[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

MX2014004977A - Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina. - Google Patents

Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.

Info

Publication number
MX2014004977A
MX2014004977A MX2014004977A MX2014004977A MX2014004977A MX 2014004977 A MX2014004977 A MX 2014004977A MX 2014004977 A MX2014004977 A MX 2014004977A MX 2014004977 A MX2014004977 A MX 2014004977A MX 2014004977 A MX2014004977 A MX 2014004977A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
residues
binding protein
sclerostin
antibody
Prior art date
Application number
MX2014004977A
Other languages
English (en)
Inventor
Chung-Ming Hsieh
Alexander Ivanov
Wendy Waegell
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of MX2014004977A publication Critical patent/MX2014004977A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/439—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom the ring forming part of a bridged ring system, e.g. quinuclidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2026—IL-4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2073—IL-11
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

Se describen proteínas que ligan a esclerostina o esclerostina y TNF junto con su uso en composiciones y métodos para tratar, prevenir, y diagnosticar enfermedades relacionadas con esclerostina y para detectar esclerostina o esclerostina y TNF en células, tejidos, muestras, y composiciones.

Description

INMUNOAGLUTIN ANTES DIRIGIDOS CONTRA ESCLEROSTINA Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud Provisional Estadounidense Serie No. 61/550,724, presentada el 24 de Octubre de 2011, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Campo de la invención Se proporcionan proteínas de enlace a esclerostina, y específicamente sus usos en la prevención y/o tratamiento de enfermedades inmunológicas agudas y crónicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, esclerosis múltiple, y otras enfermedades.
Antecedentes de la invención El gene de SOST codifica una proteína de 24 KD llamada esclerostina que ha sido clasificada como un miembro de la familia DAN de glicoproteínas que contienen nodales de cisteína basados en la similitud de secuencia (Avasian-Kretchmer (2004) Mol. Endocrinol. 8(1 ): 1 -12). La esclerostina es un regulador negativo de la formación de hueso que inhibe la proliferación de osteoblastos así como también la diferenciación y suprime la mineralización de células osteoblásticas in vitro (Poole et al. (2005) FASEB J. 19:1836-38; Winkler et al. (2005) J. Biol. Chem. 280(4): 2498-2502).
La esclerostina es un inhibidor de la ruta de señalización Wnt canónica. Se une a receptores LRP4, LRP5 y/o LRP6 que conducen a estabilización de ß-catenina conduciendo a la regulación de la transcripción del gene a través de reguladores de la transcripción que incluyen factores de células T (TCF) y factor-1 (LEF) de mejoramiento linfoide. La inhibición de esclerostina permite la señalización a través de la ruta Wnt resultando en formación del hueso (van Bezooijen et al. (2007) J. Bone Min. Res. 22(1 ): 19-28).
Un incremento en la señalización Wnt canónica resulta en masa ósea aumentada (Li et al. (2005) J Biol. Chem. 280(20): 19883-7; Semenov et al. (2005) J. Biol. Chem. 280(29):26770-775). La pérdida de mutantes de función en LRP5 conduce al bajo fenotipo de masa ósea visto en el síndrome de osteoporosis-pseudoglioma en humanos y ratones KO LRP5 demuestran fenotipos similares a aquellos vistos en estos pacientes (Balemans et al. (2008) Calcif. Tissue Int. 82:445-53). Se han identificado dos mutaciones humanas del gene SOST que conducen a Esclerosterosis y enfermedad de Van Buchem, ambas de las cuales resultan en un fenotipo de masa ósea alta (Brunkow et al. (2001) Am. J. Hum. Genet. 68:577-89; Balemans et al. (2001) Hum Mol Genet 10:537-43). Adicionalmente, ratones KO con esclerostina demuestran un fenotipo de masa ósea alta mientras ratones Tg que sobre-producen esclerostina tienen un fenotipo de masa ósea baja (Li et al. (2008) J. Bone and Min. Res. 23(6):860-9).
UCB Celltech (anteriormente Celltech), en colaboración con AMGEN, está desarrollando un mAb neutralizante de esclerostina para el tratamiento de osteoporosis y curación de fracturas. Los ensayos clínicos de Fase I han sido completados. Un ensayo Fase II se ha completado en osteoporosis y se han iniciado ensayos Fase III. Los ensayos Fase II múltiples están en curso para el tratamiento de curación de fracturas. El papel patogénico de TNF en artritis está bien establecido ya que los antagonistas de TNF-a reducen la inflamación y limitan el progreso del daño al cartílago y erosión ósea en enfermedades humanas (van den Berg (2001) Arthritis Res. 3:18-26). Aunque los antagonistas del TNF han revolucionado la terapia de RA, una porción significante de pacientes no responden adecuadamente a estos fármacos. Estudios preclínicos con TNF-a y SOST indican papeles tanto independientes como traslapantes en la patofisiología de artritis. Mientras la inhibición de esclerostina o TNF-a solo ejerce efectos modestos en expresión del gene proinflamatorio, la combinación de la inhibición de SOST con inhibición de TNF-a conduce a fuerte respuesta sinergística. En particular, la combinación de inhibición de esclerostina y TNF-a tiene el potencial de tanto bloquear la inflamación como promover la curación ósea proporcionando mayor beneficio a pacientes.
Aunque una variedad de anticuerpos a esclerostina se han descrito desde el descubrimiento de esta citocina proinflamatoria crítica, permanece una necesidad para anticuerpos mejorados que puedan mediar o neutralizar efectivamente la actividad de esclerostina durante una respuesta inflamatoria o trastorno autoinmune, mientras protege o restaura la densidad mineral ósea, volumen ósea y resistencia ósea.
Breve descripción de la invención Se proporcionan proteínas que se enlazan a esclerostina humana. Se proporcionan proteínas de enlace que incluyen pero no se limitan a anticuerpos, porciones de enlace al antígeno de las mismas, y proteínas de enlace multivalente, multiespecíficas tales como proteínas de enlace-DVD que pueden unirse a esclerostina humana y a otro objetivo, tales como TNF-a. Se proporcionan métodos para elaborar y usar las proteínas de enlace a esclerostina descritas en la presente así como también varias composiciones que pueden ser usadas en los métodos para detectar esclerostina en una muestra o en métodos para tratar o prevenir un trastorno en un individuo que está asociado o se sospecha estar asociado con la actividad de esclerostina.
En un aspecto, se proporciona una proteína de enlace que comprende un dominio de enlace al antígeno capaz de unirse a esclerostina humana, el dominio de enlace al antígeno comprende al menos una CDR que comprende: CDR-H1. X1-X2-X3-X4-X5 (SEC ID NO:15), en donde; Xi es D o N o no está presente; X2 es Y o N; X3 es A o N; X4 es L o N; X5 es H o N; CDR-H2. Xi~ X2— X3-X4- Xs— ?d- Xz— X8— 9— Xl 0— Xl 1— Xl 2~ Xl 3— X14-X15-X16-X17 (SEC ID NO:16), en donde; Xi es G o N; X2 es I o N; X3 es S o N; X4 es W o N; X5 es H o N; X6 es G o N; X? es D o N; Xs es F o N; X9 es I o N; X10 es D o N; X es Y o N; Xi2 es A o N; Xi3 es D o N; Xi4 es S o N; Xi5 es V o N; X16 es K o N; y Xi7 es G o N; CDR-H3. Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-Xi i-Xi2 (SEC n donde; Xi es N o N; X2 es N o N; X3 es R o N; X4 es G o N; X5 es Y o N; X6 es G o N; X7 es G o N; Xa es L o N; Xg es D o N; y X10 es V o N; CDR-L1. Xi— X2— X3— X4— X5— ?ß— X7— ?ß— X9— X10— X11— X12— Xi3 (SEC ID NO:18), en donde; Xi es S o N; X2 es G o N; X3 es S o N; X4 es S o N; X5 es S o N; X6 es N o N; X7 es I o N; X8 es G o N; X9 es S o N; X10 es N o N; X11 es T o N; X12 es V o N; y X13 es N o N; CDR-L2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEC ID NO:19), en donde; Xi es S o N; X2 es N o N; X3 es N o N; X4 es Q o N; X5 es R o N; X6 es P o N; y X7 es S o N; o CDR-L3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEC ID NO:20), en donde; Xi es A o N; X2 es A o N; X3 es W o N; X4 es D o N; X5 es D o N; X6 es S o N; X7 es L o N; X8 es N o N; X9 es G o N; X10 es S o N; X11 es Y o N; y X12 es V o N.
En una modalidad, se proporciona una proteína de enlace que comprende al menos una CDR que comprende los residuos 31-35 de la SEC ID NO: 3; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 3; residuos 99-108 de la SEC ID NO:3; residuos 23-34 de la SEC ID NO: 4; residuos 51-57 de la SEC ID NO: 4; residuos 90-101 de la SEC ID NO:4; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 5; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 5; residuos 99-115 de la SEC ID NO:5; residuos 23-33 de la SEC ID NO: 6; residuos 49-55 de la SEC ID NO: 6; residuos 88-96 de la SEC ID NO:6; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 7; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 7; residuos 99-107 de la SEC ID N0:7; residuos 23-33 de la SEC ID NO: 8; residuos 49-55 de la SEC ID NO: 8; residuos 88-95 de la SEC ID NO:8; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 9; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 9; residuos 99-107 de la SEC ID NO:9; residuos 24-39 de la SEC ID NO: 10; residuos 55-61 de la SEC ID NO: 10; residuos 94-112 de la SEC ID NO:10; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 11; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 11; residuos 99-111 de la SEC ID NO: 11; residuos 24-39 de la SEC ID NO: 12; residuos 55-61 de la SEC ID NO: 12; residuos 94-113 de la SEC ID NO:12; residuos 31-37 de la SEC ID NO: 13; residuos 52-69 de la SEC ID NO: 13; residuos 102-122 de la SEC ID NO:13; residuos 24-34 de la SEC ID NO: 14; residuos 50-56 de la SEC ID NO: 14; residuos 89-97 de la SEC ID NO:14; Residuos 31-35 de la SEC ID NO:1998; Residuos 50-66 de la SEC ID NO:1998; Residuos 99-110 de la SEC ID NO:1998; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:1999; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:1999; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:1999; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2000; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2000; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2000; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2001; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2001; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2001; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2002; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2002; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2002; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2003; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2003; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2003; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2004; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2004; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2004; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2005; Residuos 50-66 de la SEC ID NO..2005; Residuos 99-110 de la SEC ID NO..2005; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2006; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2006; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2006; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2007; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2007; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2007; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2009; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2009; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2009; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2010; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2010; Residuos 23-36 de la SEC ID NO..2011 , Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2011, Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2011; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2012; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2012; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2012; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2013; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2013; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2013; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2014; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2014; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2014; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2015; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2015; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2015; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2016; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2016; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2016; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2017; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2017; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2017; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2020; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2020; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2020; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2021; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2021; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2021; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2022; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2022; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2022; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2023; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2023; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2023; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2024; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2024; Residuos 99 -108 de SEC ID NO:2024; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2025; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2025; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO.2025; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2026, Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2026; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2026; Residuos 31 -35 de SEC ID NO:2027; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2027; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2027; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2028; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2028; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2028; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2029; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2029; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2029; Residuos 31 -35 de SEC ID NO:2030; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2030; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2030; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2031; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2031; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2031; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2032; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2032; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2032; Residuos 31 -35 de SEC ID NO:2033; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2033; Residuos 99 - 108 de SEC ID NO:2033; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO:2034; Residuos 50 - 66 de SEC ID NO:2034; Residuos 99 - 110 de SEC ID NO:2034; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2035; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2035; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2035; Residuos 31 -35 de SEC ID NO.:2036; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2036; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2036; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO..2037; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2035; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2037; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2038; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2038; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2038; Residuos 31 -35 de SEC ID NO.:2039; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2039; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2039; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2040; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2040; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2040; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2041; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2041; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2041; Residuos 31 -35 de SEC ID NO.:2042; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2042; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2042; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2043; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2043; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2043; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2044; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2044; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2044; Residuos 31 -35 de SEC ID NO.:2045; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2045; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2045, Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2046; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2046; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2046; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2047; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2047; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2047; Residuos 31 -35 de SEC ID NO.:2048; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2048; Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2048; Residuos 31 - 35 de SEC ID NO.:2049; Residuos 51-57 de SEC ID NO.:2049; y Residuos 90-101 de SEC ID NO.:2049.
En otra modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina que comprende al menos 3 CDRs descritas anteriormente.
En otra modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina que comprende al menos 3 CDRs de la Tabla 1: Tabla 1 En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina puede comprender al menos dos series de CDR de dominio variable descritas anteriormente. En una modalidad, las dos series de CDR de dominio variable son la Serie de CDR MSL10 de VH y la Serie de CDR SL10 de VL; Serie de CDR MSL17 de VH y la Serie de CDR MSL17 de VL; Serie de CDR MSL9-8 de VH y la Serie de CDR MSL9-8 de VL; Serie de CDR MSK9 de VH and Serie de CDR MSK9 de VL; Serie CDR de MSK13 de VH y la Serie CDR de MSK13 de VL; Serie de CDR MS 21 de VH o Serie de CDR MSK21 de VL; Serie CDR de VH AE10-6 AM1 y Serie CDR de VL AE10-6 A 1; Serie CDR de VH AE10-6 AM2 y Serie CDR de VL AE10-6 A 2; Serie CDR de VH AE10-6 AM3 y Serie CDR de VL AE10-6 AM3; Serie CDR de VH AE10-6 AM4 y Serie CDR de VL AE10-6 AM4; Serie CDR de VH AE10-6 AM5 y Serie CDR de VL AE10-6 AM5; Serie CDR de VH AE10-6 AM6 y Serie CDR de VL AE10-6 AM6; Serie CDR de VH AE10-6 AM7 y Serie CDR de VL AE10-6 AM7; Serie CDR de VH AE10-6 AM8 y Serie CDR de VL AE10-6 AM8; Serie CDR de VH AE10-6 AM9 y Serie CDR de VL AE10-6 AM9; y Serie CDR de VH AE10-6 AM10 y Serie CDR de VL AE10-6 AM10; Serie CDR de VH MSL10 AM1 y Serie CDR DE VL MSL10 AM1; Serie CDR de VH MSL10 AM2 y VL Serie CDR MSL10 AM2; Serie CDR de VH MSL10 AM3 y Serie CDR VL MSL10 AM3; Serie CDR de VH MSL10 AM4 y Serie CDR VL MSL10 AM4; Serie CDR de VH MSL10 AM5 y Serie CDR VL MSL10 AM5; Serie CDR de VH MSL10 AM6 y Serie CDR VL MSL10 AM6; Serie CDR de VH MSL10 AM7 y Serie CDR VL MSL10 AM7; Serie CDR de VH MSL10 A 8 y Serie CDR VL MSL10 AM8; Serie CDR de VH MSL10 AM9 y Serie CDR VL MSL10 AM9; Serie CDR de VH MSL10 AM10 y Serie CDR VL MSL10 AM10; Serie CDR de VH MSL10 AM1.2 y Serie CDR VL MSL10 AM1.2; Serie CDR de VH MSL10 AM2.2 y Serie CDR VL MSL10 AM2.2; Serie CDR de VH MSL10 AM3.2 y Serie CDR VL MSL10 AM3.2; y Serie CDR de VH MSL10 AM4.2 y Serie CDR VL MSL10 AM4.2 En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente comprende dos dominios variables, en donde el primer dominio variable comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 1719-1866, 1998-2007, 2018, y 2020-2034 y en donde el segundo dominio variable comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs 4, 6, 8, 10, 12, 1867-1997, 2007-2017, 2019, y 2035-2049.
En otra modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina que comprende un dominio de enlace al antígeno que comprende una VH. En una modalidad, la VH comprende cualquiera de las SEC ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 1719-1866, 1998-2007, 2018, o 2020-2034. En otra modalidad, se proporciona la proteína de enlace a esclerostina que comprende un dominio de enlace al antígeno que comprende una VL. En una modalidad, la VL comprende cualquiera de las SEC ID NOs 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1867-1997, 2008-2017, 2019, o 2035-2049.
En otra modalidad, se proporciona la proteína de enlace a esclerostina que comprende un dominio de enlace al antígeno que comprende una VH y una VL. En una modalidad, la VH comprende la SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, o 13 y la VL comprende la SEC ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1867-1997, 2008-2017, 2019, o 2035-2049.
Una proteína de enlace a esclerostina puede comprender un armazón aceptor humano alternativo que comprende al menos una sustitución de aminoácido de la región de armazón, en donde la secuencia de aminoácidosdel armazón es al menos 65% idéntica a la secuencia del armazón aceptor humano y comprende al menos 70 residuos de aminoácido idénticos al armazón aceptor humano.
En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina comprende un armazón aceptor humano alternativo, en donde el armazón aceptor comprende al menos una sustitución de aminoácido de la región de armazón en un residuo clave, el residuo clave comprende: un residuo adyacente a una CD ; un residuo del sitio de glicosilación; un residuo raro; un residuo capaz de interactuar con SOST humano; un residuo capaz de interactuar con una CDR, un residuo canónico; un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera; un residuo dentro de una zona Vernier; o un residuo en una región que se traslapa entre una CDR1 de cadena pesada variable definida por Chothia y un primer armazón de cadena pesada definida por Kabat.
En otra modalidad, una proteina de enlace a esclerostina descrita en la presente, comprende además un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de: un dominio constante IgM humano; un dominio constante IgG 1 humano; un dominio constante lgG2 humano; un dominio constante lgG3 humano; un dominio constante lgG4 humano; un dominio constante I g E humano; o un dominio constante IgA humano. En una modalidad, la región constante de inmunoglobulina de cadena pesada es un dominio constante IgG 1 humano. En una modalidad, el dominio constante I gG 1 humano comprende la SEC ID NO: 1691 o SEC ID NO: 1692.
En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera es un dominio constante kappa Ig humano o es un dominio constante lambda Ig humano. Un dominio constante kappa Ig humano ejemplar comprende la secuencia de aminoácidosSEC ID NO: 1693. Un dominio constante lambda Ig humano ejemplar comprende la secuencia de aminoácidosSEC ID NO: 1694.
En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente es una molécula de inmunoglobulina; un scFv; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo de dominio único; un fragmento Fab; un fragmento Fab'; un F(ab')2; un Fv; o un Fv enlazado a disulfuro. En una modalidad particular, la proteína de enlace a esclerostina es un anticuerpo humano.
Otro aspecto proporciona una proteína de enlace capaz de unirse a esclerostina humana, en donde la proteína de enlace comprende: una región pesada constante Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde la SEC ID NO: 1691 o SEC ID NO: 1692; una región ligera constante Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde la SEC ID NO: 1693 o SEC ID NO: 1694; una región pesada variable Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde la SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 1719-1866, 1998-2007, 2018, o 2020-2034; y una región ligera variable Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde la SEC ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1867-1997, 2008-2017, 2019, o 2035-2049.
En una modalidad, se proporciona una proteína de enlace capaz de unirse a esclerostina humana y comprende: una región pesada constante Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde la SEC ID NO:3; una región ligera constante Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde la SEC ID NO:5; una región pesada variable Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde una VH en la Tabla 18; una secuencia de aminoácidosde una VH de la SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 1719-1866, 1998-2007, 2018 o 2020-2034; y una región ligera variable Ig que tiene una secuencia de aminoácidosde una VL de la SEC ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1867-1997, 2008-2017, 2019, o 2035-2049.
Otro aspecto proporciona una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, que comprende una cadena de polipéptido, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición de que no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde (a) VD1 o VD2 comprenden tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y la proteína de enlace es capaz de unirse a esclerostina y a otro objetivo; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, o 1682, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, o 634, y VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, o 1682, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse al TNF-a y esclerostina.
En una modalidad de la proteína de enlace-DVD descrita anteriormente, VD1 -(X1 )n-VD2 comprende la SEC ID NO: 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 , 131, 141, 151 , 161 , 171 , 181 , 191 , 201, 211 , 221, 231, 241, 251 , 261, 271 , 281 , 291 , 301 , 311 , 321 , 331 341, 351 , 361, 371, 381, 391, 401 , 411, 421 , 431 , 441 , 451 , 461, 471 481, 491 , 501, 511, 521, 531, 541, 551 , 561, 571, 581, 591 , 601, 611 , 621, 631 , 641, 651, 661, 671 , 681 , 691, 701, 711, 721, 731 , 741 , 751 761, 771 , 781, 791, 801, 811 , 821 , 831, 841, 851 , 861 , 871 , 881, 891 901, 911 , 921, 931, 941, 951, 961 , 971 , 981 , 991 1001 , 1011, 1021, 1031, 1041, 1051, 1061, 1071, 1081, 1091, 1101, 1111, 1121, 1131, 1141 1151, 1161, 1171, 1181, 1191, 1201, 1211, 1221, 1231, 1241, 1251 1261, 1271, 1281, 1291, 1301, 1311, 1321, 1331, 1341, 1351, 1361 1371, 1381, 1391, 1401, 1411, 1421, 1431, 1441, 1451, 1461, 1471, 1481, 1491, 1501, 1511, 1521, 1531, 1541, 1551, 1561, 1571, 1581, 1591, 1601, 1611, 1621, 1631, 1641, 1651, 1661, 1671, o 1681.
Otro aspecto proporciona una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, que comprende una cadena de polipeptido, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición de que no sea CL; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde (a) VD1 o VD2 comprenden tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409; 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y la proteína de enlace es capaz de unirse a esclerostina y a otro objetivo; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, o 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, o 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse al TNF-a y esclerostina.
En una modalidad de la proteína de enlace-DVD descrita anteriormente, VD1 -(X1 )n-VD2 comprende la SEC ID NO: 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236, 246, 256, 266, 276, 286, 296, 306, 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, 386, 396, 406, 416, 426, 436, 446, 456, 466, 476, 486, 496, 506, 516, 526, 536, 546, 556, 566, 576, 586, 596, 606, 616, 626, 636, 646, 656, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 756, 766, 776, 786, 796, 806, 816, 826, 836, 846, 856, 866, 876, 886, 896, 906, 916, 926, 936, 946, 956, 966, 976, 986, 996, 1006, 1116, 1126, 1136, 1146, 1156, 1166, 1176, 1186, 1196, 1206, 1216, 1226, 1236, 1246, 1256, 1266, 1276, 1286, 1296, 1306, 1316, 1326, 1336, 1346, 1356, 1366, 1376, 1386, 1396, 1406, 1416, 1426, 1436, 1446, 1456, 1466, 1476, 1486, 1496, 1506, 1516, 1526, 1536, 1546, 1556, 1566, 1576, 1586, 1596, 1606, 1616, 1626, 1636, 1646, 1656, 1666, 1676, o 1686.
Otra modalidad proporciona una proteina de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, que comprende primera y segunda cadenas de polipéptidos, en donde la primera cadena de polipéptido comprende un primera VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde la segunda cadena de polipéptido comprende un segundo VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo enlazador; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde el primero y segundo enlazador X1 son los mismos o diferentes; en donde el primer enlazador X1 no es CH1 y/o el segundo enlazador X1 no es CL y en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479, 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y la proteína de enlace es capaz de unirse a esclerostina y a otro objetivo; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, '649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, o 1682; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, o 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, o 1682; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, o 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse al TNF-a y esclerostina.
En una modalidad de la proteína de enlace-DVD descrita anteriormente, en donde X1 o X2 es la SEC ID NO: 1695, 1696, 1697, 1698, 1699, 1700, 1701, 1702, 1703, 1704, 1705, 1706, 1707, 1708, 1709, 1710, 1711, 1712, 1713, 1714, 1715, 1716, 2050, 2051, 2052, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, y 2059.
Otra modalidad proporciona una proteína de entace-DVD-A multiespecífica, multivalente, capaz de enlazar dos antígenos que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, en donde dos cadenas de polipéptidos comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde dos cadenas de polipéptidos comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo enlazador; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde el primero y segundo enlazador X1 son los mismos o diferentes; en donde el primer enlazador X1 no es CH1 y/o el segundo enlazador X1 no es CL y en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y la proteina de enlace es capaz de unirse a esclerostina y a otro objetivo; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de ia SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, o 1682; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, o 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, o 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, o 1682; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, o 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, o 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse al TNF-oc y esclerostina.
En una modalidad de una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente, n es 0.
Una modalidad se proporciona una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, en donde X1 o X2 es la SEC ID NO: 1695, 1696, 1697, 1698, 1699, 1700, 1701, 1702, 1703, 1704, 1705, 1706, 1707, 1708, 1709, 1710, 1711, 1712, 1713, 1714, 1715, 1716, 2050, 2051, 2052, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, y 2059.
En otra modalidad, una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente comprende dos primeras cadenas de polipéptidos y dos segundas cadenas de polipéptidos.
En una modalidad de una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente, la región Fe es una región Fe de secuencia nativa o una región Fe de secuencia variante.
En una modalidad, la región Fe es una región Fe de un lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.
En otra modalidad una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente comprende una primera y segunda cadenas de polipéptidos, VD1 de la primera cadena de polipéptido y el VD1 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen del mismo primero y segundo anticuerpo precursor, respectivamente, o porción de enlace al antígeno del mismo.
En una modalidad de una proteína de enlace-DVD esclerostina y TNF-a descrita en la presente, un anticuerpo anti-TNF-a parental se une a TNF-a con una potencia diferente de la potencia con la cual un anticuerpo anti-esclerostina parental se une a esclerostina humana.
En otra modalidad de una proteína de enlace-DVD SOST y TNF-a descrita en la presente, un anticuerpo anti-TNF-a parental se une a TNF-a con una afinidad diferente de la afinidad con la cual el anticuerpo anti-esclerostina se une a esclerostina humana.
En otra modalidad de una proteína de enlace-DVD SOST y TNF-a descrita en la presente, un anticuerpo anti-TNF-a y el anticuerpo anti-esclerostina son un anticuerpo humano, un anticuerpo injertado a CDR, o un anticuerpo humanizado.
En otra modalidad, una proteína de enlace-DVD SOST y TNF-a descrita en la presente posee al menos una propiedad deseada exhibida por el anticuerpo anti-TNF-a o el anticuerpo anti-esclerostina. En una modalidad, la propiedad deseada es una o más de parámetros de anticuerpo. En una modalidad, los parámetros de anticuerpo son especificidad al antígeno, afinidad al antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada del tejido, o enlace al antígeno ortólogo.
Otra modalidad proporciona un método para producir una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente, que comprende cultivar una célula hospedera que porta un vector que comprende un ácido nucleico descrito en la presente en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de enlace. En una modalidad, 50%-75% de la proteína de enlace producida de conformidad con el método es una proteína de enlace-DVD tetravalente específica dual descrita en la presente. En una modalidad, 75%-90% de la proteína de enlace producida de conformidad con este método es una proteína de enlace tetravalente específica dual. En una modalidad , 90%-95% de la proteína de enlace producida es una proteína de enlace tetravalente específica dual.
Otra modalidad proporciona una proteína producida de conformidad el método descrito.
En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, una composición farmacéutica que comprende una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, comprende además al menos un agente adicional. En una modalidad, el agente adicional es un agente terapéutico; un agente de imagen; un agente citotóxico; un inhibidor de angiogénesis; un inhibidor de cinasa; un bloqueador de molécula de co-estimulación; un bloqueador de molécula de adhesión; un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; una etiqueta detectable o reportero; un antagonista del TNF; un antirreumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo (NSAI D); un analgésico; un anestésico; un sedante; un anestésico local; un bloqueador neuromuscular; un antimicrobiano; un antipsoriático; un corticosteroide; un esteroide anabólico; una eritropoyetina; una inmunización; una inmunoglobulina; un inmunosupresor; una hormona de crecimiento; un fármaco de reemplazo de hormona; un radiofarmacéutico; un antidepresivo; un antipsicótico; un estimulante; un medicamento para asma; un agonista beta; un esteroide inhalado; una epinefrina o análogo; una citocina; o un antagonista de citocina.
Otra modalidad proporciona un método para tratar un sujeto para una enfermedad o un trastorno administrando al sujeto una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente que se une a TNF-a y esclerostina de manera que se logra el tratamiento.
Se proporciona un método para generar una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente, que comprende las etapas de: a) obtener un primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo b) obtener un segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo; c) construir cadenas de polipéptidos descritas en la presente; e) expresar las cadenas de polipéptidos; de manera que se genera una proteína de enlace-DVD.
En otra modalidad de los métodos descritos anteriormente, el primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, son un anticuerpo humano, un anticuerpo injertado a CDR, o un anticuerpo humanizado.
En otra modalidad de los métodos descritos anteriormente, el primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, son un fragmento Fab, un fragmento un F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región que determina la complementariedad aislada (CDR), un anticuerpo de cadena única, o diacuerpos.
En otra modalidad del método, el primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo posee al menos una propiedad deseada exhibida por la proteína de enlace-DVD.
En otra modalidad de los métodos descritos anteriormente el segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo posee al menos una propiedad deseada exhibida por la proteína de enlace-DVD.
En una modalidad, en el método descrito anteriormente, la región Fe es una región Fe de secuencia nativa o una región Fe de secuencia variante. En una modalidad, la región Fe es una región Fe de un lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.
En otra modalidad, en un método descrito anteriormente, una propiedad deseada es uno o más parámetros de anticuerpo del primero anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo.
En otra modalidad, en un método descrito anteriormente, una propiedad deseada es uno o más parámetros de anticuerpo del segundo anticuerpo parental.
En una modalidad, los parámetros de anticuerpo son especificidad al antígeno, afinidad al antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento al epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinéticas, biodisponibilidad, reactividad cruzada del tejido, o enlace al antígeno ortólogo.
En otra modalidad de los métodos descritos anteriormente, el primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, une el primer antígeno con una afinidad diferente que la afinidad con la cual el segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, se une al segundo antígeno.
En otra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, une el primer antígeno con una potencia diferente que la potencia con la cual el segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, se une al segundo antígeno.
En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente se une a esclerostina humana y es capaz de modular una función biológica de SOST.
Se proporciona una proteína de enlace neutralizante, en donde la proteína de enlace a esclerostina neutralizante comprende una proteína de enlace a esclerostina como se describe anteriormente, y en donde la proteína de enlace neutralizante es capaz de neutralizar a esclerostina.
En otra modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina neutralizante que se une a esclerostina pro-humano, esclerostina humana-madura, o esclerostina humana-truncada.
En una modalidad, una proteína de enlace a esclerostina neutralizante descrita en la presente disminuye la capacidad de esclerostina para unirse a su receptor. En una modalidad, una proteína de enlace a esclerostina neutralizante disminuye la capacidad de esclerostina pro-humana, esclerostina humana madura, o una esclerostina humana truncada para unirse al receptor de esclerostina.
En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina neutralizante descrita en la presente es capaz de reducir una o más actividades biológicas de esclerostina, que incluyen: inhibición de diferenciación de osteoblasto y función de osteoblasto que conduce a inhibición de formación ósea.
En una modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina que tiene una constante de unión (KaSoc) al objetivo de: al menos aproximadamente 102M"1s"1; al menos aproximadamente 103M" s" 1; al menos aproximadamente 104M"1s"1; al menos aproximadamente 105M"1s"1; o al menos aproximadamente 106M 1s 1; como se mide por resonancia de plasmón de superficie.
