MXPA01006922A - Expresion y exportacion de proteinas de anti-obesidad como proteinas de fusion en fc. - Google Patents

Abstract

Se exponen secuencias nucleotidas, por ejemplo, secuencias de ADN o ARN, que codifican una proteina de fusion de Fc-Leptina de inmunoglobulina. Las secuencias nucleotidas pueden insertarse en un vector de expresion adecuado y expresarse en celulas mamiferas. Tambien se expone una familia de proteinas de fusion de Fc-Leptina de inmunoglobulina que pueden producirse mediante la expresion de tales secuencias nucleotidas. Tambien se exponen los metodos que utilizan tales secuencias nucleotidas y proteinas de fusion para tratar condiciones que se alivian mediante la administracion de leptina.

Description

EXPRESIÓN Y EXPORTACIÓN DE PROTEÍNAS DE ANTI-OBESIDAD COMO PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE Fe Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad para ia Solicitud Provisional de E. U. No. 60/1 15,079, presentada el 7 de Enero de 1 999, la exposición de la cual se incorpora en la presente para referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a métodos y composiciones para elaborar y utilizar proteínas de fusión que contienen una proteína de anti-obesidad. Más particularmente, la invención se refiere a métodos y composiciones para elaborar y utilizar proteínas de fusión que contienen una región de Fe de inmunoglobulina y una proteína de anti-obesidad de leptina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La obesidad es un importante desorden fisiológico asociado con varias enfermedades tales como diabetes, hipertensión, enfermedades cardiacas y ciertos tipos de cánceres. En los Estados Unidos, se estima que más del 30% de la población adulta es obesa, es decir, ai menos el 20% sobre el peso corporal idóneo. También existen crecientes indicaciones de que la obesidad se está convirtiendo rápidamente en un serio problema de salud a nivel mundial. Se reconoce que, en muchos casos, la dieta y el ejercicio por sí solos son insuficientes para lograr una reducción de peso corporal, especialmente en personas que heredan rasgos genéticos que los predisponen a volverse obesos. Por consiguiente, existe la necesidad de un fármaco que pueda ayudar a las personas a perder peso y a disminuir los riesgos de desórdenes relacionados con la obesidad. Más específicamente, existe la necesidad de un fármaco de anti-obesidad con suficiente potencia para originar una pérdida substancial de peso en niveles de dosis factibles. Debido a que la obesidad se define como un 20% sobre el peso ideal, es deseable una pérdida de peso de al menos 20%. En los casos más severos, puede ser necesaria una pérdida de peso de 30-60% para disminuir el peso de una persona hacia un rango saludable. La obesidad es un fenotipo multifactorial, que puede resultar de una combinación de factores fisiológicos, psicológicos, genéticos y ambientales. Un factor asociado con la obesidad es el gen obeso (ob) que se ha clonado ahora (Zhang et al. (1994) NATURE 372: 425). En ratones normales, el gen ob codifica una hormona llamada leptina (Friedman et al. , (1998) NATURE 395: 763). En un estado saciado, la energía en exceso se convierte y almacena como triglicéridos en adipocitos, que a su vez segregan leptina en la corriente sanguínea. La leptina funciona como un mensajero mediante vinculación a su receptor, una forma larga del cual tiene un dominio citoplásmico capaz de transducción de señales y se encuentra predominantemente en el hipotálamo. Se contempla que la vinculación hormona-receptor es un mecanismo de señalización a través del cual el tejido adiposo puede informar al cerebro acerca del estado de fuentes de energía. Se contempla que la leptina cruza la barrera sangre- cerebro para ganar acceso a los receptores de leptina localizados en el hipotálamo (Spiegelman er al. (1 996) CELL 87: 377). Cuando el cerebro recibe un mensaje de que los depósitos de energía se encuentran plenos, éste le indica al cuerpo se ajuste a lo anterior, reduciendo la ingesta de alimentos e/o incrementando ia expedición de energía. Una cepa de ratones mórbidamente obesos referida como ratones ob/ob son homozigotes que tienen dos alelos ob mutantes. Los alelos mutantes producen leptina truncada, la cual es no-funcional y probablemente se degrada rápidamente in vivo. Las consecuencias de la deficiencia de leptina en ratones ob/ob incluyen letargía, hipotermia, hiperglicemia, hiperinsulinemia e infertilidad. En humanos, también existe evidencia que asocia la ganancia de peso y la obesidad con la deficiencia de leptina (Montague et al. (1 997) NATURE 387: 903; Ravussin et al. (1997) NATURE MEDICINE 3: 238), aunque se ha reportado que la mayoría de las personas obesas tienen elevados niveles de leptina en circulación (Considine et al. (1995) N. ENGL. J. MED. 334: 292). Los síntomas asociados con deficiencia de leptina en ratones ob/ob pueden disminuirse mediante la administración de leptina recombinante. Las inyecciones intraperitoneales diarias de leptina pueden reducir la ingesta de alimentos, el peso corporal, la grasa corporal porcentual y las concentraciones de suero de glucosa e insulina. Esto se acompaña por incrementos en la velocidad metabólica, temperatura corporal y actividades locomotoras, todas las cuales requieren de la expedición de energía (Pelleymounter et al. (1995) SCIENCE 269: 540; Halaas ef al. (1995) SCIENCE 269: 543). En los mismos estudios, los ratones normales también se benefician del tratamiento con leptina, aunque las reducciones en el peso corporal, la ingesta de alimentos y la grasa corporal son significativamente menores. La leptina recombinante también se ha utilizado para corregir infertilidad en ratones ob/ob tanto machos como hembras (Chebab et al. (1996) NATURE GENETICS 1 2: 31 8; Mounzib ef al. (1997) ENDOCRINOLOGY 1 38: 1 1 90). Además, los experimentos recientes que utilizan ratones transgénicos sugieren que aproximadamente 5 a 1 0% de los humanos obesos que tienen niveles de leptina relativamente normales o bajos, pueden responder a tratamiento con leptina (loffe ef al. (1998) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 95: 1 1852). El uso de leptina en sus formas actuales requiere que se inyecten dosis elevadas múltiples veces, diariamente, durante meses, para lograr el resultado clínico deseado. Por ejemplo, en un ensayo clínico reciente, algunos voluntarios en el rango de dosis elevado requirieron que se inyectara leptina tres veces al día durante seis meses (WALL STREET JOURNAL, 15 de Junio de 1998). Presumiblemente, se necesitan dosis elevadas, frecuentes, debido a una combinación de baja potencia y una corta vida media del suero de leptina. Esta observación también es consistente con observaciones en modelos de ratón ob/ob en los cuales se necesitó una inyección intraperitoneal de 5 a 20 mg/kg/día de leptina para demostrar una reducción significativa en el peso corporal (Pelleymounter ef al. (1995) SCIENCE 269: 540; Hallas ef al. (1995) SCIENCE 269: 543; Chebab ef al. (1996) NATURE GENETICS 12: 318; Mounzih et al. (1 997) ENDOCRINOLOGY 1 38: 1 190). Para superar la "farmacocinética sub-óptima" de la leptina, se necesitó una infusión crónica de leptina a 400 ng/hr de manera subcutánea para lograr un nivel de plasma fisiológico de leptina en los ratones (Halaas ef al. (1997) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 94: 8878). Las principales razones para dosis elevadas, frecuentes, parecen ser debido a una o más propiedades intrínsecas, por ejemplo, el tamaño de la leptina y el método mediante el cual se preparó el agente farmacológico. La leptina tiene un peso molecular de aproximadamente 16 kD (Halaas ef al. (1995) SCIENCE 269: 543) y por lo tanto es lo suficientemente pequeña para ser limpiada por filtración renal. Por lo tanto, puede ser necesaria una dosis elevada para compensar la corta vida media del suero in vivo. Además, las proteínas más pequeñas tales como leptina pueden producirse en bacterias, por ejemplo, E. coli. Bajo ciertas circunstancias, la leptina recombinante se produce como cuerpos de inclusión insolubles en E. coli. Antes de utilizarse, los cuerpos de inclusión deben solubilizarse con un agente desnaturalizante, por ejemplo, hidrocloruro de guanidina, purificado bajo condiciones desnaturalizantes, y doblarse bajo condiciones apropiadas para producir la proteína funcional. Además, la leptina contiene dos residuos de cisteína que participan en una unión de disulfuro intramolecular. Por lo tanto, para maximizar la recuperación de una molécula biológicamente activa, soluble, el proceso de doblado necesita controlarse cuidadosamente para minimizar la formación de agregados de proteína msolubles y de uniones de disulfuro intermoleculares. Como resultado de tal proceso de producción complicado, es decir, leptina purificada a partir de cuerpos de inclusión hechos en procariotes, puede no ser posible proporcionar una muestra de proteína homogénea bien definida con actividad biológica completa. Los intentos por mejorar la solubilidad de la leptina han incluido la mutación de ciertos residuos amino ácidos en aspartatos o glutamatos, disminuyendo así el punto isoeléctrico (pl) de la leptina de 5.84 hasta por debajo de 5.5 (Patente de E. U. No. 5,719,266). Aunque tal manipulación da como resultado un producto que puede formularse y almacenarse más fácilmente, el producto también es una proteína mutante que podría ser inmunogénica en el recipiente propuesto. Dada la dosis elevada, baja eficacia, corta vida media del suero, y procesos muy complejos involucrados en la producción y purificación de leptina, existe una necesidad en la materia de métodos para mejorar la producción y mejorar las propiedades farmacológicas de este agente de anti-obesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención caracteriza métodos y composiciones útiles en la elaboración y uso de proteínas de fusión que contienen una proteína de anti-obesidad, por ejemplo, leptina. Las proteínas de fusión pueden facilitar la expresión a nivel elevado de proteínas de anti-obesidad biológicamente activas. La proteína de fusión puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable antes de su administración a un mamífero, por ejemplo, un humano. Bajo ciertas circunstancias, la proteína de anti-obesidad puede disociarse de la proteína de fusión antes de la formulación y/o administración. De manera alternativa, las secuencias de ácido nucleico, que codifican la proteína de anti-obesidad que contiene la proteína de fusión, pueden combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable y administrarse al mamífero. Un objeto de la invención es proporcionar secuencias novedosas de ácido nucleico, por ejemplo, ADNs o ARNs, que facilitan la producción y secreción de leptina. En particular, los objetos de la invención son (i) proporcionar secuencias novedosas de ácido nucleico que facilitan la eficiente producción y secreción de leptina; (ii) proporcionar construcciones de ácido nucleico para la rápida y eficiente producción y secreción de leptina en una variedad de células huésped mamíferas; y (iii) proporcionar métodos para la producción, secreción y recolección de leptina recombinante o variantes genéticamente diseñadas de la misma, incluyendo proteínas de leptina no nativa, biosintética o artificial de otro modo, tal como proteínas que se han creado por diseño racional. Otros objetos de la invención son proporcionar secuencias polinucleótidas que, cuando se fusionen con una leptina que codifica polinucleótido, codifiquen una leptina que contiene polipéptido de fusión que puede purificarse mediante el uso de reactivos y técnicas comunes. Todavía otro objeto es interponer un sitio de disociación proteolítica entre un cassette de secreción y la proteína de leptina codificada, de tal manera que el cassette de secreción pueda disociarse del dominio de leptina a fin de que la leptina pueda purificarse de manera independiente. Otro objeto de la invención es proporcionar proteínas de fusión que contienen leptina. Las proteínas de fusión de la presente invención demuestran propiedades biológicas mejoradas sobre leptina nativa, tales como solubilidad incrementada, vida media del suero prolongada y vinculación a su receptor incrementada. Estas propiedades pueden mejorar significativamente la eficacia clínica de la leptina . En una modalidad preferida, la proteína de fusión comprende, en una dirección de terminal N a C, una región de Fe de inmunoglobulina y leptina, con otros elementos, por ejemplo, un sitio de disociación proteolítica, opcionalmente interpuesto entre la región de Fe de inmunoglobulina y la leptina. La proteína de fusión resultante se sintetiza preferentemente en una célula que glicosila la región de Fe en sitios de glicosilación normales, es decir, que normalmente existen en anticuerpos templados. La glicosilación contribuye, al menos en parte, a la vida media circulatoria mejorada de la proteína de fusión. Otros objetos de la invención son proporcionar formas multivalentes y multiméricas de proteínas de fusión de leptina y combinaciones de las mismas. Otro objeto de la invención es proporcionar métodos de tratamiento mediante el uso de las proteínas de fusión o leptina disociada. Un objeto total de la invención es proporcionar procesos que son tanto eficientes como económicos así como también producen proteínas de antiobesidad biológicamente activas. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ADN o ARN, que codifican una proteína de fusión de región de Fe de inmunoglobulina-leptina. La molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de señal, una región de Fe de inmunoglobulina y al menos una proteína objetivo, también referida en la presente como la proteína de anti-obesidad, por ejemplo, leptina. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico codifica, serialmente en una dirección 5' a 3', la secuencia de señal, la región de Fe de inmunoglobulina y la secuencia de proteína objetivo. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica, serialmente en una dirección 5' a 3', la secuencia de señal, la secuencia objetivo, y la región de Fe de inmunoglobulina. El ácido nucleico puede codificar una estructura de X-Fc o Fc-X donde X es una proteína objetivo, tal como leptina. Las modalidades preferidas con las estructuras de Fc-X debido a su nivel de expresión superior. En una modalidad preferida, la región de Fe de inmunoglobulina comprende una región de articulación de inmunoglobulina y preferentemente comprende al menos un dominio de región pesada constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio 2(CH2) pesado constante de inmunoglobulina, un dominio 3(CH3) pesado constante de inmunoglobulina y, dependiendo del tipo de inmunoglobulina utilizado para generar la región de Fe, opcionalmente un dominio 4(CH4) de cadena pesada constante de inmunoglobulina. En una modalidad más preferida, la región de Fe de inmunoglobulina carece al menos de un dominio 1 (CH 1 ) pesado constante de ¡nmunoglobulina. Aunque las regiones de Fe de inmunoglobulina pueden basarse en cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, se prefieren las regiones de Fe de inmunoglobulina en base a IgG.

