NO158740B

NO158740B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive 4-substituerte 2-azetidinonforbindelser.

Info

Publication number: NO158740B
Application number: NO841158A
Authority: NO
Inventors: Toshinari Tamura; Hidenori Iwamoto; Makoto Yoshida; Minoru Yamamoto
Original assignee: Yamanouchi Pharma Co Ltd
Priority date: 1983-03-25
Filing date: 1984-03-23
Publication date: 1988-07-18
Also published as: KR890002104B1; ES544236A0; DK164684A; ES544235A0; ES530960A0; EP0123444A1; DE3476399D1; DK164684D0; CA1256650A; NO841158L; ES8604136A1; KR870000357B1; US4564609A; ES544234A0; KR880009550A; ES8600279A1; KR840008021A; EP0123444B1; US4610821A; ES8604209A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive 4-substituerte 2-azetidinonforbindelser av generell formel I

13 4

hvori R , R og R som kan være lik eller forskjellig hver betegner et hydrogenatom eller en C, -C.-alkylgruppe; R<2>

betegner en imidazolylgruppe vist ved

eller

hvori R^ betegner et hydrogenatom, en C^-C4~alkylgruppe, en tosylgruppe eller 2,4-dinitrofenylgruppe; n betegner 0, 1,

2 eller 3; X betegner en methylengruppe, en ethylengruppe eller et svovelatom, og Y betegner en hydroxygruppe, en benzyloxygruppe eller en usubstituert eller substituert amino-

gruppe vist ved

hvori R^ og R<7>, som kan være lik

eller forskjellig, hver betegner et hydrogenatom, en C^~C4~ alkylgruppe, en hydroxy-C^-C^-alkylgruppe, en opp til C^Q-cycloalkylgruppe, en fenylgruppe, en 2-pyrrolidinon-l-yl-gruppe

6 7

eller en acetyloxy-C^-C^-alkylgruppe; hvilke R og R kan sammen med hverandre og sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet, danne en morfolinring, og optisk aktive og inaktive isomerer og salter derav.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er

kjennetegnet ved at

a) en carboxylsyre av generell formel II

hvori R1 og n har de ovenfor angitte betydninger, eller et reaktivt derivat derav, omsettes med et amin av generell formel VI 2 3 4 hvori R , R , R , X og Y har de ovenfor angitte betydninger; og når Y er en hydroxygruppe eller R 6 og R 7 betegner en hydroxy-C^-C^-alkylgruppe eller en 2-pyrrolidinon-l-yl-gruppe, kan disse grupper ha en beskyttende gruppe eller et reaktivt derivat derav, og når reaksjonsproduktet har en beskyttende gruppe fjernes denne beskyttende gruppe, eller b) en carboxylsyre av generell formel (IV) hvori R 1 , R 2og n har de tidligere angitte betydninger, eller et reaktivt derivat derav, omsettes med et syklisk amin av generell formel (V)

hvori R 3 , R 4, X og Y har de ovenfor angitte betydninger; og når Y er en hydroxygruppe eller R 6 eller R 7 betegner en hydroxy- C-^-C^-alkylgruppe eller en 2-pyrrolidinon-l-yl-gruppe, kan disse grupper ha en beskyttende gruppe eller et reaktivt derivat derav, og når reaksjonsproduktet har en beskyttende gruppe fjernes denne beskyttende gruppe.

Når bade R 3 og R 4 er en laverealkylgruppe, kan disse laverealkylgrupper være bundet til samme carbonatom.

Cycloalkylgruppen vist ved R 6 og R 7, er cycloalkyl-grupper med opp til 10 carbonatomer som kan være tverr-bundet, slik som en cyclopentylgruppe, en cyclohexylgruppe, en adamantylgruppe etc.

6 7

R og R kan være bundet til hverandre og danne en

morfolinogruppe

Den ønskede forbindelse vist ved generell formel I ifølge oppfinnelsen har minst 3 asymmetriske carbonatomer slik at det foreligger stereoisomerer.

Således innbefatter den ønskede forbindelse hver slik separert isomer og en blanding av isomerene.

Den ønskede forbindelse vist

ved generell formel I kan danne et salt med en syre eller base. Saltet av forbindelsen innbefatter saltene med ikke-toksiske syrer (f.eks. et uorganisk syresalt slik som et hydroklorid, et sulfat etc. og et organisk syresalt slik som et citrat, et acetat, et tartarat etc.) og saltene derav med ikke-toksiske baser (f.eks. saltene med en uorganisk base slik som et natriumsalt, et kaliumsalt etc. og saltene med en organisk base slik som et ammoniumsalt, et trimethylaminsalt etc.)

Som en forbindelse som har relasjon til

de ønskede forbindelser vist ved formel I, er kjent L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid (pGlu-His-Pro-NH2)

kalt "Thyrotropin Releasing Hormone" (TRH).

Eksistensen av TRH har allerede vært kjent siden 1960, men strukturen derav ble fastslått i 1970 (Endocrino-logy, 86, 1143(1970)). TRH angis å være et hormon som regule-rer frigivelsen av thyrotropin (TSH) i hypofysen i pattedyr. Senere undersøkelser har imidlertid fastslått at den biolo-i. giske funksjon av tripeptidet TRH ikke er begrenset til kontroll av frigivelsen av TSH, men TRH virker vidt på sentral-nervesystemet (CNS) og et område for nye undersøkelser er blitt utviklet basert på denne oppdagelse (Science, 178, 417/1972) and Lancet, 2, 999 (1972)). Således er det kjent at TRH og derivater derav har virkninger på CNS slik som nedset-telse av ekstra søvntid fremkalt av barbiturater eller alkohol, kontroll av hypothermia ved stimulering av forskjellige medikamenter, akselerering av den motoriske aktivitet, forhindring av haloperidolfremkalt katalepsi, hukommelsesforøkende effekt, forbedring av anti-psykisk effekt, en anti-depressiv effekt etc. i tillegg til den TRH-frigivende aktivitet (US patentskrift 3 865 934 og 3 932 623). Ennvidere er det blitt opp-daget at TRH er anvendbar for forbedring eller behandling av funksjonelle eller organiske forstyrrelser i hjernen, f.eks. en forstyrrelse av bevissthet fremkalt av hodeskade, hjerne-kirurgi, cerebro-vaskulære forstyrrelser, hjernetumorer etc,

i særdeleshet en akutt eller semiakutt forstyrrelse av bevissthet (belgisk patentskrift 839 833).

Utviklingen av TRH-derivater som utviser en svakere TSH-frigivende aktivitet enn TRH eller praktisk talt ingen TSH-frigivende aktivitet og som har virkning på CNS som er

lik eller høyere enn de foregående virkninger av TRH har vært etterlengtet. Således ble forskjellige TRH-derivater syntetisert for det foregående formål og virkningene på CNS er blitt ytterligere utvidet. Som forbindelser syntetisert for dette formål er det kjent et TRH-derivat. som har en svakere TSH-f ri-givende aktivitet enn TRH, som har en narkotikaantagoniserende virkning, en virkning som øker den spontane aktivitet, eller en dopaminlignende virkning, og er angitt å være anvendbar for forbedring eller behandling av sonifacient forgiftning, forstyrrelse av bevissthet, hyperaktive barn, schizofreni, nervedepresjon og parkinsons sykdom (japansk patentpublikasjon (ugransket) 116 465/77) og et TRH-derivat som har en virkning som forbedrer og behandler bevissthetsforstyrrelse etter en ytre skade på hodet og en nedsettende virkning av den ekstra søvntid som forårsakes av hexobarbital, og er angitt å være anvendbar for behandling av en pasient med bevissthetsforstyrrelse fremkalt av organiske eller funksjonelle forstyrrelser i hjernen, behandling av pasienter som utviser senilitet eller mental utmattelse og behandling av depresjonstilstander (japansk patentpublikasjon (ugransket) 59 714/81).

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, har

det strukturelle trekk ved at pyroglutamyl (pGlu) struktur-gruppen i TRH er omdannet til en azetidinonstruktur (p-lactamstruktur) som tidligere ikke er blitt utviklet. Når det gjelder medisinsk virkning, har forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen en mer bemerkelsesverdig sterk CNS-virkning enn TRH og de konvensjonelt kjente TRH-derivater og er således meget anvendbare som medikamenter. Eksempelvis er forbindelsene anvendbare for å forbedre bevissthetsforstyrr-elser når det gjelder schizofreni, nervedepresjon, følger av cerebro-vaskulære forstyrrelser, hodeskade, senil dementia, epilepsi etc, eller for å forbedre hypobulia, depressive syndromer, hukommelsestap etc

De etterfølgende forsøk viser virkningen overfor lav kroppstemperatur med pentobarbitol (forsøk 1), virkningen overfor bevissthetsforstyrrelse ved hodeskade (forsøk 2) og virkningen overfor akutt toksisitet (forsøk 3) for typiske forbindelser av forbindelsene av generell formel I.

Forsøk 1

Pentobarbital- fremkalt hypothermia;

Ni hanmus som veide 18 til 22 g ble anvendt for

hver dose av testforbindelsene. Musene ble intravenøst gitt forskjellige doser av TRH eller de testede forbindelser 10 minutter etter pentobarbital (55 mg/kg i.p.) Rektaltemperatur ble målt før pentobarbitaldosering og umiddelbart før og 30 minutter etter administrering av testforbindelsene. Virkningen av testforbindelsene ble vurdert som ED^5°^' & en nødvendige dose for å redusere med 1,5°C pentobarbitalhypothermia i kontrollgruppen av mus som mottok bare pentobarbital og salt-vann. Resultatene er vist i tabell 1.

Forsøk 2

Bevissthetsforstyrrelse fremkalt ved konkussiv hodeskade;

9 hanmus som veide 18 til 22 g ble anvendt for hver dose av testforbindelsene. Et acrylatholdig lodd (20,5 g, 19 mm både i diameter og tykkelse) ble sluppet på hodet av musene fra en høyde på 18 cm. Musene mistet bevisstheten og forble ^bevisstløse i en viss tid. Tiden fra sjokket opp til starten av spontan bevegelse ble nedtegnet som den spontane bevegelses tid. Testforbindelsene ble administrert intravenøst 10 minutter før fremkalling av konkussiv hodeskade og virkningene av testforbindelsene ble vurdert som ED^q%, dvs. den nødvendige dose for å redusere med 50% den spontane bevegelsestid for kontrollgruppen. Resultatene er vist i tabell 1.

Forsøk 3

Akutt toksisitet

En vandig fysiologisk saltvannløsning av 1493 mg/kg av en testf orbindelse, N01- \ (S) -2-azetidinon-4-carbonyl3 -Li-ti ist idyl-L-pr ol inamid ble intravenøst administrert til en gruppe av 9 hanmus og disse ble observert i 24 timer, men ingen dødsfall ble observert. Det vil si at LD5Q (i.v.) for forbindelsen ifølge oppfinnelsen var høyere enn 1493 mg/kg. Når det gjelder administrering av TRH til mus var på den annen side LDjjq (i.v.) 751 mg/kg (i.v.)

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil bli forklart mer i detalj i det etterfølgende.

Reaksjonsforløpene for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vist i det etterfølgende reaksjonsskjerna:

Forbindelsen vist ved formel (1^),

kan omdannes til forbindelsen av formel (I2) ved hydrolyse

eller katalytisk reduksjon når Y er en benzyloxygruppe, eller ved omsetning med et usubstituert eller substituert amin når Y er en hydroxygruppe. Når substituenten R i lmidazolylgruppen vist ved R 2 er en tosyl- eller 2,4-dinitrofenyl-gruppe, kan forbindelsen av formel (I2) hvori R"* er et hydrogenatom erholdes ved å fjerne substituenten på vanlig måte.

12 3 4

I reaksjonsskjemaene har R , R , R , R , n, X og Y

de tidligere angitte betydninger; R 2 1 betegner et tilfelle hvori substituenten R 5 i imidazolylgruppen vist ved R 2 er et hydrogenatom; og Y' betegner en hydroxygruppe eller en usubstituert eller substituert aminogruppe.

Ifølge fremgangsmåten kan den ønskede forbindelse av formel I fremstilles ved (a) ved omsetning av forbindelsen av formel II og forbindelsen av formel III under dannelse av forbindelsen av formel IV hvoretter forbindelsen av formel IV omsettes med forbindelsen av formel V, eller (b) ved omsetning av forbindelsen av formel III og forbindelsen av formel V under dannelse av forbindelsen av formel VI, hvoretter forbindelsen av formel VI omsettes med forbindelsen av formel II.

Den .ønskede forbindelse av formel (1^) kan overføres til andre ønskede forbindelser av formel (I2) ved omdannelse av substituenten Y.

Reaksjonen anvendt for fremstilling av forbindelsen av formel I i den foregående prosess (a) eller (b) er en peptid-syntesereaksjon og utføres på kjent måte. Som vanlig anvendte metoder kan nevnes en metode som gjør bruk av dicyclohexyl-carbodiimid som kondenseringsmiddel, en azidmetode, en syre-kloridmetode, en syreanhydridmetode,.en aktiv estermetode etc. Disse metoder utføres som følger: Før utførelse av den peptid- dannende reaksjon i hvert trinn vil de funksjonelle grupper i utgangsforbindelsen slik som en aminogruppe, en iminogruppe, en carboxygruppe etc. som ikke tar del i reaksjonen vanligvis bli beskyttet, og en aminogruppe, en iminogruppe eller en carboxygruppe av forbindelsen som tar del i reaksjonen aktiveres om nødvendig. Forbindelsen hvori aminogruppen, iminogruppen eller carboxygruppen er aktivert, f.eks. den aktive ester, kan underkastes peptidsyntesereaksjonen etter at den er isolert fra reaksjonsblandingen eller kan underkastes peptidsyntese-reaks jonen uten isolering.

Eksempler på beskyttende grupper for aminogruppen er en benzyloxycarbonylgruppe, en t-butyloxycarbonylgruppe, en p-methoxybenzyloxycarbonylgruppe, en fthaloylgruppe, en trifluor-acetylgruppe, etc, og eksempler på den beskyttende gruppe for iminogruppen er en tosylgruppe, en benzyloxycarbonylgruppe,

en p-methoxybenzyloxycarbonylgruppe, en benzylgruppe, en 2,4-dinitrofenylgruppe etc. Den beskyttende gruppe for carboxyl-gruppen anvendes i form av en ester slik som en methylester, en ethylester, en benzylester, en p-nitrobenzylester, en t-butylester etc.

Aktivering av gruppen som tar del i reaksjonen ut-føres ved en fosfatoprosess under anvendelse av fosfortri-klorid, en isocyanatprosess under anvendelse av fosgen, eller en fosforsyreesterprosess når gruppen er en aminogruppe eller en iminogruppe eller utføres i form av en aktiv ester (f.eks. 2,4-dinitrofenolester, N-hydroxysuccinimidester, etc.) en azidgruppe, eller et carboxylsyreanhydrid når gruppen er en carboxygruppe.

Blant de foregående metoder for utførelse av peptid-syntesereaks jonen foretrekkes det å utføre koblingsreaksjonene av forbindelsen av formel IV og forbindelsen av formel V ved azidmetoden eller ved metoden som gjør bruk av dicyclohexyl-carbodiimid som kondenseringsmiddel. En metode for direkte dannelse av peptidet under anvendelse av N-carboxyanhydrid eller aminosyre uten anvendelse av en beskyttende gruppe kan også anvendes.

Deretter utføres den peptiddannende reaksjon i et inert løsningsmiddel ved romtemperatur eller ved oppvarming på vanlig måte. Eksempler på egnede løsningsmidler anvendt ved reaksjonen er dimethylformamid (DMF), ethylacetat, diklormethan (methylenklorid), tetrahydrofuran etc.

Hvis det er nødvendig å fjerne en beskyttende gruppe fra reaksjonsproduktet kan den beskyttende gruppe fjernes ved katalytisk reduksjon når den beskyttende gruppe er benzylester; ved anvendelse av vannfri hydrogenfluorid, N-hydroxy-1,2,3-benzotriazol (HOBT) eller et hydrogenfluorid-pyridinkompleks når den beskyttende gruppe er p-toluensulfonylgruppe; ved hydrolyse når den beskyttende gruppe er en alkylester; ved katalytisk reduksjon eller hydrobromsyre-eddiksyrebehandling når den beskyttende gruppe er p-methoxybenzyloxycarbonyl; eller syrespaltning når den beskyttende gruppe er en t-butyloxycarbonylgruppe.