En otra modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina que tiene una constante de desunión (K<j¡soc) al objetivo de: a lo sumo aproximadamente 103s 1; a lo sumo aproximadamente 10"4s~ 1; a lo sumo aproximadamente 105s 1; o a lo sumo aproximadamente 10" 6s'1, como se mide por resonancia de plasmón de superficie.
En otra modalidad, se proporciona una proteína de enlace a esclerostina que tiene una constante de disociación (KD) al objetivo de: a lo sumo aproximadamente 10"7 M; a lo sumo aproximadamente 10"8M; a lo sumo aproximadamente 10"9 M; a lo sumo aproximadamente 1010 M; a lo sumo aproximadamente 1011 M; a lo sumo aproximadamente 10~12 M; o a lo sumo 1013 M.
Otro aspecto proporciona un constructo de proteína de enlace a esclerostina que comprende una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente y comprende además un polipéptido enlazador o un dominio constante de inmunoglobulina. En una modalidad, se proporciona el constructo de proteína de enlace a esclerostina, en donde el constructo comprende una proteína de enlace a esclerostina de una molécula de inmunoglobulina, un Fv enlazado a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo injertado a CDR, un anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo específico dual, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2, un Fv, o una proteína de enlace-DVD.
En una modalidad, se proporciona un constructo de proteína de enlace a esclerostina, en donde el constructo comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de un dominio constante IgM humano, un dominio constante lgG4 humano, un dominio constante IgG 1 humano, un dominio constante IgE humano, un dominio constante lgG2 humano, un dominio constante lgG3 humano, o un dominio constante IgA humano.
En aún otra modalidad, un constructo de proteína de enlace a esclerostina comprende un dominio constante de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidosSEC ID NO:1691; SEC ID NO:1692; SEC ID NO:1693; y SEC ID NO:1694.
En otra modalidad, un constructo de proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente tiene una vida media mayor in vivo que la contraparte soluble del constructo de proteína de enlace a esclerostina.
Otro aspecto proporciona un conjugado de proteína de enlace a esclerostina que comprende un constructo de proteína de enlace a esclerostina, en donde el conjugado de proteína de enlace a esclerostina comprende además una molécula de inmunoadhesión, un agente de imagen, un agente terapéutico, o un agente citotóxico.
Se proporcionan agentes de imagen ejemplares útiles en la elaboración de conjugados de proteína de enlace a esclerostina e incluye, pero no se limitan a, una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética, y biotina.
Se proporcionan radioetiquetas ejemplares e incluyen, pero no se limitan, a 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 1 l n, 125l , 1 31 l , 177Lu, 166Ho, o 153Sm.
En otra modalidad, se proporcionan un conjugado de proteína de enlace a esclerostina que comprende un agente terapéutico o citotóxico, el agente comprende además un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, o un agente apoptótico.
En otra modalidad, proteínas de enlace descritas en la presente poseen un patrón de glicosilación humano.
En otra modalidad, una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente, que incluye constructos de proteína de enlace a esclerostina y conjugados de proteína de enlace a esclerostina, pueden estar en la forma de proteína de enlace cristalizada. Formas cristalinas ejemplares retienen al menos alguna de la actividad de manera biológica de la forma no cristalizada de una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente. Tales formas cristalinas también pueden ser usadas como un farmacéutico libre de portador de liberación controlada de proteínas de enlace a esclerostina cristalizadas.
Otra modalidad proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas de enlace a esclerostina, que incluyen constructos de proteína de enlace, descritos en la presente. Tales ácidos nucleicos pueden ser insertados en un vector para llevar varias técnicas recombinantes y análisis genéticos para expresar, caracterizar o mejorar una o más propiedades de una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente. Vectores ejemplares para clonar ácidos nucleicos que codifican proteínas de enlace descritas en la presente incluyen, pero no se limitan a, pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, y pBJ .
Una célula hospedera comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de enlace se proporcionan y describen en la presente. Se proporcionan células hospederas y pueden ser procarióticas o eucarióticas. Una célula hospedera procariótica ejemplar es Escherichia coli. Se proporcionan células eucarióticas útiles como células hospederas e incluyen células protistas, células animales, células vegetales y células fúngicas.
Una célula fúngica ejemplar es una célula de levadura, que incluye Saccharomyces cerevisiae. Se proporciona una célula animal ejemplar útil como una célula hospedera e incluye, pero no se limita a, una célula de mamífero, una célula de ave y una célula de insecto. Células mamarias ejemplares incluyen células CHO y COS. Se proporciona una célula de insecto útil como una célula hospedera y es una célula de insecto Sf9.
Un vector puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente en la cual el ácido nucleico está operablemente ligado a secuencias transcripcionales y/o traduccionales apropiadas que permiten la expresión de la proteína de enlace en un vector que lleva la célula hospedera particular.
Otro aspecto proporciona un método para producir una proteína de enlace a esclerostina que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un vector que codifica la proteína de enlace a esclerostina en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de enlace capaz de enlazarse a esclerostina. La proteína así producida puede ser aislada y usada en varias composiciones y métodos descritos en la presente.
Se proporcionan composiciones e incluyen una composición para la liberación de una proteína de enlace, en donde la composición comprende: (a) una formulación, en donde la formulación comprende una proteína de enlace cristalizada, descrita en la presente, y un ingrediente; y (b) al menos un portador polimérico.
Se proporcionan portadores poliméricos ejemplares útiles en composiciones e incluyen, sin limitación, uno o más de los grupos que consisten de: poli (ácido acrílico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anhídridos), poli (depsipéptido), poli (ésteres), poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli (b- hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etilenglicol), poli ((hidroxipropil)metacrilamida, poli [(organo)fosfaceno], poli (ortoésteres), poli (alcohol vinílico), poli (vinilpirrolidona), copolímeros de alquilviniléter-anhídrido maleico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona un ingrediente de una composición, en donde el ingrediente es albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol o polietilenglicol.
Otra modalidad proporciona un método para tratar un mamífero que comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición descrita en la presente.
Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable también puede servir como un adyuvante para incrementar la absorción o dispersión se la proteína de enlace a esclerostina en una composición. Un adyuvante ejemplar es hialuronidasa.
En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende además al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual la actividad de SOST es perjudicial.
Otra modalidad proporciona un método para reducir la actividad de SOST humana que comprende poner en contacto SOST humano con una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente de manera que la actividad SOST humana se reduce.
En otra modalidad, una composición farmacéutica que comprende una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente comprende al menos un agente adicional. En una modalidad, el agente adicional es un agente terapéutico; un agente de imagen; un agente citotóxico; un inhibidor de angiogénesis; un inhibidor de cinasas; bloqueadores de molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; una etiqueta detectable o reportero; un antagonista del TNF; un antirreumático; un relajante muscular; un narcótico; un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo (NSAI D); un analgésico; un anestésico; un sedante; un anestésico local; un bloqueador neuromuscular; un antimicrobiano; un antipsoriático; un corticosteroide; un esteroide anabólico; una erítropoyetina; una inmunización; , una inmunoglobulina; un inmunosupresor; una hormona de crecimiento; un fármaco de reemplazo de hormona; un radiofarmacéutico; un antidepresivo; un antipsicótico; un estimulante; un medicamento para asma; un agonista beta; un esteroide inhalado; una epinefrina o análogo; , una citocina; o un antagonista de cítocina. Otra modalidad proporciona un método para tratar un sujeto para una enfermedad o un trastorno administrando al sujeto una proteína de enlace-DVD multiespecífica, multivalente, descrita en la presente que se une a TNF-a y esclerostina de manera que se logra el tratamiento.
En otra modalidad, se proporciona un trastorno que puede ser tratado por un método de administración a un sujeto de una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente, en donde el trastorno es artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de la insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de transplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsia, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasíticas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, insuficiencia cardíaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo I I , síndrome de Schmidt, síndrome de angustia respiratoria adulta (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerativa, sinovitis enteropática, artropatía asociada con clamidia, yersinia y salmonella, espondiloartropatía, enfermedad aretomatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad IgA lineal, enfermedad hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia permiciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, Enfermedad Libre Real/encefalitis miálgica, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con I nmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogamaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad del tejido conectivo mezclado, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositosis/polim iositosis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinfílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo-1 (hepatitis lupoide o autoinmune clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a la insulina tipo B con acantosis nigra, hiperparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad inmune cónica asociada con transplante de órgano, osteoartritis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1 , psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal de NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad idiopática masculina o NOS, autoinmunidad del esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía simpatétíca, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome del Buen pastor, manifestación pulmonar de poliarteritisnodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, Enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad de Takayasus/arteritis, tromocitopenia autoinmune, tromocitopenía idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bociógeno (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda de vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleostasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por fármaco, Esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección de estreptococcos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), Enfermedades mediadas Tipo Th1 y Tipo Th2, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma) Abetalipoproteinemia, Acrocianosis, procesos infecciosos o parasíticos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, Complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica de contacto, rinitis alérgica, rechazo al aloinjerto, deficiencia por antitripsina alfa-1, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de células asta anteriores, terapia ant-CD3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterosclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación atríal (sostenida o paroxismal), aleteo atrial, bloque atrioventricular, linfoma de células B, rechazo al injerto de hueso, rechazo al transplante de médula ósea (B T), bloque de rama del haz, linfoma Burkitt, quemaduras, arritmias cardíacas, síndrome de aturdimiento cardíaco, tumores cardíacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación de derivación cardiopulmonar, rechazo al transplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelares, trastornos cerebelares, taquicardia atrial multifocal o caótica, trastornos asociados a quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CM L) , alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardíaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis de contacto, cor pulmonar, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsias negativas de cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados a terapia de citocina, demencia pugilística, enfermedades desmielinantes, fiebre hemorrágica por dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad arteriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpo Lewy Difuso, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en edad media, trastornos de movimiento inducidos por fármaco por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad al fármaco, eczema, encefaliomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección del virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos cerebelares y extrapiramidales, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsia fúngica, gangrena por gas, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo al injerto de cualquier órgano o tejido, sepsia por gram negativa, sepsia por gram positiva, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallervorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al transplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del haz His, infección por VI H/neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hipercinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipocinético, evaluación del eje adrenal-pituitario-hipotalámico, enfermedad idiopática de Addison, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por el anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza A, exposición de radiación ionizante, iridociclitis/uveíties/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión, apoplejía isquémica, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma Kaposi, rechazo al transplante renal, legionela, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al transplante de hígado, lifedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólica/idiopática, cefalea por migraña, trastornos del sistema múltiple mitocondrial, enfermedad del tejido conectivo mezclado, gamopatía monoclonal , mieloma múltiple, degeneraciones del sistema múltiple (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia gravis, micobacteria de ave intracelular, micobacteria de tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos miocardiales, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I , fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia OKT3®, orquitis/epididimitis, procedimientos reversos de vasectomía/orquitis, organomegalia, osteoporosis, rechazo al trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidades, rechazo al transplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad pericardial, enfermedad arterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POE S (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal, y síndromes de cambios en la piel) , síndrome de post-perfusión, síndrome post-bomba, síndrome de cardiotomía post-MI , preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia por radiación, enfermedad y fenómeno de Raynaud, enfermedad de Raynaud , enfermedad de Refsum , taquicardia QRS estrecha regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión , cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo Lewy, artropatías seronegativas, choque, anemia de células falsiformes, rechazo al aloinjerto de piel, síndrome de cambios en la piel, rechazo al transplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis por estreptococcos, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxias sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de comienzo sistémico, células-T o FAB ALL, Telangiectasía, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, transplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo I I I , hipersensibilidad tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedad cardíaca bulbar, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis virales/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado-viral, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo al xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, poliradiculoneuropatía desmielinante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still en adulto, alopecia areata, anafilaxias, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplásica, arteriosclerosis, eczema atópica, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección de estreptococcos, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS) , miocarditis autoinmune, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasis, penfigoide buloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolípido catastrófico, enfermedad celiaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de comienzo infantil, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapso de disco, anemia mesolítica inmune inducida por fármaco, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome Guillain-Barré (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis de cuerpo de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinante inflamatoria, enfermedad cardíaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, I PF/UIP, iritis, queratitis, queratojuntivitis sicca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de células de Langerhan, livedo reticularis, degeneración macular, poliangiitis microscópica, morbus bechterev, trastornos neuronales motores, membrana mucosa penfigoide, insuficiencia de órgano múltiple, miastenia gravis, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de raíz nerviosa, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteólisis, cáncer de ovario, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), arteria periférica, enfermedad (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, J RA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome post-bomba, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasta de células rojas puras, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad cardíaca reumática, safo (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis, y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, choque pulmonar, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada con silicona, dermatosis de sneddon-wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidermal tóxica, mielitis transversa, TRAPS (receptor del factor necrosis del tumor, reacción alérgica tipo 1 , diabetes tipo I I , urticaria, neumonía intersticial usual (UI P), vasculitis, conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas o yersinia y artropatía asociada a salmonella.
Otra modalidad proporciona un método para tratar un sujeto para una enfermedad o un trastorno en el cual la actividad de SOST es perjudicial administrando al sujeto una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente de manera que se logra el tratamiento. El método puede ser usado para tratar trastornos respiratorios; asma; asma alérgica y no alérgica; asma debido a infección; asma debido a infección con virus sincitial respiratorio (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); otras condiciones que involucran inflamación de las vías respiratorias; eosinofilia; fibrosis y exceso de producción de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; trastornos atópicos; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; y enterogastritis alérgica; condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de la piel; condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias del intestino (IBD); colitis ulcerativa; enfermedad de Crohn, condiciones inflamatorias y/o autoinmunes del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática causada por hepatitis B y/o virus C; escleroderma; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin; infecciones virales; infección por HTLV-1 (por ejemplo, de HTLV-1 ); supresión de expresión de respuestas inmunes tipo 1 protectoras, o supresión de expresión de respuestas inmunes tipo 1 protectoras durante la vacunación.
En una modalidad adicional del método anterior, la administración del sujeto es por parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intrabronquial, intraabdominal, ¡ntracapsular, intracartilaginosa, intracavital, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardial, intraosteal , intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial , intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdermal.
Se proporciona un método para tratar un paciente que sufre de un trastorno en el cual la esclerostina es perjudicial comprende la etapa de administrar una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente antes, concurrente con, o después de la administración de un segundo agente, en donde el segundo agente son esteroides inhalados; beta-agonistas; beta-agonistas de acción corta o acción prolongada; agonistas de leucotrienos o receptores de leucotrieno; ADVAIR; inhibidores de IgE; anticuerpos anti-lgE; XOLAI R; inhibidores de fosfodiesterasa; inhibidores de PDE4; xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de células mástil; Cromolina; inhibidores de I L-4; inhibidores de I L-5; inhibidores de CCR3/eotaxina; agonistas de histamina o sus receptores que incluyen H 1 , H2, H3, y H4; antagonistas de prostaglandina D o sus receptores DP 1 y CRTH2; antagonistas TNF; un fragmento soluble de un receptor de TNF; ENBREL®; antagonistas de la enzima TNF; inhibidores de enzima que convierte el TNF (TACE); antagonistas del receptor muscarínico; antagonistas TGF-beta; gamma interferón; perfenidona; agentes quimioterapéuticos; metotrexato; leflunomida; sirolimus (rapamicina) o un análogo de la misma, CCI-779; inhibidores de COX2 o cPLA2; NSAI Ds; inmunomoduladores; inhibidores de p38; inhibidores de TPL-2, K-2 y NFkB; budesónida; factor de crecimiento epidermal; corticosteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor IL-1 ; anticuerpos anti-l 1-1 ß; anticuerpos anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos o agonistas del TNF, LT, IL-1 , IL-2, I L-3, I L-4, IL-5, I L-6, IL-7, I L-8, I L-9, I L-10, I L-1 1 , I L-12, I L-14, I L-15, IL-16, I L-1 7, I L-1 8, IL-19, I L-20, I L-21 , IL-22, I L-23, I L-24, IL-25, I L-26, I L-27, IL-28, I L-29, IL-30, I L-31 , I L-32, IL-33, EMAP-I I, GM-CSF, FGF, o PDGF; anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos; FK506; rapamicina; mofetil micofenolato; ibuprofeno; prednisolona; inhibidores de fosfodiesterasa; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento; agentes adrenérgicos; inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38, o MAP; inhibidores de la enzima que convierte IL-?ß; inhibidores de enzima que convierte TNF-a; inhibidores de señalización de células-T; inhibidores de metaloproteinasa; 6-mercaptopurinas; inhibidores de enzima que convierte angiotensina; receptores de citocina soluble; receptor de TNF p55 soluble; receptor TNF p75 soluble; si L-1 Rl ; sll_-1RII; slL-6R; citocinas anti-inflamatorias; IL-4; IL-10; IL-11; SOST; o TGF-ß.
Breve descripción de las figuras La Figura 1A es una representación esquemática de constructos de Dominio Variable Dual (DVD) y muestra la estrategia para la generación de una proteína de enlace-DVD de dos anticuerpos precursores.
La Figura 1B es una representación esquemática de constructos DVD1-lg, DVD2-lg, y dos clones de anticuerpo mono-específico quiméricos.
Las Figuras 2A-C demuestran el efecto de anti-TNF, anti-esclerostina, o terapias combinadas en hinchazón de la pata en un modelo de ratón de artritis inducida. La Figura 2A muestra el cambio en un el espesor de una pata cuando se dosifica con mAb TNF anti-ratón, mAb anti-esclerostina, o una combinación de tanto mAb TNF anti ratón y mAb anti-esclerostina. La Figura 2B muestra el volumen óseo del tobillo artrítico cuando se dosifica con mAb TNF anti-ratón, mAb anti-esclerostina o una combinación de ambos, mAb TNF anti-ratón y mAb anti-esclerostina. La Figura 2C muestra la densidad ósea del hueso trabecular en la espina lumbar (L5) cuando se dosifica con mAb TNF anti-ratón, mAb anti-esclerostina o una combinación de cambios, mAb TNF anti-ratón y mAb anti-esclerostina.
La Figura 3 demuestra la alineación de anticuerpos anti- SOST.
Las Figuras 4A-C muestran la neutralización combinada de TNF y SOST en un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratón terapéutico en el cual la terapia comienza cinco días después del comienzo de la inflamación. La Figura 4A muestra el cambio en espesor de la pata cuando se dosifica con mAb TNF anti-ratón, mAb anti-esclerostina, o una combinación de tanto mAb TNF anti-ratón como mAb anti-esclerostina. La Figura 4B muestra el volumen óseo del tobillo artrítico cuando se dosifica con mAb TNF anti-ratón, mAb anti-esclerostina, o una combinación de tanto mAb TN F anti-ratón como mAb anti-esclerostina. La Figura 4C muestra la densidad ósea del hueso trabecular en la espina lumbar (L5) cuando se dosifica con mAb TNF anti-ratón, mAb anti-esclerostina, o una combinación de tanto mAb TNF anti-ratón como mAb anti-esclerostina.
Las Figuras 5A-C muestran la capacidad de inhibición de esclerostina para restaurar el hueso en la articulación artrítica en ratones en los cuales la terapia comienza cinco días después del comienzo de la inflamación. La Figura 5A muestra el cambio en el espesor de la pata cuando se dosifica con un terapéutico anti-I L1 a y un terapéutico anti-l L 1 ß, anti-esclerostina, o una combinación de un terapéutico anti-l L1 a y un terapéutico anti-l L1 ß y anti-esclerostina. La Figura 5B muestra el volumen óseo del tobillo artrítico cuando se dosifica con un terapéutico anti-I L1 a y un terapéutico anti-I L1 ß, anti-esclerostina, o una combinación de un terapéutico anti-l L1 a y un terapéutico anti-l L1 ß y anti-esclerostina. La Figura 5C muestra la densidad ósea del hueso trabecular en la espina lumbar (L5) cuando se dosifica con un terapéutico anti-l L1 a y un terapéutico anti-l L 1 ß, anti-esclerostina, o una combinación de terapéutico anti-l L1 a y un terapéutico a nti-l L 1 ß y anti-esclerostina.
Las Figuras 6A-B muestran los datos de un modelo de ratón de enfermedad de Crohn. La Figura 6A muestra el registro de inflamación de colon cuando los ratones son dosificados con mAb anti-TNF, mAb anti-esclerostina, o una combinación de mAb anti-TNF y mAb anti-esclerostina. La Figura 6B muestra la densidad ósea del hueso trabecular en la espina lumbar (L5) cuando los ratones son dosificados con mAb anti-TNF, mAb anti-esclerostina, o una combinación de mAb anti-TNF y mAb anti-esclerostina.
Las Figuras 7A-B muestran los datos de perfil de enlace los cuales demuestran que la Esclerostina ejempla/lgGs-DVD de TNF se enlaza a esclerostina una vez saturados con TNF y vice versa.
Descripción detallada de la invención Se proporcionan proteínas de enlace a esclerostina, que incluyen , pero no se limitan a, anticuerpos anti-esclerostina , o porciones de enlace al antígeno de los m ismos, que se enlazan a esclerostina y proteínas de enlace m ultiespecíficas, multivalentes tales como proteínas de enlace-DVD que se enlazan a SOST y otros objetivos. Se proporcionan varios aspectos que se refieren a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, proteínas de enlace a DVD, y composiciones farmacéuticas de las mismas, así como también ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y célu las hospederas para elaborar tales proteínas de enlace a esclerostina, que incluyen anticuerpos, proteínas de en lace-DVD, y fragmentos de los mismos. También se proporcionan métodos para usar las proteínas de en lace a esclerostinas para detectar esclerostina humana, ya sea in vitro o in vivo; y para regular la expresión del gene.
También se proporciona cualqu ier proteína o anticuerpo de enlace capaz de competir con una proteína de enlace a esclerosti na descrita en la presente.
A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos deben tener los significados q ue son comúnmente entendidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. El sig nificado y alcance de los térm inos debe ser claro, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente toman precedente sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca . Además, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, térm inos singulares deben incluir pluralidades y los términos plurales deben incluir el singular. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se declare de otro modo. Además, el uso del término "que incluye", así como también otras formas, tales como "incluye" e "incluido" no es limitante. También, los términos tales como "elemento" o "componente" abarca tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se declare específicamente de otro modo.
En general, las nomenclaturas usadas en conjunto con, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, hibridación y química de ácido nucleico y proteína y genética descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el arte. Los métodos y técnicas proporcionados son en general realizados de conformidad con los métodos convencionales bien conocidos en el arte y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidas a través de la presente especificación a menos que se indique de otro modo. Las técnicas de purificación y reacciones enzimáticas son realizadas de conformidad con las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las nomenclaturas usadas en conjunto con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y médica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se usan técnicas estándares para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de pacientes.
Los que se proporciona puede ser más fácilmente entendido, los términos selectos se definen abajo.
El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" son usados intercambiablemente con el término polipéptido y también se refiere a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptido de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El uso de "polipéptido" aquí está propuesto para abarcar polipéptidos y fragmentos y variantes (que incluyen fragmentos de variantes) de los mismos, a menos que se contradiga de otro modo por el texto. Para un polipéptido antigénico, un fragmento de polipéptido opcionalmente contiene al menos un epítope de polipéptido no lineal o contiguo. Los límites precisos de al menos un fragmento de epítope pueden ser confirmados usando habilidad ordinaria en la técnica. El fragmento comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos contiguos, tal como al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, o al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos. Una variante de polipéptido es como se describe en la presente.
El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" se refiere a una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociada con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado nativo; está sustancialmente libre de otras proteínas de las mismas especies; es expresada por una célula de una especie diferente; o no ocurre en la naturaleza. De este modo, un polipéptido que es químicamente sintetizado o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente será "aislado" de sus componentes naturalmente asociados. Una proteína también puede ser considerada sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en el arte.
El término "recuperar" se refiere al proceso de proporcionar una especie química tal como polipéptido sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados por aislamiento, por ejemplo, usando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en el arte.
Los términos "Esclerostina humana" o "SOST humana" (abreviada aquí como "hSOST") se refieren a una proteína de 24 KD, o fragmentos activos de los mismos, llamados esclerostina que han sido clasificados como un miembro de la familia DAN de glicoproteínas que contienen cisteína nodal con base en la similitud de secuencia (Avasian-Kretchmer (2004) Mol. Endocrinol. 8(1):1-12). La esclerostina es un regulador negativo de formación ósea que inhibe la proliferación de osteoblastos así como también diferenciación y suprime la mineralización de células osteoblásticas in vitro (Poole et al. (2005) FASEB J. 19:1836-38; Winkler et al. (2005) J. Biol. Chem. 280(4): 2498-2502). El término "SOST" humana está propuesto para incluir SOST humana recombinante (rhSOST) la cual puede ser preparada por métodos de expresión recombinante estándar. La secuencia de SOST humana se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Secuencia de Esclerostina Humana "Actividad biológica" se refiere a todas las propiedades biológicas inherentes de la citocina. Las propiedades biológicas de esclerostina incluyen, pero no se limitan a, enlace a un receptor de esclerostina.
Los términos "enlace específico" o "específicamente enlazante" con referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un péptido con una segunda especie química, significa que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítope) en las especies químicas; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para un epítope "A" , la presencia de una molécula que contiene el epítope A (o A no etiquetada, libre), en una reacción que contiene "A" etiquetada y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A etiquetada unida al anticuerpo.
El término "anticuerpo" se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) comprendida de cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, muíante, variante o derivación del mismo, el cual retiene las características de enlace al epítope esenciales de una molécula Ig. Tales formatos de anticuerpo mutantes, variantes o derivados se conocen en la técnica. Ejemplos no limitantes de los cuales se discuten abajo.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios: CH 1 , CH2, y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser además subdivididas en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones que determinan la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de armazón (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas del término amino al término-carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA y IgY), clase (por ejemplo, IgG 1 , lgG2, IgG 3, lgG4, lgA1 y lgA2) o subclase.
El término "región Fe" se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, la cual puede ser generada por digestión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. La región Fe de una inmunoglobulina en general comprende dos dominios constantes, un dominio CH2, y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Los reemplazos de los residuos de aminoácido en la porción Fe para alterar la función efectora de anticuerpo se conocen en la técnica (Patentes Estadounidenses Nos. 5,648,260 y 5,624,821 ). La porción Fe de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción por citocina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y relación de separación/vida media del anticuerpo y complejos de anticuerpo-antígeno. En algunos casos estas funciones efectoras son deseables para anticuerpos terapéuticos pero en otros casos podrían ser innecesarias o aún deletéreas, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos IgG humanos, particularmente IgG 1 e lgG3, median ADCC y CDC vía enlace a FcRys y C1 q de complemento, respectivamente. Receptores Fe neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media de circulación de anticuerpos. En todavía otra modalidad al menos un residuo de aminoácido es colocado en la región constante del anticuerpo, por ejemplo, la región Fe del anticuerpo, de manera que las funciones efectoras del anticuerpo son alteradas. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobulina es mediada por la dimerización de dominios CH3 y es estabilizada por los enlaces disulfuro dentro de la región de articulación (Huber et al. Nature 264:41 5-20; Thies et al. (1 999) J. Mol. Biol. 293:67-79.). La mutación de los residuos de cisteína dentro de las regiones de articulación para prevenir los enlaces disulfuro de cadena pesada-cadena pesada desestabilizarán la dimerización de dominios CH3. Los residuos responsables de la dimerización de CH3 han sido identificados (Dall'Acqua ( 1998) Biochem. 37:9266-9273.). Por lo tanto, es posible generar un lg-medio monovalente. De manera interesante, estas moléculas Ig medias monovalentes se han encontrado en la naturaleza para tanto las subclases IgG e IgA (Seligman ( 1978) Ann . I mmunol. 129:855-70; Biewenga et al. (1983) Clin. Exp. Immunol. 51 : 395-400). La estequiometria de FcRn: La región Fe de Ig ha sido determinada por ser 2: 1 (West et al. (2000) Biochem. 39: 9698-708), y Fe medio es suficiente para mediar el enlace de FcRn (Kim et al . ( 1994) Eur. J . I mmunol. 24: 542-548). Las mutaciones para romper la dimerización del dominio CH3 no pueden tener mayor efecto adverso en su enlace de FcRN ya que los residuos importantes para la dimerización de CH3 están localizados en la superficie interna de la estructura de la lámina b de CH3, mientras la región responsable para enlace a FcRN se localiza en la superficie externa de los dominios CH2-CH3. Sin embargo, la molécula Ig media puede tener cierta ventaja en la penetración del tejido debido a su tamaño más pequeño que aquel de un anticuerpo regular. En una modalidad proporcionada, al menos un residuo de aminoácido es reemplazado en la región constante de la proteína de enlace, por ejemplo la región Fe, de manera que la dimerización de las cadenas pesadas se rompe, resultando en moléculas Ig de DVD media. La actividad inflamatoria de IgG es completamente dependiente de la sililación del glicano N-ligado del fragmento Fe de IgG. Los requerimientos de glicano precisos para actividad anti-inflamatorio han sido determinados, de manera que un fragmento Fe de IgG 1 apropiado puede ser creado, de este modo generando un Fe de IgG 1 sililado, completamente recombinante, con potencia mayormente mejorada (Anthony et al. (2008) Science 320:373-376).
El término "porción de enlace al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, esclerostina humana (hSOST)). Se ha mostrado que la función de enlace al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Tales modalidades de anticuerpo pueden también ser formatos biespecíficos, específicos duales o multi-específicos; especialmente que enlaza a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL, y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341 :544-546, Publicación de PCT No. WO 90/05144), el cual comprende un dominio de variable única; y (vi) una región que determina la complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite ser elaborados como una cadena de proteína única en la cual las regiones VL y VH par forman moléculas monovalentes (conocidas con Fv de cadena única (scFv) ; véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única también están propuestos para estar abarcados dentro del término "porción de enlace al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como diacuerpos también están abarcadas. Los diacuerpos son bivalentes, anticuerpos biespecíficos en los cuales, los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptido única, pero usando un enlazador que es también corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, con ello forzando los dominios para aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de enlace al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak et al . (1994) Structure 2: 1 121 -1 123). Tales porciones de enlace al anticuerpo se conocen en la técnica (Kontermann and Dubel eds. , Antibody Engineering (2001 ) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). Además los anticuerpos de cadena única también incluyen "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fv en serie (VH-CH 1 -VH-CH 1 ) los cuales, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de enlace al antígeno (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(1 0): 1 057-1062; y Patente Estadounidense No. 5,641 ,870) .
Un dominio constante de inmunoglobulina (C) se refiere a un dominio constante de cadena ligera (CL) o pesada (CH). Las secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena ligera y cadena pesada IgG murina y humana se conocen en la técnica.
El término "constructo de proteína de enlace" se refiere a un polipéptido que comprende uno o más de las porciones de enlace al antígeno ligadas a un polipéptido enlazador o un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipéptidos enlazadores comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y son usados para ligar una o más porciones de enlace al antígeno. Tales polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Holliger et al. (1 993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1 121 -1 1 23). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena ligera y pesada. Secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena ligera y pesada IgG humanas se proporcionan en la Tabla 3.
