NO315856B1 - Vandig lösning av delvis renset faktor IX, samt fremgangsmåte for å rense faktor IX fra andre proteiner og makromolekyler i en lösning medslike - Google Patents

Description

O ppfinnelsens område

Denne oppfinnelsen vedrører en vandig løsning av delvis renset faktor IX, samt fremgangsmåte for å rense faktor IX fra andre proteiner og makromolekyler i en løsning med slike.

Faktor IX er et kuleformet protein som har en molekylvekt på ca. 70.000 dalton, og som hos et normalt individ hele tiden produseres i leveren og sirkulerer ved en normal blodplasmakonsentrasjon på omtrent 5 pig/ml.

B-hemofili (også kjent som Christmas-sykdom) er en svært alvorlig sykdom som resulterer i nedsatt blodlevringsaktivitet in vivo og in vitro, og som krever omfattende medisinsk overvåkning gjennom hele livet til den berørte person. Slike personer oppviser normale blodlevringstider bare når de forsynes med eksogen faktor IX som ekstraheres fra blodplasmaet til normale individer. Bortsett fra slik behandling kan den berørte person lide av spontane blødninger i ledd, noe som gir alvorlig smerte og svekkende immobilitet, blødninger i muskler som resulterer i store volumer med blodakkumulering i vevet, spontane blødninger i halsen og nakken som kan forårsake kvelning dersom de ikke behandles øyeblikkelig, blødning i urinen og alvorlig blødning etter kirurgisk inngrep eller mindre skader ved uhell eller tannuttrekninger.

Mangel på funksjonell faktor IX kan oppstå på forskjellige måter. Genet som koder for faktor IX, befinner seg på X-kromosomet. Dette forklarer hvorfor B-hemofili er mye vanligere hos menn enn hos kvinner. Noen av de berørte personer er kjent for å ha arvet et X-kromosom med en fullstendig delesjon av genet for faktor IX. Disse alvorlig rammede personer kan til og med produsere antistoffer mot terapeutisk injisert faktor IX. Mange pasienter med B-hemofili er kjent for å produsere et faktor IX-moIekyl med en endret aminosyresekvens som resulterer i molekyler med delvis eller ingen koaguleringsaktivitet. Noen B-hemofilipasienter produserer normal faktor IX, men i utilstrekkelige mengder til å bevirke blodlevring innen en normal tid etter skade.

Som nevnt ovenfor, kan faktor K-aktivitet gjenopprettes hos pasienten ved injeksjon av normalt humanplasma. Minst flere liter ville imidlertid måtte administreres for å øke pasientenes blodomløpsnivåer av faktor IX til et effektivt område. Ved behandling for B-hemofilipasienter har vekten følgelig vært lagt på å gi injeksjoner av et plasmakonsentrat som er svært anriket med faktor DC Tilveiebringelsen av et slikt konsentrat er ikke noen enkel oppgave, slik det vil fremgå av omtalen som følger.

Mekanismene hvorved blod i omløp generelt forhindres fra blodlevring, men likevel styres til å levre seg på stedet for et sår, er svært kompleks og omfatter et stort antall proteiner, andre makromolekyler, celler og strukturer. Denne hemostatiske mekanisme benytter også et stort antall feedback- eller amplifikasjonsveier for ytterligere å regulere koagulering. På grunn av det store antall individuelle proteinarter som utgjør blodlevringsveien, og det store antall andre makromolekyler i blodplasma, er det generelt vanskelig å isolere brukbare mengder av noen enkelt komponent, inkludert faktor IX, i høyren form. I tillegg inneholder blod et stort antall proteaser (enzymer som fordøyer eller skader andre proteiner) som kan skadelig påvirke proteinet valgt for isolering, slik som faktor IX, før det kan skilles fra de øvrige blodkomponentene.

Ettersom blodets levringsevne holdes i en regulert balanse, må faktor IX og andre komponenter forbundet med koagulering holdes inaktive mesteparten av tiden for å unngå unødvendig levring. Likevel må proteinene alltid være til stede i hele sirkulasjonssystemet, klare til å reagere umiddelbart når det trengs.

Blodet inneholder derfor nødvendigvis en svært komplisert mekanisme for å forhindre levring fra å finne sted hvor det ikke trengs, for å unngå uønsket levring og for hurtig å stanse blodtapet på et skadet sted. Belysningen av denne komp-liserte reguleringsmekanisme klargjør hvorfor det er så vanskelig å isolere terapeutisk faktor IX fri for klinisk skadelige forurensninger.

Dannelsen av et effektivt blodkoagel omfatter den komplekse interaksjon mellom mange komponenter i det vaskulære system, inkludert blodplateceller, kollagen og mikrofibriller eksponert ved skade på det vaskulære epitel, fosfolipider og proteiner i omløp. Proteiner som sirkulerer i blodet som inerte proenzymer og som er involvert i koagulering, henvises vanligvis til som "koagulasjonsfaktorer". Etter aktivering virker de generelt som svært spesifikke enzymer som lager spesifikke endringer i andre koagulasjonsfaktorproenzymer. Hver faktor i rekkefølgen aktiveres således etter tur. Noen proenzymer, slik som faktor XII, kan også aktiveres ved kontakt med en skadet overflate eller ved kompleksdannelse med andre makromolekyler.

Blodlevringsprosessens mekanisme er kjent i betydelig detalj. Den aktive form av en koagulasjonsfaktor betegnes ved indeksen "a" og produseres vanligvis fra det inaktive proenzym ved virkningen av en annen av de faktorspesifikke proteaser. Administrering av aktiverte koagulasjonsfaktorer til hemofilipasienter medfører i teorien en risiko for blodkoageldannelse på mange steder utenom skadestedet.

Den hemostatiske mekanisme kan karakteriseres som en svært fin balanse mellom de materialene eller prosessene som inhiberer koagulasjon og de som fremmer den. Overtilførsel av ett eller flere stoffer, særlig aktiverte koagulasjonsfaktorer, kan føre til uønsket koagulasjon. Aktiverte koagulasjonsfaktorer kan derfor være skadelige forurensere i terapeutiske preparater av koagulasjonsproenzymer, slik som faktor IX-preparater.

Når det gjelder B-hemofilipasienter, omfatter teknikkens stand imidlertid at de vanligvis behandles med "protrombinkomplekskonsentrat", som er en plasmaekstrakt konsentrert med hensyn på faktor IX, men som inneholder også betydelige mengder av andre plasmaproteiner, inkludert faktorene II, VII, X, aktive former derav og et stort antall andre forurensende proteaser. Slike preparater kan også rutinemessig være forurenset med faktor IXa.

Det finnes et stort antall rapporter i litteraturen vedrørende de skadelige kliniske konsekvenser av å administrere protrombinkomplekskonsentrater (eller andre faktor IX-konsentrater) forurenset med faktor IXa og/eller med aktive eller nedbrutte former av andre blodlevringsfaktorer. Den mest alvorlige risiko er den uunngåelige aktivering av blodlevringskaskaden. Dødsfall er blitt dokumentert.

Løsninger på problemene forbundet med bruken av urene faktor IX-konsentrater er blitt forhindret ved mangel på forståelse av nøyaktig hvordan og hvorfor slike konsentrater induserer ønsket blodlevring. Det er blitt foreslått at faktor IX-konsentrater kan indusere koagulasjon ikke bare på grunn av at mengder av faktor IX„ er til stede, men også fordi de er betydelig forurenset med andre blodlevringsfaktorer, hvorved blodet overlesses med høye sirkulasjonsnivåer av én eller flere blodlevringsfaktorer eller aktiverte former derav.

Basert på bestemmelser under anvendelse av natriumdodecylsulfatpoly-akrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) har faktor IX„ en omtrentlig molekylvekt på 54.000. Andre peptidarter som skriver seg fra proteolytisk nedbrytning av faktor IX, har imidlertid svært like molekylvekter, f.eks. fra omtrent 40.000 til omtrent 65.000. Det er for tiden ikke kjent hvorvidt faktor IX-aktiveringsprodukter eller -nedbrytningsprodukter er primært ansvarlig for skadelige kliniske følger som er blitt observert etter administrering av protrombinkomplekskonsentrat eller andre konsentrater som inneholder uren faktor IX. Følgelig er utviklingen av terapeutika som inneholder faktor LX, og som unngår risikoene ved urene preparater, av stor farmasøytisk interesse.

I teknikkens stand beskrives forskjellige strategier for rensingen av faktor IX, inkludert bruken av affinitetsteknologi med monoklonalt antistoff for å skille faktor IX fra andre koagulasjonsfaktorer. Det er imidlertid viktig at slike faktor IX-rensinger omfatter enhver anstrengelse for å minimalisere dannelsen av faktor IXa eller nedbryte faktor IX-peptider. Ettersom faktor IX (proenzymet) og aktivert faktor IX (IXa) er like i struktur, er det vanskelig å skille de to formene av faktor IX ved noen rensestrategi. Selv antistoffaffinitetsteknologi vil sannsynligvis ikke oppnå en separasjon ettersom begge molekyler har de fleste av sine potensielle determinanter til felles, og faktor IXa-forurenseren (og potensielt faktor IX-nedbrytningspeptider) ville være tilbøyelig til å bli ført med inn i sluttproduktet. Det antas at det ikke finnes noe for tiden kjent antistoff med passende differensiell sensitivitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbedrede midler for forhindring av proteolytisk omdannelse av faktor LX til faktor IXa eller til nedbrutte faktor IX-peptider etter hvert som faktor IX renses, og for å stanse proteolytisk virkning på renset faktor IX under lagring derav.

Ra pporterte utviklinger

Rensingen av faktor IX krever at den skilles fra et stort antall andre plasmaproteiner og andre plasmamakromolekyler. Vanligvis produseres faktor IX fra kryopresipitatfritt plasma. Denne plasmafraksjonen fremstilles ved å nedfryse helplasma hurtig, la det tine sakte og samle opp den utskilte supernatant. Se Pool, J.G. et al., Nature, 203,312 (1964). Mange proteiner, inkludert faktor VIII, utfelles fra det sakte tinende plasma og kan fjernes ved sentrifugering.

Ved utøvelsen av teknikkens stand blandes det faktor LX-holdige kryopresipitatfrie supernatantplasma vanligvis med en anionbytterharpiks eller gel, slik som DEAE-"Sephadex", DEAE-cellulose eller DEAE-"Sepharose" (i satsvis eller kolonneform), eller alternativt Al(OH)3-gel, noe som fører til adsorpsjon av faktor IX sammen med andre blodlevringsfaktorer med lignende bindingsegenskaper, og også adsorpsjon av mindre mengder av andre forurensende proteiner. Innledende fraksjonering med anionbytterharpikspartikler drar fordel av det faktum at visse blodlevringsfaktorer (slik som faktorene II, VIII, LX og X) adsorberes selektivt på slike harpikser på grunn av deres negativt ladete gamma-karboksyglutamatrester. Disse proteinene henvises også til som "vitamin K-avhengige blodlevringsfaktorer" ettersom en posttranslasjonell vitamin K-kofaktoravhengig prosess fester gammakarboksy-gruppene, idet slike grupper er nødvendige for korrekt binding av koagulasjonsfak-torene til Ca<+2>, lipidoverflater og blodplater.

Vanligvis vaskes den bundne faktor IX, og elueres så fra anionbytter-harpiksen under anvendelse av en bufret saltoppløsning med høy molaritet. Såfremt slik høymolaritetssaltoppløsning anses for å være osmotisk uforenlig med humanvev, underkaster utøvere av teknikkens stand konsekvent sine faktor IX-ekstrakter dialyse og filtrering (eller vekselvis ultrafiltrering og diafiltrering) som plasserer faktor IX-ekstrakten i konsentrert form, men erstatter høymolaritetssaltoppløsningen med en fysiologisk forenlig lavmolaritetssaltoppløsning.

