MXPA05008713A - Agente terapeutico para dano de medula espinal que comprende antagonista de interluceina-6. - Google Patents

Abstract

Un agente terapeutico para dano de medula espinal, un modulador de diferenciacion de celulas de tallo neurales y un inhibidor de diferenciacion hacia celulas guia que compre un antagonista de interleucina-6 como un ingrediente activo.

Description

AGENTE TERAPÉUTICO PARA DAÑO DE MÉDULA ESPINAL QUE COMPRENDE ANTAGONISTA DE INTERLUCEINA-6 Campo Técnico La presente invención se relaciona con un agente terapéutico para daño de médula espinal que comprende antagonista de interleucina-6 { IL-6 ) como un ingrediente activo. En la sociedad de la actualidad, una persona puede padecer el daño a la médula espinal debido a un accidente de vehículo de motor, una calda, una rodada, un daño deportivo y lo semejante. En Japón, el número anual de gente' dañada es aproximadamente 5,000 con un número acumulativo de pacientes que totaliza posiblemente 100,000. Los síntomas de daño de médula espinal son muy severos incluyendo cuadriplegia permanente, parálisis motora y parálisis sensorial, desórdenes de vejiga y recto, desórdenes respiratorios, etc., y el manejo diario de los mismos incluye rehabilitación, manejo respiratorio, prevención de úlcera por decúbito, el manejo de defecación y orina, y lo semejante. Como regímenes terapéuticos para daño de médula espinal, no hay actualmente disponibles métodos efectivos de tratamiento y solamente hay tratamientos sintomáticos que incluyen estabilización local tal como cirugía. A fin de prevenir el agravamiento de condiciones patológicas, se han administrado esteroides en cantidades grandes, pero no se han obtenido resultados que indiquen recuperación de parálisis. Muchos daños de la médula espinal empiezan con un daño (daño primario) por una acción mecánica externa y progresan adicionalmente a destrucción de tejido (daño secundario) a través de trayectorias de reacción en el cuerpo vivo. la única droga para usar al inhibir la progresión de estos daños secundarios es metil prenisolona, que se ha administrado en cantidades tan grandes como casi 10000 mg. Se ha reportado, sin embargo, que este método está asociado con efectos laterales tales como agravamiento de diabetes mellitus y neumonía. A principios del Siglo XIX, Ramón y Cajal, un neuroanatomista, manifestó en su libro ?1 sistema nervioso central (el cerebro y la médula espinal) de mamíferos es incapaz de regeneración una vez que se ha dañado", y desde entonces esto se ha creído. En los años 1980, sin embargo, el implante de nervios periféricos para daño de la médula espinal (A. Aguaya y col., J. Exp. Bilo. 95:231-240, 1981) y el implante de médula espinal de feto (Bregman B.S., Dev.

Brain Res., 34:265-279, 1987) se han reportado, indicando que aún después de daño de médula espinal la regeneración de axones dañados se puede observar si se ha introducido un ambiente apropiado en el sitio dañado. Asimismo, una multiplicidad de reportes sobre regeneración axonal se ha hecho de modo que la promoción de regeneración de axones dañados por factores neorotróficos (Cai, D., y col., Neuron, 22:89-101, 1999), la identificación de factores inhibitorios de crecimiento axonal (Chen. D. , y col., Nature 403:434-439, 2000) y lo semejante, sugiriendo que la regeneración de daño de médula espinal dañada se puede convertir en una realidad. Sin embargo, la aplicación clinica del implante de la médula espinal de feto es muy difícil debido a la falta de donadores y a problemas éticos . Además, las células de tallo neurales son (pluripotentes ) células no diferenciadas del sistema nervioso que se pueden propagar y pasajes repetidos (capacidad de auto replicación) y generar simultáneamente tres tipos de células (neuronas, astrocitos, oligodendrocitos ) que constituyen el sistema nervioso central y, como también ocurren en la médula espinal de adulto, se supone que son capaces de reparar tejidos dañados. De hecho, sin embargo, no se diferencian en neuronas después del daño, y todas se diferencian en células glia formando de estar manera cicatrices. Hay reportes esporádicos sobre citoquinas involucradas en la inducción de diferenciación en células de tallo neurales. Weiss y col., reportaron que la diferenciación de células de tallo neurales derivadas del cuerpo estriado de un feto de ratón en neuronas se promueve mediante factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Ahmed, S., y col., J. Neurosci. 150:5765-5778, 1995). Ghosh y col., también reportaron que la diferenciación de células de tallo neurales derivadas de la piel cerebral de un feto de rata en neuronas de promueve mediante neurogrofina-3 (NT-3) (Ghosh, A., y col., Neuron 15:89-103, 1995) . c ay y col., reportaron que la diferenciación de células de tallo neurales derivadas del hipocampo de un feto de rata se induce "instructivamente" hacia neuronas mediante factor neurotrófico derivado de plaqueta (PDNF) , hacia astrocitos mediante factor neurotrófico ciliar (CNTF) , y hacia oligodendrocitos mediante hormona de tiroides (T3) (Jone, J. , y col., Gene & Dev. 10:3129-3140) . Además, Taga y col., recientemente reportaron que la diferenciación de células de tallo neurales derivadas de células epiteliales neurales de un feto de ratón en astrocitos se promueve por factor inhibitorio de leucemia (LIF) y proteina-2 morfogénica de hueso (BMP-2) (Nakashima y col., Science 284:479-482, 1999). Son comunes a estos reportes las llamadas superfamilia IL-6 tales como CNTF y LIF. De esta manera, una señal via gpl30, . que es una subunidad del receptor de citocina, se cree que induce la diferenciación de células de tallo neurales en astrocitos. Sin embargo, no hay literatura que demuestra que el daño de médula espinal se puede reparar por la inducción de diferenciación de células de tallo neurales por citocinas . IL-6 es una citocina que también se llama factor 2 de estimulación de célula B (BSF2) o interferón ß2 . IL-6 se descubrió como un factor de diferenciación involucrado en la activación de células B-linfáticas (Hirano, T., y col., Nature 81986) 324, 73-76) . Posteriormente, se encontró que es una citocina multifuncional que influencia varias funciones de la célula (Akira, S., y col., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78) . IL-6 se ha reportado que induce la maduración de células T-linfáticas (lotz, M. , y col., J. Exp. Med. 81988) 167, 1253-1258). IL-6 transmite su actividad biológica a través de dos tipos de proteínas en la célula. Uno de ellos es receptor de IL-6, una proteína de se liga a ligando con un peso molecular de aproximadamente 80 kD, al qúe se liga IL-6 (Taga, . , y col., J. Exp. ¾ed. 81987) 166-967-981; Yamasaki, . , y col., Science 81987) 241, 825-828). El receptor de IL-6 ocurre no solamente en la forma ligada a membrana que penetra a través y se expresa sobre la membrana de célula, sino también como un receptor de IL-6 soluble que consiste principalmente de la región extracelular. La otra es una proteína ligada a membrana gpl30 que tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kD que está involucrada en transducción de señal de enlace de no ligando. IL-6 y receptor de IL-6 forman el complejo receptor de IL-6/IL-6 que, después de ligarse a gpl30, transmite la actividad biológica de IL-6 a la célula (Taga, T., y col., Cell 81989) 58, 573-581). Un antagonista de IL-6 es una substancia que inhibe la transducción de actividad biológica de IL-6. Se han conocido hasta ahora anticuerpo dirigido contra IL-6 (anticuerpo contra-IL-6) , anticuerpo dirigido contra receptor de IL-6 (anticuerpo contra receptor de IL-6) , anticuerpo dirigido contra gpl30 (anticuerpo contra gpl30), IL-6 alterado, péptidos parciales de IL-6 o receptor de IL-6 y lo semejante. El anticuerpo contra receptor de IL-6 se ha descrito en diversos reportes (Novick D., y col., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W., y col., Hybridoma 81993) 12, 621-630, Publicación de Patente Internacional WO 95-09873, Solicitud de Patente francesa FR 2694767, Patente de Estados Unidos US521628) . El anticuerpo PM-1 humanizado se obtuvo trasplantando la región determinante de complementariedad (CDR) de uno de ellos, un anticuerpo PM-1 de ratón (Hirata, Y., y col., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906), a un anticuerpo humano (la publicación de Patente Internacional WO 92-19759) .

Documento de Patente 1: WO95-09873 Documento de Patente 2: FR 2694767 Documento de Patente 3: USP 0521628 Documento de no patente 1: A. Aguayo y col., J. Exp. Bilo. 95:231-240, 1981 Documento de no patente 2: Bregman B.S., Dev. Brain Res. 34:265-279, 1987 Documento de no patente 3: Cai, D., y col., Nerón 22:89-101, 1999 Documento de no patente 4: Chen. D., y col., Nature 403:434-439, 2000 Documento de no patente 5: Ahmed, S., y col., J. Neurosci. 150:5765-5778, 1995 Documento de no patente 6: Ghosh, A., y col., Neuron 15:89-103, 1995 Documento de no patente 7: Jone, K. , y col., Gene & Dev. 10:3129-3140, 1996 Documento de no patente 8: Nakashima, K. , y col., Science 284:479-482, 1999 Documento de no patente 9: Hirano, T., y col., Nature (1986) 324, 73-76 Documento de no patente 10: Akira, S., y col., Adv. In Immunology 81993) 54, 1-78 Documento de no patente 11; Lotz, M. , y col., J. Exp. Med. 81988) 167, 1253-1258 Documento de no patente 12: Taga, T., y col., Cell 81989) 58; 573-581 Documento de no patente 13: Yamasaki, K. , y col., Science (1987) 241, 825-828 Documento de no patente 14: Novick, D., y col., Hybridoma (1991) 10, 137-146 Documento de no patente 15: Huang, Y.W., y col., Hybridoma (1993) 12, 621-630 Documento de no patente 16: Hirata, Y., y col., J. Immunol. (1989)) 143, 1900-2906 Exposición de la Invención De esta manera, existe la necesidad de un medio terapéutico que no solo prevenga el agravamiento de condiciones de un daño _ de médula espinal, sino también ayude a la recuperación del mismo, y la presente invención proporciona una composición farmacéutica útil como uno de los medios . Después de intensos y extensos estudios para resolver el problema anteriores, los presentes inventores han encontrado que el agonista contra IL-6, por ejemplo, anticuerpo Contra receptor de IL-6 tiene un efecto de ayudar a la recuperación de daño de médula espinal. De esta manera, la presente invención proporciona un agente terapéutico para daño de médula espinal que comprende antagonista de interlucina-6 (IL-6) como un ingrediente activo. La presente invención también proporciona un modulador de diferenciación de células de tallo neurales que comprende antagonista de interleucina-6 (IL-6) como un ingrediente activo. La presente invención también proporciona un inhibidor de diferenciación de células glia que comprende antagonista de interleucina-6 (IL-6) como un ingrediente activo . El antagonista de IL-6 anterior es de preferencia un anticuerpo contra receptor de IL-6, y más preferentemente un anticuerpo monoclonal. Como dicho anticuerpo monoclonal, se pueden mencionar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano y un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 de ratón. Como un ejemplo especifico del anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano, se puede mencionar por ejemplo el anticuerpo PM-1, y como un ejemplo especifico del anticuerpo monoclonal anterior contra receptor de IL-6 de ratón, se puede mencionar por ejemplo el anticuerpo MR16-1. Adicionalmente, como un anticuerpo contra receptor de IL-6, se puede mencionar un anticuerpo recombinante, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y lo semejante, que se ha obtenido haciendo por ingeniería artificialmente un gene clonado de cuna hibridoma productora de anticuerpo monoclonal. Breve Explicación de los Dibujos La Figura 1 es una gráfica que muestra que la recuperación de movimiento después de daño de médula espinal es mayor en ratones dañados en médula espinal que recibieron un anticuerpo de receptor de anti-IL-6 (MR16) en comparación con ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior en la evaluación de función motora de los miembros inferiores. La Figura 2 es una gráfica que muestra que la recuperación de coordinación de movimiento después de daño de médula espinal es mayor en los' ratones dañados en médula espinal que recibieron un anticuerpo de receptor de anti-IL-6 (MR16) en comparación con ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior en la prueba de molino de caminata de varilla giratoria La Figura 3 es una gráfica que muestra que la formación de glia en el sitio dañado de médula espinal se ha inhibido en los ratones dañados en médula espinal que recibieron un anticuerpo receptor de anti-IL-6 (MR16) en comparación con los ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior. La Figura 4 es una gráfica que muestra que el receptor de IL-6 se ha expresado en el sitio dañado de médula espinal en los ratones dañados en médula espinal en comparación con los ratones ( sham) que no tienen daño de médula espinal . La Figura 5 es una mancha Western de un STAT3 fosforilado que muestra que la administración de un anticuerpo de receptor de anti-IL-6 (MR16) en realidad inhibió la cascada de señal de IL-6 en el sitio dañado de médula espinal . Mejor Modo para Llevar a Cabo la Invención Los antagonistas de IL-6 para uso en la presente invención pueden ser de cualquier origen, cualquier clase, y cualquier forma, en tanto exhiban un efecto terapéutico sobre daño de médula espinal. Los antagonistas de IL-6 bloquean la transduccion de señal por IL-6 e inhiben la actividad biológica de IL-6.

Los antagonistas de IL-6 son de preferencia substancias que tienen una actividad de inhibición del enlace a cualquiera de IL-6, receptor de IL-6, y gpl30. Como los antagonistas de IL-6, se pueden mencionar, por ejemplo, anticuerpo de anti-IL-6, anticuerpo de receptor de anti-IL-6, anticuerpo de anti-gpl30, IL-6 alterado, receptor de IL-6 soluble alterado, un péptido parcial de IL-6 o receptor de IL-6, y una substancia de bajo peso molecular que tiene la misma actividad que estos. Los anticuerpos anti-IL-6 para uso en la presente invención se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un método . conocido. Como los anticuerpos anti-IL-6 para uso en la presente invención, los anticuerpos monoclonales, en particular, de un origen mamífero, se prefieren. Los anticuerpos monoclonales de un origen mamífero incluyen aquellos producidos por una hibridoma y anticuerpo recombinante producido por un huésped que se ha transformado con un vector de expresión que contiene genes de anticuerpos hechos por ingeniería genética. Estos anticuerpos/ a través de enlace a IL-6, bloquean el enlace de IL-6 a receptor de IL-6, y de esta manera bloquean la transducción de señal de actividad biológica de IL-6 hacia la célula. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen MH166 (Matsuda T. , y col., Eur. J. Iiomunol . (1988), 18, 951-956) y anticuerpo SK2 (Sato, K. , y col., The 21 Nihon Menekigakkai Soukai (General Meeting of the Japan Immunology Society) , Academic Record (1991) 21, 166) y lo semejante. Una hibridoma productora de anticuerpo de anti-IL-6 se puede construir básicamente utilizando un procedimiento conocido como se describe abajo. De esta manera, IL-6 se puede usar como un antígeno de sensibilización y se inmuniza en el método de inmunización convencional. Las células inmunes obtenidas de esta manera se funden con células originales conocidas en el proceso de fusión de células convencional, y luego las células productoras de anticuerpo monoclonal se tamizan por el método de tamizado convencional para preparar la ibridoma deseada. Específicamente, el anticuerpo anti-IL-6 se puede obtener de la siguiente manera. Por ejemplo, un IL-6 humano para uso como el antigeno de sensibilización para obtener anticuerpo se puede obtener usando la secuencia de gene IL-6/aminoácido descrita en Eur. J. Biochem 81987) 168, 543-550, J. Immonol. (1988) 140, 1534-1541, o Agr. Biol. (1990) 54, 2685-2688. Después de que una célula huésped apropiada se transforma insertando la secuencia de gene IL-6 hacia un sistema de vector de expresión conocido, la proteína IL-6 de interés se purifica de la célula huésped o el sobrenadante de cultivo de la misma, y la proteína IL-6 purificada se puede usar como el antígeno de sensibilización. Alternativamente, una proteína de fusión de la proteína IL-6 y otra proteína, se puede usar como el antígeno de sensibilización. Los anticuerpos de receptor de anti-IL-6 para uso en la presente invención se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un método conocido. Como los anticuerpos de receptor de anti-IL-6 para uso en la presente invención, anticuerpos monoclonales de, en particular un origen mamífero, se prefieren. Los anticuerpos monoclonales de un origen mamífero incluyen aquellos producidos por una hibridoma y aquellos producidos por un huésped que se ha transformado con un vector de expresión que contiene genes de anticuerpos genéticamente formados. Los anticuerpos, a través de enlace a receptor de IL-6, inhiben el enlace de IL-6 a receptor de IL-6 y, de esta manera bloquean la transducción de la actividad biológica de IL-6 hacia la célula. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen anticuerpo MR16-1 (Tamura, T., y col., Proc. Nati. Acá. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), anticuerpo PM-1 (Hirata, Y., y Col-, J. Irumunol. (1989) 143, 2900-2906), o anticuerpo AUK12-20, anticuerpo AUK64-7, o anticuerpo AUK146-15 (Publicación de Patente Internacional WO 92-19759) y lo semejante. Entre ellos, el anticuerpo PM-1 es el más preferido. Incidentalmente, la línea de célula de hibridoma que produce el anticuerpo PM-1 se ha depositado internacionalmente de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest como PM-1 el 12 de julio d3 1989 con el Depósito de Microorganismo de Patente del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial, de Chuo 6, 1-1/ Higashi 1-chome, ciudad Tsukuba, Ibaraki pref . , Japón, como FERM BP-2998. La linea de célula de hibridoma que produce el anticuerpo MR16-1 se ha depositado internacionalmente bajo las provisiones del Tratado de Budapest como hibridoma de rata-ratón MR16-1 el 13 de marzo de 1997 con el Depósito de Microorganismo de Patentes del instituto Nacional de Ciencia y tecnología Industrial, de Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, ciudad Tsukuba, Ibaraki pref., Japón, como FERM BP-5875. Las hibridomas que producen anticuerpo monoclonal receptor de anti-IL-6 se pueden preparar básicamente usando un procedimiento conocido como se describe abajo. De esta manera, el receptor de IL-6 se usa como un antigeno de sensibilización y se inmuniza de conformidad con el método convencional de inmunización. Las células inmunes obtenidas de eta manera se funden con células originales parecidas en el proceso de fusión de célula convencional, y luego las células productoras de anticuerpo monoclonal se pueden tamizar mediante el método de tamizado convencional para preparar la hibridoma deseada. Específicamente, el anticuerpo de receptor de anti-IL-6 se puede preparar de la siguiente manera. Por ejemplo, el receptor de IL-6 humano usado como el agente de sensibilización para obtener anticuerpo se puede obtener usando la secuencia de gene receptor de IL-6/secuencia de aminoácido descrita en la Solicitud de Patente europea EP 325474, y el receptor de IL-6 de ratón se puede obtener usando la secuencia de gene receptor de IL-6, secuencia de aminoácido descrita en la Publicación de Patente No Examinada japonesa ( okai) 3-155795. Hay dos tipos de proteínas receptoras de IL-6: el receptor de IL-6 expresado en la membrana de célula, y el receptor de IL-6 separado de la membrana de célula (receptor de IL-6 soluble) (Yasukawa K. , y col-, J. Biochem. (1990) 108, 673-676) . El anticuerpo de receptor de IL-6 soluble está compuesto substancialmente de la región extracelular del receptor de IL-6 ligado a la membrana de célula, y de esta manera es diferente al receptor de IL-6 ligado a membrana en que el primero carece de la región de transmembrana o ambas, la región de transmembrana y la región intracelula . Como la proteina receptora de IL-6, cualquier receptor de IL-6 se puede utilizar, en tanto que pueda ser un antigeno de sensibilización para producción del anticuerpo de receptor de anti-IL-6 para uso en la presente invención. Después de la secuencia de gene de receptor de IL-6 se inserta en un sistema vector de expresión conocido para transformar una célula huésped apropiada, la proteina receptora de IL-6 deseada se puede purificar de la célula huésped o un sobrenadante de cultivo de la misma usando un método conocido, y la proteina receptora de IL-6 purificada se puede usar como el antígeno de sensibilización. Alternativamente, las células que expresan receptor de IL-6 o una proteina de fusión de la proteina receptora de IL-6 y otra proteina se puede usar como el antigeno de sensibilizació . Escherichia coli (E. coli) que tiene un plásmido pIBIBSF2R que contiene receptor de IL-6 humano que codifica cDNA se ha depositado internacionalmente de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest como HB101-pIBIBSF2R el 9 de enero de 1989 con el Depósito de Microorganismo de Patente del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial, de Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, ciudad Tsukuba, Ibaraki pref., Japón, como FERM BP-2232. Los anticuerpos de anti-gp!30 para uso en la presente invención se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un método conocido. Como los anticuerpos anti-gpl30 para uso en la presente invención, los anticuerpos monoclonales, en particular, de origen mamífero, se prefieren. Los anticuerpos monoclonales de un origen mamífero incluyen aquellos producidos por una hibridoma y aquellos producidos por un huésped que se ha transformado con un vector de expresión que contiene genes de anticuerpo genéticamente formados . Los anticuerpos, a través de enlace con gpl30, inhiben el enlace de complejo de IL-6/receptor de IL-6 a gpl30, y de esta manera bloquear la transducción de la actividad biológica de 1L-6 hacia la célula. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen anticuerpo AM64 (Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) 3-219894), el anticuerpo 4B11 y el anticuerpo 2H4 (US 5571513), el anticuerpo B-S12 y el enticuerpo B-P8 (Publicación de Patente No Examinada japonesa (Kokai) 8-291199) y lo semejante. La hibridoma productora de anticuerpo monoclonal anti-gpl30 se puede crear básicamente usando un procedimiento conocido como se describe abajo. _ De esta manera, gp-130 se puede usar como un antígeno de sensibilización y se usa para inmunizar un método convencional de inmunización. Las células inmunes obtenidas de esta manera se funden con las células originales conocidas en un proceso de fusión de célula convencional, y luego las hibridomas productoras de anticuerpo monoclonal se tamizan por un método de tamizado convencional para preparar la hibridoma deseada. Específicamente, el anticuerpo monoclonal se puede obtener de la siguiente manera. Por ejemplo, gpl30 se usa como el antígeno de sensibilización para generación de anticuerpo se puede obtener utilizando la secuencia de gene gpl30/secuencia de aminoácido descrita en la Solicitud de Patente europea EP 411946.

Después de que una célula huésped apropiada se transforma insertando la secuencia de gene gpl30 hacia un sistema de vector de expresión conocido, la proteina gpl30 de interés se purifica de la célula huésped o del sobrenadante de cultivo de la misma de un método convencional. La proteina receptora de gpl30 purificada se puede usar como el antigeno de sensibilización. Alternativamente, las células que expresan gpl30 o una proteina de fusión, de la proteina gpl30 y otra proteina, se pueden usar como el antigeno de sensibilización. Aún cuando los mamíferos que se van a inmunizar con el antígeno de sensibilización no se limitan específicamente, se seleccionan de preferencia en consideración a su compatibilidad con la célula original para uso en fusión de célula. Generalmente incluyen roedores tales como ratones, ratas, hámsters y lo seme ant . La inmunización de animales con un antígeno de sensibili ación se lleva a cabo usando un método conocido. Un método general, por ejemplo, involucra la inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno de sensibilización al mamífero. Específicamente, un antígeno de sensibilización que se ha diluido y suspendido en una cantidad apropiada de salina tamponada con fosfato (PBS) o salina fisiológica, etc., se mezcla, como se desee, con una cantidad apropiada de un adyuvante común, por ejemplo adyuvante completo de Freund. Después de emulsionarse, de preferencia se administra a un mamífero durante varias veces cada 4 a 21 días. Alternativamente, se puede usar un portador apropiado al momento de inmunización del antígeno de sensibilización. Después de la inmunización y la confirmación del aumento en los niveles deseados de anticuerpo en él suero, las células se retiran del mamífero y se someten a fusión de célula. Las células inmunes preferidas para someterse a fusión de célula incluyen, en particular, las células de bazo . Las células de mieloma de mamífero, como las otras células originales que se funden con las células inmunes arriba mencionadas, de preferencia incluyen varias líneas de célula conocidas tales como P3X63Ag8.653 (Kearney, F. J., y col., J. Imitiunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Iiranonology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. , y Milstein, C, Eur, J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H., y col., Cell 81976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. , y col., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F., y col., J. Immunol. Methods (1980) 35; 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J, Exp. Med. 81978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. , y col., nature (1979) 277; 131-133), y los semejantes . La fusión de célula entre las células inmunes anteriores y las células de mieloma se puede conducir esencialmente de conformidad con un método conocido tal como se describe en Milstein y col., (Kohler, G., y Milstein, C, Met ods Enzymol. 81981) 73, 3-46) y los semej ntes . Más específicamente, la fusión se célula anterior se lleva a cabo en el caldo nutriente convencional en presencia de, por ejemplo, un acelerador de fusión de célula. Como el acelerador de fusión de célula, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , virus Sendai (HVJ) y lo semejante se puede usar y, además, un adyuvante tal como sulfóxido de dimetilo, etc., se puede añadir como se desee para mejorar la eficiencia de fusión. La relación preferida de las células inmunes y las células de mieloma a utilizar es, por ejemplo, 1 a 10 veces más células inmunes que las células de mieloma. Los ejemplos de medios de cultivo a usar para la fusión de célula anterior incluyen medio RPMI1640 y medio de cultivo MEM apropiado para el crecimiento de las lineas de célula de mieloma anteriores, y el medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo de células y, además un suplemento de suero tal como suero de becerro fetal (FCS) se puede añadir.

En la fusión de células, cantidades predeterminadas de las células inmunes anteriores y las células de mieloma se mezclan bien en el liquido de cultivo anterior, al que una solución de PEG previamente calentada a aproximadamente 3 °C, por ejemplo una solución de PEG con un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000, se añade a una concentración de 30 a 60% (peso/volumen) y se mezcla para formar las células de fusión deseadas (hibridoma) . Luego repitiendo la adición en secuencia de un liquido de cultivo apropiado y centrifugación para remover el sobrenadante, agentes de fusión de célula, etc., que son indeseables para el crecimiento del hibridoma se pueden remover. Dicha hibridoma se puede seleccionar cultivando en el medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de cultivo HAT (un liquido de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) . El cultivo en el liquido de cultivo HAT se continúa generalmente durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar el exterminio de las células (células de no fusión) distintas a la hibridoma deseada, y generalmente durante varios dias a varias semanas. Luego, el método de dilución de limitación convencional se conduce para efectuar el tamizado y la clonación de las hibridomas que producen el anticuerpo deseado.

Además de obtener la hibridoma anterior inmunizando un animal distinto al humano con un antigeno, también es posible sensibilizar linfocitos humanos in vitro con una proteina de antigeno deseada o células que expresan antígeno deseadas, y los linfocitos B sensibilizados resultantes se funden con células de mieloma humanas por ejemplo U266, para obtener el anticuerpo humano deseado que tiene la actividad de ligarse al antigeno deseado o las células que expresan el antigeno deseado (ver Publicación de Patente Post-examinada japonesa (Kiokoku) No. 1-59878). Además, un animal transgénico que- tiene un repertorio de todos los genes de anticuerpo humano se puede inmunizar con el antigeno o las células que expresan antigeno para obtener el anticuerpo humano deseado en el método descrito arriba (ver Publicación de Patente Internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). La hibridoma que produce anticuerpo monoclonal construida de esta manera puede ser subcultivada en el liquido de cultivo convencional, o se puede almacenar durante un periodo de tiempo prolongado en nitrógeno liquido . A fin de obtener anticuerpos monoclonales de la hibridoma, se puede utilizar un método en el que la hibridoma se cultiva en el método convencional y los anticuerpos se obtienen como si sobrenadante, o un método en el que la hibridoma se administra a y se desarrolla en un mamífero compatible con la hibridoma y los anticuerpos se obtienen como los asertos . El primer método es apropiado para obtener anticuerpos de pureza elevada, mientras que el último es apropiado para una producción a gran escala de anticuerpos. Por ejemplo, una hibridoma que produce anticuerpo receptor de anti-Il-6 se puede construir utilizando el método descrito en la Publicación de Patente No Examinada japonesa ( okai) 3-139293. Se puede construir mediante un método en el que la hibridoma productora de cuerpo PM-1 que se depositó · internacionalmente de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest como FERM BPA-2998 el 12 de julio de 1989 con el Depósito de Microorganismo de Patente del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial, de Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Ciudad Tsukuba, Ibaraki pref., Japón, se inyecta intraperitonealmente a ratones BALB/c para obtener los ascitos de los cuales se purifica el anticuerpo de PM-1, o un método en el que la hibridoma se cultiva en un medio de cultivo apropiado tal como el medio RPMI1640 que contiene 10% de suero fetal bovino y 5% de Hl MB-Condimado (fabricado por Boehringer Mannheim) , el medio SFM de hibridoma (fabricado por GIBCO-BRL) , el medio PFHM-II (fabricado por G1BC0-BRL) y lo semejante, y el anticuerpo de PM-1 se puede purificar a partir del sobrenadante. Un anticuerpo recombinante que se produjo por la tecnología de gene recombinante en la que un gene de anticuerpo se clonó de hibridoma y se integró en un vector apropiado que luego se introdujo a un huésped se puede usar en la presente invención como anticuerpo monoclonal (ver, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K., y Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicada en el Reino Unido por MACMILLA PUBLISHERS LTD. 1990) . Específicamente, mRNA que codifica la región variable (V) del anticuerpo deseado se aisla de células que producen anticuerpo tal como una hibridoma. El aislamiento de mRNA se conduce preparando RNA total cuando, por ejemplo, un método conocido tal como el método ultracentrifugo de guanidina (Chirgwin, J.M. , y col., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), el método AGPC (Chomczynski, P., y col., Anal. -Biochem. (1987) 162, 156-159), y luego mRNA se prepara del RNA total usando el equipo de Purificación de mRNA (fabricado por Pharmacia) y lo semejante. Alternativamente, mRNA se puede preparar directamente usando el Equipo de Purificación de mRNA QuickPrep (fabricado por Pharmacia) . cDNA de la región V de anticuerpo se puede sintetizar del mRNA obtenido de esta manera usando una transcriptasa de reversa. Se puede sintetizar cDNA usando el Equipo de Síntesis de cDNA de Primera Hebra de Transcriptasa de Reversa AMV y lo semejante. Alternativamente, para la síntesis y amplificación de cDNA, el Equipo 5'-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech) y el métoco 5' -RACE (Frohman, M.A. , y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1988) 85, 8998-9002;. Belyavsky, A., y col., Nucleic Acids Res. 81989) 17, 2919-2932) que emplea reacción de cadena de polimerasa (PCR) se puede usar. El fragmento de DNA deseado se purifica del producto de PCR obtenido y se puede ligar al vector DNA. Además, se construye un vector recombinante del mismo y luego se introduce hacia E. coli, etc., desde el que las colonias se seleccionan para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia de base del DNA deseado se puede confirmar mediante un método conocido tal como el método de dideoxi. Una vez que se ha obtenido el ADN que codifica la región V del anticuerpo deseado, se puede ligar a ADN que codifica la región constante (región C) del anticuerpo deseado, que luego se integra hacia un vector de expresión.

Alternativamente el ADN que codifica la región V del anticuerpo se puede integrar hacia un vector de expresión que contiene el ADN que codifica la región C del anticuerpo. A fin de producir el anticuerpo para uso en la presente invención, el gene de anticuerpo se integra como se describe abajo hacia un vector de expresión de manera de expresarse bajo el control de la región regulatoria de expresión, por ejemplo, un me orador y/o un promotor. Subsecuentemente, el vector de expresión se puede transformar hacia una célula huésped y el anticuerpo puede luego expresarse en el mismo. De conformidad con la presente invención, el anticuerpo recombinante artificialmente alterado tal como anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, y anticuerpo humano se puede usar para el propósito de reducir la antigenicidad heteróloga contra humanos. Estos anticuerpos laterales pueden producirse usando métodos conocidos. El anticuerpo quimérico se puede obtener ligando el ADN obtenido de esta manera que codifica la región V de anticuerpo a ADN que codifica la región C de anticuerpo humano, que luego se integra hacia un vector de expresión y se introduce hacia un huésped para producción del anticuerpo en el mismo (ver la Solicitud de Patente europea EP 125023, y la Publicación de Patente Internacional O 92-19759). Usando este método conocido, el anticuerpo quimérico útil para la presente invención se puede obtener. Por ejemplo, un plásmido que contiene ADN que codifica la región V de cadena L o la región V de cadena H de anticuerpo PM-1 quimérico se diseñó como pPM-k3 o pPM-hl, respectivamente, y E. coli que tienen estos plástidos se han depositado internacionalmente de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest como NCIMB 40366 y MCIMB 40362, respectivamente, el 12 de febrero de 1991 con la National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited. El anticuerpo humanizado que también se llama anticuerpo humano reconfigurado se ha hecho trasplantando la región de determinación de complementariedad (CDR) de anticuerpo de un mamífero distinto al humano, por ejemplo anticuerpo de ratón, hacia la región de determinación de complementariedad del anticuerpo humano. La tecnología de ADN recombinante general para preparación de estos anticuerpos también se conoce (ver la Solicitud de Patente europea EP125023 y Publicación de Patente Internacional WO 92-19759) . Específicamente, una secuencia de ADN que se diseñó para ligar el CDR de anticuerpo de ratón con la región de estructura (FR) de anticuerpo humano se sintetiza de varios oligonucleótidos divididos que tienen secciones traslapantes entres sí en los extremos de los mismos por el método de PCR. El ADN obtenido de esta manera se liga al ADN que codifica la región C de anticuerpo humano y luego se integra hacia un vector de expresión, que se introduce hacia un huésped para la producción de anticuerpo (ver la Solicitud de Patente europea EP 239400 y Publicación de Patente Internacional WO 92-19759} . Para el FR de anticuerpo humano ligado a través de CDR, aquellos en los que la región de determinación de complementariedad que forma un sitio de enlace de antigeno favorable se seleccionan. Cuando se desea, aminoácidos en la región de bastidor de la región variable de anticuerpo se puede substituir de manera que la región de determinación de complementariedad del anticuerpo humano reconfigurado puede formar un sitio de enlace de antigeno apropiado (Sato, ., y col., cáncer Res. (1993) 53, 851-856) . Por ejemplo, para anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado, la región C del anticuerpo humano se usa. Como la región C de anticuerpo humano, se pueden mencionar Cy, Cyl, Cy2' , Cy3, y Cy4, como ejemplos, se pueden usar. La región C de anticuerpo humano se puede modificar para mejorar la estabilidad de anticuerpo o la producción de la misma. El anticuerpo quimérico consiste de la región variable de anticuerpo derivado de un mamifero distinto al humano y la región C derivada del anticuerpo humano, mientras que el anticuerpo humanizado consiste de la región de determinación de complementariedad de anticuerpo derivado de un mamifero distinto al humano y la región de estructura y la región C derivada del anticuerpo humano. Consecuentemente, la antigenicidad del mismo en el cuerpo humano se ha reducido de manera que son útiles como anticuerpo para uso en la presente invención. Como una modalidad preferida del anticuerpo humanizado para uso en la presente invención, se puede mencionar anticuerpo PM-1 humanizado (ver Publicación de Patente Internacional WO 92-19759) . Adicionalmente, como un método para obtener anticuerpo humano, se conoce una tecnología que emplea lavado con una librería de anticuerpo humano, además de aquellos arriba descritos. Por ejemplo, la región variable de anticuerpo humano se expresa sobre la superficie de un fago mediante el método de presentación de fago como un anticuerpo de cadena única (scFv) para seleccionar un fago que se liga al antígeno. Analizando el gene del fago seleccionado, la secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo humano que se liga al antígeno se puede determinar. Una vez que la secuencia de ADN de scFv que se liga al antígeno se clarifica, se posible construir un vector de expresión apropiado que contiene la secuencia y luego obtener anticuerpo humano. Estos métodos ya se conocen y se pueden encontrar en WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, y WO 95/15388.

Los genes de anticuerpo construidos como se describe arriba se pueden expresar y obtener ' en un método conocido. En el caso de células de maraiferor la expresión se puede lograr usando un vector que contiene un promotor útil comúnmente usado, el gene de anticuerpo que se va .a expresar, ADN en el que la señal poli A se ha enlazado operablemente en 3' corriente abajo de la misma o un vector que contiene dicho ADN. Los ejemplos de promotor/m orador incluyen promotor/m orador temprano inmediato de citomegalovirus humano . Adicionalmente, como el promotor/mej orador que se puede usar para expresión de anticuerpo para uso en la presente invención, se pueden utilizar promotores/mej oradores virales tales como retrovirus, virus de polioma, adenovirus, y virus de simio 40 (SV40) , y promotores /me oradores derivados de células de mamífero tal como factor la de alargamiento humano (HEFla) . Por ejemplo, la expresión se puede lograr fácilmente mediante el método de Mulligan y col. (Mulligan, R. C, y col., Nature (1979) 277, 108-114) cuando se usa el promotor/mej orador SV40, o mediante el método de Mizushima y col. (Mizushima, S., y Nagata, S., Nuciere Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/mej orador HEFla. En el caso de E. coli, la expresión se puede conducir enlazando operablemente un promotor útil comúnmente utilizado, una secuencia de señal para secreción de anticuerpo, y el gene de anticuerpo que se va a expresar, seguido por expresión del mismo. Como el promotor, por ejemplo, se puede mencionar promotor lacZ y promotor araB. El método de ard y col. (Ward, E.S., y col., Nature 81989) 341, 544-546; Ward, E.S., y col., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) se puede curar cuando se usa el promotor lacz, y el método de Better y col. (Better, M. , y col., Science (1988) 240, 1041-1043) se puede usar cuando se utiliza el promotor araB. Como la secuencia se señal para secreción de anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli, la secuencia de señal pelB (Lei, S. P., y col., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) se puede usar. Después de separa del anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo se redobla apropiadamente antes de uso (ver, por ejemplo, O 96/30394) . Como el origen de replicación, se pueden usar aquellos derivados de SV40, virus de polioma, adenovirus, virus de papiloma bovina (BPV) y lo semejante. Además, para la amplificación del número de copia de gene en el sistema de célula de huésped, los vectores de expresión pueden incluir como marcadores seleccionables el gene aminoglicosida fosfotransferasa (APH), el gene timidina quinasa (TK) , gene 'de E. coli xantina guanina fosforibosila transferasa (Ecogpt), el gene dihidrofolato reductasa (d fr) y lo semejante. Para la producción de anticuerpo para uso en la presente invención, se puede usar cualquier sistema de producción. El sistema de producción para reparación de anticuerpo comprende el sistema de producción in vitro o el in vivo. Como en el sistema de producción in vitro, se puede mencionar un sistema de producción que emplea células eucarióticas y el sistema de producción que emplea células procarióticas . Cuando se usan las células eucarióticas, se encuentran los sistemas de producción que emplean células animales, células de planta, o células fúngales. Las células de animal conocidas incluyen (1) células de mamífero tales como células CHO, células COS, células de mieloma, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células HeLa, y células Vero, (2) células de anfibio tales como Xanopus oocytes o (3) células de insecto tales como s 9, sf21, y Tn5. Las células de planta incluyen, por ejemplo, aquellas derivadas de Nitoriana tabacum, que se pueden someter a cultivo de callus. Las células fúngales conocidas incluyen levaduras tales como el género Saccharomyces, más específicamente Saccharomyces cerevisiae, u hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger.

Cuando se usan las células procarióticas, están los sistemas de producción que emplean células bacterianas, las células bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E. coli), y Bacillus subtilis. Introduciendo a través de transformación el gene del anticuerpo deseado hacia estas células y cultivando las células transformadas in vitro, se puede obtener el anticuerpo. El cultivo se conduce en los métodos conocidos. Por ejemplo, como el liquido de cultivo, se pueden usar DMEM, MEM, RPMI1640 e IMDM, y suplementos de suero tales como suero de becerro fetal (FCS) se pueden usar en combinación. Además, los anticuerpos se pueden producir in vivo implantando células hacia las que se ha introducido el gene de anticuerpo hacia la cavidad abdominal de un animal y lo semejante. Como en sistemas de producción in vivo, se pueden mencionar aquellos que emplean animales y aquellos que emplean plantas. Cuando se usan animales, hay sistemas de producción que emplean mamíferos e insectos. Como mamíferos, se pueden usar cabras, cerdos, borregos, ratones y ganado (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) . También como insectos, se pueden usar gusanos de seda. Cuando se usan plantas, tabaco, por ejemplo, se puede utilizar. los genes de anticuerpo se introducen en estos animales o plantas, y los anticuerpos se producen en dichos animales o plantas, y se recuperan. Por ejemplo, un gene de anticuerpo se inserta hacia la mitad de la proteina que codifica gene que se produce inherentemente en la lecha tal como caseína beta de cabra para preparar genes de fusión.

Los fragmentos de ADN que contienen el gene de fusión hacia el que el gene de anticuerpo se ha insertado se inyectan hacia un embrión de cabra, y el embrión se introduce a una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene de la leche producida por la cabra transgénica nacida a la cabra que recibió el embrión o el resultado del mismo. A fin de aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, se pueden proporcionar hormonas a la cabra transgénica como sea apropiado. (Ebert, Km:m, y col., Bio/Technology (1994) 12, 699-702) . Cuando se usan gusanos de seda, un baculovirus hacia el que se ha insertado el gene de anticuerpo deseado se infecta al gusano de seda, y el anticuerpo deseado se puede obtener del fluido corporal del gusano de seda (Maeda, S., y col., Nature (1985) 315, 592-594). Además, cuando se utiliza tabaco, el gene de anticuerpo deseado se inserta hacia un vector de expresión para plantas, por ejemplo pMON 530, y luego el vector se introduce a una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens . La bacteria luego se infecta al tabaco tal como Nicotiana tabacum para obtener el anticuerpo deseado de las hojas del tabaco (Julián, K.-C. Ma y col . , Eur. J. Immunol. 81994) 24, 131-138) . Cuando el anticuerpo se produce en sistemas de producción in vitro o in vivo, como se describe arriba, el ADN que codifica la cadena pesada (cadena H) o la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo se pueden integrar separadamente hacia un vector de expresión y los huéspedes se transforman simultáneamente, o ADN que codifica la cadena H y la cadena L se pueden integrar en un solo vector de expresión, y el huésped se transforma con el mismo (ver Publicación de Patente Internacional WO 94-11523) . Los anticuerpos para uso en la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpo o versiones modificadas de los mismos en tanto que se usen de preferencia. Por ejemplo, como fragmentos de anticuerpo, se pueden menciona Fab, (F(ab' )2 Fv o Fv de cadena sencilla (scFv) en la que Fv's de cadena H y cadena L se ligaron a través de un enlazador apropiado. Especifreamente, los anticuerpos se tratan con una enzima, por ejemplo, papaina o pepsina, para producir fragmentos de anticuerpo, o genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo se construyen, y luego se introducen hacia un vector de expresión, que se expresa en una célula huésped apropiada (ver, por ejemplo, Co, M.S., y col., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. , y Hor itz, A.H., Methods in Enzymology 81989) 178, 476-496; Pleuckthun, A., y Skerra, A., Methos in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi) , E . , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. , y col., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66; Bird, R.E., y col., TIBTECH (1991) 9, 132-137) . Se puede obtener scFv ligando la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de anticuerpo. En scEV, la región V de cadena H y la región V de cadena L de preferencia se ligan a través de un enlazador, de preferencia en enlazador de péptido (Huston, J.S., y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1988) 85, 5879-5883). La región V de la cadena H y la región V de la cadena L en scFv se pueden derivar de cualquier de los anticuerpos arriba mencionados. Como el enlazador de péptido para ligar las regiones V, cualquier péptido de cadena sencilla que comprende, por ejemplo 12-19 residuos de aminoácido se puede usar. El ADN que codifica scFv se puede obtener usando ADN que codifica la cadena H o la región V de cadena H del anticuerpo anterior y el ADN que codifica la cadena L o la región V de cadena L del anticuerpo anterior como la plantilla amplificando la porción del ADN que codifica la secuencia de aminoácido deseada entre las secuencias anteriores mediante la técnica de PCR con el par imprimador especificando ambos extremos del mismo, y amplificando adicionalmente la combinación de ADN que codifica la porción de enlazador de péptido y el par imprimador que define que ambos extremos del ADN que se va a ligar a la cadena H y la Cadena L, respectivamente. Una vez que los ADNs que codifican scFv se han construido, un vector de expresión que los contiene y un huésped transformado con el vector de expresión se puede obtener mediante los métodos convencionales, y scFv se puede obtener usando el huésped resultante mediante los métodos convencionales . Estos fragmentos de anticuerpo se pueden producir obteniendo el gene del mismo de una manera similar a aquella arriba mencionada y dejándolo expresarse en un huésped. "Anticuerpo"' como se utiliza en la presente también abarca estos fragmentos de anticuerpo. Como anticuerpos modificados, los anticuerpos asociados con diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG) se pueden usar. "Anticuerpo" como se usa en la presente también abarca estos anticuerpos modificados . Estos anticuerpos modificados se pueden obtener modificando químicamente los anticuerpos obtenidos de esta manera. Estos métodos ya se han establecido en el ramo. Los anticuerpos producidos y expresados como se describe arriba se pueden separar el interior o exterior de la célula huésped y luego se pueden purificar hasta homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo para uso en la presente invención se pueden lograr mediante cromatografía de afinidad. Como la columna usada para dicha cromatografía de afinidad, se pueden mencionar columna de Proteína A y columna de Proteína G. Los ejemplos de los portadores usados en la columna de Proteína A son Hyper D, POROS, Sepharose F. F. , y los semejantes. Alternativamente, los métodos para separación y purificación convencionalmente usados para proteínas se pueden usar sin ninguna limitación. La separación y purificación del anticuerpo para uso en la presente invención se pueden lograr combinando, como sea apropiado, cromatografía distinta a la cromatografía de afinidad arriba mencionada, filtración, ultrafiltración, desalado, diálisis y lo semejante. La cromatografía incluye, por ejemplo cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, filtración de gel y lo semejante. Estas cromatografías se pueden aplicar en cromatografía líquida de alto funcionamiento (HPLC) . Alternativamente, se puede usar HPLC de fase reversa.

La concentración de anticuerpo obtenido en lo anterior se puede determinar mediante la medición de absorción o mediante ELISA y lo semejante. De esta manera, cuando se emplea la medición de absorción, una muestra se diluye apropiadamente con PBS(-) y luego se mide la absorción a 280 nm, seguido por cálculo usando el coeficiente de absorción de 1.35 OD a 1 mg/ml. Cuando se usa el método ELISA, la medición se conduce como sigue. De esta manera, 100 ul de IgG antihumano de cabra (fabricado por TAG) diluido a 1 ug/ml en 0.1 M de tampón de bicarbonato, pH 9.6, se añade a una placa de 96 pozos (fabricada por Nunc) , y se incuba durante la noche a 4°C para inmovilizar el anticuerpo. Después del bloqueo, 100 ul cada uno de anticuerpo apropiadamente diluido de la presente invención o una muestra que contiene el anticuerpo, o 100 ul de IgG humano (fabricado por CAPPEL) , como 1 norma, se añade y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, 100 ul de IgG antihumano etiquetada con fosfatasa alcalina diluida 5000 veces (fabricada por BIO SOURCE) se añade, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, la solución de substrato se añade y se incuba, seguido por la medición de absorción a 405 nm usando un MICROPLATE READER Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo deseado. El IL-6 alterado para uso en la presente invención tiene una actividad de enlace a receptor de IL-6 y no transmite la actividad biológica de IL-6. De esta manera, el IL-6 alterado, aún cuando compite con IL-6 para ligarse a receptor de IL-6 no transmite la actividad biológica de IL-6, y de esta manera bloquea la transduccion de señal mediante IL-6. El IL-6 alterado se puede construir a través de la introducción de mutación reemplazando residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácido de IL-6. IL-6, la fuente del IL-6 alterado, puede ser de cualquier origen, pero cuando la antigenicidad se debe considerar, es de preferencia IL-6 humano. Específicamente, la estructura secundaria de IL-6 se produce usando un programa de modelación molecular conocido de la secuencia de aminoácido, por ejemplo WHATIF (Vriend y col., J. Mol. Graphics (1990), 8, 52-56), y los efectos totales en el residuo de aminoácido que se va a reemplazar se evalúa. Después de que se ha determinado un residuo de aminoácido apropiado, se introduce la mutación para efectuar la substitución de aminoácido mediante la reacción de cadena de polimerasa (PCR comúnmente usada usando un vector que contiene la secuencia de base que codifica gene IL-6 humano como una plantilla para de esta manera obtener un gene que codifica un IL-6 alterado. Este luego se integra, como se desee, hacia un vector de expresión apropiado, del que se puede obtener el IL-6 alterado de conformidad con los métodos de expresión, producción y purificación del anticuerpo recombinante . Los ejemplos específicos del IL-6 alterado se describen en Brakenhoff y col., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, y Savino y col., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, y WO 96-17869. El péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial de receptor de IL-6 para uso en la presente invención tiene una actividad de enlace a receptor de IL-6 o IL-6, respectivamente, y no transmite la actividad biológica de IL-6. De esta manera, el péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial de receptor de IL-6 específicamente inhibe el enlace de IL-6 a receptor de IL-6 ligando al receptor de IL-6 o IL-6, respectivamente, y de esta manera capturándolo. Como resultado, no transmiten la actividad biológica de IL-6, y de esta manera bloquean la transducción de señal de IL-6. El péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial de receptor de IL-6 es un péptido que comprende aparte o toda la secuencia de aminoácido de la región involucrada en el enlace a IL-6 y receptor de IL-6 en la secuencia de aminoácido de IL-6 o receptor de IL-6. Dicho péptido generalmente comprende 10 - 80, de preferencia 20 - 50, más preferentemente 20 - 40 residuos de aminoácido. El péptido parcial de IL-6 o el peptido parcial de receptor de IL-6 se puede construir especificando la región involucrada en el enlace a IL-6 y receptor de IL-6 en la secuencia de aminoácido de IL-6 o receptor de IL-6, y produciendo parte o toda la secuencia de aminoácido mediante un método convencional tal como una tecnología de ingeniería genética o un método de síntesis de péptido. A fin de preparar el péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial de receptor de IL-6 mediante una tecnología de ingeniería genética, la secuencia de ADN que codifica el péptido deseado se integra hacia un vector de expresión, del que el péptido se puede obtener mediante los métodos de expresión producción y purificación del anticuerpo recombinante . La preparación del péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial de receptor de IL-6 mediante el método de síntesis de péptido se puede efectuar utilizando un método comúnmente usado en síntesis de péptido tal como síntesis de fase sólida o síntesis de fase líquida. Específicamente, el método descrito en Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals) , vol. 14, Peputido Gousei (Peptide Synthesis), editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991, se puede usar. El método de síntesis de fase sólida usado incluye, por ejemplo, una reacción en la que un aminoácido correspondiente a la terminal C del péptido que se va a sintetizar se copula a un soporte que es insoluble en solventes orgánicos, y luego un aminoácido en el que el grupo alfa-amino o un grupo funcional de cadena lateral se ha protegido con un grupo protector apropiado se condensa, un aminoácido a la vez, de la terminal C en la dirección a la terminal N, y una reacción en la que el grupo protector del grupo alfa-amino del aminoácido o el péptido copulado a la resina se elimina se repiten alternativamente para alargar la cadena de péptido. Los métodos de síntesis de péptido de fase sólida se dividen en el método Boc y el método moc dependiendo del tipo de grupo protector que se va a usar. Después de que se completa la síntesis del péptido deseado, una reacción de desprotección y una reacción para dividir la cadena de péptido del soporte se llevan a cabo. Para separación de la cadena de péptido, fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometansulfónico en el método Boc y TFA en el método Fmoc se usan generalmente. En el método Boc, por ejemplo, la resina de péptido protegida anterior se trata en fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. Subsecuentemente, el grupo protector se elimina y el péptido se recupera separando del soporte.

Mediante liofilización, se puede obtener un péptido crudo. Por otra parte, en el método F oc, la reacción de desprotección y la reacción de separación del péptido a partir del soporte se pueden realizar en TFA por ejemplo, en un procedimiento similar al anterior. El péptido crudo obtenido de esta manera se puede aplicar a HPLC para su separación y purificación. Su elución se puede llevar a cabo en un sistema de agua-solvente de acetonitrilo que se usa comúnmente para purificación de proteina bajo una condición óptima. La fracción correspondiente a la cresta del perfil de la cromatografía obtenida se recoge y liofiliza. La fracción de péptido purificada de esta manera se identifica sometiéndola al análisis del peso molecular mediante análisis espectroscópico de masa, el análisis de composición de aminoácido, o el análisis de secuencia de aminoácido, y lo semejante. Los ejemplos específicos del péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial de receptor de IL-6 se describen en la Publicación de Patente No Examinada japonesa (Kokai) 2-188600, publicación de Patente No Examinada japonesa (Kokai) 7-324097, Publicación de Patente No Examinada japonesa (Kokai) 8-311098, y la Publicación de Patente de Estados Unidos US 5210075. La actividad del antagonista de IL-6 para usarse en la presente invención de bloquear la transducción de señal de IL-6 se puede evaluar usando un método convencionalmente conocido. Específicamente, la línea de célula de mieloma humana dependiente de IL-6 (S6B45, KPMNM2) , línea de célula de T-linfoma de Lennert humana KT3, o célula dependiente de IL-6 MH6C.BSF2 se cultiva, a la que se añade IL-6, y la actividad se puede evaluar usando la incorporación de 3H-timidina hacia la célula dependiente de IL-6 con la coexistencia del antagonista de IL-6. Alternativamente, U266, una célula que expresa receptor de IL-6, se puede cultivar, a la que se añade IL-6 125I-etiquetada y un antagonista de IL-6 se añade al mismo tiempo, y luego el IL-6 12I-etiquetado ligado a la célula que expresa receptor de IL-6 se determina. En el sistema de ensayo anterior, un grupo de control negativo que no contiene antagonistas de ILO-6, además del grupo en el que un antagonista de receptor de IL-6 está presente, se establece, y los resultados obtenidos de los mismos se comparan para evaluar la actividad de inhibición de IL-6 del antagonista de IL-6. Como se describe en el Ejemplo abajo, el anticuerpo receptor de anti-IL-6 exhibió un efecto terapéutico en pacientes con daño en médula espinal. El sujeto a tratar en la presente invención es un mamífero.

El mamífero sujeto a tratar es de preferencia un humano. Los agentes terapéuticos para daño a médula espinal de la presente invención se pueden administrar, ya sea oral o parenteralmente, sistémicamente o localmente. Por ejemplo, la inyección intravenosa tal como infusión de goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, supositorios, lavado intestinal, tabletas revestidas entéricas orales, y lo semejante se pueden seleccionar, y el método de administración se puede elegir, como sea apropiado, dependiendo de la edad y las condiciones del paciente. La dosificación efectiva se selecciona de la escala de 0.01 mg a 100 mg por kg de peso corporal por administración. Alternativamente, la dosificación en la escala de 1 a 1000 mg, de preferencia 5 a 50 mg por paciente se puede seleccionar. Las dosificaciones preferidas y métodos de administración preferidos son tales que, en el caso de anticuerpo de receptor de anti-IL-6, las cantidades en donde el anticuerpo libre está presente en la sangre son dosificaciones efectivas. En ejemplos específicos, 0.5 mg a 40 mg por kg de peso corporal, de preferencia 1 mg a 20 mg, al mes (4 semanas) se administran en una o varias dosis, por ejemplo en el programa de administración de dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada cuatro semanas y lo semejante mediante inyección intravenosa tal como infusión de goteo e inyección subcutánea. El programa de administración se puede ajustar observando las condiciones de enfermedad y los niveles de sangre de pruebas de laboratorio, por ejemplo, prolongando el intervalo de administración de dos veces por semana o una vez por semana a una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, y lo semejante. Los agentes terapéuticos para daño de médula espinal de la presente invención pueden contener portadores o aditivos farmacéuticamente aceptables dependiendo de la ruta de administración. Los ejemplos de dichos portadores o aditivos incluyen agua, un solvente orgánico farmacéutico aceptable, colágeno, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboxímetilcelulosa de sodio, sodio poliacrílico, alginato de sodio dextrano soluble en agua, sodio de almidón de carboximetilo, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol de estearilo, ácido esteárico, albúmina de suero humano (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable y lo semejante.- Los aditivos usados se seleccionan de, pero no están limitados a los anteriores o combinaciones de los mismos, dependiendo de la forma de dosificación. Ejemplos La presente invención se explicará ahora con mayor detalle con referencia a los ejemplos y ejemplos de referencia. Se debe observar, sin embargo, que la presente invención no está limitada a ellos en forma alguna. Ejemplo 1 Materiales y Métodos Animales : Se usaron ratones c57BL/6J adultos (18-22g) hembras en todos los grupos de experimento. Daño de Médula Espinal Los ratones hembra se anestesiaron mediante la inyección intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) . La espalda se rasuró, se hizo una incisión de piel de linea media de 20 mm, y luego se expuso la espina. Después la región torácica de la espina se expuso mediante separación a los lados del músculo de espalda, el proceso espinoso de la vértebra T7-T13 se expuso. Se hizo laminectomía en el noveno nivel de espina torácica para exponer la médula espinal teniendo cuidado de no dañar la materia dura. La espina se estabilizó con fórceps y abrazaderas en los procesos espinosos T7 y Til y el ligamento. Después del cuerpo de animal se hizo flotar reduciendo la etapa, se hizo el daño de médula espinal (SCI) mediante el impactador NYU. Un peso de 3 g (el ápice con un diámetro de 1.2 mm) se dejó caer desde una altura de 25 mm a la médula espinal de nivel T9. Los músculos y la parte cortada se cerraron en capas, y los animales se colocaron en una cámara controlada en temperatura hasta que el control de temperatura se reestablece. La orina mediante expulsión de vejiga manual se realizó dos veces al dia hasta que se estableció la orina espontánea. Protocolo y la inyección de mAB receptor de IL-6 contra ratón de rata (MR16-1) : Inmediatamente después del daño, 100 ug de MR16-1 por gramo de peso corporal de ratón se administró por una sola inyección intraperitoneal (el grupo MR16-1, n=15) , y el grupo de control recibió la misma cantidad de IgG de rata mediante inyección intraperitoneal (el grupo de control, n=15) . Para análisis histológico e inmunohistoquímico de ambos grupos, la inyección intraperitoneal de BrdU (50 mg/kg de peso corporal) se realizó durante dos semanas desde el dia de la cirugía a fin de etiquetas las células divididas . Evaluación de función motora: Utilizando tres pruebas diferentes, los presentes inventores evaluaron la recuperación de función motora después del daño. La evaluación funcional se continuó a la semana 6 después del daño.

La evaluación de función motora de los miembros inferiores: A fin de evaluar el efecto funcional de SCI, los presentes inventores realizaron una evaluación de función motora mediante la marca Basso-Beattie-Bresna an (BBB) que se ha usado común y ampliamente. Tres probadores diferentes evaluaron animales individuales durante cuatro minutos de una manera ciega doble, y marcaron (0-21) la función de los miembros inferiores individuales como se define. Todas las pruebas se grabaron en cintas de video. SCA ET : SCA ET es un sistema analítico automatizado de movimiento animal que comprende una jaula equipada con bastidor sensor infrarrojo. Este supervisa movimientos menores (Mi) y mayores (M2) laterales y verticales (RG) , es decir, el número de veces de pararse, que cuantifica la cantidad de movimiento espontáneamente realizado por el animal en un momento dado. En particular, se dice que hay una relación estadística positiva entre la marca RG y la marca BBB. Molino de caminada de Varilla giratoria: El movimiento coordinado de los cuatro miembros se evaluó colocando un ratón en un dispositivo de varilla revolvente que comprende una varilla de plástico de manera de forzar a los ratones a caminar. El ratón se coló sobre la varilla revolvente a velocidades de 5, 10 y 165 rpm, y el tiempo latente hasta que cayó se supervisó durante 120 segundos.

La función de movimiento coordinado se evaluó cada uno del valor medio y el máximo. Inmunohistoquímica : Para examen histológico, los ratones se anestesiaron mediante inhalación de éter de dietilo, y 4% de paraformaldehido, se perfundió transcardiacamente, y los ratones se fijaron. La médula espinal se extrajo, y se fijó posteriormente con 4% de paraformaldehido a temperatura ambiente durante unas pocas horas. La muestra de tejido se sumergió en 10% de sucrosa a 4°C durante 24 horas, y se colocó en 305 de sucrosa durante 48 horas antes de incrustarla en el compuesto OTC. El tejido incrustado se congeló en nitrógeno liquido y se almacenó a -80°C. Las criosecciones se hicieron mediante sección sagital y sección axial a un espesor de 20 micrómetros, y se manchó con la mancha HE o la doble mancha de inmunofluoro. Para el experimento de doble mancha de inmunofluoro, la sección de médula espinal se bloqueó en 0.03% de Tritón X-100 y 105 de suero de cabra normal en 0.01M PBS (pH 7.4) durante 30 minutos. Como el anticuerpo primario, se usaron anticuerpo anti-GFAP de conejo, anticuerpo anti-Brd-U/ de rata y anticuerpo anti-Hu humano (como un marcador de neurona), y se incubaron durante la noche a 4°C. Como el anticuerpo secundario se usaron anticuerpo de IgG de conejo conjugado con FITC y anticuerpo de rata conjugado con Texas Red, y se mancharon en doble. Las platinas se lavaron, fijaron en húmedo y se analizaron bajo un flúoromicroscopio. Análisis de mancha Western Doce horas después de la creación de daño (n=4 para cada grupo) , un segmento de 8 mm de la médula espinal (del centro del daño, 4 mm del lado de proboscis y 4 mm de lado de caudal) se cortó, que se homogeneizó en un tampón bacteriolitico MASPK que contiene un inhibidor de proteasa, y se sónico seguido por centrifugación a 15,000 rpm. Se separó la proteína del sobrenadante de cada muestra mediante SDS-PAGE, y se manchó a una membrana de poli (difluoruro) vinilideno mediante electroforesis . Después la membrana se bloqueó en un tampón TBST que contiene 5% de lecha desgrasada, 150 mM de NaCl y 0.05% de Tween 20 (pH 7.5) a temperatura ambiente durante una hora, ya sea de anticuerpo anti-stat3 de conejo policlonal o anticuerpo stat3 anti-fosforilado de conejo o anticuerpo anti-IL-6R<¾ de conejo se usó como el anticuerpo primario, y luego se incubaron junto con anticuerpo IgG de anti conejo conjugado con HRP como el anticuerpo secundario. Después de revelar a una película mediante un revelador automatizado, se cuantificó mediante el formador de imagen alfa. Resultado: (1) Evaluación de función motora de miembros inferiores Para 15 ratones dañados en médula espinal que recibieron anticuerpo de receptor de anti-IL-6 (MR16) y6 15 ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior, los valores medios de marcas BBB se muestran en una gráfica en la Figura 1. Después de daño de médula espina. En el dia 7 y a continuación, la recuperación de movimiento fue buena en el grupo de ratones que recibieron el anticuerpo MR16, y en la semana 5 y semana 6 se observó una diferencia significativa. (2) SCANET Para 15 ratones dañados en médula espinal que recibieron el anticuerpo de receptor de anti-IL-6 (MR16) y 15 ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior, el movimiento lateral y el número de veces de pararse se compararon, con un resultado que no se observó diferencia significativa en movimiento lateral, pero el movimiento de pararse se observó en 12 de 15 ratones dañados en médula espinal que recibieron anticuerpo receptor de anti-IL-6 (MR16) , mientras que solamente se observó en 3 de 15 ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior. Esta diferencia fue significativa por la prueba de probabilidad exacta de Fisher con p<0.05. (3) Molino de caminata de varilla giratoria Para 15 ratones dañados en médula espinal que recibieron anticuerpo de receptor de anti-IL-6 (MR16) y 15 ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior, se realizó el experimento anterior, con un resultado que no se observó diferencia significativa cuando la velocidad de revolución de la varilla fue 10 rpm (10 revoluciones por minuto) y 15 rpm, mientras que a 5 rpm, como se muestra en la Figura 2, en el dia 358 y a continuación después del daño de médula espinal, la recuperación de los ratones dañados en médula espinal que recibieron anticuerpo receptor de anti-IL-6 (MR6) fue significativamente (p<0.05) superior que aquella de los ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior. (4) Examen inmunohistoquímico A pesar de la presencia de células de tallo neurales inherentes en la medula espinal de adulto, la reparación de la médula espinal debida a la diferenciación de las células no ocurre. Esto es probablemente debido a que las células de tallo neurales inherentes diferencias en células precursoras de glia y además en astrocitos en la médula espinal dañada y de esta manera no se diferencian en células neuronales. Cuando la formación de astrocitos reactivos se contó por un método inmunofluorescente usando anticuerpo anti-GFAP y anticuerpo anti-BrDU para la médula espinal de la parte dañada de cuatro ratones dañados en médula espinal que recibieron anticuerpo receptor de anti-IL-6 (MR16) y la parte dañada de cuatro ratones dañados en médula espinal (control) que no recibieron el anticuerpo anterior, como se muestra en la figura 3, la administración del anticuerpo anterior redujo significativamente la formación de astrocitos reactivos (p<0.01) . (5) Análisis de mancha Western Para cuatro ratones dañados en médula espinal y cuatro ratones dañados en médula espinal (control), la expresión de receptor de IL-6 a 12 horas después del daño a médula espinal se investigó mediante análisis de mancha Western. El resultado se muestra en la figura 4. La expresión de receptor IL-6 solamente se observó en los ratones dañados en médula espinal. Asimismo, como se muestra en la Figura 5, la administración de MR16 suprimió la cantidad de STAT3 fosforilado, indicando que el MR16 intraperitonealmente administrado actuó en la médula espinal . Lo anterior confirmó que los antagonistas de IL-6 promuevan la reparación de daño de médula espinal . Ejemplo de referencia 1. Preparación de receptor de IL-6 soluble humano Se preparó receptor de IL-6 soluble mediante el método PCR usando un plásmido pBSF2R.236 que consiente cADN que codifica receptor de IL-6 obtenido de conformidad con el método de Yamasaki y col., (Yamasaki, K., y col, Science (1988) 241, 825-828) . El' plásmido p3SF2R.236 se digirió con una enzima de restricción Sph I para obtener el cADN de receptor de IL-6, que luego se insertó en mpl8 (fabricado por Amersham) . Utilizando un oligoimprimador sintético diseñado para introducir un codón de detención hacia el cADN de receptor de IL-6, se introdujo una mutación en el cADN de receptor de IL-6 mediante el método PCR utilizando el Sistema de Mutagenesis in vitro (fabricado por Amersha) . El procedimiento resultó en la introducción de un codón de detención al aminoácido en la posición 345, y proporcionó cADN que codifica receptor de IL-6 soluble. A fin de expresar el cADN de receptor de IL-6 soluble en células CHO, se ligó a un plásmido pSV (fabricado por Pharmacia) para obtener un plásmido pSVL344. El cADN de receptor de IL-6 soluble que se separó con Hind III-Sal I se insertó al plásmido pECEdhfr que contiene 1 cACN de dhfr para obtener un plásmido pECEdhfr344 que se puede expresar en las células CHO. Diez ug de plásmido pECEdhfr344 se transfectaron a una linea de célula dhfr-CHO DXB-11 (Urlaub G. , y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1980) 77, 4216-4220) mediante el método de precipitación de fosfato de calcio (Chen C. , y col., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). Las células CHO transfectadas se cultivaron durante 3 semanas en un medio de selección MEM alfa libre de nucleósido que contiene 1 iriM de glutamina, 10% de FCS dializada, 100 U/ml de penicilina, y 100 ug/ml de estreptomicina . Las células CHO seleccionadas se tamizaron mediante el método de dilución de limitación para obtener un solo clón de célula CHO. El clón de célula CHO se amplificó en 20 nM - 200 nM de metotrexato (MTX) para obtener una linea 5E27 de célula CHO que produce receptor de IL-6 soluble humano. La linea 5E27 de célula CHO se cultivó en un medio modificado con Iscov de Dulbecco (IMDM, fabricado por Gibco) que contiene 5% de FBS. El sobrenadante de cultivo se recogió y la concentración de receptor de IL-6 soluble en el sobrenadante de cultivo se determinó mediante ELISA. El resultado confirmó, que el receptor de IL-6 soluble está presente en el sobrenadante de cultivo. Ejemplo de referencia 2. Preparación de anticuerpo de IL-6 anti-humano. Diez ug del IL-6 recombinante (Hirano y col., Immunol. Lett., 81988) 17, 41) se utilizaron para inmunizar ratones BALB/c junto con adyuvante completo de Freund, y esto se repitió cada semana hasta que el anticuerpo de anti-IL-6 se pudo detectar en el suero. Las células inmunes se trajeron de nodos de linfo locales y luego se fundieron con una linea P3U1 de célula de mieloma utilizando polietilenglicol 1500. Las hibridomas se seleccionaron de conformidad con el método de Oi y col.

(Selective Methods en Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980) que emplea el medio HAT, y la hibridoma que produce anticuerpo IL-6 anti-humano se estableció . La hibridoma que produce anticuerpo IL-6 anti-humano se sometió al ensayo de enlace de IL-6 como sigue. De esta manera, una placa de microtitulo de 96 pozos hecha de polivinilo flexible (fabricada por Dynatech Lahboratoríes, Inc., Alexandria, VA) se revistió con 100 ul de Ig anti-ratón de cabra (10 ul/ml, fabricada por Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) durante la noche a 4UC en 0.1 M de tampón de carbonato-carbonato de hidrógeno, pH 9.6. Subsecuentemente, la placa se trató con 100 ul de PBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA) a temperatura ambiente durante 2 horas . Después de lavar en PBS, 100 ul del sobrenadante de cultivo de hibridoma se añadieron a cada pozo, y luego se incubó durante la noche a 4°C. La placa se lavó, se añadió IL-6 recombinante 125I-etiquetado a cada pozo a una concentración de 2000 cpm/0.5 ng/pozo, y luego la radioactividad de cada pozo después de lavar se determinó mediante un contador gamma (Beckman Gamma 9000, Bechman Instruments, Fullerton, CA) . De 216 clones de hibridoma, 32 fueron positivos, en el ensayo de enlace de IL-6. De estos clones, MH166.BSF2 estable se obtuvo finalmente. El anticuerpo anti-IL-6 MH166 producido por dicha hibridoma fue un subtipo de IgGl k. Luego, el clón de hibridoma de ratón IL-6-dependiente MH60.BSF2 se usó para examinar la actividad de neutralización con respecto al crecimiento de la hibridoma mediante anticuerpo MH166. Las células de MH60.BSF2 se surtieron a 1 x 10V200 ul/pozo, y muestras que contienen anticuerpo MH166 se añadieron a las mismas, se cultivaron durante 48 horas, se añadió 0.5 uCi/pozo de 3H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA.) , y el cultivo se continuó durante 6 horas adicionales. Las células se colocaron en un papel de filtro de vidrio y se trataron mediante un cosechador automático (Labo Mah Science Co., Tokio, Japón) . Como el control, se usó el anticuerpo anti-IL-6 de conejo. Como resultado, el anticuerpo MH166 inhibió, en una manera dependiente de dosis, la incorporación de 3H-timidina de células MH60.BSF2 inducidas por IL-6. Esto reveló que el anticuerpo MH166 neutraliza la actividad de IL-6.

Ejemplo de referencia 3. Preparación de anticuerpo de receptor de IL-6 anti-humano Anticuerpo MT18 de receptor de anti-IL-6 preparado mediante el método de Hirata y col. (Hirata, Y., y col., J. Immunol., (1989) 143, 2900-2906) se ligó a Sepharose 4B CNBr-activada (fabricada por Pharmacia Fine Chemicals, piscata ay, NJ) de conformidad con el régimen anexo, y receptor de IL-6 (Yamasaki, K. , y col., Science (1988) 241, 825-828) se purificó. Una linea U266 de célula de mieloma humana se solubilizó con 1 mM de clorhidrato de fluoruro de p-para-aminofenil metano sulfonilo (fabricado por Wako Chemicals) (tampón de digitonina) que contiene 1% de digitonina (fabricado por Wako Chemicals) , 10 mM de trietanolamina (OH 7.8) y 0.15 M de NaCl, y se mezclo con anticuerpo MT18 ligado a cuentas de Sepharose 4B. Luego, las cuentas se lavaron seis veces con el tampón de digitonina para preparar el receptor de IL-6 parcialmente purificado que se va a usar para inmunización. Ratones BALB/c se inmunizaron cuatro veces cada diez dias con el receptor de IL-6 parcialmente purificado anterior obtenido de 3 x 109 células U266, y luego se preparó una hibridoma usando un método convencional. El sobrenadante de cultivo de hibridoma del pozo de crecimiento positivo se probó para su actividad de enlace a receptor de IL-6 de conformidad con el método abajo descrito. 5 x 107 células U266 se etiquetaron con 35S-metionina (2.5 mCi) y se solubilizaron con el tampón de digitonina anterior. Las células U266 solubilizadas se mezclaron con un volumen de 0.4 mi de anticuerpo MT18 ligado a cuentas de Sepharose 4B, y luego se lavaron seis veces con el tampón de digitonina. Se eluyó receptor de IL-6 35S-metionina-etiquetado con 0.25 mi del tampón de digitonina (pH 3.4) y se neutralizó en 0.025 mi de 1M tris (pH 7.4) . 0.05 mi del sobrenadante de cultivo de hibridoma se mezclaron con 0.01 mi de Proteina G Sepharose (fabricada por Pharmacia) . Después de lavar. La Sepharose se incubó con 0.0095 mi de solución de receptor de IL-6 35S-etiquetada preparada como se describió arriba. El inmunoprecipitado se analizó mediante SDS-PAGE para investigar el sobrenadante de cultivo de hibridoma que reacción con receptor de IL-6. Como resultado, un clón PM-1 de hibridoma de reacción positiva (FERM BP-2998) se estableció. El anticuerpo producido de la hibridoma PM-1 tiene un subtipo de IgGl k. La actividad inhibitoria del anticuerpo producido por la hibridoma PM-1 en el enlace de IL-6 a receptor de IL-6 humano se estudió usando la linea U266 de célula de mieloma humana. Un IL-6 recombinante humano se preparó de E. coli (Hirano y col., Inmunol. Lett., (1988) 17, 41-45), y se etiquetó con 125I utilizando el reactivo Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, ??) (Taga, T., y col., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981). 4 x 105 células U266 se cultivaron con el 70% (volumen/volumen) de sobrenadante de cultivo de hibridoma de PM-1 junto con 14,000 cpm de IL-6 125I-etiquetado durante una hora. Setenta ul de la muestra se formó en capas en 300 ul de FCS en un tubo de polietileno microfugo de 400 ul. Después de centrifugación, la radioactividad de la célula se determinó. El resultado reveló que el anticuerpo producido por la Hibridoma PM-1 inhibe el enlace de 11-6 a receptor de IL-6. Ejemplo de referencia 4. Preparación de anticuerpo de receptor de anti-Il-6 Un anticuerpo monoclonal dirigido contra receptor IL-6 de ratón se preparó de conformidad con el método descrito en Saito, y col., J. Immunol. (1991) 147, 168-173. Las células CHO que producen receptor de IL-6 soluble de ratón se cultivaron en el liquido de cultivo IMDM que contiene 10% de FCS. Del sobrenadante de cultivo, receptor de IL-6 soluble de ratón se purificó usando una columna de afinidad en la que el anticuerpo R12 receptor de IL-6 anti-ratón (ver Saito, y col., supra) se había fijado a gel Affigel 10 (fabricado por Biorad) . El receptor de IL-6 soluble de ratón (50 ug) obtenido de esta manera se mezcló con adyuvente completo de Freund, que luego se inyectó al abdomen de ratas Wistar. De dos semanas después de la administración, los animales se acrecentaron con adyuvante incompleto de Freund. En el dia 45, se cosecharon células de bazo de rata, y aproximadamente 2 x 108 células de las mismas se fundieron con 1 x 107 células de mieloma de ratón P3U1 utilizando un PEG1500 al 50% (fabricado por Boehringer annheim) de conformidad con el método convencional, y luego se tamizaron mediante el medio de cultivo HAT. Después de que el sobrenadante de cultivo de hibridoma se añadió a la placa revestida con anticuerpo IgG anti-rata de cone o (fabricado por Cappel) , el receptor de IL-6 soluble de ratón se hizo reaccionar. Subsecuentemente, usando anticuerpo receptor de IL-6 anti-ratón de conejo e IgG de anti-conejo de oveja etiquetada con fosfatasa alcalina, las hibridomas que producen anticuerpo dirigido contra receptor IL-6 soluble de ratón se tamizaron mediante ELISA. Los clones de hibridoma para los que se confirmó la producción de anticuerpo se subtamizaron dos veces para obtener un solo clon de hibridoma. El clon se designó como MR16-1. La actividad de neutralización del anticuerpo producido por la hibridoma en transduccion de señal de IL-6 de ratón se examinó mediante incorporación de 3H-timidina usando células MH60.BSF2 (Matsuda, T. , y col., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). A una placa de 96 pozos, células MH60.BSF2 se prepararon a 1 x 104 células/200 ul/pozo. A la placa se añadieron 10 pg/ml de IL-6 de ratón y anticuerpo MR16-1 o anticuerpo RS12 a 12.3 - 1000 ng/ml, luego se cultivaron a 3 °C y 5% de C02 durante 44 horas, la incorporación de 3H-timidina se midió. Como resultado, se encontró que el anticuerpo MR16-1 suprimió' la incorporación de 3H-timidina mediante las células MH60.BSF2. De esta manera, se demostró que el anticuerpo producido por la hibridoma MR16-1 (FERM BP-5875) inhibe el enlace de IL-6 a receptor de IL-6.

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un agente terapéutico para daño de la médula espinal que comprende un antagonista de interleucina-6 (IL-6) como un ingrediente activo.
2. 2. - el agente terapéutico para daño de la médula espinal de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6.
3. 3. - El agente terapéutico para daño de la médula espinal de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. - El agente terapéutico para daño de la médula espinal de conformidad con la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano.
5. 5. - El agente terapéutico para daño de la médula espinal de conformidad con la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 de ratón.
6. 6. - El agente terapéutico para daño de la médula espinal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recom inante .
7. 7. - El agente terapéutico para daño de la médula espinal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano es anticuerpo de PM-1.
8. 8. ~ El agente terapéutico para daño de médula espinal de conformidad con la reivindicación 5, en donde el anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 de ratón es anticuerpo MR16-1.
9. 9. - El agente terapéutico para daño de médula espinal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano contra receptor de IL-6.
10. 10. - El agente terapéutico para daño de médula espinal de conformidad con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo humanizado en un anticuerpo PM-1 humanizado.
11. 11.- Un modulador de diferenciación de células de tallo neurales que comprende un antagonista de interleucina-6 (IL-6) como un ingrediente activo.
12. 12. - Un inhibidor de diferenciación hacia células glia que comprende un antagonista de interleucina-6 (IL-6) como un ingrediente activo.
13. 13. - El uso de un antagonista de interleucina-6 (IL-6) para la fabricación de un agente terapéutico para daño de médula espinal.
14. 14. - El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el antagonista IL-6 es un anticuerpo contra receptor de IL-6.
15. 15. - El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
16. 16. - El uso de conformidad con la reivindicación 13 o 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano.
17. 17. - El uso de conformidad con la reivindicación 14 o 15, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 de ratón.
18. 18.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante .
19. 19. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en donde el anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano es anticuerpo PM-1.
20. 20. - El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo monoclonal contra receptor IL-6 de ratón es anticuerpo MR16-1.
21. 21. - el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano contra receptor de IL-6.
22. 22. - El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo PM-1 humanizado.
23. 23. - El uso de antagonista de interleucina-6 (IL-6) para la fabricación de un modulador de diferenciación de células de tallo neurales.
24. 24. - El uso de antagonista de interleucina-6 (IL-6) para la fabricación de un inhibidor de diferenciación hacia células glia.
25. 25. - Un método terapéutico para daño de médula espinal de un sujeto, que comprende administrar un antagonista de interleucina-6 (IL-6) al sujeto.
26. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra receptor de IL-6.
27. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
28. 28. - El método de conformidad con 1 reivindicación 26 o 27, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano.
29. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 26 o 27, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 de ratón.
30. 30. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante .
31. 31.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, en donde el anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 humano es anticuerpo PM-1.
32. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo monoclonal contra receptor de IL-6 "de ratón es anticuerpo MR16-1.
33. 33. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano contra receptor de IL-6.
34. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo PM-1 humanizado.
35. 35. - Un método para modular la diferenciación de células de tallo neurales de un sujeto, que comprende administrar un antagonista de interleucina-6 (IL-6) al sujeto.
36. 36. - Un método para inhibir la diferenciación hacia células glia, en un sujeto, que comprende administrar un antagonista de interleucina-6 (IL-6) al sujeto.