I reaksjonen for omforming av den ønskede forbindelse av formel I til andre ønskede forbindelser ved omdannelse av substituenten Y i forbindelsen av formel I kan reak-sjonsbetingelsene hensiktsmessig velges alt etter karakteren av de forbindelser som tar del i reaksjonen. Detaljene ved disse betingelser vil bli illustrert i de etterfølgende eksempler .

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved de etter-følgende eksempler.

Fremgangsmåter for fremstilling av utgangsmaterialene anvendt i flere av eksemplene vil først bli illustrert som referanseeksempler.

De forkortelser som anvendes i eksemplene har føl- : gende betydning:

I tillegg er forbindelsen inneholdende markeringen N<im> i navnene for forbindelsene en blanding av en tt nitrogenatomsubstituert ^<-su>bst<it>uentj forbindelse av imidaZol-i ringen av histidin og en t nitrogenatomsubstituert forbindelse. Referanseeksempel 1

I 350 ml methanol ble oppløst 3,46 g (S)-4-benzyloxycarbonyl-2-azetidinon (1) og azetidinonet ble hydrogenert under anvendelse av 350 mg 10%-ig palladium-carbon som katalysator. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert til tørrhet under dannelse av 1,94 g (S)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (2).

NMR (DMSO-dcb ) 6 ppni: 8,26 (s, 1H), 4,02 (dd, 1H,

J=3,4 Hz, 6,9 Hz), 3,21 (dd, 1H, J=6,9 Hz, 16,0 Hz), 2,82 (dd, 1H, J=3,4 Hz, 16,0 Hz).

IR (KBr) cm<-1>: 3320, 1740, 1720

Masse: 116 (M<+> + 1)

Referanseeksempel 2

I 99 ml av en vandig løsning av 1N saltsyre ble opp-løst 10,01 g Na-benzyloxycarbonyl-L-histidinhydrazid (3). Etter tilsetning av 132 ml ethylacetat ble 8,25 ml av en vandig løsning av 2,313 g natriumnitritt tilsatt til blandingen under kraftig omrøring og under isavkjøling. Etter utførelse av reaksjonen ved 0°C i 5 minutter ble 39,6 ml av en vandig 50%-ig kaliumcarbonatløsning tilsatt til reaksjonsblandingen under isavkjøling for å gjøre løsningen alkalisk. Reaksjonsblandingen ble anbragt i en skylletrakt og det organiske lag ble oppsamlet. Det vandige lag ble ekstrahert med 20 ml ethylacetat og ekstraktet ble kombinert med det foregående organiske lag. Blandingen ble tørket over vannfritt natriumsulfat under isavkjøling i 10 minutter. Ved fjerning av det vannfrie natriumsulfat ved filtrering ble det erholdt 152 ml av en ethylacetatløsning av N ct-benzyloxycarbonyl-L-histidin-azid (4). Produktet ble avkjølt på is og 20 ml av en ethyl-acetatløsning av 5,703 g L-prolinbenzylester (5) ble tilsatt.

Blandingen ble omsatt over natten ved 0° hvoretter reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet. Residuet ble oppløst i 22 ml kloroform-methanol (10:1) og underkastet silicagelkolonnekromatografi. Eluatet dannet med kloroform-methanol (95:5) ble konsentrert til tørrhet under dannelse av 6,602 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolinbenzylester (6) .

NMR (CDC'l3) 6ppm: 7,45 (1H), 7,14 (s, 5H) , 7,10 (s, 5H) ,

6,82 (1H), 5,70 (d, 1H, J=8,5 Hz), 5,20 (s, 2H), 5,06 (s, 2H), 4,4-4,8 (m, 2H), 2,8-3,9 (m. 2H),

3,09 (d, 2H, J=5,7 Hz), 1,6-2,5 (m, 4H)

Masse: 476 (M<+>), 396, '325, 244, 91, 70.

Referanseeksempel 3

Etter isavkjøling av 20 ml av en eddiksyreløsning av 25% hydrobromsyre, ble 1,91 g av forbindelse (6) tilsatt til løsningen som deretter fikk reagere i 2 timer ved 5-10°C. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til 200 ml tørr ether, og etter hurtig fjerning av det således dannede bunnfall ved filtrering ble reaksjonsblandingen tørket over natten i en eksikator med kaliumhydroxyd, under dannelse av 1,99 g L-histidyl-L-prolinbenzylester.2-hydrobromid (7).

NMR (CDCI3 + CD3OD) 6ppra: 8,75 (1H), 7,57 (1H), 7,35

(s, 5H) , 5,2 (1H) .

Eksempel 1

I 13 ml DMF ble oppløst 826 mg L-histidyl-L-prolinamid 2-hydrobromid (8) og deretter ble 2 ml av en DMF-løsning av 405 mg triethylamin tilsatt til løsningen under isavkjøling. Etter 30 minutter under isavkjøling ble det dannede bunnfall filtrert fra under dannelse av L-histidyl-L-prolinamid (9). Produktet ble umiddelbart anvendt for den etterfølgende syn-te sereaksjon.

I 10 ml DMF ble oppløst 230 mg av forbindelse (2) og deretter 351 mg HOBT og 4 53 mg DCC ble tilsatt løsningen under isavkjøling. Etter omrøring av blandingen i 15 minutter fikk reaksjonen forløpe i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble igjen avkjølt på is og 15 ml av en DMF-løsning av den foregående forbindelse (9) ble tilsatt til reaksjonsblandingen etterfulgt av omsetning over natten ved 0°C. Det dannede bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert til tørrhet, residuet ble oppløst i 10 ml kloroform-methanol (4:1) og underkastet silicagelkolonnekromatografi. Eluatene erholdt med kloroform-methanol (7:3) ble oppsamlet og konsentrert til tørrhet under dannelse av 509 mg urent Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinamid (10).

Når produktet ble underkastet silicagelkolonnekroma-tograf i og eluert med en blanding av kloroform, methanol og vandig ammoniakk (40:10:1) ble det erholdt 394 mg av det rene produkt (10).

NMR (CD,OD) 6 : 7,59 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 4,41 (dd,

j ppm

(1H), 4,11 (dd, 1H, J=3,1 Hz, 5,9 Hz), 3,36-3,96

(m, 2H), 3,05 (dd, 1H, J=5,9 Hz, 14,9 Hz), 2,80

(dd, 1H, J=3,1 Hz, 14,9 Hz), 1,72-2,20 (m, 4H) Masse: 348 (M<+>), 234, 207, 154, 82, 70

[o]2)3 = - 75,8° (C = 0,6, methanol)

[a]<24> = -100,4° (C = 1, vann)

Når forbindelse (10) ble triturert med en liten mengde methanol krystalliserte forbindelsen. Smeltepunkt 183-185°C.

Elementær analyse for c-| 5H2QN6°4 ' ^ H20:

Når forbindelsen (10) ble omkrystallisert fra methanol ble det erholdt produkter med forskjellig krystallform alt etter krystalliseringsbetingelsene. Produkter med smelte-punkter på 145-149°C, 154-157°C, 154-163°C, 181,5-183,5°C, 187-189°C etc, ble erholdt og disse ble fastslått å være polyamorfe krystaller ved infrarød absorpsjonsspektra (KBr-tablett), røntgendiffraksjon, differentiell spredningskalo-metri etc Forskjellen i smeltepunkt skyldes blandingsforhol-det av de forskjellige krystallformer. Egenskapene (NMR, optisk rotasjon etc.) av løsningene av disse produkter utviste samme egenskaper.

Eksempel 2

I 45 ml diklormethan ble oppløst 1,99 g L-histidyl-L-prolinbenzylester . 2-hydrobromid (7) og etter avkjøling av løsningen til -20°C ble 5 ml av en diklormethanløsning av 900 mg triethylamin tilsatt til løsningen. Etter omsetning i én time ved -10 til -20°C ble bunnfallet filtrert fra under dannelse av en løsning inneholdende L-histidyl-L-prolinbenzylester (11). Produktet ble umiddelbart anvendt i den etterføl-gende syntesereaksjon.

I 30 ml diklormethan ble suspendert 455 mg av forbindelse (2), og etter tilsetning av 801 mg HOBT og 1,059 g DCC og omrøring av blandingen i 15 minutter ble reaksjonen utført i 15 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble igjen isavkjølt hvoretter 50 ml av en diklormethanløsning av den foregående forbindelse (11) ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter omsetning av blandingen i én time under isavkjø-ling fikk reaksjonen forløpe ved romtemperatur over natten. Det dannede bunnfall ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert til tørrhet. Det således erholdte residuum ble oppløst i 20 ml vann-methanol (4:1) og ble underkastet HP-20 kolonnekromatografi. Kolonnen ble eluert med vann-methanol (1:4) og eluatet ble konsentrert til tørrhet hvorved det ble erholdt 1,135 g urent Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinbenzylester (12). Når produktet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi og eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:10:1) ble det erholdt 827 mg av det rene produkt (12).

NMR (CD3OD) 6ppm: 7,58 (1H), 7,34 (s, 5H), 6,88 (1H),

5,15 (s, 2H), 4,50 (dd, 1H), 4,08 (dd, 1H, J=3,3 Hz, 5,9 Hz), 3,40-3,92 (m, 2H), 3,04 (dd, 1H, j=5,9 Hz, 14,9 Hz), 2,76 (dd, 1H, J=3,3 Hz, 14,9 Hz), 1,65-2,20 (m, 4H)

Masse: 439 (M<+>), 325

Eksempel 3

I 150 ml methanol ble oppløst 78 2 mg Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinbenzylester (12) og forbindelse (12) ble hydrogenert i 2 timer ved romtemperatur under anvendelse av 156 mg 10% palladium på carbon som katalysator. Når katalysatoren var filtrert fra og filtratet ble konsentrert, ble det erholdt 620 mg N<01->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolin (13).

NMR (CD3OD) 6ppm: 8,44 (1H), 7,28 (1H), 4,94 (1H), 4,44

(dd, 1H), 4,14 (dd, 1H, J=3,1 Hz, 5,9 Hz), 3,3-4,0 (m, 2H), 3,25 (dd, 1H, 5,9 Hz, 14,9 Hz), 2,86 (dd, 1H, J=3,1 Hz, 14,9 Hz), 1,7-2,4 (m, 4H)

Masse: (diazomethanbehandling, som dimethylforbindelse): 377 (M<+>), 263, 221, 96, 70

Eksempel 4

I 8 ml DMF ble oppløst 277 mg av forbindelse (13) hvoretter 168 mg HOBT og 330 mg DCC ble tilsatt til løsningen under isavkjøling. Etter utfellelse av reaksjonen i én time under isavkjøling fikk reaksjonen ytterligere forløpe i to timer ved romtemperatur. Etter isavkjøling av reaksjonsblandingen ble 2 ml av en DMF løsning av 80 mg monoethanolamin tilsatt og reaksjonen fikk forløpe i én time og deretter over natten ved romtemperatur. Bunnfallet ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert til tørrhet og det således dannede residuum ble oppløst i 10 ml av kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:10:1) og underkastet silicagelkolonnekromatografi. Deretter ble produktet eluert med samme løsningsmiddel under dannelse av 106 mg N - [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-L-prolinamid (14).

NMR (CD3OD) 6ppm: 7,74 (1H), 7,00 (1H), 4,41 (1H, d,d),

4,12 (d,d, J=2,9 Hz, 5,5 Hz), 3,08 (2H, t, J=7,1 Hz), 3,62 (2H, t, J=7,1Hz), 2,81 (d,d, J=2,9 Hz, 15,7 Hz) Masse: 392 (M<+>), 279, 207

_ Når forbindelsen (14) ble triturert med ether krystalliserte forbindelsen. Produktet ble omkrystallisert fra ethanol, sm.p. 239-241°C (spaltet).

[ct]<24>= -87,3°(C = 0,13, methanol)

IR (KBr) cm<-1>: 3280, 3180, 2950, 1760, 1650,

1635, 1550

Elementær analyse for C^<H>2^NgO^:

I 30 ml diklormethan ble oppløst 876 mg 3-[Nlm<->(2,4-dinitrofenyl)-L-histidyl]-L-thiazolidin-4-carboxamid.2-hydroklorid (15) og etter tilsetning av 2 ml av en diklormethan-løsning av 388 mg triethylamin under isavkjøling ble reaksjonen ytterligere utført i 3 0 minutter ved 0°C under dannelse av en løsning av 3-[Nlm<->(2,4-dinitrofenyl)-L-histidyl3-L-thiazol-idin-4-carboxamid (16).

I 6 ml DMF ble oppløst 223 mg av forbindelse (2),

og etter tilsetning av 389 mg HOBT og 517 mg DCC under isavkjø-ling ble reaksjonen utført i 30 minutter ved 0°C og deretter i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble av-kjølt på is igjen og 32 ml av diklormethanløsningen av forbindelse (16) ble tilsatt. Blandingen ble omsatt over natten ved 0°C. Det således dannede bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert til tørrhet og residuet ble oppløst i 20 ml kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:10:1) og underkastet silicagelkolonnekromatografi. Produktet ble eluert med samme løsningsmiddel som ovenfor angitt under dannelse av 347 mg 3-[Na-[ (S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-Nlm-(2,4-dinitro-fenyl)-L-histidyl]-L-thiazolidin-4-carboxamid (17) .

NMR (CD3OD) 6ppm: 8,93 (d, 1H, J=3,1 Hz), 8,63 (dd, 1H,

J=3,1 Hz, 9,0 Hz), 7,92 (d, 1H, J=9,0 Hz), 7,87 (s, 1H), 7,26 (s, 1H), 4,43 (d, 2H, J=9,5Hz), 4,14 (dd, 1H, J=3,1 Hz, 5,9 Hz), 2,86 (dd, 1H, J=3,1 Hz, 14,7 Hz)

Masse: 419 (M<+->C4H5N202), 372, 248, 81

Eksempel 6

I 15 ml DMF ble oppløst 337 mg av forbindelse (17), og etter tilsetning av 2 ml mercaptoethanol ble reaksjonen ut-ført i 3 0 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet og residuet ble oppløst i 20 ml kloroform-methanol-vandig ammoniakk (30:10:1) og ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Deretter ble produktet eluert med samme løsningsmiddel som ovenfor beskrevet under dannelse av 214 mg 3-[Na- [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl]-L-thiazolidin-4-carboxamid (18) .

NMR (CD3 -.0D) 6 ppm: 7,55 (1H), 6,91 (1H), 4,32 (d, 2H,

J=9,5 Hz), 4,07 (dd, 1H, J=3,1 Hz, 5,9 Hz)

Masse: 367 (M<+> + 1), 253, 206, 115

Referanseeksempel 4

I 90 ml tørr methylenklorid ble oppløst 6,28 g N<01->t-butyloxycarbonyl-N<im->tosyl-L-histidyl-DL-pipecolinsyre (19) og 1,39 g N-hydroxysuccinimid (HOSu) og løsningen ble avkjølt på et isbad. Etter tilsetning av 2,74 g DCC ble den resulterende blanding omrørt i 3 timer på et isbad, og etter filtrering av uløselige bestanddeler ble filtratet konsentrert ved redusert trykk. Det således dannede residuum ble oppløst i ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med vandig natriumhydrogencarbonat, vann og vandig natriumkloridløsning. Det organiske lag ble oppsamlet og tørket hvoretter løsningsmidlet ble fjernet. Det sirupaktige produkt ble triturert med en 1:1 blanding av ether og petroleumether. Den krystallinske forbindelse (20) ble tørket og ble anvendt i den etterfølgende omsetning. I 40 ml tetrahydrofuran (THF) ble oppløst 2,3 g av forbindelse (20) hvoretter 5 ml av en THF løsning av 251 mg ethanolamin ble tilsatt til løsningen under isavkjøling. Etter utførelse av reaksjonen i én time under omrøring og under is-avkjøling ble løsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i kloroform og løsningen ble vasket suksessivt med vandig natriumhydrogencarbonat, vann og vandig natriumkloridløsning. Det organiske lag ble oppsamlet og etter fjerning av løsningsmidlet ble residuet triturert med ether under dannelse av 1,05 g fast Na-t-butyloxycarbonyl-Nim-tosyl-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-DL-pipecolamid (21). Modervæsken ble konsentrert og underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering med 1% methanol-kloroform ble det erholdt 0,66 g av forbindelse (21).