Det faktor IX-anrikede harpikseluat (forurenset med betydelige mengder av andre proteiner, inkludert blodlevringsfaktorene II, VII og X) er kjent som et protrombinkomplekskonsentrat. Faktor II (protrombin) og de øvrige vitamin K-avhengige koagulasjonsfaktorer er kjent som "protrombinkompleks" på grunn av de ovenfor nevnte like bindingsegenskaper. B-hemofilipasienter har vanligvis blitt beha-ndlet med slike konsentrater.

Ved utøvelsen av teknikkens stand kan den ovenfor nevnte anionbytterkromatografi også etterfølges eller erstattes av andre trinn. For eksempel kan kryopresipitatfritt plasma som det er tilsatt sitrat til, behandles med bariumklorid, noe som forårsaker utfelling av bariumsitrat hvorpå faktor IX og visse andre koagulasjonsfaktorer bindes. Proteinene isoleres fra utfellingen og underkastes så anionbytterkromatografi. Se f.eks. Miletich, J.P. et al., J. Biol. Chem., 253 (19), 6908-6916

(1978). Faktor IX kan også adsorberes til en gel av Al(OH)3.

Alternativt kan et andre ionebytterharpikstrinn tilføyes. Som beskrevet i US patentskrift nr. 4.447.416, underkastes faktor IX-fraksjonen etter anionbytterkromatografi ultrafiltrering og diafiltrering mot 0,15 molar NaCl bufret med 20 mM sitrat, pH 6, og underkastes så en andre fase med ionebytterkromatografi under anvendelse av en sulfatert dekstranharpiks. Faktor IX elueres fra denne andre harpiksen når saltkonsentrasjonen når 0,8 molar. Faktor IX inneholdt i en oppløsning med høy saltmolaritet underkastes så igjen ultrafiltrering og diafiltrering mot fysiologisk akseptabelt 0,11 molar NaCl, 20 mM sitrat, pH 6,8, og lagres så i lyofilisert form. Den rapporterte fremgangsmåte fører imidlertid til et faktor IX-produkt hvor mindre enn 10 % av proteinet er faktor IX, idet mer enn 90 % av materialet består av forurensende proteinarter. Det er ikke rapportert noen analyser av faktor IXa i US patentskrift nr. 4.447.416, og det er ikke beskrevet noen forsøk som ville bestemme hvorvidt forurensende proteaser vil fortsette å generere faktor IXa eller nedbrutte former av faktor IX dersom produktet skulle lagres i noe annet enn lyofilisert form.

I Menache, D. et al. i Blood, 64 (6), 1220-1227 (1984), som bruker teknologi som gjenspeiler US patentskrift nr. 4.447.416, beskrives et faktor IX-preparat, angitt å være fritt for aktivert faktor IXa og nied en spesifikk aktivitet på omtrent 5 enheter faktor IX-aktivitet pr. mg totalprotein. Ettersom den spesifikke aktivitet til ren faktor IX er omtrent 200 enheter/mg protein, anses sluttproduktet å være svært forurenset med andre proteiner, og på grunn av muligheten av proteaseaktivitet er dets langvarige ikke-trombogene status tvilsom.

I Michalski et al., Vox Sang, 55,202-210 (1988), beskrives en rensestrategi for faktor IX hvor standard anionbytterkromatografi kjent fra tidligere etterfølges av kromatografi på harpiks belagt med heparin, et negativt ladet muko-polysakkarid. Produktet angis å være fritt for faktor IXa målt ved hjelp av en antitrombin Ill-nøytralisasjonsanalyse, men inneholder bare 5 vekt% av faktor IX, idet det gjenværende er proteinforurensninger. Det er klinisk uønsket å administrere slike urene preparater på grunn av muligheten for eventuell aktivering av faktor IX av et av de forurensende proteiner som er til stede. Uten evaluering av slikt konsentrat i dyremodeller som er følsomme for trombogene bestanddeler, som beskrevet i denne søknaden, er ikke fraværet av trombogen risiko verifisert.

Ettersom blodplasma inneholder mange proteiner som har lignende fysikalske egenskaper, og som er svært vanskelige å skille fra faktor IX, og ettersom de fleste rensefremgangsmåter resulterer i betydelig proteolytisk aktivering og/eller nedbrytning av faktor IX, har utøvere prøvd å utvikle nye strategier for å oppnå faktor IX-terapeutika med høy spesifikk aktivitet (høy renhet), og som er fri for andre proteinforurensninger.

Betydelig vekt er blitt lagt på kloning av humanfaktor IX-genet for å produsere faktor IX-preparater som er frie for andre blodlevringsfaktorer og blodplasmaproteaser som er tilbøyelige til å bryte ned faktor IX. Dessverre har det hit-til ikke vært mulig å isolere faktor IX fra slike preparater i tilstrekkelig ren form. I tillegg til hindringen med duplisering har i det genetisk kunstig fremstilte produkt den spesifikke in vivo posttranslasjonelle modifikasjon av bestemte glutaminsyrerester, hvorved man far de avgjørende gamma-karboksyglutaminsyrerester fra faktor IX, ikke blitt løst.

Antistoffer som er spesifikke for individuelle proteiner, er blitt et verdifullt verktøy i forsøk på å isolere koagulasjonsfaktorer i ren form. Ved å følge teknikken til Koehler, G. og Milstein, C. (Nature, 256,495-497 (1975)), identifiserte Goodall, A.H. et al. monoklonale antistoffer til faktor IX og brukte dem i preparativ immunoaffinitetskromatografi for å danne en faktor IX med høy spesifikk aktivitet, Blood, 59 (3), 664-670 (1982). Goodall-fremgangsmåten løser imidlertid ikke den avgjørende kliniske vanskelighet ved at faktor IXa foreligger i naturlig plasma og vil bli ytterligere fremstilt ved proteolytisk aktivitet under de innledende trinn i fremgangsmåten (konvensjonell kromatografi, slik som anionbytterkromatografi) før immunoafrinitetskromatografi. Ingen analyser med hensyn på faktor IX* eller nedbrutte faktor IX-peptider ble rapportert. Ingen strategi for å regulere trombogenisitet før immunoaffinitetskromatografi ble beskrevet, og heller ikke ble testre-sultater i dyremodeller som er følsomme for trombogene bestanddeler, rapportert.

Affinitetsteknikker med monoklonalt antistoffer svært effektive når det gjelder å skille faktor IX fra andre blodlevringsfaktorer, og har blitt den foretrukne rensemetode til mange forskere. Ved den foreliggende teknikkens stand er imidlertid faktor IX erholdt ved immunoaffinitetskromatografi betydelig forurenset med samrensende faktor IXa og/eller andre klinisk uakseptable, nedbrutte former av faktor LX, som kryssreagerer med faktor IX-antistoffer.

I US patentskrift nr. 4.786.726 beskrives et bestemt monoklonalt antistoff som der er betegnet som "A-7". Utviklingen består i å gjenkjenne at bindingen av dette antistoffet til faktor IX er Ca<+2->avhengig og kan forhindres ved tilsetning av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Dette gir en nyttig fremgangsmåte for å regulere eluering av faktor LX fra den stasjonære fase i en affinitetskolonne etter vasking for å fjerne proteinforurensning. Faktor LX elueres til sist fra antistoff-harpikskompleksene under anvendelse av kalsiumchelatering. Utviklingen forbedrer imidlertid ikke kvaliteten til protrombinkomplekskonsentratet tilført immunoaffinitetskolonnen, og det tilveiebringer heller ikke en måte for å skille faktor IX fra faktor IXa. Det er ikke gitt noen erkjennelse av nødvendigheten av eller midlet for å regulere faktor IX-aktivering eller -nedbrytning i tidlige prosesseringsstadier.

Smith, KJ. et al., Thrombosis Research, 33,211-224 (1984), mislyktes i en publikasjon som gjenspeiler US patentskrift nr. 4.786.726 i et forsøk på å danne et antistoff som ville gjenkjenne faktor IX og ikke faktor IX„ (eller omvendt). Den nåværende teknikk beskriver ikke noe slikt antistoff (som i virkeligheten sannsynligvis vil være svært vanskelig å isolere på grunn av strukturelle betraktninger), noe som understreker behovet for andre rensetrinn og fremgangsmåter som vil løse problemet med aktivering av faktor IX til faktor LX,, eller dens nedbrytning til andre klinisk usikre peptider.

For å fremstille den klinisk mest akseptable faktor LX fri for trombogene bestanddeler er det nødvendig å regulere dekomponering eller aktivering av faktor LX under fremstillingsfremgangsmåten, og spesielt i tidlige stadier derav. Mangel på en løsning på dette problemet er følgelig bemerket i teknikkens stand. For eksempel er det blitt rapportert at immunoaffinitetsrenset faktor LX-produkt oppviste forurensning av bestanddeler med lavere molekylvekt (inkludert IXa) tilskrevet faktor IX-nedbrytning i utgangsmaterialet.

Under henvisning til et annet immunoaffinitetsrensesystem bemerker i tillegg H.A. Liebman et al. den samme manglende evne til å differensiere og separere faktorene IX og IXa, Blood, 62 (5), supp. 1, 288a (1983). Se også Liebman, H.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 82,3879-3883 (1985).

Immunorensesystemet til H. Bessos et al. er rapportert å ha frembrakt en faktor IX med høy spesifikk aktivitet, som ble hurtig redusert etter rensing når produktet ble plassert i en lagringsoppløsning med lav ionestyrke, Thrombosis and Haemostasis, 56 (1), 86-89 (1986). Denne reduksjonen kan ha blitt forårsaket av proteaseakti vitet.

I teknikkens stand er det også gjort forsøk på, bare med delvis suksess, å forhindre aktivering av faktor IX til faktor IXa under anvendelse av bestemte proteaseinhibitorer, hvorav mange er organiske forbindelser, vanligvis med høy toksisitet. Disse forbindelsene er egnet for forskningsanvendelse bare in vitro og er svært uønskede som reagenser i fremgangsmåter for kliniske produkter. For eksempel angis det i US patentskrift nr. 4.786.726 at immunoaffinitetskromatografi av faktor IX må finne sted i nærvær av benzamidin. For å oppnå faktor IX som er tilstrekkelig ren og stabil for dannelsen av spesifikke monoklonale antistoffer, lærer Goodall, A.H. et al. (Blood, 59 (3), 664-670 (1982)) tilsetningen av de toksiske, organiske forbindelser benzamidin og isopropylfluorfosfonat til faktor IX-holdige oppløsninger.

Foreliggende oppfinnelse vedrører stabilisering av faktor IX mot aktivering eller nedbrytning.

O ppsummering av oppfinnelsen

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en vandig løsning av delvis renset faktor IX, kjennetegnet ved at den har en forhåndsbestemt spesifikk aktivitet og inneholder én eller flere vannløselige organiske eller uorganiske salter i en konsentrasjon tilstrekkelig til å forhindre eller vesentlig minimalisere katalytisk aktivitet av proteaser på faktor IX, men som ikke tilstrekkelig til å forårsake irreversibel endring i, presipitering av, eller denaturering av faktor IX-molekylet, og hvor faktor IX-aktiviteten er omtrent 80 til omtrent 100 % av den forhåndsbestemte spesifikke aktivitet når løsningen er blitt lagret i minst omtrent 12 timer på eller under en temperatur på 4°C.

