NO175003B

NO175003B - Fusjonsproteiner med eukaryotisk ballastandel, vektor som inneholder et DNA som koder for fusjonsproteinet samt E.coli celle inneholdene vektoren

Info

Publication number: NO175003B
Application number: NO865192A
Authority: NO
Inventors: Paul Habermann
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1985-12-21
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1994-05-09
Also published as: IE58935B1; EP0229998A2; NO865192L; KR950000301B1; JPS62167799A; FI93734C; JP2774260B2; IE863334L; AU6676086A; DK619186D0; HU209747B; DK619186A; IL81018A0; DE3636903A1; EP0229998B1; FI865187A; GR3005985T3; JPH08187089A; HUT44614A; AU599943B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fusjonsproteiner med eukaryotisk ballastandel, samt vektor som inneholder et DNA som koder for fusjonsproteinet og E.coli celle inneholdende vektoren.

Det er allerede foreslått fusjonsproteiner som er kjennetegnet ved en C— eller N-terminal andel som i det vesentlige tilsvarer de første 100 aminosyrene av interleukin-2 (tysk patentsøknad P 3541856.7). Interleukin-2-andelen kan herved være avledet fra pattedyr-interleukin-2, eksempelvis fra mus— eller rotte-interleukin-2, som er kjent fra den europeiske patentpublikasjonen (i det følgene "EP-A") 0 091 539, fortrinnsvis humant-interleukin-2. Disse fusjonsproteinene er overraskende stabile i vertscellen og kan på grunn av deres lave oppløselighet enkelt skilles fra de oppløselige vertsegne proteinene.

I en videreutvikling av denne oppfinnelsestanken er det nå overraskende funnet at også vesentlig mindre andeler av interleukin-2-molekylet er egnet som "ballast"-andel for slike fusjonsproteiner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fusjonsproteiner, kjennetegnet ved en C- eller N-terminalandel som i det vesentlige tilsvarer aminosyresekvensen av interleukin-2 (IL-2), fortrinnsvis menneskelig IL-2, og omfatter 20 til 70 aminosyrer.

Oppfinnelsen vedrører videre en vektor som er kjennetegnet ved at den inneholder et DNA som koder for et fusjonsprotein som inneholder en C- eller N-terminal del av human IL-2, idet denne andelen omfatter 20 til 70 aminosyrer og DNA inneholdes fortrinnsvis i et av plasmidene: pW226, pW226-l, pK40, pSL12, pK50, pK51, pK52, pSL14, pPH31, pK192, pW214, pW227, pW227-l, pW233, pW228, pW228-l, pW234, pH200, pH201 og pH202.

Endelig omfatter oppfinnelsen en E.coli celle kjennetegnet ved at den inneholder den overfor angitte vektoren.

Spesielt fordelaktig tar man utgangspunkt i det syntetiske genet for humant-interleukin-2 (i det følgende "IL-2"), som er beskrevet i EP-A 0 163 249 og gjengitt i vedlegget. Dette syntetiske genet inneholder en rekke restriksjonssnitt-seter som gjør det mulig å oppdele det for IL-2 kodende DNA i "håndterbare" segmenter. Med disse segmentene kan ballastan-delene for fusjonsproteinene målsys ved hjelp av byggestensprinsippet, hvor man avhengig av kombinasjonen av segmentene og typen av det ønskede proteinet kan oppnå lett oppløselige til tungt oppløselige fusjonsproteiner.

Oppfinnelsen gjør det altså mulig å velge den mest fordel-aktige oppløseligheten avhengig av den mulige eller ønskede opparbeidelsen av produktet, det vil si en høy oppløselighet når produktet skal renses kromatografisk, eksempelvis ved hjelp av en antistoffsøyle, eller en lav oppløselighet når de vertsegne, oppløselige proteinene skal fraskilles ved en forrensing, eksempelvis frasentrifugeres.

En spesiell fordel ved oppfinnelsen ligger i at man kan fremstille fusjonsproteiner med en meget liten "ballastandel", hvorved det relative utbyttet av det ønskede proteinet forhøyes betraktelig.

En ytterligere fordel ved oppfinnelsen ligger i at "ballastandelen" kan konstrueres på en slik måte at den hindrer den romlige strukturen av det ønskede proteiner minst mulig og følgelig ikke forhindrer en sammenfolding.

Ved spaltningen av fusjonsproteinene får man ved siden av det ønskede proteiner "ballastandelen", det vil si IL-2-deri-vatet. Disse kan oppvise IL-2-aktivitet (T-celleproli-fereringsforsøk) eller bindes til IL-2-reseptorer. "Byggestensprinsippet" ved .oppfinnelsen kan følgelig også tjene til å fremstille IL-2-derivater som "biprodukter", som oppviser den biologiske aktiviteten av IL-2- i mer eller mindre ut-preget grad.

