BR112014006153A2

BR112014006153A2 - composição farmacêutica, e, método para tratar um distúrbio

Info

Publication number: BR112014006153A2
Application number: BR112014006153-0A
Authority: BR
Inventors: Jose E. Fehr Pereira Lopes
Original assignee: Nanocare Technologies, Inc.
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2020-12-01
Also published as: EP2755643A1; US9592305B2; CN107970213A; EP2755643B1; WO2013040556A1; CN104203222A; JP2014526519A; MX2014003301A; US20130089615A1; CA2848219A1; US20180000958A1; KR102023132B1; RU2014114931A; KR20190108189A; JP2019077702A; US8883220B2; US10328155B2; JP2017222659A; MX370253B; KR20140090602A

Abstract

composição farmacêutica, e, método para tratar um distúrbio a descrição descreve compostos de jasmonato nanocarreados e/ou microcarreados e suas composições farmacêuticas, assim como o seu uso para tratar ou prevenir distúrbios relacionados com a angiogênese ou relacionados com nf-kb. também são descritos métodos de fabricar os compostos nanocarreados e/ou microcarreados e suas composições.

Description

“COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA TRATAR UM DISTÚRBIO” PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade para, e o benefício do, Pedido provisório U.S. Nos.: 61/535.836, depositado em 16 de setembro de 2011; 61/555.690, depositado em 4 de novembro de 2011; 61/603.042, depositado em 24 de fevereiro de 2012; 61/607.318, depositado em 06 de março de 2012; e 61/612.774, depositado em 19 de março de 2012; e Pedido internacional No.: PCT/IB2012/000364, depositado em 27 de fevereiro de

2012. Os conteúdos inteiros de cada um dos pedidos acima são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas de compostos de jasmonato (por exemplo, compostos de jasmonato nanocarregados ou microcarregados) úteis para o tratamento e prevenção de várias doenças e distúrbios.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] Os compostos de jasmonato ou jasmonatos são caracterizados pelo anel de ciclopentanona e são conhecidos como hormônios de estresse de planta produzidos pelas plantas em face de uma situação estressante. Os exemplos de jasmonatos incluem, mas não são limitados a, ácido jasmônico (JA), jasmonato de metila (MJ), e cis-/trans-jasmona (ver, por exemplo, Patente U.S. 6.469.061 e WO 2007/066337). Foi mostrado que MJ e JA são tanto eficazes quanto seletivos contra células de tumores (ver, por exemplo, Flescher, Anti-Cancer Drugs 2005, 16:901-916 e US 2002/0173470). Ainda, quando administrados in vivo, os jasmonatos são usualmente metabolizados por exemplo, pelas, esterases, antes que eles atinjam células cancerosas alvo, tornando-as menos atraentes como agentes anticâncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] A presente invenção, em parte, fornece jasmonatos nanocarregados ou microcarregados, especialmente, di-hidrojasmonato de metila nanocarregado ou microcarregado (MDJ, também conhecidos como 2- (3-0x0-2-pentilciclopentil)acetato) de metila, para a aplicação de tratamento ou prevenção de vários distúrbios, tais como distúrbios relacionados com angiogênese doenças inflamatórias. A estrutura química de MDJ é mostrada abaixo. o o o

[0005] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que inclui um solvente farmaceuticamente aceitável e uma pluralidade de nanocarregadores e/ou microcarregadores que contém MDJ. Os nanocarregadores e/ou os microcarregadores lsão formados de uma ciclodextrina ou um dendrímero, ou um lipossoma, ou são partículas de nanoemulsão sintéticas (LDEs) que compreendem um núcleo de colesteril éster circundado por uma camada externa de fosfolipídeo; os nanocarregadores têm um tamanho que varia de 1 nanômetro (nm) a 1000 nm (por exemplo, 1 a 900 nm, 1 a 800 nm, 1 a 700 nm, 1 a 600 nm, 1500 nm, 1 a 400 nm, 1 a 300 nm, 1 a 200 nm, 1 a 100 nm, 1 a 90 nm, 1 a 80 nm, 1 a 70 nm, 1 a 50 nm, 1 a 30 nm, ou 1 a 10 nm); os microcarregadores têm um tamanho que varia de 1 micron a 50 micron (por exemplo, de 1 micron a cerca de 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1,5 micron) e a composição farmacêutica tem uma concentração de MDJ que varia de 1 nM a 1 M (por exemplo, de 1 nM a 10 nM, 1 nM a 100 nM, l AM a LUM, L NM a 1O UM, | nM a 100 uM, 100 uM a 1 mM, 100 uM al0 mM, 100 uM a100 mM, ou 100 mMalM).

[0006] A composição farmacêutica pode ter um ou mais dos traços que seguem.

[0007] A composição farmacêutica tem uma concentração de MDJ que varia de 1 nM a 10 a 100 uM (por exemplo, 1 nM a 10 nM, 10 nM a 100 nM, 100 nM a 1 uM, 1 uM a 10 UM, ou 10 uM a 100 uM), ou 100 uM a 1 mM (por exemplo, 100 uM a 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, ou a 900 uM), ou 100 uM a 10 mM (por exemplo, de 100 uM, 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, ou de 900 uM a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ou a 10 mM), ou 100 uM a 100 mM (por exemplo, de 100 uM, 200 uM, 300 UM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, 900 uM, ou de Il nM a 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, ou a 100 mM), ou 10 uM a 1 mM (por exemplo, de 10 uM, 20 uM, 30 uM, 40 uM, 50 uM, 60 uM, 70 uM, 80 uM, ou de 90 uM a 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 MM, ou a |l MM), ou | a 100 mM (por exemplo, 1 a 10 MM, 1 a 20 MM, 1a 30 mM, l a 40 mM, l a 50 mM, 1 a 60 MM, 1 a 70 mM, 1 a 80 MM, ou 1a 90 MM), ou 100mMa | M (por exemplo, de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M alM).

[0008] Os nanocarregadores são formados de uma ciclodextrina e têm um tamanho que varia de 3 nm a 100 nm, por exemplo, 3,5-11 nm, 10 a 20 nm, 10 a 30 nm, 10 a 40 nm, 10 a 50 nm, 10 a 60 nm, 10 a 70 nm, 10 a 80 nm, a 90 nm, 20 a 30 nm, 20 a 40 nm, 20 a 50 nm, 20 a 60 nm, 20 a 70 nm, 20 a 80 nm, 20 a 90 nm, 30 a 40 nm, 30 a 50 nm, 30 a 60 nm, 30 a 70 nm, 30 a 80 nm, 30 a 90 nm, 40 a 50 nm, 40 a 60 nm, 40 a 70 nm, 40 a 80 nm, 40 a 90 nm, ou 50 a 60 nm, 50 a 70 nm, 50 a 80 nm, 50 a 90 nm, ou 50 a 100 nm.

[0009] Os nanocarregadores são lipossomas ou LDEs e têm um tamanho que varia de 30 nm a 500 nm, por exemplo, 50 nm a 110 nm, 30 nm a 50 nm, 30 nm a 100 nm, 30 nm a 150 nm, 30 nm a 200 nm, 30 nm a 250 nm nm a 300 nm, 30 nm a 350 nm, 30 nm a 400 nm, ou 30 nm a 450 nm.

[00010] Os microcarregadores são lipossomas ou LDEs e têm um tamanho que varia de cerca de 2 um a 30 um (por exemplo, 2-5 um, 2 a 10 um, 2 a 15 um, 2 a 20 um, ou 2 a 25 um), de cerca de 5 um a 20 um (por exemplo, 5 a 7,5 um, 5a 10 um, 5 a 12,5 um, 5 a 15 um, ou 5 a 17,5 um), ou cerca de 10 um. Além disso, a concentração de MDJ varia de 10 a 100 uM a 100 mM (por exemplo, de 50 a 100 uM ou de 100 uM, 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, ou de 900 uM a 1 MM, 2 mM, 3 MM, 4 MM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ou a 10 MM 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, ou a 100 mM) ou 100 mM a 1 M (por exemplo, de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M,0,9 Mal M).

[00011] Os nanocarregadores são formados de um dendrímero e têm um tamanho que varia de 1 nm a 500 nm (por exemplo, 2 a 10 nm, 2 a 20 nm, 2 a 50 nm, 2 a 100 nm, 2 a 150 nm, 2 a 200 nm, 2 a 250 nm, 2 a 300 nm, 2 a 350 nm, 2 a 400 nm, 2 a 450 nm, 10 a 100 nm, 10 a 200 nm, 10 a 300 nm, 10 a 400 nm, 10 a 500 nm, 50 a 100 nm, 50 a 200 nm, 50 a 300 nm, 50 a 400 nm, 50 a 500 nm, 100 a 300 nm, 100 a 500 nm, 200 a 500 nm 300 a 500 nm, ou 400 a 500 nm).

[00012] O dendrímero é poliamidoamina (PAMAM).

[00013] A concentração de MDJ varia de 1 nM a 10 a 100 uM (por exemplo, | nM a 10 nM, 10 nM a 100 nM, 100 nM a 1 UM, l UM a 1O UM, ou 10 uM a 100 uM), 10 a 100 uM a 100 mM (por exemplo, de 50 a 100 uM ou de 100 uM, 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 UM, ou de 900 uM a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ou a 10 MM 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 MM, 80 mM, 90 mM, ou a 100 mM), ou 100 mM a 1 M (por exemplo, de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 Ma 1 M). Por exemplo,

a concentração de MDJ é de 100 uM a 1 mM ou 50 nM a 70 nM.

[00014] Os nanocarregadores ou microcarregadores contêm ainda di- hidrogeno fosfato de 2-aminoetila (ou fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6- octadienal (ou citral), salicilato de metila, ácido abscísico, ou seus derivados ou análogos. 3,7-Dimetil-2,6-octadienal pode ser um isômero cis ou trans.

[00015] O solvente farmaceuticamente aceitável é água, um álcool, ou uma mistura dos mesmos.

[00016] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que inclui um solvente farmaceuticamente aceitável e uma pluralidade de nanocarregadores e/ou microcarregadores que contêm um composto de jasmonato. Os nanocarregadores e/ou microcarregadores são formados de uma ciclodextrina ou um dendrímero, ou um lipossoma, ou os nanocarregadores e/ou microcarregadores são partículas de nanoemulsão sintéticas (LDEs) que compreendem um núcleo de colesteril éster circundado por uma camada de fosfolipídeo. As nanopartículas têm um tamanho que varia de 1 nm a 1000 nm (por exemplo, 1 a 900 nm, 1 a 800 nm, 1 a 700 nm, 1 a 600 nm, 1 a 500 nm, 1 a 400 nm, 1 a 300 nm, 1 a 200 nm, 1 a 100 nm, 1 a 90 nm, 1 a 80 nm, 1 a 70 nm, 1 a 50 nm, 1 a 30 nm, ou 1 a 10 nm);os microcarregadores têm um tamanho que varia de 1 micron a 50 micron (por exemplo, de 1 micron a cerca de 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1,5 micron) e a composição farmacêutica tem uma concentração do composto de jasmonato que varia de 1 nM a 1 M (por exemplo, de 1 nMa10nM,lnMa 100 nM, 1 NM a 1 UM, | NM a 10 UM, 1 nM a 100 uM, 100 uM a 1 mM, 100 uM a 10 mM, 100 uM a100 mM, ou 100mMa1M),.

[00017] A composição farmacêutica pode ter um ou mais dos traços que seguem.

[00018] O composto de jasmonato é selecionado do grupo que consiste do ácido jasmônico, ácido iso-7-isojasmônico, ácido 9,10-di-hidrojasmônico, ácido 9,10-di-hidro-isojasmônico, ácido 2,3-dides-hidrojasmônico, ácido 3,4-

dides-hidrojasmônico, ácido 3,7-dides-hidrojasmônico, ácido 4,5-dides-hidro- jasmônico, ácido 4,5-dides-hidro-7-isojasmônico, ácido cucurúbico, ácido 6- epicucurúbico, ácido 6-epicucurúbico-lactona, ácido 12-hidróxi-jasmônico, ácido 12-hidróxi-jasmônico-lactona, ácido 11-hidróxi-jasmônico, ácido 8- hidróxi-jasmônico, ácido homo-jasmônico, ácido diomo-jasmônico, ácido 11- hidróxi-diomo-jasmônico, — ácido — 8-hidróxi-diomo-jasmônico, — ácido tuberônico, ácido tuberônico-O-B-glicopiranossídeo, ácido cucurúbico-O-B- glicopiranossídeo, ácido 5,6-dides-hidro-jasmônico, ácido 6,7-dides-hidro- jasmônico, ácido 7,8-dides-hidro-jasmônico, cis-jasmona, di-hidrojasmona, e um alquil éster inferior do mesmo.

[00019] A composição farmacêutica tem uma concentração do composto de jasmonato que varia de 1 nM a 1 uM (por exemplo, de 1,2,3,4, 5,6,7,8, ou 9 nM a 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, ou 950 nM), ou 1 nM a 100 uM (por exemplo, 1 nM a 10 nM, 10 nM a 100 nM, 100 nM a 1 UM, l UM a 10 UM, ou 10 uM a 100 uM), ou 1 nM a 1 mM (por exemplo, de 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM, 50 uM, ou de 100 uM a 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, ou a 900 uM), ou 10 uM a 100 mM (por exemplo, de 50 uM ou de 90 uM a 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, ou a 90 mM), ou 100 uM a 1 mM (por exemplo, 100 uM a 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, ou a 900 uM), ou 100 uM a 10 mM (por exemplo, de 100 uM, 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, ou de 900 uM a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ou a 10 MM), ou 100 uM a 100 mM (por exemplo, de 100 uM, 200 uM, 300 uM, 400 uM, 500 uM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, 900 uM, ou de 1 mM a 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, ou a 100 mM), ou uM a 1 mM (por exemplo, de 10 uM, 20 uM, 30 uM, 40 uM, 50 uM, 60 uM, 70 uM, 80 uM, ou de 90 uM a 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, ou a 1 MM), ou 1 a 100 mM (por exemplo, 1 a 10 mM, 1 a 20 mM, 1 a 30 mM, 1 a 40 mM, 1 a 50 MM, 1 a 60 mM, 1 a 70 mM, 1 a 80 mM, ou 1 a 90 mM), ou 100 mM a 1 M (por exemplo, de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M/0,8 M0,9º Ma I M).

[00020] Os nanocarregadores são formados de uma ciclodextrina e têm um tamanho que varia de 3 nm a 100 nm, por exemplo, 3,5 a 11 nm, 10 a 20 nm, 10 a 30 nm, 10 a 40 nm, 10 a 50 nm, 10 a 60 nm, 10 a 70 nm, 10 a 80 nm, a 90 nm, 20 a 30 nm, 20 a 40 nm, 20 a 50 nm, 20 a 60 nm, 20 a 70 nm, 20 a 80 nm, 20 a 90 nm, 30 a 40 nm, 30 a 50 nm, 30 a 60 nm, 30 a 70 nm, 30 a 80 nm, 30 a 90 nm, 40 a 50 nm, 40 a 60 nm, 40 a 70 nm, 40 a 80 nm, 40 a 90 nm, ou 50 a 60 nm, 50 a 70 nm, 50 a 80 nm, 50 a 90 nm, ou 50 a 100 nm.

[00021] Os nanocarregadores são LDEs e têm um tamanho que varia de 30 nm a 500 nm, por exemplo, 50 nm a 110 nm, 30 nm a 50 nm, 30 nm à 100 nm, 30 nm a 150 nm, 30 nm a 200 nm, 30 nm a 250 nm 30 nm a 300 nm, nm a 350 nm, 30 nm a 400 nm, ou 30 nm a 450 nm.

[00022] Os microcarregadores são lipossomas ou LDEs e têm um tamanho que varia de cerca de 2 um a 30 um (por exemplo, 2a 5 um, 2a 10 um, 2 a 15 um, 2 a 20 um, ou 2 a 25 um), de cerca de 5 um a 20 um (por exemplo, 5 a 7,5 um, 5a 10 um, 5 a 12,5 um, 5 a 15 um, ou 5 a 17,5 um), ou cerca de 10 um. Além disso, o composto de jasmonato é MDJ e a concentração de MDJ varia de 100 mM a 1 M (por exemplo, de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 Ma IM)..

[00023] Os nanocarregadores são formados de um dendrímero e têm um tamanho que varia de 2 nm a 500 nm (por exemplo, 2 a 10 nm, 2 a 20 nm, 2 a 50 nm, 2 a 100 nm, 2 a 150 nm, 2 a 200 nm, 2 a 250 nm, 2 a 300 nm, 2 a 350 nm, 2 a 400 nm, 2 a 450 nm, 10 a 100 nm, 10 a 200 nm, 10 a 300 nm, 10 a 400 nm, 10 a 500 nm, 50 a 100 nm, 50 a 200 nm, 50 a 300 nm, 50 a 400 nm, 50 a 500 nm, 100 a 300 nm, 100 a 500 nm, 200 a 500 nm 300 a 500 nm, ou

400 a 500 nm).

[00024] O dendrímero é poliamidoamina (PAMAM).

[00025] O composto de jasmonato é MDJ e a concentração de MDJ varia de 1 nM a 10 a 100 uM, 10 a 100 uM a 100 mM, ou 100 mM a 1 M, por exemplo, 100 uM a | mM ou 50 nM a 70 nM.

[00026] O composto de jasmonato é MJ e a concentração de MJ varia de 1 nM a 1 uM, 10 a 100 uM a 100 mM, ou 100 mM a 1 M, por exemplo, 100 uM a | MM ou 50 nM a 70 nM.

[00027] Os nanocarregadores ou microcarregadores contêm ainda di- hidrogeno fosfato de 2-aminoetila (ou fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6- octadienal (ou citral), salicilato de metila, ácido abscísico, ou seus derivados ou análogos. 3,7-Dimetil-2,6-octadienal pode ser um isômero cis ou trans.

[00028] O solvente farmaceuticamente aceitável é água, um álcool, ou uma mistura dos mesmos. Qualquer um dos compostos aqui descritos podem adicionalmente incluir um ou mais compostos que não de jasmonato, tais como, por exemplo, di-hidrogeno fosfato de 2-aminoetila (ou fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6-octadienal (ou citral), salicilato de metila, ácido abscísico, aminoácidos naturais, Ca?**, Znº**, ou seus derivados ou análogos.

[00029] Ainda em um outro aspecto, a presente descrição descreve o uso dos compostos nanocarregados e/ou microcarregados de jasmonato ou suas composições farmacêuticas aqui descritas para o tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com a angiogênese, tal como câncer ou um distúrbio inflamatório (por exemplo, distúrbio do intestino inflamatório, dermatite aguda, distúrbio inflamatório pélvico, ou amigdalite).

[00030] Ainda em um outro aspecto, a presente descrição descreve o uso dos compostos nanocarregados e/ou microcarregados de jasmonato ou suas composições farmacêuticas aqui descritas para o tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com NF-x«B, tal como uma infecção viral, bacteriana ou fúngica.

[00031] Além disso, a invenção caracteriza o uso dos compostos nanocarregados e/ou microcarregados de jasmonato ou suas composições farmacêuticas aqui descritas para inibir o crescimento da célula cancerosa in vitro ou in vivo. Por exemplo, linhagem de célula cancerosa adequada para o uso nos métodos desta invenção incluem: UACC62 - melanoma, MCF7 - resistência ao cânceri NCIADR - câncer mamário de resistente a medicamento múltiplo, 7860 - câncer renal, NCI460 - câncer pulmonar, PCO3 - resistência ao câncer prostático, OVCARO3- câncer ovariano, HT29 - câncer de cólon, K562 — leucemia, TCP-1003 (Painel de Câncer de Mama Negativo Triplo), Caco-2-câncer de cólon, um painel de 18 linhagens de célula de tumor de mama negativo triplo que compartilha uma morfologia igual à mesenquimatosa ou luminal; linhagem de célula cancerosa de mama HCC38 (Número ATCCº: CRL-2314º) e MCF7 (Número ATCCº: HTB- 22º); linhagem de célula de adenocarcinoma prostático PC-3 (Número ATCCº: CRL-1435º); linhagem de célula de câncer prostático VCaP (Número ATCCº: CRL-2876º); linhagem de célula de carcinoma prostático 22Rv1l (Número ATCCº: CRL-2505º); linhagem de célula de carcinoma prostático DU 145 (Número ATCCº: HTB-81º); linhagem de célula de carcinoma prostático LNCaP clone FGC (Número ATCCº: CRL-1740º); linhagem de célula de leucemia MOLT-4 (Número ATCCº: CLR-1582º); linhagem de célula de leucemia (AML) KG-1 (Número ATCCº: CCL246º); linhagem de célula de leucemia (CML) K-562 (Número ATCCº: CCL-243º); linhagem de célula de leucemia humana CCRF-CEM (Número ATCCº: CCL-119º); CLL linhagem de célula de leucemia Hs 505.T (Número ATCCº: CRL-7306º); linhagem de célula de Jurkat (leucemia, Número ATCCº: TIB-156º); linhagens de célula de Molm (leucemia, por exemplo, Molm-13, Molm-14, Molm-16, Molm-17, e Molm-18), linhagens de célula de Nomo (leucemia, por exemplo, NOMO-I1) e células mutantes Ras.

[00032] Os compostos nanocarregados e/ou microcarregados de jasmonato (por exemplo, MDJ) ou suas composições farmacêuticas aqui descritas têm as seguintes vantagens. Eles apresentam in vitro e/ou in vivo atividades anticâncer em uma faixa de tais como câncer prostático, câncer mamário, melanoma, câncer de cólon, leucemia enquanto apresenta pouca ou nenhuma toxicidade para as células saudáveis in vivo. Seu novo mecanismo de ação pode ser complementar a outras terapias medicamentosas estabelecidas para o câncer prostático. Por exemplo, para doenças avançadas, a composição da invenção pode reduzir o uso de terapias agressivas que têm efeitos colaterais, e para doenças localizadas, a composição da invenção pode prolongar a eficácia da sensibilidade para a terapia hormonal e progressão retardada para as doenças mentais.

[00033] A presente descrição também descreve métodos de sintetizar os compostos nanocarregados e/ou microcarregados de jasmonato ou suas composições farmacêuticas aqui descritas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00034] Os termos “A-14” e “Al4” são usados intercambiavelmente nas figuras para se referir ao complexo de MDJ-nanocarregador usado para a medição.

[00035] Figura 1: (A) Cromatograma do MDJ em um LDE; (B) uma imagem de microscopia eletrônica de varredura de MDJ carregado com LDE (um MDJ carregado com lipossoma exemplar); (C) uma imagem de microscopia eletrônica de varredura de MDJ carregado com LDE e aminoácidos.