Las secuencias de dominio VH y VL proporcionadas abajo comprenden reg iones que determinan la complementariedad (CDR) y regiones de armazón que son ya sea conocidas en la técnica o fácilmente discernibles usando métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, una o más de estas CDR y/o secuencias de armazón son reem plazadas, sin pérdida o función , por otras CDR y/o secuencias de armazón de proteínas en lazantes que se conocen en la técnica por enlazarse al m ismo antígeno.
Tabla 3. Secuencia de Dominio Constante de Cadena Pesada Humano y Domin io Constante de Cadena Ligera Todavía además, una proteína de enlace a esclerostina, tal como un anticuerpo o porción de enlace al antígeno de la misma, puede ser parte de una molécula de ¡nmunoadhesión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción del anticuerpo con uno o más de otros péptidos o proteínas. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesion incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al. (1 995) Human Antibod. Hybridomas 6: 93-1 01 ) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas scFv biotiniladas y bivalentes (Kipriyanov et al. (1 994) Mol. I mmunol. 31 : 1047-1058). Porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, pueden ser preparadas de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Sin embargo, anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener usando técnicas recombinantes estándares de DNA, como se describe en la presente.
El término "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente hSOST está sustancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente antígenos diferentes al hSOST). Un anticuerpo aislado que une específicamente hSOST, sin embargo, pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las moléculas esclerostina de otras especies. Sin embargo, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos.
El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles m utaciones presentes de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada mAb se dirige contra una sola determ inante del antígeno. No se debe interpretar que el modificador "monoclonal" requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular.
Se pretende que el término "anticuerpo humano" incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobu lina de la línea germinal humana . Se proveen anticuerpos humanos y pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina germinales (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante m utagénesis aleatoria o puntual in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Sin embargo, no se pretende que el término "anticuerpo humano" incluya anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la l í nea germinal de otras especies de mam íferos, tales como un ratón , han sido injertadas en secuencias de armazón humanas.
Se pretende que el térm ino "anticuerpo humano recombi nante" incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan , expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando u n vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera (descrito adicionalmente en la Sección II C, más adelante), los anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios, recombinantes (Hoogenboom (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy y Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo y Larrick (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21: 371-378), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann y Green (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-597; Little et al (2000) Immunol. Today 21: 364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que involucre el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de DNA. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por consiguiente las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y están relacionadas con secuencias VH y VL de línea germinal humana, no existen de manera natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie y secuencias de región constante de otras especies, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera enlazadas a regiones constantes humanas.
El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie aunque en los cuales las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se remplazan con secuencias CDR de otra especie, tales como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de murino en las cuales una o más de las CDRs de murino (por ejemplo, CDR3) han sido remplazadas con secuencias CDR humanas.
Los términos "numeración Kabat", "definiciones Kabat", y "etiquetado Kabat" se utilizan indistintamente en la presente. Estos términos, los cuales son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos los cuales son más variables (es decir, hipervariable) a diferencia de los residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de enlace al antígeno de los mismos (Kabat et al. (1 971 ) Ann. NY Acad. Sci. 1 90:382-391 y Kabat, E.A. , et al. (1 991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NI H Publication No. 91 -3242). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable de las posiciones de aminoácidos 31 a 35 de CDR 1 , posiciones de aminoácidos 50 a 65 de CDR2, y posiciones de aminoácidos 95 a 102 de CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácidos 24 a 34 de CDR1 , posiciones de aminoácidos 50 a 56 de CDR2, y posiciones de aminoácidos 89 a 97 de CDR3.
El término "CDR" se refiere a la región determinante de la complementariedad dentro de las secuencias variables de anticuerpos. Hay tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las cuales son CDR1 , CDR2 y CDR designadas, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDR" se refiere a un grupo de tres CDRs que están presentes en una sola región variable capaz de unir el antígeno. Los contornos exactos de estas CDRs se han definido de diferente modo de acuerdo a diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991 )) no sólo provee un sistema de numeración de residuos inequívoco a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también provee contornos de residuos precisos que definen los tres CDRs. Estos CDRs pueden denominarse como CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk (1987) J . Mol. Biol. 196:901 -91 7 y Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883) encontraron que ciertas sub-porciones dentro de CDRs Kabat adoptan conformaciones de estructura de péptidos casi idénticos, a pesar de que tienen gran diversidad al nivel de secuencia de aminoácidos. Estas sub-porciones se designaron como L1 , L2, y L3 o H 1 , H2, y H3 donde la "L" y la "H" designan las regiones de la cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden referirse como CDRs de Chothia, las cuales tienen contornos que se superponen con las CDRs de Kabat. Otros contornos que definen los CDRS que se superponen con los CDRs de Kabat han sido descritos por Padlan (1995). Los métodos descritos en la presente pueden utilizar CDRs definidas de acuerdo a cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas modalidades utilizan CDRs definidas de Kabat o Chothia.
El término "residuo canónico" se refiere a un residuo en una CDR o armazón que define una estructura de CDR canónica particular que se define en Chothia et al. (1 987) J . Mol. Biol. 1 96:901 -907; Chothia et al. (1 992) J . Mol. Biol. 227:799). De acuerdo con Chothia et al. , las porciones críticas de las CDRs de muchos anticuerpos tienen confirmaciones de estructura de péptidos casi idénticas a pesar de la gran diversidad al nivel de secuencia de aminoácidos. Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión de estructura de péptidos para un segmento contiguo de residuos de aminoácidos que forman un bucle.
Un anticuerpo "de afinidad madurada" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDRs de los mismos los cuales dan como resultado en una mejora en la afinidad del anticuerpo para un antígeno objetivo, en comparación con un anticuerpo parental el cual no posee la(s) alteración(es). Los anticuerpos de afinidad madurada ejemplificantes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Una variedad de procedimientos para producir anticuerpos de afinidad madurada son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al. (1992) Bio/Technol. 1 0: 779-783 describe la maduración de afinidad mediante reordenación de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos del armazón se describe en Barbas et al. ( 1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 : 3809-381 3; Schier et al. (1 995) Gene 1 69: 147- 155; Yelton et al. (1 995) J. Immunol. 155: 1 994-2004; Jackson et al. ( 1 995) J. Immunol. 154(7):3310-331 9; Hawkins et al. (1 992) J. Mol. Biol. 226:889-896. La mutación selectiva en las posiciones de mutagénesis selectiva y en contacto o posiciones de hipermutación con un residuo de aminoácido de mejora de la actividad se describe en la Patente Norteamericana No. 6,914, 128.
El término "proteína de enlace multivalente" denota una proteína de enlace que comprende dos o más sitios de enlace de antígenos. En una modalidad, la proteína de enlace multivalente se manipula genéticamente para tener tres o más sitios de enlace de antígenos, y en general no es un anticuerpo presente de manera natural. El término "proteina de enlace multi-específica" se refiere a una proteína de enlace capaz de unir dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Se proveen proteínas de enlace del "dominio variable dual ("DVD") y comprenden dos o más sitios de enlace de antígenos y son proteínas de enlace tetravalentes y multivalentes. Los DVDs pueden ser mono-específicos, es decir, capaces de unir un antígeno, o multi-específicos, es decir, capaces de unir dos o más antígenos. Una "proteína de enlace de DVD" comprende dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera. Cada mitad de una proteína de enlace de DVD comprende un polipéptidos de DVD de cadena pesada y un polipéptidos de DVD de cadena ligera, y dos o más sitios de enlace de antígenos. Cada sitio de enlace comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de seis CDRs involucradas en el enlace del antígeno por sitio de enlace de antígenos. Las proteínas de enlace DVD también se conocen como moléculas DVD-lg™.
Una descripción del diseño, expresión, y caracterización de proteínas de enlace de DVD se proveen en la Publicación PCT No. WO 2007/024715, Patente Norteamericana No. 7,612,181 , y Wu et al. (2007) Nature Biotech. 25: 1 290-1297. Un ejemplo de tales proteínas de enlace de DVD comprende una cadena pesada que comprende la fórmula estructural VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlace con la condición de que el mismo no sea CH1 , X2 es una región Fe, y n es 0 o 1 , aunque en una modalidad, 1 ; y una cadena ligera que comprende la fórmula estructural VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlace con la condición de que él mismo no sea CL, y X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1 , aunque, en una modalidad, 1 . Tal proteína de enlace de DVD puede comprender dos de tales cadenas pesadas y dos de tales cadenas ligeras, en donde cada cadena comprende dominios variables enlazados simultáneamente sin una región constante intermedia entre las regiones variables, en donde una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar sitios de enlace de antígenos funcionales en tándem , y un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse sin otro par de cadenas pesadas y ligeras para formar una proteína de enlace tetramérica con cuatro sitios de enlace de antígenos funcionales. En otro ejemplo, la proteína de enlace de DVD puede comprender cadenas pesada y ligera que comprenden cada una tres dominios variables (VD1 , VD2, VD3) enlazados en tándem sin una región constante intermedia entre los dominios variables, en donde un par de cadenas pesada y ligera pueden asociarse para formar tres sitios de enlace de antígenos, y en donde un par de cadenas pesada y ligera pueden asociarse con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de enlace tetramérica con seis sitios de enlace de antígenos.
Una proteína de enlace de DVD puede unir uno o más epítopes de esclerostina. Una proteína de enlace de DVD también puede unir un epítope de esclerostina y un epítope de un segundo antígeno objetivo en vez de un polipéptido de esclerostina.
El término "anticuerpo biespecífico" se refiere a anticuerpos de longitud completa que se generan mediante tecnología quadroma (ver Milstein y Cuello ( 1983) Nature 305(5934):537-40), mediante conjugación química de dos diferentes anticuerpos monoclonales (ver Staerz et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31 ), o mediante tecnologías de perilla en el orificio o similares la cual introduce mutaciones en la región Fe (ver Holliger et al. ( 1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(14):6444-6448), obteniendo como resultado múltiples especies de inmunoglobulina diferentes de las cuales solamente una es el anticuerpo biespecífico funcional. Mediante la función molecular, un anticuerpo biespecífico une un antígeno (o epítope) en uno de sus dos ramas de enlace (un par de HC/LC) , y une un diferente antígeno (o epítope) en su segundo brazo (un par diferente de HC/LC). Mediante esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos distintos ramas de enlace de antígenos (tanto en la especificidad como en las secuencias CDR), y es monovalente para cada antigeno al cual el mismo se une.
El término "anticuerpo específico dual" se refiere a anticuerpos de longitud completa que pueden unir dos diferentes antígenos (o epítopes) en cada uno de sus dos ramas de enlace (un par de HC/LC) (ver Publicación PCT No. WO 02/02773). De acuerdo con esto una proteína de enlace específica dual tiene dos ramas de enlace de antígenos idénticos, con especificidad idéntica y secuencias CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al cual el mismo se une.
Un "sitio de enlace de antígeno funcional" de una proteína de enlace es uno que es capaz de unir un antígeno objetivo. La afinidad de enlace de antígeno del sitio de enlace de antígeno no necesariamente es tan fuerte como el anticuerpo parental del cual se deriva el sitio de enlace de antígeno, aunque la capacidad de unir el antígeno debe ser medible utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar el enlace de anticuerpos a un antígeno. Además, la afinidad de enlace de antígeno de cada uno de los sitios de enlace de antígeno de un anticuerpo multivalente de la presente no necesita ser cuantitativamente igual.
El término "citocina" es un término genérico para proteínas que se liberan mediante una población de células y que actúa en otra población de células como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas de polipéptido tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas de crecimiento, tales como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento de N-metionilo y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroides; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pro-relaxina; hormonas de glicoproteína, tales como hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante para la tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de los fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; un factor de necrosis tumoral tales como factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) y factor alfa de necrosis tumoral (TNF-ß); sustancia inhibidora de la hormona mulleriana; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de los nervios tales como NGF-alfa (NGF-a); factor de crecimiento de las plaquetas; factor de crecimiento placentario; factores transformantes de crecimiento de (TGFs) tales como TGF-alfa (TGF-a) y TGF-beta (TGF-ß); factor 1 y 1 1 de crecimiento similar a la insulina y eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferonas tales como interferón-alfa (IFN-a), interferón-beta (IFN-ß), e interferón-gamma (I FN-?); factores estimuladores de colonias (CSFs) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF) ; interleucinas (I Ls) tales como IL- 1 , IL-2, I L-3, IL-4, I L-5, I L-6, I L-7, I L-8, I L-9, I L-1 0, I L-1 1 , I L-12, I L-1 3, I L-15, I L-17, IL-1 8, I L-21 , I L-22, IL-23, I L-33; y otros factores de polipéptidos incluyendo LI F y ligando kit (KL). El término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencias naturales.
Los términos "donador" y "anticuerpo donador" se refieren a un anticuerpo que provee una o más CDRs. En una modalidad, el anticuerpo donador es un anticuerpo de una especie diferente al anticuerpo del cual se obtienen o derivan las regiones de armazón. En el contexto de un anticuerpo humanizado, el término "anticuerpo donador" se refiere a un anticuerpo no humano que provee una o más CDRs.
Los términos "armazón" y "secuencia de armazón" se refieren a las secuencia restantes de una región variable menos las CDRs. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR se puede determinar mediante diferentes sistemas, el significado de una secuencia de armazón se somete a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDRs (CDR-L1 , -L2, y -L3 de cadena ligera y CDR-H 1 , -H2, y -H3 de cadena pesada) también dividen las regiones de armazón en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro sub-regiones (FR1 , FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en la cual la CDR1 se posiciona entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR1 , FR2, FR3 o FR4, una región de armazón, como se refiere por las otras, representa las FRs combinadas dentro de la región variable de una sola cadena de ¡nmunoglobulina presente de manera natural. Una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y FRs representa dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen una región de armazón.
Los términos "aceptador" y "anticuerpo aceptador" se refiere al anticuerpo que provee o secuencia de ácido nucleico que codifica al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 1 00% de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones de armazón. En algunas modalidades, el término "aceptador" se refiere al aminoácidos del anticuerpo que provee o secuencia de ácido nucleico que codifica la(s) región(es) constante(s). En aún otra modalidad, el término "aceptador" se refiere al aminoácidos de anticuerpo que provee o secuencia de ácido nucleico que codifica una o más de las regiones de armazón y la(s) región(es) constante(s). En una modalidad específica, el término "aceptador" se refiere a un aminoácidos de anticuerpo humano o secuencia de ácido nucleico que provee o codifica al menos 80%, en una modalidad, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 1 00% de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones de armazón. De acuerdo con esta modalidad, un aceptador puede contener al menos 1 , al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 10 residuos de aminoácidos que se presentan(n) en una o más posiciones específicas de un anticuerpo humano. Una región de armazón aceptadora y/o región(es) constante(s) aceptadora(s) por ejemplo pueden derivarse u obtenerse de un gene de anticuerpo de línea germinal , un gene de anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (por ejemplo, anticuerpos bien conocidos en la técnica, anticuerpos en desarrollo, o anticuerpos comercialmente disponibles).
Las secuencias aceptadoras humanas de cadena pesada y cadena ligera son conocidas en la técnica. En una modalidad, se proveen secuencias aceptadoras humanas de cadena pesada y cadena ligera de base V (hvbase.mrc-cpe.cam.ac. uk/) o de IMGT®, el sistema® de información de I mMunoGeneTics internacional (himgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/). Los términos "gene del anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refieren a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que lleva al reordenamiento genético y mutación para la expresión de una inmunoglobulina particular. (Ver, por ejemplo, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3) : 183-200; Marchalonis et al. (2001 ) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 1 3-30). Una de las ventajas proporcionadas por varias modalidades provienen del reconocimiento de que los genes de anticuerpos de línea germinal son más susceptibles que los genes de anticuerpos maduros a conservar las estructuras de secuencias de aminoácidos esenciales características de individuos en las especies, de ahí que sea menos probable que sea reconocida de una fuente extraña cuando se utiliza terapéuticamente en esa especie.
Los términos residuos "clave" se refieren a ciertos residuos dentro de la región variable que tienen más impacto en la especificidad y/o afinidad de enlace de un anticuerpo, en particular un anticuerpo humanizado. Un residuo clave incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: un residuo que es adyacente a un CDR, un sitio de glicosilación potencial (puede ser ya sea el sitio de glicosilación N u O), un residuo raro, un residuo capaz de interactuar con el antígeno, un residuo capaz de interactuar con un CDR, un residuo canónico, un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, un residuo dentro de la zona Vernier, y un residuo en la región que se superpone entre la definición de Chothia de una CDR1 de cadena pesada variable y la definición de Kabat del primer armazón de cadena pesada.
Los términos "anticuerpo humanizado" se refieren a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las cuales al menos una porción de la secuencia VH y/o VL ha sido alterada para ser más "similar a la humano", es decir, más similar a secuencias variables de líneas germinales humanas. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el cual las secuencias CDR humanas se introducen en secuencias VH y VL no humanas para remplazar las correspondientes secuencias CDR no humanas. También el "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo el cual se une inmuno-específicamente a un antígeno de interés y el cual comprende una región de armazón (FR) que sustancialmente tiene la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a los de una inmunoglobulina no humana (es decir anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de armazón son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones de CH 1 , bisagra, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado solamente contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.
Un anticuerpo humanizado puede ser de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA o IgE, o cualquier isotipo incluyendo sin limitación IgG 1 , lgG2, lgG3, o lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas utilizando técnicas bien conocidas en el arte.
El armazón y regiones CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder precisamente a las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donador o el armazón puede mutagenizarse mediante sustitución, inserción y/o eliminación de al menos un residuo de aminoácido de modo que la CDR o residuo de armazón en ese sitio no corresponda al anticuerpo donador ni al armazón de consenso. En una modalidad, tales mutaciones, sin embargo, no serán extensivas. Usualmente, al menos 80%, al menos 85%, adicionalmente al menos 90%, y al menos 95% de los residuos de aminoácidos humanizados corresponderán a las de las secuencias de FR parental y CDR. El término "armazón de consenso" se refiere a la región de armazón en la secuencia de inmunoglobulina de consenso. El término "secuencia de inmunoglobulina de consenso" se refiere a la secuencia formada de los aminoácidos (o nucleótidos) presentes más frecuentemente en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (ver por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1 987)). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso es ocupada por el aminoácido presente más frecuentemente en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos están presentes con igual frecuencia, cualquiera puede incluirse en la secuencia de consenso.
Con respecto a la construcción de la proteína de enlace de DVD u otras moléculas de proteína de enlace, un "enlace" se utiliza para denotar polipéptidos que comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos mediante uniones de péptidos y se utilizan para enlazar una o más porciones de enlace al antígeno. Tales polipéptidos de enlace son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure, 2: 1121-1123). Los enlaces ejemplificantes incluyen, pero no están limitados a, GGGGSG (SEC ID NO:1695), GGSGG (SEC ID NO:1696), GGGGSGGGGS (SEC ID NO:1697), GGSGGGGSGS (SEC ID NO:1698), GGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO:1699), GGGGSGGGGSGGGG (SEC ID NO:1700), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO:1701), ASTKGP (SEC ID NO:1702), ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO:1703), TVAAP (SEC ID NO:1704), TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO:1705), AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID NO:1706), AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO:1707), AKTTPKLGG (SEC ID NO:1710), SAKTTPKLGG (SEC ID NO:1709), SAKTTP (SEC ID NO:1702), RADAAP (SEC ID NO:1711), RADAAPTVS (SEC ID NO:1712), RADAAAAGGPGS (SEC ID NO:1713), RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO:1714), SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO:1715), ADAAP (SEC ID NO:1716), ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO:2050), QPKAAP (SEC ID NO:2051), QPKAAPSVTLFPP (SEC ID NO:2052), AKTTPP (SEC ID NO:2053), AKTTPPSVTPLAP (SEC ID NO:2054), AKTTAP (SEC ID NO:2055), AKTTAPSVYPLAP (SEC I D NO:2056), GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO:2057), GPAKELTPLKEAKVS (SEC I D NO:2058), y GHEAAAV QVQYPAS (SEC I D NO:2059).
El término zona "Vernier" se refiere a un subconjunto de residuos de armazón que pueden ajustar la estructura de CDR y precisar el ajuste al antígeno que se describe en Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499). Los residuos de la zona Vernier forman una capa por debajo de las CDRs y pueden impactarse en la estructura de las CDRs y la afinidad del anticuerpo.
El término "neutralizante" se refiere a la neutralización de la actividad biológica de un antígeno (por ejemplo, SOST) cuando una proteína de enlace une específicamente el antígeno. En una modalidad, una proteína de enlace neutralizante descrita en la presente se une al hSOST dando como resultado la inhibición de una actividad biológica de hSOST. En una modalidad, la proteína de enlace neutralizante une el hSOST y reduce una actividad biológica de hSOST aproximadamente al menos al 20%, 40%, 60% , 80%, 85%, o más. La inhibición de una actividad biológica de hSOST mediante una proteína de enlace neutralizante se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hSOST bien conocida en la técnica.
El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de enlace de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hSOST que se une a un antígeno SOST y/o la potencia neutralizante de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hSOST cuyo enlace a hSOST inhibe la actividad biológica de hSOST.
El término "epítope" incluye cualquier determinante de polipéptido apto para su enlace específico a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas modalidades, las determinantes del epítope incluyen agrupaciones químicamente tensioactivas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características específicas de estructura tridimensional, y/o características de carga específicas. Un epítope es una región de un antígeno que se une mediante un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo une específicamente un antígeno cuando el mismo reconoce preferencialmente su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Se dice que los anticuerpos "se enlazan al mismo epítope" si los anticuerpos compiten recíprocamente (uno previene el efecto de enlace o modulación del otro). Además, las definiciones estructurales de los epítopes (superposición, similares, idénticos) son informativas, aunque las definiciones funcionales frecuentemente son más relevantes cuando las mismas abarcan parámetros estructurales (enlace) y funcionales (modulación, competición).
El término "resonancia de plasmón superficial" se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, ver Jónsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51 : 1 9-26; Jónsson et al. (1991 ) BioTechniques, 1 1 :620-627; Johnsson et al. (1 995) J. Mol. Recognit. 8: 125-1 31 ; y Johnnson et al. (1991 ) Anal. Biochem . 198:268-277.
Se pretende que el término "Kasoc" (también "Kasoc", "asociación") se refiere a la constante de asociación para la asociación de una proteína de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) a un antígeno para formar un complejo de asociación, por ejemplo, complejo de anticuerpo/antígeno, que es conocido en la técnica. La "Kasoc" también es conocida por los términos "constante de proporción de asociación", o "ka" , que se utiliza indistintamente en la presente. Este valor indica la porción de enlace de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la proporción de formación de complejo entre un anticuerpo y antígeno que se muestra mediante la ecuación a continuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag")?Ab-Ag .
Se pretende que el término " Kdisoc" (también "Kdisoc" , "disociación") se refiera a la constante de disociación para la disociación, de una proteína de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) de un complejo de asociación (por ejemplo, un complejo de anticuerpo/antígeno) que es conocido en la técnica. La "disociación" también es conocida por los términos "constante de proporción de disociación", o ukd" , que se utiliza indistintamente en la presente. Este valor indica la proporción de disociación de un anticuerpo de su antigeno objetivo o separación del complejo Ab-Ag con el paso del tiempo en el anticuerpo libre y antígeno como se muestra mediante la ecuación a continuación: Ab + Ag<-Ab-Ag.
Se pretende que el término "KD" (también "Kd") se refiera a la "constante de disociación de equilibrio", y se refiere al valor obtenido en una medición de titulación en equilibrio, o dividiendo la constante de proporción de disociación (Kdisoc) por la constante de proporción de asociación (Kasoc). La constante de proporción de asociación (Kasoc), la constante de proporción de disociación (Kdisoc), y la constante de disociación de equilibrio (K) se utilizan para representar la afinidad de enlace de un anticuerpo a un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica. Utilizando técnicas a base de fluorescencia que ofrecen alta sensibilidad y la capacidad de examinar muestras en amortiguadores fisiológicos en equilibrio. Otras metodologías experimentales e instrumentos tales como un ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) se pueden utilizar (por ejemplo, instrumento disponible de BIAcore I nternational AB, una compañía GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, también se puede utilizar un ensayo KinExA® (Ensayo de Exclusión Cinética), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
Los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable" significa una porción anexada a un asociado de enlace especifico, tal como un anticuerpo o un analito, por ejemplo, para hacer la reacción entre miembros de un par de enlace específico, tal como un anticuerpo y un analito, detectable. El asociado de enlace específico, por ejemplo, anticuerpo o analito, así etiquetado se denomina "detectablemente etiquetado". Por consiguiente, el término "proteína de enlace etiquetada" se refiere a una proteína con una etiqueta incorporada que provee para la identificación de la proteína de enlace. En una modalidad, la etiqueta es un marcador detectable que puede producir una señal que es detectable mediante un medio visual o instrumental, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radioetiquetado o adhesión a un polipéptido de porciones de biotinilo que se puede detectar mediante avidina o estreptavidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar mediante métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 35S , 90Y, "Te, 1 1 ln, 25l , 31 l , 177Lu, 166Ho, o 153Sm), cromógenos, etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, epítopes de polipéptidos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias par de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, marcadores de epítope), y agentes magnéticos (por ejemplo, quelatos de gadolinio). Los ejemplos representativos de etiquetas comúnmente empleadas para inmunoensayos incluyen porciones que producen luz, por ejemplo, compuestos de acridinio, y porciones que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. En la presente se describen otras etiquetas. En este sentido, la porción misma puede no etiquetarse detectablemente aunque puede volverse detectable tras la reacción con aún otra porción. El uso del término "detectablemente etiquetado" se pretende que abarque el último tipo de etiquetado detectable.
El término "conjugado de proteína de enlace SOST" o "conjugado de proteína de enlace a esclerostina" se refiere a una proteína de enlace a esclerostina descrita en la presente, químicamente enlazada a una segunda porción química, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos. En una modalidad, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, pero no están limitados a, toxina de difteria, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracin-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Cuando se emplean en el contexto de un inmunoensayo, un conjugado de proteína de enlace a esclerostina puede ser un anticuerpo detectablemente etiquetado, el cual se utiliza como el anticuerpo de detección.
Los términos "cristal" y "cristalizado" se refiere a una proteína de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) , o porción de enlace al antígeno de la misma, que existe en la forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de materia que es distinto al de otras formas tales como el estado sól ido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos de arreglos trid imensionales regulares y repetitivos de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos), o ensambles moleculares (por ejemplo, complejos de antígeno/anticuerpo) . Estos arreglos tridimensionales se disponen de acuerdo a relaciones matemáticas específicas que son bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental , o bloque de construcción, que se repite en un cristal se denom ina la u nidad asimétrica . La repetición de la unidad asimétrica en un arreglo que se conforma a una simetría cristalográfica dada, bien definida, provee la "célula de unidad" del cristal. La repetición de la célula unidad mediante traducciones regulares en todas las tres dimensiones provee el cristal. Ver Giegé et al . , Capítulo 1 , En Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed . , (Ducruix and Giegé, eds. ) (Oxford University Press, Nueva York, 1 999) pp. 1 - 1 6.
El térm ino "polinucleótido" significa una forma polimérica de dos o más nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxin ucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de una sola hebra o doble hebra de DNA.
El térm ino "polinucleótido aislado" significará un polinucleótido (por ejemplo, de origen genóm ico, cDNA, o sintético, o alguna combinación de los mismos) q ue, en virtud de su origen , el "polin ucleótido aislado" no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza; se enlaza operablemente a un polinucleótido el que no se encuentra enlazado de manera natural; o no está presente en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
Se pretende que el término "vector" se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual el mismo se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de DNA en el cual pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral , en donde pueden ligarse segmentos de DNA adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autónoma en una célula hospedera en la cual los mismos se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de episoma de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores de episoma que no son de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera tras su introducción en la célula hospedera, y por lo tanto se replican junto con el genoma hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales los mismos se enlazan operativamente. Tales vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante frecuentemente están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente cuando el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, se proveen otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adeno- asociados) , los cuales desempeñan funciones equivalentes.
El término "enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que permite funcionar a los mismos en su manera prevista. Una secuencia de control "enlazada operablemente" a una secuencia de codificación se l iga de tal modo que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo cond iciones compatibles con las secuencias de control . Las secuencias "operablemente enlazadas" i ncluyen ambas secuencias de control de expresión que son contiguas con el gene de interés y secuencias de control de expresión que actúan in trans o a una distancia que controle el gene de interés. El término "secuencia de control de expresión" se refiere a secuencias de pol inucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación en las cuales las m ismas se ligan . Las secuencias de control de expresión incluyen inicio de transcri pción apropiada , terminación , secuencias promotoras y mejoradoras; señales de procesamiento de RNA eficientes tales como em palme y señales de poliadenilación; secuencias que estabilizan mRNA citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de traslación (es decir, secuencia de consenso de Kozak) ; secuencias que mejoran la estabilidad de proteína; y cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedero; en procariotas, tales secuencias de control en general incluyen promotor, sitio de enlace ribosóm ico, y secuencia de termi nación de transcripción ; en eucariotas, en general , tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias del asociado de fusión.
"Transformación", como se define en la presente, se refiere a cualquier proceso mediante el cual el DNA exógeno entra a una célula hospedera. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando varios métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede depender de cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico extrañas en una célula hospedera procariota o eucariota. El método se selecciona en base a la célula hospedera que se transforma y puede incluir, pero no se limita a, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Tales células "transformadas" incluyen células establemente transformadas en las cuales el DNA insertado es capaz de replicacion ya sea como un plásmido autónomamente replicante o como parte del cromosoma hospedero. Las mismas también incluyen células las cuales expresan temporalmente el DNA o RNA insertado por períodos de tiempo limitados.
El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), se pretende que se refiera a una célula en la cual se ha introducido el DNA exógeno. En una modalidad, la célula hospedera comprende dos o más anticuerpos codificantes de (por ejemplo, múltiples) ácidos nucleicos, tal como las células hospederas descritas en la Patente Norteamericana No. 7,262 , 028, por ejem plo. Se pretende que tales térm inos se refieran no solamente a la célula particular en cuestión, sino también a la progenie de tal célula . Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a cualquier influencia de mutación o ambiental , tal progenie puede no, de hecho , ser idéntica a la célula parenta l , aunque todavía está incluida dentro del alcance del térm ino "célula hospedera". En una modalidad , las células hospederas incluyen célu las procariotas y eucariotas de cualquiera de los Reinos de vida . En otra modalidad, las células eucariotas incluyen células del reino protista , fúngico, vegetal o animal. En otra modalidad, las células hospederas incluyen pero no están limitadas a la línea cel ular procariota Escherichia coli; líneas cél ulas de mam ífero CHO, H EK 293, COS , NSO, SP2 y PER. C6; y la l ínea celular de insectos Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.
También pueden utilizarse técnicas estándares para DNA recombi nante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación , l ipofección) . Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técn icas de purificación de acuerdo a las especificaciones de fabricante o como se realizan comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedim ientos antecedentes pueden realizarse en general de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas q ue se citan y abordan en toda la presente especificación. Ver por ejemplo, Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989).
"Organismo transgénico", como se conoce en la técnica, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgene, en donde el transgene introducido en el organismo (o un predecesor del organismo) expresa un polipéptido no expresado naturalmente en el organismo. Un "transgene" es un constructo de DNA, el cual se integra de manera estable y operable en el genoma de una célula a partir de la cual un organismo transgénico desarrolla, dirigiendo la expresión de un producto genético codificado en uno o más tipos de células o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regular" y "modular" se utilizan indistintamente, y se refiere a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de hSOST). La modulación puede ser un incremento o disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula de interés. Las actividades ejemplificantes y funciones de una molécula incluyen, pero no están limitadas a, características de enlace, actividad enzimática, activación del receptor celular, y transducción de señal.
