar ya sea al comienzo de la reacción y/o el cofactor adicional se agrega durante la reacción.
El compuesto de sustrato en las mezclas de reacción puede variar, teniendo en cuenta, por ejemplo, la cantidad deseada del compuesto de producto, el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, la estabilidad de la enzima bajo condiciones de reacción, y el porcentaje de conversión de sustrato a producto. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un compuesto de sustrato con carga de al menos 0.5 a 200 gramos/litro aproximadamente, 1 a 200 gramos/litro aproximadamente, 5 a 150 gramos/litro aproximadamente, 10 a 100 gramos/litro aproximadamente, 20 a 100 gramos/litro aproximadamente o 50 a 100 gramos/litro aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un compuesto de sustrato con carga de al menos 0.5 gramos/litro aproximadamente, al menos 1 gramos/litro aproximadamente, al menos 5 gramos/litro aproximadamente, al menos 10 gramos/litro aproximadamente, al menos 15 gramos/litro aproximadamente, al menos 20 gramos/litro aproximadamente, al menos 30 gramos/litro aproximadamente, al menos 50 gramos/litro aproximadamente, al menos 75 gramos/litro aproximadamente, al menos 100 gramos/litro aproximadamente, al menos 150 gramos/litro aproximadamente o al menos 200 gramos/litro aproximadamente, o incluso mayor.
La actividad y/o estereoselectividad mejorada de los polipeptidos de transaminasas modificados descritos en la presente proporciona para procesos en donde el porcentaje de conversión más alto se puede alcanzar con concentraciones más bajas del polipéptido modificado. En algunas modalidades del proceso, las condiciones de reacción adecuadas comprenden una concentración de polipéptido modificada de 0.01 a 50 gramos/litro aproximadamente; 0.05 a 50 gramos/litro aproximadamente; 0.1 a 40 gramos/litro aproximadamente; 1 a 40 gramos/litro aproximadamente; 2 a 40 gramos/litro aproximadamente; 5 a 40 gramos/litro aproximadamente; 5 a 30 gramos/litro aproximadamente; 0.1 a 10 gramos/litro aproximadamente; 0.5 a 10 gramos/litro aproximadamente; 1 a 10 gramos/litro aproximadamente; 0.1 a 5 gramos/litro aproximadamente; 0.5 a 5 gramos/litro aproximadamente; o 0.1 a 2 gramos/litro aproximadamente. En algunas modalidades, el polipéptido de transaminasa es la concentración a 0.01 , 0.05, 0.1 , 0.2, 0.5, 1 , 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50 gramos/litro aproximadamente.
Durante el curso de las reacciones de transaminación, el pH de la mezcla de reacción puede cambiar. El pM de la mezcla de reacción puede mantenerse en un pH deseado o dentro de un intervalo de pH deseado. Esto puede hacerse mediante la adición de un ácido o una base, antes y/o durante el curso de la reacción. Alternativamente, el pH puede ser controlado mediante el uso de un tampón. Por consiguiente, en algunas modalidades, las condiciones de reacción comprenden un búfer. Los tampones adecuados para mantener los rangos de pH deseados son conocidos en la téenica e incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, borato, carbonato, fosfato, tampón de trietanolamina, y similares. En algunas modalidades, el tampón es borato. En algunas modalidades del proceso, las condiciones de reacción adecuadas comprenden una solución de tampón de trietanolamina, dónde la concentración de trietanolamina es de 0.01 a 0.4 M aproximadamente, 0.05 a 0.4 M aproximadamente, 0.1 a 0.3 M aproximadamente, o 0.1 a 0.2 M aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción comprenden una concentración de trietanolamina de 0.01 , 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.07, 0.1 , 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.3, o 0.4 M aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción comprenden agua como un disolvente adecuado sin tampón presente.
En las modalidades del proceso, las condiciones de reacción pueden comprender un pH adecuado. El pH deseado o rango de pH deseado puede mantenerse mediante el uso de un ácido o base, un tampón apropiado, o combinación de una base o un ácido regulador de adición. El pH de la mezcla de reacción puede ser controlado antes y/o durante el curso de la reacción. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden una solución de pH que comprenden un pH de 6 a 12 aproximadamente, un pH de 6 a 10 aproximadamente, un pH de 6 a 8 aproximadamente, un pH de 7 a 10 aproximadamente, un pH de 7 a 9 aproximadamente, o un pH de 7 a 8 aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción comprenden un pH de solución de 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 1 1 , 1 1 .5 o 12 aproximadamente.
En las modalidades de los procesos de la presente, una temperatura adecuada puede utilizarse para las condiciones de reacción, por ejemplo, teniendo en cuenta el aumento de la tasa de reacción a temperaturas más altas, y la actividad de la enzima durante el período de tiempo de reacción. Por ejemplo, los polipeptidos modificados de la presente divulgación tienen estabilidad aumentada con respecto al polipéptido de transaminasa de origen natural por ejemplo, el polipéptido de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2, que permite que los polipéptidos modificados sean utilizados a temperaturas más altas para las tasas de conversión aumentadas y características de solubilidad de sustratos modificadas para la reacción. Por consiguiente, en algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden una temperatura de 10°C a 70°C aproximadamente, 10°C a 65°C aproximadamente, 15°C a 60°C aproximadamente, 20°C a 60°C aproximadamente, 20°C a 55°C aproximadamente, 30°C a 55°C aproximadamente, o 40°C a 50°C aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden una temperatura de 10°C, 15°C , 20°C , 25°C , 30°C, 35°C , 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C o 70°C aproximadamente. En algunas modalidades, la temperatura durante la reacción enzimática se puede mantener a una temperatura durante el transcurso de la reacción. En algunas modalidades, la temperatura durante la reacción enzimática se puede ajustar en un perfil de temperatura durante el curso de la reacción.
Los procesos de la divulgación se llevan a cabo generalmente en un disolvente. Los disolventes adecuados incluyen agua, soluciones de tampón acuosas, disolventes orgánicos, disolventes poliméricos, y/o sistemas co-disolventes, que generalmente comprenden disolventes acuosos, disolventes orgánicos y/o disolventes poliméricos. El disolvente acuoso (agua o sistema de co-disolvente acuoso) puede ser de pH tamponado o no tamponado. En algunas modalidades, los procedimientos que utilizan los polipéptidos de transaminasas modificados se llevan a cabo generalmente en un sistema de co-disolvente acuoso que comprende un disolvente orgánico (por ejemplo, etanol, isopropanol (IPA), dimetil sulfóxido (DMSO), acetato de etilo, acetato de butilo, 1 -octanol, heptano, octano, Metil-tertbutil éter (MTBE), tolueno, y similares), disolventes iónicos o polares (por ejemplo, tetrafluoroborato de 1 -etil-4-metilimidazolio, tetrafluoroborato de 1 -butil-3-metilimidazolio, hexafluorofosfato de 1 -butil-emetilimidazolio, glicerol, polietilenglicol, y similares). En algunas modalidades, el co-disolvente puede ser un disolvente polar, tal como un poliol, dimetilsulfóxido, DMSO, o alcohol inferior. El componente co-disolvente no acuoso de un sistema co-disolvente acuoso puede ser miscible con el componente acuoso, proporcionando una única fase líquida, o puede ser parcialmente miscible o inmiscible con el componente acuoso, proporcionando dos fases liquidas. Sistemas co-disolventes acuosos de ejemplo pueden comprender agua y uno o más co-disolventes seleccionados a partir de un disolvente orgánico, disolvente polar, y disolvente de poliol. En general, el componente co-disolvente de un sistema de co-disolvente acuoso es elegido de manera tal que no inactiva negativamente la enzima de transaminasa bajo las condiciones de reacción. Sistemas co-disolventes apropiado se pueden identificar fácilmente mediante la medición de la actividad enzimática de la enzima de transaminasa modificada especificada con un sustrato de interés definido en el sistema disolvente candidato, utilizando un ensayo de actividad enzimática, tales como los descritos en la presente.
En algunas modalidades del proceso, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un co-disolvente acuoso, donde el co-disolvente comprende un disolvente de poliol, en particular glicoles. Ejemplos de disolventes de polioles adecuados incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, polietilenglicol, polietilenglicol-metil-éter, dietilenglicol-dimetil-éter, trietilenglicol-dimetil-éter, y el glicol de polipropileno. En algunas modalidades, el co-disolvente acuoso comprende polietilenglicol, que está disponible en diferentes pesos moleculares. Particularmente útiles son los glicoles de peso molecular bajo, tales como PEG200 a PEG600. Por consiguiente, en algunas modalidades, el co-disolvente acuoso comprende PEG200 de 2 por ciento a 40 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 2 por ciento a 40 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 2 por ciento a 40 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 5 por ciento a 40 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 2 por ciento a 30 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 5 por ciento a 30 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 1 a 20 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 2 por ciento a 20 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 5 por ciento a 20 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 2 por ciento a 10 por ciento volumen/volumen aproximadamente; 2 por ciento a 10 por ciento volumen/volumen aproximadamente. En algunas modalidades, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un co-disolvente acuoso que comprende PEG200 a 2 por ciento, 2 por ciento, 5 por ciento, 10 por ciento, 15 por ciento, 20 por ciento; 25 por ciento; 30 por ciento; 35 por ciento; 35 por ciento aproximadamente o 40 por ciento volumen/volumen aproximadamente.
En algunas modalidades del proceso, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un co-disolvente acuoso, donde el co-disolvente comprende DMSO de 2 por ciento a 80 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente, 1 a 70 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente, 2 por ciento a 60 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente, 5 por ciento a 40 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente, 10 por ciento a 40 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente, 10 por ciento a 30 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente, o 10 por ciento a 20 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente. En algunas modalidades del proceso, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un co-disolvente acuoso que comprende DMSO al menos 2 por ciento, 5 por ciento, 10 por ciento, 15 por ciento, 20 por ciento, 25 por ciento, 30 por ciento, 35 por ciento, 40 por ciento, 45 por ciento, 50 por ciento, 55 por ciento, 60 por ciento, 65 por ciento, 70 por ciento, 75 por ciento, o 80 por ciento (volumen/volumen) aproximadamente.