[00036] Figura 2: A expressão da CASPASE-3 intensa e homogeneamente distribuída no tumor colônico de camundongo tratado com MD) carregado com ciclodextrina (i.p.)

[00037] Figura 3: A expressão CASPASE-3 heterogênea, limitada superficialmente ao epitélio de carcinoma colônico em camundongos tratados com MD)J (1.1).

[00038] Figuras 44-40: (A) Vista esquemática de variação do volume do tumor, em ratos tratados com MDJ carregados com ciclodextrina (GT) e controles (GC). Observe que todos os animais tratados apresentaram uma falha acentuada no volume do tumor. (B e C) Vista macroscópica de tumores representativos no final do experimento. Os tumores do os tumores de animais tratados com MDJ carregados com ciclodextrina (B) foram menores e apresentaram uma camada externa dura clara e um núcleo mais mole, em comparação com os tumores de controle (C). A histopatologia mostrou que a presença de áreas de necrose (N), que foram muito maiores nos tumores dos tumores de animais tratados com MDJ carregados com ciclodextrina (E) do que nos controles (D). Observe que focos de necrose foram circundados pela concentração de pseudopaliçadas neoplásticas hipercromáticas, que é chamada de “áreas poi-necróticas” (PN). As células tumorais de controle foram organizadas como cordas de rede de células (em linhas bem delimitadas) intimamente acompanhadas por pequenos vasos (setas pretas) (F e H). Esta organização espacial foi severamente rompida em animais tratados com MDJ carregados com ciclodextrina, como mostrado na Figura 4G, com a presença de vazamento de células sanguíneas (setas brancas) e focos micro- hemorrágicos (Figura 41).**** as células CD34 positivamente imunotingidas foram presentes em alto número nos estromas dos tumores de controle (Figura 45), enquanto que os tumores GT apresentaram uma redução acentuada e estatisticamente significante no número de células tingidas com CD34 (Figuras 4K e 41). O imunotingimento com VEGF mostrou uma rede organizada de vasos na área frontal da invasão de tumor (SE) nos tumores de controle (Figura 4M). Nos tumores GT a área SE apresentou um rompimento acentuado da organização espacial e um número menor de células positivas (Figura 4N). as análises quantitativas tem mostrado uma queda dramática no número de células positivas em VEGF nas áreas SE PN no grupo GT (Figura

40). Teste de Mann-Whitney (*p < 0,01)

[00039] Figuras SA-SD: Variação da expressão de gene nos tumores GT e CG. Lista dos primeiros genes supra e infrarregulados em tumores MDJ carregado com ciclodextrina em comparação com os tumores de controle, como encontrado pela análise de microarranjo. Também são mostrados os padrões de expressão de genes que apresentaram uma variação de pelo menos duas vezes entre os dois grupos.

[00040] Figuras 6A-6E: Vista esquemática dos dados de microarranjo. Na Figura 6A, um diagrama de dispersão de dados apresentados mostra a distribuição de gene de ambos os grupos, ao longo dos eixos centrais (vetor característico). Os genes analisados são distribuídos de acordo com a faixa mínima até a máxima, que inclui os seus valores de mudança de vezes, revelados pelos defaults de cor. Na Figura 6B, os algoritmos de agrupamento (Médias K) como agrupamento hierárquico, revelaram as entidades mais similares fundidas juntas com base na similaridade dos seus perfis de expressão. As interações das Proteínas que representam o Classificador de Gene das proteínas estão presentes na base de dados Ingenuity. Estes são representados pelos símbolos coloridos (os símbolos verdes indicam proteínas que têm indução menor depois do MDJ carregado com ciclodextrina e os símbolos vermelhos indicam as proteínas que têm indução mais alta. À intensidade das cores indica a diferença entre os grupos na magnitude da indução. As proteínas conectoras são representadas pelos símbolos vazios. Apenas um pouco das proteínas coloridas não estão direta ou indiretamente ligados através de uma proteína conectora. Alguns dos fatores envolvidos na angiogênese, na Figura 6C e um quadro geral pode ser observado na Figura 6D. Na Figura 6E, os resultados concordantes podem ser observados entre os métodos de dados de microarranjo e qRP-PCR, para alguns genes amostrados.

[00041] Figuras 7A-7T: Expressão de NFKB, TGFI3, HIF-1 e COX-2. As Figuras 7A -7C mostram uma redução acentuada tanto das sub-unidades de NFKB (P105 e P50) pela western-blotting no grupo GT, quando comparado ao grupo GC. Além disso, a análise histoquímica de southwestern confirmou que a transcrição de NFKB para o núcleo foi virtualmente abolido no grupo GT (Figura 7E), quando comparado ao grupo GB (Figura 7D). À única exceção foi um tingimento acentuado e altamente NFKB nos vasos (Figura 7F) apenas no grupo GT nas áreas com dano vascular, visualizado no tingimento com H&E. Observe como o número de vasos foi pequeno, isto pode não ter afetado a quantificação global de NFKB, pela análise WB. O imunotingimento com TGFI3 foi muito mais intenso no grupo GC, principalmente nas áreas PN, como delimitado pelas setas pretas (Figura 7H), quando comparado ao GT (Figura 71), que foi confirmado pela morfometria (Figura 7J). Também, o imunotingimento de HIF-1 foi muito mais intenso no grupo GC, principalmente nas áreas PN (Figuras 7K e 7L), quando comparado ao GT (Figuras 7M e 7N), o que foi confirmado pela morfometria (Figura 70) e análise western blotting (Figuras 7P e 7Q). O tingimento de COX-2 tem mostrado uma concentração mais alta de células marcadas na frente de invasão dos GC, com muitas células organizadas em cordões (Figura 7R), que foi abolido no grupo GT, em que foi também encontrado uma desorganização acentuada do tecido (Figura 7S). A morfometria (Figura 7T) confirmou a queda na expressão de IHC de COX-2 no grupo GT, com a exceção do núcleo central dos tumores. Teste de Mann- Whitney (*p <0,01).

[00042] Figura 8A-8T: Marcadores de célula tronco (CD133, Oct4 e MT) e marcadores de apoptose (Tunel e CASPASE3). As Figuras 8A-8SF mostram padrão similar de tingimento com IHC para ambos os marcadores de célula tronco Oct4 e CD133. O imunotingimento foi muito mais intenso no grupo GC, principalmente nas áreas PN (Figuras A e D/E, respectivamente), quando comparado ao GT (Figuras B e F/G, respectivamente), que foi confirmado pela morfometria (Figuras C e H, respectivamente). O imunotingimento de MT foi muito mais intenso no grupo GC, principalmente nas áreas SE (Figuras 15), quando comparado ao GT (Figuras L/M), que foi confirmado pela morfometria (Figura N). O tingimento MT também mostrou uma desorganização importante dos cordões de célula e vasos no grupo GT. Tanto o tingimento TUNEL quanto o de Caspase-3 mostraram níveis de apoptose mais altos no grupo GT em todas as três áreas que foram avaliadas (Figuras P e S, respectivamente), quando comparado ao grupo GC (Figuras O e R, respectivamente), que foi confirmado pela análise morfométrica (Figuras QeT). Teste de Mann-Whitney (*p < 0,01)

[00043] Figura 9: Modelo proposto para o papel de hipoxia de tumor na progressão do câncer extraído e MDJ carregado com ciclodextrina no desligamento dos sistemas de sinalização de tumor.

[00044] Figura 10: Efeito de MDJ sobre o crescimento de células endoteliais (HUVEC, 2 x 10º células / reservatório) em placas de 96 reservatórios na presença de diluições em série de MDJ. Eixo principal, símbolos ocos: citotoxicidade medida pela redução de MTT. Cada ponto representa a média de quatro leituras realizadas em duplicatas independentes, exceto para o controle, medido em quadruplicata. O valor medido para os controles não tratados é mostrado pelas barras de erro correspondentes no gráfico. O eixo secundário, símbolos cheios: vezes de dobramento calculados a partir das culturas de célula. Cada ponto representa a média de três experimentos independentes.

[00045] Figura 11: Efeito de MDJ sobre o crescimento de células de melanoma de murino (B16-F10, 1 x 10º células / reservatório) em placas de 96 reservatórios na presença de diluições em série de MDJ. Eixo principal, símbolos ocos: citotoxicidade medida pela redução de MTT. Cada ponto representa a média de quatro leituras realizadas em duplicatas independentes, exceto para o controle, medido em quadruplicata. O valor medido para os símbolos não tratados é mostrado pela barra de erro correspondente no gráfico. O eixo secundário, símbolos cheios: tempo de dobramento calculado a partir das culturas de célula. Cada ponto representa a média de três experimentos independentes.

[00046] Figura 12: Imagem representativa de células endoteliais (A e B) ou melanoma de murino B1I6F10 (C e D) cultivadas até a confluência nas lâminas de vidro em meio RPMI na condição de controle (A e C) ou depois de 60 h de exposição a | MM de MDJ (Be D).

[00047] Figura 13: Efeito de MDJ sobre o ciclo celular em HUVEC depois de 18 h de exposição in vitro. As concentrações usadas em cada teste são mostradas em gráficos e as medidas do ciclo celular foram realizadas em um equipamento BD FACScalibur, depois da rotulação com iodeto de propídio simples. O tingimento com laranja de acridina serviu como um controle do processo de apoptose.

[00048] Figura 14: Efeito de MDJ sobre a viabilidade de células endoteliais em 24 plaqueamentos de baixa densidade (HUVEC, 1 x 10º células / reservatório), como medido pelo ensaio de redução de MTT em placas de 96 reservatórios. Cada ponto representa a média de oito leituras realizadas em quatro experimentos independentes, a linha contínua representa a medida dos controles não expostos para comparação. O efeito sobre a mitocondria foi confirmado pelo tingimento com Mitotracker Red e observação microscópica confocal e pode ser observado já em 4 h de exposição (Ver a Figura 15).

[00049] Figura 15: Efeito de MDJ sobre a atividade mitocondrial das células endoteliais depois de 4 h de exposição em plaqueamento de baixa densidade sobre lamínulas de vidro de 25 mm em placas de 24 reservatórios, como medido pela microscopia confocal de fluorescência Mitotracker red, aumentada 80x (40x + 2x zoom digital). Os parâmetros de calibração foram mantidos para todas as medidas. A medida de brilho que corresponde ao tingimento fluorescente da mitocondria foi quantificada em relação à área marcada, sugerindo que existe um aumento no número ou atividade mitocondrial nas células expostas às baixas concentrações de MDJ, também em 24 horas. As concentrações iguais ou maiores do que 1 mM levaram a uma diminuição na intensidade / área de marcação.

[00050] Figura 16: Efeito de MDJ sobre a atividade mitocondrial das células endoteliais depois de 24 horas de exposição no plaquemento de baixa densidade sobre lamínulas de vidro de 25 mm em placas de 24 reservatórios, como medido pela fluorescência Mitotracker Red em microscópio confocal, ampliação de 40x. Os parâmetros de calibração foram mantidos para todas as medições, cada ponto é a média de seis medições independentes. O MDJ foi bem tolerado pelos ovos, quando administrado em solução na sua própria albumina do ovo.

[00051] Figura 17: Estudo da toxicidade de MDJ in vivo de sobrevivência. Os ovos fertilizados foram expostos ao MDJ em doses de 100, 50, 10, 5 ul por ovo (n = 5) em um volume de 5 ml de albumina removido do próprio ovo. Os controles foram expostos ao veículo sem MDJ. As concentrações indicadas na legenda foram calculadas assumindo um volume de 60 ml / ovo.

[00052] Figura 18: Efeito do MDJ adicionado à albumina sobre a angiogênese em COSES modelo CAM que corresponde ao controle não exposto (C), 1 ul (B), 5 ul (A) por ovo. À presença de células de melanoma diminuiu a sobrevivência dos ovos. MDJ parcialmente recuperou esta sobrevivência. Os resultados de CAM no modelo confirmou que os corpos de melanoma sofreram uma involução dependente da dose sob a ação da substância ativa.

[00053] Figura 19: Estudo da toxicidade de MDJ in vivo da sobrevivência em ovos inoculados com melanoma de murino B16F10, 1 x 10º células/reservatório. Os ovos fertilizados foram expostos ao MDJ nas doses de 100, 50, 10, 5 ul por ovo (n = 5) em um volume de 5 ml de albumina removido dom próprio ovo. Os controles foram expostos ao veículo sem

MDJ. As concentrações indicadas na legenda foram calculadas assumindo o volume de 60 ml / ovo.

[00054] Figura 20: Efeito de MDJ administrado em albumina sobre o crescimento de melanoma na área de CAM. Todas as amostras foram inoculadas com melanoma de murino B16F10, 1 x 10º células/ reservatório. À e B, com imagem aumentada 5x, C e D, a mesma região imageada em aumento de 10x. A e C, controle não tratado, B e D, tratamento com dose única de 5 ul de MDJ. O crescimento de tumor está intimamente relacionado aos vasos. A angiogênese induzida por melanoma cresceu próxima aos vasos principais do CAM.

[00055] Figura 21: Efeito de MDJ administrado com albumina sobre o crescimento de melanoma na área de CAM. Amostra inoculada com melanoma de murino BI6FI10, 1 x 10º células/reservatório. A: imagem estereoscópica digitalizada na lente de ampliação no campo brilhante e B: a mesma região, imagem tirada no campo escuro. Ampliação 10X.

[00056] Figura 22: Efeito de MDJ carregado com ciclodextrina sobre o crescimento de células endoteliais (HUVEC, 1 x 10º células/ reservatório) ou melanoma de murino (B16F10, 1 x 10º células/ reservatório) nas placas de cultura de 96 reservatórios. Cada ponto representa a média de três leituras realizadas em duplicatas independentes.

[00057] Figura 23: Efeito de MDJ carregado com ciclodextrina sobre a viabilidade de células endoteliais (HUVEC, 1 x 10º células/ reservatório) ou melanoma de murino (BI6F10, 1 x 10º células/ reservatório) em placas de cultura de 96 reservatórios depois de 24 h de exposição, medida pelo teste de MTT. Cada ponto representa a média de três leituras realizadas em duplicatas independentes.

[00058] Figura 24: Efeito de MDJ carregado com ciclodextrina sobre o crescimento de vasos sanguíneos no modelo CAM de angiogênese. A e B: fotomicrografias feitas sobre material fresco sem tingimento. Microscópio

Jena, iluminação com capacitor paralelo. Aumento de 8x. B e D: fotomicrografias feitas sobre material fresco sem tingimento, microscópio Jena, capacitor de luz paralelo aumento de 32x. Amostras obtidas em testes independentes. À e C: controles não tratados. B e D: Dose aplicada ao CAM equivalente a 1 uM de MDJ.

[00059] Figura 25: Efeito de MDJ carregado com ciclodextrina sobre o crescimento de vaso no modelo de angiogênese em CAM inoculado com melanoma de murino BI6FIO, 1 x 10º células/reservatório no 8º dia de incubação. Fotomicrografias tiradas sobre o material fresco sem tingimento, microscópio Jena, capacitor de luz paralelo aumento de 32x. A: controle não tratado. B: amostra tratada com MDJ carregado com ciclodextrina aplicado no CAM no dia 11 de incubação, o equivalente de 1 uM de MDJ.

[00060] Figura 26: Efeito do MDJ carregado com CD (com tamanho variando de 3 a 30 nm) em nove linhagens de célula cancerosa: UACC62, MCF7, NCIADR, 7860, NC1460, PCO3, OVCARO3, e HT29, K562. O eixo X é a concentração de MDJ com base no volume total da amostra; a concentração de MDJ na nanoemulsão usada foi de 1 milimolar.

[00061] Figura 27: Efeito do tamanho de nanocarregadores sobre a atividade da angiogênese; concentração de MDJ nanocarregado usada sendo de 1 nM a 10 a 100 micromolares.

[00062] Figura 28: Efeito da fosfatidilcolina de soja carregada com lipossomas MDJ (lipossoma com 50 a 120 nm no tamanho) em nove linhagens de célula cancerosa: UACC62, MCF7, NCIADR, 7860, NC1460, PCO3, OVCARO3, e HT29, K562. O eixo X é a concentração de MDJ com base no volume total da amostra; concentração de MDJ na nanoemulsão usada foi de 1 milimolar.

[00063] Figura 29: Efeito do complexo nanocarregador de lipossoma MD/J-fosfatidil na atividade mitocondrial de células UACC-62 depois de 8 h de incubação daquelas células com o complexo (os três painéis de fundo),

como medido pela microscopia confocal de fluorescência Mitotracker red). À concentração de MDJ foi 10? M e o tamanho do complexo variou de 25 nm a 200 nm.

[00064] Figura 30: Efeito do complexo de nanocarregador de lipossoma de MDJ-fosfatidil de soja sobre a viabilidade de células endoteliais (HUVEC) ou melanoma de murino (B1I6F10) depois de 24 h de exposição, medido pelo teste de MTT.

[00065] Figura 31: Efeito antizcangiogênese de complexo nanocarregador de MDJ-PAMAM, com uma concentração de MDJ sendo de 10? M na nanoemulsão. O painel de topo mostrou claramente a formação da massa de tumor de melanoma de murino (B16F10) e a formação de uma nova rede vascular para fornecer nutrição de modo a fazer com que o tumor cresça enquanto como mostrado no painel de fundo, nenhuma rede vascular foi formada no tratamento com o complexo.

[00066] Figura 32: Efeito anticangiogênese do complexo nanocarregador MDJ-LDE sobre as células UACC-62, com uma concentração de MDJ sendo de 10? M na amostra.

[00067] Figura 33: Efeito antiangiogênese de Complexo nanocaregador de lipossoma de MDJ-fosfatidilcolina da soja sobre as células UACC-62, com uma concentração de MDJ sendo de 10º M na amostra.

[00068] Figura 34: Efeito de macrófago-activado pelo complexo de microcarregador de MDJ-LDE (10 microns no tamanho, uma concentração de MDJ sendo de 10? a 10 M) sobre as células de leucemia. A: quadro de microscópio de células cancerosas (brilhante) engolfadas pelos macrófagos (dim); B: quadro microscópico de células cancerosas sendo digeridas dentro de um macrófago.

[00069] Figura 35: Efeito da angiogênese in vivo de MDJ nanocarregado em doses baixas: as concentrações de MDJ sendo de 10 uM no topo duas imagens e 100 nM no fundo três imagens.

[00070] Figura 36: Efeito da angiogênese in vivo de MDJ e MDJ nanocarregado em uma concentração de 30 uM.

[00071] Figura 37: Caminhos da ação de jasmonato contra células cancerosas (Ver Flescher, Cancer Lett. 2007; 245(1-2): 1-10).

[00072] Figura 38: Imagens de microscópio invertido da linhagem de célula de Jurkat (leucemia, Número ATCCO: TIB-156º) depois de 24 horas de tratamento com: À: água (controle); B: nanopartículas vazias; e C: nanopartículas que carregam MDJ. Na Figura 38C, quase todas as células morreram depois de 24 horas de tratamento.

[00073] Figura 39: Imagens de microscópio invertidas da linhagem de célula de câncer prostático VCaP (Número ATCCO: CRL-2876º) depois de 24 horas de tratamento com: A: água (controle); B: nanopartículas vazias; e C: nanopartículas que carregam MDJ. Na Figura 39C, quase todas as células morreram depois de 24 horas de tratamento.

[00074] Figura 40: Imagens de microscópio invertido da linhagem de célula cancerosa de mama HCC38 (Número ATCCG: CRL-2314º) depois de 24 horas de tratamento com: A: água (controle); B: nanopartículas vazias; e C: nanopartículas que carregam MDJ. Na Figura 40C, quase todas as células morreram depois de 24 horas de tratamento.

[00075] Figura 41: Imagens de microscópio invertidas da linhagem de célula de carcinoma prostático 22Rv1 (Número ATCCG: CRL-2505º) depois de 24 horas de tratamento com: A: água (controle); B: nanopartículas vazias; e C: nanopartículas que carregam MDJ. Na Figura 41C, 60% a 70% das células morreram depois de 24 horas de tratamento.

[00076] Figura 42: Imagens de microscópio invertidas de células de macrófago depois de 24 horas de tratamento com: A: água (controle); B: nanopartículas vazias; e C: nanopartículas que carregam MDJ.

[00077] Figura 43: Imagens que mostram a fragmentação dos vasos quando contatados com o A14 ligado com zinco, cálcio ou aminoácidos. O A-

14 ligado com zinco demonstrou o efeito mais significante sobre a fragmentação de vaso comparado com A-14 ligado a cálcio ou aminoácido. 1: A-14 com alanina; 2: A-14 com argentine; 0,5: A-14 com zinco; 5: A-14 com cálcio e c: controle. O carregador é lipossoma.

[00078] Figura 44: Imagem esquerda: uma quantidade enorme de vasos, a angiogênese foi formada em torno das células de tumor. De modo a crescer, o tumor precisa receber uma quantidade maior de nutrientes e oxigênio. Devido a uma tal necessidade, o complexo de vaso é formado dentro/no tumor depois do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) é liberado pelo tumor. Imagem da direita: Depois de ser tratado com A-14 conjugado com aminoácidos, a maior parte do complexo de vaso desapareceu. O fenômeno chamado anti-angiogênese, a destruição destes vasos, impede o tumor de receber os nutrientes e o oxigênio requerido para o seu crescimento. O carregador é lipossoma.

[00079] Figura 45: Imagem que mostra a destruição das células endoteliais pelo A-14 ligado ao aminoácido. O carregador é lipossoma.

[00080] Figura 46: Imagem que mostra o efeito anti-angiogênese em tomo dos vasos no câncer de mama pelo A-14 ligado a zinco. O carregador é lipossoma.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00081] Os jasmonatos foram verificados ser agentes anticâncer potenciais que atuam direta e seletivamente sobre a mitocôndria da célula cancerosa humana (ver, por exemplo, Rotem et al., Cancer Res 2005; 65:1984-1993; Costantini er al., INCI 2000; 90:1042-1053) Foi relatado que os membros de jasmonatos, e alguns dos seus derivados sintéticos, exibem a atividade anticâncer in vitro e in vivo. Por exemplo, os jasmonatos aumentaram a expectativa de vida de camundongos que carregam o linfoma EL-4, MJ é ativo em células de linfoma B quimio-resistentes, e dados preliminares têm sugerido que MJ exibe citotoxicidade por intermédio de caminho apoptótico (ver, por exemplo, Flescher, Cancer Lett. 2007; 245(1-

2):1-10; Fingrut et al., Br J Pharmacol. 2005; 146(6): 800-808; Fingrut et al., Leukemia, 2002; 16:608-616.) Os mecanismos de ação foram propostos para explicar a atividade anticâncer dos jasmonatos (Ver id, e Figura 37). Entretanto, o maior problema que enfrenta esta nova família de agentes anticâncer é a dificuldade para administrar os compostos in vivo. Sendo um éster, quando administrado in vivo, os jasmonatos são usualmente metabolizados, por exemplo, pelas, esterases, antes que eles atinjam células cancerosas alvo, tornando-as menos atraentes como agentes anticâncer.