IR (KBr) cm"<1>: 3360, 2920, 1680, 1640, 1170

NMR (CD3OD) 6ppm: 7,28-8,4 (6H, imidazolringhydrogen,

benzenringhydrogen), 2,4 4 (3H, methyl av tosylgruppe), 1,0-1,5 (bred, BOC hydrogen)

I 40 ml methylenklorid ble oppløst 1,71 g av forbindelse (21), og etter tilsetning av 40 ml trifluoreddiksyre under isavkjøling fikk reaksjonen forløpe i 2 timer under om-røring. Den således erholdte reaksjonsblanding ble tørket ved redusert trykk, det dannede residuum ble azeotropisk dehydrert flere ganger under anvendelse av toluen og ble deretter tørket. Ved triturering av residuet med ether ble det faste trifluor-acetat av forbindelse (22) erholdt. Produktet ble tørket og ble anvendt for den etterfølgende reaksjon. I 8 ml DMF ble oppløst 1,3 g av trifluoracetatet og deretter ble 274 mg triethylamin tilsatt til løsningen under isavkjøling. Deretter ble pH på blandingen justert til 7 til 8 med ytterligere triethylamin mens pH ble kontrollert under anvendelse av et pH-papir.

I en blanding av 8 ml methylenklorid og 1,5 ml DMF ble oppløst 286 mg av forbindelse (2) og 557 mg DCC, og til den således erholdte reaksjonsblanding ble tilsatt den foregående fri aminløsning under isavkjøling. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten i et kjøleskap. Uløselige bestanddeler ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble oppløst i kloroform og løsningen ble vasket tre ganger med vann. De organiske lag ble oppsamlet, tørket, og løsningsmidlet ble fjernet under dannelse av en sirup som ble underkastet kolonnekromatografi på 140 ml silicagel. Ved eluering med en blanding av 7% methanol-kloroform ble det erholdt 537 mg av den ønskede forbindelse Na<->[(S)-azetidinon-4-carbonyl]-N<im->tosyl-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl) DL-pipecolamid (23).

NMR (CDC13) 6ppm: 7,0-8,3 (9H, imidazolhydrogen,

benzenhydrogen, NH), 5,08 senter (2H, a-methinhydrogen av histidin, a-methinhydrogen av pipecolin-syre), 4,08 (1H, 4-stilling hydrogen av azetidinonring), 2,44 (3H, methyl av tosylgruppe)

Masse m/z: 559 (M-1), 472, 402, 388

Eksempel 8

115 ml tørr methylenklorid ble oppløst 250 mg av forbindelse (23) og 73 mg HOBT og reaksjonen fikk forløpe i 5 timer ved romtemperatur under omrøring hvorved uløselige bestanddeler utfeltes. Løsningsmidlet ble fjernet fra reaksjonsblandingen og det dannede residuum ble underkastet kolonnekromatografi på 100 ml silicagel. Ved eluering med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2), ble 116 mg av den ønskede forbindelse Na<->£(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-DL-pipecolamid (24) erholdt. Produktet var en blanding av diastereomerer og utviste to flekker ved TLC.

IR (prøven ble målt med KBr tablett etter lyofili-sering) cm<-1>: ,3250 (NH, OH), 1750 (4-leddet ring-lactam), 1630 senter (bred, amid)

NMR (CD3OD) 5ppm: 7'65 (1H, imidazolringhydrogen),

6,92 (1H, imidazolhydrogen), 4,14 (1H, d,d, 4-stilling hydrogen av azetidinonring), 1,2-1,8 (6H, methylenhydrogen av piperidinring)

Masse m/z: 406 (M<+>), 388, 345, 318

Referanseeksempel 5

Fra 2,8 g av forbindelse (20) fremstilt fra forbindelse (19) ved samme prosedyre som i referanseeksempel 4, og 755 mg 1-aminoadamantan, ble det erholdt Na<->t-butyloxycarbonyl-Nlm<->tosyl-L-histidyl-N-(1-adamantyl)-DL-pipecolamid (25) i kvantitativt utbytte.

NMR (CD3OD) <5ppm: 7,1-8,3 (6H, imidazolringhydrogen,

benzenringhydrogen), 2,44 (3H, methyl av tosylgruppe) Masse m/z: 653 (M<+>), 502, 475, 419

Eksempel 9

BOC-gruppen ble fjernet fra forbindelse (25) på lignende måte som i det foregående eksempel 7, og det således erholdte fluoracetat av forbindelse (26) ble omdannet til den fri base under anvendelse av triethylamin som i eksempel 7. Deretter ble 2,15 mmol av det fri amin og 29 0 mg av forbindelse (2) underkastet en koblingsreaksjon på lignende måte som beskrevet i eksempel 7. Etter at reaksjonen var fullført ble uløselige bestanddeler filtrert fra og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Det således dannede residuum ble oppløst i ethylacetat og løsningen ble vasket tre ganger med vann. Det organiske lag ble oppsamlet og tørket, og etter fjerning av løsningsmidlet ble residuet underkastet kolonnekromatografi på 220 mg silicagel. Ved eluering av produktet med 3% methanol-kloroform ble det erholdt 598 mg av det ønskede produkt Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-Nlm<->tosyl-L-histidyl-N-(1-adamantyl)-DL-pipecolamid (27) som et pulver.

NMR (CD3OD) <5ppm: 7,2-8,24 (6H, imidazolringhydrogen,

benzenringhydrogen), 4,04 senter (1H, 4-stilling

hydrogen av azetidinonring), 2,44 (3H, methyl av tosylgruppe), 1,2-2,3 (21H, methylenhydrogen av piperidinring, adamantylgruppehydrogen)

IR (KBr) cm"<1>: 3280, 2900, 1760, 1640 senter (bred) Masse m/z: 650 (M<+>), 472, 402, 360

Eksempel 10

I 10 ml methylenklorid ble oppløst 510 mg av forbindelse (27) og 130 mg HOBT, og løsningen ble omrørt i 7 timer ved romtemperatur. Etter fjerning av løsningsmidlet fra reaksjonsblandingen ble residuet underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble to diastereomerer separert. 98 mg av forbindelsen med liten polaritet, Na<->['2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-(1-adamantyl)-pipecolamid (28a) ble først eluert på silicagelkolonnen hvoretter 128 mg av en blanding av forbindelse (28a) og stereosiomeren (28b) ble erholdt. Deretter ble 6 3 mg av forbindelse (28b) eluert. Egenskapene av forbindelsene (28a) og (28b) var som følger:

Forbindelse (28a)

NMR (CD3OD) Sppm: 7,66, 7,58, 6,92, 6,90 (imidazolring C-H), 4,10 (1H, d,d, 4-stilling hydrogen av azetidinonring), 2,04 senter, 1,72 senter (21H, methylenhydrogen av piperidinring, adamantylgruppehydrogen),

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 1760, 1640 senter (bred),

1520, 1440

[a]g6 = -74,9° (C = 1,1, methanol)

Masse m/z: 496 (M<+>), 382, 345, 318, 261

Forbindelse (28b)

NMR (CD3OD + DMSO-d<6>) 6 : 7,64, 6,90 (imidazolring C-H), 4,10 senter (1H, d,d, 4-stilling av azetidinonring), 2,02 senter, 1,70 senter (21H, methylenhydrogen av piperidinring, adamantylgruppehydrogen)

IR (KBr) cm"<1>: 3200, 1750, 1530, 1440, 1640

[a]<26> = +82,4° (c = 1,3, methanol)

Masse m/z: 496 ,(M+) , 345, 318, 261

Referanseeksempel 6

I 50 ml THF ble oppløst 4,99 g N-benzyloxycarbonyl-L-prolin hvoretter 2,23 g triethylamin ble tilsatt til løsnin-gen. Etter langsom tilsetning av 2,39 g ethylklorformiat under isavkjøling fikk reaksjonen forløpe i én time ved 0 til 5°C. Deretter ble 2,19 g n-butylamin langsomt tilsatt til reaksjonsblandingen under isavkjøling og reaksjonen fikk for-løpe i én time ved 0 til 5°C. Løsningsmidlet ble fjernet fra reaksjonsblandingen, det dannede residuum ble oppløst i ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med en vandig løs-ning av 1N saltsyre, en mettet, vandig natriumhydrogencarbonåt-løsning, og en mettet, vandig natriumkloridløsning. Det organiske lag ble oppsamlet, tørket med Glaubers salt og ble deretter krystallisert til tørrhet. Produktet ble omkrystallisert fra vann under dannelse av 4,31 g (S)-1-benzyloxycarbonyl-N-butyl-2-pyrrolidincarboxamid (30), sm.p. 88-90°C.

NMR (CDC13) 5ppm: 7'36 (s' 5H)' 5'17 <s' 2H>' 4'33

(dd, 1H), 3,51 (t, 2H), 3,21 (dd, 2H), 1,65-2,40 (4H), 1,05-1,65 (4H), 0,70-1,05 (3H)

IR (KBr) cm<-1>: 3280, 2950, 1715, 1640, 1540

Masse (EI): 304 (M<+>), 232, 204, 91, 70

Referanseeksempel 7

I 140 ml methanol ble oppløst 4,41 g av forbindelse (30) og forbindelsen ble hydrogenert under anvendelse av 426 mg 10%-ig palladium på carbon som katalysator. Katalysatoren ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert under dannelse av 2,41 g (S)-N-butyl-2-pyrrolidincarboxamid (31).

NMR (CDC13) 6ppm: 7,3-8,0 (1H), 3,71 (dd, 1H), 2,8-3,4 (4H), 1,1-2,4 (9H), 0,7-1,1 (3H)

IR (netto) cm"<1>: 3280, 2950, 1645, 1520

Referanseeksempel 8

Til 75 ml av en ethylacetatløsning av Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidinazid (4) fremstilt fra 4,85 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidinhydrazid (3) ved metoden beskrevet i referanseeksempel 2 ble tilsatt 2,23 g av forbindelse (31) under isavkjøling, og blandingen fikk stå over natten i et kjøleskap for å fullføre reaksjonen. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (95:5:0,5) ble det erholdt 4,13 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N-butyl-L-prolinamid.

NMR (CDC13) 6ppm: 7,51 (1H), 7,34 (s, 5H), 6,85 (s, 1H),

5,76 (d, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,3-4,8 (2H), 2,8-3,7 (6H), 1,7-2,3 (4H), 1,1-1,7 (4H), 0,7-1,1 (3H)

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 2950, 1705, 1635, 1540

Masse (EI): 441 (M<+>), 361, 341, 272, 244, 190, 136, 91,

70

Referanseeksempel 9

Til 20 ml av en eddiksyreløsning av 25% hydrobromsyre ble tilsatt 1,77 g av forbindelse (32) under isavkjøling og reaksjonen fikk forløpe i 3 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til 200 ml tørr ether, det dannede bunnfall ble raskt oppsamlet ved filtrering og tørket over natten i en eksikator inneholdende kaliumhydroxyd under redusert trykk under dannelse av 2,14 g L-histidyl-N-butyl-L-prolinamid.2-hydrobromid (33).

Eksempel 11

I 10 ml DMF ble oppløst 9 38 mg av forbindelse (33)

og etter avkjøling av løsningen til -4 0°C ble 415 mg triethylamin tilsatt til løsningen. Etter omsetning i én time ved -30 til -4 0°C ble det dannede bunnfall filtrert fra under dannelse av en DMF-løsning av L-histidyl-N-butyl-L-prolinamid (34). Produktet ble anvendt ved den etterfølgende syntesereaksjon umiddelbart etter dannelsen.

I 5 ml DMF ble oppløst 230 mg (S)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (2) (fremstilt i referanseeksempel 1) hvoretter 406 mg HOBT og 495 mg DCC ble tilsatt under isavkjøling, og reaksjonen fikk forløpe i én time ved 0 til 5°C. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til -4 0°C og DMF-løsningen av den foregående forbindelse (34) ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Reaksjonen fikk forløpe i 30 minutter ved -40°C og deretter over natten i et kjøleskap. Det dannede bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert og residuet underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble det erholdt 471

mg N a- [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-butyl-L-prolinamid (35).

NMR (D20' natrium-3-(trimethylsilyl)-1-propansulfonat)

<Sppm: 7,76 (1H), 7,07 (1H), 4,96 (t, 1H), 4,2-4,5 (2H), 2,6-4,0 (8H), 1,7-2,2 (4H), 1,1-1,7 (4H), 0,7-1,1 (3H)

IR (KBr) cm"<1>: 3240, 2950, 1755, 1630, 1540

Masse (EI): 404 (M<+>), 305, 290, 235, 207, 165, 110, 70

Lal<27> -81,8° (C = 0,50, MeOH)

Referanseeksempel 10

Til 30 ml av en ethylacetatløsning av forbindelse (4) fremstilt fra 1,52 g av forbindelse (3) ved metoden vist i referanseeksempel 2 ble tilsatt 785 mg (S)-N-cyclohexyl-2-pyrrolidincarboxamid (36) fremstilt på kjent måte, hvoretter reaksjonen fikk forløpe over natten i et kjøleskap. Reaksjons' blandingen ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (90:10:1) ble det erholdt 1,30 g N a-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N-cyclohexyl-L-prolinamid (37) .

NMR (CDC13) 6 ppm: 7,54 (s, 1H), 7,32 (s, 5H), 6,88

(s, 1H) , 5,77 (d, 1H) , 5,09 (s, 2H) , 4,61 (dd, 1H) , 4,36 (t, 1H), 3,3-4,0 (2H), 2,8-3,3 (3H), 0,9-2,4

(14H)

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 2920, 1710, 1630, 1525

Masse (EI): 467 (M<+>), 387, 360, 341, 272, 244, 136, 108,

70

Referanseeksempel 11

til 15 ml isavkjølt eddiksyreløsning av 25%-ig hydrobromsyre ble tilsatt 1,14 g av forbindelse (37) og reaksjonen ble utført i tre timer ved romtemperatur. Den således erholdte reaksjonsblanding ble tilsatt til 150 ml eksikatorbehandlet ether, det dannede bunnfall ble raskt oppsamlet ved filtrering og tørket over natten i en eksikator ved redusert trykk under dannelse av 1,53 g L-histidyl-N-cyclohexyl-L-prolinamid.2-hydrobromid.

Eksempel 12

I 10 ml DMF ble oppløst 991 mg av forbindelse (38), og etter avkjøling av løsningen til -4 0°C ble 415 mg triethylamin tilsatt til løsningen. Etter utførelse av reaksjonen i én time ved -30 til -40°C ble det dannede bunnfall filtrert fra under dannelse av en DMF-løsning av L-histidyl-N-cyclohexyl-L-prolinamid (39).

I 5 ml DMF ble oppløst 230 mg av forbindelse (2), og etter tilsetning av 406 mg HOBT og 495 mg DCC under isavkjøling fikk reaksjonen forløpe i én time ved 0 til 5°C. Reaksjonsblandingen ble kjølt til -40°C, den foregående DMF-løsning av forbindelse (39) ble tilsatt til reaksjonsblandingen og reaksjonen fikk forløpe i 30 minutter ved -4 0°C og deretter over natten i et kjøleskap. Det dannede bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble det erholdt 305 mg Na- [.(S)-2-azetidinon-4-carbonyl] -L-histidyl-N-cyclohexyl-L-prolinamid (40).

