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MXPA06012445A - Endodermo que expresa pdx1. - Google Patents

Endodermo que expresa pdx1.

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Publication number
MXPA06012445A
MXPA06012445A MXPA06012445A MXPA06012445A MXPA06012445A MX PA06012445 A MXPA06012445 A MX PA06012445A MX PA06012445 A MXPA06012445 A MX PA06012445A MX PA06012445 A MXPA06012445 A MX PA06012445A MX PA06012445 A MXPA06012445 A MX PA06012445A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
cells
cell
endoderm
pdxi
positive
Prior art date
Application number
MXPA06012445A
Other languages
English (en)
Inventor
Amour Kevin Allen D
Alan D Agulnick
Susan Eliazer
Emmanuel E Baetge
Original Assignee
Cythera Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US11/021,618 external-priority patent/US7510876B2/en
Application filed by Cythera Inc filed Critical Cythera Inc
Publication of MXPA06012445A publication Critical patent/MXPA06012445A/es

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Abstract

Descritos en la presente se encuentran cultivos celulares que comprenden celulas de endodermo positivas a PDX1 y metodos para producir los mismos. Tambien se describen en la presente poblaciones celulares que comprenden celulas de endodermo positivas a PDX1 sustancialmente purificadas, asi como metodos para enriquecer, aislar y purificar las celulas de endodermo positivas a PDX1 a partir de otros tipos de celulas. Tambien se describen metodos para identificar los factores de diferenciacion capaces de promover la diferenciacion de las celulas de endodermo, tales como las celulas de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDX1 y celulas de endodermo definitivas negativas a PDX1.

Description

ENDODERMO QUE EXPRESA PDX1 Solicitudes Relacionadas Esta solicitud es una continuación parcial de la Solicitud de Patente de E.U. No. 11/021,618, titulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Diciembre 23 de 2004, que reivindica prioridad bajo el 35 U.S.C., 119 (e) por las siguientes tres solicitudes de patente provisional: Solicitud de Patente Provisional de E.U. Número 60/566,293, titulada PDX1 EXPRESSING ENDODERM, presentada en Abril 27 de 2004; Solicitud de Patente Provisional de E.U. Número 60/587,942, titulada CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Julio 14 de 2004; Solicitud de Patente Provisional de E.U. Número 60/586,566, titulada CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Julio 9 de 2004. Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la biología celular. En particular, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden células endodérmicas PDXl-positivo y métodos para producir, aislar y utilizar tales células. Antecedentes Las células progenitoras humanas pluripotentes, tales como las células progenitoras embriónicas (ES) y las células germinales embriónicas (EG) , se aislaron primero en cultivo sin alimentadores fibroblasto en 1994 (Bongso et al., 1994) y con alimentadores fibroblasto (Hogan, 1997). Posteriormente, Thomson, Reubinoff y Shamblott, establecieron cultivos continuos de células ES y EG humanas utilizando capas de alimentadores de ratón mitóticamente desactivadas (Reubinoff et al., 2000; Shamblott et al., 1998; Thomson et al., 1998). Las células ES y EG humanas (hESCs) ofrecen oportunidades únicas para investigar etapas tempranas del desarrollo humano así como para la intervención terapéutica en diversas etapas de enfermedades tales como diabetes mellitus y enfermedad de Parkinson. Por ejemplo, el uso de células productoras de insulina derivadas de hESCs ofrecerá una vasta mejoría sobre los procedimientos actuales de terapia celular que utilizan células de páncreas de donantes para el tratamiento de diabetes. Sin embargo, actualmente se sabe cómo generar una célula ß productora de insulina a partir de hESCs. Por tanto, los tratamientos actuales de terapia celular para diabetes mellitus, que utilizan células isleta de páncreas de donante, se encuentran limitados por la escasez de células isleta de alta calidad necesarias para transplantes. La terapia celular para un solo paciente diabético Tipo I requiere un transplante de aproximadamente 8 x 108 células isleta pancreáticas. (Shapiro et al., 2000; Shapiro et al., 2001a; Shapiro et al., 2001b). Por tanto se requieren al menos dos órganos donantes sanos para obtener suficientes células isleta para un transplante exitoso. Las células progenitoras embriónicas ofrecen una fuente de material de inicio del cual desarrollar cantidades sustanciales de células diferenciadas de alta calidad para terapias de células humanas. Dos propiedades que producen hESCs únicamente adecuadas para aplicaciones en terapia celular son la pluripotencia y la capacidad de mantener estas células en cultivo durante períodos prolongados. La pluripotencia se define por la capacidad de las hESCs para diferenciar un derivado de todas las 3 capas germinales primarias (endodermo, mesodermo, ectodermo) que, a su vez, forman todos los tipos de célula somática del organismo maduro además de tejidos extraembriónicos (e.g., placenta) y células progenitoras. Aunque la pluripotencia imparte una extraordinaria utilidad a las hESCs, esta propiedad también plantea retos únicos para el estudio y manipulación de estas células y sus derivados. Dada la gran variedad de tipos celulares que pueden surgir en cultivos hESC de diferenciación, la casta mayoría de tipos celulares se producen a muy bajas eficiencias. Adicionalmente, el éxito en la evaluación de cualquier tipo celular dado depende críticamente de la definición de marcadores apropiados. El logro de una diferenciación dirigida eficiente es de gran importancia para la aplicación terapéutica de hESCs. A fin de utilizar hESCs como material de inicio para generar células útiles en aplicaciones de terapia celular, sería ventajoso superar los siguientes problemas. Por ejemplo, a fin de lograr el nivel de material celular requerido para terapia de transplante de células isleta, sería ventajoso dirigir eficientemente las hESCs hacia el linaje de isleta pancreática/célula ß en las etapas más tempranas de la diferenciación. Además de la dirección eficiente del proceso de diferenciación, también sería benéfico aislar y caracterizar tipos celulares intermedios a lo largo de la ruta de diferenciación hacia el linaje de isleta pancreática/célula ß y utilizar tales células como precursores de linaje apropiados para etapas adicionales en la diferenciación. Sumario de la Invención Las modalidades de la presente invención se refieren a composiciones que comprenden células endodérmicas que expresan PDX1 (PDXl-positivo) así como a métodos para producirlas. Modalidades adicionales se refieren a poblaciones celulares enriquecidas en endodermo PDXl-positivo y a métodos para la producción de tales poblaciones celulares. Otras modalidades se refieren a métodos para incrementar la expresión de PDX1 en células endodérmicas así como para identificar factores útiles para la diferenciación adicional del endodermo PDXl-negativo y/o PDXl-positivo. En algunas modalidades de las composiciones y métodos descritos a lo largo de esta solicitud, las células endodérmicas PDXl-positivo son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior/tubo digestivo medio. En ciertas modalidades preferidas de las composiciones y métodos descritos a lo largo de esta solicitud, las células endodérmicas PDXl-positivo son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En otras modalidades preferidas, las células endodérmicas PDXl-positivo son células endodérmicas PDXl-positivo de la porción posterior del tubo digestivo anterior. Algunas modalidades de la presente invención se refieren a cultivos celulares que comprenden células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, en donde las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos de la porción anterior del tubo digestivo. En algunas modalidades, los cultivos celulares comprenden células humanas. En tales cultivos de células humanas, el endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior puede comprenden al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, o al menos aproximadamente 25% de las células humanas en el cultivo. En algunas modalidades, al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, o al menos aproximadamente el 25% se calcula sin referencia a ninguna célula alimentadora presente en dicho cultivo. Las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, en ciertas modalidades, de los cultivos celulares descritos en la presente, pueden expresar un marcador seleccionado del grupo que consiste del gen homeobox A13 (HOXA13), del gen homeobox C6 (HOXC6) y SOX17. En otras modalidades, los cultivos celulares que comprenden células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, se encuentran sustancialmente libres de células endodérmicas viscerales, células endodérmicas parietales y/o células neurales. En algunas modalidades, los cultivos celulares comprenden además uno o más de los siguientes: un compuesto retinoide, tal como ácido retinoico (RA) , FGF-10 o B27. Modalidades adicionales de la presente invención se refieren a poblaciones de célula endodérmica PDXl-positiva del tubo digestivo anterior aisladas o sustancialmente purificadas, en donde las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo. En algunas modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se derivan de células pluripotentes, tales como células progenitoras embriónicas humanas. Otras modalidades de la presente invención, se refieren a una población celular que comprende células, en donde al menos aproximadamente 90% de las células son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, y en donde las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo. En modalidades preferidas, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior comprenden al menos aproximadamente el 95% de las células en la población celular. En modalidades aún más preferidas, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior comprenden al menos aproximadamente el 98% de las células en la población. Modalidades adicionales descritas en la presente, se refieren a métodos para producir células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior proporcionando un cultivo celular o una población celular que comprende células de endodermo definitivo que no expresan sustancialmente PDXl (células de endodermo definitivo PDXl-negativo) con un factor de diferenciación del tubo digestivo anterior, tal como un retinoide. El retinoide, por ejemplo RA, puede suministrarse en una concentración que varía de aproximadamente 0.01 µM a aproximadamente 50 µM. En algunas modalidades, la diferenciación del endodermo definitivo PDXl-negativo con el endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, aumenta proporcionando el cultivo celular o población celular con FGF-10 y/o B27. El FGF-10 puede suministrarse en una concentración que varía de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En algunas modalidades, se suministra B27 al cultivo celular o población celular a una concentración que varía de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 20%. Puede agregarse FGF-10 y/o B27 al cultivo celular o población celular aproximadamente al mismo tiempo que el retinoide, o cada uno de los factores puede agregarse por separado hasta con varias horas entre cada adición. En ciertas modalidades, se agrega el retinoide a un cultivo de endodermo definitivo PDXl-negativo de aproximadamente 4 días. En algunas modalidades, se agrega el retinode a un cultivo de endodermo definitivo PDXl-negativo de aproximadamente 5 días. Aún otras modalidades, se refieren a métodos para utilizar un factor de diferenciación del tubo digestivo anterior para el incremento adicional de la producción de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en un cultivo celular o población celular que se ha puesto en contacto con un retinoide tal como RA. En tales modalidades, la diferenciación del endodermo definitivo PDX1-negativo con el endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, aumenta proporcionando al cultivo " celular o población celular activina A y/o activina B. Puede suministrarse activina A y/o activina B en una concentración que varía de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. Otras modalidades se refieren a métodos para incrementar la producción de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en un cultivo celular o población celular diferenciando las células PDXl-negativo en un medio que comprende un retinoide, en donde el medio se ha acondicionado previamente mediante el mantenimiento o crecimiento de ciertos tipos celulares. Tales tipos celulares incluyen, pero no se limitan a células progenitoras embriónicas u otras células pluripotentes que se han diferenciado en un medio que comprende suero o miembros de la superfamilia TGFß de factores de crecimiento, tales como activina A, activina B, Nodal y/o proteína morfogénica ósea (BMP) . En algunas modalidades, el medio acondicionado se suministra al cultivo celular o población celular a una concentración que varía de aproximadamente 1% a aproximadamente 100% de todo el medio de crecimiento. Pueden agregarse factores de crecimiento de la superfamilia TGFß y/o medio acondicionado al cultivo celular o población celular aproximadamente al mismo tiempo que el retinoide, o cada uno de los factores puede agregarse por separado hasta varias horas entre cada adición.
Las modalidades de la presente invención se refieren también a métodos para producir una población celular enriquecida en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En ciertas modalidades, estos métodos comprenden la etapa de obtención de una población de células pluripoténtes, en donde al menos una célula de la población celular pluripotente comprende al menos una copia de un ácido nucleico que se encuentra bajo el control de un promotor PDXl. En algunas modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica para una proteína verde fluorescente (GFP) o un fragmento biológicamente activo de la misma. En otras modalidades, las etapas adicionales del método incluyen, la diferenciación de células pluripotentes a fin de producir células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, en donde las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción del tubo digestivo anterior, y la separación de las células PDXl-positivo de las células PDXl-negativo. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, la etapa de diferenciación comprende además proporcionar la población celular pluripotente con al menos un factor de crecimiento de la superfamilia TGFß en una cantidad suficiente para promover la diferenciación de las células pluripotentes con las células de endodermo definitivo PDXl-negativo, y proporcionar las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior con un factor de diferenciación del tubo digestivo anterior en una cantidad suficiente para promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDX1-negativo con las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Algunas modalidades de la presente invención se refieren a un método para incrementar la expresión del producto del gen PDXl en células de endodermo definitivo que expresan SOX17 (SOXld-positivas) poniendo en contacto tales células con un factor de diferenciación en una cantidad suficiente para incrementar la expresión del producto del gen PDXl. En algunas modalidades, el factor de diferenciación se selecciona del grupo que consiste de RA, FGF-10 y B27. Modalidades adicionales de la presente invención se refieren a un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDXl-negativo con las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En tales métodos, las células de endodermo definitivo PDX1-negativo se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato y se determina si la expresión PDXl en la población celular después del contacto con el factor de diferenciación candidato ha aumentado en comparación con la expresión PDXl en la población celular antes del contacto con el factor de determinación candidato. Un incremento en la expresión PDXl en la población celular indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDX1-negativo con las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En algunas modalidades, la expresión PDXl se determina mediante reacción cuantitativa de cadena polimerasa (Q-PCR) . Algunas modalidades del método anterior comprenden además la etapa de determinación de la expresión del gen HOXA13 y/o HOXC6 en la población celular antes y después del contacto con el factor de diferenciación candidato, por ejemplo, un retinoide, tal como RA. En otras, el factor de diferenciación candidato es un polipéptido, por ejemplo, un factor de crecimiento, tal como FGF-10. Aún otras modalidades de la presente invención se refiere a un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En tales métodos, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato y se determina si la expresión de un marcador en la población aumenta o disminuye después del contacto con el factor de diferenciación candidato en comparación con la expresión del mismo marcador en la población antes del contacto con el factor de diferenciación candidato. Un incremento o disminución en la expresión del marcador indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En algunas modalidades, la expresión del marcador se determina mediante Q-PCR. En algunas modalidades el factor de diferenciación candidato es una molécula pequeña, por ejemplo, un retinoide tal como RA. En otras, el factor de diferenciación candidato es un polipéptido, por ejemplo, un factor de crecimiento, tal como FGF-10. En ciertas jurisdicciones, puede no existir ninguna definición generalmente aceptada del término "que comprende". Como se utiliza en la presente, el término "que comprende" pretende representar un lenguaje "abierto" que permite la inclusión de cualquier elemento adicional. Con esto en mente, se describen las modalidades adicionales de la presente invención con referencia a los párrafos numerados abajo: 1. Un cultivo celular que comprende células humanas, en donde al menos aproximadamente 2% de dichas células humanas son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior de factor 1 homeobox pancreáticas-duodenales, siendo dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejido u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo. 2. El cultivo celular del párrafo 1, en donde al menos aproximadamente el 5% de dichas células humanas son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 3. El cultivo celular del párrafo 1, en donde al menos aproximadamente el 10% de dichas células humanas son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 4. El cultivo celular del párrafo 1, en donde al menos aproximadamente el 25% de dichas células humanas son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 5. El cultivo celular del párrafo 1, en donde se encuentran presentes células humanas alimentadoras en dicho cultivo, y en donde al menos aproximadamente el 2% de las células humanas diferentes a las células humanas alimentadoras son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 6. El cultivo celular del párrafo 1, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan el gen homeobox A13 (HOXA13) . 7. El cultivo celular del párrafo 1, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan el gen homeobox C6 (H0XC6) . 8. El cultivo celular del párrafo 1, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan S0X17. 9. El cultivo celular del párrafo 1, en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión de un marcador seleccionado del grupo que consiste de alfa-fetoproteína (AFP), S0X7, S0X1, ZIC1 y NFM en dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 10. El cultivo celular del párrafo 1, en donde dicho cultivo celular se encuentra sustancialmente libre de células seleccionadas del grupo que consiste de células endodérmicas, células endodérmicas parietales y células neurales . 11. El cultivo celular del párrafo 1, en donde al menos 1 célula endodérmica PDXl-positiva del tubo digestivo anterior se encuentra presente por aproximadamente cada 10 células de endodermo definitivo PDXl-negativo en dicho cultivo celular. 12. El cultivo celular del párrafo 1, en donde al menos 1 célula endodérmica PDXl-positiva del tubo digestivo anterior se encuentra presente por aproximadamente cada 5 células de endodermo definitivo PDXl-negativo en dicho cultivo celular. 13. El cultivo celular del párrafo 1, en donde al menos 1 célula endodérmica PDXl-positiva del tubo digestivo anterior se encuentra presente por aproximadamente cada 4 células de endodermo definitivo PDXl-negativo en dicho cultivo celular. 14. El cultivo celular del párrafo 1 que comprende además una célula progenitora embriónica. 15. El cultivo celular del párrafo 14, en donde dicha célula progenitora embriónica se deriva de un tejido seleccionado del grupo que consiste de la mórula, la masa celular interna (ICM) de un embrión y los bordes gonadales de un embrión. 16. El cultivo celular del párrafo 1 que comprende además un retinoide. 17. El cultivo celular del párrafo 16, en donde dicho retinoide es ácido retinoico (RA) . 18. El cultivo celular del párrafo 1 que comprende además FGF-10. 19. El cultivo celular del párrafo 1 que comprende además B27. 20. El cultivo celular del párrafo 1 que comprende además tanto RA como FGF-10. 21. El cultivo celular del párrafo 20 que comprende además B27. 22. Una población celular que comprende células, en donde al menos aproximadamente 90% de dichas células son células humanas endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, siendo dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo. 23. La población celular del párrafo 22, en donde al menos aproximadamente el 95% de dichas células son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 24. La población celular del párrafo 22, en donde al menos aproximadamente el 98% de dichas células son células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 25. La población celular del párrafo 22, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan el gen H0XA13. 26. La población celular del párrafo 22, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan el gen HOXC6. 27. La población celular del párrafo 22, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan SOX17. 28. La población celular del párrafo 22, en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión de un marcador seleccionado del grupo que consiste de AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 y NFM en dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 29. Un método para producir células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, comprendiendo dicho método las etapas de obtención de una población celular que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo y proporcionar dicha población celular con un retinoide en una cantidad suficiente para promover la diferenciación de al menos una porción de dichas células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, en donde dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo. 30. El método del párrafo 28 que comprende además la etapa de permitir el tiempo suficiente para que se formen las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, en donde dicho tiempo suficiente para que se formen las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se ha determinado mediante la detección de la presencia de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en dicha población celular. 31. El método del párrafo 29, en donde al menos aproximadamente el 2% de dichas células de endodermo definitivo PDXl-negativo se diferencian en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 32. El método del párrafo 29, en donde al menos aproximadamente el 5% de dichas células de endodermo definitivo PDXl-negativo se diferencian en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 33. El método del párrafo 29, en donde al menos aproximadamente el 10% de dichas células de endodermo definitivo PDXl-negativo se diferencian en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 34. El método del párrafo 29, en donde al menos aproximadamente el 25% de dichas células de endodermo definitivo PDXl-negativo se diferencian en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 35. El método del párrafo 29, en donde la detección de la presencia de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en dicha población comprende la detección de la expresión de PDXl. 36. El método del párrafo 35, en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión de un marcador seleccionado del grupo que consiste de alfa-fetoproteína (AFP), SOX7, SOX1, ZIC1 y NFM en dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 37. El método del párrafo 35, en donde la expresión de dicho PDXl se determina por reacción cuantitativa de cadena polimerasa (Q-PCR) . 38. El método del párrafo 35, en donde la expresión de PDXl se determina mediante inmunohistoquímica . 39. El método del párrafo 29, en donde dicho retinoide es RA. 40. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.01 µM a aproximadamente 50 µM. 41. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.04 µM a aproximadamente 20 µM. 42. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.1 µM a aproximadamente 10 µM. 43. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.2 µM a aproximadamente 2.5 µM. 44. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.5 µM a aproximadamente 1.5 µM. 45. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona en una concentración de aproximadamente 1 µM. 46. El método del párrafo 39, en donde RA se proporciona cuando dicho cultivo tiene aproximadamente 4 días . 47. El método del párrafo 29 que comprende además proporcionar a dicho cultivo un factor seleccionado del grupo que consiste de FGF-10, FGF-4, activina A, activina B, B27, medio acondicionado y combinaciones de dichos factores, en una cantidad suficiente para aumentar la producción de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 48. El método del párrafo 47, en donde dicho factor se selecciona del grupo que consiste de FGF-10, FGF-4, activina A y activina B. 49. El método del párrafo 48, en donde dicho factor se proporciona en una concentración que varia de aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 500 ng/ml. 50. El método del párrafo 48, en donde dicho factor se proporciona en una concentración que varia de aproximadamente 20 ng/ml hasta aproximadamente 200 ng/ml. 51. El método del párrafo 48, en donde dicho factor se proporciona en una concentración que varia de aproximadamente 25 ng/ml hasta aproximadamente 75 ng/ml. 52. El método del párrafo 48, en donde dicho factor se proporciona en una concentración de aproximadamente 50 ng/ml. 53. El método del párrafo 48, en donde dicho factor se proporciona aproximadamente al mismo tiempo que tal retinoide . 54. El método del párrafo 47 en donde dicho factor es B27. 55. El método del párrafo 54, en donde B27 se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 20% del medio total. 56. El método del párrafo 54, en donde B27 se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 5% del medio total. 57. El método del párrafo 54, en donde B27 se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 2% del medio total. 58. El método del párrafo 54, en donde B27 se proporciona en una concentración de aproximadamente 1% del medio total. 59. El método del párrafo 54, en donde B27 se proporciona aproximadamente al mismo tiempo que dicho retinoide . 60. El método del párrafo 47, en donde dicho factor es medio acondicionado. 61. El método del párrafo 60, en donde el medio acondicionado se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 10% hasta aproximadamente 100% del medio total. 62. El método del párrafo 60, en donde el medio acondicionado se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 20% hasta aproximadamente 80% del medio total . 63. El método del párrafo 60, en donde el medio acondicionado se proporciona en una concentración que varía de aproximadamente 40% hasta aproximadamente 60% del medio total . 64. El método del párrafo 60, en donde el medio acondicionado se proporciona en una concentración de aproximadamente 50% del medio total. 65. El método del párrafo 60, en donde el medio acondicionado se proporciona aproximadamente al mismo tiempo que dicho retinoide. 66. El método del párrafo 60, en donde el medio acondicionado se prepara poniendo en contacto células embriónicas humanas diferenciadas (hESCs) con un medio de cultivo durante aproximadamente 24 horas. 67. El método del párrafo 66, en donde dichas hESCs se diferencian durante aproximadamente 5 días en un medio de cultivo celular seleccionado del grupo que consiste de RPMI suplementado con suero al 3%, RPMI bajo en suero suplementado con activina A y RPMI bajo en suero suplementado con BMP4. 68. Una célula endodérmica PDXl-positiva del tubo digestivo anterior producida mediante el método del párrafo 29. 69. Un método para producir una población celular enriquecida en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, comprendiendo dicho método las etapas de obtención de una población de células pluripotentes, en donde al menos una célula de dicha población celular pluripotente comprende al menos una copia de un ácido nucleico bajo el control de un promotor PDXl, comprendiendo dicho ácido nucleico una secuencia que codifica para una proteína verde fluorescente (GFP) o un fragmento biológicamente activo de la misma, la diferenciación de dichas células pluripotentes a fin de producir células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, siendo dichas células endodérmicas PDX1-positivo del tubo digestivo anterior, células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción del tubo digestivo anterior, y la separación de dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior de las células PDXl-negativo. 70. El método del párrafo 69, en donde dicha población celular enriquecida comprende al menos aproximadamente 95% de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 71. El método del párrafo 69, en donde dicha población celular enriquecida comprende al menos aproximadamente 98% de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 72. El método del párrafo 69, en donde la etapa de diferenciación comprende además, proporcionar dicha población celular pluripotente con al menos un factor de crecimiento de la superfamilia TGFß en una cantidad suficiente para promover la diferenciación de dichas células pluripotentes con las células de endodermo definitivo PDXl-negativo, y proporcionar dichas células de endodermo definitivo PDXl-negativo con un retinoide en una cantidad suficiente para promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDX1-negativo con las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 73. El método del párrafo 72, en donde dicho retinoide es RA. 74. Una población enriquecida de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior producida mediante el método del párrafo 69. 75. Un método para incrementar la expresión del producto del gen PDXl en una célula endodérmica definitiva que expresa SOX17, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula endodérmica definitiva con un factor de diferenciación en una cantidad suficiente para incrementar la expresión del producto del gen PDXl. 76. El método del párrafo 75, en donde dicho factor de diferenciación es un retinoide. 77. El método del párrafo 76, en donde dicho factor de diferenciación es RA. 78. El método del párrafo 75, en donde dicho factor de diferenciación se selecciona del grupo que consiste de FGF-10, FGF-4, activina A, activina B, B27, medio acondicionado y combinaciones de dichos factores. 79. Un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDXl-negativo con las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, comprendiendo dicho método las etapas de obtención de una población que comprende células de endodermo definitivo PDX1-negativo, poner en contacto dicha población que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo con un factor de diferenciación candidato y determinar si la expresión PDXl en dicha población celular después del contacto con dicho factor de diferenciación candidato ha aumentado en comparación con la expresión PDXl en dicha población celular antes del contacto con dicho factor de determinación candidato, en donde un incremento en dicha expresión PDXl en dicha población celular indica que dicho factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDX1-negativo con las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, siendo dichas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo. 80. El método del párrafo 79, en donde dicha expresión PDXl se determina mediante Q-PCR. 81. El método del párrafo 79 que comprende además la etapa de determinación de la expresión del gen H0XA13 en dicha población celular antes y después del contacto con dicho factor de diferenciación candidato 62. El método del párrafo 79 que comprende además la etapa de determinación de la expresión del gen H0XC6 en dicha población celular antes y después del contacto con dicho factor de diferenciación candidato 83. El método del párrafo 79, en donde dicho factor de diferenciación candidato es una molécula pequeña. 84. El método del párrafo 83, en donde dicha molécula pequeña es un retinoide. 85. El método del párrafo 84, en donde dicho retinoide es RA. 86. El método del párrafo 79, en donde dicho factor de diferenciación candidato es un polipéptido. 87. El método del párrafo 79, en donde dicho factor de diferenciación candidato es un factor de crecimiento. 88. El método del párrafo 79, en donde dicho factor de diferenciación candidato es FGF-10. 89. Un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, comprendiendo dicho método las etapas de obtención de una población que comprende células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, poner en contacto dicha población que comprende células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior con un factor de diferenciación candidato y determinar si la expresión de un marcador en dicha población aumenta o disminuye después del contacto con dicho factor de diferenciación candidato en comparación con la expresión del mismo marcador en dicha población antes del contacto con dicho factor de diferenciación candidato, en donde un incremento o disminución en la expresión de dicho marcador en dicha población indica que dicho factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. 90. El método del párrafo 81, en donde la expresión de dicho marcador se determina mediante Q-PCR. 91. El método del párrafo 81, en donde dicho factor de diferenciación candidato es una molécula pequeña. 92. El método del párrafo 81, en donde dicho factor de diferenciación candidato es un polipéptido. 93. El método del párrafo 81, en donde dicho factor de diferenciación candidato es un factor de crecimiento. 94. Un vector que comprende un gen informante operablemente unido a una región de control PDXl. 95. El vector del párrafo 94, en donde dicho gen informante es EGFP. 96. Una célula que comprende el vector del párrafo 94. 97. Una célula que comprende un gen informante operablemente unido a una región de control PDXl. 98. La célula del párrafo 97, en donde dicho gen informante operablemente unido a dicha región de control PDXl se encuentra integrado en un cromosoma. 99. La célula del párrafo 97, en donde dicho gen informante es EGFP. 100. La célula del párrafo 97, en donde dicha célula es pluripotente. 101. La célula del párrafo 100, en donde dicha célula es una hESC. 102. La célula del párrafo 97, en donde dicha célula es una célula endodérmica definitiva. 103. La célula del párrafo 100, en donde dicha célula es una célula endodérmica PDXl-positiva del tubo digestivo anterior. 104. Un medio acondicionado preparado mediante las etapas de poner en contacto el medio de cultivo celular fresco con una población de hESCs diferenciadas durante aproximadamente 24 horas, en donde dichas hESCs se han diferenciado durante aproximadamente 5 días en un medio de cultivo celular seleccionado del grupo que consiste de RPMI suplementado con suero al 3%, RPMI bajo en suero suplementado con activina A y RPMI bajo en suero suplementado con BMP4, y retirar dicha población de hESCs diferenciadas del medio. 105. El medio aconaicionado del párrafo 104, en donde dicho medio de cultivo celular fresco es RPMI . 106. El medio acondicionado del párrafo 105, en donde dicho RPMI es un RPMI bajo en suero. 107. Un método para acondicionar un medio, comprendiendo dicho método las etapas de poner en contacto el medio de cultivo fresco con una población de hESCs diferenciadas durante aproximadamente 24 horas, en donde dichas hESCs se han diferenciado durante aproximadamente 5 días en un medio de cultivo celular seleccionado del grupo que consiste de RPMI suplementado con suero al 3%, RPMI bajo en suero suplementado con activina A y RPMI bajo en suero suplementado con BMP4, y retirar dicha población de hESCs diferenciadas del medio. 108. El método del párrafo 107, en donde dicho medio de cultivo fresco es RPMI . 109. El método del párrafo 108, en donde dicho RPMI es RPMI bajo en suero. Se apreciará que los métodos y composiciones descritos anteriormente se refieren a células cultivadas in vitro. Sin embargo, las composiciones celulares diferenciadas in vitro antes descritas pueden utilizarse para aplicaciones in vivo. También pueden encontrarse modalidades adicionales de la presente invención en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/532,004 titulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Diciembre 23 de 2003; Solicitud de Patente Provisional de E.U. Número 60/566,293, titulada PDXl EXPRESSING ENDODERM, presentada en Abril 27 de 2004; Solicitud de Patente Provisional de E.U. Número 60/586,566, titulada CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Julio 9 de 2004; Solicitud de Patente Provisional de E.U. Número 60/587,942, titulada CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Julio 14 de 2004; y Solicitud de Patente de E.U. No. 11/021,618, titulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Diciembre 23 de 2004. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un esquema de una ruta de diferenciación propuesta para la producción de células beta a partir de hESCs. La primera etapa en la ruta confía la célula ES al linaje endodérmico definitivo y también representa la primera etapa previo a eventos de diferenciación adicionales al endodermo pancreático, endodermo endocrino, o células isleta/beta. La segunda etapa en la ruta muestra la conversión de endodermo definitivo S0X17-positivo/PDXl-negativo a endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Algunos factores útiles para mediar estas transiciones se muestran en letra cursiva. Los marcadores relevantes para definir las células objetivo se encuentran subrayados. La Figura 2 es un diagrama del ADNc S0X17 humano que despliega las posiciones de motivos conservados y resalta la región utilizada para el procedimiento de inmunización mediante GENOVAC. La Figura 3 es un dendograma de relación que ilustra que SOX17 se encuentra más cercanamente relacionado con SOX7 y de alguna manera menos a SOX18. Las proteínas SOX17 se encuentran más cercanamente relacionadas entre especies homologas que con otros miembros de la subfamilia F del grupo SOX dentro de la misma especie. La Figura 4 es una inmunoanálisis Western probado con el anticuerpo de rata anti-SOX17. Este inmunoanálisis demuestra la especificidad de este anticuerpo para la proteína SOX17 humana sobreexpresada en fibroblastos (campo 1) y una falta de inmunorreactividad con EGFP (campo 2) o para el miembro de la familia SOX más cercanamente relacionado SOX7 (campo 3) . Las Figuras 5A-B son micrográficas que muestran una agrupación de células SOX17+ que despliega un número significativo de células AFP+ co-marcadas (A) . Esto se encuentra en sorprendente contraste con otras agrupaciones S0X17+ (B) en donde se observan pocas o ninguna célula AFP+. Las Figuras 6A-C son micrográficas que muestran el endodermo parietal y S0X17. El panel A muestra la inmunohistoquímica para la proteína trombomodulina humana (TM) ubicada en la superficie celular de células de endodermo parietales en cultivos aleatoriamente diferenciados de células hES. El panel B es el campo idéntico mostrado en A marcado doblemente para TM y SOX17. El panel C es la imagen de contraste de fase del mismo campo con núcleos marcados con DAPI . Nótese la completa correlación de núcleos marcados con DAPI y el marcado con SOX1 . Las Figuras 7A-B son diagramas en barra que muestran la expresión del gen SOX17 mediante PCR cuantitativa (Q-PCR) y de células anti-SOX17 positivas mediante anticuerpo específico para SOX17. El panel A muestra que la activina A incrementa la expresión del gen SOX17 mientras que el ácido retinoico (RA) suprime fuertemente la expresión de SOX17 en relación al medio de control no diferenciado (SR20) . El panel B muestra el patrón idéntico así como una magnitud similar de estos cambios que se refleja en el número de células SOX17+, indicando que la medición por Q-PCR de la expresión del gen SOX17 refleja bien los cambios en el único nivel celular.
La Figura 8A es un diagrama en barra que muestra que un cultivo de hESCs diferenciadas en presencia de activina A mantiene un bajo nivel de expresión del gen AFP mientras que las células que se dejan diferenciar aleatoriamente en suero fetal bovino al 10% (FBS) exhiben una fuerte sobrerregulación de AFP. La diferencia en los niveles de expresión es de aproximadamente 7 veces. Las Figuras 8B-C son imágenes de dos micrográficas que muestran que la supresión de la expresión de AFP mediante activina A también es evidente en el único nivel celular como se indica por las muy raras y pequeñas agrupaciones de células AFP+ observadas en condiciones de tratamiento con activina A (parte inferior) en relación con FBS al 10% solo (parte superior) . Las Figuras 9A-B son imágenes comparativas que muestran la cuantificación del número de células AFP+ utilizando citometría de flujo. Esta figura demuestra que la magnitud de cambio en la expresión del gen AFP (Figura 8A) en presencia (panel derecho) y ausencia (panel izquierdo) de activina A corresponde exactamente al número de células AFP+, sosteniendo adicionalmente la utilidad de análisis Q-PCR para indicar los cambios que se presentan en el nivel celular individual . Las Figuras 10A-F son micrográficas que muestran que la exposición de hESCs a activina A y activina B nodal (NAA) produce un sorprendente incremento en el número de células S0X17+ durante el período de 5 días (A-C) . Comparando la relativa abundancia de células S0X17+ con el número total de células presente en cada campo, como se indica por los núcleos coloreados con DAPI (D-F), puede observarse que aproximadamente el 30-50% de todas las células es inmunorreactivo para SOX17 después de cinco días de tratamiento con NAA. La Figura 11 es un diagrama en barra que demuestra que la activina A (0, 10, 30 o 100 ng/ml) dependiendo de la dosis incrementa la expresión del gen SOX17 para la diferenciación de hESCs. El incremento en la expresión es ya más robusto después de 3 días de tratamiento en cultivos adherentes y continúa también a través de los días 1, 3 y 5 subsecuentes de suspensión del cultivo. Las Figuras 12A-C son diagramas en barra que demuestran el efecto de activina A en la expresión de MIXL1 (panel A) , GATA4 (panel B) y HNF3b (panel C) . los incrementos de activina A dependientes de la dosis también se observan para otros tres marcadores de endodermo definitivo; MIXL1, GATA4 y HNF3b. Las magnitudes del aumento de expresión en respuesta a la dosis de activina son sorprendentemente similares a las observadas paca SOX17, indicando fuertemente que la activina A especifica una población de células que co-expresan todos los cuatro genes (S0X17+, MIXL1+, GATA4+ y HNF3b+) . Las Figuras 13A-C son diagramas en barra que demuestran el efecto de activina A en la expresión de AFP (panel A) , S0X7 (panel B) y SPARC (panel C) . existe una disminución en la activina A dependiente de la dosis en la expresión del marcador de endodermo visceral AFP. Los marcadores de endodermo primitivo (S0X7) y de endodermo parietal (SPARC) permanecen ya sea sin cambio o exhiben supresión en algunos puntos indicando que la activina A no actúa para especificar estos tipos celulares de endodermo extra-embriónico. Esto sostiene adicionalmente el hecho de que el aumento en la expresión de SOX17, MIXL1, GATA4 y HNF3b se debe a un incremento en el número de células de endodermo definitivo en respuesta a activina A. Las Figuras 14A-B son diagrama en barra que muestran en efecto de activina Z en la expresión de ZIC1 (panel A) y Brachyury (panel B) . La expresión consistente del marcador neural ZIC1 demuestra que no existe un efecto dependiente de la dosis de la activina A en la diferenciación neural. Existe una notable supresión de diferenciación del mesodermo mediada por 100 ng/ml de tratamiento con activina A como se indica por la disminución de la expresión de brachyury. Este es probablemente el resultado del aumento en la especificación del endodermo definitivo a partir de los precursores mesendodermo. Niveles más bajos del tratamiento con activina A (10 y 30 ng/ml) mantienen la expresión de brachyury en puntos de tiempo posteriores de diferenciación en relación con cultivos de control no tratados. Las Figuras 15A-B son micrográficas que muestran la disminución en la diferenciación del endodermo parietal en respuesta al tratamiento con activinas. Las regiones del endodermo parietal TMhl se encuentran a lo largo del cultivo (A) cuando se diferencian en suero solo, mientras que la diferenciación a células TM+ es escasa cuando se incluyen activinas (B) y la intensidad total de la inmunorreactividad TM es menor. Las Figuras 16A-D son micrográficas que muestran la expresión del marcador en respuesta al tratamiento con activina A y activina B. Las hESCs se trataron durante cuatro días consecutivos con activina A y activina B y se marcaron tres veces con anticuerpos SOX17, AFP y TM. Panel A- SOX17; Panel B - AFP; Panel C - TM; y Panel D -Fase/DAPI . Nótese las numerosas células SOX17 positivas (A) asociadas con la completa ausencia de AFP (B) e inmunorreactividad TM (C) . La Figura 17 es una micrográfica que muestra la aparición de endodermo definitivo y endodermo visceral en vitro a partir de hESCs. Las regiones del endodermo visceral se identifican por AFPhl/SOXl710, mientras que el endodermo definitivo despliega en perfil completo opuesto, S0X17hl/AFP10. Este campo se seleccionó selectivamente debido a la proximidad de estas dos regiones entre sí. Sin embargo, existen numerosas veces cuando se observan las regiones S0X17hl/AFPl0 en absoluto aislamiento de cualquiera de las regiones de células AFPhl, sugiriendo el origen separado de las células de endodermo definitivo de las células endodérmicas viscerales. La Figura 18 es un diagrama que ilustra la familia TGFß de ligantes y receptores. Los factores que activan Smads AR y Smads BR son útiles en la producción de endodermo definitivo a partir de células progenitoras embriónicas humanas (ver J. Cell. Physiol. 187:265-76). La Figura 19 es un diagrama en barra que muestra la inducción de la expresión SOX17 al paso del tiempo como resultado del tratamiento con factores TGFß individuales y combinaciones . La Figura 20 es un diagrama en barra que muestra el incremento en el número de células SOX17+ al paso del tiempo como resultado del tratamiento con combinaciones de factores TGFß. La Figura 21 es un diagrama en barra que muestra la inducción de la expresión SOX17 al paso del tiempo como resultado del tratamiento con combinaciones de factores TGFß. La Figura 22 es un diagrama en barra que muestra que la activina A induce un incremento dependiente de la dosis en el número de células S0X17+. La Figura 23 es un diagrama en barra que muestra que la adición de Wnt3a a cultivos tratados con activina A y activina B incrementa la expresión de S0X17 por arriba de los niveles inducidos por activina A y activina B solos. Las Figuras 24A-C son diagramas en barra que muestran que la diferenciación con endodermo definitivo aumenta en condiciones de bajo FBS. El tratamiento de hESCs con activinas A y B en medio conteniendo FBS al 2% (2AA) produce un nivel 2-3 veces más grande de expresión de SOX17 en comparación con el mismo tratamiento en medio FBS al 10% (10AA) (panel A). La inducción del marcador de endodermo definitivo MOXLl (panel B) también se afecta de la misma manera y la supresión de AFP (endodermo visceral) (panel C) es mayor en FBS al 2% que en condiciones de FBS al 10%. Las Figuras 25A-D son micrográficas que muestran que las células SOX17+ se dividen en el cultivo. Las células SOX17 inmunorreactivas se encuentran presentes en el borde de diferenciación de una colonia de hESC (C, D) y se encuentran marcadas con antígeno nuclear celular de proliferación (PCNA) (panel B) y sin embargo no se encuentran co-marcadas con OCT4 (panel C) . adicionalmente, pueden observarse claras figuras mitóticas mediante el marcado con DAPI de los núcleos tanto en células SOX17+ (flechas) como en OCT4+, hESCs no diferenciadas (puntas de flecha) (D) .
La Figura 26 es un diagrama en barra que muestra el nivel de expresión relativo de CXCR4 en hESCs de diferenciación bajo diversas condiciones de medio. Las Figuras 27A-D son diagramas en barra que muestran cómo un panel de marcadores de endodermo definitivo comparten un patrón muy similar de expresión con CXCR4 a través de los mismos tratamientos de diferenciación desplegados en la Figura 26. Las Figuras 28A-E son diagramas en barra que muestran cómo los marcadores para mesodermo (BRACHYURY, MOX1), ectodermo (SOX1, ZIC1) y endodermo visceral (SOX7) exhiben una relación inversa con la expresión de CXCR4 a través de los mismos tratamientos desplegados en la Figura 26. Las Figuras 29A-F son micrográficas que muestran la diferencia relativa en células SOX17 inmunorreactivas a través de tres de las condiciones del medio desplegadas en las Figuras 26-28. Las Figuras 30A-C son ilustraciones punteadas de citometría de flujo que demuestran el incremento en el número de células CXCR4+ con un incremento en la concentración de activina A agregada al medio de diferenciación. Las Figuras 31A-D son diagramas en barra que muestran que las células CXCR4+ aisladas del tratamiento con alta dosis de activina A (A100-CX+) se enriquecen aún adicionalmente para marcadores de endodermo definitivo que la población original (A100) . La Figura 32 es un diagrama en barra que muestra la expresión de gen de células CXCR4+ Y CXCR" aisladas utilizando selección celular activada por fluorescencia (FACS) así como la expresión de gen en las poblaciones originales. Esto demuestra que las células CXCR4+ contienen esencialmente toda la expresión de gen CXCR4 presente en cada población de origen y que las poblaciones CXCR4" contienen poca o ninguna expresión de gen CXCR4. Las Figuras 33A-D son diagramas en barra que demuestran el agotamiento de la expresión de gen de mesodermo (BRACHYURY, MOX1), ectodermo (ZIC1) y endodermo visceral (SOX7) en las células CXCR4+ aisladas del tratamiento de alta dosis de activina A que ya se encuentra suprimida en la expresión de estos marcadores de endodermo no definitivo. Las Figuras 34A-M son diagramas en barra que muestran los patrones de expresión de genes marcadores que pueden utilizarse para identificar células de endodermo definitivo. El análisis de expresión de los marcadores de endodermo definitivo, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 y CRIP1 se muestra en los paneles G-L, respectivamente. El análisis de expresión de los genes marcadores de linaje previamente descritos, SOX17, SOX7, SOX17/SOX7, TM, ZIC1 y MOX1 se muestra en los paneles A-F, respectivamente. El panel M muestra el análisis de expresión de CXCR4. Con respecto a cada uno de los paneles A-M, la columna marcada con hESC indica la expresión del gen a partir de células progenitoras embriónicas humanas; 2NF indica células tratadas con FBS al 2%, sin adición de activina; 0.1A100 indica células tratadas con FBS al ü.1%, 100 ng/ml de activina A; 1A100 indica células tratadas con FBS al 1%, 100 ng/ml de activina A; y 2A100 indica células tratadas con FBS al 2%, lOOng/ml de activina A. La Figura 35 es un diagrama que muestra la expresión relativa del gen PDXl en un cultivo de hESCs después de 4 días y 6 días con y sin activina en presencia de ácido retinoico (RA) y factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) agregado en el día 4. Las Figuras 36A-F son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESCs después de 4 días y 6 días con y sin activina en presencia de ácido retinoico (RA) y factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) agregado en el día 4. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) SOX17; (B) SOX7; (C) AFP; (D) SOX1; (E) ZIC1; y (F) NFM. Las Figuras 37A-C son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESCs después de 4 días y 8 días con y sin activina en presencia y ausencia de combinaciones de ácido retinoico (RA) , factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) y factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-4) agregado en el día 4. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) S0X7; y (C) NFM. Las Figuras 38A-G son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de células de endodermo definitivo en contacto con 50 ng/ml de FGF-10 en combinación ya sea con 1 µM, 0.2 µM o 0.04 µM de ácido retinoico (RA) agregado en el día 4. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) HOXA3; (C) HOXC6; (D) HOXA13; (E) CDX1; (F) SOX1; y (G) NFM. Las Figuras 39A-E son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESCs después de 4 días y 8 días con y sin activina en presencia de combinaciones de ácido retinoico (RA) , factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) y uno de los siguientes: reemplazo de suero (SR), suero fetal bovino (FBS) o B27. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) SOX7; (C) AFP; (D) ZIC1; y (E) NFM. Las Figuras 40A-B son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores para páncreas (PDXl, HNF6) e hígado (HNF6) en un cultivo de hESCs después de 6 días (justo previo a la adición de RA) y a los 9 días (tres días después de la exposición a RA) . Se incluyeron diversas condiciones para comparar la adición de activina B en dosis de 10 ng/ml (alO) , 25 ng/ml (a25) , o 50 ng/ml (a50) en presencia ya sea de 25 ng/ml (A25), o 50 ng/ml (A50) de activina A. La condición sin activina A o activina B (NF) sirve como control negativo para la producción de endodermo negativo y endodermo PDXl-positivo. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl y (B) HNF6. Las Figuras 41A-C son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESCs después de 6 días con 100 ng/ml (AlOO), 50 ng/ml (A50) o sin (NF) activina A a los 5 días (justo previo a la adición de ácido retinoico) y en los días 2, 4 y 6 después de la exposición a RA (día 7, 9, y 11, respectivamente) . El porcentaje marcado directamente bajo cada barra indica la dosis de FBS durante los días 3-5 de diferenciación. Comenzando en el día 7, las células tratadas con RA (R) se cultivaron en medio RPMI que comprende FBS al 0.5%. la concentración de RA fue de 2 µM en el día 7, 1 µM en el día 9 y 0.2 µM en el día 11. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) ZIC1; (C) SOX7. Las Figuras 42A-B son diagramas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESCs tratadas primero con activina A en FBS bajo para inducir endodermo definitivo (día 5) y después con medio fresco (A25R) comprendiendo 25 ng/ml de activina A y RA o varios medios acondicionados (MEFCM, CM#2, CM#3 y CM#4) y RA para inducir el endodermo que expresa PDXl. La expresión del marcador se determinó en los días 5, 6, 7, 8 y 9. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) CDX1. La Figura 43 es un diagrama que muestra la expresión relativa de PDXl en un cultivo de hESCs tratadas primero con activina A en FBS bajo para inducir el endodermo definitivo y seguido por medio fresco comprendiendo activina A y ácido retinoico (A25R) o cantidades variables de RA en medio acondicionado diluido en medio fresco. El volumen total del medio es de 5 ml en todos los casos. La Figura 44 es un inmunoanálisis Western que muestra PDXl inmunoprecipitado a partir de células de endodermo definitivo tratadas con RA 3 días (d8) y 4 días (d9) después de la adición de RA y 50 ng/ml de activina A. La Figura 45 es un diagrama en resumen que despliega los resultados de una selección celular activada por fluorescencia (FACs) de células endodérmicas PDXl-positivo de tubo digestivo anterior genéticamente marcadas con un informante EGFP bajo control del promotor PDXl.
La Figura 46 es un diagrama que muestra los niveles de expresión PDXl relativos normalizados para genes domésticos para poblaciones seleccionadas de células vivas (Live), células EGFP-negativas (Neg) y células EGFP-positivas (GFP+) . La Figura 47 es un diagrama que muestra los niveles de expresión PDXl relativos normalizados para genes domésticos para poblaciones seleccionadas de células vivas (Live) , células EGFP-negativas (Neg) , la mitad de la población de células EGFP-positivas que tiene la más baja intensidad de señal EGFP (Lo) y la mitad de la población de células EGFP-positivas que tiene la más alta intensidad de señal EGFP (Hi) . Las Figuras 48A-E son diagramas que muestran los niveles de expresión relativos normalizados para genes domésticos de cinco marcadores de endodermo pancreático en poblaciones seleccionadas de células vivas (Live) , células EGFP-negativas (Neg) y células EGFP-positivas (GFP+) . Paneles: A - NKX2.2; B - GLUT2; C - HNF3ß; D - KRT19 y E -HNF4 . La Figura 49 es un diagrama que muestra los niveles de expresión relativos normalizados para genes domésticos de dos marcadores de endodermo no pancreático en poblaciones seleccionadas de células vivas (Live) , células EGFP-negativas (Neg) y células EGFP-positivas (GFP+) . Paneles: A -ZIC1 y B - GFAP. Descripción Detallada Una etapa crucial en el desarrollo humano temprano llamada gastrulación se presenta 2-3 semanas después de la fertilización. La gastrulación es extremadamente significativa debido a que es en este momento que las tres capas germinales primarias se especifican y organizan primero (Lu et al., 2001; Schoen olf y Smith, 2000). El ectodermo es responsable de la eventual formación de las cubiertas externas del cuerpo y de toso el sistema nervioso, mientras que el corazón, la sangre, hueso, músculo esquelético y otros tejidos de conexión se derivan del mesodermo. El endodermo definitivo se define como la capa germinal responsable de la formación de todo el tubo digestivo que incluye el esófago, estómago e intestinos delgado y grueso, y los órganos que se derivan del tubo digestivo tales como los pulmones, hígado, timo, glándulas paratiroideas y tiroideas, vejiga y páncreas (Grapin-Botton y Melton, 2000; Kimelman y Griffin, 2000; Tremblay et al., 2000; Wells y Melton, 1999; Wells y Melton 2000) . Debe hacerse una muy importante distinción entre el endodermo definitivo y el linaje completamente separado de células llamado endodermo primitivo. El endodermo primitivo es principalmente responsable de la formación de tejidos extra embriónicos, principalmente las porciones endodérmicas parietal y visceral de la bolsa placentaria y el material de matriz extracelular de membrana de Reichert. Durante la gastrulación, el proceso de formación del endodermo definitivo comienza con un evento de migración celular en el cual las células mesendodérmicas (células competentes para formar mesodermo o endodermo) migran a través de una estructura llamada la línea primitiva. El endodermo definitivo se deriva de células que migran a través de la porción anterior de la línea y a través del nodo (una estructura especializada en la región más anterior de la línea) . Mientras ocurre la migración, el endodermo definitivo puebla primero el tubo digestivo más anterior y culmina con la formación del extremo posterior del tubo digestivo. La Expresión del Gen PDXl Durante el Desarrollo PDXl (llamado también STF-1, IDX-1 e IPF-1) es un factor de transcripción necesario para el desarrollo del páncreas y el duodeno rostral. PDXl se expresa primero en el endodermo pancreático, que surge del endodermo posterior del tubo digestivo anterior y producirá las células tanto exócrinas como endocrinas, comenzando en E8.5 en el ratón. Posteriormente, PDXl se restringe a las células beta y algunas células delta. Este patrón de expresión se mantiene en el adulto. PDXl también se expresa en endodermo duodenal tempranamente en el desarrollo, que se encuentra adyacente al páncreas formado, después en los enterocitos duodenales y las células endocrinas, estómago antral y en los conductos de bilis común, cistíticos y biliares. Esta región de expresión también se vuelve limitada, en el momento en que se restringe la expresión pancreática predominantemente, al duodeno rostral. Células PDXl-positivo y Procesos Relacionados a las Mismas Las modalidades de la presente invención se refieren a nuevos procesos definidos para la producción de células endodérmicas PDXl-positivo, en donde las células endodérmicas PDXl-positivo son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la región del tubo digestivo anterior/tubo digestivo medio del tubo digestivo (endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior/tubo digestivo medio) . Como se utiliza en la presente, "multipotente" o "célula multipotente" se refiere a un tipo celular que puede dar lugar a un número limitado de otros tipos celulares particulares. Como se utiliza en la presente, "tubo digestivo anterior/tubo digestivo medio" se refiere a células de la porción anterior del tubo digestivo así como a células de la porción media del tubo digestivo, incluyendo células de la unión del tubo digestivo anterior/tubo digestivo medio. Algunas modalidades preferidas de la presente invención se refieren a procesos para la producción de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En algunas modalidades, estas células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo (endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior) . Modalidades preferidas adicionales se refieren a procesos para la producción de células endodérmicas PDXl-positivo de la porción posterior del tubo digestivo anterior. En algunas modalidades, estas células endodérmicas PDX1-positivo son células multipotentes que se diferencian en células, tejidos u órganos derivados de la porción posterior de la región de tubo digestivo anterior del tubo digestivo. Las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, tales como las producidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente, pueden utilizarse para producir células ß productoras de insulina totalmente diferenciadas. En algunas modalidades de la presente invención, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se producen diferenciando células de endodermo definitivo que no expresan sustancialmente PDXl (células de endodermo definitivo PDXl-negativo; referidas en la presente también como endodermo definitivo) a fin de formar células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Las células de endodermo definitivo PDXl-negativo pueden prepararse diferenciando células pluripotentes, tales como las células progenitoras embriónicas, como se describe en la presente o mediante cualquier otro método conocido. Un método conveniente y altamente eficiente para producir endodermo definitivo PDXl-negativo a partir de células pluripotentes se describe en la Patente de E.U. No. 11/021,618, titulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Diciembre 23 de 2004. Los procesos para producir células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior proporcionan una base para la producción eficiente de tejidos pancreáticos tales como células acinares, células de conducto y células isleta a partir de células pluripotentes. En ciertas modalidades preferidas, las células endodérmicas humanas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se derivan de células de endodermo definitivo PDXl-negativo, que a su vez, se derivan de hESCs. Estas células endodérmicas humanas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden utilizarse entonces para producir células ß productoras de insulina funcionales. Para obtener cantidades útiles de células ß productoras de insulina, es deseable una alta eficiencia de diferenciación para cada una de las etapas de diferenciación que se presentan previo a lograr el destino de la isleta pancreática/célula ß. Debido a que la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDXl-negativo para células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior representa una etapa temprana hacia la producción de isleta pancreática/células ß (como se muestra en la Figura 1), es particularmente deseable una alta eficiencia de diferenciación en esta etapa. En vista de lo deseable de una eficiente diferenciación de células de endodermo definitivo PDX1-negativo para células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, algunos aspectos de la presente invención se refieren a metodología in vitro que da como resultado aproximadamente 2-25% de conversión de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Típicamente, tales métodos abarcan la aplicación de condiciones de cultivo y de factor de crecimiento de una manera definida y temporalmente especificada. Puede lograrse un enriquecimiento adicional de la población celular para células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, mediante aislamiento y/o purificación de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior a partir de otras células en la población utilizando un reactivo que se une específicamente a las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Como alternativa, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden marcarse con un gen informante tal como una proteína verde fluorescente (GPF) , a fin de permitir la detección de la expresión de PDXl. Tales células marcadas fluorescentemente pueden purificarse entonces mediante selección celular activada por fluorescencia (FACS) . Aspectos adicionales de la invención se refieren a cultivos celulares y poblaciones celulares enriquecidas que comprenden las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, así como a métodos para identificar los factores útiles en la diferenciación a y de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. A fin de determinar la cantidad de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en un cultivo celular o población celular, es deseable un método para distinguir este tipo celular de otras células en el cultivo o en la población. En consecuencia, ciertas modalidades de la presente invención se refieren a marcadores celulares cuya presencia, ausencia y/o niveles de expresión relativos son indicativos de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, así como a métodos para detectar y determinar la expresión de tales marcadores. Como se utiliza en la presente, "expresión" se refiere a la producción de un material o sustancia así como al nivel o cantidad de producción de un material o sustancia. Por tanto, la determinación de la expresión de un marcador específico se refiere a la detección de la cantidad ya sea absoluta o relativa, del marcador que se expresa o simplemente a la detección de la presencia o ausencia del marcador. Como se utiliza en la presente, "marcador" se refiere a cualquier molécula que pueda observarse o detectarse. Por ejemplo, un marcador puede incluir, pero no se limita a, un ácido nucleico, tal como una transcripción de un gen específico, un polipéptido producto de un gen, un polipéptido no producto de un gen, una glicoproteína, un carbohidrato, un glicolípido, un lípido, una lipoproteína o una molécula pequeña (por ejemplo, moléculas que tienen un peso molecular menor que 10,000 amu) . En algunas modalidades de la presente invención, la presencia, ausencia y/o nivel de expresión de un marcador se determina por medio de PCR cuantitativa (Q-PCR) . Por ejemplo, la cantidad de transcripción producida por ciertos marcadores genéticos, tales como PDXl, SOX17, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, alfa-fetoproteína (AFP), homeobox A13 (HOXA13) , homeobox C6 (HOXC6) , y/o otros marcadores descritos en la presente, se determina por medio de Q-PCR. En otras modalidades, se utiliza inmunohistoquímica para detectar las proteínas expresadas por los genes antes mencionados. Aún en otras modalidades, se utilizan técnicas tanto de Q-PCR como inmunohistoquímicas para identificar y determinar la cantidad o proporciones relativas de tales marcadores. Utilizando los métodos de diferenciación y detección descritos en la presente, es posible identificar células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, así como determinar la proporción de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en un cultivo celular o población celular. Por ejemplo, en algunas modalidades de la presente invención, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo" digestivo anterior o poblaciones celulares que se producen expresan el gen PDXl a un nivel de al menos aproximadamente 2 órdenes de magnitud mayor que las células PDXl-negativo o poblaciones celulares. En otras modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior que se producen expresan el gen PDXl a un nivel de más de 2 órdenes de magnitud mayor que las células PDXl-negativo o poblaciones celulares. Aún en otras modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior o poblaciones celulares que se producen expresan uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de PDXl, SOX17, HOXA13, y H0XC6 a un nivel de aproximadamente 2 o más de 2 órdenes de magnitud mayor que las células de endodermo definitivo PDXl-negativo o poblaciones celulares. Las composiciones y métodos descritos en la presente tienen diversas características útiles. Por ejemplo, los cultivos celulares y poblaciones celulares que comprenden endodermo PDXl-positivo, así como los métodos para producir tales cultivos celulares y poblaciones celulares, son útiles para modelar las etapas tempranas del desarrollo humano. Además, las composiciones y métodos descritos en la presente también pueden servir para intervención terapéutica en estados de enfermedad, tales como diabetes mellitus. Por ejemplo, dado que el endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior sirve como fuente solo para un número limitado de tejidos, éste puede utilizarse en el desarrollo de tejido puro o tipos celulares. PRODUCCIÓN DE ENDODERMO DEFINITIVO PDX1-NEGATIV0 (ENDODERMO DEFINITIVO) A PARTIR DE CÉLULAS PLURIPOTENTES Los cultivos celulares y/o poblaciones celulares que comprenden células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se producen a partir de células pluripotentes produciendo primero endodermo definitivo PDX1-negativo (referido también como "endodermo definitivo") . Los procesos para diferenciar células pluripotentes para producir cultivos celulares y poblaciones celulares enriquecidas que comprenden endodermo definitivo se describen brevemente abajo y en detalle en la Patente de E.U. No. 11/021,618, titulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada en Diciembre 23 de 2004. En algunos de estos procesos, las células pluripotentes utilizadas como material de inicio son células progenitoras. En ciertos procesos, los cultivos celulares de endodermo definitivo y las poblaciones celulares enriquecidas que comprenden células de endodermo definitivo se producen a partir de células progenitoras embriónicas. Como se utiliza en la presente, "embriónico" se refiere a un rango de etapas de desarrollo de un organismo comenzando con un solo zigoto y finalizando con una estructura multicelular que ya no comprende células pluripotentes o totipotentes diferentes a las células gaméticas desarrolladas. Adicionalmente a los embriones derivados por fusión de gameto, el término "embriónico" se refiere a embriones derivados por transferencia somática nuclear celular. Un método preferido para derivar células de endodermo definitivo utiliza células progenitoras embriónicas humanas como material de inicio para la producción de endodermo definitivo. Tales células pluripotentes pueden ser células que se originan de la mórula, masa celular interna embriónica o aquellas obtenidas de bordes gonadales embriónicos. Las células progenitoras embriónicas humanas pueden mantenerse en cultivo en un estado pluripotente sin diferenciación sustancial utilizando métodos conocidos en la técnica. Tales métodos se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926, 5,843,780, 6, 200, 806 y 6, 251, 671. En algunos procesos para la producción de células de endodermo definitivo, se mantienen hESCs en una capa de alimentador. En tales procesos, puede utilizarse cualquier capa de alimentador que permita mantener las hESCs en un estado pluripotente. Una capa de alimentador comúnmente utilizada para el cultivo de células progenitoras embriónicas humanas es una capa de fibroblastos de ratón. Más recientemente, se han desarrollado capas de alimentador de fibroblasto humano para su uso en el cultivo de hESCs (ver, Solicitud de Patente de E.U. No. 2002/0072117). Los procesos alternativos para producir endodermo definitivo permiten mantener la hESC pluripotente sin el uso de una capa de alimentador. Los métodos para mantener las hESCs pluripotentes bajo condiciones libres de alimentador se han descrito en la Solicitud de Patente de E.U. No. 2003/0175956. Las células progenitoras embriónicas humanas utilizadas en la presente pueden mantenerse en cultivo ya sea con o sin suero. En algunos procedimientos de mantenimiento de células progenitoras embriónicas, se utiliza reemplazo de suero. En otros, se utilizan técnicas de cultivo libres de suero, tales como las descritas en la Solicitud de Patente de E.U. No. 2003/0190748. Las células progenitoras se mantienen en cultivo en un estado pluripotente mediante pasos de rutina hasta que se desea diferenciarlas en endodermo definitivo. En algunos procesos, la diferenciación a endodermo definitivo se logra proporcionando al cultivo de célula progenitora un factor de crecimiento de la superfamilia TGFß en una cantidad suficiente para promover la diferenciación a endodermo definitivo. Los factores de crecimiento de la superfamilia TGFß que son útiles para la producción de endodermo definitivo se seleccionan de los subgrupos nodal/activina o BMP. En algunos procesos de diferenciación preferidos, el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de Nodal, activina A, activina B y BMP4. Adicionalmente, el factor de crecimiento Wnt3a y otros miembros de la familia Wnt son útiles para la producción de células de endodermo definitivo. En ciertos procesos de diferenciación, pueden utilizarse combinaciones de cualquiera de los factores de crecimiento antes mencionados. Con respecto a algunos de los procesos para la diferenciación de células progenitoras pluripotentes a células de endodermo definitivo, se proporcionan los factores de crecimiento antes mencionados a las células de manera que los factores de crecimiento se encuentran presentes en los cultivos en concentraciones suficientes para promover la diferenciación de al menos una porción de las células progenitoras a células de endodermo definitivo. En algunos procesos, los factores de crecimiento antes mencionados se encuentran presentes en el cultivo celular a una concentración de al menos aproximadamente 5 ng/ml, al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 25 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 75 ng/ml, al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 200 ng/ml, al menos aproximadamente 300 ng/ml, al menos aproximadamente 400 ng/ml, al menos aproximadamente 500 ng/ml, al menos aproximadamente 1000 ng/ml, al menos aproximadamente 2000 ng/ml, al menos aproximadamente 3000 ng/ml, al menos aproximadamente 4000 ng/ml, al menos aproximadamente 5000 ng/ml o más de aproximadamente 5000 ng/ml. En ciertos procesos para la diferenciación de células progenitoras pluripotentes a células de endodermo definitivo, los factores de crecimiento antes mencionados se retiran del cultivo celular subsecuente a su adición. Por ejemplo, los factores de crecimiento pueden retirarse dentro de aproximadamente un día, aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro días, aproximadamente cinco días, aproximadamente seis días, aproximadamente siete días, aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días o aproximadamente diez días después de su adición. En un proceso preferido, los factores de crecimiento se retiran aproximadamente cuatro días después de la adición. Los cultivos de células de endodermo definitivo pueden cultivarse en un medio que contiene suero reducido o sin suero. Bajo ciertas condiciones de cultivo, las concentraciones de suero pueden variar de aproximadamente 0.05% v/v a aproximadamente 20% v/v. Por ejemplo, en algunos procesos de diferenciación, la concentración de suero del medio puede ser menor que aproximadamente 0.05% (v/v), menor que aproximadamente 0.1% (v/v), menor que aproximadamente 0.2% (v/v), menor que aproximadamente 0.3% (v/v), menor que aproximadamente 0.4% (v/v), menor que aproximadamente 0.5% (v/v), menor que aproximadamente 0.6% (v/v), menor que aproximadamente 0.7% (v/v), menor que aproximadamente 0.8% (v/v), menor que aproximadamente 0.9% (v/v), menor que aproximadamente 1% (v/v) , menor que aproximadamente 2% (v/v) , menor que aproximadamente 3% (v/v) , menor que aproximadamente 4% (v/v) , menor que aproximadamente 5% (v/v) , menor que aproximadamente 6% (v/v) , menor que aproximadamente 7% (v/v) , menor que aproximadamente 8% (v/v) , menor que aproximadamente 9% (v/v) , menor que aproximadamente 10% (v/v) , menor que aproximadamente 15% (v/v) o menor que aproximadamente 20% (v/v) . En algunos procesos, las células de endodermo definitivo se cultivan sin suero o con reemplazo de suero. Aún en otros procesos, las células de endodermo definitivo se cultivan en presencia de B27. En tales procesos, la concentración del suplemento B27 puede variar de aproximadamente 0.1% v/v a aproximadamente 20% v/v. MONITOREO DE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS PLURIPOTENTES A ENDODERMO DEFINITIVO PDX1-NEGATIVO (ENDODERMO DEFINITIVO) El progreso del cultivo de hESC a endodermo definitivo puede monitorearse determinando la expresión de marcadores característicos de endodermo definitivo. En algunos procesos, la expresión de ciertos marcadores se determina detectando la presencia o ausencia del marcador. Alternativamente, la expresión de ciertos marcadores puede determinarse midiendo el nivel al cual el marcador se encuentra presente en las células del cultivo celular o población celular. En tales procesos, la medición de la expresión del marcador puede ser cualitativa o cuantitativa. Un método para cuantificar la expresión de marcadores que se producen por genes marcadores se realiza a través del uso de PCR cuantitativa (Q-PCR) . Los métodos para llevar a cabo la Q-PCR son muy conocidos en la técnica. También pueden utilizarse otros métodos conocidos en la técnica para cuantificar la expresión del gen marcador. Por ejemplo, la expresión de un gen marcador puede detectarse utilizando anticuerpos específicos para el producto del gen marcador de interés. En ciertos procesos, se determina la expresión de genes marcadores característicos de endodermo definitivo así como la falta de expresión significativa de genes marcadores característicos de hESCs y otros tipos celulares. Como se describe más adelante en los Ejemplos abajo, un marcador confiable de endodermo definitivo es el gen SOX17. Por tanto, las células de endodermo definitivo producidas mediante los procesos descritos en la presente, expresan el gen marcador SOX17, produciendo así el producto del gen SOX17. Otros marcadores de endodermo definitivo son MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, F0XQ1, CMKOR1 y CRIP1. Dado que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador S0X17 a un nivel más alto que el del gen marcador S0X7, que es característico de endodermo primitivo y visceral (ver Tabla 1) , en algunos procesos, se monitorea la expresión canto de S0X17 como de S0X7. En otros procesos, se monitorea la expresión tanto del gen marcador S0X17 como del gen marcador 0CT4, que es característico de hESCs. Adicionalmente, debido a que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador SOX17 a un nivel mayor que el de los genes marcadores AFP, SPARC o trombomodulina (TM) , también puede monitorearse la expresión de estos genes. Otro marcador de endodermo definitivo es el gen CXCR4. El gen CXCR4 codifica para un receptor quimiosina de superficie celular cuyo ligante es el quimioatrayente SDF-1. Se cree que los papeles principales de las células portadoras del receptor CXCR4 en el adulto son la migración de células hematopoyéticas a la médula espinal, el tráfico de linfocitos y la diferenciación de varias células B y linajes celulares sanguíneos macrófagos [Kim, C, y Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol., 65, 6-15 (1999)]. El receptor CXCR4 funciona también como un co-receptor para la entrada de HIV-1 en células T [Feng, Y., et al., Science, 272, 872-877 (1996)]. En una extensa serie de estudios realizados por McGrath, K. E., et al., Dev. Biology 213, 442-456 (1999), la expresión del receptor quimiosina CXCR4 y su único ligante, SDF-1 [Kim, C, y Broxymer, H. J. Leukocyte Biol., 65, 6-15 (1999)], se delineó durante el desarrollo temprano y la vida adulta en el ratón. La interacción CXCR4/SDF1 en el desarrollo se hizo aparente cuando se demostró que su cualquier gen se fractura en ratones transgénicos [Nagasawa et al., Nature, 382, 635-638 (1996)], Ma, Q., et al., Immunity, 10, 463-471 (1999)] da como resultado mortalidad embriónica tardía. McGrath et al., demostraron que CXCR4 es el ARN mensajero receptor de quimiosina más abundante detectado durante la gastrulación temprana de embriones (E7.5) utilizando una combinación de metodologías de protección RNasa e hibridación in situ. En el embrión en gastrulación , la señalización CXCR4/SDF-1 parece encontrarse implicada principalmente en la inducción de la migración de células de capa germinal de línea primitiva y se expresa en endodermo definitivo, mesodermo y mesodermo extraembriónico presentes en este momento. En embriones de ratón E7.2-7.8, CXCR4 y alfa-fetoproteína son mutuamente exclusivos indicando una falta de expresión en endodermo visceral [McGrath, K. E., et al., Dev. Biology 213, 442-456 (1999) ] . Dado que las células de endodermo definitivo producidas diferenciando células pluripotentes expresan el gen marcador CXCR4, la expresión de CXCR4 puede monitorearse a fin de rastrear la producción de células de endodermo definitivo. Adicionalmente, las células de endodermo definitivo producidas por los métodos descritos en la presente expresan otros marcadores de endodermo definitivo incluyendo, pero sin limitarse a, S0X17, MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, F0XQ1, CMK0R1 y CRIP1. Dado que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador CXCR4 a un nivel mayor que el del gen marcador S0X7, puede monitorearse la expresión tanto de CXCR4 como de S0X7. En otros procesos, se monitorea la expresión tanto del gen marcador CXCR4 como del gen marcador OCT4. Adicionalmente, debido a que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador CXCR4 a un nivel mayor que el de los genes marcadores AFP, SPARC o trombomodulina (TM) , también puede monitorearse la expresión de estos genes. Se apreciará que la expresión de CXCR4 en células endodérmicas no impide la expresión de SOX17. En consecuencia, las células de endodermo definitivo producidas mediante los procesos descritos en la presente expresarán sustancialmente SOX17 y CXCR4 pero no expresarán sustancialmente AFP, TM, SPARC o PDXl. ENRIQUECIMIENTO, AISLAMIENTO Y/O PURIFICACIÓN DE ENDODERMO DEFINITIVO Las células de endodermo definitivo producidas mediante cualquiera de los procesos antes descritos pueden enriquecerse, aislarse y/o purificarse utilizando una marca de afinidad específica para tales células. Ejemplos de marcas de afinidad específicas para células de endodermo definitivo son anticuerpos, ligantes u otros agentes de unión que son específicos para una molécula marcadora, tal como un polipéptido, que se encuentra presente en la superficie celular de células de endodermo definitivo, pero que no se encuentra sustancialmente presente en otros tipos celulares que se encontrarían en un cultivo celular producido mediante los métodos descritos en la presente. En algunos procesos, se utiliza un anticuerpo que se une a CXCR4 como marca de afinidad para el enriquecimiento, aislamiento o purificación de células de endodermo definitivo. En otros procesos, también puede utilizarse SDF-1 quimiosina u otras moléculas a base de SDF-1 como marcas de afinidad. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, fragmentos SDF-1, fusiones SDF-1 o miméticos SDF-1. Los métodos para elaborar anticuerpos y utilizarlos para aislamiento de células se conocen en la técnica y tales métodos pueden implementarse para su uso con los anticuerpos y células de endodermo definitivo descritos en la presente. En un proceso, un anticuerpo que se une a CXCR4 se une a una perla magnética y después se deja unir a células de endodermo definitivo en un cultivo celular que se ha tratado enzimáticamente para reducir la adhesión intercelular y de sustrato. Los complejos de célula/anticuerpo/perla se exponen entonces a un campo magnético móvil que se utiliza para separar las células de endodermo definitivo unidas a perlas de las células no unidas. Una vez que las células de endodermo definitivo se separan físicamente de otras células en cultivo, la unión de anticuerpo se fractura y las células se re-emplacan en un medio de cultivo de tejido apropiado. También pueden utilizarse métodos adicionales para obtener cultivos o poblaciones celulares de endodermo definitivo enriquecidos, aislados o purificados. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo CXCR4 se incuba con un cultivo celular que contiene endodermo definitivo que se ha tratado para reducir la adhesión intercelular y de sustrato. Las células se lavan entonces, se centrifugan y se resuspenden. La suspensión celular se incuba entonces con un anticuerpo secundario, tal como un anticuerpo conjugado a FITC que es capaz de unirse al anticuerpo primario. Las células se lavan entonces, se centrifugan y se resuspenden en amortiguador. La suspensión celular se analiza entonces y se selecciona utilizando un seleccionador celular activado por fluorescencia (FACS) . Las células CXCR4-positivas se colectan por separado a partir de células CXCR4-negativas, dando como resultado el aislamiento de tales tipos celulares. Si se desea, las composiciones celulares aisladas pueden purificarse adicionalmente utilizando un método alterno en base a afinidad o mediante rondas adicionales de selección utilizando los mismos o diferentes marcadores específicos para endodermo definitivo. Aún en otros procesos, las células de endodermo definitivo se enriquecen, se aislan y/o se purifican utilizando un ligante u otros molécula que se une a CXCR4.
En algunos procesos, la molécula es SDF-1 o un fragmento, fusión o mimético del mismo. En procesos preferidos, las células de endodermo definitivo se enriquecen, se aislan y/o se purifican a partir de otras células de endodermo no definitivo después de inducir los cultivos de célula progenitora se diferencian hacia el linaje de endodermo definitivo. Se apreciará que los procedimientos de enriquecimiento, aislamiento y purificación antes descritos pueden utilizarse con tales cultivos en cualquier etapa de diferenciación. Adicionalmente a los procesos recientemente descritos, las células de endodermo definitivo pueden aislarse también mediante otras técnicas para aislamiento celular. Adicionalmente, las células de endodermo definitivo también pueden enriquecerse o aislarse mediante métodos de subcultivo en serie en condiciones de crecimiento que promueven la supervivencia selectiva o la expansión selectiva de las células de endodermo definitivo. Utilizando los métodos descritos en la presente, las poblaciones enriquecidas, aisladas y/o purificadas de células y/o tejidos de endodermo definitivo pueden producirse in vitro a partir de cultivos celulares o poblaciones celulares pluripotentes, tales como los cultivos o poblaciones de células progenitoras, que han experimentado al menos alguna diferenciación. En algunos métodos, las células experimentan diferenciación aleatoria. Sin embargo, en un método preferido, las células se dirigen para diferenciarse principalmente en endodermo definitivo. Algunos métodos preferidos de enriquecimiento, aislamiento y/o purificación se refieren a la producción in vitro de endodermo definitivo a partir de células progenitoras embriónicas. Utilizando los métodos descritos en la presente, pueden enriquecerse poblaciones celulares o cultivos celulares en el contenido de endodermo definitivo por al menos aproximadamente 2 a aproximadamente 1000 veces en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN ENDODERMO DEFINITIVO PDX1-NEGATIVO (ENDODERMO DEFINITIVO) Las composiciones celulares producidas por los métodos antes descritos incluyen cultivos celulares que comprenden endodermo definitivo y poblaciones celulares enriquecidas en endodermo definitivo. Por ejemplo, pueden producirse cultivos celulares que comprenden células de endodermo definitivo, en donde al menos aproximadamente 50-80% de las células en el cultivo son células de endodermo definitivo. Debido a que la eficiencia del proceso de diferenciación puede ajustarse modificando ciertos parámetros, que incluyen pero no se limitan a, condiciones de crecimiento celular, concentraciones del factor de crecimiento y el cronometraje de las etapas de cultivo, los procedimientos de diferenciación descritos en la presente pueden dar como resultado aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de aproximadamente 95% en la conversión de células pluripotentes a endodermo definitivo. En procesos en los cuales se emplea el aislamiento de células de endodermo definitivo, por ejemplo, utilizando un reactivo de afinidad que se une al receptor CXCR4, puede recuperarse una población celular de endodermo definitivo sustancialmente pura. PRODUCCIÓN DE ENDODERMO PDX1-POSITIVO DEL TUBO DIGESTIVO ANTERIOR A PARTIR DE ENDODERMO DEFINITIVO PDX1-NEGATIVO Los cultivos celulares de endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior y poblaciones que comprenden las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior descritas en la presente, se producen a partir de endodermo definitivo PDXl-negativo, que se genera de células pluripotentes como se describió anteriormente. Un método preferido utiliza células progenitoras embriónicas humanas como material de inicio. En una modalidad, las hESCs se convierten primero en células de endodermo definitivo PDX1-negativo que después se convierten en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Sin embargo, se apreciará que los materiales de inicio para la producción de endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior no se limitan a las células de endodermo definitivo producido utilizando métodos de diferenciación de células pluripotentes. Por el contrario, cualquier célula de endodermo definitivo PDXl-negativo puede utilizarse en los métodos descritos en la presente sin tomar en cuenta su origen. En algunas modalidades de la presente invención, los cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden células de endodermo definitivo PDXl-negativo pueden utilizarse para diferenciación adicional a cultivos celulares y/o poblaciones celulares enriquecidas que comprenden células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Por ejemplo, puede utilizarse un cultivo celular o población celular que comprende células de endodermo definitivo humanas PDXl-negativo, SOX17-positivas . En algunas modalidades, el cultivo celular o población celular puede comprender también factores de diferenciación, tales como activinas, nodales y/o BMPs, que permanecen de la etapa de diferenciación previa (es decir, la etapa de diferenciación de células pluripotentes a células de endodermo definitivo) . En otras modalidades, los factores utilizados en la etapa de diferenciación previa se retiran del cultivo celular o población celular previo a la adición de factores utilizados para la diferenciación de las células de endodermo definitivo PDXl-negativo, S0X17-positivas a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. En otras modalidades, se utilizan poblaciones celulares enriquecidas con células de endodermo celular PDXl-negativo, SOX17-positivas como una fuente para la producción de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Las células de endodermo definitivo PDXl-negativo en cultivo se diferencian de las células endodérmicas PDXl-positivo proporcionando, a un cultivo celular que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo, SOX17-positivas, un factor de diferenciación que promueve la diferenciación de las células a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior (factor de diferenciación de tubo digestivo anterior) . En algunas modalidades de la presente invención, el factor de diferenciación de tubo digestivo anterior es retonoide, tal como ácido retinoico (RA) . En algunas modalidades, el retinoide se utiliza en conjunción con un factor de crecimiento de fibroblasto, tal como FGF-4 o FGF-10. En otras modalidades, el retinoide se utiliza en conjunción con un miembro de la superfamilia TGFß de factores de crecimiento y/o un medio acondicionado. Por "medio acondicionado" se entiende un medio alterado en comparación con un medio base. Por ejemplo, el acondicionamiento de un medio puede ocasionar que se agreguen o se agoten moléculas tales como nutrientes y/o factores de crecimiento de los niveles originales encontrados en el medio de base. En algunas modalidades, un medio se acondiciona permitiendo el crecimiento de células de ciertos tipos o el mantenimiento en el medio bajo ciertas condiciones durante un cierto período de tiempo. Por ejemplo, un medio puede acondicionarse permitiendo la expansión, diferenciación o mantenimiento de las hESCs en un medio de composición definida a una temperatura definida durante un número de horas definido. Como se apreciará por los expertos en la técnica, pueden utilizarse numerosas combinaciones de células, tipos de medio, duraciones y condiciones ambientales para producir una disposición casi infinita de medios acondicionados. En algunas modalidades de la presente invención, un medio se acondiciona permitiendo el crecimiento o mantenimiento de células pluripotentes diferenciadas en un medio que comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de concentración de suero. En otras modalidades un medio se acondiciona permitiendo el crecimiento o mantenimiento de células pluripotentes diferenciadas en un medio que comprende de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml de activina A. Aún en otras modalidades un medio se acondiciona permitiendo el crecimiento o mantenimiento de células pluripotentes diferenciadas en un medio que comprende de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml de BMP4. En una modalidad preferida, se prepara un medio acondicionado permitiendo el crecimiento o mantenimiento de las hESCs diferenciadas durante 24 horas en un medio, tal como RPMI, comprendiendo aproximadamente 25 ng/ml de activina A y aproximadamente 2 µM de RA. En algunas modalidades de la presente invención, las células utilizadas para acondicionar el medio, que se utilizan para aumentar la diferenciación de endodermo definitivo PDXl-negativo a endodermo PDXl-positivo de tubo digestivo anterior, son células diferenciadas de células pluripotentes, tales como hESCs, durante un período de aproximadamente 5 días en un medio tal como RPMI que comprenden aproximadamente 9% a aproximadamente 20% de suero y/o uno o más factores de crecimiento/diferenciación de la superfamilia TGFß. Los factores de diferenciación, tales como activina A y BMP4 se suministran en concentraciones que varían de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En ciertas modalidades de la presente invención, las células utilizadas para acondicionar el medio se diferencian de las hESCs durante un período de aproximadamente 5 días en RPMI bajo en suero. De acuerdo con algunas modalidades, RPMI bajo en suero se refiere a un medio que contiene bajo suero, en donde la concentración de suero aumenta gradualmente durante un período de tiempo definido. Por ejemplo, en una modalidad, el RPMI de bajo suero comprende una concentración de suero fetal bovino a aproximadamente 0.2% (FBS) en el primer día de crecimiento celular, FBS al 0.5% a aproximadamente 0.5% en el segundo día del crecimiento celular y FBS a aproximadamente 2% en el tercero a quinto día del crecimiento celular. En otra modalidad, el RPMI bajo en suero comprende una concentración de aproximadamente 0% en el día uno, aproximadamente 0.2% en el día dos y aproximadamente 2% en los días 3-6. En ciertas modalidades preferidas, el RPMI bajo en suero se suplementa con uno o más factores de diferenciación, tales como activina A y BMP4. Adicionalmente a su uso para preparar las células utilizadas para acondicionar el medio, el RPMI bajo en suero puede utilizarse como un medio para la diferenciación de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior a partir de células de endodermo definitivo PDXl-negativo. Se apreciará por los de experiencia ordinaria en la técnica que el medio acondicionado puede prepararse a partir de medios diferentes a RPMI siempre que tal medio no interfiera con el crecimiento o mantenimiento de las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. También se apreciará que las células utilizadas para acondicionar el medio pueden ser de diversos tipos. En modalidades en donde se utilizan células recién diferenciadas para acondicionar un medio, tales células pueden diferenciarse en un medio diferente a RPMI siempre que el medio no inhiba el crecimiento o mantenimiento de tales células. Además, el técnico experto apreciará que no se requiere que la duración del acondicionamiento y la duración de la preparación de las células utilizadas sea de 24 horas o 5 días, respectivamente, dado que otros períodos de tiempo serán suficientes para lograr los efectos reportados en la presente . En general, el uso de un retinoide en combinación con un factor de crecimiento de fibroblasto, un miembro de la superfamilia TGFß de factores de crecimiento, un medio acondicionado o una combinación de cualquiera de estos factores de diferenciación de tubo digestivo anterior ocasiona mayor diferenciación de endodermo definitivo PDX1-negativo a endodermo PDXl-positivo del tubo digestivo anterior, que el uso de un retinoide solo. En una modalidad preferida, tanto RA como FGF-10 se proporcionan al cultivo celular de endodermo definitivo PDXl-negativo. En otra modalidad preferida, se diferencian las células de endodermo definitivo PDXl-negativo en un cultivo que comprende un medio acondicionado, activina A, activina B y RA. Con respecto a algunas de las modalidades de procesos de diferenciación descritas en la presente, los factores de diferenciación de tubo digestivo anterior antes mencionados se proporcionan a las células de manera que estos factores se encuentran presentes en el cultivo celular o en la población celular en concentraciones suficientes para promover la diferenciación a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Cuando se utiliza en conexión con cultivos celulares y/o poblaciones celulares, el término "porción" significa cualquier cantidad no de cero del cultivo celular o población celular, que varía desde una sola célula hasta la totalidad del cultivo celular o población celular . En algunas , modalidades de la presente invención, se proporciona un retinoide a las células de un cultivo celular de manera que se encuentra presente en una concentración de al menos aproximadamente 0.01 µM, al menos aproximadamente 0.02 µM, al menos aproximadamente 0.04 µM, al menos aproximadamente 0.08 µM, al menos aproximadamente 0.1 µM, al menos aproximadamente 0.2 µM, al menos aproximadamente 0.3 µM, al menos aproximadamente 0.4 µM, al menos aproximadamente 0.5 µM, al menos aproximadamente 0.6 µM, al menos aproximadamente 0.7 µM, al menos aproximadamente 0.8 µM, al menos aproximadamente 0.9 µM, al menos aproximadamente 1 µM, al menos aproximadamente 1.1 µM, al menos aproximadamente 1.2 µM, al menos aproximadamente 1.3 µM, al menos aproximadamente 1.4 µM, al menos aproximadamente 1.5 µM, al menos aproximadamente 1.6 µM, al menos aproximadamente 1.7 µM, al menos aproximadamente 1.8 µM, al menos aproximadamente 1.9 µM, al menos aproximadamente 2 µM, al menos aproximadamente 2.1 µM, al menos aproximadamente 2.2 µM, al menos aproximadamente 2.3 µM, al menos aproximadamente 2.4 µM, al menos aproximadamente 2.5 µM, al menos aproximadamente 2.6 µM, al menos aproximadamente 2.7 µM, al menos aproximadamente 2.8 µM, al menos aproximadamente 2.9 µM, al menos aproximadamente 3 µM, al menos aproximadamente 3.5 µM, al menos aproximadamente 4 µM, al menos aproximadamente 4.5 µM, al menos aproximadamente 5 µM, al menos aproximadamente 10 µM, al menos aproximadamente 20 µM, al menos aproximadamente 30 µM, al menos aproximadamente 40 µM o al menos aproximadamente 50 µM. Como se utiliza en la presente, "retinoide" se refiere a retinol, retinal o ácido retinoico así como a derivados de cualquiera de estos compuestos. En una modalidad preferida, el retinoide es ácido retinoico. En otras modalidades de la presente invención, uno o más factores de diferenciación de la familia del factor de crecimiento de fibroblasto se encuentran presentes en el cultivo celular. Por ejemplo, en algunas modalidades, FGF-4 puede encontrarse presente en el cultivo celular a una concentración de al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 25 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 75 ng/ml, al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 200 ng/ml, al menos aproximadamente 300 ng/ml, al menos aproximadamente 400 ng/ml, al menos aproximadamente 500 ng/ml o al menos aproximadamente 1000 ng/ml. En modalidades adicionales de la presente invención, FGF-10 se encuentra presente en el cultivo celular en una concentración de al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 25 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 75 ng/ml, al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 200 ng/ml, al menos aproximadamente 300 ng/ml, al menos aproximadamente 400 ng/ml, al menos aproximadamente 500 ng/ml o al menos aproximadamente 1000 ng/ml. En algunas modalidades ya sea FGF-4 o FGF-10, pero no ambos, se proporciona al cultivo celular conjuntamente con RA. En una modalidad preferida, RA se encuentra presente en el cultivo celular a 1 µM y FGF-10 se encuentra presente a una concentración de 50 ng/ml. En algunas modalidades de la presente invención, los factores de crecimiento de la superfamilia TGFß y/o el medio acondicionado se encuentran presentes en el cultivo celular. Los factores de diferenciación pueden utilizarse en combinación con RA y/o otros factores de diferenciación del tubo digestivo medio-anterior incluyendo, pero sin limitarse a, FGF-4 y FGF-10. Por ejemplo, en algunas modalidades, activina A y/o activina B pueden encontrarse presentes en el cultivo celular a una concentración de al menos aproximadamente 5 ng/ml, al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 25 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 75 ng/ml, al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 200 ng/ml, al menos aproximadamente 300 ng/ml, al menos aproximadamente 400 ng/ml, al menos aproximadamente 500 ng/ml o al menos aproximadamente 1000 ng/ml. En modalidades adicionales de la presente invención, un medio acondicionado se encuentra presente en el cultivo celular en una concentración de al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 100% del medio total. En algunas modalidades, activina A, activina B y un medio acondicionado se proporcionan al cultivo celular conjuntamente con RA. En una modalidad preferida, las células de endodermo definitivo PDXl-negativo se diferencian a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior en cultivos que comprenden aproximadamente 1 µM de RA, aproximadamente 25 ng/ml de activina A y medio RPMI bajo en suero que se ha acondicionado durante aproximadamente 24 horas mediante hESCs diferenciadas, en donde las hESCs diferenciadas se han diferenciado durante aproximadamente 5 días en RPMI bajo en suero comprendiendo 100 ng/ml de activina A. en otra modalidad preferida, activina A y/o FGF-10 se encuentran también presentes en el cultivo a 25 ng/ml y 50 ng/ml, respectivamente . En ciertas modalidades de la presente invención, los factores de diferenciación de tubo digestivo anterior se retiran del cultivo celular subsecuente a su adición. Por ejemplo, los factores de diferenciación del tubo digestivo anterior pueden retirarse dentro de aproximadamente un día, aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro días, aproximadamente cinco días, aproximadamente seis días, aproximadamente siete días, aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días o aproximadamente diez días después de su adición. Los cultivos de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden cultivarse en un medio que contiene suero reducido. Las concentraciones de suero pueden variar de aproximadamente 0.05% (v/v) hasta aproximadamente 20% (v/v) . En algunas modalidades las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se cultivan con reemplazo de suero. Por ejemplo, en ciertas modalidades la concentración de suero del medio puede ser menor que aproximadamente 0.05% (v/v), menor que aproximadamente 0.1% (v/v), menor que aproximadamente 0.2% (v/v), menor que aproximadamente 0.3% (v/v), menor que aproximadamente 0.4% (v/v), menor que aproximadamente 0.5% (v/v), menor que aproximadamente 0.6% (v/v), menor que aproximadamente 0.7% (v/v), menor que aproximadamente 0.8% (v/v), menor que aproximadamente 0.9% (v/v), menor que aproximadamente 1% (v/v) , menor que aproximadamente 2% (v/v) , menor que aproximadamente 3% (v/v) , menor que aproximadamente 4% (v/v) , menor que aproximadamente 5% (v/v) , menor que aproximadamente 6% (v/v) , menor que aproximadamente 7% (v/v) , menor que aproximadamente 8% (v/v) , menor que aproximadamente 9% (v/v) , menor que aproximadamente 10% (v/v) , menor que aproximadamente 15% (v/v) o menor que aproximadamente 20% (v/v) . En algunas modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se cultivan sin suero. En otras modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se cultivan con reemplazo de suero.
Aún en otras modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se cultivan en presencia de B27. En tales modalidades, puede proporcionarse B27 al medio de cultivo en concentraciones que varían de aproximadamente 0.1% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v) o en concentraciones mayores que aproximadamente 20% (v/v) . En ciertas modalidades, la concentración de B27 en el medio es de aproximadamente 0.1% (v/v), aproximadamente 0.2% (v/v), aproximadamente 0.3% (v/v), aproximadamente 0.4% (v/v), aproximadamente 0.5% (v/v), aproximadamente 0.6% (v/v), aproximadamente 0.7% (v/v), aproximadamente 0.8% (v/v), aproximadamente 0 D..99%% ( v/v ) , aproximadamente 1 % ( v/v) , aproximadamente 2 % ( v/v ) , aproximadamente 3% ( v/v) , aproximadamente 4 % ( v/v ) , aproximadamente 5% ( v/v) , aproximadamente 6% ( v/v ) , aproximadamente 7 % (v/v) , aproximadamente 8% (v/v ) , aproximadamente 9% (v/v) , aproximadamente 10% (v/v) , aproximadamente 15% (v/v) o aproximadamente 20% (v/v) . Alternativamente, la concentración del suplemento B27 agregado puede medirse en términos de múltiplos de la resistencia de una solución de reserva de B27 comercialmente disponible. Por ejemplo B27 se encuentra disponible de Invitrogen (Carlsbad, CA) como una solución de reserva de 50X. La adición de una cantidad suficiente de esta solución de reserva a un volumen suficiente de medio de crecimiento produce un medio suplementado con la cantidad de B27 deseada. Por ejemplo, la adición de 10 ml de solución de reserva de 50X de B27 a 90 ml de medio de crecimiento produce un medio de crecimiento suplementado con 5X de B27. La concentración de suplemento B27 en el medio puede ser de aproximadamente 0.1X, aproximadamente 0.2X, aproximadamente 0.3X, aproximadamente 0.4X, aproximadamente 0.5X, aproximadamente 0.6X, aproximadamente 0.7X, aproximadamente 0.8X, aproximadamente 0.9X, aproximadamente IX, aproximadamente 1.1X, aproximadamente 1.2X, aproximadamente 1.3X, aproximadamente 1.4X, aproximadamente 1.5X, aproximadamente 1.6X, aproximadamente 1.7X, aproximadamente 1.8X, aproximadamente 1.9X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2.5X, aproximadamente 3X, aproximadamente 3.5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4.5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X, aproximadamente 11X, aproximadamente 12X, aproximadamente 13X, aproximadamente 14X, aproximadamente 15X, aproximadamente 16X, aproximadamente 17X, aproximadamente 18X, aproximadamente 19X, aproximadamente 20X y mayor que aproximadamente 20X. MONITOREO DE LA DIFERENCIACIÓN DE ENDODERMO DEFINITIVO PDX1-NEGATIVO A ENDODERMO PDXl-POSITIVO Como con la diferenciación de células de endodermo definitivo a partir de células pluripotentes, el progreso de diferenciación de endodermo definitivo de PDXl-negativo, S0X17-positivo a endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo puede monitorearse determinando la expresión de marcadores característicos de estos tipos celulares. Tal monitoreo permite determinar la cantidad de tiempo suficiente para la producción de una cantidad deseada de endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo bajo varias condiciones, por ejemplo, una o más concentraciones de factor de diferenciación y condiciones ambientales. En modalidades preferidas, la cantidad de tiempo suficiente para la producción de una cantidad deseada de endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo se determina detectando la expresión de PDXl. En algunas modalidades de la presente invención, la expresión de ciertos marcadores se determina detectando la presencia o ausencia del marcador. Alternativamente, la expresión de ciertos marcadores puede determinarse midiendo el nivel al cual el marcador se encuentra presente en las células del cultivo celular o población celular. En tales modalidades, la medición de la expresión puede ser cualitativa o cuantitativa. Como se describió anteriormente, un método preferido para cuantificar los marcadores de expresión que se producen por genes marcadores es a través del uso de Q-PCR. En modalidades particulares, se utiliza Q-PCR para monitorear el progreso de células del cultivo de endodermo definitivo de PDXl-negativo, S0X17-positivo a células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior cuantificando la expresión de genes marcadores característicos de endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo y la falta de expresión de los genes marcadores característicos de otros tipos celulares. También pueden utilizarse otros métodos conocidos en la técnica para cuantificar la expresión del gen marcador. Por ejemplo, la expresión de un producto de gen marcador puede detectarse utilizando anticuerpos específicos para el producto de gen marcador de interés. En algunas modalidades de la presente invención, se determina la expresión de genes marcadores característicos de endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo así como la falta de una expresión significativa de genes marcadores característicos de endodermo definitivo PDXl-negativo, hESCs y otros tipos celulares . Como se describe adicionalmente en los Ejemplos abajo, PDXl es un gen marcador asociado con endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo. En consecuencia, en algunas modalidades de la presente invención, se determina la expresión de PDXl. En otras modalidades se determina también la expresión de otros marcadores que se expresan en endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo, incluyendo, pero sin limitarse a SOX17, HOXA13 y/o HOXC6. Dado que PDXl también puede expresarse por otros ciertos tipos celulares (es decir, endodermo visceral y cierto ectodermo neural), algunas modalidades de la presente invención se refieren a la demostración de la ausencia o sustancial ausencia de expresión del gen marcados asociado con endodermo visceral y/o ectodermo neural. Por ejemplo, en algunas modalidades, se determina la expresión de marcadores que se expresan en endodermo visceral y/o células neurales, incluyendo, pero sin limitarse a, S0X7, AFP, S0X1, ZIC1 y/o NFM. En algunas modalidades, los cultivos de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior producidos mediante los métodos descritos en la presente se encuentran sustancialmente libres de células que expresan los genes marcadores SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 o NFM. En ciertas modalidades, los cultivos de células endodérmicas PDX1-positivo del tubo digestivo anterior producidos mediante los procesos descritos en la presente se encuentran sustancialmente libres de endodermo visceral, endodermo parietal y/o células neurales . ENRIQUECIMIENTO, AISLAMIENTO Y/O PURIFICACIÓN DE ENDODERMO DE TUBO DIGESTIVO ANTERIOR PDXl-POSITIVO Con respecto a aspectos adicionales de la presente invención, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden enriquecerse, aislarse y/o purificarse. En algunas modalidades de la presente invención, las poblaciones celulares enriquecidas por células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se producen aislando tales células de cultivos celulares. En algunas modalidades de la presente invención, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior se marcan con fluorescencia después se aislan as partir de células no marcadas utilizando un seleccionador celular activado por fluorescencia (FACS) . En tales modalidades, se utiliza un ácido nucleico que incluye proteína verde fluorescente (GFP) u otro ácido nucleico que codifica para un gen marcador fluorescente expresable para marcar células PDXl-positivo. Por ejemplo, en algunas modalidades, se introduce al menos una copia de un ácido nucleico que codifica para GFP o un fragmento biológicamente activo del mismo en una célula pluripotente, preferentemente una célula progenitora embriónica humana, aguas abajo del promotor PDXl de manera que la expresión del producto de gen GFP o su fragmento biológicamente activo se encuentra bajo el control del promotor PDXl. En algunas modalidades, la región de codificación completa del ácido nucleico, que codifica para PDXl, se reemplaza por un ácido nucleico que codifica para GFP o su fragmento biológicamente activo. En otras modalidades, el ácido nucleico que codifica para GFP o su fragmento biológicamente activo se fusiona en estructura con al menos una porción del ácido nucleico que codifica para PDXl, generando así una proteína de fusión. En tales modalidades, la proteína de fusión retiene una actividad fluorescente similar a GFP. Las células marcadas con fluorescencia, tales como las células pluripotentes antes descritas, se diferencian a endodermo definitivo y después a endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo como se describió previamente arriba. Debido a que las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior expresan el gen marcador fluorescente, mientras que las células PDXl-negativo no, estos dos tipos pueden separarse. En algunas modalidades, se seleccionan suspensiones celulares que comprenden una mezcla de células PDXl-positivo marcadas con fluorescencia y células PDX1-negativo no marcadas utilizando un FACS. Las células PDXl-positivo se colectan por separado de las células PDX1-negativo, dando así como resultado el aislamiento de tales tipos celulares. Si se desea, las composiciones aisladas pueden purificarse adicionalmente mediante rondas adicionales de selección utilizando el mismo o diferentes marcadores específicos para endodermo de tubo digestivo anterior PDX1-positivo. Adicionalmente a los procesos recientemente descritos, las células de endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo pueden aislarse también mediante otras técnicas para aislamiento celular. Adicionalmente, las células de tubo digestivo anterior PDXl-positivo también pueden enriquecerse o aislarse mediante métodos de subcultivo en serie en condiciones de crecimiento que promueven la supervivencia selectiva o la expansión selectiva de las células de endodermo de tubo digestivo anterior PDX1-positivo. Se apreciará que los procedimientos de enriquecimiento, aislamiento y purificación antes mencionados pueden utilizarse con tales cultivos en cualquier etapa de diferenciación. Utilizando los métodos descritos en la presente, las poblaciones enriquecidas, aisladas y/o purificadas de células y/o tejidos de endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo pueden producirse in vitro a partir de cultivos celulares o poblaciones celulares pluripotentes de endodermo definitivo PDXl-negativo, SOXl7-positivo, que han experimentado al menos alguna diferenciación. En algunas modalidades, las células experimentan diferenciación aleatoria. Sin embargo, en una modalidad preferida, las células se dirigen para diferenciarse principalmente en células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior. Algunos métodos preferidos de enriquecimiento, aislamiento y/o purificación se refieren a la producción in vitro de células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior a partir de células progenitoras embriónicas humanas.
Utilizando los métodos descritos en la presente, pueden enriquecerse poblaciones celulares o cultivos celulares en el contenido de células endodérmicas PDXl- positivo del tubo digestivo anterior por al menos aproximadamente 2 a aproximadamente 1000 veces en comparación ' con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. En algunas modalidades, las células endodérmicas PDXl- positivo del tubo digestivo anterior pueden enriquecerse por al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. En otras modalidades las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden enriquecerse de al menos aproximadamente 10 a aproximadamente 200 veces en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. Aún en otras modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden enriquecerse por al menos aproximadamente 20 a aproximadamente 100 veces en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. Aún en otras modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden enriquecerse por al menos aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. En ciertas modalidades, las células endodérmicas PDXl-positivo del tubo digestivo anterior pueden enriquecerse por al menos aproximadamente 2 a aproximadamente 20 veces en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares no tratados. COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN ENDODERMO DE TUBO DIGESTIVO ANTERIOR PDX1-POSITIVO Algunas modalidades de la presente invención se refieren a composiciones celulares tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células endodérmicas PDXl-positivo, en donde las células endodérmicas PDXl-positivo son células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo (endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo) . De acuerdo con ciertas modalidades, el endodermo de tubo digestivo anterior PDXl-positivo son células de mamífero, y en una modalidad preferida, las células de endodermo definitivo son células humanas . Otras modalidades de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células de uno o más tipos celulares seleccionadas del grupo que consiste de hESCs, células de endodermo definitivo PDXl-negativo, células endodérmicas PDXl-positivo de tubo digestivo anterior y células de mesodermo. En algunas modalidades, las hESCs comprenden menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3%, menos que aproximadamente 2%, o menos que aproximadamente 1%, del total de células en el cultivo. En otras modalidades las células de endodermo definitivo PDXl-negativo comprenden menos que aproximadamente 90%, menos que aproximadamente 85%, menos que aproximadamente 80%, menos que aproximadamente 75%, menos que aproximadamente 70%, menos que aproximadamente 65%, menos que aproximadamente 60%, menos que aproximadamente 55%, menos que aproximadamente 50%, menos que aproximadamente 45%, menos que aproximadamente 40%, menos que aproximadamente 35%, menos que aproximadamente 30%, menos que aproximadamente 25%, menos que aproximadamente 20%, menos que aproximadamente 15%, menos que aproximadamente 12%, menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 8%, menos que aproximadamente 6%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3%, menos que aproximadamente 2%, o menos que aproximadamente 1%, del total de células en el cultivo. Aún en otras modalidades, las células mesodérmicas comprenden menos que aproximadamente 90%, menos que aproximadamente 85%, menos que aproximadamente 80%, menos que aproximadamente 75%, menos que aproximadamente 70%, menos que aproximadamente 65%, menos que aproximadamente 60%, menos que aproximadamente 55%, menos que aproximadamente 50%, menos que aproximadamente 45%, menos que aproximadamente 40%, menos que aproximadamente 35%, menos que aproximadamente 30%, menos que aproximadamente 25%, menos que aproximadamente 20%, menos que aproximadamente 15%, menos que aproximadamente 12%, menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 8%, menos que aproximadamente 6%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3%, menos que aproximadamente 2%, o menos que aproximadamente 1%, del total de células en el cultivo . Las modalidades adicionales de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, producidas por los procesos descritos en la presente comprende Endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl como el tipo de células mayoritario. En algunas modalidades, los procesos descritos en la presente producen cultivos celulares y/o poblaciones celulares que comprenden al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 54%, al menos aproximadamente 53%, al menos aproximadamente 52% o al menos aproximadamente 51% de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En modalidades preferidas las células de los cultivos celulares o poblaciones celulares comprenden células humanas. En otras modalidades, los procesos descritos en la presente produce cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 24%, al menos aproximadamente 23%, al menos aproximadamente 22%, al menos aproximadamente 21%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 19%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 9%, al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 7%, al menos aproximadamente 6%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 4%, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente 1% de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En modalidades preferidas, las células de los cultivos celulares o poblaciones celulares comprenden células humanas. En algunas modalidades, el porcentaje de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl en los cultivos o poblaciones celulares se calcula sin importar las células del alimentador que permanecen en el cultivo. Aún otras modalidades de la presnete invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden ,ézclas de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl y células de endodermo definitivas negativas a PDXl. Por ejemplo, pueden producirse cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden al menos aproximadamente 5 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 95 células de endodermo definitivas negativas a PDXl. En otras modalidades, pueden producirse cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden al menos aproximadamente 95 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 5 células de endodermo definitivas negativas a PDXl. Adicionalmente, se contemplan los cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden otras proporciones de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl a células de endodermo definitivas negativas a PDXl. Por ejemplo, se contemplan composiciones que comprenden al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1,000,000 de células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 100,000 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 10,000 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 1000 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 500 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 100 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 10 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 5 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 4 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 2 células de endodermo definitivas negativas a PDXl, al menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 2 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 4 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 5 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 10 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 20 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 50 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 100 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 1000 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 10,000 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl, al menos aproximadamente 100,000 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl y al menos aproximadamente 1,000,000 células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo negativa a PDXl. En algunas modalidades de la presente invención, las células de endodermo definitivas negativas a PDXl de las cuales se producen células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl se derivan de células pluripotentes humanas, tales como células germinales pluripotentes humanas. En ciertas modalidades, las células pluripotentes humanas se derivan de una mórula, la masa celular interna de un embrión o los rebordes genitales de un embrión. En ciertas otras modalidades, las células pluripotentes humanas se derivan de los tejidos genitales o germinales de una estructura multicelular que se ha desarrollado después de la etapa embriónica. Modalidades adicionales de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células humanas, incluyendo endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl humano, en donde la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 2% de las células humanas. En otras modalidades, la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 5% de las células humanas, en al menos aproximadamente 10% de las células humanas, en al menos aproximadamente 15% de las células humanas, en al menos aproximadamente 20% de las células humanas, en al menos aproximadamente 25% de las células humanas, en al menos aproximadamente 30% de las células humanas, en al menos aproximadamente 35% de las células humanas, en al menos aproximadamente 40% de las células humanas, en al menos aproximadamente 45% de las células humanas, en al menos aproximadamente 50% de las células humanas, en al menos aproximadamente 55% de las células humanas, en al menos aproximadamente 60% de las células humanas, en al menos aproximadamente 65% de las células humanas, en al menos aproximadamente 70% de las células humanas, en al menos aproximadamente 75% de las células humanas, en al menos aproximadamente 80% de las células humanas, en al menos aproximadamente 85% de las células humanas, en al menos aproximadamente 90% de las células humanas, en al menos aproximadamente 95% de las células humanas o en al menos aproximadamente 98% de las células humanas. En algunas modalidades, el porcentaje de células humanas en los cultivos o poblaciones celulares, en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM, se calcula sin importar las células del alimentador. Se apreciará que algunas modalidades de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl humanas, en donde la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de SOX17, HOXA13 y HOXC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en desde al menos aproximadamente 2% a más de al menos aproximadamente 98% de las células humanas. En algunas modalidades, la expresión de uno o más marcadores seleccionado del grupo que consiste de SOX17, H0XA13 y HOXC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 5% de las células humanas, en al menos aproximadamente 10% de las células humanas, en al menos aproximadamente 15% de las células humanas, en al menos aproximadamente 20% de las células humanas, en al menos aproximadamente 25% de las células humanas, en al menos aproximadamente 30% de las células humanas, en al menos aproximadamente 35% de las células humanas, en al menos aproximadamente 40% de las células humanas, en al menos aproximadamente 45% de las células humanas, en al menos aproximadamente 50% de las células humanas, en al menos aproximadamente 55% de las células humanas, en al menos aproximadamente 60% de las células humanas, en al menos aproximadamente 65% de las células humanas, en al menos aproximadamente 70% de las células humanas, en al menos aproximadamente 75% de las células humanas, en al menos aproximadamente 80% de las células humanas, en al menos aproximadamente 85% de las células humanas, en al menos aproximadamente 90% de las células humanas, en al menos aproximadamente 95% de las células humanas o en al menos aproximadamente 98% de las células humanas. En algunas modalidades, el porcentaje de células humanas en los cultivos o poblaciones celulares, en donde se calcula la expresión de uno o más marcadores seleccionado del grupo que consiste de SOXl 7, HOXA13 y HOXC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM, sin importar las células del alimentador. Modalidades adicionales de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células de endodermo de mamífero, tales como células de endodermo humanas, en donde la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 2% de las células endodérmicas. En otras modalidades, la expresión del marcaaor PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 5% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 10% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 15% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 20% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 25% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 30% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 35% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 40% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 45% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 50% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 55% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 60% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 65% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 70% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 75% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 80% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 85% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 90% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 95% de las células endodérmicas o en al menos aproximadamente 98% de las células endodérmicas. Aún otras modalidades de la presnete invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células de endodermo de mamífero, tales como células endodérmicas humanas, en donde la expresión de uno o más marcadores seleccionado del grupo que consiste de SOX17, HOXA13 y HOXC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 2% de las células endodérmicas. En otras modalidades, la expresión de uno o más marcadores seleccionado del grupo que consiste de SOXl 7, HOXA13 y HOXC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente 5% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 10% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 15% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 20% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 25% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 30% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 35% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 40% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 45% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 50% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 55% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 60% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 65% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 70% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 75% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 80% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 85% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 90% de las células endodérmicas, en al menos aproximadamente 95% de las células endodérmicas o al menos aproximadamente 98% de las células endodérmicas . Utilizando los procesos descritos en la presente, pueden producirse composiciones que comprenden células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl sustancialmente libres de otros tipos de células. Con respecto a células en cultivos celulares o en poblaciones celulares, el término "sustancialmente libre de" significa que el tipo de célula especificado de la cual el cultivo celular o población celular se encuentra libre, se presenta en una cantidad de menos de aproximadamente 5% del número total de células presentes en el cultivo celular o población celular. En algunas modalidades de la presente invención, las poblaciones celulares o cultivos celulares de endodermo de intestino delantero embrionariopositivas a PDXl producidas por los métodos descritos en la presente se encuentran sustancialmente libres de células que expresan significativamente los genes marcadores AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM. En una modalidad de la presente invención, una descripción de una célula de endodermo de intestino delantero embrionario positiva a PDXl con base en la expresión de genes marcadores es, alto en PDXl, bajo en AFP, bajo en SOX7, bajo en SOXl, bajo en ZIC1 y bajo en NFM. EXPRESIÓN DE INCREMENTO DE PDXl EN UNA CÉLULA DE ENDODERMO DEFINITIVO POSITIVA A SOX17 Algunos aspectos de la presente invención se refieren a métodos para incrementar la expresión del producto genético PDXl en cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden células de endodermo definitivas positivas a SOX17. En tales modalidades, las células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se ponen en contacto con un factor de diferenciación en una cantidad que es suficiente para incrementar la expresión del producto genético PDXl. Las células de endodermo definitivas positivas a SOX17 que se ponen en contacto con el factor de diferenciación pueden ser ya sea negativas a PDXl o positivas a PDXl. En algunas modalidades, el factor de diferenciación puede ser un retinoide. En ciertas modalidades, las células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se ponen en contacto con un retinoide a una concentración que varía de aproximadamente 0.01 µM a aproximadamente 50 µM. En una modalidad preferida, el retinoide es RA.
En otras modalidades de la presente invención, la expresión del producto genético PDXl en cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se incrementa al poner en contacto las células positivas a SOX17 con un factor de diferenciación de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos. Tal factores de diferenciación puede ya sea utilizarse solo o en conjunto con RA. En algunas modalidades, las células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se ponen en contacto con un factor de crecimiento de fibroblastos a una concentración que varía de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En una modalidad preferida, el Factor de crecimiento FGF es FGF-10. En algunas modalidades de la presente invención, la expresión del producto genético PDXl en cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se incrementa al poner en contacto las células positivas a SOX17 con B27. Este factor de diferenciación puede ya sea utilizarse solo o en conjunto con uno o ambos del retinoide y Factores de diferenciación de la familia FGF. En algunas modalidades, las células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se ponen en contacto con B27 a una concentración que varía de aproximadamente 0.1% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v) . En una modalidad preferida, las células de endodermo definitivas positivas a SOX17 se ponen en contacto con RA, FGF-10 y B27. Los métodos para incrementar la expresión del producto genético PDXl en cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden células de endodermo definitivas positivas a SOX17 pueden llevarse a cabo en medio de crecimiento conteniendo suero reducido o no. En algunas modalidades, las concentraciones de suero varían de aproximadamente 0.05% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v). En algunas modalidades, las células positivas a SOX17 se desarrollan en remplazo de suero. IDENTIFICACIÓN DE FACTORES CAPACES DE PROMOVER LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS DE ENDODERMO DEFINITIVAS NEGATIVAS A PDXl A CÉLULAS DE ENDODERMO DE INTESTINO DELANTERO EMBRIONARIO POSITIVAS A PDXl Aspectos adicionales de la presente invención se refieren a métodos para identificar uno o más factores de diferenciación capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En tales métodos, se obtiene un cultivo celular o población celular que comprende células de endodermo definitivas negativas a PDXl y se determina la expresión de PDXl en el cultivo celular o población celular. Después de determinar la expresión de PDXl, las células del cultivo celular o población celular se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, la expresión de PDXl se determina en el momento de poner en contacto o de manera cercana después de poner en contacto las células con un factor de diferenciación candidato. La expresión de PDXl se determina entonces en una o más veces después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato. Si la expresión de PDXl se ha incrementado después de ponerse en contacto con el factor de diferenciación candidato según se compara a la expresión de PDXl antes del contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato se identifica como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En algunas modalidades, los métodos anteriormente descritos para identificar los factors capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl también incluyen determinar la expresión del gen HOXA13 y/o el gen HOXC6 en el cultivo celular o población celular. En tales modalidades, la expresión de HOXA13 y/o H0XC6 se determina tanto antes como después de que las células se ponen en contacto con el factor de diferenciación candidato. Si la expresión de PDXl y H0XA13 se ha incrementado después del contacto con el factor de diferenciación candidato según se compara con la expresión de PDXl y H0XA13 antes de ponerse en contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato se identifica como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. De manera similar, si la expresión de PDXl y H0XC6 se ha incrementado después del contacto con el factor de diferenciación candidato según se compara con la expresión de PDXl y H0XC6 antes de ponerse en contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato se identifica como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En una modalidad preferida, un factor de diferenciación candidato se identifica que es capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl al determinar la expresión de PDXl, HOXA13 y H0XC6 tanto antes como después de poner en contacto las células del cultivo celular o población celular con el factor de diferenciación candidato. En modalidades preferidas, la expresión de PDXl, H0XA13 y/o H0XC6 se determina por Q-PCR.
Se apreciará que en algunas modalidades, la expresión de uno o más de PDXl, H0XA13 y H0XC6 puede determinarse en el momento de poner en contacto o de manera cercana después de poner en contacto las células de los cultivos celulares o poblaciones celulares con un factor de diferenciación candidato preferentemente antes de poner en contacto las células con un factor de diferenciación candidato. En tales modalidades, la expresión de uno o más de PDXl, H0XA13 y H0XC6 en el momento de poner en contacto o de manera cercana después de poner en contacto las células con un factor de diferenciación candidato se compara con la expresión de uno o más de PDXl, HOXA13 y HOXC6 en una o más veces después de poner en contacto las células con un factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades de los métodos anteriormente descritos, la una o más veces en que la expresión de PDXl se determina después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato puede varían de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 días. Por ejemplo, la expresión de PDXl puede determinarse aproximadamente 1 hora después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 12 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 16 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 24 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 3 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 5 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 7 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 9 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato o más de 10 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato. Los factores de diferenciación candidato para utilizarse en los métodos descritos en la presente pueden seleccionarse de compuestos, tales como polipéptidos y moléculas pequeñas. Por ejemplo, polipéptidos candidato pueden incluir, pero no se limitan a, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, proteínas de matriz extracelular, y péptidos sintéticos. En una modalidad preferida, el factor de crecimiento es de la familia FGF, por ejemplo FGF-10. Las moléculas pequeñas candidato incluyen, pero no se limitan a, compuestos generados de síntesis química conbinacional y productos naturales, tales como esteroides, isoprenoides, terpenoides, fenilpropanoides, alcaloides y flavinoides. Se apreciará por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica que miles de clases de moléculas pequeñas naturales y sintéticas se encuentran disponibles y que las moléculas pequeñas contempladas para utilizarse en los métodos descritos en la presente no se limitan a las clases arriba identificadas. Típicamente, las moléculas pequeñas tendrán un peso molecular menor de 10,000 amu . En una modalidad preferida, la molécula pequeña es un retinoide, por ejemplo RA. IDENTIFICACIÓN DE FACTORES CAPACES DE PROMOVER LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS DE ENDODERMO DE INTESTINO DELANTERO EMBRIONARIO POSITIVAS A PDXl Otros Aspectos de la presente invención se refieren a métodos para identificar uno o más factores de diferenciación capaces de promover la diferenciación de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En tales métodos, se obtiene un cultivo celular o población celular que comprende células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl y se determina la expresión de un marcador en el cultivo celular o población celular. Después de determinar la expresión del marcador, las células del cultivo celular o población celular se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, la expresión del marcador se determina en el momento de poner en contacto o de manera cercana después de poner en contacto las células con un factor de diferenciación candidato. La expresión del mismo marcador se determina entonces en una o más veces después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato. Si la expresión del marcador se ha incrementado o disminuido después del contacto con el factor de diferenciación candidato según se compara con el marcador de expresión antes de ponerse en contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato se identifica como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl. En modalidades preferidas, la expresión del marcador se determina por Q-PCR. En algunas modalidades de los métodos anteriormente descritos, la una o más veces en las cuales el marcador de expresión se determina después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato puede variar de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 días. Por ejemplo, el marcador de expresión puede determinarse aproximadamente 1 hora después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 12 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 16 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 24 horas después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 3 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 5 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 7 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 9 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato o más de 10 días después de poner en contacto las células con el factor de diferenciación candidato. Como se describió previamente, los factores de diferenciación candidatos para utilizarse en los métodos descritos en la presente pueden seleccionarse de compuestos tales como polipéptidos y moléculas pequeñas. Aunque cada uno de los métodos descritos en la presente se ha descrito con respecto a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl, se apreciará que en ciertas modalidades, estos métodos pueden utilizarse para producir composiciones que comprenden las células de endodermo de de intestino delantero/intestino medio embrionarios positivas a PDXl que se describen en la presente y/o las células de endodermo positivas a PDXl de la porción posterior del intestino delantero embrionario que se describen en la presente. Además, cualquiera de los tipos de células de endodermo positivas a PDXl descritas en esta especificación pueden utilizarse en los métodos de selección descritos en la presente. Habiendo descrito en general esta invención, puede obtenerse un entendimiento adicional mediante la referencia a ciertos ejemplos específicos los cuales se proporcionan en la presente únicamente para propósitos de ilustración, y no pretender ser limitantes. EJEMPLOS Muchos de los ejemplos de bajo describen el uso de células pluripotentes humanas. Los métodos para producir células pluripotentes humanas se conocen bien en la materia y se han descrito numerosas publicaciones específicas, incluyendo las Patentes de E.U. Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926, 6,090,622, 6,200,806 y 6,251,671 así como la U.S. Publicación de Solicitud de Patente No. 2004/0229350. EJEMPLO 1 Células ES humanas Para nuestros estudios de desarrollo de endodermo empleamos células germinales embrionarias humanas, que son pluripotentes y pueden dividirse aparentemente de manera indefinida en cultivolture mientras se mantiene un cariotipo normal. Las células ES se dividieron a partir de la masa celular binterna del embrión de 5 días de edad utilizando cualquier método inmunológico o mecánico para el aislamiento. En particular, la línea de célula germinal embriónica humana hESCyt-25 se derivó de un embrión congelado supernumerario de un ciclo de fertilización in vi tro después del concentimiento informado del paciente. Al descongelar el blastocito formado se colocó en placas en fibroblastos embriónicos de ratón (MEF) , en medio ES (DMEM, 20% FBS, aminoácidos no esenciales, beta-mercaptoetanol, suplemento ITS) . El embrión se adhirió al plato de cultivo y después de aproximadamente dos semanas, las regiones de hESCs no diferenciadas se transfirieron a nuevas placas con MEFs. La transferencia se realizó con corte mecánico y una breve digestión con dispasa, seguido por el retiro mecánico de los aglomerados celulares, lavado y re-emplacado. Desde la derivación, hESCyt-25 se ha pasado serialmente más de 100 veces. Empleamos la línea de célula germinal embriónica humana hESCyt-25 como nuestro material de inicio para la producción de endodermo definitivo. Se apreciará por aquellos de experiencia en la técnica que las células germinales u otras células pluripotentes también pueden utilizarse como material de inicio para el procedimientos de diferenciación descritos en la presente. Por ejemplo, las células obtained de rebordes genitales embriónicos, que pueden aislarse por métodos conocidos en la materia, pueden utilizarse como material celular pluripotente de inicio. EJEMPLO 2 Caracterización de hESCyt-25 La líinea de célula germinal embriónica humana, hESCyt-25 ha mantenido propiedades de morfología, cariotipo, crecimiento y auto-renovación normales durante 18 meses en cultivo. Esta línea celular despliega fuerte inmunorreactividad para los antígenos OCT4, SSEA-4 y TRA-1-60, todos los cuales, son característicos de hESCs no diferenciadas y despliegan actividad de fosfatasa así como una morfología idéntica a otras líneas hESC establecidas.
Además, la línea de célula germinal humana, hESCyt-25, también forma fácilmente cuerpos embrioides (EBs) cuando se cultivan en suspensión. Como una demostración de su naturaleza pluripotente, hESCyT-25 se diferencia en varios tipos celulares que representan las tres capas germinales principales. La producción de ectodermo se demostró mediante Q-PCR por ZIC1 así como la inmunocitoquímica (ICC) para nestina y más marcadores neuronales maduros. Se observó la inmunocitoquímica teñida por ß-III tubulina en aglomerados de células alargadas, características de meuronas tempranas. Previamente, tratamos EBs en suspensión con ácido retinoico, para inducir la diferenciación de células pluripotentes germinales a endodermo visceral (VE), un linaje embriónico extra. Las células tratadas expresaron altos niveles de a-fetoproteina (AFP) y SOX7, dos marcadores de VE, durante 54 horas de tratamiento. Las células diferenciadas en monocapas expresaron AFP en parches esporádicos como se demiuestra por la tinción de inmunocitoquímica. Orno se describirá abajo, la línea celular hESCyT-25 también fue capaz de formar endodermo definitivo, según se validó por la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) y la inmunocitoquímica para SOX17, en la ausencia de la expresión de AFP. Para demostrar la diferenciación a mesodermo, diferenciando EBs se analizó por expresión genética de Brachyury en varios puntos de tiempo. La expresión de Brachyury se incrementa progresivamente a través del curso del experimento. En vista de lo anterior, la línea hESCyT-25 es pluripotente como se muestra por la capacidad para formar células que representan las tres capas germinales. EJEMPLO 3 Producción deL Anticuerpo S0X17 Un principal obstáculo para la identificación del endodermo definitivo en cultivos hESC es la carencia de herramientas apropiadas. Por lo tanto asumida la producción de un anticuerpo producido contra la proteína SOX17 humana. El marcador SOX17 se expresa a través del endodermo definitivo a medida que se forma durante gastrulación y su expresión se mantiene en el tubo del intestino (aunque los niveles de expresión varían a lo largo del eje A-P) hasta alrededor del inicio de la organogénesis. SOX17 también se expresa en un subconjunto de células de endodermo extra embrionarias. Se ha observado la no expresión de esta proteína en el mesodermo o ectodermo. Se ha descubierto ahora que SOX17 es un marcador apropiado para el linaje de endodermo definitivo cuando se utiliza en conjunto con los marcadores para excluir linajes extra embrionarios. Como se describe en detalle en la presente, el anticuerpo SOX17 se utilizó para examinar específicamente los efectos de varios tratamientos y procedimientos de diferenciación dirigidos a la producción de Células de endodermo definitivo positivas a S0V17. También se emplearon otros anticuerpos que reaccionana a AFP, SPARC y Thrombomodulina para regular la producción de endodermo visceral y parietal (endodermo extra embrionario) . A fin de producir un anticuerpo contra S0X17, una porción del ADNc de S0X17 humano (SEQ ID NO: 1) que corresponde a los aminoácidos 172-414 (SEQ ID NO: 2) en el extremo carboxiterminal de la proteína S0X17 (Figura 2) se utilizó para inmunización genética en ratas en la compañía de producción de anticurepos, GENOVAC (Freiberg, Alemania) , de acuerdo con procedimientos ahí desarrollados. Los procedimientos para inmunización genética pueden encontrarse en las Patentes de E.U. Nos. 5,830,876, 5,817,637, 6,165,993 y 6,261,281 así como en las Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO00/29442 y W099/13915. Otros métodos adecuados para la inmunización genética también se describen en la literatura no de patente. Por ejemplo, Barry et al . , describe la producción de anticuerpos monoclonales mediante inmunización genética en Biotécnicas 16: 616-620, 1994. Ejemplos específicos de métodos de inmunización genética para producir anticuerpos contra proteínas específicas pueden encontrarse, por ejemplo, en Costaglia et al., (1998) La inmunización genética contra el receptor de tirotropina humana causa tiroiditis y permite la producción de anticuerpos monoclonales que reconocen al receptor nativo, J. Immunol . 160: 1458-1465; Kilpatrick et al . , (1998) Inmunizaciones a base de AND suministrado por pistola genética mediante la producción rápida de anticuerpos monoclonales murinos para el receptor Flt-3, Hybridoma 17: 569-576; Schmolke et al . , (1998) Identificación de partículas del virus de hepatitis G en suero humano mediante anticuerpos monoclonales específicos para E2 generados por inmunización de ADN, J. Virol . 72: 4541-4545; Krasemann et al . , (1999) Generación de anticuerpos monoclonales contra proteínas con una estrategia de inmunización a base de ácidos nucleicos no convencionales, J. Biotechnol . 73: 119-129; y Ulivieri et al., (1996) Generación de un anticuerpo monoclonal para una porción definida de la citotoxina de vacuoluzación del Heliobacter pylori mediante inmunización de ADN, J. Biotechnol . 51: 191-194. SOX7 y SOX18 son la familia Sox más cercana relacionada a SOX17 como se representa en el dendrograma relational mostrado en la Figura 3. Empleamos el polipéptido SOX7 humano como un control negativo para demostrar que el anticuerpo SOX17 producido por inmunización genética es específico para SOX17 y no reacciona con miembros de su familia más cercana. En particular, SOX7 y otras proteínas se expresaron en fibroblastos humanos, y después, se analizaron para reactividad cruzada con el anticuerpo SOX17 mediante inmunoanálisis Western e ICC. Por ejemplo, los siguientes métodos se utilizaron para la producción de los vectores de expresión SOXl 7, S0X7 y EGFP, su transfección en fibroblastos humanos y análisis mediante inmunoanálisis Western. Los vectores de expresión empleados para la producción de SOXl 7, S0X7, y EGFP fueron pCMV6 (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) , pCMV-SP0RT6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y pEGFP-Nl (Clonetech, Palo Alto, CA) , respectivamente. Para la producción de proteínas, se trasfectaron de menera transitoria fibroblastos humanos MDX immortalizados con telomerasa con ADN superenrollado en la presencia de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El lisado celular total se recolectó 36 horas post-transfección en TRIS-HC1 50 mM (pH 8), NaCl 150 mM, SDS al 0.1%, desoxicolato al 0.5%, conteniendo un coctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) . Inmunoanálisis Western de 100 µg de proteínas celulares, separadas mediante SDS-PAGE en NuPAGE (poliacrilamida de gradiente 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) , y se transfirió mediante electro-inmunoanálisis en membranas PDVF (Hercules, CA) , se probó con una dilución de 1/1000 del suero anti SOX17 de rata en TRIS-HC1 10 mM (pH 8), NaCl 150 mM, BSA al 10%, Tween-20 al 0.05 % (Sigma, St . Louis, MO) , seguido por IgG de rata anti conjugado de Fosfatasa Alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) , y se reveló a través de tinción de Fosfatasa Alcalina de Vector Black (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . El estándar del tamaño de las proteínas utilizado fueron los marcadores color de amplio rango (Sigma, St . Louis, MO) . En la Figura 4, los extractos de proteína hechos de células de fibroblasto humanas que se trasfectaron de manera transitoria con ADNc ' s de SOXl 7, S0X7 o EGFP se probaron en inmunoanálisis Westerns con el anticuerpo S0X17. Sólo el extracto de proteína de las células hS0X17 transfectadas produjeron una banda de ~51Kda las cuales se igualaron cercanamente al peso molecular de 46 Kda predicho de la proteína SOX17 humana. No hubo reactividad del anticuerpo SOX17 a los extractos hechos de cualquiera de las células S0X7 o EGFP humanas transfectadas. Además, el anticuerpo SOX17 claramente etiquetó los núcleos de las células de fibroblasto humanas transfectadas con la construcción de expresión hSOX17 pero no etiquetó células transfectadas solo con EGFP. Como tal, el anticuerpo SOX17 exhibe especificidad por ICC. EJEMPLO 4 Validación del Anticuerpo SOX17 como un Marcador de Endodermo Definitivo Las hESCs parcialmente diferenciadas se coetiquetaron con anticuerpos SOX17 y AFP para demostrar que el anticuerpo SOX17 es específico para la proteína SOX17 humana y además marca el endodermo definitivo. Se ha demostrado que S0X17, S0X7 (que es un miembro cercanamente relacionado del subgrupo F de la familia del gen SOX (Figura 3) ) y AFP cada uno se expresa en endodermo visceral. Sin embarago, AFP y S0X7 no se expresan en células de endodermo definitivo a niveles detectables por ICC, y así, pueden emplearse como marcadores negativos para células de endodermo definitivo bonifide. Se mostró que el anticuerpo S0X17 etiqueta las poblaciones de células que existen como agrupaciones de células separadas o se entremezclan con células AFP positivas. En particular, la Figura 5A muestra que números pequeños de células SOX17 se co-etiquetaron con AFP; sin embarago, también se encontraron regiones en donde existen pocas o ninguna célula AFP+ en el campo de las células SOX17+ (Figura 5B) . De manera similar, ya que el endodermo parietal se ha reportado que expresa SOX17, el anticuerpo coetiquetado con SOX17 junto con los marcadores parietales SPARC y/o Trombomodulina (TM) pueden utilizarse para identificar las células SOX17+ que son de endodermo parietal. Como se muestra en las Figuras 6A-C, las células de endodermo parietal co-etiquetadas con Trombomodulina y SOX17 se produjeron mediante diferenciación alatoria de células hES. En vista de los experimentos de etiquetado de células anterior, la identidad de una célula de endodermo definitivo puede establecerse por el perfil del marcador S0Xnl7hi/AFP10 [TMlD o SPARC10] . En otras palabras, la expresión del marcador S0X17 es mayor que la expresión del marcador AFP, que es característica del endodermo visceral, y los marcadores TM o SPARC, que son característicos del endodermo parietal. De acuerdo con lo anterior, estas células positive para S0X17 pero negativas para AFP y negativas para TM o SPARC son de endodermo definitivo. Mo una evidencia adicional de la especificidad del perfil del marcador S0Xnl7hi/AFPlo/TMloSPARCl0 como predictivo del endodermo definitivo, la expresión genética de SOX17 y AFP se comparó cuantitativamente con el número relativo de las células etiquetadas con anticuerpo. Como se muestra en la Figura 7A, las hESCs tratadas con ácido retinoico (inductor del endodermo visceral), o activina A (inductor del endodermo definitivo) , dieron como resultado una diferencia de 10 veces en la etiqueta de la expresión del ARNm de SOX17. Este resultado refleja la diferencia de 10 veces en el número de células etiquetadas con el anticuerpo SOX17 (Figura 7B) . Además, como se muestra en la Figura 8A, el tratamiento de activina A de las hESCs suprimió la expresión genética de AFP por 6.8 veces en comparasión al no tratamiento. Esto se relejóo visualmente por una dramática disminución en el número de células etiquetadas con AFP en estos cultivos como se muestra en las Figuras 8B-C. Para cuantificar adicionalmente esto, se demostró que esta aproximadamente 7 veces la disminución en la expresión genética de AFP fue el resultado de una disminución fue el resultado de una disminución similar de 7 veces en el número de células etiquetadas con el anticuerpo AFP según se midió por citometría de flujo (Figuras 9A-B) . Este resultado es extremadamente significativo en que indica que cambios cuantitativos en la expresión genética se observan por los cambios de espejo Q-PCR en la especificación del tipo de célula como se observa por la tinción del anticuerpo. La incubación de hESCs en la presencia de miembros de la familia Nodal (Nodal, activina A y activina B - NAA) dan como resultado un incremento significativo en las células etiquetadas con el anticuerpo S0X17 a través del tiempo. Durante 5 días de tratamiento de activina continua más del 50% de las células se etiquetaron con SOX17 (Figuras 10A-F) . Existieron pocas o ningunao célula etiquetada con AFP después de 5 días del tratamiento de activina. En resumen, el anticuerpo producido contra los aminoácidos 242 de la terminal carboxi de la proteína SOX17 humana identificó la proteína SOX17 humana en el inmunoanálisis Westerns pero no reconoce SOX7, su relativa familia Sox más cercana. El anticuerpo SOX17 reconoce un subconjunto de células en cultivos de diferenciación hESC que fueron principalmente SOX17+/AFPlo " (mayor de 95% de células etiquetadas) así como un pequeño porcentaje (< 5%) de células que se co-etiquetaron para S0X17 y AFP (endodermo visceral) . El tratamiento de cultivos hESC con activinas dio como resultado una marcada elevación de la expresión genética de S0X17 así como las células S0X17 etiquetadas y suprimió dramáticamente la expresión de RNAm de AFP y el número de células etiquetadas con el anticuerpo AFP. EJEMPLO 5 Ensayo de la expresión genética Q-PCR En los siguientes experimentos, el RT-PCR (Q-PCR) cuantitativo en tiempo real fue el principal ensayo utilizado para la detección sistemática de los efectos de varios tratamientos sobre la diferenciación de hESC. En particular, las mediciones en tiempo real de la expresión genética analizaron para múltiples genes marcadores en múltiples puntos de tiempo mediante Q-PCR. Las características de los genes marcadores de los tipos de células deseadas así como de las no deseadas se evaluaron para ganar un mejor entendimiento de las dinámicas totales de las poblaciones celulares. La solidez del análisis Q-PCR incluye su sensibilidad extrema y su facilidad relativa para desarrollar los marcadores necesarios, a medida que la secuencia del genoma se encuentra fácilmente disponible. Además, la sensibilidad extremadamente alta de Q-PCR permite la detección de la expresión genética a partir de un número relativamente pequeño de células dentro de una población mucho mayor. Además, la capacidad para detectar niveles muy bajos de expresión genética proporciona indicationes para "la tendencia de diferenciación" dentro de la población. La tendencia hacia una trayectoria de diferenciación particular, antes de la diferenciación abierta de esos fenotipos celulares, es irreconocible utilizando técnicas de inmunocitoquímica. Por esta razón, Q-PCR proporciona un método de análisis que es al menos complementario y potencialmente muy superior a las técnicas de inmunocitoquímica para la detección sistemática de los éxitos de los tratamientos de diferenciación. Adicionalmente, Q-PCR proporciona un mecanismo mediante el cual evaluar los sucesos de un protocolo de diferenciación en un formato cuantitativo a escalas de producción semi-altas de análisis. El procedimiento aquí tomado fue realizar la cuantificación relativa utilizando química de SYBR Green en un instrumento Rotor Gene 3000 (Corbett Research) y un formato RT-PCR de dos etapas. Tal procedimiento permite el montaje en paralelo de las muestras de ADNc para análisis de genes marcadores adicionales en el futuro, evitando así la variabilidad en la eficiencia de la transcripción inversa entre las muestras. Cuando fue posible, se designaron iniciadores para colocarse sobre los límites entre exón-exón o intrones de espacio de al menos 800 bp, según estos se han determinado empíricamente para eliminar la amplificación del ADN genómico contaminante. Cuando se emplearon genes marcadores que no contienen intrones o poseen pseudogenes, se realizó el tratamiento de DNasa I de las muestras de ARN. Rutinariamente utilizamos Q-PCR para medir la expresión genética de múltiples marcadores de tipos celulares objetivo y no objetivo a fin de proporcionar una descripción de amplio perfil de expresión genética en muestras celulares. Los marcadores relevantes para las fases tempranas de la diferenciación de hESC (específicamente ectodermo, mesodermo, endodermo definitivo y endodermo extra embrionario) y para la cuales los conjuntos de iniciadores validados se encuentran disponibles, se proporcionan abajo en la Tabla 1. También se demostrado la especificidad humana de estos conjuntos de iniciadores. Esto es un hecho importante ya que las hESCs con frecuencia se desarrollaron en capas de alimentador de ratón. Most típicamente, las muestras por triplicado se tomaron para cada condición y se analizaron independientemente en duplicado para valorar la variabilidad biológica asociada con cada determinación cuantitativa. Para generar modelos de PCR, se aisló el ARN total was utilizando RNeasy (Qiagen) y se cuantificaron utilizando RiboGreen (Sondas Moleculares) . La transcripción inversa de 350-500 ng del ARN total se llevó a cabo utilizando el equipo de transcriptasa inversa iScript (BioRad) , que contiene una mezcla de iniciadores oligo-dT y aleatorios. Cada reacción de 20 µl se diluyó subsecuentemente hasta el volumen total de 100 µl y se utilizaron 3 µl en cada reacción Q-PCR de 10 µl conteniendo iniciadores en avance e inversos de 400 nM y mezcla de 5 µl 2X SYBR Green master (Qiagen) . Se utilizaron parámetros de ciclización de dos etapas emplando una desnaturalización de 5 segundos a 85-940C (seleccionado específicamente de acuerdo con la temperatura de fusión del amplicón para cada conjunto iniciador) seguido por una hibridación/extendido de 45 segundos a 60°C. Los datos de fluorescencia se recolectaron durante los últimos 15 segundos de cada fase de extensión. En tres puntos, se utilizó una serie de diluciones de 10 veces para generar la curva estándar para cada funcionamiento y los umbrales de ciclo (Ct's) se convirtieron a valores cuantitativos con bas en esta curva estándar. Los valores cuantitativos para cada muestra se normalizaron a desempeño genético de mantenimiento y después las desviaciones promedio y estándar se calcularon por muestras por triplicado. A la conclusión del ciclo de PCR, se realizó un análisis de curva se fusión para cerciorarse de la especificidad de la reaction. Se indicó un solo producto específico mediante un solo pico a la Tm apropiada para el amplicón de PCR. Además, las reacciones realizadas sin la transcriptasa inversa sirven como el control negativo y no se amplifican.
Una primera etapa para estabilizar la metodología de Q-PCR se validó de genes de mantenimiento (HGs) apropiados en el sistema experimental. Ya que el HG se utilizó para normalizar las muestras cruzadas para la entrada de ARN, la integridad del ARN y la eficiencia a temperatura ambiente, fue de valor que el HG exhibió un nivel constante de expresión a través del tiempo en todos los tipos de muestras a fin de que la normalización sea significativa. Medimos los niveles de expresión de la Ciclophilina G, hipoxantina f osf oribosil transf erasa 1 (HPRT) , beta -2-microglobulina , hidroximetilbiana sintasa (HMBS) , proteina enlazada a TATA (TBP) , y beta glucuronidasa (GUS) para diferenciar hESCs.
Nuestros resultados indican que los niveles de expresión de beta-2-microglobulina se incrementaron a través del curso de la diferenciación y por lo tanto excluimos el uso de este gen para la normalization. Los otros genes exhibieron niveles de expresión consistentes a través del tiempo así como en tratamientos cruzados. Utilizamos rutinariamente tanto Ciclofilina G como GUS para calcular un factor de normalización para todas las muestras. El uso de múltiples HGs reduce simultáneamente la variabilidad inherente al process de normalización e incrementa la confiabilidad de los valores de expresión genética relativos. Después de obtener los genes para uso en la normalization, se utilizó Q-PCR para determinar los niveles de expresión genética relativa de muchos genes marcadores a través de las muestras que recibieron diferentes tratamientos experimentales. Los genes marcadores empleados se han seleccionado debido a que exhiben enriquecimiento en poblaciones específicas representativas de las capas germinales tempranas y en particular se enfocan a conjuntos de genes que se expresan de manera diferencial en el endodermo definitivo y endodermo extra-embriónico . Estos genes así como sus perfiles de enriquecimiento relativo sobresalen en la Tabla 1. TABLA 1 Ya que muchos genes se expresan en más de una estrato germinal es útil comparar cuantitativamente los niveles de expresión de muchos genes dentro del mismo experimento. SOX17 se expresa en el endodermo definitivo y a un menor grado en el visceral y el endodermo de origen. S0X7 y AFP se expresan en el enaodermo visceral en su punto de tiempo de desarrollo temprano. SPARC y TM se expresan en el endodermo de origen y Brachyury se expresa en el mesodermo temprano. Las células de endodermo definitivo se predijeron para expresar niveles elevados de ARNm SOX17 y niveles bajos de AFP y SOX7 (endodermo visceral), SPARC (endodermo parietal) y Brachyury (mesodermo). Además, ZIC1 se utilizó aquí para regular adicionalmente la inducción del ectodermo temprano. Finalmente, GATA4 y HNF3b se expresaron tanto en el endodermo definitivo como en el extra embrionario, y así, se correlaciona con la expresión de SOX17 en el endodermo definitivo (Tabla 1) . Un experimento representativo se muestra en las Figuras 11-14 que demuestran cómo los genes marcadores descritos en la Tabla 1 se correlacionan entre si entre las diferentes muestras, resaltando así los patrones específicos de la diferenciación para el endodermo definitivo y el endodermo extra embrionario así como así como para los tipos de células mesodermal y neural. En vista de los datos anteriores es clasro que las dosis incrementadas de activina dan como resultado la expresión genética de S0X17 incrementada. Además esta expresión de S0X17 representa predominantemente el endodermo definitivo como opuesto al endodermo extra embrionario. Esta conclusión se origina de la observación que la expresión genética de S0X17 se correlaciona inversamente con la expresión genética de AFP, S0X7 y SPARC. EJEMPLO 6 Diferenciación Dirigida de las Células ES Humanas al Endodermo Definitivo Los cultivos celulares de ES humanos se diferencian aleatoriamente si se cultivan bajo condiciones que no mantienen activamente su estado de no diferenciación. Esta diferenciación heterogénea da como resultado la producción de células de endodermo extra embrionario comprendido tanto de endodermo parietal como de visceral (expresión de AFP, SPARC y SOX7 ) así como derivados ectodermales y mesodermales tempranos según se marcan por la expresión de ZIC1 y Nestina (ectodermo) y Brachyury (mesodermo) . Las células del endodermo definitivo parece que no se han examinado o especificado de la carencia de marcadores de anticuerpo específicos en cultivos celulares de ES. Como tal, y predeterminado, la producción de endodermo definitivo temprano en cultivos celulares ES no ha sido bien estudiado. Ya que los reactivos satisfactorios para anticuerpo para células de endodermo definitivo no se encuentran disponibles, la mayoría de la caracterización se ha enfocado sobre el ectodermo y el endodermo extra embrionario. Sobre todo, existen números significativamente mayores de tipos celulares extra-embrionicos y neurectodermales en comparación a células endodermo definitivo S0X17hl en cultivos celulares ES aleatoriamente diferneciados . Como las colonias hESC no diferenciadas se expanden sobre un lecho de alimentadores de fibroblasto, las células en los bordes de la colonia toman una morfología alternativa que se distingue de aquellas células residentes dentro del interior de la colonia. Muchas de estas células de borde externo pueden distinguirse por su morfología de cuerpo celular más grande, menos uniforme, y por la expresión de niveles mayores de OCT4. Se ha descrito que a medida que las células ES comienzan a diferenciarse alteran los niveles de expresión de OCT4 hacia arriba o hacia abajo con relación a las células ES no diferenciadas. La alteración de los niveles de OCT4 hacia arriba o hacia abajo del umbral no diferenciad puede significar las etapas iniciales de la diferenciación lejos del estado pluripotente. Cuando se examinaron las colonias no diferenciadas por inmunocitoquímica SOX17, ocasionalmente los pequeños aglomerados de 10-15 células de células positivas a SOX17 se detectaron en ubicaciones aleatorias sobre la periferia y en las uniones entre las colonias hESC no diferenciadas. orno se anotó arriba, estos grupos diseminados de los bordes externos de la colonia parecen ser algunas de las primeras células para diferenciarse lejos de la morfología de las células ES clásica a mediada que la colonia se expande en tamaño y se vuelve más coronada. Las colonias más jóvenes, más pequeñas completamente no diferenciadas (< lmm; 4-5 días de edad) no mostraron células positivas a S0X17 dentro o en los borde de las colonias mientras las colonias más grandes, de más edad (1-2 mm de diámetro, > 5días de edad) tuvieron parches esporádicos aislados de células positivas a SOX17, negativas a AFP en la periferia de algunas colonias o en regiones interiores al borde que no despliega la morfología hESC clásica descrita previamente. Dado que ste fue el primer desarrollo de un anticuerpo SOX17 efectivo, las células de endodermo definitivo generadas en tales cultivos celulares ES "no diferenciadas" tempranas nunca se han demostrado previamente . Con base en las correlaciones negativas de los niveles de expresión genética de SOX17 y SPARC by Q-PCR, la vasta mayoría de estas células positivas a SOX17, negativas a AFP serán negativas para los marcadores de endodermo parietal mediante el anticuerpo co-etiquetado. Esto se demostró específicamente por las células de endodermo parietal que expresan TM como se muestra en las Figuras 15 A-B. La exposición a la activina A and B de los factores Nodales da como resultado una dramática disminución en la intensidad de la expresión de TM y el número de células TM positivAS. Al utilizar S0X17 triple etiquetado, los anticuerpos AFP y TM en un cultivo tratado con activina, se observaron aglomerados de células positivas a S0X17 que también fueron negativas para AFP y TM (Figuras 16A-D) . Estas osn la primeras demostraciones celulares de células de endodermo definitivo positivas a S0X17 en cultivos hESC de diferenciación (Figuras 16A-D y 17) . Con el anticuerpo SOX17 y las herramientas Q-PCR descritas arriba hemos explorado varios de los procedimientos capaces de programar eficientemente hESCs para volverlos células de endodermo definitivo SOXl 7hl/AFPl0/ SPARC/TM10. Aplicamos una variedad de protocolos de diferenciación dirigidos a incrementar el número y capacidad proliferativa de estas células según se midió en el nivel de población por Q-PCR para la expresión genética SOX17 y en el nivel de células individuales por etiquetado de anticuerpo de la proteína SOX17. Nosotros fuimos los primeros en analizar y describir el efecto de los factores de la familia TGFß de crecimiento, tales como Nodal/activin/BMP, para utilizarse en crear células de endodermo definitivo a partir de células germinales embrionarias en cultivos celulares in vi tro . En experimentos típicos, la activina A, activina B, BMP o combinaciones de estos factores de crecimiento se agregaron a cultivos de línea celular hESCyt-25 germianl humana no diferenciada para iniciar el proceso de diferenciación. Como se muestra en la Figura 19, la adición de activina A en 100 ng/ml da como resultado una inducción de 19-veces la expresión genética SOX17 vs . hESCs no diferenciadas por el día 4 de diferenciación. Agregar activina B, un segundo miembro de la familia activina, junto con activina A, da como resultado la inducción de 37 veces sobre las hESCs no diferenciadas poe el día 4 del tratamiento activina combinado. Finalmente, agregar un tercer miembro de la familia TGFß a partir de los subgrupos Nodal/Activina y BMP, BMP4, junto con activina A y activina B, incrementa las veces de inducción a 57 veces que que la hESCs no diferenciadas (Figura 19) . Cuando la inducción de SOX17 con activinas y BMP se compara a inducciones sin controles de medio de factor 5, 10, y 15 veces resulñta en el punto de tiempo del día 4. Durante cinco días de triple tratamiento con activinas A, B y BMP, SOX17 se indujo más de 70 veces más que hESCs. Estos datos indican que mayores dosis y tiempos de tratamiento más largos de los miembros de familia Nodal/activina TGFß da como resultado la expresión de SOX17. La Nodal y la activina A, B y BMP de moléculas relacionadas facilitan la expresión de SOX17 y la formación de endodermo definitivo in vivo o in vi tro . Además, la adición de BMP da como resultado una inducción de S0X17 mejorada posiblemente a través de la inducción adicional de Cripto, el co-receptor Nodal. Hemos demostrado que la combinación de activinas A y B junto con BMP4 da como resultado el incremento aditivo en la inducción de S0X17 y en consecuencia la formación de endodermo definitivo. La adición de BMP4 durannte periodos prolongados (>4 días) , en combinación con activina A y B puede inducir SOX17 en endodermo parietal y visceral así como endodermo definitivo. En algunas modalidades de la presente invención, es por lo tanto valioso retirar BMP4 del tratamiento dentro de los 4 días de adición. Para determinar el efecto del tratamiento del factor TGFß en el nivel de célula individual, un curso de tiempo de la adición del factor TGFß se examinó utilizando la etiquetación del anticuerpo SOX17. Como se mostró previamente en las Figuras 10A-F, existió un damático incremento en el número relativo de las céluas etiquetadas de SOX17 a través del tiempo. La cuantificación relativa (Figura 20) muestra más de 20 veces el incremento en las células etiquetadas con SOX17. Este resultado indica que tanto los números de células así como el nivel de expresión del gen SOX17 se incrementan com el tiempo de exposición al factor TGFß. Como se muestra en la Figura 21, después de cuatro días de exposición a Nodal, activina A, activina B y BMP4, el nivel de inducción de S0X17 se elevó 168 veces sobre las hESCs no diferenciadas. La Figura 22 muestra que el número relativo de células positivas a S0X17 también respondió a la dosis. Activina A de 100 ng/ml o más fue capaz de inducir de manera potente la expresión del gen SOX17 y el número de células. Además de los miembros de la familia TGFß, la familia de moléculas Wnt puede jugar un rol en la especificación y/o mantenimiento del endodermo definitivo. El uso de moléculas Wnt también fue benéfico para la diferenciación de hESCs para el endodermo definitivo como se indica por la expresión genpética SOX17 incrementada en las muestras que se trataron con activinas más Wnt3a sobre las activinas solas (Figura 23) . Todos los experimentos descritos arriba se realizaron utilizando un medio de cultivo de tejido conteniendo 10% de suero con factores agregados. Sorprendentemente, descubrimos que la concentración de suero tuvo un efecto sobre el nivel de expresión de SOX17 en la presencia de activinas agregadas como se muestra en las Figuras 24A-C. Cuando los niveles suero se redujeron de 10% a 2%, la expresión de SOX17 se triplicó en la presencia de activinas A y B. Finalmente, demostramos que las células SOX17+ inducidas por activina se divide en cultivos como se representa en las Figuras 25A-D. Las flechas muestran células etiquetadas con SOX17/PCNA/DAPI que se encuentran en mitosis como se evidencia por el patrón de placa mitótica etiquetada con PCNA/D API y el perfil mitótico en contraste de fases. EJEMPLO 7 La Expresión del Receptor 4 de Quimiocina ( CXC1M) de Correlaciona con los Marcadores para el Endodermo Definitivo y sin Marcadores para el Mesodermo, Ectodermo o Endodermo Visceral Como se decribe arriba, hESCs puede inducirse para diferenciarse al estrato germinal de endodermo definitivo mediante la aplicación de citocinas de la familia TGFß y más específicamente de la subfamilia activina/nodal .
Adicionalmente, hemos mostrado que la proporción de suero fetal de bovino (FBS) en el medio de cultivo de diferenciación afreta la eficiencia de la diferenciación del endodermo definitivo a partir de hESCs. Este efecto es tal que a una concentración dada de activina A en el medio, los niveles más altos de FBS inhibirán la diferenciación máxima para el endodermo definitivo. En la ausencia de activina A exógena, la diferenciación de hESCs al linaje de endodermo definitivo es muy ineficiente y la concentración de FBS tiene muchos efectos más benignos de hESCs.
En estos experimentos, hESCs se diferenció al crecer en medio RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA; cat# 61870-036) suplementado con 0.5%, 2.0% o 10% de FBS y ya sea con o « sin 100 ng/ml de activina A durante 6 días. Además, un gradiente de FBS que varía de 0.5% a 2.0% a través de los primeros tres días de diferenciación también se utilizó en conjunto con 100 ng/ml de activina A. Después de 6 días, se recolectaron muestras réplicas de cada condición de cultivo y se analizaron para la expresión genética relativa por PCR cuantitativa en tiempo real. Las células restantes se fijaro para la detección de inmunofluorescencia de la proteína SOX17. Los niveles de expresión CXCR4 variaron dramáticamente a través de las 7 condiciones de cultivo utilizadas (Figura 26) . En general, la expresión de CXCR4 se elevó en cultivos tratados con activina A (AlOO) y bajo en aquellos que no recibieron activina A exógena (NF) . Además, entre los cultivos tratados AlOO, la expresión de CXCR4 fue mayor cuando dismunuyó la concentración de FBS. Existió una disminucióm remarcable en el nivel CXCR4 en la condición de 10% de FBS de manera que la expresión relativa fue más enla línea con las condicones que no recibieron activina A (NF) . Como se describe arriba, la expresión de los genes SOX17, GSC, MIXLl, y HNF3ß es consistente con la caracterización de una célula como endodermo definitivo. La expresión relativa de estos cuatro genes a través de las 7 condicines de diferenciación reflejan esa de CXCR4 (Figuras 27 A-D) . Esto demuestra que CXCR4 también es un marcador de endodermo definitivo. Los linajes de ectodermo y mesodermo pueden distinguirse del endodermo definitivo por su expresión de varios marcadores. El mesodermo temprano expresa los genes Brachyury y MOX1 mientras el neuro-ectodermo naciente expresa SOXl y ZIC1. Las Figuras 28A-D demuestran que los cultivos que no recibieron activina A exógena se enriquecieron preferentemente por la expresión genética del mesodermo y ectodermo y que entre los cultivos tratados con activina A, la condición de 10% de FBS también tuvo niveles incrementados de la expresión del marcador de mesodermo y ectodermo. Estos patrones de expresión fueron inversos a los de CXCR4 e indican que CXCR4 no se expresó de manera elevada en el mesodermo o ectodermo derivado de hESCs en este periodo de tiempo de desarrollo. Durante el desarrollo temprano del mamífero, también ocurre la diferenciación a linajes extra-embrionicos . De particular relevencia aquí es la diferenciación del endodermo visceral que cómprate la expresión de muchos genes en común con el endodermo definitivo, incluyendo SOXl 7. Para distinguir el endodermo definitivo del endodermo visceral extra embrionario debe examinarse un marcador que es distinto entre estos dos. S0X7 representa un marcador que se expresa en el linaje de endodermo visceral pero no en el de endodermo definitivo. Así, las condiciones de cultivo que exhiben la expresión genética S0X17 robusta en la ausencia de la expresión S0X7 es probable que contenga endodermo definitivo y no visceral. Se muestra en la Figura 28E que S0X7 se expresó de manera elevada en los cultivos que no recibieron activina A, S0X7 también exhibió expresión incrementada aún en la presencia de activina A cuando se incluyó FBS al 10%. Este patrón es el inverso del patrón de expresión CXCR4 y sugiere que CXCR4 no se expresa de manera elevada en el endodermo visceral. El número relativo de células inmunoreactivas SOX17 (SOX17+) presente en cada una de las condiciones de diferenciación arriba mencionadas, también se determinó. Cuando hESCs se diferenció en la presencia de dosis alta de activina A y baja concentración de FBS (0.5% - 2.0%) las células SOX17+ se distribuyeron de manera ubicua a través del cultivo. Cuando se utilizó activina A a dosis alta pero FBS se incluyó a 10% (v/v) , las células SOX17+ aparecieron a frecuencia mucho menor y siempre aparecieron en aglomerados aislados preferentemente distribuidas de manera unifome a través del cultivo (Figuras 29A y C así como B y E) . Una disminución adicional en células SOX17+ se observó cuando no se utilizó activina A exógena. Bajo estas condiciones las células S0X17+ también aparecen en aglomerados y estos aglomerados fueron más pequeños y mucho más raros que los encontrados en la activina A mayor, bajo tratamiento FBS (Figura 29 C y F) . Estos resultados demuestran que el patrón de expresión de CXCR4 no solo corresponde a la expresión genética del endodermo definitivo sino también al número de células de endodermo definitivo en cada condición. EJEMPLO 8 Condiciones de Diferenciación que Enriquecen el Endodermo Definitivo Incrementan la Proporción de las Células Positivas a CXCR4 La dosis de activina A también afecta la eficiencia en la que el endodermo definitivo puede derivarse de hESCs.
Este ejemplo demuestra que incrementar la dosis de activina A incrementa la proporción de las células CXCR4+ en el cultivo. Las hESCs se diferenciaron en medio RPMI suplementado con 0.5%-2% de FBS (incrementado de 0.5% a 1.0% a 2.0% a través de los primeros 3 días de diferenciación) y cualquiera de 0, 10, o 100 ng/ml de activina A. Después de 7 días de la diferenciación las células se disociaron en PBS sin Ca2+Mg2+ conteniendo 2% de FBS y (EDTA) 2 mM durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se filtraron a través de filtros de nylon de 35 µm, se contaron y pelletizaron . Los pellets se suspendieron en un volumen pequeño de 50% suero humano/50% suero normal de asno y se incubó durante 2 minutos sobre hielo para bloquear los sitios de unión a anticuerpo no específicos. A esto, se agregó 1 µl de anticuerpo de ratón anti-CXCR4 (Abcam, cat# abl0403-100) por 50 µl (conteniendo aproximadamente 105 células) y el etiquetado procedió durante 45 minutos sobre hielo. Las células se lavaron al agregar 5 ml de PBS conteniendo 2% de suero humano (amortiguador) y se pelletizaron. Se completó un segundo lavado con 5 ml de amortiguador después las células se resuspendieron en 50 µl de amortiguador por 105 células. El anticuerpo secundario (FITC conjugado de asno anti-ratón; Jackson ImmunoResearch, cat# 715-096-151) se agregó a la concentración final de 5 µg/ml y se dejó etiquetar durante 30 minutos seguido por dos lavados en amotiguador como arriba. Las células se resuspendieron a 5xl06 células/ml en amortiguador y se analizaron y clasificaron utilizando un FACS Vantage (Beckton Dickenson) por el equipo de apoyo de las instalaciones de núcleo de la citometría de flujo (The Scripps Research Institute) . Las células se recolectaron directamente en amortiguador de lisis RLT (Qiagen) para el aislamiento subsecuente del ARN total para el análisis de expresión genética por PCR cuatitativo en tiempo real. El número de células CXCR4+ como se determinó mediante citometría de flujo, se observó que se incrementó dramáticamente a medida que la dosis de activina A se incrementó en el medio de cultivo de diferenciación (Figuras 30A-C) . Las células CXCR4+ fueron las que cayeron dentro de la compuerta R4 y esta compuerta se estableció utilizando un control solo de anticuerpo secundario por lo cual 0.2% de los casos se localizaron eb la compuerta R4. Los número de células CXCR4+ dramáticamente incrementadosse correlacionan con un incremento robusto en la expresión genética del endodermo definitivo a medida que se incrementó la dosis de activina A (Figuras 3 IA-D) . EJEMPLO 9 Aislamiento de células positivas a CXCR4 enriquecidas para la expresión genética del endodermo definitivo y células agotadas que expresan los marcadores de mesodermo, ectodermo y endodermo visceral Se determinaron simultáneamemnte las células CXCR4+ y CXCR4" identificadas en el Ejemplo 8 de arriba se recolectaron y analizaron para la expresión genética relativa y la expresión genética de la población original. Los niveles relativos de la expresión genética de CXCR4 se incrementaron dramáticamente al incrementa la dosis de activina A (Figura 32). Esto se correlaciona muy bien con el incremento de células CXCR4+ dependientes de la dosis de activina A (Figuras 3 OA-C) . También es claro que el aislamiento de las células CXCR4+ de cada población se contabilizó cercanamente a toda la expresión genética de CXCR4 en esa población. Esto demuestra la eficiencia del método FACS para la recolección de estas células. El análisis de la expresión genética revela que las células CXCR4+ contiene no solo la mayoría de la expresión genética CXCR4 sino también contiene la expresión genética para otros marcadores de endodermo definitivo. Como se muestra en las Figuras 31A-D, las células CXCR4+ se enriquecieron adicionalmente sobre la población AlOO original por SOX17, GSC, HNF3B, y MIXLl. Además, la fracción CXCR4" contuvo muy poca expresión genética para esos marcadores de endodermo definitivo. Además las poblaciones CXCR4+ y CXCR4" despliegan el patrón inverso de expresión genética para los marcadores de mesodermo, ectodermo y endodermo extra embrionario. Las Figuras 33 A-D muestran que las células CXCR4+ se agotaron para la expresión genética de Brachyury, MOX1, ZIC1, y SOX7 con relación a la población original AlOO. Esta población original AlOO ya fue baja en expresión de estos marcadores con relación a las condiciones de dosis baja y sin activina A. Estos resultados muestran que el aislamiento de las CXCR4+ de hESCs diferenciadas en la presencia de elevada activina A produce una población que esta altamente enriquecida y sustancialmente pura de endodermo definitivo. EJEMPLO 10 Cuantificación de Células de Endodermo Definitivo en una Población celular Utilizando CXCR4 Para conformar la cuantificación de la proporción de las células de endodermo definitivo presentes en un cultivo celular o población celular como se determinó previamente en la presente y como se determinó en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos No. 60/532,004, titulada DEFINITIVE ENDODERM (ENDODERMO DEFINITIVO), presentada el 23 de Diciembre, 2003, que expresan las células CXCR4 y otros marcadores del endodermo definitivo se analizaron por FACS. Utilizando los métodos tales como tales como los descritos en los Ejemplos anteriores, hESCs se diferenció para producir endodermo definitivo. En particular, para incrementar el rendimiento y pureza en cultivos celulares de diferenciación, la concentración en suero del medio se recolectó como sigue: 0.2% FBS en el día 1, 1.0% FBS en el día 2 y 2.0% FBS en los días 3-6. Los cultivos diferenciados se clasificaron mediante FACS utilizando tres epitopes de superficie celular, E-Caderina, CXCR4, y Trombomodulina. Las poblaciones de celulares clasificadas se analizaron por Q-PCR para determinar los niveles de expresión relativos de los marcadores para endodermo definitivo y extraembrionario así como otros tipos de células. Las células clasificadas CXCR4 tomadas de los cultivos opcionalmente diferenciados dieron como resultado el aislamiento de células de endodermo definitivo que fueron >98% de pureza. La Tabla 2 muestra los resultados de un análisis de marcador para un cultivo de endodermo que se diferenció de hESCs utilizando los métodos descritos en la presente. Tabla 2 Composición de Cultivos de Endodermo Definitivo Marcador (s) Porciento Porciento Porciento de Porciento de de Endodermo de cultivo Endodermo extra- células definitivo embrionario hES S0X17 70-80 100 Trombomodulina <2 0 75 AFP <1 0 25 CXCR4 70-80 100 0 ECAD 10 0 100 otro (ECAD neg. ) 10-20 Total 100 100 100 100 En particular, la Tabla 2 indica que células positivas a CXCR4 y SOX17 (endodermo) comprenden 70%-80% de las células en el cultivo celular. De estas células que expresan SOX17, menos del 2% expresan TM (endodermo parietal) y menos del 1% expresan AFP (endodermo visceral) . Después de sustraer la proporción de células TM-positivas y AFP-positivas (combinado de endodermo parietal y visceral; 3% total) de la proporción de células positivas a SOX17/CXCR4, puede observarse que aproximadamente de 67% a aproximadamente 77% del cultivo celular fue endodermo definitivo. Aproximadamente 10% de las células fueron positivas a E-Caderina (ECAD) , que es un marcador para hESCs, y aproximadamente 10-20% de las células fueron de otros tipos celulares . Hemos descubierto que la pureza del endodermo definitivo en los cultivos celulares de diferenciación que se obtuvieron antes de la separación FACS pueden mejirarse según se compara con el procedimiento bajo en suero descrito arriba al mantener la concentración de FBS a <0.5% a través del procedimiento de diferenciación del día 5-6. Sin embarago, mantener el cultivo celular a <0.5% a través del procedimiento de diferenciación del día 5-6 también da como resultado un núemro reducido de células de endodermo definitivo totales que se producen. Las células de endodermo definitivo producidas por los métodos descritos en la presente se han mantenido y expandiso en cultivos en la presencia de activina por más de 50 días sin diferenciación apreciable. En tales casos, la expresión SOX17, CXCR4, MIXLl, GATA4, HNF3ß se mantiene a través del periodo de cultivo. Adicionalmente, TM, SPARC, OCT4, AFP, SOX7, ZIC1 y BRACH no se detectaron en estos cultivos. Es probable que tales células puedan mantenerse y expandirse en cultivos sustancialmente por más de 50 días sin diferenciación apreciable. EJEMPLO 11 Marcador Adicionl de Células de Endodermo Definitivo En los siguientes experimentos, el ARN se aisló de endodermo definitivo purificado y poblaciones de células germinales embrionarias humanas. La expresión genética se analizó entonces mediante de trocito de gen del ARN a partir de cada población purificada. El Q-PCR también se realizó para investigar adicionalmente el potencial de los genes expresados en el endodermo definitivopero no en células germinales embrionarias, como un marcador para endodermo definitivo. Las células germinales embrionarias humanas (hESCs) se mantuvieron en medio DMEM/F12 suplementado con 20% de Remplazo de Suero KnockOut, 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) humano recombinante, 0.1 mM 2-mercaptoetanol, L-glutamina, aminoácidos no esenciales y penicilina/estreptomicina. Las hESCs se diferenciaron para endodermo definitivo al cultivarse durante 5 días en medio RPMI suplementado con 100 ng/ml de activina A humana recombinante, suero fetal de bovino (FBS), y penicilina/estreptomicina. La concentración de FBS varió cada día como sigue: 0.1% (primer día), 0.2% (segundo día), 2% (días 3-5) .
Las células se aislaron clasificación celular activada mediante fluorescencia (FACS) a fin de obtener poblaciones purificadas de hESCs y endodermo definitivo para el análisis de expresión genética. La inmuno-purificación se logró por hESCs utilizando antígeno SSEA4 (R&D Sistemas, cat# FAB 1435P) y para endodermo definitivo utilizando CXCR4 (R&D Sistemas, cat# FAB 170P) . Las células se disociaron utilizando tripsina/EDTA (Invitrogen, cat# 25300-054), se lavaron en salina amortiguada con fosfato (PBS) conteniendo 2% de suero humano y suspendidas en 100% de suero humano en hielo durante 10 minutos para bloquear la unión no específica. Se llevó a cabo la tinción durante 30 minutos sobre hielo al agregar 200 µl de anticuerpo conjugado a ficoeritrina a 5 x 106 células en 800 µl de suero humano. Las células se lavaron dos veces con 8 ml de amortiguador PBS y se resuspendieron en 1 ml del mismo. Se llevó a cabo el aislamiento de FACS mediante las instalaciones de núcleo del The Scripps Research Institute utilizando un FACS Vantage (BD Biosciences) . Las células se recolectaron directamente en amortiguador de lisis RLT y el ARN se aisló por RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen) . El ARN purificado se presentó en duplicado para el Análisis de Expresión (Durham, NC) para la generación de los datos del perfil de expresión utilizando la plataforma Affymetrix y U133 Plus 2.0 arreglo de oligonucleótidos de alta densidad. Los datos presentados es una comparación de grupo que identifica los genes diferencialmente expresados entre las dos poblaciones, hESCs y endodermo definitivo. Los genes que exhiben un cambio ascendente robusto en el nivel de expresión sobre el encontrado en hESCs se seleccionaron como nuevos marcadores candidato que son elevadamente característicos del endodermo definitivo. Los genes seleccionados se analizaron mediante Q-PCR, como se describe arriba, para verificar los cambios de expresión genética encontrados en el trocito de gen y también para investigar el patrón de expresión de esos genes durante un curso de tiempo de diferenciación de hESC. Las Figuras 34A-M muestran los resultados de la expresión genética para ciertos marcadores. Los resultados se despliegan para los cultivos celulares analizados de 1, 3 y 5 días después de la adición de 100 ng/ml de activina A, las células que expresan CXCR4 de endodermo definitivo purificadas al final de los cinco días del procedimiento de diferenciación (CXDE) , y en hESCs purificadas. Una comparación de las Figuras 34C y G-M demuestra que los seis maracdores genéticos, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 y CRIP1, exhiben un patrón de expresión que es casi idéntico entre si y que también es idéntico al patrón de expresión de CXCR4 y la proporción de SOX17/SOX7. Como se describió previamente, SOX17 se expresa en ambos el endodermo definitivo así como en el endodermo extra embrionario que expresan S0X7. Ya que S0X7 no seexpresa en el endodermo definitivo, la proporción de SOX17/SOX7 proporciona un estimado confiable de contribución de endodermo definitivo a la expresión de S0X17 testificado en la población como un entero. La similitud de los paneles G-L y M al panel C indica que FGF17, VWF, CALCR, F0XQ1, CMKORl y CRIP1 son probablemente marcadores de endodermo definitivo y que no se expresan de manera significativa en células de endodermo extra embrionarias. Se apreciará que los resultados Q-PCR descritos en la presente pueden confirmars e además por ICC. EJEMPLO 12 Ácido retinoico y FGF-10 Inducen PDXl Específicamente en Cultivos de Endodermo definitivo El siguiente experimento demuestra que RA y FGF-IO inducen la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo. Las células germinales embrionarias humanas se cultivaron con o sin activinas durante cuatro días. En el día cuatro, se agregó 1 µM RA y 50 ng/ml FGF-IO al cultivo celular. Cuarenta y ocho horas después de la adición de RA/FGF-10, la expresión del gen marcador PDXl y otros marcadores genéticos no específicos para endodermo de intestino delantero embrionario se cuantificaron por Q-PCR.
La aplicación de RA a células de endodermo definitivo causaron un incremento robusto en la expresión genética PDXl (ver la Figura 35) sin incrementar la expresión de los marcadores de expresión genética de endodermo visceral (S0X7, AFP), neural (SOXl, ZIC1), o neuronal (NFM) (ver las Figura 36A- F) . La expresión genética de PDXl se indujo a niveles aproximadamente de 500 veces más elevados que los observados en endodermo definitivo después de 48 horas expuesto a esa inducción PDXl sustantial ocurrida solo en cultivos celulares que se han diferenciado previamente a endodermo definitivo (SOX17) como se indica por 160 veces mayor que la expresión de PDXl encontrada en los cultivos celulares tratados con activina relativa a aquellos cultivos que no recibieron activina antes de la aplicación de RA. EJEMPLO 13 FGF-10 Proporciona Incremento Adicional en la Expresión de PDXl Sobre RA Solo Este Ejemplo muestra que la combinación de RA y FGF-10 induce la expresión de PDXl a un mayor grado que el de RA solo. Como en el Ejemplo previo, hESCs se cultivaron con 0 sin activinas durante cuatro días. En el día cuatro, las células se trataron con uno de los siguientes: 1 µM RA solo; 1 µM RA en combinación con otro FGF-4 o FGF-10; o 1 µM RA en combinación con ambos FGF-4 y FGF-10. La expresión de PDXl, S0X7 y NFM se cuantificó por Q-PCR noventa y seis horas después de RA o RA/FGF. El tratamiento de cultivos de hESC con activina seguido por ácido retinoico induce a incremento de 60 veces en la expresión genética de PDXl. La adición de FGF-4 al tratamiento de RA tratamiento induce ligeramente más a PDXl (aproximadamente 3 veces sobre el RA solo) . Sin embarago, al agregar FGF-10 y ácido retinoico juntos, la inducción de PDXl se mejoró adicionalmente 60 veces sobre RA solo (ver la Figura 37A) . Esta inducción de PDXl muy robusta fue mayor que las 1400 veces más elevadas que con el tratamiento sin activina o RA/FGF. De manera interesante, la adición de FGF- 4 y FGF-10 simultáneamente abolieron el efecto benéfico del FGF-10, que produce solo el incremento de PDXl modesto atribuido a la adición de FGF-4. La adición de combinaciones de RA/FGF-4 o RA/FGF-10 no incrementan la expresión de genes marcadores no asociados con el endodermo de intestino delantero embrionario cuando se compara a células no expuestas a combinaciones RA/FGF (ver las Figura 37B-C) . EJEMPLO 14 Posición Anterior-Posterior (A-P) de los Efectos de la Dosis de Ácido Retinoico In Vi tro Para determinar si la dosis de RA afecta la posición A-P en los cultivos celulares in vi tro, se realizaron los siguientes experimentos. Las células germinales embrionarias humanas se cultivaron con o sin activinas durante cuatro días. En el día cuatro, se agregó FGF-10 a 50 ng/ml al cultivo en combinación con RA a 0.04 µM, 0.2 µM o 1.0 µM. La expresión del gen marcador PDXl así como otros marcadores no específicos para el endodermo de intestino delantero embrionario se cuantificó por Q-PCR. La adición del ácido retinoico a varias dosis, en combinación con FGF-10 a 50 ng/ml, indujo los patrones de expresión genética diferencial que se correlacionan con patrones posicionales anterior-posterior específicos. La dosis más alta de RA (1 µM) preferentemente induce la expresión del marcador de endodermo anterior (HOXA3) y también produce el incremento más robusto en PDXl (Figura 38A-B) . La dosis media de RA (0.2 µM) induce los marcadores endodermo del intestino medio (CDX1, HOXC6) (ver Figura 38C y 41E) , mientras la dosis más baja de RA (0.04 µM) induce preferentemente un marcador de endodermo de intestino posterior (HOXA13) (ver Figura 38D) . La dosis de RA esencialmente no tiene efecto sobre la expresión relativa de cualquiera de los marcadores neural (SOXl) o neuronal (NFM) (ver las Figura 38F-G) . Este ejemplo destaca el uso de RA como un morfogen in vi tro y en particular como un morfogen de endodermo derivado de hESCs de diferenciación.
EJEMPLO 15 El Uso del Suplemento B27 Mejora la Expresión de PDXl La expresión de PDXl en endodermo definitivo puede influenciarse por el uso de varios factores y condiciones de crecimiento/diferenciación celular. En el siguiente experimento, mostramos que el uso del suplemento B27 mejora la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo. Las células germinales embrionarias humanas se indujeron para diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento crecimiento de células hES no diferenciadas en alimentadores de fibrobasto embriorario de ratón con dosis elevadas de activina A (100-200 ng/ml en 0.5-2 % FBS/DMEM/F12) durante 4 días. El control sin activina A recibió 0.5-2 % FBS/DMEM/F12 sin agregar activina A. A los cuatro días, los cultivos recibieron cualquiera de no activina A en 2% de FBS (ninguno) , y en 2% de remplazo de suero (SR), o 50 ng/ml de activina A junto con 2 µM RA y 50 ng/ml de FGF-10 en 2% FBS/DMEM/F12 (ninguno, +FBS, +B27) y de manera similar en 2% de Remplazo de suero (SR) . El suplemento B27, (Gibco/BRL), se agregó como una dilución 1/50 directamente en 2% FBS/DMEM/F12 (+B27) . Las células duplicadas se muestrearon en donde tomaron por cada punto, y el ARN total se aisló y sometió a Q-PCR como se describió previamente . La Figura 39A-E muestra eue el suplemento B27 libre de suero proporciona un beneficio adicional para la inducción de la expresión genética de PDXl sin inducir un incremento en la expresión de marcadores genéticos no específicos para el endodermo de intestino delantero embrionario según se compara con tal marcador de expresión genética en células desarrolladas si suero. EJEMPLO 16 Uso de Activina B para Mejorar la Inducción de PDXl Este Ejemplo muestra que el uso de activina B mejora la diferenciación de células negativas a PDXl a células positivas a PDXl en cultivo celular in vi tro . Las células germinales embrionarias humanas se indujeron a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de hESCs no diferenciadas desarrolladas en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón con dosis altas de activina A (50 ng/ml) en bajo en suero/RPMI durante 6 días. La dosis de FBS fue 0% en el día uno, 0.2% en el día dos y 2% en los días 3-6. El control negativo para la producción de endodermo definitivo (NF) recibió 2% de FBS/RPMI sin agregar activina A. A fin de inducir la expresión de PDXl, cada uno de los cultivos recibió ácido retinoico a 2 µM en 2% FBS/RPMI en el día 6. Los cultivos tratados con activina A en los días uno a cinco se proporcionaron con diferentes combinaciones de dosis de activina A y activina B o permanecieron con activina A solo a 50ng/ml. El cultivo control (NF) sin activina A no se proporcionó ni con activina A ni activina B. Este tratamiento de RA/activina se llevó a cabo durante 3 días en cuyo tiempo se midió la expresión genética PDXl mediante Q-PCR por muestras de células en duplicado. La Figura 40A muestra que la adición de activina B a dosis que varía de 10-50 ng/ml (alO, a25 y a50) en la presencia de 25 ng/ml (A25) o 50 ng/ml (A50) de activina A incrementó la expresión de PDXl al menos 2 veces sobre el cultivo que recibió solo activina A a 50 ng/ml. El incremento en PDXl como resultado de la adición de activina B fue sin incremento en la expresión de HNF6 (ver Figura 40B) , que es un marcador para hígado así como para páncreas en este momento del desarrollo. Este resultado sugiere que la proporción de células que se diferencian a páncreas se han incrementado con relación a hígado. EJEMPLO 17 Uso de Dosis de Suero para Mejorar la Inducción de PDXl La expresión de PDXl en células de endodermo definitivo se influencia por la cantidad de suero presente en el cultivo celular a través de todo el proceso de diferenciación. El siguiente experimento muestra que el nivel de suero en un cultivo durante la diferenciación de hESCs a endodermo definitivo negativo a PDXl tiene un efecto sobre la expresión de PDXl durante la diferenciación adicional de estas células a endoderm positivas a PDXl. Las células germinales embrionarias humanas se indujeron a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de hESCs no diferenciadas desarrolladas en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón con dosis altas de activina A (100 ng/ml) en bajo en suero/RPMI durante 5 días. La dosis de FBS fue 0.1% en el día uno, 0.5% en el día dos y cualquiera de 0.5%, 2% o 10% en los días 3-5. El control sin activina A (NF) recibió la misma dosificación diaria de FBS/RPMI, pero sin agregar activina A. La expresión de PDXl se indujo iniciando en el día 6 mediante la adición de RA. Durante los días 6-7, los cultivos recibieron ácido retinoico a 2 µM en 0.5% FBS/RPMI, 1 µM el día 8 y 0.2 µM el día 9-11. La activina A se disminuyó a 50 ng/ml durante el tratamiento de ácido retinoico y se dejó ausente del control sin activina A (NF) . La Figura 41A muestra que la dosificación con FBS durante el periodo de 3 días de inducción de endodermo definitivo (días 3, 4 y 5) tuvo una capacidad final de cambiar la inducción de la expresión genética de PDXl durante el tratamiento de ácido retinoico. Este fue sin alteración significativa en el patrón de expresión de ZIC1 (Figura 41B) o expresión genética de SOX7 (Figura 41C) . EJEMPLO 18 Uso de Medio Condicionado para Mejorar la Inducción de PDXl También se estudiaron otros factors y condiciones de crecimiento que influencian la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo. El siguiente experimento muestra el efecto de medio condicionado en la diferenciación de células de endodermo definitivas negativas a PDXl a células de endodermo positivas a PDXl. Las células germinales embrionarias humanas se indujeron a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de hESCs no diferenciadas desarrolladas en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón con dosis altas de activina A (100 ng/ml) en bajo en suero/RPMI durante 5 días. La dosis de FBS fue de 0.2% en el día uno, 0.5% en el día dos y 2% en los días 3-5. Los cultivos de endodermo definitivo generado por los 5 días de tratamiento de activina A se indujeron entonces a diferenciarse a PDXl expresando el endodermo mediante la adición de RA en 2% FBS/RPMI conteniendo activina A en 25 ng/ml durante cuatro días. El RA fue 2 µM durante los dos días de addition, 1 µM en el tercer día y 0.5 µM en el cuarto día. Este medio base para la inducción de PDXl se proporcionó fresco (2A25R) o después de acondicionado durante 24 horas por de una a cuatro diferentes poblaciones celulares. El medio condicionado (CM) se generó de ya sea fibroblastos embriónicos de ratón (MEFCM) o de hESCs que se diferenciaron primero durante 5 días por una de tres condiciones; i) 3% FBS/RPMI (CM2), o ii) activina A (CM3) o iii) proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) (CM4). Los factores de Activina A o BMP4 se proporcionaron a 100 ng/ml bajo el mismo régimen de dosificación de FBS arriba descrito (0.2%, 0.5%, 2%). Estos tres diferentes paradigmas de diferenciación produjeron tres poblaciones muy diferentes de células humanas mediante lo cual el medio de inducción de PDXl puede ondicionarse . El 3% de FBS sin agregar factor de crecimiento (NF) produjo una población heterogénea comparada a la mayor parte de células de endodermo extraembrionario, ectodermo y mesodermo. El cultivo tratado con activina A (AlOO) produjo una gran proporción de endodermo definitivo y el cultivo tratado con BMP4 (B100) produjo principalmente trofectodermo y lo mismo de endodermo extraembrionario. La Figura 42A muestra que PDXl se indujo de manera equivalente en medio condicionado fresco y sobre los dos primeros dos días de tratamiento de RA. Sin embarago, para el tercer día la expresión de PDXl inició a descender en los tratamientos de medio fresco y medio condicionado MEF. Las hESCs diferenciadas produjeron medio condicionado que dio como resultado el mantenimiento o incremento adicional en la expresión genética de PDXl a niveles de 3 a 4 veces mayor que el medio fresco. El efecto de mantener alto la expresión de PDXl en medio condicionado de hESC se amplificó adicionalmente en los cuatro días de tratamiento RA alcanzando niveles 6 a 7 veces más altos que el medio fresco. La Figura 42B muestra que los tratamientos de medio condicionado dan como resultado vibeles mucho menores de la expresión genética de CDX1, un gen no expresado en la región del endodermo que expresa PDXl. Esto indica que la pureza tdtal del endodermo que expresa PDXl mejoró mucho al tratar el endodermo definitivo con medio condicionado generado de cultivos hESC diferenciados. La Figura 43 muestra que la expresión genética de PDXl exhibió una respuesta de dosis positiva a la cantidad de medio condicionado aplicado a las células de endodermo definitivo. El volumen total de medio agregado a cada placa fue 5 ml y el volumen indicado (ver Figura 43) de medio condicionado se diluyó en medio fresco (A25R) . Se nota que solo 1 ml de medio condicionado agregado en 4 ml de medio fresco fue aún capaz de inducir y mantener mayores niveles de expresión de PDXl que 5 ml de medio fresco solo. Esto sugiere que el efecto benéfico del medio condicionado para la inducción de endodermo que expresa PDXl depende de la liberación de la misma sustancia o sustancias de las células en el medio condicionado y que estas sustancia (s) dependiente de la dosis mejora la producción de endodermo que expresa PDXl. EJEMPLO 19 Validación de Anticuerpos que se Unen a PDXl Los anticuerpos que se unen a PDXl son herramientas útiles para monitorear la inducción de la expresión de PDXl en una población celular. Este Ejemplo muestra que anticuerpos policlonales de conejo e IgY a PDXl pueden utilizarse para detectar la presencia de esta proteína. En un primer experimento, el anticuerpo IgY anti-PDX1 (IgY a-PDXl) que se une a PDXl en células lisadas se validó mediante inmunoanálisis Western. En este análisis, se comapró la unión del anticuerpo IgY a-PDXl a 50 µg de lisado celular total de fibroblastos humanos MDX 12 o células MDX 12 transfectadas 24 horas previamente con la expresión del vector PDXl. El lisado celular comparado separado por SDS-PAGE, transferido a una membrana mediante electroinmunoanálisis, y después probado con antisuero primario de IgY a-PDXl seguido por anticuerpos secundarios anti-IgY (Rb a-IgY) de conejo conjugados con fosfatasa alcalina. Diferentes dilusiones de anticuerpos primarios y secundarios se aplicaron a tiras separadas de la membrana en las siguientes combinaciones: A (500x dilución de primario, 10,000x dilución de secundario), B (2,000x, 10,000x), C (500x, 40,000x), D (2,00Ox, 40,000), E (8,00Ox, 40,000x). La unión se detectó en células transfectadas con la expresión del vector PDXl (positivas a PDXl) en todas las combinaciones de anticuerpo probadas. La unión solo se observó en fibroblastos no trasfectados (negativos a PDXl) cuando se utilizarn las concentraciones más altas de ambos el anticuerpo primario y el secundario juntos (combinación A) . Tal unión no específica se caracterizó por la detección de una banda adicional en un peso molecular ligeramente más alto que PDXl en ambos los fibroblastos transfectados y los no transfectados. En un segundo experimento, a unión del anticuerpo policlonal de conejo anti-PDXl (Rb a-PDXl) a PDXl se probó mediante inmunocitoquímica. Para producir una célula que xpresa PDXl para tales experimentos, se transfectaron células MS1-V (ATCC # CRL-2460) de manera transitoria con un vector de expresión de PDX1-EGFP (construido utilizando pEGFP-Nl, Clontech) . Las células transfectadas se etiquetaron entonces con Rb a-PDXl y antisuero a-EGFP. Las células transfectadas se visualizaron mediante ambos fluorescencia EGFP así como inmunocitoquímica a-EGFP a través del uso de un anticuerpo secundario conjugado a Cy5. La immunofluorescencia PDXl se visualizó a través del uso de un anticuerpo secundario conjugado a a-Rb Cy3. La unión del anticuerpo Rb a-PDXl y el a-EGPF se co-localizó con la expresión de GPF EJEMPLO 20 Inmunocitoquímica de Tejido Pancreático Humano Este Ejemplo muestra que el anticuerpos que tiene especificidad para PDXl puede utilizarse para identificar células humanas positivas a PDXl mediante inmunocitoquímica. En un primer experimento, secciones embebidas de parafina de páncreas humano se tiñeron para insulina con anticuerpo primario de insulina anti-cobayo (Gp a-Ins) a una dilución de 1/2*00 seguida por anticuerpo secundario de cobayo anti-perro (D a-Gp) conjugatedo a Cy2 en una dilución 1/100. En un segundo experimento, las mismas secciones embebidas de parafina de páncreas humano se tiñeron para PDXl con anticuerpo primario IgY a-PDXl a una dilución 1/4000 seguida por anticuerpo secundario Rb a-IgY conjugado a AF555 a una diluciónl/300. S recolectaron las imágenes del primero y segundo experimentos enb donde se fundieron. En un tercer experimento, las células que se tiñeron con anticuerpos IgY a-PDXl también se tiñeron con DAPI . El análisis de las secciones pancreáticas humanas revelaron la presencia de tinciones fuertes de islotes de Langerhans. Aunque la señal más fuerte de PDXl aparece en los islotes (positivas a insulin) , también se observa tinción más débil en tejido acinar (negativo a insulin). La co-tinción de DAPI y PDXl muestran que PDXl estuvo principalmente pero no exclusivamente localizada en los núcleos . EJEMPLO 21 Immunoprecipitación de PDXl a partir de Células Tratadas con Ácido Retinoico Para confirmar adicionalmente la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo que se han diferenciado en la presencia de RA y la carencia de PDXl en células de endodermo definitivo que no se han diferenciado con RA, un anticuerpo PDXl anti-conejo (Rb a-PDXl) se utilizó para immunoprecipitar PDXl a partir de ambas células RA diferenciadas y no diferenciadas de endodermo definitivo. El RA inmunoprecipitado se detectó mediante inmunoanálisis Western utilizando anticuerpo IgY a-PDXl. Para obtener lisado de células de endodermo definitivo no diferenciadas y diferenciadas para immunoprecipitación, las hESCs se trataron durante 5 días con activina A a 100 ng/ml en bajo en suero (endodermo definitivo) seguido por el tratamiento con activina A a 50 ng/ml y 2 µM todos-trans RA durante dos días, 1 µM por un día y 0.2 µM por un día (endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl) . Como un control positivo el lisado celular también sepreparó a partir de células MS1-V (ATCC # CRL-2460) transfectadas con un vector de expresión PDXl. PDXl se immunoprecipitó al agregar Rb a-PDXl y anticuerpos secundarios específico de conejo en cada lisado. El precipitado se cosechó mediante centrifugación. Los inunoprecipitados se disolvieron en amortiguador conteniendo SDS después de cargarlo en gel de poliacrilamida. Después de la separation, las proteínas se transfirieron a una membrana mediante electroinmunoanálisis, y después se probaron con el anticuerpo primario IgY a-PDXl seguido por anticuerpos secundarios Rb a-IgY. Los inmunoprecipitados recolectados de las células control positivas a MSl-V así como aquellas células del día 8 (línea d8, tres días después del inicio del tratamiento RA) y día 9 (línea d9, cuatro días después del inicio de RA) fueron positivas para la proteína PDXl (Figura 44). Los precipitados obtenidos de células no diferenciadas de endodermo definitivo (es decir, día 5 células tratadas con activina A — designadas (A) en la Figura 44) y hESCs no diferenciadas (es decir, células no tratadas día 5 designadas como (NF) en la Figura 44) fueron negativas a PDXl. EJEMPLO 22 Generación de promotor PDXl- líneas hESC transgénicas EGFP A fin de utilizar el marcador PDXl para el aislamiento celular, nos dirigimos genéticamente a células de endodermo de intestino delantero embrionario positivas a PDXl con un gen informador expresable. Este Ejemplo describes la construcción de un vector que comprende un cásete informador que comprende un gen informador bajo el control de la región de regulación PDXl. Este Ejemplo también describe la preparación de una célula, tales como una célula germinal embrionaria humana, transfectada con este vector así como una célula que tiene el cásete informador integardo en su genoma. Las líneas celulares de endodermo definitivo que expresan PDXl dirigidas genéticamente con un gen informador se construyeron al colocar un gen informador GFP bajo el control de la región reguladora (promotor) del gen PDXl.
Primero, una construcción de plásmido en la cual la expresión de EGFP se activa por el promotor genético PDXl humano se generó al recolocar el promotor CMV del vector pEGFP-Nl (Clontech) con la región de control PDXl humana (Genbank Acceso No. AF192496) , que comprende una secuencia nucleótida que varía de aproximadamente 4.4 kilopares base (kb) corriente arriba a aproximadamente 85 pares de bases (bp) corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción PDXl. Esta región contiene los elementos de regulación característicos del gen PDXl, y es suficiente para conferir el patrón de expresión PDXl normal en el ratón transgénico. En el vector resultante, la expresión de EFGPse dirige por el promotor PDXl. En algunos experimentos, este vector puede transfectarse en hESCs. El cásete promoter PDXl /EGFP se separó del vector anterior, y después se subclonó un vector d selección conteniendo el gen de neomicin fosfotransferasa bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa-1. El cásete de selección se flanqueó por sitios de reconocimiento de flp recombinasa para permitir el retiro del cásete. Este vector de selección se linearizó, y después se introdujo en hESCs utilizando métodos lipofección estándar. Después de los días 10-14 de la selección en G418, los clones de hESC transgénicos no diferenciados se aislaron y se expandieron. EJEMPLO 23 Aislamiento de Endodermo de Intestino Delantero Embrionario Positivo a PDXl Los siguientes Ejemplos demuestran que hESCs que comprenden el cásete promoter PDX1/EGFP puede diferenciarse en células d endodermo positivas a PDXl y después aislarse subsecuentemente por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las hESCs de promoter PDX1/EGFP transgénico se diferenciaron durante 5 días en medio conteniendo activina A seguido por dos días en medio que comprenden activina A y RA. Las células diferenciadas se cosecharon entonces mediante digestión con tripsina y se clasificaron en un Becton Dickinson FACS Diva directamente en amortiguador de lisis de o PBS. Una muestra de células vivas simples se tomaron sin selección periódica para EGFP (Vivas) y células vivas simples se introdujeron en las poblaciones EGFP positive (GFP) y GFP negative (Neg) . En un experimento, la fracción EGFP positiva se separó en dos poblaciones igualmente dimensionadas de acuerdo con la intensidad de fluorescencia (Hi y Lo) (Alto y Bajo) .
Siguiendo la clasificación, las poblaciones celulares se analizaron tanto por Q-PCR como por inmunocitoquímica. Para el análisis Q-PCR, el ARN se preparó utilizando columnas Qiagen RNeasy y después se convirtieron a ADNc. Q-PCR se construyó como se describió previamente. Para el análisis de inmunocitoquímica, las células se clasificaron en PBS, se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4%, y se adhirieron a portaobjetos de vidrio utilizando una centrífuga Cytospin. Los anticuerpos primarios a Cytokeratinl9 (KRT19) fueron de Chemicon; para el Hepatocito el factor 3 beta nuclear (HNF3ß) de Santa Cruz; para el Transportador de Glucosa 2 (GLUT2) de sistemas R&D. Los anticuerpos secundarios apropiados conjugados a FITC (verde) o Rhodamine (rojo) se utilizaron para detectar la unión de los anticuerpos primarios. Una clasificación de FACS típica de células diferenciadas se muestra en la Figura 45. El porcentaje de células positivas a PDXl aislado en este ejemplo fue aproximadamente 7%, el cual varió dependiendo de la eficiencia de diferenciación de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%. Las células clasificadas se sometieron adicionalmente a análisis Q-PCR. Las células diferenciadas mostraron una correlación de fluorescencia EGFP con la expresión genética de PDXl endógeno. En comparación a las células no fluorescentes, las células positivas a EGFP mostraron incremento de más de 20 -veces la expresión de los niveles de PDXl (Figura 46) . La separación de células de intensidad de EGFP alta y baja indica que el nivel de expresión EGFP se correlaciona con la expresión del nivel de PDXl (Figura 47) . Además para el análisis del marcador PDXl, las células clasificadas se sometieron a análisis Q-PCR de varios genes que se expresan en el endodermo pancreático. Los productos de cada uno de estos marcadores genéticos (NKX2.2, GLUT2, KRT19, HNF4a y HNF3ß) se enriquecieron todos en la fracción positiva de EGFP (Figuras 48 A-E). En contraste, los marcadores neurales ZIC1 y GFAP no se enriquecieron en las células que expresan EGFP clasificadas (Figuras 49A y B) . Mediante inmunocitoquímica, virtualmente todas las células positivas a PDXl aisadas se observaron que expresaron KRT19 y GLUT2. Este resultado se espera para células del linaje de endodermo pancreático. Muchas de estas células también fueron positivas a HNF3ß al teñir el anticuerpo. Los métodos, composiciones, y dispositivos descritos en la presente son actualmente representativos de las modalidades preferidas y son ejemplificativos y no se pretenden como limitación al alcance de la invención. Los cambios a la presente y otros usos se les ocurrirán a los de experiencia en la materia los cuales se encuentran comprendidos dentro del espírutu de la invención y se definen por el alcance de la descripción. De acuerdo con lo anterior, será aparente para alguien de experiencia en la materia que varias sustituciones y modificaciones pueden hacerse a la invención descrita en la presente sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Como se utiliza en las reivindicaciones de abajo y a través de esta exposición, por la frse "que consiste esencialmente de" significa que incluye cualquier elemento listado después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren o contribuyen a la actividad o acción especificada en la exposición para los elementos listados. Así, , la frase "que consiste esencialmente de" indica que los elementos listados se requieren o son mandatarios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar prsentes dependiendo de si o no afectan la actividad o acción de los elementos listados.
Referencias Numerosa literatura y referencias de patente se han citado en la presente solicitud de patente. Para algunas referencias, la cita completa se encuentra en le cuerpo del texto. Para otras referencias la cita en el cuerpo del texto es por autor y año, siendo la cita completa como sigue: Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., y Stainier, D. Y. (1999). Casanova juega un rol temprano y esencial en la formación de endodermo en el pez cebra. Dev Biol 215, 343-357. Alexander, J., y Stainier, D. Y. (1999). Una trayectoria molecular que conduce a la formación de endodermo en el pez cebra. Curr Biol 9, 1147-1157. Aoki, T. O., Mathieu, J., Saint-Etienne, L., Rebagliati, M. R., Peyrieras, N., y Rosa, F. M. (2002). Regulación de señalización nodal y formación de mesendodermo por TARAM-A, un receptor tipo I relacionado a TGFbeta. Dev Biol 241, 273-288. Beck, S., Le Good, J. A., Guzman, M., Ben Haim, N., Roy, K., Beermann, F., y Constam, D. B. (2002). Proteasas extra-embrionarias regulan la señalización Nodal durante la gastrulación. Nat Cell Biol 4, 981-985. Beddington, R. S., Rashbass, P., y Wilson, V. (1992). Brachyury-un gen que afecta la gastrulación del ratón la organogénesis temprana. Dev Suppl, 157-165. Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C, y Ratnam, S. (1994). Aislamiento y cultivo de células de masa celular interna de blastocistos humanos. Hum Reprod P, 2110-2117. Chang, H., Brown, C. W., y Matzuk, M. M. (2002).
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Claims (28)

  1. REI INDICACIONES 1. Un cultivo celular que comprende células humanas, en donde al menos aproximadamente 2% de dichas células humanas son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas al factor 1 de caja homeótica pancreático-duodenal (PDXl) , siendo dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl, células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejido u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo.
  2. 2. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente el 5% de dichas células humanas son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  3. 3. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente el 10% de dichas células humanas son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  4. 4. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente el 25% de dichas células humanas son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  5. 5. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde se encuentran presentes células humanas alimentadoras en dicho cultivo y en donde al menos aproximadamente el 2% de las células humanas diferentes a dichas células humanas alimentadoras son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  6. 6. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl expresan el gen caja homeótica A13 (HOXA13) .
  7. 7. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl expresan el gen caja homeótica C6 (HOXC6) .
  8. 8. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl expresan SOX1 .
  9. 9. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión de un marcador seleccionado del grupo que consiste de alfa-fetoproteína (AFP), SOX7, SOXl, ZIC1 y NFM en dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  10. 10. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde dicho cultivo celular se encuentra sustancialmente libre de células seleccionadas del grupo que consiste de células endodérmicas viscerales, células endodérmicas parietales y células neurales.
  11. 11. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente 1 célula de endodermo del intestino delantero embrionario positiva a PDXl se encuentra presente por aproximadamente cada 10 células de endodermo definitivo negativas a PDXl en dicho cultivo celular.
  12. 12. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente 1 célula de endodermo del intestino delantero embrionario positiva a PDXl se encuentra presente por aproximadamente cada 5 células de endodermo definitivo negativas a PDXl en dicho cultivo celular.
  13. 13. El cultivo celular de la reivindicación 1, en donde al menos aproximadamente 1 célula de endodermo del intestino delantero embrionario positiva a PDXl se encuentra presente por aproximadamente cada 4 células de endodermo definitivo negativas a PDXl en dicho cultivo celular.
  14. 14. El cultivo celular de la reivindicación 1 que comprende además una célula germinal embriónica.
  15. 15. El cultivo celular de la reivindicación 14, en donde dicha célula germinal embriónica se deriva de un tejido seleccionado del grupo que consiste de la mórula, la masa celular interna (ICM) de un embrión y los bordes gonadales de un embrión.
  16. 16. El cultivo celular de la reivindicación 1 que comprende además un retinoide.
  17. 17. El cultivo celular de la reivindicación 16, en donde dicho retinoide es ácido retinóico (RA) .
  18. 18. El cultivo celular de la reivindicación 1 que comprende además FGF-10.
  19. 19. El cultivo celular de la reivindicación 1 que comprende además B27.
  20. 20. El cultivo celular de la reivindicación 1 que comprende además tanto RA como FGF-10.
  21. 21. El cultivo celular de la reivindicación 20 que comprende además B27.
  22. 22. Una población celular que comprende células, en donde al menos aproximadamente 90% de dichas células son células de endodermo del intestino delantero embrionario positiva a PDXl humanas, siendo dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl, células multipotentes que pueden diferenciarse en células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo digestivo.
  23. 23. La población celular de la reivindicación 22, en donde al menos aproximadamente el 95% de dichas células son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  24. 24. La población celular de la reivindicación 22, en donde al menos aproximadamente el 98% de dichas células son células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
  25. 25. La población celular de la reivindicación 22, en donde dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl expresan el gen H0XA13.
  26. 26. La población celular de la reivindicación 22, en donde dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl expresan el gen HOXC6.
  27. 27. La población celular de la reivindicación 22, en donde dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl expresan S0X17.
  28. 28. La población celular de la reivindicación 22, en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión de un marcador seleccionado del grupo que consiste de AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y NFM en dichas células de endodermo del intestino delantero embrionario positivas a PDXl.
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