[00082] A invenção fornece composições farmacêuticas de jasmonatos nanocarregados e/ou microcarregados. É intencionado que a composição da invenção são composições “farmacêuticas”, significando que elas são adequadas para o uso farmacêutico. Consequentemente, o termo “composição” como aqui usado é intencionado a abranger as composições farmacêuticas mesmo se “farmacêutica” não seja expressamente declarada. As composições da invenção preferivelmente fornecem estabilidade contra a degradação dos jasmonatos antes que eles atinjam as células alvo in vivo. À invenção está fundamentada em parte na verificação não esperada de que os jasmonatos nanocarregados e/ou microcarregados, em particular, MDJ nanocarregado e/ou micro-carregado, mostram atividades anti-angiogênicas. A invenção também está fundamentada em parte na verificação não esperada de que o MDJ nanocarregado e/ou microcarregado é muito mais eficaz contra células tumorais do que o MJ nanocarregado, por exemplo, pelo menos 10º? mais eficaz, com menos toxicidade para células normais e vasos sanguíneos. A invenção também está fundamentada em parte na verificação não esperada de que os jasmonatos nanocarregados e/ou microcarregados, em particular, MDJ ou MJ nanocarregados e/ou microcarregados, mostram atividades anti- angiogênicas ou atividades angiogênicas com base em doses ou concentrações diferentes. Por exemplo, em uma concentração baixa de 1 nM a cerca de 10 a 100 uM, o MDJ nanocarregado e/ou microcarregado exibe efeito angiogênico, enquanto em uma concentração maior do que 100 uM, o MDJ nanocarregado e/ou microcarregado exibe efeito anti-angiogênico. Como para MJ, em uma concentração baixa de 1 nM a cerca de 1 uM, o MJ nanocarregado e/ou microcarregado exibe efeito angiogênico, enquanto em uma concentração maior do que 1 uM (por exemplo, maior do que 2 uM ou maior do que 5 uM) o MDJ nanocarregado e/ou microcarregado exibe efeito anti-angiogênico.

[00083] As verificações não esperadas acima sugerem que o jasmonato nanocarregado/microcarregado a ser usado como uma terapia anticâncer nova e promissora alvejada.

[00084] Como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singular “um,” “uma,” e “o”, “a” incluem referendos plurais a menos que o contexto claramente dito de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a “um composto de jasmonato” pode incluir não apenas um jasmonato único mas também uma combinação ou mistura de dois ou mais jasmonatos diferentes que incluem pró medicamentos, ésteres, sais, seus metabólitos.

[00085] Como aqui usado, nas frases “por exemplo,” “por exemplo,” “tal como,” ou “que inclui” são intencionados a introduzir exemplos que esclarecem ainda mais matéria objeto geral. Estes exemplos são fornecidos apenas como uma ajuda para entender a verificação, e não são intencionados a serem limitantes de nenhum modo.

[00086] Na descrição e reivindicação da presente invenção, a terminologia que segue será usada de acordo com as definições apresentadas abaixo.

[00087] Como aqui usado, as frases “contendo, “sendo formado/ composto de,” “que inclui,” “tendo a fórmula,” ou “tendo a estrutura” não são intencionadas a serem limitadas e são usadas do mesmo modo que o termo “que compreendem” é habitualmente usado a menos que o contexto claramente dito de outro modo.

[00088] O termo “nanocarregador” como aqui usado refere-se a um carregador ou veículo adequados para a carrying e liberação de um ingrediente ativo (por exemplo, um medicamento) para uma célula, tecido, ou órgão alvos e o veículo tem um tamanho na faixa de cerca de 1 nanômetro (nm) a cerca de 1000 nm. O termo “microcarregador” como aqui usado refere-se a um carregador ou veículo adequados para a carrying e liberação de um ingrediente ativo (por exemplo, um medicamento) para uma célula, tecido, ou órgão alvos e o veículo tem um tamanho na faixa de cerca de | micron a cerca de 100 microns. Em uma outra forma de realização, um microcarregador é formado de um grupo de nano-carregadores, por exemplo, um microcarregador de LDE formado de um grupo de microcarregadores de LDE. Preferivelmente, o nanocarregador ou microcarregador é um carregador farmaceuticamente aceitável.

[00089] O termo “composto de nanocarregado/microcarregado” ou o termo “nanocarregador/microcarregador que contém um composto” como aqui usado refere-se a um complexo de um nanocarregador/micro-carregador associado ou ligado com um composto. A associação ou ligação podem ser criados por intermédio de uma ligação química (por exemplo, uma ligação covalente), uma ligação de hidrogênio, uma força de van der Waals, uma interação de Coulomb, ou os seus semelhantes. Em uma outra forma de realização, o composto é encapsulado no nanocarregador/micro-carregador. Em uma outra forma de realização, o composto é parcialmente encapsulado no nanocarregador/microcarregador ou na superfície do nanocarregador/microcarregador (por exemplo, como uma parte da superfície de nanocarregador/microcarregador ou fora ligada ainda à superfície).

[00090] O termo “emulsão” refere-se a um suspensão de pequenos glóbulos ou partículas de um primeiro líquido (a fase dispersa) dispersado em um segundo líquido (a fase contínua), com o qual o primeiro é normalmente imiscível.

[00091] O termo “nanoemulsão” como aqui usado refere-se a um emulsão tendo as partículas dispersas com um tamanho variando de cerca de 1 nm a cerca de 50 um (por exemplo, | nm a 50 um, | nm a 40 um, l nm a 30 um, 1 nm a 20 um, | nm a 10 um, 1 a 5000 nm, 1 a 4000 nm, 1 a 3000 nm, 1 a 2000 nm, 1 a 1000 nm, 1 a 900 nm, 1 a 800 nm, 1 a 700 nm, 1 a 600 nm, 1 a 500 nm, 1 a 400 nm, 1 a 300 nm, 1 a 200 nm, 1 a 150 nm, 1 a 100 nm, 1a 90 nm, 1 a 80 nm, 1 a 70 nm, 1 a 60 nm, 1 a 50 nm, 1 a 40 nm, 1 a 30 nm, 1 a 20 nm, 1 a 10 nm, 1 a 5 nm, 50 a 100 nm, 3 a 150 nm, ou 3 a 20 nm). As nanoemulsões tendem a se tornar claras devido ao tamanho pequeno da fase dispersa.

[00092] O termo “LDE” refere-se a uma partícula de nanoemulsão que assemelha à lipoproteína de densidade baixa (LDL) em composição e comportamento. Por exemplo, uma vez introduzida no sistema da circulação, várias proteínas de plasma (por exemplo, apoE) tornam-se absorvidas na superfície das partículas de LDE e subsequentemente direto do LDE para as células expressam os receptores de LDL (LDLR). A LDE é proteína livre é tipicamente composta de um núcleo de colesteril éster circundado por uma monocamada de fosfolipídeo. Para as descrições em mais detalhes de LDEs e suas preparações, ver, por exemplo, Ginsburg er al. (1982), J Biol Chem 257: 8216-8227; Maranhao et al. (1993), Lipides 28: 691-696; e Favero et al. (2010), Biol Res 43: 439-444. O termo “LDE” é aqui usado para referir-se a um exemplo de um nanocarregador ou microcarregador equivalente a lipossoma que pode ser usado de acordo com a presente invenção. À determinação de outros nanocarregadores e/ou microcarregadores equivalentes a lipossoma adequados é dentro dos níveis de rotina da pessoa habilitada na técnica.

[00093] O termo “colesteril éster” refere-se a um éster de colesterol. Por exemplo, a ligação do éster é formada entre grupo o grupo carboxilato de um ácido graxo e grupo hidroxila de colesterol. Os exemplos de colesteril ésteres incluem, mas não são limitados a oleato de colesterila, nervonato de colesterila, etc.

[00094] O termo “fosfolipídeo” refere-se a uma classe de lipídeos que são um componente principal de todos as membranas celulares visto que elas podem formar bicamadas de lipídeo. A maior parte dos lipídeos contém um diglicerídeo, um grupo fosfato, e uma molécula orgânica única tal como colina. Uma exceção desta regra é a esfingomielina, que é derivada de esfingosina ao invés de glicerol. Os exemplos de fosfolipídeos incluem mas não são limitados a glicerofosfolipídeo tal como ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, e fosfoinositidas (por exemplo, fosfatidilinositol, fosfato de fosfatidilinositol, bisfosfato de fosfatidilinositol e trifosfato de fosfatidilinositol).

[00095] Os compostos aqui mencionados podem conter uma ligação dupla não aromática e um ou mais centros assimétricos. Assim, eles podem ocorrer como racematos e misturas racêmicas, enantiômeros únicos, diastereômeros individuais, misturas diastereoméricas, e formas isoméricas cis e trans. Todas as tais formas isoméricas são consideradas. Por exemplo, o composto de jasmonato aqui descrito inclui todos de qualquer isômero ótico que está fundamentado no carbono assimétrico e é opticamente puro, qualquer mistura de várias isômeros ópticos, ou forma racêmica. Os exemplos de estereoisômeros = de MDJ incluem, por exemplo, (IR,2R)-di- hidrometiljasmonato, (1R,2S)-di-hidrometiljasmonato, (18,2R)-di- hidrometiljasmonato, e (1S,2S)-di-hidrometiljasmonato. Os exemplos de isômeros de jasmonato de metila incluem cis ou trans(1R,2R)-jasmonato de metila, cis ou trans-(1IR,28)-jasmonato de metila, cis ou trans-(1S8,2R)- jasmonato de metila, e cis ou trans-(18,2S)-jasmonato de metila.

[00096] A presente invenção é intencionada a incluir todos os isótopos de átomos que ocorrem nos presentes compostos. Os isótopos incluem estes átomos tendo o mesmo número atômico, mas números de massa diferentes. Por via de exemplo geral sem limitação, os isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério, e isótopos de carbono incluem C-13 e C-14.

[00097] O termo “alquila” como aqui usado refere-se a um grupo hidrocarboneto saturado ramificado ou não ramificado tipicamente embora não necessariamente contendo de 1 a cerca de 24 átomos de carbono, tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, t-butila, octila, decila, e os seus semelhantes, assim como grupos cicloalquila tais como ciclopentila, ciclohexila e os seus semelhantes. No geral, embora não necessariamente, os grupos alquila aqui podem conter de 1 a cerca de 18 átomos de carbono, e tais grupos pode conter de 1 a cerca de 12 átomos de carbono. O termo “alquila inferior” significa um grupo alquila de 1 a 6 átomos de carbono, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 átomos de carbono. Composições farmacêuticas

[00098] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem um composto de jasmonato e pelo menos um excipiente ou carregador farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, um nanocarregador/microcarregador aqui descrito.

[00099] Em uma outra forma de realização, os nanocarregadores usados para a composição da invenção são formados de ciclodextrinas. As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos formados por unidades de D-L(+)-Glicose ligadas por cadeias a-1,4-C-O-C. Os CDs são produzidos a partir do amido por meios de conversão enzimática. Os CDs nativos são definidos pelo número de unidade de glicose, por exemplo, a-, 13- e 7-CDs contém de 6, 7, e 8 unidades de glicose, respectivamente. Os exemplos de CDs mais adequados desta invenção são descritos, por exemplo, na, WO 2010/006392, US 2008/044364, e EP 392608.

[000100] Em uma outra forma de realização, os nanocarregadores/ microcarregadores usados para a composição da invenção são LDEs. Em particular, o LDE usado para esta invenção compreende fosfatidilcolina, ácido oléico, colesterol, e trioleína. Outros carregadores equivalentes a lipossoma também podem ser usados.

[000101] Em uma outra forma de realização, os nanocarregadores usados para a composição da invenção são formados de um dendrímero tal como PAMAM. A tabela abaixo demonstra o tamanho de um dendrímero de PAMAM como uma função de gerações. Mais exemplos de dendrímeros são descritos na, por exemplo, WO 2010/006392. Geração Peso Molecular Diâmetro Medido (A) Grupos de Superfície 0 517 15 4 1 1,430 22 8 3,256 3 6,909 36 32 14,215 28,826 6 58,048 67 256 7 116,493 81 512 Ls | 233,383 1024 o | 467,162 2048 934,720 4096

[000102] Ainda em uma outra forma de realização, Os nanocarregadores/microcarregador são lipossomas (que incluem lipossomas alvejados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais). A formulação de lipossoma para o composto da presente invenção compreende pelo menos um polímero, óleo, pelo menos um tensoativo e um solvente. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que qualquer(is) polímero(s), óleo(s), tensoativo(s) e/ou solvente(s) adequado(s) pode(m) ser usado(s) para a formulação de lipossoma. A determinação de formulações de lipossoma adequadas para o uso na presente invenção está dentro da rotina da pessoa habilitada na técnica. Os polímeros exemplares para a formação de lipossoma incluem, por exemplo, policaprolactona, PHB - Poli- hidroxibutirato, PMMA - Poli(metacrilato de metila), quitosano e B- Ciclodextrina. O óleo exemplar usado para a fase oleosa inclui, por exemplo, oleato de isodecila, óleo mineral e óleo de EMU. Os tensoativos exemplares incluem, por exemplo, monoestearato de sorbitano, lectina (tal como lectina de soja) e polissorbato 80. A lectina pode ser qualquer lectina natural e/ou sintética e/ou uma mistura dos mesmos. Os solventes usados para a formação de lipossoma incluem, mas não são limitados a, acetona, etanol e água ultra pura. Um exemplo não limitante do lipossoma usado para a invenção é lipossoma formado de fosfatidilcolina da soja ou do ovo (ou lectina). Estes podem ser preparados de acordo com os métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No.

4.522.811. Assim, as escolhas da formulação de lipossoma exata utilizada será influenciada pelo câncer sendo tratado. Certas formulações de lipossoma funcionarão melhor para alguns cânceres do que para os outros.

[000103] Em uma outra forma de realização, o tamanho dos nanocarregadores varia de 1 nm a 1000 nm, por exemplo, 900 a 1000 nm, 1 a 900 nm, 1 a 800 nm, 1 a 700 nm, 1 a 600 nm, 1 a 500 nm, 1 a 400 nm, 1 a 300 nm, 1 a 200 nm, 1 a 150 nm, 1 a 100 nm, 1 a 90 nm, 1 a 80 nm, 1a 70nm, 1a 60 nm, 1 a 50 nm, 1 a 40 nm, 1 a 30 nm, 1 a 20 nm, L a IO nm, 1a 5nm, 2a 300 nm, 20 a 200 nm, 50 a 150 nm, ou 3,5 a 11 nm.

[000104] Em uma outra forma de realização, o tamanho dos microcarregadores varia de 2 um a 50 um, por exemplo, 2 a 5 um, 2 a 10 um, 2a15 um, 2a20 um, 2 a25 um, 2 a 30 um, 2 a 40 um, 2 a 50 um, 5 a 20 um, 5 a 10 um, ou 7,5a 10 um.

[000105] Em uma outra forma de realização, o composto de jasmonato na composição farmacêutica é selado a partir do grupo que consiste de ácido jasmônico, ácido 7-iso-jasmônico, ácido 9,10-di-hidrojasmônico, ácido 9,10- di-hidro-isojasmônico, ácido 2,3-dides-hidrojasmônico, ácido 3,4-dides-hidro- jasmônico, ácido 3,7-dides-hidrojasmônico, ácido 4,5-dides-hidrojasmônico, ácido 4,5-dides-hidro-7-isojasmônico, ácido cucurúbico, ácido 6-epi- cucurúbico, ácido 6-epicucurúbico-lactona, ácido 12-hidróxi-jasmônico, ácido 12-hidróxi-jasmônico-lactona, ácido 11-hidróxi-jasmônico, ácido 8-hidróxi- jasmônico, ácido homo-Jjasmônico, ácido diomo-jasmônico, ácido 11-hidróxi- diomo-jasmônico, ácido 8-hidróxi-diomojasmônico, ácido tuberônico, ácido tuberônico-O-B-glicopiranossídeo, ácido cucurúbico-O-B-glicopiranosida, ácido 5,6-dides-hidro-jasmônico, ácido 6,7-dides-hidro-jasmônico, ácido 7,8-

dides-hidrojasmônico, cis-jasmona, di-hidrojasmona, e um alquil éster inferior do mesmo. Preferivelmente, a composição da invenção inclui di- hidrojasmonato de metila. Outros exemplos do composto de jasmonato adequados para a invenção podem ser encontrados na, por exemplo, WO 02/080890 e Gfeller et al. Sci. Signal. 2010, Vol. 3, Publicação 109, pp. cm3.

[000106] Em uma outra forma de realização, a composição da invenção tem uma concentração de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) que varia de 1 nM a 100 mM, por exemplo, 1 nM a 99 mM, | nM a 90 mM, | nM a 80 MM, | nM a 70 mM, 1 nM a 60 mM, 1 nM a 50 mM, 1 nM a 40 mM, 1 nM a 30 MM, 1 nM a 20 MM, 1 NM a IO MM, l OM a 5mMM, L nM al mM, 1 nM a 900 uM, 1 nM a 800 uM, 1 nM a 700 uM, 1 nM a 600 uM, 1 nM a 500 uM, 1 nM a 400 uM, 1 nM a 300 uM, 1 nM a 200 uM, 1 nM a 100 UM, 1 nM a 90 uM, 1 nM a 80 uM, 1 nM a 70 UM, 1 nM a 60 UM, 1 nM a 50 UM, 1 nM a 40 uM, 1 NM a 30 UM, | NM a 20 UM, L OM a IOUM, Ll nM a 5 uM, 1 nM a 1 uM, 1 nM a 900 nM, 1 nM a 800 nM, 1 nM a 700 nM, L nM à 600 nM, 1 nM a 500 nM, 1 nM a 400 nM, 1 nM a 300 nM, 1 nM a 200 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 90 nM, 1 nM a SO nM, 1 nM a 7O nMI, 1 nMMa GO AnM,, | nM a 50 nM, | nM a 40 nM, 1 nM a 3O nM, 1 nM a 20 NM, | NM a IO NM, | nMa5nM,lnMalmM,100nMalmM,100nM a 100 uM, 1a 100 uM, a 50 uM, 20 a 30 uM, 100 uM a 10 mM, 100 uM a 100 mM, 1 a 100 mM, 1 a 100 nM, e 59 a 64 nM.

[000107] Em uma outra forma de realização, a composição da invenção tem uma concentração de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) que varia de 100 mM a 1 M, por exemplo, de 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 Ma 1 M, 100 MM a 1 M, 200 mM a 750 mM, ou cerca de 0,8a IM.

[000108] Em uma outra forma de realização, quando a composição é usada para tratar leucemia, a concentração de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) incluído neste ponto varia de 100 uM a 5 mM, 100 uM a 4 mM, 100 uM a 3 mM, 100 uM a 2 MM,100 uM a 1 mM, 100 uM a 0,5 mM, 0,01 mM a cerca de 2 mM, ou cerca de 1 MM, 10 UM a 5 MM, 10 uM a 4 mM, 10 uM a 3 mM, ou 10 uM a 2 MM. Em uma outra forma de realização, quando a composição é usada para tratar um tumor sólido, a concentração de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) incluído neste ponto varia de 1 nM a 1 M (por exemplo, 1 nM a 0,5 M, Il AM a0,1 M, l nM a SOMM, | nMal0mM,lnMa5mM,lOnMalM, oulnM acerca de 1 mM, oul uM a 1 M, ou 1 a 1000 nM, 1 a 500 nM, 1 a 250 nM, de cerca de 1 a 100 nM, 1a50nM, lalOnM,oula5nM).

[000109] Os nanocarregadores ou microcarregadores podem conter ainda moléculas ou fons de não jasmonato além dos compostos de jasmonato. Por exemplo, di-hidrogeno fosfato de 2-aminoetila (ou fosfoetanolamina), 3,7-dimetil-2,6-octadienal (ou citral), salicilato de metila, ácido abscísico, aminoácidos naturais, Ca*, Znº*, ou seus derivados ou análogos. 3,7-Dimetil- 2,6-octadienal pode ser um isômero cis ou trans. Estas moléculas ou fons de não jasmonato podem ser associados ou ligados com os compostos de jasmonato ou com os nano/microcarregadores. Em algumas formas de realização, os compostos que não de jasmonato podem ser contidos no mesmo nano/microcarregador como os compostos de jasmonato. Entretanto, em uma outra forma de realização, os compostos que não de jasmonato são contidos em diferentes nano/microcarregadores do que os compostos de jasmonato, e ambos destes carregadores podem ser administrados concorrentemente. À associação ou a ligação podem ser criadas por intermédio de uma ligação química (por exemplo, uma ligação covalente), uma ligação de hidrogênio, uma força de van der Waals, uma interação de Coulomb, ou os seus semelhantes. Em uma outra forma de realização, o composto que não de jasmonato é encapsulado no nanocarregador/microcarregador. Em uma outra forma de realização, o composto é parcialmente encapsulado no nanocarregador/microcarregador ou na superfície do nanocarregador/microcarregador (por exemplo, como uma parte da superfície de nanocarregador/microcarregador ou fora ligada ainda à superfície).

[000110] Em uma outra forma de realização, o composto de jasmonato nanocarregado ou microcarregado (por exemplo, MJ ou MDJ) pode ser sinteticamente modificado, por exemplo, covalentemente ligado com citral e/ou moléculas de fosforiletanolamina. Especificamente, as reações podem ser realizadas com qualquer um dos grupos carbonila do composto de jasmonato, por exemplo, a cetona (El) no anel de ciclopentila de um composto de jasmonato (por exemplo, MJ ou MDJ) ou a carbonila do éster (E2) do composto de jasmonato. À reação entre a cetona (ou grupo éster) de jasmonato e o grupo amino (R1) de fosforiletanolamina pode resultar na formação de uma imina ou uma hemiaminal (ou amida). O rendimento da reação entre jasmonato e citral pode ser melhorado reduzindo-se primeiro o grupo aldeído de citral para formar um composto citral reduzido (“R2”) ou hidratar a ligação dupla (C6) para formar R3. Estas etapas preliminares resultam nos grupos hidroxila em R2 ou R3, que podem reagir com a cetona (EI) do composto de jasmonato para formar um cetal ou éster, ou reagir com o grupo éster (E2) do composto de jasmonato para formar um novo éster.