NMR (CD3OD) <5ppm: 7,64 (1H), 6,98 (1H), 4,2-4,5 (1H),

4,12 (dd, 1H), 2,81 (dd, 1H), 0,9-1,2 (14H)

IR (KBr) cm<-1>: 3220, 2920, 1750, 1620, 1540

Masse (EI): 430 (M<+>), 316, 235, 180, 152, 99, 70

[a]<27>= - 69,2°C (C = 1,90, MeOH)

Referanseeksempel 12

I 1150 ml ether ble suspendert 71 g (146,6 mmol) D-aspartinsyredibenzylester-p-toluensulfonat (41) og under omrø-ring av suspensjonen under isavkjøling (0 til 5°C) ble 22,5 ml (146,6 x 1,1 mmol) triethylamin dråpevis tilsatt til suspensjonen. Etter omrøring av blandingen i 2 timer ved 0 til 5°C ble 4 50 ml vann tilsatt ved samme temperatur, og blandingen ble ytterligere omrørt i 30 minutter. Det dannede etherlag ble fraskilt, det vandige lag ble ekstrahert med 200 ml ether og det foregående etherlag ble kombinert med etherekstraktet. Blandingen ble vasket med 400 ml av en mettet, vandig natrium-sulfatløsning og ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Ether ble destillert fra under redusert trykk under dannelse av 45 g D-aspartinsyre-dibenzylester (42) som et farveløst, oljeaktig produkt.

Referanseeksempel 13

I 485 ml tørr ether ble oppløst 45 g (143,8 mmol) D-aspartinsyre-dibenzylester (4 2) og etter avkjøling av løsnin-gen til 0°C under en argonatmosfære ble 20 ml (143,8 mmol) triethylamin dråpevis tilsatt til løsningen. Deretter ble 15,6 g (143,9 mmol) trimethylsilylklorid dråpevis tilsatt til blandingen ved samme temperatur som ovenfor angitt, og den resulterende blanding ble omrørt i én time. Det således dannede bunnfall ble filtrert fra under argonatmosfære og filtratet ble avkjølt til 0 til-5°C hvoretter 134,8 x 1,01 mmol av en etherløsning av t-butylmagnesiumklorid dråpevis ble tilsatt til blandingen under omrøring. Etter ytterligere omrøring av blandingen i to timer ved 0°C og deretter i tre timer ved romtemperatur ble blandingen avkjølt til 0°C, 100 ml 2N HC1 (mettet med NH^Cl) ble tilsatt til blandingen og etter omrøring av blandingen i 30 minutter ble 100 ml av en mettet, vandig ammoniumkloridløsning tilsatt til blandingen. Det dannede etherlag ble fraskilt og det vandige lag ble ekstrahert to ganger, hver gang med 200 ml ethylacetat. Etherlaget ble kombinert med ethylacetatekstraktet, og etter vasking av blandingen med 300 ml av den mettede, vandige ammoniumkloridløsning og tørking med vannfritt magnesiumsulfat ble ether og ethylacetat destillert fra under redusert trykk. Til residuet ble tilsatt 10 ml ethylacetat under dannelse av krystaller som ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av 13,7 g (R)-4-benzyloxycarbonyl-2-azetidinon (43). I tillegg ble modervæsken konsentrert og renset ved silicagelkolonnekromatografi (elueringsmiddel: ethylacetat-n-hexan (2:1)) under dannelse av 5,1 g av

det ønskede produkt, sm.p. 136-138°C.

[ot] = +33,7° (C = 1, MeOH)

NMR (DMSO-d<6>) 6 : 8,40 (1H, NH), 7,40 (5H, s, fenylgruppe), 5,20 (2H, s, methylen av benzylgruppe), 4,22 (1H, d,d, 4-stilling hydrogen), 3,27 (1H, d,d,d, 3-stilling hydrogen), 2,89 (1H, d,d,d, 3-stilling hydrogen)

IR (KBr) cm"<1>: 3200, 1760, 1725, 1230

Referanseeksempel 14

I 250 ml methanol ble oppløst 5 g forbindelse (43) og forbindelsen ble katalytisk redusert i nærvær av 500 mg palladium-carbon ved normal temperatur og normalt trykk i en

hydrogenatmosfære. Etter filtrering av katalysatoren ble methanolen destillert av under redusert trykk.

Det dannede residuum ble krystallisert fra ether og krystallene ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av 2,5 g av det ønskede produkt, (R)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (44)

som farveløse krystaller, sm.p. 97-101°C.

NMR (DMSO-d<6>, CD3OD) 6ppm: 4'60 (1H, d,d, 4-stilling hydrogen), 3,23 (1H, d,d, 3-stilling hydrogen), 2,85

(1H, d,d, 3-stilling hydrogen)

IR (KBr) cm<-1>: 3310, 1735 (bred), 860

i

I 13 ml vannfri DMF ble oppløst 826 mg (2 mmol) L-histidyl-L-prolinamid 2-hydrobromid (8) etterfulgt av avkjø-ling til -10°C. Til løsningen ble langsomt tilsatt 404 mg (2x2 mmol) triethylamin og blandingen ble omrørt i 3 0 minutter ved samme temperatur. Deretter ble det utfelte triethylaminhydrobromid filtrert fra under argonatmosfære. Løsningen ble dråpevis tilsatt til en aktiv esterløsning fremstilt fra 230 mg (2 mmol) (R)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (44) (erholdt i referanseeksempel 12 til 14), 351 mg (2 x 1,3 mmol) HOBT,

453 mg (2 x 1,1 mmol) DCC og 10 ml DMF ved -20°C. Etter omrø-ring av blandingen i 1,5 time ved samme temperatur ble blandingen omrørt over natten i et kjøleskap. Deretter ble DMF destillert fra reaksjonsblandingen under redusert trykk, og til det dannede residuum ble tilsatt 10 ml methylenklorid-methanol-konsentrert, vandig ammoniakk (80:20:2), og de utfelte krystaller ble filtrert fra. Filtratet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi og renset under anvendelse av methylenklorid-methanol-konsentrert, vandig ammoniakk (80:20:2) som det fremkallende løsningsmiddel under dannelse av 3 70 mg Na-[(R)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinamid (45) som et amorft pulver.

[a]D =-21,5° (C = 1, MeOH)

NMR (D20) <$ppm: 7,03 (1H, imidazolring) , 6,72 (1H,

imidazolring), 4,95 (1H, m), 4,42 (1H, m) 4,27 (1H, d,d, 4-stilling hydrogen av azetidinonring), 3,40-4,00 (2H, m) , 3,32 (1H, d,d, 3-stilling hydrogen av azetidinonring), 2,74 (1H, d,d, 3-stilling hydrogen av azetidinonring), 2,00 (4H, m)

IR (KBr) cm"<1>: 3350, 3150, 1745, 1660, 1625, 1440

Masse: 348 (M<+>), 304, 278, 234, 207, 190

Eksempel 14

I 2 ml DMF ble oppløst 300 mg N01 - [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolin (13) (erholdt i eksempel 3), 116 mg HOBT og 177 mg DCC, og etter omrøring i 7 timer ved romtemperatur ble løsningen avkjølt på et isbad. Deretter ble 0,6 ml av en methanolløsning av 30%-ig methylamin tilsatt til løsningen, og blandingen fikk reagere over natten under om-røring ved 2 til 6°C. Uløselige bestanddeler ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Det således dannede residuum ble renset ved kolonnekromatografi under anvendelse av LiChroprep Si 60 (størrelse B). Ved anvendelse av kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:10:1) som elueringsmiddel ble det erholdt N3t-[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-methyl-L-prolinamid (46). Produktet ble oppløst i vann og ble deretter lyofilisert. Mengden av produktet var 149 mg.

NMR (CD3OD) 6 : 7,62 (1H, imidazolring), 6,94 (1H,

imidazolring), 4,8 (1H, methingruppe), 4,10 (1H, 4-stilling hydrogen av azetidinonring), 2,76 (3H, N-methylgruppe), 1,6-2,3 (4H, prolinringhydrogen)

IR (KBr) cm<-1>: 3250, 1750, 1630, 1540, 1440

Masse m/z: 362 (M<+>), 304, 292, 248, 235, 207

Referanseeksempel 15

B0C-His(Ts)-0H + Pro-OBn • HC1 ^

(47) (48) B0C-His(Ts)-Pro-0CH2 (49)

Til 100 ml eksikatorbehandlet methylenklorid ble tilsatt 10 g Na<->t-butyloxycarbonyl-N<im->tosyl-L-histidin (47)

og 6,50 g L-prolinbenzylesterhydroklorid, og blandingen ble avkjølt på et isbad. Etter tilsetning av 2,72 g triethylamin ble ytterligere 6,05 g DCC tilsatt til blandingen og den resulterende blanding ble omrørt i 30 minutter på et isbad og ble omrørt over natten ved romtemperatur. De løselige bestanddeler ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert. Det dannede residuum ble renset ved silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med ethylacetat-benzen (1:1) ble det erholdt 13,5 g N a-t-butyloxycarbonyl-Nim-toSyl-L-histidyl-L-prolinbenzylester (49).

NMR (CD3OD) <5ppm: 8, 14, 7,92, 7,84, 7,40, 7,30

(total 11H, imidazolring, benzenring), 5,12 (2H, q, benzylgruppe), 4,5 senter (2H, 2 typer av methingrupper), 2,36 (3H, methyl av tosylgruppe), 1,30 (9H, t-butylgruppe)

IR (KBr) cm<-1>: 3400, 3280, 2970, 1740, 1700, 1640, 1590

Masse m/z: 596 (M<+>), 523, 480, 364, 290, 155, 91

Referanseeksempel 16

I 150 ml methanol ble oppløst 13,5 g av forbindelse (49) og forbindelsen ble katalytisk redusert i 5 timer i nærvær av 10% palladium-carbon. Katalysatoren ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble oppløst i ethylacetat og ekstrahert tre ganger, hver gang med en vandig natriumhydrogencarbonatløsning. Ekstraktene ble kombinert med hverandre og vasket én gang med ethylacetat. Etter surgjøring av det vandige lag med 1N saltsyre ble den ønskede forbindelse ekstrahert med ethylacetat. Således ble

2,0 g Na<->t-butyloxycarbonyl-N<im->tosyl-L-histidyl-L-prolin (50) erholdt som et skumaktig produkt. Fra det organiske lag dannet etter ekstrahering av produktet med en vandig natriumhydrogencarbo-natløsning ble det erholdt 9,1 g av utgangsmaterialet (49).

Egenskapene av den ønskede forbindelse (50) er vist i det etterfølgende.

NMR (CD3OD) Sppm: 8,16, 7,96, 7,86, 7,46, 7,40, (total 6H, imidazolringhydrogen, benzenringhydrogen), 4,48 senter (2H, to typer av methingrupper), 2,42 (3H, s, methyl av tosylgruppe), 1,32 (9H, t-butylgruppe)

IR (KBr) cm<-1>: 3300, 3100, 2970, 2500-2600, 1710, 1640 Masse m/z: 388 (M-118), 308,234

Referanseeksempel 17

Til 70 ml methylenklorid ble tilsatt 3,25 g av forbindelse (50), 0,79 g monoethanolamin og 2,61 g HOBT, og blandingen ble isavkjølt på et isbad. Deretter ble 20 ml DMF tilsatt til blandingen under dannelse av en jevn løsning. Etter ytterligere tilsetning av 1,99 g DCC ble blandingen om-rørt i to timer i et isbad og ble deretter omrørt over natten ved romtemperatur. Uløselige bestanddeler ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble oppløst i 70 ml methylenklorid og etter ytterligere tilsetning av 1,3 g HOBT ble blandingen igjen omrørt i 20 timer ved romtemperatur. Løsningsmidlet ble destillert fra reaksjonsblandingen under redusert trykk og det dannede residuum ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:10:1) ble det erholdt 1,35 g Na<->t-butyloxycarbonyl-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-L-prolinamid (51).

NMR (CD3OD) <5ppm: 7,64 (1H, imidazolring), 6,96 (1H,

imidazolring), 4,48 senter (2H, to typer av methingrupper) , 2,0 senter (4H, prolinring ) , 1,40 (9H, t-butylgruppe)

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 2960, 1700, 1630

Masse m/z: 395 (M<+>), 365, 322, 307, 278

Eksempel 15

(2)

I 25 ml methylenklorid ble oppløst 79 0 mg av forbindelse (51) hvoretter 20 ml trifluoreddiksyre ble dråpevis tilsatt til løsningen ved 0 til 5°C. Etter omrøring av blandingen i 2,5 time på et isbad ble reaksjonsblandingen konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Ennvidere ble produktet azeotropisk tørket flere ganger under anvendelse av toluen og residuet ble triturert med tørr ether under dannelse av et pulver av L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-L-prolinamid.2-tri-fluoracetat i kvantitativt utbytte.

I en blanding av 7 ml DMF og 8 ml methylenklorid ble oppløst 253 mg av forbindelse (2) og 350 mg HOBT, og etter tilsetning av 530 mg DCC under isavkjøling ble blandingen omrørt i 1,5 time. Til reaksjonsblandingen ble tilsatt en reaksjonsblanding erholdt ved nøytralisering av den foregående forbindelse (52) i en blanding av 4 ml DMF og 4 ml methylenklorid med 445 mg triethylamin, og den resulterende blanding ble omsatt over natten under omrøring i et kjøleskap. Uløse-lige bestanddeler ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:40:1) ble det erholdt 313 mg av forbindelse (14) som var identisk med den som ble erholdt i eksempel 4.

Referanseeksempel 18

Til en ethylacetatløsning av Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidinazid (4) fremstilt fra 6,07 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidinhydrazid (3) på kjent måte ble tilsatt 10 ml av en DMF-løsning av 2,31 g (S)-N-(2-hydroxyethyl)-2-pyrrolidincarbox-amid (53) under isavkjøling, og blandingen ble omsatt over natten i et kjøleskap. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og det dannede residuum ble underkastet silicagelkolonnekroma-tograf i. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (90:10:1) ble det erholdt 3,4 3 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-L-prolinamid (54).

NMR (CDC13) 6pplti: 8,3-8,7 (1H), 7,55 (s, 1H), 7,34 (s,

5H), 6,87 (s, 1H), 5,93 (d, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,3-4,8 (2H), 2,8-3,8 (8H), 1,6-2,3 (4H)

Masse (EI): 429 (M<+>), 341, 272, 244, 136, 108, 79

Referanseeksempel 19

Til 37,5 ml av en isavkjølt eddiksyreløsning av 25% hydrobromsyre ble tilsatt 3,22 g av forbindelse (54) og reaksjonen fikk forløpe i 3 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til 375 ml tørr ether og det dannede bunnfall ble raskt oppsamlet ved filtrering og tørket over natten i en eksikator inneholdende kaliumhydroxyd under dannelse av 4,43 g L-histidyl-N-(2-acetoxyethyl)-L-prolinamid

.2-hydrobromid.

Eksempel 16

a)

His-Pro-NH-CH2CH2OCOCH3-2HBr -> [His-Pro-NH-CH2CH2OCOCH3]

I 35 ml DMF ble oppløst 4,43 g av forbindelse (55)

og etter avkjøling av løsningen til -40°C ble 1,82 g triethylamin tilsatt til løsningen hvoretter reaksjonen ble utført i én time ved -30 til -40°C. Deretter ble det dannede bunnfall fjernet under dannelse av en DMF-løsning av L-histidyl-N- ( 2-acetoxyethyl) -L-prolinamid (56). Produktet ble umiddelbart anvendt for den etterfølgende reaksjon.

I 17,5 ml DMF ble oppløst 863 mg av forbindelse (2), og etter tilsetning av 1,52 g HOBT og 1,86 g DCC ble reaksjonen utført i 30 minutter under isavkjøling. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til -40°C og etter tilsetning av DMF-løsningen av den foregående forbindelse (56) fikk reaksjonen forløpe i 30 minutter ved -40°C og deretter over natten i et kjøleskap. Det dannede bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20: 2) ble det erholdt 1,60 g Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl] -L-histidyl-N-(2-acetoxyethyl)-L-prolinamid.