Correspondientemente, el término "modulador" es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de hSOST). Por ejemplo, un modulador puede causar un incremento o disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula comparada con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del modulador. En ciertas modalidades, un modulador es un inhibidor, el cual disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Los inhibidores ejemplificantes incluyen, pero no están limitados a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en la Solicitud PCT No. WO 01 /83525.
El término "agonista" se refiere a un modulador que, cuando está en contacto con una molécula de interés, causa un incremento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del agonista. Los agonistas particulares de interés pueden incluir, pero no están limitados a, polipéptidos de esclerostina, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula que se una a esclerostina humana (hSOST).
Los términos "antagonista" e "inhibidor" se refieren a un modulador que, cuando está en contacto con una molécula de interés causa una disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del antagonista. Los antagonistas particulares de interés incluyen aquéllos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica de esclerostina humana. Los antagonistas e inhibidores de esclerostina humana pueden incluir, pero no están limitados a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula, la cual se una a esclerostina humana.
El término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la severidad y/o duración de un padecimiento o uno o más síntomas del mismo; prevenir el avance de un padecimiento; causar la regresión de un padecimiento; prevenir la recurrencia, desarrollo, aparición, o progreso de uno o más síntomas asociados con un padecimiento; detectar un padecimiento, reforzar o mejorar el(los) efecto(s) profiláctico(s) o terapéutico(s) de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).
"Paciente" y "sujeto" pueden utilizarse indistintamente en la presente para referirse a un animal, tal como un mamífero, incluyendo un primate (por ejemplo, un humano, un mono, y un chimpancé), un no-primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, un cobayo, un gato, un perro, una rata, un ratón, una ballena), un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), y un tiburón. En una modalidad, un paciente o sujeto es un humano, tal como un humano que es evaluado o tratado de una enfermedad, padecimiento o condición, un humano en riesgo de una enfermedad, padecimiento o condición, un humano que tiene una enfermedad, padecimiento o condición, y/o humano que es tratado de una enfermedad, padecimiento o condición.
El término "muestra" se utiliza en su más amplio sentido. Una "muestra biológica" incluye, pero no está limitada a, cualquier cantidad de una sustancia de una cosa viva o cosa antiguamente viva. Tales cosas vivas incluyen, pero no se limitan a, humanos, primates no humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no están limitadas a, sangre (por ejemplo sangre entera), plasma, suero, orina, fluido amniótico, fluido sinovial, células endoteliales, leucocitos, monocitos, otras células órganos, tejidos, médula ósea, nodulos linfáticos y bazo.
"Componente", "componentes", y "al menos un componente", se refiere en general a un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un contenedor, un amortiguador, un diluyente, una sal, una enzima, un co-factor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pre-tratamiento, un substrato (por ejemplo, como una solución), una solución de detención, y similares que se pueden incluir en un kit de ensayo de una muestra de análisis, tal como una muestra de orina, suero o plasma del paciente, de acuerdo con los métodos descritos en la presente y otros métodos conocidos en la técnica. Por consiguiente, en el contexto de la presente descripción, "al menos un componente", "componente", y "componentes" pueden incluir un polipéptido u otro analito que se mencione anteriormente, tal como una composición que comprende un analito tal como un polipéptido, el cual opcionalmente se inmoviliza en un soporte sólido, tal como uniéndolo a un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anti-polipéptido). Algunos componentes pueden estar en solución o liofilizarse para su reconstitución al usarse en un ensayo.
"Control" se refiere a una composición conocida que no es de analito ("control negativo") o que contiene analito ("control positivo"). Un control positivo puede comprender una concentración conocida de analito. "Control", "control positivo", y "calibrador" puede utilizarse indistintamente en la presente para referirse a una composición que comprende una concentración conocida de analito. Un "control positivo" se puede utilizar para estabilizar las características de desempeño del ensayo y es un indicador útil de la integridad de reactivos (por ejemplo, analitos).
"Corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refiere en general a un valor de corte del ensayo que se utiliza para evaluar resultados en el diagnóstico/pronostico/eficacia terapéutica comparando los resultados del ensayo contra el corte/nivel predeterminado, donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido vinculado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, severidad de padecimiento, progreso/no progreso/mejora, etc.). Aunque la presente descripción puede proveer niveles predeterminados ejemplificantes, es bien sabido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, anticuerpos empleados, etc.). Además está lo suficientemente adentro de la habilidad ordinaria de alguien en la técnica adaptar la descripción de la presente a otros inmunoensayos para obtener valores de corte de inmunoensayos específicos para aquellos otros ensayos basados en esta descripción. Mientras que el valor preciso del corte/nivel predeterminado puede variarse entre ensayos, las correlaciones que se describe en la presente (si existe alguna) deben ser en general aplicables.
"Reactivo de pre-tratamiento", por ejemplo, la lisis, precipitación y/o reactivo de solubilización, cuando se utiliza en un ensayo de diagnóstico tal como se describe en la presente es uno que lisa cualquier célula y/o solubiliza cualquier analito que está/n presente/s en la muestra de análisis. El pre-tratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe aun más en la presente. Entre otras cosas, la solubilización del analito (por ejemplo, polipéptido de interés) puede conllevar la liberación del analito de cualquier proteína de enlace endógena presente en la muestra. Un reactivo de pre-tratamiento puede ser homogéneo (que no requiere una etapa de separación) o heterogéneo (que requiere una etapa de separación). Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento heterogéneo existe la remoción de cualquier proteína de enlace de analito precipitada de la muestra de análisis antes de proceder a la siguiente etapa del ensayo.
"Reactivos de control de calidad" en el contexto de los inmunoensayos y kits descritos en la presente, incluyen, pero no están limitados a, calibradores, controles, y paneles de sensibilidad. Un "calibrador" o "estándar" típicamente se utiliza (por ejemplo, uno o más, tal como una pluralidad) a fin de establecer curvas de calibración (estándar) para la interpolación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Alternativamente, se puede utilizar un solo calibrador, el cual esté cerca de un corte positivo/negativo predeterminado. Se pueden utilizar múltiples calibradores (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibrador(es)) en conjunción a fin de incluir un "panel de sensibilidad".
"Riesgo" se refiere a la posibilidad o probabilidad de que ocurra un evento particular ya sea en ese momento o en algún momento en el futuro. "Estratificación de riesgo" se refiere a una variedad de factores de riesgo clínicos conocidos que permite a los médicos clasificar pacientes en un riesgo bajo, moderado, alto o muy alto de desarrollar una enfermedad, padecimiento o condición .
"Específico" y "especificidad" en el contexto de una interacción entre miembros de un par de enlace específico (por ejemplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y un anticuerpo (o fragmento antigénicamente del mismo)) se refiere a la reactividad selectiva de la interacción. La frase "une específicamente a" y frases análogas se refiere a la capacidad de anticuerpos (o fragmentos antigénicamente reactivos de los mismo) de unirse específicamente al analito (o un fragmento del mismo) y no unirse específicamente a otras entidades.
"Asociado de enlace específico" es un miembro de un par de enlace específico. Un par de enlace específico comprende dos diferentes moléculas, las cuales se enlazan específicamente entre sí a través de un medio químico o físico. Por lo tanto, además del par de enlace específico del antígeno y anticuerpo de ¡nmunoensayos comunes, otros pares de enlace específicos pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. Además, los pares de enlace específicos incluyen miembros que son análogos de los miembros de enlace específicos originales, por ejemplo, un análogo de analito. Los miembros de enlace específicos inmuno-reactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígeno, y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales así como complejos, fragmentos, y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) de los mismos, ya sea aislados o recombinantemente producidos.
El término "variante" significa un polipéptido que difiere de un polipéptido dado (por ejemplo, polipéptido de esclerostina, BNP, NGAL, o H IV, o anticuerpo anti-polipéptido) en secuencia de aminoácidos mediante la adición (por ejemplo, inserción), eliminación, o sustitución conservativa de aminoácidos, pero que retiene la actividad biológica del polipéptido dado (por ejemplo, una variante de esclerostina puede competir con el anticuerpo anti-esclerostina para unirse a esclerostina). Una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, remplazando un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad y grado y distribución de regiones cargadas) es reconocida en la técnica puesto que típicamente involucra un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, como se entiende en la técnica (ver, por ejemplo, Kyte et al. (1 982) J. Mol. Biol. 1 57: 105-132). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Es sabido en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares se pueden sustituir y todavía retener la función de proteína. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. La hidrofilicidad de aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que puedan dar como resultado proteínas que retengan la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la hidrofilicidad promedio local mayor de ese péptido, una media útil que se ha reportado se correlaciona bien con la antigenicidad e inmunogenicidad (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,554, 1 01 ). La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad similar puede dar como resultado péptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, tal como se entiende en la técnica. En un aspecto, las sustituciones se realizan con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ± 2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos son influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. Consistente con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente de las cadenas laterales de esos aminoácidos, que son revelados por la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y otras propiedades. También se puede utilizar "variante" para describir un polipéptido o fragmento del mismo que haya sido procesado de un modo diferente, tal como mediante proteólisis, fosforilación, u otra modificación post-traducción, aun retiene su actividad biológica o reactividad al antígeno, por ejemplo, la capacidad de unirse al SOST. El uso de "variante" en la presente se pretende que abarque fragmentos de una variante a menos que se contradiga de otra manera por el contexto.
I . Anticuerpos que enlazan la SOST Humana.
Un aspecto provee anticuerpos monoclonales aislados murinos, o porciones de enlace al antígeno de los mismos, que se enlazan a la esclerostina con alta afinidad, una proporción de retraso y alta capacidad neutralizante. Un segundo aspecto provee anticuerpos quiméricos que enlazan a esclerostina. Un tercer aspecto provee anticuerpos injertados con CDR, o porciones de enlace al antígeno de los mismos, que se enlazan a esclerostina. Un cuarto aspecto provee anticuerpos humanizados, o porciones de enlace al antígeno, que se enlazan a esclerostina. Un quinto aspecto provee proteínas de enlace de dominio variable dual (proteínas de enlace de DVD) que se enlazan a esclerostina y otro objetivo. En una modalidad, los anticuerpos, o porciones de los mismos, son anticuerpos aislados. En una modalidad, se proveen los anticuerpos que neutralizan la anti-esclerostina humana.
LA. Método para hacer anticuerpos anti-esclerostina Se proveen anticuerpos anti-esclerostina hechos mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en el arte.
I .A.1 . Anticuerpos monoclonales anti-esclerostina utilizando tecnología de hibridoma Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y de exhibición de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando técnicas de hibridoma incluyendo aquéllas conocidas en el arte e imparticiones, por ejemplo, en Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hammerling, et al. , en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y. , 1 981 ). El término "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota, o de fago, y no el método mediante el cual el mismo se produce.
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos anti-esclerostina específicos utilizando la tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Una modalidad provee métodos para generar anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos mediante el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo en donde, en una modalidad, el hibridoma es generado fusionando los esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno con células de mieloma y seleccionando luego los hibridomas resultantes de la fusión de clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unir un polipéptido. En breve, los ratones se pueden inmunizar con un antígeno de esclerostina. En una modalidad , el antígeno de esclerostina se administra con un adyuvante para estimular la repuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger al polipéptido de una rápida dispersión secuestrando el mismo en un depósito local, o los mismos pueden contener sustancias que estimulen al hospedero a secretar factores que sean quimiotácticos para los macrófagos u otros componentes del sistema inmune. En una modalidad, si un polipéptido se administra, el esquema de inmunización involucrará dos o más administraciones del polipéptido, separado por varias semanas.
Después de la inmunización de un animal con un antígeno de esclerostina, pueden obtenerse anticuerpos y/o células que producen anticuerpos del animal. Un suero que contiene el anticuerpo anti-esclerostina se obtiene del animal desangrando o sacrificando al animal. El suero puede utilizarse, tal como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero, o los anticuerpos anti-esclerostina pueden purificarse del suero. El suero o inmunoglobulinas obtenidas de esta manera son policlonales, teniendo así una serie de propiedades heterogéneas.
Una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos del antígeno SOST en el suero del ratón, el bazo del ratón se cosecha y los esplenocitos se aislan. Los esplenocitos se fusionan entonces mediante técnicas bien conocidas para cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo células de la línea celular SP20 disponible de la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC, Manassas, Virginia, US). Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitada. Los clones de hibridoma se examinan entonces mediante métodos conocidos en la técnica las células que secretan anticuerpos capaces de unir la SOST.
Se puede generar fluido de ascitis, el cual en general contiene altos niveles de anticuerpos inmunizando los ratones con clones de hibridoma positivo.
En otra modalidad, pueden prepararse hibridomas inmortalizados que producen anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B esplénicas se fusionan en células de mieloma inmortalizadas como es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra. En una modalidad, las células de mieloma no secretan polipéptidos de ¡nmunoglobulina (una línea celular no secretoria). Después de la fusión y selección antibiotica, los hibridomas se seleccionan utilizando SOST, o una porción de los mismos, o una célula que expresa SOST. En una modalidad, la selección inicial se realiza utilizando un enzimoinmunoanálisis (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), en una modalidad, un ELISA. Un ejemplo de selección con ELISA se provee en la Publicación PCT No. WO 00/37504.
Los hibridomas que producen anticuerpos anti-esclerostina se seleccionan, clonan, y detectan adicionalmente por las características deseables, incluyendo crecimiento de hibridomas robustos, alta producción de anticuerpos y características de anticuerpos deseables, como se aborda aun más a continuación. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse ¡n vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica.
En una modalidad, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describe anteriormente. En otra modalidad, los hibridomas se producen en una especie distinta a la humana y de ratones tales como ratas, oveja, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales un mieloma no secretorio humano se fusiona con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-esclerostina.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, se proveen fragmentos de Fab y F(ab')2 producidos mediante la escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos de Fab) o pepsina (para producir fragmentos de F(ab')2). Los fragmentos de F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CHI de la cadena pesada.
I .A.2. Anticuerpos monoclonales anti-esclerostina utilizando SLAM En otra modalidad, se proveen anticuerpos recombinantes generados a partir de linfocitos aislados simples utilizando un procedimiento mencionado en la técnica como el método de anticuerpos de linfocitos seleccionados (SLAM), como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,627,052; Publicación PCT No. WO 92/02551 ; y Babcook et al. (1 996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848. En este método, los anticuerpos simples que secretan células de interés, por ejemplo, linfocitos derivados de cualquiera de los animales inmunizados descritos en la Sección 1 , se seleccionan utilizando un ensayo de placa hemolítica de antígeno específico, en donde del antígeno SOST, una subunidad de SOST, o un fragmento de los mismos, se acopla a glóbulos rojos de oveja utilizando un enlace, tal como biotina, y se utiliza para identificar células simples que secreten anticuerpos con especificidad a la SOST. Después de la identificación de células que secretan anticuerpos de interés, los cDNAs de región variable de cadena pesada y ligera (VH y VL) se rescatan de las células mediante PCR de transcriptasa, y estas regiones variables se pueden expresar entonces, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células hospederas de mamífero, tales como células de COS o CHO. Las células hospederas transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse entonces a un análisis adicional y selección in vitro, por ejemplo, cribando las células transfectadas para aislar las células que expresen anticuerpos en la SOST. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas se pueden manipular además in vitro, tal como mediante métodos de maduración por afinidad in vitro tal como los descritos en la Publicación PCT Nos. WO 97/291 31 y WO 00/56772.
I .A.3. Anticuerpos monoclonales anti-esclerostina utilizando animales transgénicos En otra modalidad, se proveen anticuerpos producidos inmunizando un animal no humano que comprende algo, o la totalidad del locus de inmunoglobulina humana con un antígeno SOST. En una modalidad, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón modificada genéticamente que comprende fragmentos grandes de los locus de inmunoglobulina humana y que carece de producción de anticuerpos de ratón. Ver, por ejemplo, Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13-21 y Patentes Norteamericanas Nos. 5,916,771; 5,939,598; 5,985,615; 5,998,209; 6,075,181; 6,091,001; 6,114,598 y 6,130,364. Ver también la Publicación PCT Nos. WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096 y WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; y WO 00/037504. El ratón transgénico XENOMOUSE® produce un repertorio parecido al del humano adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera Mabs humanos de antígenos específicos. El ratón transgénico XENOMOUSE® contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal en tamaño de megabases, de los locus de cadena pesada humana y x locus de cadena ligera. Ver, Méndez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997); y Green y Jakobovits, J. Exp. Mecí., 188: 483-495 (1998).
I.A.4. Anticuerpos monoclonales anti-esclerostina utilizando bibliotecas de anticuerpos recombinantes Se proveen métodos in vitro para hacer anticuerpos, en donde se selecciona una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de enlace deseada. Los métodos para tal selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen los métodos descritos en, por ejemplo, Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,223,409; Kang et al., Publicación PCT No. WO 92/18619; Dower et al., Publicación PCT No. WO 91/17271; Winter et al., Publicación PCT No. WO 92/20791; Markland et al., Publicación PCT No. WO 92/15679; Breitling et al., Publicación PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al., Publicación PCT No. WO 92/01047; Garrard et al., Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucí. Acid Res., 19: 4133-4137 (1991); and Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); publicación de solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0186374; y Publicación PCT No. WO 97/29131.
La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto inmunizado con esclerostina, o una porción de esclerostina. Alternativamente, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto sin tratamiento previo, es decir, alguien que no haya sido inmunizado con esclerostina, tal como una biblioteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con esclerostina. Los anticuerpos de la invención se seleccionan detectando la biblioteca de anticuerpos recombínantes con el péptido que comprende esclerostina humana para seleccionar por lo tanto aquellos anticuerpos que reconozcan la esclerostina. Los métodos para realizar tal detección y selección son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en las referencias en el párrafo precedente. Para seleccionar anticuerpos que tengan afinidades de enlace particulares para la esclerostina humana, tales como aquéllas que se disocian de la esclerostina humana con una constante de proporción Kdisoc el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón superficial se puede utilizar para seleccionar anticuerpos que tengan la constante de proporción Kdisoc deseada. Para seleccionar anticuerpos que tengan una actividad neutralizante particular para la esclerostina humana, tal como aquéllos con una IC50 particular, pueden utilizarse métodos estándares conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad de esclerostina humana.
En un aspecto, se provee un anticuerpo aislado, o una porción de enlace del antígeno del mismo, que se enlaza a esclerostina humana. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.
Por ejemplo, los anticuerpos que se proveen también se pueden generar utilizando varios métodos de exhibición de fagos en la técnica. En métodos de exhibición de fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se exhiben sobre la superficie de las partículas de fagos las cuales portan las secuencias de polinucleótidos que codifican las mismas. En particular, tal fago se puede utilizar exhibir dominios de enlace de fagos expresados de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatorios (por ejemplo, humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de enlace de antígeno que une el antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con el antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno etiquetado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. El fago utilizado en estos métodos típicamente son fagos filamentosos que incluyen dominios de enlace fd y M 1 3 expresados del fago con Fab, Fv, o dominios de anticuerpos Fv estabilizados con disulfuro recombinantemente fusionados ya sea a la proteína del gene I I I o gene VI I I del fago. Se proveen métodos de exhibición de fagos que se pueden utilizar para hacer los anticuerpos de la invención e se incluyen aquéllos descritos en Brinkmann et al. , J. Immunol. Methods, 182: 41 -50 (1995); Ames et al. , J. Immunol. Methods, 1 84: 1 77-186 (1 995); Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol. , 24: 952-958 (1 994); Persic et al. , Gene, 1 87: 9-18 ( 1997); Burton et al. , Advances in Immunology, 57: 191 -280 (1 994); Publicaciones PCT Nos. WO 90/02809; WO 91 /10737; WO 92/01047 (PCT/GB91 /01 1 34); WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,71 7; 5,427,908; 5,750,753; 5,821 ,047; 5,571 ,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969, 108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones de codificación de anticuerpos del fago se pueden aislar y utilizarse para generar anticuerpos entero incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de enlace de antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levadura, y bacterias, por ejemplo, como se describe con detalle más adelante. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al. , BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); y Sawai et al. , Am. J. Reprod. Immunol. , 34: 26-34 (1995); y Better et al. , Science, 240: 1 041 -1043 (1 988). Los ejemplos de técnicas las cuales se pueden utilizar para producir Fvs de cadena simple y anticuerpos incluyen los descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778 and 5,258, 498; Huston et al. , Methods in Enzymology, 203: 46-88 ( 1991 ); Shu et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al. , Science, 240: 1038-1041 (1988).
Alternativo a la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante exhibición de fagos, se proveen otras metodologías conocidas en la técnica para seleccionar bibliotecas combinatorias grandes y se pueden aplicar para la identificación de anticuerpos de especificidad dual. Un tipo de sistema de expresión alternativa es uno en el cual la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de RNA-proteína, como se describe en la Publicación PCT No. WO 98/31 700 de Szostak y Roberts, y en Roberts, R.W. y Szostak, J .W. ( 1 997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA , 94: 1 2297-1 2302. En este sistema, se crea una fusión covalente entre un m RNA y el péptido o proteína que se codifica mediante la traducción in vitro de mRNAs si ntéticos que portan purom icina, u n antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. Por consig uiente, un m RNA específico se puede enriquecer a partir de una mezcla compleja de mRNAs (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) basada en las propiedades del péptido o proteína cod ificada, por ejemplo, anticuerpo, o porción del mismo, tal como el enlace del anticuerpo, o porción del m ismo, al antígeno de especificidad dual . Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos, o porciones de las mismas, recuperadas de la selección de tales bibl iotecas se pueden expresar med iante medios recombinantes como se descri be anteriormente (por ejem plo, en células hospederas de mam ífero) y, por otra parte, se pueden someter a maduración por afinidad adicional ya sea med iante rondas adicionales de selección de fusiones de m RNA-péptido en las cuales las m utaciones se han introducido en la(s) secuencia(s) seleccionada(s) originalmente, o mediante otros métodos de maduración por afin idad in vitro de anticuerpos recom bi nantes, como se describe anteriormente.
En otra metodolog ía, se proveen anticuerpos generados utilizando métodos de exhi bición de levaduras conocidos en la técnica . En los métodos de exh ibición de fagos, se utilizan métodos genéticos para anclar dom in ios de anticuerpos a la pared celular de levaduras y exhibir los mismos sobre la superficie de levadura. En particular, tales levaduras se pueden utilizar para exhibir dominios de enlace de antígeno expresados de un reportorio o biblioteca de anticuerpos combinatorios (por ejemplo, humanos o murinos). Se proveen ejemplos de métodos de exhibición de levadura que se pueden utilizar para hacer los anticuerpos, e incluyen los descritos por Wittrup et al. , en la Patente Norteamericana No. 6,699,658.
I . B. Producción de anticuerpos de esclerosina recombinantes Se proveen anticuerpos producidos mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, la expresión de células hospederas, en donde el(los) vector(es) de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se transfecta(n) en una célula hospedera mediante técnicas estándares. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" de DNA exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano, y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos que se proveen en cualquier célula hospedera procariota o eucariota, es preferible la expresión de anticuerpos en células eucariotas, debido a que tales células eucariotas (y en células de mamífero particulares) es más probable que las células procariotas se agrupen y secreten un anticuerpo propiamente plegado e inmunológicamente activo.
Las células hospederas de mamífero ejemplificantes para expresar los anticuerpos recombinantes que se proveen incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin , ( 1 980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 , utilizadas con un marcador seleccionable DH FR, por ejemplo, descrito en R. J . Kaufman and P. A. Sharp (1 982) Mol. Biol., 1 59: 601 -621 ) , células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando se introd ucen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células hospederas de mam ífero, los anticuerpos se prod ucen cu ltivando las cél ulas hospederas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, en una modalidad , la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se hacen crecer las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándares.
Tam bién se pueden utilizar célu las hospederas para producir fragmentos de anticuerpos funcionales, tales como fragmentos de Fab o moléculas de scFv. Se entenderá que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alca nce de lo que se provee. Por ejemplo, cuando se contem ple puede ser deseable transfectar una célula hospedera con DNA que cod ifican fragmentos funcionales de ya sea la cadena l igera y/o cadena pesada de un anticuerpo . También puede utilizarse la tecnología DNA recom binante para remover algo, o la totalidad del DNA que codifica cualquiera o am bas de las cadenas ligera y pesada que no sea necesaria para su en lace a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas de tales moléculas de DNA truncadas también son abarcadas por los anticuerpos , cuando se contemple. Además, se proveen y pueden prod ucirse anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno aparte de los antígenos de interés mediante la reticulación de un anticuerpo a un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química estándar.
En un sistema ejemplificante de expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de enlace al antígeno del mismo, se provee un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células dhfr-CHO mediante transfección mediada con fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, cada uno los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se enlazan operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para manejar altos niveles de transcripción de genes. El vector de expresión recombinante también porta un gene DHFR, el cual permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera el anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Más aun todavía, se provee un método para sintetizar un anticuerpo recombinante cultivando una célula hospedera en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetice un anticuerpo recombinante. El método además puede comprender aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
I.B.1 Anticuerpos Anti-esclerostina humana Las tablas de la presente proveen una lista de secuencias de aminoácidos de regiones VH y VL de anticuerpos anti-esclerostina humana ejemplificantes.
La Tabla 6 provee una proteína de enlace de a esclerostina que comprende un dominio de enlace de antígeno capaz de unir la SOST humana, dicho dominio de enlace de antígeno comprende al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos provista en la presente.
I.B.2. Anticuerpos Quiméricos Anti-esclerostina humana Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes especies, tales como los anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de la familia murina y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica y se abordan con detalle en la sección de Ejemplos. Ver, por ejemplo, Morrison, Science, 229: 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4: 214-221 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202 (1989); Patentes Norteamericanas Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397. Además, se pueden utilizar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 : 6851 -6855 (1 984); Neuberger et al. , Nature, 312: 604-608 (1984); Takeda et al. , Nature, 314: 452-454 (1985) empalmando genes de una modalidad de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada.
En una modalidad, se proveen los anticuerpos quiméricos producidos remplazando la región constante de cadena pesada de los anticuerpos anti-esclerostina monoclonales murinos, descritos en la sección 1 con una región constante de IgG 1 humana.
I . B.3. Anticuerpos Injertados con CDR Anti-esclerostina Se proveen anticuerpos injertados con CDR que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano en donde una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se remplazan con secuencias CDR de los anticuerpos murinos. Una secuencia de armazón de cualquier anticuerpo humano puede servir como el modelo para el injerto de CDR. Sin embargo, el remplazo de cadena recta en tal armazón frecuentemente lleva a cierta pérdida de afinidad de enlace con el antígeno. Entre más homólogo sea un anticuerpo humano es para el anticuerpo murino original, menos probable es la posibilidad de que combinando las CDRs murinas con el armazón humano se introduzcan distorsiones en las CDRs que podrían reducir la afinidad. Por lo tanto, es preferible que el armazón variable humana que es elegida para remplazar el armazón variable murina alejadas de las CDRs tengan al menos un 65% de identidad de secuencia con el armazón de la región variable de anticuerpo murino. Es más preferible que las regiones variables humanas y de la familia murina alejadas de las CDRs tengan al menos 70% de identidad de secuencia. Es aún más preferible que las regiones variables humanas y murinas alejadas de las CDRs tengan al menos 75% de identidad de secuencia. Es más preferible que las regiones variables humanas y murinas alejadas de las CDRs tengan al menos 80% de identidad de secuencia. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica (también ver EP 0239400; Publicación PCT No. WO 91/09967; Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089); enchapado o revestimiento (ver, por ejemplo, EP 0592 106; EP 0519596; Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 969-973 (1994)); y reordenación de cadenas (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,565,352).
I.B.4. Anticuerpos Humanizados Anti-Esclerostina Humana Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos derivadas del anticuerpo de especie no humana que unen el antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo de especie no humana y las regiones de armazón de una molécula de inmunoglobulina humana. Las secuencias Ig humanas conocidas se describen, por ejemplo, en los sitios de Internet de todo el mundo: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onhnecomp.html; www. public.iastate.edu/. abo ut.pedro/resea rch_tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com-/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org-/12429/I mmune/Anti body.html; www.hhmi.org/grants/lectures/-1996/vlab/; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m i keimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/Biol_inks/lrnmuno-logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/. a bout.-hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/-awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito- /Elisa, html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/-axp/facs/davies/links.html; www. biotech.ufl.edu/.about.-fccl/protocol. html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt. unimarburg.de/. about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imtdoc/-public/l NTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; i mgt.cnusc.fr: 8104/; www. biochem. ucl.ac.uk/. a bout.martin/-abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/-lab/wwwabgen.html; www. unizh.cn/. about.honegger/AHOseminar/- Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/-.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/-structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/-index.html; www. cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech. html; www.jerini.de/frroducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Tales secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar el enlace, afinidad, asociación, disociación, avidez, especificidad, vida media, o cualquier otra característica adecuada, que sea conocida en la técnica.
Los residuos de armazón (FR) en las regiones de armazón humanas pueden sustituirse con el correspondiente residuo del anticuerpo donador de CDR para alterar, en una modalidad, mejorar, el enlace del antígeno. Estas sustituciones de armazón se identifican mediante los métodos bien conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de los residuos de CDR y armazón para identificar residuos de armazón importantes para el enlace del antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos de armazón inusuales en posiciones particulares. Ver, por ejemplo, Queen et al., Patente Norteamericana No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988). Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales comúnmente están disponibles y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora los cuales ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensional de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unir su antígeno. De este modo, se pueden seleccionar residuos FR y combinarse a partir de las secuencias de consenso e importación de modo que se logre la característica del anticuerpo deseada, tal como la afinidad incrementada del(los) antígenos(s) objetivo. En general, los residuos de CDR se involucran de manera directa y más sustancialmente para influenciar el enlace del antígeno. Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una variedad de técnicas conocidas en el arte, tales como pero no limitadas a las descritas en Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Sims et al., J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623-2632 (1993); Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 969-973 (1994); Publicaciones PCT Nos. WO 91/09967; WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; WO 99/06834 (PCT/US98/16280); WO 97/20032 (PCT/US96/ 8978); WO 92/11272 (PCT/US9 /09630); WO 92/03461 (PCT/US91/05939); WO 94/18219 (PCT/US94/01234); WO 92/01047 (PCT/GB91/01134); y WO 93/06213 (PCT/GB92/01755); Patentes EP Nos. EP 0 592 106; EP 0519596 and EP 0239400; Patentes Norteamericanas Nos. 5,565,332; 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539 y 4,816,567.