[000111] A reação entre estes compostos, isto é, jasmonato (por exemplo, MJ ou MDJ), fosforiletanolamina R1, citral, R2, e R3, pode gerar produtos que incluem, mas não são limitados a: RI-(ENVDMJ; RI-(E2)MJ; R1- (EDMI(E2)- RI; R2-(EDMIJ; R2-(E2)MJ; R2-(EDMI(E2)-R2; R3-(EDMJ; R3-(E2)MJ; R3-(EL)MI(E2)-R3 assim como misturas deles tais como R1- (EDMI(E2)-R2; R2-(ELMI(E2)-R1; RI-(EDMJ (E2)-R3; R3-(EVU)MI(E2)- R1; R2-(EDMI(E2)-R3; R3-(EL)MI(E2)-R2. Em uma outra forma de realização, quinze moléculas derivadas de jasmonato de metila foram sintetizados pelos métodos descritos acima.

[000112] Uma “composição farmacêutica” é uma formulação que contém um composto nanocarregado e/ou microcarregado da presente invenção em uma forma adequada para administração a um indivíduo. Em uma outra forma de realização, a composição farmacêutica é a granel ou em uma forma de dosagem única. A forma de dosagem única é qualquer uma de uma variedade de formas, que inclui, por exemplo, uma cápsula, uma bolsa IV, um tablete, uma bomba única em um inalador de aerossol ou um frasco. À quantidade de ingrediente ativo (por exemplo, uma formulação do composto nanocarregado e/ou microcarregado descrito ou sal, hidrato, solvato ou isômero do mesmo) em uma dose única de composição é uma quantidade eficaz e é variada de acordo com o tratamento particular envolvido. Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que é algumas vezes necessário fazer variações de rotina às dosagens que dependem da idade condições do paciente. A dosagem dependerá também da via de administração. Uma variedade de vias é considerada, que incluem oral, pulmonar, retal, parenteral, transdérmica, — subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inalação, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal, e os seus semelhantes. As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de um composto desta invenção incluem pós, pulverizações, unguentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. Em uma outra forma de realização, o composto ativo nanocarregado e/ou microcarregado é misturado sob condições estéreis com um carregador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, nanocarregadores/microcarregadores), e com qualquer um de preservantes, tampões ou propelentes que são requeridos.

[000113] Como aqui usada, a frase “farmaceuticamente aceitável” refere-se aqueles compostos, materiais, composições, carregadores, e/ou as formas de dosagem que estão, dentro do escopo do julgamento médico criterioso, adequada para o uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurados com uma razão benefício/risco razoável. [0001 14] “Excipiente ou carregador ou solvente farmaceuticamente aceitáveis” significam um excipiente, carregador, ou solvente que são úteis na preparação de uma composição farmacêutica que é no geral segura, não tóxica e nem biologicamente nem de outro modo indesejável, e inclui excipiente que é aceitável para o uso veterinário assim como uso farmacêutico humano. Um “excipiente farmaceuticamente aceitável” como aqui usado inclui tanto um quanto mais do que um de tal excipiente.

[000115] Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com sua via intencionada de administração. Os exemplos de vias de administração incluem administração parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutâneas, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica), e transmucósica. As soluções ou suspensões usadas para as aplicações parenterais, intradérmicas, ou subcutâneas podem incluir os componentes que seguem: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfato de sódio; agentes de quelação tais como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajustamento da toxicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. À preparação parenteral pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.

[000116] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, como aqui usado, refere-se a uma quantidade de um agente farmacêutico para tratar, “melhorar ou prevenir uma doença ou condição identificadas, ou para exibir um efeito detectável terapêutico ou inibidor. O efeito pode ser detectado por qualquer método de ensaio conhecido na técnica. A quantidade eficaz precisa para um indivíduo dependerá do peso corporal, tamanho e saúde do indivíduo; do grau natural da condição; e do produto terapêutico ou combinação dos produtos terapêuticos selecionados para a administração. As quantidades terapeuticamente eficazes para uma dada situação podem ser determinadas pela experimentação de rotina que está dentro da habilidade e julgamento do médico. Em um aspecto preferido, a doença ou condição a serem tratadas é a infecção viral.

[000117] Para qualquer composto (por exemplo, composto nano- carregado e/ou microcarregado aqui descrito), a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaio de cultura de célula, por exemplo, de células neoplásticas, ou em modelos de animal, usualmente ratos, camundongos, coelhos, cachorros, ou porcos. O modelo de animal também podem ser usado para determinar a via de faixa da concentração apropriada de administração. Tal informação pode ser depois usada para determinar doses e vias úteis para a administração em seres humanos. A eficácia e a toxicidade terapêutica/profilática = pode ser determinada pelos procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, EDso (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LDso (a dose letal para 50% da população). A razão da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, e o mesmo pode ser expressado como a razão, LDso/EDso. As composições farmacêuticas que exibem índices terapêuticos grandes são preferidos. Toda dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada, sensibilidade do paciente, e a via de administração.

[000118] A dosagem e administração são administradas para fornecer níveis suficientes do(s) agente(s) ativo(s) ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser levados em conta incluem a severidade do estado da doença, saúde geral do indivíduo, idade, peso, e gênero do indivíduo, dieta, frequência do tempo de administração, combinação(s) medicamentosa(s), reações sensitivas, e tolerância/resposta a terapia. As composições farmacêuticas de ação longa podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana, ou uma vez a cada duas semanas dependendo da taxa de depuração da meia vida da formulação particular.

[000119] As composições farmacêuticas que contêm compostos ativos nanocarregados e/ou microcarregados da presente invenção podem ser fabricado em uma maneira que é no geral conhecida, por exemplo, por meios da mistura convencional, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento, ou processos de liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas em uma maneira convencional usando um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis que compreendem excipientes e/ou auxiliares que facilitam o processamento do composto ativo nanocarregado e/ou microcarregados em preparações que podem ser farmaceuticamente usadas. Naturalmente, a formulação apropriada é dependente da via de administração escolhida.

[000120] As composições farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções aquosas adequadas (quando solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para a administração intravenosa, adequada os carregadores incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N. J.) ou solução salina tamponada por fosfato (PBS). Em todo os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluída até o grau em que seringabilidade fácil exista. A mesma deve ser estável sob as condições de armazenagem de fabricação e deve ser preservada contra da ação de contaminação de microorganismos tais como bactérias e fungos. O carregador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e os seus semelhantes), e suas misturas adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lectina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso da dispersão e pelo uso dos tensoativos. A prevenção da ação dos microorganismos pode se obtida pelos vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerossal, e os seus semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, gelatina de monoestearato de gelatina.

[000121] As soluções injetáveis adequadas podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo nanocarregado e/ou microcarregado na quantidade requerida em um solvente apropriado com uma ou mais combinações de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela esterilização filtrada. No geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo nanocarregado e/ou microcarregado em um veículo estéril que consiste em um meio de dispersão básica e os outros ingredientes requeridos destes enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação das soluções injetáveis adequadas, métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução deste previamente filtrada estéril.

[000122] As composições orais no geral incluem um diluente inerte ou um carregador farmaceuticamente aceitável comestível. Elas podem ser fechadas em cápsulas de gelatina ou comprimidos em tabletes. Para o propósito da administração terapêutica oral, o composto ativo nano-carregado e/ou microcarregado pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de tabletes, comprimidos, ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas usando um carregador fluídico para o uso como um líquido para limpeza bucal, em que o composto no carregador fluídico é aplicado oralmente e bochechado e expectorado ou engolido. Os agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os tabletes, pílulas, cápsulas, comprimidos e os seus semelhantes podem conter qualquer um dos ingredientes que seguem, ou compostos de uma natureza similar: um ligando tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou sabor de laranja.

[000123] Para administração pela inalação, os compostos nano- carregados e/ou microcarregados são liberados na forma de um pulverizador de aerossol a partir do recipiente ou dispersador pressurizado, que contêm um propelente adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador.

[000124] A administração sintética também pode ser por meios transmucósicos ou transdérmicos. Para a administração transmucósica ou transdérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são no geral conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para a administração transmucósica, detergentes, sais biliares, e derivados do ácido fusídico. A administração transmucósica pode ser realizada através do uso das pulverizações nasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, o composto ativo nanocarregado e/ou microcarregados são formulados nos unguentos, salves, géis, ou cremes como no geral conhecido na técnica.

[000125] As composições farmacêuticas dos compostos ativos nanocarregados e/ou microcarregados podem ser preparadas com carregadores farmaceuticamente aceitáveis que protegerão o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, que inclui implantes e sistemas de liberação microencapsulada. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como vinil acetato de etilenoy polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para a preparação de tais formulações estarão evidentes para aqueles habilitados na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente da Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.

[000126] É especialmente vantajosos formular composições orais ou parenterais em forma de dosagem única para a facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem única como aqui usado refere-se a unidades fisicamente descritas adequadas como dosagem unitária para o indivíduo a ser tratado; cada unidade que contém uma quantidade predeterminada do composto ativo nanocarregado e/ou microcarregado calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carregador farmaceuticamente requerido. A especificação para as formas de dosagem únicas da invenção são detectadas e diretamente dependentes das características únicas do composto ativo nanocarregado e/ou microcarregado e o efeito terapêutico particular a ser obtido.

[000127] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, pacote, ou dispensador junto com as instruções para a administração.

[000128] Os compostos de jasmonato usados para a composição da presente invenção incluem seus sais. Todas estas formas também são consideradas dentro do escopo da invenção reivindicada.

[000129] Como aqui usado, “sais farmaceuticamente aceitáveis” refere- se a derivados dos compostos da presente invenção em que o composto precursor é modificado pela fabricação do ácido ou e seus sais de base. Os exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, sais minerais ou ácidos orgânicos de resíduos básicos tais como

40 / 89 aminas, sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos tais como ácidos carboxílicos, e os seus semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem a conversão dos sais não tóxicos ou os sais de amônia quaternária do composto precursor formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem, mas não são limitados a, aqueles derivados de ácidos inorgânicos e orgânicos selecionados de 2-acetoxibenzóico, 2-hidroxietano sulfônico, acético, ascórbico, benzeno sulfônico, benzóico, bicarbônico, carbônico, cítrico, —“edético, etanodissulfônico, 1,2-etano-sulfônico, — fumárico, glicoeptônico, glicônico, glutâmico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabâmico, bromídrico, clorídrico, 1odídrico, hidroximaléico, hidroxinaftálico, isetiônico, láctico, lactobiônico, lauril sulfônico, maléfico, málico, mandélico, metano sulfônico, napsílico, nítrico, oxálico, pamóico, pantotênico, fenilacético, fosfórico, poligalacturônico, propiônico, salicíclico, esteárico, subacético, succínico, sulfâmico, sulfanílico, sulfúrico, tânico, tartárico, tolueno sulfônico, e os aminoácidos que ocorrem naturalmente, por exemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.

[000130] Outros exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem ácido hexânico, ácido ciclopentano propiônico, ácido pirúvico, ácido malônico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, ácido cinâmico, ácido 4- clorobenzenossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 4-tolueno- sulfônico, ácido canforsulfônico, ácido 4-metilbiciclo-[2,2,2]-oct-2-eno-1- carboxílico, ácido 3-fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido mucônico, e os seus semelhantes. A presente invenção também abrange sais formados quando um próton ácido presente no composto precursor é substituído por um fon metálico, por exemplo, um fon de metal alcalino, um fon alcalino terroso, ou um fon de alumínio; ou coordenados com uma base orgânica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metil-glicamina, dietilamina, dietilaminoetanol,

etilenodiamina, imidazol, lisina, arginina, morfolina, 2- hidroxietilmormorfolina, dibenziletileno-diamina, trimetilamina, piperidina, pirrolidina, benzilamina, hidróxido de tetrametilamônio e os seus semelhantes.

[000131] Deve ser entendido que todas as referências para OS sais farmaceuticamente aceitáveis incluem formas de adição de solvente (solvatos) ou formas de cristais (polimorfos) como aqui definido, do mesmo sal.

[000132] Os compostos de jasmonato usados na composição farmacêutica da presente invenção também podem ser preparados como ésteres, por exemplo, ésteres farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, um grupo funcional do ácido carboxílico em um composto pode ser convertido ao seu éster correspondente, por exemplo, um metil éster, etílico ou outro éster. Também, um grupo de álcool em um composto pode ser convertido ao seu éster correspondente, por exemplo, um éster de acetato, propionato ou outro éster.

[000133] Os compostos de jasmonato usados na composição farmacêutica da presente invenção também podem ser preparados como pró- medicamentos, por exemplo, pró-medicamentos farmaceuticamente aceitáveis. Os termos “pró-medicamento” e “pró-medicamento” são aqui usados intercambiavelmente e referem-se a qualquer composto que libera um medicamento precursor ativo in vivo. Visto que os pró-medicamentos são conhecidos por realçar numerosas qualidades desejadas de produtos farmacêuticos (por exemplo, solubilidade, biodisponibilidade, fabricação, etc.), os compostos nanocarregados e/ou microcarregados da presente invenção pode ser liberado na forma de pró-medicamento. Assim, a presente invenção é intencionada abranger os pró-medicamentos dos compostos presentemente reivindicados, os métodos de liberação das mesmas composições que contêm os mesmos. Os “pró-medicamentos” são intencionada incluir quaisquer carregadores covalentemente ligados que liberam um medicamento precursor ativo da presente invenção in vivo quando tal pró medicamento é administrado a um indivíduo. Os pró-medicamentos na presente invenção são preparados pela modificação dos grupos funcionais presentes no composto de um tal modo que as modificações são clivadas, na manipulação de rotina ou in vivo, para o composto precursor. Os pró- medicamentos incluem compostos da presente invenção em que um grupo hidroxi, amino, sulfidrila, carbóxi ou carbonila é ligada a qualquer grupo que pode ser clivado in vivo para formar um grupo hidroxila livre, amino livre, sulfidrila livre, carbóxi livre ou carbonila livre, respectivamente.

[000134] Os exemplos de pró-medicamentos incluem, mas não são limitados a, ésteres (por exemplo, derivados de acetato, dialquilamino- acetatos, formiatos, fosfatos, sulfatos e benzoato) e carbamatos (por exemplo, N,N-dimetilaminocarbonila) de grupos de hidróxi funcionais, ésteres (por exemplo, etil ésteres, ésteres de morfolinoetanol) de grupos de carboxila funcionais, derivados de N-acila (por exemplo, N-acetila) N-base de Mannich, bases de Schiff e enaminonas de grupos de amino funcionais, oximas, acetais, cetais e ésteres de enol de grupos funcionais de cetona e aldeído em compostos da invenção, e os seus semelhantes, Ver Bundegaard, H., Design of Prodrugs, p 1-92, Elesevier, Nova Iorque-Oxford (1985).

[000135] Os compostos de jasmonato usados na composição farmacêutica da presente invenção também podem ser seus metabólitos, tais como metabólitos obtidos a partir do ácido e / ou catálise básica, por exemplo, ácido cis-jasmônico, ácido trans-jasmônico, cis-jasmonatos de hidroximetila, trans-jasmonatos de hidroximetila, ácido hidroxil cis-jasmônicos, ácido hidroxil trans-jasmônicos, lactonas obtidas a partir da transesterificação, e os seus semelhantes; metabólitos obtidos a partir da reação oxidativa, por exemplo, cis-jasmonatos de cetometila, trans-jasmonatos de cetometila, cis- jasmonatos de hidroximetila, trans-jasmonatos de hidroximetila, dióis obtidos a partir das reações oxidativas, estereoisômeros (por exemplo, enantiômeros ou diastereoisômeros) obtidos a partir das reações oxidativas, epóxidos obtidos a partir das reações oxidativas, e lactonas obtidas a partir das reações oxidativas; produtos de desidratação de jasmonato de metila, ácido jasmônico, e jasmonato de di-hidrometila; e metabólitos formados através de processos intracelulares, tais como fosforilação (por exemplo, por intermédio da cinase) ou qualquer outra reação com receptores (tais como receptor AKR2 e receptores ligados a G-proteína), e interações com organelas celulares. Os exemplos de metabólitos de MDJ incluem, mas não são limitados a jasmonato de metila, cucurbato de metila, 7-iso-jasmonato de metila, 2,3-dides-hidro- MDJIJ, 3 4-dides-hidro-MDJ, 3,7-dides-hidro-MDJ, 4,5-dides-hidro-MDJ, 12- hidróxi-MDJ, 11-hidróxi-MDJ, 8-hidróxi-MDJ, tuberonato de metila, 12-O- glicosil-MDJ, 11-O-glicosil-MDJ, 12-O-glicosil-MJ, 11-O-glicosil-MJ, 7, 8- dides-hidro-MDJ, cis-jasmona, di-hidrojasmona, salicilato de metila, e ácido abscísico.

[000136] Adicional ou alternativamente, outros compostos relacionados com jasmonato podem ser usados na composição farmacêutica da presente invenção, tais como aqueles formos a partir dos compostos de ciclopentanona ou com base em ciclopentanona derivados do ácido (LA). Ver, por exemplo, Annals of Botany 100: 681-697, 2007; e Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. 48:355-81.

[000137] A composição farmacêutica que inclui os compostos nanocarregados —e/ou microcarregados de jasmonato, Ou sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, pró-medicamentos ou seus metabólitos, são administrados oral, nasal, transdérmica, pulmonar, inalação, bucal, sublingual, intraperintoneal, subcutânea, intramuscular, intravenosa, retal, intrapleural, intratecal e parenteralmente. Em uma outra forma de realização, a composição é uma composição injetável. Uma pessoa habilitada na técnica reconhece as vantagens de certas vias de administração.

[000138] O regime de dosagem é selecionado de acordo com uma

44 / 89 variedade de fatores que inclui tipo, espécie, idade, peso, sexo e condições médicas do paciente; a severidade da condição a ser tratada; a via de administração; a função renal e hepática da paciente; e o composto particular ou seu sal utilizado.

Um médico ou veterinário de habilidade comum podem facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz do medicamento requerido para prevenir, conter ou deter o progresso da condição.

O regime de dosagem que pode ser usado nos métodos da invenção incluem, mas não são limitados a, diário, três vezes por semana (intermitente), duas vezes por semana, semanalmente, ou a cada 14 dias.

Em certas formas de realização, o regime de dosagem inclui, mas não é limitado a, dosagem mensal ou a dosagem a cada 6 a 8 semanas.

Em certas formas de realização, a dosagem varia durante o período de tratamento.

Por exemplo, uma concentração alta de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) em nano/micro-carregadores, que varia de 1 MM a 1 M (por exemplo, 1 a 1000 mM, 1 a 900 mM, 1 a 800 mM, 1 a 700 mM, 1 a 600 mM, 1 a 500 mM, 1 a 400 MM, 1 a 300 MM, l a 200 mM, 1 a 100 mM, 1 a 50 mM, 1 a 40 MM, 1 a 30 MM, 1a 20 mM, 1 a 10 mM, 100 mM a 1 M) pode ser administrada nos primeiros 3 a 7 dias antes de uma concentração mais baixa do composto nano/micro-carregado é administrada (por exemplo, de 100 uM a 5 MM, 100 uM a 4 MM, 100 uM a 3 mM, 100 uM a 2 mM, 100 uM a 1 mM, 0,01 mM a cerca de 2 mM, ou a cerca de 1 MM, 10 UM a 5 MM, 10 NM a 4 m6M, 10 UM a 3 MM, ou 10 UM à 2 mM). Em uma outra forma de realização, quando a composição é usada para tratar um tumor sólido, a concentração de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) incluído neste ponto varia de 1 nM a 1 M (por exemplo, 1nMa0,5 M, | nMa0,1 M, 1 NM a 50 MM, | NM a 10 MM, 1 NM a 5 MM, nMa1M,oulnM acerca de 1 MM, ou luMa1lM,oulal1l000nM,la 500 nM, 1 a 250 nM, de cerca de 1 a 100 nM, 1a 5O0nNM, la lOnM, ou 1a5 nM) para tratar câncer.

Este regime de dosagem pode ser mais eficaz no certo tipo de câncer (por exemplo, leucemia) do que os outros.

Alternativamente,

uma dose baixa pode ser administrada primeiro seguida por uma dose alta dos jasmonatos nano/micro-carregados.

[000139] As técnicas para a formação e administração dos compostos nanocarregados e/ou microcarregados descritos da invenção podem ser encontrados na Remington: the Science Practice of Pharmacy, 19º edição, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Em uma forma de realização, os compostos nanocarregados e/ou microcarregados aqui descritos, e os sais farmaceuticamente aceitáveis, pró-medicamentos, metabolitos, ou seus ésteres, são usados nas preparações farmacêuticas em combinação com um excipiente, solvente ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem enchedores ou diluentes sólidos inertes e soluções aquosas ou orgânicas estéreis. Os compostos nanocarregados e/ou microcarregados estarão presentes em tais composições farmacêuticas em quantidades suficientes para fornecer a quantidade de dosagem desejada na faixa aqui descrita. Métodos de Sintetizar Jasmonatos nanocarregados ou microcarregados

[000140] Os “compostos de jasmonato nanocarregados — ou microcarregados e composição destes aqui descritos podem ser preparados com as técnicas conhecidas no ramo ou os métodos aqui descritos.

[000141] Por exemplo, quando ciclodextrina é usada como o nanocarregador, os compostos nanocarregados da invenção podem ser preparado misturando-se um composto de jasmonato de interesse com ciclodextrinas em uma solução adequada (por exemplo, solução aquosa), preferivelmente em temperatura elevada. Nas formas de realização da presente invenção, os nanocarregadores ou microcarregadores como formados contêm de cerca de 1 a 100 moles (por exemplo, de 1 a 90 moles, de 1 a 80 moles, de 1 a 70 moles, de 1 a 60 moles, de 1 a 50 moles, de 1 a 40 moles, de 1 a 30 moles, de 1 a 20 moles, de 1 a 10 moles, ou de 1 a 5 moles) do composto de jasmonato por mole do ciclodextrina. Descrições mais

46 / 89 detalhadas podem ser encontradas, por exemplo, na, US 2008/044364, EP 392608, e WO 2007/145663. Os microcarregadores de ciclodextrina podem ser formados de grupos de nanocarregadores de ciclodextrina.

