NO331700B1

NO331700B1 - Anvendelse av preparat for fremstilling av medikament for fjerning av fibrinbundet blodpropp fra kateter, og multiseksjonsforpakning omfattende preparatet

Info

Publication number: NO331700B1
Application number: NO20042693A
Authority: NO
Inventors: Charles P Semba
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-11-26
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2012-02-27
Also published as: JP2005510302A; CA2467645C; WO2003045466A2; US20030206906A1; CA2467645A1; AU2002365408A1; ZA200404024B; ECSDI045123S; HUP0600436A2; US7829082B2; IL162083A0; ME00015B; IS7275A; AU2002365408B2; RS46204A; NZ533029A; CO5580795A2; HUP0600436A3; WO2003045466A3; AU2008203131A1

Abstract

Preparat som er nyttig til fjerning av fibrinbundne blodpropper fra et kateter og som omfatter vann, en fibrinolytisk effektiv mengde av en plasminogenaktivator og en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatiskorganisk alkohol. Preparatet omfatter ikke et chelaterende middel.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Oppfinnelsens område:

Foreliggende oppfinnelse vedrører fagfeltet for intravenøse medisinske innretninger, spesielt katetre, i tillegg til fagfeltet med preparater til skylling, lukking, klargjøring og belegging av disse medisinske innretningene. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som er nyttige til økning av strømning i et kateter og for å forhindre infeksjon i katetre som potensielt er utsatt for fibrindeponering eller som allerede inneholder fibrinbundne blodpropper.

Beskrivelse av kjent teknikk:

Avleveringssystemer er omfattende benyttet i medisin som et middel for å introdusere flytende materiale som kan inneholde medikamenter, næring eller andre aktive midler til en spesiell lokalisering hos en pasient. Slike systemer involverer ofte anvendelsen av katetre som i mange applikasjoner kirurgisk eller intravenøst er lokalisert og festet på plass for langsiktig administrering av det ønskede materialet. Typiske systemer inkluderer sentralkatetre som kan bli benyttet til total parenteral næringstilførsel (TPN) benyttet ved for eksempel kort-bowelsyndrom (for å vare livet ut), med risiko for sepsis eller endokarditt. Slike systemer inkluderer også katetre og dren som er involvert i peritonal dialyse hos de som lider av endelig nyresvikt, som hvis de blir infiserte kan føre til peritonitt med alvorlige konsekvenser.

Intravaskulære katetre er blant de mest vanlig benyttede medisinske innretningene. Slike katetre blir rutinemessig plassert i kontakt med en pasients vaskulære system ved mange prosedyrer og blir ofte værende på plass i lange perioder. En type avleveringssystem som i noen år har blitt benyttet i behandlingen av tilstander hos mennesker omfatter et reservoar eller kammer med lite volum som subkutant er implantert under fascia med direkte tilgang via et kateter til det kardiovaskulære systemet. Slike systemer er kjent som portsystemer. Siden en port og et intravaskulært kateter utgjør direkte forbindelser mellom miljøet på utsiden og pasientens blodomløp utgjør tilstedeværelsen av kateteret eller porten et vesentlig og kontinuerlig potensial for introduksjon av mikroorganismer inn i pasientens blodomløp.

Det er nå generelt anerkjent at intravenøs innsetting av katetre i medisinske, kirurgiske, gynekologiske, urologiske og andre pasienter kan føre til alvorlige infeksjoner i urinveiene og i forplantningssystemet. Utøvere på fagområdet har utviklet mange protokoller vedrørende plassering, anvendelse, fastgjøring og frigjøring av væske-behandlende innretninger og andre prosedyrer vedrørende katetre. Målet for nesten alle disse prosedyrene er å unngå introdusering av en mikroorganisme i pasientens blodomløp.

Et antall fremgangsmåter for å redusere risikoen for infeksjon som inkorporerer anti-infeksjonsmidler i medisinske innretninger har blitt utviklet, der ingen av disse klinisk har blitt vist å være fullstendig tilfredsstillende. Slike innretninger tilveiebringer ønskelig effektive nivåer av anti-infeksjonsmiddel gjennom hele perioden som innretningen blir benyttet. Denne opprettholdte frigivelsen kan være problematisk å oppnå fordi en mekanisme for å spre anti-infeksjonsmiddel over en lang tidsperiode kan være nødvendig, og inkorporeringen av tilstrekkelige mengder av anti-infeksjonsmiddel kan ødeleggende påvirke overflatekarakteristika for innretningen. Vanskelighetene som møtes når det skal tilveiebringes effektiv antimikrobiell beskyttelse øker ved utviklingen av legemiddelresistente patogener.

Dagens standardbehandling av vaskulære katetre inkluderer skylling av innsiden av katetret med et antikoagulerende middel, slik som heparin, for å forhindre at blod inne i og rundt tuppen på katetret koagulerer og hindrer strømmen av væsker gjennom katetret. Videre har ikke heparin noen antimikrobiell aktivitet, og i tillegg kan heparin, hvis det ikke blir nøye kontrollert, føre antikoagulasjonsprosessen for langt og dermed innebære en risiko for blødning. Heparin kan også føre til antistoffproduksjon og føre til en alvorlig autoimmun tilstand med heparinindusert trombocytopeni (HIT) som tømmer blodplate-lagrene og ytterligere øker risikoen for blødning. Dermed fortsetter infeksjoner i tillegg til trombotisk okklusjon å forekomme hyppig på tross av profylaktisk anvendelse av heparin-skyllemidler. Kjennskap til patogenesen og mikrobiologien til sentralvenekateterrelaterte infeksjoner er essensielt for å tilveiebringe effektiv forebygging av dette problemet.

Staphylococcus epidermidis og S. aurens står for 75 % av alle sentralvenekateter (CVC)-relaterte infeksjoner. Candida- arter står for ytterligere 10-15 % av slike infeksjoner. Anvendelsen av anti-støp/zy/øcocc-antibiotika for å forhindre disse infeksjonene har blitt funnet å redusere CVC-relaterte bakterielle infeksjoner, men bare på bekostning av høyere forekomst av sopp (Ca«cfofø)-infeksjoner.

Det er også observert en korrelasjon mellom trombogenese og infeksjon. I all vesentlighet omslutter en fibrinkappe som etter hvert virker for å dekke de indre og ytre overflatene på et kateter intravenøse vaskulære katetre. Denne fibrinkappen tilveiebringer slike organismer som Staphylococci og Candida med en forsterket festekapasitet på kateteroverflaten. Ulikt disse spesielle mikrobene fester ikke gram-negative bacilli godt på fibrin og fibronektin. Et preparat som stoppet fibrindannelse ville dermed være spesielt nyttig for å forhindre koloniseringen fra Staphylococci, Candida og tilsvarende på intravenøse katetre.

Når et medikament blir tilført en pasient gjennom et kateter sørger vanligvis ansvarlig helsepersonell for at dette blir fulgt av en skylleløsning som kan inkludere et antikoagulerende middel slik som heparin. Formålet med skylleløsningen er å skyve medikamentet ut av katetret slik at hele dosen blir levert, og å sørge for at katetret forblir fylt opp slik at pasientens blod ikke strømmer opp gjennom katetret og muligens danner en propp som vil tilstoppe innsiden av katetret. Når katetret dermed etter hvert igjen skal benyttes er det riktig skylte katetret sannsynligvis helt i orden og klar for den neste anvendelsen.

I WO 98/23151 beskrives forebyggelse av vaskulær sykdom ved å anvende kronisk administrasjon av lave doser av slike trombolytiske nmidler som plasminogenaktivator, streptokinase og urokinase.

Root et al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1627-1631 (1988) publiserte en undersøkelse som rapporterte om effekten av dinatriumetylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i katetre, en forbindelse som er velkjent for sine chelaterende egenskaper in vivo og som er i utstrakt bruk som et antikoagulerende middel in vitro. US patentskrift 5,363,754 tilkjennega at farmasøytiske preparater av en blanding av minosyklin og EDTA var nyttige i å opprettholde åpenheten av en kateterport. US patentskrift 5,091,442 beskrev tubulære artikler, slik som kondomer og katetre, som er gjort antimikrobielt effektive ved inkorporeringen av et ikke-ionisk, tungt oppløselig antimikrobemiddel. Antimikrobemiddelet kan bli distribuert over hele artikkelen eller i et belegg på denne. US patentskrift 5,362,754 tilkjennega et farmasøytisk preparat som inkluderer minosyklin og EDTA for å opprettholde åpenheten av et kateter. US patentskrift 5,362,754 rapporterte anvendelsen av en blanding av minosyklin og EDTA (M-EDTA) for å opprettholde åpenheten av en kateterport.

Purchase et al., Nephron, 58:119-20 (1991) tilkjennega anvendelse av kalsiumchelatorer inkludert citrat for dette formålet. Butovic et al., Artif. Organs. 22:945-7 (1998) tilkjennega at citrat og polygelin, som er et plasmasubstitutt laget av ben fra kuer, var like effektive som heparin i å opprettholde katetret. I et foredrag som ble presentert på det 30. årlige møtet til the American Society of Nephrology, holdt 2.-5. Nov. 1997 i San Antonio, Texas, rapporterte Sodemann et al. at utskiftingen av katetre som skyldes infeksjon kan bli unngått ved rutinemessig bruk av den konsentrerte gentamicin/citrat-blandingen.

Likevel har én kalsiumchelator for dialysekatetre, kalt TRICITRASOL, visse uheldige egenskaper. Noen pasienter rapporterte om tap av smakssans for en kort periode rett etter injeksjonen av citrat. Nylig rapporterte FDA et tilfelle med en pasient som døde kort etter injeksjonen av citrat fordi et kateter ble blokkert (Stas et al., Nephrol. Dial. Transplant, 16:1521-1522 (2001), "FDA issues warning on triCitrasol (trademark) dialysis catheter anticoagulant". FDA Talk Paper T00-16, 14.april 2000.

US patentskrift 5,019,096 tilkjennega infeksjonsresistente medisinske innretninger omfattende en synergistisk kombinasjon av et sølvsalt (slik som sølvsulfadiazin) og klorheksidin. US patentskrift 5,772,640 rapporterte om polymere medisinske artikler omfattende anti-infeksjonsmidlene klorheksidin og triclosan. US patentskrift 5,362,754 tilkjennega forhindring av glykocalyxdannelse på et kateter ved å belegge med EDTA og/eller minosyklin for å forhindre bakterie- og soppinfeksjoner. US patentskrift 6,258,797 tilkjennega bekjempning av infeksjon eller sepsis i kateter- og portsystemer ved å benytte en antimikrobiell blokkeringsløsning av taurolidin eller taurultam.

US patentskrift 6,166,007 tilkjennega antimikrobielle blokkeringer omfattende taurinamidderivater og karboksyl syrer og/eller salter derav for å forhindre infeksjoner og blodkoagulering i eller i nærheten av en medisinsk prostetisk innretning etter at innretningen har blitt satt inn i en pasient. EP 1,040,841 beskrev forhindring av trombose-dannelse og/eller bakterievekst på en væskekontaktende overflate på et avleveringssystem ved å kontakte overflaten med en trombosemotvirkende væske med de antikoagulerende midlene taurolidin og/eller taurultam. EP 882,461 tilkjennega en medisinsk innretning som både hadde fysiologisk og antimikrobiell aktivitet omfattende et basismateriale, en kryssbundet beskyttende film dannet på en overflate på basismaterialet, og hvert av et fysiologisk aktivt stoff og et antimikrobielt stoff bundet til den beskyttende filmen.