NMR (D20) 6ppm: 7,74 (s, 1H), 7,05 (1H), 4,93 (t, 1H),

4,1-4,5 (4H), 2,9-3,9 (7H), 2,76 (dd, 1H), 2,7-3,2

(7H)

IR (KBr) cm<-1>: 3230, 2950, 2860, 1755, 1730, 1630, 1540 Masse (EI): 434 (M<+>), 364, 320, 262, 235, 154, 70, 43

[ot]27 = _86f2° (c = 0,45, MeOH)

I 12 ml methanol ble oppløst 56 mg kaliumcarbonat

og etter tilsetning av 348 mg av forbindelse (57) under is-avkjøling fikk reaksjonen forløpe i to timer under isavkjøling. Reaksjonsblandingen ble underkastet silicagelkolonnekromatografi, og ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble det erholdt 294 mg Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-(2-hydroxyethyl)-L-prolinamid. De fysikalsk-kjemiske egenskaper av produktet var de samme som de for forbindelse (14) erholdt i eksempel 4.

(Referanseeksempel 20)

Eksempel 17-a

I 200 ml DMF ble oppløst 10 g (8,68 mmol) (S)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (2) og 24,4 g (8,68 mmol) pentaklor-fenol hvoretter 17,93 g (8,70 mmol) DCC ble tilsatt til løs-ningen under avkjøling (0 til 5 oC). Etter omrøring av blandingen i 5 timer ved romtemperatur ble det utfelte dicyclo-hexylurea filtrert fra og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Det dannede residuum ble oppløst i 200 ml ethylacetat ved oppvarmning og ble deretter avkjølt. De utfelte krystaller ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av 25,6 g gulaktige krystaller av (S)-4-pentaklorfenoxycarbonyl-2-azetidinon (58) med et smeltepunkt på 177 til 179°C.

NMR (90 MHz, d<6->DMSO-D20) <6>ppm: 3,23 (1H, q, azetidinonring 3-stilling), 3,57 (1H, q, azetidinonring 3-

stilling), 4,70 (1H, q, azetidinonring 4-stilling) IR (KBr) cm"<1>: 3200, 1775, 1755, 1720

Masse: 363 (M<+>), 335, 266, 237

Eksempel 17-b

I 20 ml DMF ble oppløst 690 mg (S)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (2) og etter tilsetning av 690 mg HOSu og 1,236 g DCC under isavkjøling fikk reaksjonen forløpe i 30 minutter under isavkjøling og deretter i 4 timer ved romtemperatur. Uløselige bestanddeler ble filtrert fra reaksjonsblandingen hvoretter løsningsmidlet ble destillert fra under dannelse av et lysebrunt, fast materiale. Produktet ble omkrystallisert fra dioxan-petroleumether (5:1) under dannelse av 7 50 mg (S)-4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-oxycarbonyl-2-azetidinon.

NMR (DMSO-d<6>, TMS) i5ppm: 8,70 (bred, 1H), 4,62 (dd, 1H) ,

3,84 (s, 4H)

IR (KBr) cm"<1>: 3320, 2920, 2840, 1810, 1780, 1750, 1730,

1720, 1650, 1620, 1570

Masse (CI i stråle): 213 (M<+> + 1), 185, 171, 116

(Referanseeksempel 21)

I 75 ml DMF ble suspendert 6,05 g (25 mmol) L-histi-dinmethylester-2-hydroklorid (59) og etter avkjøling av suspensjonen til 0 til 5°C ble 5,05 g (50 mmol) triethylamin langsomt, dråpevis tilsatt til suspensjonen. Deretter ble blandingen omrørt i 15 minutter ved samme temperatur.

9,50 g (25 mmol) av forbindelse (58) ble tilsatt til blandingen som et pulver, og etter omrøring av blandingen i

én time ved samme temperatur fikk blandingen stå over natten ved romtemperatur. Triethylaminhydroklorid ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble blandet med 4 0 ml ethylacetat og 3 0 ml vann etterfulgt av risting, hvoretter det vandige lag ble oppsamlet. Ethylace-tatlaget ble ekstrahert to ganger med 20 ml vann. Det vandige lag ble kombinert og vannet ble destillert fra under redusert trykk. Residuet ble blandet med acetonitril og benzen og blandingen ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble krystallisert fra 30 ml methanol og krystallene ble oppsamlet under dannelse av 4,1 g av farveløse krystaller av B<8->

[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidinmethylester (60) med smeltepunkt på 142 til 147°C.

NMR (90 MHz, d<6->DMS0) 6 : 2,94 (2H, d, fl-stilling methylen av histidingruppe), 3,6 0 (3H, s, methylgruppe), 4,02 (1H, q, azetidinonring 4-stilling), 4,54 (1H, m, a-stilling methin av histidingruppe), 6,72 (1H, s, imidazolring), 7,56 (1H, s, imidazolring), 8,20 (1H, s, NH), 8,56 (1H, d, azetidinonring NH)

IR (KBr) cm<-1>: 3250, 3100, 2950, 1770, 1750, 1740, 1720,

1650, 1550

Eksempel 17-d

I 20 ml kloroform ble oppløst 1,178 g (2 mmol) histidinbenzylester.2-p-toluensulfonat hvoretter 4 04 mg (2 mmol) triethylamin ble langsomt tilsatt til løsningen under isavkjøling til 0°C. Til løsningen ble tilsatt 766 mg (2 mmol) (S)-4-pentaklorfenoxycarbonyl-2-azetidinon (58) som et pulver og blandingen ble omrørt over natten ved 0 til 5°C.

Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 30 ml kloroform og det ønskede produkt ble ekstrahert to ganger, hver gang med 3 0 ml vann. Deretter ble vannet destillert fra under redusert trykk og det dannede residuum ble azeotropisk dehydrert med benzen-acetonitril under dannelse av et farveløst, klebrig produkt. Produktet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi under anvendelse av 50 ml Wako-gel C-200 og eluert med ethylacetat-methanol-konsentrert, vandig ammoniakk (60:30:3) under dannelse av 470 mg Na- [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidinbenzyl-ester (60-1) med smeltepunkt på 196 til 199°C som farveløse krystaller.

NMR (90 MHz, d<6->DMSO) <5 : 2,58 (1H, m, azetidinonring 3-stilling), 2,96 (2H, d, histidingruppe 3-stilling methylen), 3,12 (1H, m, azetidinonring 3-stilling), 4,00 (1H, m, azetidinonring 4-stilling), 4,62 (1H,

m, histidingruppe ot-stilling methin) , 5,10 (2H, s, benzylstilling), 6,80 (1H, s, imidazolring), 7,36 (5H, s, benzenring), 7,56 (1H, s, imidazolring),

8,20 (1H, s, NH), 8,58 (1H, d, NH)

IR (KBr) cm"<1>: 3260, 2980, 2760, 1750, 1650, 1540

I 20 ml methanol ble suspendert 342 mg av forbindelse (60-1) og forbindelsen ble katalytisk redusert ved tilsetning av 20 mg av 10%-ig palladium-carbon ved omgivende temperatur og vanlig trykk. Etter at absorpsjonen av hydrogen hadde stoppet ble katalysatoren filtrert fra og methanol ble destillert fra under redusert trykk under dannelse av 230 mg Na-[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidin (61) med smeltepunkt på 213 til 215°C) (spaltning) som farveløse krystaller.

NMR (90 MHz, D„0 <5 : 2,80 (1H, q, azetidinonring 3-

2 ppm ^ 3 stilling), 3,20 (2H, m, histidingruppe B-stilling), 3,38 (1H, q, azetidinonring 3-stilling), 4,28 (1H, q, azetidinonring 4-stilling), 4,58 (1H, m, histidin om-stilling methin), 7,30 (1H, s, imidazolring), 8,60

(1H, s, imidazolring)

IR (KBr) cm"<1>: 3400, 3260, 2560, 1750, 1630, 1570, 1390

Etter avkjøling av 20 ml av en vandig løsning av 0,1N natriumhydroxyd til 0 til 5°C ble 53 2 mg (2 mmol) av forbindelse (60) tilsatt og blandingen ble omrørt i 1,5 time ved samme temperatur. Deretter ble 760 mg (4 mmol) p-toluen-sulfonsyremonohydrat tilsatt til blandingen ved samme temperatur, og vann ble destillert fra under redusert trykk. Det således erholdte residuum ble azeotropisk dehydrert med acetonitril og benzen og ble deretter tørket under redusert trykk. Det erholdte pulver ble oppløst i 20 ml DMF, og etter tilsetning av 228 mg (2 mmol) L-prolinamid (6 2) og 412 mg (2 mmol) DCC ble blandingen omrørt over natten ved romtemperatur. Di-cyclohexylurea ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert under redusert trykk og det dannede residuum ble oppløst i 20 ml vann. Etter filtrering av uløselige bestanddeler ble vann destillert fra under redusert trykk. Etter tørking av det dannede residuum under redusert trykk ble residuet oppløst i 7 ml methanol under oppvarming og etter omrøring av løsningen under avkjøling ble de utfelte krystaller oppsamlet ved filtre ring under dannelse av 500 mg av farveløse krystaller av N<01->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinamid med smeltepunkt på 179 til 184°C. De fysikalsk-kjemiske egenskaper av produktet var de samme som for forbindelse (10) erholdt i eksempel 1.

I 10 ml DMF ble suspendert 252 mg (1 mmol) av forbindelse (61), og etter tilsetning av 115 mg (1 mmol) N-hydroxysuccinimid og deretter 114 mg (1 mmol) prolinamid og 206 mg (1 mmol) DCC under avkjøling til 0°C fikk den resulterende blanding stå over natten ved 0 til 5°C og ble deretter omrørt i 2 dager ved romtemperatur. Etter filtrering av de dannede krystaller ble DMF destillert fra under redusert trykk. Det dannede residuum ble blandet med 5 ml vann, og etter filtrering av uløselig bestanddeler ble vannet destillert fra under redusert trykk. Etter azeotropisk dehydrering av residuet med tilsetning av benzen-acetonitril, ble 3 ml methanol tilsatt til residuet og blandingen ble omrørt under dannelse av 82 mg av krystaller av Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinamid (10). De fysikalsk-kjemiske egenskaper av produktet var de samme som for produktet erholdt i eksempel 1 7-A.

Eksempel 18

I en blanding av 2 ml DMF og 10 ml methylenklorid ble oppløst 211 mg (S)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (2) og 248 mg HOBT, og løsningen ble isavkjølt. Etter tilsetning av 472 mg DCC ble blandingen omrørt i én time ved romtemperatur. Deretter ble 10 ml av en DMF-løsning av 4 26 mg L-histidyl-DL-(3,3-dimethyl)-prolinamid (62) tilsatt til blandingen, og den resulterende blanding ble omrørt i to dager ved 0 til 4°C. Uløselige bestanddeler ble oppsamlet ved filtrering og vasket med DMF. Filtratet ble kombinert med vaskeløsningene og løs-ningsmidlet ble destillert fra blandingen under redusert trykk. Residuet ble underkastet kolonnekromatografi på 150 ml silicagel. Ved eluering med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80: 20:2) ble N01-£(S)-2-azetidinon-4-carbonyl] -L-histidyl-DL-(3,3-dimethyl)-prolinamid (63) erholdt. Den vandige løsning ble lyofilisert under dannelse av 63 mg av et hvitt pulver. Produktet var en blanding av diastereomerer som utviste to flekker på TLC.

IR (KBr) cm"<1>: 3250 (bred), 1750, 1670, 1630, 1540, 1440 NMR (CD3OD) 5ppm'- 7 ,64, 6,96, 6,88 (2H, imidazolring),

4,14 (1H, d,d, azetidinonring 4-stilling), 1,80 senter (2H, prolinring), 1,06, 1,12, 1,06, 0,92 (6H, prolinring 3-stilling dimethyl)

Masse m/z: 376 (M<+>), 343, 316, 306, 262, 98

Referanseeksempel 22 (utgangsmaterialer for eksempler 19 og 22)

a)

I 130 ml vann ble oppløst 9,9 g L-NT<->methyl-histidin .2-hydroklorid (64) og løsningen ble avkjølt på et is-natrium-kloridkjølebad. pH på løsningen ble justert til 11 ved tilsetning av en vandig løsning av 2N natriumhydroxyd og mens den indre temperatur ble holdt ved 0 til 5°C ble 10,5 g carbo-benzoxyklorid tilsatt dråpevis til blandingen. Under tilset-ningen ble pH på systemet justert til 11 til 12 ved tilsetning av en vandig løsning av 2N natriumhydroxyd. Deretter ble blandingen omrørt i én time ved 0 til 5°C mens pH ble holdt ved 12 1 0,5 ved leilighetsvis tilsetning av en vandig løsning av 2N natriumhydroxyd. Etter at forandringen i pH hadde stoppet ble løsningen ytterligere omrørt i 1,5 time ved 5 til 10°C. Reaksjonsblandingen ble vasket to ganger, hver gang med ethylacetat, den vandige løsning ble oppsamlet og pH på løsningen ble justert til 3,9 med 4N saltsyre. Deretter ble pH justert til 2,2 ved tilsetning av 2N p-toluensulfonsyre. Reaksjonsblandingen ble mettet med natriumklorid og ekstrahert fire ganger med acetonitril-isobutanol-ethylacetat (1:1:2). Det organiske lag ble konsentrert under redusert trykk og residuet ble triturert med acetonitril. Etter filtrering av uløselige bestanddeler ble filtratet konsentrert under dan- : neise av en gulaktig sirup. Produktet ble underkastet kolonnekromatografi under anvendelse av 6 00 mg silicagel og produktet ble eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (60:40:3) hvorved det ble erholdt 8,8 g Na<->benzyloxycarbonyl-NT<->methyl-L-histidin (65) som et skumaktig materiale.

IR (KBr) cm<-1>: 3100 senter (bred), 1700, 1590, 1390 NMR (CD3OD) <5ppm: 7,86 (1H, imidazolring), 7,32 (5H,

benzenring), 6,96 (1H, imidazolring), 5,04 (2H, benzyl), 4,30 senter (1H, d,d, methingruppe), 3,68 (3H, N-methyl)

[ct] 25= +22,2° (C = 1, methanol)

I 25 ml tørr DMF ble oppløst 1,65 g av forbindelse (65) og 621 mg L-prolinamid, og løsningen ble avkjølt til 5 til 10°C. Deretter ble 1,03 g p-toluensulfonsyre og 1,35 g DCC tilsatt til løsningen og blandingen fikk stå over natten

i et kjøleskap. Uløselige bestanddeler ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert under redusert trykk og residuet ble triturert med en blanding av ethylacetat og ether. Deretter ble 3,2 g av den uløselige bestanddel underkastet kolonnekromatografi på 500 mg silicagel og ble eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2), under dannelse av 2,0 g Na-benzyloxycarbonyl-N T-methyl-L-histidyl-L-prolinamid (66) .

IR (KBr) cm<-1>: 3300 senter (bred), 1620-1720 (bred),

1510, 1440

NMR (CD3OD) <5ppm: 7,48 (1H, imidazolring), 7,32 (5H,

benzenring), 6,90 (1H, imidazolring), 5,04 (2H, benzyl), 3,64 (3H, N-methyl), 2,0 senter (4H, prolinring)

Masse (FD) m/z: 399 (M<+>)

c)

Z-(NT-CH3)His-Pro-NH2 —> (NT<->CH3)His-Pro-NH2•2HBr

(66) (67)

Til 24 ml eddiksyreløsning av 25% hydrobromsyre ble tilsatt 2,04 g av forbindelse (66) og blandingen ble omrørt i 1,5 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble helt over i 26 0 ml tørr ether og det dannede hvite bunnfall ble oppsamlet ved filtrering. Bunnfallet ble tørket over kaliumhydroxyd ved redusert trykk under dannelse av 2,2 g av et hygroskopisk fast materiale av N x-methyl-L-histidyl-L-prolinamid.2-hydrobromid (67) .

I en blanding av 7 ml DMF og 7 ml methylenklorid

ble oppløst 3 23 mg av forbindelse (2) og 38 0 mg HOBT, og etter isavkjøling av løsningen ble 579 mg DCC tilsatt til løsningen hvorved krystaller utfeltes raskt. Etter omrøring i ca. 20 minutter ble en løsning av den frie aminforbindelse fremstilt fra 1,0 g forbindelse (67) og 521 mg triethylamin i DMF tilsatt under isavkjøling til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 minutter i et kjøleskap, de uløse-lige bestanddeler ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert under dannelse av et sirupaktig residuum. Residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi og eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2), hvorved det ble erholdt 543 mg Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-NT<->methyl-L-histidyl-L-prolinamid (68).