Las cantidades de reactivos utilizados en la reacción de transaminación generalmente varían en función de las cantidades del producto deseadas, y concomitantemente la cantidad de sustrato de transaminasa empleada. Los expertos en la téenica entenderán fácilmente cómo variar estas cantidades para adaptarlas al nivel deseado de la productividad y la escala de producción.
En algunas modalidades, el orden de adición de los reactivos no es crítico. Los reactivos se pueden agregar juntos al mismo tiempo a un disolvente (por ejemplo, disolvente monofásico, sistema co-disolvente acuoso bifásico, y similares), o alternativamente, algunos de los reactivos pueden agregarse por separado, y algunos juntos en diferentes puntos temporales. Por ejemplo, el cofactor, transaminasa, y transaminasa del sustrato pueden agregarse primero al disolvente.
Los reactivos sólidos (por ejemplo, enzimas, sales, etc.) pueden ser proporcionados a la reacción en una variedad de formas diferentes, incluyendo en polvo (por ejemplo, liofilizado, pulverización seca, y similares), solución, emulsión, suspensión, y similares. Los reactivos pueden ser liofilizados o secados por pulverización fácilmente utilizando métodos y equipos que son conocidos para los expertos normales en la téenica. Por ejemplo, la solución de proteína puede congelarse a -80°C en pequeñas alícuotas, luego agregarse a una cámara de liofilización previamente enfriada, seguido por la aplicación de vacío.
Para una eficacia de mezcla mejorada cuando se utiliza un sistema co-disolvente acuoso, la transaminasa, y el cofactor puede agregarse y mezclarse en la fase acuosa primero. Luego, la fase orgánica puede agregarse y mezclarse, seguida por la adición del sustrato de transaminasa. Alternativamente, el sustrato de transaminasa puede mezclarse previamente en la fase orgánica, antes de la adición a la fase acuosa.
La reacción de transaminación generalmente se dejó proceder mientras que una conversión adicional del sustrato cetónico a un producto amino no altere de manera significativa el tiempo de la reacción, por ejemplo, menos de 10 por ciento de sustrato que se convierte, o menos de 5 por ciento de sustrato que se convierte). En algunas modalidades, la reacción se deja que continúe hasta que la conversión este completa o casi completa de cetona de sustrato a producto de amina. La transformación de sustrato a producto puede monitorizarse utilizando métodos conocidos mediante la detección de sustrato y/o producto. Los métodos adecuados incluyen la cromatografía de gas, HPLC, y similares. Los rendimientos de conversión del producto de amina quiral generados en la mezcla de reacción son generalmente mayor que 50 por ciento aproximadamente, también puede ser mayor que 60 por ciento aproximadamente, también puede ser mayor que 70 por ciento aproximadamente, también puede ser mayor que 80 por ciento aproximadamente, también puede ser mayor que 90 por ciento, y son a menudo mayor que 97 por ciento aproximadamente. En algunas modalidades, los métodos para preparar compuestos de la fórmula (II) utilizando un polipéptido de transaminasa modificado bajo condiciones de reacción adecuadas resulta en al menos una conversión del 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento aproximadamente o mayor de sustrato de cetona, por ejemplo, compuesto de la fórmula (I), al compuesto del producto de amina, por ejemplo, el compuesto de la fórmula (II) en 48h o menos aproximadamente, en 36 horas o menos aproximadamente, en 24 horas o menos aproximadamente, o incluso menos tiempo.
En algunas modalidades del proceso, las condiciones de reacción adecuadas comprenden un sustrato con carga de compuesto de sustrato de al menos 20 gramos/litro, 30 gramos/litro, 40 gramos/litro, 50 gramos/litro, 60 gramos/litro, 70 gramos/litro, 100 gramos/litro aproximadamente, o más, y en donde los resultados del método en al menos una conversión del 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento aproximadamente o mayor de compuesto de sustrato a compuesto de producto en aproximadamente 48 horas o menos, en 36 horas o menos aproximadamente, o en 24 horas o menos aproximadamente.
Los polipéptidos de transaminasas modificados de la presente divulgación cuando se utilizan en el proceso bajo condiciones de reacción adecuadas dan como resultado un exceso enantiomérico de la amina quiral en al menos 97 por ciento, 98.99 por ciento, 99.2 por ciento, 99.2 por ciento, 99.3 por ciento, 99.4 por ciento, 99.5 por ciento, 99.6 por ciento, 99.7 por ciento, 99.8 por ciento, o 99.9 por ciento e.e.
En una modalidad adicional de los métodos para la conversión de compuesto de sustrato a compuesto de producto amina utilizando los polipéptidos de transaminasas modificados, las condiciones de reacción adecuadas comprenden una carga de sustrato inicial a la solución de reacción que se pone luego en contacto por el polipéptido. Esta solución de reacción se complementa además con el sustrato adicional del compuesto como una adición continua con el tiempo a una tasa de al menos 1 grams/litro/hora aproximadamente, al menos 2 gramos/litro/hora aproximadamente, al menos 4 gramos/litro/hora aproximadamente, al menos 6 gramos/litro/hora aproximadamente, o superior. Por lo tanto, de acuerdo con estas condiciones de reacción adecuadas se agrega polipéptido a una solución que tiene una carga de sustrato inicial de al menos aproximadamente 20 gramos/litro, 30 gramos/litro, o 40 gramos/litro. Esta adición de polipéptido es seguida por la adición continua de sustrato adicional a la solución en una tasa de 2 gramos/litro/hora, 4 gramos/litro/hora, o 6 gramos/litro/hora aproximadamente hasta que se alcance una carga de sustrato final mucho más alta de al menos 30 gramos/litro, 40 gramos/litro, 50 gramos/litro, 60 gramos/litro, 70 gramos/litro, 100 gramos/litro, 150 gramos/litro, 200 gramos/litro aproximadamente o más. Por consiguiente, en algunas modalidades del método, las condiciones de reacción adecuadas comprenden la adición del polipéptido a una solución que tiene una carga de sustrato inicial de al menos 20 gramos/litro, 30 gramos/litro, o 40 gramos/litro aproximadamente seguido por la adición de sustrato adicional a la solución en una tasa de 2 gramos/litro/hora, 4 gramos/litro/hora, o 6 gramos/litro/hora aproximadamente hasta que se alcance una carga de sustrato final de al menos 30 gramos/litro, 40 gramos/litro, 50, gramos/litro, 60 gramos/litro, 70 gramos/litro, 100 gramos/litro aproximadamente o más. Esta condición de reacción de suplementación del sustrato permite cargas de sustrato más altas a ser alcanzadas, manteniendo tasas altas de conversión de sustrato de cetona al producto amina de al menos 92 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento aproximadamente o más. En algunas modalidades de este método, el sustrato adicional se agrega en una solución que comprende isopropilamina o acetato de isopropilamina a una concentración de al menos 0.5 M aproximadamente, al menos 1 .0 M aproximadamente , al menos 2.5 M aproximadamente, al menos 5.0 M aproximadamente, al menos 7.5 M aproximadamente, al menos 10.0 M aproximadamente.
En algunas modalidades de los procesos, la reacción de transaminación utilizando un polipéptido de transaminasa modificado puede comprender las siguientes condiciones de reacción adecuadas: (a) carga de sustrato de 5 gramos/litro a 200 gramos/litro aproximadamente; (b) 0.1 a 50 gramos/litro de polipéptido de transaminasas aproximadamente; (c) 0.1 a 4 M de isopropilamina aproximadamente (IPM); (d) 0.1 a 10 gramos/litro de cofactor de fosfato de piridoxal (PLP) aproximadamente; (e) pH de 6 a 9 aproximadamente; y (f) temperatura de 30 a 60°C aproximadamente.
En algunas modalidades de los procesos, la reacción de transaminación utilizando un polipéptido de transaminasa modificado puede comprender las siguientes condiciones de reacción adecuadas: (a) carga de sustrato de 5 a 20 gramos/litro aproximadamente; (b) 0.05 a 2 gramos/litro de polipéptido transaminasas aproximadamente; (c) 1 a 10 por ciento volumen/volumen de PEG200 aproximadamente; (d) 1 a 2 M de isopropilamina (IPM) aproximadamente; (e) 0.1 a 1 gramos/litro de cofactor de fosfato de piridoxal (PLP) aproximadamente; (f) 0.1 a 0.5 M de trietanolamina (TEA) aproximadamente; (g) pH de 6 a 8 aproximadamente; y (h) temperatura de 45 a 55°C aproximadamente.
En algunas modalidades de los procesos, la reacción de transaminación utilizando un polipéptido de transaminasa modificado puede comprender las siguientes condiciones de reacción adecuadas: (a) carga de sustrato de 25 a 100 gramos/litro aproximadamente; (b) 0.05 a 10 gramos/litro de polipéptido de transaminasas aproximadamente; (c) 1 a 10 por ciento volumen/volumen de PEG200 aproximadamente; (d) 1 a 2 M de isopropilamina (IPM) aproximadamente; (e) 0.1 a 1 gramos/litro de cofactor de fosfato de piridoxal (PLP) aproximadamente; (f) 0.1 a 0.5 M de trietanolamina aproximadamente; (g) pH de 6 a 8 aproximadamente; y (h) temperatura de 45 a 55°C aproximadamente.