Boorgu et al., ASAIO J., 46(6):767-770 (Nov. 2000) publiserte en attributiv antibiotisk/antikoagulerende blokkeringsterapi i behandlingen av bakterier i blodet som er assosiert med anvendelsen av en subkutant implantert innretning for å gjøre hemodialyse tilgjengelig. Festet til innretningen er to katetre som er implantert i vena cava superior eller i høyre atrium. En antibiotisk/antikoagulerende blokkeringsterapi nødvendiggjorde bibringelsen av både et antibiotikum og et antikoagulerende middel inn i innretningen. Se også Schwartz et al., Journal of Clinical Oncology, 8(9): 1591-1597 (1990) og Kamal et al., JAMA, 265(18):2364-2368 (1991).

Wiernikowski et al., Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 13(2)137-140 (1991) diskuterte om bakteriostatiske saltvannsskylleløsninger forhindret kateterinfeksjoner sammenlignet med normal saltvann. Verscaigne et al., Pharmacotherapy, 20:394-9 (2000) vurderte heparin pluss antibiotika som en blokkeringsløsning for å motvirke infeksjon, Patel et al., Thromb. Hemost., 82:1205-6 (1999) tilkjennega suksessrik anvendelse av lave doser av r-hirudin gjentagende dialysekatetertrombose hos en pasient med heparinindusert trombocytopeni. Darouiche et al., Nutrition, 13(4) (suppl):26s-29s (1997) rapporterte at forebygging av vaskulær kateterrelatert infeksjon kan bli oppnådd ved å benytte antimikrobielle midler som involverer bruken av topiske desinfiseringsmidler slik som klorheksidin, anvendelse av sølvimpregnerte subkutane mansjetter (til korttidsbenyttede CVCer), skylling av katetre med en kombinasjon av antimikrobielle og antitrombotiske midler og belegning av katetre med enten antiseptiske (klorheksidin og sølvsulfadiazin) eller antimikrobielle midler (minosyklin og rifampin).

Antibakterielle blokkeringsløsninger har blitt benyttet for å rense katetre. For eksempel tilkjennega US patentskrift 6,174,537 en kateterskylleløsning. Se også Sodermann et al., Blood Purif, 19:251-254 (2001) vedrørende DIALOCK og CLS, TUBEX-heparinblokkeringsskylleløsning (Wyeth-Ayerst) og Henrickson et al., J. Clin. Oncol., 18:1269-1278 (2000) om forebygging av CVC-relaterte infeksjoner og trombotiske hendelser ved å benytte vancomycin/ciprofloxacin/heparin-skylleløsning.

Implanterbare CDVer med myke mansjetter slik som QUINTON-PERMCATT-CVC (Quinton Instruments Co., Seattle, WA) blir oftere og oftere benyttet på pasienter med nyresykdom i sluttstadium som et middel for permanent tilgjengelighet. Deres største begrensninger ved siden av infeksjon er trombose og utilstrekkelig blodstrømning. For å unngå disse komplikasjonene blir heparin hensiktsmessig benyttet for å forbehandle QUINTON-PERMCATH-CVC mellom dialysesesjoner. Schenk et al., Amer. J. Kidney Diseases, 35:130-136 (Jan. 2000) viste at rekombinant vevsplasminogenaktivator (rt-PA) var overlegen i forhold til heparin når det gjelder forbehandling av QUINTON-PERMCATH-CVC mellom hemodialysesesjoner. Schenk et al. benyttet likevel 2 mg alteplase pluss SWFI (sterilt vann for injeksjon, USP) som ikke forhindrer bakterievekst.

Sentralvenetilgjengelighetsinnretning (CVAD)-tilstoppinger eller -blokkeringer som skyldes dannelse av en blodpropp (trombe) inne i eller i tuppen av CVAD-kateteret er et vanlig problem som kan blokkere administreringen av terapier til pasienter. Beregninger tyder på at 25 % av CVADer blir tilstoppet, med trombose som den mest vanlige etiologien (Haire et al., Thromb. Haemost., 72:543-547 (1994), Rubin, J. Clin. Oncol., 1:572-573 (1983), Lokich et al., J. Clin. Oncol., 3:710-717 (1985)). I 1994 utførte Haire et al., referert ovenfor, en dobbelt-blind, fremsynt, randomisert undersøkelse av urokinase versus alteplase (t-PA) i ufunksjonerende katetre som radiologisk var vist å være tilstoppet med tromber. Katetre ble behandlet med 2 mg alteplase eller 10 000 U urokinase som ble tillatt å være til stede i innretningen i 2 timer. Etter opp til 2 behandlinger gjenopprettet alteplase funksjon i flere katetre enn urokinase gjorde (89 % versus 59 % (p=0,013)).

Den 4.september 2001 godkjente US Food and Drug Administration (FDA) det trombolytiske midlet CATHFLO-ACTIVASE (alteplase) -t-PA for gjenoppretting av funksjon av CVADer, der gjenopprettingen besto i gjenoppretting av evnen til å samle blod. CATHFLO-ACTIVASE-t-PA som er tilgjengelig i et enkeltpasientrør på 2 mg, er det eneste markedsførte trombolytiske middelet som er tilgjengelig for denne indikasjonen, og det gir profesjonelle utøvere en levedyktig behandlingsmulighet for en CVAD-komplikasjon som kan hindre pasientbehandling. Ett rør med CATHFLO-t-PA inneholder 2,2 mg med alteplase, 77 mg L-arginin, 0,2 mg POLYSORBAT-80-emulgator og fosforsyre for å justere pH til omtrent 7,3.

t-PA har blitt bundet til andre materialer enn vaskulære katetre. Se for eksempel Zhou et al., J. Control Release, 55:281-295 (1998), Greco et al., Ann. Vase. Surg., 9:140-145 (1995) og Woodhouse et al., Biomaterials, 17:75-77 (1996).

US patentskrift 5,688,516 tilkjennega anvendelse av valgte kombinasjoner av et chelaterende middel, et antikoagulerende eller antitrombotisk middel med et ikke-glykopeptid antimikrobielt middel slik som tetrasyklinantibiotika, for å belegge en medisinsk innretning og for å hemme kateterinfeksjon. Foretrukne kombinasjoner inkluderer minosyklin eller et annet ikke-glykopeptid antimikrobielt middel sammen med EDTA, EGTA, DTPA, TTH, heparin og/eller hirudin i et farmasøytisk, akseptabelt fortynningsmiddel. US patentskrift 6,187,768 tilkjennega likeledes anvendelse av et antimikrobielt middel og et antikoagulerende middel, et antitrombotisk middel eller et chelaterende middel for å opprettholde åpenhet i intravenøse medisinske innretninger slik som katetre og for å forhindre infeksjoner som er forårsaket av bakterievekst i katetre.

På tross av det som er beskrevet ovenfor, er det fremdeles et behov for et ikke-toksisk medikament for å fjerne fibrinbundne blodpropper fra katetre, spesielt fra intravenøse medisinske innretninger. Det er et ytterligere behov for forhindring og fjerning av fibrin fra slike innretninger siden visse bakterier har bindingsseter som fremmer binding til fibrin spesielt.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse innebærer løsninger som er unike i å møte behovene beskrevet ovenfor og som ikke er basert på antikoagulerende, antitrombotiske eller chelaterende aktiviteter og som ikke involverer anvendelsen av antibiotika som pattedyr kan utvikle resistens mot. Foreliggende oppfinnelse løser behovene som er fremlagt her ved å benytte en plasminogenaktivator i sammenheng med et desinfiserende middel som benyttes som et preserveringsmiddel, først og fremst en organisk alkohol som tjener dette formålet. Det resulterende medikamentet har ikke bare fibrinolytisk aktivitet men forhindrer også patogenvekst, spesielt i katetre med blodpropper, og har tilfredsstilt USP-standarder.

I ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av et preparat for fremstilling av et medikament for fjerning av fibrinbundne blodpropper fra et kateter hvori preparatet omfatter vann, fra 0,1 til 10 mg/ml av en fibrinolytisk effektiv mengde av en plasminogenaktivator og fra 0,5 til 1,2 vol% av en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatisk organisk alkohol, der preparatet ikke omfatter et chelaterende middel.

I et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en multiseksjonsforpakning som er kjennetegnet ved at den omfatter en seksjon som omfatter fra 0,1 til 10 mg/ml av en fibrinolytisk effektiv mengde av en plasminogenaktivator, en seksjon som omfatter vann som inneholder fra 0,5 til 1,2 vol% av en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatisk organisk alkohol, der ingen av seksjonene omfatter et chelaterende middel.

I nok et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en multiseksjonsforpakning som omfatter en seksjon som omfatter fra 0,1 til 10 mg/ml nativsekvens-t-PA eller tenecteplase og en seksjon som omfatter vann inneholdende 0,5 til 1,2 % (v/v) benzylalkohol, isopropanol eller etanol, der ingen av seksjonene omfatter et chelaterende middel.

Den foretrukne mengden benzylalkohol, som her er en foretrukket alkohol, er 0,8-1,1 %. Dette området og det utvidede området på 0,5-1,2 % er tilstrekkelig til å hemme mikrobevekst men samtidig bevare stabilitet og funksjon for plasminogenaktivatoren. En fordel med denne alkoholen er at den ikke fører til antibiotikaresistens.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser reduserte SEC-kromatogrammer av rekonstituert rt-PA (1 mg/ml med BWFI, BNS og SWF1) etter 14 dager med lagring ved 37 °C i glassrør.

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Definisjoner:

Som benyttet her refererer "kateter" til en medisinsk innretning som generelt er utformet av plastikkpolymerer slik som for eksempel polyuretaner, silikon eller andre slike polymerer til formålet å avlevere medisinsk terapi og til innsamling av blod. Slike katetre representerer et bredt utvalg av intravenøse medisinske innretninger slik som et urinkateter, et vaskulært kateter slik som en CVC eller et perifert intravenøst kateter, et arterielt kateter, et trakealt kateter, et Swan-Ganz-kateter, et hemodialysekateter, et navlekateter, et perkutant ikke-rørinnsatt silikonkateter, et mansjettkledd rørinnsatt sentralvenekateter og en subkutan sentralveneport og liknende.

Uttrykket "vaskulære katetre" blir her benyttet for å beskrive et kateter som involverer det vaskulære systemet og som inkluderer perifere katetre og CVCer, mansjettkledde langtidsinnretninger, ikke-mansjettkledde kortidsinnretninger og implanterbare porter. CVCer, som er det samme som sentralvenetilgjengelighets-innretninger (CVADer), inkluderer perifert innsatte sentralkatetre (PICC-linjer), eksternt mansjettkledde innretninger, ikke-mansjettkledde katetre, ikke-rørinnsatte og subkutant rørinnsatte katetre, hemodialyse (HD)-katetre og porter.

De foretrukne katetrene her er et intravenøst kateter slik som en CVC, helst en mansjettkledd rørinnsatt CVC, et perifert intravenøst kateter, et arteriekateter, et Swan-Ganz-kateter, et hemodialysekateter, et navlekateter, et perkutant ikke-rørinnsatt silikonkateter eller en subkutan sentralveneport. Også foretrukket er et urinkateter eller et peritonalt kateter. Foretrukket i tillegg er et intravenøst kateter, ett som er fabrikkert fra et biomedisinsk polyuretan eller silikon, eller et vaskulært kateter.

Som benyttet her refererer "fremstilling " eller "preparat" til et preparat, en løsning, en formulering eller liknende som er en blanding av de angitte ingrediensene.

Som benyttet her betyr uttrykkene "kontakt" og "kontakte" og liknende, en utsettelse for et reagens på en hvilken som helst måte, så som belegging og inkubering.

Uttrykkene "belegge", "belagt" o.s.v., slik som de benyttes her, refererer til dypping, gjennombløting, behandling og/eller impregnering av et kateter med preparatet det gjelder her.