Spesielt hensiktsmessige utførelsesformer av oppfinnelsen skal i det følgende beskrives på bakgrunn av det syntetiske genet som er beskrevet i EP-A 0 163 249. Dette genet er ved 5'-enden skåret med restriksjonsendonukleasen EcoRI og ved 3'-enden med Sali. Ved siden av de tre singulære restrik-sjonssetene for enzymene Pstl, Xbl og SacI, som tjente til konstruksjonen av dette genet, er også de singulære snittsetene Mlul og Pvul gunstig anordnet. Dersom man betegner sekvensen som ligger mellom disse snittsetene med A til F, kan det syntetiske genet fremstilles skjematisk som følger (EcoRI)-A-Pstl-B-Mlul-D-Xbal-D-Sacl-E-Pvul-F--(sali).

Segmentene A til f utgjør følgelig spesielt egnede "bygnings-Stener" for byggestenssysternet ifølge oppfinnelsen. I denne fremstillingen tilsvarer altså "ballastandelen" for fusjonsproteinene tilsvarende den tyske patentsøknaden P 3541856.7 segmentene A til E, og for det i den samme søknaden nevnte bifunksjonelle proteinet med det samlede IL-2-genet alle segmentene A til F. Derimot vedrører genkonstruksjonene ifølge oppfinnelsen andre kombinasjoner av segmentene A til F, fortrinnsvis mindre enn 4 av disse segmentene, hvorved segmentet A koder N-terminalen av fusjonsproteinet. Anord-ningen av de ytterligere segmentene er tilfeldig, hvorved det eventuelt kan anvendes tilsvarende adaptorer eller linkere. Tilsvarende adaptor- eller linkersekvenser kan også innføres ved C-terminalen av "ballastandelen", som i dette tilfellet også kan kode for aminosyrer eller korte aminosyresekvenser, som muliggjør eller letter den enzymatiske eller kjemiske avspaltningen av "ballastandelen" fra det ønskede proteinet. Adapter— eller linkersekvensene kan naturligvis også tjene til å skreddersy "ballastandelen" for et bestemt fusjonsprotein, f.eks. for å oppnå en ønsket oppløselighet. Det har nemlig overraskende vist seg at oppløseligheten for fusjonsproteinene ikke er avhengig av molekylstørrelsen, men at derimot også relativt små molekyler kan oppvise lav opp-løselighet. Med en kjennskap til denne sammenhengen, som er beskrevet nærmere i eksemplene, kan fagmannen følgelig uten store eksperimentelle anstrengelser fremstille fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen med liten "ballastandel", som oppviser bestemte ønskede egenskaper.

Når det ønskede proteinet er et eukaryotisk protein oppnås følgelig fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen som utelukkende, eller praktisk talt utelukkende, består av eukaryotiske proteinsekvenser. Overraskende gjenkjennes disse fusjonsproteinene ikke av prokaryotiske vertsceller som fremmedproteiner og nedbygges ikke raskt av vertsegne proteaser. Denne nedbygning forekommer spesielt hyppig ved cDNA-sekvens-kodede vertsfremmede proteiner som skal uttrykkes i bakterier. Det har nå vist seg at cDNA-sekvenser kan uttrykkes meget effektivt når de "innbygges" i segmentene ifølge oppfinnelsen. For dette formålet kan det konstrueres spesielle vektorer som inneholder en polylinkersekvens mellom sekvensene ifølge oppfinnelsen, som oppviser flere klonings-seter for cDNA-sekvensene. Dersom det innkodede cDNA ikke inneholder noe stoppkodon, så beskyttes den av cDNA-sekvensen kodede polypeptidsekvensen ved polypeptidet, for hvilket det C-terminale segment koder.

Spaltningen av fusjonsproteinet kan foregå på i og for seg kjent måte kjemisk eller enzymatisk. Valget av egnet fremgangsmåte avhenger fremfor alt av aminosyresekvensen for det ønskede proteinet. Når denne eksempelvis ikke inneholder metionin kan bindeleddet stå for Met, hvorpå kjemisk spaltning foregår med klor— eller bromcyan. Dersom cystein står ved karboksyterminalen i bindeleddet eller bindeleddet står for Cys, så kan det foregå en enzymatisk cystein-spaltning eller en kjemisk spaltning, eksempelvis etter spesifikk S-cyanylering. Dersom tryptofan står i broleddet ved karboksyterminalen eller bindeleddet står for Trp, så kan det foregå en kjemisk spaltning med N-bromsuksinimid.