El ácido nucleico de la invención puede incorporarse en asociación operativa en un vector de expresión reproducible que puede introducirse después en una célula huésped mamífera , competente para producir la proteína de fusión en base a leptina. La proteína de fusión en base a leptina resultante se produce de manera eficiente y se segrega a partir de la célula huésped mamífera. La proteína de fusión en base a leptina segregada puede recolectarse del medio de cultivo sin pasar por lísis la célula huésped mamífera. El producto de proteína puede ensayarse respecto a la actividad y/o purificarse mediante el uso de reactivos comunes, según se desee y/o disociarse del socio de fusión, todo mediante el uso de técnicas convencionales. En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende una región de Fe de inmunoglobulina enlazada, ya sea directamente a través de una unión de polipéptido o indirectamente a través de un enlazador de polipéptido, a la proteína objetivo. L proteína objetivo puede fusionarse a través de su extremo de terminal C a un extremo de terminal N de la región de Fe de inmunoglobulina. Sin embargo, en una modalidad más preferida, la proteína objetivo se fusiona a través de su extremo de terminal N a un extremo de terminal C de la región de Fe de inmunoglobulina. En una modalidad, cuando las proteínas de fusión de la invención se administran a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg/día durante 5 días a un ratón ob/ob que tiene un peso corporal inicial de al menos aproximadamente 50 gramos, induce aproximadamente un 10% (aproximadamente 5 gramos), más preferentemente aproximadamente un 12% (aproximadamente 6 gramos) o más preferentemente aproximadamente un 1 5% (aproximadamente 7.5 gramos) de pérdida del peso corporal inicial. En una modalidad más preferida, cuando las proteínas de fusión de la invención se administran a una dosis de 5 aproximadamente 0.1 mg/kg/día a un ratón ob/ob que tiene un peso corporal inicial de al menos aproximadamente 50 gramos, induce aproximadamente un 10% (aproximadamente 5 gramos), más preferentemente aproximadamente un 12% (aproximadamente 6 gramos) o más preferentemente aproximadamente un 1 5% (aproximadamente 7.5 10 gramos) de pérdida del peso corporal inicial. En otra modalidad, la proteína de fusión puede comprender una segunda proteína objetivo, por ejemplo, una leptina madura de longitud completa o un fragmento bioactivo de la misma. En este tipo de construcción, las proteínas objetivo, primera y segunda, pueden proteínas 15 iguales o diferentes. Las proteínas objetivo, primera y segunda, pueden enlazarse juntas, ya sea directamente o por medio de un enlazador de polipéptido. De manera alternativa, ambas proteínas objetivo pueden enlazarse ya sea directamente o a través de un enlazador de polipéptido a la región de Fe de inmunoglobulina. En el último caso, la primer proteína 20 objetivo puede conectarse a un extremo de terminal N de la región de Fe de inmunoglobulina y la segunda proteína objetivo puede conectarse a un extremo de terminal C de la región de Fe de inmunoglobulina. En otra modalidad, dos proteínas de fusión pueden asociarse, ya sea de manera covalente, por ejemplo, mediante una unión de disulfuro 25 o polipéptido, o de manera no covalente, a fin de producir una proteína -I-----I--Í--I-----I-- dimérica. En una modalidad preferida, la dos proteínas de fusión se asocian de manera covalente por medio de al menos una y más preferentemente dos uniones de disulfuro de intercadena a través de residuos de cisteína, preferentemente localizados dentro de regiones de articulación de inmunoglobulina colocadas dentro de las regiones de Fe de inmunoglobulina de cada cadena. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para producir una proteína de fusión que comprende una región de Fe de inmunoglobulina y la proteína objetivo. El método comprende ias etapas de (a) proporcionar una célula mamífera que contiene una molécula de ADN que codifica tal proteína de fusión, ya sea con o sin una secuencia de señal, y (b) cultivar la célula mamífera para producir la proteína de fusión. La proteína de fusión resultante puede entonces recolectarse, redoblarse, si es necesario, y purificarse mediante el uso de técnicas de purificación convencionales muy conocidas y utilizadas en la materia. Suponiendo que la proteína de fusión comprende un sitio de disociación proteolítica colocado entre la región de Fe de inmunoglobulina y la proteína objetivo, el objetivo puede disociarse de la proteína de fusión mediante el uso de enzimas proteolíticas convencionales y, si es necesario, purificarse antes de utilizarse. En todavía otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar condiciones aliviadas por leptina o variantes activas de la misma, mediante la administración a un mamífero de una cantidad eficaz de leptina producida por un método de la invención y/o construcción de fusión de la invención. La invención también proporciona un método para tratar condiciones aliviadas por leptina o variantes activas de la misma mediante la administración de un ADN o ARN de la invención, por ejemplo, un "ADN simple" o un vector que contiene un ADN o ARN de la invención, a un mamífero que tiene la condición. Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la presente invención, se harán más aparentes a partir de la descripción detallada, dibujos y reivindicaciones a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-E son ilustraciones esquemáticas de proteínas de fusión de anti-obesidad ejemplificativas, construidas de acuerdo con la invención. Las figuras ilustran, respectivamente, Figura 1A, leptina de Fe dimérica; Figura 1 B, fragmento de leptina enlazador de GlySer de leptina de Fe dimérica; Figura 1 C, leptina enlazadora de GlySer de leptina de Fe dimérica; Figura 1 D, Fe de leptina dimérica; y Figura 1 E, Fe enlazadora de GlySer de leptina dimérica. Las líneas verticales representan uniones de disulfuro opcionales que conectan residuos de cisteína (C) colocados dentro de una región de articulación de cada región de inmunoglobulina. La figura 2 es una gráfica que muestra el peso corporal de ratones ob/ob en gramos, tratados con inyecciones IP de 0.25 mg/kg de muLeptina-enlazador-muFc (rombos), 0.25 mg/kg de muLeptina-muFc (cuadrados), 0.25 mg/kg de muFc-muLeptina (triángulos) o solución salina regulada con fosfato (PBS) (cruces). La figura 3 es una gráfica que muestra el peso corporal de ratones ob/ob tratados con inyecciones diarias (diarias durante los primeros 12 días y en lo subsecuente de Lunes a Viernes) intraperitoneales (IP) de ya sea 0.25 mg/kg de muFc-muLeptina (rombos) o solución salina regulada con fosfato (PBS) (cuadrados). La figura 4 es una gráfica que muestra el peso corporal de ratones ob/ob en gramos, tratados con inyecciones diarias intravenosas (IV) de 0.25 mg/kg de muFc-muLeptina (triángulos), 1 .0 mg/kg de muFc-muLeptina (círculos) o PBS (cuadrados) durante cinco días, seguidos por ningún tratamiento. La figura 5 es una gráfica que muestra el efecto de diferentes programas de dosificación en el peso corporal de ratones ob/ob tratados con inyecciones subcutáneas (SC) de muFc-muLeptina (0.25 mg/kg (rombos); y 0.1 mg/kg seguidos por 1 .0 mg/kg (cuadrados)) o PBS (triángulos). La figura 6 es una gráfica que muestra el peso corporal de ratones ob/ob en gramos, tratados con inyecciones intraperitoneales (IP) de 0.1 mg/kg de huFc-huLeptina (rombos), 0.5 mg/kg de huFc-huLeptina (cuadrados) o PBS (triángulos). La figura 7 es una gráfica que muestra los niveles circulantes en suero de huFc-huLeptina glicosilada (rombos) y huFc(N?Q mutación)-huLeptina no glicosilada (cuadrados) como una función de tiempo (horas) después de la administración. Los niveles circulantes se expresan como un porcentaje de la dosis inicial.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona proteínas de fusión que son útiles en la producción de proteínas de anti-obesidad. Las proteínas de fusión de la invención y/o ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de fusión, pueden administrarse directamente a mamíferos que necesitan de tratamiento con una proteína de anti-obesidad. Sin embargo, se contempla que las proteínas de anti-obesidad pueden disociarse de las proteínas de fusión antes de utilizarse. La invención proporciona así proteínas de fusión que comprenden una región de Fe de inmunoglobulina y al menos una proteína objetivo, referida en la presente como leptina. Cinco modalidades ejemplificativas de las construcciones de proteína que incorpora la invención se ilustran en los dibujos como Figuras 1A-1 E. Debido a que se prefieren las construcciones diméricas, todas se ilustran como degradadas por dímeros mediante un par de uniones de disulfuro entre cisteínas en subunidades adyacentes. En los dibujos, las uniones de disulfuro se ilustran como enlace conjunto de las dos regiones de Fe de cadena pesada de inmunoglobulina a través de una región de articulación de inmunoglobulina dentro de cada cadena pesada y, por lo tanto, son características de las formas nativas de estas moléculas. Aunque se prefieren las construcciones que incluyen la región de articulación de Fe y han demostrado ser prometedoras como agentes terapéuticos, la invención contempla que la degradación en las otras posiciones puede elegirse según se desee. Además, bajo ciertas circunstancias, los dímeros o multímeros útiles en la práctica de la invención pueden producirse mediante asociación no covalente, por ejemplo, mediante interacción hidrofóbica.