En algunas modalidades, com ponentes de reacción adicionales o téenicas adicionales llevadas a cabo para complementar las condiciones de reacción. Estos pueden incluir la toma de medidas para estabilizar o evitar la inactivación de la enzima, reducir la inhibición del producto, cambiar el equilibrio de reacción para producir la formación de aminas.
Por consiguiente, en algunas modalidades del proceso para la preparación de una amina, tal como una amina quiral, cantidades adicionales del aceptor amino se pueden agregar (hasta saturación) y/o el aceptor amino (cetona) formado puede ser retirado continuamente de la mezcla de reacción. Por ejemplo, un puente disolvente o un sistema de dos fases co-disolvente pueden utilizarse para mover el producto de amina a una solución de extracción, y con ello reducir la inhibición por el producto de amina y también cambiar el equilibrio hacia la formación del producto (véase, por ejemplo, Yun y Kim 2008, Biosci. Biotechnol. Biochem . 72(1 1 ):3030-3033).
En algunas modalidades de los procesos, las condiciones de reacción adecuadas comprenden la presencia del cofactor reducido, nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), que puede actuar para limitar la inactivación de la enzima de transaminasa (véase, por ejemplo, van Ophem et al., 1998, Bioquímica 37 (9): 2879-88). En tales modalidades en donde NADH está presente, un sistema de regeneración cofactor, tal como glucosa deshidrogenasa (GDH) y glucosa o formiato de deshidrogenasa y formiato se puede utilizar para regenerar el NADH en el medio de reacción.
En algunas modalidades, el proceso puede comprender además la eliminación del sub-producto de carbonilo formado entre el donante de grupo amino cuando el grupo amino se transfiere al aceptor de grupo amino. Tal eliminación in situ puede reducir la tasa de la reacción inversa de tal manera que la reacción directa domina y más sustrato se convierte entonces en producto. La eliminación del carbonilo mediante el producto se puede llevar acabo en un número de maneras. Donde el donante de grupo amino es un aminoácido, tal como alanina, el sub-producto carbonilo, un ceto ácido, puede ser eliminado por reacción con un peróxido (vease, por ejemplo, EE.UU. 2008/0213845, incorporada en la presente como referencia). Peróxidos que pueden ser utilizados incluyen, entre otros, peróxido de hidrógeno; peroxiácidos (perácidos), tales como ácido peracético (CH3CO3H), ácido trifluoroperacético y ácido metacloro-peroxibenzoico; peróxidos orgánicos tales como peróxido de t-butilo ((CH3) 3COOH), u otros oxidantes selectivos tales como perrutenato de tetrapropilamonio, Mn02, KMn04, tetróxido de rutenio y compuestos relacionados. Alternativamente, la eliminación de piruvato se puede lograr a través de su reducción a lactato mediante el empleo de deshidrogenasa de lactato para cambiar el equilibrio a la amina de producto (véase, por ejemplo, Koszelewski et al, 2008, Adv. Syn. Catal. 350: 2761 -2766). La eliminación de piruvato también se puede lograr a través de su descarboxilación mediante el empleo de descarboxilasa de piruvato (ver, por ejemplo, Hohne et al, 2008, Chem bioquímica 9: 363-365) o sintasa de acetolactato (ver, Yun y Kim, supra).
Alternativamente, en modalidades donde se utiliza un aminoácido como donante de grupo amino, el sub-producto de carbonilo del ceto ácido puede ser recielado de nuevo al aminoácido por reacción con amoniaco y NADH utilizando una enzima de deshidrogenasa apropiada, por ejemplo, deshidrogenasa del aminoácido, en presencia de un donante de amina, tal como amoníaco, por lo tanto de este modo se da la reposición del donante de grupo amino.
En algunas modalidades, donde la elección de los donantes amino resulta en un sub-producto de carbonilo que tiene una presión de vapor mayor que el agua (por ejemplo, un co-producto de baja ebullición, tal como un compuesto de carbonilo orgánico volátil), el sub-producto de carbonilo puede ser eliminado al bullir la solución de la reacción con un gas no reactivo o mediante la aplicación de un vacío para reducir la presión de reacción y eliminar el sub-producto de carbonilo presente en la fase de gas. Un gas no reactivo es cualquier gas que no reacciona con los componentes de reacción. Varios gases no reactivos incluyen nitrógeno y gases nobles (por ejemplo, gases inertes). En algunas modalidades, el gas no reactivo es gas de nitrógeno. En algunas modalidades, el donante amino utilizado en el proceso es isopropilamina (M IP), que forma el carbonilo por el producto cetónico después de la transferencia del grupo amino al aceptor de grupo amino. La acetona puede ser eliminada al someterse a ebullición con gas de nitrógeno o por la aplicación de un vacío a la solución de reacción y la eliminación de la acetona a partir de la fase gaseosa por una trampa de acetona, tal como un condensador u otra trampa fría. Alternativamente, la acetona puede ser eliminada por reducción a isopropanol utilizando una transaminasa.
En algunas modalidades de los procesos anteriores donde se elimina el subproducto de carbonilo, el donante del grupo amino correspondiente se puede agregar durante la reacción de transaminación para reponer el donante del grupo amino y/o mantener el pH de la reacción. La reposición del donante de grupo amino también cambia el equilibrio hacia la formación del producto, aumentando de este modo la conversión de sustrato a producto. Por lo tanto, en algunas modalidades en donde el donante de grupo amino es isopropilamina y el producto de acetona se elimina in situ, la isopropilamina se pueden agregar a la solución para reponer el donante de grupo amino perdido durante la extracción de acetona y para mantener el pH de la reacción (por ejemplo, a 8.5 aproximadamente) En modalidades adicionales, cualquiera de los procesos descritos anteriormente para la conversión del compuesto de sustrato a compuesto de producto puede comprender adicionalmente uno o más pasos seleccionados a partir de: la extracción; aislamiento; purificación; y cristalización del compuesto de producto. Metodos, téenicas y protocolos para extraer, aislar, purificar, y/o cristalizar la amina de producto a partir de mezclas de reacción biocataliticas producidas por los métodos anteriormente divulgados son conocidas por el experto en la materia y/o sustentado mediante la experimentación rutinaria. Además, los métodos ilustrativos se proporcionan en los Ejemplos a continuación.
Sección J: Ejemplos Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma, mientras que por otro lado representan modalidades preferidas de los pasos de reacción, intermediarios y/o el proceso de la presente invención.
Abreviaturas: d desplazamiento químico mI microlitros m m micrómetros aq acuoso (+)CSA (+) Ácido Canforsulfónico ESTP Acetato de Etilo IPA Acetato de Isopropilo TRMA T rietilamina Ac acetilo AcOH ácido acético cn br amplio O br Om multiplete ancho br. m. multiplete ancho br. mult. multiplete amplio br. s. señal ancha br. sign. señal amplia cat. cantidad catalítica compl. m multiplete complejo compl. mult. multiplete complejo 0 copl. m. multiplete complejo cpl. m . multiplete complejo CDCI3 cloroformo deuterado CH2CI2 diclorometano CH2O formaldehido dióxido de carbono d doblete dd doblete de doblete de exceso diastereoisomerico dr relación diastereoisomérica 0 DCM diclorometano DEA dietil amina DMSO dimetilsulfóxido DMSO-de dimetilsulfóxido deuterado ee exceso enantiomérico 5 equiv equivalente ES electroatomización ES + ionización por electroatomización positiva ESI ionización por electroatomización Et etilo Et20 eter dietílico EtOAc acetato de etilo EtOH etanol FTIR infrarrojo con transformación de Fourier 9 gramo(s) GC cromatografía de gases h hora(s) HCI ácido clorhídrico HCI(aq) solución acuosa de cloruro de hidrógeno HNMR resonancia magnética nuclear protónica 1HNMR resonancia magnética nuclear protónica HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento H3PO4 ácido fosfórico HRMS espectroscopia de masas de alta resolución H2SO4 ácido sulfúrico Hz hertz iPr isopropilo ¡Pr2NEt N-etildiisopropi lamina ¡PrOAc acetato de isopropilo ¡PrOH isopropanol IR infrarrojo J constante de acoplamiento K2CO3 carbonato de potasio L litro LC-MS cromatografía líquida- espectrometría de masas LC-MS cromatografía líquida- espectrometría de masas LRMS espectroscopia de masas de baja resolución m multiplete m/e relación masa a carga mg miligramo imin minuto(s) ml mililitros ml mililitros mmol(s) milimole(s) mol(s) mole(s) monosustituido. monosustituido mp punto de fusión m.p. punto de fusión mult. d múltiples dobletes m/z relación masa a carga M molaridad/molar Me metilo 2-MeTHF 2-metiltetrahidrofurano MeOH metanol MgSO4 sulfato de magnesio MS espectrometría de masas [MS]+ masa de aducto de protones MTBE eter terc-butilmetílico nm nanómetro N átomo de nitrógeno N2 nitrógeno NaCI cloruro de sodio Na2CO3 carbonato de sodio NaHC03 bicarbonato de sodio NaHMDS bis(trimetilsilil)amida de sodio NaOH hidróxido de sodio Na2S04 sulfato de sodio NH4CI cloruro de amonio NMR resonancia magnética nuclear oct. octeto ppm partes por millón psi libras por pulgada cuadrada Pd/C paladio sobre carbono Pd(PPh3)4 tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) Pt/C platino sobre carbono q cuarteto Rh/C rodio sobre carbono RT = rt temperatura ambiente s singulete sev. brm varios multipletes anchos sev. dd varios dobletes de dobletes t tripleta temp. temperatura T temperatura ÍR tiempo de retención tBu butilo terciario TEA trietilamina TFA ácido trifluoroacetico THF tetrahidrofurano Tol tolueno UV luz ultravioleta vol. volumen wt. peso Ejemplo 1 : : Síntesis de Intermediarios de cetona 6-Cloro-5-fluoro-3-hidroxi-3-(2-oxo-propil)-1 ,3-dihidro-indol-2-ona A la suspensión de 6-cloro-5-fluoro-isatina (25 gramos, 125 milimoles) en acetona (620 mililitros), se le agregó Et2NH (0.9 gramos, 12.5 milimoles) y K2CO3 (1 .7 gramos, 12.5 milimoles). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 horas. Después se enfrió a temperatura ambiente. Después de enfriar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió nuevamente en MeOH (300 mililitros) a 50° C y se agregó agua (300 mililitros). Con la adición de agua, el sólido se precipitó. El MeOH (250 mililitros) se eliminó a presión reducida a 50° C. La mezcla se enfrió a 0-5° C y se agitó durante 30 minutos; el sólido se filtró y se secó para producir 6-cloro-5-fluoro-3-hidroxi-3-(2-oxo-propil)-1 ,3-dihidro-indol-2-ona (27 gramos). 1H NMR (DMSO-d6): 2.00 (3H, s, CH3), 3.09 (1 H, d, CH, J = 16Hz), 3.39 (1 H , d, CH, 5 =16Hz), 6.16 (1 H, s, OH); 6.88 (1 H, d, CH J =8Hz), 7.36 (1 H , d, CH, J =12Hz), 10.37 (1 H, s, NH). MS (ESI) m/z 258.0 (M + H)+ Metodo HPLC: Columna: Agilent Extend-C18; 150x3. Omm; 3.5 miti. Fase Móvil A (H3P04 al 0.1 por ciento) en agua; Fase Móvil B (Acetonitrilo). Gradiente: 0 min (95 por ciento A); 0.5 min (95 por ciento A), 14 min (5 por ciento A), 19.5 min (5 por ciento A). Tasa de flujo: 0.5 mi min-1. Longitud de onda: 210 nm Temperatura: 40° C Tiempo de retención: 7.52 min. 6-Cloro-5-fluoro-3-hidroxi-3-(2-metil-[1 ,3]dioxolan-2-ilmetil)-1 ,3-dihidro-indol-2-ona A la suspensión de 6-cloro-5-fluoro-3-hidroxi-3-(2-oxopropil) indolin-2-ona (25 gramos, 97 milimoles) en eti le ng I icol (250 mililitros) se le agregó ortoformato de trietilo (43 gramos, 291 milimoles) y monohidrato del ácido tolueno-4-sulfónico (0.9 gramos, 4,8 milimoles). La mezcla de reacción se calentó a 40-50° C durante 2 horas. Sucesivamente se le agregó solución acuosa de MeTHF (500 mililitros) y NaCI al 10 por ciento (500 mililitros). La capa orgánica se separó y se lavó con agua dos veces. Después de evaporar el solvente al vacío, el sólido blanco se lavó con TBME (400 mililitros) y se secó para producir la 6-cloro-5-fluoro-3-hidroxi-3-(2-metil-[ ,3]dioxolan-2-ilmetil)-1 ,3-dihidro-indol-2-ona (27.8 gramos). 1H NMR (DMSO-d6): 1.00 (3H, s, CH3), 2.37 (2H, d, CH2 ), 3.13 (1 H, q, CHH ), 3.58 (1 H, q, CHH ), 3.59 (1 H, q, CHH ), 3.68 (1 H, q, CHH ), 6.00 (1 H, s, OH); 6.85 (1 H, d, CH 5 =8Hz), 7.31 (1 H, d, CH, J = 12Hz), 10.24 (1 H , s, NH). MS (ESI) m/z 302.0 (M + H)+ HPLC método: Columna: Agilent Extend-C18; 150x3. Omm; 3.5 pm. Fase Móvil A (H3PO4 al 0.1 por ciento) en agua; Fase Móvil B (Acetonitrilo). Gradiente: 0 min (95 por ciento A); 0.5 min (95 por ciento A), 14 min (5 por ciento A), 19.5 min (5 por ciento A), Tasa de flujo: 0.5 mi min-1. Longitud de onda: 210 nm Temperatura: 40° C Tiempo de retención: 7.94 min. 1 -(6-Cloro-5-fluoro-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona A la solución de 6-cloro-5-fluoro-3-hidroxi-3-((2-metil-1 ,3-dioxolan-2-il)-metil)-¡ndolin-2-ona (27.8 gramos, 92milimoles) en THF (250 mililitros), se le añadió lentamente Red-al (79.8 gramos, 276 milimoles) en THF (100 mililitros) a 60° C en atmósfera de N2. Después de la adición, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se agregó HCI al 20 por ciento (400 mililitros) y la mezcla se agitó durante 20 minutos. Se agregó acetato de etilo (500 mililitros) y se agitó durante 10 minutos. La capa orgánica se separó y se lavó con agua (100 mililitros, 2 veces); Después se trató con Na2SO4 (50 gramos) y carbón activo (5 gramos) a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y el filtrado se concentró. El producto crudo se recristalizó con MeOH (80 mililitros) y agua (60 mililitros) para producir la 1 -(6-cloro-5-fluoro-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona (15.5 gramos).
? NMR (DMSO-d6): 2.21 (3H, s, CH3), 3.78 (2H, s, CH2,), 7.13 (1 H, d, CH, J = 4Hz); 7.23 (1 H, d, CH, J =8Hz), 7.33 (1 H, d, CH, J =8Hz), 8.23 (1 H, s, NH).
MS (ESI) m/z 226.0 (M + H)+.
Método HPLC: Columna: Agilent Extend-C18; 150x3. Omm; 3.5 mhi. Fase Móvil A (H3P04 al 0.1 por ciento) en agua; Fase Móvil B (Acetonitrilo). Gradiente: 0 min (95 por ciento A); 0.5 min (95 por ciento A), 14 min (5 por ciento A), 19.5 min (5 por ciento A). Tasa de flujo: 0.5 mi min-1. Longitud de onda: 210 nm Temperatura: 40° C Tiempo de retención: 10.75 min.
Ejemplo 2: Segunda Síntesis Alternativa del Material de Partida Cetona 1 -(6-Cloro-5-fluoro-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona Bajo N2, se cargó Pt/C (10 gramos, Pt sobre carbono al 5 por ciento) a la suspensión de 6-cloro-5-fluoro-3-((Z)-2-nitro-propenil)-1 H indol (100 gramos, 0.39 moles) en acetato de etilo (500 mililitros). La mezcla de reacción se aspiró y se purgó con H2 tres veces y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El catalizador se filtró y el disolvente orgánico se eliminó a presión reducida para proporcionar un aceite marrón. El aceite se re-disolvió en EtOH (500 mililitros) y se agregó bisulfito de sodio (81.7 gramos, 0.79 moles) en H2O (). La mezcla se calentó hasta 80°C durante la noche. El precipitado se separó por filtración y el etanol se eliminó bajo presión. El residuo se diluyó con agua (500 mililitros) y se extrajo con acetato de etilo (300 mililitros, 2 veces). La capa orgánica combinada se secó sobre Na-2SO4 y se condensó en el rotovapor para proporcionar un aceite marrón (53 gramos, rendimiento del 60 por ciento).
Ejemplo 3: Segunda Síntesis Alternativa del Intermediario de Cetona 1 -(6-Cloro-5-fluoro-1 H-indol-3-il)-propan-2-ona Se cargó Raney/Ni (0.75 gramos) y ácido acetico (1 , 1 mililitros, 19.6 milimoles) a la suspensión de 6-cloro-5-fluoro-3-((Z)-2-nitro-propenil)-1 H-indol (5 gramos, 19.6 milimoles) en la mezcla de MeOH y H2O (2:1 , 50 mililitros) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se aspiró y se purgó con H2 tres veces y se calentó 50° C durante la noche. Se agregó MeOH (50 mililitros) a la mezcla de reacción y el catalizador se filtró sobre Celite. El solvente se concentró a 50 militros y se agregó H20 (300 mililitros). Con la adición de H20, se produjo un sólido blancuzco. El sólido se filtró y se lavó con agua. Después de secar en el horno, se aisló 2.53 gramos de sólido blancuzco.
Ejemplo 4: Síntesis, Optimización y Cribado de Polipéptidos Diseñados en Transaminasa Síntesis v Optimización de Genes: La secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de transaminasa omega tipo silvestre reportado a partir de Vibrio fluvialis de la SEQ ID NO: 2 se optimizó en su secuencia de codones y se sintetizó como el gen de la SEQ ID NO: 1. El gen sintético de la SEQ ID NO: 1 se clonó en un sistema de vectores pCK1 10900 (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. 20060195947, que se incorpora como referencia en este documento) y posteriormente se expresa en E. coli W31 10fhuA. La E. coli W3110 expresa los polipe ptidos de transaminasas como una proteína intracelular bajo el control del promotor lac. El polin ucleótido (SEQ ID NO: 3) que codifica el polipéptido de transaminasa modificado de la SEQ ID NO: 4 se obtuvo mediante evolución dirigida de la SEQ ID NO: 1 del gen optimizado en codón. El polipéptido de SEQ ID NO:4 tiene 24 diferencias de residuos aminoácidos (A9T; G 18A; D21 H; V31 M ; N45H; F86Y ; A133R; R 146L; W147K; V153S ; K163F; V177L; R21 1 K; P233T ; A235P; P244T; M294V; P318D; A323T; S324G; A383V; T391 A; C424A; F427Y) con relación a SEQ ID NO:2. Esta SEQ ID NO: 3 DEL gen sintético (que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 4) se utilizó como la columna vertebral de partida para una optimización adicional usando métodos estándar de evolución dirigida a través de la generación de bibliotecas iterativas variantes por síntesis de genes seguido por la detección y secuenciación de los aciertos para generar genes que codifican las transaminasas modificadas capaces de convertir el compuesto (IA) en el compuesto (IIA) con propiedades enzimáticas mejoradas con respecto a las SEQ ID NOs: 2 y 4 de polipéptidos. 2 y 4. Las secuencias resultantes de polipéptidos de transaminasas modificadas y mutaciones específicas y actividades relativas se enumeran en la Tabla 2A.