Ønskede proteiner som i aminosyresekvensen ikke inneholder Asp-Pro og som er tilstrekkelig syrestabile kan som fusjonsproteiner spaltes proteolytisk med dette broleddet på i og for seg kjent måte. Herved får man proteiner som N-terminalt inneholder prolin, henholdsvis C-terminalt asparginsyre. På denne måten kan også modifiserte proteiner syntetiseres.

Asp-Pro-bindingen kan også utformes syrelabil, når dette broleddet er (Asp)n-Pro, henholdsvis Glu-(Asp)n-Pro, hvorved n er 1 til 3.

Eksempler på enzymatiske spaltninger er også kjente, hvorved også modifiserte enzymer med forbedret spesifisitet kan anvendes (kfr. D.S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297). Dersom det ønskede eukaryotiske peptidet er proinsulin, så velges hensiktsmessig en peptidsekvens hvori en ved trypsin-avspaltbar aminosyre (Arg, Lys) er bundet til den N-terminale aminosyren (Phe) av proinsulin, eksempelvis Ala-Ser-Met-Thr-Arg, idet da den arginin-spesifikke spaltningen kan foregå med proteasen trypsin.

Dersom det ønskede proteinet ikke inneholder aminosyrerekken

Ile-Glu-Gly-Arg,

så kan fusjonsproteinet spaltes med det tilsvarende broleddet med faktor Xa (EP-A 0 025 190 og 0 161 973).

Fusjonsproteiner utvinnes ved uttrykking i et egnet uttryk-kingssystem på i og for seg kjent måte. For dette formålet egner alle kjente vertsvektorsystemer seg, eksempelvis pattedyrceller og mikroorganismer, eksempelvis gjær og fortrinnsvis bakterier, spesielt E.coli.

DNA-sekvensen som koder for det ønskede proteiner innebygges på kjent måte i en vektor, som sikrer en god uttrykking i det valgte uttrykkingssystemet.

I bakterielle verter velger man hensiktsmessig promotoren og operatoren fra gruppen lac, tac, trp, PL eller Pr av fagene X, hsp, omp eller en syntetisk promotor, f.eks. som foreslått i det tyske utlegningsskriftet 3430683 (EP-A 0 173 139). Fordelaktig er tac promotor-operatorsekvensen, som nå er kommersielt tilgjengelig (f.eks. uttrykkingsvektoren pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, side 63).

Ved uttrykkingen av fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen kan det vise seg hensiktsmessig å endre enkelte tripletter av de første aminosyrene etter ATG-startkodonet for å forhindre en eventuell basepardannelse ved området for mRNA. Slike endringer, på samme måte som endringer, utelatelser eller tillegg av enkelte aminosyrer i IL-2-proteinandelen, er kjente for fagmannen. Eksempelvis kan nevnes eliminering av cystein eller erstatning av cystein med andre aminosyrer for å forhindre en dannelse av uønskede disulfidbroer, som eksempelvis beskrevet i EP-A 0 109 748.