Debido a que las construcciones homodiméricas son modalidades importantes de la invención, los dibujos ilustran tales construcciones. Debe apreciarse que las estructuras heterodiméricas también son útiles en la práctica de la invención . Sin embargo, pueden construirse construcciones viables útiles en la inhibición de la obesidad en diversas especies mamíferas, incluyendo humanos, por ejemplo, una cadena de una proteína de fusión de Fe dimérica que comprende una leptina de longitud completa y la otra cadena de la proteína de fusión de Fe dimérica que comprende una variante de leptina. La figura 1 A ilustra una construcción dimérica producida de acuerdo con los principios establecidos en ia presente (ver, por ejemplo, Ejemplos 1 y 4). El Ejemplo 1 expresa la construcción murina y el Ejemplo 4 expresa la construcción humana. Cada monómero del homodímero comprende una región de Fe de inmunoglobulina 1 que incluye una región de articulación, un dominio CH2 y un dominio CH3. Sujeto directamente, es decir, a través de una unión polipéptida, al término C de la región Fe, se encuentra la leptina 2. Debe entenderse que la región de Fe puede anexarse a una proteína objetivo a través de un enlazador de polipéptido (no mostrado). Las figuras 1 B y 1 C ilustran construcciones de proteína de la invención que incluye, como una proteína objetivo, proteínas plurales de anti-obesidad instaladas en serie y conectadas por un enlazador. En la figura 1 B, la proteína objetivo comprende una leptina 2 de longitud completa, un enlazador de polipéptido hecho de glicina y residuos de serina 4 y una variante activa de leptina 3. La figura 1 C difiere de la construcción de la figura 1 B ya que la mayor parte del dominio de proteína de terminal C comprende una segunda copia de leptina 2 de longitud completa. Aunque las figuras 1 A-1 C representan construcciones Fc-X, donde X es la proteína objetivo, se contempla que las construcciones de tipo X-Fc también pueden ser útiles en la práctica de la invención. De acuerdo con lo anterior, las figuras 1 D y 1 E ilustran construcciones de tipo X-Fc hechas de acuerdo con los principios establecidos en la presente (ver, por ejemplo, Ejemplos 5 y 6). La construcción de tipo X-Fc ilustrada en la figura 1 D comprende, en su término N, una leptina 2' de longitud completa. Conectada directamente al término C de la leptina se encuentra una región de Fe 1 ' que incluye una región de articulación. En la figura 1 E, la construcción ilustrada tiene en su término N una leptina 2' de longitud completa. Sin embargo, en contraste con la construcción de la figura 1 D, la leptina 2' ilustrada en la figura 1 E se conecta mediante un enlazador de polipéptido 4' a una región de Fe 1 '. Además, se contempla que las proteínas útiles de la invención también pueden ilustrarse por la fórmula X-Fc-X, en donde las X's pueden representar proteínas objetivos iguales o diferentes. Según se utiliza en la presente, se entiende que el término "enlazador de polipéptido" significa una secuencia de polipéptido que puede enlazar juntas dos proteínas que por naturaleza no se enlazan juntas. El enlazador de polipéptido preferentemente comprende una pluralidad de amino ácidos tales como alanina, glicina y serina o combinaciones de tales amino ácidos. Preferentemente, el enlazador de polipéptido comprende una serie de péptidos de glicina y serina de aproximadamente 10-1 5 residuos de longitud . Ver, por ejemplo, la Patente de E. U. No. 5,258,698, la exposición de la cual se incorpora en la presente para referencia. Sin embargo, se contempla que la longitud óptima del enlazador y la composición amino acida pueden determinarse mediante experimentación de rutina. Según se utiliza en la presente, el término "multivalente" se refiere a una molécula recombinante que incorpora dos o más segmentos biológicamente activos. Los fragmentos de proteína que forman la molécula multivalente pueden enlazarse a través de un enlazador de polipéptido que anexa las partes constituyentes y permite que cada una funcione de manera independiente. Según se utiliza en la presente, el término "bivalente" se refiere a una molécula recombinante multivalente que tiene la configuración Fc-X o X-Fc, donde X es una molécula objetivo. Las regiones de Fe de inmunoglobulina pueden asociarse, por ejemplo, a través de uniones de disulfuro de intercadena, para producir el tipo de construcciones mostradas en las figuras 1 A y 1 D. Si la construcción de fusión de la invención tiene la configuración Fc-X-X, la molécula de dímero de Fe resultante se muestra en la figura 1 C. Las dos proteínas objetivo pueden enlazarse a través de un enlazador de péptido. Las construcciones del tipo mostrado en la figura 1 A pueden incrementar la aparente afinidad de vinculación entre la molécula objetivo y su receptor. Por ejemplo, si un elemento de leptina de una proteína de fusión de Fc-Leptina puede unirse a un receptor en una célula con una cierta afinidad, el segundo elemento de leptina de la misma proteína de fusión de Fc-Leptina puede unirse a un segundo receptor en la misma célula con una avidez mucho mayor (afinidad aparente). Esto puede ocurrir debido a la proximidad física del segundo elemento de leptina respecto al receptor después de que el primer elemento de leptina ya se ha unido. En el caso de una vinculación de anticuerpo a un antígeno, la afinidad aparente puede incrementarse en al menos diez mil veces, es decir, 1 04. Cada subunidad de proteína, es decir, "X", tiene su propia función independiente a fin de que en una molécula multivalente las funciones de las subunidades de proteína puedan ser aditivas o sinergísticas. Según se utiliza en la presente, el término "multimérico" se refiere a la asociación estable de dos o más cadenas de polipéptido ya sea de manera covalente, por ejemplo, por medio de una interacción covalente, por ejemplo, una unión de disulfuro, o de manera no covalente, por ejemplo, mediante interacción hidrofóbica. Se intenta que el término multímero abarque tanto los homomultímeros, en donde las subunidades son las mismas, como también los heteromultímeros, en donde las subunidades son diferentes. Según se utiliza en la presente, el término "dimérico" se refiere a una molécula multimérica específica en donde dos cadenas polipéptidas se asocian de manera estable a través de interacciones covalentes o no covalentes. Debe entenderse que la región de Fe de inmunoglobulina que incluye al menos una porción de la región de articulación , un dominio de CH2 y un dominio de CH3, forman típicamente un dímero. Se sabe que muchos ligandos de proteína se unen a sus receptores como un dímero. Si un ligando de proteína X se dimeriza de manera natural, el elemento X en una molécula de Fc-X se dimerizará en un grado mucho mayor, ya que el proceso de dimerización depende de la concentración. La proximidad física de los dos elementos X conectados por Fe haría de la dimerización un proceso intramolecular, desplazando enormemente el equilibrio a favor del dímero y mejorando su vinculación al receptor. Según se utiliza en la presente, se entiende que el término "leptina" significa no solamente una proteína de leptina madura de longitud completa (ver, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, los cuales representan leptina humana madura y leptina murina, respectivamente), sino también variantes y fragmentos bioactivos de la misma. El término fragmento bioactivo se refiere a cualquier fragmento de proteína de leptina que tiene al menos 30%, más preferentemente al menos 70% y más preferentemente al menos 90% de la actividad biológica de la proteína de leptina, templada, madura, según se determina mediante el uso de modelo de ratón ob/ob. El término variantes incluyes especies y variantes aiélicas, generadas mediante protocolos de diseño genético, que son al menos 70% similares o 60% idénticas, más preferentemente al menos 75% similares o 65% idénticas y más preferentemente al menos 80% similares o 70% idénticas a cualquiera de las secuencias de leptina naturalmente ocurrentes, expuestas en la presente. Para determinar si un polipéptido candidato tiene la similitud porcentual de requisito o identidad con un polipéptido de referencia, la secuencia amino acida candidata y la secuencia amino acida de referencia se alinean primero mediante el uso del algoritmo de programación dinámica descrito en Smith y Waterman (1 981 ) J. MOL. BIOL. 147: 1 95-197, en combinación con la matriz de substitución BLOSUM62 descrita en la figura 2 de Henikoff y Henikoff (1 992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks", PROC. NATL. ACAD. SCI USA 89: 10915-10919. Para la presente invención, un valor apropiado para la desventaja de inserción de espacio es -12, y un valor apropiado para la desventaja de extensión de espacio es -4. Los programas computarizados que llevan a cabo alineaciones mediante el uso del algoritmo de Smith-Waterman y la matriz BLOSUM62, tales como la sucesión de programa GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Inglaterra), se encuentran comercialmente disponibles y se utilizan ampliamente por aquellos expertos en la materia. Una vez que se realiza la alineación entre la secuencia candidata y de referencia, puede calcularse una puntuación de similitud porcentual. Los amino ácidos individuales de cada secuencia se comparan de manera secuencial de acuerdo a su similitud entre sí. Si el valor en la matriz BLOSUM62 correspondiente a ios dos amino ácidos alineados es cero o un número negativo, la puntuación de similitud entre pares es cero; de otro modo, la puntuación de similitud entre pares es 1 .0. La puntuación de similitud en bruto es la suma de las puntuaciones de similitud entre pares de los amino ácidos alineados. La puntuación en bruto se normaliza entonces al dividirla entre el número de amino ácidos en la secuencia más pequeña, candidata o de referencia. La puntuación en bruto normalizada es la similitud porcentual. De manera alternativa, para calcular una identidad porcentual, los amino ácidos alineados de cada secuencia se comparan nuevamente de manera secuencial. Si los amino ácidos no son idénticos, la puntuación de identidad entre pares es cero; de otro modo, la puntuación de identidad entre pares es 1 .0. La puntuación de identidad en bruto es la suma de los amino ácidos alineados, idénticos. La 5 puntuación en bruto se normaliza entonces al dividirla entre el número de amino ácidos en la más pequeña de las secuencias, candidata o de referencia. La puntuación en bruto normalizada es la identidad porcentual. Las inserciones y omisiones se ignoran con el propósito de calcular la similitud e identidad porcentuales. De acuerdo con lo anterior, 10 las desventajas de espacio no se utilizan en este cálculo, aunque se utilizan en la alineación inicial. Las variantes también pueden incluir otras muteínas de leptina que tienen actividad similar a la leptina. Ver, por ejemplo, la Patente de E. U. No. 5,719,266, la exposición de la cual se incorpora en la presente 15 para referencia. Las variantes de especies incluyen, pero sin limitarse, secuencias de leptina humana y de ratón (ver, por ejemplo, SEQ ID NOS 2 y 4, respectivamente) y las variantes de especies codificadas por secuencias nucleótidas expuestas en las bases de datos Genbank y/o EMBL, bajo los números de acceso U72873 (Pongo pymaeus), U96450 20 (Pan troglogytes), U66254 (Sus scrota), U50365 (Bos taurus), D49653 (Rattus norvegicus), U58492 (Macaca mulatta), U72872 (Gorilla gorilla), U62123 (Ovis aries), AF082500 (Gallus gallus), AF082501 (Meleagris gallopavo), AB020986 (Canis familiaris), AF097582 (Equus caballus) y AF1 5971 3 (Sminthopsis crassicaudata), las exposiciones de los cuales se 25 incorporan en la presente para referencia. ^..----l i------ Además, la secuencia de leptina puede comprender una porción o toda la secuencia de consenso establecida en la SEQ ID NO: 20, en donde la leptina tiene al menos 30%, más preferentemente al menos 70%, y más preferentemente al menos 90% de la actividad biológica de la leptina humana, madura, de longitud completa, según se determina mediante el uso del modelo de ratón ob/ob. La secuencia de consenso de la SEQ ID NO: 20, se generó a partir de las secuencias de leptina derivadas de ratón, rata, pollo, humano, chimpancé, vaca, oveja, gorila, mono rhesus, cerdo, orangután y perro. Por ejemplo, la leptina puede comprender una porción o toda la secuencia de consenso: SECUENCIA SCAN (SEQ ID NO: 20), en donde Xaa3 opcionalmente puede ser lie o Cys, Xaa4 puede ser Arg, Trp, Gln o His, Xaa5 puede ser Lys, Arg o Me, Xaa6 puede ser Val o Phe, Xaa 19 puede ser Ala o Thr, Xaa28 puede ser Gln o una unión péptida, Xaa32 puede ser Ser o Ala, Xaa33 puede ser Lys o Arg, Xaa35 puede ser Arg o Lys, Xaa37 puede ser Ala o Thr, Xaa46 puede ser Gln o His, Xaa48 puede ser Val, He o Lys, Xaa50 puede ser Ser o Thr, Xaa53 puede ser Arg, Lys o Gln, XaaßO puede ser He o Val, Xaa64 puede ser lie o Val, Xaa66 puede ser Ans, Thr, Me o Ala, Xaa67 puede ser Leu o Met, Xaa68 puede ser Leu o Met, Xaa69 puede ser His o Pro, Xaa71 puede ser Arg o Gln, Xaa73 puede ser Val o Met, Xaa74 puede ser Val, Me o Leu, Xaa77 puede ser Ser o Ala, Xaa78 puede ser Asn o His, Xaa89 puede ser Leu o Val, Xaa92 puede ser Ser, Phe o Ala, Xaa97 puede ser Pro, His o Ser, Xaal OO puede ser Arg, Qln, Trp o Leu, Xaa 101 puede ser Ala, Val o Thr, Xaa 102 puede ser Arg o Ser, Xaa 1 03 puede ser Gly o Ala, Xaa105 puede ser Glu o Gln , Xaa 106 puede ser Thr, Ser o Lys, Xaa 107 puede ser Phe, Leo o Pro, Xaa 1 08 puede ser Glu o Asp, Xaa 1 1 1 puede ser Gly o Asp, Xaa1 12 puede ser Gly, Asp o Val, Xaa 1 1 8 puede ser Leu o Gly, Xaa131 puede ser Ala, Gly o Arg, Xaa132 puede ser Ala o Ser, Xaa136 puede ser Met o Me, Xaa 138 puede ser Ar, Trp o Qln, Xaa 1 39 puede ser Arg o Gln, Xaa 142 puede ser Leu o Val, o Xaa 145 puede ser Gly o Glu. En modalidades preferidas, la proteína objetivo incluye la secuencia de leptina madura, de longitud completa. Las secuencias nucleótidas que codifican y las secuencias amino acidas que definen proteínas de leptina humana y murina, se establecen en las SEQ ID NOS: 1 -4. Las proteínas objetivo aquí expuestas se expresan como proteínas de fusión con una región de Fe de una inmunoglobulina. Como se sabe, cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los dominios se nombran en secuencia como sigue: CH 1 -articulación-CH2-CH3-(-CH4). Las secuencias de ADN de los dominios de cadena pesada tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo, el dominio de CH2 de IgG es homólogo del dominio CH2 de IgA e IgD, y del dominio CH3 de IgM e IgE. Según se utiliza en la presente, se entiende que el término "región de Fe de inmunoglobulina" significa la porción de terminal carbóxilo de una región constante de cadena de inmunoglobuiina, preferentemente una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina o una porción de la misma. Por ejemplo, una región de Fe de inmunoglobulina puede comprender 1 ) un dominio de CH1 , un dominio de CH2 y un dominio de CH3, 2) un dominio de CH 1 y un dominio de CH2, 3) un dominio de CH 1 y un dominio de CH3, 4) un dominio de CH2 y un dominio de CH3, o 5) una combinación de dos o más dominios y una región de articulación de inmunoglobulina. En una modalidad preferida, la región de Fe de inmunoglobulina comprende al menos una región de articulación de inmunoglobulina, un dominio de CH2 y un dominio de CH3 y preferentemente carece del dominio de CH 1 . La clase de inmunoglobulina, a partir de la cual se deriva la región constante de cadena pesada, actualmente preferida, es IgG (Ig?) (subclases ?1 , 2, 3 o 4). Las secuencias nucleótida y amino acida de Fe humano ?-1 se establecen en las SEQ ID NOS: 5 y 6. Las secuencias nucleótida y amino acida de Fe murino ?