Slik som det benyttes her betyr "bakteriostatisk organisk alkohol" en organisk alkohol som er et desinfiserende middel benyttet som et preserveringsmiddel og som ikke er klassifisert som et antibiotikum eller som ikke tilhører en antibiotikaklasse. Desinfiserende midler, som er kjemikalier som hemmer eller dreper mikroorganismer, er definert i Basic and Clinical Pharmacology, 8.utgave (2001), del VII, Chemotherapeutic drugs, kapittel 50, Miscellaneous Antimicrobial Agents - Disinfectants, Antiseptics, and Sterilants. Preserverende midler er kjemikalier som benyttes for å forhindre ødeleggelse av preparater fra mikrober. Desinfiserende midler blir benyttet som preserverende midler for å hindre oppvekst av bakterier og sopp i farmasøytiske preparater. De må være effektive i forhold til å hindre vekst av mikroorganismer som det er sannsynlig kan kontaminere dem, og må ha tilstrekkelig løselighet og stabilitet til å forbli aktive som beskrevet i Ellenhorn's Medical Toxicology, 2. red. (1997), del IV, Chemicals, kapittel 57, Antiseptics and Disinfectants. Eksempler på slike preserverende organiske alkoholer inkluderer etanol, isopropanol og benzylalkohol, som er foretrukket her, der benzylalkohol er mest foretrukket. Benzylalkohol, som er hydrofob, kan ødelegge cellevegger og membraner hos mikroorganismer, denaturere proteiner og inaktivere enzymer.

"Bakteriostatisk vann for injeksjon" eller "BWFI" refererer til en blanding av vann og ulike mengder av benzylalkohol og vann uten noen andre ingredienser som definert av the United States Pharmacopeia (USP).

Som benyttet her er "sterilt vann for injeksjon" eller "SWFI" sterilt vann alene uten noen andre ingredienser.

Som benyttet her er "normal saltvannsoppløsning" eller "NS" en blanding av vann med en passende mengde (slik som 0,9 % (w/v)) med natriumklorid uten noen andre ingredienser.

Som benyttet her refererer "bakteriostatisk normal saltvannsoppløsning" eller "BNS" til sterilt vann med en passende mengde (slik som 0,9 % (w/v)) med natriumklorid og med en passende mengde (d.v.s. en mengde som er effektivt preserverende) med en bakteriostatisk organisk alkohol slik som benzylalkohol uten noen andre ingredienser.

Som benyttet her betyr uttrykket "plasminogenaktivator" en fibrinolytisk enkelt-eller dobbeltkjedet plasminogenaktivator inkludert urinary plasminogenaktivator i nativ eller i variantform, vevsplasminogenaktivator i en nativ form slik som ACTIVASE-altaplase-t-PA eller i en variantform slik som r-PA (reteplase, RET A VASE, Centocor Inc.) og tenecteplase (en t-PA-variant betegnet T103N, NI 17Q, K296A, H297A, R298A, R299A som er tilgjengelig som TNKASE fra Genentech Inc. og for eksempel beskrevet i US patentskrift 5,612,029) i tillegg til urokinase (for eksempel ABBOKINASE, Abbott) som kan være et naturlig forekommende nativt molekyl eller en variant av urokinase som har funksjonen til et fibrinolytisk middel ved å løse opp propper i blodet og forhindre og fjerne fibrin. Plasminogenaktivatoren er foretrukket t-PA med nativ sekvens, en fibrinolytisk t-PA-variant, urokinase med nativ sekvens eller en fibrinolytisk urokinase-variant. Mer foretrukket er plasminogenaktivatoren en t-PA med nativ sekvens, en fibrinolytisk t-PA-variant eller urokinase med nativ sekvens. Enda mer foretrukket er plasminogenaktivatoren en t-PA med nativ sekvens eller en fibrinolytisk t-PA-variant. Enda mer foretrukket er t-PA-varianten tenecteplase eller reteplase. Mest foretrukket er plasminogenaktivatoren t-PA eller tenecteplase med nativ sekvens.

Som benyttet her betyr "chelaterende middel" et middel som blir benyttet til chelatering, slik som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), DMSA, deferoxamin, dimercaprol, sinkcitrat, TR1CITRASOL (en citratkalsiumchelator), en kombinasjon av vismut og citrat, penicillamin, succimer eller etidronat. Etylenglykol-bis-(beta-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (EGTA) og dietylentriaminpentaeddiksyre (DPTA) og salter derav er andre kjente chelaterende midler, i tillegg til edetatkalsium-dinatrium, trietylentetramindihydroklorid og de som chelaterer divalente metallioner slik som Ca, Mg, Mn, Fe og Zn.

Utførelses/ ormer av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av et preparat for fremstilling av et medikament som er nyttig til fjerning av fibrinbundne blodpropper fra et kateter og som omfatter vann, en fibrinolytisk effektiv mengde av en plasminogenaktivator og en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatisk organisk alkohol. Preparatet inneholder ikke et chelaterende middel.

Vannet inneholder fortrinnsvis til å begynne med den bakteriostatiske alkoholen. Det er generelt fire typer fortynningsmidler som blir benyttet for å fortynne eller rekonstituere legemidler: BWFT, SWFI, BNS og NS. Foreliggende oppfinnelse inkluderer bare de som er bakteriostatiske, d.v.s., BWFI og BNS. Vannet som inneholder alkoholen er fortrinnsvis bakteriostatisk vann for injeksjon eller det er bakteriostatisk normal saltvannsoppløsning.

pH-verdien for preparatet her må være passende til biologisk bruk. Typisk vil preparatet eller løsningen ha en pH i området fra 3 til 7, helst fra 3,5 til 6,5 og aller helst fra 4,5 til 6,5. Preparatet vil normalt ha en fysiologisk pH. Hvis det er nødvendig kan pH bli justert ved å tilsette syre eller base slik som en mineralsyre, for eksempel saltsyre eller helst én som ikke vil forårsake asidose, slik som for eksempel eddiksyre, eplesyre eller melkesyre. Andre fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området for å justere pH-verdien kan også bli benyttet.

En test for å finne ut hvorvidt mengden av plasminogenaktivator i preparatet er fibrinolytisk effektiv kan bli utført, for eksempel med in vzYro-propplyseringsanalyser, slik som de som er beskrevet i eksemplene som er tilveiebrakt her.

Den preserveringsmessig effektive mengden av alkohol kan for eksempel bli bestemt ved hjelp av den antimikrobielle effektivitetstesten som er fremlagt i eksemplene nedenfor. Fortrinnsvis er mengden av plasminogenaktivator fra 0,1 til 10 mg/ml og den preserveringsmessig effektive mengden av organisk alkohol er fortrukket fra 0,5 til 1,2 %

(v/v). Mer foretrukket er den fibrinolytisk effektive mengden av plasminogenaktivator fra

0,3 til 5 mg/ml, enda mer foretrukket fra 0,5 til 4 mg/ml og aller mest foretrukket fra 1 til 3 mg/ml. Den mer foretrukne mengden av organisk alkohol er fra 0,8 til 1,1 % (v/v).

Preparatet anvendt ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis utsatt for betingelser som hovedsakelig fører til at enhver mikroorganisme i preparatet dør, og preparatet blir pakket i en forseglet forpakning slik som i en sprøyte, et septum-lukket rør, eller i en ampulle som i all vesentlighet er ugjennomtrengelig for mikroorganismer. Helst inneholder den forseglede forpakningen et volum av skylleløsningen som er tilstrekkelig til å utføre én kateterskylleprosedyre. Til spesielle applikasjoner kan en større forpakning være foretrukket, som inneholder en tilstrekkelig mengde av løsningen til at flere individuelle kateterskylleprosedyrer kan foretas.

En fremgangsmåte for å skylle et intravenøst kateter inkluderer å tilveiebringe en blandet løsning som beskrevet ovenfor og kontakte katetret med en slik løsning i minst to timer. Fremgangsmåten inkluderer å fylle en væskeholdende innretning, helst en sprøyte, med et volum av løsningen som er tilstrekkelig til utføre en kateterskyllingsprosedyre. Den foretrukne mengden til skylleprosedyren er generelt omtrent en til tre milliliter. Utøveren fester deretter sprøyten til det intravaskulære katetret som krever skylling og administrerer løsningen inn i katetret for dermed å fullføre skylleprosedyren.

Fremgangsmåten her kan bli benyttet for å fjerne eksisterende blodpropper i nesten ethvert direkte innsatt kateter eller kateter som er innsatt gjennom et rør. Som en del av et katetervedlikehold eller skylleregime blir katetret mest foretrukket skylt med preparatet ifølge oppfinnelsen for eksempel én gang i uken, én gang hver 4. dag, annenhver dag, én gang om dagen (omtrent hver 24. time), to ganger om dagen, hver 4. time eller etter behov ifølge pasientens behov, slik som det er åpenbart for den erfarne utøveren. Kateterskylleregimet kan ganske enkelt bestå av én skylling hver gang katetret blir byttet ut. I et fortrukket aspekt ifølge fremgangsmåten skal katetret bli skylt oftere ved fire timers intervaller med preparatet ifølge oppfinnelsen.

Selv om fremgangsmåten gjelder for å introdusere preparatet inn i katetre som allerede er på plass, vil fagfolk på området forstå at å kontakte eller belegge katetret mens det er på utsiden av kroppen med preparatet kan forhindre deponering av fibrin på en slik overflate etter at det er implantert og redusere seter for bakteriell vekst. Dermed kan overflatene på katetre, slik som hemodialysekatetre, bli forhåndsbehandlet med preparatet her. Katetret kan først bli behandlet med et preparat og deretter etter innsetting bli utsatt for repetert periodisk skylling.

Spesielle eksempler på katetre som kan bli klargjort og belagt med preparatene anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse er tilveiebrakt i listen ovenfor. Ved belegningen er plasminogenaktivatoren, vannet og alkoholen til stede i mengder slik at deres kombinasjon har effektiv fibrinolytisk og preserverende aktivitet på artikkelen som blir behandlet. I en spesifikk utførelsesform er katetret et polyuretankateter eller silikonkateter (eller ett som er fremstilt av liknende polymerer) som har blitt behandlet med (d.v.s.. dyppet eller gjennombløtt i) en behandlingsløsning som fremlagt ovenfor. Overflaten til katetret av interesse blir deretter utsatt for preparatet i en tidsperiode som er tilstrekkelig til å tillate dannelsen av en film eller et belegg av preparatet på den blottlagte overflaten av innretningen. Som en væske vil preparatet bli tillatt å tørke på overflaten av innretningen slik at det dannes en film.

Mengden av preparatet her injisert inn i et kateter vil være tilstrekkelig til å fylle det opp. Når de er hemodialysekatetre har slike innretninger typisk interne volumer i området fra 0,1 til 10 ml. Slike mengder vil selvfølgelig variere med lengden og diameteren til slangene på innretningen som eventuelt kan være en funksjon av størrelsen på den individuelle pasient.

