NL9202208A - Werkwijze voor de enzymatische bereiding van optisch aktieve glycidezure esters. - Google Patents

Description

-1- PN 7712

WERKWIJZE VOOR DE ENZYMATISCHE BEREIDING VAN OPTISCH AKTIEVE

TRANS-GLYCIDEZURE ESTERS

De uitvinding beschrijft een werkwijze voor de bereiding van een optisch aktieve ester van trans-3-fenyl-glycidezuur volgens de algemene formule

Ri» een groep afgeleid van een alcohol bijvoorbeeld een alkylgroep; A = een aromaatring bijvoorbeeld een fenylring al dan niet gesubstitueerd, waarbij een mengsel van twee enantiomeren van trans-3-fenyl-glycidezure ester stereoselektief wordt gehydrolyseerd met een enzym afkomstig van het genus Candida en de niet-gehydrolyseerde ester uit het reaktiemengsel wordt afgescheiden.

In EP-A-362556 wordt de enzymatische hydrolyse van racemisch trans-methyl-3-(4-methoxyfenyl)glycidezure ester met behulp van een groot aantal enzymen waaronder ook Candida cylindracea beschreven. Aanvraagster heeft gevonden dat Candida cylindracea niet meer aktief en selektief is bij temperaturen hoger dan of gelijk aan 50°C.

Ook in WO-A-9004643 wordt de enzymatische hydrolyse van een racemisch mengsel van twee enantiomeren van trans-methyl-3-(4-methoxyfenyl)glycidezure ester met behulp van een groot aantal enzymen waaronder ook een enzym geïsoleerd uit Candida cylindracea beschreven. Uit de beschrijving blijkt dat de enzymatische hydrolyse met behulp van het Candida cylindracea enzym doorgaans een lage e.e. (enantiomeric excess) vertoont en bovendien blijkt het enzym zeer gevoelig voor het gekozen oplosmiddel.

Er bestaat grote belangstelling een geschikt enzym te vinden voor de bereiding van deze chirale verbindingen. Het doel van de uitvinding is een werkwijze te verschaffen welke bovengenoemde nadelen niet heeft en waarbij een racemisch mengsel van trans-fenylglycidezure esters in een relatief korte reactietijd selectief, enzymatisch wordt gehydrolyseerd waarbij de resterende ester met een hoge opbrengst en met hoge e.e. kan worden verkregen.

Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door een enzym afkomstig van Candida antarctica toe te passen.

De onderhavige uitvinding berust op een enantioselektieve enzymatische hydrolyse van een mengsel van twee enantiomeren van trans-3-fenylglycidezure ester met behulp van een enzym afkomstig uit Candida antarctica. Gebleken is dat de enzymatische hydrolyse stereo-selektief kan worden uitgevoerd bij hogere temperaturen dan tot nu toe in de literatuur aangetoond, bijvoorbeeld bij temperaturen tussen 30-80°C. Hierdoor kan de reaktietijd aanzienlijk worden verkort. Bovendien lijkt het enzym minder gevoelig voor het gekozen oplosmiddel d.w.z. dat in verschillende oplosmiddelen goede selektiviteiten verkregen worden.

De trans-3-fenylglycidezure ester volgens formule I kan op de aromaatring A al dan niet een of meerdere substituenten bevatten. De substituenten kunnen bijvoorbeeld worden gekozen uit hydroxy, alkoxy met 1-6 C-atomen, alkyl met 1-6 C-atomen en halogeen. De aromaatring A kan ook polycyclisch zijn. Het ester residu R1 is meestal een alkyl groep met 1-6 koolstofatomen en is bij voorkeur methyl, ethyl, isopropyl of isobutyl.

De enantiomere overmaat, die een maat is voor de enantiomere zuiverheid en veelal wordt aangeduid als "e.e." (enantiomeric excess), is een veel gebruikte grootheid. Kort gezegd is de enantiomere overmaat gelijk aan het verschil van de hoeveelheden enantiomeren gedeeld door de som van de hoeveelheden enantiomeren, welk quotiënt door vermenigvuldiging met 100 als percentage kan worden uitgedrukt.