-2 se establecen en las SEQ ID NOS: 7 y 8. Pueden utilizarse otras clases de inmunoglobulina, IgA (Iga), IgD (Igd), IgE (Ige) e IgM (Igµ). La elección de las regiones constantes de cadena pesada, de inmunoglobulina, apropiadas, se discute en detalle en las Patentes de E. U. Nos. 5,541 ,087 y 5,726,044. La elección de las secuencias de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, particulares, de ciertas clases y subclases de inmunoglobulina para lograr un resultado en particular, se considera dentro del nivel del experto en la materia. La porción de la construcción de ADN que codifica la región de Fe de inmunoglobulina preferentemente comprende al menos una porción de un dominio de articulación y preferentemente al menos una porción de un dominio de CH3 de Fc? o los dominios homólogos en cualquiera de IgA, IgD, IgE o IgM. Dependiendo de la aplicación , pueden utilizarse genes de región constante de especies diferentes a la humana, por ejemplo, ratón o rata. La región de Fe de inmunoglobulina utilizada como un socio de fusión en la construcción de ADN generalmente puede ser de cualquier especie mamífera . Cuando no es deseable producir una respuesta inmune en la célula o animal huésped contra la región de Fe, la región de Fe puede derivarse de la misma especie que la célula o animal huésped. Por ejemplo, una región de Fe de inmunoglobulina humana puede utilizarse cuando el animal o célula huésped es humano; de igual modo, una región de Fe de inmunoglobulina murina puede utilizarse cuando el animal o célula huésped sea un ratón. Las secuencias de ácido nucleico que codifican y las secuencias amino acidas que definen regiones de Fe de inmunoglobulina humana y murina, útiles en la práctica de la invención, se establecen en las SEQ ID NOS: 5-8. Sin embargo, se contempla que otras secuencias de región de Fe de inmunoglobulina útiles en la práctica de la invención pueden encontrarse, por ejemplo, por aquellos codificados por secuencias nucleótidas expuestas en las bases de datos del Genbank y/o EMBL, por ejemplo, AF045536.1 (Macaca fuscicularis), AF045537.1 (Macaca mulatta), AB01671 0 (Félix catus), K00752 (Oryctolagus cuniculus), U03780 (Sus scrofa), Z48947 (Camelus dromedarius), X62916 (Bos taurus), L07789 (Mustela vison), X69797 (Ovis aries), U1 7166 (Cricetulus migratorius), X07189 (Rattus rattus), AF57619.1 (Trichosurus vulpécula) o AF0351 95 (Monodelphis domestica), las exposiciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia . Además, se contempla que la substitución u omisión de amino ácidos dentro de las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, pueden ser útiles en la práctica de la invención . Un ejemplo sería introducir substituciones amino acidas en la región de CH2 superior para crear una variante de Fe con afinidad reducida para receptores de Fe (Colé et al. (1 997) J. IMMUNOL. 1 59: 361 3). Cualquiera de experiencia ordinaria en la materia puede preparar tales construcciones mediante el uso de técnicas de biología molecular muy conocidas. El uso de Fc?1 humano como la secuencia de región de Fe tiene varias ventajas. Por ejemplo, si la proteína de fusión de Fe está por utilizarse como un biofarmacéutico, el dominio de Fc?1 puede otorgar actividades de función efectora a la proteína de fusión. Las actividades de función efectora incluyen las actividades biológicas tales como transferencia placental y vida media incrementada del suero. La región de Fe de inmunoglobulina también proporciona la detección mediante ELISA de anti-Fc y purificación a través de vinculación a proteína A de Staphylococcus aureus ("Proteína A"). Sin embargo, en ciertas aplicaciones, puede ser deseable omitir las funciones efectoras específicas de la región de Fe de inmunoglobulina, tales como vinculación al receptor de Fe y/o fijación del complemento. En las proteínas de fusión de la invención, las regiones de Fe de inmunoglobulina facilitan el doblez apropiado de la proteína de leptina para producir proteínas de leptina activa y también impartir solubilidad a los elementos activos, al menos en el medio extracelular. Ya que la región de Fe de inmunoglobulina es hidrofílica, la proteína de fusión que contiene leptina es soluble a diferencia de las contrapartes de leptina expresadas en un huésped bacteriano. DiMarchi eí al. (Patente de E. U. No. 5,71 9,266) mejoró la solubilidad de la leptina al mutar ciertos residuos amino ácidos en aspartatos o glutamatos, disminuyendo así el punto isoeléctrico (pl) de la leptina desde 5.84 hasta por debajo de 5.5. El uso de la región de Fe como un socio de fusión reduce la necesidad de crear muteínas de leptina con un pl inferior, debido a que Fe se glicosila y se carga altamente a un pl fisiológico y, por lo tanto, actúa como un vehículo para solubilizar la leptina. Como resultado, la proteína de fusión que contiene leptina es completamente soluble en soluciones acuosas, por ejemplo, vehículos farmacéuticamente aceptables. Se entiende que la presente invención explota metodologías convencionales de ADN recombinante para generar las proteínas de fusión de Fe útiles en la práctica de la invención. Las construcciones de fusión de Fe preferentemente se generan en el nivel de ADN y los ADNs resultantes se integran en los vectores de expresión y se expresan para producir las proteínas de fusión de la invención. Según se utiliza en la presente, se entiende que el término "vector" significa cualquier ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida competente para incorporarse en una célula huésped y para recombinarse con e integrarse en el genoma de la célula huésped o para reproducirse de manera autónoma como un episoma. Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidas, fagomidas, cósmidas, vectores de ARN, vectores virales y lo similar. Los ejemplos no limitantes de un vector viral incluyen un retrovirus, un adenovirus y un virus adeno-asociado. Según se utiliza en la presente, se entiende que el término "expresión genética" o "expresión" de una proteína objetivo significa la transcripción de una secuencia de ADN , la traslación de la transcripción de mARN y la secreción de un producto de proteína de fusión de Fe. Un vector de expresión útil es pdCs (Lo ef al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 1 1 : 495, la exposición de lo cual se incorpora en la presente para referencia), en el cual la transcripción del gen Fc-X utiliza el mejorador/promotor del citomegalovirus humano y la señal de poliadenilación SV40. La secuencia mejoradora y promotora del citomegalovirus humano utilizado, se derivó de nucleótidos -601 a +7 de ia secuencia proporcionada en Boshart ef al. (1985) CELL 41 : 521 , la exposición de lo cual se incorpora en la presente para referencia. El vector también contiene el gen de reductasa de dihidrofolato mutante como un marcador de selección (Simonsen y Levinson (1983) PROC. NAT. ACAD. SCI. USA 80: 2495, la exposición de lo cual se incorpora en la presente para referencia). Una célula huésped apropiada puede transformarse o transfectarse con la secuencia de ADN de la invención y utilizarse para la expresión y/o secreción de la proteína objetivo. Las células huéspedes actualmente preferidas para utilizarse en la invención, incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma de NS/O, 293 células, células de ovario de Hámster Chino, células de HELA y células de COS. Un sistema de expresión que se ha utilizado para producir una expresión de alto nivel de las proteínas de fusión en células mamíferas es una construcción de ADN que codifica, en la dirección 5' a 3', un cassette de secreción , incluyendo una secuencia de señal y una región de Fe de inmunoglobulina y una proteína objetivo. Varias proteínas objetivo se han expresado con éxito en tal sistema e incluyen, por ejemplo, IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, ßlG-H3, Receptor de IgE, PSMA y gp120. Estas construcciones de expresión se exponen en las Patentes de E.U. Nos. 5,541 ,087 y 5,726,044 de Lo ef al. , las exposiciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Según se utiliza en la presente, se entiende que el término "secuencia de señal" significa un segmento que dirige la secreción de la proteína de fusión de leptina y después de eso se disocia después de la traslación en la célula huésped. La secuencia de señal de la invención es un polinucleótido que codifica una secuencia amino acida que inicia la transportación de una proteína a través de la membrana de la retícula endoplásmica. Las secuencias de señal que son útiles en la invención incluyen secuencias de señal de cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo 14.1 8 (Gillies ef al. (1 989) J. IMMUNOL. METH. 125: 191 ), secuencias de señal de cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, la secuencia de señal de cadena pesada de anticuerpo MOPC141 (sakano ef al. (1 980) NATURE 286: 5774) y cualquier otra secuencia de señal que se conozca en la materia (ver, por ejemplo, Watson (1 984) NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12:5141 ). Cada una de estas referencias se incorpora en la presente para referencia. Las secuencias de señal se han caracterizado bien en la materia y se sabe típicamente que contienen de 16 a 30 residuos amino ácidos y pueden contener más o menos residuos amino ácidos. Un péptido de señal típico consiste en tres regiones: una región de terminal N básica, una región hidrofóbica central y una región de terminal C más polar. La región hidrofóbica central contiene de 4 a 1 2 residuos hidrofóbicos que anclan el péptido de señal a través de la bicapa lípida de membrana durante la transportación del polipéptido naciente. Después del inicio, el péptido de señal normalmente se disocia dentro del lumen de la retícula endoplásmica mediante enzimas celulares conocidas como peptidasas de señal. Los sitios de disociación potencial del péptido de señal generalmente siguen la "regla (-3, -1 )". Por lo tanto, un péptido de señal típico tiene pequeños residuos amino ácidos neutrales en posiciones -1 y -3 y carece de residuos de prolínea en esta región. La peptidasa de señal disociará tal péptido de señal entre los amino ácidos -1 y +1 . Por lo tanto, la secuencia de señal puede disociarse del término amino de la proteína de fusión durante la secreción. Esto da como resultado la secreción de una proteína de fusión de Fe que consiste en la región de Fe de inmunoglobulina y la proteína objetivo. Una discusión detallada de las secuencias de péptido de señal se proporciona por von Heijne (1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14: 4683, la exposición de lo cual se incorpora en la presente para referencia. Como sería aparente a cualquiera de experiencia ordinaria en la materia, lo apropiado de una secuencia de señal en particular, para utilizarse en la cassette de secreción, puede requerir de cierta experimentación de rutina. Tal experimentación incluirá la determinación de la habilidad de fa secuencia de señal para dirigir la secreción de una proteína de fusión de Fe y también una determinación de la configuración óptima, genómica o cADN, de la secuencia a utilizarse con objeto de lograr la secreción eficiente de las proteínas de fusión de Fe. De manera adicional, un experto en la materia es capaz de crear un péptido de señal sintético siguiendo las reglas presentadas por von Heijne, arriba referido, y probando la eficacia de tal secuencia de señal sintética mediante experimentación de rutina. Una secuencia de señal también puede ser referida como un "péptido de señal", "secuencia líder" o "péptidos líderes". La fusión de la secuencia de señal y la región de Fe de inmunoglobulina es algunas veces referida en la presente como cassette de secreción. Una cassette de secreción ejemplificativa en la práctica de la invención es un polinucleótido que codifica, en una dirección 5' a 3', una secuencia de señal de un gen de cadena ligera de inmunoglobulina y una región de Fc?l del gen ?1 de inmunoglobulina humano. La región Fc?l del gen de Fc?l de inmunoglobulina preferentemente incluye al menos una porción del dominio de articulación de inmunoglobulina y al menos el dominio de CH3, o más preferentemente al menos una porción del dominio de articulación, el dominio de CH2 y el dominio de CH3. Según se utiliza en la presente, se entiende que la "porción" de la región de articulación de inmunoglobulina significa una porción de la articulación de inmunoglobulina que contiene al menos uno, preferentemente dos, residuos de cisteínas capaces de formar uniones de disulfuro de intercadena. El ADN que codifica la cassette de secreción puede encontrarse en esta configuración genómica o su configuración de cADN. Bajo ciertas circunstancias, puede ser ventajoso producir la región de Fe a partir de secuencias de cadena pesada de Fc?2 de inmunoglobulina humana. Aunque las fusiones de Fe en base a secuencias de ?1 y ?2 de inmunoglobulina humana se comportan de manera similar en los ratones, las proteínas de fusión en base a las secuencias de ?2 pueden mostrar farmacocinéticas superiores en humanos. En otra modalidad, la secuencia de ADN codifica un sitio de disociación proteolítica interpuesto entre ia cassette de secreción y la proteína objetivo. Un sitio de disociación proporciona la disociación proteolítica de la proteína de fusión codificada, separando así el dominio de Fe de la proteína objetivo. Según se utiliza en la presente, se entiende que "sitio de disociación proteolítica" significa secuencias amino acidas que se disocian preferentemente por una enzima proteolítica u otros agentes de disociación proteolítica. Los sitios de disociación proteolítica útiles incluyen secuencias amino acidas que se reconocen por enzimas proteolíticas tales como tripsina, plasmina o enteroquinasa K. Se conocen muchos pares de sitio de disociación/agente de disociación. Ver, por ejemplo, la Patente de E.U. No. 5,726,044, la exposición de la cual se incorpora en la presente para referencia. En los Ejemplos aquí expuestos, se producen niveles elevados de proteínas de fusión de Fc-Leptina. Las clonas iniciales produjeron aproximadamente 50 µl/mL de Fc-Leptina, la cual podría purificarse fácilmente hasta la homogeneidad mediante cromatografía de Proteína A. Los niveles de expresión con frecuencia pueden incrementarse varias veces mediante subclonación. Además, las proteínas de fusión de Fc-Leptina podrían disociarse y purificarse de manera adicional, por ejemplo, mediante purificación por afinidad . Como se estableció arriba , se encuentra que cuando la leptina se expresa como moléculas de fusión de Fe, se obtienen elevados niveles de expresión, presumiblemente debido a que la porción de Fe actúa como un vehículo, ayudando a que el polipéptido en el término C se doble correctamente y se segregue de manera eficaz. Además, la región de Fe se glicosila y carga de manera elevada a un pH fisiológico, así, la región de Fe puede ayudar a solubilizar las proteínas hidrofóbicas. Además de los niveles elevados de expresión, las proteínas de fusión de leptina exhibieron vidas medias del suero más largas en comparación con leptina sola, debido en parte a sus tamaños de molécula mayores. Por ejemplo, el Fe murino-leptina murina tiene una vida media en circulación de 8.8 horas en el ratón, en comparación con 18 minutos para leptina murina (ver, Ejemplo 14 a continuación). La leptina, que tiene un peso molecular de aproximadamente 16 kD, es lo suficiente pequeña para eliminarse de manera eficaz mediante filtración renal. En contraste, la proteína de fusión de Fc-Leptina tiene un peso molecular de aproximadamente 90 kD ya que existen dos elementos de leptina, cada uno unido a una región de Fe de inmunoglobulina, en donde las regiones de Fe se unen de manera covalente entre sí. Tal estructura dimérica debe exhibir una mayor afinidad de vinculación al receptor de leptina, la secuencia del cual sugiere que incluye dos dominios de vinculación a ligando (Tartaglia ef al. (1995) CELL 83: 1 263). Ya que la actividad de la leptina parece mediarse por receptor, las proteínas de fusión de leptina serán potencialmente más eficaces que la leptina en sí.

