NO328150B1 - Taxanderivater og fremgangsmater ved fremstilling derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder et nytt taxan nyttig som kjemiterapeutisk middel, de farmasøytiske blandingene som inneholder det og en prosess for tilberedning av 14-p-hydroksy-1,14-karbonat-bakkatin III og V derivater, substituert i 13 posisjonen av en isoserinrest. Det vises i denne forbindelsen til de foreliggende kravene.

Taxaner er en av de viktigste klassene av anticancer medikamenter nylig utviklet. Den bemerkelsesverdige effekti-viteten av Paclitaxel og dets analog Docetaxel ved behand-lingen av en rekke svulster har fokusert forskning på sub-stanser med antimikrotubular aktivitet. Taxaner er imidler-tid karakterisert av en spesiell aksjonsmekanisme idet de fremmer sammenstillingen av mikrotubuler og inhiberer tubu-lin depolymerisasjon.

De viktigste ulempene med de taxaner som for øyeblikket brukes, er: (a) uløselighet i vann, som påtvinger bruken av spesielle bærere som kan gi hypersensitivitetsreaksjoner, (b) toksisiteter som begrenser doseringen, (c) utvikling av motstandsmekanismer. Cellemotstanden overfor taxaner har blitt relatert til MDR fenotypen("multimedikament mot-stand") formidlet av P-glykoprotein transportører, av tubu-line forandringer, og ved forandringer i uttrykket av de apoptotisk regulerende proteinene.

For å finne nye aktive molekyler med større løselighet og bedre tolererbarhet har 14-p-hydroksy-10-deacetylbakkatin III og V taxan derivater blitt syntetisert.

Noen derivater av 14-hydroksybakkatin III substituert ved 13-posisjonen med isoserinrester er åpenbart i US 5,705,508, sammen med en prosess for fremstilling av disse.

Det har nå blitt funnet at forbindelsen i henhold til formel (I), et 14p-hydroksy-l,14-karbonatbakkatin V-derivat, har bemerkelsesverdige cytotoksiske og anticancer aktivi-teter, og er i stand til å overvinne motstanden i celle-linjene som uttrykker MRD fenotypen.

Nevnte forbindelse avviker fra derivatene beskrevet i det amerikanske patentet nevnt ovenfor på grunn av hydroksyl i 7-posisjonen, som i foreliggende tilfelle er i alfa konfigurasjon. 13-(N-Boc-p-Isobutylisoserinyl)-14p- hydroksybakkatin III 1,14-karbonat, tilsvarende derivatet henvist til i US 5,705,508 som SB-T-101131, kan brukes som utgangsprodukt for fremstilling av forbindelsen (II).1 dette tilfelle blir nevnte bakkatin III derivat enten behandlet med DBU (diazobisyklo[5,4,0] 7-undecen) i metanol eller THF eller den blir helt enkelt forlatt i løsning med metylenklorid eller klorerte løsemidler i nærvær av alifatiske alkoholer slik som metanol, etanol eller propanol med basisk allumin i en tid varierende fra en time til 14 døgn. Forbindelsen med beta konfigurasjon ved C-7, blir omdannet ved nøytral eller svakt alkalisk pH til den mer stabile alfa isomeren (bakkatin V derivatet).

Alternativt kan forbindelsen (I) bli fremstilt med en prosess som også tillater å fremstille den tilsvarende beta epimeren ved C-7.

Nevnte prosess (A) omfatter de følgende trinnene:

a) transformering av 14p-hydroksy-10-deacetylbakkatin III eller V til det trietylsilylerte derivat ved 7-posisjonen; b) fremstilling av 1,14 karbonatderivatet fra produktet fra trinn (a); c) selektiv acetylering av hydroksylet ved 10; d) reaksjon av produktet fra trinn (c) med (4S,5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oksazolidin-5-karboksylsyre; e) spalting av de trietylsilyl- og dimetoksybenzylidenbeskyttende gruppene fra produktet fra trinn (d).

I henhold til en foretrukket utførelse av prosess (A) blir trietylklorosilan brukt som silyleringsmiddel i trinn (a), mens 1,14 karbonat derivatet i trinn (b) blir fremstilt ved å bruke fosgen i toluen i en 3:1 metylenklorid/pyridin løs-ning under nitrogenatmosfære. I det følgende trinnet (c) blir 14-p-hydroksy-10-deacetylbakkatin III eller V 7-Tes-1,14-karbonat kombinert med LiHMD'er i vannfri THF, for derved å få 10-hydroksyderivatets litiumsalt, som deretter blir acetylert med acetylklorid. Kondensasjonsreaksjonen mellom 14-p-hydroksy-7-Tes-l,14-karbonat-bakkatin III eller V og (4S,5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oks-azoliden-5-karboksylsyre (trinn d) blir utført i et vannfritt apolart organisk løsemiddel, i nærvær av en base og et kondensasjonsmiddel slik som disykloheksylkarbodiimid

(DCC).

Endelig, i trinn (e) blir trietylsilyl fjernet med pyridinfluorid i en acetonitril/pyridin løsning under nitrogen, mens dimetoksybenzylidengruppen blir fjernet i et metylenklorid løsemiddel ved tilsetning av metanol i HC1 og deretter av NaHC03.

Trinnsekvensen i prosessen beskrevet kan bli invertert som således oppnår sluttproduktet i sammenlignbare utbytter. Nevnte alternative prosess (B) omfatter de følgende trinnene: a' ) selektiv acetylering av hydroksyl ved C-10 i 14|3-hydroksy-10-deacetylbakkatin III eller V;

b') fremstilling av 1,14 karbonatderivatet fra produktet fra trinn (a')

c' ) silylering av hydroksylet ved C-7;

d') reaksjon av produktet fra trinn (c') med (4S,5R)-N-Boc-2-(2, 4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oksazolidin-5-karboksylsyre;

e') spalting av de trietylsilyl- og dimetoksybenzylidenbeskyttende gruppene fra produktet fra trinn (d').