Videre er det tilveiebrakt en vandig løsning av delvis renset faktor IX kjennetegnet ved at rensingen involverer 2 eller flere sekvensielle rensetrinn, hvor rensingen omfatter tilsetting av én eller flere løselige organiske eller uorganiske salter til løsningen som inneholder faktor IX i en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å forhindre eller i det vesentlige minimalisere aktivering av, eller degradering av faktor IX, hvor tilsettingen skjer samtidig med eller etter et spesifikt rensetrinn, men hvor den totale konsentrasjon av nevnte salt eller salter ikke er tilstrekkelig til å forårsake presipitering av, irreversibel endring i, eller denaturering av faktor IX-molekylet, og bevare det delvis rensede proteinet i kontakt med nevnte saltløsning ved nevnte tilstrekkelige saltkonsentrasjon i en periode på minst inntil rett før begynnelsen av neste rensetrinn.

Som det vil bli nærmere beskrevet nedenunder, kan det brukes mange forskjellige vannoppløselige, organiske og uorganiske salter ved utøvelsen av oppfinnelsen. Foretrukne salter er vannoppløselige alkalimetall- eller jordalkali-metallsalter, helst magnesium-, kalium-, natrium- og litiumklorid, eller natriumsulfat. Det forventes at den mest utbredt brukte konsentrasjon av salt vil falle innenfor området ca. 0,4 til ca. 1,4 molar.

Med uttrykket "forutbestemt spesifikk aktivitet" menes det at den spesifikke aktiviteten (renheten) til faktor IX i vandig løsning kan justeres innen et vidt område ved å anvende ulike separasjons- og opprensingsfremgangsmåter i henhold til den tilsiktede anvendelsen av løsningen, f. eks. som et mellomprodukt eller et terapeutisk preparat.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen vedrører tilveiebirngelsen av et faktor IX-preparat som er i terapeutisk form og er stabilt ved at det er i stand til å bli lagret som en vandig oppløsning uten ødeleggelse i et langvarig tidsrom, f.eks. minst ca. 2 uker ved romtemperatur. Følgelig omfatter oppfinnelsen også et terapeutisk preparat som omfatter en vandig oppløsning av faktor IX med en spesifikk aktivitet på mer enn ca. 50 enheter faktor IX-aktivitet/mg protein, og hvor preparatet er i stand til å bli lagret i et tidsrom på ca. 2 uker ved en lagringstemperatur på opptil 15-30 °C, samtidig som det forblir fritt for faktor IX, nedbrutte former av faktor LX og/eller aktive former eller andre blodlevringsfaktorer i konsentrasjoner som ville være tilbøyelige til å forårsake påvisbare skadelige kliniske virkninger hos et menneske når preparatet administreres i en terapeutisk dose.

Viktige fordeler som fås ved oppfinnelsen, omfatter: 1) forbedring av renheten, sikkerheten og stabiliteten av faktor IX-terapeutika; og 2) innføring av fleksibilitet og økonomi i kommersielle fremstillingsmåter for faktor IX. Nok en annen fordel som fås ved oppfinnelsen, er at stabil, høyrenset faktor IX kan fremstilles uten bruk av terapeutisk uønskede og svært toksiske, organiske proteaseinhibitorer. I tillegg er egenskapene ved oppfinnelsen slik at den er bredt anvendbar for mange typer av fremgangsmåter som er blitt utviklet for fremstilling av faktor IX-preparater, inkludert dem med lav, middels eller høy renhet.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en SDS-polyakrylamidplategel som viser DEAE-konsentrater og sluttprodukter av faktor IX fremstilt fra disse ved hjelp av en typisk tidligere kjent fremgangsmåte eller ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 2 er en Western blot som oppviser DEAE-konsentrater og sluttprodukter av faktor IX fremstilt fra disse ved hjelp av en typisk tidligere kjent fremgangsmåte eller ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 3 er en Western blot som oppviser nivåene av proteolyse av faktor IX som inntrer ved 25 °C i prøver med faktor IX-holdig DEAE-konsentrat dialysert mot forskjellige molariteter av natriumklorid. Figur 4 er en Western blot som oppviser nivåer av proteolyse av faktor LX som inntrer ved 4 °C i prøver med faktor IX-holdig DEAE-konsentrat dialysert mot 0,5 molar konsentrasjoner av forskjellige salter.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på den erkjennelse at vannoppløselige, organiske og uorganiske salter kan brukes til å beskytte faktor IX mot proteolyse, inkludert aktivering til faktor LXa, under rensing av faktor IX. En av de viktige fordelene ved foreliggende oppfinnelse er at den kan brukes effektivt ved ethvert antall av forskjellige fremgangsmåter som er tilgjengelige for rensing av faktor IX. Det følger en beskrivelse av en grunnleggende fremgangsmåtetype for fremstilling av renset konsentrert faktor IX.

Fremstillingen av faktor IX for terapeutisk bruk ved behandlingen av B-hemoflli (Christmas-syke) begynner tradisjonelt med blodplasma som underkastes nedfrysing.

Dette nedfryste plasma tines så sakte, hvoretter blodlevringsfaktor VIII og visse andre proteiner kan utvinnes som et kryopresipitat. Faktor IX og andre proteiner beveger seg inn i den oppløselige supernatantfase.

Denne faktor IX-holdige plasmafraksjon underkastes så typisk adsorpsjon på en anionbytterharpiks. Etter grundig vasking av harpikspartiklene med en fortynnet saltoppløsning for å fjerne ubundet eller saltbindende proteiner, brukes vanligvis en saltoppløsning med høy molaritet til å eluere faktor IX, som samles opp i en fraksjon kjent som "protrombinkomplekskonsentratet" ettersom den også inneholder betydelige mengder av andre vitamin K-avhengige eller "protrombinkompleks"-blodlevringsfaktorer (faktorene II, VII og X, og også aktiverte former derav).

Denne faktor IX-anrikede fraksjon underkastes så vanligvis en langvarig filteroppkonsentrering og dialysefremgangsmåte som kan ta opptil 24 timer for det formål å erstatte høysaltmediet med en fysiologisk forenlig buffer med lav saltmolaritet. I tidligere tider ble denne formen av produktet brukt for terapeutiske formål. Denne lavsaltform av protrombinkomplekskonsentrat inneholdt vanligvis proteaser som altfor tidlig aktiverer faktor IX til klinisk farlig faktor IXa. Under disse omstendigheter nedbrytes også faktor LX til andre peptider som også kan være klinisk farlige. En slik proteolyse av faktor IX er særlig alvorlig når faktor IX lagres i lengre tidsrom i saltoppløsninger med lav molaritet. Det er blitt rapportert dødsfall fra administreringen av denne produkttype, Plat, P.M. et al., Annals of Internal Medicine, 81,766-770(1974).

I et forsøk på å forbedre den klinisk passende renhet av protrombinkomplekskonsentrat har forskere modifisert en grunnleggende prosess som er beskrevet ovenfor, f.eks. ved å tilsette forskjellige ytterligere trinn eller separasjons-prosedyrer, eller ved å ta i bruk alternative strategier for å forhindre proteolyse av faktor IX og for å fjerne ytterligere forurensninger. Nyere fremgangsmåter er vanligvis en variasjon av det følgende: 1) kryoutfelling; 2) anionbytter som gjør bruk av den felles spesifikke adsorberbarhet til vitamin K-avhengige blodlevringsfaktorer; og 3) en ytterligere separasjonsfremgangsmåte som skiller faktor IX fra andre protrombinkompleksproteiner.

Eksempler på slike ytterligere separasjonsfremgangsmåter omfatter bruken av kromatografi på en agarosegel hvortil heparingrupper er blitt festet, kationbytting på en sulfatert dekstrangel eller immunoaffinitetskromatografi hvor den stasjonære fase i separasjonssystemet (rensing) består av faktor IX-spesifikke antistoffer.

En annen strategi omfatter bruk av ammoniumsul fat fraksjonering og/eller eluering av faktor IX fra et adsorpsjonskompleks dannet fra utfelte bariumsalter, etterfulgt av anionbytterkromatografi. Selektiv adsorpsjon til en gel av aluminium-hydroksid er også blitt benyttet. Nok en annen strategi omfatter bruken av en ytterligere anionbytterharpiks som bevirker separasjon av protrombinkompleksproteiner som ikke ble fraskilt når de tidligere ble brakt i kontakt med en annen type ani onbytterharpiks.

Nok en annen fremgangsmåte er å anvende helplasma eller kryopresipitatfritt plasma direkte til en faktor IX-spesifikk immunoafifnitetskromatograifharpiks som er til stede i satsvis eller kolonneform.

Tilgjengelige fremgangsmåter for rensing av faktor IX, slik som dem som er beskrevet ovenfor, omfatter separasjonsprosesser og -manipulasjoner. Uttrykket "separasjonsprosess" henviser slik det her er brukt, til et trinn som omfatter å skille faktor IX fra ett eller flere andre peptider (proteiner) i blanding med den. Uttrykket "manipulasjon" henviser slik det her er brukt, til et trinn som ikke påvirker separasjon av faktor IX fra andre peptider (proteiner), men som utøves før eller etter en separasjonsprosess. Eksempler på manipulasjoner er dialyse, sterilfiltrering, varmesteirlisering for å inaktivere forurensende mikroorganismer eller viruspartikler i faktor IX-oppløsninger, og også diafiltrering hvor faktor IX selektivt holdes tilbake mot en selektivt permeabel membran mens oppløsningsmidlet hvor faktor IX er oppslemmet, filtreres gjennom og erstattes.

Når en separasjonsprosess eller en manipulasjon ifølge teknikkens stand krever bruk av et salt, utføres den rutinemessig under anvendelse av en lavmolaritets-saltoppløsning (generelt 0,15 M), bortsett fra når egenskapene ved fremgangsmåten eller manipulasjonen krever at den utføres ved bruk av en høy saltkonsentrasjon. I det sistnevnte tilfellet er det vanlig å senke saltkonsentrasjonen med en gang etter at trinnet som omfatter bruk av salt er fullført, og uten å lagre faktor IX. Eksempler på manipulasjoner hvor en høy saltkonsentrasjon som ikke er ment for å beskytte faktor IX mot proteolyse, fjernes med en gang etter trinnet som omfatter bruk av salt, omfatter 1) eluering av faktor IX fra en kromatografikolonne under anvendelse av en høysaltbuffer, og så fjerning av saltet ved fremgangsmåter slik som dialyse, eller ved nedfrysing og lyofilisering av eluatet, hvorved saltet fjernes ved fordamping, eller 2) oppvarming av en faktor IX-holdig oppløsning for å inaktivere mikroorganismer eller virus. I løpet av utviklingen av denne oppfinnelsen er det blitt erkjent at reduksjon av konsentrasjonen av organisk eller uorganisk salt i en faktor IX-holdig oppløsning under eller etter fullførelse av en separasjons- eller manipulasjonsfremgangsmåte gir en viktig mulighet for aktivering av faktor IX til faktor IX,, eller for nedbrytning av faktor IX til andre faktor IX-avledede peptider. Det antas at det er to generelle grunner til at betydningen av proteolyse av faktor IX og resulterende fremstilling av faktor IXa i lavsaltmiljøer ikke er blitt erkjent innen teknikken.

For det første virker saltoppløsninger med høy molaritet inn på visse typer av separasjonsprosesser. For eksempel ville høye konsentrasjoner av salter forhindre binding av faktor IX til visse ionebytterharpikser eller immunoaf-finitetskolonner. Ingen separasjon kunne utføres.

For det andre kan faktor IX-holdige saltoppløsninger med høy molaritet ikke sprøytes inn i pasienter ettersom de er osmotisk uforenlige med levende vev. Som et resultat av dette anser teknikkens stand "overskudd" salt som noe som bør fjernes fra et faktor IX-preparat ved første anledning.

Bruken av salter ved forholdsvis høye konsentrasjoner i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse muliggjør beskyttelse av faktor IX ikke bare under manipulasjoner mellom eller etter separasjonsprosesser, men under selve separasj onsprosessene.