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 1750, 1670, 1630

NMR (CD30D) <5ppm: 7,52 (1H, imidazolring), 6,96 (1H,

imidazolring), 4,44 senter (1H, m, methinhydrogen), 4,12 senter (1H, d,d, azetidinonring 4-stilling hydrogen), 3,70 (3H, s, N-methyl), 2,0 senter (4H, prolinring)

Masse m/z: 362 (M<+>), 319, 292, 249, 221

[a]^<5> = -68,6° (C = 1 , methanol)

Referanseeksempel 23 (utgangsmateriale for eksempel 20)

Ved omsetning av 2,24 g av forbindelse. (65) og 1,05 g 3,3-dimethyl-DL-prolinamid (69) på lignende måte som beskrevet i referanseeksempel 22 b) ble det erholdt 3,2 g Na<->benzyloxycarbonyl-NT<->methyl-L-histidyl-3,3-dimethyl-DL-prolinamid (70), som var en blanding av diastereomerer.

NMR (CD3OD) <S : 7,52, 7,48 (1H, imidazolring), 7,32

(5H, benzenring), 6,88, 6,84 (1H, imidazolring), 5,04 (2H, benzyl), 3,64, 3,60 (3H, N-methyl)

IR (KBr) cm"<1>: 3300, 2920, 1620-1720 (bred)

Masse m/z: 427 (M<+>), 383, 319, 286, 277, 258

b)

Ved å følge prosedyren beskrevet i referanseeksempel

(22 c) ble NT<->methyl-L-histidyl-3,3-dimethyl-DL-prolinamid . 2-hydrobromid (71) med kvantitativt utbytte fra 3,2 g av forbindelse (70). Produktet ble anvendt som sådant for den etter-følgende reaksjon.

Eksempel 20

Ved å gå frem på lignende måte som beskrevet i eksempel 19 ble 3 29 mg av forbindelse (2) omsatt med 1,3 g forbindelse (71) og reaksjonsproduktet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Produktet ble eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2). Det ønskede reaksjons-produkt NT- [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-Na-methyl-L-histidyl-3,3-dimethyl-DL-prolinamid var en blanding av en diastereomer (72a) med svak polaritet ved kromatograferingen og en diastereomer (72b) med sterk polaritet. Det produkt som først ble eluert var 244 mg av en blanding av (72a) og (72b) i et forhold på 8:2, det neste produkt var 254 mg av en blanding av (72a) og (72b) i forhold 1:1, og det sluttelige produkt var 182 mg av en blanding av (72a) og (72b) i forhold 2:8.

Egenskapene av diastereomeren med svak polaritet (forhold mellom (72a) og (72b) =8:2)

IR(KBr) cm<-1>: 3250 senter (bred), 1750, 1670, 1630, 1540,

1510, 1440

NMR (CD3OD) <5 ppm: 7,50 (1H, imidazolring), 6,92 (1H,

imidazolring), 4,8 (1H, methin), 4,10 (1H, d,d, azetidinon 4-stilling hydrogen), 4,0 (1H, methin), 3,66 (3H, N-methyl), 1,12, 1,08 (6H, to typer methyl) Masse m/z: 390 (M<+>), 373, 347, 320, 278, 249, 221

[<of>)<27> = _27f3° (c = 1, methanol)

Egenskapene til diastereomeren med sterk polaritet (forhold mellom (72a) og (72b) = 2:8)

IR (KBr) cm<-1>: 3250 (bred), 1750, 1670, 1630, 1440

NMR (CD,OD) 6 : 7,56 (1H, imidazolring), 6,90 (1H,

-> ppm

imidazolring), 4,14 (1H, d,d, azetidinonring 4-stilling hydrogen), 3,68 (3H, N-methyl), 1,08, 0,92 (6H, to typer av methyl)

Masse m/z: 390 (M<+>), 347, 320, 277, 249, 221

[a]" "7,9° (C = 1, methanol)

Referanseeksempel 24 (utgangsmateriale for eksempel 21)

Ved omsetning av 2,25 g av forbindelse (65) og 0,89 g L-thiazolidin-4-carboxamid (73) på lignende måte som beskrevet i referanseeksempel 22 b) ble 1,72 g 3- [Na-benzyloxycarbonyl-NT-methyl-L-histidyl^] -L-thiazolidin-4-carboxamid (74) erholdt som et skumaktig materiale.

IR (KBr) cm"<1>: 3270, 1640-1720 (bred), 1510, 1410, 1250 NMR (CD3OD) <5ppm: 7,48 (1H, imidazolring), 7,32 (5H,

benzenring), 6,90 (1H, imidazolring), 5,06 (2H, benzyl), 3,64 (3H, N-methyl)

Masse m/z: 417 (M<+>), 373, 346, 286, 258

bl

Ved å følge den prosedyre som er beskrevet i referanseeksempel 22 c) ble 1,9 g 3-[NT-methyl-L-histidyl]-L-thiazolidin-4-carboxamid . 2-hydrobromid (75) erholdt fra 1,70 g av forbindelse (74). Produktet ble anvendt som sådant ved den etterfølgende reaksjon.

Eksempel 21

Ved å følge den prosedyre som er beskrevet i eksempel 19 ble 416 mg 3-[_Na- [jS)-2-azetidinon-4-carbonyl]-NT-methyl-L-histidylJ-L-thiazolidin-4-carboxamid (76) erholdt som et skumaktig materiale fra 230 mg av forbindelse (2) og 9 00 mg av forbindelse (75).

IR (KBr) cm<-1>: 3250, 1750, 1630-1680 (bred), 1420

NMR (CD3OD) <$ : 7,46 (1H, imidazolring), 6,90 (1H,

imidazolring), 4,9 senter (3H, methin, methylen),

4,4 (1H, methin), 4,10 (1H, d,d, azetidinonring 4-stilling hydrogen), 3,64 (3H, N-methyl) Masse m/z: 381 (M<+>), 326, 309, 281, 267, 249

Eksempel 22

Ved å gå frem som beskrevet i eksempel 19 under anvendelse av 413 mg DL-4-(2-carboxyethyl)-2-azetidinon (77) og 1,12 g av forbindelse (67) ble det erholdt 540 mg Na<->[(RS)-3-(2-oxo-4-azetidinyl)-propionyl]-NT<->methyl-L-histidyl-L-prolinamid (78). Produktet var en blanding av diastereomerer. IR (KBr) cm<-1>: 3250, 1730, 1660, 1630, 1540, 1510, 1440 NMR (CD,OD) 6 : 7,52 (1H, imidazolring), 6,96 (1H,

j ppITl

imidazolring), 4,80 (1H, methin), 4,44 (1H, methin), 3,68 (3H, N-methyl), 3,3-3,96 (3H, azetidinonring 4-stilling hydrogen), prolinring), 1,94 senter (4H, prolinring)

Masse m/z: 390 (M<+>), 348, 320, 307, 277, 249

Referanseeksempel 25 (utgangsmateriale for eksempel 23)

a)

I 40 ml THF ble oppløst 9,96 g N-benzyloxycarbonyl-L-prolin (29) og 4,45 g triethylamin og løsningen ble is-avkjølt. Deretter ble 6,10 g ethylklorformiat langsomt tilsatt til løsningen under isavkjøling, hvoretter en løsning av 5,13 g monoethanolamin i 15 ml THF ble tilsatt til blandingen. Den således erholdte reaksjonsblanding ble omrørt i 15 minutter under isavkjøling og ble deretter omrørt i 1,5 time ved romtemperatur. Etter avdestillering av THF under redusert trykk ble 150 ml ethylacetat og 50 ml vann tilsatt til residuet, og det organiske lag ble fraskilt fra det vandige lag.

Det organiske lag ble vasket suksessivt med en vandig løsning av 1N saltsyre, en vandig løsning av 0,1N natriumhydroxyd og vann, og deretter en vandig natriumkloridløsning. Etter tørking av det organiske lag ble løsningsmidlet fjernet hvorved krystaller ble utfelt, som ble oppsamlet ved filtrering og omkrystallisert fra ethylacetat under dannelse av 5,23 g (S)-1-benzyloxycarbonyl-N-2-hydroxyethyl-2-pyrrolidincarbox-amid (79) med smeltepunkt 104 til 106°C.

IR (KBr) cm"<1>: 3420, 3270, 1680, 1640, 1540

NMR (CDC13) (5ppm: 7'36 (5H, s, benzenring), 5,16 (2H, q,

benzyl), 4,30 (1H, t, methin), 2,04 senter (5H, prolinring, OH)

b)

Z-Pro-NHCH2CH2OH >Pro-NHCH2<C>H2OH

(79 ) ( 53 )

x /u mx metnanox Die oppxpsr o,<y>^ g av roroinaexse (79) og forbindelsen ble katalytisk redusert på vanlig måte under anvendelse av 10% palladium-carbon som katalysator. Etter reaksjonen ble katalysatoren og løsningsmidlet fjernet under dannelse av 3,2 g av en sirup av (S)-N-2-hydroxyethyl-2-pyrrolidincarboxamid (53). Produktet stivnet når det ble avkjølt.

NMR (CD3OD) 5ppm: 2,96-3,84 (7H, prolinring, hydroxy-ethyl), 1,64-2,36 (4H, prolinring)

IR (netto) cm<-1>: 3250, 1640 (bred), 1530 (bred)

Masse m/z: 159 (M + 1), 127, 70

I 25 ml tørr DMF ble oppløst 1 ,54 g N<01->benzyloxycarbonyl-NT<->methyl-L-histidin (65) og 0,80 g av forbindelse (53) og løsningen ble isavkjølt.

Etter tilsetning av 1,01 g p-toluensulfonsyremono-hydrat til løsningen ble også 1,36 g DCC tilsatt til blandingen. Blan-dingen ble omrørt over natten i et kjøleskap for at reaksjonen skulle forløpe. Deretter ble reaksjonsblandingen omrørt i 2,5 time ved romtemperatur. Etter filtrering av uløselige bestanddeler ble filtratet konsentrert under redusert trykk, det dannede residuum ble underkastet kolonnekromatografi på 300 ml silicagel og produktet ble eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) under dannelse av 1,7 g N ct-benzyloxycarbonyl-NT<->methyl-L-histidyl-N-2-hydroxyethyl-L-prolinamid (80) som et skumaktig materiale.

NMR (CD30D) 5ppm: 7>54 (1H, imidazolring), 7,32 (5H,

benzenring), 6,92 (1H, imidazolring), 5,04 (2H, benzyl), 3,64 (3H, N-methyl), 2,0 senter (4H, prolinring )

Masse m/z: 443 (M<+>), 413, 355, 286, 258

IR (netto) cm<-1>: 3250 (bred), 1620-1720 (bred)

d)

Til 22 ml av en eddiksyreløsning av 25%-ig hydrobromsyre ble tilsatt 1,7 g av forbindelse (80) og reaksjonen fikk forløpe i 1,5 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til 250 ml tørr ether under dannelse av et hvitt bunnfall. Bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering og ble tørket under redusert trykk under dannelse av NT<->methyl-L-histidyl-N-2-acetoxyethyl-L-prolinamid • 2-hydrobromid (81) i kvantitativt utbytte. Produktet ble anvendt som sådant for den etter-følgende reaksjon.

Eksempel 23

I en blanding av 7 ml methylenklorid og 7 ml DMF ble oppløst 317 mg av forbindelse (2) og 448 mg HOBT, og løs-ningen ble isavkjølt. Etter tilsetning av 683 mg DCC ble blandingen omrørt i 20 minutter under isavkjøling. Til reaksjonsblandingen ble tilsatt en fri aminløsning fremstilt ved omsetning av 1,37 g forbindelse (81) og 670 mg triethylamin i 12 ml DMF under isavkjøling, etterfulgt av filtrering. Blandingen ble omrørt i 38 timer i et kjøleskap for at reaksjonen skulle få forløpe. Uløselige bestanddeler ble filtrert fra, filtratet ble tørket under redusert trykk og residuet ble underkastet kolonnekromatografi under anvendelse av 300 ml silicagel. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (85:15:2) ble det erholdt 59 3 mg N01- L(S)-azetidinon-4-carbonyl] -NT-methyl-L-histidyl-N-2-acetoxyethyl-L-prolinamid (82) som et skumaktig materiale. Produktet ble oppløst i vann og ble deretter lyofilisert.

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 1750, 1730, 1640, 1540, 1230

NMR (CD3OD) 5ppm: 7, 56 (1H, imidazolring), 6,96 (1H,

imidazolring), 4,80 (1H, methinhydrogen), 4,40 (1H, methinhydrogen), 4,16 senter (3H, azetidinonring 4-O

il

stilling hydrogen, -CH20-CCH3), 2,0 senter (7H, prolinring, acetyl)

Masse (FD) m/z: 449 (M + 1)

Referanseeksempel 26 (utgangsmateriale for eksempel 24)

a)

I 80 ml tørr tetrahydrofuran ble oppløst 4,9 g (20 mmol) Z-prolin (29) og 3,5 g (26 mmol) HOBT hvoretter 4,53 g (22 mmol) DCC langsomt ble tilsatt løsningen ved 0°C. Etter omrøring av blandingen i 30 minutter ved samme temperatur ble en løsning av 1,74 g (20 mmol) morfolin oppløst i 20 ml tørr

DMF dråpevis tilsatt til blandingen. Den resulterende blanding fikk stå i 18 timer ved romtemperatur hvoretter løsningsmidlet ble destillert fra under redusert trykk. Det dannede residuum ble oppløst i 200 ml ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med 75 ml av en vandig løsning av 0,5N saltsyre, 75 ml av en mettet vandig løsning av natriumhydrogencarbonat og deretter 50 ml vann. Etter tørking av løsningen med vannfritt magnesiumsulfat ble ethylacetat destillert fra og residuet ble renset ved silicagelkolonnekromatografi på 49 0 ml Wako Gel C-200; og produktet ble eluert med ethylacetat under dannelse av 5,0 g N-[N-benzyloxycarbonyl-L-prolyl]-morfolin (83) med smeltepunkt på 139 til 140°C.

NMR: 90 MHz (CDC13) <5ppm: 1 ,70-2,40 (m, 4H, prolinring),

3,20-4,00 (m, 10H, prolinring, morfolinring), 4,40-4,90 (m, 1H, prolinring methin), 5,10, 5,14 (q, q, 2H, benzyl), 7,32, 7,34 (s, s, 5H, benzenring)

IR (KBr) cm<-1>: 2960, 2910, 2860, 2830, 1680, 1635

I 100 ml ethanol ble suspendert 4,9 g forbindelse (83) og etter tilsetning av 250 mg 10% palladium-carbon ble blandingen omrørt i 4 timer i en hydrogenstrøm. Etter filtrering av 10% palladium-carbon ble ethanolen destillert fra under redusert trykk fra filtratet under dannelse av 2,8 g urent N-(L-prolyl)-morfolin (84).

NMR: 90 MHz (CDCl,) 6 : 1 ,40-2,30 (m, 4H, prolinring),

j ppiu

2,60-3,40 (m, 2H, prolinring), 2,97 (s, 1H), 3,40-4,10 (m, 9H, morfolinring)

IR (netto) cm<-1>: 3280, 2960, 2840, 1635

Masse: 185 (M + 1), 142, 114, 98, 70, 43

I 54 ml av en vandig løsning av 1N saltsyre ble oppløst 5,46 g (18 mmol) L-Z-histidinhydrazid (3) og etter tilsetning av 72 ml ethylacetat ble blandingen avkjølt til 0°C. Deretter ble 5,4 ml av en vandig løsning av 4N-NaN02 tilsatt til blandingen ved samme temperatur, etterfulgt av omrøring i 5 minutter, og etter tilsetning av 21,6 ml av en vandig løs-ning av 50%-ig kaliumcarbonat etterfulgt av kraftig omrøring ble det dannede ethylacetatlag fraskilt. Det vandige lag ble ekstrahert med 18 ml avkjølt ethylacetat, ethylacetatekstraktet ble kombinert med foregående ethylacetatlag og blandingen ble tørket med vannfritt natriumsulfat i 5 minutter under omrøring og under isavkjøling. Etter at natriumsulfat var filtrert fra ble filtratet avkjølt til -20°C, og etter langsom dråpevis tilsetning av en løsning av 2,76 g (15 mmol) av forbindelse (84) oppløst i 10 ml ethylacetat fikk blandingen stå over natten i et kjøleskap ved 4°C. Etter at temperaturen fikk stige til romtemperatur ble ethylacetaten destillert fra under redusert trykk, og det således dannede residuum ble renset ved silicagelkolonnekromatografi på 600 ml Wako-gel C 200 og ble eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (10:1:0,1) under dannelse av 6,46 g tex

N -benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolyl]-morfolin (85) som en farveløs olje.