Hvis fibrinbundne blodpropper blir fjernet fra et kateter kan katetret bli kontaktet med løsningen her i minst 5 dager, helst 6 til 15 dager.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i nok et annet aspekt et sett eller en forpakning. 1 en utførelsesform omfatter settet eller forpakningen en beholder slik som en seksjonert sprøyte som omfatter minst to separate seksjoner. En seksjon eller beholder omfatter en fibrinolytisk mengde av en plasminogenaktivator slik som t-PA og den andre beholderen eller seksjonen omfatter vann som inneholder en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatisk organisk alkohol. Som for preparatet omfatter ingen av seksjonene et chelaterende middel. Forpakningen inneholder også instruksjoner for blanding av innholdet i begge seksjoner og for anvendelse av den resulterende blandingen for å fjerne fibrinbundne blodpropper fra et kateter som inneholder slike blodpropper, t-PA kan være et lyofilisert pulver som i form av et tørt pulver deretter kan bli rekonstituert når det blandes med vannet for å tilveiebringe en løsning som er passende for bruk. Settet kan ytterligere inkludere en beholder som er en bærer som er tilpasset til å motta innholdet i de to seksjonene. Forpakningen her kan være et sett der hver seksjon er en separat beholder slik som et rør eller en ampulle, eller forpakningen kan være en multiseksjonssprøyte.

Ulike egenskaper og aspekter av foreliggende oppfinnelse er videre illustrert i eksemplene som følger.

Eksempler

Eksempel 1 (sammenlikningseksempel):

O ppsummering:

Testing ble utført som beskrevet nedenfor for å evaluere de antimikrobielle egenskapene for 2 mg/ml ACTIVASE-t-PA som var rekonstituert i SWFI. Denne prøven tilfredstilte ikke kravet i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

USP- antimikrobeeffektivitetstest:

Denne testen blir benyttet for å evaluere effektiviteten til et preserveringsmiddel i en formulering eller for å undersøke den interne antimikrobielle aktiviteten til en aktiv ingrediens. Den er beskrevet i USP 24, "Microbiological Tests/(51) Antimicrobial Effectiveness Testing, sidene 1809-1811.

A. Materialer og viktigste utstyr:

1. Utfordrerorganismene som ble benyttet var Escherichia coli, ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027, Staphylococcus aureus, ATCC 6538, Candida albicans, ATCC 10231 og Aspergillus niger, ATCC 16404.

2. Medier, tilsetninger og viktigste utstyr var:

Trypticase soy agar (TSA)

Sabouraud dekstroseagar (SDA)

Fosfalbufret saltvannsløsning (PBS), steril, pH 7,2 ± 0,2

Sterile koniske 50-ml-rør

Sterile vattpinner og serologiske pipetter

Spektrofotometer

Koloniteller, Quebec eller tilsvarende

Inkubatorer ved 2-8 °C, 22,5 ± 2,5 °C og 32,5 ± 2,5 °C

B. Prosedyre:

Hver organismesuspensjon ble tillaget for å oppnå en omtrentlig konsentrasjon på 1x10 kolonidannende enheter (CFUVml. Hver av de fem rørene inneholdende 10 ml med prøve ble inokulert med 0,05 ml av sin tilsvarende utfordrerorganisme, noe som resulterer i en startkonsentrasjon på mellom lxlO<5>CFU/ml og lxl0<6>CFU/ml av testpreparatet. Utgangspopulasjonen av levedyktige organismer i hvert testpreparat ble beregnet basert på konsentrasjonen av organismene i hver av de standardiserte inokuleringene ved hjelp av Pour-Plate-fremgangsmåten. Denne fremgangsmåten er en vanlig mikrobiologisk teknikk for å telle antallet organismer i en testprøve. Testprøven blir fortynnet med steril saltvannsløsning og pipettert over på en steril petriskål. Deretter blir smeltet agar (næringsmediet) helt over på petriskålen og blandet med prøven og inkubert ved en standardisert temperatur og tid. Denne fremgangsmåten gir kolonier som dannes i hele agaren og ikke bare på overflaten.

Omtrent 10 ml med prøve ble samlet i et rør og hensatt uinokulert for å tjene som en negativ kontroll. Ved T = dag 7, dag 14 og dag 28 ble populasjonen av hver organisme i de inokulerte prøvene og i den negative kontrollen bestemt ved hjelp av Pour-Plate-fremgangsmåten, den godkjente skåltellefremgangsmåten. Inkubasjonsbetingelser for Pour-Plate-fremgangsmåten er vist i tabell 1.

2. Validering av Pour- Plate- fremgangsmåten:

Prøven ble trinnvis fortynnet for å frembringe IO"<1->og 10"<2->fortynninger. En 1-ml-porsjon av hver prøve ble tilsatt til hver av de 5 petriskålene. For hver prøvefortynning ble et volum på 0,1 ml inneholdende omtrent lxl 03 CFU/ml av hver utfordrerorganisme tilsatt til sin tilsvarende petriskål. Parallelt ble det samme inokulerte volumet av hver organisme tilsatt til hver av to skåler uten prøvefortynningene for å bekrefte telling. En porsjon på 15-20 ml smeltet agar av omtrent 45 °C ble tilsatt til hver skål og forsiktig snurret for å blande innholdet som fikk stivne og ble inkubert som vist i tabell 1.

3. Tillaging av prøve:

10 ml prøve ble tilsatt i hver av fem rør. Hvert rør ble merket separat med "EC", "PA", "SA", "CA" og "AN" slik at hvert rør var merket for hver organisme som skulle bli testet. Ti ml prøve ble tilsatt i et rør merket som negativ kontroll. Alternativt til tilsettings-og merkingstrinnene ovenfor ble 20 ml prøve tilsatt i hvert rør.

4. Bestemmelse av biobvrde:

Ved å benytte den negative kontrollen ble biobyrden til prøven bestemt ved hjelp av Pour-Plate-fremgangsmåten. Mediene og inkubasjonsbetingelsene ble benyttet som fremlagt i tabell 1.

5. Inokulering av prøve:

0,05 ml av hver av organismesuspensjonene ble inokulert med lxlO<8>CFU/ml inn i det tilsvarende prøverøret inneholdende 10 ml prøve. Volumet av suspensjonen det ble inokulert med var 0,5 % av volumet av prøven. Blandingen ble grundig mikset på en vortekser. Sluttkonsentrasjonen av testpreparatet var omtrent 5,0x10<5>CFU/ml. Alternativt, hvis et prøvevolum på 20 ml ble benyttet i hvert rør for inokuleringstrinnet ovenfor, blir 0,1 ml av hver av utfordrersuspensjonene tilsatt.

6. Bekreftelse av startkonsentrasionstelling:

Skåltellingen for hver standardiserte inokulering ble bestemt (l,0xl0<8>CFU/ml) ved hjelp av Pour-Plate-fremgangsmåten. Mediene og inkubasjonsbetingelsene benyttet er fremlagt i tabell 1. Skåltellingene ble utført i duplikat for å finne den gjennomsnittlige skåltellingen for hver standardiserte inokulering. Startkonsentrasjonen for hver utfordrerorganisme i testpreparatet ble beregnet ved å benytte følgende likning:

S x (I/P)

der

S = gjennomsnittlig organismekonsentrasjon i standardisert suspensjon (l,0xl0<8>CFU/ml) I = inokuleringsvolum (0,05 ml)

P = volum av testpreparat (10 ml)

7. Prøvelagring og testintervaller:

De inokulerte beholderne og den negative kontrollen ble inkubert ved 22,5 ± 2,5 °C beskyttet fra lys. Hver beholder ble tatt prøve av ved spesifikke tidspunkter i tabell 2. Skåltellingen av de inokulerte prøvene og av den negative kontrollen ble utført ved hjelp av Pour-Plate-fremgangsmåten. Skåltellingen ble utført i duplikat. Medier og inkuberings-betingelser ble benyttet som fremlagt i tabell 1.

C. Godkjennelseskriterier:

1. For en gyldig utforderstudie var konsentrasjonen av utfordrerorganismer i hver test på mellom lxlO<5>CFU/ml og lxlO<6>CFU/ml. Ingen detekterbar biobyrde var til stede i prøven som ble benyttet i den validerte skåltellefremgangsmåten. 2. For en gyldig skåltellefremgangsmåte må den gjennomsnittlige tellingen av de inokulerte som er gjenvunnet ved hvert fortynningsnivå være større enn eller lik 50 % av den gjennomsnittlige tellingen for den tilsvarende kontrollen. Hvis den gjennomsnittlige tellingen av de inokulerte som er gjenvunnet ved en fortynning. Hvis den gjennomsnittlige tellingen er mindre enn 50 % blir alle tellinger ved den fortynningen ansett ugyldige.

D. Fortolkning:

1. USP

For bakterier bør det ikke være mindre enn en 1,0-log-reduksjon i forhold til den i utgangspunktet kalkulerte tellingen ved 7 dager, ikke mindre enn 3,0-log-reduksjon i forhold til utgangstellingen ved 14 dager og ingen økning fra tellingen ved 14 dager på dag 28.

For gjær og muggsopp bør det ikke være noen økning fra den i utgangspunkt kalkulerte tellingen ved 7, 14 og 28 dager. "Ingen økning" er definert som ikke mer enn 0,5-logio-enheter høyere enn den forrige verdien som ble målt.

2. EP

Kriteriene for evaluering av antimikrobiell aktivitet for parenterale preparater foreligger i tabell 3 i form av log-reduksjonen i antallet levedyktige mikroorganismer i forhold til verdien som er oppnådd for det inokulerte.

<*>A-kriteriet uttrykker den anbefalte effektiviteten som skal oppnås. I rettferdiggjorte tilfeller der A-kriteriet ikke kan bli oppnådd, for eksempel p.g.a. en økt risiko for ugunstige reaksjoner, må B-kriteriet bli oppfylt.

Test med ACTIVASE- t- PA og SWFI:

A. Materialer, utstyr og prosedyrer:

Prøven var 2 mg/ml med ACTIVASE-alteplase-t-PA i et rør med SWFI som ikke inneholdt benzylalkohol.

Utfordrerorganismene og alle medier, tilbehør og viktigste utstyr var de samme som er beskrevet i testen ovenfor. Prosedyren som ble benyttet var den samme som den som er beskrevet i teksten ovenfor, og inkuberingsbetingelsene var som beskrevet i tabell 1. Godkjennelseskriteriene og fortolkningen var de samme som i beskrivelsen ovenfor.

Resultater:

Den beregnede utgangskonsentrasjonen av utfordrerorganismer i hvert testpreparat var på mellom lxlO<5>CFU/ml og lxlO<6>CFU/ml (tabell 4).

Det var ingen påvisbar biobyrde i prøven når Pour-Plate-fremgangsmåten ble benyttet (tabell 5).

Skåltellefremgangsmåten ble validert ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten. Det gjennomsnittlig inokulerte som ble gjenvunnet ved 10"'-fortynningen av prøven var større eller lik 50 % av gjennomsnittet av den tilsvarende kontrollen (tabell 6).

For P. aeruginosa og S. aureus var det en reduksjon som var større enn eller lik

med 1,3-logioi forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7, en reduksjon på mindre enn 3,0-logi0ved dag 14 og en reduksjon som var større enn eller lik med 3,6-logioved dag 28 (tabell 7 og 8). For E. coli var det en reduksjon på mindre enn 1,0-log|0i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen på dag 7 og en reduksjon på mindre enn 3,0-logiopå dag 14 og dag 28 (tabell 7 og 8).

For gjær og muggsopp var det en reduksjon som var større enn eller lik 0,6-log)0i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen på dag 7, en reduksjon som var større enn eller lik l,0-logi0på dag 14 og en reduksjon som var større enn eller lik l,6-log|0på dag 28 (tabell 7 og 8).

Diskusjon:

I den bakterielle antimikrobielle effektivitetstesten tilfredstilte ikke denne prøven USP-kravene. Det var en < 1,0-logioreduksjon i den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 for E. coli. Ved dag 14 var log-reduksjonen til alle tre bakterielle testorganismer

<3,0 logio.. For gjær og muggsopp var det ingen økning fra den i utgangspunktet beregnede tellingen ved 7,14 og 28 dager.