De følgende publikasjoner beskriver eksempler på faktor IX-rensinger som kan modifiseres i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse for det formål å fremstille et terapeutisk materiale med høy renhet og forbedret sikkerhet og stabilitet. Ved én eksempelvis utførelsesform av slike modifikasjoner er det inkludert og opprettholdt i den urene faktor IX-oppløsning et oppløselig stoff (f.eks. kaliumklorid) ved en forholdsvis høy konsentrasjon, f.eks. på minst ca. 0,5 molar.

(A) I US patentskrift nr. 4.447.416 beskrives en fremgangsmåte for rensing av faktor IX under benyttelse av en anionbytterharpiks i en saltoppløsning med lav

molaritet ved trinnene med klaring og oppkonsentrering, ved hjelp av filtrering ved lav saltkonsentrasjon. Etter ytterligere rensing på en sul fa tert dekstrankationbytterharpiks dialyseres oppløsningen mot en

saltoppløsning med lav molaritet.

(B) I Michalski et al., Vox Sang, 55, 202-210 (1988), beskrives et faktor IX-produkt renset ved hjelp av tradisjonell anionbytterkromatografi og den etter-følgende bruk av en heparinbundet harpiks. Det er involvert et stort antall fremgangsmåter med lav ionestyrke, slik som eluering fra anionbytter-harpiksen med NaCl-buffer, fortynning før binding til den heparinbelagte

harpiks og eluering fra den.

(C) Miletich, J.P. et al. i Methods in Enzymology, 80,221-228 (1981), beskriver et faktor IX-produkt utvunnet fra på hverandre følgende trinn med

bariumsitratadsorpsjon, arnmoniumsulfatfraksjonering, ionebytterkromatografi og dekstransulfatkromatografi (og elueringer fra disse) som plasserer faktor IX-fraksjoner med mellomliggende renhet i lengre tidsrom i oppløsninger med lave konsentrasjoner av salter. Ingen faktor

IXa-analyser eller evalueringer av trombogenisitet rapporteres.

(D) I Bajaj, S.P. et al., Preparative Biochemistry, 11 (4), 397-412 (1981), rapporteres et faktor IX-preparat utvunnet fra en teknikk som omfatter fire på hverandre

følgende separasjonsfremgangsmåter som omfatter bruken av barium-sirratadsorpsjon og eluering, arnmoniumsulfatfraksjonering, DEAE-"Sephadex"-kromatografi og heparin-agarosekromatografi. Urenset faktor IX og faktor IX med mellomliggende renhet holdes i sal-toppløsninger med lav molaritet i betydelige tidsrom under og mellom hver separasjonsfremgangsmåte. Ingen enzymatiske analyser med hensyn

på faktor IXa eller evalueringer av trombogenisitet rapporteres.

(E) I US patentskrift nr. 4.786.726 beskrives flertrinns rensing av faktor IX, som omfatter bruken av bariumsaltutfelling, anionbytterkromatografi, ammoniumsulfatutfelling og dekstransulfatkromatografi før videre rensing på en immunoaffinitetskolonne. Faktor IX manipuleres med flere langvarige dialyseperioder mot faktor IX-ikke-beskyttende saltopp-løsninger ved lav molaritet. (F) I Goodall, A.H. et al., Blood, 59 (3), 664-670 (1982), i en fremgangsmåte som er representativ for immunoaffinitetsmetoder, beskrives bruken av monoklonale antistoffer for å rense faktor IX som er til stede i et protrombinkomplekskonsentrat som utgangsmateriale, idet konsentratet er blitt fremstilt ved hjelp av standardmetoder uten hensyn til beskyttelse av faktor IX mot aktivering eller nedbrytning i tidlige stadier.

Selv om kolonner med monoklonalt antistoff har høy spesifisitet for faktor IX og brukes effektivt for å fjerne andre forurensende koagulasjonsfaktorer, antas det at det for tiden ikke er tilgjengelig en antistoffaffinitetsrensestrategi som kan binde faktor IX og avvise faktor IXa (eller omvendt) (Smith, K.J. et al., Thrombosis Research, 33, 211-224 (1984)). I Tharakan, J. et al., Vox. Sang., 58,21-29 (1990), er det beskrevet et immunoaffinitetsrenset faktor IX-produkt med høy spesifikk aktivitet, som ikke desto mindre er forurenset med faktor IX-nedbrytningsprodukter avledet fra tradisjonelt fremstilt protrombinkompleks som utgangsmateriale.

Ekspresjon av human blodlevringsfaktor IX fra rekombinante DNA-kloner er tidligere blitt demonstrert i pattedyrceller, Anson, D.S. et al., Nature, 315, 683-685 (1985), Jallat, S. et al., EMBO Journal, 9 (10), 3295-3301 (1990). Rensing av slik faktor IX omfatter generelt oppsamling av en celleekstrakt og så å underkaste ekstrakten én eller flere av de ovenfor nevnte separasjonsfremgangsmåter. Beskyttelse av faktor IX under rensing mot endogene celleproteaser kan utføres ved å maksimalisere den tiden som faktor IX-holdige fraksjoner holdes i kontakt med forholdsvis høye konsentrasjoner av ett eller flere av de organiske eller uorganiske salter, i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.

Det skal forstås at en bestemt separasjonsfremgangsmåte eller - manipulasjon brukt ved rensing av faktor IX kan bli skadelig påvirket ved bruk av en forholdsvis høy saltkonsentrasjon, slik det her er ment. Dersom dette er tilfellet, bør bruken av den forholdsvis høye saltkonsentrasjon selvsagt unngås for den bestemte separasjonsfremgangsmåte eller -manipulasjon, idet det skal forstås at slik høy saltkonsentrasjon kan brukes effektivt i andre rense- eller ledsagende trinn som ikke påvirkes uheldig, og ved lagring av den delvis rensede faktor IX-oppløsning. Ett aspekt kan således beskrives som erkjennelsen av at proteaseindusert skade på faktor IX som kan inntre i oppløsninger som inneholder lave konsentrasjoner av salter, kan reduseres vesentlig ved på nytt å utforme rensefremgangsmåten for å maksimalisere mengden av tid som faktor IX-fraksjoner som er urenset eller har middels renhet, holdes i et forholdsvis høyt saltmiljø under benyttelse av ett eller flere oppløselige salter ifølge foreliggende oppfinnelse.

Mange forskjellige typer av salter kan brukes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Én mulig virkningsmekanisme er at effektive salter virker ved å modifisere energetikken ved katalyse av relevante proteaser. Det effektive salt kan virke ved å destabilisere proteaser, ved å stabilisere strukturen til faktor IX, ved reversibelt å endre strukturen til faktor IX slik at den ikke presenterer for noen bestemt protease de strukturelle trekkene som normalt angripes, ved å øke aktiveringsenergien som er nødvendig for å posisjonere og/eller spalte faktor IX i et proteaseaktivt sete, eller ved enhver kombinasjon av det ovenfor nevnte. Ettersom de spesifikke egenskapene til alt blodplasmaet eller andre proteaser som kan spalte faktor IX er ukjent, er det vanskelig å identifisere de bestemte mekanismene hvorved hver av de anvendbare proteolyseinhibitorer virker. Det postuleres at faktor IX-molekylet er sterkt resistent overfor signifikant irreversible endringer i dets tertiærstruktur, forårsaket av oppløselige, uorganiske eller organiske salter.

Det bemerkes at det er mange andre årsaker til denatureringen av proteiner (med resulterende tap av katalytisk aktivitet eller oppløsning av tredimensjonal struktur) under separasjons- eller manipulasjonsprosedyrer eller under lagring i oppløsning. Eksempler på fremgangsmåter som er kjent for å denaturere, bryte opp eller på annen måte påvirke proteiner i oppløsning, omfatter skjærkraft, binding til overflaten av en beholder, slik som en glassvegg, skumming av en oppløsning og oksidasjon av cysteinrester ved hjelp av atmosfæreoksygen. Saltoppløsningene som kan anvendes ved utøvelsen av denne oppfinnelsen, kan være effektive også når det gjelder å stanse disse andre potensielle årsaker til faktor IX-nedbrytning.

Ved utøvelsen av oppfinnelsen kan det brukes ethvert vannoppløselig, uorganisk eller vannoppløselig, organisk salt som er i stand til å redusere protease-forårsaket spalting av koagulasjonsfaktor IX ved en saltkonsentrasjon som ikke irreversibelt endrer faktor IX-strukturen eller får faktor IX til å utfelles. Saltene omfatter en positivt ladet kationisk komponent og en negativt ladet anionisk komponent som i vandige medier dissosieres til ioneform. Uttrykket "organisk salt" henviser til et salt hvor enten den kationiske eller anioniske komponent er et karbonholdig stoff.

Eksempler på vannoppløselige, uorganiske og organiske salter for bruk som inhibitorer til proteaser som aktiverer eller nedbryter faktor IX, er: ammonium-, alkalimetall- eller jordalkalimetallhalogenider; ammonium-, alkalimetall- eller jordalkalimetalltiocyanater; ammonium- eller alkalimetallfosfater eller -sulfater; magnesiumsulfat eller -fosfat; acetater av jordalkali- eller alkalimetallene; alkylammoniumhalogenider, inkludert kvaternære ammoniumhalogenider; og klorider av imidazol, lysin og trihydroksyaminometylmetan ("tris").

Foretrukne salter for anvendelse ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse er natriumklorid; natrium- og kaliumtiocyanater; magnesium-, kalium- og litiumklorider; og natriumsulfat, idet de mest foretrukne salter er natriumklorid og natriumsulfat.

Effektive konsentrasjoner av salter for anvendelse ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse kan variere, avhengig av det bestemte salt som brukes. Den nedre konsentrasjonsgrense styres av hvor mye av saltet som trengs for å inhibere faktor IX-nedbrytning og -aktivering. Den øvre grense styres av den mengde som på skadelig måte kan påvirke faktor IX, og/eller hvor proporsjonale fordeler ikke realiseres etter hvert som mengden av salt økes. Så snart prinsippet for beskyttelse av faktor IX-molekylet mot nedbrytning eller proteolyse er erkjent slik det her er beskrevet, oppnås bestemmelse av optimale saltkonsentrasjoner lett ved hjelp av enkle inkubasjonsforsøk slik det her er beskrevet.

Det skal også forstås at det er faktorer som påvirker det området av konsentrasjoner hvor et bestemt salt er effektivt. Slike faktorer omfatter det tidsrommet eller den temperaturen som det ønskes beskyttende effekter for, konsentrasjonen av makromolekyler, inkludert proteaser, som er til stede i prøven, og egenskapene til manipulasjonen, separasjonsprosessen og/eller lagringsbetingelsene hvorunder beskyttelse søkes. Disse faktorene, koblet med den iboende evne til det bestemte salt når det gjelder å endre proteolyseenergetikken, bør tas i betraktning ved

valg av effektive konsentrasjoner.

For de fleste anvendelser antas det, avhengig av det bestemte salt som brukes, at det vil være tilfredsstillende å bruke en saltkonsentrasjon på ca. 0,4 til ca. 1,4 molar.

Det bør forstås at en høyere saltkonsentrasjon kan brukes. Salter, slik som f.eks. magnesium-, kalium- og litiumklorid, og natriumsulfat, er effektive ved den nedre ende av mengdeområdet. Disse saltene er særlig anvendbare ettersom faktor IX-beskyttende virkninger kan realiseres ved saltkonsentrasjoner som det er mindre sannsynlig vil virke inn på separasjonsfremgangsmåter, slik som dem som omfatter tilførsel og binding av faktor IX til en affinitetskolonne eller ionebytterharpiks. Faktor IX kan derfor beskyttes kontinuerlig gjennom en flertrinns rensefremgangsmåte. Det er andre salter som vil trenges å bli brukt ved den øvre ende av området, f.eks. ved konsentrasjon på minst ca. 0,7 molar. Et foretrukket mengdeområde for de ovenfor nevnte foretrukne og mest foretrukne salter er ca. 0,35 til ca. 3 molar, avhengig av det bestemte salt som brukes.