De manera adicional, se sabe que muchos ligandos de proteína se unen a sus receptores como un dímero. Si la leptina pertenece a la clase de ligandos de proteína dimérica, el constreñimiento físico impuesto por la región de Fe de inmunoglobulina en la leptina haría de la dimerización un proceso intramolecular, desplazando así el equilibrio a favor del dímero y mejorando su vinculación a su receptor. Los residuos de cisteína también pueden introducirse mediante tecnología recombinante de ADN estándar en el monómero, en lugares apropiados, para estabilizar el dímero a través de una formación de unión de disulfuro covalente. Las proteínas de fusión de la invención proporcionan varios beneficios clínicos importantes. Como se demostró en el modelo de ratón ob/ob, una inyección intraperitoneal o subcutánea de 0.1 mg/kg/día de leptina murina en la forma de muFc-muLeptina fue suficiente para lograr reducciones comparables en el peso corporal cuando se compara con los 5 a 20 mg/kg/día de leptina producida bacterianamente (Pelleymounter ef al. (1995) SCIENCE 269: 540; Hallas ef al. (1 995) SCIENCE 269: 543; Chebab et al. (1996) NATURE GENETICS 12: 318; Mounzih ef al. (1997) ENDOCRINOLOGY 138: 1 190). La frecuencia de la inyección podría recortarse a tres veces por semana si se utilizara una dosis de 0.25 mg/kg. Además, los ratones ob/ob inyectados diariamente con 0.25 mg/kg/ de muFc-muLeptina durante cuatro meses aún respondieron favorablemente al tratamiento, sin efectos colaterales detectables. No obstante los ratones permanecieron muy saludables, con apetito disminuido y termogénesis y actividades locomotoras incrementadas. A la luz de estos resultados, la habilidad para construir las diversas conformaciones estructurales de la Fc-Leptina de la invención, proporciona moléculas que pueden demostrar eficacia mejorada sobre la proteína de anti-obesidad nativa. Cuando las proteínas de fusión de la invención se administran mediante inyección a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg/día durante 5 días a un ratón ob/ob que tiene un peso corporal inicial de al menos aproximadamente 50 gramos, se induce aproximadamente un 10% (aproximadamente 5 gramos), más preferentemente aproximadamente un 12% (aproximadamente 6 gramos) o incluso más preferentemente aproximadamente un 1 5% (aproximadamente 7.5 gramos) de pérdida del peso corporal inicial. Más preferentemente, cuando las proteínas de fusión de la invención se administran mediante inyección a una dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg/día durante 5 días a un ratón ob/ob que tiene un peso corporal inicial de al menos aproximadamente 50 gramos, se induce aproximadamente un 10% (aproximadamente 5 gramos), más preferentemente aproximadamente un 12% (aproximadamente 6 gramos) o incluso más preferentemente aproximadamente un 15% (aproximadamente 7.5 gramos) de pérdida del peso corporal inicial. Tales dosis preferentemente dan como resultado una reducción de 10-20% en el peso corporal. Otra modalidad de la presente invención proporciona construcciones que tienen diversas conformaciones estructurales, por ejemplo, construcciones bivalentes o multivalentes, construcciones diméricas o multiméricas y combinaciones de las mismas. Tales conformaciones funcionales de moléculas de la invención permiten que se explore el efecto sinergístico de la leptina y otras proteínas de anti-obesidad en modelos animales. directamente con obesidad, de una cantidad eficaz de una composición de la invención. Las proteínas de la invención no solamente son útiles como agentes terapéuticos, sino que un experto en la materia reconoce que las proteínas son útiles en la producción de anticuerpos para uso diagnóstico. De igual modo, por ejemplo, la administración apropiada de ADN o ARN en el vector u otro sistema de suministro para tales usos, se incluye en los métodos de uso de la invención. Además, las construcciones de la invención son útiles para controlar el peso con propósitos cosméticos en mamíferos. Un propósito cosmético busca controlar el peso de un mamífero para mejorar la apariencia corporal. El mamífero no es necesariamente obeso. Tal uso cosmético forma parte de la presente invención. Además, el uso de Fc-Leptinas derivadas de otros mamíferos, por ejemplo, bovina y porcina, es útil para elevar animales flacos para carne de consumo. No se sabe si la proteína de fusión de Fc-Leptina puede cruzar la barrera de sangre-cerebro para alcanzar el receptor en el hipotálamo. Si la proteína de fusión de Fc-Leptina no cruza la barrera sangre-cerebro, entonces su eficacia superior como un agente de anti-obesidad sugiere un nuevo mecanismo de acción o que existen receptores de leptina fuera del cerebro. Como una proteína de fusión con la región de Fe de inmunoglobulina, la proteína de fusión de Fc-Leptina puede tener una distribución de tejido muy favorable y un modo de acción ligeramente diferente para lograr la eficacia clínica e incluso superar la resistencia de la leptina especialmente en vista de su larga vida media del suero y la dosis elevada de proteína soluble que puede administrarse. Los datos de inyecciones subcutáneas en ratones sugieren que las inyecciones intramusculares en humanos deben ser igualmente exitosas. También puede ser deseable administrar la proteína de fusión de Fc-Leptina como un rocío nasal, preparación inhalada, parche dérmico o gota ocular. Si la proteína de fusión de Fc-Leptina está por administrarse como una preparación inhalada, es útil formular la proteína de fusión a fin de que se agregue en pequeñas partículas que puedan experimentar trans-citosis a través de la epitelia del pulmón. Las construcciones de ADN (o construcciones genéticas) de la invención también pueden utilizarse como parte de un protocolo de terapia genética para suministrar ácidos nucleicos que codifican leptina o una construcción de proteína de fusión de la misma. La invención caracteriza vectores de expresión para la transfección y expresión in vivo de leptina o una construcción de proteína de fusión de la misma en tipos de célula en particular, a fin de reconstituir o complementar la función de la leptina. Las construcciones de expresión de leptina o construcciones de proteína de fusión de la misma, pueden administrarse en cualquier vehículo biológicamente eficaz, por ejemplo, cualquier formulación o composición capaz de suministrar de manera eficaz el gen de leptina o construcción de proteína de fusión del mismo, a células in vivo. Los enfoques incluyen la inserción del gen sujeto en vectores virales que incluyen retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-asociados y virus-1 simplex de herpes o plásmidas eucarióticas o bacterianas recombinantes. Se contempla que las composiciones de la presente invención pueden proporcionarse a un animal mediante cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, de manera local, como mediante inyección, implantación o administración tópica a un sitio de tejido) o sistémicamente (por ejemplo, de manera parenteral u oral). Cuando la composición se proporciona de manera parenteral, tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o mediante aerosol, la composición preferentemente comprende parte de una suspensión o solución de fluido acuoso o fisiológicamente compatible. Por lo tanto, el vehículo o portador es fisiológicamente aceptable a fin de que, además de suministrar la composición deseada al paciente, no afecte negativamente de otro modo al equilibrio de electrolitos y/o volumen del paciente. El medio de fluido para el agente puede comprender así solución salina fisiológica normal. Las dosis preferidas por administración de las proteínas de fusión de la invención se encuentran dentro del rango de 50 ng/m2 a 1 g/m2, más preferentemente 5 µg/m2 hasta 200 mg/m2 y más preferentemente 100 µg/m2 hasta 10 mg/m2. Las dosis preferidas por administración de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la invención se encuentran dentro del rango de 1 µg/m2 hasta 100 mg/m2, más preferentemente 20 µg/m2 hasta 10 mg/m2 y más preferentemente 400 µg/m2 hasta 4 mg/m2. Sin embargo, se contempla que los modos y dosis óptimos de administración pueden determinarse mediante experimentación de rutina bastante dentro del nivel de experiencia en la materia. La invención se ilustra de manera adicional mediante los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS Ejemplo 1 . Expresión de muFc-muLeptina Se preparó una muestra de mARN a partir de las células grasas de un ratón normal C57/BL6 y la transcriptasa inversa de mARN mediante el uso de transcriptasa inversa. El cADN resultante se utilizó como un templado para una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para clonar y adaptar el cADN de leptina murina para su expresión como una proteína de fusión de muFc-muLeptina. La materia prima de avance fu 5' C CCG GGT AAA GTG CCT ATC CAG AAA GTC C (SEQ ID NO: 9), donde la secuencia CCCGGG (sitio de restricción Xmal) seguida por TAAA codifica el término carboxi de la cadena pesada de inmunoglobulina. La secuencia en letras negritas codifica el término N de la leptina murina. La materia prima inversa fue 5' CTC GAGTCA GCA TTC AGG GCT AAC ATC (SEQ ID NO: 10), la cual codifica la secuencia terminal C de leptina con su codón de DETENCIÓN de traslación (anticodón, TCA) y fue seguido por un sitio Xhol (CTCGAG). El producto de PCR de 450 pares base resultante se clonó y ordenó en secuencia. El análisis secuencial confirmó que el producto codificó leptina murina madura adaptada para su expresión, es decir, con un sitio Xmal en su extremo 5' y un sitio Xhol en su extremo 3'. El vector de expresión pdCs-muFc-muLeptina se construyó como sigue. El fragmento de restricción Xmal-Xhol que contiene cADN de leptina murina se ligó entonces al fragmento Xmal-Xhol del vector de pdCs-muFc de acuerdo a Lo et al. (PROTEIN ENGINEERING (1998) 1 1 : 495). muFc es el fragmento de Fe murina de la ?2a de inmunoglobulina murina. El vector resultante, pdCs-muFc-muLeptina, se utilizó para transfectar células mamíferas para la expresión de muFc-muLeptina. Ejemplo 2. Transfección v Expresión de Proteína Para la transfección transitoria , la plásmida se introdujo en 293 células de riñon humano mediante coprecipitación de ADN de plásmida con fosfato de calcio (Sambrook ef al. (1989) "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY) o mediante lipofección mediante el uso de Lipofectamina Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con objeto de obtener clonas establemente transfectadas, el ADN de plásmida se introdujo en las células NS/0 del mieloma de ratón, mediante electroporación. Las células NS/0 crecieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco, complementado con 10% de suero bovino no nato, 2 mM de glutamina y penicilina/estreptomicina. Aproximadamente 5x106 células se enjuagaron una vez con PBS y se volvieron a suspender en 0.5 ml de PBS. Diez µg de ADN de plásmida linealizada se incubaron entonces con las células en una Cubeta Pulsadora Genética (0.4 cm de espacio de electrodo, BioRad) en hielo durante 10 minutos. La electroporación se llevó a cabo mediante el uso de un Pulsador Genético (BioRad, Hercules, CA) con fijaciones a 0.25 V y 500 µF. Las células se permitieron recuperar durante 10 minutos en hielo, después de lo cual se volvieron a suspender en medio de crecimiento y después se colocaron en placas de 96 cavidades. Las clonas establemente transfectadas se seleccionaron por crecimiento en presencia de 100 nM de metotrexato (MTX), el cual se introdujo dos días después de la transfección . Las células se alimentaron cada 3 días durante dos o tres veces más, y las clonas resistentes a MTX aparecieron en 2 o 3 semanas. Los sobrenadantes de las clonas se ensayaron mediante ELISA de anti-Fc para identificar productores elevados. Las clonas de producción elevada se aislaron y propagaron en medio de crecimiento que contiene 100 nM de MTX. Para la caracterización de rutina mediante electroforesis de gel, las proteínas de fusión de Fe en el medio acondicionado se capturaron en Sefarosa de Proteína A (Repligen, Cambridge, MA) y después se levigaron mediante ebullición en el regulador de muestra de proteína con o sin 2-mercaptoetanol. Después del fraccionamiento mediante electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), las bandas de proteína se visualizaron mediante teñido con Coomassie. La muFc-muLeptina tuvo un MW aparente de aproximadamente 50 kD a través de SDS-PAGE. Para su purificación, las proteínas de fusión se unieron a Sefarosa de Proteína A seguidas por levigación en un regulador de fosfato de sodio (100 