De esters van trans-3-fenylglycidezuur met de hierboven opgegeven formule I kan men bijvoorbeeld bereiden door Darzens condensatie of door epoxydatie van esters van trans-kaneelzuur.

De esters van trans-3-fenylglycidezuur volgens formule I bezitten twee chirale centra. Moleculen met n chirale centra bezitten in principe 2n stereoisomeren. Voor 3-fenylglycidezure esters zijn dus 4 stereoisomeren denkbaar, die voorkomen als twee D,L-paren, welke onderling diastereoisomeren zijn. De twee diastereoisomere vormen van 3-fenylglycidezure esters zijn de cis en de trans vorm. De twee enantiomeren in de trans-vorm hebben de configuratie (2R,3S) respectievelijk (2S,3R). De configuraties van de cis-vorm zijn (2R,3R) respectievelijk (2S,3S). Voor de bereiding van benzothiazepines en benzazepines wordt veelal het enantiomeer toegepast met de configuratie (2R,3S).

De uitvinding heeft tevens betrekking op de toepassing van de optisch aktieve ester als intermediate in de bereiding van farmaceutica zoals bijvoorbeeld benzothiazepines zoals naltiazem, clentiazem en diltiazem, benzazepines en taxol.

Diltiazem is de gebruiksnaam van 2-(4'-methoxy-fenyl)-3-acetyloxy-5-[2-(dimethylamino)ethyl]-2,3-dihydro-l,5-benzothiazepine-4-(5H)-on en is bijvoorbeeld bekend uit US-A-3562257. Diltiazem is een calcium-antagonist die gebruikt wordt bij cardiovasculaire aandoeningen, zoals angina pectoris. Daarnaast wordt het ook toegepast bij hartritmestoornissen en tegen hypertensie. Wanneer de bereiding van diltiazem wordt beoogd bevat de trans-3-fenyl-glycidezure ester als A een para-methoxyfenylring, R1 is dan meestal een methylgroep.

Enzymatische hydrolyse van racemische esters, zoals die voor de onderhavige uitvinding wordt toegepast voor de hydrolyse van trans-3-fenylglycidaat is bekend.

Een volledig selektief enzym geeft bij een conversie van 50% zowel optisch zuiver produkt als optisch zuiver resterend substraat. In de praktijk zijn enzymen echter niet volledig selektief. Als men dus in de praktijk het produkt van een enantioselektieve enzymatische omzetting met grote enantiomere zuiverheid wil verkrijgen, zal men bij voorkeur de omzetting bij minder dan 50% conversie beëindigen.

Wil men daarentegen het resterende substraat (in het onderhavige geval de ester) met grote enantiomere zuiverheid verkrijgen, dan zal men bij voorkeur de omzetting tot een conversiegraad van meer dan 50% voortzetten, totdat de gewenste enantiomere overmaat is bereikt.

De mate van onderscheid en het rendement van een enzymatische enantioselectieve omzetting, m.a.w. de enantioselectiviteit zullen beter zijn naarmate het verschil in omzettingssnelheid tussen de enantiomeren groter is. Het verschil in omzettingssnelheid in aanwezigheid van een bepaald enzym kan men door een geschikte keuze van de procesparameters in zekere mate beïnvloeden. Uiteraard zal men bij het gebruik van een bepaald enzym er naar streven de procesparameters zo gunstig mogelijk te kiezen. De deskundige kan deze parameters aan de hand van daarop gerichte experimenten eenvoudig bepalen.

Zoals bijvoorbeeld beschreven in de publicatie van Ching-Shih Chen et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7294-7299 geldt veelal dat in het resterende substraat een hogere enantiomere zuiverheid kan worden gerealiseerd dan in het gevormde produkt.

Als hydrolytische enzymen kunnen o.a. lipasen, esterasen, proteasen en peptidasen worden toegepast. Lipasen zijn vetsplitsende enzymen die gewonnen kunnen worden uit bacteriën, gist- of schimmelsoorten, varkenspancreas e.d.