[000142] Como para um outro exemplo, quando LDE (ou um lipossoma) é usado como nanocarregador ou microcarregador, os compostos nanocarregados ou microcarregados da invenção podem ser preparados pela incubação de um composto de jasmonato de interesse nos LDEs pré formados (ou lipossomas) em uma solução adequada (por exemplo, solução aquosa) em uma temperatura abaixo da temperatura ambiente (por exemplo, de cerca de 4ºC) e depois dialisando a emulsão resultante com um tampão adequado para obter o composto de jasmonato carregado com LDE (ou carregado com lipossomas) desejado. Nas formas de realização da presente invenção, os nanocarregadores ou micro-carregadores como formados contêm de cerca de 1 a 100 moles (por exemplo, de 1 a 90 moles, de 1 a 80 moles, de 170 moles, de 1 a 60 moles, de 1 a 50 moles, de 1 a 40 moles, de 1 a 30 moles, de 1 a 20 moles, de 1 a 10 moles, ou de 1 a 5 moles) do composto de jasmonato per mole de LDE (ou lipossoma).

[000143] Em uma outra forma de realização, os microcarregadores de LDE são preparados como segue. Uma mistura de lipídeo que consiste de fosfatidilcolina (por exemplo, 40 mg), oleato de colesterila (por exemplo, 20 mg), trioleína (por exemplo, 1 mg), e colesterol (por exemplo, 0,5 mg) é primeiro seca a vácuo por 16 h a 4 ºC. Uma emulsão dos lipídeos é depois preparada em Tris-HCI 0,01 M, pH 8,0 pela irradiação ultrassônica, por exemplo, usando um equipamento Branson, modelo 450A (Ultrasound Arruda, São Paulo, Brasil) 125 watts de energia por 3 horas, sob uma atmosfera de nitrogênio, com temperaturas variando entre 51 e 55 ºC. Para obter a LDE na faixa de diâmetro ou faixa de tamanho desejada para encapsular MDJ, a emulsão é purificada em duas etapas de centrifugação (por exemplo, ultracentrífuga, Beckman rotor SW-41). Na primeira etapa, a fração do tubo superior, que resulta da centrifugação a 200.000 g por 30 min a 4 ºC, é removida pela aspiração (1 ml) e descartada. Dentro da suspensão remanescente é depois adicionado brometo de potássio (KBr) para ajustar a densidade a 1,21 g / ml. Depois da segunda centrifugação (200.000 xg por 2 horas a 4 ºC), a LDE será recuperada no topo do tubo através da aspiração. O KBr em excesso é removido pela diálise contra duas mudanças de 1000 volumes de Tris HCl a 0,01 M, pH 8. Finalmente, a emulsão é esterilizada pela filtração em membrana Millipore com porosidade de 0,22 mm em fluxo laminar e armazenada a 4 ºC por até trinta dias. O tamanho das partículas de LDE em suspensão pode ser determinado por intermédio das medições de dispersão de luz e microscopia. O potencial de superfície das partículas de LDE em suspensão pode ser medido em um equipamento Analisador de Potencial Zeta ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation) (Lima & Maranhao, 2004).

[000144] Em uma outra forma de realização, a incorporação de um composto de jasmonato (por exemplo, MDJ) dentro de carregadores de LDE é realizada como segue. Uma solução em etanol de 50 ml de MDJ é adicionada dentro de uma emulsão de LDE de 500 ml (tal como aquela preparada acima) para compor uma mistura tendo uma concentração de 3 mg de MDJ por 1 ml. A mistura é agitada na temperatura ambiente por 15 minutos, e depois incubada a 4 ºC por 72 h. A mistura incubada é depois dializada duas vezes contra um tampão estéril de 200 ml (por exemplo, Tris-HCIl, 0,01 M). À emulsão dializada pode ser depois analisada usando GC-MS para determinar a quantidade de MDJ encapsulado no ou ligado com os carregadores de LDE.

[000145] Em certas formas de realização, a nanoemulsão da invenção é formada, além do composto de jasmonato, de um ou mais ingredientes selecionados de um polímero, tal como polímero de poli(c-caprolactona) ou PCL com um Mw médio de 65.000, citral, fosforiletanolamina, monoestearato de sorbitano (Spanº60), e polissorbato 80 (Tweenº80). A emulsão pode ser

48 / 89 preparada por intermédio de um método similar a aquele descrito por Fessi et al. Drug Des Deliv 4(4): 295-302 (1989). Em resumo, uma emulsão de óleo/água (O/W) é fabricada pela agitação vigorosa do óleo (por exemplo, 10,0 g) e os compostos ativos (por exemplo, MDJ) sozinho ou em uma mistura variando de 0,05 a 0,50 g (constituintes contidos dentro do carregador) em água (por exemplo, 400 ml) pelo uso de um homogeneizador Ultra-Turrax (IKA TI10 basic Ultra-turraxº, Ika-Werke, Staufen, Alemanha), por exemplo, a 15.000 rpm, por exemplo, por 1 min. Depois uma solução orgânica que é preparada por exemplo, pela dissolução de um polímero (por exemplo, PCL, entre 0,2 e 2,0 g) em acetona (400 ml) é vertida sob agitação magnética moderada, dentro da emulsão O/W usando uma bomba peristáltica a 10% (PumpPro TPM 600 55 RPM, Waton-Marlow, Wilmington, UK). Depois de 10 min de agitação, uma solução aquosa preparada por exemplo, pela, dissolução de 1,0 g de Tweenº80 em água (200 ml) também é vertida sob agitação magnética moderada dentro da fase de emulsão. Mais uma vez, uma bomba peristáltica, por exemplo, a 10% é usada. Depois de completar a adição, a mistura de reação pode ser agitada ainda, por exemplo, por 10 min. Na última etapa, o solvente orgânico é removido e o volume da nanoemulsão é concentrado, por exemplo, até 500 ml sob pressão reduzida (por exemplo, usando um rotavapor tal como R-21, Biichi, Suíça). A segunda etapa, 1.e., a adição da solução de polímero à emulsão é opcional.

[000146] Os métodos para caracterizar os compostos nanocarregados e/ou microcarregados incluem Relação de Análises de Estruturas Qualitativas (QSAR) teóricas aplicadas com o software HYPERCHEM usando o método semi-empírico. Neste sentido QSAR é usado para estimar a estabilidade dos compostos —nanocarregados formados de ácido jasmônico ou di- hidrojasmonato de metila e ciclodextrinas nativas (CDs). Em uma outra forma de realização, o cálculo é realizado com o método semi-empírico AMI usando gradiente conjugado Polak-Rabiere com rms de Ol

49 / 89 kcal .(ângstron.mol)"'.

[000147] Qualitativamente a medição de AH (=Ejiigação) reflete a mais baixa da energia total do sistema quando a formação de composto nanocarregado e/ou microcarregado (isto é, a associação ou ligação entre nano/micro-carregadores e um dos compostos de jasmonato) ocorre.

[000148] Portanto, a estabilidade da reação representada pela Engação pode ser estimada a partir da diferença entre a energia do composto nanocarregado e/ou microcarregado como formado e a energia total dos nano/micro-carregadores e compostos.

[000149] A Tabela 1 abaixo mostra os resultados do cálculo Erigação para a associação entre ácido jasmônico ou di-hidrojasmonato de metila e as CDs nativas. Tabela 1: O resultado do AH da estabilização.

, Egação (Kcal.mo1-1) Ácido jasmônico.-a-CD -9,63 Ácido jasmônico-B-CD -19,64 Ácido jasmônico-y-CD -2,02 Di-hidrojasmonato de metila-a-CD 8,44 Di-hidrojasmonato de metila-B-CD -31,35 Di-hidrojasmonato de metila-y-CD -18,23

[000150] Como demonstrado na Tabela 1, com exceção do complexo entre a-CD e di-hidrojasmonato de metila, todos os outros compostos nanocarregados são estáveis. Também, a associação entre o composto de jasmonato e B-CD produz os compostos nanocarregados mais estáveis. Métodos de Tratamento

[000151] A presente invenção fornece métodos para o tratamento de um distúrbio o curso do qual é influenciado pela angiogênese anormal (ou um “distúrbio relacionado com a angiogênese”). O método inclui administrar a um indivíluo em necessidade de tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto nanocarregado e/ou microcarregado da presente invenção, ou um sal, pró-medicamento, metabólito, solvato, ou estereoisômero do mesmo farmaceuticamente aceitáveis.

[000152] Como aqui usado, um “indivíduo em necessidade do mesmo” é um indivíduo tendo um distúrbio em que a angiogênese anormal desempenha uma parte, ou um indivíduo tendo um risco aumentado de desenvolver tal distúrbio em relação à população como um todo. Um indivíduo em necessidade do mesmo pode ter uma condição pré-cancerosa. Preferivelmente, um indivíduo em necessidade do mesmo tem câncer. Um “indivíduo” inclui um mamífero. O mamífero pode ser por exemplo, qualquer mamífero, por exemplo, um ser humano, primata, pássaro, camundongo, rato, ave doméstica, cão, gato, vaca, cavalo, cabra, camelo, ovelha ou um porco. Preferivelmente, o mamífero é um ser humano.

[000153] Um exemplo de distúrbio relacionado com a angiogênese é câncer. Como aqui usado, o termo “câncer” inclui tumores sólidos assim como tumores hematológicos e/ou malignidades. Os cânceres exemplares incluem, mas não são limitados a, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados com a AIDS, linfoma relacionado com a AIDS, câncer anal, câncer anorretal, câncer do canal anal, câncer do apêndice, astrocitoma cerebelar da infância, astrocitoma cerebral da infância, carcinoma de célula basal, câncer de pele (não melanoma), câncer biliar, câncer do duto biliar extraepático, câncer do duto biliar intraepático, câncer vesical, câncer da bexiga urinária, câncer da junta óssea, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, câncer cerebral, tumor cerebral, glioma do tronco cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, caminho visual e glioma hipotalâmico, câncer mamário, adenomas/carcinóides brônquicos, tumor carcinóide, gastrointestinal, câncer do sistema nervoso, linfoma do sistema nervoso, câncer do sistema nervoso central, linfoma do sistema nervoso central, câncer cervical, cânceres da infância, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, câncer colorretal, linfoma de célula T cutâneo, neoplasma linfóide, fungoides micose, Síndrome de Seziary, câncer endometrial, câncer esofágico, tumor de célula germinativa extracraniana, tumor de célula germinativa extragonadal, câncer do duto biliar extraepático, câncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico (estomacal), tumor carcinóide gastrointestinal, tumor estrômico gastrointestinal (GIST), tumor de célula germinativa, tamor de célula germinativa ovariana, glioma de tumor trofoblástico gestacional, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, câncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, câncer ocular, tumores da célula da ilhota (pâncreas endócrino), Sarcoma de Kaposi, câncer renal, câncer renal, câncer renal, câncer da laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia de célula pilosa, câncer labial e da cavidade oral, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer pulmonar de célula pequena, linfoma relacionado com a AIDS, linfoma que não Hodgkin, linfoma do sistema nervoso central primário, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (olho), carcinoma de célula de merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso metastático, câncer da boca, câncer da lingua, síndrome da neoplasia endócrina múltipla, micose fungoides, síndromes mielodisplásticas, doenças mielodisplásticas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crônica, leucemia mielóide aguda, mieloma múltiplo, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma, câncer oral, câncer da cavidade oral, câncer orofaríngeo, câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor ovariano de potencial maligno baixo, câncer pancreático, câncer pancreático da célula da ilhota, sino paranasal e câncer da cavidade nasal, câncer da paratireóide, câncer peniano, câncer faríngeo, feocromocitoma, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor pituitário, neoplasma de célula plasmática/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar, câncer prostático (carcinoma da próstata ou adenocarcinoma da próstata, que inclui câncer prostático resistente a medicamento múltiplo), câncer retal, pelvis renal e ureter, câncer de célula transicional, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer da glândula salivar, família ewing de tumores de sarcoma, Sarcoma de Kaposi, sarcoma de tecido mole, câncer uterino, sarcoma uterino, câncer de pele (não melanoma), câncer de pele (melanoma), carcinoma de pele da célula de merkel, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecido mole, carcinoma de célula escamosa, câncer estomacal (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, câncer testicular, câncer da garganta, timoma, carcinoma de timoma e tímico, câncer da tireóide, câncer de célula transicional da pelvis renal e ureter e outros órgãos urinários, tumor trofoblástico gestacional, câncer uretral, câncer uterino endometrial, sarcoma uterino, câncer do corpo uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, e Tumor de Wilm.

[000154] Outros exemplos de distúrbios relacionados com a angiogênese incluem doenças oculares (por exemplo, degeração macular relacionada com a idade ou distúrbios relacionados com a angiogênese do segmento posterior do olho), doenças cardiovasculares (por exemplo, aterosclerose), inflamação crônica (por exemplo, artrite reumatóide ou doença de Crohn), diabetes (por exemplo, retinopatia diabética), psoríase, endometriose, e adiposidade. Ver, por exemplo, Pharmacological Reviews 52: 237 268, 2001.

[000155] A presente invenção fornece métodos para o tratamento de um distúrbio relacionado com NF-«B, tal como uma infecção viral, bacteriana ou fúngica. O método inclui administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto nanocarregado e/ou microcarregado da presente invenção, ou um sal, pró- medicamento, — metabólito, solvato, ou estereoisômero do mesmo farmaceuticamente aceitáveis.

[000156] Como aqui usado, “tratamento” ou “tratar” descreve o controle e cuidado de um paciente com o propósito de combater uma doença, condição, ou distúrbio e inclui a administração de um composto nanocarregado e/ou microcarregado da presente invenção, ou um sal, pró- medicamento, metabólito, ou solvato do mesmo farmaceuticamente aceitáveis, para aliviar os sintomas ou complicações de uma doença, condição ou distúrbio, ou para eliminar a doença, condição ou distúrbio.

[000157] Um composto nanocarregado e/ou microcarregado da presente invenção, ou um sal, pró-medicamento, metabólito, ou solvato do mesmo farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser usados para prevenir uma doença, condição ou distúrbio. Como aqui usado, “prevenção” ou “prevenir” descreve reduzir ou eliminar o início dos sintomas ou complicações da doença, condição ou distúrbio.

[000158] Como aqui usado, o termo “aliviar” é intencionado a descrever um processo pelo qual a severidade de um sinal ou sintoma de um distúrbio é diminuído. Importantemente, um sinal ou sintoma podem ser aliviados sem serem eliminados. Em uma forma de realização preferida, a administração de composições farmacêuticas da invenção leva à eliminação de um sinal ou sintoma, entretanto, a eliminação não é requerida. As dosagens eficazes são esperadas diminuir a severidade de um sinal ou sintoma. Por exemplo, um sinal ou sintoma de um distúrbio tal como câncer, que podem ocorrer em locais múltiplos, são aliviados se a severidade do câncer é diminuída dentro de pelo menos um de locais múltiplos.

[000159] Todas as patentes, pedidos de patente, e publicações aqui mencioadas são por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades. Entretanto, onde uma patente, pedido de patente, ou publicação que contêm definições expressas são incorporadas por referência, estas definições expressas devem ser entendidas aplicar-se à patente, pedido de patente, ou publicação incorporada em que eles são encontrados, e não ao resto do texto deste pedido, em particular a reivindicação deste pedido.

[000160] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com as suas formas de realização específicas preferidas, que a descrição precedente assim como os exemplos que seguem, são intencionados a ilustrar não limitar o escopo da invenção. Será entendido por aqueles habilitados na técnica que várias mudanças podem ser feitas equivalentes podem ser substituídos sem divergir do escopo da invenção, e além disso que outros aspectos, vantagens e modificações estarão evidentes a aqueles habilitados na técnica à qual a invenção refere-se.

[000161] Todas as porcentagens e razões aqui usadas, a menos que de outro modo indicado, são em peso. Outros traços e vantagens da presente invenção estão evidnetes a partir dos exemplos diferentes. Os exemplos fornecidos ilustram componentes e metodologia diferentes úteis na prática da presente invenção. Os exemplos não limitam a invenção reivindicada. Com base na presente descrição o técnico habilitado pode identificar e utilizar outros componentes e metodologia úteis para a prática da presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese de MDJ carregado com LDE

[000162] Uma mistura de lipídeco que consiste de 40 mg de fosfatidilcolina, 20 mg de oleato de colesterol, 1 mg de trioleína, e 0,5 mg de colesterol foi primeiro secada a vácuo por 16 h a 4 ºC. Uma emulsão dos lipídeos foi depois preparada em Tris-HCI 0,01 M, pH 8,0 pela irradiação ultrassônica, usando um equipamento Branson, modelo 450A (Ultrasound Arruda, São Paulo, Brasil) 125 watts de energia por 3 horas, sob uma atmosfera de nitrogênio, com temperaturas variando entre 51 e 55 ºC. Para obter a LDE na faixa de diâmetro ou faixa de tamanho desejados para encapsular MDJ, a emulsão foi purificada em duas etapas de centrifugação (por exemplo, ultracentrífuga, Beckman rotor SW -41). Na primeira etapa, a fração do tubo superior, que rsulta da centrifugação a 200.000 g por 30 min a

4 ºC, foi removida pela aspiração (1 ml) e descartada. Dentro da suspensão remanescente foi depois adicionado brometo de potássio (KBr) para ajustar a densidade a 1,21 g / ml. Depois da segunda centrifugação (200.000 xg por 2 horas a 4 ºC), a LDE foi coletada da fração de topo do tubo através da aspiração. O KBr em excesso foi removido pela diálise contra duas mudanças de 1000 volumes 0,01 M de Tris HCl, pH 8. Finalmente, a emulsão foi esterilizada pela filtração em membrana Millipore de porosidade de 0,22 mm em fluxo laminar e armazenada a 4 ºC por até trinta dias. O tamanho das partículas de LDE em suspensão foi determinada por intermédio das medições de dispersão de luz e microscopia como sendo de 29 a 400 nm. O potencial de superfície das partículas de LDE em suspensão foi medido em um equipamento “Analisador de Potencial Zeta ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation) (Lima & Maranhao, 2004) como estando entre -5,43 mV e -7,42 mV aproximadamente.

[000163] Uma solução em 50 ml de etanol de MDJ foi adicionada em 500 ml de emulsão de LDE preparada acima para compor uma mistura tendo uma concentração de 3 mg de MDJ por 1 ml. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 15 minutos, e depois incubada a 4 ºC por 72h. À mistura incubada foi depois dializada duas vezes contra 200 ml de um tampão de Tris-HCl1 0,01 M estéril. A emulsão dializada foi analisada usando GC-MS para determinar a quantidade de MDJ encapsulado nos ou ligado com os carregadores de LDE. Foi determinado que a razão molar de LDE para MDJ está entre 1/10 e 1/5. Exemplo 2: Síntese de MDJ carregado com fosfatidilcolina de soja lipossômica e MDJ carregado com polímero

[000164] MDJ carregado com lipossoma

[000165] Dentro de uma garrafa transparente com uma tampa, quantidades adequadas de tensoativo não iônico de óleo de mamona polioxietileno-40-Hidrogenado (ORPH) (EUMULGINº HRE 40) e fosfatidilcolina de soja (FS) (Epikuron & 200) com uma razão molar de 1:1 de ORPH/FS foram adicionados. Oleato de sódio colesterol foram depois adicionados com uma razão molar de 1:1 com base em uma razão molar de oleato de sódio/ORPH 1:5. A mistura resultante foi filtrada através de uma membrana de 0,22 um. A solução filtrada foi adicionada dentro de uma garrafa estéril, depois MDJ (96%, adquirido da Sigma-Aldrich) foi adicionado para atingir uma concentração de 10 mg por 1 ml da nanoemulsão resultante (esta quantidade pode variar de 7 mg a 21 mg de MDJ por 1 ml da nanoemulsão). A nanoemulsão homogeneizada foi gerada por intermédio de agitação de turbilhão alternando com um período de repouso. Em particular, a mistura na garrafa estéril foi sonificada pelo uso do Processador de Líquido Ultrassônico SonicO&, (modelo XL2020TM 220 watts), operado em uma maneira descontínua, por 20 minutos na temperatura ambiente. Depois da sonificação, a nanoemulsão foi centrifugada a 10.000 rpm por 15 minutos para o descarte do resíduo liberadofrom dosonificador de vareta de titânio. À mistura resultante foi dializada contra um tampão de Tris-HCI, pH 7, 2 (fase aquosa). O tamanho dos lipossomas da nanoemulsão foi medido ser de 50 a 500 nm. Também foi determinado que a razão molar do lipossoma para MDJ está entre 1/10 e 1/5.

[000166] MDJ carregado com polímero/Citral/Fosforiletanolamina

[000167] Poli(c-caprolactona) tendo Mw médio de 65.000, Monoestearato de sorbitano (Span 60), e Polissorbato 80 (Tween 80) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Todos os solventes orgânicos usados foram de grau HPLC adquirido da J. T. Baker (Ecatepec, México). Água Ultrapura foi produzida em casa pelo Sistema Milli-Q (18M52) (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). As nanopartículas que contém citral (3,7-dimetil-2,6-octadienal), fosforiletanolamina e/ou jasmonato de metila foram obtidos como segue. Primeiro, uma emulsão de óleo/água (O/W) foi feita pela agitação vigorosa do óleo (10,0 g) e os compostos ativos,

sozinhos ou em mistura variando de 0,05 a 0,50 g, (constituintes internos) em água (400 ml) pelo uso de um homogeneizador Ultra-Turrax (IKA T10 basic Ultra-turrax , Ika-Werke, Staufen, Alemanha) a 15.000 rpm em 1 min. Em uma segunda etapa, uma solução orgânica que foi preparada pela dissolução de um polímero (entre 0,2 e 2,0 g) em acetona (400 ml) foi vertida sob agitação magnética moderada, dentro da fase de emulsão usando uma bomba peristáltica a 10% (PumpPro TPM 600 SSRPM, Waton-Marlow, Wilmington, UK). Depois de 10 min de agitação, uma solução aquosa preparada pela dissolução de 1,0 g de Tween 80 em água (200 ml) foi também vertida sob agitação magnética moderada dentro da emulsão. Mais uma vez, uma bomba peristáltica a 10% foi usada. Depois da adição completa, a mistura de reação foi agitada ainda por 10 min. Na última etapa, o solvente orgânico foi removido e o volume de dispersão de nanopartícula foi concentrado até 500 ml sob pressão reduzida (R-21, Biichi, Suíça). A emulsão O/W fabricada na primeira etapa foi estável mesmo sem o polímero. Várias nanoemulsões diferentes foram preparadas e analisadas.