mM de NaH2PO , pH 3, y 150 mM de NaCI). El levigado se neutralizó inmediatamente con 0.1 volumen de 2 M de Tris-hidrocloruro, pH 8. Ejemplo 3. Procedimientos de ELISA Los ELISAs se utilizaron para determinar las concentraciones de productos de proteína en los sobrenadantes de clonas resistentes a MTX y otras muestras de prueba. Las cantidades de proteínas que contienen Fe humano y Fe murino se determinaron mediante el ELISA de anti-huFc y el ELISA de anti-muFc, respectivamente. El ELISA de anti-huFc se describe en detalle a continuación: A^ Placas de recubrimiento. Las placas de ELISA se cubrieron con IgG anti-Humano de Oveja AffiniPure (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) a 5 µg/mL en PBS, y 100 µL/cavidad en placas de 96 cavidades (placa Nunc-lmmuno Maxisorp). Las placas recubiertas se cubrieron e, incubaron a 4°C durante la noche. Las placas se enjuagaron después 4 veces con 0.05% de Tween (Tween 20) en PBS, y se bloquearon con 1 % de BSA/1 % de suero de oveja en PBS, 200 µL/cavidad. Después de la incubación con el regulador de bloqueo a 37°C durante 2 horas, las placas se enjuagaron 4 veces con 0.05% de Tween en PBS y se secaron por derivación en toallas de papel. B. Incubación con muestras de prueba v anticuerpo secundario Las muestras de prueba se diluyeron en las concentraciones adecuadas en regulador de muestra, el cual contiene 1 % de BSA/1 % de suero de oveja/0.05% de Tween en PBS. Se preparó una curva estándar con un anticuerpo quimérico (con un Fe humano), la concentración del cual se conoce. Para preparar una curva estándar, se elaboran diluciones seriales en el regulador de muestra para dar una curva estándar que varía desde 125 ng/mL hasta 3.9 ng/mL- Las muestras diluidas y estándares se agregaron a la placa, 100 µL/cavidad, y la placa se incubó a 37°C durante 2 horas. Después de la incubación, la placa se enjuagó 8 veces con 0.05% de Tween en PBS. A cada cavidad se agregaron entonces 100 µL del anticuerpo secundario, el IgG anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research), diluido aproximadamente 1 : 120,000 en regulador de muestra. La dilución exacta del anticuerpo secundario debe determinarse para cada lote del IgG anti-humano conjugado con HRP. Después de la incubación a 37°C durante 2 horas, la placa se enjuagó 8 veces con 0.05% de Tween en PBS. C. Desarrollo La solución de substrato se agregó a la placa a 100 µL/cavidad. La solución de substrato se preparó mediante la disolución de 30 mg de OPD (dihidrocloruro de o-fenilenodiamina, 1 tableta) en 15 mL de 0.025 M de ácido cítrico/0.05 M de regulador de Na2HPO4, pH 5, el cual contiene 0.03% de H2O2 recién agregado. El color se permitió desarrollar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la obscuridad. El tiempo de desarrollo está sujeto a cambios, dependiendo de la variabilidad de lote a lote de las placas recubiertas, el anticuerpo secundario, etc. Se observa el desarrollo de color en la curva estándar para determinar cuando detener la reacción. La reacción se detuvo mediante la adición de 4N de H2SO , 100 µL/cavidad. La placa se leyó mediante un lector de placa, el cual se estableció tanto en 490 como en 650 nm y se programó para substraer el OD anterior a 650 nm del OD a 490 nm. El procedimiento para el ELISA de anti-muFc fue similar, excepto que la placa de ELISA se cubrió con IgG anti-murino de Oveja AffiniPure (H+L) (Jackson Immuno Research) a 5 µg/mL en PBS, y 100 µL/cavidad; y el anticuerpo secundario fue anti-mulgG de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology Assoc , Birmingham, AL), utilizado en una dilución de 1 en 5000. Ejemplo 4. Expresión de huFc-huLeptina cADN de Quick-Clone de Célula Grasa Humana (Clontech, Palo Alto, CA) se utilizó como un templado para PCR a fin de clonar y adaptar cADN de leptina humana para su expresión como una proteína de fusión de huFc-huLeptina. La materia prima de inicio fue 5' C CCG GGT AAA GTG CCC ATC CAÁ AAA GTC CA (SEQ ID NO: 1 1 ), donde la secuencia C CCG GGT AAA (SEQ ID NO: 1 2) codifica en término carboxi de la cadena pesada de inmunoglobulina, seguida por la secuencia (en letras negritas) que codifica el término N maduro de leptina. La secuencia C CCG GG es sitio de restricción Xmal introducido mediante mutación silenciosa (Lo ef al. , (1998) PROTEIN ENGINEERING 1 1 : 495). La materia prima inversa fue 5' CTC GAGTCA GCA CCC AGG GCT GAG GTC (SEQ ID NO: 13), la cual codifica la secuencia de anti-detección del término carbóxilo de leptina con su codón de DETENCIÓN de traslación (anticodón, TCA) y esto fue seguido por un sitio Xhol (CTCGAG). El producto de PCR resultante de 450 pares base se clonó y ordenó en secuencia. El análisis secuencial confirmó que el producto codificó leptina humana madura adaptada para su expresión , es decir, con un sitio Xmal en su extremo 5' y un sitio Xhol en su extremo 3'. El vector de expresión pdCs-huFc-huLeptina se construyó como sigue. El fragmento de restricción que contiene el cADN de leptina humana se ligó al fragmento Xmal-Xhol del vector de pdCs-huFc de acuerdo a Lo ef al. (PROTEIN ENGINEERING (1998) 1 1 : 495). huFc es el fragmento de Fe humano de la ?1 de inmunoglobulina humana. El vector resultante, pdCs-huFc-huLeptina, se utilizó para transfectar células mamíferas para la expresión de huFc-huLeptina. Ejemplo 5. Construcción de vectores de expresión para muLeptina-muFc y muLeptina-Gly-Ser-enlazador-muFc El cADN de leptina murina se adaptó para su expresión como proteína de fusión de muLeptina-muFc mediante PCR. La materia prima de avance, 5' C TTA AG C GTG CCT ATC CAG AAA GTC CA (SEQ ID NO: 14), introdujo un sitio Aflll (CTTAAG) para ligar la secuencia de cADN que codifica el término maduro N de leptina murina (secuencia en letras negritas) al ADN que codifica el péptido de señal. La materia prima inversa, 5' GA T A TC GCA TTC AGG GCT AAC ATC (SEQ ID NO: 1 5), introdujo un sitio EcoRV inmediatamente corriente abajo de la secuencia que codifica el término carbóxilo de la leptina murina sin el codón de DETENCIÓN (secuencia de anti-detección en legras negritas). El sitio de EcoRV sirvió como un enlazador-adaptador para una fusión en estructura de la leptina murina con el Fe murino, como se discute a continuación. El producto de PCR de 450 pares base resultante se clonó y ordenó en secuencia por completo. El fragmento de AflIl-EcoRV que codifica la leptina murina madura se utilizó entonces para la construcción del vector de expresión de pdCs-muLeptina-muFc. El producto de ligación del fragmento AflIl-EcoRV que codifica la leptina murina madura y el fragmento Xbal-Aflll que codifica el péptido de señal de una cadena ligera de inmunoglobulina (Lo ef al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 1 1 : 495) se subclonó. El fragmento de Xbal-EcoRV resultante codifica el péptido de señal seguido por la leptina murina madura sin el codón de DETENCIÓN. Para adaptar un sitio de EcoRV al extremo 5' del ADN de muFc, el producto de ligación del fragmento Aflll-Xhol que codifica el Fe murino (Lo ef al. (1 998) PROTEIN ENGINEERING 1 1 :495) y el siguiente enlazador-adaptador se subclonó en un vector de clonación de EcoRI- Xhol. Extremo pegajoso de EcoRI 5' AATTC GA T A TC (SEQ ID NO: 16) 3' G CTA TAG AATT (SEQ ID NO: 1 7) Extremo pegajoso de Aflll El enlazador-adaptador anterior contiene extremos pegajosos EcoRI y Aflll y también contiene un sitio de EcoRV (GA TA TC). Después de la subclonación, se aisló un fragmento de EcoRV-Xhol que codifica el fragmento de muFc con un codón de DETENCIÓN. Este fragmento se ligó después con el fragmento Xbal-EcoRV que codifica el péptido de señal y la leptina murina madura (arriba descrita) y el fragmento de vector de pdCs digerido por Xbal-Xhol. La plásmida de expresión resultante, designada pdCs, muLeptina-muFc, se utilizó para la transfección de células mamíferas. Para la construcción de pdCs-muLeptina-Gly-Ser-enlazador-muFc, el ADN de pdCs-muLeptina-muFc se alineó en el único sitio de EcoRV y el siguiente enlazador no fosforilado se insertó mediante ligación: 5' GGC GCA GGA GGT TCT GGC GGA TCC 3' (SEQ ID NO: 18) 3' CCG CGT CCT CCA AGA CCG CCT AGG 5' (SEQ ID NO: 19) La construcción correcta se confirmó por orden en secuencia de ADN para asegurar que se hubiera insertado la secuencia enlazadora correcta en la orientación apropiada. El vector resultante, pdCs-muLeptina-Gly-Ser-enlazador-muFc, se utilizó para la transfección de células mamíferas. Ejemplo 6. Niveles de expresión reducidos para muLeptina-muFc y muLeptina-Gly-Ser-enlazador-muFc Ya que el residuo de cisteína de terminal C de leptina se involucra en la vinculación de disulfuro intramolecular con cisteína 1 1 7, esto puede poseer un problema en el doblez de proteína y la subsecuente secreción si la leptina se elabora como una proteína de fusión de leptina-Fc. Para probar si este es de hecho el caso, los vectores de expresión para muLeptina-muFc y muLeptina-Gly-enlazador de Ser-muFc, se construyeron como se describe en el Ejemplo 5. La última construcción codifica un enlazador flexible rico en residuos de glicina y de serina interpuestos entre leptina y Fe a fin de permitir más libertad para la leptina a fin de formar la unión de disulfuro y doblarse correctamente. La expresión transitoria en 293 células se analizó mediante ELISA de anti-muFc y el análisis de Western blot mediante el uso tanto de anticuerpo de anti-muFc (anti-mulgG de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante, Fc?, de Jackson Immuno Research) y anticuerpo de anti-muLeptina (anticuerpo policlonal de leptina de anti-ratón bioestañado, de R & D Systems, Minneapolis, MN). Se detectaron niveles de expresión muy bajos en los sobrenadantes de cada construcción. El análisis de los usados celulares totales demostró que la mayoría del muLeptina-muFc y muLeptina-Gly-enlazador de Ser-muFc permanecieron en el interior de las células. Las clonas estables de NS/0 se aislaron. Los niveles expresados de mu Leptina-mu Fc (con o sin enlazador) fueron cuando mucho de aproximadamente 1 0% los de muFc-muLeptina. Además, estudios subsecuentes sugieren que la proteína de fusión de Leptina-Fc no fue tan activa in vivo como la proteína de fusión de Fc-Leptina (ver, figura 6). Cuando los ratones ob/ob se inyectaron de manera intraperitoneal con Leptina-Fc a 0.25 mg/kg/día, no se observó una pérdida de peso significativa. Es sorprendente que la Fc-Leptina fue más efectiva que la Leptina-Fc, debido a que estas proteínas de fusión contienen los mismos elementos y difieren solamente en el orden de los elementos en cada cadena de polipéptido. Ejemplo 7. Tratamiento de ratones ob/ob mediante invección intraperitoneal (IP) de muFc-muLeptina Ratones de ob7ob1 C57BL/6J de cinco a seis semanas de edad, que eran homozigosos para esta mutación del gen de obesidad (ratones ob/ob), se adquirieron en Jackson Laboratories, Barr Harbor, ME. Dos ratones por grupo recibieron ya sea muFc-muLeptina o solamente PBS. La muFc-muLeptina se disolvió en PBS y se administró diariamente (diariamente durante los primeros 1 2 días; y solamente de Lunes a Viernes en lo subsecuente) mediante inyecciones intraperitoneales. La cantidad de leptina inyectada se normalizó a 0.25 mg de leptina por kg de peso corporal de ratón . El grupo de control recibió solamente PBS. Todos los ratones se permitieron por acceso ad libitum acceso a alimento y agua y el peso corporal se midió diariamente antes de la inyección . Durante un periodo de 4 meses, el grupo de control (cuadrados en la Figura 3) tuvo un incremento continuo de 40% en peso corporal (desde 50 g hasta 70 g). El grupo que recibe la inyección intraperitoneai diaria de muFc-muLeptina tuvo un 45% de reducción en peso corporal (desde 50.5 g hasta 28 g) durante el primer mes, después de lo cual es peso corporal se estabilizó en aproximadamente 27-31 g (rombos en la figura 3). Ya que los ratones no recibieron tratamiento los fines de semana, sus pesos corporales se incrementaron hasta sobre 30 g los Lunes, pero el tratamiento diario originó una disminución continua en el peso corporal de hasta aproximadamente 27-28 g los Viernes. Como se mostró en la figura 3, la muFc-muLeptina mostró ser eficaz durante 4 meses. Observe que durante las primeras dos semanas de tratamiento, la ingesta de alimentos se encontró por debajo del límite de detección. Después de 3 a 4 semanas, cuando los pesos corporales habían disminuido hasta aproximadamente 30 g y el tejido adiposo aparentemente se había agotado, los ratones consumieron un promedio de aproximadamente 3 g de alimento por ratón diariamente. Esto es consistente con los resultados de Mounzih ef