NMR: 90 MHz (CDC13) 6ppm: 1,60-2,40 (m, 4H, prolinring),

3,80 (d, 2H, methylen av His-fuktighet), 3,20-4,00 (m, 10H, morfolinring, prolinring), 4,40-5,0 (m, 2H, methin) 5,08 (s, 2H, benzyl), 6,09 (m, 1H, amid), 6,86 (s, 1H, imidazolring), 7,12 (s, 5H, benzenring), 7,52 (s, 1H, imidazolring)

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 2950, 2840, 1710, 1640, 1630

Masse: 455 (M<+>), 374, 341, 305, 272, 244

I 21,4 ml eddiksyre ble oppløst 6,46 g (14,2 mmol) av forbindelse (85) og etter tilsetning av 42,8 g av en eddik-syreløsning av 25%-ig hydrobromsyre under isavkjøling ble blandingen omrørt i 1,5 time. Etter at reaksjonsblandingen var tilsatt 600 ml eksikatorbehandlet ether ble bunnfallet filtrert fra under dannelse av 6,50 g urene krystaller av N-[L-histidyl-L-prolyl]-morfolin . 2-hydrobromid (86).

Eksempel 24

(Løsning A)

I 10 ml tørr DMF ble oppløst 23 0 mg (2 mmol) av forbindelse (2) og etter suksessiv tilsetning av 351 mg HOBT og 4 53 mg DCC under omrøring og avkjøling til 0°C ble blandingen omrørt i 4 0 minutter ved samme, temperatur.

(Løsning B)

I 13 ml tørr DMF ble oppløst 9 66 mg (2 mmol) av forbindelse (86) og løsningen ble avkjølt til -15°C. Etter tilsetning av 4 04 mg triethylamin under omrøring ble blandingen omrørt i 30 minutter ved samme temperatur hvoretter triethylaminhydrobromid ble filtrert fra under avkjøling.

Til løsning A avkjølt til 0°C ble tilsatt løsning B avkjølt til -15°C, og etter omrøring av blandingen i 2 timer ved -10°C fikk blandingen stå over natten i et kjøleskap ved 4°C.

Etter heving av temperaturen på reaksjonsblandingen til romtemperatur ble uløselige bestanddeler filtrert fra, DMF ble destillert av under redusert trykk og residuet ble renset ved silicagelkolonnekromatografi på 400 ml Wako-gel C-200 og ble eluert med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (40:10:1) under dannelse av 480 mg farveløse krystaller av det ønskede produkt, 4-[Na-C(S)-2-azetidinon-4-carbonyll -L-histidyl-L-prolyl]-morfolin (87) med smeltepunkt på 148 til 150°C.

NMR: 90 MHz (CD3OD) <6> ppm = 1,60-2,40 (m, 4H, prolinring),

2,72 (d,d, 1H, azetidinonring 3-stilling), 4,11

(d,d, 1H, azetidinonring 4-stilling), 6,96 (s, 1H, imidazolring), 7,63 (s, 1H, imidazolring)

IR (KBr) cm<-1>: 3200, 3040, 2850, 1755, 1650, 1625, 1555 Masse: 418 (M<+>), 348, 304, 235, 207

O]20 = -69,1° (C = 1, methanol)

Referanseeksempel 27 (utgangsmateriale for eksempel 25)

I 80 ml tørr THF ble oppløst 4,9 g (20 mmol) N-benzyloxycarbonyl-L-prolin (29) og 3,5 g (26 mmol) HOBT hvoretter 4,53 g (22 mmol) DCC langsomt ble tilsatt til løsningen ved 0°C. Etter omrøring av blandingen i 3 0 minutter ved samme temperatur ble 10 ml av en løsning av 2M dimethylamintetra-hydrofuran tilsatt. Den resulterende blanding fikk stå i 12 timer ved romtemperatur. THF ble destillert fra reaksjonsblandingen under redusert trykk, det dannede residuum ble oppløst i 200 ml ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med 7 5 ml av en vandig løsning av 0,5N saltsyre, 75 ml av en mettet, vandig natriumhydrogencarbonatløsning og 50 ml vann. Etter tørking av det organiske lag med vannfritt magnesiumsulfat ble ethylacetat destillert fra og residuet ble renset ved silicagelkolonnekromatografi på 400 ml Wako-gel C-200 og eluert med ethylacetat under dannelse av 4,8 g (S)-1 -benzyloxycarbonyl-N,N-dimethyl-2-pyrrolidincarboxamid (88) med smeltepunkt på 6 6 til 6 7°C.

NMR: 100 MHz (DMSO-d<6>) <$ ppm : 1 ,50-2,40 (m, 4H, ^prolinring), 2,74, 2,78, 2,86, 2,98 (s,s,s,s, 6H, N-dimethyl), 3,38 (m, 2H, prolinring), 4,70 (m, 1H, methin), 4,96 og 5,02 (q og s, 2H, benzyl)

IR (KBr) cm"<1>: 3020, 2960, 2940, 2860, 1700, 1640

I 86 ml ethanol ble oppløst 4,3 g av forbindelse (88) og etter tilsetning av 210 mg 10%-ig palladium-carbon ble blandingen kraftig omrørt i 90 minutter i en hydrogenstrøm. Etter filtrering av katalysatoren ble ethanol destillert av under redusert trykk under dannelse av 2,19 g urent (S)-N,N-dimethyl-2-pyrrolidincarboxamid (89).

NMR: 90 MHz (CDCl3) <6pp>m<:> 1,40-2,40 (m, 4H, prolinring),

2,84 (s, 1H, NH), 3,00 (s, 3H, N-methyl), 3,04 (m, 3H, N-methyl), 3,80-4,00 (m, 1H, methin)

IR (netto) cm"<1>: 3280, 2940, 2850, 1635

I 53,3 ml av en vandig løsning av 1N saltsyre ble oppløst 5,38 g (14,8 x 1,2 mmol) L-z-histidinhydrazid (3) og etter tilsetning av 71 ml ethylacetat ble blandingen avkjølt til 0°C. Deretter ble 5,33 ml av en vandig løsning av 4N-NaNC>2 tilsatt til blandingen ved samme temperatur, etterfulgt av omrøring i fem minutter, og etter tilsetning av 21,3 ml av en vandig løsning av 50%-ig kaliumcarbonat og omrøring i tre minutter ble det dannede ethylacetatlag oppsamlet. Det vandige lag ble ekstrahert med 18 ml avkjølt ethylacetat, ekstraktet ble kombinert med det foregående ethylacetatlag og blandingen ble tørket med vannfritt natriumsulfat i fem minutter under omrøring og under isavkjøling.

Etter filtrering av natriumsulfatet ble filtratet avkjølt til -20°C og en løsning av 2,10 g (14,8 mmol) av forbindelse (89) oppløst i 10 ml ethylacetat ble langsomt, dråpevis tilsatt til den foregående løsning. Blandingen fikk stå over natten i et kjøleskap ved 4°C. Ethylacetat ble destillert av under redusert trykk og residuet ble renset ved silicagelkolonnekromatografi på 600 ml Waco-gel C-200 og eluert med kloroform-methanol-konsentrert vandig ammoniakk (10:1:0,1) under dannelse av 5,86 g oljeaktig Not-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N,N-dimethyl-L-prolinamid (90).

NMR: 90 MHz (CDC13) 6ppm- 1,60-2,40 (m, 4H, prolinring),

3,05 (s, 3H, N-methyl), 3,16 (s, 3H, N-methyl), 4,40-5,00 (m, 2H, methin), 5,12 (s, 2H, benzyl),

5,64 (m, 1H, amid), 6,90 (s, 1H, imidazolring),

7,38 (s, 5H, benzenring), 7,56 (s, 1H, imidazolring),

11,70 (m, 1H, imidazol -NH)

IR (netto) cm<-1>: 3250, 2950, 2840, 1710, 1635 Masse: 413 (M<+>), 341, 332, 272, 262, 244

(90) (91)

I 15 ml eddiksyre ble oppløst 4,13 g (10 mmol) av forbindelse (90), og etter tilsetning av 30,12 g av en eddik-syreløsning av 25%-ig hydrobromsyre under isavkjøling ble blandingen omrørt i 1,5 time ved romtemperatur. Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 450 ml tørr ether og det utskilte bunnfall ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av 3,75 g L-histidyl-N,N-dimethyl-L-prolinamid 2-hydrobromid (91).

Eksempel 25

(Løsning A)

I 10 ml tørr DMF ble oppløst 230 mg (2 mmol) av forbindelse (2) etterfulgt av avkjøling til 0°C, og etter suksessiv tilsetning av 351 mg HOBT og 4 53 mg DCC under omrø-ring ble blandingen omrørt i 40 minutter ved samme temperatur.

(Løsning B)

I 13 ml tørr DMF ble oppløst 966 mg (2 mmol) av forbindelse (91) etterfulgt av avkjøling til -15°C, og etter langsom tilsetning av 404 mg triethylamin til løsningen under omrøring ble blandingen omrørt i 3 0 minutter. Deretter ble triethylaminhydrobromid filtrert fra under avkjøling.

Til løsning A avkjølt til 0°C ble tilsatt løsning

B avkjølt til -15°C, og etter omrøring av blandingen i to timer ved -10°C fikk blandingen stå over natten i et kjøle-

skap ved 4°C.

Reaksjonsblandingen fikk anta romtemperatur og uløselige bestanddeler ble filtrert fra. DMF ble destillert av under redusert trykk og residuet ble renset ved silicagelkolonnekromatografi på 400 ml Waco-gel C-200 og ble eluert med 4 00 ml kloroform-methanol-vandig ammoniakk (100:10:1) under dannelse av 520 mg farveløse krystaller av Na- [(S)-2-azetidinon-4-carbonyl] -L-histidyl-N,N-dimethyl-L-prolinamid (92) med smeltepunkt på 133 til 140°C.

NMR: 90 MHz (D20) & ppm- 1,60-2,50 (m, 4H, prolinring),

2,71 (d,d, 1H, azetidinonring, 3-stilling), 2,92 (s, 3H, N-methyl), 3,17 (s, 3H, N-methyl), 4,15 (d,d, 1H, azetidinonring, 4-stilling), 7,40 (s, 1H, imidazolring), 7,74 (s, 1H, imidazolring)

IR (KBr) cm"<1>: 3180, 1755, 1630, 1560

Masse: 376 (M<+>), 306, 262, 235, 207

[a] 20 = _73f1<o> (c = 1f methanol)

Referanseeksempel 28 (utgangsmateriale for eksempel 26)

I 50 ml THF ble oppløst 4,99 g (N-benzyloxycarbonyl-L-prolin (29) og etter tilsetning av 2,23 g triethylamin og 2,39 g ethylklorformiat fikk reaksjonen forløpe i 20 minutter under isavkjøling. Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 2,79

g anilin og reaksjonen fikk forløpe i én time under isavkjøling. Løsningsmidlet ble destillert fra, det dannede residuum ble oppløst i ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med en vandig løsning av 1N saltsyre, en mettet, vandig natrium-hydrogencarbonatløsning og deretter en mettet, vandig natrium-kloridløsning. Det organiske lag ble tørket over vannfritt natriumsulfat og ble deretter konsentrert til tørrhet. Residuet ble omkrystallisert fra kloroform-ethylacetat-hexan under dannelse av 5,20 g (S)-1-benzyloxycarbonyl-N-fenyl-2-pyrroli-din-carboxamid (93) med smeltepunkt 143-144°C.

NMR (CDC13) Sppn,: 6,9-7,7 (10H), 5,17 (s, 2H) , 4,43 (t,

1H), 3,4-3,8 (2H), 1,7-2,5 (4H)

IR (KBr) cm"<1>: 3260, 1690, 1660, 1595, 1545

Masse (EI): 324 (M<+>), 204, 160, 91, 70

I 150 ml methanol ble oppløst 4,87 g av forbindelse (93) og forbindelsen ble hydrogenert under anvendelse av 487 mg 10%-ig palladium-carbon som katalysator. Katalysatoren ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert under dannelse av 2,97 g (S)-N-fenyl-2-pyrrolidincarboxamid (94).

NMR (CDClo) 6 : 9,5-10,0 (1H), 6,95-7,75 (10H), 3,86

3' ppm

(dd, 1H), 2,75-3,25 (2H), 1,5-2,5 (5H)

IR (KBr) cm"<1>: 3340, 3220, 2950, 2850, 1660, 1595, 1515 Masse (EI): 190 (M<+>) , 93, 70

Til 4 5 ml av en ethylacetatløsning av Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidinazid (4) fremstilt fra 3,03 g (Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidinhydrazid (3) på kjent måte ble tilsatt 1,52 g forbindelse (94) under isavkjøling og reaksjonen fikk forløpe over natten i et kjøleskap. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol (95:5) ble det erholdt 2,49 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N-fenyl-L-prolinamid (95).

NMR (CDCIt) 6 : 6,9-7,7 (11H), 6,78 (s, 1H), 5,86 (d,

-> ppm

1H), 5,08 (s, 2H), 4,5-4,8 (2H), 2,8-3,9 (4H), 1,5-2,5 (4H)

IR (KBr) cm"<1>: 3250, 2950, 1700, 1630, 1590, 1535

Masse (EI): 461 (M<+>), 342, 310, 272, 245, 191, 136, 107,

91 , 70

Til 1,79 g av forbindelse (95) ble tilsatt 19 ml 25%-ig hydrobromsyre-eddiksyre avkjølt på et isbad, etterfulgt av omrøring i én time ved romtemperatur. Reaksjonblandingen ble tilsatt til 190 ml eksikatorbehandlet ether og det dannede bunnfall ble raskt oppsamlet ved filtrering og tørket over natten i en eksikator inneholdende kaliumhydroxyd, under dannelse av 2,05 g L-histidyl-N-fenyl-L-prolinamid.2-hydrobromid (96) .

Eksempel 26

I 10 ml DMF ble oppløst 979 mg av forbindelse (96)

og etter avkjøling av løsningen til -40°C ble 415 mg triethylamin tilsatt til løsningen. Etter at reaksjonen hadde forløpt i én time ved -30 til -40°C ble det dannede bunnfall filtrert fra under dannelse av en DMF-løsning av L-histidyl-N-fenyl-L-prolinamid (97). Produktet ble umiddelbart anvendt for den etterfølgende reaksjon etter dannelsen.

I 5 ml DMF ble oppløst 230 mg (S)-2-azetidinon-4-carboxylsyre (2) og etter tilsetning av 406 mg HOBT og 495 mg DCC under isavkjøling fikk reaksjonen forløpe i én time ved 0°C.

Reaksjonsblandingen ble avkjølt til -4 0°C, og etter tilsetning av en DMF-løsning av den foregående forbindelse (97) fikk reaksjonen forløpe i 30 minutter ved -40°C og deretter over natten i et kjøleskap. Bunnfallet ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert til tørrhet og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble det erholdt 652 mg Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-fenyl-L-prolinamid (98).