I.B.5. Proteínas de enlace de DVD Anti-esclerostina También se proveen proteínas de enlace de dominio variable (proteínas de enlace de DVD) que unen uno o más epítopes de esclerostina. Una proteína de enlace de DVD también puede unir une epítope de esclerostina y un epítope de un segundo antígeno objetivo diferente a un polipéptido de esclerostina. Una modalidad de tales proteínas de enlace de DVD comprende una cadena pesada que comprende la fórmula estructura VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlace con la condición de que no sea CH1, X2 es una región Fe, y n es 0 o 1, y, en una modalidad, 1; y una cadena ligera que comprende la fórmula estructural VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlace con la condición de que no sea CHL, y X2 no comprende una región Fe; y n es 0 o 1, y, en una modalidad, 1. Tal proteína de enlace de DVD puede comprender dos de tales cadenas pesadas y dos de tales cadenas ligeras, en donde cada cadena comprende dominios variables enlazados in tándem sin una región constante intermedia entre regiones variables, en donde una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar dos sitios de enlace de antígeno tándem, y un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de enlace tetramérica con sitios de enlace de antígenos. En otra modalidad, una proteína de enlace de DVD puede comprender cadenas pesada y ligera que comprenden cada uno dominios variables, por ejemplo, VD1 , VD2, VD3, enlazados in tándem sin una región intermedia entre dominios variables, en donde un par de cadenas pesada y ligera puede asociar para formar sitios de enlace de antígenos, y en donde un par de cadenas pesada y ligera pueden asociarse con otro par de cadenas pesada y ligera para formar un proteína de enlace con seis sitios de enlace de antígeno.
Cada dominio variable (VD) en una proteína de enlace de DVD pueden obtenerse de uno o más anticuerpos monoclonales "parentales" que unen uno o más antígenos o epítopes deseados, tal como antígenos o epítopes de esclerostina y/o no esclerostina (por ejemplo, TNF-a).
I I I . A. Generación de anticuerpos monoclonales Los dominios variables de la proteína de enlace de DVD se pueden obtener de anticuerpos parentales, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb), capaces de unir antígenos de interés. Estos anticuerpos pueden estar presentes de manera natural o pueden generarse mediante tecnología recombinante. Se entiende que si un anticuerpo que une un antígeno o epítope objetivo deseado es policlonal entonces todavía es necesario obtener los dominios variables de un sitio de enlace de antígeno de un solo anticuerpo de la población policlonal, es decir, de un solo miembro monoclonal de la población policlonal, para usarse en la generación de una proteína de enlace de DVD. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse mediante cualquiera de la variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo aquéllos descritos en la presente (ver, las secciones A.1 -A.4. , anteriores).
I I I . B. Criterios para seleccionar anticuerpos monoclonales parentales Se provee una modalidad pertinente para seleccionar anticuerpos parentales con al menos una o más propiedades deseadas en la proteína de enlace de DVD. En una modalidad, la propiedad deseada es uno o más parámetros de anticuerpos. En otra modalidad, los parámetros del anticuerpo son especificidad de antígeno, afinidad al antígeno, potencial , función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y enlace de antígeno ortóloga.
I I I . B.1 . Afinidad al antígeno La afinidad deseada de un mAb terapéutico puede depender de la naturaleza del antígeno, y el término terapéutico deseado. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales tienen afinidades superiores (Kd = 0.01 - 0.50 pM) cuando bloquean una interacción citocina-citocina del receptor como tales las interacciones usualmente son interacciones de alta afinidad (por ejemplo, rangos <pM - <nM). En tales casos, la afinidad de mAb con su objetivo deberá ser igual a, o mejor que la afinidad de la citocina (ligando) a su receptor. Por otro lado, el mAb con menos afinidad (rango >nM) podría ser terapéuticamente efectivo, por ejemplo, para depurar proteínas circulantes potencialmente patógenas por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se enlazan a, secuestran, y depuran especies circulantes de un antígeno objetivo, tal como un amiloideo ?-ß. En otros casos, la reducción de la afinidad de un mAb de alta afinidad existente mediante mutagénesis puntual o utilizando un mAb con afinidad más baja a su objetivo podría utilizarse para evitar potenciales efectos secundarios, por ejemplo, un mAb de alta afinidad puede secuestrar o neutralizar todo su objetivo previsto, vaciando/eliminando completamente en consecuencia la(s) función(es) de la proteína enfocada. En este escenario, un mAb de baja afinidad puede secuestrar/neutralizar una fracción del objetivo que puede ser responsable de los síntomas del padecimiento (los niveles patológicos o sobre-producidos), permitiendo así que una fracción del objetivo continúe realizando su(s) función(es) fisiológica(s). Por lo tanto, puede ser posible reducir la Kd para ajustar la dosis y/o reducir los efectos secundarios. La afinidad del mAb parental podría jugar un papel en la focalización apropiada de moléculas de superficie celular para lograr el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, si un objetivo se expresa en células cancerígenas con alta densidad y en células normales con baja densidad, un mAb de afinidad más baja unirá un número mayor de objetivos en células tumorales que en las células normales, dando como resultado la eliminación de células tumorales a través de ADCC o CDC, y por lo tanto podría tener efectos terapéuticamente deseables. Por consiguiente, la selección de un mAb con afinidad deseada puede ser relevante para objetivos tanto solubles como superficiales.
La señalización a través de un receptor tras la interacción con su ligando puede depender de la afinidad de la interacción receptor-ligando. De manera similar, es concebible que la afinidad de un mAb de un receptor de superficie pueda determinar la naturaleza de la señalización intracelular y si el mAb puede suministrar un agonista o una señal antagonista. La naturaleza basada en la afinidad de la señalización mediada con mAb puede tener un impacto en su perfil de efectos secundarios. Por lo tanto, la afinidad deseada y funciones deseadas de anticuerpos monoclonales terapéuticos necesitan determinarse cuidadosamente mediante experimentación in vitro e in vivo.
La Kd deseada de una proteína de enlace (por ejemplo, un anticuerpo) puede determinarse experimentalmente dependiendo del resultado terapéutico deseado. En una modalidad, se seleccionan los anticuerpos parentales con afinidad (Kd) a un antígeno particular igual a, o mejor que, la afinidad deseada de la proteína de enlace de DVD al mismo antígeno. La afinidad y cinética del enlace del antígeno se evalúan mediante Biacore u otra técnica similar. En una modalidad, cada anticuerpo parental tiene una constante de disociación (Kd) a su antígeno de: como mucho aproximadamente 10"7 M; como mucho aproximadamente 10"8 M; como mucho aproximadamente 109 M; como mucho aproximadamente 1010 M; como mucho aproximadamente 10"11 M; como mucho aproximadamente 1012 M; o como mucho aproximadamente 1013 M. El primer anticuerpo parental del cual se obtiene VD1 y el segundo anticuerpo parental del cual se obtiene VD2 pueden tener afinidad (KD) similar o diferente al respectivo antígeno. Cada anticuerpo parental tiene una constante de asociación (Kasoc) al antígeno de: al menos aproximadamente 102M 1s 1; al menos aproximadamente 103M"1s"1; al menos aproximadamente 104M s"1; al menos aproximadamente 105M 1s 1; o al menos aproximadamente 106M" 1s"\ cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial. El primer anticuerpo parental del cual, por ejemplo, se obtiene un VD1 y el segundo anticuerpo parental del cual se obtiene un VD2 pueden tener una constante de asociación (Kasoc) similar o diferente al respectivo antígeno. En una modalidad, cada anticuerpo parental tiene una constante de disociación similar o diferente (Kdisoc) al antígeno de: como mucho aproximadamente 10"3s"1; como mucho aproximadamente 10" s"1; como mucho aproximadamente 10*5s"1; o como mucho aproximadamente 106s 1; cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial. El primer anticuerpo parental el cual se obtiene el VD1 y el segundo anticuerpo parental del cual se obtiene el VD2 pueden tener constantes de disociación (Kdisoc) similares o diferentes al respectivo antígeno.
III. B.2. Potencia La afinidad/potencia deseada de anticuerpos monoclonales parentales dependerá del resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, para interacciones receptor-ligando (R-L) la afinidad (kd) es igual a, o mejor que la kd de R-L (rango pM). Para simple depuración de proteínas circulantes patológicas, la Kd podría estar en un rango nM bajo, por ejemplo, depuración de varias especies del péptido ?-ß circulante. Además, la Kd también dependerá de si el objetivo expresa múltiples copias del mismo epítope, por ejemplo, un epítope conformacional de focalización de mAb en oligómeros ?ß.
Cuando el VD 1 y VD2 unen el mismo antígeno, pero distintos epítopes, la proteína de enlace de DVD contendrá sitios de enlace para el mismo antígeno, por consiguiente incrementando la avidez y por lo tanto la Kd aparente de la proteína de enlace de DVD. En una modalidad, se eligen anticuerpos parentales con Kd igual o más baja que la deseada en las proteínas de enlace de DVD. Las consideraciones de afinidad de un mAb parental también puede depender de si la proteína de enlace de DVD contiene cuatro o más sitios de enlace de antígeno idénticos (es decir, una proteína de enlace de DVD de un solo mAb). En este caso, la Kd aparente podría ser mayor a la del mAb debido a su avidez. Tales proteínas de enlace de DVD se pueden emplear para la reticulación del receptor de superficie, la potencia de neutralización incrementada, depuración mejorada de proteínas patológicas, etc.
En otra modalidad, se seleccionan anticuerpos parentales con potencia de neutralización para un antígeno específico igual a o mejor el potencial de neutralización deseado de la proteína de enlace de DVD para el mismo antígeno. La potencia de neutralización se puede evaluar mediante un bioensayo dependiente del objetivo donde las células de tipo apropiado producen una señal medible (es decir, proliferación o producción de citocinas) en respuesta a una simulación objetivo, y neutral ización objetivo mediante el mAb puede reducir la señal de u na manera dependiente de la dosis.
I I I . B.3. Funciones biológicas Los anticuerpos monoclonales pueden realizar potencialmente varias funciones. Algunas de estas funciones se listan en la Tabla 4. Estas funciones se pueden evaluar tanto mediante ensayos in vitro (por ejem plo, ensayos bioquímicos y a base de células) y modelos de animales in vivo.
Tabla 4. Algu nas Aplicaciones Potenciales para Anticuerpos Terapéuticos.
Los mAbs con distintas funciones descritos en los ejemplos de la presente y en la Tabla 8 se pueden seleccionar para lograr resultados terapéuticos deseados. Dos o más anticuerpos monoclonales parentales seleccionados se pueden utilizar entonces en el formato de proteína de enlace de DVD para lograr dos distintas funciones en una sola proteína de enlace de DVD. Por ejemplo, una proteína de enlace de DVD se puede generar seleccionando un mAb parental que neutralice la función de una citocina específica, tal como esclerostina, y seleccionando un mAb parental que mejore la depuración de una proteína patológica. De manera similar, pueden seleccionarse dos mAbs parentales que reconozcan dos diferentes receptores de superficie celular, un mAb con una función agonista en un receptor y el otro mAb con una función antagonista en un receptor diferente. Estos dos mAbs seleccionados, cada uno con una función distinta, se pueden utilizar para construir una sola proteína de enlace de DVD que posea las dos distintas funciones (agonista y antagonista) de los anticuerpos monoclonales seleccionados en una sola molécula. De manera similar, pueden utilizarse dos mAbs antagonistas a los receptores de superficie celular, cada uno bloqueando el enlace de los respectivos ligandos receptores (por ejemplo, EGF e IGF), en un formato de proteína de enlace de DVD. Por el contrarío, un mAb anti-receptor antagonista (por ejemplo, anti-EGFR) y un mAb mediador anti-soluble neutralizante (por ejemplo, anti-IGF1 /2) se puede seleccionar para hacer una proteína de enlace de DVD.
I I . B. . Reconocimiento de Epítope: Las diferentes regiones de proteínas pueden realizar diferentes funciones. Por ejemplo, las regiones específicas de una citocina, tal como la esclerostina, interactúan con el receptor de citocina para causar la activación del receptor mientras que otras regiones de la proteína pueden requerir estabilizar la citocina. En este caso, se puede seleccionar un mAb que se una específicamente a la(s) región(es) de interacción del receptor en la citocina y por lo tanto se bloquea la interacción citocina-receptor. En algunos casos, por ejemplo ciertos receptores de quimiocina que unen múltiples ligandos, se puede seleccionar un mAb que se une al epítope (región en el receptor de quimiocina) que interactúa solamente con un ligando. En otros casos, los anticuerpos monoclonales se pueden unir a epítopes en un objetivo que sea directamente responsable de las funciones fisiológicas de la proteína, aunque el enlace de un mAb a estas regiones podría ya sea interferir con las funciones fisiológicas (impedimento estérico) o alterar la conformación de la proteína de modo tal que la proteína no pueda funcionar (mAb a receptores con múltiples ligandos los cuales alteran la conformación del receptor de modo tal que ninguno del ligando se pueda unir). También se han identificado anticuerpos monoclonales anti-citocina que no bloquean el enlace de la citocina a su receptor, pero que bloquean la transducción de señales (por ejemplo, 125-2H, un mAb anti-I L-18).
Los ejemplos funciones de los epítopes y mAb incluyen, pero no están limitados a, bloquear la interacción Receptor-Ligando (R-L) (neutralizando el mAb que une el sitio de interacción R); el impedimento estérico resulta en un enlace disminuido o ningún enlace R. Un anticuerpo puede unir el objetivo en un sitio diferente a un sitio de enlace del receptor, aunque todavía interfiere con el enlace del receptor y las funciones del objetivo que inducen el cambio conformacional y elimina la función (por ejemplo, omalizumab XOLAI R®, Genetech/Novartis), de enlace a R aunque bloquea la señalización (mAb 125-2H).
En una modalidad, el mAb parental necesita focalizar el epítope apropiado para su máxima eficacia. Tal epítope deberá conservarse en la proteína de enlace de DVD. El epítope de enlace de un mAb se puede determinar mediante varias metodologías, incluyendo co-cristalografía, proteólisis limitada del complejo de mAb-antígeno más mapeo de péptido espectrométrico de masa (Legros V. et al 2000 Protein Sci. 9: 1002-1 0), bibliotecas de péptidos de exhibición con fagos (O'Connor KH et al 2005 J Immunol Methods. 299:21 -35) , así como mutagénesis (Wu C. et al. 2003 J Immunol 1 70: 5571 -7).
I I I . B.5. Propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas: El tratamiento terapéutico con anticuerpos frecuentemente requiere la administración de altas dosis, frecuentemente varios mg/kg (debido a una baja potencia en una base en masa como consecuencia de un peso molecular típicamente grande). A fin de adaptarse a la adhesión del paciente y para dirigir adecuadamente las terapias de padecimientos crónicos y el tratamiento ambulatorio, es deseable la administración subcutánea (s.c.) o intramuscular (i. m.) de mAbs terapéuticos. Por ejemplo, el volumen deseable máximo para administración s.c. es ~1 .0 ml_, y por lo tanto son deseables concentraciones de >1 00 mg/mL para limitar el número de inyecciones por dosis. En una modalidad, el anticuerpo terapéutico se administra en una dosis. El desarrollo de tales formulaciones es restringido, sin embargo, por las interacciones proteína-proteína (por ejemplo, agregación, la cual incrementa potencialmente los riesgos de inmunogenicidad) y por las limitaciones durante el procesamiento y suministro (por ejemplo, viscosidad). En consecuencia, las grandes cantidades requeridas para la eficacia clínica y las restricciones de desarrollo asociadas limitan el completo aprovechamiento del potencial de la formulación del anticuerpo y administración s.c. en regímenes de dosis altas. Es evidente que las propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas de una molécula de proteína y la solución de proteína son de extrema importancia, por ejemplo, los aspectos de estabilidad, solubilidad y viscosidad.
I I I .6.5. i. Estabilidad Una formulación de anticuerpo "estable" es una en la cual el anticuerpo de la presente esencialmente mantiene su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica en almacenamiento. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. En una modalidad, el anticuerpo en la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante al menos 1 mes y/o estable aproximadamente a 2-8°C durante al menos 1 año por al menos 2 años. Además, en una modalidad, la formulación es estable después de su congelamiento (a, por ejemplo, -70°C) y descongelamiento de la formulación, a partir de aquí referido como un "ciclo de congelación/descongelación". En otro ejemplo, una formulación "estable" puede ser una en donde menos de aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% de la proteína está presente como un agregado en la formulación.
Es deseable una proteína de enlace de DVD estable in vitro a varias temperaturas durante un periodo de tiempo prologando. Se puede lograr esto mediante la rápida selección de mAbs parentales estables in vitro a temperatura elevada, por ejemplo, a 40°C durante 2-4 semanas, y tras evaluar la estabilidad. Durante el almacenamiento a 2-8°C, la proteína revela una estabilidad de al menos 12 meses, por ejemplo, al menos 24 meses. La estabilidad (% de molécula monomérica intacta) se puede evaluar utilizando varias técnicas tales como la cromatografía con intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaños, SDS-PAGE, así como análisis de bioactividad. Para una lista más exhaustiva de técnicas analíticas que pueden emplearse para analizar las modificaciones covalentes y conformacionales, ver, Jones, A. J. S. (1993) "Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems," En Cleland, J. L.; Langer, R., editors. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1a edición (Washington, ACS), páginas 22-45; y Pearlman, R.; Nguyen, T. H. (1990) "Analysis of protein drugs," En Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1a edición (New York, Marcel Dekker, Inc.), páginas 247-301.
La heterogeneidad y formación de agregados: estabilidad del anticuerpo puede ser de modo tal que la formulación pueda relevar menos de aproximadamente 10%, y, en una modalidad, menos de aproximadamente 5%, en otra modalidad, menos de aproximadamente 2%, o, en una modalidad, dentro del rango de 0.5% a 1 .5% o menos en el material del anticuerpo GMP que está presente como agregado. La cromatografía de exclusión por tamaños es un método que es sensible, reproducible, y muy robusto en la detección de agregados de proteína.
Además de bajos niveles de agregados, el anticuerpo debe, en una modalidad, ser químicamente estable. La estabilidad química puede determinarse mediante cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico), cromatografía de interacción hidrófoba, u otros métodos tales como enfoque isoeléctrico o electroforesis capilar. Por ejemplo, la estabilidad química del anticuerpo puede ser de modo tal que después del almacenamiento de al menos 12 meses a 2-8°C el pico que representa el anticuerpo no modificado en una cromatografía de intercambio catiónico puede incrementarse no más del 20%, en una modalidad, no más del 10%, o, en otra modalidad, no más del 5% en comparación con la solución de anticuerpos previo al análisis de almacenamiento.
En una modalidad, la integridad estructura de la exhibición de anticuerpos parentales; la correcta formación de enlace con disulfuro, y el correcto pliegue: La inestabilidad química debida a cambios en la estructura secundaria o terciaria de un anticuerpo puede impactar la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, la estabilidad que se indica por la actividad del anticuerpo puede ser de modo tal que después del almacenamiento de al menos 12 meses a 2-8°C la actividad del anticuerpo puede disminuir no más del 50%, en una modalidad no más del 30%, o incluso no más del 10%, o en una modalidad no más del 5% o 1 % en comparación con la solución de anticuerpos previo al análisis en almacenamiento. Pueden emplearse ensayos de enlace de antígenos adecuados para determinar la actividad del anticuerpo.
I I I . B.5 ii. Solubilidad: La "solubilidad" de un mAb se correlaciona con la producción de IgG monomérica correctamente plegada. La solubilidad de la IgG por lo tanto puede evaluarse mediante HPLC. Por ejemplo, la IgG soluble (monomérica) dará lugar a un solo pico en el cromatografo de HPLC, mientras que insoluble (por ejemplo, multimérica y agregada) dará lugar a una pluralidad d épicos. Una persona experta en la técnica por lo tanto será capaz de detectar un incremento o disminución en la solubilidad de una IgG que utiliza técnicas HPLC de rutina. Para una lista más exhaustiva de técnicas analíticas que pueden emplearse para analizar la solubilidad (ver, Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng. , Univ. Col!. London, London, UK. Editor(s): Shamlou, P. Ayazi, Process. Solid-Liquid Suspensions ( 1993), 93-1 17. (Butterworth-Heinemann, Oxford, UK) y Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H , Advances en Parenteral Sciences (1 990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301 . La solubilidad de un mAb terapéutico que es crítica para formular a concentración elevada frecuentemente requiere dosificación adecuada. Según lo descrito en la presente, las solubilidades de > 100 mg/mL pueden requerir adaptar una dosificación eficiente de anticuerpos. Por ejemplo, la solubilidad del anticuerpo puede no ser menor que aproximadamente 5 mg/mL al comienzo de la fase de investigación, en una modalidad no menos de aproximadamente 25 mg/mL, o en una modalidad no es menor que aproximadamente 150 mg/mL. Las propiedades intrínsecas de una molécula de proteína son importantes para las propiedades físico-químicas de la solución de proteína, por ejemplo, estabilidad, solubilidad, viscosidad. Sin embargo, una persona experta en la técnica apreciará que una amplia variedad de excipientes que pueden utilizarse como aditivos par impactar benéficamente las características de la formulación final de la proteína. Estos excipientes pueden incluir: (i) solventes líquidos, co-solventes (por ejemplo, alcoholes tales como etanol); (ii) agentes amortiguadores (por ejemplo, fosfato, acetato, citrato, amortiguadores de aminoácidos); (iii) azucares o alcoholes de azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, fructosa, rafinosa, manitol, sorbitol, dextranos); (iv) surfactantes (por ejemplo, polisorbato 20, 40, 60, 80, poloxámeros); (v) modificadores de isotonicidad (por ejemplo, tales como NaCI, azucares, alcoholes de azúcar); y (vi) otros (por ejemplo, conservadores, agentes quelantes, antioxidantes, sustancias quelantes (por ejemplo, EDTA), polímeros biodegradables, moléculas portadoras (por ejemplo, HSA, PEGs).
La viscosidad es un parámetro de alta importancia con respecto a la fabricación de anticuerpos y procesamiento de anticuerpos (por ejemplo, diafiltración/ultrafiltración), procesos de acabado de relleno (aspectos de bombeo, aspectos de filtración) y aspectos de suministro (posibilidad de suministro por inyección, suministro con dispositivos sofisticados). Las bajas viscosidades permiten la solución líquida del anticuerpo que tiene una concentración más alta. Esto permite administrar la misma dosis en volúmenes más pequeños. Los pequeños volúmenes de inyección son inherentes a la ventaja de sensaciones de mínimo dolor en la inyección, y las soluciones no necesariamente tienen que ser isotónicas para reducir el dolor por inyección en el paciente. La viscosidad de la solución de anticuerpos puede ser de modo tal que a velocidades de cizallamiento de la viscosidad de la solución de anticuerpos de 1 00 (l/s) es por debajo de 200 mPas, en una modalidad por debajo de 125 mPas, en otra modalidad por debajo de 70 mPas, y en aún otra modalidad por debajo de 25 mPas o incluso por debajo de 10 mPas.
I I I . B.5. Mi. Eficiencia de producción La de una proteína de enlace de DVD que se expresa eficientemente en células de mamífero, tal como células de ovario de hámster chino (CHO), en una modalidad requerirá dos anticuerpos monoclonales parentales los anticuerpos por sí mismos se expresan eficientemente en células de mamífero. El rendimiento de producción de una línea de mamífero estable (es decir, CHO) deberá estar por arriba de aproximadamente 0.5 g/L, en una modalidad por arriba de aproximadamente 1 g/L, y en otra modalidad en el rango de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 g/L o más (Kipriyanov SM, Little M. 1 999 Mol Biotechnol. 12: 1 73-201 ; Carroll S, Al-Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther. 4: 1821 -9).
La producción de anticuerpos y proteínas de fusión de Ig en células de mamífero es influenciada por varios factores. El diseño genético del vector de expresión a través de la incorporación de promotores fuertes, mejoradores y marcadores de selección puede maximizar la transcripción del gene de interés de una copia de vector integrada. La identificación de sitios de integración del vector que son permisivos de altos niveles de transcripción genética puede aumentar la expresión de proteína de un vector (Wurm et al, 2004, Nature Biotechnology, 2004, 22(1 1 ): 1 393-1398). Además, los niveles de producción pueden afectarse por la proporción de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos y varias etapas en el proceso del ensamble y secreción de proteína (Jiang et al. 2006, Biotechnology Progress, Ene-Feb 2006, vol. 22, no. 1 , pp. 313-31 8).
I I I . B.6. I nmunogenicidad La administración de un mAb terapéutico puede dar como resultado cierta incidencia de una respuesta inmune (es decir, la formación de anticuerpos endógenos dirigidos contra el mAb terapéutico). Pueden tomarse elementos potenciales que podrían inducir la inmunogenicidad deberán analizarse durante la selección de los anticuerpos monoclonales párenteles, y etapas para reducir tal riesgo para optimizar los anticuerpos monoclonales parentales previo a la construcción de proteínas de enlace de DVD. Se ha encontrado que los anticuerpos derivados de ratón son altamente inmunizadores en los pacientes. La generación de anticuerpos quiméricos comprendidos de regiones constantes humanas y variables de ratón presenta una siguiente etapa lógica para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos (Morrison y Schlom, 1 990). Alternativamente, la inmunogenicidad se puede reducir transfiriendo secuencias de CDR murinas en un armazón de anticuerpo humano (remodelado/injerto de CDR/humanización), como se describe para un anticuerpo terapéutico por Riechmann et al. , 1 988. Otro método es referido como "revestimiento" o "enchapado" comenzando con los dominios de cadena ligera y pesada variables de roedor, solamente se alteran los aminoácidos de armazón de superficie accesible en humanos, aunque la CDR y los aminoácidos enterrados permanecen del anticuerpo de roedor parental (Roguska et al. , 1 996). En otro tipo de humanización, en vez de injertar las CDRs enteras, una técnica injerta solamente las "regiones determinantes de la especificidad" (SCDRs), definidas como el subconjunto de residuos de CDR que están involucrados en el enlace del anticuerpo a su objetivo (Kashmiri et al. , 2005). Esto necesita la identificación de los SDRs ya sea a través del análisis de estructuras tridimensionales de complejos de anticuerpos objetivo o análisis mutacional de residuos de CDR de anticuerpos para determinar cuáles interactúan con el objetivo. Alternativamente, los anticuerpos totalmente humanos pueden tener inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos murinos, quiméricos, o humanizados.
Otra metodología para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es la eliminación de ciertas secuencias específicas que se predice que son inmunógenas. En una metodología, después de que una sustancia biológica de primera generación se ha probado en humanos y que se encontró inaceptablemente inmunógena, los epítopes de células B se pueden mapear y luego alterarse para evitar la detección inmune. Otra metodología utiliza métodos para predecir y remover los epítopes de células T. Se han desarrollado métodos computacionales para escanear e identificar las secuencias de péptidos de sustancias terapéuticas biológicas con el potencial de unirse a proteínas MHC (Desmet et al., 2005). Alternativamente se puede utilizar un método a base de células dendríticas humanas para identificar epítopes de células T CD4+ en potenciales alérgenos de proteína (Stickler et al., 2005; S.L. Morrison and J. Schlom, Important Adv. Oncol. (1990), pp. 3-18; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. and Winter, G. "Reshaping human antibodies for therapy," Nature (1988) 332: 323-327; Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Bláttler-W-A, Rees-A-R, Guild-B-C, "A comparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing," Protein Engineering, (1996), 9: 895-904; Kashmiri-Syed-V-S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom-Jeffrey, "SDR grafting-a new approach to antibody humanization," Methods (San Diego Calif .), May 2005, 36(1): 25-34; Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq-Krista, Debulpaep-Maja, Braeckman-Tessa, Lasters-Ignace, "Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation," Proteins (2005) 58: 53-69; Stickler-M-M, Estell-D-A, Harding-F-A., "CD4+ T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells," J. Immunother. (2000) 23: 654-60) .
I I I . B.7. Eficacia in vivo Para generar una proteína de enlace de DVD con eficacia in vivo deseada , es im portante generar y seleccionar mAbs con eficacia in vivo de sim il itud deseada cuando se da en combinación . Sin embargo, en algunos casos, la proteína de enlace de DVD puede exhibir eficacia in vivo que no se puede lograr con la combinación de dos mAbs separados. Por ejem plo, una proteína de enlace de DVD puede poner dos objetivos en proximidad cercana que llevan a una actividad que no se puede lograr con la combinación de dos mAbs separados. Las funciones biológicas deseables ad icionales se describen en la presente en la sección B3. Los anticuerpos parentales con características deseables en la proteína de en lace de DVD pueden seleccionarse en base a factores tales como vida med ia farmacocinética (t½) ; distribución de tejido; objetivos solubles versus de superficie celular; y concentración soluble/densidad de superficie del objetivo.
I I I . B.8. Distribución de tejido in vivo Para generar u na proteína de enlace de DVD con distribución de tejido in vivo deseada , en una modalidad , deben seleccionarse mAbs parentales con perfil de distribución de tej ido in vivo deseada sim ilar. Alternativamente, en base al mecanismo de la estrategia de focalizacion dual-específica, puede no requerirse en otros momentos para seleccionar mAbs parentales con distribución de tej ido in vivo similarmente deseada cuando se da en combinación. Por ejemplo, en el caso de una proteína de enlace de DVD a un sitio específico llevando por lo tanto el segundo componente de enlace al mismo sitio objetivo. Por ejemplo, una especificidad de enlace de una proteína de enlace de DVD podría focalizar el páncreas (células de islote) y la otra especificidad podría llevar el GLP1 al páncreas para inducir la insulina.
I I I. B.9. Isotipo Para generar una proteína de enlace de DVD con propiedades deseadas que incluyen, pero no están limitadas a, isotipo, funciones efectoras, y la vida media circulante, se seleccionan mAbs parentales que poseen funciones efectoras Fe apropiadas que dependen de la utilidad terapéutica y el término terapéutico deseado. Existen cinco principales clases de cadena pesada o isotipos, algunos de los cuales tienen varios sub-tipos y estos determinan las funciones efectoras de una molécula de anticuerpo. Estas funciones efectoras residen en la región de bisagra, CH2, y dominios CH3 de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, los residuos en otras partes de una molécula de anticuerpo pueden tener efectos en las funciones efectoras también. Las funciones efectoras Fe de la región de bisagra incluyen: (i) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), (ii) enlace de complemento (C1 q) , activación, y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), (iii) fagocitosis/depuración de complejos de antígeno-anticuerpo, y (iv) liberación de citocinas en algunos casos. Estas funciones efectoras Fe de una molécula de anticuerpo se median a través de la interacción de la región Fe con un conjunto de receptores de superficie celular de clase específica. Los anticuerpos del isotipo lgG1 son más activos aunque la lgG2 e lgG4 tengan funciones efectoras mínimas o no tenga funciones efectoras. Las funciones efectoras de los anticuerpos IgG se median a través de interacciones con tres tipos de receptores Fe celulares estructuralmente homólogos (y sub-tipos) (FcgR1 , FcgRIl , y FcgRI I I). Estas funciones efectoras de una lgG 1 se puede eliminar mutando residuos de aminoácidos específicos en la región de bisagra más baja (por ejemplo L234A, L235A) que son requeridas para el enlace de FcgR y C1 q. los residuos de aminoácidos en la región Fe, en particular los dominios CH2-CH3, también determinan la vida media circulante de la molécula del anticuerpo. Esta función Fe es mediada a través de el enlace de la región Fe al receptor Fe neonatal (FcRn), el cual es responsable del reciclado de las moléculas del anticuerpo de los lisosomas ácidos de regreso a la circulación general .