Den sistnevnte prosessen innebærer en rekke fordeler slik som muligheten til å oppnå det ønskede syntonet (1,14-karbonat-7-Tes-bakkatin III eller V uten kromatografisk rensing, bare ved krystallisering.

I samsvar med en foretrukket utførelse blir den selektive acetyleringen i trinn (a') utført med eddiksyreanhydrid i nærvær av cerium-, scandium-, og ytterbiumsalter, foretrukket CeCl3 x 7H2O, mens de gjenværende trinnene blir utført som indikert ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også som mellomprodukter i prosessen for fremstillingen av 14p-hydroksy-l,14-kar-bonatbakkatin III og V, de følgende forbindelsene: 14p-hydroksybakkatin III eller V, 14p-bakkatin III eller V 1,14 karbonat, 14-p-hydroksy-7-Tes-10-deacetylbakkatin II eller V, 14-p-hydroksy-7-Tes-bakkatin III eller V, 14-p-hydroksy-7-Tes-bakkatin III eller V 1,14-karbonat.

Det vises videre til en prosess for fremstillingen av (4S,5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oksazolidin- 5-karboksylsyre, i henhold til følgende skj ema:

Nevnte prosess omfatter de følgende trinnene:

a) beskyttelse av aminogruppen i leucinol med Boe; b) transformering av N-Boc-L-Leucinol til N-Boc-L-leucinal; c) fremstilling av cyanhydrinet av produktet fra trinn (b); d) transformering av cyanhydrinnitril til den tilsvarende karboksylsyren; e) dannelse av karboksylsyrens metylester; f) rensing av (2R,3S)-3-(N-Boc)amino-2-hydroksy-5-metyl-heksansyremetylester; g) kondensasjon av produktet fra trinn (f) med 2,4-dimetoksybenzaldehyd dimetylacetal; h) transformering av (4S,5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oksazolidin-5-karboksylsyre metylesteren

til den tilsvarende karboksylsyren

I henhold til en foretrukket utførelse, i trinn (a) får leucinol reagere med Boc-anhydrid, og blir deretter oksi-dert til aldehyd i DMS0/CH2C12 løsemiddel ved å bruke oksalylklorid ved en temperatur under -60 °C, idet den dan-nede syren nøytraliseres med trietylamin, eller blir oksi-dert med natriumhypokloritt ved -2 til -5 °C. Cyanhydrinet fra trinn (c) blir fremstilt ved å substituere sulfon-gruppen i det intermediære l-hydroksy-2-(N-Boc)amino-4-me-tylpentansulfonat med cyanidionet. Cyanhydrinet blir deretter hydrolysert til den tilsvarende karboksylsyren i trinn (d) ved å kjøres i tilbakeløp med konsentrert saltsyre.

I trinn (e) blir (2R/S,3S)-3-(N-Boc)amino-2-hydroksy-5-metylheksansyre omdannet til den tilsvarende metylesteren ved en reaksjon med diazometan i en eterløsning. I trinn (f) blir diastereomer (2R,3S) renset ved krystallisering fra sykloheksan eller en heksan/toluen blanding. Trinn (g) blir utført i THF i nærvær av pyridin p-toluensulfonat og fjer-ning av den utviklede metanolen; etter fullføring av reaksjonen blir pyridin p-toluensulfonat nøytralisert med bi-karbonat. I trinn (h) blir esteren hydrolysert i en metanol/vannblanding. Reaksjonsblandingen blir deretter surgjort og det endelige produktet ekstrahert med metylenklorid.

Det nye taxanet i henhold til foreliggende oppfinnelse viste en sterk anticancer aktivitet overfor cancerceller fra bryst, lunger, livmoren, tykktarmen, prostata, nyrer, bukspyttkjertelen, og også overfor celler resistente mot kjente anticancer medikamenter slik som adriamycin, vin-blastin og platinaderivater.

Oppfinnelsen gjelder derfor farmasøytiske blandinger som

inneholder en effektiv mengde av forbindelsen i henhold til oppfinnelsen, sammen med farmakologisk akseptable bærere og tilsetningsstoff. Mer spesielt kan forbindelsen bli formu-lert i form av tabletter, pulvere, granulater, kapsler, in-jiserbare produkter, løsninger, suppositorier, emulsjoner,

dispersjoner, og lignende. For intravenøs administrering blir blandinger av Chremophor L og etanol, polysorbat og etanol eller liposome formuleringer fremstilt med naturlig eller syntetisk fosfatidylcholin, eller blandinger av nat-urlige fosfolipider i nærvær av cholesterol hovedsakelig brukt; For oral administrering blir myke gelatinkapsler hvor produktet er oppløst i polysorbater, PEG eller blandinger av disse, valgfritt i nærvær av fosfolipider, foretrukket fremstilt. Forbindelse (I) kan bli administrert til mennesker i konsentrasjoner på fra 50 til 500 mg/m<2>.

De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen mer i de-talj .

Eksempel 1: Syntese av 13-( N- Boc- p- isobutylserinyl)- 140-hydroksybakkatin III, 1, 14 karbonat

43,26 g av 14p-hydroksydeacetylbakkatin III sammen med 22,3 ml av N-metylimidazol ble oppløst i 230 ml DMF i en 500 ml glasskolbe med rund bunn; denne løsningen ble tilsatt under kraftig omrøring ved romtemperatur i 1 h sammen med 14 ml trietylklorosilan. Da reaksjonen var over, ble reaksjonsblandingen helt i 2 L vann under kraftig omrøring. Det ble dannet et rikelig bunnfall som fikk stå over natten ved 4 °C. Bunnfallet ble deretter filtrert, vasket omhyggelig med vann og deretter med n-heksan. Etter tørking i vakuum ble det oppnådd 48,1 g av 7-Tes-10-deacetylbakkatin III (XII) som inneholdt en prosentsats av 7,10-derivatet med følgende kjemifysikalske karakteristika:

<*>H NMR (CDC13 200 MHz: 5 (ppm)=0,55 (6H, t, J=7,8 Hz, 7-OTES CH2) , 0,94 (9H, q, J=7,8 Hz, 7-OTES CH3) , 1,18 (3H, s, CI6H3), 1,20 (3H, s, C17H3) , 1,77 (3H, s, C19H3) , 1,90 (1H, ddd, J=2,4, 10,8, 13,2 Hz, C6H15) , 2,12 (3H, d, J=l,6 Hz, CI8H3) , 2,31 (3H, s, 4-OCOCH3) , 2,48 (3H, ddd, J=14,3, 9,8, 6,5 Hz, C6Ha), 2,73 (1H, d, J=5,5Hz, OH), 3,79 (1H, d, J=7,l Hz, C3H) , 4,20 (1H, dd, J=1,0, 8,3 Hz, C20H15) , 4,31 (1H, d, J=8,6 Hz, C20Ha), 4,39 (1H, dd, J=6,4, 10,7 Hz, C7H), 4,77 (1H, d, J=5,8 Hz, C14H), 4,94 (1H, dd, J=2,l, 9,7 Hz, (C5H), 5,05 (1H, m, C13H), 5,13 (1H, d, J=l,9 Hz, C10H), 6,05 (1H, d, J=7,3 Hz, C2H), 7,41-8,09 (5H, m, Ph).

Massespektrum (NH3, DEP/CI, positive ioner): (m/z) 718 [(M+NH4)<+>, 100%], 701 [ M+H)<+>, 39%]

Den resulterende forbindelsen ble oppløst i 300 ml av en metylenklorid/pyridin 3:1 blanding under nitrogenatmosfære; og denne løsningen ble tilsatt under omrøring til en fosgenløsning (214 ml av en 1,9 M løsning i toluen), på forhånd nedkjølt til -10 °C, idet temperaturen ble holdt mellom -5 og -10 °C under tilsetningen.

Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30', og deretter rystet med 700 ml av en mettet løsning av NaHCC>3 idet temperaturen ble holdt under eller på 2 °C. Fasene ble separert og den organiske fasen ble vasket for å fjerne pyridin. Den organiske fasen ble dehydrert over MgSC>4 og konsentrert til tørrhet. Det ble oppnådd 46,6 g 10-deacetylbakkatin III 7-Tes-1,14-karbonat som direkte kunne benyttes i de følgende reaksjonene. 31 g av forbindelsen ble oppløst i 250 ml strengt vannfritt THF, løsningen ble nedkjølt til -50 °C, og det ble tilsatt 48 ml av en 1 M LiHMDS-løsning i løpet av 2 minutter og om-rørt i 20 minutter ved den samme temperaturen. 3,7 g acetylklorid ble tilsatt i løpet av 40 min. under omrøring. Reaksjonstemperaturen fikk lov å stige til 0 °C idet omrøringen ble opprettholdt i 2 h. Ved avslutning av reaksjonen ble blandingen behandlet med en mettet NH4C1 løsning og fortynnet med etylacetat. Fasene ble separert og den vandige løsningen ble fortynnet med etylacetat inntil produktet var oppbrukt. De kombinerte organiske fasene ble vasket med vann, deretter tørket over MgS04 og konsentrert til tørrhet. Det ble oppnådd 33 g av 14p-hydroksy-7-Tes-1,14-karbonat-bakkatin III, urent på grunn av forbindelsene fra de foregående reaksjonene. Denne forbindelsen ble kromatografert på silikagel idet det rene produktet ble utløst med en etylacetat/CH2Cl2 9:1 blanding. Det ble oppnådd 30 g av det ønskede produktet (XIII) med følgende karakteristika: <*>H NMR (CDCI3 200 MHz: 6 (ppm)=0,55 (6H, t, J=7,8 Hz, 7-OTES CH2) , 0,95 (9H, q, J=7,8 Hz, 7-OTES CH3) , 1,16 (3H, s, CI6H3), 1,32 (3H, s, C17H3) , 1,77 (3H, s, C19H3) , 1,88 (1H, ddd, J=2,4, 10,8, 13,2 Hz, C6H15) , 2,21 (3H, d, J=l,6 Hz, C18H3) , 2,19 (3H, s, 10-OCOCH3), 2,31 (3H, s, 4-OCOCH3) , 2,48 (3H, ddd, J=14,3, 9,8, 6,5 Hz, C6Ha), 2,73 (1H, d, J=5,5Hz, OH), 3,72 (1H, d, J=7,l Hz, C3H), 4,20 (1H, d, J=8,3 Hz, C20H1J), 4,31 (1H, d, J=8, 6 Hz, C20Ha) , 4,46 (1H, dd, J=6,4, 10,7 Hz, C7H), 4,79 (1H, d, J=5,8 Hz, C14H), 4,94 (1H, dd, J=2,l, 9,7 Hz, (C5H), 5,02 (1H, m, C10H), 5,05 (1H, m, C13H), 6,09 (1H, d, J=7,3 Hz, C2H), 7,41-8,09 (5H, m, Ph). Massespektrum (NH3, DEP/CI, positive ioner): (m/z) 759 [(M+NH4)<+>, 19%], 743 [(M+H)<+>, 100%] 20 g av 14p-hydroksy-7-Tes-l,14-karbonatbakkatin III sammen med 300 ml av en strengt vannfri toluen ble plassert i en 1 L kolbe med rund bunn, 10 g (4S,5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetok-syf enyl) -4-isobutyl-l-oxazoli-din-5-karboksylsyre og 2 g N,N-dimetylaminopyridin (DMAP) og 9,5 g disykloheksylkarbodiimid (DCC) oppløst i CH2C12 ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kjørt med tilbakeløp i 3 h, deretter nedkjølt, ureidproduktet bunnfelt bort og morluten ble vasket med en mettet løsning av NaHC03 for å fjerne den ureagerte syren, og deretter med fortynnet saltsyre for å fjerne DMAP og endelig igjen med NaHC03 til nøytralitet. Den organiske fasen ble konsentrert til tørrhet for å få 41,5 g produkt som direkte kunne benyttes i neste trinn. 40 g av denne forbindelsen ble avdekket i to trinn ved først å fjerne Tes og deretter 2,4-dimetoksybenzaldehyd. 40 g av forbindelsen ble oppløst i 100 ml av en acetonitril/- pyridinblanding (80:100) under nitrogen og nedkjølt ved 0 °C; 13 ml pyridinfluorid ble tilsatt, og det hele fikk stå under omrøring i 24 h. Løsningen ble helt i 2 L vann og produktet ble filtrert og tørket i vakuum.