NMR (CD3OD) <5ppm: 6,9-7,7 (7H), 4,56 (dd, 1H) , 4,12 (dd,

1H), 3,7-3,9 (1H), 2,81 (dd, 1H), 1,7-2,3 (4H)

IR (KBr) cm<-1>: 3250, 2910, 1750, 1620, 1540

Masse (EI): 425 (M<+> + 1), 305, 262, 250, 208, 191, 154, 93, 70

[a]<25> = -103,5° (C = 1,35, methanol)

Referanseeksempel 29 (utgangsmateriale for eksempel 27)

a)

I 100 ml THF ble oppløst 9,97 g av forbindelse (29), og etter langsom tilsetning av 4,45 g triethylamin og deretter 6,01 g isobutylklorformiat under isavkjøling fikk reaksjonen forløpe under isavkjøling. Til reaksjonsblandingen ble langsomt tilsatt 11,37 g 3-(2-oxo-1-pyrrolidinyl)-propylamin hvoretter reaksjonen fikk forløpe i én time under isavkjøling. Bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med ethylacetat-methanol (4:1) ble det erholdt 4,43 g (S)-1-benzyloxycarbonyl-N-[3-(2-oxo-pyrrolidi-nyl)-propyl]-2-pyrrolidincarboxamid (99) . NMR (CDC13) 6ppm: 7,36 (s, 5H), 5,16 (2H), 4,33 (t, 1H), 2,8-3,8 (8H), 1,7-2,5 (10H) IR (netto) cm"<1>: 3280, 2930, 2860, 1700, 1660, 1530 Masse (EI): 373 (M<+>), 238, 204, 160, 91, 70

I 150 ml methanol ble oppløst 4,32 g av forbindelse (99)._og forbindelsen ble hydrogenert under anvendelse av 432 mg 10%-ig palladium-carbon som katalysator. Deretter ble katalysatoren filtrert fra reaksjonsblandingen og filtratet ble konsentrert under dannelse av 1,9 9 g (S)-N-[3-(2-oxo-1-pyrrolidinyl)-propyl]-2-pyrrolidin-carboxamid (100) .

NMR (CDC13) 6ppm: 7,6-8,2 (1H), 3,72 (d,d, 1H), 2,8-3,5

(8H), 1,5-2,5 (10H)

IR (netto) cm"<1>: 3280, 2920, 2850, 1650, 1530

Masse (EI):: 239 (M+) , 197, 141 , 99 , 70

Til 30 ml av en ethylacetatløsning av forbindelse

(4) fremstilt fra 2,12 g forbindelse (3) på kjent måte ble tilsatt 5 ml av en DMF-løsning av 1,17 g forbindelse (100) under isavkjøling, og reaksjonen fikk forløpe over natten i et kjøleskap. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (90:10:1) ble det erholdt 2,00 g Na<->benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N-[3-(2-oxo-1-pyrrolidinyl)-propyl]-L-prolinamid (101).

NMR (CDC1,) 6 : 8,0-8,4 (1H), 7,56 (1H), 7,35 (s, 5H),

j ppm

6,97 (s, 1H), 5,87 (d, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,3-4,8 (2H), 2,9-3,7 (8H), 1,5-2,6 (10H)

IR (KBr) cm"<1>: 3220, 2930, 2850, 1700, 1640, 1530

Masse (EI): 510 (M<+>), 430, 402, 359, 267, 239, 136, 108,

79

Til 1,02 g forbindelse (101) ble tilsatt 10 ml av en isavkjølt eddiksyreløsning av 25%-ig hydrobromsyre og reaksjonen fikk forløpe i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til 100 ml tørr ether og det dannede bunnfall ble deretter raskt oppsamlet ved filtrering og tørket over natten i en eksikator inneholdende kaliumhydroxyd, hvorved 1,28 g L-histidyl-N-[3-(2-OXO-1-pyrrolidinyl)-propyl]-L-prolinamid. 2-hydrobromid (102) ble erholdt.

Eksempel 27

I 10 ral DMF ble oppløst 1,28 g av forbindelse (102)

og etter avkjøling til -40°C ble 415 mg triethylamin tilsatt til løsningen. Etter at reaksjonen hadde fått forløpe i én time ved -3 0 til -4 0°C ble det dannede bunnfall filtrert fra under dannelse av en DMF-løsning av L-histidyl-N- [3-(2-oxo-1-pyrrolidinyl)-propyl]-L-prolinamid (103). Produktet ble umiddelbart anvendt for den etterfølgende reaksjon etter dannelsen av dette.

I 5 ml DMF ble oppløst 23 0 mg av forbindelse (2),

og etter tilsetning av 406 mg HOBT og 495 mg DCC fikk reaksjonen forløpe i én time under isavkjøling. Réaksjonsblandingen ble avkjølt til -4 0°C og etter tilsetning av den foregående DMF-løsning av forbindelse- (103) fikk reaksjonen forløpe i

30 minutter ved-40 °C og deretter over natten i et kjøleskap.

Det dannede bunnfall ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert til tørrhet og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi. Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble det erholdt 461 mg Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-N-[3-(2-oxo-1-pyrrolidi-nyl )-propyl]-L-prolinamid (104).

NMR (D20) 6ppm: 7,74 (1H), 7,05 (1H), 5,96 (dd, 1H),

5,2-5,5 (2H), 2,9-3,9 (11H), 2,72 (dd, 1H), 1,6-2,6

(10H)

IR (KBr) cm"<1>: 3240, 2950, 2850, 1755, 1630

Masse (EI): 473 (M<+>), 304, 262, 235, 154, 70

Ol27 75,6° (C = 0,55, methanol)

Referanseeksempel 3 0

a)

I 6 ml tørr THF ble oppløst 836,3 mg (8,28 mmol) diisopropylamin og løsningen ble avkjølt til 0°C under en nitrogenatmosfære. Til løsningen ble tilsatt 5,2 ml av en n-hexanløsning inneholdende 530 mg (8,28 mmol) n-butyllithium ved 0°C, og blandingen ble omrørt i 10 minutter ved samme temperatur. Til løsningen ble tilsatt en løsning av 9 20 mg (4 mmol) (S)-1-t-butyldimethylsilyl-2-azetidinon-4-carboxylsyre (105) oppløst i 8 ml tørr THF ved 0°C, hvoretter blandingen ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Løsningen ble avkjølt til 0°C, og etter tilsetning av 682 mg (4,8 mmol). methyljodid ble blandingen omrørt i 3 0 minutter ved romtemperatur. Den således erholdte reaksjonsblanding ble igjen av-kjølt til 0°C, ble surgjort med tilsetning av en vandig 10%-ig citronsyreløsning, og etter tilsetning av ether og vann ble det organiske lag fraskilt. Etherlaget ble fraskilt fra det vandige lag, ble tørket og løsningsmidlet ble destillert fra under dannelse av 860 mg 1-t-butyldimethylsilyl-3(R)-methyl-2-azetidinon-4-(S)-carboxylsyre (106) som farveløse krystaller.

[a]23 = -36,1° (C 0,5, methanol)

NMR (90 MHz, CDC13) & ppm'- 0 > 16 (3H, s, Si-methyl) , 0,34

(3H, s, Si-methyl), 0,98 (9H, s, t-butyl), 1,42 (3H, d, azetidinonring 3-stilling methyl), 3,37 (1H, q,d, azetidinonring 3-stilling), 3,74 (1H, d, J=3,5 Hz, azetidinonring 4-stilling), 9,60 (1H, s, carboxygruppe)

IR (KBr) cm"<1>: 2940, 2920, 2840, 1740, 1680

Masse m/z: 244 (M + 1), 200, 186, 143

I 20 ml av en blanding av vann, methanol og konsentrert saltsyre (10:90:1,7) ble oppløst 641 mg (2,63 mmol) av forbindelse (106) og løsningen ble omrørt i 1,5 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C, ble nøytralisert med 4 ml av en vandig løsning av 1N natriumhydroxyd hvoretter løsningsmidlet ble destillert fra under redusert trykk under dannelse av 3-(R)-methyl-2-azetidinon-4-(S)-carboxylsyre som ble anvendt ved den etterfølgende reaksjon uten å bli renset.

NMR (60 MHz, D20) 6 ppm: 1,25 (3H, d, methylgruppe), 3,20

(1H, q,d, azetidinonring 3-stilling), 3,88 (1H, d, azetidinonring 4-stilling)

I 13 ml tørr DMF ble oppløst forbindelse (107) erholdt i det foregående trinn, etterfulgt av avkjøling til 0°C, og etter tilsetning av 461,6 mg (3,42 mmol) HOBT og 596 mg (2,89 mmol) DCC, ble reaksjonsblandingen omrørt i 15 minutter ved samme temperatur (løsning A).

I 30 ml tørr DMF ble oppløst 1,086 g (2,63 mmol) L-histidyl-L-prolinamid.2-hydrobromid (8) og etter avkjøling av løsningen til -10°C ble 0,733 ml (2,63 mmol) triethylamin tilsatt til løsningen. Etter omrøring av blandingen i 30 minutter ved samme temperatur ble det utfelte triethylaminhydrobromid filtrert fra i en nitrogenatmosfære under dannelse av et klart filtrat (løsning B).

Til løsning A ble tilsatt løsning B og blandingen ble omrørt over natten ved 0 til 5°C og deretter i tre timer ved romtemperatur. De utfelte krystaller ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert under redusert trykk og residuet ble underkastet silicagelkolonnekromatografi under anvendelse av 200 ml silicagel (Wako-gel C-200). Ved eluering av produktet med kloroform-methanol-vandig ammoniakk (80:20:2) ble det erholdt 200 mg Na<->[3-(R)-methyl-2-azetidinon-4-(S)-carbo-nylj-L-histidyl-L-prolinamid (108) .

[a]<23> = -33,8° (C = 0,5, methanol)

NMR (100 MHz, D20) <$ m: 1 ,60-2,40 (4H, m, prolinring)

2,80-3,20 (3H, m, histidinring, B-methylen, prolinring), 3,40-4,00 (2H, m, azetidinonring 3-stilling,

bb

prolinring), 3,90 (1H, d, J = 3,0 Hz, azetidinonring 4-stilling), 4,40 (1H, m, methin), 4,88 (1H, m, methin), 7,00 (1H, s, imidazolring), 7,68 (1H, s, imidazolring), 1,32 (3H, d, methyl)

IR (KBr) cm"<1>: 3450, 2960, 2860, 1750, 1670, 1630 Masse m/z: 362 (M<+>), 318, 278, 249, 234, 221

Eksempel 29

(i) Til 504 ml av en vandig løsning av 0,1 N natriumhydroxyd avkjølt til 1 til 5°C ble tilsatt 13,4 g av forbindelse (60). Blandingen ble omrørt i 1 time ved O til 5°C og ble deretter langsomt nøytralisert med 50,4 ml 0,1 N vandig saltsyre. Vann ble destillert fra under redusert trykk, og residuet ble dehydratisert azeotropisk med benzen. De utfelte krystaller ble filtrert samtidig som de ble vasket med methanol under dannelse av forbindelse (61) i kvantitativt utbytte. Produktet ble anvendt uten ytterligere rensning ved det etterfølgende syntesetrinn. (ii) 1,553 g av forbindelse (61), 1,012 g 2,4-dinitro-fenol og 570 mg L-prolinamid ble suspendert i 20 ml tørket DMF, og blandingen ble isavkjølt. Etter tilsetning av 1,13 g DCC ble blandingen omrørt i 1 time ved 0 til 5°C og i 20 timer ved romtemperatur, hvoretter uløselige bestanddeler ble filtrert fra. DMF ble fjernet fra filtratet under redusert trykk, og 50 ml vann ble tilsatt til residuet. Utfelte uløselige bestanddeler ble fjernet ved filtrering, og 5,5 ml 1 N vandig saltsyre ble tilsatt til filtratet. Den dannede løsning ble vasket 3 ganger, hver gang med 30 ml methylenklorid, og ble nøytralisert med 5,5 ml 1 N vandig natrium-hydroxydløsning. Vann ble destillert fra under redusert trykk, og residuet ble dehydratisert azeotropisk med en blanding av toluen-ethanol. Til residuet ble tilsatt 40 ml methanol, og uløselige bestanddeler ble filtrert fra. Filtratet ble konsentrert til ca. 10 ml og isavkjølt. De således utfelte krystaller ble filtrert under dannelse av 1,3 g Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-L-histidyl-L-prolinamid (10). De fysiokjemiske egenskaper av produktet var de samme som for produktet fremstilt i eksempel 1.

Referanseeksempel 31

På lignende måte som beskrevet i referanseeksempel 21, men ved anvendelse av D-histidin-methylester-2-hydroklorid istedenfor L-histidin-methylester-2-hydroklorid, ble Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbonyl]-D-histidin-methylester fremstilt.

NMR(d<6->DMS0) Sppm: 2,6-3,24 (4H, m, (3-stilling methylen av histidingruppe, 3-stilling av azetidinonring), 3,60 (3H, s, methyl), 4,0 (1H, d,d, 4-stilling av azetidinonring), 4,56 (1H, a-stilling methin av histidingruppe),

6,82 (1H, imidazolring), 7,56 (1H, imidazolring), 8,22

(1H, NH), 8,56 (1H, NH).

IR(KBr)cm-1: 3230, 3000, 2950, 1780, 1730, 1710, 1660, 1580, 1440, 1230.

E ksempel 30

Ved å gå frem på lignende måte som beskrevet i eksempel 17-A, men ved å anvende forbindelse (110) istedenfor forbindelse (60), ble amorft Na<->[(S)-2-azetidinon-4-carbony 1 ] -D-histidy 1-L-prolincimid erholdt.

NMR(D20) <£>ppm: senter ved 2,0 (4H, m, pyrrolidin-ring), 2,72, 2,90 (1H, d,d, 3-stilling av azetidinonring)/ 3,0-3,48 (3H, p-stilling methylen av histidingruppe og 3-stilling av azetidinonring), 4,30 (2H, 4-stilling av azetidinonring og methin), 7,0 (1H, imidazolring), 7,72

(1H, imidazolring).

IR(KBr)cm<_1>: 3250 (bred), 1750, 1670, 1630, 1540, 1440.

[a] = -76,2° (C=l, vann).

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive 4-substituerte 2-azetidinonforbindelser av generell formel I 13 4

hvori R , R og R som kan være lik eller forskjellig hver betegner et hydrogenatom eller en C, -C .-alkylgruppe; R

betegner en imidazolylgruppe vist ved

eller

hvori R<5> betegner et hydrogenatom, en C^-C^-alkylgruppe, en tosylgruppe eller 2,4-dinitrofenylgruppe; n betegner 0, 1, 2 eller 3; X betegner en methylengruppe, en ethylengruppe eller et svovelatom, og Y betegner en hydroxygruppe, en benzyloxygruppe eller en usubstituert eller substituert amino-

gruppe vist ved -

hvori R 6 og R 7, som kan være lik

eller forskjellig, hver betegner et hydrogenatom, en C^-C4~ alkylgruppe, en hydroxy-C^-C^-alkylgruppe, en opp til C1Q-cycloalkylgruppe, en fenylgruppe, en 2-pyrrolidinon-l-yl-gruppe eller en acetyloxy-C^-C^-alkylgruppe; hvilke R6 og R7 kan sammen med hverandre og sammen med nitrogenatomet til hvilket de er bundet, danne en morfolinring, og optisk aktive og inaktive isomerer og salter derav, karakterisert ved at a) en carboxylsyre av generell formel II

hvori R<1> og n har de ovenfor angitte betydninger, eller et reaktivt derivat derav, omsettes med et amin av generell formel VI 2 3 4

hvori R , R , R , X og Y har de ovenfor angitte betydninger; og når Y er en hydroxygruppe eller R 6 og R 7 betegner en hydroxy-C1-C4-alkylgruppe eller en 2-pyrrolidinon-l-yl-gruppe, kan disse grupper ha en beskyttende gruppe eller et reaktivt derivat derav, og når reaksjonsproduktet har en beskyttende gruppe fjernes denne beskyttende gruppe, eller b) en carboxylsyre av generell formel (IV)

hvori R 1 , R 2 og n har de tidligere angitte betydninger, eller et reaktivt derivat derav, omsettes med et syklisk amin av generell formel (V)

hvori R 3 , R 4, X og Y har de ovenfor angitte betydninger; og når Y er en hydroxygruppe eller R 6 eller R 7 betegner en hydroxy- C^-C^-alkylgruppe eller en 2-pyrrolidinon-l-yl-gruppe, kan disse grupper ha en beskyttende gruppe eller et reaktivt derivat derav, og når reaksjonsproduktet har en beskyttende gruppe fjernes denne beskyttende gruppe, hvoretter forbindelsen av formel I eventuelt isoleres i en optisk aktiv eller inaktiv isomer og/eller omdannes til et farmasøytisk akseptabelt salt ved hjelp av kjente metoder.