[000168] Nanoemulsão sem polímeros que contém apenas um de citral, fosforiletanolamina, e um composto de jasmonato;

[000169] Nanoemulsão sem polímeros que contém um mistura de qualquer de dois de citral, fosforiletanolamina, e um composto de jasmonato;

[000170] Nanoemulsão sem polímeros que contém todos os três compostos, isto é, citral, fosforiletanolamina, e um composto de jasmonato;

[000171] As nanopartículas poliméricas que contém apenas um de citral, fosforiletanolamina, e um composto de jasmonato;

[000172] As nanopartículas poliméricas que contém uma mistura de qualquer de dois de citral, fosforiletanolamina, e um composto de jasmonato;

[000173] As nanopartículas poliméricas que contém todos os três compostos, isto é, citral, fosforiletanolamina, e um composto de jasmonato;

[000174] Todas as nanoemulções mostraram uma alta taxa de recuperação absoluta (>90%), eficiência de aprisionamento (>85%) e estabilidade — coloidal! para todos os compostos ativos (citral, fosforiletanolamina, o composto de jasmonato tal como MJ ou MDJ) aplicados. Exemplo 3: Síntese de MDJ carregado pela ciclodextrina

[000175] A nanoemulsão de MDJ-ciclodextrina foi preparada pela mistura de uma solução aquosa ou alcoólica de di-hidro jasmonato de metila (1 x 10º Molar a 1 x 10? Molar) com uma solução de ciclodextrina com quantidade equivalente de ciclodextrina. A mistura resultante foi agitada até que uma emulsão homogênea fosse obtida. Exemplo 4: Estudo de toxicidade e uma avaliação pré clínica de MDJ carregado pela ciclodextrina para o tratamento de tumores de cólon quimicamente induzidos em camundongos

[000176] efeito de MDJ carregado pela ciclodextrina fabricado no Exemplo 3 acima foi estudado em um modelo experimental de câncer colônico em camundongos. A apoptose e a proliferação de célula, os dois eventos mais importantes relatados para o crescimento de tumor foram investigados. Os índices de apoptose e proliferação de tumor de cólon, tecidos não cancerosos adjacentes e tecidos colônicos normais foram determinados. À apoptose foi quantificada pela contagem dos núcleos apoptóticos e imunotingimento com CASPASE-3, ao passo que a proliferação foi determinada pelo imunotingimento com PCNA. Material e Métodos

[000177] Os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes do Committee on Care Uses of Laboratory Animals of the National Research Council of the National Institutes of Health (USA). Os camundongos foram alimentados com alimento e água ad libitum e mantidos em leito de madeira dura sob um ciclo de 12 h de luz/escuro. Os animais foram pesados semanalmente durante os experimentos. Todos os experimentos foram aprovados pelo USP Animal Etics Committee.

[000178] Em resumo, camundongos Balb/c foram tratados pelas instilações intrarretais do carcinógeno N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), duas vezes por semana por 2 semanas (XX), e foram sacrificados 24 semanas depois do início do tratamento. Dez dias antes do final do experimento, os animais do grupo A (n = 10) foram tratados com injeções 1.p. diárias de MDJ carregado pela ciclodextrina (10 uL de solução salina com 1 milimolar de MDJ) para cada 60 gramas de peso corporal. Os animais do grupo B (n = 10) foram tratados pelas instilações intrarretais diárias de MDJ carregado pela ciclodextrina, na mesma dosagem. O grupo C (n = 10) foi tratado com MNNG e com injeções i.p. diárias de MDJ (diluído a 10% em 100 ul de solução salina). Os animais do grupo D foram tratados com MNNG e pelas instilações intrarretais diárias de MDJ, na mesma dosagem. O grupo de controle E foi tratado apenas com MNNG. Os grupos de controle F e G foram tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina em solução salina, 1.p. e 1.r, respectivamente. Os grupos de controle H e I receberam MDJ em solução salina, i.p. e i.r, respectivamente. As dosagens de MDJ carregado pela ciclodextrina e MDJ foram com base nos estudos piloto em animal anteriores.

[000179] Os cólons foram coletados e histologicamente processados quanto a H&E de modo a estudar os traços histopatológicos dos tumores quimicamente induzidos e para contar o índice apoptótico. O tumor de cólon (TD), o sítio adjacente qque não tumor (NT), a mucosa colônica macroscopicamente normal de ratos sem tumor (N) no mesmo grupo de tratamento foram obtidos. A imunoistoquímica foi realizada para estudar a proliferação de célula pelo tingimento com antígeno de proliferação celular (PCNA) e analisar a apoptose da célula tanto pela contagem dos corpos apoptóticos quanto pelo tingimento com CASPASE-3. Os resultados foram expressados e o índice de rotulação de PONA (PCNA-Li), Índice Apoptótico (AD) e Índice de Rotulação de CASPASE-3 (CASPASE-3-Li). Os parâmetros de hematologia e química clínica padrão também foram monitorados.

[000180] Determinação do índice apoptótico — À apoptose foi determinada pela contagem de núcleos apoptótico. As seções foram tingidas com hematoxilina e eosina para avaliar o número de células apoptóticas por seção. Os critérios usados para reconhecer as células apoptóticas foram: tamanho contraído, perda de contato com os tecidos circundantes (nos tempos que formam o halo classicamente descrito) e condensação nuclear como anteriormente descrita (Yu et al., Gut 2002, 51: 480-484). Pelo menos 1.000 células foram contadas em cinco campos aleatórios e a porcentagem de células com traços apoptóticos foi depois calculada (índice apoptótico ou AI). As contagens de núcleos apoptóticos foram comparados com as verificações obtidas pelo imunotingimento de CASPASE-3 em 30 áreas randomicamente selecionadas. Uma correlação forte entre a contagem de núcleos apoptóticos e os resultados de CASPASE-3 foi verificado (r = 0,83, P<0,001).

[000181] Determinação do índice de proliferação — A proliferação foi ensaiada pelo tingimento com imunoperoxidase para o Antígeno Nuclear da Célula de Proliferação (PCNA) como descrito anteriormente. Em resumo, as seções embutidas em parafina de cada espécimen foram rotuladas com anticorpo de PCNA, depois da recuperação do antígeno em microonda em tampão de citrato. Os controles negativos foram conduzidos pela substituição do anticorpo primário com soro não imune. As lâminas foram desenvolvidas em tetracloridreto de 3,3-diamino-benzidina (DAB, Dako, Dinamarca) e contra-tingidas com hematoxilina de Mayer. O índice de proliferação (PI) foi expressado como uma porcentagem da razão de núcleos positivos em PCNA para os núcleos totais contados.

[000182] Análise estatística - Os resultados foram expressados como média + SE. As comparações entre grupos de tratamento diferentes foram feitas pela (análise de variação) ANOVA com teste de comparação múltipla de Bonferroni. P<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando o pacote de software estatístico SPSS (versão 11.0, SPSS Inc.). Resultados Efeitos antitumor de MDJ carregado pela ciclodextrina

[000183] Os grupos experimentais C e H (que recebeu MDJ 1.p.) foram discharged devido aos sinais precoces ou peritonite. Todos os camundongos tratados com MNNG desenvolveram tumores colônicos, enquanto que nenhum dos camundongos nos grupos de controle desenvolveram câncer colônico. Não houve nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos com respeito ao número médio de tumores por camundongos (4,6) que desenvolveram câncer colônico. O índice apoptótico no geral foi mais alto nos tumores colônicos do que nos seus tecidos adjacentes que não de tumor e colônicos normais (P<0,005, ANOVA). O tamanho médio dos tumores, assim como, o Ai, CAPASE-Li e PCNA-Li em cada grupo de tratamento está resumido na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 — Tamanho de tumores colônicos médios, PCNA-Li, Índice Apoptótico e CASPASE3-Li nos tumores colônicos de grupos de tratamento diferentes Índice Grupo Tratamento Tamanho do PCNA-Li Apoptótico Caspase-3- Tumor (mm”º) Li(tumor) (Tumor) MNNG +MDJ A carregado pela 0,41* 0,22+0,03* |0,52+1,3** | 0,78+0,19º ciclodextrina(i.p) MNNG +MDJ 0,51 0,31+0,05 0,21+0,04 0,39+0,11 carregado pela ciclodextrina MD! (i.) (LP) | D |MNNG sozinho 0,36+0,06 | 0,18+0,04 | 0,34+0,10 *P = 0,03 (grupos A vs E) e P = 0,002 (grupos A vs D, P= 0,02) — (ANOVA) ** P = 0,03 (grupos A vs B, De E) — (ANOVA)

4 P = 0,002 (grupos C vs B, P = 0,002; grupos C vs D, P = 0,004) — (ANOVA)

[000184] Em resumo, os carcinomas colônicos nos animais tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina apresentaram uma redução significante (43%) no índice mitótico avaliado pelo tingimento com PCNA quando comparado ao grupo. Além disso, o MDJ carregado pela ciclodextrina injetado intraperitonealmente (i.p.) causou um aumento acentuável de três vezes no índice de apoptose (avaliado pelas contagens de corpos apoptóticos e expressão de CASPASE-3). Neste grupo, a expressão de CASPASE-3 foi intensa homogeneamente distribuída nos tumores (Figura 2). Entretanto, a administração de MDJ carregado pela ciclodextrina i.r. e MDJ ir. foi associada a uma redução branda, mas significante nos marcadores de tumor acima, mas a análise histopatológica mostrou que a expressão da CASPASE-3 foi limitada superficialmente ao epitélio mucósico (Figura 3).

[000185] Outras características histológicas indicam um aumento nas defesas imunes contra os tumores (devido a um aumento acentuável no número de linfócitos peri-tumorais, não contados) nos grupos A e B.

[000186] Tanto nos animais tratados com MNNG quanto nos animais que não receberam o carcinógeno MNNG o tratamento com MDJ e MDJ carregado pela ciclodextrina não foi associado a nenhuma das mudanças significantes na proliferação e apoptose de célula na mucosa colônica normal e na mucosa adjacente aos tumores. Ausência dos efeitos tóxicos de MDJ carregado pela ciclodextrina

[000187] A despeito dos efeitos fortes de MDJ carregado pela ciclodextrina nos tumores e à parte de algum sinal de ansiedade comportamental, não houve nenhuma observação de nenhum dos sinais de toxicidade do cérebro, fígado, baço, rim, gastrointestinal e medula óssea tanto na análise histopatológica e na hematologia padrão e parâmetros químicos clínicos.

[000188] estudo avaliou o uso da detecção morfológica da atividade da caspase-3 como uma técnica quantitativa simples para medir a apoptose em amostras de tecido. A enzima pró-apoptótica caspase-3 é ativada em um ponto de convergência para os caminhos da indução da apoptose intrínseca e extrínseca (Nakopoulou et al., Pathobiology 2001, 69: 266-273). Este estudo visou caracterizar a cinética da célula e mudanças apoptóticas nos tumores colônicos e mucosa normal de camundongos depois do tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina e MDJ de modo a obter mais discernimento sobre os mecanismos subjacentes aos seus efeitos antineoplásticos. Foi demonstrado neste estudo que o tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina, mas não MDJ foi associado com um dos menores tamanhos de tumor de cólon médio induzido pelo MNNG em camundongos. Foi verificado que o tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina (1.p.) causou uma inibição branda da proliferação nos tumores colônicos mas não nos seus tecidos normais adjacentes ou distantes. Além disso, foi observado que apenas este tratamento foi associado com uma indução acentuada de apoptose, também apenas nos tumores mas não no adjacente normal da mucosa colônica distante. De maneira intrigante, um índice de proliferação mais alto foi verificado nos tumores dos animais tratados com MDJ, sugerindo que o MDJ pode ser um estímulo irritante para a mucosa, possivelmente devido a um efeito citotóxico nas células epiteliais.

[000189] Junto, o tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina resultou tanto na indução acentuada da apoptose quanto a inibição da proliferação. Ao contrário, MDJ foi verificado não inibir a proliferação da célula e induzir um aumento brando da apoptose nos tumores colônicos. Estas verificações sugerem que os mecanismos subjacentes ao efeito antineoplástico de MDJ carregado pela ciclodextrina podem estar mais relacionados com a sua capacidade para atingir todas as partes de um dado tumor que não foi encontrado no grupo tratado com MDJ e também no grupo do MDJ carregado pela ciclodextrina (1.r.). Importantemente, foi confirmado que os efeitos

64 / 89 inibidores de MDJ carregado pela ciclodextrina foram específicos do câncer no sentido de que eles induziram a apoptose nas células tumorais enquanto deixa as células não tumorais não afetadas.

[000190] Os resultados obtidos neste estudo mostram que MDJ carregado pela ciclodextrina sistemicamente injetado foi capaz de atingir os tumores colônicos e reduzir o crescimento de tumores colônicos quimicamente induzidos sem nenhum efeito colateral significante, pelo menos nas condições experimentais realizadas. Exemplo 5: Desligamento do câncer pelo MDJ carregado pela ciclodextrina

[000191] estudo descrito neste Exemplo mostrou que o MDJ carregado pela ciclodextrina fabricado no Exemplo 3 acima induziu recuo acentuável nos tumores Caco2 de xenoenxerto humano nos camundongos NOD-SCID. Além disso, o MDJ carregado pela ciclodextrina induziu o rompimento vascular, inibiu a angiogênese das células tronco cancerosas. À análise de microarranjo mostrou que o MDJ carregado pela ciclodextrina influenciou simultaneamente vários caminhos de sinalização importantes, com inibição maior de NF-«B, HIF-1 e metalotioneínas. Os resultados foram validados pela PCR em tempo real quantitativa, western Dblotting, histoquímica de southwestern e imuno-histoquímica.

[000192] Os camundongos NOD-SCID machos (6 a 8 semanas de idade) foram injetados subcutaneamente com células de câncer de cólon humano Caco2 (1,5 x 106, em 100 uL de PBS). Uma semana depois, os camundongos foram randomicamente divididos em dois grupos. Depois de 4 semanas, quando os tumores palpáveis (20 a 25 mm?) foram estabelecidos, o grupo GT foi intraperitonealmente injetado com 100 uL de MDJ carregado pela ciclodextrina, uma vez ao dia, durante quatro dias e o grupo de controle foi administrado com PBS (grupo GC). O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula que segue: Comprimento?x Largura/2 e os tumores foram removidos no Dia 5 depois do começo do tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrinan O RNA total dos tumores foi obtido, quantificado e a qualidade do RNA foi avaliado, como descrito. A análise de expressão de gene foi realizada com protocolo de experimentos de microarranjo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA, que contém aproximadamente 40.000 sondas) (Rizzatti et al., 2005). A PCR em tempo real quantitativa (QPCR) foi realizada para os genes alvo ciclina DI, HIF-1, Metalotioneína D3 e VEGFA. A mudança em vezes foi calculada usando o método 2ACt. A análise de Western blot (WB) foi realizada para HIF-la (Novus biologicals) e NF-xB p-50 (Santa Biotechnology, CA). B-tubulina (clone KMX-1 1:3000, Millipore) foi usada como um controle de carga. À análise de histoquímica de Southwestern (SW) foi realizada para a detecção in situ de NF-xB nas preparações de tecido de tumor. As seções de H&E foram usadas para a análise histopatológica.

[000193] Imunoistoquímica (IHC) foi realizada com PCNA, ciclina DI; CASPASE-3, CD31, VEGF, CD34, COX-2, TGFB, HIF-1, CD133, Oct e MT. O ensaio de TUNEL também foi realizado. Dois investigadores, cegos à identificação de grupo, independentemente avaliaram as amostras. As células tingidas e a densidade de microvaso foram marcadas. Os dados foram analisados usando o programa estatístico GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, Califórnia, USA) e a análise foi realizada pelo teste de Mann-Whitney. A probabilidade de P<0,05 foi considerada ser estatisticamente significante.

[000194] Além disso, foi visado verificar se o mesmo influenciaria o microambiente do tumor, angiogênese e células tronco cancerosas (CSCs), que são intimamente relacionadas e correntemente são consideradas, respectivamente, direcionar o crescimento de tumor e possuir o sistema de resistência principal contra o tratamento contra o câncer convencional. À análise estatística foi realizada pelo teste de Mann- Whitney.

[000195] A verificação mais notável do estudo aqui apresentado foi um

66 / 89 efeito acentuável da retração do tumor induzido pelo MDJ carregado pela ciclodextrina, enquanto que os tumores de animais de controle (GC) apresentaram um crescimento significante no período experimental (P<0,01) (Figura 4A).

[000196] Macroscopicamente, em comparação com os tumores de controle, os tumores dos animais tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina apresentaram uma camada externa dura clara e um núcleo mais mole, (Figuras 4B e 4C), sugerindo que o tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina levou a uma redução na perfusão de sangue no tumor.

[000197] A análise de hematoxilina e eosina (H&E) de tumores de xenoenxerto mostraram vascularidade proeminente e uma divisão em cinco tipos de tecidos: (1) Núcleo de tumor, com população de células de redondas a ovais que apareceram insuficientemente diferenciadas, hipercromáticas, com um citoplasma basofílico e reduzido; (2) focos de necrose hemorrágica coagulativa; (3) focos necróticos que circundam pseudopalissadas, que foram chamadas de “áreas peri-necróticas” (PN), (4) frente invasiva nas fronteiras dos tumores, e (5) elementos estrômicos usualmente compostos de células na forma de fuso, agrupados em feixes e espalhados tanto no núcleo do tumor quanto na periferia (Figura 4).

[000198] A análise de microarranjo mostrou que o MDJ carregado pela ciclodextrina influenciou simultaneamente vários caminhos de sinalização importantes (Figuras 6A e 6B). Dos 40.000 genes no arranjo, o tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina causou a supra-regulagem de 2016 genes e a infra-regulagem de 1305 genes (2-26,3 vezes). Os fatores de transcrição master foram alterados assim como os genes novos de função ainda desconhecida. Estão resumidos na Figura 2 os genes principais que foram supra ou infra regulados duas vezes ou mais em tumores de animais tratados coim MDJ carregado pela ciclodextrina, em comparação com aqueles não tratados. Quando da correlação dos genes mais importantes com expressão alterada e classificando-os pelas interações de seus produtos de gene, usando o sistema de Ingenuity Pathways Analysis, uma rede altamente conectada emergiu (Figura 6C e 6D). Nenhuma discrepância foi encontrada entre as verificações de microarranjo e a qPCR (Figura 6E).

[000199] Interessantemente, vários genes que são conhecidos estar associados com os efeitos anti-câncer foram verificado estar supra-regulados nos tumores tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina, como por exemplo, o PPAR.

[000200] Ao contrário, alguns genes importantes que estão associados com o crescimento de tumor foram verificados estar infra regulados, como NFKkB, VEGF, AKT, HIF-1 e Hox. As alterações da expressão de gene incluíram muitos caminhos ligados à angiogênese, inflamação, apoptose, metaloproteases de matriz, proliferação de célula, metabolismo e resistência aos medicamentos. A faixa inteira de mudanças na expressão do gene de tumor pelo MDJ carregado pela ciclodextrina pode não estar aqui descrita, mas highlights de alguns das mais importantes verificações relacionadas com os mecanismos envolvidos na angiogênese das células tronco cancerosas regulação podem ser apresentadas em conjunção com os dados morfológicos.

[000201] Efeitos antizcangiogênese de MDJ carregado pela ciclodextrina — O grupo tratado com MDJ carregado pela ciclodextrina apresentou áreas de necrose de tumor hemorrágica, que foram 284% maiores do que aquelas presentes no grupo de controle GC (p<0,01) (Figuras 4D e 4E, respectivamente). Além disso, a necrose de tumor aparentemente ocorreu principalmente a partir do centro do tumor, ao invés do lado de fora do tumor na periferia (Figura 4E), indicando que não apenas a angiogênese foi inibida mas também que um fenômeno de ruptura vascular pode ter ocorrido. De fato, o MDJ carregado pela ciclodextrina prejudicou a montagem da célula endotelial (EC) dentro dos vasos sanguíneos lumenizados e organizados (Figuras 4F e 4H), que resultou na formação do crescimento vascular perturbado, formando lotes de vasos aparentemente disfuncionais com muitas terminações capilares em um cul de sac (Figuras 4G e 41). Estas observações estão de acordo com as verificações anteriores de redução da densidade do vaso pelo MDJ carregado pela ciclodextrina em Embrião de Galinha e o brotamento de novos vasos que foram leakier e menos organizados do que os normais (Brat J Biol. 2010; 70: 443-449).

[000202] SW mostrou um aumento específico impressivo no número de vasos sanguíneos com tingimento específico para NF-<KB em tumores GT (485%; p<0,01), o que pode representar uma mera sinalização reativa para o dano de célula (Figura 7F). Isto também está coerente com a observação de um grande número de microvasos positivamente tingidos quanto ao marcador de apoptose CASPASE-3 no grupo GT. Além disso, os tumores de camundongos tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina contiveram menos microvasos tingidos positivo com VEGF e CD31 do que aqueles dos camundongos de controle, compatível com a noção de que MDJ carregado pela ciclodextrina pode suprimir a angiogênese de tumor (Figura 4N, 4M e 40).

[000203] Além disso, GT apresentou uma redução significante no número de células positivas para CD34, um marcador de células precursoras endoteliais de origem na medula óssea (Figuras 4J, 4K e 4L). Estas verificações validam a observação de MA de uma infra-regulagem de CCRI (receptor CCL9/15), que está relacionada com o recrutamento de células mielóides imaturas CD34(+) (iMCs). Uma falta de Cerl dramaticamente suprime outgrowths de tumores no fígado de camundongos (Proc Nail Acad Sci U.S.A. 2010; 13063-13068).

[000204] microarranjo mostrou que o tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina infra-regulou os caminhos de SAT3 e NF-«xB que atuam na p65/RelA (Fc -2,524) de acordo com a supra regulagem de mRNA IkB (2,599), potenciado por uma alta expressão de MBRNA TKBI1 (NAK) no núcleo. Ambas, as análises de WB e SW validaram os resultados do microarranjo pela confirmação de que os níveis de NF-<B foram significantemente reduzidos (Figura 8). Tanto NF-kKB quanto Stat3 são considerados fatores de transcrição principais que orquestram as relações entre inflamação e angiogênese na progressão do câncer, pelo aumento do VEGF e outros fatores pró-angiogênicos (Curr Mol Med. 2010; 10: 369-373).

[000205] TGFRB foi verificado ser infra-regulado neste ensaio, com uma supra-regulagem de TGFBR1 e TGFBR2. A infra regulagem de TGFB na análise MA foi corroborada pela gPCR e IHC (Figuras 7H, 71 e 7)). À regulagem de TGFR pode estar relacionada com as mudanças parciais na regulagem do complexo SMAD (ativação de SMAD?2 e supressão de SMAD3), e ativação de E2F7 e suppressão de E2F6 e E2F4. Isto está associado com a supra-regulagem de ciclina-B2 e CDK2API, assim como com a infra-regulagem de ciclina-C. TGFB causa a progressão do câncer através da estimulação da angiogênese, entre outros mecanismos (Tian et al. Transforming growth factor-B and the hallmarks of cancer. Cell Signal. 2010).