Si un mAb debe tener un isotipo activo o inactivo dependerá del término terapéutico deseado para un anticuerpo. Algunos ejemplos de uso de isotipos y resultado terapéutico deseado se listan a continuación: 1 . Si el término deseado es la neutralización funcional de una citocina soluble entonces puede utilizarse un isotipo inactivo; 2. Si el resultado deseado es la depuración de una proteína patológica puede utilizarse un isotipo activo; 3. Si el resultado deseado es la depuración de agregados de proteína puede utilizarse un isotipo activo; 4. Si el resultado deseado es antagonizar un receptor de superficie se utiliza un isotipo inactivo (Tysabri, lgG4; OKT3®, lgG1 mutada); 5. Si el resultado deseado es eliminar células objetivo se utiliza un isotipo activo (Herceptin, IgG 1 (y con funciones efectoras mejoradas); y 6. Si el resultado deseado es depurar proteínas de la circulación sin entrar al SNC puede utilizarse un isotipo de IgM (por ejemplo, depurar especies de péptidos de Ab circulantes). Las funciones efectoras Fe de un mAb parental se puede determinar mediante varios métodos in vitro bien conocidos en la técnica.
Como se aborda, la selección de isotipo, y por lo tanto las funciones efectoras dependerán del término terapéutico deseado. En casos donde se desea la simple neutralización de un objetivo circulante, por ejemplo bloquear interacciones receptor-ligando, pueden no requerirse las funciones efectoras. En tales casos, son deseables isotipos o mutaciones en la región Fe de un anticuerpo que eliminen funciones efectoras. En otros casos cuando la eliminación de células objetivo es el término terapéutico, por ejemplo la eliminación de células tumorales, son deseables isotipos o mutaciones o la des-fucosilación en la región Fe que mejoren las funciones efectoras (Presta GL, Adv. Drug Delivery Rev., 58: 640-656, 2006; Satoh M., I ida S., Shitara K., Expert Opinión Biol. Ther., 6: 1161-1173, 2006). De manera similar, dependiendo de la utilidad terapéutica, la vida media circulante de una molécula de anticuerpo se puede reducir/prolongar modulando las interacciones anticuerpo-FcRn introduciendo mutaciones específicas en la región Fe (Dall'Acqua WF, Kiener PA, Wu H . , J. Biol. Chem. , 281 : 23514-23524 (2006); Petkova SB. , Akilesh S., Sproule TJ. et al. , Internet. Immunol. , 18: 1759-1 769 (2006); Vaccaro C , Bawdon R. , Wanjie S et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103: 18709-1 8714 (2007).
La información publicada sobre los diversos residuos que influencian las diferentes funciones efectoras de un mAb terapéutico normal puede necesitar confirmarse para una proteína de enlace de DVD. Puede ser posible que en un formato de proteína de enlace de DVD puedan ser importantes los residuos de la región FC adicionales (diferentes), aparte de los identificados para la modulación de funciones efectoras de anticuerpos monoclonales.
En términos generales, la decisión en cuanto a cuáles funciones efectoras Fe (isotipo) serán críticas en el formato de proteína de enlace de DVD final dependerá de la indicación del padecimiento, objetivo terapéutico, término terapéutico deseado, y consideraciones de seguridad. A continuación se listan regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera apropiadas ejemplificantes que incluyen, pero no están limitadas: lgG1 - alotipo: G 1 mz lgG1 muíante - A234, A235 lgG2 - alotipo: G2m(n-) Kappa - Km3 Lambda Estudios sobre Receptor Fe y C1 q: La posibilidad de citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo indeseada (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediante la formación de complejos de anticuerpos a cualquier objetivo sobreexpresado en membranas celulares puede ser anulada por (por ejemplo L234A, L235A), mutaciones de región de bisagra. Estos aminoácidos sustituidos, presentes en la región de bisagra IgG 1 del mAb, se espera que den como resultado el enlace disminuido del mAb a los receptores Fe humanos (pero no FcRn), puesto que se cree que el enlace de FcgR ocurre dentro de los sitios de superposición en la región de bisagra I g G 1 . Este aspecto de mAb puede llevar a un perfil de seguridad mejorado sobre anticuerpos que contienen una IgG de fenotipo natural. El enlace de un mAb a receptores Fe humanos se puede determinar mediante experimentos de citometría de flujo utilizando líneas celulares (por ejemplo, THP-1 , K562) y una línea de células CHO manipuladas genéticamente que expresa el FcgRI Ib (u otros FcgRs). En comparación con los anticuerpos monoclonales de control, el mAb muestra enlace reducido en FcgRI y FcgRIIa tanto el enlace a FcgRI I b no sea afectado. El enlace y activación de C1 q mediante complejos inmunes de antígeno/lgG provoca la clásica cascada de complementos con las consecuentes respuestas inflamatorias y/o inmuno-reguladoras. El sitio de enlace C1 q en IgGs ha sido localizado en residuos dentro de la región de bisagra IgG. Se evalúa el enlace C1 q para incrementar concentraciones de mAb mediante el ELISA en C1 q. Los resultados demuestran que el mAb es incapaz de unirse al C 1 q, como se esperaba en comparación con el enlace de una IgG 1 de control de fenotipo natural. En términos generales, la mutación de la región de bisagra L234A, L235A anula el enlace del mAb a FcgRI, FcgRIIa, y C1q, aunque no tiene impacto en la interacción del mAb con FcgRIIb. Estos datos sugieren que el mAb in vivo con Fe mutante interactuará normalmente con el FcgRIIb inhibidor aunque probablemente falle en interactuar con los receptores FcgRI y FcgRIIa activadores o C1q.
Enlace del FcRn humano: El receptor neonatal (FcRn) es responsable del transporte de la IgG a través de la placenta y de controlar la vida media catabólica de las moléculas de IgG. Podría ser deseable incrementar la vida media terminal de un anticuerpo para mejorar la eficacia, para reducir la dosis o frecuencia de administración, o para mejorar su localización en el objetivo. Alternativamente, podría ser ventajoso hacer lo opuesto es decir, disminuir la vida media terminal de un anticuerpo para reducir la exposición del cuerpo entero o mejorar las proporciones de enlace de objetivo respecto a no objetivo. La adaptación de la interacción entre IgG y su receptor de rescate, FcRn, ofrece una manera para incrementar o disminuir la vida medía terminal de IgG. Las proteínas en la circulación, incluyendo la IgG, se absorben en la fase fluida a través de micropinocitosis mediante ciertas células, tales como las del endotelio vascular. La IgG puede unir el FcRn en endosomas bajo condiciones ligeramente ácidas (pH 6.0-6.5) y puede reciclarse en la superficie celular, cuando la misma se libera bajo condiciones casi neutrales (pH 7.0-7.4). El mapeo del sitio de enlace de la región Fe en FcRn80, 16, 17 mostró que dos residuos de histidina que se conservan a través de las especies, His310 y His435, son responsables de la dependencia al pH de esta interacción. Utilizando la tecnología de exhibición de fagos, se identificó una mutación de la región Fe de ratón que incrementa el enlace al FcRn y prolonga la vida media de la IgG de ratón (ver Víctor, G. et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997)). También han sido identificadas mutaciones de la región Fe que incrementan la afinidad de enlace de IgG humana para FcRn a pH de 6.0, aunque no a pH de 7.4 (ver, Dall'Acqua et al., J. Immunol., 169(9): 5171-80 (2002)). Además, en un caso, también se observó un incremento dependiente del pH similar en el enlace (de hasta 27 veces) en el FcRn de macaco, y esto da como resultado un incremento doble en la vida media del suero en monos macacos en comparación con la IgG parental (ver, Hinton et al., J. Biol. Chem., 279(8): 6213-6216 (2004)). Estos hallazgos indican que es factible prolongar la vida media del plasma de sustancias terapéuticas de anticuerpos adaptando la interacción de la región Fe con FcRn. Por el contrario, las mutaciones de la región Fe que atenúan la interacción con FcRn pueden reducir la vida media del anticuerpo.
III. B.10. Farmacocinética (PK) Para generar una proteína de enlace de DVD con perfil farmacocinético deseado, en una modalidad, se seleccionan mAbs parentales con el perfil farmacocinético similarmente deseado. Una consideración es que la respuesta inmunógena a anticuerpos monoclonales (es decir, "HAHA", respuesta al anticuerpo anti-humano humano; "HACA", respuesta al anticuerpo anti-quimérico humano) complica además la farmacocinética de estos agentes terapéuticos. En una modalidad, se utilizan anticuerpos monoclonales con inmunogenicidad mínima o nada de inmunogenicidad para construir proteínas de enlace de DVD de modo tal que las proteínas de enlace de DVD resultantes también tengan inmunogenicidad mínima o nada de inmunogenicidad. Algunos de los factores que determinan la PK de un mAb incluyen, pero no se limitan a, propiedades intrínsecas del mAb (secuencia de aminoácidos VH); inmunogenicidad; enlace de FcRn y funciones Fe.
El perfil de PK de los anticuerpos monoclonales parentales seleccionados se puede determinar fácilmente en roedores puesto que el perfil PK en roedores se correlaciona adecuadamente con (o predice estrechamente) el perfil PK de anticuerpos monoclonales en el mono macaco y humanos.
Después de que se seleccionan los anticuerpos monoclonales parentales con características PK deseadas (y otras propiedades funcionales deseadas que se abordan en la presente), se construye la proteína de enlace de DVD. Cuando las proteínas de enlace de DVD contienen dos dominios de enlace de antígenos de dos anticuerpos monoclonales parentales, las propiedades PK de la proteína de enlace de DVD se evalúan también. Por lo tanto, mientras se determinan las propiedades PK de la proteína de enlace de DVD, pueden emplearse ensayos PK que determinan el perfil PK basado en la funcionalidad de ambos dominios de enlace de antígenos derivados de los 2 anticuerpos monoclonales parentales. El perfil PK de una proteína de enlace de DVD se puede determinar. Los factores adicionales que pueden impactar el perfil PK de la proteína de enlace de DVD incluyen la orientación del dominio de enlace de antígenos (CDR), tamaño de enlace, e interacciones Fc/FcRn. Se pueden evaluar las características PK de anticuerpos parentales examinando los siguientes parámetros: absorción, distribución, metabolismo y excreción.
Absorción: Hasta ahora, la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos es a través de rutas parenterales (por ejemplo, intravenosa [IV], subcutánea [SC], o intramuscular [IM]). La absorción de un mAb en la circulación sistémica después de la administración ya sea SC o IM del espacio intersticial principalmente es a través de la vía linfática. La degradación proteolítica, presistémica, saturable, puede dar como resultado la biodisponibilidad absoluta variable después de la administración extravascular. Usualmente, pueden observarse incrementos en la biodisponibilidad absoluta con dosis aumentativas de anticuerpos monoclonales debido a la capacidad proteolítica saturada a dosis más altas. El proceso de absorción para un mAb usualmente es bastante lento cuando el fluido linfático se drena lentamente en el sistema vascular, y la duración de la absorción puede ocurrir durante horas hasta varios días. La biodisponibilidad absoluta de anticuerpos monoclonales después de la administración SC en general varía de 50% a 100%. En el caso de una estructura mediadora del transporte en la barrera hematoencefálica (BBB) en el compartimento del SNC, donde la proteína de enlace de DVD se libera para permitir la interacción con su segundo sitio de reconocimiento de antígenos.
Distribución: Después de la administración IV, los anticuerpos monoclonales usualmente siguen un perfil de concentración-tiempo del suero (o plasma) bifásico, que comienza con una fase de rápida distribución, seguida por una fase de lenta eliminación. En general, un modelo farmacocinético biexponencial describe mejor este tipo de perfil farmacocinético. El volumen de distribución en el compartimento central (Ve) para un mAb usualmente es igual a o ligeramente más grande que el volumen en plasma (2-3 litros). Un patrón bifásico distinto en el perfil de concentración versus tiempo del suero (plasma) puede no ser evidente con otras rutas parentales de administración, tales como IM o SC, debido a la fase de distribución de la curva de concentración-tiempo del suero (plasma) es enmascarada por la porción de absorción larga. Muchos factores, incluyendo las propiedades fisicoquímicas, absorción mediada por el receptor de sitio específico y objetivo orientado, la capacidad de enlace del tejido, y la dosis de mAb pueden influenciar la biodistribución de un mAb. Algunos de estos factores pueden contribuir a la no linealidad en la biodistribución de un mAb.
Metabolismo y Excreción: Debido al tamaño molecular, los anticuerpos monoclonales intactos no se excretan en la orina a través del riñon. Los mismos principalmente se inactivan mediante el metabolismo (por ejemplo, catabolismo). Para anticuerpos monoclonales terapéuticos a base de IgG, las vidas medias típicamente varían de horas o 1 -2 días a más de 20 días. La eliminación de un mAb puede ser afectada por muchos factores, incluyendo, pero no limitados a, afinidad al receptor FcRn, inmunogenicidad del mAb, el grado de glicosilación del mAb, la susceptibilidad del mAb a la proteólisis, y la eliminación mediada con el receptor.
II I . B.1 1 . Patrón de reactividad cruzada del tejido en especies humanas y tox El patrón de tinción idéntico sugiere que la potencial toxicidad humana se puede evaluar en las especies tox. Las especies tox son aquellos animales en los cuales se estudia la toxicidad no relacionada.
Los anticuerpos individuales se seleccionan para cumplir dos criterios: (1 ) tinción de tejida apropiada para la expresión conocida del anticuerpo objetivo y (2) patrón de tinción similar entre tejidos de especies humanas y tox del mismo órgano.
Criterio 1 : Las inmunizaciones y/o selecciones de anticuerpos típicamente emplean antígenos recombinantes o sintetizados (proteínas, carbohidratos u otras moléculas). El enlace a la contraparte natural y contra-selección contra antigenos no relacionados frecuentemente son parte del embudo de selección de anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, la selección contra una multitud de antígenos frecuentemente es impráctica. Por lo tanto, los estudios de reactividad cruzada de tejido con tejidos humanos de todos los órganos mayores sirven para descartar el enlace indeseable del anticuerpo a cualquier antígeno no relacionado.
Criterio 2: Los estudios comparativos de reactividad cruzada de tejido con tejidos de especies h umanas y tox (mono macaco, perro, posiblemente roedores, y otros, los mismos 36 o 37 tej idos que se analizan como en el estudio en humanos) ayuda a validar la selección de una especie tox. En los estudios típicos de reactividad cruzada de tejidos en secciones de tejido congelado, los anticuerpos terapéuticos pueden demostrar el enlace esperada al antígeno conocido y/o a un menor grado de enlace a tej idos basados ya sea en i nteracciones de bajo nivel (enlace no específico, bajo nivel de enlace a antígenos similares , interacciones a base de cargas de bajo nivel , etc.). En cualquier caso, las especies animales de toxicolog ía más relevante es una con el grado más alto de coincidencia de enlace a tejido humano o animal.
Los estudios de reactividad cruzada de tejido siguen las guías reguladoras apropiadas incluyendo la Guía EC CPM P 111/5271 /94 "Production and qual ity control of mAbs" y la 1 997 US FDA/CBER " Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use" . Las criosecciones (5 pm) de tejidos humanos obtenidos en la autopsia o biopsia se fijaron y secaron en lentes de objeto. La tinción con peroxidasa de secciones de tej ido se realizan, utilizando el sistema de avidina-biotina . Gu ía de FDA "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use ". Las referencias relevantes incluyen Clarke, J . (2004), Boon , L. (2002a) , Boon , L. (2002b) , Ryan , A. ( 1 999) .
Los estudios de reactividad cruzada de tej ido frecuentemente se hacen en dos etapas, con la primera etapa incluyendo criosecciones de 32 tejidos (típicamente: Glándula Adrenal, Tracto Gastrointestinal, Próstata, Vejiga, Corazón, Músculo Esquelético, Células Sanguíneas, Riñon, Piel, Médula Ósea, Hígado, Médula Espinal, Senos, Pulmón, Bazo, Cerebelo, Nodulos Linfáticos, Testículos, Corteza Cerebral, Ovarios, Timo, Colon, Páncreas, Tiroides, Endotelio, Paratiroides, Uretra, Ojos, Pituitaria, Útero, Trompa de Falopio y Placenta) de un donador humano. En la segunda fase, se realiza un estudio de reactividad cruzada completo con hasta 38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cerviz, esófago, ojos, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodulos linfáticos, glándula mamaría del pecho, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervios periféricos, pituitaria, placenta, próstata, glándulas salivales, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estomago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdalas, uretra, vejiga urinaria, y útero) de tres adultos no relacionados. Los estudios típicamente se hacen mínimamente a dos niveles de dosis.
El anticuerpo terapéutico (es decir, artículo de prueba) y el anticuerpo de control de isotipo coincidente pueden biotinilarse para la defección del complejo de avidina-biotina (ABC); otros métodos de detección pueden incluir la detección de anticuerpos terciaria para un artículo de prueba etiquetado con FITC (o de algún otro modo), o formando pre-complejos con una IgG anti-humana etiquetada para un artículo de prueba no etiquetado.
Brevemente, las criosecciones (aproximadamente 5 µ?t?) de tejidos humanos obtenidos en la autopsia o biopsia se fijan y secan en lentes de objeto. La tinción con peroxidasa de secciones de tejido se realiza, utilizando el sistema de avidina-biotina. Primero (en el caso de un sistema de detección de formación de pre-complejos), el artículo de prueba se incuba con la IgG anti-humana biotinilada secundaria y se desarrolla en el complejo inmune. El complejo inmune en las concentraciones finales de 2 y 10 pg/mL del artículo de análisis se agrega en secciones de tejido en el lente de objeto y luego las secciones de tejido se hicieron reaccionar durante 30 minutos con un kit de avidina-biotina-peroxidasa. Subsecuentemente, la DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de la peroxidasa, se aplicó durante 4 minutos para la tinción del tejido. Se utilizan perlas de antígeno-Sepharose como secciones de tejido de control positivo.
Se considera que cualquier tinción específica es cualquier reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión del antígeno) o inesperada en base a la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión . Se califica la intensidad y frecuencia de cualquier tinción considerada específica. La competición de antígeno o suero o los estudios de bloqueo pueden ayudar además a determinar si la tinción observada es específica o no específica.
Si se encuentra que dos anticuerpos seleccionados cumplen los criterios de selección - tinción de tejido apropiada, tinción coincidente entre tejido específico humano y de toxicología animal - los mismos se pueden seleccionar para la generación de proteínas de enlace de DVD.
El estudio de reactividad cruzada de tejido tiene que repetirse con el constructo de proteína de enlace de DVD final, aunque estos estudios siguen el mismo protocolo que se describe en la presente, los mismos son más complejos de evaluar debido a que cualquier antígeno puede provenir de cualquiera los dos anticuerpos parentales, y cualquier enlace inexplicado necesita confirmarse con estudios de competición de antígeno complejo.
Es fácilmente evidente que la labor compleja de los estudios de reactividad cruzada de tejido con una molécula multiespecífica como una proteína de enlace de DVD es mayormente amplificada si los dos anticuerpos parentales se seleccionan por: (1 ) la falta de hallazgos inesperados en la reactividad cruzada del tejido y (2) similitud apropiada de los hallazgos de reactividad cruzada en el tejido entre los correspondientes tejidos de especies humanas y de toxicología animal.
I I I. B.12. Especificidad y Selectividad Para generar una proteína de enlace de DVD con especificidad y selectividad deseadas, se necesita generar y seleccionar mAbs parentales con el perfil de especificidad y selectividad similarmente deseado.
Los estudios de enlace para la especificidad y selectividad con una proteína de enlace de DVD pueden ser complejos debido a los cuatro o más sitios de enlace, dos de cada uno para cada antígeno. Brevemente, los estudios de enlace utilizando ELISA, BIAcore, KinExA, u otros estudios de interacción con una proteína de enlace de DVD necesitan monitorear el enlace de uno, dos o más antígenos a la proteína de enlace de DVD. Aunque la tecnología BIAcore puede resolver el enlace independiente y secuencial de múltiples antígenos, más métodos tradicionales que incluyen ELISA o técnicas más modernas como la KinExA no pueden. Por lo tanto la caracterización cuidadosa de cada anticuerpo parental es crítica. Después de que cada anticuerpo individual ha sido caracterizado para especificidad, la confirmación de la retención de especificidad de los sitios de enlace individuales en la proteína de enlace de DVD se simplifica en gran medida.
Es fácilmente evidente que la labor compleja de determinar la especificidad de una proteína de enlace de DVD es simplificada en gran medida si los dos anticuerpos parentales se seleccionan por su especificidad antes de ser combinados en una proteína de enlace de DVD.
Los estudios de interacción de antígeno-anticuerpo pueden tomar muchas formas, incluyendo muchos estudios clásicos de interacción proteína-proteína, incluyendo ELISA (ensayo de enzimoinmunoanálisis absorbente), espectrometría de masa, reticulación cruzada química, SEC con dispersión de luz, diálisis de equilibrio, permeación sobre gel, ultrafiltración, cromatografía con gel, SEC analítica de zona grande, ultra-centrifugación micro-preparativa (equilibrio en sedimentación), métodos espectroscópicos, microcalorimetría con titulación, equilibrio en sedimentación (en ultra-centrífuga analítica), velocidad de sedimentación (en centrífuga analítica), resonancia de plasmón superficial (incluyendo BIAcore). Las referencias relevantes incluyen "Current Protocols in Protein Science," John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) Volumen 3, capítulos 1 9 y 20, publicada por John Wiley & Sons Inc. , y las referencias incluidas en la presente y "Current Protocols in Immunology," John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (eds.) publicada por John Wiley & Sons Inc y referencias relevantes incluidas en la presente.
Liberación de Citocina en Sangre Entera: La interacción del mAb con glóbulos rojos humanos se puede investigar mediante un ensayo de liberación de citocina (Wing, M. G. , Therapeutic Immunology (1995), 2(4): 1 83-190; "Current Protocols in Pharmacology," S.J. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser, (eds.) publicada por John Wiley & Sons I nc; Madhusudan, S. , Clinical Cáncer Research (2004), 1 0(19): 6528-6534; Cox, J. Methods (2006), 38(4): 274-282; Choi, I . , Eur. J. Immunol. , (2001 ), 31 ( 1 ): 94-1 06). Brevemente, varias concentraciones de mAb se incuban con sangre entera humana durante 24 horas. La concentración analizada deberá cubrir un amplio rango que incluye concentraciones finales que imitan niveles sanguíneos típicos en pacientes (incluyendo pero no limitados a 1 00 ng/ml - 100 g/ml). Después de la incubación, se analiza la presencia de IL-1 Ra, TNF-a, I L-1 b, IL-6 e IL-8 en los sobrenadantes y Usados celulares. Los perfiles de concentración de citocina generados para el mAb se comparan con los perfiles producidos mediante el control negativo de IgG humana y un control positivo de LPS o PHA. El perfil de citocina exhibido por el mAb de tanto los sobrenadantes celulares como los lisados celulares se comparan con el que utiliza IgG humana de control. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal no interactúa con células sanguíneas humanas para liberar espontáneamente las citocinas inflamatorias.
Los estudios de liberación de citocina para una proteína de enlace de DVD son complejos debido a los cuatro o más sitios de enlace, dos de cada uno para cada antígeno. Brevemente, los estudios de liberación de citocina que se describen en la presente miden el efecto de la proteína de enlace de DVD completa en sangre entera u otros sistemas celulares, pero no puede resolver cuál porción de la molécula causa la liberación de la citocina. Una vez que se ha detectado la liberación de la citocina, la pureza de la preparación de la proteína de enlace de DVD tiene que constatarse, debido a que algunos componentes celulares de co-purificación pueden causar la liberación de la citocina por su propia cuenta. Si la pureza no es la cuestión, la fragmentación de la proteína de enlace de DVD (que incluyen, pero no están limitadas a la remoción de la porción Fe, separación de sitios de enlace etc. ), mutagénesis del sitio de enlace u otros métodos pueden necesitar emplearse para desplegar cualquier observación. Es fácilmente evidente que esta labor compleja se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos parentales se seleccionan por la falta de liberación de citocina antes de ser combinados en una proteína de enlace de DVD.
II I . B.1 3. Reactividad cruzada a otras especies para estudios toxicológicos En una modalidad, los anticuerpos individuales se seleccionan con suficiente reactividad cruzada a especies tox apropiadas, por ejemplo, monos cinomólogos. Anticuerpos parentales necesitan unirse a objetivos de especies ortólogos (es decir, monos cinomólogos) y provocar respuestas apropiadas (modulación, neutralización, activación). En una modalidad, la reactividad cruzada (afinidad/potencia) a objetivos de especies ortólogas deben ser dentro de 10 veces el objetivo humano. En la práctica, los anticuerpos parentales son evaluados para especies múltiples, que incluyen ratón, rata, perro, mono (y otros primates no humanos), así como también especies de modelos de enfermedad (es decir, ovejas mará modelo de asma). La reactividad cruzada a especies tox de los anticuerpos monoclonales parentales permite estudios toxicológicos futuros de proteína de enlace-DVD en las mismas especies. Por tal razón, los dos anticuerpos monoclonales parentales deben tener reactividad cruzada aceptable para una especie tox común por lo tanto permitiendo estudios de toxicología de proteína de enlace-DVD en las mismas especies.
Los mAbs parentales pueden ser seleccionados de varios mAbs capaces de enlazar objetivos específicos y bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a anticuerpo anti-esclerostina, anti-SOSTF, anti-TNF (Patente Estadounidense No. 6,258,562), anticuerpo anti-I L-12 y/o anti-IL-12p40 (Patente Estadounidense No. 6, 914, 128); anticuerpo anti-I L-1 8 (Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2005/0147610 A1 ), anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, anti-gp120, anti-VLA-4, anti-CD 1 1 a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (por ejemplo, véase el documento WO2007124299) anti-ld, anti-ICAM-1 , anti-CXCL1 3, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti DLL-4, anti-NPR1 , anti-PLGF, anti-ErbB3, anti-E-selectina, anti-Fact VII , anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CD 1 1 /1 8, anti-CD 14, anti-ICA -3, anti-RON , anti CD-1 9, anti-CD80 (por ejemplo, véase Publicación de PCT No. WO 2003/039486), anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrinA, anti-alpha4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,789,554), anti-CD20, anti-MI F, anti-CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti-gp120, anti-CMV, a nti-g pl I bM I a , anti-lgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, anti-IGF1 ,2, anti IGFR, anti-VN Rintegrina, anti-IL-1 alfa, anti-I L-1 beta, receptor anti-IL-1 , receptor anti-I L-2, anti-I L-4, receptor anti-I L-4, anti-I L5, receptor anti-I L-5, anti-I L-6, anti-IL-6R, RANKL, NGF, DKK, alfaVbeta3, anti-I L-8, anti-IL-9, anti-I L-1 3, anti-IL-13 receptor, y anti-IL-23; IL-23p1 9; (véase, Presta, "Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies," J. Alergia Clin. Immunol. , 1 16: 731 -736 (2005) y en el sitio de web en todo el mundo hwww.path.cam. ac. uk/~mrc7/humanisation/antibodies. html ) .
Los mAbs parentales también pueden ser seleccionados de varios anticuerpos terapéuticos aprobados para uso, en ensayos clínicos, o en desarrollo para uso clínico. Tales anticuerpos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, rituximab (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (véase por ejemplo Patente Estadounidense No. 5,736, 1 37), un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar linfoma no Hodgkin ; HuMax-CD20, un anti-CD20 siendo actualmente desarrollado por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la Patente Estadounidense No. 5, 500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (I ntracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, titulado "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof"), trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (véase por ejemplo Patente Estadounidense No. 5,677, 1 71 ), un anticuerpo anti-He2/neu humanizado aprobado para tratar cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), actualmente siendo desarrollado por Genentech; un anticuerpo anti-Her descrito en la Patente Estadounidense No. 4,753, 894; cetuximab (Erbitux®, I mclone) (Patente Estadounidense No. 4,943,533; documento PCT WO 96/4021 0), un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para una variedad de cánceres; ABX-EGF (Patente Estadounidense No. 6,235,883), actualmente siendo desarrollado por Abgenix-lmmunex-Amgen; HuMax-EGFr (U.S. Ser. No. 1 0/1 72,31 7), actualmente siendo desarrollado por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (Patente Estadounidense No. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al. , 1987, J Cell Biochem. 35(4): 31 5-20; Kettleborough et al. , 1 991 , Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cáncer Research) (documento PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al. , 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22( 1 -3): 129-46; Modjtahedi et al. , 1993, Br J Cáncer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cáncer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá y Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Patente Estadounidense No. 5,891 ,996; Patente Estadounidense No. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1 ):71 -8 ); mAb-806 (Ludwig Institute for Cáncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Nati Acad Sci USA. 1 00(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1 -1 (IVAX, National Cáncer I nstitute) (documento PCT WO 0162931 A2); y SC1 00 (Scancell) (documento PCT WO 01 /88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), un mAb humanizado actualmente aprobado para tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), y anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg®) , un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), una fusión Fe de anti-LFA-3 desarrollado por Biogen), abciximab (ReoPro®), desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®), desarrollado por Medimmune, infliximab (Remicade®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO-148), un anticuerpo TNF completamente humano desarrollado por Centocor, etanercept (Enbrel®), una fusión Fe del receptor de TN F p75 desarrollado por I mmunex/Amgen , lenercept, una fusión Fe del receptor p55TNF previamente desarrollada por Roche, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-IL8 siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MA1 , un anticuerpo anti-MUC 18 siendo desarrollado por Abgenix, Pemtumomab (R1 549, 90Y-muHMFG 1 ), un anti- UC1 en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 siendo desarrollado por Antisoma, AngioMab (AS 1405), siendo desarrollado por Antisoma, HuBC-1 , siendo desarrollado por Antisoma, Thioplatin (AS 1407) siendo desarrollado por Antisoma, Antegren® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y alfa-4-beta-7 siendo desarrollado por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo de integrina anti-VLA-1 siendo desarrollado por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo del receptor beta anti-linfotoxina (LTBR) siendo desarrollado por Biogen, CAT-1 52, un anticuerpo anti-TGF- 2 siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), un anticuerpo anti-I L-12 p40 siendo desarrollado por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGFpi siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Genzyme, CAT-21 3, un anticuerpo anti-Eotaxina l siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® un anticuerpo anti-Blys siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences Inc. , TRAI L-R1 mAb, un anticuerpo anti-TRAI L-R1 siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences, Inc. , Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF siendo desarrollado por Genentech, un anticuerpo de la familia del receptor anti-HER siendo desarrollado por Genentech, Anti-Tissue Factor (ATF), un anticuerpo del Factor anti-tejido siendo desarrollado por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-lgE siendo desarrollado por Genentech, Raptiva® (Efalizumab), un anticuerpo anti-CD1 1 a siendo desarrollado por Genentech and Xoma, anticuerpo MLN-02 (anteriormente LDP-02), siendo desarrollado por Genentech and Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL1 5 siendo desarrollado por Genmab and Amgen, HuMax-Inflam, siendo desarrollado por Genmab and Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I siendo desarrollado por Genmab and Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Linfoma, siendo desarrollado por Genmab and Amgen, HuMax-TAC, siendo desarrollado por Genmab, I DEC-1 31 , y anticuerpo anti-CD40L siendo desarrollado por I DEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado por I DEC Pharmaceuticals, IDEC- 14, un anticuerpo anti-CD80 siendo desarrollado por I DEC Pharmaceuticals, IDEC-1 52, un anti-CD23 siendo desarrollado por I DEC Pharmaceuticals, anticuerpos del factor de migración anti-macrófago (MI F) siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiopático siendo desarrollado por Imclone, I MC-1 C 1 1 , un anticuerpo anti-KDR siendo desarrollado por I mclone, DC 101 , un anticuerpo anti-flk-1 siendo desarrollado por Imclone, anticuerpos cadherina anti-VE siendo desarrollado por Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), un anticuerpo antígeno anti-carcinoembriónico (CEA) siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, siendo desarrollado por I mmunomedics, MyelomaCide, siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-01 0, un anticuerpo anti-CTLA4 siendo desarrollado por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 siendo desarrollado por Medarex, MDX-070 siendo desarrollado por Medarex, MDX-01 8 siendo desarrollado por Medarex, Osidem® (IDM-1 ), y anticuerpo anti-Her2 siendo desarrollado por Medarex and Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado por Medarex and Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-I L15 siendo desarrollado por Medarex and Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa siendo desarrollado por Medarex and Centocor/Johnson & Johnson, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina siendo desarrollado por Centocor/Johnson & Johnson, MOR101 y MOR1 02, anticuerpos de molécula-1 de adhesión anti-intercelular (ICAM-1 ) (CD54) siendo desarrollados por MorphoSys, MOR201 , un anticuerpo del receptor-3 del factor de crecimiento anti-fibroblasto (FGFR-3) siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 siendo desarrollado por Protein Design Labs, HuZAF®, un anticuerpo anti-gamma interferón siendo desarrollado por Protein Design Labs, Integrina Anti-a 5ß1 , siendo desarrollada por Protein Design Labs, anti-IL-12, siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1 , un anticuerpo anti-Ep-CAM siendo desarrollado por Xoma, Xolair® (Omalizumab) un anticuerpo anti-lgE humanizado desarrollado por Genentech and Novartis, y MLN01 , un anticuerpo de integrina anti-Beta2 siendo desarrollado por Xoma. En otra modalidad, los terapéuticos incluyen KRN330 (Kirina); anticuerpo huA33 (A33, Ludwig Institute for Cáncer Research); CNTO 95 (integrinas alfa V, Centocor); MEDI-522 (integrina alfa \/ß3, Medimmune); volociximab (integrina alfa ?/ß1, Biogen/PDL); mAb 216 humano (epítope glicosilado de células B, NCI); BiTE MT103 (CD19 x CD3 biespecifico, Medimmune); 4G7xH22 (BcelIxFcgammaRI Biespecifico, Medarex/Merck KGa); rM28 (CD28 x MAPG Biespecifico, Patente Estadounidense No. EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (CD64 x EGFR Biespecifico, Medarex); Catumaxomab (removab) (EpCAM x anti-CD3 Biespecifico, Trion/Fres); Ertumaxomab (HER2/CD3 biespecifico, Fresenius Biotech); oegovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex® (WX G250) (anhidrasa carbónica IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglina), Tracon); BMS-663513 (agonista CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab ( hA20) (CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (receptor fc de CD3, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hl_L1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (colágeno desdoblado, Tracon); HuLuc63 (CS1 , PDL Pharma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (agonista DR4 TRAIL-R1, Human Genome Science /Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (lexatumumab) (agonista DR5 TRAIL-R2, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIll, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab ( T201) (Epcam , Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (receptor folato a, Morphotech); KW-2871 (gangliósido GD3, yowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptina) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (cadena beta HLA-DR, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); R1507anti-IGF-1 R (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (receptor similar a Ig de células asesinas (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewes (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cáncer Research); hCBE-11 (LTfcR, Biogen); HuHMFGI (MUC1 , Antisoma/NCI); RAV12 (epítope de carbohidrato ligado a N, Raven); CAL (proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidilserina, Peregrine); huJ591 (PS A, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (TGFb (pan) inhibidor (lgG4), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.1 5 (receptor de transferrina, Salk Institute, I NSERN WO 2005/1 1 1082); E2.3 (receptor de transferrina, Salk I nstitute); Bevacizumab (Avastina) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab-WO/2000/034337, University of Texas); IMC-18F1 (VEGFR1 , Imclone); IMC-1 121 (VEGFR2, Imclone).