Residuet ble oppløst i 60 ml metylenklorid, og denne løs-ningen ble tilsatt 40 ml av 0,6 N HC1 i metanol under kraftig omrøring og ved 0 °C. Reaksjonsblandingen fikk stå i 2 h under omrøring, ble deretter fortynnet med 150 ml metylenklorid og rystet med en NaHCC>3 løsning idet pH ble justert til 6-7. Den organiske fasen ble konsentrert til tørrhet og residuet ble krystallisert fra acetonheksan. Etter tørking ble det oppnådd 16 g 13-(N-Boc-p-isobutyl-isoserinyl)-14p-hydroksybakkatin-l,14-karbonat med de følgende kjemifysikalske og spektroskopiske karakteristika:

Formel: C44H57NO17

Aspekt: Hvitt pulver

Smeltepunkt: 245 °C

Massespektra: (NH3, DEP/ CI, positive ioner): (m/z) 889 [(MNH4)<+>], 832 [ (MNH4- (CH3) 3C) +] , 772 [ (MNH4-BocNH2)+] (NH3, DEP/ CI, negative ioner): (m/ z) 871 (M~) , 260 (side-kjede) Infrarødt spektrum (KBr skive): 3521, 3321, 2971, 2953, 1826, 1762, 1526, 1366, 1238, 1165, 1072, 723 cm"<1 >UV spektrum(MeOH): 231, 276 og 284 nm; -Ei% ved 231 nm = 180,99 -Ei% ved 276 nm = 14,094 -Ei% ved 284 nm = 12,182 Eksempel 2: Syntese av 13-( N- Boc- p- isobutylserinyl)- 14ft-hydroksybakkatin V, 1, 14 karbonat 5 g av 13-(N-Boc-p-isobutylserinyl)-14p-hydroksybakkatin III, 1,14 karbonat ble oppløst i 500 ml toluen under argon-atmosfære, idet løsningen ble fullstendig avoksygenert; 80 mg DBU (diazabisyklo[5,4,0]-undecen) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble kjørt med tilbakeløp i 1 h i argon-atmosfære. Løsningen ble fortynnet med 100 ml etylacetat og vasket med vann. Den organiske fasen ble fordampet til tørrhet til å oppnå 4,5 g av 13-(N-Boc-p-isobutylserinyl)-14p-hydroksybakkatin V 1,14 karbonat med de følgende kje-misk-fysikalske og spektroskopiske karakteristika:

Formel: C44H57NO17

Aspekt: hvitt pulver

Smeltepunkt: 245 °C

Massespektrum: (TSP+) : (m/z) 872 (MH+) ; 816 (MH<+->(CH3)2 C=CH2) ; 772 (8I6-CO2); 756 (816-AcOH) ; 712 (772-AcOH)

Infrarødt spektrum (KBr skive): 3450, 2963, 1913, 1740, 1702, 1247, 1091, 710 cm<-1>

UV spektrum (MeOH): 200e 230 nm

-Ei% ved 200 nm = 370.9

-Ei% ved 230 nm = 193.2

Eksempel 3: Tilberedning av ( 4S, 5R)- N- Boc-( 2, 4- dimetok-syf enyl) - 4- isobutyl- l- oksazolidin- 5- karboksylsyre Fremstilling av N- Boc- L- leucinol ( III) : 46,8 g L-Leucinol II (400 mmol) ble oppløst i 300 ml CH2C12 i en 2 L kolbe med tre halser og rund bunn, utstyrt med en mekanisk omrører, termometer og dråpetrakt. Den omrørte løsningen ble deretter tilsatt dråpe for dråpe av løsningen av Boe anhydrid (87,2 g, 400 mmol) i CH2C12 (100 ml) i løp-et av 90 minutter. Under tilsetningen av de første 25% av Boc-anhydridet var reaksjonen eksoterm, og den nådde 20-30 °C idet man fikk en slurry som ble klar etter omrøring ved romtemperatur i ytterligere 3 h. Det hele fikk stå ved romtemperatur over natten. Løsemidlet ble fordampet i høy-vakuum for å få det ønskede produktet som en tykk olje i kvantitativt utbytte (87 g). Produktet ble deretter behandlet uten ytterligere rensing.

Tilberedning av N- Boc- L- Leucinal ( IV)

En løsning av oksalylklorid (26,274 ml, 300 mmol) i 300 ml metylenklorid nedkjølt til -60/-65 °C fikk langsomt tilsatt DMSO (28,4 ml, 400 mmol).

Løsningen ble klar etter at tilsetningen av DMSO var av-sluttet. Etter 20 minutters omrøring ved samme temperatur ble reaksjonsblandingen deretter behandlet med en løsning av alkohol III (43,7 g, 200 mmol) i CH2C12 (200 ml) i 25 min. idet temperaturen ble holdt under -60 °C. Under tilsetningen av alkoholen ble reaksjonsblandingen skyet, og det ble dannet et hvitt bunnfall. Etter 20-25 minutters om-røring ved den samme temperaturen ble det dråpevis tilsatt en løsning av trietylamin (112 ml, 800 mmol) i CH2C12 (100 ml) i løpet av 4 0 minutter mens temperaturen ble holdt mellom -68 og -62 °C. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt mellom -60 og -65 °C i ytterligere 50 minutter. TLC av reaksjonsblandingen ved å bruke 8% metanol i CH2C12 som eluent oppdaget ikke noe utgangsprodukt.