[000206] Uma infra regulagem acentuada do inibidor da subunidade HIFla do mRNA (HIFIAN, FC 3,713) foi observada, assim como uma infra regulagem (Fc -2,464) do Fator 1 Indutível pela Hipoxia (HIFI), o mediador chave dos caminhos da sinalização da hipoxia. Uma infra regulagem de APEXI (Fc -2,387) foi possivelmente relacionada com a presença mais baixa de HIFla e também possivelmente relacionada com uma transcrição diminuída do complexo da metalopeptidase de matriz como MMP?2 (Fc -3,108) e MMP1l4 (Fe 3,890). A inibição de HIFI pode estar relacionada com a expressão do VRGF do mMRNA indetectável e indução de angiogênese mais baixa (FEBS J. 2009: 509- 518). Foi observado que a análise de WB e IHC (Figuras 7K, 7L, 7N, 7M, 70) confirmaram as verificações de microarranjo e gPCR.

[000207] Um aumento importante na expressão de PPARa (Fc 7,007), possivelmente relacionado com a presença de STATS do mRNA indetectável no núcleo foi encontrado. Uma falta na expressão do PPAR-gama do MBRNA possivelmente foi associada com a ausência de fatores de transcrição como c- Fos e c-Jun e isto pode ser responsável pela presença de MRNA de COX-2 indetectável o que está de acordo com uma diminuição acentuada da expressão de COX-2 pelo IHC (Figuras 7P, 7Q e 7R). Uma ativação de PPARa pode ser conectada com a supra regulagem de CD36 e ABCAI, ABCA?2 e ABCA 10. Este caminho de sinalização sustenta um mecanismo mais para a inibição pelo MDJ carregado pela ciclodextrina da angiogênese, porque agonistas de PPARs são mediadores potentes de respostas anti- angiogênese, e agonistas de PPAR estão correntemente em estudo como opções lógicas no tratamento do câncer (PPAR Res. 2010; 81: 4609).

[000208] Assim, o rompimento vascular e os efeitos anti-angiogênese de MDJ carregado pela ciclodextrina estão de acordo com a proposta de que os caminhos de alvejamento múltiplos é uma tendência na terapia anti- angiogênese, porque o bloqueio de um único caminho pode não ser altamente eficaz e as células tumorais podem desenvolver resistência contra os medicamentos anti-angiogênese e/ou usar outros mecanismos de angiogênese (CA Cancer J Clin. 2010; 60: 222-243).

[000209] MDJ carregado pela ciclodextrina e Células tronco cancerosas — À célula tronco cancerosa (CSM) são a fonte principal de origem do tumor (J Pathol. 1999; 187: 61-81), da renovação de célula e demonstram resistência aumentada à indução da apoptose pelos agentes citotóxicos e terapia de radiação, quando comparados com as células mais diferenciadas que compreende a massa de tumores (Curr Med Chem. 2008; 3171-3184). Portanto, os métodos terapêuticos direcionados ao CSC são correntemente considerados representar estratégias relevantes para melhorar a terapia clínica contra o câncer (Curr Med Chem. 2008; 3171-3184; J Clin Invest. 2010; 120: 41-50).

[000210] Três marcadores clássicos das células tronco de tumor, correlacionados com a baixa sobrevivência nos pacientes foram usados neste estudo: CD133, Oct4 e Metalotioneína (J Pathol. 2000; 191: 306-312; Ann Surg Oncol. 2009; 16: 3488-3498; World J. Surg. 2002; 26: 726-731; Mutat Res. 2003; 533: 201-209). Nos tumores de controle, foi observado que os três marcadores de célula tronco usados foram principalmente encontrados nas áreas de PN e na frente de invasão dos tumores (Figuras 8A a 8N). As áreas de PN também são onde o tingimento com HIF-1 foi mais intenso. Possivelmente as áreas de PN são mais propensas a conter um ambiente hipóxico e a hipoxia ativa HIF-1I alfa para realçar a atividade de auto- renovação das células positivas em CD133, direcionando a sua transformação para células tronco cancerosas e inibindo a sua diferenciação (Oncogene 2009; 45: 3949-3959). Interessantemente, foi observado que MDJ carregado pela ciclodextrina foi associado com uma falha acentuada no número de CSCs, não obstante os mecanismos que sustentam esta verificação permanecerem para ser completamente elucidados. É menos plausível que a necrose de célula direta devido às alterações vasculares fossem um mecanismo principal para a mesma, porque as CSCs são bastantes resistentes às condições hipóxicas.

[000211] Os tumores de controle mostraram alto número de células redondas que super-expressam metalotioneína (MTOEC) em áreas peri- necróticas (PN) e MTOEC na foma de fuso lined com os limites do tumor, organizadas em cordas que se interconectam e estão intimamente correlacionadas com os novos vasos sanguíneos (Figuras 81,J, L, N e M). No presente estudo, a análise de microarranjo tem mostrado uma falha relacionada com o MDJ carregado pela ciclodextrina na expressão de MT, que foi validada pela gPCR e IHC. Além disso, MDJ carregado pela ciclodextrina também fortemente inibiu o aparecimento de organização espacial das MTOECs (Figuras 8I a 8N). Isto pode de modo importante e negativamente influenciar a angiogênese, porque MT tem funções reguladoras principais no processo de angiogênese (J Cereb Blood Flow Metab. 2000; 20: 1174-1189).

[000212] Existe uma mudança maior de sinalização entre CSCs e células endotelial (Nat Rev Cancer 2007; 7: 733-736) e em alguns tumores as CSCs preferencialmente residem em zonas específicas adjacentes aos vasos sanguíneos do tumor (CSCs niches), ou alternativamente origina-se das áreas insuficientemente perfundidas e hipóxicas, para as quais elas tenham se adaptado (Nature 2006; 441: 1075-1079). As próprias CSCs podem produzir fatores angiogênicos e são elas próprias dependentes dos fatores produzidos pela vasculatura para manter a auto-regeneração e crescimento de longa duração (Nat Rev Cancer 2010; 2: 138-146). Por esta razão, novas terapias contra o câncer para alvejar as CSCs e o seu microambiente foram recentemente propostas, levando-se em conta que as CSCs necessitam de um niche hipóxico para protegê-las do estresse oxidativo porque as espécies de oxigênio reativo induzem a proliferação mediada por p38-MAPK levando à exaustão das CSCs (Nat Rev Cancer 2010; 2: 138-146; Curr. Opin. Hematol., 2008; 522528). Com base nas verificações pode ser sugerido que MD) carregado pela ciclodextrina também pode adaptar-se bem a este tipo de terapia, porque o mesmo não foi apenas associado com uma queda no número de CSC associada aos vasos, mas também rompeu a organização espacial de MTOEC e novos vasos sanguíneos, perturbando o niche CSC. Foi deduzido que não é inconcebível que o comportamento do fenótipo biológico da CSC pode ser invertido ou desligado pela ação de uma molécula de multi- sinalização tal como MDJ carregado pela ciclodextrina.

[000213] MDJ carregado pela ciclodextrina e indução da apoptose — Tumores de camundongos tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina contiveram muito mais células apoptóticas do que os controles, como mostrado pelos dois marcadores bem conhecidos de apoptose, isto é, a técnica TUNEL da CASPASE-3. (Figuras 8O a 8T).

[000214] Possivelmente esta verificação está relacionada com a inibição de NF-xB e HIF-1 nestas áreas, porque ambos fatores são inibidores potentes da apoptose. Isto também pode estar relacionado com a queda no número de CSCs nestas regiões. O índice de proliferação, como refletido pelo tingimento de PCNA, não foi significantemente influenciado pelo Tratamento com MDJ carregado pela ciclodextrina (P = 0,14), a despeito de um aumento na expressão de Ciclina-DI1.

[000215] A ativação de caminhos de sobrevivência/antiapoptóticos é um traço comum de células cancerosas e está relacionada com a resistência aos agentes citotóxicos. Os caminhos de sobrevivência implicados na resposta celular ao tratamento com medicamento são primariamente PI3K/Akt e Ras/MAPK, que também medeiam a sinalização ativada pelos fatores de crescimento e desempenham um papel na regulagem de processos críticos que incluem a proliferação de célula, metabolismo, apoptose e angiogênese. Em nosso estudo, o MRNA AKTI foi infra-regulado (Fc -2,021) em paralelo a uma alta infra-regulagem do complexo AKT (Fc -2,021; PKBa, PKBI3, RAC, RACa, PKB/AKT). Please fill out e relacionado com uma infra-regulagem branda do complexo de PI3K (PIK3API -1,856; PIK3C3 1,549), possivelmente devido à ativação do complexo GAB (GAB1 1,511 e GAB2 1,569), direcionando o controle na ativação de p65/RelIA. Supra-regulagem de FGFRLI1 e FGFRI, supressão de PIK3AP1 e FGF13 foram relacionados com a ativação de FGFR3 e em sequência de PI4K2A. No todo estas regulagens são possivelmente relacionadas com uma infra-regulagem no complexo P13K (PIK3AP1 -1,856; PIK3C3 1,549), possivelmente pela ativação do complexo GAB (GABI 1,511 e GAB2 1,569) e uma redução de inibição da expressão de caspases 2 e 9, principalmente estimuladas pelo complexo AIFM2 e AIFM3. Wnt foi infra-regulado pelo WIFI com supressão acentuada de Wnt5A.

[000216] Além disso, uma infra-regulagem importante do complexo de MAPK também foi observada, principalmente para MAP2K1(Fc -3,155), MAPKAPK2 (Fc -2,501), MAPK12 (Fc -2,245), MAPAK3 (Fc -2,153), MAP4K5 (Fc -2,149) e MAPKI4 (Fc -2,082). O complexo de ciclina apresentou resultados que seriam dependentes da modulação do complexo NF-«B. Assim, o complexo de ciclina como D3, Al, e B2 (Fc 3,775; 1,528 e 1,676) foram supra regulados a despeito da infra-regulagem de ciclina C (Fc - 1727). Ao mesmo tempo, os complexos inibidores foram ativados como p19 INK4D (Fc 1,871) e pl5 INK4B (1,523) em um equilíbrio direto para a ativação de ciclinas. Isto foi acompanhado por uma diminuição de 13c1l XL (Fc -1,601) comensurado com o aumento de tBID e BIM assim como a supra regulagem de mRNA BID (Fc 1,505) e finalmente a alta supra regulagem da Caspase 9 (2,6343) e Caspase 2 (1,530), a despeito das contagens da Caspase 3 do mRNA inalteradas. Visto que os camundongos SCID são imunodeficientes, a indução da apoptose e a supressão do crescimento de tumor pelo MDJ carregado pela ciclodextrina não requer a função imune do hospedeiro e mais provavelmente resulte do efeito de morte antiangiogênica ou direta da célula de tumor do MDJ carregado pela ciclodextrina.

[000217] Visto que este foi um experimento de curta duração, não foi possível avaliar os sistemas defensivos do tumor contra a terapia. Não obstante, a infra regulagem de alguns dos genes mais notavelmente relacionado com a resistência contra a quimioterapia, como MT, ABCB4 e HSP70 (HSPAIA) (AntiCancer Res. 2005; 2661-2668; Mol Cell 2009; 15- 27), faz com que seja muito prováveel que os tumores tratados com MDJ carregado pela ciclodextrina não apresentem um tratamento contra a resistência importante.

[000218] MDJ carregado pela ciclodextrina e organização do tecido de tumor — Os tecidos de tumor são usualmente considerados ser completamente desorganizados, caótico. Não obstante, em anos recentes o argumento tem sido feito de que os tumores malignos representam biossistemas “dinâmicos complexos e auto organizantes, capazes de desenvolver padrões coletivos multicelulares que lembram o comportamento adaptivo desenvolvido conhecido de outros sistemas biológicos. Isto inclui o sentir coletivo das condições ambientais e a tomada de decisão coletiva, tal como a evid-encia crescente de que a migração de célula coletiva é comum durante a invasão dos tumores malignos (BioEssays 2009; 31: 190-197). Assim, Uma outra estratégia conceitualmente nova foi proposta, que seria direcionada para “interromper” o processo de informação da multidão de célula.

Isto é, se a comunicação de célula para célula pode ser interrompida ou pelo menos severamente atrasada terapeuticamente, possivelmente o sistema inteiro tornar-se-ia menos ativo.

Foi observado que nos controles, as células tumorais, principalmente na frente de invasão, usualmente se alinham elas mesmas em cordões (como linhas), que se comunicam com as estruturas similares próximas e em torno dos vasos sanguíneos, formando redes de cordões que se juntam por anastomose (Figuras 4F e 4H). Interessantemente, uma “desorganização” de tecido de tumor foi encontrado devido ao efeito do MDJ carregado pela ciclodextrina.

No grupo GT as células tumorais muito frequentemente perdem a organização de cordão e os microvasos foram distorcidos ou interrompidos e apresentaram vazamento de células vermelhas do sangue, caracterizando uma perda importante de organização de célula de tecido (Figuras 4G e 41). Foi sugerido que MDJ carregado pela ciclodextrina também pode ter desligado o sistema de sinalização de tumor organizacional, e isto justifica investigação adicional.

Interessantemente, a análise de microarranjo tem mostrado infra-regulagem pelo MDJ carregado pela ciclodextrina de alguns genes importantes que são relacionados com a organização estrutural de tecidos, tal como Claudin-4 (CLDNA4), uma proteína de transmembrana de estrutura de junção firme que é altamente expressada em alguns canceres (Cancer Sci. 2009; 1623-1630); EIF4E, que foi considerado ser um calcanhar de Aquiles para o câncer devido à suscetibilidade de tecidos de tumor para a inibição de elF4E (Cancer Res. 2008; 631-634); DSC2 (proteínas desmossômicas), recentemente incluído em um novo conjunto de moléculas de adesão de célula que contribuiria para a formação de metástase (Cancer Res. 2008; 68: 6092-6099); MMP13, uma metaloproteinase de matriz que desempenha um papel na proliferação e invasão de célula de tumor (Oncol Rep. 2010; 1241-1247); e Wnt-5a, cuja expressão aumentada pode servir para inibir a ativação do caminho de sinalização de WNT canônico e crescimento de câncer aumentado (Br J Cancer. 2009; 209-214).

[000219] Em conclusão, parece claro que os efeitos anti-câncer de MDJ carregado pela ciclodextrina não podem ser explicados pelo paradigma da terapia de alvo único. Para entender os efeitos do MDJ carregado pela ciclodextrina é necessário uma vista compreensiva dos tumores como organismos multicelulares, que adaptam as suas respostas de gene em uma luta para a sobrevivência, como mostrado na Figura 9. Os efeitos de MDJ carregado pela ciclodextrina nesta adaptação pode espalhar luz sobre um novo paradigma na terapia contra o câncer. JA é o regulador genético. O mesmo é extraordinariamente conservado nas espécies de evolução de planta por milhões de anos e opera na regulagem do equilíbrio complexo entre o crescimento e respostas de defesa a uma faixa extraordinária de agressores bióticos, por meio dos quais a otimização da adaptação da planta em ambientes que mudam rapidamente (Curr Opin Plant Biol. 2008; 11: 428-435).

[000220] Na Figura 9, as setas pretas indicam sinais direcionados para a hipoxia; as linhas de corte azuis indicam bloqueio de MDJ carregado pela ciclodextrina de sinais direcionado à hipoxia; e as setas azuis indicam MDJ carregado com indução de ciclodextrina. Durante o crescimento de tumor, uma falta de coordenação entre as demandas de uma provisão vascular do tecido em desenvolvimento causa insuficiência de provisão de oxigênio em algumas áreas de tumor. Aquelas mais afetadas, que permanecem em um ambiente de axonia eventualmente presente na necrose de tecido. Circundando estes focos de necrose existe as regiões peri-necróticas (PNA), com hipoxia, uma falta menos intensiva de oxigênio que pode permitir que as células se adaptem e sobrevivam através da ativação intensa da sinalização de sobrevivência. Assim, nôs temos observado que esta região apresenta alta expressão de NF-xB, HIF-1, TGFB, COX-2. Os altos níveis destas moléculas por sua vez ativam fenótipos de Célula Tronco que também liberam os fatores de crescimento que estimulam o crescimento de tecido, reduz a apoptose e promove a angiogênese. Por esta razão foi verificado um alto número de células positivas para os marcadores de célula tronco cancerosa clássicos (CSC): CD133, Oct4, e MT, com índices de apoptose reduzidos (pelo TUNEL e Caspase-3). Assim, o PNAs funciona como fábricas de sinalização que estimulam o crescimento do tumor e a resistência à hipoxia e tratamento.

[000221] As CSCs também acumulam nas regiões de Frente Invasiva (SE) e podem migrar em proximidade imediata com os vasos e sustentam a invasão dos tecidos vizinhos. A proximidade imediata das CSCs e as células endoteliais estabelece uma rede de sinalização parácrina na margem do tumor, Esta parceria aumenta a invasibilidade da célula de tumor como o resultado da estimulação pelas CSCs e fornecimento de sangue relativamente fácil fornecido pelos novos vasos do tumor.

[000222] Neste modelo teórico, as células tumorais nas regiões normóxicas o núcleo do tumor permanece em um metabolismo e crescimento bastante moderados, com uma pequena presença de células tronco e fators de crescimento de tecido. Estas células fornecem um tipo de exército de reserva. Algumas delas podem mudar para o fenótipo CSC se a hipoxia ou outras agressões as atingem, mas a maioria delas pode apenas preencher espaços pela proliferação lenta conforme o tumor avança.

[000223] MD)J carregado pela ciclodextrina bloqueia a angiogênese e rompe os vasos existentes, o que aumenta a hipoxia e isto pode deflagrar sinais para a sobrevivência e crescimento do tumor (HIF-1, NF-<B, MT, MAPK, fatores de célula troco). Não obstante, isto é evitado pelo fato de que o MDJ carregado pela ciclodextrina simultaneamente inibe pelo menos a maior parte destes sistemas de sinalização principais. Assim, o tumor não é capaz de reagir com as condições hipóxicas aumentadas e áreas grandes de necrose substitaem progressivamente os tecidos do tumor, fornecendo condições ideais para o encolhimento do tumor, até o tumor ser virtualmente eliminado.

[000224] Quando MDJ carregado pela ciclodextrina é colocado em contato com tumores, ele não apenas inibe a angiogênese, induz a apoptose e o rompimento vascular mas também inibe os sistemas de sinalização de sobrevivência principal que são ativadas pelos tumores quando eles apresentam hipoxia e dano ao tecido. Assim, nós temos observado que o MDJ carregado pela ciclodextrina causou impactos diretos na vasculatura de tumor, que causou a formação de vastas áreas de necrose, e isto foi combinado com a inibição dos sistemas de sinalização defensiva do tumor.

[000225] A redução no número de CSCs resulta em pelo menos dois resultados principais. Primeiro, a perda de tumor possivelmente a sua fonte principal de fatores de estimulação. Segundo, visto que as CSCs são muito mais resistentes aos tratamentos contra o câncer e a hipoxia é muito provável que o tumor possa não recuperar do primeiro impacto e desenvolver resistência contra tratamento. Exemplo 6: Ensaio de angiogênese in vitro e ensaio de membrana corioalantóica (CAM) in vivo de pintinho

[000226] As linhagens de célula usadas: células não neoplásticas derivadas de células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVEC) e neoplásticas de melanoma, tumor de murino BI6F1I0. As HUVECs foram fornecidas pela Dra. Dulcinea Saes Parra Abdalla, Department of Clinical and Toxicological Analyses, FCF-USP's e as células de melanoma B1I6F10 de murino, pela Prof. Márcia Cominetti Department of Physiology and Molecular Biology of UFSCar. Ambas as cepas foram cultivadas em RPMI com 10% de soro de bezerro fetal. A observação morfológica dos dois tipos de célula sugeriram mecanismos comuns. A investigação preliminar do efeito sobre a angiogênese também foi feita in vitro com HUVEC. As medidas foram empreendidas para estudar o ciclo celular pela citometria de fluxo (iodeto de propídio e laranja de acridina) a avaliação da atividade mitocondrial pela microscopia confocal (Mitotracker Red), e medição da produção de VEGF e PGE2 pela HUVEC, nós preparamos sobrenadantes de cultura de célula pelo ELISA com anticorpos comerciais.

[000227] Para os testes com ovos, as claras dos ovos foram usadas Gallus gallus incubadas em um incubador controlado com termostato na temperatura e umidade controladas. A incubação foi realizada com e sem giragem na postura dos ovos. Uma marca na superfície superior da casca foi usada para controlar este procedimento. Os ovos foram abertos no quarto dia de incubação, depois cuidadosamente limpos da pele com algodão embebido em álcool a 70%. A abertura foi realizada no fluxo laminar, mantendo todos OS seus ovos na mesma posição na qual eles foram chocados, sustentados sobre um suporte plástico e marcados na superfície superior. O procedimento experimental foi adaptado e refinado para o projeto, usado na primeira metade do século vinte. A descrição do método desenvolvido

[000228] A abertura foi realizada com tesouras cirúrgicas pequenas de ponta fina e curva, fórceps de micro cirurgia, fita transparente, um recipiente para descarte, uma pipeta de Pasteur, agulhas e seringas descartáveis, uma bandeja plástica ou de cartão para os ovos.

[000229] A primeira manobra realizada para abrir os ovos permitiu obter-se uma área sob a casca. pDesta modo, abrir uma janela na superfície superior pode ocorrer sem transbordar os conteúdos do ovo que permaneceram na posição de observação. Uma agulha BD 25 x 8 ligada a uma seringa de 3 ml, que foi introduzida lentamente através da câmara de ar do ovo, um ângulo inicial de 45º, foi usado até aproximadamente a posição onde, da sucção, é coletada apenas albumina fina. A perfuração foi feita cuidadosamente para evitar rachadura. A remoção da albumina espessa, como a gema do ovo ou ar foi evitada, ou a retirada da gema arruinaria o embria e remover o ar permitiria o retorno do mesmo, colocando em risco a sobrevivência do embrião.