al. (Mounzih ef al. (1997) ENDOCRINOLOGY 1 38: 1 190), , el cual demostró que el consumo de alimentos de ratones ob/ob que reciben tratamiento con leptina a 20 mg/kg se resumió a aproximadamente 2.6-3.2 g el día 45. Ejemplo 8. Tratamiento de ratones ob/ob mediante invección subcutánea (SC) de muFc-muLeptina La inyección subcutánea de muFc-mu Leptina se encontró tan eficaz como la inyección intraperitoneal en la reducción de peso corporal de los ratones ob/ob. Ratones ob/ob (3 ratones por grupo) de cinco a seis semanas de edad se trataron con muFc-muLeptina diariamente (solamente de Lunes a Viernes) mediante inyección SC. Las cantidades de leptina inyectadas se normalizaron a 0.25 o 0.1 mg de leptina por kg de peso corporal del ratón. Se permitió el acceso ad libitum a todos los ratones al alimento y agua y el peso corporal se midió diariamente antes de la inyección. Después de 17 días, ios ratones que recibieron 0.1 y 0.25 mg de leptina/kg tuvieron una reducción de 14% y 22% en peso corporal, respectivamente, mientras que el grupo de control que recibió PBS tuvo un 15% de ganancia de peso. La disminución en la ingesta de alimentos en los ratones que recibieron inyecciones SC es similar a la de los ratones que recibieron inyecciones IP de dosis equivalentes. Ejemplo 9. Tratamiento de ratones ob/ob mediante invección intravenosa (IV) de muFc-muLeptina. La inyección intravenosa (IV) de muFc-muLeptina se encontró igualmente eficaz en la reducción de peso corporal de los ratones ob/ob. Ratones ob/ob (2 ratones por grupo) se trataron con inyecciones IV diarias de muFc-muLeptina a 0.25 o 1 mg de leptina por kg o PBS. Se permitió el acceso ad libitum al alimento y agua y el peso corporal se midió diariamente antes de la inyección. El tratamiento se detuvo después de 5 días, pero el peso corporal continuó registrándose diariamente. Como se muestra en la figura 4, el tratamiento con 0.25 y 1 mg/kg de leptina como muFc-muLeptina (triángulos y círculos, respectivamente) originó que el peso corporal disminuyera durante las siguiente 48 y 72 horas, respectivamente. Estos resultados sugieren que la muFc-muLeptina tuviera vida media en circulación mucho mayor que la leptina murina, en base a las dosis frecuentes, elevadas de leptina que se necesitan para reducir el peso corporal. Ejemplo 1 0. Tratamiento de ratones ob/ob con muFc-muLeptina 3 veces a la semana o una vez cada 4 días La figura 5 muestra el efecto de diferentes programas de dosis en el peso corporal de ratones ob/ob. Específicamente, un grupo de 3 ratones ob/ob (rombos sólidos) recibieron 0.25 mg/kg de leptina murina en la forma de muFc-muLeptina mediante inyecciones SC diariamente de Lunes a Viernes hasta el punto A; del punto A al punto B la frecuencia de inyección se redujo a solamente de Lunes a Viernes; en lo subsecuente, la frecuencia de inyección se incrementó a 3 veces por semana (Lunes, Miércoles y Viernes), otro grupo, que también consistió en 3 ratones ob/ob (cuadrados), recibió 0.1 mg/kg de leptina murina en la forma de muFc-muLeptina mediante inyecciones SC diariamente de Lunes a Viernes hasta el punto C; del punto C al punto D la frecuencia de inyección se redujo a 3 veces por semana (Lunes, Miércoles y Viernes); sin embargo, después del punto D, la dosis se incrementó a 1 mg/kg una vez cada 4 días. Un grupo de control de ratones ob/ob (triángulos) recibió PBS diariamente, de Lunes a Viernes. Se permitió el acceso ad libitum a todos los ratones al alimento y agua y el peso corporal se midió diariamente antes de la inyección . Como se muestra en la figura 5, 0.25 mg/kg de muFc- muLeptina inyectados SC tres veces a la semana (Lunes, Miércoles, y Viernes) fueron eficaces en la estabilización del peso corporal en aproximadamente 36 a 39 g durante 9 semanas y 1 mg/kg inyectado SC una vez cada 4 días dio como resultado una reducción de 51 g a 34 g en 4 semanas, después de lo cual el peso se estabilizó entre 30 hasta 33 g . Una programa de dosis de 0.1 mg/kg 3 veces a la semana fue ineficaz en la reducción del peso corporal. Estos resultados sugieren que las inyecciones diarias de muFc-muLeptina son innecesarias dado su efecto de larga duración cuando se inyectan en una dosis apropiada. Ejemplo 1 1 . Tratamiento de ratones flacos y ratones db/db con muFc-muLeptina Para su comparación con ratones ob/ob, ratones normales C57BL/6J, C57BL/KS y Balb/C y ratones diabéticos C57BL/KS db/db (todos adquiridos en Jackson Laboratories, Barr Harbor, ME) recibieron todos diariamente (de Lunes a Viernes) inyección intraperitoneal o subcutánea de muFc-muLeptina en PBS. Las cantidades de leptina inyectada se normalizaron hasta 0.25 mg o 1 mg de leptina por kg de peso corporal de ratón. Como se muestra en la Tabla 1 , muFc-muLeptina en ambos niveles de dosis no tuvo efecto en ratones db/db, los cuales carecen de receptor de leptina. En los ratones normales de C57BL/6J , C57BL/KS y Balb/C, la dosis baja tuvo un efecto muy modesto. Sin embargo, la dosis elevada dio como resultado una reducción significativa de peso corporal durante 19 días (Tabla 1 ), independiente a la edad del ratón.

Tabla 1 Cambio porcentual en el peso corporal de ratones (3 ratones por grupo) tratados con 0, 0.25 o 1 mg/kg de muFc-muLeptina mediante inyecciones intraperitoneales (I P) o subcutáneas (SC) diarias (de Lunes a Viernes) durante 19 días. Ruta Edad Vehículo 0.25 mg/kg 1 mg/kg ob/ob IP 2 meses + 14.7 -23.2 -1 7.4** db/db SC 2 meses +7.21 +6.78 +5.01 db/db IP 5 meses + 1 .82 +5.66 +5.28 C57BL/6J IP 5 meses + 1 .03 -1 .69 -1 3.9 C57BL/KS IP 5 meses +0.22 -0.13 -16.9 Balb/C IP 2 meses +9. 1 8 -5.4 -9.1 9 ** El tratamiento de ratones ob/ob a 1 mg/kg se detuvo después de 5 días debido a que la dosis inferior a 0.25 mg/kg se encontró eficaz.

Ejemplo 12. Tratamiento ratones ob/ob mediante invección intraperitoneal (IP) de huFc-huLeptina La huFc-huLeptina se administró mediante IP en lugar de SC para reducir la inmunogenicidad en ratones. Un ratón ob/ob recibió 0.1 mg/kg de leptina humana en la forma de huFc-huLeptina mediante inyecciones IP diariamente (durante los primeros 1 7 días y en lo subsecuente de Lunes a Viernes). Otro ratón ob/ob recibió una dosis mayor de 0.5 mg/kg diariamente (durante los primeros 1 7 días y en lo subsecuente de Lunes a Viernes) hasta el día 33, después de lo cual la frecuencia de la inyección se redujo a 3 veces por semana (Lunes, Miércoles y Viernes). Un ratón ob/ob de control recibió PBS diariamente (durante los primeros 1 7 d ías y en lo subsecuente de Lunes a Viernes). Se permito el acceso ad libitum a todos los ratones al alimento y agua y el peso corporal se midió diariamente antes de la inyección . La figura 6 muestra que la huFc-huLeptina fue tan eficaz como ia muFc-muLeptina en la reducción del peso corporal en ratones ob/ob. Otro grupo de dos ratones de mayor edad recibió dosis intermedia de 0.25 mg/kg diariamente (durante los primeros 1 0 días y en lo subsecuente de Lunes a Viernes). Su peso corporal disminuyó desde 65 g hasta 31 g (-51 .4%) en 23 días, después de lo cual se peso corporal fluctuó entre aproximadamente 31 g los Lunes hasta aproximadamente 26 g los Viernes (datos no mostrados). Es notable que después de casi dos meses de tratamiento, la huFc-huLeptina mantuvo su eficacia y no pareció afectarse negativamente por ninguna respuesta inmunológica que pudiera haberse desarrollado contra la proteína humana. Este experimento se ha repetido con grupos mayores de ratones (n=8). Además, los ratones ob/ob se han tratado durante 1 5 meses con Fc-Leptina con el resultado de que el peso de los ratones se mantuvo en el rango de 20-30 gramos. Durante este periodo de tiempo, los ratones no sufrieron efectos laterales adversos aparentes. Experimentos adicionales también indicaron que la administración diaria de Fc-Leptina mediante inyección intraperitoneal, inyección subcutánea y la inyección intravenosa produjeron todas resultados similares. Por lo tanto, la ruta de inyección no parece ser importante cuando se cuantifica la actividad in vivo de la Fc-Leptina en ratones ob/ob.

Ejemplo 1 3. Tratamiento de infertilidad en ratones ob/ob mediante invección intraperitoneal (IP) de muFc-muLeptina Machos ob/ob y hembras ob/ob se trataron con muFc-muLeptina mediante inyecciones IP diarias de 0.25 mg/kg . Cada macho ob/ob se alojó inicialmente con una hembra ob/ob y una hembra normal C57BL/6J. Cuando existió un rápido incremento en el peso corporal indicativo de embarazo, el ratón preñado se aisló. Después de aproximadamente 2 a 4 semanas de tratamiento, los seis machos ob/ob tenían corregido su defecto de infertilidad y preñaban hembras normales y/o ob/ob. Todas las madres normales C57BL/6J dieron a luz a sus crías de manera normal. De las seis hembras ob/ob preñadas, solamente cuatro tuvieron partos normales, conduciendo a cachorros ob/ob homozigosos. Sin embargo, ninguna de las crías sobrevivió más allá del primer día debido a que las madres ob/ob no lactaron normalmente. Ejemplo 14. Farmacocinéticos Los farmacocinéticos de muFc-muLeptina y leptina murina (R & D Systems, Minneapolis, MN) se compararon. Los ratones ob/ob (6 ratones por grupo) se inyectaron en la vena de la cola. Las cantidades de leptina inyectada se normalizaron a 1 mg de leptina por kg de peso corporal del ratón . La sangre se obtuvo mediante sangrado retro-orbital inmediatamente después de la inyección (0 minutos) y a 0. 1 , 0.5, 1 , 2, 4, 6, 24 y 48 horas después de la inyección. Las muestras sanguíneas se recolectaron en tubos que contienen heparina para prevenir la coagulación . Las células se retiraron mediante centrifugación en una microcentrífuga Eppendorf de velocidad alta durante 4 minutos. La concentración de leptina de ratón en el plasma se midió mediante el uso de un equipo de inmunoensayo de leptina de ratón (R & D Systems, Minneapolis, MN). Las vidas medias en circulación de la muFc-muLeptina y leptina murina se determinaron en 8.8 horas y 1 8 minutos, respectivamente. De manera similar, se encontró que la huFc-huLeptina tiene una vida media en circulación de más de 1 0 horas en ratones. Ejemplo 1 5. Construcción de huFc(N?Q mutación)-huLeptina Con objeto de probar si la glicosilación enlazada a N de la región de Fe de inmunoglobulina afecta la vida media del suero de huFc-huLeptina, se produjo un mutante recombinante de huFc-huLeptina, donde el residuo de asparagina en un sitio de glicosilación de la región de Fe se mutó a una glutamina. En resumen, el único sitio de N-glicosilación (Asn-Ser-Thr) codificado en el ADN de huFc-huLeptina se mutó por PCR mediante el uso de la materia prima de avance 5' GAG CAG TAC CAÁ AGT ACG TAC CGT GTG GTC AGC (SEQ ID NO: 16) y materia prima inversa 5' ACG GTA CGT ACT TTG GTA CTG CTC CTC CCG CG (SEQ ID NO: 1 7). Las materias primas codificaron el cambio de Asn-Ser-Thr a Gln(CAA)-Ser-Thr, la cual ya no es un sitio para glicosilación-N. Además, las materias primas introdujeron un sitio SnaBI (TACGTA) mediante mutación silenciosa para facilitar la selección del Asn para la mutación de Gln (N a Q). Después de la mutagenesis por PCR, el fragmento de Sacll-Smal que contiene N para la substitución de Q se confirmó por ordenamiento en secuencia de ADN, y después se utilizó para reemplazar el fragmento correspondiente en pdCs-huFc-huLeptina para generar pdCs-huFc(N-»Q)- huLeptina . La plásmida de expresión pdCs-huFc(N?Q)-huLeptina se transfectó en células mamíferas como se describe en el Ejemplo 2. La proteína de huFc(N->Q)-huLeptina purificada se utilizó entonces para los 5 estudios farmacocinéticos como se describe en el Ejemplo 14. Para una comparación directa, se inyectaron cantidades iguales de huFc-huLeptina (1 mg de leptina/kg) o huFc(N->Q)-huLeptina (1 mg de leptina/kg) en ratones en paralelo. Las concentraciones de huFc(N?Q)-huLept¡na y huFc-huLeptina en el suero del ratón se midieron mediante ELISA de anti- 10 huFc como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados mostrados en la Figura 7 muestran que la huFc-huLeptina (rombos) tuvo una mayor vida media en circulación que huFc(N-»Q)-huLeptina (cuadrados). Eguivalencias La invención puede incorporarse en otras formas específicas 15 sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. Por consiguiente, las modalidades anteriores se consideran ilustrativas en todos los aspectos en vez de limitantes a la invención aquí descrita. Por lo tanto, el alcance de la invención se indica por las reivindicaciones anexas en vez de por la descripción anterior, y por consiguiente se intenta 20 que todos los cambios que vienen dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones se abarquen en la presente.