Fig. 1 til 13 anskueliggjør flytskjemaer for fremgangsmåtene for syntesene som er beskrevet i eksemplene av samme nummer. For å lette oversikten er fremstillingen av utgangsmateri-alene, henholdsvis mellomproduktene, gjengitt i fig. A til C. for å forbedre oversiktligheten er i fig. 1 til 13 hen-visningstallene begynt med en ny 10-rekke, det vil si i fig. 1 med (11). Henvisningstall for utgangsmaterialer som ikke er gjenstand for foreliggende søknad ender på 0, altså eksempelvis i fig. 2 (20). Figurene er ikke tegnet i riktig måle-stokk, spesielt i området for polylinkersekvensen er måle-stokken uttrukket tilsvarende. IL-2-sekvensen er kjennetegnet ved tykke linjer, strukturgener for ønskede proteiner er fremhevet ved annen bokstavbredde. Fig. A gjengir en oversikt over segmentene A til F ifølge oppfinnelsen, henholdsvis segmentkombinasjonen A og B. Utgangsmaterialet er plasmidet pl59/6, hvis fremstilling er beskrevet utførlig i EP-A 0 163 249 og angitt i fig. 5 i nevnte publikasjon. Fig. B viser ekspresjonsplasmidet pEWlOOO, hvis fremstilling er beskrevet i den tyske patentsøknad P 3541856.7 og gjengitt i fig. 1 i denne søknaden. Ved tilsvarende dobbeltnedbrytning åpnes dette plasmidet i polylinkersekvensen, hvorved de lineariserte plasmidene (Exl) til (Ex4) oppnås. Fig. C viser fremstillingen av pUCl2-derivatet pW226 og ekspresjonsplasmidet pW226-l, som inneholder begge segmentene A og F, adskilt av en polylinkersekvens. Fig. 1 viser fremstillingen av pUC12-derivatet pKH40 og ekspresjonsplasmidet pK40, som koder for fusjonsproteiner hvori etter proteinsekvensen tilsvarende segmentet A, det vil si de første 22 aminosyrene av IL-2, broleddet Thr-Arg følger, hvoretter aminosyresekvensen av proinsulin slutter seg. Fig. 2 viser konstruksjonen av plasmidet pSLll og ekspresjonsplasmidet pSL12, som koder for polypeptider hvori etter segmentet A et broledd tilsvarende polylinkersekvensene (2) og (20a) følger, hvoretter aminosyrerekken av proinsulin slutter seg. Fig. 3 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pK50, som koder for et polypeptid, hvori etter segmentene A og B, det vil si etter de første 38 aminosyrene av IL-2, det umiddelbart følger aminosyresekvensen for proinsulin. Fig. 4 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pK51, som koder for et polypeptid, hvori det etter segmentene a og B følger et broledd tilsvarende sekvensene (42) og (41), hvoretter følger aminosyresekvensen av proinsulin. Fig. 5 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pK52, som adskiller seg fra pK51 ved den innførte Mlul-linkeren (51), som koder for aminosyresekvensen som muliggjør en spaltning med faktoren Xa. pK52 kan også utvinnes fra pK50 (fig. 3) ved spaltning med Mlul og innføring av den nevnte Mlul-linkeren. Fig. 6 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pK53 fra pK51 (fig. 4) , også ved innføring av Mlul-linkeren. Fig. 7 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pSL14 fra pSL12 (fig. 2) ved innføring av fragmentet C i polylinkeren. Herved tilføyes segment C umiddelbart etter segment A. I den følgende polylinkeren tilsvarer de første to aminosyrene (i ethvert tilfelle Glu) aminosyrene 60 og 61 av IL-2. Følgelig består altså IL-2-andelen av aminosyrene 1 til 22 og 37 til 61. Den videre aminosyrerekken tilsvarer den for hvilken plasmidet pSL12 (fig. 2) koder. Fig. 8 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pPH31, som koder for et fusjonsprotein, hvori det etter segmentene A til C følger et broledd som er gjengitt i sekvensen (81), hvoretter aminosyrerekken av proinsulin følger. Fig. 9 viser konstruksjonen av plasmidet pK192, som koder for et fusjonsprotein, hvori etter segmentene A og B metionin og deretter aminosyrerekken av hirudin følger. Fig. 10 viser konstruksjonen av plasmidet pW214, som koder for et fusjonsprotein, hvori etter segmentene A og B følger aminosyresekvensen som muliggjør en spaltning med Xa-faktoren, hvoretter det slutter seg aminosyresekvensen av granulocytmakrofager "Colony Stimulating Factor" (CSF). Fig. 11 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pW233 som koder for et fusjonsprotein, hvori etter segmentene A og C (tilsvarende aminosyrene 1 til 22 og 3 7 til 61 av IL-2) broleddet Leu-Thr-Ile-Asp-Asp-Pro følger, hvoretter følger aminosyresekvensen av CSF. Fig. 12 viser konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pW234 som koder for et fusjonsprotein med følgende aminosyre-sekvens: Etter segmentet A (aminosyrene 1 til 22) følger et broledd Thr-Arg, deretter segment D (aminosyrene 59 til 96 av IL-2), som ytterligere bindeledd Thr-Asp-Asp-Pro og til slutt CSF.

Fig. 13 viser konstruksjonen av plasmidet pH200 og pH201 samt ekspresjonsplasmidet pH202. Disse plasmidene har en poly-linker anordnet mellom segmentene A og F, henholdsvis A, B og F, i hvis tallrike snittseter fremmed-DNA kan innklones. Disse plasmidene egner seg spesielt til kloning av cDNA-sekvenser.

I de følgende eksemplene, hvis nummerering stemmer overens med figurene, skal oppfinnelsen beskrives nærmere. Dersom ikke annet er angitt, angir prosentangivelsene vektprosent.

Eksempel A

Utgangsplasmidet pl59/6 er beskrevet i EP-A 0 163 249 (fig. 5). Den dersom "IL-2", henholdsvis i teksten som "DNA-sekvens I" definerte sekvensen, er i fig. A oppdelt i segmentene A til F, som er begrenset av snittsetene for enzymene EcoRI, Pstl, Mlul, Xbal, SacI, Pvul og Sali. Ved dobbeltnedbrytning med de tilsvarende enzymene får man segmentene (A) til (F), eller også sammenhengende segmenter, eksempelvis med EcoRI— og Mlul-segmentet (A,B).