[000230] Aproximadamente 5 ml de albumina foram removidos de cada ovo no saco viteliono para ficar baixo e ser capaz de abrir os ovos sem que o embrião estivesse ligado à casca e a visualização disto tornou-se possível. À albumina foi descartada no recipiente apropriado, deixando unspoucos milímetros para fechar o orifício da inserção da agulha. O furo foi bloqueado com a sua própria albumina do ovo, precipitado com álcool gotejando no local. A atenção e cuidado para prevenir vazamento são importantes para minimizar o risco de contaminação da chocadeira. Se necessário, uma gota mais de albumina pode ser colocada no furo gotejando o álcool sobre ela até a observação de uma membrana no local.

[000231] Usando uma tesoura de ponta fina e curva, a casca do ovo foi perfuranda cuidadosamente próximo à marca de grafite, que é a parte mais alta da face na qual o ovo recebeu calor. Depois da perfuração, a casca foi cortada lentamente, evitando a ocorrência de rachaduras, até a formação de um corte na forma da letra “U”. No final, um clampe foi usado que foi introduzido no ponto de partida do corte, completando a returada e a formação da janela. O cuidado nesta etapa foi a introdução e manipulação das tesourasscissors para evitar dano ao embrião. Quando o embrião é muito jovem, a casca é mais dura e a observação é mais difícil. Além disso, embriões mais velhos têm o maior e a maior parte da CAM aderido à casca do ovo, que aumenta o risco de lesão durante o procedimento. O tempo ideal para a abertura dos ovos foi padronizado por 4 dias de incubação. Durante este período, a ocorrência de perda através da lesão foi evitada e a janela aberta na casca do ovo permitiu a observação fácil do embrião e tecidos extraembrionários de CAM, com Os seus arranjos característicos de artérias e veias.

[000232] A janela foi fechada com um pedaço de fita transparente para proteger o embrião. Os ovos retornaram para a temperatura de incubação. O tempo fora da chocadeira deve ser mínimo, porque neste estágio de vida, os embriões não têm a capacidade de produzir o próprio calor. O desenvolvimento — apropriado depende das condições ambientais de temperatura e umidade.

[000233] Depois da abertura e fechamento da janela todos os ovos foram reciolocados na incubadora, com as mesmas condições iniciais e mantidos por mais sete dias, tipicamente. Neste intervalo procedimentos foram realizados pata os testes de angiogênese ou para pesquisar sobre o crescimento do tumor in vivo. A observação da angiogênese nos ovos inoculados com células tumorais seguiu virtualmente o mesmo modelo de teste da angiogênese. A exposição ao MDJ puro (cis/trans 96% puro da Sigma) ou MDJ carregado pela ciclodextrina fabricado no Exemplo 3 acima foi realizada no dia 8, com os ovos permanecendo na incubadora até o dia 14. A inoculação com as células de melanoma foi realizada no dia 4, os ovos receberam MDJ puro ou MDJ carregado pela ciclodextrina no 8o dia e permaneceram incubados até 14 dias. Durante o desenvolvimento do protocolo, o tempo de inoculação e tratamento foram ajustados. Cuidado durante a coleta e para obter as imagens foram padronizados para todos os experimentos.

[000234] Pelo final do período estipulado em cada teste, os ovos foram removidos do incubador e resfriados no refrigerador por pelo menos meia hora até que o batimento cardíaco do embrião não fosse mais observadoforam. Depois da verificação deste fenômeno, a fita foi retirada e pingado CAM com um pequeno volume de formaldeído a 4%. O fixador foi mantido por 20 min. Depois disso as membranas foram colhidas e processadas para a fresca. A qualidade das imagens obtidas dependeu da preservação apropriada dos conteúdos dos vasos contraste não foi usado ou injeção de corante de contraste.

[000235] Depois de breve fixação, a casca foi quebrada e o embrião inerte colocado em uma placa de petri. Os vasos principais foram amarrados com linha de algodão, com um triplo nó, fechado no ponto de inserção no abdômem do embrião. O CAM foi separado depois desunido dos outros tecidos, lavado rapidamente com solução salina fria para a remoção da gema do ovo residual e espalhado sobre uma lâmina de microscópio, com um mínimo de fluido e evitando a formação de bolhas, rachaduras ou dobras na membrana. A observação foi realizada depois de colocar uma lamínula de microscópio sobre a membrana, prevenindo a formação de bolhas na película líquida formada. A lenta de ampliação foi ajustada para a observação sob campo brilhante, nenhum filtro e pequeno aumento (tipicamente 2x em alguns casos aumentos de 5 a 10x foram usados para a observação de detalhes). As imagens foram escaneadas em arquivos TIFF depois da captura em alta definição com o programa ACT-2U para uma câmera DS-U1 ligada a um estereomicroscópio Nikon SMZ1800 Magnifier, mantendo as mesmas condições e luz ajustável, equilíbrio de sombra e branco para cada teste. Em cada teste, a imagem foi capturada a partir do fundo, mantendo os ajustes de luz e cor de modo a padronizar as imagens do material analisado. Os ajustes foram repetidos para as imagens de campo escuro, o mesmo aumento.

[000236] Cada região da mesma amostra foi imageada no campo brilhante e campo escuro, para melhor observação de detalhes. O crescimento da rede vascular foi analisada com o programa Image J pelo processamento das imagens em imagens binárias em campo brilhante. A técnica permitiu a coleta de resultados quantitativos não dependentes dos cálculos pela combinação das imagens de campo brilhante e campo escuro, embora esta possibilidade também tenha sido estudada. Este estudo foi importante para guiar o refinamento da sua própria coleção e processamento preliminar do material. O mesmo foi depois substituído pelo algoritmo de análise tão simples quanto possível para a construção de imagens binárias. O procedimento para processar imagens de campo brilhante, normalizado para a imagem de fundo em imagens binárias foi refinado e padronizado. Um plugin para Image J foi desenvolvido, que permite observação contínua da imagem resultante durante um único ajuste do limiar de binarização. Cada teste completo foi analisado, de acordo com este processamento de algoritmo comum, e o limiar de binarização ajustado para cada lote de imagens processadas e analisadas em série.

[000237] Para a análise qualitativa e documentação adicional, imagens foram obtidas com uma câmera Canon PowerShot A640 ligada a uma objetiva de microscópio óptico Jenamed em aumentos de 32 x 250 x.

[000238] inóculo típico foi de 2 x 10º células por ovo, em um volume de meio de cultura menor do que 10 ml. O crescimento de melamona foi acompanhado pela inspeção visual de formação de massa pigmentada no CAM, na lente de ampliação e no microscópio. A lente de ampliação, a observação de opacidades na imagem de campo escuro definiram a localização do crescimento da célula de tumor mesmo quando o pigmento foi ainda muito pouco visível. Sob o microscópio, as células também foram observadas depois de tingir o material não fixado com Tionina ou 0,1% de azul de toluidina. Para ambos os corantes, a diferenciação com álcool ácido melhorou o contraste com o tecido normal permitiu o arquivo das lâminas. À análise quantitativa do material tingido deste modo não foi realizada, porque a desidratação do material com álcool muda o diâmetro do vaso e o padrão de tingimento obtitido não mostrou reprodutibilidade e qualidade de contraste adequadas, até o presente momento.

[000239] As doses de MDJ e MDJ carregado pela ciclodextrina, testadas nas culturas de célula, foram depois incorporadas dentro do modelo dos ovos, considerado o volume fixado de 60 ml por ovo.

[000240] Os ovos usados foram medidos pela amostragem e o volume médio de 60 ml foi mantido por todo o período de teste com um desvio padrão abaixo de 10%. O tratamento foi feito em diferentes modos, de acordo com o interesse do teste. Para os estudos de praticabilidade, o tratamento foi realizado na albumina, removida no terceiro dia de incubação, antes da abertura dos ovos e mantidos a 37 ºC até o dia da preparação das soluções e retorno para o ovo, pelo mesmo furo de agulha. A reintrodução da albumina no ovo no 7º dia, foi precedido por uma nova retirada de volume para evitar um aumento na pressão de fluido ou a sua extravasação. Os testes de viabilidade foram monitorados por até 10 dias. Para os estudos de efeitos antitumor, o tratamento foi feito em uma única dose no CAM, no 11º dia de incubação. A praticabilidade do tratamento no CAM foi comparado com a viabilidade de tratamento pela albumina.

[000241] Os efeitos sobre a angiogênese in vivo revelou um novo perfil na ação antitumor do MDJ carregado pela ciclodextrina.

[000242] MDJ mostrou-se tóxico para as células de melanoma e HUVEC na cultura. Nos culturas de célula, foi verificado que a substância ativa exerceu os efeitos anti-angiogênicos e anticâncer em concentrações muito similares. Foi possível identificar muito claramente a concentração tóxica para cada um dos tipos de célula (Figuras 10 e 11). No teste de toxicidade (MTT), a redução do corante, devido à atividade mitocondrial preservada foi mantida em um valor constante nas concentrações de menos do que 1 mM de MDJ. Este comportamento foi muito reprodutível em culturas de célula de HUVEC confluente. As curvas de crescimento mostram, também nas concentrações abaixo de 1 mM, uma constante de tempo de duplicação de cerca de 20 horas. Nas concentrações mais altas, a atividade mitocondrial foi comprometida e o tempo de duplicação tendei ao infinito, isto é, as células pararam de se dividir e morreram. Nas culturas de melanoma de murino, os resultados foram muito similares, e as concentrações tóxicas foram muito próximas.

[000243] Nas concentrações tóxicas, a morfologia da célula alterada pelo MDJ dos dois tipos de célula também levou à formação de células gigantes multinucleadas e vacúolos pseudoinclusos.

[000244] Estes efeitos sobre a morfologia de MDJ sugeriu que a indução da apoptose e autofagia podem ocorrer não apenas nas células tumorais mas também no endotélio e levaram a estudo mais detalhado do ciclo celular de HUVEC pela citometria de fluxo (Figura 13). Os novos resultados reafirmaram a hipótese de um alvo de toxicidade compartilhada entre as células endoteliais e os tumores (Figura 13 e Tabela 3).

[000245] Adicionalmente, um efeito sobre o fator de crescimento vascular, VEGF foi demonstrado. Tabela 3. Efeitos de MDJ sobre o ciclo celular e a produção de VEGF em HUVECs de tratamento do ciclo celular,% (18 h) de Acridina (18 h) células, 4 h)

EE | 10nM | 93 | 5 [2 | nã | nd | aa pso9% | -

[000246] A mitocondria de células endoteliais em cultura mostrou a ativação na presença de MDJ. Este efeito foi mais evidente na resposta ao MTT no plaqueamento de baixa densidade (Figura 14). Sob estas condições (1 x 10º células / ml) e também não no plaquemaneto de alta densidade (2 x 10º células / ml), não houve nenhum aumento na produção de PGE2 pela HUVEC. A produção de PGE? é normalmente a confluência destas células, mas mediariam um efeito indireto de MDJ.

[000247] O efeito tóxico sobre a proliferação de célula endotelial foi demonstrado in vitro e in vivo no modelo de CAM.

[000248] A presença de células de melanoma diminuiu a sobrevivência dos ovos. MDJ parcialmente recuperou esta sobrevivência. Os resultados de

CAM no modelo confirmaram que os corpos de melanoma sofreram uma involução dependente da dose sob a ação da substância ativa.

[000249] Os testes no MDJ carregado pela ciclodextrina

[000250] Os testes no MDJ carregado pela ciclodextrina in vitro demonstraram que a citotoxicidade do composto ativo para HUVEC e BI16FIO foi preservada, que ocorre em doses muito mais baixas (Figura 22). O veículo foi inerte nas concentrações equivalentes àquelas usadas na formulação. MDJ carregado pela ciclodextrina também foi testado com a linhagem de célula cancerosa MEI0O01l humana e tecidos. Citotoxicidade similar foi observada.

[000251] MDJ carregado pela ciclodextrina foi depois testado no modelo in vivo. O primeiro estudo confirmou uma redução de doses da substância ativa sobre a estrutura vascular, e um efeito protetivo na presença de melanoma. Exemplo 7: Ensaio anti-crescimento de célula in vitro e experimento anti- angiogênese in vivo com MDJ carregado por lipossoma do Exemplo 2

[000252] MDJ carregado por lipossoma preparado no Exemplo 2 foi testado em nove linhagens de célula cancerosa: UACC62 - melanoma, MCF7 - resistência ao cânceri NCIADR — câncer mamário resistente a medicamento múltiplo, 7860 - câncer renal, NCI460 - câncer pulmonar, PCO3 - resistência ao câncer prostático, OVCARO3- câncer ovariano, HT29 - câncer de cólon, K562 - leucemia. Estas linhagens de célula foram tratadas com a nanoemulsão fabricada no Exemplo 2 com várias concentrações de MDJ. Como mostrado na Figura 26, o MDJ carregado por CD inibiu o crescimento de tumor em uma maneira dependente da dose. A Figura 27 mostra o efeito doo tamanho do nanocarregador sobre as atividades anti- angiogênicas in vivo. Mais especificamente, a nanoemulsão com 100 nm de nanocarregadores exibiu melhor atividade do que a nanoemulsão com nanocarregadores de 50 nm.

[000253] Além disso, como demonstrado pela Figura 28, o MDJ carregado com lipossoma mostrou atividade de anti-crescimento de célula realçada quando o tamanho dos lipossomas foi menor do que 100 nm. Exemplo 8: Ensaio de anti- crescimento de célula in vitro este exemplo está fundamentado no manuscrito que descreve os estudos de Harvard]

[000254] MDJ nanocarregado (onde os nanocarregadores foram CD, lipossoma, ou LDE) foi testado nas 11 linhagens de célula que seguem (3 leucemias, 2 Câncer mamário, 1 Macrófago, 5 Câncer Prostrático) que foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram cultivadas no respectivo meio de cultura sugerido pela ATCC (meios RPMI- 1640, DMEM, EMEM ou F12-k suplementados com 10% de soro bovino fetal e penicilina/estreptomicina. Os detalhes das linhagens de célula são apresentados na tabela 4 abaixo. Tabela 4 Nome da Linhagem de célula — Descrição da linhagem de célula DU-145 âncer Prostático Humano RL-2505 RI-1740 |DU-145 (HTB-81) PC-3 (CRL-1435) âncer Prostático Humano CF-7 (HTB-22) RL-2314 âncer Mamário Humano Nomo1 | eucemia Mielóide Aguda Humana MOLM-14 Leucemia Mielóide Aguda Humana 1B-152 Leucemia Linfoblástica Aguda Humana

[000255] A formulação de MDJ nanocarregado foi dissolvida em água MIlli-Q e armazenada na temperatura ambiente. Antes do uso, a formulação foi purificada usando um filtro de 0,22 micron para evitar a contaminação.

[000256] Três milhões de células de cada linhagem de célula foram distribuídos igualmente em três reservatórios de uma placa de Ewell foram cultivados durante a noite. No dia seguinte, a formulação de MDJ nanocarregado que contém 1 uM de MDJ foi adicionada dentro de um reservatório, ao passo que a mesma concentração de nanocarregadores vazios (ou nanopartículas) foi adicionada no segundo resrvatório, e o terceiro reservatório que carrega as células foi mantido intacto sem nenhum medicamento ou nanocarregadores vazios (“controle”). O efeito apoptótico da formulação foi observado em 6 horas, 12 horas e 24 horas a seguir do tratamento sob um microscópio invertido.

[000257] MDJ nanocarregado mostrou um efeito enorme do fenômeno da apoptose nas linhagen de célula cancerosa que foram testadas. O efeito de apoptose foi observado em cada linhagem de célula testada, partindo depois de 6 horas do tratamento com MDJ e atingiu o pico depois de 24 horas. Algumas das linhagens de célula cancerosa, tais como TIB-512, CRL-2876, e CRL-2314, foram completamente ou quase completamente mortas depois de 24 horas (ver as Figuras 38 a 40) enquanto as outras mostraram uma média de 60% a 70% de morte de célula (ver a Figura 41). O resto das células foram no estágio pré-apoptótico. A molécula teve a sua ação que alveja apenas as células cancerosas, sugerindo os nano-carregadores como um agente de liberação de medicamento eficaz dentro das células cancerosas. As células de controle que tiveram apenas as nanopartículas vazias mostraram muito pouca a nenhuma apoptose.

[000258] As células cancerosas têm modos diferentes de produzir energia comparadas com as células saudáveis, que também são conhecidas como Hipótese de Warburg. Nesta hipótese, a mitocondria que produz a energia para as células cancerosas usa um caminho não oxidativo ao invés do caminho oxidativo usado pelas células saudáveis. Foi relatado que MJ alveja esta anomalia na mitocondria em células cancerosas e provoca a liberação do citocromo C assim como de outras proteases e caspases. O MJ foi capaz de induzir o intumescimento na mitocondria isolada de células de hepatomas Hep 3B, mas não na mitocondria isolada de células 3T3 não transformadas ou de linfócitos normais. A liberação de citocromo C leva à transição da permeabilidade da membrana mitocondrial, despolarização de membrana, intumescimento osmótico e levando assim à apoptose. A linhagem de célula de macrófago como listado na Tabela 4 foi usada neste estudo como células não transformadas, onde nenhum efeito de apoptose foi amplamente observado (ver a Figura 42).

[000259] Os estudos conduzidos pelo requerente sugeriram que MDJ nanocarregado exerce os seus efeitos citotóxicos independentes da transcrição, tradução e p53 (não publicado). Os estudos anteriores (não publicados) de MDJ sozinhos mostraram resultados similares in vitro mas o medicamento degradou muito rapidamente in vivo e precisa de doses muito altas para que se observe um efeito. Pela encapsulação da molécula nas nanopartículas, foi mostrado que MDJ não degradou in vivo e foi altamente eficaz no tratamento das células cancerosas com uma dose muito baixa, por exemplo, 1000 vezes menos do que a que foi usada com a molecule nua.

EQUIVALENTES

[000260] A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem divergir do espírito ou suas características essenciais. As formas de realização precedentes portanto devem ser considerados em todos os aspectos ilustrativos ao invés de limitantes na invenção aqui descrita. O escopo da invenção é assim indicado pelas reivindicações anexas ao invés de pela descrição precedente, e todas as mudanças que entram dentro do significado e faixa de equivalência das reivindicações são intencionadas a serem aí abrangidas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um solvente farmaceuticamente aceitável e uma pluralidade de nanocarreadores ou microcarreadores que contêm di-hidrojasmonato de metila (MDJ), em que os nanocarreadores ou microcarreadores são formados de uma ciclodextrina ou um dendrímero, ou são partículas de nanoemulsão sintéticas (LDEs) que compreendem um núcleo de colesteril éster circundado por uma camada de fosfolipídeo; os nanocarreadores têm um tamanho que varia de 1 nanômetro (nm) a 500 nm; ou os microcarreadores têm um tamanho que varia de 1 micron a 100 microns; e a composição farmacêutica tem uma concentração de MDJ que varia de I nNMalM.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores são formados de uma ciclodextrina e têm um tamanho que varia de 3 nm a 100 nm.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores de ciclodextrina têm um tamanho que varia de 3,5 nm a 11 nm.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os nanocarreadores de ciclodextrina têm um tamanho que varia de 50 nm a 100 nm.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores são LDEs e têm um tamanho que varia de 30 nm a 500 nm.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5,

caracterizada pelo fato de que as LDEs têm um tamanho que varia de 50 nm a 110 nm.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores são formados de um dendrímero e têm um tamanho que varia de 2 nm a 500 nm.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dendrímero é poliamidoamina (PAMAM).

9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a concentração de MDJ varia de 1 nM a 100 uM.

10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a concentração de MDJ varia de 10 uM a 100 mM.

11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a concentração de MDJ varia de 100 mM a | M.

12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores ou microcarreadores contêm ainda di-hidrogeno fosfato de 2- aminoetila, 3,7-dimetil-2,6-octadienal, salicilato de metila, ou ácido abscísico.

13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o solvente farmaceuticamente aceitável é água, um álcool, ou uma mistura dos mesmos.

14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores ou microcarreadores contêm ainda um composto que não jasmonato.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um solvente farmaceuticamente aceitável e uma pluralidade de nanocarreadores ou microcarreadores que contêm um composto de jasmonato, em que os nanocarreadores ou microcarreadores são formados de uma ciclodextrina ou um dendrímero, ou são partículas de nanoemulsão sintéticas (LDEs) que compreendem um núcleo de colesteril éster circundado por uma camada de fosfolipídeo; os nanocarreadores têm um tamanho que varia de 1 nanômetro (nm) a 500 nm; ou os microcarreadores têm um tamanho que varia de 1 micron a 50 microns; e a composição farmacêutica tem uma concentração do composto de jasmonato que varia de Il nMa1lM.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o composto de jasmonato é selecionado do grupo que consiste do ácido jasmônico, ácido 7-iso-jasmônico, ácido 9,10-di- hidrojasmônico, ácido 9,10-di-hidro-isojasmônico, ácido 2,3-dides- hidrojasmônico, ácido 3 4-dides-hidrojasmônico, ácido 3,7-dides-hidrojasmônico, ácido 4,5-dides-hidrojasmônico, ácido 4,5-dides-hidro-7-isojasmônico, ácido cucurúbico, ácido 6-epicucurúbico, ácido 6-epicucurábico-lactona, ácido 12- hidróxi-jasmônico, ácido 12-hidróxi-jasmônico-lactona, ácido 11-hidróxi- jasmônico, ácido &8-hidróxi-jasmônico, ácido homojasmônico, ácido diomo- jasmônico, ácido 11-hidróxi-diomo-jasmônico, ácido 8-hidróxi-diomojasmônico, ácido tuberônico, ácido tuberônico-O-B-glicopiranosídeo, ácido cucurábico-O-R- glicopiranosídeo, ácido 5,6-dides-hidro-jasmônico, ácido 6,7-dides-hidro- jasmônico, ácido 7,8-dides-hidro-jasmônico, cis-jasmona, di-hidrojasmona, e um alquil éster inferior dos mesmos.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o composto de jasmonato é jasmonato de metila e tem uma concentração de cerca de 1 nMa 1 uM.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o composto de jasmonato é jasmonato de metila e tem uma concentração de cerca de 1 uM a 100 mM.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que os nanocarreadores ou microcarreadores contêm ainda um composto que não de jasmonato.

20. Método para tratar um distúrbio relacionado com a angiogênese, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 em um indivíduo em necessidade da mesma.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado com a angiogênese é câncer.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia, câncer de cólon, câncer de mama, câncer prostático, câncer pancreático, câncer hepático, câncer de pele, câncer ovariano, melanoma, ou um sarcoma.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado com a angiogênese é uma doença inflamatória.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é a doença do intestino inflamatória.

25. Método para tratar um distúrbio relacionados com NF-xB, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 em um indivíduo em necessidade da mesma.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado com NF-xB é uma infecção viral, bacteriana ou fúngica.

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