Når det gjelder den relative effektivitet av forskjellige typer salter, ble i én serie av tester 1 molar konsentrasjoner av organiske salter, slik som hydrokloridene av tris, lysin og imidazol, og natriumacetat, funnet å oppvise faktor IX-stabiliserende virkninger som er lavere enn virkningene av 1 M konsentrasjon av NaCl. Slike organiske saltoppløsninger er imidlertid beskyttende sammenlignet med 0,15 M NaCl.

Et viktig aspekt er at en fraksjon av faktor IX med middels renhet og høyt saltinnhold som er blitt delvis renset ved ionebytterkromatografi eller en annen separasjonsprosess, men som fortsatt ikke har vært underkastet immunoaffinitetskromatografi eller annen separasjonsprosess, kan lagres effektivt i lengre tider, f.eks. minst ca. 12 timer ved 4 °C eller minst ca. 3 måneder når den ble lagret nedfryst. Ved slik lagring inhiberes nedbrytning eller aktivering av faktor IX i kraft av bruken sammen med faktor IX av en forholdsvis høy konsentrasjon av salt, slik det her er beskrevet. Dette tjener som et klinisk viktig alternativ til lagring av slike fraksjoner i nærvær av toksiske, organiske proteaseinhibitorer som kan være svært vanskelige å fjerne fra sluttproduktet. Det er et stort antall bearbeidingsfordeler forbundet med å være i stand til å lagre fraksjoner av faktor IX med middels renhet under rensingen.

Selv faktor IX-produkter med den høyeste renhet kan inneholde spor av et stort antall proteaser som til sist vil bryte ned eller aktivere faktor IX, spesielt dersom produktet, selv ved lav temperatur, underkastes langvarig lagring i flytende form. Som et alternativ til lyofilisering eller nedfrysing, kan salter tilsettes til rensede faktor IX-produkter for å muliggjøre langvarig lagring i flytende form. For det formål å tilveiebringe en terapeutisk form av preparatet med faktor IX, bør konsentrasjonen av saltet i preparatet reduseres til et klinisk akseptabelt nivå, f.eks. til ca. 0,15 M eller lavere. Dette kan utføres ved slike fremgangsmåter som dialyse, eller ved diafiltrering før produktet distribueres til en behandlingsinstitusjon eller en pasient.

Den rensede, terapeutiske form av faktor IX-preparater som fås fra utøvelsen av oppfinnelsen, forventes ikke å utløse uønskede kliniske konsekvenser (slik som myokardialinfarkt, trombose og disseminert intravaskulær koagulasjon), som ellers kan fås ved administrering av for tiden tilgjengelige faktor IX-produkter. Eksempelavsnittet nedenunder gir data som underbygger den økte sikkerhet av faktor IX fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det følger en beskrivelse av en foretrukket total rensing av faktor IX for bruk ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse.

Ved den foretrukne rensing benyttes kryoutfelling av blodplasma for å fjerne protein, slik som faktor VIII, etterfulgt av anionbytterkromatografi som drar nytte av den bestemte adsorberbarhet av vitamin K-avhengige blodlevringsfaktorer, etterfulgt av immunoaffinitetskromatografi under anvendelse av monoklonale antistoffer, idet den sistnevnte separasjonsprosess har høy spesifisitet for faktor IX sammenlignet med andre proteinarter.

Den foretrukne anionbytterharpiks for rensing av faktor IX er en svært hydrofil kuleformet gel av epiklorhydrinkryssbundet dekstran hvortil dietylamino-etyleter(DEAE)-byttergrupper er festet, slik som DEAE-"Sephadex" A-50 tilgjengelig fra Pharmacia, Uppsala, Sverige. Temperaturen holdes under 15 °C og fortrinnsvis under 4 °C, under "Sephadex"-adsorpsjonsekvilibreringsprosessen. Selv om faktor IX bindes hurtigere og mer fullstendig ved 20 °C enn ved 4 °C til DEAE-"Sephadex" A-50, er det anbefalt at temperaturen er så lav som mulig for å minimalisere proteaseaktivitet på faktor IX. Adsorpsjon av faktor IX ved 4 °C er følgelig foretrukket. Faktor IXa minimaliseres også som en forurensning i sluttproduktet ved å holde faktor IX-fraksjoner (inntil den tid de er blitt skilt fra gjenværende forurensende proteaser på en kolonne med monoklonalt antistoff) i et lavtemperaturmiljø (slik som 4 °C eller lavere) i saltoppløsninger med forholdsvis høy molaritet, ifølge foreliggende oppfinnelse.

Proteolyse av faktor IX i anionbytterkromatografieluatene forhindres ved å holde proteinet i nærvær av ett eller flere egnede organiske eller uorganiske salter ved forholdsvis høy molaritet, inntil umiddelbart før de faktor IX-anrikede fraksjoner underkastes den ytterligere separasjonsrfemgangsmåte med immunoaffinitetskromatografi under anvendelse av monoklonale antistoffer, som anvendes for å skille faktor IX fra gjenværende koagulasjonsfaktorer og andre proteiner.

I forbindelse med evaluering av renheten av faktor IX-preparater som er i stand til å bli fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, må to parametrer, proteinkonsentrasjon og spesifikk aktivitet, bestemmes.

Målinger som bestemmer proteinkonsentrasjonene i prøver av faktor IX varierer, avhengig av den nøyaktige metode som brukes. Ved utøvelsen av denne oppfinnelsen bestemmes konsentrasjonen av protein i faktor IX-prøver ved 280 nm basert på en ekstinksjonskoeffisient for en 10 mg/ml oppløsning av ren faktor IX på 13,7 enheter i et 1 cm spor. Korreksjoner for Rayleigh-spredning gjøres ved å følge fremgangsmåtene til Bloom, J.W. et al., Biochemistry, 18,4419-4425 (1979). Se også Shapiro, S.S. et al., Thromb. Diath. Haemorr., 16,469 (1966).

Mange analysefremgangsmåter er blitt rapportert innen teknikken for evaluering av den spesifikke aktivitet (enheter av faktor IX-aktivitet/mg protein) til faktor IX-preparater. Slike analysefremgangsmåter gjør ofte ikke korreksjoner for forurensning av faktor IX-prøven med faktor IXa. Som et resultat av dette er det vanskelig å evaluere renheten og sikkerheten til faktor IX-terapeutika fremstilt ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter og/eller analysert i henhold til forskjellige fremgangsmåter.

Noen av analysene som for tiden brukes, omfatter en totrinns blodlevringsanalyse (Liebman, H.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 82, 3879-3883

(1985)); en analyse basert på den ettrinnsaktiverte, partielle tromboplastintid ("APTT"), Smith, K.J. et al., Blood, 72, 1269-1277 (1988); og analyser som er modifikasjoner av APTT-testen, f.eks. Jenny, R. et al., Preparative Biochemistry, 16, 227-245 (1986). Analyser basert på antigen styrke av faktor IX er også blitt foreslått som et mål for renhet (Smith, K.J. et al., Thromb. Haemostas., 58,349 (1987)).

For formålet ved foreliggende oppfinnelse analyseres den spesifikke aktivitet til faktor IX-preparater i henhold til den ettrinnsaktiverte, partielle tromboplastintid-fremgangsmåte "APTT" til Smith, K.J. et al., Blood, 72,1269-1277

(1988).

Ved analyser ifølge teknikkens stand har mange forskere brukt som en faktor IX-standard humanplasmaprøver som er tildelt en forventet styrke på 1,0 enhet/ml. Det må imidlertid understrekes at normal humanplasma ofte inneholder en faktor IX-konsentrasjon som er betydelig forskjellig fra 1,0 enhet/ml. For de foreliggende formål henvises det til International Reference Standard of faktor IX, WHO nr. 1, som kan fås fra World Health Organization.

Litteraturverdier for den spesifikke aktivitet til renset faktor IX er blitt funnet å variere fra 130 til 220 enheter/mg. Forskjeller i fremgangsmåter for protein-bestemmelse, analyseteknikk og kalibreringsstandarder er sannsynligvis skyld i de rapporterte forskjeller. Det vises til Smith, KJ. et al., Blood, 72, 1269-1277 (1988)

(134-155 enheter/mg); Bajaj, S.P. et al., Preparative Biochemistry, 11 (4), 397-412

(1981) (180-220 enheter/mg); Osterud, B. et al., J. Biol. Chem., 253 (17), 5946-5951

(1978) (207 enheter/mg); Jenny, R. et al., Preparative Biochemistry, 16, 227-245

(1986) (132 enheter/mg).

Sammenligning av resultater fra forskjellige laboratoiregrupper som benytter forskjellige fremgangsmåter for å analysere faktor IXa, er også svært vanskelig. Det er særlig viktig ettersom faktor IX og faktor IXa hver kan virke inn på analyser utformet for å påvise den andre. Et tilleggsbidrag forbundet med utviklingen av denne oppfinnelsen omfatter tilveiebirngelsen av en høysensitivitetsanalyse for faktor IXa basert på den partielle tromboplastintest ("PTT"). Analysen som her er rapportert, påvirkes ikke av tilstedeværelsen av faktor IX, og som vist i eksempelavsnittet nedenunder, underbygger den utnyttbarheten av fremgangsmåtene for stabilisering av faktor IX ifølge foreliggende oppfinnelse.

Terapeutiske preparater som inneholder faktor IX, og som kan anvendes ved behandlingen av Christmas-syke, vil ha en forhåndsbestemt, spesifikk aktivitet som da ikke behøver å være omfattet av faktor IX ved den absolutte grense for spesifikk aktivitet så lenge gjenværende proteinforurensninger ikke vil forårsake påvisbare skadelige kliniske effekter på mennesker når slike preparater administreres i ellers terapeutiske doser. Som vist i eksempelavsnittet nedenunder, kan rensefremgangsmåten ifølge eksempel 1 brukes til å fremstille faktor IX for terapeutisk anvendelse med en spesifikk aktivitet på minst 194 enheter/mg protein med et faktor IXa-forurensningsnivå på mindre enn 0,02 % (vekt/vekt). Faktor IX-preparater egnet for injeksjon i en pasient kan fremstilles f.eks. ved rekondisjonering med et farmakologisk akseptabelt fortynningsmiddel av en lyofilisert prøve som omfatter renset faktor IX og stabiliserende salter.

Blant teknikkene som kan brukes til å vise renheten til den resulterende faktor IX, og minimaliseringen av forurensende faktor IXa eller faktor IX-nedbrytningspeptider i de terapeutiske preparatene, er natriumdodecylsulfatpolyakryl-amidgelelektroforese (SDS-PAGE), Western "blotting" av elektroforesebehandlede faktor IX-holdige prøver og direkte enzymatiske analyser renset på faktor IX og faktor

IX*.

Ved utøvelsen av denne oppfinnelsen, og på grunn av vanskelighetene med å korrelere analyser in vitro med trombogene hendelser in vivo, evalueres den potensielle trombogenisitet til preparater av renset faktor IX ved å bruke (1) Wessler Rabbit Stasis Assay, (2) SDS-PAGE og "Western blots" for å bestemme mengden av peptid(er) med en omtrentlig molekylvekt på 54 kDa, og (3) en ny, modifisert form av APTT-analysen for å bestemme nivået av faktor IXa eller av andre peptider som forårsaker IXa-lignende aktiviteter. Det antas at den for tiden beste tilgjengelige indikator på sikkerhet ved preparater av terapeutisk faktor IX tilveiebringes når prøven har en lav respons i kaninstasetesten, inneholder (ved SDS-PAGE) mindre enn 10 % 54 kDa-materiale og gir ytterligere indikasjon på et lavt innhold av faktor IXa målt ved

en modifisert (se eksempel 3) APTT-test.