II I . C. Construcción de proteínas de enlace DVD Una proteína enlazante de dominio variable dual multiespecífica, multivalente (proteína de enlace-DVD) es diseñada de manera tal que dos diferentes dominios variables de cadena ligera diferentes (VL) de dos diferentes anticuerpos monoclonales parentales están ligados en serie directamente o vía un enlazador corto por técnicas de DNA recombinante, seguido por el dominio constante de cadena ligera. De manera similar, la cadena pesada comprende dos diferentes dominios variables de cadena pesada (VH) ligados en serie, seguido por la región Fe y el dominio constante CH 1 .
Los dominios variables se pueden obtener usando técnicas de DNA recombinante a partir de un anticuerpo parental generado por cualquiera de los métodos descritos en la presente. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera o pesada murino. En otra modalidad, el dominio variable es un dominio de cadena ligera o pesada variable humanizado o injertado en CDR. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera o pesada humana.
En unt. modalidad, el primero y segundo dominios variables están ligados directamente entre sí usando técnicas de DNA recombinante. En otra modalidad los dominios variables están ligados vía una secuencia enlazadora. En una modalidad, dos dominios variables están ligados. Tres o más dominios variables también pueden ser ligados directamente o vía una secuencia enlazadora. Los dominios variables pueden enlazar el mismo antígeno o pueden unir diferentes antígenos. Se proporcionan proteínas de enlace-DVD las cuales pueden incluir un dominio variable de inmunoglobulina y un dominio variable no inmunoglobulina, tal como dominio de enlace al ligando de un dominio activo o receptor de una enzima. Las proteínas de enlace-DVD también pueden comprender dos o más dominios no Ig.
La secuencia enlazadora puede ser un aminoácido único o una secuencia de polipéptido. En una modalidad, las secuencias enlazadoras son GGGGSG (SEC ID NO: 1695), GGSGG (SEC ID NO: 1696), GGGGSGGGGS (SEC ID NO: 1697), GGSGGGGSGS (SEC ID NO: 1698), GGSGGGGSGGGGS (SEC I D NO: 1699), GGGGSGGGGSGGGG (SEC I D NO: 1700) , GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 1701 ), ASTKGP (SEC ID NO: 1702), ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 1703), TVAAR (SEC I D NO: 1 704), TVAAPSVFI FPP (SEC ID NO: 1705), AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC I D NO: 1706), AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC I D NO: 1707), AKTTPKLGG (SEC ID NO: 1710), SAKTTPKLGG (SEC I D NO: 1709), SAKTTP (SEC ID NO:1702), RADAAP (SEC ID NO:1711), RADAAPTVS (SEC ID NO:1712), RADAAAAGGPGS (SEC ID NO:1713), RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO:1714), SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO:1715), ADAAP (SEC ID NO:1716), ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO:2050), QPKAAP (SEC ID NO:2051), QPKAAPSVTLFPP (SEC ID NO:2052), AKTTPP (SEC ID NO:2053), AKTTPPSVTPLAP (SEC ID NO:2054), AKTTAP (SEC ID NO:2055), AKTTAPSVYPLAP (SEC ID NO:2056), GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO:2057), GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID NO:2058), y GHEAAAVMQVQYPAS (SEC ID NO:2059). La elección de las secuencias enlazadoras se basa en el análisis de estructura cristalina de varias moléculas Fab. Existe un enlace flexible natural entre el dominio variable y el dominio constante CH1/CL en estructura molecular de anticuerpo o Fab. Este enlace natural comprende aproximadamente 10-12 residuos de aminoácido, contribuye por 4-6 residuos del C-término del dominio V y 4-6 residuos del N-término del dominio CL/CH1. Las proteínas de enlace-DVD descritas en la presente pueden ser generadas usando 5-6 residuos de aminoácido N-terminal, u 11-12 residuos de aminoácidos, de CL o CH1 como enlazador en la cadena ligera y cadena pesada de la proteína de enlace-DVD, respectivamente. Los residuos N-terminales de dominios CL o CH1, particularmente los primeros 5-6 residuos de aminoácidos, adoptan una conformación de bucle sin estructuras secundarias fuertes, y por lo tanto pueden actuar como enlazadores flexibles entre los dos dominios variables. Los residuos N-terminales de dominios CL o CH1 son extensiones naturales de los dominios variables, ya que son parte de las secuencias Ig, y por lo tanto minimizan a una extensión mayor cualquier inmunogenicidad que se origina potencialmente a partir de los enlazadores y uniones.
Otras secuencias enlazadoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud de dominio CL/CH1 pero no todos los residuos de dominio CL/CH1; por ejemplo los primeros 5-12 residuos de aminoácidos de los dominio CL/CH1; los enlazadores de cadena ligera pueden ser de CK o ??; y los enlazadores de cadena pesada se pueden derivar de CH1 de cualquiera de los isotipos, que incluyen Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, C6, Ce, y ?µ. Las secuencias enlazadoras también se pueden derivar de otras proteínas tales como proteínas similares a Ig, (por ejemplo, TCR, FcR, KIR); secuencias a base de G/S; secuencias derivadas de la región de articulación; y otras secuencias naturales de otras proteínas.
En una modalidad un dominio constante está ligado a dos dominios variables ligados usando técnicas de DNA recombinante. En una modalidad, una secuencia que comprende dominios variables de cadena pesada en serie ligados está ligada a un dominio constante de cadena pesada y una secuencia que comprende dominios variables de cadena ligera ligados en serie, está ligada a un dominio constante de cadena ligera. En una modalidad, los dominios constantes son dominio constante de cadena pesada humana y dominio constante de cadena ligera humana, respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada DVD es además ligada a una región Fe. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa, o una región Fe variante. En otra modalidad, la región Fe es una región Fe humana. En otra modalidad la región Fe incluye la región Fe de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.
En una modalidad, se combinan dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos DVD de cadena ligera para formar una proteína de enlace-DVD. La descripción detallada de proteínas de enlace-DVD específicas capaces de enlazar antígenos de objetivo específicos, tales como SOST, y métodos para elaborar los mismos, se proporciona en la sección de Ejemplos abajo.
I I I . D. Producción de proteínas de enlace-DVD Se proporcionan proteínas de enlace-DVD producidas por cualquiera de un número de técnicas bien conocidas en el arte, que incluyen por ejemplo, expresión de células hospederas, en donde los vectores de expresión que codifican las cadenas ligeras de proteína de enlace-DVD y proteína pesada de enlace-DVD son transfectadas en una célula hospedera por técnicas estándares. Las varias formas del término "transfección" están propuestas para abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de DNA exógeno en una célula hospedera procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroforación, precipitación por fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar las proteínas de enlace-DVD proporcionadas en ya sea células hospederas eucarióticas o procarióticas, las proteínas de enlace-DVD son expresadas en células eucarióticas, por ejemplo, células hospederas de mam ífero, debido a que tales células eucarioticas (y en particular células de mam ífero) son más probables que las células procarióticas de parecer y secretar una proteína de enlace-DV apropiadamente plegada e inm u nológicamente activa .
Célu las hospederas de mam ífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes proporcionados incluyen cél ulas de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyen células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin , ( 1 980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J . Kaufman and P.A. Sharp ( 1 982) Mol. Biol. , 1 59: 601 -621 ) , células de mieloma NS0, células COS , células SP2 y PER. C6. Cuando las proteínas de en lace-DVD que cod ifican vectores de expresión recom binante se introducen en cél ulas hospederas de mam ífero, las proteínas de enlace-DVD se producen cultivando las células hospederas por un periodo de tiempo suficiente para perm itir la expresión de las proteínas de enlace-DVD en las célu las hospederas o secreción de las proteínas DVD en el medio de cultivo en el cual las cél ulas hospederas se hacen crecer. Las proteínas de enlace-DVD pueden ser recuperadas del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteína estándar.
En un sistema ejem plar para expresión recom bi nante de las proteínas de enlace-DVD proporcionadas, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena ligera de proteína de enlace-DVD como la cadena pesada de proteína de enlace-DVD se introduce en células dhfr-CHO por transfección mediada por fosfato de calcio . Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera de la proteína de enlace-DVD son cada uno operativamente ligados a elementos reguladores promotores de AdMLP/intensificadores de CMV para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gene DHFR, el cual permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector usando selección/amplificación de metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas son cultivadas para permitir la expresión de las cadenas ligera y pesada de la proteína de enlace-DVD y la proteína de enlace-DVD intacta se recupera del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular estándares para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar la proteína de enlace-DVD del medio de cultivo. Todavía además, se proporciona un método para sintetizar una proteína de enlace-DVD cultivando una célula hospedera en un medio de cultivo adecuado hasta que una proteína de enlace-DVD es sintetizada. El método puede comprender además aislar la proteína de enlace-DVD del medio de cultivo.
Una característica importante de la proteína de enlace DVD es que puede ser producida y purificada en una forma similar como un anticuerpo convencional. La producción de proteína de enlace-DVD resulta en un producto mayor único, homogéneo, con actividad específica dual deseada, sin alguna modificación de secuencia de la región constante o modificaciones químicas de cualquier tipo. Otros métodos previamente descritos para generar proteínas de enlace de longitud completa "bi-específicas", "multi-específicas" y "multivalentes multi-específicas" no conducen a un producto primario único sino preferentemente conducen a la producción intracelular o secretada de una mezcla de proteínas de enlace de longitud completa, multivalentes, multi-específicas, mono-especificas, inactivas ensambladas, y proteínas de enlace de longitud completa multivalentes con combinación de diferentes sitios de enlace. Un ejemplo, con base en el diseño descrito por Miller y Presta (Publicación de PCT No. WO 2001 /077342(A1 ), son 16 posibles combinaciones de cadenas ligera y pesada. Consecuentemente solamente 6.25% de proteína es probable que esté en la forma activa deseada, y no como un producto mayor único o producto primario único comparado con las otras 15 combinaciones posibles. La separación de las formas completamente activas, deseadas, de la proteína de las formas inactivas y parcialmente activas de la proteína usando técnicas cromatográficas estándares, típicamente usadas en gran escala de manufacturación, está aún siendo demostrada.
De manera sorprendente, el diseño proporcionado de las "proteínas de enlace de longitud completa multivalentes específicas-duales" conduce a una cadena ligera de dominio variable dual y a una cadena pesada de dominio variable dual la cual se asemeja principalmente a las "proteínas de enlace de longitud completa multivalentes especificas-duales" deseadas.
Al menos 50%, al menos 75%, y al menos 90% de las proteínas de enlace-DVD ensambladas y expresadas son la proteína tetravalente específica dual deseada. Este aspecto se mejora particularmente la utilidad comercial de la invención proporcionada. Por lo tanto, se proporciona un método para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula única que conduce a un producto primario único de una "proteína de enlace de longitud completa tetravalente específica dual" .
Se proporcionan métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula única que conduce a un "producto primario" de una "proteína de enlace de longitud completa, tetravalente, especifica-dual", donde el "producto primario" es más de 50% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual.
Se proporcionan métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula única que conduce a un "producto primario" único de una "proteína de enlace de longitud completa, tetravalente, especifica-dual", donde el "producto primario" es más del 75% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual.
Se proporcionan métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula única que conduce a un "producto primario" único de una "proteína de enlace de longitud completa tetravalente especifica-dual", donde el "producto primario" es más de 90% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena l igera de domin io variable dual y una cadena pesada de dom inio variable.
IV. Producción de proteínas de enlace a esclerostina y Líneas Celulares Productoras de proteínas de enlace En una modalidad provista , las proteínas de enlace a esclerostina, incl uyendo anticuerpos anti-esclerostina , exhiben una alta capacidad para reducir o neutralizar la actividad de esclerostina, por ejemplo, cuando se evalúa mediante cualquiera de varios ensayos in vitro e in vivo en la técnica. Preferiblemente, las proteínas de enlace a esclerostina también exhiben una alta capacidad para reducir o neutralizar la actividad SOST.
En modal idades, u na proteína de enlace, o porción de enlace al antígeno de la m isma, en laza la esclerostina humana, en donde la proteína de en lace, o porción de enlace al antígeno de la misma, se d isocia de SOST humana con constante de d isociación kd¡soc de aproximadamente 0. 1 s"1 o menos, cuando se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o la cual inhibe la actividad de SOST humana con una I C50 de aproximadamente 1 x 1 0 6M o menor. Alternativamente, la proteína de enlace, o una porción de en lace al antígeno de la m isma, puede disociarse de la esclerostina humana con una proporción de d isociación kdisoc de aproximadamente 1 x 1 0-2S"1 o menos, cuando se determ ina med iante resonancia de plasmón superficial , o puede in hibir la actividad de la esclerostina humana con una I C50 de aproximadamente 1 x 1 0 7 o menor. Alternativamente, la proteína de enlace, o una porción de enlace al antígeno de la misma, puede disociarse de la esclerostina humana con una constante de disociación kdisoc de aproximadamente 1 x 10 3s 1 o menor cuando se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la esclerostina humana con una IC5o de aproximadamente 1 x 10 8 o menor. Alternativamente, la proteína de enlace, o una porción de enlace al antígeno de la misma, puede disociarse de la esclerostina humana con una constante de disociación kd ¡soc de aproximadamente 1 x 10 4s"1 o menos, cuando se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la esclerostina humana con una I C 50 de aproximadamente 1 x 10 9 o menor. Alternativamente, la proteína de enlace, o una porción de enlace al antígeno de la misma, puede disociarse de la esclerostina humana con una constante de disociación kdisoc de aproximadamente 1 x 10"5s 1 o menos, cuando se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la esclerostina humana con una I C50 de aproximadamente 1 x 10"10 o menor. Alternativamente, la proteína de enlace, o una porción de enlace al antígeno de la misma, puede disociarse de la esclerostina humana con una constante de disociación kdisoc de aproximadamente 1 x 10"5s"1 o menos, cuando se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la esclerostina humana con una I C50 de aproximadamente 1 x 1 0 1 1 o menor.
En ciertas modalidades, la proteína de enlace comprende una región constante de cadena pesada, tal como una región constante de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. En una modalidad, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG 1 o una región constante de cadena pesada de lgG4. Además, el anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera, ya sea una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda. En una modalidad, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. Alternativamente, la porción del anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de una sola cadena.
Los remplazos de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidas en la técnica (Winter et al. , Patentes Norteamericanas Nos. 5,648,260 y 5624821 ). La porción Fe de un anticuerpo media diversas funciones efectoras importantes por ejemplo la inducción de citocina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemente (CDC) y proporción de vida media/depuración del anticuerpo y complejos de antígeno-anticuerpo. En algunos casos estas funciones efectoras son deseables para el anticuerpo terapéutico aunque en otros casos podrían ser innecesarias e incluso nocivas, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos de IgG humana, particularmente la lgG1 e lgG3, median la ADCC y CDC a través de su enlace a FcyRs y C1 q complementario, respectivamente. Los receptores Fe neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media circulante de los anticuerpos. En todavía otra modalidad al menos un residuo de aminoácido se remplaza en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fe del anticuerpo, de modo tal que se alteren las funciones efectoras del anticuerpo.
Una modalidad provee una proteína de enlace etiquetada en donde un anticuerpo o porción de anticuerpo se deriva o enlaza a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de enlace etiquetada se puede derivar enlazando funcionalmente un anticuerpo o porción de anticuerpo (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de algún otro modo) a una o más de otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), una gente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar el asociado del anticuerpo o porción del anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o un marcador de polihistidina).
Se proveen agentes detectables útiles con los cuales una proteína de enlace, tal como un anticuerpo o porción de anticuerpo de la cual se puede derivar incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ejemplificantes incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamin-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también se puede derivar con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabino, oxidasa de glucosa y similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción de color, el cual es detectable. Un anticuerpo también se puede derivar con biotina, y detectarse a través de la medición indirecta del enlace de avidina o estreptavidina.
Otra modalidad provee una proteína de enlace cristalizada.
En una modalidad, se proveen cristales de los anticuerpos anti-esclerostina completos y fragmentos de los mismos que se describen en la presente, y las formulaciones y composiciones que comprende tales cristales. En una modalidad, la proteína de enlace cristalizada tiene una vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de la proteína de enlace. En otra modalidad, la proteína mantiene la actividad biológica después de la cristalización.
La proteína de enlace cristalizada se provee y puede producirse de acuerdo a métodos conocidos en la técnica y como se describe en la Publicación PCT No. WO 02072636.
Otra modalidad provee una proteína de enlace glicosilada en donde el anticuerpo o porción de enlace al antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción de proteínas in vivo naciente puede someterse a procesamiento adicional, conocido como modificación post-traducción. En particular, pueden agregarse enzimáticamente residuos de azúcar (glicosilo), un proceso conocido como glicosilación. Las proteínas resultantes que portan cadenas laterales de oligosacárido enlazadas covalentemente son conocidas como proteínas glicosiladas o glicoproteínas.
Los anticuerpos presentes de manera natural son glicoproteínas con uno o más residuos de carbohidrato en el dominio Fe, así como el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fe tienen un efecto importante en la función efectora del dominio Fe, con un efecto mínimo en el enlace al antígeno o vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog., 21: 11-16 (2005)). En contraste, la glicosilacion del dominio variable puede tener un efecto en la actividad el enlace al antígeno del anticuerpo. La glicosilacion en el dominio variable puede tener un efecto negativo en la afinidad de enlace del anticuerpo, probablemente debido al impedimento esférico (Co, M.S., et al., Mol. Immunol., 30: 1361- 1367 (1993)), o como resultado de la afinidad incrementada para el antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med., 168:1099-1109 (1988); Wright, A., et al., EMBO J. , 10: 2717-2723 (1991)).
Un aspecto de lo provisto se dirige a generar mutantes de sitio de glicosilacion en los cuales se ha mutado el sitio de glicosilacion O- o N-enlazado de la proteína de enlace. Un experto en la técnica puede generar tales mutantes utilizando tecnologías bien conocidas estándares. Se proveen mutantes del sitio de glicosilacion que mantienen la actividad biológica aunque tienen actividad de enlace incrementada o disminuida.
En todavía otra modalidad provista, se modifica la glicosilacion del anticuerpo o porción de enlace al antígeno. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo al antígeno.
Tales modificaciones de carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de región variable para eliminar por lo tanto la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo al antígeno. Tal metodología se describe además a detalle en la Publicación PCT WO 2003/016466A2, y Patentes Norteamericanas Nos. 5,714,350 y 6,350,861.
Adicional o alternativamente, se provee una proteína de enlace modificada y se puede hacer que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo (ver Kanda, Yutaka et al., Journal of Biotechnology (2007), 130(3), 300-310) o un anticuerpo que tiene estructuras GIcNAc de bisección incrementada. Tales patrones de glicosilación alterados han sido demostrados para incrementar la capacidad de anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedera con maquinaria de glicosilación alterada. Se proveen células con maquinaría de glicosilación alterada y se han descrito en la técnica y se pueden utilizar como células hospederas en las cuales para expresar los anticuerpos recombinantes para producir por lo tanto un anticuerpo con glicosilación alterada. Ver, por ejemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al., "Engineered glycoforms of an antineuroblastoma lgG1 with optimized antibody- dependent cel lular cytotoxic activity, " Nat. Biotech. , 1 7: 1 76-180 (1 999) , así como, Patente Europea No: EP 1 , 1 76, 1 95; Pu blicaciones PCT Nos. WO 03/035835 y WO 99/54342.
La glicosilación de proteína depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como la célula hospedera en la cual se expresa la proteína. Los diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de g licosilación (por ejemplo, glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen diferentes sustratos (azucares de nucleótidos) disponibles. Debido a tales factores, el patrón de glicosilación de proteína, y la composición de residuos de glicosilo, pueden diferir dependiendo del sistema hospedero en el cual se expresa la proteína particular. Los residuos de glicosilo úti les se proveen y pueden incluir, pero no están lim itados a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-aceti lglucosami na y ácido siálico. En una modalidad, la proteína de enlace glicosilada comprende resid uos de glicosilo de modo tal que el patrón de glicosilación sea humano.
Es sabido por aquellos expertos en la técn ica q ue un diferente de g licosilación de proteína puede dar como resultado diferentes características de proteína. Por ejemplo, la eficacia de u na proteína terapéutica producida en un huésped m icroorganismo, tal como levadura, y glicosilado utilizando la ruta endógena de levadura puede reducirse en comparación con la de la misma proteína expresada en una cél ula mam ífera , tal como una l ínea de células C HO. Tales glicoproteínas también pueden ser inm unógenas en humanos y m uestra vida media reducida in vivo después de la adm inistración . Los receptores específicos en humanos y otros animales pueden reconocer residuos de glicosilo específicos y promueve la rápida depuración de la proteína del flujo sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el pliegue de proteínas, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, compartimentación, secreción, reconocimiento mediante otras proteínas o factores, antigenicidad, o alergenicidad. De acuerdo con esto, un practicante puede preferir una proteína terapéutica con una composición específica y patrón de glicosilación, por ejemplo composición de glicosilación y patrón idéntico, o al menos similar, al producido en células humanas o en las células de especies especificas del animal sujeto objetivo.
La expresión de proteínas glicosiladas diferentes a las de una célula hospedera puede lograrse modificando genéticamente la célula hospedera para que exprese enzimas de glicosilación heteróloga. Utilizando técnicas conocidas en el arte un practicante puede generar anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos que exhiben glicosilación de proteína humana. Por ejemplo, las cepas han sido modificadas genéticamente para expresar enzimas de glicosilación no presentes de manera natural de modo tal que las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levadura exhiben una glicosilación de proteína idéntica a la de las células animales, especialmente células humanas (publicación de solicitud de Patente Norteamericana Nos. 2004001 8590 y 200201371 34).
Además de las proteínas de enlace, se proveen anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) específicas de tales proteínas de enlace. Un anticuerpo anti-ld es un anticuerpo, el cual reconoce determinantes únicas en general asociadas con la región de enlace al antígeno de otro anticuerpo. El anti-ld se puede preparar inmunizando un animal con la proteína de enlace o una región que contiene CDR de la misma. El animal inmunizado reconocerá, y responderá a las determinantes idiotipicas del anticuerpo inmunizador y producirá un anticuerpo anti-id. Es fácilmente evidente que puede ser más fácil generar anticuerpos anti-idiotípicos para los dos o más anticuerpos parentales incorporados en una molécula de la proteína de enlace de DVD; y confirmar los estudios de enlace mediante métodos bien reconocidos en la técnica (por ejemplo, BIAcore, ELISA) para verificar que los anticuerpos anti-idiotípicos del idiotipo de cada anticuerpo parental también reconozca el idiotipo (por ejemplo, el sitio de enlace al antígeno) en el contexto de la proteína de enlace de DVD. Los anticuerpos anti-idiotípicos específicos de cada uno de los dos o más sitios de enlace al antígeno de una proteína de enlace de DVD proveen reactivos ideales para medir las concentraciones de proteína de enlace de DVD de una proteína de enlace de DVD humana en el suero del paciente. Por ejemplo, los ensayos de concentración de la proteína de enlace de DVD se pueden establecer utilizando un "formato de ensayo ELI SA de fase doble" con un anticuerpo a una primera región de enlace al antígeno revestida sobre la fase sólida (por ejemplo, chip BIAcore, placa ELISA, etc.), enjuagada con amortiguador de enjuague, incubación con una muestra de suero, otra etapa de enjuague, y por último incubación con otro anticuerpo anti-idiotípico para el otro sitio de enlace al antígeno, por sí mismo etiquetado con una enzima para la cuantificación de la reacción de enlace. En u na modalidad , para una proteína de enlace de DVD con más de dos diferentes sitios de enlace, anticuerpos anti-idiotípicos a los dos sitios de en lace más alejados (más distal y próximo de la región constante) no solamente ayudará a determinar la concentración de la proteína de enlace de DVD en suero humano sino que también documentará la integridad de la molécula in vivo. Cada anticuerpo anti-Id también se puede util izar como un "inm unógeno" para inducir una respuesta inmune en aú n otro animal , produciendo un así llamado anti-anticuerpo anti-ld .
Además , se apreciará por un experto en la técnica que una proteína de interés puede expresarse util izando una biblioteca de células hospederas genéticamente manipuladas para expresar varias enzimas de glicosilación , de modo tal que las células hospederas de la biblioteca prod uzcan la proteína de i nterés con patrones de glicosilación variantes. Un practicante puede seleccionar entonces y aislar la proteína de interés con nuevos patrones de glicosilación particu lares. En una modalidad , la proteína que tiene un nuevo patrón de g licosilación particularmente seleccionado exh ibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.
V. Usos de Proteínas de Enlace a Esclerostina Dada su capacidad de unirse a la esclerostina humana, se proveen las proteínas de enlace a esclerostina, o porciones de enlace al antígeno de las mismas, y se pueden util izar para detectar la esclerostina (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como un enzimoinmunoanálisis absorbente (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. Se provee un método para detectar esclerostina en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con una proteína de enlace provista, o porción de enlace al antígeno, y detectando ya sea la proteína de enlace (o porción de enlace al antígeno), para detectar por lo tanto la esclerostina en la muestra biológica. La proteína de enlace se etiqueta directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos del grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o picoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 3H, 4C, 35S, 90Y, "Te, 1 1 1 l n, 125l , 1 31 l , 1 77 L U ) 1 66 |_| 0 0 1 53S m Alternativo al etiquetado de la proteína de enlace, se puede examinar la esclerostina humana en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo de competición utilizando estándares rhSOST etiquetados con una sustancia detectable y u na proteína de enlace de esclerostina humana no etiquetada . En este ensayo, la m uestra biológica, los estándares rhSOST etiq uetados, y la proteína de enlace esclerostina humana se combinan y se determ ina la cantidad de estándar de esclerostina humana etiquetada un ida al anticuerpo no etiquetado. La cantidad de esclerostina humana en la m uestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de estándar de rhSOST etiquetada unido a la proteína de enlace esclerostina. De manera similar, la esclerostina humana también se puede exam inar en fluidos biológicos mediante un inm unoensayo de competición utilizando estándares de rhSOST etiquetados con una sustancia detectable y u na proteína de en lace de esclerostina h umana no etiquetada.
En una modalidad provista , las proteínas de enlace y las porciones de enlace de esclerostina son capaces de neutralizar la actividad de la esclerostina humana tanto in vitro como in vivo. De acuerdo con esto, tales proteínas de enlace y porciones de enlace de esclerostina de las mismas se proveen y se pueden utilizar para inhibir la actividad hSOST, por ejemplo, en un cu ltivo celular q ue contiene hSOST, en sujetos humanos, o en otros sujetos mam íferos que tienen esclerostina con el cual un anticuerpo hace reacción cruzada. U na modal idad provee un método para inhibir la actividad hSOST que comprende poner en contacto la hSOST con una proteína de enlace esclerostina o porción de enlace de la m isma de modo tal que se inhiba la actividad hSOST. Por ejem plo, en u n cultivo celular que contiene, o se sospecha q ue contiene hSOST, una proteína de enlace esclerostina o porción de la misma se puede agregar al medio de cultivo para inhibir la actividad hSOST en el cultivo.