Eksempel 2:

Oppsummering:

Testing ble utført som tilkjennegitt ovenfor for antimikrobiell effektivitet, for å evaluere effekten av 0,8 % benzylalkohol som et preserveringsmiddel i 2 mg/ml ACTIVASE-t-PA i forhold til USP-kravene. Denne prøven oppfylte karvene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

Materialer, utstyr og prosedyrer:

Prøven var ACTIVASE-t-PA (2 mg/ml) i et rør med 0,8 % benzylalkohol. Spesifikt var fortynningsmiddelet sterilt vann pluss den passende mengden av benzylalkohol til en sluttkonsentrasjon på 0,8 %.

Utfordrerorganismene var de som er beskrevet i eksempel 1.

Medier, tilbehør og viktigste utstyr var de samme som omtalt i eksempel 1.

Prosedyren som ble benyttet var den samme som den som er beskrevet i eksempel 1 og inkuberingsbetingelsene var som i tabell 1. Godkjennelseskriteriene og fortolkningen var de samme som i eksempel 1.

Resultater:

Resultatene var de samme som i tabell 4 og tabell 5 for beregnet utgangs-konsentrasjon for utfordrerorganismer i hvert testpreparat (mellom lxlO<5>og lxlO<6>CFU/ml) og for biobyrde i prøven ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten (ingen påvisbar biobyrde). Skåltellefremgangsmåten ble validert ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten. Det gjennomsnittlige inokulerte gjenvunnet ved 10"'-fortynningen av prøven var større enn eller lik 50 % av gjennomsnittet for den tilsvarende kontrollen (tabell 9). For bakterier var det en >3,3 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en >4,3 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 10 og 11). For gjær og muggsopp var det en større enn eller lik 3,1 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en større enn 4,6 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 10 og 11).

Konklusjon:

Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

Eksempel 3:

O ppsummering:

Testing ble utført som tilkjennegitt ovenfor for antimikrobiell effektivitet for å evaluere effekten av 0,9 % benzylalkohol som et preserverende middel i 2 mg/ml ACTIVASE-t-PA i forhold til USP-kravene. Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

Materialer, utstyr og prosedyrer:

Prøven var ACTIVASE-t-PA (2 mg/ml) i et rør med 0,9 % benzylalkohol. Spesifikt var fortynningsmiddelet sterilt vann pluss den passende mengden av benzylalkohol til en sluttkonsentrasjon på 0,9 %.

Utfordrerorganismene var de som er beskrevet i eksempel 1.

Medier, tilbehør og viktigste utstyr var de samme som omtalt i eksempel 1.

Resultater:

Resultatene var de samme som i tabell 4 og tabell 5 for beregnet utgangs-konsentrasjon for utfordrerorganismer i hvert testpreparat (mellom lxlO<5>og lxlO<6>CFU/ml) og for biobyrde i prøven ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten (ingen påvisbar biobyrde). Skåltellefremgangsmåten ble validert ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten. Det gjennomsnittlige inokulerte gjenvunnet ved 10"'-fortynningen av prøven var større enn eller lik 50 % av gjennomsnittet for den tilsvarende kontrollen (tabell 12). For bakterier var det en >3,3 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en >4,3 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 13 og 14). For gjær og muggsopp var det en større enn eller lik 3,6 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en større enn 4,6 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 13 og 14).

Konklusjon:

Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

I en foreslått forbehandlingsapplikasjon kan en løsning av CATHFLO-ACTIVASE (alteplase) 2,2 mg lyofilisert pulver rekonstituert med 2,2 ml 0,9 % benzylalkohol i sterilt bakteriostatisk vann for injeksjon (1 mg/ml konsentrasjon) bli plassert inne i et vaskulært kateter i et volum som tilsvarer volumet som kan omfattes av innsiden av katetret. Løsningen kan bli aspirert fra katetret og kastet før katetret benyttes til medisinske formål.

Eksempel 4:

Oppsummering:

Testing ble utført som tilkjennegitt ovenfor for antimikrobiell effektivitet for å evaluere effekten av 1,0 % benzylalkohol som et preserverende middel i 2 mg/ml ACTIVASE-t-PA i forhold til USP-kravene. Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

Materieler, utstyr og prosedyrer:

Prøven var ACTIVASE-t-PA (2 mg/ml) i et rør med 1,0 % benzylalkohol. Spesifikt var fortynningsmiddelet sterilt vann pluss den passende mengden av benzylalkohol til en sluttkonsentrasjon på 1,0 %.

Utfordrerorganismene var de som er beskrevet i eksempel 1.

Medier, tilbehør og viktigste utstyr var de samme som omtalt i eksempel 1. Prosedyren som ble benyttet var den samme som den som er beskrevet i eksempel 1 og inkuberingsbetingelsene var som i tabell 1. Godkjennelseskriteriene og fortolkningen var de samme som i eksempel 1.

Resultater:

Resultatene var de samme som i tabell 4 og tabell 5 for beregnet utgangs-konsentrasjon for utfordrerorganismer i hvert testpreparat (mellom lxlO<5>og lxlO<6>CFU/ml) og for biobyrde i prøven ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten (ingen påvisbar biobyrde). Skåltellefremgangsmåten ble validert ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten. Det gjennomsnittlige inokulerte gjenvunnet ved 10"'-fortynningen av prøven var større enn eller lik 50 % av gjennomsnittet for den tilsvarende kontrollen (tabell 15). For bakterier var det en >3,3 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en >4,3 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 16 og 17). For gjær og muggsopp var det en større enn eller lik 4,1 log|0-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en større enn 4,6 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 16 og 17).

Konklusjon:

Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

Eksempel 5:

Oppsummering:

Testing ble utført som tilkjennegitt ovenfor for antimikrobiell effektivitet for å evaluere effekten av 1,1 % benzylalkohol som et preserverende middel i 2 mg/ml ACTIVASE-t-PA i forhold til USP-kravene. Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffekti vitetstesten.

Materialer, utstyr og prosedyrer:

Prøven var ACTIVASE-t-PA (2 mg/ml) i et rør med 1,1 % benzylalkohol. Spesifikt var fortynningsmiddelet sterilt vann pluss den passende mengden av benzylalkohol til en sluttkonsentrasjon på 1,1 %.

Utfordrerorganismene var de som er beskrevet i eksempel 1.

Medier, tilbehør og viktigste utstyr var de samme som omtalt i eksempel 1.

Resultater:

Resultatene var de samme som i tabell 4 og tabell 5 for beregnet utgangskon-sentrasjon for utfordrerorganismer i hvert testpreparat (mellom lxlO<5>og lxlO<6>CFU/ml) og for biobyrde i prøven ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten (ingen påvisbar biobyrde). Skåltellefremgangsmåten ble validert ved å benytte Pour-Plate-fremgangsmåten. Det gjennomsnittlige inokulerte gjenvunnet ved 10"'-fortynningen av prøven var større enn eller lik 50 % av gjennomsnittet for den tilsvarende kontrollen (tabell 18). For bakterier var det en >3,3 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en >4,3 logio-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 19 og 20). For gjær og muggsopp var det en større enn eller lik 3,6 logio-reduksjon i forhold til den beregnede utgangskonsentrasjonen ved dag 7 og en større enn 4,6 logi0-reduksjon på dag 14 og dag 28 (tabell 19 og 20).

Konklusjon:

Denne prøven tilfredstilte kravene i USP-antimikrobeeffektivitetstesten.

Eksempel 6

Oppsummering:

Alteplase (2 mg/rør rt-PA) ble rekonstituert til l mg/ml med BWFI, BNS og

SWFI. Stabiliteten til proteinet etter rekonstituering i glassrør ble overvåket ved 37 °C i 2 uker. Etterl4 dager med lagring ved 37 °C fremsto alle de rekonstituerte løsningene som klare og fargeløse. Proteinkonsentrasjonene (1,1 ± 0,02 mg/ml) og pH (7,2 ± 0,03) forble uforandret. Prosenten av monomer av nativ SEC viste en gradvis minkning med henholdsvis 1-3 % og 4-5 % etter én og to uker ved 37 °C. En minkning av prosentandelen av enkeltkjede og propplyseringsaktivitet ( in vitro) ble observert etter én uke ved 37 °C. Prosentandelen av enkeltkjede og propplyseringsaktivitet ( in vitro) ble likevel drastisk redusert etter 14 dager ved 37 °C. Mer proteolytisk kutting av molekylet ble observert for proteinløsningen som var rekonstituert med SWFI enn med BWFI og BNS. Derfor var alteplase (2 mg/rør rt-PA) som var rekonstituert med BWFI, BNS eller SWFI til 1 mg/ml relativt stabilt ved 37 °C i én uke.

Materialer og fremgangsmåter:

A. Materialer:

- Alteplase (2 mg-rør rt-PA)

- BWFI, USP, 20 ml (Abbott)

- Bakteriostatisk 0,9 % natriumklorid (w/v) (BNS) -injeksjon, USP, 20 ml (Abbott)

- SWFI, USP, 20 ml (Abbott)

B. Fremgangsmåter:

Alteplase (2 mg/rør rt-PA) ble rekonstituert til 1 mg/ml med BWFI, BNS eller SWFI (i duplikat). De rekonstituerte proteinløsningene ble lagret ved 37 °C. Stabiliteten til de rekonstituerte proteinløsningene etter lagring i 3 timer, 7 dager og 14 dager ved 37 °C ble undersøkt med analysene som er fremlagt nedenfor.

For partikkeltellinger med HIAC/ROYCO ble et separat eksperiment utført. Alteplase (2-mg rt-PA) ble rekonstituert med BWFI, BNS eller SWFI (i duplikat) til 1 mg/ml. Fire rør per gruppe for hvert tidspunkt ble kombinert sammen i et enkelt rør (originalt 5-ml glassrør), Partikkeltellingene (3 x 1 ml prøvetagning med den første kjøringen kastet) ble tatt ved T = 0, 3 timer, 7 dager, og 14 dager etter lagring ved 37 °C.

C. Analyser:

(1) Farge og klarhet. Hver prøve i et glassrør ble undersøkt under en lysboks utstyrt med en svart og en hvit bakgrunn. Fargen og klarheten til prøven ble registrert i forhold til disse. (2) HIAC/ROYCO. Fire rør av den rekonstituerte proteinløsningen ble kombinert for målingen. Prosedyren for analyse av partikkelbestående stoff for parenterale med små volumer ble benyttet med modifikasjonen som medførte at et prøvevolum på 1 ml ble testet ved å benytte en 1-ml sprøyte istedenfor et volum på 5 ml ved å benytte en 10-ml sprøyte. Partikkeltellinger i størrelsesområdet > 10 og > 25 um ble registrert. (3) pH. pH for utvalgte volumer ble bestemt ved å benytte et RADIOMETER-PHM-93-pH-meter utstyrt med en kombinasjons-pH-elektrode (Microelectrodes, Inc.). pH-meteret ble standardisert med standardbuffere på pH 4,01 og 7,00 (Mallinckrodt, Inc.). 20 ul av volumene ble overført til et eppendorfrør på 0,5 ml for måling. (4) Konsentrasjon med UV. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved UV-absorpsjon ved 280 nm, Et UV/VIS-diodearray-spektrofotometer (HP8253A) med en kvartskyvette med lysvei på 1 cm ble benyttet til målingene. Prøvene ble fortynnet 10 til 12,5 ganger med formuleringsbuffer. Målingen ble nullstilt mot den riktige referansen og en UV-skanning fra 240 til 400 nm ble foretatt. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet på følgende måte: Kons., mg/ml = (A280-A320)/l,9, der 1,9 er absorpsjonsevnen (ml/mg-cm) til rt-PA ved 280 nm. (5) % monomer av nativ SEC. En TSK-3000SWXL-kolonne (ToSoHaas, 300 x 7,5-mm i.d., 5-u.m) ble benyttet på en HP1090 væskekromatografikolonne (LC) utstyrt med en Diode-Array-detektor. Den mobile fasen var 0,2 M arginin, 0,12 M ammonium-sulfat, 10 % isopropanol, pH 7,3. Strømningshastigheten var 1 ml/min. Prøvene (50 u,g rt-PA-ekvivalent) ble injisert enkeltvis og kromatogrammer ble laget med deteksjon ved 280 nm. Prosentandel monomer blir beregnet på følgende måte:

% monomer = (monomertoppareal/totalt toppareal som skyldes protein) x 100

(6) % enkeltkjede av redusert SEC. En TSK-3000SWXL-kolonne (ToSoHaas, 300 x 7,5-mm i.d., 5-um) ble benyttet på en HP1090-LC utstyrt med en Diode-Array-detektor. Den mobile fasen var 0,2 M natriumfosfat, 0,1 % SDS, pH 6,8. Strømnings-hastigheten var 1 ml/min. Prøvene (12,5 jig rt-PA-ekvivalent) ble inkubert med 20 mM DTT (sluttkonsentrasjon) ved 37 °C i 3-5 minutter og injisert enkeltvis. Kromato-grammene ble overvåket med deteksjon ved 214 nm. Prosentandelen av enkeltkjede (SC) blir beregnet på følgende måte:

5 SC = (første hovedtoppareal/summen av første og andre hovedtoppareal) x 100.

(7) Renset propplyseringsaktivitet for rt-PA. Styrken til proteinet ble undersøkt ved hjelp av den rensede propplyseringsanalysen som er beskrevet i eksempel 7 nedenfor. Prøver ble fortynnet (200-1000 ng/ml) i to konsentrasjoner med fortynningsmiddel slik at de kunne bli analysert. Fortynninger ble utført dagen før analysen og fortynnede prøver ble lagret ved 2-8 °C frem til analysen neste dag. rt-PA-referansematerialet ble fortynnet tilsvarende som en intern referanse.

Resultater:

Resultatene av undersøkelsen er vist i tabell 21 og 22. Etter 14 dager med lagring ved 37 °C fremsto alle de rekonstituerte løsningene som klare og fargeløse. Proteinkonsentrasjonene (1,1 ± 0,02 mg/ml) og pH (7.2 ± 0,03) forble uforandret. Tabell 21 viser partikkeltellingene med HIAC/ROYCO av rekonstituert alteplase (2 mg/rør rt-PA, n=l) ved 1 mg/ml med BWFI, BNS og SWFI etter lagring ved 37 °C. Tabellen viser en økning i partikkeltellinger (> 10 og 25 um) for alle proteinløsninger etter rekonstituering sammenlignet med fortynningsmiddelet alene. Alle resultatene ligger likevel godt innenfor USP-begrensningene for småvoluminjeksjon (SVI, se tabell 23). Det så ut til å være en minkning i partikkeltellinger for det rekonstituerte legemiddelproduktet lagret over tid ved 37 °C. Partikkeltellingsresultatet viste også et lavere antall tellinger for proteinløsninger rekonstituert med BWFI og BNS enn med SWFI.

Alle de rekonstituerte løsningene hadde 94-95 % gjenværende monomer etter 14 dager ved 37 °C (tabell 22). Både %-enkeltkjedetesten og propplyseringsaktivitetstesten ( in vitro) viste en minkning etter én uke ved 37 °C. Prosentandelen enkeltkjede er høyere for proteinløsningene som er rekonstituert med BWFI eller BNS enn med SWFI. Uten å være begrenset til noen spesiell teori kan dette være resultatet av den preserverende hemmingen av den proteolytiske aktiviteten. Etter 2 uker ved 37 °C falt prosentandelen enkeltkjede for proteinløsningene som var rekonstituert med SWFI til det samme som eller mindre enn 50 %, som er under stabilitetsspesifikasjonen (> 55 %) for enkeltkjede i rt-PA.

I tillegg til omdannelsen fra én kjede til to kjeder avslørte reduksjons-SEC-kromatogrammene av de rekonstituerte proteinløsningene etter to uker ved 37 °C fragmenter av molekylet, noe som tyder på økt proteolytisk kløyving ved forhøyet temperatur over tid (se figur 1). Figur 1 viser klart at i tillegg til fragmentene så ble mer omdannelse av én-kjede til to-kjede observert der rt-PA var rekonstituert med SWFI enn med GWFI eller BNS etter lagring ved 37 °C i 14 dager.

Propplyseringsaktiviteten ( in vitro) tydet på at alle de rekonstituerte alteplaseløsningene (1 mg/ml) opprettholdt mer enn eller likt med 100 % styrke etter 3 timer ved 37 °C (tabell 23). Alle prøver var fargeløse og klare. Aktiviteten begynte å falle etter en uke med lagring ved 37 °C, men omtrent 90 % av aktiviteten (relativt til utgangsverdi, T = 0) var fremdeles til stede. Det var en drastisk reduksjon i aktivitet etter to uker ved 37 °C med kun 44-65 % gjenværende aktivitet.

Konklusjon:

Alteplase (2 mg/rør rt-PA) rekonstituert med BWFI, BNS eller SWFI til 1 mg/ml var relativt stabilt ved 37 °C i én uke i et glassrør. Det er antatt at BNS-løsningen vil være antimikrobiell siden det er benzylalkoholen som er den aktive ingrediensen. Stabilitetstesting ved å benytte BNS var positiv, d.v.s., alteplase var stabil og funksjonell.

Eksempel 7:

O ppsummering:

t-PA fortynnet ned til 0,01 mg/ml i normal saltvannsoppløsning ble funnet å være lytisk aktivt i en propplyseringseffektivitetstest. I en slik test blir trombin og fibrinogen blandet sammen for å danne fibrin, plasminogen og rt-PA blir blandet sammen for å danne plasmin og sammen lyserer fibrinet og plasminet proppen. Testen måler effektiviteten til t-PA ved å virke sammen med plasminogen for å danne plasmin og dermed lysere proppen.

Materialer og fremgangsmåter:

A. Materialer:

Alteplase (2 mg/rør rt-PA) ble fortynnet til en konsentrasjon på 0,01, 0,025, 0,05 og 0,1 mg/ml sluttproteinkonsentrasjon i 0,9 % NaCl (normal saltvannsoppløsning, NS) - inneholdende IV-poser (Baxter og/eller Abbott, 250 ml). Spesifikt ble rt-PA, råprotein, fortynnet til 1 mg/ml (50-mg-rør formuleringsekvivalent, 0,004 % TWEEN-80-overflateaktivt stoff) med filtrert MILLI-Q-vann, eller et 100-mg-rør med rt-PA ble rekonstituert til 1 mg/ml (0,008-0,011 % TWEEN-80-overflateaktivt stoff) med sterilt vann for injeksjon, USP (SWFI) ved å benytte en 60-cc BD-sprøyte og en 18G-nål direkte satt inn i gummiskilleveggen på røret i senter av massen. Røret ble forsiktig blandet med rolige innsugninger eller rolige roteringer inntil massen var fullstendig løst. IV-fortynningsmiddel (0,9 % NaCl, NS) ble fjernet og byttet med samme mengde rekonstituert eller fortynnet 1 mg/ml rt-PA på følgende måte:

<*>overfylling av poser ble ikke tatt hensyn til.

Etter fortynning i IV-posene (n=2 for hver konsentrasjon) ble posene forsiktig blandet ved å snu dem opp ned (omtrent 20-24 ganger). Et volum på 10 ml ble tatt ut gjennom åpningssperren på IV-posen ved å benytte en 10-cc BD-sprøyte og en 22G-nål. Et volum (t=0) ble tilsatt direkte inn i et 20-cc-type-I klart glassrør for visuell inspeksjon. Likeledes ble også placeboekvivalenter ved 0,025 og 0,05 mg/ml fysisk undersøkt.

B. Analyser:

1. Visuell inspeksjon:

Hvert volum ble undersøkt under en lysboks utstyrt med en svart og hvit bakgrunn. Volumene ble sammenlignet med et likt volum med SWFI eller filtrert MILLI-Q-vann i et like stort rør som virket som en kontroll. Fargen og klarheten til volumene ble registrert i henhold til dette.

Renset proppl<y>seringstest ( Mikrosentrifugeanalysator (" Test 1) og skålavleser ( Test 2Y) : Styrken til alteplase-t-PA-proteinet ble undersøkt ved hjelp av den rensede propplyseringsanalysen som er beskrevet nedenfor. Prøver ble fortynnet slik at de kunne bli analysert (200-1000 ng/ml) i tre eller to konsentrasjoner med fortynningsmiddel. Fortynningene ble laget dagen før analysen og fortynnede prøver ble lagret ved 2-8 °C inntil analysen ble utført neste dag. rt-PA-referansematerialet ble fortynnet tilsvarende som en intern referanse.

a. Utstyr:

IL-MONARCH-mikrosentrifugeanalysator modell nr. 761 ble benyttet og den består av en analysesammensetning med fluorescens- og lysspredningsegenskaper og en innebygget datamaskin, og en påsettingsenhet.

b. Reagenser:

- 1 % (v/v) POLYSORBAT-80-emulgator (JT Baker).

- Analysebuffer: 0,06 M natriumfosfat (0,0114 F NaH2P04.H2, 0,0486 F Na2HP04) med 0,02 % (w/v) NaN3og 0,01 % (v/v) POLYSORBAT-80-emulgator, pH 7,4±0,1. - Humant trombin (30-40 enheter/ml) (Calbiochem) holdt i et uåpnet rør nedfryst ved eller under -60 °C inntil bruk.

- Plasminogen holdt nedfryst ved eller under -60 °C inntil bruk.

- Biocell-fibrinogen klargjort på følgende måte: Fibrinogen og propplyseringsbuffer ble brakt til romtemperatur. Totalt 7 ml propplyseringsbuffer ble tilsatt til røret. Røret ble forseglet og påført parafilm. Røret ble plassert på siden i en skål eller tapet fast på en roterende blandingsinnretning. Farten ble satt til mellom 4 og 5. Røret ble ristet i opp til én time mens det ble inspisert for å finne ut hvor godt massen var i ferd med å løses opp. Når massen i røret var fullstendig løst ble løsningen overført til et Falcon-rør på 50 ml. Røret ble skylt minst tre ganger med propplyseringsbuffer og skyllevannet ble overført til Falcon-røret. Løsningen ble brakt til et sluttvolum på 30 ml ved å benytte volummerkene på Falcon-røret. Falcon-røret ble påført parafilm og satt på risteinnretningen i 15-30 minutter. Alt protein var løst etter risting. Løsningen ble plassert på våt is i minst 2-3 timer og periodisk forsiktig ristet. Ved å benytte WHATMAN-papir nr. 1 ble løsningen filtrert ved å dekantere løsningen vekk fra presipitatet. Den filtrerte løsningen ble holdt på is.

- Referansemateriale (standard ACTIVASE-t-PA). Alle løsninger inneholdende t-PA ble holdt i polystyren- eller polypropylenbeholdere.

c. Tillaging av standarder:

Med utgangspunkt i referansematerialet ble en standard stokkløsning på 10 ug/ml tillaget. Fortynningen ble registrert på analysedata-ark. De gjenværende standardene ble tillaget i henhold til følgende fortynningsskjema. Alle standarder ble holdt på is og utløpet av standardkurven var 12 timer fra tillagingstidspunket.