Eksempel B

Fremstillingen av ekspresjonsplasmidet pEWlOOO er foreslått i den (ikke tidligere offentliggjorte) tyske patentsøknaden P 3541856.7 (fig. 1). Dette plasmidet er et derivat av plasmidet ptac 11 (Amann et al., Gene 25, (1983) 167-178), hvori det i gjenkjenningssetet for EcoRI er innebygget en syntetisk sekvens som inneholder et Sall-snittsete. På denne måten oppnås uttrykkingsplasmidet pKK 177.3. Ved innføring av LAC-repressoren (Farabaugh, Nature 274 (1978) 765-769) får man plasmidet pJF118. Dette åpnes på det singulære restrik-sjonssetet for Aval og forkortes på kjent måte ved ekso-nuklease-behandling med Ca. 1000 bp og ligeres. Man får plasmidet pEWlOOO. Ved åpning av dette plasmidet i polylinkeren med enzymene EcoRI og Hindlll, Sali, Pstl eller Saml, får man de lineariserte ekspresjonsplasmidene (Exl), (Ex2) , (Ex3) og (Ex4) .

Eksempel C

Det handelsvanlige plasmidet pUC12 åpnes med EcoRI og Sali og det lineariserte plasmidet (1) isoleres. Ved ligering av (1) med segmentet (A), den syntetiske linkersekvensen (2) og segmentet (F) får man plasmidet pW226 (3).

Stammen E.coli 79/02 transformeres på kjent måte med plasmid-DNA fra ligeringsblandingen. Cellene utlegges på agarplater som inneholder isopropyl-P-D-galctopyranosid (X-gal) samt 20 jjg/ml ampicillin (Ap) . Fra hvite kloner utvinnes plasmid-DNA og ved restriksjonsanalyse og DNA-sekvensanalyse bekreftes dannelsen av plasmid (3).

Fra plasmidet (3) utskjæres det lille EcoRI-Hindlll-fragmentet (4) og isoleres. Dette ligeres i en T4-DNA-ligase-reaksjon med det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl). Det dannede plasmidet pW226-l (5) karakteriseres ved restriksjonsanalyse.

Kompetente celler av stammen E.coli Mc 1061 transformeres med DNA fra plasmid pW 226-1. Kloner som er resiste mot ampicillin isoleres på Ap-holdige agarplater. Plasmid-DNA'et reisoleres fra Mc 1061-celler og karakteriseres deretter igjen ved hjelp av restriksjonsanalyse. Kompetente celler av E.coli-stammen W 3110 transformeres så med plasmid-DNA isolert fra E.coli Mc 1061-celler. E.coli W 3110-celler anvendes i det følgende til eksprimering. Tilsvarende de følgende betingelsene gjennomføres alle eksprimeringsforsøk i de angitte eksemplene.

En kultur som får stå over natten av E.coli-celler, som inneholder plasmidet (5), fortynnes med LB-medium (J. H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics". Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) , som inneholder 50 jjg/ml ampicillin i forholdet ca. 1:100, og veksten følges ved hjelp av 0D-måling. Ved OD = 0,5 innstilles kulturen på 1 mM IPTG og bakteriene frasentrifugeres etter 150 til 180 minutter. Bakteriene kokes 5 minutter i en bufferblanding (7 M urin-stoff, 0,1% SDS, 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0) og prøvene påføres på en SDS-gelelektroforeseplate. Etter elektroforese oppnås fra bakterier som inneholder plasmidet (5) et proteinbånd som tilsvarer størrelsen av det ventede proteinet (6 kD) .

De angitte induksjonsbetingelsene gjelder for rystekulturer; ved større fermenteringer er tilsvarende endrede OD-verdier og eventuelt lett varierte IPTG-konsentrasjoner hensiktsmessig.

Det oppnådde proteinet viser ingen biologisk aktivitet i celleprofileringsforsøk med en IL-2-avhengig cellelinje

(CTLL 2) .

Eksempel 1

Plasmidet (3) åpnes med Mlul og Sali og de to dannede fragmentene adskilles gelelektroforetisk fra hverandre. Det største fragmentet (11) isoleres.

Det syntetiske oligonukleotidet (12) ligeres med det buttende, proinsulinkodende DNA (13) (Wetekam et al., Gene 19

(1982) 1979-183) , hvorved DNA-sekvensen (14) oppnås. Denne skjæres med Mlul og Sali, hvorved DNA-sekvensen (15) oppnås. Denne ligeres så med fragment (11) hvorved plasmid pKH40 (16) dannes. Dette karakteriseres ved restriksjonsanalyse.