Het enzym dat toegepast wordt volgens de onderhavige uitvinding is een lipase afkomstig van Candida antarctica. Dit lipase kan bijvoorbeeld worden geproduceerd via recombinant DNA technologie. Het gen coderend voor het betreffende lipase wordt daarbij heteroloog tot expressie gebracht in een gastheer microorganisme, bijvoorbeeld

Aspergillus oryzae. Dit enzym is in de handel verkrijgbaar.

Via de enzymatische hydrolyse van een trans-3-fenylglycidezure ester met Candida antarctica lipase wordt het (2S,3R) enantiomeer van de trans-3-fenylglycidezure ester met hoge selectiviteit gehydrolyseerd waardoor het (2R,3S) enantiomeer met hoge e.e. kan worden verkregen.

De reactiesnelheden van de enantiomeren blijken aanmerkelijk te verschillen waardoor men, uitgaande van een racemisch mengsel, bij een conversie van minder dan 53% al een enantiomere overmaat van meer dan 95% van het (2R,3S)-3-(4-methoxy£enyl)glycidezure ester enantiomeer kan verkrijgen. Een enantiomere overmaat van meer dan 98% wordt, eveneens uitgaande van een racemisch mengsel, reeds bereikt bij een conversie van ongeveer 55%. Uitgaande van aan het gewenste enantiomeer verrijkte mengsels worden betere resultaten bereikt, waarbij het enzym zijn selectiviteit behoudt.

Het enzym volgens de uitvinding wordt bij voorkeur toegepast in zijn geïmmobiliseerde vorm d.w.z. op een vaste fase o.a. op microporeuze deeltjes, gel type deeltjes en ionenwisselaar harsen. Het terugwinnen van het enzym wordt hierdoor gemakkelijker en het enzym kan hergebruikt worden. Gebleken is dat bij toepassing van het enzym in geïmmobiliseerde vorm ook een hoge aktiviteit en selectiviteit wordt behaald, welke aktiviteit en selectiviteit na diverse malen recyclen, behouden bleef.

De stereoselektieve hydrolyse wordt bij voorkeur uitgevoerd in een twee fasen systeem met een waterfase en een organische fase welke een organisch solvent bevat. Voorbeelden van een dergelijk solvent zijn niet of slechts weinig in water oplosbare oplosmiddelen zoals chloroform, isopropylether, 3-pentanon, dichloormethaan, trichloor-methaan, benzeen, tolueen, xyleen, methyl-t-butylether, methylisobutylketon, cyclohexanon, isooctaan, ethylacetaat e.a. Verrassenderwijze is de selektiviteit van het enzym volgens de uitvinding nagenoeg onafhankelijk van het gekozen solvent, waarbij veelal een e.e. van hoger dan 95% bereikt kan worden bij een conversie van minder dan 53%. De hydrolyse volgens de uitvinding kan bij kamertemperatuur of bij verhoogde temperatuur worden uitgevoerd. De bovengrens wordt bepaald door de stabiliteit van het substraat en is in de praktijk ongeveer 80°C. Bij voorkeur wordt een temperatuur van 20-60°C in het bijzonder 30-50°C toegepast. Toepassing van hogere temperaturen heeft het voordeel dat de reaktie sneller verloopt.

Tijdens de hydrolyse wordt de pH, bijvoorbeeld door toevoeging van een base, op een waarde van 5 tot 10 bij voorkeur van 7-9, in het bijzonder op ongeveer 8, gehouden. De overblijvende ester, dat wil zeggen het enantiomeer dat niet is gehydrolyseerd kan bijvoorbeeld worden gewonnen door afscheiding van het organische oplosmiddel waarin de ester is opgelost, gevolgd door winning van de ester uit de oplossing.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt de optisch aktieve ester van (2R,3S)-3-(4-alkoxyfenyl)glycidezuur bij voorkeur (2R,3S)-3-(4-methoxyfenyl)glycidezuur verkregen met een e.e. groter dan 95% bij voorkeur groter dan 98%.

De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van voorbeelden zonder hiertoe te worden beperkt.

De enantiomere overmaat (e.e.) van de (2R,3S) ester werd bepaald via HPLC analyse met behulp van een chiracel OD kolom (Daicel Chemical Industries, Ltd; eluent: hexaan/iso-propanol = 70/30).