Eksempler

De følgende eksempler illustrerer utøvelsen av oppfinnelsen.

Eksempel 1

Rensing av faktor IX

Dette eksemplet viser rensingen av preparative mengder av terapeutisk anvendbar faktor IX fra blodplasma under benyttelse av høye konsentrasjoner av natriumklorid ved bestemte trinn for å forhindre proteolytisk skade på faktor IX.

En kommersiell fremstillingsmengde av nedfryst plasma fikk tine sakte ved ca. 0 °C, hvorved man fikk supernatant og utfelte fraksjoner (se Pool, J.G. et al., Nature, 203,312 (1964)). Supernatantfraksjonen av plasmaet som blir tilbake etter kryoutfelling, inneholder faktor IX og mye av de opprinnelige konsentrasjoner av faktorene II, VII og X. Til supernatantplasmafraksjonen ved ca. 4 °C ble det tilsatt DEAE-"Sephadex" A-50 anionbytterkuler (ca. 1,5 g/l supernatant). Den resulterende suspensjon ble forsiktig omrørt i 1 time under avkjøling mens faktor IX bandt seg til harpikskulene. Omtrent 96 vekt% av den opprinnelig tilstedeværende faktor IX i plasmaet ble lokalisert på harpikskulene. Andre protrombinkompleksproteiner bandt seg også. Harpikskulene med tilbakeholdt protein ble samlet opp ved filtrering og så vasket med et volum vaskebuffer, foravkjølt til ca. 4 °C, som var minst likt med volumet av den kryopresipitatfrie supernatant. Vaskebufferen omfattet en oppløsning av 0,2 M NaCl, 0,01 M Na3-sitrat, pH 7,0, og 0,04 enheter/ml natriumheparin. Ionestyrken til vaskebufferen var utilstrekkelig til å forårsake signifikant dissosiering av faktor IX fra "Sephadex"-kuler. Elueringsbuffer (en vandig oppløsning av 2 M NaCl med 10 mM natriumsitrat, pH 7,0, og foravkjølt til ca. 4 °C) ble tilsatt og så forsiktig omrørt med harpikskulene i 30 minutter. Det resulterende eluat ble samlet opp og oppbevart eller bearbeidet videre. Eluering av harpikskulene kan gjentas og eluatene slås sammen. Temperaturkontroll ble holdt ved mellom 2 og 8 °C i hvert av trinnene med DEAE-"Sephadex"-bindingen og elueringsfremgangsmåten.

Elueringen av faktor IX-anriket fraksjon (protrombinkompleks) fra DEAE-"Sephadex"-harpiksen med en oppløsning av 2 M NaCl bufret med 10 mM natriumsitrat, resulterte i en kombinert eluatfraksjon med en endelig NaCl-molaritet (på grunn av den lavere ionestyrke til hulromvolumoppløsningen) på omtrent 1,0 molar.

Når det først var klaret og sterilfiltrert, ble det kombinerte eluat (den "stabile faktor IX-anrikede fraksjon" ifølge oppfinnelsen) lagret nedfryst ved eller under -40 °C før etterfølgende bearbeiding. Lagring i den nedfryste tilstand ved eller under -40 °C i 4 uker eller mindre påvirker ikke nyttigheten av prøvene som inneholder faktor IX. Som et resultat av stabiliserende innflytelse av saltene som kan anvendes ved utøvelsen av oppfinnelsen, resulterer lagring i kommersielt praktiserbare tidsrom i preparater av faktor IX med middels renhet, og som har mindre enn 10 % tap

av styrke, og som oppviser liten eller ingen aktivering eller nedbrytning. Dette ville

. ikke være tilfelle dersom lagring ble utført i en buffer som inneholder et salt med lavere molaritet, slik som 0,15 M NaCl, selv med -40 °C.

Alternativt ble den stabile faktor IX-anrikede fraksjon lagret ved 4 °C i opptil 12 timer før den ble bearbeidet videre. Denne fremgangsmåten er i motstrid med fremgangsmåter ifølge teknikkens stand, hvor det læres at eluatet bør dialyseres eller diafiltreres grundig mot en buffer med lav saltkonsentrasjon før ytterligere rensing eller klinisk bruk.

Umiddelbart før tilførsel av den "stabile faktor LX-anrikede fraksjon" til en affinitetskolonne med monoklonalt antistoff fortynnes den 1:1 med vann, noe som reduserer natriumkloridkonsentrasjonen i preparatet til 0,5 molar. Den faktor IX-holdige protrombinkompleksoppløsning helles på en kolonne med monoklonalt antistoff, vaskes grundig og elueres med 3 M natriumtiocyanat. Testing av eluatet med hensyn på nedbrutt faktor IX eller med hensyn på faktor IXa viser at de er til stede ved svært lave nivåer, noe som muliggjør fullførelse av fraksjoneringen.

Fremstilling og benyttelse av monoklonale antistoffer for immunoaffinitetskromatografi av den stabile faktor IX-anrikede fraksjon følger godt etablerte fremgangsmåter. Rensing av faktor IX som er tilstrekkelig ren for fremstillingen av monoklonale antistoffer, fulgte fremgangsmåten til Osterud, B. et al., J. Biol. Chem., 253 (17), 5946-5951 (1978). Milter fra mus som på forhånd var blitt injisert med høyrenset faktor IX, ble fjernet og celler fra disse fusjonert i henhold til en standardfremgangsmåte, Brown, J.P. et al., J. Biol. Chem., 225,4980-4983 (1980). Detaljer vedrørende fremstilling og drift av immunoadsorbantsystemet er som beskrevet i beskrivelsen til "Immunoadsorbent, and Method of Recovering Vitamin-K Dependent Protein Therewith", EP patentsøknad nr. 84-301162.8, bevilget 12. september 1984 med nr. 0 118 256.

Faktor IX ble eluert fra kolonnen med monoklonalt antistoff i en oppløsning av 3 M natriumtiocyanat, 50 mM tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, og så diafiltrert mot 50 mM NaCl, 5 mM histidin, pH 7,0. Den diafiltrerte oppløsning av faktor IX ble så underkastet ultrafiltrering mot en YMIOO-membran (Amicon Co., Danvers, MA) med en molekylvektgrense for kuleformede proteiner på 100 kDa, slik at faktor IX fikk passere gjennom membranen med tilbakeholdelse av viruspartikler. Det faktor IX-holdige filtrat ble samlet opp og så underkastet filterkonsentrering mot en membran egnet for å holde tilbake kuleformede proteiner med molekylvekter som er større enn 10 kDa. Den rensede faktor IX-oppløsning ble så nedfryst og lagret ved - 70 °C før endelig bearbeiding, idet en kommersiell produksjonsplan ble tilpasset. Den rensede faktor LX-oppløsning ble til sist underkastet kromatografi på en kuleformet agarosegel inneholdende positivt ladete aminoheksylgrupper (AH "Sepharose" 4B, Pharmacia, Uppsala, Sverige). Agarosegelkromatografien gav i virkeligheten ingen ytterligere forbedring av renhet av faktor IX når det gjelder andre koagulasjonsfaktorer, men tjener til å konsentrere faktor IX og fjerne spornivåer av faktor IX-antistoff som kan ha sluppet ut fra kolonnen med monoklonalt antistoff. Andre kommersielt tilgjengelige geler kan også brukes.

Etter at faktor IX hadde fått bindes til agarosegelkulene, ble gelen vasket med 0,15 M NaCl, 10 mM histidin-HCl, 5 mM lysin-HCl, pH 7,0. Faktor IX ble eluert fra gelen med en oppløsning av 0,05 M CaCb, 0,15 M NaCl, 10 mM histidin-HCl, pH 7,0. Eluatet ble så diafiltrert mot 66 mM NaCl, 10 mM histidin-HCl, 3 %

(vekt/volum) mannitol, pH 7,0, klaret, sterilfiltrert og lagret ved -40 °C eller lavere. Alternativt kan den filtrerte oppløsning frysetørkes. Det resulterende materiale er det "forbedrede faktor LX-sluttprodukt" ifølge oppfinnelsen og har en spesifikk aktivitet som i gjennomsnitt er 180-200 enheter aktivitet/mg protein.

Eksempel 2

En sammenligning med tidligere kjente produkter

Innen teknikkens stand er det beskrevet at protrombinkomplekskonsentrat i omtrent 1 M-2 M NaCl bør underkastes langvarige manipulasjoner, slik som dialyse, som kanskje tar 24 timer, for å redusere saltkonsentrasjonen i det faktor IX-holdige isolat til det fysiologiske området (ca. 0,15 molar) for klinisk bruk, eller før ytterligere rensing under betingelser med lav ionestyrke.

En sammenligning ble gjort mellom det klarede, filtrerte protrombinkomplekskonsentrat holdt i en 1,0 M NaCl-oppløsning inneholdende også 10 mM natriumsitrat, pH 7,0 ("den stabile faktor IX-anrikede fraksjon" ifølge eksempel 1) og et DEAE-"Sephadex"-anionbytterkromatografieluat av tidligere kjent type (et protrombinkomplekskonsentrat), som ifølge standardpraksis ble underkastet dialyse eller diafiltrering for å redusere dets saltkonsentrasjon til det fysiologiske området. Begge typer av eluatfraksjoner ble så underkastet ytterligere rensing under anvendelse av monoklonale antistoffer som beskrevet ovenfor, noe som resulterte i et "forbedret faktor IX-sluttprodukt" og et typisk tidligere kjent sluttprodukt.

Tabell 1 viser renhetsresultater for det endelige faktor IX-produkt ifølge eksempel 1 og typisk sluttprodukt fra tidligere kjent fremgangsmåte. Som det kan ses av tabellen, oppviser enkeltstående mengder av "forbedret faktor IX-sluttprodukt" avledet fra "stabil faktor IX-anriket fraksjon" mye mindre forurensning med faktor IXa enn sluttprodukt avledet fra DEAE-"Sephadex"-anionbyttereluater, som i overensstemmelse med tidligere kjent teknikk ble underkastet diafiltrering i isoton bufferoppløsning i 3-4 timer med etterfølgende fryselagring før det ble fylt på en immunoaffinitetskolonne. Faktor IX ble analysert ved hjelp av "APTT"-metoden ifølge Smith, KJ. et al., Blood, 72,1269-1277 (1988). Faktor IXa ble analysert ved hjelp av den partielle tromboplastintest, "PTT", Varadi, K. et al., Thromb. Haemos., 35, 576-585 (1976), modifisert i henhold til fremgangsmåten ifølge eksempel 3 nedenunder. Den reduserte forurensning med faktor IXa i det forbedrede produkt underbyg-ges ytterligere av de lengre blodlevirngstider i sekunder i faktor IXa-analysen vist i tabell 1.

Anionbytterkromatografieluater og sluttprodukter avledet fra disse viste, når de ble analysert under anvendelse av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) ifølge fremgangsmåten til Weber, K. et al., J. Biol. Chem., 244,4406-4412 (1969), eller som modifisert av Laemli, U.K., Nature, 227,680-685

(1970), under anvendelse av en akrylamidkonsentrasjonsgradient på 4-12 % (se figur 1), at anionbytterkromatografieluat av tidligere kjent type (protrombinkompleks) og resulterende sluttprodukt er svært mye forurenset med et bånd med tilsynelatende molekylvekt på 54.000, som er karakteristisk for faktor LXa (og visse faktor IX-nedbr-ymingspeptider), mens denne forurensning er mye mindre i gelfeltene som svarer til den stabile faktor IX-anrikede fraksjon ifølge oppfinnelsen og sluttprodukt avledet fra denne. Feltene i plategelen (figur 1) lades med omtrent 14 fig protein i tilfellet med DEAE-konsentrater og omtrent 9 /ig sluttprodukter avledet fra disse. Felt 1 i figuren viser passende molekylvektmarkører. Feltene 2, 4 og 6 viser individuelle deler av stabil faktor IX-anriket fraksjon avledet fra DEAE-"Sephadex"-kromatografi i henhold til fremgangsmåten ifølge eksempel 1. Feltene 3, 5 og 7 omfatter prøver av de respektive sluttproduktene avledet fra disse. Felt 8 omfatter en prøve av DEAE-konsentrat fremstilt ved hjelp av en ikke-optimalisert fremgangsmåte ifølge teknikkens stand som ikke gjør bruk av høye konsentrasjoner av salt for å beskytte faktor IX. Feltene 9 og 10 viser duplikatprøver av sluttprodukt avledet fra denne.