Tillagingen av standard stokkløsning og av gjenværende standarder ble gjentatt for å lage to standardkurver.

d. Tillaging av prøve:

i. Utgangstillaging

Hvis prøven var et ferdig rør med lyofilisert materiale ble det rekonstituert volummessig til 1 mg/ml med vann for injeksjon (WFI). Hvis prøven var et sterilt råmateriale ble det fortynnet til 1 mg/ml med WFI.

ii. Tillaging av prøvestokkløsning:

Ved å benytte en mikropipette ble 100 ul av 1,0-mg/ml-rt-PA-prøven pipettert over i et polystyrenrør på 15 ml. Totalt 9,90 ml analysebuffer ble tilsatt til røret ved å benytte en 10-ml gradert polystyrenpipette eller volumetrisk pipette pluss mikropipette. Denne løsningen ble definert som prøvestokkløsningen.

iii. Tillaging av arbeidsprøveløsning:

Ved å benytte en mikropipette ble 600 ul av prøvestokkløsningen pipettert over i et polystyrenrør på 15 ml. 9,40 ml analysebuffer ble tilsatt til røret ved å benytte en 10-ml gradert polystyrenpipette eller volumetrisk pipette pluss mikropipette. Dette var prøveløsningen som skulle settes på prøvekoppene. De fortynnede prøvene ble hold på is. iv. Trinnene med tillaging av prøvestokkløsning og arbeidsprøveløsning ble gjentatt for å lage to prøvefortynninger.

v. Tillaging av positiv analysekontroll.

Kontrollen ble tillaget ved å rekonstituere en prøve med rt-PA til 1 mg/ml, pipettere volumer på 0,5 ml over i Eppendorfrør og fryse ned til -60 °C. Et nytt rør ble deretter tint på hver dag analysen ble utført. Kontrollen ble fortynnet ved å benytte 100 (il prøve på samme måte som for prøven. De fortynnede kontrollprøvene ble holdt på is.

e. Prosedyre for MONARCH- 2000- analvsator ( Analyse 1) :

Denne analysen virker på følgende måte: Reagenser er substanser som tilsettes til en løsning av en annen substans for å delta i en kjemisk reaksjon. I dette tilfellet vil innholdet i skip-1 reagere med innholdet i skip-2 og danne en standardisert propp. Trombin (skip-1) forårsaker når det blandes med plasminogen og fibrinogen (skip-1) omdannelsen av fibrinogen til fibrin, og danner en standardisert in v/Vrø-propp som består av plasminogen og fibrin. En testprøve av t-PA blir den utsatt for proppen. t-PA forårsaker omdannelsen av plasminogen til plasmin og plasmin bryter deretter fibrintrådene fra hverandre. Mens proppen brytes ned forandres absorbans (lys) - karakteristika. Absorbansen blir plottet mot tid.

Pipettespissene på analysatoren ble undersøkt for å forsikre om at de var riktig innrettet og vannreservoaret ble undersøkt for å være sikker på at det var fult. Bobler ble fjernet fra sprøyter hvis det var nødvendig og vaskesyklus ble utført.

Analyseparametrene var som vist i tabell 24.

Reagensskip-1 ble klargjort ved å tilsette 200 ul rekonstituert plasminogen til 10,0 ml filtrert fibrinogen. Dette ble forsiktig blandet og satt på reagensskip-1. Reagensskip-1 ble plassert i den første posisjonen på reagensbordet på analysatoren.

Reagensskip-2 ble klargjort ved å tilsette 33 enheter/ml-trombinløsningen beskrevet ovenfor til reagensskip-2. Reagensskip-2 ble plassert i posisjon 2 på analysatoren.

0,25-ml-prøvekoppene ble plassert i prøveringen. Ved å benytte engangspipetter eller en PIPETMAN-pipette ble prøvekoppene fylt med standard, kontroll og prøver som vist i tabell 25. Hvis færre enn to prøver ble kjørt ble påsettingen utført som indikert og analysebufferen eller vannet ble pipettert til alle tomme prøvekopper.

Knappen merket "special request" var trykket ned på MONARCH-analysatoren. Prøvekoppinformasjonen ble lagt inn. Knappen merket "Accept" ble trykket ned to ganger. Etter at MONARCH-analysatoren avsluttet pipetteringen ble reagensskipene fjernet og plassert på is. Prøveringen ble fjernet og plassert i kjøleskapet ved 2-8 °C.

i. Endepunktsbestemmelse:

Endepunktet (lyseringstid) kan bli bestemt ved hjelp av et dataprogram eller manuelt. For automatisk beregning med datamaskin er endepunktet tiden som trengs for å lysere proppen, som blir bestemt automatisk. For manuell endepunktsbestemmelse blir endepunktet definert som det første tidspunktet under 0,03 absorbansenheter der endringen er mindre enn 0,003 absorbansenheter. Spesifikt for manuell bestemmelse ble endepunktet bestemt ut fra absorbanstid-dataene. Det første absorbanspunktet mindre enn 0,0300 ble lokalisert. Endepunktet ble bestemt som tiden for den første absorbansverdien som var mindre enn 0,0300 hvis endringen i absorbans mellom daværende absorbans og den neste absorbansen var mindre enn 0,0030. Hvis absorbansforskjellen var større enn 0,0030 gikk man til neste absorbansavlesning og bestemte absorbansforskjellen. Endepunktet var den første absorbansverdien i paret (første og påfølgende absorbans-verdi) der absorbansforskjellen var mindre enn 0,0030.

ii. Beregninger:

Den gjennomsnittlige lyseringstiden for hvert standardkurvepunkt ble beregnet. Standardkonsentrasjonene (ng/ml) og de gjennomsnittlige endepunktstidene (som er i sekunder) ble konvertert til log-verdier. En standardkurve med log-konsentrasjoner (x-akse) versus log-tid (y-akse) ble satt opp.

Ved å benytte stignings- og kryssningspunktverdiene som var fremskaffet fra den lineære regresjonsanalysen ble log-konsentrasjonen for hver prøve beregnet fra log-lyseringstiden (endepunkt). Antilogaritmen for den fremskaffede log-konsentrasjonen ble tatt og multiplisert med fortynningsfaktoren (for eksempel 1667) for å få enheter/ml.

Systemanvendbarheten til standardkurven ble evaluert ved å benytte system-anvendbarhetstesten. For at en bestemmelse skal være gyldig med denne testen må korrelasjonskoeffisienten for standarden være mellom -0,997 og -1,000 og kontrollen innenfor ±10 % av sin aksepterte verdi. Hvis systemanvendbarhet ikke blir tilfredstilt kan standardkurven bli redefinert ved å utføre den lineære regresjonsanalysen med minst fire tilstøtende punkter (d.v.s., den første eller siste standarden kan bli utelatt).

Resultatene ble rapportert som enheter/rør, enheter/mg, enheter/ml, IU/rør, IU/mg eller IU/ml. For kontrollen ble alle fem gjentakelser gjort om til et gjennomsnitt. Systemanvendbarhet ble undersøkt som beskrevet ovenfor. For sluttrørprøver ble alle fem gjentakelser per prøve gjort om til et gjennomsnitt. Det gjennomsnittlige resultatet ble rapportert fra de to prøvefortynningene. Dette ble rapportert i enheter/rør, der enheter/rør = gjennomsnittlige enheter/ml x ml/rør. For grovprøver ble de fem gjentakelsene per prøvefortynning omgjort til et gjennomsnitt. Det gjennomsnittlige resultatet ble rapportert fra de to fortynningene. Det rapporterte var i enheter/mg der:

<*>Enheter/ml eller enheter/mg kan bli konvertert til internasjonale enheter (IU)/ml eller IU/mg ved å multiplisere med den hensiktsmessige internasjonale enhetskonverteringsfaktoren.

For COA og stabilitetstesting ble testingen av prøven gjentatt ved å benytte én rotor for hver av tre dager. Gjennomsnittet av resultatene fra de tre dagene ble rapportert. Analysen kan bli gjentatt basert på resultatene fra den interne kontrollen og/eller basert på bestemt eller ubestemt feil. Sluttresultatene kan bli rapportert som et gjennomsnitt av flere tester.

f. Prosedyre for skålavleseranalysen 2:

Skålavleseren ble slått på og temperaturen på termostaten ble satt til 25 °C. Lampen ble tillatt å varmes opp i minst en halv time. Trombin ble tilsatt i en mengde på 20 ul til hver brønn. Trombin kan bli tilsatt fra et reagensreservoar eller fra en interimskål ved å benytte multikanalpipetten. 20 ul per brønn av fortynnede standarder (i duplikat) ble tilsatt til brønnene B2-B6 og C2-C6. 20 ul per brønn med kontrollen ble tilsatt til brønnene D2-G2 og 20 ul av prøvene ble tilsatt i de gjenværende brønnene med fire like utgaver i et vertikalt format til maksimalt ni prøver per skål. Brønner i radene B-G som ikke inneholder standarder, kontroller eller prøver bør inneholde 20 ul analysefor-tynningsmiddel. rt-PA-prøvene kan bli tilsatt individuelt med en enkeltkanalpipette eller fra en interimskål ved å benytte en multikanalpipette.

Fibrinogenløsningen ble tillatt å nå romtemperatur før plasminogen ble tilsatt. 200 ul per brønn med fibrinogen-plasminogen ble tilsatt til skålen så raskt som mulig over hele skålen.

Etter tilsettingen av fibrinogen-plasminogen ble skålen umiddelbart plassert på skålavleseren og datainnsamling ble satt i gang. Den første avlesningen ble gjort etter to minutter fra tilsettingen av fibrinogen-plasminogen til skålen slik at den maksimale absorbansen for proppen ble registrert.

Absorbansen til platen ved 340 nm ble registrert og avlest ved et passende tidsintervall (vanligvis 30 sekunder) inntil baselinjeabsorbans for alle brønner var oppnådd (vanligvis 1 time).

i. Beregning:

Sluttpunktbestemmelsen (tid til halv maksimal lysering) ble utført på følgende måte: Lyseringstider ble beregnet som tiden det tok for absorbansen å nå den halvt maksimale absorbansen. Den maksimale absorbansen tilsvarte den maksimale proppopasiteten som var registrert for den brønnen. Bakgrunnsabsorbansen tilsvarte den minimale absorbansen for fullstendig lysert propp. Rådatapunktene (lyseringstid i sekunder) ble gjort om til gjennomsnitt for hver av standardene, kontrollen og prøvegjentakelsene. Logaritmeverdi for den gjennomsnittlige verdien ble beregnet.

En standardkurve ble plottet ved å sette inn dataene fra lyseringstider (log-sekunder - y-akse) versus rt-PA-standardkurveproteinkonsentrasjonen (log ng/ml - x-akse).

Ved å benytte stigningen og skjæringsverdiene fremskaffet fra den lineære regresjonsanalysen ble log-konsentrasjonen beregnet for hver prøve ut fra log-lyseringstiden. Antilogaritmen til den fremskaffede log-konsentrasjonen ble tatt og multiplisert med fortynningsfaktoren (for eksempel 1667) for å få enheter/ml.

For sluttrørprøvetagning ble enheter rapportert i enheter/rør der: Enheter/rør = gjennomsnittlige enheter/ml x ml/rør.

Hvis en spesifikk aktivitet var påkrevd for sterile grovprøver ble gjennomsnittet for alle fem gjentatte i enheter/mg rapportert der:

Systemanvendbarhet ble bestemt. For at en bestemmelse skal være gyldig med denne testen må korrelasjonskoeffisienten for standarden være mellom -0,997 og -1,000 og kontrollen innenfor ±10 % av sin aksepterte verdi. Hvis systemanvendbarhet ikke blir tilfredstilt kan standardkurven bli redefinert ved å kjøre beregningsprogrammet igjen ved å benytte minst fire tilstøtende punkter (d.v.s., den første eller siste standarden kan bli utelatt).

rt-PA-aktiviteten ble rapportert som enheter/rør, enheter/mg, enheter/ml, IU/rør, IU/mg eller IU/ml som påkrevd på analysedata-arket. Analysen kan bli gjentatt basert på resultatene fra den interne kontrollen og/eller basert på bestemte eller ubestemte feil. Sluttresultatet kan bli rapportert som et gjennomsnitt av flere tester.