Voorbeeld I

20 gram racemisch trans-methyl-3-(4-methoxyfenyl)-glycidaat werd opgelost in 180 ml methylisobutylketon waarna 180 ml 50 mM Tris/HCl buffer van pH 8 werd toegevoegd. Na toevoeging van 100 mg Candida antarctica lipase werd de pH constant gehouden op 8 middels automatische titratie met 2 N

NaOH. De temperatuur werd op 30°C gehandhaafd. Analyse van het reactiemengsel na 7,5 uur hydrolyse gaf een enantiomere overmaat van de (2R,3S)-ester van 97%.

Voorbeeld II

Na oplossen van 10 gram racemisch trans-methyl-3-(4-methoxyfenyl)glycidaat in 75 ml tolueen en toevoeging van 75 ml 50 mM kaliumfosfaat buffer met een pH 7 werd 200 mg Candida antarctica lipase toegevoegd. Na 3 uur reageren bij 30°C, waarbij de pH constant werd gehouden d.m.v. titratie met 2 N NaOH, werd een enantiomere overmaat van 99% gemeten.

Voorbeeld III

Voorbeeld II werd herhaald met dien verstande dat de pH constant werd gehouden op 8. Na 2 uur reageren werd een enantiomere overmaat van 97% gemeten.

Voorbeeld IV

Voorbeeld II werd herhaald met dien verstande dat de reactie werd uitgevoerd bij 50°C. Hierbij werd, na 1 uur hydrolyse, een enantiomere overmaat van 97% gemeten.

Voorbeeld V

20 gram racemisch trans-methyl-3-(4-raethoxyfenyl)-glycidaat werd onder roeren, toegevoegd aan 60 ml organisch oplosmiddel, zoals vermeld in tabel 1. Hieraan werd 60 ml 50 mM Tris/HCl buffer van pH 8 toegevoegd. Na toevoeging van 2 gram geïmmobiliseerd Candida antarctica lipase werd de pH

constant gehouden op 8 middels automatische titratie met 2 N NaOH. De reactie werd uitgevoerd bij 30°C.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 1.

Voorbeeld VI

20 gram racemisch trans methyl 3-(4-methoxy-fenyl)glycidaat werd opgelost in 60 ml methylisobutylketon. Hieraan werd 60 ml 50 mM Tris/HCl buffer van pH 8 toegevoegd. Na toevoeging van 4 gram geïmmobiliseerd Candida antarctica lipase werd de pH constant gehouden op 8 middels automatische titratie met 2 N NaOH. De hydrolyse werd uitgevoerd bij 30°C.

Na 5 uur werd de reactie gestopt door filtratie van het reactiemengsel waarbij de biokatalysator als residu achterbleef. De biokatalysator werd gewassen met 2x 40 ml methyl isobutylketon. Na afscheiding van de waterfase werd de verzamelde organische fase 2x gewassen met 30 ml 20% natriumbisulfietoplossing en daarna met 2x 20 ml 5% natrium-bicarbonaatoplossing. De organische fase werd gedroogd op MgS04 en ingedampt. Via kristallisatie in MeOH werd 7,5 gram (2R,3S)-3-(4-methoxyfenyl)glycidaat verkregen.

[a]20D = -203° (c = 1 MeOH). Smeltpunt 84-87°C.

Voorbeeld VII

Voorbeeld VI werd herhaald waarbij de teruggewonnen geïmmobiliseerde biokatalysator uit voorbeeld VI opnieuw werd ingezet onder dezelfde condities. Na 6 uur hydrolyse werd de trans (2R,3S)-ester geïsoleerd zoals beschreven in voorbeeld VI. 7,0 gram (2R,3S)-3-(4-methoxyfenyl)glycidaat werd verkregen. [a]20D = -204° (c = 1 MeOH). Smeltpunt 84-87°C.

Voorbeeld VIII

Voorbeeld VI werd herhaald met dien verstande dat 2 gram Candida antarctica lipase werd gebruikt. De enantiomere overmaat van de (2R,3S)-ester, gemeten na 6 uur hydrolyse, bedroeg 99%.

Voorbeeld IX

10 gram racemisch trans-methyl-3-(-4-methoxyfenyl)-glycidaat werd opgelost in 60 ml methyl-t-butylether.

Hieraan werd 60 ml 50 mM Tris/HCl buffer van pH 8 toegevoegd. Vervolgens werd 4 gram geïmmobiliseerd Candida antarctica lipase toegevoegd en werd de pH constant gehouden op 8 middels automatische titratie met 2 N NaOH. De hydrolyse werd uitgevoerd bij 60°C.

Na 3 uur hydrolyse werd een enantiomere overmaat ft van 90% gemeten voor de (2R/3S)-ester.

Voorbeeld X

5 gram racemisch trans-methyl-3-(4-methoxyfenyl)-glycidaat werd opgelost in 60 ml isooctaan. Hieraan werd 60 ml 50mM Tris/HCl buffer van pH 8 toegevoegd. Na toevoeging van 2 gram geïmmobiliseerd Candida antarctica lipase werd de pH constant gehouden op 8 middels automatische titratie met 2 N NaOH. De hydrolyse werd uitgevoerd bij 80°C.

Na 150 minuten hydrolyse werd een enantiomere overmaat van 95% gemeten.

Voorbeeld XI

1,5 gram racemisch trans-methyl-3-(4-methoxyfenyl)-glycidaat werd opgelost in 60 ml chloroform. Hieraan werd 60 ml 50 mM Tris/HCl buffer van pH 8 toegevoegd. Na toevoeging van 4 gram geïmmobiliseerd Candida antarctica lipase werd de pH constant gehouden op 8 middels automatische titratie met 2 N NaOH. De hydrolyse werd uitgevoerd bij 50°C.

Na 240 minuten bedroeg de enantiomere overmaat van de (2R,3S)-ester 96%.

Claims (13)

1. Werkwijze voor de bereiding van een optisch aktieve ester van trans-3-fenylglycidezuur volgens de algemene formule

Rl= een groep afgeleid van een alcohol bijvoorbeeld een alkylgroep; A= een aromaatring bijvoorbeeld een fenylring al dan niet gesubstitueerd, waarbij een mengsel van de twee enantiomeren van de trans- 3-fenylglycidezure ester stereoselektief wordt gehydrolyseerd met behulp van een enzym van het genus Candida en de niet-gehydrolyseerde ester uit het reaktiemengsel wordt afgescheiden met het kenmerk dat het toegepaste enzym afkomstig is van Candida antarctica.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 waarbij de configuratie van de niet-gehydrolyseerde ester (2R,3S) is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2 waarbij de niet-gehydrolyseerde ester de methylester is van (2R,3S)-3-4-methoxyfenylglycidezuur.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3 waarbij de enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd bij een temperatuur hoger dan 30°C.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4 waarbij de hydrolyse wordt toegepast in een twee fasen systeem van water en een niet of slechts weinig in water oplosbaar organisch solvent.

6. Werkwijze volgens conclusie 5 waarbij het organisch solvent gekozen wordt uit de groep chloroform, methyl-isobutylketon, ethylacetaat, 3-pentanon, cyclohexaan, isooctaan, isopropylether, methyl-t-butylether, i dichloormethaan, trichloormethaan, benzeen, tolueen en xyleen.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6 waarbij de optisch aktieve ester van (2R,3S)-3-fenylglycidezuur wordt verkregen met een e.e groter dan 98%.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7 waarbij het enzym geïmmobiliseerd is.

9. Toepassing van een ester verkregen volgens één der conclusies 1-8 in de bereiding van benz(othi)azepines.

10. Werkwijze voor de bereiding van benz(othi)azepines waarbij een ester verkregen volgens één der conclusies 1-9 wordt onderworpen aan een koppelingsreactie met een thiofenol en desgewenst wordt gealkyleerd en/of geacyleerd.

11. Werkwijze voor de bereiding van een optisch aktieve ester van trans-3-fenylglycidezuur zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de voorbeelden.

12. Optisch aktieve ester van trans-3-fenylglycidezuur verkregen met de werkwijze volgens een der conclusies 1-8, 11.

13. Benz(othi)azepines verkregen met de werkwijze volgens conclusie 10.