Den kalde løsningen ble deretter helt opp i 800 ml av en nediset løsning som inneholdt 68 g (0,5 mol) KHSO4. Det organiske sjiktet ble separert og den vandige fasen ekstrahert med CH2C12 (100 ml). De kombinerte organiske fasene ble vasket med vandig KHS04 (5%, 1 x 200 ml) , saltlake (100 ml, 50 ml) og konsentrert til det halve volumet (~ 250 ml). Nevnte material ble benyttet direkte i det følgende trinnet .

Aldehyd ( V) bisulfittforbindelsederivat

Metylenkloridløsningen av aldehydet (IV) i en 2L kolbe med 3 halser og rund bunn utstyrt med en mekanisk omrører og en dråpetrakt ble behandlet i 10 minutter ved -5°C med en løsning av natriumbisulfitt (41,7 g, 400 mmol) i vann (200 ml) og deretter med n-Bu4NHSC>4 (678 mg, 2 mmol). Løsningen ble nedkjølt til -5 °C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -5 til 0 °C i 5-6 h og deretter over natten ved romtemperatur. Den vandige fasen som inneholdt forbindelsen V ble separert og vasket med CH2C12 (2 x 20 ml).

( 2- Cyano- 3-( N- Boc)- amino- 5- metyl- heksanol ( VI)

Til den vandige løsningen ovenfor (~ 250 ml) ble det tilsatt CH2C12 (120 ml) og reaksjonsblandingen ble nedkjølt til 0-5 °C i et isbad. Fast KCN (15 g, 230 mmol) ble deretter tilsatt til reaksjonsblandingen og løsningen ble om-rørt ved romtemperatur over natten. Den organiske fasen ble adskilt, og den vandige fasen ekstrahert med CH2CI2. De kombinerte organiske fasene ble vasket med saltlake (1 x 50 ml), tørket over MgS04 og fordampet til å oppnå produktet som en fargeløs viskøs væske (43 g) . Produktet hadde [<x]D 51,11 (c=2, MeOH) og var en omtrent 2:1 blanding av VI 2(R ), 3(S) og 2(S),3(S) derivater. Utbyttet var 89% sammenlig-net med den L-Leucinol som man startet med.

( 2RS, 3S)- 3- Amino- 2- hydroksy- 5- metylheksansyre ( VII)

Blandingen av det rå nitrilet VI ovenfor (43 g) ble behandlet med 150 ml konsentrert HC1 (37%) (150 ml) og fikk stå under tilbakeløp over natten til å gi den rå syren VII<*>. Overskuddet av saltsyre ble fjernet ved roterende fordam-ping og residuet ble fordampet med vann (100 ml) for å fjerne HC1. Residuet ble deretter oppløst i 150 ml vann, 100 ml aceton ble tilsatt, og deretter behandlet med 33 ml av en 6,25 M NaOH-løsning for å justere pH til 5. En ytterligere mengde aceton (500 ml) ble deretter tilsatt til løs-ningen som fikk stå over natten ved 4 °C. Det utfelte faste stoffet ble deretter filtrert og den faste kaken ble vasket med aceton og tørket i vakuum til å gi rå syre VII (6,5 g) som inneholdt en ca 3:1 blanding av 2(R ), 3(S) og 2(S), 3(S) derivater av forbindelse VI.

Filtratet ble fordampet og det ble tilsatt vann for å justere volumet til 7 5 ml.

Aceton (IL) ble deretter tilsatt til løsningen som fikk stå over natten ved 4 °C i et kjøleskap. Det utfelte faste stoffet ble deretter filtrert og den faste kaken ble vasket med aceton og tørket i vakuum til å gi en andre mengde av et produkt (18 g) som inneholdt fast NaCl med en omtrent 1:1 blanding av 2(R ), 3(S) og 2(S), 3 (S) derivater av VII. Det første produktet VII gjenvunnet (22,5 g) ble oppvarmet i vann (120 ml) uten å oppnå fullstendig oppløsning og deretter nedkjølt i is og filtrert til å oppnå 12,5 g av syre VII fortsatt forurenset med ca 10% uønsket 2(R ), 3(S) derivatet av VII. Dette produktet ble tørket og blandet med den ovennevnte 1:1 blandingen av krystaller fra den andre høstingen (totalt ~ 27 g).

( 2RS, 3S)- 3-( N- Boc) Amino- 2- hydroksy- 5- metylheksansyre

( VIII)

(A) Den rå syren VI 2(R ), 3(S), ca 90% renhet, (2,5 g, 77,6 mmol) ble oppløst i en vann - THF 1:1 blanding

(80 ml), og deretter ble trietylamin (13,5 ml) og deretter Boe anhydrid (18,5 g, 85 mmol) tilsatt til reaksjonsblandingen, og hele løsningen ble deretter omrørt i 40 h ved romtemperatur. Løsningen ble fordampet med en roterende fordamper, det ble tilsatt 60 ml vann og 60 ml etylacetat mens det hele ble holdt

under omrøring. Den vandige fasen ble adskilt og ekstrahert med etylacetat (30 ml). De kombinerte organiske fasene ble ekstrahert med 10% vandig natriumkarbonat (30 ml, 20 ml). Det basiske ekstraktet ble deretter kombinert med en vandig fase surgjort med 2 M saltsyre (~ 55 ml) for å justere pH av løsningen

til 2. Syre VIII ble deretter ekstrahert fra den vandige fasen med etylacetat (3 x 40 ml) og de heteroeddiksure ekstraktene ble vasket med vann (20 ml), tørket (MgS04) og fordampet til å gi det rå VIII Boe derivatet som en sirup (20 g, 99%).