Plasmidet (16) nedbrytes med EcoRI og Hindlll og det lille fragmentet (17) isoleres ved geleketroforese. Ved ligering med det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) får man ekspresjonsplasmidet pK40 (18), ved ekspresjon ifølge eksempel C får man et protein som etter celleoppslutning finnes i den oppløselige cellulære proteinfraksjonen. Den intakte proinsulinsekvensen ble påvist ved "Western Blott"-teknikk.

Eksempel 2

Utgangsprodukt er plasmidet pPH3 0 som er gjengitt i den (ikke tidligere offentliggjorte) tyske patentsøknaden P 3541856.7 i fig. 3c. Ved foreliggende oppfinnelse er i fig. 2 IL-2-delsekvensen gjengitt som "A-E" (20). Enden av denne sekvensen og broleddet til proinsulinsekvensen er i fig. 2 gjengitt som (20a).

Plasmidet (20) nedbrytes med Pvul og Hindlll og det lille fragmentet (22) isoleres. Videre åpnes plasmidet (3) med EcoRI og Pvul og det lille fragmentet (23) isoleres. Videre nedbrytes vektoren pUC12 med EcoRI og Hindlll og det store fragmentet (21) isoleres. Ved ligering av fragmentene (21), (23) og (22) får man plasmidet pSLll (24).

Plasmidet (24) nedbrytes med Hindlll og partielt med EcoRI og fragmentet (25) isoleres, som inneholder segment A og proinsulingenet. Ved ligering av (25) i den lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) får man ekspresjonsplasmidet pSL12 (26) .

Ekspresjonen ifølge eksempel C og den etterfølgende opparbeidelsen gir et oppløselig fusjonsprotein. "Western Blot"-analyse med insulin-antistoffer bekrefter at dette proteinet inneholder den intakte insulinsekvensen.

Eksempel 3

Til amplifisering av proinsulingenet tjener plasmidet ptrED5-1 (30) (Hallewell et al., Gene 9 (1980) 27-47). Dette åpnes med Hindlll og Sali og det store fragmentet (31) isoleres. Fragmentet (31) ligeres med DNA-sekvensen (14), hvorved plasmidet pH106/4 (32) oppnås.

Plasmidet (32) nedbrytes med Sali og Mlul og det lille fragmentet (15) isoleres. Det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Ex2), segmentet (A,B) og fragmentet (15) ligeres, hvorved ekspresjonsplasmidet pK50 (33) oppnås.

Ekspresjonen av det kodede fusjonsproteinet gjennomføres analogt eksempel C. Cellene frasentrifugeres først fra kulturbuljongen og oppbrytes i "French-Press". Protein-suspensjonen separeres så ved sentrifugering i oppløselige og uoppløselige proteinbestanddeler. Begge fraksjonene analys-eres ved hjelp av gelelektroforese på kjent måte på 17% SDS-polyakrylamidgeler og deretter ved farging av proteinene med fargestoffet "Coomassie Blue"- Overraskende finnes at fusjonsproteinet foreligger i det uoppløselige sedimentet. "Western-Blot"-analysen med insulin-antistoffene bekrefter at intakt proinsulin foreligger i fusjonsproteinet.

Sedimentet fra "French-Press"-oppslutningen kan så videre anvendes direkte til isolering av Pro-Insulin.

Eksempel 4

Utgangsprodukt er plasmidet pPH20 (40), som er beskrevet i den tyske patentsøknad P 3541856.7 i fig. 3c. Ved skjæring av dette plasmidet med EcoRI, oppfylling av de overstående endene og skjæring med Hindlll får man fragment (41), hvorfra DNA-sekvensen for den i denne sammenheng interessante delen av (40) fremgår.

Ved ligering av det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Ex4) med segmentet (A,B), det syntetiske oligonukleotidet (42) og fragmentet (41) får man plasmidet pK51 (43).

Eksempel 5

Ved ligering av det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Ex2) med segmentet (A,B) , det syntetiske oligonukleotidet (51) og DNA-sekvensen (15) får man plasmidet pK52 (52). Den riktige orienteringen av oligonukleotidet (51) oppdages ved sekvensanalyse. Plasmidet koder for et fusjonsprotein som inneholder aminosyresekvensen tilsvarende oligonukleotidet (51) og er derved spaltbart ved den aktiverte faktoren Xa.

Plasmidet (52) kan også oppnås på følgende måte:

Skjærer man plasmidet (33) partielt med Mlul og ligerer det oppnådde åpnede plasmidet (53) med DNA-sekvensen (51), så oppstår også plasmidet pK52.