*"" -"«—--- LISTAPO DE SECUENCIAS cllO> Lo, Kin-Ming 2hang, Jinyang Gillies, Stephen D. <120> Expresión y Exportación de Proteínas de Anti-O esidad como Proteínas de Fusión de Fe <130> LEX-00TPC <140> <141> <150> US 60/llS,079 <151> 1999-01-07 <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 441 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (441) <223> Hu-Leptina <400> 1 gtg ccc atc ca aaa gtc caá gat gac acc aaa acc etc atc aag acá 48 Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 1 5 10 15 att gtc acc agg atc aat gac att tca cae acg cag tca gtc tec tec 96 lie Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser 20 25 30 cag aaa gtc acc ggt ttg gac ttc att cct ggg etc cae ccc atc 144 Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45 ctg acc tta tec aag atg gac cag acá ctg gca gtc tac caá cag atc 192 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln He 50 55 60 etc acc agt atg cct tec aga aac gtg atc caá ata tec aac gac ctg 240 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gln He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80 gag aac etc cgg gat ctt ctt cae gtg ctg gcc ttc tet aag age tgc 288 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 cae ttg ccc tgg gcc agt ggc ctg gag acc ttg gac age ctg ggg ggt 336 His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110 gtc ctg gaa gct tca ggc tac tec acá gag gtg gtg gcc ctg age agg 384 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 "' 130 135 140 ggg tgc tga 441 Gly Cys 145 <210> 2 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Pro He Gln Lys Val Gln ASD Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 1 5 ' 10 15 He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser 20 25 30 Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln He 50 55 60 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gln He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro 13C 135 140 Gly Cys 145 <210> 3 <211> 441 <212> ADN <213> músculo Mus <220> <221> CDg <222> (1 ) . . (441) <223> Mu-LepUna <400> 3 gtg cct atc cag aaa gtc cag gat gac acc aaa acc etc atc aag acc 48 Val Pro He Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 1 5 10 15 att gtc acc agg atc aat gac att tca cae acg cag tcg gta tec gcc 96 He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala 20 25 30 aag cag agg gtc act ggc ttg gac ttc att cct ggg ctt cae ccc att 144 35 40 45 ctg agt ttg tec aag atg gac cag act ctg gca gtc tat caá cag gtc 192 Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val 50 55 60 etc acc age ctg cct tec caá aat gtg ctg cag ata gcc aat gac ctg 240 Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln He Ala Asn ñsp Leu 65 70 75 80 gag aat etc cga gac etc etc cat ctg ctg gcc ttc tec aag age tgc 288 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 tec ctg cct cag acc agt ggc ctg cag aag cea gag age ctg gat ggc 336 Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly 100 105 110 gtc ctg gaa gcc tca etc tac tec acá gag gtg gtg gct ttg age agg 384 Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 ctg cag ggc tet ctg cag gac att ctt caá cag ttg gat gtt age cct 432 Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp He Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro 130 135 140 gaa tgc tga 441 Glu Cys 145 <210> 4 <211> 146 <212> PRT <213> músculo Mus <400> 4 Val Pro He Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 1 5 10 15 He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala 20 25 30 Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45 Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val 50 55 60 Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu G n He Ala Asn Asp Leu 65 70 75 80 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp He Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro 130 135 140 Glu Cys 210 5 <211> 696 <212 > ADN <213> Ho o sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(696) <223> HuFc <400> 5 ga? ccc aaa tet tet gac aaa act. cae acá tgc cea ccg tgc cea gca 48 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Has Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 cct gaa etc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc etc ttc ccc cea aaa ccc 96 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 aag gac acc etc atg atc tec cgg acc cct gag gtc acá tgc gtg gtg 144 Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 gtg gac gtg age cae gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 192 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag acá aag ccg cgg gag gag cag 240 Asp Gly Val Glu Val H s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cae cag 288 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tec aac aaa gcc 336 A=p Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 etc cea gcc ccc atc gag aaa acc atc tec aaa gcc aaa ggg cag ccc 384 Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 cga gaa cea cag gtg tac acc ctg ccc cea tca cgg gag gag atg acc 432 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age 480 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 gac atc gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac 528 Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tec gac ggc tec ttc ttc etc tat 576 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 624 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 'cea tgc tec gcg atg cat gag gct ctg cae aac cae tac acg cag aag 672 Ser Cys Ser Val Met Has Glu Ala Leu H s Asn Has Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 age etc tec ctg tec ccg ggt aaa 696 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 6 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 .0 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 1B5 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 7 <211> 699 <212> ADN <213> músculo Mus <221> CDS <222> (1) .. (699) <223> MuFc <400> 7 gag ccc aga ggg ccc acá atc aag ccc tgt cct cea tgc aaa tgc cea 48 Glu Pro Arg Gly Pro Thr He Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 1 5 10 15 gca cct aac etc ttg ggt gga cea tec gtc ttc atc ttc cct cea aag 96 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Lys 20 25 30 atc aag gat gta etc atg atc tec ctg age ccc ata gtc acá tgt gtg 144 He Lys Asp Val Leu Met He Ser Leu Ser Pro He Val Thr Cys Val 35 40 45 gtg gtg gat gtg age gag gat gac cea gat gtc cag atc age tgg ttt 192 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln He Ser Trp Phe 50 55 60 gtg aac aac gtg gaa gta cae acá gct cag acá caá acc cat aga gag 240 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 65 70 75 80 gat tac aac agt act etc cgg gtg gtc agt gcc etc ccc atc cag cae 288 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro He Gln His 85 90 95 cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa 336 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 100 105 110 gac etc cea gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca 384 Asp Leu Pro Ala Pro He Glu Arg Thr He Ser Lys Pro Lys Gly Ser 115 120 125 gta aga gct cea cag gta tat gtc ttg cct cea cea gaa gaa gag atg 432 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 130 135 140 act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc acá gac ttc atg cct 480 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 145 150 155 160 gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa ac gag cta aac 528 Glu Asp He Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 165 170 175 tac aag aac act gaa cea gtc ctg gac tet gat ggt tet tac ttc atg 576 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 180 185 190 tac age aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat age 624 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 195 200 205 tac tec tgt tca gtg gtc cae gag ggt ctg cae aat cae cae acg act 672 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 210 215 220 aag age ttc tec cgg acc ccg ggt aaa 699 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 23C <210> 8 <211> 233 <212> PRT <213> músculo Mus <400> 8 Glu Pro Arg Gly Pro Thr He Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Lys 20 25 30 He Lys Asp Val Leu Met He Ser Leu Ser Pro He Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln He Ser Trp Phe 50 55 60 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 65 70 75 80 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro He Gln His 85 90 95 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Pro Ala Pro He Glu Arg Thr He Ser Lys Pro Lys Gly Ser 115 120 125 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 130 135 140 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 145 150 155 160 Glu Asp He Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 195 200 205 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230 <210> 9 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primario delantero para clonar y adaptar el cADN de leptina de murino <400> 9 cccgggtaaa gtgcctatcc agaaagtcc 29 ------>«----i----i-------i < 1 > 10 '<211 > 27 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primario inverso para clonar y adaptar el cADN de leptina de murino <400> 10 ctcgagtcag cattcagggc taacatc 27 <210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primario delantero para clonar y adaptar el cADN de leptina de humano <400> 11 cccgggtaaa gtgcccatcc aaaaagtcca 30 <210> 12 <211> 10 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de ia Secuencia Artificial: término car oxl de la cadena pesada de inmunoglobulina <400> 12 cccgggtaaa 10 <210> 13 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primario inverso para clonar y adaptar el cADN de leptina de humano <400> 13 ctcgagtcag cacccagggc tgaggtc 27 <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primarlo delantero para adaptar el cADN de leptina de murino <400> 14 cttaagcgtg cctatccaga aagtcca 27 <210> 15 <2U> 24 <?12> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: primario inverso para adaptar el cADN de leptina de murino <400> 15 gatatcgcat tcagggctaa cate 24 <210> 16 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: EcoRI / Afl II en lazador-adaptador <400> 16 aattcgatat c 11 <210> 17 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: EcoRi /Afl II enlazador-adaptador <400> 17 ttaagatatc g 11 <210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: enlazador <400> 18 ggcgcaggag gttctggcgg atcc 24 <210> 19 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: enlazador <400> 19 ggatccgcca gaacctcctg cgcc 24 <210> 20 <211> 146 <212> PRT <213> Secuencia Artificial ¿220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de leptino de concenso <220> <223> en donde Xaa representa cualquier aminoácido, y en donde cada Xaa se selecciona independientemente <400> 20 Val Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 1 5 10 15 He Val Xaa Arg He Asn Asp He Ser His Thr Xaa Ser Val Ser Xaa 20 25 30 Xaa Gln Xaa Val Xaa Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu Xaa Pro Xaa 35 40 45 Leu Xaa Leu Ser Xaa Met Asp Gln Thr Leu Ala Xaa Tyr Gln Gln Xaa 50 55 60 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asn Xaa Xaa Gln He Xaa Xaa Asp Leu 65 70 75 80 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Xaa Leu Ala Xaa Ser Lye Ser Cys 85 90 95 Xaa Leu Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Xaa Xaa 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Gln Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Asp Xaa Ser Pro 130 135 140 Xaa Cys 145

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, caracterizado porque comprende: (a) una secuencia de señal ; (b) una región de Fe de inmunoglobulina; y (c) una secuencia de proteína objetivo que comprende leptina. 2. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha secuencia de señal, dicha región de Fe de inmunoglobulina y dicha secuencia de proteína objetivo se codifican en serie en una dirección de 5' a 3'. 3. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha secuencia de señal, dicha secuencia objetivo, y dicha región de Fe de inmunoglobulina se codifican en serie en una dirección de 5' a 3'. 4. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha región de Fe de inmunoglobulina comprende una región de articulación de articulación de inmunoglobulina. 5. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha región de Fe de inmunoglobulina comprende una región de articulación de inmunoglobulina y un dominio de cadena pesada constante de inmunoglobulina. 6. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha región de Fe de inmunoglobulina comprende una región de articulación y un dominio CH3. 7. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha región de Fe de inmunoglobulina carece al menos del dominio CH 1 . 8. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha región de Fe de inmunoglobulina codifica al menos una porción de inmunoglobulina ?. 9. Un vector de expresión reproducible para transfectar una célula mamífera, comprendiendo dicho vector el ácido nucleico según la reivindicación 1 . 10. Una célula mamífera que alberga el ácido nucleico según la reivindicación 1 . 1 1 . Una proteína de fusión caracterizada porque comprende una región de Fe de inmunoglobulina y una proteína objetivo que comprende leptina, en donde, cuando la proteína de fusión se administra a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg/día durante 5 días a un ratón ob/ob que tiene un peso corporal inicial de al menos aproximadamente 50 gramos, induce una pérdida de 10% o 5 gramos de peso corporal. 12. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque, cuando la proteína de fusión se administra a una dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg/día, induce una pérdida de 10% o 5 gramos de peso corporal. 1 3. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque la proteína objetivo comprende una secuencia amino acida establecida en la SEQ ID NO: 2 o 4. 14. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha proteína objetivo comprende al menos dos moléculas de leptina, en donde dichas dos moléculas de leptina se enlazan por un enlazador péptido. 1 5. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha proteína objetivo se enlaza a un extremo de terminal N de dicha región de Fe de inmunoglobulina. 16. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha proteína objetivo se enlaza a un extremo de terminal C de dicha región de Fe de inmunoglobulina. 1 7. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque comprende además un enlazador péptido que enlaza dicha región de Fe de inmunoglobulina a dicha proteína objetivo. 18. Una proteína multimérica que comprende al menos dos proteínas de fusión según la reivindicación 1 1 enlazadas a través de una unión covalente. 1 9. La proteína según la reivindicación 18, caracterizada porque la unión covalente es una unión de disulfuro. 20. Una proteína multimérica, caracterizada porque comprende al menos dos proteínas de fusión según la reivindicación 1 1 , enlazadas a través de una unión covalente. 21 . La proteína según la reivindicación 20, caracterizada porque la unión covalente en una unión de disulfuro. 22. La proteína de fusión según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha región de Fe de inmunoglobulina glicosila al menos un sitio de glicosilación. 23. Un método para producir una proteína de fusión, caracterizado porque comprende las etapas de (a) proporcionar la célula mamífera según la reivindicación 10; y (b) cultivar la célula mamífera para producir dicha proteína de fusión . 24. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque comprende la etapa adicional de recolectar dicha proteína de fusión. 25. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque comprende la etapa adicional de purificar dicha proteína de fusión. 26. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque comprende la etapa adicional de disociar dicha región de Fe de inmunoglobulina de dicha proteína objetivo. 27. El método según la reivindicación 26, caracterizado porque comprende la etapa adicional de disociar dicha proteína objetivo en un sitio de disociación interna con una enzima proteolítica endógena a la célula mamífera. 28. Un método para tratar una condición aliviada por la administración de leptina, caracterizado porque comprende la administración de un ácido nucleico según la reivindicación 1 a un mamífero que tiene dicha condición. 29. Un método para tratar una condición aliviada por la administración de leptina, caracterizado porque comprende la administración de un vector según la reivindicación 9 a un mamífero que tiene dicha condición . 30. Un método para tratar una condición aliviada por la administración de leptina, caracterizado porque comprende la administración de la proteína de fusión según la reivindicación 1 1 a un mamífero que tiene dicha condición. 31 . Un método para tratar una condición aliviada por la administración de leptina, caracterizado porque comprende la administración de la proteína multimérica según la reivindicación 1 8 a un mamífero que tiene dicha condición.