(B) Den rå syren VII 2R,3S, med en renhet på ca 50%, forurenset av NaCl (27g) ble oppløst i en vann - dioksan

1:1 blanding (120 ml). Deretter ble trietylamin (20 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen, og så Boe anhydrid (26,16 g, 120 mmol). Løsningen ble omrørt i 4 0 h ved romtemperatur. Løsningen ble fordampet med en roterende fordamper og vann (100 ml) og etylacetat

(100 ml) ble tilsatt til residuet som ble holdt omrørt 1 ytterligere noen minutter. Den organiske fasen ble

adskilt og ekstrahert med 10% vandig natriumkarbonat (45 ml, 30 ml). Natriumkarbonatekstraktene ble deretter kombinert med den vandige fasen, surgjort med IM saltsyre (~ 165 ml) og ekstrahert med etylacetat (3 x 60 ml), etterpå vasket med vann (30 ml), tørket

(MgS04) og fordampet til å gi den rå VII Boe som en sirup (16 g) som besto av en 1:1 blanding av de 2R, 3S og 2S, 3S isomerene.

( 2R, 3S)- 3-( N- Boc) Amino- 2- hydroksy- 5- metylheksansyre metylester ( IX)

Diazometan ble tilberedt fra diazald ved å følge prosessen rapportert i T.H.Black [Aldrichimica Acta, 16,3 (1983)]. (A) En løsning av den rå syren VIII (20 g, 56,6 mmol) i CH2CI2 (75 ml) ble langsomt tilsatt til en kald diazo-metaneterløsning (~ 77 mmol) og blandingen fikk stå i 2 h på et isbad. Fargen på løsningen i dette trinnet ble hvit og viste således at den største delen av dia-zometanet hadde blitt adsorbert. Løsningen ble deretter konsentrert og residuet krystallisert fra en blanding av toluen (20 ml) og heksan (70 ml). Etter kjø-ling over natten i et kjøleskap ved 4 °C ble krystal-lene av det rene IXA 2R, 3S derivatet oppsamlet ved filtrering. Utbyttet var 15 g. Morluten ga ca 5 g av en 1:1 isomer blanding.

(B) Ved å bruke den samme fremgangsmåten ble en 1:1 blanding av surt VIII (16 g) transformert til en 1:1 blanding av IXA og IXB estere. Materialet fra morlutene (5 g fra trinn A) ble deretter tilsatt og materialet ble kombinert og separert ved kolonne kromatografi ved å bruke heksan - etylacetat som eluent (9:1 til 7:3). Ninhydrin ble brukt som utvikler for TLC platene. Den apolare forbindelsen, Rf 0,75 (heksanetylacetat: 7:3)

ble identifisert som den ønskede esteren IXA (2R, 3S), som ble rekrystallisert fra sykloheksan til å gi IXA som fargeløse nåler (8 g) sm.p. 95-96 °C, [a] D 72,4°

(C=l, MeOH).

Den polare forbindelsen, Rf 0,5 (heksanetylacetat 7:3) ble identifisert som IXB (2s,3s), og ble rekrystallisert fra sykloheksan til å gi 10 g IXB som fargeløse nåler.

2, 4- dimetoksybenzaldehyd dimetylacetal

En blanding av 2,4-dimetoksybenzaldehyd (41,25 g, 0,25 mol), vannfritt trimetyl ortoformiat (50 ml) og ammonium-nitrat (2 g oppløst i 20 ml metanol) ble kjørt med tilbake-løp i 6 h (<1>HNMR av reaksjonsblandingen viste en 65-70% omdanning). Til å begynne med var den varme reaksjonsblandingen en klar løsning, men etter hvert som reaksjonen utviklet seg, bunnfalt det faste stoffet. En andre del av vannfritt trimetyl ortoformiat (20 ml) ble tilsatt og en del metanol ble destillert av.

Da temperaturen i reaksjonsblandingen nådde 95-100 °C var alt det faste stoffet oppløst i kolben. Løsningen ble ned-kjølt til romtemperatur, og det ble tilsatt vannfri Na2CC>3 (5 g), under omrøring i 30 minutter. Deretter ble løsningen filtrert og residuet ble destillert ved fraksjonert destil-lasjon i vakuum ved 0,25 mm Hg. Den første fraksjonen ved lav temperatur besto hovedsakelig av overskuddet av trimetyl ortoformiat og den andre fraksjonen som ble destillert som en fargeløs olje ved 175-180 °C, var den ønskede aceta-len. Utbytte: 37 g (70 %).

( 4S, 5R)- N- Boc- 2-( 2, 4- Dimetoksyfenyl)- 4- isobutyl- l- oksazo-lidin- 5- karboksylsyre metylester ( X)

En løsning av (2R, 3S)-3-(N-Boc)amino-2-hydroksy-5-metylheksansyre metylester (IXA) (34,375 g, 125 mmol) i vannfri THF (150 ml) ble tilsatt med destillert 2,4-dimetoksybenzaldehyd dimetylacetal (30 g, 142 mmol) og deretter pyridin p-toluensulfonat (Py.Tos; 400 mg).

Løsningen ble oppvarmet ved et mildt tilbakeløp i en 500 ml kolbe med tre halser utstyrt med en Dean-Stark separator. Etter ca 6 h ved tilbakeløp, ble det fjernet ca 60 ml THF inneholdende metanol generert i løpet av reaksjonen. En prøve ble tatt for <*>H NMR analyse (i CDC13) .

Toppen ved = 1.41 ppm forsvant (1_) og en ny topp viste seg ved 8 = 1.24 ppm for den beskyttede metylesteren (2). Etter 6 h med tilbakeløp var omdanningen omtrent 70-75%.

En frisk aliquot med vannfri THF (50 ml) ble tilsatt, og deretter en mengde 2,4-dimetoksybenzaldehyd acetal (5,0 g; 24 mmol). Reaksjonsblandingen ble kjørt med tilbakeløp i ytterligere 2,5 h, i hvilken tid ca 50 ml THF ble fjernet ved å bruke Dean-Stark apparatet. Den påfølgende <1>H NMR analysen viste fullstendig transformering av det inngående materialet.