Faktor IXa-forurensning av de endelige faktor IX-produkter og anionbytterkromatografieluater (begge fremstilt via den forbedrede fremgangsmåte og i henhold til teknikkens stand) ble også sammenlignet under anvendelse av den svært følsomme "Western blot"-teknikk. Faktor IXa ble påvist ved kryssreaktivitet av antifaktor IX-antistoff. Ved denne fremgangsmåten ble testprøvene underkastet elektroforese i en 4-12 % akrylamidgradientgel i nærvær av natriumdodecylsulfat-detergent. Proteinene ble så blottet og immobilisert på et nitrocelluloseark. Mønsteret ble visualisert ved å bruke kaninantiserum til humanfaktor IX og pepperrotper-oksidasekonjugat av geit-antikanin-IgG. Farge ble til sist fremkalt ved å bruke 4-klor-1-naftol og hydrogenperoksid (se Pasternack et al., Nature, 322,740 (1986)). Figur 2 viser at den nye fremgangsmåten fører til et sluttprodukt med bare spor av faktor IXg selv når gelene overfylles, sammenlignet med det typiske resultat av den tidligere kjente teknikk. Gelfeltene i figur 2 svarer nøyaktig til feltene i figur 1 og viser en "Western blot" av et duplikat av SDS-PAGE-gelen vist i figur 1. Gelfeltene lades med omtrent 14 fig prøver omfattende DEAE-konsentrater og 0,07 fig for felter som inneholder sluttprodukter.

Eksempel 3

En forbedret analyse med hensyn på faktor IXa i faktor IX- preparater

I forbindelse med arbeidet med foreliggende oppfinnelse ble det utviklet og standardisert en forbedret koagulasjonsanalyse for faktor IXa eller for nedbrutte 54 kDa faktor IX-avledede peptider, eller andre proteiner med faktor IXa-lignende aktivitet, for å forsyne teknikken vedrørende blodrensing med en forbedret analytisk fremgangsmåte. Prinsippet ved den nye koagulantanalysen, som er svært følsom, er basert på den partielle tromboplastintest ("PTT") og demonstrerer ytterligere mangelen på faktor IXa-aktivitet i faktor IX renset i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse. Analysen er anvendbar for å forutsi trombogenisitet av faktor IX-preparater in vivo, spesielt når de brukes sammen med in Wvø-analysene ifølge eksempel 7.

Styrken av faktor IX* eller av peptider som gir faktor IXa-lignende aktivitet, beregnes direkte basert på blodlevringstid i en ettrinns analyse. Fosfolipid-reagenser som brukes i analysen, ble utvunnet fra bovin hjerne og ble brukt uten aktivator, "Thrombofax", Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ. Typisk PTT-fremgangsmåte ble modifisert ved å tilsette BaSCvadsorbert bovint plasma til faktor IX-fattig humanplasma ved analysefremgangsmåter!, for derved å øke tilførselen av labile faktorer V og VIII.

Denne fremgangsmåten brukes til målingen av aktivert faktor IXa i faktor IX-sluttprodukter samt for overvåking av prøver under fremgangsmåten. Resultatene fra en "spike"-test med faktor IX-prøver viste god linearitet og reproduserbarhet for faktor IXa-analysen i området 0,0005 IXa-enheter/ml til 0,05 IX*-enheter/ml. Svært små mengder av faktor IXa i faktor IX-preparater kan derfor måles.

Effekten av renset faktor IX på faktor IXa-analysen ble også undersøkt ved sammenligning av faktor IXa tilsatt faktor LX-fortynninger og faktor IX tilsatt faktor LXa-fortynninger. Faktor IX virker ikke inn på faktor IXa-analysen. Analysen tilpasses lett for å overvåke andre faktor IX-preparative fremgangsmåter. Faktor IXa-konsentrasjonsdata tilveiebrakt i tabell 1 ble beregnet i henhold til denne fremgangsmåten.

Bare svært lave nivåer av faktor LXa ble funnet i det endelige monoklonalt antistoffrensede faktor IX-produkt fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge eksempel 1. Eksempler 4-8 ifølge oppfinnelsen viser videre renhetene og stabilitetene til faktor IX som kan oppnås ved å bruke forskjellige typer av saltmiljøer i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 4

Stabilisering av faktor IX ved forskjellige NaCl- konsentrasioner

Dette eksemplet viser effekten av forskjellige natriumkloridkonsen-trasjoner på stabiliteten til faktor IX i preparater med middels renhet (DEAE-"Sephadex"-eluatfraksjoner) i løpet av et 5-dagers tidsrom med lagring ved 4 °C.

Protrombinkomplekset (inneholdende faktor IX, signifikante mengder av faktorene II, VII, X og et stort antall andre forurensende proteiner) elueres fra DEAE-"Sephadex"-harpiksen under anvendelse av 2 M NaCl i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge eksempel 1. Både et første og et andre eluat fra harpiksen samles opp og lagres separat ved 4 °C. Eluerte fraksjoner får forskjellige slutt-NaCl-molariteter (0,96-1,4 M) ettersom bufferen som er til stede i hulromvolumet av harpiksen, må fortrenges.

Prøvene av eluatene som ble frembrakt for dette eksemplet er:

(A) fra den første kolonneeluering ved 0,956 M NaCl,

(B) en prøve av materialet (A) fortynnet til 0,524 M NaCl,

(C) en prøve av materialet (A) underkastet ultrafiltrering og diafiltrering

som i den typiske tidligere kjente fremgangsmåte, idet NaCl-

konsentrasjonen er redusert til 0,056 M,

(D) en porsjon av prøve (C) bringes etter fullførelse av filtrerings-fremgangsmåten så tilbake til 0,481 M NaCl for analyse over 5

dager,

(E) fra den andre kolonneeluering ved 1,4 M NaCl,

(F) en prøve av materialet (E) fortynnet til 0,532 M NaCl.

Etter fremstilling ble disse prøvene lagret ved 4 °C og så undersøkt ved

0, 1, 2 og 5 dagers tid med hensyn på faktor IX og på faktor IXa. Faktor IX ble analysert ved en ettrinnsaktivert partiell tromboplastintid-fremgangsmåte, "APTT", i henhold til fremgangsmåten ifølge Smith, K.J. et al., Blood, 72,1269-1277 (1988), og faktor IXa-nivåer ble bestemt ved å bruke den nye faktor IXa-analysen presentert i eksempel 3. Tabell 2 viser at NaCl ved 1,4 M eller høyere konsentrasjon resulterer i maksimal beskyttelse av faktor IX mot proteaseaktivitet og minimaliserer fremstilling av faktor IX* under de angitte betingelser.

Av tabell 2 kan det ses at bruk av foreliggende oppfinnelse har en dyptgående effekt på stabiliteten til faktor IX i protrombinkompleksfraksjoner. Resultatene for tidspunktene 0 og 5 dager ble også bekreftet i "Western blot"-analysesystemet ifølge eksempel 2 under anvendelse av et antifaktor IX-monoklonalt antistoff som også reagerer med faktor IXa og andre 54 kDa faktor IX-avledede peptider.

Eksempel 5

Effekt av saltkonsentrasjon på faktor IX- stabilitet ved to forskjellige temperaturer

Dette eksemplet illustrerer at bruken av en forholdsvis høy konsentrasjon av salt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er effektiv over et bredt temperaturområde.

En prøve av DEAE-"Sephadex"-eluat fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ovenfor, som var blitt klaret og sterilfiltrert og inneholdt 1 M NaCl og 10 mM natriumsitrat, pH 7,0, ble tint etter lagring ved -80 °C. Separate 5 ml aliquoter av prøven ble dialysert over natten ved enten 3 eller 25 °C mot 1,0,0,75,0,5 eller 0,15 M natriumkloridoppløsninger, og så analysert ved hjelp av "Western blots" og i faktor IX- og IXa-aktivitetsanalyser. Ved lave konsentrasjoner av dialysesalt er aktivering av faktor IX vesentlig, selv ved 3 °C. Når den holdes ved 3 °C og ved 0,15 M NaCl, nedbrytes omtrent to tredjedeler av den opprinnelige faktor IX etter 12 timer. Faktor IXa-nivåer ble også observert å falle i prøve dialysert ved lav saltkonsentrasjon ved 3 eller 25 °C, noe som gir ytterligere bevis på det mulige omfang av proteolyse i protrombinkonsentrater.

Figur 3 viser resultatet av en "Western blot" ved 25 °C. Resultater ved 3 °C var svært like. De respektive feltene i "bloten" er (1) molekylvektmarkører, (2) en kontroll bestående av nedfryst DEAE-konsentrateluat fra DEAE-"Sephadex"-harpiks opprettholdt med høy saltkonsentrasjon i overensstemmelse med utøvelsen av denne oppfinnelsen, (3) en opptint prøve av DEAE-konsentrat (fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge eksempel 1 og inneholdende også omtrent 1 M NaCl) tilført direkte til utgangsakrylamidgelen uten dialyse over natten, (4) en prøve av DEAE-konsentrat fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge eksempel 1 og dialysert over natten mot 1,0 M NaCl, (5) en prøve som i (4) ovenfor, men dialysert mot 0,75 M NaCl, (6) en prøve som i (4) ovenfor, men dialysert mot 0,5 M NaCl, og (7) en prøve som i (4) ovenfor, men dialysert mot 0,15 M NaCl.

Eksempel 6

Anvendelse av forskjellige salter

Dette eksemplet viser at mange forskjellige oppløselige salter oppviser faktor IX-beskyttende virkninger.

En prøve av DEAE-"Sephadex"-eluat fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge eksempel 1 og inneholdende 1 M NaCl og 10 mM natriumsitrat, pH 7,0, ble klaret og sterilfiltrert før lagring ved -80 °C. Separate 5 ml aliquoter av den opptinte oppløsning ble dialysert over natten ved 3 °C mot 1 molar oppløsning av natriumacetat, litiumklorid, magnesiumklorid, kaliumklorid, natriumklorid eller natriumsulfat. De dialyserte oppløsninger ble analysert med hensyn på faktor IX, faktor IXa og også analysert i den ikke-aktiverte, partielle tromboplastintid-test "NAPTT" (Kingdom, H.S. et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 33, 617-631

(1975)). Resultatene er oppsummert i tabell 3 og ble bekreftet med "Western blots". Det kan ses at LiCl, KC1, NaCl, MgCl2 og Na2S04 er sterkt faktor IX-beskyttende ved 1,0 M konsentrasjon. Det legges merke til at slike virkninger kan påvises både i visse sterkt innsaltende salter (Na eller KSCN) og visse moderat utsaltende salter (KC1 og Na2S04).

Natriumacetatdialysatet utviste betydelig mer faktor IXa-produksjon enn oppløsninger av de andre oppløselige salter, selv om mindre faktor IX-aktivering og - nedbrytning ble lagt merke til enn det som ville forventes under anvendelse av en 0,15 M NaCl-dialyseoppløsmng.