Eksempel 6

Skjærer man plasmidet (43) partielt med Mlul og ligerer det oppnådde lineariserte plasmidet (61) med den syntetiske DNA-sekvensen (51) , så får man plasmidet pK53 (62) . Dette koder, også for et fusjonsprotein som er spaltbart med den aktiverte faktoren Xa. Den riktige orienteringen av sekvensen (51) fastlegges som i eksempel 5 ved DNA-sekvensanalyse.

Eksempel 7

Plasmidet (26) spaltes med Xbal og partielt med Mlul og det store fragmentet (71) isoleres. Ved ligering med segmentet

(C) får man plasmidet pSL14 (72). Etter ekspresjon og celleoppslutning finnes fusjonsproteinet i den oppløselige

cellulære proteinfraksjonen.

Eksempel 8

Plasmidet (20) spaltes med Xbal og partielt med EcoRI og de overstående endene oppfylles, hvorved DNA-sekvensen (81) oppnås. Ved ligering under "blunt end"-betingelser oppnås plasmidet pPH31 (82). Fusjonsproteinet finnes i den uopp-løselige cellulære proteinfraksjonen.

Eksempel 9

Som utgangsmateriale tjener plasmidet (90) som er beskrevet i EP-A 0 171 024 (fig. 3). Dette plasmidet omsettes med Sali og deretter med AccI og det lille fragmentet (91) isoleres. Dette ligeres med det syntetiske oligonukleotidet (92), hvorved DNA-sekvensen (93) oppnås. Denne skjæres med Mlul, hvorved DNA-fragmentet (94) oppstår.

Plasmidet (33) nedbrytes partielt med Mlul og med Sali og det store fragmentet (95) isoleres. Dette ligeres med DNA-sekvensen (94), hvorved ekspresjonsplasmidet pK192 (96) oppnås. Dette koder for et fusjonsprotein hvori etter de 38 første aminosyrene av IL-2 følger metionin og deretter aminosyresekvensen for hirudin. Fusjonsproteinet finnes i den oppløselige cellulære proteinfraksjonen.

Eksempel 10

Som utgangsmateriale tjener plasmidet pHG23 (100) som er beskrevet i EP-A 0 183 350 og er allment tilgjengelig ved American type Culture Collection under nr. ATCC 39000. Dette plasmidet skjæres med SfaNI og de overstående endene oppfylles, det omsettes deretter med Pstl og det lille fragmentet (101) isoleres. Ved ligering av det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Ex3) med segmentet (A,B), det syntetiske oligonukleotidet (102) og fragmentet (101) får man ekspresjonsplasmidet pW214 (103). Dette plasmidet koder for et fusjonsprotein hvori etter de første 38 aminosyresekvensen av IL-2 fra oligonukleotidet (102) følger, hvilket tillater spaltningen av molekylet med faktoren Xa, hvoretter følger aminosyrerekken fra CSF. Etter celleoppslutning finnes fusjonsproteinet i den uoppløselige cellulære proteinfraksjonen.

Eksempel 11

Utgangsplasmidet pW216 (110) er foreslått i den tyske patentsøknaden P 3545568.7 (fig. 2b). I dette plasmidet følger en linker etter IL-2- sekvensen tilsvarende segmentene A til E (Pvul-snittsete), linkeren koder for aminosyrene Asp-Asp-Pro, umiddelbart fulgt av aminosyrerekken for CSF. Forbindelsessekvensen mellom IL-2 og CSF tillater proteolytisk spaltning av fusjonsproteinet.

Fra plasmidet (110) isoleres sekvensen (111) ved skjæring med Pvul og Hindlll.

Plasmidet (3) skjæres med Mlul og Xbal og det store fragmentet (112) isoleres. Dette ligeres med segmentet (C), hvorved plasmidet pW227 (113) oppnås. Dette plasmidet omsettes med EcoRI og Hindlll og det korte fragmentet (114) isoleres. Dersom dette fragmentet ligeres med det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) så får man plasmidet pW227-l

(115). Plasmidet koder for et fra IL-2 avledet protein som ikke har IL-2-aktivitet.

Plasmidet (113) skjæres videre med EcoRI og Pvul og det korte fragmentet (116) isoleres. Ved ligering av det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) med fragmentene (116) og (111) får man ekspresjonsplasmidet pW233 (117). Dette koder for et uoppløselig fusjonsprotein, som på grunn av den ovenfor nevnte linkeren er proteolytisk spaltbar.