Ejemplo 5: Producción de Transaminasas Modificadas Los polipéptidos de transaminasas modificadas fueron producidos en E. coli W3110 como una proteína intracelular expresada bajo el control del promotor lac. El polipéptido se acumula principalmente como una enzima activa citosólica soluble. Un procedimiento de agitación en frasco se utiliza para generar polvos de polipéptidos modificados que se pueden utilizar en ensayos de actividad o procesos biocatalíticos descritos en este documento.
Crecimiento v expresión de alto rendimiento. Las células se recogieron y se cultivaron durante la noche en medio LB que contenía glucosa al 2 por ciento y 30 mg/mL de cloranfenicol (CAM), 30°C, 200 rpm, 85 por ciento de humedad. 20 mL de crecimiento durante la noche se transfirieron a una placa de pozos profundos que contenía 380 pL de medio de crecimiento 2xYT conteniendo 30 pg/mL de CAM , IPTG 1 mM , MgS04 1 mM , y se incubó durante 18 horas aproximadamente a 30°C, 200 rpm, 85 por ciento de humedad. El medio de subcultivo TB se componía de medio TB (380 microlitros/pozo), 30 pg/mL de CAM , MgS04 1 mM , y IPTG 1 mM . Los cultivos celulares se centrifugaron a 4000 rpm, 4°C durante 10 min., y los medios se desecharon. Los pellets celulares se resuspendieron en 200 o 400 pL de búfer de tisis (0.1 M de trietanolamina (TEA), pH 9.0, que contiene MgS04 1 mM, 400 pg/ml de PMBS y 500 pg/mL de lisozima), como se describe a continuación.
Producción de Polvos al Agitar el Matraz (SFP): Un procedimiento de agitación en frasco se utilizó para generar polvos polipeptídicos de transaminasas diseñados y utilizados en ensayos de selección secundaria o en el proceso biocatalítico descrito en este documento. El polvo agitado en matraz (SFP) incluye la proteína total de aproximadamente 30 por ciento y, en consecuencia proporciona una preparación más purificada de una enzima modificada en comparación con el lisado celular utilizado en ensayos HTP. Una sola colonia microbiana de E.coli conteniendo un plásmido que codifica una transaminasa modificada de interes se inoculó en 50 mi de caldo de Luria Bertani conteniendo 30 mg/ml de cloramfenicol y glucosa al 2 por ciento. Las células se cultivaron durante la noche (al menos 16 horas) en una incubadora a 30°C con agitación a 250 rpm. El cultivo se diluyó en 250 mi de caldo Terrific Broth (12 gramos/litro de Bacto-triptona, 24 gramos/litro de extracto de levadura, 4 mL/L de glicerol, fosfato de potasio 65 mM, pH 7.0, MgS04 1 mM) que contiene 30 pg/ml de cloranfenicol, en un matraz de 1 litro a una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0.2 y se dejó crecer a 30°C. La expresión del gen de transaminasas se induce mediante la adición de isopropil-b -D-tiogalactosida ("IPTG") a una concentración final de 1 mM cuando la DO600 del cultivo es de 0.6 a 0.8 y la incubación se continúa luego durante la noche (al menos 16 horas). Las células se recogen por centrifugación (5000 rpm, 15 min, 4°C) y el sobrenadante se desechó. El peí let celular se resuspendió con un volumen igual de búfer trietanolamina 100 mM fría (4°C) (cloruro), pH 7.0 (opcionalmente incluyendo MgS04 2 mM), y se cosechó por centrifugación como antes. Las células lavadas se resuspenden en dos volúmenes de búfer de trietanolamina fría (cloruro) y pasan dos veces a través de una prensa francesa a 12.000 psi, mientras que se mantienen a 4°C. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación (9.000 rpm, 45 minutos, 4°C). El sobrenadante lisado claro fue recogido y almacenado a -20°C. La liofilización de Usado claro congelado proporciona un polvo seco de agitación en matraz de polipéptido de transaminasa crudo. Alternativamente, el pellet celular (antes o después del lavado) se puede almacenar a 4°C o -80°C.
Producción de polvos de proceso aguas abajo (DSP): Los polvos DSP contienen proteína total de aproximadamente 80 por ciento y, en consecuencia proporcionan una preparación más purificada de la enzima transaminasa modificada en comparación con el lisado celular utilizado en el ensayo de alto rendimiento. La fermentación a gran escala (~100 - 120 gramos) de la transaminasa modificada para la producción de polvos DSP puede llevarse a cabo como un lote corto seguido de un proceso alimentado por lotes de acuerdo con métodos estándar de bioprocesos. Brevemente, la expresión transaminasa es inducida por la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM . Después de la fermentación , las células se recogen y se resuspenden en búfer de trietanolamina H2SO4 100 mM, luego se alteran mecánicamente por homogeneización. Los restos celulares y ácido nucleico se floculados con polietilenimina (PEI) y la suspensión clarificada por centrifugación. El sobrenadante claro resultante se concentró usando una membrana de ultrafiltración de flujo transversal tangencial para eliminar sales y agua. La enzima concentrada y parcialmente purificada se puede secar entonces en un liofilizador y se envasa (por ejemplo, en recipientes de polietileno).
Ejemplo 6: Procedimientos Analíticos Análisis HPLC de Reacciones HTP: Una alícuota de la reacción inactivada se somete a análisis HPLC bajo las siguientes condiciones.
La conversión del compuesto (IA) al compuesto ( 11 A) se determinó a partir de los cromatogramas resultantes como sigue: Conversión (por ciento) = Área de Producto / (Área de Producto + Área de Sustrato x 0.73) x 100 por ciento Análisis HPLC de Reacciones a Escala de 5 mL y 100 mL: Una alícuota de la reacción inactivada se somete a análisis HPLC bajo las siguientes condiciones.
La conversión del compuesto (IA) al compuesto (NA) se determinó a partir de los cromatogramas como sigue: Conversión (por ciento) = Área de Producto / (Área de Producto + Área de Sustrato x 0.73) x 100 por ciento Determinación de la pureza auiral del producto : La pureza quiral o exceso enantiomérico del compuesto (I I A) se evaluó por HPLC usando las siguientes condiciones.
Determinación de la pureza del producto: La pureza del producto se determinó por HPLC usando las siguientes condiciones.
Ejemplo 7: Cribado de Alto Rendimiento (HTP) de Transaminasas para la Conversión del Compuesto (IA) al Compuesto (HA) Ensayos de Cribado HTP: La selección de alto rendimiento utilizada para guiar la selección primaria de variantes, se llevó a cabo en placas de 96 pozos utilizando Usados celulares bajo condiciones de ensayo de 10 gramos/litro de compuesto (IA); fosfato de piridoxal 1 mM (PLP); isopropilamina 2M (IPM), pH 7.0); trietanolamina 0.1 M (TEA), pH 7; 5 por ciento volumen/volumen PEG200; 10 microlitros de Usado; y 50 o 55°C.
Las células se cultivaron en placas de 96 pozos como se describe anteriormente y se prepararon Usados mediante la dispensación de 200 microlitros (para la Ronda 1 ) o 400 microlitros (para la Ronda 2) de búfer de lisis (1 mg/m L de lisozima, 0.5 mg/m L de sulfato de polimixina B, PLP 1 mM , trietanolamina 0.1 M (TEA), pH 7.0) en cada pozo. Las placas se sellaron, se agitaron durante 2 horas, y después se centrifugaron durante 20 min a 4000 rpm a 4°C para sedimentar los desechos celulares.
Se agregaron 10 microlitros de solución de sustrato concentrado (200 gramos/litro de compuesto (IIA) disuelto en PEG200) a cada pozo de una placa de 96 pozos seguido de 180 microlitros de una solución concentrada de isopropilamina (MIP) / fosfato de piridoxal (PLP) (IPM 2.2 M y PLP 1 .06 mM en TEA 100 mM , pH 7.0. Para la evaluación de la refractariedad de la inhibición del compuesto producto (IIA), se añadió el compuesto (IIA) a la mezcla de reacción a una concentración final de 14 gramos/litro para la primera vez y 16 gramos/litro para la segunda vez de los ensayos. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 10 microlitros de Usado celular/pozo. Las placas se sellaron y se incubaron con agitación a 50 o 55°C durante 24 h. Las reacciones se inactivaron con 600 microlitros de acetonitrilo y las muestras se examinaron por H PLC como se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 8: Proceso para la Conversión del Compuesto (IA) al Compuesto (I I A) en Escala de 5 mL Las reacciones a escala de 5 mi se llevaron a cabo como sigue. A un vial de vidrio de 20 mililitros equipado con una barra de agitación magnética en forma de cruz se añadió 0.75 mililitros (o 0.5 mililitros en el caso de 10 por ciento volumen/volumen de concentración de PEG 200) de búfer de TEA 100 mM (pH 7.0). Se agregaron 2 mililitros de solución concentrada de IPM 5 M«HCI al vial seguido por 1 mililitros de solución concentrada de PLP 5 mM. La mezcla se agitó a 500 rpm (agitación magnética). El pH de la mezcla se ajustó a 7.0 usando solución de NaOH 1 M . Luego se agregó 125 mligramos de sustrato (sólido) (o concentración de 250 miligramos para 50 gramos/litro o 500 miligramos para 100 gramos/litro) al vial. Luego se agregó 0.25 mL (o 0.5 mililitros para 10 por ciento volumen/volumen) de PEG 200 a la mezcla. Las concentraciones finales de los componentes fueron: 25 gramos/litro (o 50 o 100 gramos/litro) del compuesto (IA); PLP 1 mM; IPM 2M ; 5 por ciento volumen/volumen (o 10 por ciento) PEG 200; 2 gramos/litro de enzima TA; TEA 100 mM , pH 7.0). Luego la mezcla se agitó y se calentó a 50°C.
Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 1 mililitros de la solución concentrada enzimática (10 gramos/litro). Se tomaron muestras de 20 microlitros en diferentes puntos de tiempo y se diluyeron con 750 microlitros de metanol y se analizaron por HPLC . Después de 24 horas, las mezclas de reacción se apagaron con 5 mililitros de acetonitrilo y las muestras se analizaron por HPLC para obtener el porcentaje de conversión final.
Ejemplo 9: Proceso para la Conversión del Compuesto <l A) al Compuesto (HA) en Escala de 100 mililitros La reacción a escala de 100 mililitros se llevó a cabo como sigue. A un matraz de fondo redondo de 250 mililitros con una paleta de agitación en forma de ancla, se añadió 15 mililitros de búfer de TEA 100 mM (pH 7). 40 mililitros de solución concentrada de IPM 5 M»HCI se le agregó al vial de fondo redondo seguido por 20 mililitros de la solución concentrada de PLP 5 mM. La mezcla se agitó a 100 rpm (agitación superior) y el pH se ajustó a 7.0 usando NaOH 10 M. Luego se agregó compuesto de sustrato sólido (IA) al matraz de fondo redondo durante ~ 5 min con agitación. Luego se añadió PEG 200 (5 mililitros) y la mezcla se calentó a 50°C. Lugo se añadieron 20 mililitros de la solución concentrada enzimática (10 gramos/litros) para iniciar la reacción. La reacción se agitó a 200 rpm (agitación superior). Se tomaron muestras de 20 microlitros en diferentes puntos de tiempo y se diluyeron con 750 microlitros de metanol y se analizaron por MPLC. En algunos casos, cuando no se prosiguió el procesamiento adicional, despues de 24 h, las mezclas de reacción se inactivaron con 100 mililitros de acetonitrilo y muestras se analizaron por HPLC para obtener el porcentaje de conversión final (Figura 9). Concentración de diferentes componentes en la reacción: cetona: 25 gramos/litro (o 50 o 100 gramos/litro); PLP: 1 mM; IPM: 2 M; PEG200: 5 por ciento volumen/volumen; enzima TA:2 gramos/litro; búfer: TEA 100 mM, pH 7.0. La conversión de sustrato a producto se analizó por HPLC como se describe en el Ejemplo 3.
Tratamiento del Producto: Después de reacción de 24 horas bajo las condiciones descritas anteriormente (hasta el punto 1 1 ) la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado G4 estándar con un trozo de papel de filtro (Whatman 1 , tamaño de poro 1 1 mieras). El matraz de fondo redondo se enjuagó con 20 mililitros de agua desionizada que después se filtró a través del mismo embudo. La torta del filtro se lavó dos veces con 20 mililitros de agua desionizada. El pH del filtrado se ajustó de 6.8 a 3 utilizando una solución de HCI 5M . Después, el filtrado se transfirió a un embudo de separación y se extrajo con 100 mililitros de MTBE. La mezcla bifásica se dejó separar. La capa de MTBE que contiene sustrato sin reaccionar y las impurezas, se descartó. La capa acuosa se transfirió a un vaso de precipitados y se añadieron 100 mililitros de MTBE. El pH de la capa acuosa se ajustó de 3 a 10 usando solución de NaOH 10 M . La mezcla se transfirió a un embudo de separación y las fases se dejaron separar. La capa acuosa se extrajo con 100 mililitros de MTBE tres veces (nb: se repite hasta que el producto no estuvo presente en la capa acuosa). Las fases de MTBE a partir de las tres extracciones se combinaron y se evaporaron a sequedad usando un evaporador rotatorio. El producto cudo se secó adicionalmente al vacío durante 48 horas.
Ejemplo 10: Proceso para la Conversión del Compuesto (IA) al Compuesto (NA) a Escala de 30g ' ' 458.97 152.48 gramos de hidrocloruro de isopropilamina y 0.204 gramos de monohidrato de piridoxalfosfato se disolvieron en 495 mililitros de agua mientras se agitaba. A esta solución transparente de color amarillo se agregó una solución de 30.0 gramos de cetona en 85 mililitros de glicol de polietileno (peso molecular medio 200) en 15 minutos. Tras la adición, la cetona se precipita como partículas finas que se distribuyen de manera uniforme en el medio de reacción. A la suspensión se agregó 180 mililitros de búfer de trietanolamina (0.1 moles/litro, pH 7) y el pH se ajustó a 7 mediante la adición de solución de hidróxido de sodio acuoso (1 mol/litro). La mezcla de reacción se calentó a 50°C y se agregó una solución de 1 .62 gramos de transaminasa SEQ ID NO: 134 disuelta en 162 mililitros de búfer de trietanolamina (0.1 moles/litro, pH 7). La mezcla de reacción se mantuvo continuamente a pH 7 por adición de 1 mol/litro de solución de hidróxido de sodio acuoso. La mezcla de reacción se agitó 24 horas a 50°C y una corriente de nitrógeno se sopló sobre la superficie de la mezcla de reacción para desprender la acetona formada. Luego la mezcla de reacción se enfría a 25°C y se filtró sobre un lecho abundante de celulosa. El pH del filtrado se ajustó a «1 por adición de ácido sulfúrico concentrado. El filtrado acidificado se extrajo con 250 mililitros de acetato de iso-propilo. Las capas se separaron y el pH de la fase acuosa se ajustó a *10 mediante la incorporación de solución concentrada de hidróxido de sodio acuoso. La fase acuosa alcalinizada se extrajo con acetato de iso-propilo. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó con 100 mililitros de agua. La fase orgánica se concentra por destilación a 2/3 de su volumen de origen. En un segundo reactor se disuelve 33.98 gramos de ácido (+) alcanfor sulfónico en 225 mililitros de acetato de iso-propilo a reflujo y la fase orgánica concentrada se añade en 10 minutos. Despues de completar la adición, la suspensión delgada formada se enfrió a 0°C en 2 horas y se mantuvo a 0°C durante 15 horas. La amina precipitada -(+)- sal de sulfonato de alcanfor se filtró, se lavó con 70 mililitros de acetato de iso-propilo y se secó a 40°C al vacío proporcionando 51.57 gramos de cristales incoloros (rendimiento 84.5 por ciento) Datos Analíticos IR: v (cm 1)=3296, 3061, 2962, 2635, 2531, 2078, 1741, 1625, 1577, 1518, 1461,1415, 1392,1375,1324, 1302,1280, 1256,1226, 1170, 1126, 1096,1041,988, 966,937,868, 834,814, 790,766,746, 719, 669, 615.
LC-MS (ESI +): Ion de amonio: m/z =227 ([M + H]), 268 ([M + H + CH3CN]), 453 ([2M + H]). Ion alcanforsulfonato: m/z =250 ([M+NH4]), 482 ([2M + NH4]).
LC-MS (ESI + ): Ion alcanforsulfonato: m/z=231 ([M-H]), 463 ([2M-H]). 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): 11 .22 (br. s., 1 H), 7.75 (br. s., 3H), 7.59 (d, 5 = 10.3 Hz, 1 H), 7.54 (d, J = 6.5 Hz, 1 H), 7.36 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 3.37 - 3.50 (m, 1 H), 2.98 (dd, J = 14.3, 5.8 Hz, 1 H), 2.91 (d, J = 14.8 Hz, 1 H), 2.81 (dd, J = 14.3, 8.0 Hz, 1 H), 2.63 - 2.74 (m, 1 H), 2.41 (d, J = 14.6 Hz, 1 H), 2.24 (dt, J = 18.3, 3.8 Hz, 1 H), 1.94 (t, J = 4.4 Hz, 1 H), 1.86 (dt, J = 7.4, 3.6 Hz, 1 H), 1 .80 (d, J = 18.1 Hz, 1 H), 1.23 - 1 .35 (m, 2H), 1 .15 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.05 (s, 3H), 0.74 (s, 3H) Amina libre (obtenida por evaporación de la capa de isopropil-acetato despues de la extracción de la capa acuosa alcalinizada): 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): 11 .04 (br. s., 1 H), 7.50 (d, J = 10.5 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 6.5 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H), 3.03 (sxt, J = 6.3 Hz, 1 H), 2.61 (dd, J = 14.3, 6.5 Hz, 1 H), 2.57 (dd, J = 14.1 , 6.5 Hz, 1 H), 1.36 (br. s., 2H), 0.96 (d, J = 6.3 Hz, 3H) Ejemplo 11 : Proceso para la Conversión del Compuesto (NA) al Compuesto reflujo H 458.97 2 ) {«>-CSA 3.) intercambio de solvente a ESTP 622.54 13.62 gramos de 5-cloroisatina se suspendieron en 35 mililitros de isopropanol y se agregaron 2.3 gramos de trietilamina. La suspensión se calentó a reflujo y se leagregó una solución de 34.42 gramos de amina-(+)- sal de sulfonato de alcanfor disuelta en 300 mililitros de isopropanol dentro de 50 minutos. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 17 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 75°C y se añadieron 17.4 gramos de ácido (+)-canforsulfónico a la mezcla de reacción. Aproximadamente 300 mililitros de isopropanol se separaron por destilación al vacío. El isopropanol destilado se sustituyó por acetato de isopropilo y se continuó la destilación al vacío. Esta destilación se repitió una segunda vez. Al residuo de destilación se añadió 19 mililitros de etanol y 265 mililitros de acetato de etilo y la mezcla se calentó a reflujo. La mezcla se enfrió en rampas a 0°C y se mantuvo a 0°C durante 24 horas. Los cristales de color beige a blancuzco se separaron por filtración, se lavaron con 3 porciones (cada una 25 mililitros) de acetato de etilo preenfriado (0°C) y se secaron al vacío, produciendo 40.3 gramos de cristales de color beige a blancuzco. (Rendimiento del 86.3 por ciento).