Eksempel 7

Faktor IX- renhet bedømt ved hjelp av The Wessler Rabbit Stasis Assav

Dette eksemplet viser at faktor IX renset i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ikke forårsaker uønsket koagulasjon målt ved hjelp av in vivo Wessler Rabbit Stasis Assay for trombogenisitet.

Faktor IX-preparater bestående av DEAE-"Sephadex"-eluater (diafiltrert mot fysiologisk, isoton buffer) ifølge teknikkens stand og faktor IX-sluttprodukter fremstilt i henhold til utøvelsen av denne oppfinnelsen (ved å bruke anionbytterkromatografi og holdt ved høy natriumkloridkonsentrasjon før etterfølgende immunoaffinitetskromatografi) ble injisert in vivo i isolerte, ligerte snitt av kaninhalsvener i henhold til fremgangsmåten til Wessler et al., J. Appl. Physiol., 14:943-946 (1959), for å fastslå dannelsen av stasetromber.

Bedømmelse ble utført ved å følge systemet til Wessler et al. i henhold til størrelsen på koagelet, hvor et <+>4 koagel utgjør den største koagelstørrelsen som normalt kan frembringes med trombogene materialer ved den valgte karstørrelse og - type, og <+>1 er det minste koagel som kan bli synlig påvist. Resultatene av evalueringen av de tidligere kjente preparater og preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse viser at preparater ifølge oppfinnelsen, i motsetning til bruken av preparater fra teknikkens stand, ikke oppviser noen ugunstige effekter in vivo opp til konsentrasjoner av faktor IX på en vektbasis pr. kg som er godt ut over det som ville bli administrert til en human hemofili B-pasient. Det foreslås at bruk av denne analysen sammen med analyse av SDS-PAGE-geler for 54 kDa peptider, og også faktor IXa-analysen (eksempel 3), er den best tilgjengelige fremgangsmåte for å forutsi terapeutiske faktor IX-preparaters utnyttbarhet og sikkerhet in vivo.

Eksempel 8

Moderate konsentrasjoner av visse salter er effektive når det gjelder å beskytte faktor

IX

Dette eksemplet viser at visse oppløselige salter er effektive for beskyttelse av faktor LX når de brukes ved lavere konsentrasjoner enn det som generelt trengs for natriumklorid. Ettersom bruk av protrombinkomplekskonsentrat kan føre til farlige kliniske virkninger, omfatter nyutviklede rensestrategier tilleggsseparasjons-trinn i fremgangsmåten for ytterligere å rense faktor IX. Ikke alle disse separasjons-teknikkene (f.eks. visse kolonneteknikker) kan fås til å virke under betingelser med høy saltmolaritet. For eksempel kan faktor IX feste seg til en bestemt affinitetskolonne med monoklonalt antistoff dersom saltkonsentrasjonen er mye over 0,5 molar. Det ville derfor være ønskelig å identifisere oppløselige salter som oppviser faktor IX-beskyttende effekter når de er til stede ved middels molaritet, slik som mellom ca. 0,4 og ca. 0,7 molar, eller lavere.

Følgelig ble separate 5 ml aliquoter av en prøve av DEAE-konsentrat, den "stabile faktor LX-anrikede fraksjon", fremstilt via fremgangsmåten ifølge eksempel 1 (også inneholdende 1,0 M NaCl bufret ved pH 7,0 med 10 mM natriumsitrat), og som var blitt lagret nedfryst ved -80 °C, dialysert over natten ved 4 °C mot 0,5 M oppløsninger av NaCl, KC1, LiCl, Na2S04 eller MgCl2. Et sitratbufret 1,0 M NaCl-dialysat ble brukt som en kontroll. Analyser med hensyn på faktor IX og faktor IXa ble så utført, og prøvene ble screenet (figur 4) i "Western blot"-systemet.

Som det klart fremgår av "bloten" i figur 4, oppviste både bufrede oppløsninger av 0,5 M magnesiumklorid (felt 3), natriumsulfat (felt 4), litiumklorid (felt 5) og kaliumklorid (felt 6) faktor IX-stabiliserende virkning som er omtrent lik med virkningen av 1,0 M NaCl (felt 8) og betydelig bedre enn virkningen av 0,5 M NaCl (felt 7). Felt 9 i figur 4 viser passende molekylvektmarkører. Felt 1 viser en kontroll av DEAE-konsentrat laget ved hjelp av den typiske tidligere kjente fremgangsmåte og dialysert mot isoton buffer før nedfrysing, noe som resulterer i høyt innhold av 54 kDa nedbrutt peptid; og felt 2 viser en prøve av nedfryst DEAE-konsentrat fremstilt som eluat fra DEAE-"Sephadex"-harpiks opprettholdt ved høyt saltinnhold i henhold til utøvelsen av denne oppfinnelsen.

Claims (18)

1. Vandig løsning av delvis renset faktor IX, karakterisert ved at den har en forhåndsbestemt spesifikk aktivitet og inneholder én eller flere vannløselige organiske eller uorganiske salter i en konsentrasjon tilstrekkelig til å forhindre eller vesentlig minimalisere katalytisk aktivitet av proteaser på faktor IX, men som ikke tilstrekkelig til å forårsake irreversibel endring i, presipitering av, eller denaturering av faktor IX-molekylet, og hvor faktor IX-aktiviteten er omtrent 80 til omtrent 100 % av den forhåndsbestemte spesifikke aktivitet når løsningen er blitt lagret i minst omtrent 12 timer på eller under en temperatur på 4 °C.

2. Terapeutisk sammensetning omfattende en vandig løsning av faktor IX ifølge krav 1, karakterisert ved at den har en spesifikk aktivitet større enn omtrent 50 enheter faktor IX-aktivitet/mg protein og en saltkonsentrasjon redusert til et klinisk akseptabelt nivå, og hvor sammensetningen kan lagres i et tidsrom på omtrent to uker ved en lagringstemperatur på opp til 15 - 30 °C mens den forblir fri for faktor IXa, degraderte former av faktor IX og/eller aktive former av andre faktorer som ønskes fjernet, i konsentrasjoner som ville bidra til å forårsake målbare ugunstige kliniske effekter i et menneske når nevnte sammensetning administreres i en terapeutisk dose.

3. Terapeutisk sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved at den har en faktor IX-spesifikk aktivitet som er større enn omtrent 100 enheter/mg protein.

4. Terapeutisk sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved at den omfatter et lyofilisert pulver, løsning, suspensjon, eller frossen løsning eller suspensjon, av faktor IX som har en spesifikk aktivitet av faktor IX på over 50 enheter/mg av protein, og som inkluderer på en vekt% av proteingrunnlaget, ikke mer enn omtrent 0,1 % faktor IXa, eller ikke mer enn omtrent 10 % totalt av én eller flere faktor IX-degradeirngspeptider som har en molekylvekt fra omtrent 40 til omtrent 65 kDa.

5. Løsning ifølge krav 1, karakterisert ved at saltet eller saltene er til stede i en konsentrasjon på omtrent 0,4 til omtrent 1,4 M.

6. Løsning ifølge krav 5, karakterisert ved at saltet vesentlig består av natriumklorid.

7. Løsning ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av saltet minst er omtrent 0,7 M.

8. Sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte spesifikke aktivitet minst er 194 enheter/mg.

9. Sammensetning ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte spesifikke aktivitet minst er 194 enheter/mg.

10. Sammensetning ifølge krav 4, karakterisert ved at den kan lagres som en væskeløsning i terapeutisk form i et tidsrom på omtrent 2 uker med en lagringstemperatur på opptil 15-30 °C, og samtidig forblir fri for faktor IXa, degraderte former av faktor IX og/eller aktive former av andre levringsfaktorer i konsentrasjoner som vil kunne bidra til å forårsake målbare ugunstige kliniske effekter i et menneske når nevnte sammensetning administreres i en terapeutisk dose.

11. Fremgangsmåte for å rense faktor IX fra andre proteiner og makromolekyler i en løsning med slike, karakterisert ved at rensingen involverer 2 eller flere sekvensielle rensetrinn, hvor rensingen omfatter tilsetting av én eller flere løselige organiske eller uorganiske salter til løsningen som inneholder faktor IX i en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å forhindre eller i det vesentlige minimalisere aktivering av, eller degradering av faktor IX, hvor tilsettingen skjer samtidig med eller etter et spesifikt rensetrinn, men hvor den totale konsentrasjon av nevnte salt eller salter ikke er tilstrekkelig til å forårsake presipitering av, irreversibel endring i, eller denaturering av faktor IX-molekylet, og bevare det delvis rensede proteinet i kontakt med nevnte saltløsning ved nevnte tilstrekkelige saltkonsentrasjon i en periode på minst inntil rett før begynnelsen av neste rensetrinn.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at én eller flere av de to eller flere sekvensielle rensetrinn er valgt blant cryopresipitering, ionebyttekromatografi, adsorpsjon til heparin, presipitering med et bariumsalt, arnmoniumsulfatfraksjonering, eller antistoffaffinitetskromatografi.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte andre blodplasmaproteiner i nevnte løsning inkluderer vitamin K-avhengige levringsfaktorer, og hvor én eller flere av de to eller flere sekvensielle rensetrinnene involverer å bringe i kontakt nevnte løsning med et anionbytteharpiks som nevnte vitamin K-levringsfaktorer, inkluderende faktor IX, adsorberes til.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at én eller flere av de to eller flere sekvensielle rensetrinn involverer å bringe i kontakt nevnte faktor IX i nevnte løsning med et faktor IX-spesifikt antistoff for å oppnå nevnte rensing.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at løsningen som inneholder faktor IX og nevnte én eller flere salter, underkastes manipulering i løpet av et tidsintervall mellom et første og et etterfølgende rensetrinn, hvor nevnte manipulering involverer én eller flere fremgangsmåter valgt fra gruppen bestående av dialyse, ultrafiltrering, filterkonsentrering, diafiltrering, presipitering, resuspendering, steril filtrering, filtersentirfugering, elektrodialyse, fremgangsmåter i stand til å redusere konsentrasjonen av salt, varmebehandlig av den faktor IX-holdige løsningen for å inaktivere kontaminerende mikroorganismer eller virus.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte løsning som inneholder faktor IX, underkastet et rensetrinn og tilsatt én eller flere løselige organiske eller uorganiske salter, lagres forut for at nevnte løsning underkastes et ytterligere separeringstrinn.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at saltet eller saltene er til stede i en konsentrasjon på omtrent 0,4 til omtrent 1,4 molar.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 11, for fremstilling av en terapeutisk sammensetning som er anvendelig ved behandling av Christmas sykdom, og som har en spesifikk aktivitet som er større enn omtrent 50 enheter faktor IX-aktivitet/mg protein, og som er i stand til å bli lagret i en løselig form i et tidsrom på omtrent 2 uker med en lagringstemperatur på opptil 15-30 °C, og som samtidig forblir fri for faktor IXa, denaturerte former av faktor IX og/eller aktive former av andre levringsfaktorer i en konsentrasjon som ville kunne bidra til å forårsake målbare ugunstige kliniske effekter i et menneske når nevnte sammensetning administreres i en terapeutisk dose, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (A) bringe i kontakt et cryopresiptert fritt bloplasma med en anionbytteharpiks hvor faktor IX og andre faktorer blir adsorbert; (B) eluere faktor IX fra anionbytteharpiksen ved tilsetting til harpiksen en saltløsning som har tilstrekkelig molaritet til å eluere faktor IX og tilveiebringe et eluat av faktor IX; (C) underkaste det faktor IX-holdige eluatet kromatografi på en immunoaffinitetskolonne for å binde faktor IX til denne; (D) fjerne faktor IX fra immunitetsaffinitetskolonnen for å tilveiebringe en løsning som inneholder renset faktor IX.