Eksempel 12

Plasmidet (3) skjæres med Xbal og SacI og det store fragmentet (121) isoleres. Ved ligering med segmentet (D) får man plasmidet pW22 8 (122). Dette skjæres med EcoRI og Hindlll og det lille fragmentet (123) isoleres. Ved ligering av det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) med fragmentet (123) får man ekspresjonsplasmidet pW228-l (124). Dette plasmidet koder et biologisk inaktivt IL-2-derivat. Dette nedbrytes med EcoRI og Ovul og det korte fragmentet (125) isoleres. Ved ligering av det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) med fragmentene (125) og (111) får man ekspresjonsplasmidet pW234

(126). Dette koder for et tungt oppløselig fusjonsprotein som også er proteolytisk spaltbart.

Eksempel 13

Til konstruksjonen av plasmidene, som spesielt er egnede for uttrykking av cDNA-sekvenser, syntetiseres først polylinkersekvensen (131).

Ved ligering av de lineariserte plasmidet (1) med segmentet (A), polylinkersekvensen (131) og segmentet (F) får man plasmidet pH200 (132).

Plasmidet (132) omsettes med EcoRI og Mlul og det store fragmentet (133) isoleres. Dette ligeres med segmentet (A,B), dermed får man plasmidet pH201 (134).

Plasmidet (134) omsettes med EcoRI og Hindlll og det korte fragmentet (135) isoleres. Ved ligering av dette fragmentet med det lineariserte ekspresjonsplasmidet (Exl) får man ekspresjonsplasmidet pH202 (13 6).

Plasmidet (13 6) åpnes med BamHI og i det lineariserte plasmidet innføres cDNA som skal eksprimeres ved hjelp av en handelsvanlig BamHI-adaptor. Avhengig av orienteringen av cDNA er hver tredje sekvens i leserrammen knyttet til (A,B). Når cDNA-sekvensen ikke inneholder noe stoppkodon, så vil polypeptidsekvensen som kodes av denne i tillegg være beskyttet av aminosyresekvensen som tilsvarer segmentet (F).

Dersom cDNA ikke er knyttet i riktig leserramme så oppnås det en forskyvning av leserrammen ved at men f.eks. spalter det cDNA-holdige (opprinnelige eller formerte) plasmidet med Mlul eller Xbal (såfremt cDNA ikke inneholder snittseter for disse enzymene) og oppfyller de overstående endene ved Klenow-polymerasereaksj oner.

Vedlegg DNA- sekvens I

Claims

1. Fusjonsproteiner, karakterisert ved en Celler N-terminalandel som i det vesentlige tilsvarer aminosyresekvensen av interleukin-2 (IL-2), fortrinnsvis menneskelig IL-2, og omfatter 20 til 70 aminosyrer.

2 . Fusjonsproteiner ifølge krav 1, karakterisert ved en C- eller N-terminalandel som i det vesentlige tilsvarer aminosyresekvensen av interleukin-2 (IL-2), fortrinnsvis menneskelig IL-2, og omfatter 20 til 70 aminosyrer som blir kodet av DNA-sekvens I (vedheng).

3 . Fusjonsprotein ifølge krav 2, karakterisert ved at det for IL-2-andelen kodende genet i det vesentlige består av 1, 2 eller 3 av segmentene A til F, som angitt i figur A, av IL-2-genet (EcoRI)-A-Pstl-B-Mlul-C-Xbal-D-Sacl-E-Pvul-F-(Sali) i en hvilken som helst rekkefølge, eventuelt sammenknyttet ved hjelp av adapter- eller linkersekvenser.

4. Fusjonsproteiner ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det mellom IL-2-sekvensen og aminosyresekvensen av det ønskede proteinet er anordnet en aminosyre eller en aminosyrerekke som muliggjør den kjemiske eller enzymatiske avspaltningen av det ønskede proteinet fra IL-2-andelen, fortrinnsvis aminosyrene Met, Cys, Trp, Lys eller Arg eller en aminosyrerekke som inneholder disse aminosyrene C-terminalt.

5 . Fusjonsprotein ifølge krav 4, karakterisert ved at aminosyrerekken er Asp-Pro eller Ile-Glu-Gly-Arg eller C-terminalt inneholder en slik aminosyrerekke.

6. Vektor, karakterisert ved at den inneholder et DNA som koder for et fusjonsprotein som inneholder en Celler N-terminal del av human IL-2, idet denne andelen omfatter 2 0 til 70 aminosyrer og DNA inneholdes fortrinnsvis i et av plasmidene: pW226, pW226-l, pK40, pSL12, pK50, pK51, pK52, pSL14, pPH31, pK192, pW214, pW227, pW227-l, pW233, pW228, pW228-l, pW234, pH200, pH201 og pH202.

7. E.coli celle, karakterisert ved at den inneholder en vektor ifølge krav 6.