NL1036531C2 - Xanthomonas campestris pv. campestris resistente brassica plant en werkwijzen voor het verkrijgen hiervan. - Google Patents

Description

«

XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS RESISTENTE BRASSICA PLANT EN WERKWIJZEN VOOR HET VERKRIJGEN HIERVAN

Beschrijvingsinleiding 5

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een Xanthomonae campestris pv. campestris (Xcc) resistente Brassica plant, en zaden, vruchten en/of plantdelen daarvan, en werkwijzen voor het verkrijgen hiervan. De onderhavige 10 uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een Xcc resistente Brassica oleracea plant, en zaden, vruchten en/of plantdelen daarvan, en werkwijzen voor het verkrijgen hiervan. Daarnaast heeft de onderhavige uitvinding betrekking op Quantitative Trait Loei (QTL's) welke de 15 onderhavige Xcc resistentie verschaffen en moleculaire merkers, in het bijzonder Random Amplified Microsatellite Polymorphisms (RAMP) merkers, voor het identificeren van de onderhavige QTL' s.

Het micro-organisme Xanthomonas campestris pv.

20 campestris is de veroorzaker van zwartnervigheid (Engels: "blackrot") in kruisbloemigen. Het is wereldwijd waarschijnlijk het belangrijkste pathogeen op kruisbloemigen. In delen van Europa, Amerika, Afrika, Azië, Australië en Oceanië, komt de ziekte algemeen voor. De 25 belangrijkste waardplant van deze bacterieziekte is Brassica oleracea. Echter, de ziekte komt ook op verschillende andere kruisbloemige gewassen, onkruiden en siergewassen voor.

Een aantasting door Xanthomonas campestris pv. campestris vindt plaats via de hydathoden van het blad (soms 30 via de stomata of via verwondingen van de plant) en de infectie verspreidt zich vervolgens via de vaatbundels. Hierdoor worden zwarte nerven en V-vormige laesies in het 1036531 2 blad gevormd en zal een deel van het blad verwelken en vergelen.

Xanthomonas campestris pv. campestris is daarnaast een, via zaad, overdraagbare ziekte, die de plant in een 5 vroeg stadium vanuit het zaad kan infecteren. De bacterie kan tot wel drie jaar overleven op het zaad. Besmetting door de bacterie kan ook plaatsvinden vanuit opslag van plantenresten, secundaire waardplanten en irrigatiesystemen.

Chemische bestrijding van de ziekte is niet 10 mogelijk. Gebruik van ziektevrij uitgangsmateriaal en sanitaire maatregelen zoals het verwijderen van mogelijke waardplanten zijn de enige maatregelen die kunnen worden genomen. Ziektevrij uitgangsmateriaal (planten) kan verkregen worden door het gebruik van pathogeenvrije 15 zaadpartijen of door fysische behandeling van besmette zaadpartijen. Het gebruik van, en het beschikken over, resistente rassen, die ook tijdens het groeiseizoen vrij van Xcc aantasting blijven, geniet echter veruit de voorkeur om een gezond gewas, dat wil zeggen vrij van Xcc, op te kweken. 20 Brassica is een plantengeslacht binnen de familie

Brassicaceae (vroeger: Cruciferae). De leden van dit geslacht worden gezamenlijk als kool of mosterd betiteld.

Het geslacht Brassica omvat een aantal belangrijke land- en tuinbouwgewassen, waaronder koolzaad, bloemkool, rode kool, 25 savooienkool, witte kool, spitskool, boerenkool, broccoli, spruitkool, Chinese kool, koolrabi en Portugese kool (tronchuda).

Vrijwel alle delen van de planten worden als voedsel gebruikt, zoals de wortels (koolraap), stengels (koolrabi), 30 bladeren (witte kool), okselknoppen (spruitjes), bloemen (bloemkool, broccoli), kiemplanten en zaden (koolzaad). Verder worden sommige soorten met witte of paarse bloemen of aparte bladkleur of -vorm voor de sier geteeld.

3

Gelet op het belang van Brassica planten voor de voedselproductie en de economische schade die wordt veroorzaakt door de bacterie Xanthomonas campestris pv. campestris, is het een doel van de onderhavige uitvinding 5 het verschaffen van een Xcc resistente Brassica plant en werkwijzen voor het verkrijgen hiervan.

De behoefte aan een Xcc resistente Brassica plant voor de voedselproductie wordt verder onderschreven door de afwezigheid van adequate, kosteneffectieve, en efficiënte 10 middelen om deze ziekte te bestrijden, zoals het niet beschikbaar zijn van bestrijdingsmiddelen tegen deze bacterie.

Het hierboven aangegeven doel van de onderhavige uitvinding, naast andere doelen, wordt volgens een eerste 15 aspect verschaft door een werkwijze voor het verschaffen van een Xcc resistente Brassica plant volgens conclusie 1.

Specifiek wordt het hierboven aangegeven doel van de onderhavige uitvinding, naast andere doelen, volgens een eerste aspect verschaft door een werkwijze voor het 20 verschaffen van een Xcc resistente Brassica acceptorplant omvattende: het selecteren van een eerste Brassica donorplant welke in zijn genoom een Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) omvat; 25 - het selecteren van een tweede Brassica donorplant welke in zijn genoom een Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) omvat; en introgressie, of het genomisch samenvoegen, van de Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) uit 30 de eerste donorplant en de Quantitative Trait

Locus 2 (QTL2) uit de tweede donorplant in een Brassica acceptorplant; waarbij: 4 de Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) wordt gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de groep die bestaat uit een fragment van 158-162 bp met primercombinatie 1.1 5 (SEQ ID No: 1) en 6; een fragment van 283-287 bp met primercombinatie 1.2 (SEQ ID No: 2) en 6; een fragment van 370-374 bp met primercombinatie 1.3 (SEQ ID No: 3) en 6; en een fragment van 41-45 bp met primer combinatie 1.4 (SEQ ID No: 4) en 6,- 10 de Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) wordt gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de groep die bestaat uit een fragment van 88-92 bp met primercombinatie 2.1 (SEQ ID No: 5) en 6; een fragment van 125-129 bp met 15 primercombinatie 2.2 (SEQ ID No: 6) en 6; een fragment van 334-338 bp met primercombinatie 2.3 (SEQ ID No: 7) en 6; en een fragment van 47-51 bp met primercombinatie 2.4 (SEQ ID No: 8) en 6; en 20 waarbij de Brassica acceptorplant met betrekking tot zijn genoom niet gelijk is aan de eerste en tweede Brassica donorplanten.

Volgens dit eerste aspect van de onderhavige uitvinding vindt het selecteren, of identificeren, van de 25 eerste en tweede donorplant plaats door te bepalen of in het genoom van de respectievelijke donorplanten zich Quantitative Trait Loci (QTL's) bevinden die gerelateerd zijn aan de onderhavige Xcc resistentie.

Een dergelijke bepaling kan worden uitgevoerd door 30 gebruik te maken van standaard moleculair biologische technieken die algemeen bekend zijn in het vakgebied. Een voorbeeld is het isoleren van het genomisch DNA van een potentiële donorplant en het vervolgens bepalen van de 5 aanwezigheid van de onderhavige loci in het geïsoleerde genoom aan de hand van, bijvoorbeeld, PCR, DNA fingerprinting, of Southern blots.

Een bijzonder geschikte werkwijze voor het 5 identificeren van de onderhavige loei in het genoom van de respectievelijke donorplanten is een DNA fingerprinting techniek die in het vakgebied bekend staat als Random Amplified Microsatellite Polymorphism of RAMP. Hierbij wordt op het geïsoleerde genomisch materiaal van een donorplant 10 een RAMP PCR reactie uitgevoerd waarbij gebruik wordt gemaakt van de onderhavige primers (SEQ ID Nos: 1-8) en RAPD primers (Operon RAPD 10-mer kits A-01 tot en met BH-20).

Na deze PCR reactie worden de verkregen amplificatieproducten gescheiden door middel van, 15 bijvoorbeeld, gelelectroforese en hun grootte wordt bepaald, bijvoorbeeld aan de hand van een moleculaire basepaar ladder. De Quantitative Trait Loci 1 en 2 (QTL1 en QTL2) worden gekenmerkt door tenminste de aanwezigheid van een band met de aangeduide grootte naast een mogelijk veelvoud 20 van andere banden met een andere grootte.

Na het selecteren van de geschikte donorplanten kunnen de geïdentificeerde loci (QTL1 en QTL2) worden ingebracht of genomisch samengevoegd, in het genoom van een gewenste acceptorplant door middel van, bijvoorbeeld, 25 standaardkruisingen waarbij de aanwezigheid van de onderhavige QTL's telkens wordt bepaald in de nakomelingen op bijvoorbeeld dezelfde wijze die is gebruikt voor het selecteren van de donorplanten. Een bijzonder geschikte techniek hiervoor is het herhaald terugkruisen.

30 Volgens de onderhavige uitvinding is de Brassica acceptorplant met betrekking tot zijn genoom niet gelijk aan de eerste en tweede Brassica donorplant. In de context van de onderhavige uitvinding kan dit op eenvoudige wijze worden 6 vastgesteld aan de hand van een verschillend fenotype, indicatief voor het genoom van de donor- en acceptorplanten.

De term "...met betrekking tot zijn genoom niet gelijk..." volgens de onderhavige uitvinding duidt dus aan 5 dat de donorplanten en acceptorplant één of meer fenotypische verschillende kenmerken bezitten of in andere woorden, een ander ras zijn.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding zijn de eerste Brassica donorplant en 10 de tweede Brassica donorplant met betrekking tot hun genoom gelijk. Dit betekent dat het selecteren van de eerste en tweede donorplant plant het selecteren omvat van één donorplant welke in zijn genoom zowel QTL1 als QTL2 omvat.

In andere woorden, het identificeren van een 15 geschikt Brassica donorras met QTL1 en QTL2 en het vervolgens inbrengen van zowel QTL1 als QTL2 in een gewenste Brassica acceptorplant waardoor Xcc resistentie wordt verschaft aan deze acceptorplant.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de 20 onderhavige uitvinding wordt de Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de groep die bestaat uit een fragment van 160 bp met primercombinatie 1.1 (SEQ ID No: 1) en 6; een fragment van 285 bp met primercombinatie 1.2 (SEQ ID No: 2) en 6; een 25 fragment van 372 bp met primercombinatie 1.3 ((SEQ ID No: 3) en 6; en een fragment van 43 bp met primer combinatie 1.4 (SEQ ID No: 4) en 6.

Volgens een andere voorkeursuitvoeringvorm van de onderhavige uitvinding wordt de Quantitative Trait Locus 2 30 (QTL2) gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de groep die bestaat uit een fragment van 90 bp met primercombinatie 2.1 (SEQ ID No: 5) en 6; een fragment van 127 bp met primercombinatie 2.2 (SEQ ID No: 6) en 6; een 7 fragment van 336 bp met primercombinatie 2.3 (SEQ ID No: 7) en 6; en een fragment van 49 bp met primercombinatie 2.4 (SEQ ID No: 8) en 6.

Volgens een bij zonder de voorkeur genietende 5 uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding omvat het selecteren van de donorplanten het bepalen of identificeren, door middel van moleculair biologische technieken, van de aanwezigheid van 1 of meer, bij voorkeur 2 of meer, meer bij voorkeur 3 of meer, en meest bij voorkeur 4, van de 10 onderhavige RAMP merkers in het genoom van de respectievelijke Brassica donorplanten per QTL.

In een meest de voorkeur genietende uitvoeringsvorm omvat het selecteren volgens de onderhavige uitvinding verder het selecteren van het homozygoot zijn van 15 de eerste en tweede Brassica donorplant voor de respectievelijke Quantitative Trait Loci 1 en 2 (QTL's 1 en 2) .

De Brassica acceptorplant volgens de onderhavige uitvinding is bijvoorkeur een Brassica oleracea plant, bij 20 voorkeur gekozen uit de groep die bestaat uit B. oleracea convar. botrytis var, botrytis (bloemkool, romanesco), B. oleracea convar. botrytis var, cymosa (broccoli), B. oleracea convar. botrytis var, asparagoides (spruitbroccoli), B. oleracea convar. oleracea var.

25 gemnifera (spruitkool), B. oleracea convar. capitata var, alba (witte kool, spitskool), B. oleracea convar. capitata var. rubra (rode kool), B. oleracea convar. capitata var, sabauda (savooienkool), B. oleracea convar. acephala var, sabellica (boerenkool), B. oleracea convar. acephela var.

30 gongyloides (koolrabi) en B. oleracea var, tronchuda syn. costata (Portugese kool).

Gelet op de beschreven voordelen van een Xcc resistente Brassica plant heeft de onderhavige uitvinding, 8 volgens een verder aspect, ook betrekking op een Brassica acceptorplant, zoals hierboven gedefinieerd, en zaden, vruchten en/of plantdelen daarvan, omvattende in zijn genoom een Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en een Quantitative 5 Trait Locus 2 (QTL2) zoals hierboven gedefinieerd.

Volgens een bij zonder de voorkeur genietende uitvoeringsvorm van dit aspect, heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een Brassica plant met het depositienummer NCIMB 41553, en zaden, vruchten en/of 10 plantdelen daarvan.

Volgens nog een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op het gebruik van een Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en een Quantitative Trait Locus 2 (QTL2), zoals hierboven gedefinieerd, voor het verschaffen 15 van de onderhavige Xcc resistente Brassica acceptorplant.

Volgens nog een verder aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op het gebruik van één of meer primers geselecteerd uit de groep die bestaat uit SEQ ID Nos: 1-8 (primers 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, en 2.4) voor het 20 verschaffen van de onderhavige Xcc resistente Brassica acceptorplant.

De onderhavige uitvinding zal hierna verder worden beschreven aan de hand van een voorbeeld van een voorkeursuitvoeringsvorm. Er moet echter worden begrepen dat 25 dit voorbeeld slechts worden verschaft voor illustratieve doeleinden en niet om de uitvinding zoals hierboven is beschreven op enigerlei wijze te beperken.

Voorbeeld 30 Het veredelen gericht op Xanthomonas campestris pv. campestris resistentie in Brassica oleracea is een complex proces. Meerdere stammen van Xcc zijn beschreven en resistentie komt maar zelden voor in Brassica oleracea. De 9 huidige beschreven resistenties tegen Xcc in Brassica oleracea zijn van kwantitatieve aard. Dit houdt in dat er meerdere genen bij betrokken zijn, waardoor gradaties in resistentie tegen Xcc waargenomen kunnen worden.

5 Voor het verkrijgen van de resistente Brassica oleracea plant is gebruik gemaakt van een genetische bron waarvan de resistentie zich hoofdzakelijk recessief gedraagt. Via een terugkruisingsprogramma is de resistentie in diverse genetische achtergronden (vatbare ouderlijnen) 10 gebracht. Het resistentieniveau van de planten wordt in een veldtoets bepaald. Omdat het een recessieve eigenschap betreft moet elke kruising met een vatbare plant gevolgd worden door een inteeltgeneratie om de eigenschap homozygoot te maken. De nakomelingen van deze generatie moeten op het 15 veld worden getest op hun resistentieniveau. Het kost daarmee altijd minimaal twee jaar om het effect van een nieuwe kruising te zien in het geval van een éénjarig gewas en vier jaar bij een tweejarig gewas.

Omdat het geen zwart-wit resistentiereactie 20 betreft wordt het niveau in een kwantitatieve waarde {0 (volledig vatbaar) t/m 9 (volledig resistent)} uitgedrukt. Het blijkt dat de resistentie in de diverse genetische achtergronden geen eenvoudig Mendeliaans gedrag maar een fenotypische gradatie binnen een normaalverdeling vertoont. 25 Deze verdeling kan sterk verschuiven naar de vatbare kant hetgeen inhoudt dat de inteeltpopulaties van kruisingen tussen de resistente bron en diverse vatbare ouderlijnen verschillende percentages resistente planten opleveren.

Op grond van de splitsingsverhoudingen en de 30 niveauverschillen in resistentie van de planten in de populaties is gebleken dat het resistentieniveau van de plant wordt bepaald door meerdere genetische factoren. Om een kwantitatieve eigenschap in kaart te brengen met DNA- 10 merkers wordt veelal gebruik gemaakt van QTL analyses. QTL's zijn onafhankelijke chromosoomgebieden die, gekoppeld aan de onderliggende genen, gezamenlijk een eigenschap verklaren of vormgeven.

5 Met DNA-merkers is een genoom omvattende QTL- analyse uitgevoerd op Brassica oleracea populaties met diverse genetische achtergronden. Met planten van deze verschillende populaties zijn veldtoetsen gehouden om het resistentieniveau van de individuele planten te bepalen. Met 10 de data van de merkeranalyse en de veldscores was het mogelijk om de QTL's te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de Xcc resistentie.

In totaal zijn zes onafhankelijk overervende QTL's geïdentificeerd die in meer of mindere mate bijdragen aan 15 het niveau van de resistentie. De variatie in de resistentieniveaus tussen de planten die wordt waargenomen op het veld wordt veroorzaakt door de aan- en/of afwezigheid van de QTL's. Van de zes gevonden QTL's zijn twee QTL's in iedere achtergrond aanwezig. Eén hiervan kan aangemerkt 20 worden als het hoofd-QTL dat altijd aanwezig dient te zijn om überhaupt resistentie te kunnen krijgen.

Iedere Xanthomonas campestris pv. campestris resistente inteeltlijn die de eindstreep haalt in het veredelingsproces bezit dit hoofd-QTL. Het tweede QTL heeft 25 net als het hoofd-QTL een bijdrage aan het resistentieniveau, echter die is niet zo groot als het hoofd-QTL maar is eveneens onafhankelijk van de genetische achtergrond.

De overige vier QTL's komen voor in de 30 verschillende genetische achtergronden. Deze vier QTL's hebben mogelijk een modificerende rol waardoor variatie in resistentieniveaus wordt veroorzaakt. Op het hoofd-QTL ligt de recessieve overervende eigenschap waarover hierboven is % l 11 gesproken. Echter de aanwezigheid van dit hoofd-QTL geeft geen garantie dat de plant ook daadwerkelijk resistent is. Het kan voorkomen dat bijvoorbeeld het hoofd-QTL aanwezig is maar dat een storende QTL uit een vatbare ouderlijn is 5 ingekruist waardoor de resistentie wordt gemaskeerd.

Het gebruik van DNA-merkers gekoppeld aan de twee belangrijkste QTL's biedt de mogelijkheid om planten te selecteren die met een veel grotere mate van zekerheid resistent zullen zijn tegen Xcc. Selectie van eigenschappen 10 die op meerdere gebieden zijn gelegen vraagt om grote selectiepopulaties. In een inteeltpopulatie gemaakt van een individu afkomstig uit een kruising tussen een resistente en een vatbare plant, is de kans 1:16 dat daadwerkelijk een plant aanwezig is met de twee belangrijkste QTL's homozygoot 15 uit de bron.

Vanzelfsprekend is de plant resistent in een veldtoets en beschikt daarnaast over goede kwaliteitseigenschappen. Een ziektetoets zal niet met zekerheid planten opleveren die beide QTL's in homozygote 20 vorm bezitten. Uit een ziektetoets kunnen ook planten met een hoge mate van resistentie worden verkregen, maar die één of twee QTL's in heterozygote vorm bezitten en geen stabiele resistentie zullen geven. De omgevingsfactoren en de genetische achtergrond van de vatbare ouderlijnen spelen 25 hierbij een cruciale rol.

Het uitvoeren van een ziektetoets met aantallen boven de duizend planten is slechts mogelijk voor een beperkt aantal kruisingen. Echter, het gebruik van DNA-merkers biedt de mogelijkheid om meerdere populaties van 30 duizend planten te analyseren en een voorselectie van de gewenste planten te maken.

Daarnaast biedt de selectie met DNA merkers de mogelijkheid om herhaald kruisingen te gaan maken waarbij 12 geselecteerd wordt op de twee belangrijkste QTL's. Per kruisingsgeneratie wordt op deze manier één of twee jaar gewonnen wat een versnelling van tien tot twintig jaar in het veredelingsprogramma betekent en daarmee een versnelde 5 introductie van een nieuw Xcc resistent hybrideras kan opleveren.

Een extra complicerende factor bij de productie van resistente hybride rassen is dat de recessieve resistentie in beide ouders aanwezig moet zijn. De beide 10 ouders (ouderlijnen) zijn bij voorkeur homozygoot voor de twee belangrijkste QTL's. Met DNA-merkers is snel te bepalen of de beide ouders homozygoot zijn voor de twee belangrijkste QTL's en geschikt zijn voor het produceren van een nieuwe resistente hybride.

15 Zaden van een dergelijk hybride ras zijn gedeponeerd bij het NCIMB, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK onder nummer NCIMB 41553.

De twee belangrijkste QTL's worden elk gekenmerkt door vier DNA-merkers die de introgressie vanuit de bron 20 karakteriseren. QTL1 is het hoofd-QTL en QTL2 het minor-QTL.

De DNA merkers zijn gegenereerd met de RAMP-techniek. De RAMP techniek, waarbij een iSSR en een RAPD-primer worden gecombineerd, levert bandenpatronen op met daarin DNA-fragmenten die specifiek co-segregeren met de 25 resistentie, waarmee onderscheid kan worden gemaakt tussen individuen die de QTL-introgressie wèl en individuen die de QTL-introgressie niet bevatten. Door kartering van de RAMP-fragmenten en fenotypering van de resistentiescore zijn nauw gekoppelde RAMP-merkers geïdentificeerd die de QTL vormen, 30 zie Tabel 1. De genetische afstand tussen de DNA-merkers binnen de QTL wordt weergegeven in centimorgans (cM).

13

De algemene PCR condities waaronder de DNA merkers werden gegenereerd zijn in onderstaand overzicht weergegeven.

5 PCR mix voor RAMP reactie:

Per reactie -0.2 ng/μΐ genomisch plant DNA 75 mM Tris-HCl (pH 8.8) 2 0 mM NH4SO4 10 0.01% (v/v) Tween20 2.80 mM MgCl2 0.25 mM dNTPs 0.15 μΜ forward-primer 0.20 μΜ reverse-primer 15 0.04 units/μΐ Red Hot1” DNA Polymerase (ABgene, Epsom) PCR programma RAPD35:

Aantal cycli stap 1: 2 min 93 °C 1

20 stap 2: 30 sec 93 °C

stap 3: 30 sec 35 °C

stap 4: opwarmen met 0.3 °C/sec tot 72 °C

stap 5: 1 min 30 sec 72 °C

herhaling stap 2-5 40 25 stap 6: 5 min 72 °C 1 PAGE/Licor

Voor het analyseren van de RAMP patronen werd gebruik gemaakt van een "Gene ReadIR 4200 DNA analyzer" 30 (Licor Ine.). Op basis van een optimale concentratie van 6.5% acrylamide kunnen fragmenten tot op één enkele base worden gescheiden. Om de fragmenten zichtbaar te maken op dit systeem is het noodzakelijk om gelabelde (IRDye labels) f 14 primers te gebruiken. Hiertoe werd een derde deel van de hoeveelheid forwardprimer vervangen door een gelabelde primer met dezelfde sequentie.

5 Me rke rove r z i c ht

In het onderzoek dat heeft geleid tot de onderhavige uitvinding zijn de in Tabel 2 vermelde primers gebruikt om de in Tabel 1 vermelde DNA-merkers te genereren.

10 Tabel 1: Overzicht van RAMP merkers per QTL

QTL RAMP primer Fragment grootte Positie in de QTL combinatie (bp) (cM) ï 1.1 + 6 160 10,1 1 1.2 + 6 285 18,5 ï 1.3 + 6 372 20,9 ï 1.4 + 6 43 ’ ' 21,3 2 2.1 + 6 90 28,5 2 2.2 + 6 127 29,4 2 2.3 + 6 336 36,3 2 2.4 + 6 49 37,2

Tabel 2: Overzicht van SEQ ID Nos SEQ ID No. Primer iSSR/RAPD Sequentie Ί Ï7Ï iSSR TTA GCT CTC TCT CTC TC

1> ÏT2 iSSR CCA GCA CAC ACA CAC A

~3 ΓΓ3 iSSR AGA TTC TCT CTC TCT C

1 ΓΤ4 iSSR CAA CTC TCT CTC TCT

~5 2T1 iSSR TTG TAG AGA GAG AGA G

~6 2T2 iSSR TCT CTT CTT CTT CTT C

~7 2T3 iSSR CAA CTC TCT CTC TCT

~8 274 iSSR GAA ATC TCT CTC TCT C

J

15 6 RAPD Operon RAPD® 10-mer kits A-01

t/m BH2 0 (Operon Biotechnologies, Inc., Huntsville, USA

De PCR reacties met de diverse primercombinaties vormen de QTL-introgressie fragmenten met een specifieke grootte (zie Tabel 1). Deze DNA-merkers zijn karakteristiek voor de 5 betreffende QTL's. De combinatie van deze DNA-merkers die de QTL kenmerken, geeft een onomstotelijk bewijs dat de QTL introgressie vanuit de Xcc resistentie bron aanwezig is.

16

Definities

Centimorgan (cM): Eenheid voor de genetische afstand tussen merkers, gebaseerd op het aantal 5 overkruisingen per honderd individuen.

DNA-merker: Een DNA-fragment dat gekoppeld is aan een gen of een ander stuk DNA met een bekende locatie op het genoom, welke 10 gebruikt wordt om overerving van dit gen of deze locatie te volgen.

Gel-elektroforese: Methode om moleculen (o.a. DNA, RNA, eiwit) te scheiden in een matrix 15 (agarose of polyacrylamide) onder invloed van een elektrisch veld op basis van hun grootte, vorm of lading.

Inteeltgeneratie (zelfbestuiving): 20 Bevruchting van een individu met het eigen stuifmeel

Introgressie: Een chromosoomfragment van een lijn die door kruising in een andere lijn is 25 ingebracht.

IRDye labels: Infrarood-labels die gebruikt worden voor Licor imaging systems, waarvan de detectie plaatsvindt bij 700 nm of 800 30 nm.

Monogeen: Bepaald door één gen 17

Polymerase Chain Reaction (PCR):

Een in vitro amplificatiemethode om een specifiek DNA fragment te vermeerderen. Deze synthesereactie maakt gebruik van 5 minimaal één oligonucleotide primer die aanhecht op een stuk DNA waarna tijdens opeenvolgende temperatuurcycli een polymerase de flankerende regio amplificeert.

10

Primer: Een korte oligonucleotide (~20-50bp) complementair aan de sequentie van een enkelstrengs DNA-molecuul, welke dient als startpunt van een polymerase.

15

Quantitative Trait Locus (QTL):

Chromosoomgebied(en) die, gekoppeld aan genen, gezamenlijk een kwantitatieve eigenschap verklaren 20

Random Amplified Microsatellite Polymorphisms (RAMP):

DNA fingerprinting techniek gebaseerd op RAPD- en iSSR primers waarmee polymorfismen tussen verschillende DNA

25 monsters worden opgespoord.

Random Amplified Polymorphic dna (RAPD):

Een 10-mer met een "random" sequentie, waarbij het GC-gehalte tussen 60% en 70% 30 ligt en waarbij de primer-uiteinden niet zelfcomplementair zijn.

inter Simple Sequence Repeat (iSSR): 18

Een primer ontworpen op het 5' uiteinde van een SSR (Single Sequence Repeat); een stukje DNA bestaande uit een herhaling van 2 of 3 nucleotiden 5

Terugkruising: Kruising van een individu met één van de oorspronkelijke ouders

Xcc: Xanthomonas campestris pv. campestris 10 19

Sequence listing <110> BEJO Zaden B.V.

5 <120> XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS RESISTENTE

BRASSICA PLANT EN WERKWIJZEN VOOR HET VERKRIJGEN HIERVAN

<13 0 > 4/2FX68/11 10 <160> 8 <170> Patentln version 3.3 15 <210> 1 <211> 17

<212> DNA

<213> Artificial 20 <220> <223> RAMP primer 1.1 of Table 2 <400> 1 ttagctctct ctctctc 17 25 <210> 2 <211> 16

<212> DNA

<213> Artificial 30 <220> <223> RAMP primer 1.2 of Table 2 <400> 2 35 ccagcacaca cacaca 16 <210> 3 <211> 16

<212> DNA

40 <213 > Artificial <220> <223> RAMP primer 1.3 of Table 2 45 <40Q> 3 agattctctc tctctc 16 <210> 4 <211> 15

50 <212> DNA

20 <213> Artificial <22 0 > <223> RAMP primer 1.4 of Table 2 5 <400> 4 caactctctc tctct 15 <210> 5 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <22 0 > 15 <223> RAMP primer 2.1 of Table 2 <400> 5 ttgtagagag agagag 16 20 <210 > 6 <211> 16 <212 > DNA <213> Artificial 25 <220> <223> RAMP primer 2.2 of Table 2 <4 00> 6 tctcttcttc ttcttc 16 30 <210> 7 <211> 15 <212 > DNA <213> Artificial 35 <220> <223> RAMP primer 2.3 of Table 2 <400> 7 40 caactctctc tctct 15

<210 > 8 <211> 16 <212> DNA

45 <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 2.4 of Table 2 50 <400> 8 i 21 gaaatctctc tctctc 16 1036531

Claims (16)

1. Werkwijze voor het verschaffen van een Xanthomonas campestris pv. campestris resistente Brassica 5 acceptorplant omvattende: het selecteren van een eerste Brassica donorplant welke in zijn genoom een Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) omvat; het selecteren van een tweede Brassica 10 donorplant welke in zijn genoom een Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) omvat; en introgressie, of het genomisch samenvoegen, van de Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) uit de eerste donorplant en de Quantitative Trait 15 Locus 2 (QTL2) uit de tweede donorplant in een Brassica acceptorplant; waarbij de Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) wordt gekenmerkt door 20 één of meer RAMP merkers gekozen uit de groep die bestaat uit een fragment van 158-162 bp met primercombinatie SEQ ID No: 1 en primer 6; een fragment van 283-287 bp met primercombinatie SEQ ID No: 2 en primer 6; een fragment van 370-374 bp met primercombinatie SEQ ID No: 3 en primer 6; en 25 een fragment van 41-45 bp met primer combinatie SEQ ID No: 4 en primer 6; de Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) wordt gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de groep die bestaat 30 uit een fragment van 88-92 bp met primercombinatie SEQ ID No: 5 en primer 6; een fragment van 125-129 bp met primercombinatie SEQ ID No: 6 en primer 6; een fragment van 334-338 bp met primercombinatie SEQ ID No: 7 en primer 6; en 1036531 ) een fragment van 47-51 bp met primercombinatie SEQ ID No: 8 en primer 6; en waarbij de Brassica acceptorplant met betrekking tot zijn 5 genoom niet gelijk is aan de eerste en tweede Brassica donorplanten.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de eerste Brassica donorplant en de tweede Brassica donorplant 10 met betrekking tot hun genoom gelijk zijn.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of conclusie 2, waarbij de Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) wordt gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de 15 groep die bestaat uit een fragment van 160 bp met primercombinatie SEQ ID No: 1 en primer 6; een fragment van 285 bp met primercombinatie SEQ ID No: 2 en primer 6; een fragment van 372 bp met primercombinatie SEQ ID No: 3 en primer 6; en een fragment van 43 bp met primercombinatie SEQ 20 ID No: 4 en primer 6.

4. Werkwij ze volgens conclusie 1 of conclusie 2, waarbij de Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) wordt gekenmerkt door één of meer RAMP merkers gekozen uit de 25 groep die bestaat uit een fragment van 90 bp met primercombinatie SEQ ID No: 5 en primer 6/ een fragment van 127 bp met primercombinatie SEQ ID No: 6 en primer 6; een fragment van 336 bp met primercombinatie SEQ ID No: 7 en primer 6; en een fragment van 49 bp met primercombinatie SEQ 30 ID No: 8 en primer 6.

5. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 4, waarbij het selecteren het bepalen door middel van moleculair biologische technieken omvat van de aanwezigheid van één of meer van de RAMP merkers zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 4 in het genoom van de respectievelijke Brassica donorplanten. 5

6. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 5, waarbij Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en/of Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) worden gekenmerkt door twee of meer RAMP merkers zoals gedefinieerd in één van de 10 conclusies 1 tot en met 4 in het genoom van de respectievelijke Brassica donorplanten.

7. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 6 waarbij Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en/of

8. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 7, waarbij Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en/of Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) worden gekenmerkt door vier RAMP merkers zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 4 in het genoom van de 25 respectievelijke Brassica donorplanten.

9. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 8, waarbij het selecteren het selecteren omvat op het homozygoot zijn van de eerste en tweede Brassica donorplant 30 voor de respectievelijke Quantitative Trait Loci 1 en 2 (QTL's 1 en 2).

10. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 9, waar de Brassica acceptorplant en/of de Brassica donorplant(en) een Brassica oleracea plant is/zijn.

11. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot en met 10, waarbij de Brassica plant wordt gekozen uit de groep die bestaat uit B. oleracea convar. botrytis var, botrytis (bloemkool, romanesco), B. oleracea convar. botrytis var, cymosa (broccoli), B. oleracea convar. 10 botrytis var, asparagoides (spruitbroccoli), B. oleracea convar. oleracea var, gemnifera (spruitkool), B. oleracea convar. capitata var, alba (witte kool, spitskool), B. oleracea convar. capitata var, rubra (rode kool), B. oleracea convar. capitata var, sabauda (savooienkool)

12. Brassica acceptorplant, zoals gedefinieerd in 20 één van de conclusies 1 tot en met 11, omvattende in zijn genoom een Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en een Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 11.

13. Brassica plant volgens conclusie 12, welke een plant is met het depositienummer NCIMB 41553.

14. Zaden, vruchten en/of plantdelen van een Brassica plant volgens conclusie 12 of conclusie 13. 30

15. Gebruik van een Quantitative Trait Locus 1 (QTL1) en een Quantitative Trait Locus 2 (QTL2), zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 11, voor CV het verschaffen van een Xanthomonas campestris pv. campestris resistente Brassica acceptorplant zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 13.

15 B. oleracea convar. acephala var, sabellica (boerenkool), B. oleracea convar. acephela var, gongyloides (koolrabi) en B. oleracea var, tronchuda syn. costata (Portugese kool).

15 Quantitative Trait Locus 2 (QTL2) worden gekenmerkt door drie of meer RAMP merkers zoals gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 4 in het genoom van de respectievelijke Brassica donorplanten.

16. Gebruik van één of meer primers geselecteerd uit de groep die bestaat uit SEQ ID Nos: 1-4, en één of meer primers geselecteerd uit de groep die bestaat uit SEQ ID Nos: 5-8 voor het verschaffen van een Xanthomonas campestris pv. campestris resistente Brassica acceptorplant zoals 10 gedefinieerd in één van de conclusies 1 tot en met 13. 1 03 653 1 j