En mettet NaHCC>3 vandig løsning (15 ml) ble tilsatt til re-aks jonsblandingen og blandingen ble omrørt i 15 minutter for å nøytralisere Py.Tos. t-Butyl metyleter (85 ml), og vann (15 ml) ble deretter tilsatt og den organiske fasen ble adskilt. Den vandige fasen ble ekstrahert med t-butyl metyleter (20 ml) og de kombinerte organiske fasene ble vasket med vann (30 ml) og fordampet til et residu (66 g) med råproduktet X.

Hydrolyse av ester X til å gi syren XI

Råesteren X (22 g, 42 mmol) ble oppløst i 100 ml metanol og vann(50 ml) tilsatt som inneholdt 8,7 g kaliumkarbonat. Etter omrøring over natten ved romtemperatur, ble reaksjonen ansett for fullstendig ved TLC oppfølging (toluenetylace-tat: 4,5:1). TLC analysen ble bekreftet av <1>H NMR analysen, idet man kontrollerte at metylestertoppen forsvant. Metanol ble fordampet ved en temperatur ikke over 4 0 °C i vakuum (ca 60 g residu) og vann (150 ml) ble tilsatt til residuet. Den vandige suspensjonen ble ekstrahert med etylacetat (5 x 50 ml) for å fjerne overskuddet av benzaldehyd og benzaldehyddimetylacetal. 90 ml metylenklorid ble tilsatt til den vandige fasen, blandingen ble nedkjølt i et isbad og to-fase systemet ble behandlet med ca 125 ml av 1 M NaHS04 (pH=3) under kraftig omrøring. Fasene ble separert og den vandige fasen ble ekstrahert med metylenklorid (75 ml). De kombinerte metylenklorid ekstraktene ble vasket med vann (30 ml), saltlake (30 ml) og tørket over MgS04. Løsningen ble deretter holdt ved -60 °C inntil neste bruk. Utbyttet av det endelige produktet som et fargeløst fast stoff var 16 g, ca 93% basert på startproduktet.

Eksempel 4: Tilberedning av 14P~ hydroksy- 7- Tes bakkatin III 1, 4 karbonat

En løsning av 11.2 g 10-deacetyl-14-hydroksybakkatin III i 50 ml av tørt tetrahydrofuran ble tilsatt 0,72 g CeCl3 x 7H20 og 7,3 ml eddiksyreanhydrid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 h, og i løpet av denne tiden ble blandingen homogen. 10 g is ble tilsatt, og det hele ble omrørt i 1 time. Tetrahydrofuran ble dampet av i vakuum, og residuet ble fortynnet med 200 ml H2O. Bunnfallet ble filtrert og tørket i vakuum i nærvær av P2O5: produktet ble krystallisert fra etylacetat til å oppnå 10 g 14-hydroksybakkatin III med de følgende karakteristika: Sm.p.: 236-8 °C; IR (KBr): 3474, 1739, 1400, 1240, 1090, 104 9 cm"<1>.

1H NMR (CDCI3, 200 MHz); 8,07 (d,J=8 Hz, Bz), 7,55 (d, J= 8 Hz, Bz), 7,44 (t, J= 8 Hz, Bz), 6,31 (s, H-10), 5,80 (d,J=7 Hz, H-2), 4,97 (br d, J= 8 Hz, H-5), 4,73(br, d, J=4 Hz, H-13), 4,41 (m, H-7), 4,24 (d, J=4 Hz, H-14), 4,20 (D, J=7

Hz, H-20a)4,06 (d, J=7 Hz, H-20b), 3,89 (J 0 (Hz, H-3), 2,29 (s,OAc), 2,22 (s, Oac), 2,04 (s, H-18), 1,66 (s, H-19), 1,25, 1,11 (s, H-16 og H-17).

I en kolbe med fire halser utrustet med omrører, dråpetrakt, termometer og tilbakeløpskondensator nedkjølt til -12 °C ble det plassert 52,8 ml av en 1,9 M løsning av fosgen i toluen. Denne løsningen ble tilsatt dråpevis med 11,6 g 14-hydroksy bakkatin III oppløst i 53 ml metylenklorid og 17,5 ml pyridin under omrøring i 30 minutter. Temperaturen ble holdt mellom -6 og -10 °C. Etter 30 minutter ble det tilsatt 50 ml av en mettet NaHCC"3-løsning under omrøring mens man holdt en streng kontroll med temperaturen. Etter oppvarming til romtemperatur ble fasene separert. Den vandige fasen ble kontraekstrahert med metylenklorid og de organiske fasene ble vasket med 45 ml av en 2 N HC1 idet pH ble justert til ca 1. Den organiske fasen ble vasket med 0,1 N HC1 og deretter med NaHCC>3, deretter tørket over Na2S04 og fordampet til tørrhet til kvantitativt å oppnå 11,5 g 14-hydroksybakkatin-l,14 karbonat.

11,5 g 14-hydroksybakkatin-l,14 karbonat ble oppløst i 50 ml DMF og 1,1 ekvivalenter klortrietylsilan og 3 ekvivalenter N-metylimidazol ble tilsatt ved romtemperatur. Etter avslutning av reaksjonen ble blandingen helt i 500 ml H2O og bunnfallet ble filtrert og vasket omhyggelig med H20, og deretter tørket til å gi 12,8 g 14p-hydroksy-7-Tes-Bakkatin 111-1,14 karbonat med de samme karakteristika som de rapportert i eksempel 1.

Eksempel 5: Syntese av 13-( N- Boc- p- isobutylserinyl)- 14( 3-hydroksybakkatin III, 1, 14 karbonat

Med utgangspunkt i 14p-hydroksy-7-Tes-Bakkatin 111-1,14 karbonat oppnådd som beskrevet i eksemplet ovenfor, var fremgangsmåten som følger: I en 1 L kolbe med rund bunn ble det plassert 20 g 14p-hydroksy-7-Tes-l,14-karbonat-bakkatin III sammen med 300 ml av strengt vannfritt toluen; 10 g (4s, 5R)-N-Boc-2-(2,4-dime-toksyf eny1-4-isobutyl-l-oksazolidin-5-karboksylsyre oppløst i CH2C12 og 2 g N,N-dimetylaminopyridin (DMAP) ble tilsatt og 9,5 g disykloheksylkarbodiimid (DCC) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kjørt med tilbakeløp i 3 h, deretter nedkjølt til å bunnfelle bort det ureidproduktet, og morlutene ble vasket med en mettet NaHCC>3-løsning for å fjerne den ureagerte syren, deretter med fortynnet saltsyre for å fjerne DMAP og endelig igjen med NaHCC>3 til nøytralitet. Den organiske fasen ble konsentrert til tørrhet til å oppnå 41,5 g produkt som direkte kunne brukes i det påfølgende trinnet.