IR: v (cm 1)= 3229, 3115, 3078, 3052,2971,2890, 2841, 2772,2722, 2675,2605, 2434,1741, 1718,1621, 1606,1483, 1460,1408, 1391, 1372, 1336,1307,1277, 1267,1238, 1202,1184, 1162,1149, 1128, 1067, 1036,987,973, 939,919, 896,871, 857,843, 785,771, 756, 717,690, 678,613.
LC-MS (ESI +); Ion de amonio: m/z =390 ([M + H]), 431 ([M + H + CH3CN]).
Ion de canforsulfonato: m/z =250 ([M+NH4]), 482 ([2M + NH4]).
LC-MS (ESI -): Ion de Canforsulfonato: m/z=231 ([M-H]), 463 ([2M-H]). 1 H NMR (DMSO-de. 600 MHz): 1 1.49 (s, 1 H), 1 1.23 (s, 1 H), 10.29 - 10.83 (m, 1 H), 9.78 - 10.31 (m, 1 H), 7.55 - 7.60 (m, 2H), 7.52 (s, 1 H), 7.40 (d, J = 6.2 Hz, 1 H), 7.16 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.52 - 4.63 (m, 1 H), 3.20 (dd, J = 16.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.96 (dd, J = 16.1 , 11 .3 Hz, 1 H), 2.90 (d, J = 15. C Hz, 1 H), 2.56 - 2.63 (m, 1 H), 2.39 (d, J = 14.6 Hz, 1 H), 2.21 (dt, J = 18.0, 3.8 Hz, 1 H), 1.89 - 1 .93 (m, 1 H), 1 .81 (ddd, J = 15.3, 7.8, 3.7 Hz, 1 H), 1.76 (d, J = 18.3 Hz, 1 H), 1 .53 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.20 1.33 (m, 2H), 0.98 (s, 3H), 0.70 (s, 3H).
Ejemplo 12: Proceso para preparar un compuesto de l< fórmula (IVA) ½ hidratado 622.54 39925 En un reactor de 750 mililitros con agitador impulsor, se disolvió 50 gramo de sal del compuesto (IVB) en 300 mililitros de etanol (ALABD) y 100 mililitros de agua desionizada (WEM). La solución clara, amarillenta se calentó a 58°C de temperatura interna. A la solución se agregaron 85 gramos de una solución acuosa de carbonato de sodio al 10 por ciento en 10 minutos. La solución transparente se filtró en un segundo recipiente de reacción. El recipiente y filtro de partículas se enjuagaron cada uno con 25 mililitros de una mezcla de etanol: agua (3: 1 volumen/volumen) en el segundo recipiente de reacción. La solución filtrada partículas combinada se calentó a 58°C de temperatura interna y se agregó por goteo 200 mililitros de agua (WEM) en 15 minutos. Hacia el final de la adición, la solución se tornó turbia. La mezcla se agitó durante 10 minutos a 58°C de temperatura interna y después se enfrió lentamente a temperatura ambiente dentro de 4 horas 30 minutos formando una suspensión blanca delgada, fácil de incorporar. A la suspensión se agregaron 200 mililitros de agua y la mezcla se agitó durante 15 horas 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. La suspensión se filtró y la torta de filtro se lavó dos veces con porciones de 25 mililitros de una mezcla de etanol: agua 9: 1 (volumen/volumen). Los cristales incoloros se secan a 60°C al vacío rindiendo 26.23 gramos (rendimiento 91.2 por ciento). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 10.70 (s, 1 H), 10.52 (s, 1 H), 7.44 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 7.33 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.83 - 4.00 (m, 1H), 3.13 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 2.77 (dd, J = 15.1, 3.8 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 15.1, 10.5 Hz, 1 H), 1.17 (d, J = 6.3 Hz, 3H).

Claims (40)

REIVINDICACIONES:
1. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (II), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (II) que comprende convertir un compuesto de la Fórmula (I) a un compuesto de la Fórmula (II), o una sal, solvato o hidrato del mismo, (l) en donde: la línea discontinua es un enlace o está ausente; A se selecciona entre C = O y C = NH; o cuando la línea discontinua es un enlace A-R8 doble es: Ra es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono CO2CH2CH3 o -CF3; y n es 1 0 2.
2. El proceso de la reivindicación 1 , en donde R5 y R6 son fluoro cuando: R8 es -CH3, y n es 1 .
3. El proceso de la reivindicación 1 , en donde R5 y R6 son fluoro y cloro cuando: R8 = -CH3, y n es 1 .
4. El proceso de la reivindicación 1 , en donde R5 y R6 son hidrógeno cuando: R8 es -CH3, y n es 1.
5. El proceso de la reivindicación 1 , en donde R5 es fluoro cuando: n es 1 , and R6 es hidrógeno.
6. El proceso de la reivindicación 1 , en donde el compuesto de la fórmula (II) es de la fórmula (IIA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (HA).
7. El proceso de la reivindicación 1 , en donde el compuesto de la fórmula (II) se convierte a partir del compuesto de la fórmula (I) bajo una condición seleccionada entre transaminación enzimática, catálisis asimétrica química, reducción asimétrica y resolución quiral, o una combinación de dos o más condiciones.
8. El proceso de la reivindicación 1 , en donde A es C=0.
9. El proceso según la reivindicación 1 , en donde el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (IA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (IA).
10. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula ( 11 A) , o una sal o hidrato o solvato del mismo, (HA) el cual comprende transaminar enzimáticamente un compuesto de la fórmula (IA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (IA). para formar el compuesto de la fórmula (IIA).
11 . Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la enzima es SEQ ID NO: 134.
12. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (IV), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (IV) que comprende hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (III) o una sal o hidrato o solvato del mismo, (III) con un compuesto de la Fórmula (II) o una sa o hidrato o solvato del mismo, (II) en donde el compuesto de la Fórmula (II), o una sal o hidrato o solvato del mismo, se prepara a partir de un compuesto de la Fórmula (I), o una sal o hidrato o solvato del mismo, (l) en donde: la línea discontinua es un enlace o está ausente; A se selecciona entre C = O y C = NH; o cuando I línea discontinua es un enlace A-R8 doble es: Ra es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R1 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un amino, alquil-(de 1 a 6 átomos de carbono)-amino, a Iq u i I - (d e 1 a 6 átomos de carbono)-di-alquilamino o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono)-C(O)NH-alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R4 y R7 son cada uno, independientemente, H o halo; R5 y R6 son cada uno, independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), trihalo-alquilo (1 átomo de carbono), ciano o alcoxilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R8 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un hidroxilo; n es 1 o 2; R1 es hidrógeno o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); y R4 , R5 , R6 y R7 , son cada uno, independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), y alquiloxilo (de 1 a 6 átomos de carbono).
13. El proceso de la reivindicación 12, en donde R5 y R6 son fluoro cuando: R8 es -CH3, y n es 1.
14. El proceso de la reivindicación 12, en donde R5 y R6 son fluoro y cloro cuando: R8 es -CH3, y n es 1.
15. El proceso de la reivindicación 12, en donde R5 y R6 son hidrógeno cuando: R8 es -CH3, y n es 1 .
16. El proceso de la reivindicación 12 en donde R5 es flúor cuando: n es 1 and R6 es hidrógeno.
17. El proceso de la reivindicación 12, en donde R1 es H, -CH3, -CF3; y n es 1 o 2.
18. El proceso de la reivindicación 12, en donde el compuesto de la fórmula (II) es de la fórmula (NA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (HA).
19. El proceso de la reivindicación 12, en donde R5' es un halo.
20. El proceso de la reivindicación 12, en donde R5 es un cloro, y R1 , R4 , R6 y R7 son cada uno hidrógeno.
21 . El proceso de la reivindicación 12, en donde el compuesto de la fórmula (II I) es de la fórmula (MIA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (I IIA).
22. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (IVA), o una sal o solvato o hidrato del mismo, (IVA) que comprende hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (MIA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (NIA) con un compuesto de la Fórmula (II) o una sal o solvato o hidrato del mismo, (NA) para proporcionar el compuesto de la Fórmula (IVA) o una sal o solvato o hidrato del mismo, en donde el compuesto de la Fórmula (HA) se prepara a partir del compuesto de la Fórmula (IA), o una sal o hidrato o solvato del mismo,
23. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 12- 22 en donde la enzima es SEQ ID NO: 134.
24. El proceso de la reivindicación 22, en donde el compuesto de la fórmula (HA) se convierte en una sal de la fórmula ( 11 B ) : (l l B) antes de la reacción con el compuesto de fórmula (MIA).
25. El proceso de la reivindicación 22, en donde la reacción se lleva a cabo bajo condiciones alcalinas.
26. El proceso de la reivindicación 22, en donde la reacción se lleva a cabo en la presencia de amina de trietilo.
27. El proceso de la reivindicación 22, en donde el compuesto de la fórmula (IVA) se aísla como una sal de la fórmula (IVB): , (IVB)
28. El proceso de la reivindicación 22, en donde la sal de la fórmula (IVB) se convierte en el compuesto de la fórmula (IVA) en base libre.
29. El proceso de la reivindicación 28, en donde la conversión se lleva a cabo con carbonato de sodio.
30. El proceso de la reivindicación 22, en donde el compuesto de la fórmula (IVA) es un hidrato.
31 . El proceso de la reivindicación 22, en donde el compuesto de la fórmula (IVA) es un ½ hidrato.