Resultater:

Ved visuell inspeksjon fremsto alteplase-t-PA fortynnet til 0,01, 0,025 og 0,05 mg/ml med NS som fargeløse, klare til noe opaliserende løsninger i ved starten og etter 24 timer med infusjon (uten filtere) ved romtemperatur. Ved 0,1 mg/ml i NS fremsto alteplase-t-PA som en litt uklar løsning rett etter fortynning og forble slik hele infusj onsperioden.

I de fleste tilfeller viste alle fraksjoner samlet i løpet av 24 timer for alle konsentrasjoner spesifikke aktiviteter som var høyere enn 90 % slik som dette ble undersøkt med propplyseringsaktivitetsanalysen.

Konklusjon:

Gjenvunnet t-PA (5 mg/ml) fortynnet til 0,01, 0,02 og 0,05 mg/ml i 0,9 % NaCl i IV-poser (500 ml) var lytisk aktivt etter 24 timer med lagring under omgivelsesbetingelser.

Eksempel 8

Oppsummering:

Tenecteplase fortynnet til 0,01 mg/ml i normal saltvannsoppløsning ble funnet å være lytisk aktivt i en propplyseringseffektivitetstest. I en slik test blir trombin og fibrinogen blandet sammen for å danne fibrin, plasminogen og tenecteplase blir blandet sammen for å danne plasmin og sammen lyserer fibrinet og plasminet proppen. Testen måler effektiviteten til tenecteplase i å virke sammen med plasminogen for å danne plasmin og dermed lysere proppen.

Materialer og frem<g>angsmåter:

A. Materialer og kjemikalier:

<*>Tenecteplase, TNKASE, 50-mg-rør

<*>0,9 % NaCl injeksjon, USP, 500 ml (Baxter)

<*>10 ml SWFI, USP (Abbott)

<*>3-cc-, 5-cc- og 10-cc-BD-sprøyter

*22G 1,5-nåler

<*>5-cc-WHEATON-type-I klare glassrør

<*>20-mm grå butylgummivæskestoppere

B. Fremgangsmåter:

Tenecteplase (TNKASE-variant av t-PA) fremskaffet fra Genentech Inc. (for eksempel US patentskrift 5,612,029) (50 mg/rør) ble rekonstituert til 5 mg/ml med 10 ml SWFI. Ved å benytte en 3-cc- og 5-cc-sprøyte og en 22G-nål ble 1, 2 og 5 ml med normal saltvannsoppløsning (NS) fjernet fra separate IV-poser (500 ml NS, Baxter) i duplikater. Det samme volumet ble erstattet med det rekonstituerte legemiddelproduktet for å få en sluttkonsentrasjon av tenecteplase inne i posene på 0,01, 0,02 og 0,05 mg/ml. Posene ble deretter forsiktig blandet ved å snu dem. Et volum på 10 ml av den fortynnede tenecteplaseløsningen ble prøvetatt gjennom IV-åpningen med en 10-cc-sprøyte og overført til to 5-cc klare glassrør (6 ml i ett og resten i det andre). IV-posene inneholdende den fortynnede tenecteplasen ble plassert på en benkplate under normalt fluorescerende lys ved omkringliggende forhold i 24 timer. Ytterligere volumer (10 ml hver) fra disse IV-posene ble prøvetatt etter 8 og 24 timer under lagring.

C. Analyser:

pH-bestemmelsen ble utført ved å benytte et RADlOMETER-PHM-93-pH-meter og en mikroelektrode (MI-410, Microelectrode, Inc.). pH-meteret ble standardisert med pH-standarder med pH 4,01 og 7,00 før målingen ved omkringliggende betingelser.

Alle volumene med tenecteplase ble utsatt for propplyseringsanalysen beskrevet ovenfor for å bestemme in v/Yro-bioaktiviteten til tenecteplase i disse volumene. Prøvene ble fortynnet til to eller tre ulike konsentrasjoner innenfor analyseområdet (200-500 ng/ml) med fortynningsmiddelet. Tenecteplase ble benyttet som en intern referanse. Alle verdier som ble fremskaffet ble normalisert i forhold til tenecteplasereferansematerialet. Bioaktiviteten ble analysert med propplysering før og etter sentrifugering.

Resultater:

En oppsummering av resultatene er vist i tabell 26. Den observerte pH (7,1 - 7,2) for den høyere tenecteplasekonsentrasjonen (0,05 mg/ml i NS) var noe høyere enn for de lavere konsentrasjonene (pH 6,7 - 6,8 og pH 6,8 - 6,9 ved henholdsvis 0,01 og 0,02 mg/ml). Dette skyldes den større mengden med den buffrede tenecteplasen (5 mg/ml, pH 7,3) som blir tilsatt til IV-posen direkte for utgangsfortynning. Alle pH-verdiene forble uforandret etter 24 timer med lagring ved omkringliggende betingelser.

Propplyseringsaktiviteten og proteinkonsentrasjonene (bestemt med RP-HPLC) ble utført før og etter sentrifugering av hvert prøvevolum. Dette var for å sikre at enhver presipitering som ikke var synlig for det blotte øyet ble fjernet før analysen for å oppnå mer nøyaktig tolkning av resultatene. I alle tilfeller var resultatene etter sentrifugering noe lavere for både aktivitet og konsentrasjon enn før sentrifugering, noe som tyder på at litt presipitering forekom. Tabell 26 viser prosentvis endring i konsentrasjon før og etter sentrifugering, noe som indikerer at tapet av protein er større ved 0,01 og 0,02 mg/ml med en gang rette etter fortynning enn ved høyere konsentrasjon (0,5 mg/ml). Denne prosentvise endringen ved lavere konsentrasjon (0,01 mg/ml) økte også med lagringstid. Ved 0,01 mg/ml var den prosentvise endringen i konsentrasjon 57 % rett etter fortynning og økte til 71 % etter 24 timer. Ingen signifikant endring ble observert ved 0,02 og 0,05 mg/ml. Denne observasjonen kan bli forklart, uten å være begrenset til en spesiell teori, med en mer utpreget proteinadsorpsjon ved en lavere konsentrasjon som vanligvis foregår med en gang og som mettes over tid.

Tabell 27 viser at prosentvis proteingjenvinning relativt i forhold til de ønskede konsentrasjonene på 0,01, 0,02 og 0,05 mg/ml var henholdsvis 40-50 %, 65 % og 86-92 %. Denne prosentvise gjenvinningen var underestimert fordi overfyllingsvolumet inne i IV-posene ikke ble tatt hensyn til og proteinet som ble gjenvunnet vil være minst 10 % lavere enn de forventede ønskede konsentrasjonene (ved å anta 10 % overfylling i IV-posene).

Propplyseringsaktiviteten til proteinet som ble gjenvunnet (etter sentrifugering) endret seg ikke signifikant etter 24 timer med lagring ved omkringliggende betingelser. Den totale prosentvise spesifikke aktiviteten til proteinet som ble gjenvunnet ved 0,01, 0,02 og 0,05 mg/ml var henholdsvis > 100 %, > 92 % og > 80 % (tabell 27).

Konklusjon:

Som for med t-PA bemerket ovenfor, var gjenvunnet tenecteplase (5 mg/ml) fortynnet til 0,01, 0,02 og 0,05 mg/ml i 0,9 % NaCl IV-poser (500 ml) lytisk aktivt etter 24 timer ved lagring ved omkringliggende betingelser.

De beskrevne preparatene og fremstillingene er forventet å være effektive i forhold til å forhindre festingen og koloniseringen av kateteroverflater med smittefarlige organsimer slik som S. aureus, S. epidermidis og sopp.

Claims

1. Anvendelse av et preparat for fremstilling av et medikament for fjerning av fibrinbundne blodpropper fra et kateter hvori preparatet omfatter vann, fra 0,1 til 10 mg/ml av en fibrinolytisk effektiv mengde av en plasminogenaktivator og fra 0,5 til 1,2 vol% av en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatisk organisk alkohol, der preparatet ikke omfatter et chelaterende middel.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori plasminogenaktivatoren er en vevsplasminogenaktivator eller en urokinase.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori plasminogenaktivatoren er t-PA med nativ sekvens, urokinase med nativ sekvens, reteplase eller tenecteplase.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvori plasminogenaktivatoren er t-PA med nativ sekvens eller tenecteplase.

5. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-4, hvori den organiske alkoholen er benzylalkohol, isopropanol eller etanol.

6. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-5, hvori den organiske alkoholen er benzylalkohol.

7. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-6, hvori den fibrinolytisk effektive mengden av plasminogenaktivator er fra 0,3 til 4 mg/ml.

8. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-7, hvori vannet som inneholder alkoholen er bakteriostatisk vann for injeksjon eller bakteriostatisk normal saltvannsoppløsning.

9. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-8, hvor kateteret inneholder slike blodpropper, og hvor kateteret holdes i kontakt med preparatet i minst 5 dager.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvori kateteret holdes i kontaktet med preparatet i 6 til 15 dager.

11. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-8, hvori kateteret er belagt med preparatet.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvori kateteret er et intravenøst kateter.

13. Multiseksj onsforpakning, karakterisert vedat den omfatter en seksjon som omfatter fra 0,1 til 10 mg/ml av en fibrinolytisk effektiv mengde av en plasminogenaktivator, en seksjon som omfatter vann som inneholder fra 0,5 til 1,2 vol% av en preserveringsmessig effektiv mengde av en bakteriostatisk organisk alkohol, der ingen av seksjonene omfatter et chelaterende middel.

14. Forpakning ifølge krav 13, karakterisert vedat plasminogenaktivatoren er en vevsplasminogenaktivator eller en urokinase.

15. Forpakning ifølge krav 14, karakterisert vedat plasminogenaktivatoren er t-PA med nativ sekvens, urokinase med nativ sekvens, reteplase eller tenecteplase.

16. Forpakning ifølge krav 15, karakterisert vedat plasminogenaktivatoren er t-PA med nativ sekvens eller tenecteplase.

17. Forpakning ifølge ethvert av kravene 13-16, karakterisert vedat den organiske alkoholen er benzylalkohol, isopropanol eller etanol.

18. Forpakning ifølge ethvert av kravene 13-17, karakterisert vedat den organiske alkoholen er benzylalkohol.

19. Forpakning ifølge ethvert av kravene 13-18, karakterisert vedat den fibrinolytisk effektive mengden av plasminogenaktivator er fra 0,3 til 4 mg/ml.

20. Forpakning ifølge ethvert av kravene 13-191, karakterisert vedat den er et sett der hver seksjon er en separat beholder eller forpakningen er en multiseksjonssprøyte.

21. Forpakning ifølge ethvert av kravene 13-20, karakterisert vedat vannet som inneholder alkoholen er bakteriostatisk vann for injeksjon eller bakteriostatisk normal saltvannsoppløsning.

22. Multiseksjonsforpakning, karakterisert vedat den omfatter en seksjon som omfatter fra 0,1 til 10 mg/ml av t-PA med nativ sekvens eller tenecteplase, og en seksjon som omfatter vann som inneholder fra 0,5 til 1,2 vol% benzylalkohol, isopropanol eller etanol, der ingen av seksjonene omfatter et chelaterende middel.