40 g av denne forbindelsen ble avdekket i to trinn ved først å spalte Tes og deretter 2,4-dimetoksybenzaldehyd. 40 g av forbindelsen ble oppløst i 100 ml av en acetonitril/

pyridin blanding (80:100) under nitrogen, og blandingen ble nedkjølt til 0 °C; 13 ml pyridinfluorid ble tilsatt, og det hele fikk stå under omrøring i 24 h. Løsningen ble helt opp i 2 L vann, og produktet ble filtrert og tørket i vakuum.

Residuet ble oppløst i 60 ml metylenklorid og denne løsningen ble tilsatt 40 ml metanol i 0,6 N HC1 under kraftig omrøring og ved 0 °C. Reaksjonsblandingen fikk stå i 2 h under omrøring, ble deretter fortynnet med 150 ml metylenklorid og rystet med en NaHCC>3 løsning som justerte pH til 6-7. Den organiske fasen ble konsentrert til tørr-het, og residuet ble krystallisert fra acetonheksan, deretter tørket til å gi 16,5 g 13-(N-Boc-p- isobutyl-isoserinyl)-14p-hydroksybakkatin III 1,14-karbonat.

Claims (9)

1. Forbindelse i henhold til formel (I):

2. Prosess for fremstilling av forbindelsen i henhold til krav 1, karakterisert ved at 13-(N-Boc-p-isobuty-lisoserinyl)-14p-hydroksybakkatin III 1,14-karbonat enten blir behandlet med DBU (diazabisyklo[,4,0] 7-undecen) i metanol eller THF, eller alternativt får stå i løsning med metylenklorid og klorerte løsemidler i nærvær av alifatiske alkoholer valgt fra metanol, etanol eller propanol og med basisk allumin, i en tid varierende fra en time til 14 døgn.

3. Prosess for fremstilling av 13-(N-Boc-p-isobutyl-isoserinyl)-14p-hydroksybakkatin III eller V 1,14-karbonat karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) transformering av 14p-hydroksy-10-deacetylbakkatin III eller V til det trietylsilylerte derivatet ved 7-posisjonen; b) fremstilling av 1,14 karbonatderivatet fra produktet fra trinn (a); c) selektiv acetylering av hydroksylet ved 10; d) reaksjon av produktet fra trinn (c) med (4S,5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oksa-zolidin-5-karboksylsyre; e) spalting av de trietylsilyl- og dimetoksybenzyl-iden beskyttende gruppene fra produktet fra trinn (d).

4. Prosess i henhold til krav 3, karakterisert ved at det silylerende mid-let i trinn (a) er trietylklorosilan; 1,14 karbonat derivatet i trinn (b) blir fremstilt ved å bruke fosgen i toluen i metylenklorid/pyridin 3:1 løsning under nitrogenatmosfære; reduksjonen i trinn (c) blir utført med LiHMD'er i vannfri THF, og det resulterende 10-hydroksy derivatet deretter blir acetylert med acetylklorid; kondensasjonsreaksjonen i trinn (d) blir utført i et vannfritt apolart organisk løsemiddel, i nærvær av en base og av kondensasjons-midlet disykloheksylkarbodiimid (DCC); den trietylsilyl-beskyttende gruppen i trinn (e) blir fjernet med pyridinfluorid i en acetonitril/pyridin løsning under nitrogen, og den dimetoksybenzylidenbeskyttende gruppen blir fjernet i et metylenklorid løsemiddel ved tilsetning av HC1 i metanol og deretter av NaHCC>3.

5. Prosess for fremstilling av 13-(N-Boc-p-isobutyliso-serinyl)-14|3-hydroksybakkatin III eller V 1,14-karbonat karakterisert ved at den omfatter de føl-gende trinnene: a') selektiv acetylering av hydroksylet ved C-10 i 14p-hydroksy-10-deacetylbakkatin III eller V; b') fremstilling av 1,14 karbonatderivatet fra produktet fra trinn (a' ); c') silylering av hydroksylet ved C-7; d') reaksjon av produktet fra trinn (c) med (4S, 5R)-N-Boc-2-(2,4-dimetoksyfenyl)-4-isobutyl-l-oksa-zolidin-5-karboksylsyre; e') spalting av de trietyl- og dimetoksybenzylidenbeskyttende gruppene fra produktet fra trinn (d').

6. Prosess i henhold til krav 5, karakterisert ved at den selektive acetyleringen i trinn (a') blir utført med eddiksyreanhydrid i nærvær av cerium-, scandium-, og ytterbium salter, foretrukket CeCl3 x7 H2O, og trinnene (b' ) - (e' ) blir utført analogt med trinnene (b), (a), (d) og (e) i krav 4.

7. De følgende syntese mellomproduktene: 14p-hydroksy bakkatin III eller V, 14p-hydroksy bakkatin III eller V 1,14 karbonat, 14-p-hydroksy-7-Tes-10-deacetylbakkatin III eller V, 14-p-hydroksy-7-Tes-bakkatin V, 14-p-hydroksy-7-Tes-bakkatin III eller V 1,14-karbonat.

8. Farmasøytiske blandinger som inneholder forbindelsen (I) sammen med farmasøytisk akseptable bærere og eksipien-ter.

9. Anvendelse av forbindelsen (I) til fremstilling av et medikament med anticancer aktivitet.