32. El proceso de la reivindicación 22, en donde el compuesto de la fórmula (IVA) se muele despues del aislamiento.
33. Un compuesto de la Fórmula (IC): (IC) en donde: R1 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un amino, alquilo-(de 1 a 6 átomos de carbono)-amino, alquilo-(de 1 a 6 átomos de carbono)-di-alquilamino o alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono)-C(O)NH-alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R5 y R6 son cada uno, independientemente hidrógeno, halo, hidroxilo, alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), trihalo-alquilo (1 átomo de carbono), ciano o alcoxilo (de 1 a 6 átomos de carbono); R8 es alquilo (de 1 a 6 átomos de carbono), opcionalmente sustituido por un hidroxilo; n es 1 o 2; o una sal o solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.
34. El compuesto de la reivindicación 33, en donde R5 y R6 son flúor cuando: R8 es -CH3, y n es 1 .
35. El compuesto de la reivindicación 33, en donde R5 y R6 son flúor y cloro, cuando: R8 es -CH3, y n es 1 .
36. El compuesto de la reivindicación 33, en donde R5 y R6 son hidrógeno cuando: R8 es -CH3, y n es 1 .
37. El compuesto de la reivindicación 33, en donde R5 es flúor cuando: n es 1 y R6 es hidrógeno.
38. El compuesto de la reivindicación 33, en donde R1 es H, CH3, R5 es H, -OH, -CH3, -OCH3 -F, -01, -CF3 o -CN; R6 es H, -OH , -OCH3, -F O -Cl; R8 es H, -CH3, -CH2CH3 -CH2OH, -CO2H, -C02CH3 -C02CH2CH3 o -CF3; y n es 1 o 2;
39. El compuesto de la reivindicación 33, en donde el compuesto es de la fórmula (IA): (IA); o una sal o hidrato o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.
40. Un compuesto seleccionado a partir de: o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
MX2014011489A 2012-03-23 2013-03-22 Proceso quimico para preparar espiroindolonas e intermediarios de las mismas. MX354023B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012000359 2012-03-23
PCT/EP2013/056170 WO2013139987A1 (en) 2012-03-23 2013-03-22 Chemical process for preparing spiroindolones and intermediates thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014011489A true MX2014011489A (es) 2015-05-11
MX354023B MX354023B (es) 2018-02-08

Family

ID=48048006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014011489A MX354023B (es) 2012-03-23 2013-03-22 Proceso quimico para preparar espiroindolonas e intermediarios de las mismas.

Country Status (21)

Country Link
US (1) US9598712B2 (es)
EP (2) EP2828256B1 (es)
JP (1) JP6117906B2 (es)
KR (1) KR102057590B1 (es)
AP (1) AP2014007906A0 (es)
AU (1) AU2013237330C1 (es)
BR (1) BR112014022909B1 (es)
CA (1) CA2866222C (es)
CY (1) CY1122087T1 (es)
DK (1) DK2828256T5 (es)
ES (2) ES2748460T3 (es)
HK (1) HK1202289A1 (es)
HR (1) HRP20191632T1 (es)
HU (1) HUE046421T2 (es)
LT (1) LT2828256T (es)
MX (1) MX354023B (es)
PL (1) PL2828256T3 (es)
PT (1) PT2828256T (es)
RU (1) RU2662815C2 (es)
SI (1) SI2828256T1 (es)
WO (1) WO2013139987A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3233852T3 (da) 2014-12-18 2020-09-14 Hoffmann La Roche Tetrahydro-pyrido[3,4-b]indoler som østrogenreceptormodulatorer og anvendelser deraf
JP2017024992A (ja) * 2015-07-15 2017-02-02 公益財団法人微生物化学研究会 化合物の製造方法
PE20211207A1 (es) 2018-06-21 2021-07-05 Hoffmann La Roche Formas solidas de 3-((1r,3r)-1-(2,6-difluoro-4-((1- (3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2h-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2,2-difluoropropan-1-ol y procesos para preparar compuestos triciclicos fusionados que comprenden un resto fenilo o piridinilo sustituido, incluidos metodos para su uso
EP4133064A4 (en) 2020-04-10 2024-07-24 Codexis Inc GENETICALLY ENGINEERED TRANSAMINASE POLYPEPTIDES
WO2022066534A1 (en) * 2020-09-28 2022-03-31 Codexis, Inc. Engineered biocatalysts and methods for synthesizing chiral amines

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2947758A (en) * 1959-04-28 1960-08-02 Searle & Co 3-(omega-hydrazino) alkylindoles
GB974895A (en) * 1961-04-06 1964-11-11 Parke Davis & Co Process for the production of amine compounds
GB974893A (en) * 1961-04-06 1964-11-11 Parke Davis & Co Amine compounds and means of producing the same
US3183170A (en) 1961-10-03 1965-05-11 Sanraku Ocean Kabushiki Kaisha Method of l-amino acid manufacture
BE795457A (fr) * 1972-02-16 1973-08-16 Clin Midy Amines indoliques, leur preparation et leur application en therapeutiques
US4073795A (en) * 1976-06-22 1978-02-14 Hoffmann-La Roche Inc. Synthesis of tryptophans
US4331818A (en) * 1980-03-19 1982-05-25 The Procter & Gamble Company Chiral phospine ligand
DE3307095A1 (de) * 1983-03-01 1984-09-06 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Mikrobiologisch hergestellte l-phenylalanin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung
US4518692A (en) * 1983-09-01 1985-05-21 Genetics Institute, Inc. Production of L-amino acids by transamination
DE3482982D1 (de) 1983-09-01 1990-09-20 Genetics Inst Herstellung von l-aminosaeuren durch transaminierung.
US4859591A (en) * 1984-07-05 1989-08-22 W. R. Grace & Co.-Conn. Transamination process for producing amino acids
US4826766A (en) * 1985-09-23 1989-05-02 Genetics Institute, Inc. Production of amino acids using coupled aminotransferases
EP1654354A1 (en) 2003-08-11 2006-05-10 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
US7541091B2 (en) 2004-05-18 2009-06-02 M & G Usa Corporation Compartmentalized resin pellets for oxygen scavenging
US8043836B2 (en) * 2004-10-05 2011-10-25 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing amino acid derivative from hydroxyimino acid
WO2008050207A1 (en) * 2006-10-25 2008-05-02 Pfizer Limited Heterocyclic compounds useful as anabolic agents for livestock animals
WO2008108998A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Richmond Chemical Corporation Method to increase the yield and improve purification of products from transaminase reactions
MX2010011868A (es) * 2008-04-29 2010-11-26 Novartis Ag Derivados de espiro-indol para el tratamiento de enfermedades parasitarias.
AT507050B1 (de) * 2008-06-17 2010-06-15 Angewandte Biokatalyse Kompete Verfahren zur herstellung von aminen unter verwendung von omega-transaminasen
EP2385983B1 (en) * 2009-01-08 2017-12-20 Codexis, Inc. Transaminase polypeptides
PT2593556T (pt) * 2010-07-14 2017-12-11 Dpx Holdings Bv Método enzimático de (r)-aminação seletiva
US9139821B2 (en) * 2012-03-23 2015-09-22 Codexis, Inc. Biocatalysts and methods for synthesizing derivatives of tryptamine and tryptamine analogs

Also Published As

Publication number Publication date
RU2014142621A (ru) 2016-05-20
CY1122087T1 (el) 2020-11-25
ES2748460T3 (es) 2020-03-16
DK2828256T3 (da) 2019-10-07
WO2013139987A1 (en) 2013-09-26
CA2866222C (en) 2022-01-11
HRP20191632T1 (hr) 2019-12-13
EP3578557A1 (en) 2019-12-11
EP2828256A1 (en) 2015-01-28
AP2014007906A0 (en) 2014-08-31
EP3578557B1 (en) 2023-09-20
HUE046421T2 (hu) 2020-02-28
ES2962530T3 (es) 2024-03-19
KR20140137374A (ko) 2014-12-02
JP2015512381A (ja) 2015-04-27
CA2866222A1 (en) 2013-09-26
AU2013237330A1 (en) 2014-09-25
SI2828256T1 (sl) 2019-11-29
AU2013237330C1 (en) 2016-08-25
HK1202289A1 (en) 2015-09-25
KR102057590B1 (ko) 2019-12-19
US9598712B2 (en) 2017-03-21
LT2828256T (lt) 2019-09-25
US20150045562A1 (en) 2015-02-12
DK2828256T5 (da) 2019-12-09
BR112014022909B1 (pt) 2021-11-03
MX354023B (es) 2018-02-08
EP2828256B1 (en) 2019-07-03
BR112014022909A2 (pt) 2017-07-18
PT2828256T (pt) 2019-10-18
JP6117906B2 (ja) 2017-04-19
AU2013237330B2 (en) 2015-12-03
RU2662815C2 (ru) 2018-07-31
PL2828256T3 (pl) 2019-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2895752C (en) Engineered biocatalysts and methods for synthesizing chiral amines
DK2828385T3 (en) BIOCATALIZATORS AND METHODS FOR SYNTHETIZING DERIVATIVES AND TRYPTAMIN AND TRYPTAMINE ANALOGS
CN103998461B (zh) 用于合成取代的内酰胺的生物催化剂和方法
CA2866222C (en) Chemical process for preparing spiroindolones and intermediates thereof
JP2021531749A (ja) 操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド
JP2020521509A (ja) 操作されたポリペプチドおよびβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸合成におけるそれらの用途
JP2020521510A (ja) 操作されたアルドラーゼポリペプチドおよびその使用
CN104185634B (zh) 制备螺旋吲哚酮和其中间体的化学工艺
CN116209754A (zh) 用于合成手性胺的工程化生物催化剂及方法
CA3126671A1 (en) Engineered transaminase polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration