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CN117448299A - 脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物 - Google Patents

脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物 Download PDF

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CN117448299A
CN117448299A CN202311183931.5A CN202311183931A CN117448299A CN 117448299 A CN117448299 A CN 117448299A CN 202311183931 A CN202311183931 A CN 202311183931A CN 117448299 A CN117448299 A CN 117448299A
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CN
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variant
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lipase
substitution
acid
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Application number
CN202311183931.5A
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M·D·G·P·托斯卡诺
T·A·波尔森
C·H·汉森
L·鲍恩斯加德
K·吉布森
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Novozymes AS
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Novozymes AS
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Abstract

本发明涉及脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物。本发明涉及亲本脂肪酶的变体，这些变体具有脂肪酶活性并且包含对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的一个或多个取代，其中使用SEQ ID NO:2进行编号。本发明还涉及包含本发明的脂肪酶变体的组合物或微囊组合物，并且涉及包含本发明的微囊组合物的液体产品，以及所述微囊组合物用于稳定本发明的脂肪酶变体的用途。

Description

脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物
本申请是申请日为2018年9月25日，申请号为201880061647.1，发明名称为“脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物”的中国专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请含有呈计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。
技术领域
本发明涉及脂肪酶变体、编码这些变体的多核苷酸以及产生所述变体的方法。本发明还涉及包含本发明的脂肪酶变体的组合物和微囊组合物以及包含本发明的微囊组合物的液体产品。
背景技术
脂肪酶是重要的生物催化剂，其已经示出对于不同应用是有用的。以商品名LIPOLASETM出售的野生型疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)(同义词疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa))脂肪酶及其变体已被商业化为洗涤剂组合物中的活性成分，用于通过水解甘油三酯生成脂肪酸来去除脂质污渍。
洗涤剂、清洁和/或织物护理组合物包含干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力的活性成分。具有良好洗涤性能的许多已知的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体在洗涤期间形成产生气味的短链脂肪酸和/或具有短的储存稳定性。
因此，仍然需要和期望具有改善的洗涤性能、减少的气味产生和/或改善的储存稳定性/更长的保存期限/增加的热稳定性的脂肪酶。
发明内容
本发明涉及亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T231R、N233R、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
此外，本发明涉及包含本发明的脂肪酶变体的组合物及其在水解脂质底物中的用途。此外，本发明涉及编码本发明的变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；
在一方面，本发明涉及微囊组合物，其中该微囊的膜通过使具有高于1kDa分子量的多支化的多胺交联而产生，其中该微囊包含本发明的脂肪酶变体。
在又一方面，本发明涉及微囊组合物，这些微囊组合物包含被截留在由膜形成的隔室中的本发明的脂肪酶变体，该膜通过使(a)具有高于800Da分子量的多支化的多胺和(b)具有小于300Da分子量的脂肪胺或芳香胺的交联而产生；其中(a)/(b)的重量比在0.1至1000的范围内。
最后，本发明涉及包含本发明的微囊组合物的液体产品。
定义
脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂肪分解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC3.1.1类中的酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一方面，本发明的变体具有至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％的SEQ ID NO:2的多肽的脂肪酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体位点的基因的两种或多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可能导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有在多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至269的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但是小于100％。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％ SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本脂肪酶有所改进的变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于洗涤剂稳定性、具有存在蛋白酶的洗涤剂中的稳定性、蛋白酶稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、pH稳定性、储存条件下的稳定性、以及热稳定性。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％ SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后呈其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至269。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸1至807。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％ SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％ SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的、或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段、或是合成的，其含有一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被置于相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得控制序列引导编码序列的表达。
亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指一种脂肪酶，对该脂肪酶进行改变以产生本发明的酶变体。该亲本脂肪酶可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的残基数×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸数×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
稳定性：本发明的脂肪酶变体的稳定性可以表示为在暴露于不同测试条件(例如储存在洗涤剂组合物中、在不同温度、在不同pH、在不同组分(例如蛋白酶、化学品、和/或氧化物质(压力条件)的存在下)期间或之后或在用于洗涤过程期间，所述脂肪酶的残余活性或残余性能。脂肪酶变体的稳定性可以相对于亲本脂肪酶(例如示为SEQ ID NO:2的脂肪酶)的已知活性或性能，或替代性地相对于最初添加到任选地冷藏或冷冻储存的洗涤剂组合物时的变体脂肪酶的已知活性或性能，或相对于冷藏或冷冻储存的(无压力条件)脂肪酶变体来测量。
子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5′端和/或3′端缺失的一个或多个(例如若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1至807的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％，但是小于100％。
变体：术语“变体”意指具有脂肪酶活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的脂肪酶活性。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％ SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％ SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的脂肪酶。
变体命名惯例
出于本发明的目的，使用作为SEQ ID NO:2披露的多肽来确定另一种脂肪酶中的相应的氨基酸残基。另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于SEQ ID NO:2中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种脂肪酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:2的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.可以在一个位置处引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
披露了亲本脂肪酶的变体，这些变体具有脂肪酶活性，与例如衍生自疏棉状嗜热丝孢菌的SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性。
变体
本发明提供了亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T231R、N233R、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
优选地，该脂肪酶变体与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个取代。优选地，该变体包含在对应于T231R和/或N233R的位置处另外包含一个或两个取代。
优选的变体包含在对应于G23S的位置处的取代。优选的变体包含在对应于D27N的位置处的取代。优选的变体包含在对应于A40l的位置处的取代。优选的变体包含在对应于F51I,L的位置处的取代。优选的变体包含在对应于E56R的位置处的取代。优选的变体包含在对应于D57N的位置处的取代。优选的变体包含在对应于V60E,K的位置处的取代。优选的变体包含在对应于K98I的位置处的取代。优选的变体包含在对应于N101D的位置处的取代。优选的变体包含在对应于R118F的位置处的取代。优选的变体包含在对应于G163S的位置处的取代。优选的变体包含在对应于Y220F的位置处的取代。优选的变体包含在对应于T244E的位置处的取代。优选的变体包含在对应于P256T的位置处的取代。
优选的变体包含在对应于F51I,L、E56R和/或R118F的位置处的一个或多个取代。
在优选的实施例中，本发明的变体包括以下一组取代中的任一种：
在一个实施例中，该变体包含在对应于T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在一个优选的实施例中，该变体包含对应于E56R+T231R+N233R的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在一个优选的实施例中，该变体包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在一个更优选的实施例中，变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在另一个更优选的实施例中，该变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在又一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在附加的甚至更优选的实施例中，变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在又一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在附加的甚至更优选的实施例中，变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在又一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在进一步优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。在又一个更优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60EK、N101D、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在又一个甚至更优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在进一步优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在进一步优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。在进一步优选的实施例中，该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
特别优选的实施例包括包含在对应于以下一组取代之一的位置处的取代的变体：
R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+D57N+R118F+T231R+N233R；
E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
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D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
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A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
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G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
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G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
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F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
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F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
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G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
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G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
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G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
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G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T。
本发明的脂肪酶变体与亲本脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个优选的实施例中，本发明的变体与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
本发明的变体可以具有1-40、1-30、1-20，诸如1-12，诸如1-11，诸如1-10，诸如1-9，诸如1-8，诸如1-7，诸如1-6，诸如1-5，诸如1-4，诸如1-3，或诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个取代。
与亲本脂肪酶相比，本发明的变体可以具有以下一种或多种特性：改善的洗涤性能、减少的气味产生、改善的储存稳定性、更长的保存期限和/或增加的热稳定性。
本发明的脂肪酶变体可以进一步包含在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的取代。
氨基酸改变可以具有微弱的性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；最多20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],纽约学术出版社(AcademicPress,New York)中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
替代性地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，这些氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
变体可以由SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％组成或含有它们。
亲本脂肪酶
该亲本脂肪酶可以选自由以下组成的组：
a)与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的多肽；
b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交；
c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
d)SEQ ID NO:2的多肽的片段。
在本发明的一方面，该亲本脂肪酶与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，具有脂肪酶活性。
在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差最多40个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。
在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的多肽的片段，该片段包含SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的多肽的等位基因变体。
在另一方面，该亲本脂肪酶由如下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的多肽编码序列、(ii)(i)的全长补体杂交(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第2版，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,NewYork))。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的多肽编码序列。在另一方面,这些核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，该亲本由如下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的多肽编码序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本脂肪酶可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两种多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6：240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
该亲本脂肪酶可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
亲本可以是细菌脂肪酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属或嗜热裂孢菌属脂肪酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属脂肪酶。
在一方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)脂肪酶。
在另一方面，该亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)脂肪酶。
在另一方面，该亲本是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌脂肪酶。
在另一方面，该亲本是阿尔巴嗜热裂孢菌(Thermobifida alba)或褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(之前称为褐色热单孢菌)脂肪酶。
亲本可以是真菌脂肪酶。例如，亲本可以是酵母脂肪酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)脂肪酶；或丝状真菌脂肪酶，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属脂肪酶。
在另一方面，该亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母或卵形酵母脂肪酶。
在另一方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)脂肪酶。
在另一方面，该亲本是疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，例如，特别是SEQ ID NO:2的脂肪酶。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上探针，鉴定亲本脂肪酶并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得本发明的脂肪酶变体的方法，这些方法包括：(a)在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、K98I、R118F、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的位置处引入取代；(b)选择具有脂肪酶活性并且与亲本脂肪酶相比具有上列所需特性之一的变体；并且(c)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本脂肪酶的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如若干个)突变的技术。
通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本脂肪酶的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，US2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的脂肪酶变体的分离的多核苷酸。在某些方面，本发明涉及一种包含本发明的多核苷酸的核酸构建体。在某些方面，本发明涉及一种包含本发明的多核苷酸的表达载体。在某些方面，本发明涉及一种包含本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，本发明涉及一种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992，同上)描述。
该控制序列也可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，该信号肽编码区编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。替代性地，编码序列的5’-端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。替代性地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化裂解或自身催化裂解来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
也可能需要添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。替代性地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，该编码序列位于该载体中，使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。替代性地，该载体可以是这样一种载体，当被引入该宿主细胞中时，它被整合到基因组中并与其整合的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。替代性地，该载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或轭合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)细胞、汉逊酵母属(Hansenula)细胞、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、酵母菌属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢菌、谷类镰孢菌、库威镰孢菌、大刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474、以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156，以及WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,纽约学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.,New York))；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的脂肪酶变体的方法，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性(如实例中所述的那些)。
可以使用本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收该变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,纽约VCH出版社(VCH Publishers,New York),1989)。
在替代性方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
组合物
本发明还包括包含本发明的脂肪酶变体的组合物。
在某些方面，本发明涉及包含亲本脂肪酶的变体的组合物，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、K98I、R118F、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在某些方面，该组合物包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、K98I、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
在某些方面，所述变体具有改善的洗涤性能、减少的气味产生和/或改善的储存稳定性/更长的保存期限/增加的热稳定性。
下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于这些组合物中，并且在此的方法可以合宜地并入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料等一起的情况下修饰该组合物的美感。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
除非另外表明，否则以百分比计的量是按组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露内容，此类其他组分的适合的实例以及使用水平发现于US 5576282、US 6306812、和US 6326348中，这些专利特此通过援引并入。
因此，在某些实施例中，本发明不包含以下附属材料的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以如下文详述的那样存在：
表面活性剂-根据本发明的组合物可以包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中该表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0.2wt％到40wt％、从0.5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％、从20wt％至25wt％或从25wt％-60wt％的水平存在。
适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。
适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为C10-13烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(LAS)可以通过将可商购的直链烷基苯(LAB)磺化而获得；适合的LAB包括低2-苯基LAB，诸如或/>其他适合的LAB包括高2-苯基LAB，诸如/>适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成路线(如HF)也可以是适合的。在一方面，使用LAS的镁盐。
适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面为C8-18烷基硫酸盐，或主要为C12烷基硫酸盐。
另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为C8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在另一方面为C8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。
烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。
去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是C1-4烷基，典型地为甲基和/或乙基。
阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括磺酸甲酯(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
适合的非离子去污表面活性剂选自由以下组成的组：C8-C18烷基乙氧基化物，例如C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，其中这些烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元、丙烯氧基单元或其混合物；C12-C18醇和C6-C12烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如/>C14-C22中链分支的醇；C14-C22中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。
适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为C8-18烷基烷氧基化醇，例如C8-18烷基乙氧基化醇，该烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是C8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子型表面活性剂包括
非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及可以商品名SPAN和TWEEN获得的产品、及其组合。
适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物及其混合物。
适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R1)(R2)(R3)N+X-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C6-18烷基或烯基部分，R1和R2独立地选自甲基或乙基部分，R3是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-C8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单C10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。
阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。
适合的两性表面活性剂/兼性离子型表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子型表面活性剂-阴离子型表面活性剂以及辅助的阴离子辅助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，如NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子型表面活性剂和呈其酸形式的辅助阴离子型表面活性剂或助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子型表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子型表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。
半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物。
包含一种或多种阴离子型表面活性剂、和另外一种或多种非离子型表面活性剂、以及任选的如阳离子型表面活性剂的另外表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可能是优选的。优选的阴离子与非离子型表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。
在一方面，表面活性剂系统可包括由化学式A以及化学式B代表的类异戊二烯表面活性剂的一种混合物：
其中Y是CH2或无，并且Z可如此选择以使得所得的表面活性剂是选自以下表面活性剂：烷基羧酸酯表面活性剂、烷基多烷氧基表面活性剂、烷基阴离子型多烷氧基硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯磺酸酯表面活性剂、烷基二甲基氧化胺表面活性剂、基于烷基多羟基的表面活性剂、烷基磷酸酯表面活性剂、烷基甘油磺酸酯表面活性剂、烷基多葡糖酸酯表面活性剂、烷基多磷酸酯表面活性剂、烷基膦酸酯表面活性剂、烷基多糖苷表面活性剂、烷基单糖苷表面活性剂、烷基二糖苷表面活性剂、烷基磺基琥珀酸酯表面活性剂、烷基二硫酸酯表面活性剂、烷基二磺酸酯表面活性剂、烷基磺化琥珀酰胺酸酯表面活性剂、烷基葡萄糖酰胺表面活性剂、烷基牛磺酸酯表面活性剂、烷基肌氨酸酯表面活性剂、烷基甘氨酸酯表面活性剂、烷基羟乙基磺酸酯表面活性剂、烷基二链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯表面活性剂、烷基甘油酯硫酸酯表面活性剂、烷基甘油醚表面活性剂、烷基甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基甲基酯磺酸酯表面活性剂、烷基多甘油醚表面活性剂、烷基多甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基山梨聚糖酯表面活性剂、烷基氨基烷烃磺酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基甜菜碱表面活性剂、基于烷基烯丙基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基单羟基烷基-二-烷基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基二-羟基烷基单烷基季铵盐的表面活性剂、烷基化季铵盐表面活性剂、烷基三甲基铵季铵盐表面活性剂、基于烷基多羟基烷基氧基丙基季铵盐的表面活性剂、烷基甘油酯季铵盐表面活性剂、烷基乙二醇胺季铵盐表面活性剂、烷基单甲基二羟基乙基季铵表面活性剂、烷基二甲基单羟基乙基季铵表面活性剂、烷基三甲基铵表面活性剂、基于烷基咪唑啉的表面活性剂、烯烃-2-基-琥珀酸酯表面活性剂、烷基a-磺化羧酸表面活性剂、烷基a-磺化羧酸烷基酯表面活性剂、α烯烃磺酸酯表面活性剂、烷基苯酚乙氧基化物表面活性剂、烷基苯磺酸酯表面活性剂、烷基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基羟基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基铵基羧酸甜菜碱表面活性剂、烷基蔗糖酯表面活性剂、烷基烷醇酰胺表面活性剂、烷基二(聚氧化乙烯)单烷基铵表面活性剂、烷基单(聚氧化乙烯)二烷基铵表面活性剂、烷基苄基二甲基铵表面活性剂、烷基氨基丙酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基二甲胺表面活性剂、或其混合物；并且如果Z是带电部分，则Z通过适合的金属或有机反离子被电荷平衡。适合的反离子包括金属反离子、胺、或烷醇胺，例如C1-C6烷醇铵。更确切地说，适合的反离子包括Na+、Ca+、Li+、K+、Mg+，例如单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、三乙醇胺(TEA)、2-氨基-l-丙醇、1-氨基丙醇、甲基二乙醇胺、二甲基乙醇胺、单异丙醇胺、三异丙醇胺、l-氨基-3-丙醇、或其混合物。在一个实施例中，这些组合物包含5％至97％的一种或多种非类异戊二烯表面活性剂；以及一种或多种辅助清洁添加剂；其中式A的表面活性剂与式B的表面活性剂的重量比为从50:50至95:5。
皂-本文的组合物可以含有皂。不受理论的限制，可能希望包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，这些组合物含有从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。
本文有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂及其混合物。典型的皂呈具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。
在一个实施例中，该皂选自自由脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。
用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸包括：棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci2-Ci4脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci8脂肪酸及其混合物。
当存在时，织物软化阳离子辅助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。
本文的皂和非皂阴离子型表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子型表面活性剂和皂。
水溶助剂–本发明的组合物可以包含一种或多种水溶助剂。水溶助剂是如下化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于该临界浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。
洗涤剂可以含有从0至10wt％，如从0至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包含从0至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。该组合物可以基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2′,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
螯合试剂和晶体生长抑制剂-本文的组合物可以含有螯合试剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合试剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦酰基丁烷1,2,4-三羧酸(AM)及其衍生物。典型地，该组合物可以包含从0.005wt％至15wt％，或从3.0wt％至10wt％的螯合试剂或晶体生长抑制剂。
漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包含从0至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：
(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：预形成的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。
预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：R14选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R14基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且Y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R14是直链或支链的、取代或未取代的C6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有从30℃至60℃范围内的熔点。
预成形的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：R15选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R15基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R15是直链或支链的、取代或未取代的C6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自由以下组成的组的那些：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入此类组合物中作为可以被涂覆的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
(3)术语漂白活化剂本文意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当该漂白活化剂是疏水的时，具有从6个至14个碳原子，或从8个至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS))、和/或披露于WO 98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。替代性地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO98/17767中。尽管可采用任何适合的漂白活化剂，但在本发明的一个方面，本主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
(4)二酰基过氧化物–优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R1-C(O)-OO-(O)C-R2，其中R1表示C6-C18烷基，优选地是包含具有至少5个碳原子的直链并且任选地包含一个或多个取代基(例如–N+(CH3)3、-COOH或-CN)和/或在烷基的相邻碳原子之间插入的一个或多个中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C6-C12烷基基团，并且R2表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R1和R2一起包含总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R1和R2是直链的未取代的C6-C12烷基链。最优选地，R1和R2是相同的。二酰基过氧化物(其中R1和R2均是C6-C12烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R1或R2)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不含有分支的或下垂的环，或优选在α位或β位都不含有分支的或下垂的环，或最优选在α位或β位或γ位都不含有分支的或下垂的环。在一个另外优选的实施例中，DAP可以是不对称的，这样使得R1酰基基团优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基基团的水解缓慢。
四酰基过氧化物漂白性种类优选地选自以下通式的四酰基过氧化物：R3-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R3，其中R3表示C1-C9烷基或C3-C7基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。
优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选实施例中，这些漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。
优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。
(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；修饰的胺；修饰的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。
适合的亚胺阳离子及聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron[四面体](1992),49(2),423-38中所述的进行制备(参见例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对甲苯磺酸盐，如US 5360569中所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对甲苯磺酸盐，如US 5360568中所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。
适合的亚胺鎓兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282中所述的进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614中所述的进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264中所述的进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。
适合的修饰的胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1987),28(48),6061-6064中描述的程序制备。适合的修饰的氧化胺氧气转移催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧代-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。
适合的N-磺酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物，其可根据Journal of Organic Chemistry[有机化学杂志](1990)，55(4),1254-61中描述的程序制备。
适合的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可根据Journal of theChemical Society[化学学会杂志],Chemical Communications[化学通讯](1994),(22),2569-70中描述的程序制备。
适合的N-酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于可以[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺，其可根据Polish Journal of Chemistry[波兰化学杂志](2003),77(5),577-590中描述的程序制备。
适合的噻二唑二氧化物氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物，其可根据US 5753599(第9栏，实例2)中描述的程序制备。
适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1994),35(34),6329-30中描述的程序制备。
适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。
优选地，漂白催化剂包含亚胺离子和/或羰基官能团，并且通常能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包含过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包含环状亚胺离子官能团，优选地其中环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包含芳基亚胺离子官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，该洗涤剂组合物包含具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logPo/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logPo/w的方法。
典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的XSO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定XSO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在此实例中，XSO是过氧亚胺正离子漂白种类的XSO。
优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：n和m独立地为0至4，优选n和m均为0；每个R1独立地选自取代的或未取代的基团，该基团选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R1取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R2独立地选自取代的或未取代的基团，该基团独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R2可以与任何其他的R2结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R2可以合并以形成羰基；并且任何两个R2可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R3是C1至C20取代的或未取代的烷基；R4是氢或Qt-A部分，其中：Q是分支或未分支的烯烃，t＝0或1，并且A是选自由以下组成的组的阴离子基团：OSO3 -、SO3 -、CO2 -、OCO2 -、OPO3 2-、OPO3H-和OPO2 -；R5是氢或-CR11R12-Y-Gb-Yc-[(CR9R10)y-O]k-R8部分，其中：每个Y独立地选自由以下组成的组：O、S、N-H或N-R8；并且每个R8独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自由以下组成的组：CO、SO2、SO、PO和PO2；R9和R10独立地选自由以下组成的组：H和C1-C4烷基；R11和R12独立地选自由以下组成的组：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R6是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且如果X存在的话，它是适合的电荷平衡反离子，当R4为氢时X优选存在，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、四氟化硼合磷酸盐。
在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：
其中R13是含有从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基或含有从一个至24个碳原子的直链烷基；优选地，R13是含有从八个至18个碳原子的支链烷基或含有从八个至十八个碳原子的直链烷基；优选地，R13选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；优选地，R13选自由以下组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。
优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1、或2:1至10:1。
(6)含有金属的漂白催化剂–可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的含有金属的漂白催化剂是以下催化剂系统，该催化剂系统包含具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO 00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿N-供体配体的配体。
如果希望的话，可以借助锰化合物催化本文的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。
在此有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，像例如US 5597936和US 5595967中传授的程序。
本文的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整本文的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。
本发明的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，像例如US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。
(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的组合物中使用的优选漂白组分包含过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包含漂白催化剂，优选如上文所述的有机漂白催化剂。
特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。
示例性漂白系统还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。
织物调色剂-组合物可以包含织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土共轭物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自由属于以下比色指数(C.I.)分类的染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。
在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会(Society of Dyers and Colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。
适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：含有共轭色原体的聚合物(染料-聚合物共轭物)以及色原体共聚到聚合物主链中的聚合物，及其混合物。
在另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：在(美利肯(Milliken))名称之下的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自由以下组成的组的聚合物形成的染料-聚合物轭合物：包含选自由羟基部分、伯胺部分、仲胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。在另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：/>Violet CT、与活性蓝共轭的羟甲基纤维素(CMC)、活性紫或活性红染料如与C.I.活性蓝19共轭的CMC(由爱尔兰威克洛的美佳洁公司(Megazyme,Wicklow,Ireland)以产品名AZO-CM-CELLULOSE、产品代码S-ACMC销售)、烷氧基化三苯基-甲烷聚合着色剂、烷氧基化噻吩聚合着色剂及其混合物。
优选的调色染料包括发现于WO 08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：
其中R1和R2可以独立地选自：
a)[(CH2CR′HO)x(CH2CR"HO)yH]
其中R’选自由以下组成的组：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
b)R1＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R2＝[(CH2CR′HO)x(CH2CR"HO)yH]
其中R’选自由以下组成的组：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
c)R1＝[CH2CH2(OR3)CH2OR4]并且R2＝[CH2CH2(O R3)CH2O R4]
其中R3选自由以下组成的组：H、(CH2CH2O)zH及其混合物；并且其中z＝0至10；
其中R4选自由以下组成的组：(C1-C16)烷基、芳基基团、及其混合物；以及
d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。
本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：
其中R’选自由以下组成的组：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；
其中R”选自由以下组成的组：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。
本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：
典型地包含具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是在结构I中的具有在上文中“部分a”中的以下的下垂基团的那些。
表1
R1 R2
R’ R” X y R’ R” x y
A H H 3 1 H H 0 1
B H H 2 1 H H 1 1
c＝b H H 1 1 H H 2 1
d＝a H H 0 1 H H 3 1
使用的另外的增白剂包括描述于US2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。
适合的染料粘土共轭物包括选自下组的染料粘土共轭物，该组包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自由以下组成的组的染料粘土共轭物：选自由C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕1至23、CI碱性黑1至11组成的组的一种阳离子/碱性染料；以及选自由蒙脱石粘土、锂蒙脱石粘土、皂石粘土及其混合物组成的组的粘土。在又一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自由以下组成的组的染料粘土轭合物：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，锂蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，皂石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，皂石碱性蓝B9C.I.52015共轭物，皂石碱性紫V3C.I.42555共轭物，皂石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，皂石碱性红R1 C.I.45160共轭物，皂石C.I.碱性黑2共轭物及其混合物。
适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：黄士酮、阴丹酮、含有从1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解性的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以含有高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子含有高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。
在另一方面，适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫罗兰(C.I.颜料紫罗兰15)及其混合物。
上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001wt％至0.5wt％、或0.0001wt％至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。
囊化物-组合物可以包含囊化物。在一方面，囊化物包含核心、具有内表面和外表面的包壳，所述包壳封装所述核心。
在所述囊化物的一方面，所述核心可以包含选自由以下组成的组的材料：香料增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂；在一方面，石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包含选自由以下组成的组的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一方面，所述氨基塑料可以包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一方面，所述聚脲可以包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一方面，所述多糖可以包含藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。
在所述囊化物的一方面，所述核心可以包含香料。
在所述囊化物的一方面，所述包壳可以包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。
在一方面，披露了适合的囊化物可以包含核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从0.2MPa至10MPa、从0.4MPa至5MPa、从0.6MPa至3.5MPa或从0.7MPa至3MPa的抗断强度；并且具有从0％至30％、从0％至20％或从0％至5％的有益试剂泄露。
在一方面，所述囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从1微米至80微米、从5微米至60微米、从10微米至50微米或从15微米至40微米的粒度。
在一方面，所述囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的颗粒壁厚。
在一方面，所述囊化物的核心材料可以包括选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括选自由以下组成的组的材料：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油(caster oil)、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油(castor oil)、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。
在一方面，所述囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，该树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚及其混合物。
在一方面，在将囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于囊浆液中的囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的囊可以通过US2008/0305982、和/或US2009/0247449的以下传授内容来制成。
在优选的方面，该组合物还可以包含沉积助剂，优选由下组组成，该组包含阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及含有甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或多种选自包含丙烯酸和丙烯酰胺的组的单体。
香料-在一方面，组合物包含香料，该香料包含选自由以下组成的组的一种或多种香料原材料：1,1’-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二甲酸二乙酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酸2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)氧]-1-丙醇；氧杂环十六烷-2-酮；α-甲基-苯甲醇乙酸酯；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基丁酸乙酯；苯甲醛；2-甲基丁酸1-甲基乙酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸甲酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊乙酸甲酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸苯甲酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α,α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸苯甲酯；环己基丙酸-2-丙烯酯；己酸-2-丙烯酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛烷-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸甲酯；8-环十六烯-1-酮；甲基紫罗兰酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸(3Z)-3-己烯酯；2-十三碳烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；(2-甲基丁氧基)乙酸-2-丙烯基酯；苯甲酸2-羟基-3-甲基丁酯；(Z)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-己基-3-氧代环戊烷甲酸甲酯；4-乙基-α,α-二甲基-苯丙醛；3-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-桥亚甲基薁-5-基)-[3R-(3α,3aβ,7β,8aα)]-乙酮；2-甲基-2H-吡喃-2-酮6-丁基四氢-十一醛；4-(1,1-二甲基乙基)-α-甲基-苯丙醛；5-庚基二氢-2(3H)-呋喃酮；2-[(7-羟基-3,7-二甲基亚辛基)氨基]苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸苯甲酯；2-甲氧基萘；2-己基-2-环戊烯-1-酮；5-己基二氢-2(3H)-呋喃酮；3-甲基-3-苯基-环氧乙烷羧酸乙酯；1,3,3-三甲基-2-氧杂二环[2.2.2]辛烷；γ-甲基-苯戊醇；3,7-二甲基-3-辛醇；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚-6-醇丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-桥亚甲基-5H-茚-5-亚基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；2-羟基-苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸己酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸戊酯；2,3-庚二酮；2-己烯-1-醇；2,6-二甲基-6-辛烯-2-醇；大马酮(α、β、γ或δ或其混合物)，3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚-6-醇乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；3,5-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；2,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)、和2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-环戊酮和1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。
在一方面，组合物可以包含囊化的香料颗粒，该颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或修饰的聚乙烯醇。在一方面，囊化物包含(a)至少部分水溶的固体基质，该基质包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由该固体基质包封的香料油。
在另一方面，该香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。
聚合物-组合物可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
组合物可以包含一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-bis((C2H5O)(C2H4O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。
组合物可以包含两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，这些聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，这样使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包含一个核心结构和与该核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包含烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。
烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可在本文用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT 90/01815中。在化学上，这些材料包括每7-8个丙烯酸酯单元具有一条乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。侧链具有式-(CH2CH2O)m(CH2)nCH3，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包含本文的组合物的从0.05wt％至10wt％。
本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他辅助表面活性剂和其他佐剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地该两亲接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一个下垂部分，该下垂部分选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫公司(BASF)供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。
羧酸酯聚合物-本发明的组合物还包括一种或多种羧酸酯聚合物，如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，羧酸酯聚合物是具有从4,000Da至9,000Da或从6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。
去污聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种去污聚合物，这些聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：
(I)-[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d
(II)-[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e
(III)-[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f
其中：
a、b和c是从1至200；
d、e和f是从1至50；
Ar是1,4-取代的亚苯基；
sAr是1,3-取代的亚苯基，该亚苯基在5位上被SO3Me取代；
Me是Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基基团是C1-C18烷基或C2-C10羟基烷基，或其混合物；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H或C1-C18正烷基或异烷基；以及
R7是直链或支链的C1-C18烷基，或直链或支链的C2-C30烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C8-C30芳基，或C6-C30芳基烷基。
适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如Marloquest SL，由萨索尔(Sasol)供应。
纤维素聚合物-本发明的组合物还包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自包含以下的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物。在一方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。
酶-组合物可以包含提供清洁性能和/或织物护理益处的一种或多种酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂肪酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶、淀粉酶或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。
通常，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
在一方面，优选的酶将包括纤维素酶。适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自以下属的纤维素酶：芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属，例如US 4435307、US 5648263、US 5691178、US 5776757以及WO 89/09259中披露的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉以及尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0531315、US 5457046、US 5686593、US 5763254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
在一方面，优选的酶将包括蛋白酶。适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族以及Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是源自芽孢杆菌属的那些，如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024和WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
另外优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO95/23221中)及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中)。
金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993(杰能科国际公司)中所述的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以商品名DuralaseTm、DurazymTm、/>Ultra、/>Ultra、/> Ultra、/> Ultra、/>以及/>销售的那些，所有这些能以/>或/>(诺维信公司)销售；以下列商品名销售的那些：Purafect/>PreferenzTm、Purafect/>Purafect/>Purafect/> EffectenzTm、/>以及/>(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
在一方面，优选的酶将包括淀粉酶。适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、Termamyl UltraTM、FungamylTM、BanTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、SupramylTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自诺维信公司)、/>(在9000Biozym Biotech Trading GmbH,Wehlistrasse27b,A-1200维也纳，奥地利)、和RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、PreferenzS100、Preferenx S110、/>OPTISIZE HT/>以及PURASTAR />(丹尼斯克/杜邦公司)以及/>(花王株式会社)。
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如EP 258068和EP 305216中所述的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔德菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412，WO 13/033318)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所述的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司)以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司)。
仍其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
在一方面，其他优选的酶包括微生物起源的展现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，包括对于芽孢杆菌属的成员而言内源的细菌多肽(该多肽具有与US 7141403中的氨基酸序列SEQ ID NO:2至少90％、94％、97％或99％同一性的序列)及其混合物。适合的内切葡聚糖酶以商品名和/>(诺维信公司)销售。
其他优选的酶包括以商品名销售的果胶裂解酶，以及以商品名/>(诺维信公司)和/>(丹尼斯克/杜邦公司)销售的甘露聚糖酶。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
无粉尘颗粒可以例如US 4106991和US 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来涂覆。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。
染料转移抑制剂-本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制剂可以按从0.0001wt％至10wt％、从0.01wt％至5wt％或从0.1wt％至3wt％的水平存在。
增亮剂-本发明的组合物还可以包含可以给正在清洁的物品着色的另外的组分，例如荧光增亮剂。
该组合物可以包含具有以下结构的呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260：
在一方面，增亮剂是冷水可溶性增亮剂，如呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260。在一方面，增亮剂主要呈α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的C.I.荧光增亮剂260是呈α-晶体形式。
增亮剂典型地呈微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。
该组合物可以包含呈β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260，并且(i)呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260与(ii)呈β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。BE 680847涉及用于制得呈α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的方法。
可以用于本发明中的商业光学增亮剂可以划分为多个亚组，这些亚组包括但不必限制于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑类、5元和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“The Production andApplication of Fluorescent Brightening Agents”[荧光增亮剂的产生和应用],M.Zahradnik,由纽约约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,New York)出版(1982)。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的具体非限制性实例是在US 4790856和US 3646015中鉴别的那些。
另外适合的增亮剂具有以下结构：
适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。
在一方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成颗粒。硅酸盐-本发明的组合物还可以含有硅酸盐，如硅酸钠或硅酸钾。该组合物可以包含从0wt％至小于10wt％硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。
分散剂-本发明的组合物还可以含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。
酶稳定剂-用于组合物中的酶可以通过各种技术来稳定。本文使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规稳定试剂的实例是例如多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、肽醛、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述来配制该组合物。在包含蛋白酶的水性组合物的情况下，可以添加可逆蛋白酶抑制剂来进一步改进稳定性，该可逆蛋白酶抑制剂例如是硼化合物，包括硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸及其衍生物；或化合物，例如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇。肽醛可以具有式B2-B1-B0-R，其中：R是氢、CH3、CX3、CHX2或CH2X，其中X是卤素原子；B0是在对位处和/或在间位处具有OH取代基的苯丙氨酸残基；B1是单个氨基酸残基；并且B2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包含N-末端保护基团。优选的肽醛包括但不限于：Z-RAY-H、Ac-GAY-H、Z-GAY-H、Z-GAL-H、Z-GAF-H、Z-GAV-H、Z-RVY-H、Z-LVY-H、Ac-LGAY-H、Ac-FGAY-H、Ac-YGAY-H、Ac-FGVY-H或Ac-WLVY-H，其中Z是苄氧基羰基，而Ac是乙酰基。
溶剂-适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。
结构化剂/增稠剂-结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。该组合物可以包含从0.01wt％至5wt％、或从0.1wt％至2.0wt％的结构化剂。该结构化剂典型地选自由以下组成的组：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水修饰的碱性可膨胀的乳液(例如Polygel W30(3V西格玛(Sigma)))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶及其混合物。适合的结构化剂包括氢化的蓖麻油及其非乙氧基化的衍生物。适合的结构化剂披露于US6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化系统，该系统具有一定范围的纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于WO 10/034736中。
调节剂-本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。本文有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自由以下组成的组：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于International Cosmetic Ingredient Dictionary[国际化妆品成分词典]，第五版，1993，以及CTFA Cosmetic Ingredient Handbook[CTFA化妆品成分手册]，第二版，1992中。
鉴于提供改进的调节益处(如在施加至湿发的过程中的湿滑感、柔软度以及对干发的保湿感)，高熔点脂肪化合物以从0.1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1.5wt％至16wt％、从1.5wt％至8wt％的水平包含在该组合物中。
本发明的组合物可以含有阳离子聚合物。在组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05wt％至3wt％、从0.075wt％至2.0wt％、或从0.1wt％至1.0wt％。在预期使用组合物的pH下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，pH的范围将大体上是从pH 3至pH 9、或在pH 4与pH 8之间。本文，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与10,000,000之间、在50,000与5,000,000之间或在100,000与3,000,000之间。
用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物含有阳离子含氮部分，如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。
此类聚合物的非限制性实例描述于CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary[CTFA化妆品成分词典]，第3版，由Estrin、Crosley和Haynes编著(华盛顿特区化妆品、化妆用具及香水联合公司(The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.,Washington,D.C.)(1982))。
用于在该组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔豆胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔豆胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，本文的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，该凝聚相由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子型表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于US3962418、US3958581和US2007/0207109中。
本发明的组合物可以包含作为调节剂的非离子聚合物。具有大于1000的分子量的聚亚烷基乙二醇(polyalkylene glycol)在本文是有用的。具有以下通式的那些是有用的：
其中R95选自由以下组成的组：H、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包含在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包含形成乳化液体颗粒的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在该组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式于本文的水性表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。
在组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂颗粒的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。
硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01wt％至10wt％。适合的硅酮调节剂和任选的用于硅酮的悬浮剂的非限制性实例描述于以下参考文献中：美国再颁发专利号34,584、US5104646、US5106609、US4152416、US2826551、US3964500、US4364837、US6607717、US6482969、US5807956、US5981681、US6207782、US7465439、US7041767、US7217777、US2007/0286837A1、US2005/0048549A1、US2007/0041929A1、GB849433、DE10036533，它们均通过援引并入本文；Chemistry and Technology of Silicones[硅酮化学与技术]，纽约学术出版社(1968)；General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets[通用电器硅橡胶产品数据表]SE 30、SE 33、SE 54和SE 76；Silicon Compounds[硅化合物]，彼特拉克系统公司(Petrarch Systems,Inc.)(1984)；以及Encyclopedia of Polymer Science andEngineering[聚合物科学与工程百科全书]，第15卷，第2版，第204-308页，约翰威利父子公司(1989)。
本发明的组合物还可以包含从0.05wt％至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如硅酮(本文所述的)组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于本文的组合物中的是在US 5674478和US 5750122或在US 4529586；US 4507280；US 4663158；US 4197865；US 4217914；US 4381919；以及US 4422853中所述的调节剂。
卫生与恶臭味-本发明的组合物还可以包含蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(如)、聚乙烯亚胺(例如来自巴斯夫公司的/>)及其锌络合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放Ag+或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。
益生素-组合物可以包含益生素，如WO 09/043709中所述的那些。
增泡剂-如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如C10-C16烷醇酰胺或C10-C14烷基硫酸酯)可以典型地以1wt％至10wt％的水平掺入组合物中。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡辅助表面活性剂(如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如MgCl2、MgSO4、CaCl2、CaSO4等)可以典型地以0.1wt％至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。
泡沫抑制剂-用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在US 4489455和US 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如Kirk OthmerEncyclopedia of Chemical Technology[柯克·奥思默化工百科全书]，第三版，第7卷，第430-447页(约翰威利父子公司，1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族C18-C40酮(例如，硬脂酮)，N-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于US2954347、US4265779、US4265779、US3455839、US3933672、US4652392、US4978471、US4983316、US5288431、US4639489、US4749740、US4798679、US4075118、EP89307851.9、EP150872和DOS2,124,526中。
对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选以“泡沫抑制量”存在。“泡沫抑制量”意指组合物的配方设计师可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。
本文的组合物将通常包含从0至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高达5wt％的量存在。优选地，使用从0.5wt％至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高达2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1wt％至2wt％的范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01wt％至5.0wt％的范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2wt％至3wt％使用醇泡沫抑制剂。
本文的组合物可以在宽范围的pH内具有清洁活性。在某些实施例中，这些组合物具有从pH 4至pH 11.5的清洁活性。在其他实施例中，这些组合物从pH6至pH11、从pH7至pH11、从pH8至pH11、从pH9至pH11或从pH10至pH11.5具有活性。
本文的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，该温度将低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些实施例中，对于这些组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃、或从40℃至50℃。
组合物的形式
本文描述的组合物被有利地用在例如洗衣应用、硬质表面清洁、餐具洗涤应用、连同化妆品应用(如义齿、牙齿、头发和皮肤)中。本发明的组合物具体是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一方面，本发明涉及一种组合物，其中该组合物的形式选自由以下组成的组：规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个隔室的袋；单个或多个隔室单位剂型；或其任何组合。
该组合物的形式可以将多个室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合用于容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，其包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的莫诺索尔有限责任公司(MonoSol LLC,Indiana,USA)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同(US2009/0011970 A1)。
水溶性膜-本发明的组合物还可以被包封于水溶性膜之内。优选地，优选的膜材料是聚合物材料。膜材料可以是例如通过聚合物材料的铸造、吹塑、挤出或吹胀挤塑来获得，如本领域中已知的。适合用于用作袋材料的优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、丙烯酰胺、丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙烯乙酸酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(例如黄原胶和卡拉胶(carragum))。更优选的聚合物选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸脂共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，并且最优选地选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)、及其组合。优选地，聚合物在袋材料(例如，PVA聚合物)中的水平是至少60wt％。聚合物可以具有任何重均分子量，优选是从约1.000至1.000.000、从约10.000至300.000、从约20.000至150.000。聚合物的混合物还可以用作袋材料。
天然地，不同的膜材料和/或不同厚度的膜可以用于制作本发明的室。在选择不同的膜中的益处是所得的室可以展现不同溶解度或释放特征。
优选的膜材料是在莫诺索尔贸易参考M8630、M8900、H8779下已知的PVA膜，以及描述于US 6166117和US 6787512中的那些，以及具有相应溶解度和变形特征的PVA膜。
在此的膜材料还可以包括一种或多种添加剂成分。例如，可以有益的是添加增塑剂，例如甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。其他添加剂包括有待被递送至洗涤用水的功能性洗涤剂添加剂，例如有机聚合物分散剂等。
制造组合物的方法
本发明的组合物可以配制成任何适合的形式，并通过配方设计师选择的任何方法制备，它们的非限制性实例描述于申请人的实例中和US4990280、US20030087791A1、US20030087790A1、US20050003983A1、US20040048764A1、US4762636、US6291412、US20050227891A1、EP1070115A2、US5879584、US5691297、US5574005、US5569645、US5565422、US5516448、US5489392、US5486303中，所有这些专利都通过援引并入本文。本发明的组合物或根据本发明制备的组合物包括清洁和/或处理组合物，包括但不限于用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬表面和任何其他表面的组合物，包括：空气护理(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理、餐具洗涤、织物调节(包括软化和/或清新)、洗衣去垢、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器洗碗剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。优选的是用于清洁和/或处理纺织品和/或硬表面(最优选为纺织品)的组合物和方法。组合物优选地是在洗涤过程的预处理步骤中或主要洗涤步骤中(最优选用于纺织品洗涤步骤)使用的组合物。
如本文使用的，术语“织物和/或硬表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指出，该子集包括颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和冲洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调节组合物(包括软化和/或清新)，可以呈液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类组合物可以呈标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类组合物可以在某些方面呈非水性的程度。
使用方法
本发明包括在织物和/或家居护理领域中用于清洁任何表面(包括处理纺织品或硬表面或其他表面)的方法。考虑了如所述的清洁可以处于小规模(例如家庭家务(familyhouse hold))连同大规模(如处于例如工业和专业设置)两者。在本发明的一方面，该方法包括在洗涤过程的预处理步骤或主要洗涤步骤(最优选用于在纺织品洗涤步骤中使用或替代性地用于在餐具洗涤(包括手动以及自动/机械餐具洗涤两者)中使用)中接触有待处理的表面的步骤。在本发明的一个实施例中，将脂肪酶变体和其他组分顺序地添加至用于清洁和/或处理表面的方法中。替代性地，同时地添加脂肪酶变体和其他组分。
如本文使用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。洗涤可以用泡沫组合物进行(如WO 08/101958中所述的)，和/或通过施加交变压力(压力/真空)作为擦洗和机械搅拌的附加方法或替代方案来进行。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段中的任一种来完成。本发明的清洁组合物理想地适用于在洗衣以及餐具洗涤应用中使用。因此，本发明包括用于清洁物体(包括但不限于织物、餐具、刀具以及厨具)的方法。该方法包括使有待清洁的物体与所述清洁组合物接触的步骤，该清洁组合物包含申请人的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物中的至少一个实施例。织物可以包括能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的大多数任何织物。该溶液可以具有从8至10.5的pH。可以在溶液中以从500ppm至15.000ppm的浓度使用组合物。水温范围典型地是从5℃至90℃。水与织物之比典型地是从1:1至30:1。
在一方面，本发明涉及使用与SEQ ID NO:2具有至少60％一致性的多肽来产生组合物的方法。在一方面，本发明涉及该组合物用于清洁物体的用途。
在一方面，本发明涉及产生该组合物的方法，该方法包括添加与SEQ ID NO:2具有至少60％一致性的多肽、以及表面活性剂。在一方面，本发明涉及用于清洁表面的方法，该方法包括使待清洁的表面上存在的脂质污渍与该清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及用于水解存在于表面上的污物和/或污渍中的脂质的方法，该方法包括使污物和/或污渍与清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及该组合物在羧酸酯水解中的用途。在一方面，本发明涉及该组合物在酯的水解、合成或相互酯化中的用途。在一方面，本发明涉及该组合物用于制造稳定配制品的用途。
植物
本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包括本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该变体。该变体可以从植物或植物部分回收。替代性地，包含该变体的植物或植物部分可以按原样用于改进食品或进料的质量，例如，改进营养价值、可口性以及流变特性，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(例如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(例如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物体拟南芥(Arabidopsisthaliana))。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可以包含用于鉴定整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达该变体来确定对调节序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列由例如Tague等人，1988，Plant Physiology[植物生理学]86：506描述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉蜀黍泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(Franck等人,1980,Cell[细胞]21:285-294；Christensen等人,1992,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689；Zhang等人,1991,Plant Cell[植物细胞]3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]24:275-303)或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito等人,1994,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24:863-878)的启动子，来自稻的种子特异性启动子(例如谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子)(Wu等人,1998,Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆(Viciafaba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等人,1998,J.Plant Physiol.[植物生理学杂志]152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人,1998,Plant CellPhysiol.[植物与细胞生理学]39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人,1993,Plant Physiol.[植物生理学]102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等人,1995,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(Xu等人,1993,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22:573-588)。同样，该启动子可以通过如温度、干旱或盐度变化等非生物处理来诱导，或通过外源地应用使该启动子活化的物质(例如，乙醇；雌激素；植物激素，例如乙烯、脱落酸及赤霉酸；及重金属)来诱导。
启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，Xu等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因及表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser等人，1990，Science[科学]244:1293；Potrykus，1990，Bio/Technology[生物/技术]8:535；Shimamoto等人，1989，Nature[自然]338:274)。
目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，尽管对于这些植物可以使用其他转化方法。一种用于产生转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou,1992,Plant J.[植物杂志]2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术新见]5:158-162；Vasil等人,1992,Bio/Technology[生物技术]10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于天然质体转化，如由Omirulleh等人，1993，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]21:415-428所描述。另外的转化方法包括US 6395966和US 7151204(两者都通过援引以其全文并入本文)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已掺入表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了此类植物的后代。如在此所用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过将起始系用供体植物系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于US 7151204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标志物以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标志物协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异引起的错误。另外，遗传标志物可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标志物来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；以及(b)回收该变体。
包含本发明的脂肪酶变体的微囊组合物
在这方面，本发明涉及微囊组合物，其中该微囊的膜通过使具有高于1kDa分子量的多支化的多胺交联而产生，其中该微囊包含本发明的脂肪酶变体。
通过交联多支化的多胺形成的膜能够将该酶与该洗涤剂中的(阴离子)表面活性剂中分离，已知其对酶的稳定性是有害的。
当在洗涤剂中使用囊化的酶时，一个至关重要的参数是当该洗涤剂在水中稀释时立即释放该酶的能力，如例如在洗衣或餐具洗涤应用中。本发明的微囊在此方面具有优异的特性，并且能够在一分钟内释放整个囊化的酶。
这些微囊不需要核心聚合物的存在就能够在水中稀释时释放该酶。此外，本发明不需要酶在微囊的核心中呈沉淀的形式，以便控制过早释放，如在WO 97/24177中所述。
将本发明的脂肪酶变体和任选地其他酶包封在具有半透膜的微囊中，并且在这些囊(在添加至液体洗涤剂之前)中具有高于液体洗涤剂中的水活度时，当被添加到洗涤剂(水正溢出)中时这些囊将经历(部分地)崩溃，因此在这些囊中留下更为浓缩的并且更粘的含酶内部。该膜的崩溃还可导致可透性的降低。这可以通过添加稳定剂/聚合物进一步使用，尤其是不会通过该膜可透的那些。该崩溃和所得粘度增加将降低/妨碍敌对组分(例如，表面活性剂或螯合剂)扩散进入这些囊中，并且因此增加液体洗涤剂中酶的储存稳定性。该液体洗涤剂中的对该酶敏感的组分(例如，充当该酶底物的组分)还被保护免于受该酶的降解。在洗涤过程中，该液体洗涤剂被水稀释，因此增加了水活度。水现在将扩散进这些囊(渗透作用)中。这些囊将溶胀并且该膜将变得对该酶可透过由此它们可以离开这些囊，或简单地胀裂并且以此方式释放该酶。该概念在稳定这些酶对抗液体洗涤剂中的敌对组分方面非常有效，反之亦然还保护该液体洗涤剂中酶敏感的组分不受酶的影响。
对酶敏感并且可以被酶降解的洗涤剂组分的实例包括(括号中的相关酶)：黄原胶(黄原胶酶)、具有酯键的聚合物(脂肪酶)、氢化蓖麻油(脂肪酶)、香料(脂肪酶)、甲酯磺酸盐表面活性剂(脂肪酶)、纤维素和纤维素衍生物(例如，CMC)(纤维素酶)、和糊精和环糊精(淀粉酶)。
敏感的洗涤剂成分还可以被囊化，并且由此被稳定化在本发明的微囊中。敏感的洗涤剂成分在储存期间易于降解。这类洗涤剂成分包括漂白化合物、漂白活化剂、香料、聚合物、助洗剂、表面活性剂等。
通常，本发明的微囊可以被用于分离洗涤剂中不相容的组分/化合物。
将这些微囊添加到洗涤剂中可以被用于影响该洗涤剂产品的可视外观，如不透光效应(小型微囊)或明显可见的颗粒(大型微囊)的效应。这些微囊也可以是着色的。
这些微囊可以被用于在处理和加工酶产品期间降低酶尘埃水平。
除非另外指明，贯穿本申请所有的百分比指示为按重量计的百分比(％w/w)。
微囊
典型地，这些微囊通过将水滴形成不可与水混溶的连续体而产生-即典型地通过制备一种油包水乳剂-并且随后通过界面聚合经由添加一种交联剂形成该膜。在最终固化之后，可以收获这些囊并进行进一步清洗并通过本领域已知的方法进行配制。随后将该囊配制品添加到该洗涤剂中。
在水相中发现了有效负载、有待囊化的主膜成分和最终另外的组分。在该连续体中发现了稳定化这些水滴趋向凝聚的组分(乳化剂、乳化稳定剂、表面活性剂等)，并且还通过该连续体添加该交联剂。
可以通过本领域中已知的任何方法来制备该乳剂，例如，通过机械搅动、滴注方法、膜乳化、微流体技术、超声处理等。在一些情况下，这些相的简单混合将自动导致一种乳剂，通常被称为自乳化。使用导致窄粒度分布的方法是有利的。
随后典型地将该或这些交联剂添加到该乳剂中，这是直接或更典型地通过制备交联剂在一种溶剂中的溶液，该溶剂在连续相中是可溶的。该乳剂和交联剂或其溶液可以通过本领域中常规使用的方法来混合，例如，通过简单混合或通过仔细地控制该乳剂以及该交联剂溶液流动通过串联混合器。
在一些情况下，需要固化这些囊来完成膜的形成。固化经常是简单的搅拌这些囊一段时间以允许界面聚合反应结束。在其他情况下，该膜的形成可以通过添加反应淬灭剂来终止。
这些囊可以被后修饰，例如通过使组分反应到该膜上以阻碍或减少这些颗粒在如在WO 99/01534中所述的洗涤剂中的絮凝。
可以通过本领域中已知的方法分离或浓缩这些产生的囊，例如，通过过滤、离心、蒸馏或倾析该囊分散体。
这些所得囊可以被进一步配制，例如，通过添加表面活性剂以赋予产物对于存储、运输和稍后处理以及添加至洗涤剂的所需特性。其他微囊配制剂包括流变改性剂、杀生物剂(例如，Proxel)、用于pH调节的酸/碱(其也将在这些微囊内调节)、以及用于调节水活度的水。
该囊形成方法可以包括以下步骤：
-制备初始的水相和油相，
-形成油包水乳剂，
-通过界面聚合形成膜，
-任选的后修饰，
-任选的分离和/或配制，
-添加至洗涤剂。
该方法可以是分批法或者连续或半连续方法。
根据本发明的微囊是小型的水性球体，其周围具有均匀的膜。该微囊内部的材料被称为核心、内相、或填充物，而该膜有时被称为壳、包衣、或壁。本发明的这些微囊具有在0.5μm和2毫米之间的直径。优选地，这些微囊的平均直径是在1μm至1000μm的范围中，更优选地在5μm至500μm的范围中，甚至更优选地在10μm至500μm的范围中，甚至更优选地在50μm至500μm的范围中，并且最优选地在50μm至200μm的范围中。替代性地，这些微囊的直径是在0.5μm至30μm的范围中；或在1μm至25μm的范围中。该微囊的直径是当聚合作用完成之后在油相中测定的。该囊的直径可以根据周围化学环境的水活度改变。
酶的微囊化(如本发明中所用的)可以通过界面聚合来进行，其中聚合反应中的两种反应物在界面处相遇并快速反应。这一方法的基础是多胺与酸衍生物的反应，通常是酸性卤化物，充当一种交联剂。该多胺优选地是基本上水溶性的(当呈游离碱形式时)。在正确的条件下，柔性薄膜在该界面处快速形成。进行该聚合作用的一种方式是使用该酶和多胺的一种水性溶液，其与一种非水溶剂(以及一种乳化剂)进行乳化，并添加包含该酸衍生物的溶液。该酶溶液中可以存在碱剂以中和在该反应过程中形成的酸。聚合物(聚酰胺)膜在这些乳滴的界面处立即形成。该微囊的聚合物膜典型地具有阳离子性质，并且因此与具有阴离子性质的化合物结合/络合。
这些微囊的直径是通过这些乳滴的大小而确定的，乳滴的大小通过例如搅拌速率来控制。
乳剂
乳剂是一个液相在第二液相内暂时或永久的分散体。该第二液相通常被称为连续相。表面活性剂通常用于帮助乳剂的形成和稳定化。不是所有的表面活性剂都能同样地稳定化乳剂。需要针对最优乳剂效用选择表面活性剂的类型和数量，尤其是对于该乳剂的制备和物理稳定性，以及在稀释或进一步加工过程中的稳定性。物理稳定性是指将乳剂以分散体形式进行维持。如凝聚、聚合、吸附至容器壁、沉降和乳油化的过程是物理不稳定性的多种形式，并且应被避免。适合的表面活性剂的实例描述于WO 97/24177，第19-21页；以及WO 99/01534中。
可以将乳剂进一步分类为简单的乳剂，其中该分散的液相是一种简单的均质液体，或一种更复杂的乳剂，其中该分散的液相是液相或固相的非均质组合，如双重乳剂或复合型乳剂。例如，可以形成一种油包水双重乳剂或复合型乳剂，其中该水相本身进一步含有乳化的油相；这种类型的乳剂可以被指定为一种油包水包油(o/w/o)乳剂。替代性地，可以形成油包水乳剂，其中该水相含有分散的固相，通常被称为一种悬浮液-乳剂。可以描述其他更复杂的乳剂。因为在描述这类系统方面固有的困难，术语乳剂用于描述简单和更复杂的乳剂两者，不必要限制乳剂的形式或存在的相类型和相数。
多胺
膜的刚性/柔性和可透性主要受多胺选择的影响。根据本发明的多胺是一种多支化的多胺。每个分支(优选地以伯氨基团结束)充当膜网络中的系拴点，从而产生本发明的有利特性。根据本发明的多支化的多胺是一种具有多于两个分支点和多于两个反应性氨基的多胺(能够与交联剂反应，即，伯氨基团和仲氨基团)。当制备该乳剂时，该多支化的多胺被用作起始材料–它不是从其他起始材料原位形成的。为了得到本发明引人注目的特性，该多胺的多支化结构必须作为起始材料存在。
分支点数目和伯胺数目之间存在密切的关系，由于伯胺将总是位于分支的末端：直链胺只能包含两个伯胺。对于假设地引入这样一种直链二胺的每个分支点将允许一个或多个伯胺引入到该或这些被引入的分支的末端。在本文中，我们将该伯氨基团理解为该分支的一部分，即该分支的端点。例如，我们认为三(2-氨乙基)胺或1,2,3-丙烷三胺都是具有一个分支点的分子。对于本发明，该多胺具有至少四个伯胺。可以从脂肪族烃链(如在之前所述实例中)或从不饱和的碳键(如在，例如3,3’-二氨基联苯胺中)、或从叔氨基团(如在N,N,N’,N’-四-(2-氨乙基)乙二胺)中引入多个分支点。
除了分支点的数目之外，我们已经发现，反应性氨基团的紧密度非常重要。例如，N,N,N’,N’-四-(12-氨十二基)乙二胺的物质是不适合的。肽或蛋白(如一种酶)都不适合用于膜形成。因此，该多支化的多胺不是肽或蛋白。
在一个实施例中，这些反应性氨基团构成该多支化的多胺至少15％的分子量，如超过20％，或超过25％。优选地，该多支化的多胺的分子量至少为1kDa。更优选地，该多支化的多胺的分子量至少为1.3kDa。
在一个优选的实施例中，多支化的多胺是聚乙烯亚胺(PEI)及其改性形式，其具有多于两个支化点和多于两个反应性氨基；其中反应性氨基占PEI分子量的至少15％，例如大于20％，或大于25％。优选地，该PEI的分子量是至少为1kDa。
不同的多支化的多胺的组合可以用于制备根据本发明所述的微囊。
可以通过添加一种或多种具有小于1kDa分子量的小胺来改进本发明的微囊的有利特性(例如，酶储存稳定性、降低的酶渗出、降低的洗涤剂成分的入通量)。该小胺优选地是基本上水溶性的(当呈游离碱形式时)并且可以是一种例如乙二胺、六亚甲基二胺、己二胺、二亚乙基四胺、乙四胺、苯二胺、哌嗪、四亚甲基五胺或、优选地二亚乙基三胺(DETA)的物质。在制备本发明的微囊时，可以按小胺和多支化的多胺的总含量重量计高达50％、优选地高达40％、高达30％、高达20％、高达10％、高达5％的量添加这些小胺。
交联剂
如在本发明中所使用的交联剂是一种具有至少两个能够与胺类反应形成共价键的基团/位点的分子。
该交联剂优选地是油可溶性的并且可以呈酸酐或酸性卤化物的形式，优选地为酰基氯。例如，它可以是己二酰氯、癸二酰氯、十二烷基二酰氯、邻苯二甲酰氯、对苯二甲酰氯、间苯二甲酰氯、或均苯三甲酰氯，但优选地，该交联剂是对苯二甲酰氯或均苯三甲酰氯。
一种或多种酶
在一个实施例中，本发明的组合物或微囊组合物可进一步包含选自由以下组成的组的酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、DNA酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。
组合物中或包封在本发明的微囊中的该一种或多种酶可包括一种或多种适合于包含在洗衣或餐具洗涤剂(洗涤剂酶)中的酶，例如蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木聚糖酶、DNA酶、过水解酶、氧化还原酶(例如，漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)。优选的洗涤剂酶是蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、裂解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、DNA酶、过水解酶和氧化还原酶(例如，漆酶、过氧化物酶、过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶和/或卤代过氧化物酶)；或其组合。更优选的洗涤剂酶为蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、和甘露聚糖酶；或其组合。
本发明的组合物或微囊组合物可包含多于0.1％(w/w)的活性酶蛋白，特别是本发明的脂肪酶变体；优选地多于0.25％、更优选地多于0.5％、更优选地多于1％、更优选地多于2.5％、优选地多于5％、更优选地多于7.5％、更优选地多于10％、更优选地多于12.5％、更优选地多于15％、甚至更优选地多于20％并且最优选地多于25％(w/w)的活性酶蛋白。
蛋白酶：用于在本发明中使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶、金属蛋白酶和/或胰蛋白酶样蛋白酶。优选地，这些蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶；更优选地，这些蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在必需丝氨酸残基的酶(White,Handler和Smith,1973“Principles of Biochemistry[生物化学原理],”第五版,纽约麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company,NY),第271-272页)。枯草杆菌蛋白酶包括I-S1和I-S2亚组，优选地由其构成，正如Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737；和Siezen等人,Protein Science 6(1997)501-523[蛋白质科学]所定义。由于丝氨酸蛋白酶的活性位点的结构高度保守，根据本发明的枯草杆菌蛋白酶可以在功能上相当于由Siezen等人(同上)提出的指定亚组的枯草杆菌酶(subtilase)。
枯草杆菌蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体(蛋白工程化的变体)，优选为碱性微生物枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO 04/099401中。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。其他实例是描述于WO 92/19729、WO 88/08028、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 98/34946、WO 2000/037599、WO 2011/036263中的变体，尤其是在以下一个或多个位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
金属蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体(蛋白质工程化变体)，优选为碱性微生物金属蛋白酶。实例描述于WO 2007/044993、WO 2012/110562及WO 2008/134343中。
可商购的枯草杆菌蛋白酶的实例包括KannaseTM、EverlaseTM、RelaseTM、EsperaseTM、AlcalaseTM、DurazymTM、SavinaseTM、OvozymeTM、LiquanaseTM、CoronaseTM、PolarzymeTM、PyraseTM、Pancreatic Trypsin NOVO(PTN)、Bio-FeedTMPro以及Clear-LensTMPro；Blaze(所有都可从丹麦巴格斯维尔德的诺维信公司(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)获得)。其他可商购的蛋白酶包括NeutraseTM、RonozymeTMPro、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、OpticleanTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、Purafect OxTM、Purafact PrimeTM、ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM和FN4TM(可从杰能科国际公司、吉斯特布罗卡德斯公司、巴斯夫公司、或DSM公司获得)。其他实例是PrimaseTM和DuralaseTM。可从汉高公司获得的Blap R、Blap S和Blap X也是实例。
裂解酶：裂解酶可以是一种果胶裂解酶，来源于芽孢杆菌属，尤其是地衣芽孢杆菌或粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)，或一种来源于这些来源中任一种的变体，例如，正如在US 6124127、WO 99/027083、WO 99/027084、WO 02/006442、WO 02/092741、WO 03/095638中所述的，可商购的果胶裂解酶是XPect；Pectawash和Pectaway(诺维信公司)。
甘露聚糖酶：甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述于WO 99/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中所描述的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司)以及KAC-500(B)TM(花王株式会社)。
除了本发明的脂肪酶变体之外，该组合物或微囊组合物可以包含其他脂肪酶。
其他脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)的脂肪酶，例如来自如在EP 258 068和EP 305 216中所描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如在WO 96/13580中所描述的特异腐质霉；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人,1993,Biochemica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学学报],1131:253-360)、嗜热脂肪芽杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其他实例是例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/060063、WO 2007/087508以及WO 2009/109500中所描述的那些脂肪酶变体。
优选的可商购脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM和LipexTM；Lipex Evity100L、LecitaseTM、LipolexTM；LipocleanTM、LipoprimeTM(诺维信公司)。其他可商购的脂肪酶包括Lumafast(杰能科国际公司)；Lipomax(吉斯特-布劳卡德斯公司/杰能科国际公司)和来自苏威公司(Solvay)的芽孢杆菌脂肪酶。
淀粉酶：适合的淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些淀粉酶。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶的实例包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO97/43424中以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶为Stainzyme；Stainzyme Plus；DuramylTM、TermamylTM、TermamylUltra；Natalase、FungamylTM和BANTM(诺维信公司)、RapidaseTM和PurastarTM/EffectenzTM、Powerase和Preferenz S100(来自杰能科国际公司/杜邦公司)。
脱氧核糖核酸酶(DNA酶)：适合的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)是催化DNA骨架中的磷酸二酯键的水解切割从而降解DNA的任何酶。根据本发明，可获得自细菌的DNA酶是优选的；特别地，可获得自芽孢杆菌属的DNA酶是优选的；特别地，可获得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的DNA酶是优选的。此类DNA酶的实例描述于专利申请WO 2011/098579或PCT/EP2013/075922中。
过水解酶：适合的过水解酶能够催化过水解反应，该反应导致在过氧化物源(例如，过氧化氢)的存在下从羧酸酯(酰)底物产生过酸。虽然许多酶以低水平进行此反应，过水解酶展现出高的过水解：水解比率(通常大于1)。适合的过水解酶可以是植物、细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。
有用的过水解酶的实例包括天然存在的分枝杆菌属过水解酶或其变体。一种示例性酶来源于耻垢分枝杆菌。这种酶，其酶特性、其结构及其变体描述于WO 2005/056782、WO2008/063400、US 2008/145353以及US 2007167344中。
氧化酶/过氧化物酶：适合的氧化酶和过氧化物酶(或氧化还原酶)包括各种糖氧化酶、漆酶、过氧化物酶以及卤代过氧化物酶。
适合的过氧化物酶包括由国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会陈述的酶分类EC 1.11.1.7包括的那些过氧化物酶，或来源于其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中所描述的那些。
用于在本发明中使用的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶进行分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯离子形成次氯酸盐。
在一个实施例中，该卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选的方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯离子来源组合。
已从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已从细菌，如假单胞菌属(例如吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选实施例中，卤代过氧化物酶可源自弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)或不等弯孢(Curvularia inaequalis)，如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42；或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS147.63或疣枝弯孢CBS444.70；或衍生自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii，如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium属物种。
根据本发明的氧化酶特别包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或来源于其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。该酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌的适合实例包括可来源于以下的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，柱顶孢属(Schytalidium)(例如，嗜热柱顶孢属(S.thermophilum))，多孔菌属(例如，松果多孔菌(P.pinsitus))，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。
来自细菌的适合实例包括可来源于芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或来自嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。
其他氧化酶的实例包括但不限于氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸盐氧化酶、半乳糖氧化酶、多元醇氧化酶(例如，WO 2008/051491)、以及醛糖氧化酶。氧化酶及其对应的底物可以被用作过氧化氢生成酶系统，由此作为过氧化氢的来源。若干种酶，如过氧化物酶、卤代过氧化物酶以及过水解酶需要过氧化氢的来源。通过研究EC 1.1.3._、EC1.2.3._、EC 1.4.3._、以及EC 1.5.3._或类似类别(在国际生物化学协会下)，本领域的普通技术人员容易识别氧化酶和底物的此类组合的其他实例。
酶稳定剂和/或流变改性剂
这些组合物或微囊还可以含有如本领域中已知的酶稳定剂，例如，多元醇、聚合物、可逆性酶抑制剂、二价阳离子、酶底物、抗氧化剂等。水溶性稳定剂是优选的。
添加缓慢溶解的稳定剂可以用于在该囊内部产生局部环境，该局部环境对该囊化的酶/化合物更友好，由此在储存期间提高稳定性。
可逆性蛋白酶抑制剂的实例是硼酸、肽醛及其衍生物以及高分子的蛋白型抑制剂(像BASI/RASI抑制剂，见WO 2009/095425)。金属蛋白酶抑制剂的实例描述于WO 2008/134343中。下面在“蛋白酶抑制剂”的标题下更加详细地描述了蛋白酶抑制剂。
稳定化聚合物可以基于，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其共聚物。稳定化多元醇可以是像甘油、山梨糖醇、丙二醇等的更小分子，但也可以是像聚乙二醇、多糖等的更大分子。
在稳定化二价阳离子中，Ca2+、Mg2+和Zn2+是本领域已知的。因此，在一个实施例中，本发明的组合物包含Ca2+、Mg2+或Zn2+离子源。优选地，Ca2+、Mg2+或Zn2+离子源是Ca2+、Mg2+或Zn2+的难溶性(缓慢溶解的)盐。难溶性意味着在20℃下在纯水中的溶解度低于5g/l、2g/l、1g/l、0.5g/l、0.2g/l、0.1g/l、或0.05g/l。Ca2+、Mg2+或Zn2+的优选的盐是碳酸钙、碳酸镁、碳酸锌、硫酸钙、亚硫酸钙、亚硫酸镁、亚硫酸锌、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸镁、磷酸锌、柠檬酸钙、柠檬酸镁、柠檬酸锌、草酸钙、草酸镁、草酸锌、酒石酸钙、酒石酸镁、或酒石酸锌。
缓慢溶解的酸或碱还以用于在该微囊内部产生局部pH，该局部pH对该囊化的酶/化合物更友好。
在大多情况下，通过添加它们的底物(例如，对于蛋白酶是蛋白，对于淀粉酶是淀粉)来稳定化这些酶。可以应用抗氧化剂或还原剂来减少酶的氧化，例如硫代硫酸盐、抗坏血酸盐等。每克洗涤剂所需的这些稳定剂的净剂量相比于将这些稳定剂添加至该连续的洗涤剂相要低得多，因为他们在该内囊相中是浓缩的，并且在许多情况下在储存期间将不会扩散出去，或者取决于该稳定剂的结构和分子量仅仅缓慢扩散出去。特别地，高分子量稳定剂(例如，高于1kDa，或高于2kDa更优选高于5kDa)将给出改进的净效率。因此优选的是高分子量抑制剂、聚合物、多元醇、阳离子、酶底物和抗氧化剂。
可以通过添加“牺牲剂”蛋白来保护该酶。使酶不稳定的组分通过反应到蛋白上的氨基酸基团(例如，氨基)上由此可以与所添加的牺牲剂或牺牲蛋白反应。优选的是具有足够大分子量以停留在这些囊内部的牺牲剂蛋白。
一种在某种程度上有所不同的用以改进酶稳定性的方式是添加流变改性组分，这些组分增加该内囊相的粘度。增加的内部粘度将减慢酶去稳定剂扩散进入这些囊(和/或减慢酶稳定剂扩散出该囊)中并且因此延长该酶的生命期。这类粘度调节剂的实例是聚合物，比如聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、亲水性聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和PVP醋酸乙烯共聚物、淀粉、透明质酸、水溶性纤维素衍生物(像羧甲基纤维素)、水溶性树胶(像阿拉伯树胶、槐树豆胶、瓜尔胶或黄胞胶等)及其组合或共聚物。最优选的是非离子型高分子量聚合物，具有高于1kDa，或高于2kDa，更优选高于5kDa的分子量。优选非离子型聚合物是因为它们在大多情况下比离子型聚合物与该反应性膜聚合物更为相容。
高粘度可通过以下方式实现：使用高粘度水相产生这些囊，或更复杂地，当在产生该乳剂/这些囊后粘度增加首次发生时产生囊。这一“触发的”粘度增加是优选的，因为制备具有高粘度水相的乳剂可能很困难。当通过具有高于添加至其中的洗涤剂的水活度的内囊相添加至该洗涤剂时，触发的粘度增加可以原位完成，因此水将从这些囊(但不是流变改性剂)中扩散出去由此在添加至洗涤剂后增加该内相的粘度。这还可以使用盐或其他低分子组分的扩散而运用，例如，通过具有一种当盐浓度通过添加至洗涤剂而降低时使粘度增加的组分(例如，一种聚合物，其在初始盐含量高的情况下沉淀，但当盐浓度由于添加至洗涤剂时盐的扩散而降低时是可溶的)。触发粘度的另一种方式是使用其粘度取决于pH的组分。对于一些界面聚合方法(例如，胺-酸卤反应)，在囊化过程中该内相的pH将改变，在胺-酸卤的情况下，在该界面聚合过程中pH将降低。这可以用于触发粘度的增加。许多流变改性剂(像聚丙烯酸酯)在特别pH或pH范围下表现出粘度极大值。流变改性剂的实例是来自路博润(Lubrizol)的Carbopol 934和来自斯高特巴德(Scott-Bader)的Texipol 63-258，其中当将pH从11降低至8或将pH从4升高至8时，粘度显著增高。在低pH下和在高pH下具有不同粘度的另一聚合物类型是部分水解的聚丙烯酰胺。又一种可能是使用温度依赖性的流变改性剂，由此在一个温度下达成乳化/囊化，并且随后改变温度以增加粘度。还可以使用光诱导或超声诱导的粘度。又一种方法是使用剪切稀化流变改性剂，如此当形成该乳剂时该粘度在高剪切下是低的而当剪切降低时粘度是高的。
另一稳定化技术是保证在储存期间该酶在这些囊中沉淀，例如通过添加沉淀剂(像盐或聚乙二醇(PEG))。可以使用与如上所述相同的“触发稳定化”，例如，通过添加PEG，其在添加至洗涤剂后通过水扩散至该酶将沉淀的程度而浓缩。以这种方式，该酶在这些囊加工的过程中可以在溶液中，但当添加至洗涤剂时沉淀。
在制备这些微囊时，还可以沉淀的形式或晶体形式使用酶。
在一个具体考虑的实施例中，本发明的微囊组合物是WO 2014/177709(特此通过援引并入)中描述的包含本发明的脂肪酶变体的组合物。
在另一个实施例中，本发明涉及微囊组合物，这些微囊组合物包含被截留在由膜形成的隔室中的本发明的脂肪酶变体，该膜通过使(a)具有高于800Da分子量的多支化的多胺和(b)具有小于300Da分子量的脂肪胺或芳香胺的交联而产生；其中(a)/(b)的重量比在0.1至1000的范围内。
如上所述，微囊可进一步包含选自由以下组成的组的酶：蛋白酶、金属蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、黄原胶酶、DNA酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。也可以考虑上述其他酶。
在一个实施例中，该多支化的多胺的反应性氨基构成该分子量的至少15％。在一个实施例中，隔室的直径为至少50微米。在一个优选的实施例中，该隔室包含占总隔室重量的至少1％的活性酶，特别是本发明的脂肪酶变体。同样如上所述，这些微囊可以进一步包含醇，例如多元醇。
在一个优选的实施例中，(a)是聚乙烯亚胺。
在一个实施例中，(b)是亚乙基胺或烷醇胺。在一个优选的实施例中，(b)选自由以下组成的组：乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、二(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、六亚甲基二胺、苯二胺、哌嗪和四亚乙基五胺。在更优选的实施例中，(b)选自由以下组成的组：二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、二(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺和二乙醇胺。
根据本发明，微囊的隔室包含Mg2+、Ca2+或Zn2+离子源，例如Mg2+、Ca2+或Zn2+的难溶性盐。
在一个优选的实施例中，通过使用酰基氯作为交联剂来产生该膜，该酰基氯是例如间苯二甲酰氯、对苯二甲酰氯或均苯三甲酰氯。
在一个优选的实施例中，通过界面聚合来产生该膜。
在一个具体考虑的实施例中，本发明的微囊组合物是WO 2015/1144784(特此通过援引并入)中描述的包含本发明的脂肪酶变体的组合物。
液体产品
在最后方面，本发明涉及液体产品，这些液体产品包含本发明的微囊组合物。在一个优选的实施例中，该液体产品包含水或至少大量的水。
以下段落描述了本发明的实施例：
1.一种亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T231R、N233R、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
2.如段落1所述的变体，其中该变体包含在对应于T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
3.如段落1或2所述的变体，该变体包含对应于以下一组取代中的任一种的取代：
G23S+T231R+N233R
D27N+T231R+N233R
A40I+T231R+N233R
F51I+T231R+N233R
F51L+T231R+N233R
E56R+T231R+N233R
D57N+T231R+N233R
V60E+T231R+N233R
V60K+T231R+N233R
K98I+T231R+N233R
N101D+T231R+N233R
R118F+T231R+N233R
G163S+T231R+N233R
Y220F+T231R+N233R
T231R+N233R+T244E
T231R+N233R+P256T。
4.如段落1-3中任一段所述的变体，其中该变体包含对应于E56R+T231R+N233R的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
5.如段落1-4中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
6.如段落1-5中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
7.如段落1-6中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
8.如段落1-7中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
9.如段落1-8中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
10.如段落1-9中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
11.如段落1-10中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
12.如段落1-11中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
13.如段落1-12中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
14.如段落1-13中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
15.如段落1-14中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
16.如段落1-15中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
17.如段落1-16中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
18.如段落1-17中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
19.如段落1-18中任一段所述的变体，其中该变体包含在对应于以下一组取代之一的位置处的取代：
E56R+R118F+T231R+N233R；
R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+D57N+R118F+T231R+N233R；
E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
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K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
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G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T。
20.如段落1-19中任一段所述的变体，该变体是选自由以下组成的组的亲本脂肪酶的变体：
a)与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的多肽；
b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交；
c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
d)SEQ ID NO:2的多肽的片段。
21.如段落1-20中任一段所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
22.如段落1-21中任一段所述的变体，其中取代的数目是1-40，诸如1-30，诸如1-20，诸如1-12，诸如1-11，诸如1-10，诸如1-9，诸如1-8，诸如1-7，诸如1-6，诸如1-5，诸如1-4，诸如1-3，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个取代。
23.如段落1-22中任一段所述的变体，其中与亲本脂肪酶相比，所述变体具有以下一种或多种特性：增加的储存稳定性、增加的热稳定性、改善的洗涤性能和/或减少的气味产生。
24.一种组合物，该组合物包含如段落1-23中任一段所述的变体。
25.如段落25所述的组合物，该组合物进一步包含表面活性剂。
26.如段落1-23中任一段所述的变体用于水解脂肪酶底物的用途。
27.一种用于清洁表面的方法，该方法包括使该表面与如段落1-23中任一段所述的变体接触。
28.一种水解脂肪酶底物的方法，该方法包括用如段落1-23中任一段所述的脂肪酶变体处理该脂肪酶底物。
29.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-23中任一段所述的变体。
30.一种包含如段落29所述的多核苷酸的核酸构建体，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导重组宿主细胞中该脂肪酶变体的产生。
31.一种表达载体，该表达载体包含如段落29所述的多核苷酸或如段落30所述的核酸构建体。
32.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如段落30所述的核酸构建体或如段落31所述的表达载体。
33.一种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括：
a)在适合于表达该变体的条件下培养如段落32所述的宿主细胞；以及
b)回收该变体。
34.一种微囊组合物，其中该微囊的膜通过使具有高于1kDa分子量的多支化的多胺交联而产生，其中该微囊包含如段落1-23中任一段所述的脂肪酶变体。
35.如段落34所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含酶，该酶选自由以下组成的组：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、DNA酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。
36.如段落34或35所述的微囊组合物，其中该多支化的多胺的这些反应性氨基构成该分子量的至少15％。
37.如段落34至36中任一段所述的微囊组合物，其中通过使用酰基氯作为交联剂来产生该微囊。
38.如段落34至37中任一段所述的微囊组合物，其中该微囊的直径是至少50微米，或大于50微米。
39.如段落34至38中任一段所述的微囊组合物，其中该微囊包含按重量计至少1％的活性酶，特别是如段落1-23中任一段所述的脂肪酶变体。
40.如段落34至39中任一段所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含醇，例如多元醇。
41.如段落34至40中任一段所述的微囊组合物，该微囊组合物包含按重量计少于90％的水。
42.如段落34或41所述的微囊组合物，其中该蛋白酶是金属蛋白酶或碱性丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶。
43.如段落34至42中任一段所述的微囊组合物，其中使用酰基氯作为交联剂通过界面聚合来产生该微囊。
44.如段落34至43中任一段所述的微囊组合物，其中该多支化的多胺是聚乙烯亚胺。
45.如段落34至44中任一段所述的微囊组合物，其中该微囊包含Mg2+、Ca2+或Zn2+离子源，例如Mg2+、Ca2+或Zn2+的难溶盐。
46.一种微囊组合物，该微囊组合物包含被截留在由膜形成的隔室中的如段落1-23中任一段所述的脂肪酶变体，该膜通过使(a)具有高于800Da分子量的多支化的多胺和(b)具有小于300Da分子量的脂肪胺或芳香胺的交联而产生；其中(a)/(b)的重量比在0.1至1000的范围内。
47.如段落46所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含酶，该酶选自由以下组成的组：蛋白酶、金属蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、黄原胶酶、DNA酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。
48.如段落46或47中任一段所述的微囊组合物，其中该多支化的多胺的这些反应性氨基构成该分子量的至少15％。
49.如段落46至48中任一段所述的微囊组合物，其中该隔室的直径是至少50微米。
50.如段落46至49中任一段所述的微囊组合物，其中该隔室包含按总隔室的重量计至少1％的活性酶，特别是如段落1-23中任一段所述的脂肪酶变体。
51.如段落46至50中任一段所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含醇，例如多元醇。
52.如段落46至51中任一段所述的微囊组合物，其中(a)是聚乙烯亚胺。
53.如段落46至52中任一段所述的组合物，其中(b)是亚乙基胺或烷醇胺。
54.如段落46至5中任一段所述的微囊组合物，其中(b)选自由以下组成的组：乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、二(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、六亚甲基二胺、苯二胺、哌嗪和四亚乙基五胺。
55.如段落46至54中任一段所述的微囊组合物，其中(b)选自由以下组成的组：二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、二(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺和二乙醇胺。
56.如段落46至55中任一段所述的微囊组合物，其中该隔室包含Mg2+、Ca2+或Zn2+离子源，例如Mg2+、Ca2+或Zn2+的难溶盐。
57.如段落43至55中任一段所述的微囊组合物，其中通过使用酰基氯作为交联剂来产生该膜，该酰基氯是例如间苯二甲酰氯、对苯二甲酰氯或均苯三甲酰氯。
58.如段落46至57中任一段所述的微囊组合物，其中通过界面聚合来产生该膜。
59.一种液体产品，该液体产品包含如段落34-58中任一段所述的微囊组合物。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
实例1：对硝基苯基(pNP)测定
可以通过使用对硝基苯基酰基酯作为底物的动力学测定来确定脂肪酶的水解活性。
可以将以下这些底物在DMSO中的100m M储备溶液稀释到测定缓冲液(50mM Tris；pH 7.7；0.4％ TritonX-100)中1mM 25mM的终浓度：对硝基苯基丁酸酯(C4)、对硝基苯基己酸酯(C6)、对硝基苯基癸酸酯(C10)、对硝基苯基月桂酸酯(C12)和对硝基苯基棕榈酸酯(C16)(所有都来自西格玛奥德里奇丹麦公司(Sigma-Aldrich Danmark A/S)，KirkebjergAllé 84，2605目录号：C3：N-9876、C6：N-0502、C10：N-0252、C12：N-2002、C16：N-2752)。
将脂肪酶变体、亲本脂肪酶和适当的对照(例如50mM Hepes；pH 8.0；10ppmTriton X-100；+/-20mM CaCl2中的LipolaseTM(SEQ ID NO:2))以下列最终蛋白质浓度添加到96孔NUNC板(目录号260836，Kamstrupvej 90，DK-4000，罗斯基勒)中的底物溶液中：0.01mg/ml、5×103mg/ml、2.5×10-4mg/ml和1.25×10-4mg/ml。缓冲液也作为阴性对照运行。可以在Spectra max 190(分子设备股份有限公司(Molecular Devices GmbH)，Bismarckring 39，88400Biberach an der Riss，德国)上，以10秒间隔，在405nm处监测由对硝基苯基酰水解而释放的对硝基苯酚，持续5分钟。可以将变体对一种或多种底物的水解活性与亲本脂肪酶对一种或多种底物的水解活性进行比较。
实例2：通过定点诱变构建变体
用疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)(SEQ ID NO:2)构建定点变体。使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸(其在所得序列中引入所希望的突变)，通过传统的DNA片段克隆制得这些变体(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港，1989)。
对应于所需的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列设计诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离，并购自寡核苷酸的供应商，如生命科技公司(LifeTechnologies)。
为了测试TLL变体，将编码变体的突变DNA通过同源重组而整合到感受态米曲霉中，使用标准方案(基于酵母提取物的培养基，3-4天，30℃)发酵，并通过色谱法纯化。以此方式，构建并产生了下表中所列的变体。SEQ ID NO:2的变体
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T
A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E
G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T
实例3：相对洗涤性能(RP(洗涤))
为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽和盖子，盖子针对所有槽开口强力挤压衣物洗涤样品(待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈摇动以使测试溶液与纺织品接触并以规则的、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“Special method embodiments”[特殊方法实施例]段落。
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
洗涤剂： 3.3g/L洗涤剂B或0.8g/L洗涤剂J
测试溶液体积： 160μL
洗涤时间： 20分钟
温度： 30℃
脂肪酶剂量： 0ppm或0.35ppm
测试材料： 如WO 06/125437中所述准备乳脂胭脂树红染色的EMPA221棉纺织品，不同之处在于将姜黄用胭脂树红交换(胭脂树红：A-320-WS，科汉森股份有限公司，BoegeAlle′10-12,DK-2970，丹麦赫斯霍尔姆；和EMPA221：EMPA,Lerchenfeldstrasse 5,CH-9014，瑞士圣加仑)
通过添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝4:1:7.5或2:1:4.5)将水硬度调至15°dH或6°dH。
洗涤之后，将纺织品在自来水中冲洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且其后立即将纺织品在100℃下干燥15分钟。
以所洗涤的沾污的纺织品的颜色变化来测量洗涤性能。该污物是与胭脂树红混合的乳脂。胭脂树红包含着色剂降胭脂树素，它通过具有pH依赖性颜色变化而用作pH指示剂。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从乳脂酰基甘油释放，并且这导致pH降低并且由此导致降胭脂树素pH指示剂的颜色变化。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照亮时，从所洗涤的脏纺织品反射-发射的光的颜色变化程度。
使用用于捕获所洗涤的污染的纺织品的图像的专业平板扫描仪(EPSONEXPRESSION 11000XL，阿特亚公司(Atea A/S)，Lautrupvang 6，2750Ballerup，丹麦)进行颜色测量。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。
归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为相对于光强度值(Int)的绿光(G)的反射-发射的变化，该变化计算为：
相对于参照脂肪酶，脂肪酶的相对洗涤性能(RP(洗涤))被计算为：
RP(洗涤)＝(G/Int(测试的脂肪酶)-G/Int(无酶))/(G/Int(参照脂肪酶)-G/Int(无酶))。
如果脂肪酶表现优于参照(RP(洗涤)>1)，则认为脂肪酶展示出改进的洗涤性能。在本发明的背景中，参照酶是如SEQ ID NO:2所示的脂肪酶。
通过固相微萃取气相色谱法测量进行的气味检测。
使用以下方法，通过固相微萃取气相色谱法(SPME-GC)测量来自脂肪酶洗涤的布样的丁酸释放(气味)。
如上文规定的洗涤乳脂胭脂树红染色的EMPA221棉纺织品，并且在洗涤后，使用滤纸从纺织品中除去过量的水，并且其后将纺织品在25℃下干燥2小时。每次用四片洗涤并干燥的纺织品(直径5mm)进行SPME-GC测量，这些纺织品被转移到气相色谱仪(GC)小瓶并且将小瓶封闭。将样品在30℃下孵育24小时，并且随后加热至140℃持续30分钟，并且储存在20℃-25℃下至少4小时，之后进行分析。在配备有Stabilwax-DA w/Integra-Guard柱(30m，0.32mm ID和0.25微米df)和Carboxen PDMS SPME纤维(85微米)的Varian 3800GC上进行分析。在纺织品片上的顶部空间(head space)中，用SPME纤维在50℃下进行从每个GC小瓶的取样，持续8分钟，且随后将取样的化合物进样到柱上(进样器温度＝250℃)。柱流速＝2ml氦气/分钟。柱加热炉温度梯度：0分钟＝50℃，2分钟＝50℃，6分钟45秒＝240℃，11分钟45秒＝240℃。使用火焰离子化检测器(Flame Ionization Dector，FID)进行检测，并且使用可靠的标准鉴定丁酸的保留时间。
脂肪酶的相对气味释放(RP(气味))是从脂肪酶洗涤的布样释放的丁酸量(峰面积)与和从参照脂肪酶洗涤的布样释放的丁酸量(峰面积)之间的比率，计算比率之前，两个值均针对从非脂肪酶洗涤的布样(空白)释放的丁酸量(峰面积)进行了校正。根据以下公式计算多肽的相对气味性能(RP(气味))：
RP(气味)＝(气味(测试的脂肪酶)-气味(无酶))/(气味(参照脂肪酶)-气味(无酶))
其中气味是测得的从纺织品表面释放的丁酸(峰面积)。
效益风险因子(RP(洗涤)/RP(气味))。
描述与气味释放(风险)相比的洗涤性能(效益)的效益风险因子(BRF)可以定义为RP(洗涤)/RP(气味)。如果脂肪酶的效益风险因子高于1，则该脂肪酶与参照脂肪酶(SEQ IDNO:2)相比具有相对于释放的气味的更好的洗涤性能。
实例4：蛋白质热解折叠分析(TSA，热转变测定(Thermal shift assay))
使用实时PCR仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)；Step-One-Plus)，通过宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司(Invitrogen)，S-6650)监测SEQ ID NO:2的变体的蛋白质热解折叠。
在96孔白色PCR板中，将15μl样品(纯化的酶稀释在100mM EPPS中，0.01％Troton-X-100；pH8.0)与宝石橙(浓缩＝10X；得自供应商的储备溶液＝5000X)按1:1在水中混合。
用光学PCR密封件密封该平板。PCR仪被设置扫描速率为76℃每小时，在25℃下开始，并且在96℃下完成。
使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。Tm值计算为一阶导数(dF/dK)的最大值(Gregory等人2009,J.Biomol.Screen.[生物分子筛选杂志]14:700)。
实例5：通过定点诱变构建变体
用疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)(SEQ ID NO:2)构建定点变体。使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸(其在所得序列中引入所希望的突变)，通过传统的DNA片段克隆制得这些变体(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港，1989)。
对应于所需的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列设计诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离，并购自寡核苷酸的供应商，如生命科技公司。为了测试TLL变体，将编码变体的突变DNA通过同源重组而整合到感受态米曲霉中，使用标准方案(基于酵母提取物的培养基，3-4天，30℃)发酵，并通过色谱法纯化。以此方式，构建并产生了下表中所列的变体。
实例6：相对洗涤性能(RP(洗涤))
为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽和盖子，盖子针对所有槽开口强力挤压衣物洗涤样品(待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈摇动以使测试溶液与纺织品接触并以规则的、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
洗涤剂： 3.3g/L模型洗涤剂B或0.8g/L模型洗涤剂J
测试溶液体积： 160μL
洗涤时间： 20分钟
温度： 30℃
脂肪酶剂量： 0ppm或0.35ppm
测试材料： 如WO 06/125437中所述准备乳脂胭脂树红染色的EMPA221棉纺织品，不同之处在于将姜黄用胭脂树红交换(胭脂树红：A-320-WS，科汉森股份有限公司，BoegeAlle′10-12,DK-2970，丹麦赫斯霍尔姆；和EMPA221：EMPA,Lerchenfeldstrasse 5,CH-9014，瑞士圣加仑)
通过添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝4:1:7.5或2:1:4.5)将水硬度调至15°dH或6°dH。
洗涤之后，将纺织品在自来水中冲洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且其后立即将纺织品在100℃下干燥15分钟。
以所洗涤的沾污的纺织品的颜色变化来测量洗涤性能。该污物是与胭脂树红混合的乳脂。胭脂树红包含着色剂降胭脂树素，它通过具有pH依赖性颜色变化而用作pH指示剂。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从乳脂酰基甘油释放，并且这导致pH降低并且由此导致降胭脂树素pH指示剂的颜色变化。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照亮时，从所洗涤的脏纺织品反射-发射的光的颜色变化程度。
使用用于捕获所洗涤的污染的纺织品的图像的专业平板扫描仪(EPSONEXPRESSION 11000XL，阿特亚公司(Atea A/S)，Lautrupvang 6，2750Ballerup，丹麦)进行颜色测量。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。
归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为相对于光强度值(Int)的绿光(G)的反射-发射的变化，该变化计算为：
相对于参照脂肪酶，脂肪酶的相对洗涤性能(RP(洗涤))被计算为：
RP(洗涤)＝(G/Int(测试的脂肪酶)-G/Int(无酶))/(G/Int(参照脂肪酶)-G/Int(无酶))。
如果脂肪酶表现优于参照(RP(洗涤)>1)，则认为脂肪酶展示出改进的洗涤性能。在本发明的背景中，参照酶是如SEQ ID NO:2所示的脂肪酶。通过固相微萃取气相色谱法测量进行的气味检测。
使用以下方法，通过固相微萃取气相色谱法(SPME-GC)测量来自脂肪酶洗涤的布样的丁酸释放(气味)。
如上文规定的洗涤乳脂胭脂树红染色的EMPA221棉纺织品，并且在洗涤后，使用滤纸从纺织品中除去过量的水，并且其后将纺织品在25℃下干燥2小时。每次用四片洗涤并干燥的纺织品(直径5mm)进行SPME-GC测量，这些纺织品被转移到气相色谱仪(GC)小瓶并且将小瓶封闭。将样品在30℃下孵育24小时，并且随后加热至140℃持续30分钟，并且储存在20℃-25℃下至少4小时，之后进行分析。在配备有Stabilwax-DA w/Integra-Guard柱(30m，0.32mm ID和0.25微米df)和Carboxen PDMS SPME纤维(85微米)的Varian 3800GC上进行分析。在纺织品片上的顶部空间(head space)中，用SPME纤维在50℃下进行从每个GC小瓶的取样，持续8分钟，且随后将取样的化合物进样到柱上(进样器温度＝250℃)。柱流速＝2ml氦气/分钟。柱加热炉温度梯度：0分钟＝50℃，2分钟＝50℃，6分钟45秒＝240℃，11分钟45秒＝240℃。使用火焰离子化检测器(Flame Ionization Dector，FID)进行检测，并且使用可靠的标准鉴定丁酸的保留时间。
脂肪酶的相对气味释放(RP(气味))是从脂肪酶洗涤的布样释放的丁酸量(峰面积)与和从参照脂肪酶洗涤的布样释放的丁酸量(峰面积)之间的比率，计算比率之前，两个值均针对从非脂肪酶洗涤的布样(空白)释放的丁酸量(峰面积)进行了校正。根据以下公式计算相对气味性能(RP(气味))：
RP(气味)＝(气味(测试的脂肪酶)-气味(无酶))/(气味(参照脂肪酶)-气味(无酶))
其中气味是测得的从纺织品表面释放的丁酸(峰面积)。
效益风险因子(RP(洗涤)/RP(气味))。
描述与气味释放(风险)相比的洗涤性能(效益)的效益风险因子(BRF)可以定义为RP(洗涤)/RP(气味)。如果脂肪酶的效益风险因子高于1，则该脂肪酶与参照脂肪酶(SEQ IDNO:2)相比具有相对于释放的气味的更好的洗涤性能。
实例7：蛋白质热解折叠分析(TSA，热转变测定(Thermal shift assay))
使用实时PCR仪(应用生物系统公司；Step-One-Plus)，通过宝石橙(SyproOrange)(英杰公司，S-6650)监测SEQ ID NO:2的变体的蛋白质热解折叠。在96孔白色PCR板中，将15μl样品(纯化的酶稀释在100mM EPPS中，0.01％ Troton-X-100；pH8.0)与宝石橙(浓缩＝10X；得自供应商的储备溶液＝5000X)按1:1在水中混合。
用光学PCR密封件密封该平板。PCR仪被设置扫描速率为76℃每小时，在25℃下开始，并且在96℃下完成。
使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。Tm值计算为一阶导数(dF/dK)的最大值(Gregory等人2009,J.Biomol.Screen.[生物分子筛选杂志]14:700)。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
本申请具体涉：
1.一种亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T231R、N233R、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
2.如项1所述的变体，其中该变体包含在对应于T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
3.如项1或2所述的变体，该变体包含对应于以下一组取代中的任一种的取代：
G23S+T231R+N233R
D27N+T231R+N233R
A40I+T231R+N233R
F51I+T231R+N233R
F51L+T231R+N233R
E56R+T231R+N233R
D57N+T231R+N233R
V60E+T231R+N233R
V60K+T231R+N233R
K98I+T231R+N233R
N101D+T231R+N233R
R118F+T231R+N233R
G163S+T231R+N233R
Y220F+T231R+N233R
T231R+N233R+T244E
T231R+N233R+P256T。
4.如项1-3中任一项所述的变体，其中该变体包含对应于E56R+T231R+N233R的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
5.如项1-4中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
6.如项1-5中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
7.如项1-6中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
8.如项1-7中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
9.如项1-8中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
10.如项1-9中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
11.如项1-10中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
12.如项1-11中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
13.如项1-12中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
14.如项1-13中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
15.如项1-14中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
16.如项1-15中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
17.如项1-16中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
18.如项1-17中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
19.如项1-18中任一项所述的变体，该变体是选自由以下组成的组的亲本脂肪酶的变体：
a)与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的多肽；
b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交；
c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
d)SEQ ID NO:2的多肽的片段。
20.如项1-19中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
21.一种组合物，该组合物包含如项1-20中任一项所述的变体。
22.如项21所述的组合物，该组合物进一步包含表面活性剂。
23.如项1-20中任一项所述的变体的用途，用于水解脂肪酶底物。
24.一种用于清洁表面的方法，该方法包括使该表面与如项1-20中任一项所述的变体接触。
25.一种水解脂肪酶底物的方法，该方法包括使用如项1-20中任一项所述的脂肪酶变体处理该脂肪酶底物。
26.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如项1-20中任一项所述的变体。
27.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如项26所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导重组宿主细胞中该脂肪酶变体的产生。
28.一种表达载体，该表达载体包含如项26所述的多核苷酸或如项27所述的核酸构建体。
29.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如项27所述的核酸构建体或如项28所述的表达载体。
30.一种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括：
a)在适于表达该变体的条件下培养如项29所述的宿主细胞；以及
b)回收该变体。
31.一种微囊组合物，其中该微囊的膜通过使具有高于1kDa分子量的多支化的多胺交联而产生，其中该微囊包含如项1-20中任一项所述的脂肪酶变体。
32.一种液体产品，该液体产品包含如项31所述的微囊组合物。

Claims (59)

1.一种亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于R118F、G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T231R、N233R、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
2.如权利要求1所述的变体，其中该变体包含在对应于T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
3.如权利要求1或2所述的变体，该变体包含对应于以下组取代中的任一种的取代：
G23S+T231R+N233R D27N+T231R+N233R A40I+T231R+N233R F51I+T231R+N233R F51L+T231R+N233R E56R+T231R+N233R D57N+T231R+N233R V60E+T231R+N233R V60K+T231R+N233R K98I+T231R+N233R N101D+T231R+N233R R118F+T231R+N233R G163S+T231R+N233R Y220F+T231R+N233R T231R+N233R+T244E T231R+N233R+P256T
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该变体包含对应于E56R+T231R+N233R的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
12.如权利要求1-11中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
13.如权利要求1-12中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
14.如权利要求1-13中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
15.如权利要求1-14中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
16.如权利要求1-15中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
17.如权利要求1-16中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
18.如权利要求1-17中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于
F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的取代以及在对应于G23S、D27N、A40I、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如若干个)取代。
19.如权利要求1-18中任一项所述的变体，其中该变体包含在对应于以下组取代之一的位置处的取代：
E56R+R118F+T231R+N233R；
R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+D57N+R118F+T231R+N233R；
E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T；A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E:G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E；G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
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F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
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K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
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G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
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F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T。
20.如权利要求1-19中任一项所述的变体，该变体是选自由以下组成的组的亲本脂肪酶的变体：
a)与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的多肽；
b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交；
c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；以及
d)SEQ ID NO:2的多肽的片段。
21.如权利要求1-20中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
22.如权利要求1-21中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-40，诸如1-30，诸如1-20，诸如1-12，诸如1-11，诸如1-10，诸如1-9，诸如1-8，诸如1-7，诸如1-6，诸如1-5，诸如1-4，诸如1-3，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个取代。
23.如权利要求1-22中任一项所述的变体，其中与亲本脂肪酶相比，所述变体具有以下一种或多种特性：增加的储存稳定性、增加的热稳定性、改善的洗涤性能和/或减少的气味产生。
24.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-23中任一项所述的变体。
25.如权利要求24所述的组合物，该组合物进一步包含表面活性剂。
26.如权利要求1-23中任一项所述的变体的用途，用于水解脂肪酶底物。
27.一种用于清洁表面的方法，该方法包括使该表面与如权利要求1-23中任一项所述的变体接触。
28.一种水解脂肪酶底物的方法，该方法包括使用如权利要求1-23中任一项所述的脂肪酶变体处理该脂肪酶底物。
29.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-23中任一项所述的变体。
30.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如权利要求29所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导重组宿主细胞中该脂肪酶变体的产生。
31.一种表达载体，该表达载体包含如权利要求29所述的多核苷酸或如权利要求30所述的核酸构建体。
32.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求30所述的核酸构建体或如权利要求31所述的表达载体。
33.一种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括：
a)在适于表达该变体的条件下培养如权利要求32所述的宿主细胞；以及
b)回收该变体。
34.一种微囊组合物，其中该微囊的膜通过使具有高于1kDa分子量的多支化的多胺交联而产生，其中该微囊包含如权利要求1-23中任一项所述的脂肪酶变体。
35.如权利要求34所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含酶，该酶选自由以下组成的组：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、DNA酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。
36.如权利要求34或35所述的微囊组合物，其中该多支化的多胺的反应性氨基构成该分子量的至少15％。
37.如权利要求34至36中任一项所述的微囊组合物，其中通过使用酰基氯作为交联剂来产生该微囊。
38.如权利要求34至37中任一项所述的微囊组合物，其中该微囊的直径是至少50微米，或大于50微米。
39.如权利要求34至38中任一项所述的微囊组合物，其中该微囊包含按重量计至少1％的活性酶，特别是如权利要求1-23中任一项所述的脂肪酶变体。
40.如权利要求34至39中任一项所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含醇，例如多元醇。
41.如权利要求34至40中任一项所述的微囊组合物，该微囊组合物包含按重量计少于90％的水。
42.如权利要求34或41所述的微囊组合物，其中该蛋白酶是金属蛋白酶或碱性丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶。
43.如权利要求34至42中任一项所述的微囊组合物，其中使用酰基氯作为交联剂通过界面聚合来产生该微囊。
44.如权利要求34至43中任一项所述的微囊组合物，其中该多支化的多胺是聚乙烯亚胺。
45.如权利要求34至44中任一项所述的微囊组合物，其中该微囊包含Mg2+、Ca2+或Zn2+离子源，例如Mg2+、Ca2+或Zn2+的难溶盐。
46.一种微囊组合物，该微囊组合物包含被截留在由膜形成的隔室中的如权利要求1-23中任一项所述的脂肪酶变体，该膜通过使(a)具有高于800Da分子量的多支化的多胺和(b)具有小于300Da分子量的脂肪胺或芳香胺的交联而产生；其中(a)/(b)的重量比在0.1至1000的范围内。
47.如权利要求46所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含酶，该酶选自由以下组成的组：蛋白酶、金属蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、黄原胶酶、DNA酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。
48.如权利要求46或47中任一项所述的微囊组合物，其中该多支化的多胺的反应性氨基构成该分子量的至少15％。
49.如权利要求46至48中任一项所述的微囊组合物，其中该隔室的直径是至少50微米。
50.如权利要求46至49中任一项所述的微囊组合物，其中该隔室包含按总隔室的重量计至少1％的活性酶，特别是如权利要求1-23中任一项所述的脂肪酶变体。
51.如权利要求46至50中任一项所述的微囊组合物，该微囊组合物进一步包含醇，例如多元醇。
52.如权利要求46至51中任一项所述的微囊组合物，其中(a)是聚乙烯亚胺。
53.如权利要求46至52中任一项所述的组合物，其中(b)是亚乙基胺或烷醇胺。
54.如权利要求46至53中任一项所述的微囊组合物，其中(b)选自由以下组成的组：乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、二(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、六亚甲基二胺、苯二胺、哌嗪和四亚乙基五胺。
55.如权利要求46至54中任一项所述的微囊组合物，其中(b)选自由以下组成的组：二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、二(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺和二乙醇胺。
56.如权利要求46至55中任一项所述的微囊组合物，其中该隔室包含Mg2+、Ca2+或Zn2+离子源，例如Mg2+、Ca2+或Zn2+的难溶盐。
57.如权利要求43至55中任一项所述的微囊组合物，其中通过使用酰基氯作为交联剂来产生该膜，该酰基氯是例如间苯二甲酰氯、对苯二甲酰氯或均苯三甲酰氯。
58.如权利要求46至57中任一项所述的微囊组合物，其中通过界面聚合来产生该膜。
59.一种液体产品，该液体产品包含如权利要求34-58任一项所述的微囊组合物。
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