Otra modalidad provee un método para reducir la actividad hSOST en un sujeto, ventajosamente de un sujeto que padece una enfermedad o padecimiento en el cual la actividad de esclerostina es perjudicial. Se proveen métodos para reducir la actividad de esclerostina en un sujeto que padece tal enfermedad o padecimiento, el cual método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o porción de anticuerpo de modo tal que la actividad secuencia en el sujeto se reduzca. En una modalidad, la esclerostina es la esclerostina humana y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que exprese una esclerostina al cual un anticuerpo es capaz de unirse. Más aún, el sujeto puede ser un mamífero en el cual se ha introducido la esclerostina (por ejemplo, mediante la administración de la esclerostina o mediante la expresión de un transgene de esclerostina). Una proteína de enlace esclerostina se puede administrar a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Además, una proteína de enlace se puede administrar a un mamífero no humano que exprese una esclerostina con la cual el anticuerpo es capaz de unirse para propósitos veterinarios o como un modelo animal de padecimiento humano. Con respecto a esto último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos (por ejemplo, análisis de dosificaciones y momentos de administración).
El término "un padecimiento en el cual la actividad de esclerostina es perjudicial" se pretende que incluya enfermedades y otros padecimientos en los cuales la presencia de esclerostina en un sujeto que padece la enfermedad se ha demostrado que es o se sospecha que es ya sea responsable de la patofisiológica de la enfermedad o un factor que contribuye a un empeoramiento de la enfermedad. De acuerdo con esto, una enfermedad en la cual la actividad de esclerostina es perjudicial es una enfermedad en la cual la reducción de la actividad de esclerostina se espera alivie los síntomas y/o progreso de la enfermedad. Tales enfermedades pueden evidenciarse, por ejemplo, mediante un incremento en la concentración de esclerostina en un fluido biológico de un sujeto que padece la enfermedad (por ejemplo, un incremento en la concentración de esclerostina en suero, plasma, fluido sinovial, etc. , del sujeto), el cual se puede detectarse, por ejemplo, utilizando un aminoácidos anti-esclerostina que se describe anteriormente. Los ejemplos no limitativos de enfermedades que se pueden tratar con los anticuerpos incluyen aquellas enfermedades abordadas en la sección posterior relativa a las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos.
Se proveen proteínas de enlace DVD capaces de unir la esclerostina (por ejemplo, esclerostina humana) a antígenos múltiples o solos (por ejemplo, esclerostina humana y otro antígeno no esclerostina). La proteína de enlace de DVD puede bloquear o reducir la actividad de esclerostina humana y la actividad de otro antígeno objetivo. Tales otros antígenos objetivo pueden incluir objetivos adecuados (por ejemplo, TNF) y objetivos de receptores de superficie de células (por ejemplo, VEGFR, EGFR).
Tales otros antígenos incluyen, pero no están limitados a, los objetivos listados en bases de datos públicamente disponibles, las cuales bases de datos incluyen aquéllas que están disponibles en Internet. Estas bases de datos objetivo incluyen aquéllas que se listan: Objetivos terapéuticos (hxin.cz3. nus.edu.sg/group/cjttd/-ttd.asp); Citocinas y receptores de citocina (hwww.cytokinewebfacts.com/, hwww.copewithcytokines.de/cope.cgi, y hcmbi. bjmu.edu.cn/-cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine. medie, kumamotou. ac.jp-/CC/indexR. html) ; Quimiocinas (hcytokine.medic. kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/-Chemokine.html); Receptores de citocina y GPCRs (hesp. medie. kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, hwww.gpcr.org/7tm/); Receptores Olfativos (hsenselab. med.yale.edu/senselab/-ORDB/default.asp) ; Receptores (hwww.iuphardb.org/iupharrd/list/index. htm); Objetivos cancerígenos (hcged.hgc.jp/cgibin/input.cgi); Proteínas secretadas como objetivos de anticuerpos potenciales (hspd.cbi.pku.edu.cn/); Proteínas cinasas (hspd.cbi. pku.edu.cn/), y Marcadores CD humanos (hcontent. labvelocitv.eom/tools/6/1226/CD table final locked.pdf) y (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
Las proteína de enlace de DVD son útiles como agentes terapéuticos para bloquear simultáneamente dos o más objetivos diferentes, es decir, hSOST, y uno o más de otros antígenos objetivo distinto a la SOST para mejorar la eficacia/seguridad y/o incrementar la cobertura del paciente. Tales objetivos pueden incluir objetivos (TN F) solubles y objetivos de receptoras de superficie celular (VEGFR y EGFR).
Adicionalmente, se proveen proteínas de enlace DVD que se pueden emplear para el suministro de tejidos específicos (focalizando un marcador de tejido y un mediador del padecimiento para una PK local mejorada y por consiguiente una la eficacia más alta y/o toxicidad más baja), incluyendo el suministro intracelular (focalizando un receptor de internalización y una molécula intracelular), suministrándolo dentro del cerebro (focalizando el receptor de transferrina y un mediador de padecimientos en el SNC para cruzar la barrera hematoencefálica). La proteína de enlace de DVD también puede servir como una proteína portadora para suministrar un antígeno a una ubicación específica a través de su enlace a un epítope no neutralizante de ese antígeno y también para incrementar la vida media del antígeno. Además, la proteína de enlace de DVD se puede diseñar ya sea para vincularse físicamente a dispositivos médicos implantados en pacientes o para destinarse a estos dispositivos médicos (ver Burke, Sandra E.¡ Kuntz, Richard E. ; Schwartz, Lewis B. , Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; Wu et al., "Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis," Biomaterials, 27: 2450-2467 (2006); Marques et al., "Mediation of the Cytokine Network in the Implantation of Orthopedic Devices," Capítulo 21, En Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, (Reís et al., eds.) (CRC Press LLC, Boca Ratón, 2005) pp. 377-397. En breve, al dirigir los tipos apropiados de célula al sitio del implante médico puede propiciarse la sanación y restauración de la función del tejido normal. Alternativamente, también se provee inhibición de mediadores (que incluyen pero no están limitados a citocinas), liberados tras el implante del dispositivo mediante una proteína de enlace de DVD acoplada a o destinada a un dispositivo. Por ejemplo, durante años se han utilizado endoprótesis en la cardiología de intervención para limpiar arterias bloqueadas y para mejorar el flujo de sangre al músculo cardiaco. Sin embargo, se ha sabido que las endoprótesis de metal expuesto tradicionales causan restenosis (re-encogimiento de la arteria en un área tratada) en algunos pacientes y pueden llevar a coágulos sanguíneos. Recientemente, se ha descrito una endoprótesis revestida con el anticuerpo anti-CD34 la cual reduce la restenosis y previene que ocurran coágulos sanguíneos al capturar las células progenitoras endoteliales (EPC) que circulan por toda la sangre. Las células endoteliales son células que cubren los vasos sanguíneos, permitiendo fluir la sangre sin complicaciones. Las EPCs se adhieren a la secuencia dura de la endoprótesis que forman una capa lisa que no solamente propicia la sanación sino que previene la restenosis y coágulos sanguíneos, las complicaciones previamente asociadas con el uso de endoprótesis (Aoji et al. 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10): 1 574-9). Además de mejorar los resultados en pacientes que requieren endoprótesis, también hay implicaciones para pacientes que requieren cirugía de bypass cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular prostético (arteria artificial) revestido con anticuerpos anti-EPC podría eliminar la necesidad de utilizar arterias de las piernas o brazos de los pacientes para injertos de cirugía de bypass. Esto podría reducir los tiempos de cirugía y anestesia, lo cual a su vez reducirá las muertes por cirugía coronaria. La proteína de enlace de DVD se diseña de modo tal que la misma se una a un marcador de superficie celular (tal como CD34) así como una proteína (o un epítope de cualquier tipo, que incluye pero no está limitado a proteínas, lípidos y polisacáridos) que ha sido revestida en el dispositivo implantado para facilitar el reclutamiento celular. Tales metodologías también pueden aplicarse a otros implantes médicos en general. Alternativamente, las proteínas de enlace DVD se pueden revestir en dispositivos médicos y tras su implante y liberando todos los DVDs del dispositivo (o cualquier otra necesidad la cual pueda requerir proteína de enlace de DVD recién hecha adicional, incluyendo el envejecimiento y la desnaturalización de la proteína de enlace de DVD ya cargada) el dispositivo podría cargarse mediante la administración sistémica de la proteína de enlace de DVD recién hecha al paciente, donde la proteína de enlace de DVD que se diseña se enlaza a un objetivo de interés (una citocina, un marcador de superficie celular (tal como CD34) etc.) con un conjunto de sitios de enlace y a un objetivo revestido en el dispositivo (incluyendo una proteína, un epítope de cualquier tipo, incluyendo pero no limitado a lípidos, polisacáridos y polímeros) con los otros. Esta tecnología tiene la ventaja de prolongar la utilidad de implantes revestidos.
V. A. Uso de proteínas de enlace DVD en varios padecimientos Se proveen proteínas de enlace DVD útiles como moléculas terapéuticas para tratar varios padecimientos. Los ejemplos de tales objetivos en varios padecimientos se describen más adelante.
VI. Respuesta Autoinmune e Inflamatoria Humana En un aspecto, se provee una proteina de enlace de DVD capaz de unir la esclerostina humana y uno o más antígenos que han estado implicados en respuestas autoinmunes e inflamatorias generales, C5, CCL1 (I-309), CCL11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (l-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1 ), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citocina activadora de monocitos humanos), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1 , CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21 , CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1 , CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1 , CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1 , TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1 A, TNFRSF1 B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11 A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF1 1 , VEGF, ZFPM2, y RNF1 10 (ZNF144).
VI . A. Asma El asma alérgico es caracterizado por la presencia de eosinofilia, metaplasia de células caliciformes, alteraciones en la células epiteliales, hiperactividad en las vías respiratorias (AH R), y expresión de la citocina Th2 y Th 1 , así como niveles de IgE elevados en suero. Es ampliamente aceptado actualmente que la inflamación en vías respiratorias es el factor clave subyacente en la patogénesis del asma, que involucra una interacción compleja de células inflamatorias tales como las células T, células B, eosinófilos, mastocitos y macrófagos, y de sus mediadores incluyendo las citocinas y quimiocinas. Los corticosteroides son el tratamiento anti-inflamatorio más importante para el asma en la actualidad, sin embargo su mecanismo de acción no es específico y presenta cuestiones de seguridad, especialmente en la población de pacientes juveniles. El desarrollo de terapias más específicas y focalizadas por lo tanto está garantizado.
Pueden utilizar modelos animales tales como el modelo de ratón con asma inducido por OVA, donde se puede evaluar tanto la inflamación como el AHR, que son conocidos en la técnica para determinarla capacidad de varias proteínas de enlace DVD para tratar el asma. Los modelos animales para estudiar el asma se describen en Coffman, et al. , Journal of Experimental Medicine (2005), 201 (12), 1875-1879; Lloyd, et al. , Advances in Immunology (2001 ), 77, 263-295; Boyce et al. , Journal of Experimental Medicine (2005) , 201 ( 12), 1869-1873; y Snibson, et al. , Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de estos pares objetivo pueden garantizarse y ser útil el análisis de específicos del grado de ¡nmunosupresión para seleccionar los mejores pares objetivo (ver Luster et al. , Toxicology (1994), 92(1 -3), 229-43; Descotes, et al. , Developments ¡n biological standardization (1 992), 77 99-102; Hart et al. , Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001 ), 108(2), 250-257).
Un aspecto provee proteínas de enlace DVD capaces de unir la SOST y uno o más, por ejemplo dos, de I L-4, I L-5, I L-8, IL-9, IL-13, IL-18, I L-5R(a) , TNFSF4, I L-4R(a) , interferón a , eotaxina, TSLP, PAR-2, PGD2, o IgE. Una modalidad incluye una proteína de enlace de DVD de anti-esclerostina específico/TNFa como un agente terapéutico benéfico para el tratamiento del asma.
VI . B. Artritis reumatoide (RA) La artritis reumatoide (RA), es un padecimiento sistémico, que es caracterizada por una reacción inflamatoria crónica en la membrana sinovial de las articulaciones y que está asociada con la degeneración de cartílago y erosión del hueso yuxta-articular. Muchas citocinas pro-inflamatorias incluyendo el TNF, quimiocinas, y factores de crecimiento se expresan en articulaciones afectadas. La administración sistémica del anticuerpo anti-TNF o proteína de enlace sTNFR a modelos de ratón de RA se mostró que es anti-inflamatoria y protectora de las articulaciones. Varias citocinas, incluida la esclerostina han estado involucradas en la RA. I nvestigaciones clínicas en las cuales la actividad del TNF en pacientes con RA se bloqueó con infliximab administrado intravenosamente (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical triáis in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann. Rheum . Dis. , 58 Suppl 1 : 161 -4), un mAb anti-TNF quimérico, ha provisto evidencia de que el TN F regular la producción de I L-6, I L-8, MCP- , y VEGF, reclutamiento de células inmunes e inflamatorias en las articulaciones, angiogénesis, y reducción de niveles sanguíneos de las metaloproteinasas 1 y 3 de matriz. Un mejor entendimiento de la ruta inflamatoria en la artritis reumatoide ha llevado a la identificación de otros objetivos terapéuticos involucrados en la artritis reumatoide. Tratamientos prometedores tales como los antagonistas de la interleucina 6 (MRA del anticuerpo del receptor de I L-6, desarrollado por Chugai, Roche (ver Nishimoto, Norihiro et al. , Arthritis & Rheumatism, (2004), 50(6): 1761 -1 769), CTLA4lg (abatacept, Genovese et al. (2005) "Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition," N. Engl. J. Med. , 353: 1 1 14-23.), and anti-B cell therapy (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. (2004) "Rituximab for rheumatoid arthritis," N. Engl. J. Med. , 351 : 1 909) ya han sido analizadas en ensayos controlados aleatorizados en los últimos años. La esclerostina y otras citocinas, tales como I L-1 5 e IL-1 8, han sido identificadas cuando juegan un papel utilizando modelos animales con RA (anticuerpo terapéutico HuMax-IL_1 5, AMG 714 ver Baslund, Bo et al. , Arthritis & Rheumatism (2005), 52(9): 2686-2692). La terapia con anticuerpos específicos duales, combinando anti-TNF y otro mediador, tal como esclerostina, tiene gran potencial en la mejora de la eficacia clínica y/o cobertura del paciente. Por ejemplo, al bloquear tanto el TNF como el VEG se puede erradicar potencialmente la inflamación y la angiogénesis, ambas de las cuales están involucradas en la patofisiológica de la RA. Se contempla una proteína de enlace de DVD capaz de bloquear el TNF-a y la esclerostina. Además de las evaluaciones de seguridad rutinaria de estos pares objetivo, pueden garantizarse y ser útiles los análisis específicos del grado de inmunosupresion para seleccionar los mejores pares base (ver Luster et al. , Toxicology (1 994), 92(1 -3), 229-43; Descotes, et al. , Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al. , Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001 ), 108(2), 250-257). Si una proteína de enlace de DVD será útil para el tratamiento de la artritis reumatoide se puede evaluar utilizando modelos animales con RA pre-clínicos tales como el modelo de ratón con artritis inducida con colágeno. Otros modelos también son bien conocidos en la técnica (ver Brand DD. , Comp. Meó. , (2005) 55(2): 1 14-22). En base a la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, la reactividad del TNF humano y de ratón, IL-15 de humano y ratón etc.), pueden realizarse estudios de validación en el modelo CIA de ratón con "anticuerpo suplemente igualado" derivado de proteínas de enlace DVD; en breve; una proteína de enlace de DVD basada en dos (o más) anticuerpos específicos objetivo de ratón pueden igualarse en la medida de lo posible a las características de los anticuerpos humanos o humanizados parentales utilizados para la construcción de proteínas de enlace DVD humanas (afinidad similar, potencia de neutralización similar, y vida media similar etc.).
Una modalidad provee una proteína de enlace de DVD que enlaza la esclerostina humana y otro objetivo distinto a la esclerostina que también puede utilizarse para tratar otros padecimientos en los cuales la esclerostina juega un papel. Tales padecimientos incluyen, pero no están limitados a SLE, esclerosis múltiple (MS) , sepsia, varios padecimientos neurológicos, y cánceres (incluyendo cervical, de pecho, gástrico). También se provee una lista más extensiva de padecimientos y enfermedades en los cuales la SOST juega un papel más adelante.
Una modalidad provee una proteína de enlace de DVD capaz de unir la huSOST y uno o más objetivos de TNFa, I L-12, TWEAK, I L-23, CXCL13, CD40, CD40L, I L-18, VEGF, VLA-4, TNFp, CD45RB, CD200, I FN-?, GM-CSF, FGF, C5, CD52, esclerostina, o CCR2.
VI . C. SLE (Lupus) La característica distintiva inmunopatógena del SLE es la activación de células B policlonales, lo cual lleva a la hiperglobulinemia, producción de auto-anticuerpos y formación de complejos inmunes. La anormalidad fundamental parece ser la falla de las células T para suprimir los clones de células B prohibidos debido a la desregulación generada de células T. Además la interacción de células B y T es facilitada por varias citocinas tales como IL-10 así como las moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, que inician la segunda señal. Estas interacciones junto con la depuración fagocitaria dañada de los complejos inmunes y material apoptósico, permutan la respuesta inmune con la lesión de tejido resultante.
Otro aspecto provee una proteína de enlace de DVD capaz de unir la esclerostina humana y uno o más de los siguientes antígenos que han estado implicados en el SLE; terapias focalizadas en células B: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, I L1 0, I L2, I L4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR 1 , HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1 , MS4A1 , RGS1 , SLA2, CD81 , I FNB1 , IL10, TNFRSF5, TN FRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, I L10, I L1 1 , I L4, INHA, IN HBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, I L1 R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1 , ST6GAL1 , CD1 C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, y NT5E; señales co-estimuladoras: CTLA4 o B7.1 /B7.2; inhibición de supervivencia de células B: BlyS, BAFF; Inactivación de Complementos: C5; Modulación de citocinas; el principio clave es que la respuesta biológica neta en cualquier tejido es el resultado de un balance entre los niveles locales de las citocinas pro-inflamatorias o anti-inflamatorias (ver Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). Se considera que el SLE es un padecimiento estimulado por Th-2 con elevaciones documentadas en el suero IL-4, IL-6, IL-10. También se contemplan proteínas de enlace DVD capaces de unir la I L-4, I L-6, I L-10, I FN-a, o TNF-a. La combinación de objetivos abordada en la presente mejorará la eficacia terapéutica del SLE la cual se puede analizar en una serie de modelos preclínicos de lupus (ver, Peng SL (2004) Methods Mol. Meó. , 1 02 : 227-72). En base a la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales de ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, la reactividad del CD20 humano y de ratón , el Interferón alfa de h umano y ratón, etc. ) , se pueden realizar estudios de validación en un modelo de ratón con lupus con proteínas de enlace DVD derivadas de "anticuerpo subordinado igualado"; en breve, una proteína de enlace de DVD basada en dos (o más) anticuerpos específicos objetivo de ratón puede igualarse en la medida de lo posible a las características de los anticuerpos humanos o humanizados parentales para construcción de proteína de enlace de DVD humana (afinidad simi lar, potencia de neutralización similar, vida media similar etc.).
VI . D. Esclerosis múltiple (MS) La esclerosis múltiple (MS) es un padecimiento de tipo autoinmune humano com plejo con una etiología predominantemente desconocida . La destrucción inmunológ ica de la proteína básica de mielina (MBP) en todo el sistema nervioso es la principal patología de la esclerosis mú ltiple. La MS es un padecimiento de patologías complejas, las cuales involucran la infiltración med iante célu las T CD4+ y CD8+ y de la respuesta dentro del sistema nervioso central . La expresión en el SNC de citocinas , especies de n itrógeno reactivas y moléculas estimuladoras han sido descritas en la MS. De principal consideración son los mecanismos inmunológ icos que contribuyen al desarrollo de la autoinmunidad. En particular, la expresión de antígenos, interacciones de citocina y leucocitos, y células T reguladoras, las cuales ayudan a balancear/modular otras célula T tales como las células Th1 y Th2, son áreas importantes para la identificación de objetivos terapéuticos.
La IL-12 es una citocina pro-inflamatoria que es producida mediante APC y que propicia la diferenciación de las células efectoras Th1. La IL-12 es producida en el desarrollo de lesiones de pacientes con MS así como en animales afectados por EAE. Previamente se demostró que la interferencia en las rutas de IL-12 previene efectivamente la EAE en roedores, y que la neutralización in vivo de IL-12p40 utilizando un mAb anti-IL-12 tiene efectos benéficos en el modelo de EAE inducido con mielina en monos tití.
TWEAK es un miembro de la familia de TNF, constitutivamente expresado en el sistema nervioso central (SNC), con efectos pro-inflamatorios, proliferativos o apoptósicos dependientes de los tipos de células. Su receptor, Fn14, se expresa en el CNS por las células endoteliales, astrocitos reactivos y neuronas. TWEAK y la expresión del mRNA Fn14 se incrementan en la médula espinal durante la encefalomielitis autoinmune experimental (EÁE). El tratamiento con anticuerpo anti-TWEAK en la EAE inducida con glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL/6 que da como resultado una reducción de la severidad del padecimiento e infiltración de leucocitos cuando los ratones se trataron después de la fase de cebado.
Un aspecto provee proteínas de enlace DVD capaces de unir la SOST y uno o más, por ejemplo dos, objetivos incluyendo IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52, osteopontina, y/o CCR2. Una modalidad incluye una proteína de enlace de DVD anti-esclerostina/TNF-a específica dual como un agente terapéutico beneficio para el tratamiento de MS.
Varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de la proteína de enlace de DVD para tratar la MS son conocidos en la técnica (ver Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin lmmunopathol.8(3):197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al., (1995) Neurol Clin.13(1 ):51 -73; y 't Hart et al., J. Immunol., 175(7): 4761-4768 (2005). En base a la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales de ortólogos de especies humanas y de ratón (por ejemplo, la reactividad de la SOST de humano y de ratón, TWEAK de humano y ratón, etc.) se pueden realizar estudios de validación en un modelo de ratón con EAE con proteínas de enlace DVD derivadas de "anticuerpo subordinado igualado"; en breve, una proteína de enlace de DVD basada en dos (o más) anticuerpos específicos objetivo de ratón puede igualarse en la medida de lo posible a las características de los anticuerpos humanos o humanizados parentales para la construcción de la proteína de enlace de DVD humana (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida media similar etc.). El mismo concepto aplica a modelos animales en otras especies distintas a los roedores, donde una proteína de enlace de DVD derivada del "anticuerpo subordinado igualado" podría seleccionarse para la farmacología anticipada y posiblemente estudios de seguridad. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de estos pares objetivos pueden garantizarse y ser útiles análisis de pares específicos del grado de inmunosupresion para seleccionar los mejores pares objetivo (ver Luster et al. , Toxicology (1994), 92(1 -3), 229-43; Descotes, et al. , Developments in biological standardizaron (1 992), 77 99-1 02; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). I Drugs.3(4):442-6) .
VI. E. Sepsias La patofisiología de la sepsia es iniciada por los componentes de la membrana externa de ambos organismos gram-negativos (lipopolisacárido [LPS], lípido A, endotoxina) y organismos gram-positivos (ácido lipoteicoico, péptidoglicano). Estos componentes de membrana externa son capaces de unirse al receptor CD14 en la superficie de los monocitos. En virtud de los receptores tipo peaje descritos recientemente, se transmite entonces una señal a la célula, que lleva a la eventual producción del factor-alfa de necrosis tumoral de citocinas pro-inflamatorias (TNF-alfa) e interleucina-1 (I L-1 ). Las abrumadoras respuestas inflamatorias e inmunes son aspectos esenciales del choque séptico y juegan una parte central en la patogénesis del daño en el tejido, falla en múltiples órganos, y muerte inducida por sepsia. Las citocinas, especialmente el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina (I L-1 ), han mostrado ser mediadores críticos de choque séptico. Estas citocinas tienen un efecto tóxico directo en los tejidos; también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos llevan a concentraciones incrementadas del factor activador de plaquetas, promoción de la actividad de la sintasa de óxido nítrico, promoción de la infiltración de tejido mediante neutrófilos, y la promoción de actividad de neutrófilos.
El tratamiento de la sepsia y el choque séptico sigue siendo un acertijo clínico, y ensayos prospectivos recientes con modificadores de la respuesta biológica (es decir, anti-TNF, anti-MIF) dirigidos hacia la respuesta inflamatoria, han mostrado sólo un beneficio clínico modesto. Recientemente, el interés ha cambiado a terapias dirigidas a revertir los periodos acompañantes de supresión inmune. Los estudios en animales experimentales y pacientes gravemente enfermos han demostrado que la apoptosis incrementada de órganos linfoides y algunos tejidos de parénquima contribuyen a esta supresión inmune, anergia, y disfunción del sistema de órganos. Durante los síndromes de sepsia, la apoptosis de linfocitos pueden provocarse por la ausencia de IL-2 o por la liberación de glucocorticoides, granzimas, o las así llamadas citocinas de la 'muerte' : factor alfa de necrosis tumoral o ligando Fas. La apoptosis procede a través de la auto-activación de las caspasas citosólicas y/o mitocondriales, las cuales pueden ser influenciadas por los miembros pro- y anti-apoptósicos de la familia Bcl-2. En animales experimentales, no solamente el tratamiento con inhibidores de la apoptosis puede prevenir la apoptosis de células linfoides; también puede mejorar el resultado. Aunque los ensayos clínicos con agentes anti-apoptósicos permanecen distantes debido en gran parte a dificultades técnicas asociadas con su administración y focalizacion de tejidos, la inhibición de la apoptosis de linfocitos representa un objetivo terapéutico atractivo para el paciente con sepsia. Asimismo, un agente dual específico que enfoca tanto el mediador inflamatorio como un mediador apoptósico, puede tener beneficios agregados. Un aspecto provee proteínas de enlace DVD capaces de unir la esclerostina y uno o más objetivos involucrados en la sepsia, incluyendo TNF, I L-1 , MI F, I L-6, IL-8, IL-18, I L-12 , I L-23, FasL, LPS, receptores tipo peaje, TLR-4, factor de tejido, MIP-2, ADORA2A, CASP1 , CASP4, IL-10, IL-1 B, NFKB1 , PROC, TNFRSF1 A, CSF3, CCR3, I L1 RN, MI F, N FKB1 , PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1 , HMG-B1 , midkine, I RAK1 , NFKB2, SERPINA1 , SERPIN E1 , o TREM 1 . La eficacia de tales proteínas de enlace DVD para la sepsia se puede evaluar en modelos animales preclínicos conocidos en la técnica (ver, Buras JA, et al. , (2005) Nat. Rev. Drug Discov. , 4(1 0): 854-65 y Calandra T, et al. , (2000) Nat. Med. , 6(2): 164-70).
VI . F. Desórdenes neurológicos y enfermedades neurodegenerativas Las enfermedades neurodegenerativas son ya sea crónicos en cuyo caso los mismos usualmente dependen de la edad o son agudos (por ejemplo, apoplejía, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, etc.). Las mismas se caracterizan por la pérdida progresiva de las funciones neuronales (muerte celular neuronal, desmielinización), pérdida de movilidad y pérdida de memoria. El conocimiento emergente de los mecanismos subyacentes de las enfermedades crónico-neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, AD) muestran una etiología compleja y una variedad de factores que han sido reconocidos por contribuir a su desarrollo y progreso por ejemplo, la edad , estado glicémico, producción de amiloideos y multimerización, acumulación de productos de glicación final avanzada (AGE) los cuales se enlazan a su receptor RAGE (receptor de AGE), tensión oxidativa incrementada del cerebro, flujo sanguíneo cerebral disminuido, neuro-inflamación que incluye la liberación de citocinas y quimiocinas, disfunción neuronal y activación microglial. Por consiguiente estas enfermedades crónico-neurodegenerativas representan una interacción compleja entre los múltiples tipos de células y mediadores. Las estrategias de tratamiento para tales padecimientos se limitan y principalmente constituyen ya sea bloquear los procesos inflamatorios con agentes anti-inflamatorios no específicos (por ejemplo, corticosteroides, inhibidores COX) o agentes para prevenir la pérdida de neuronas y/o funciones sinápticas. Estos tratamientos fallan en detener el avance de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que terapias más enfocadas tales como los anticuerpos al péptido ?ß soluble (incluyendo las formas oligoméricas ?ß) no solamente puedan ayudar a detener el avance de la enfermedad sino que pueden ayudar a conservar la memoria también. Estas observaciones preliminares sugieren que las terapias específicas que enfocan más de un mediador de la enfermedad (por ejemplo, ?ß y una citocina pro-inflamatoria tal como TNF) pueden proveer una eficacia terapéutica incluso mejor para las enfermedades crónico- neurodegenerativas que las observadas con la focalización de un solo mecanismo de la enfermedad (por ejemplo, ?ß soluble solo) (ver E. E. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 2005 Oct 24; Nelson RB. , Curr Pharm Des. 2005; 1 1 :3335; William L. Klein. ; Neurochem Int. 2002 ;41 :345; Janelsins et al., "Early correlation of microglial activation with enhanced tumor necrosis factor-alpha and monocyte chemoattractant protein-l expression specifically within the entorhinal cortex of triple transgenic Alz eimer's disease mice," Journal of Neuroinflammation, 2(23): 1 -12 (2005); Soloman B. , Curr Alzheimer Res. 2004; 1 : 149; Igor Klyubin, et al. , Nat Med. 2005; 1 1 :556-61 ; Arancio O, et al. , EMBO Journal (2004) 1 -10; Bornemann KD, et al. , Am J Pathol. 2001 ; 158:63; Deane R, et al. , Nat Med. 2003;9:907-1 3; y Eliezer Masliah, et al. , Neuron. 2005;46:857) Las proteínas de enlace DVD pueden unir la esclerostina y uno o más objetivos involucrados en las enfermedades crónico-neurodegenerativas tales como el Alzheimer. Tales objetivos incluyen, aunque no se limitan a, cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la patogénesis, por ejemplo, AGE (S 100 A, anfotericina), citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, I L-1 ), quimiocinas (por ejemplo, MCP 1 ), moléculas que inhiben la regeneración de nervios (por ejemplo, Nogo, RGM A), moléculas que mejoran el crecimiento de neuritas (neurotrofinas) y moléculas que pueden medir el transporte en la barrera hematoencefálica (por ejemplo, receptor de transferrina, receptor de insulina o RAGE). La eficacia de proteínas de enlace DVD se puede validar en modelos animales pre-clínicos tales como los ratones transgénicos que sobre-expresan la proteína precursora de amiloideos o RAGE y desarrollan síntomas similares a los de la enfermedad de Alzheimer. Además, las proteínas de enlace DVD se pueden construir y analizar por su eficacia en los modelos animales y la mejor proteína de enlace de DVD terapéutica se puede seleccionar analizándolas en pacientes humanos. Las proteínas de enlace DVD también se pueden emplear para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson. La Alfa-Sinucleina está involucrada en la patología del Parkinson. La proteína de enlace de DVD capaz de focalizar la esclerostina y LI NGO-1 , alfa-sinucleina, y/o mediadores inflamatorios tales como TNF, I L-1 , MCP-1 pueden probar la terapia efectiva para la enfermedad de Parkinson y se contemplan.
VI . G. Regeneración Neuronal y Lesión de la Médula Espinal A pesar de un incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos, la lesión de la médula espinal (SCI) todavía es una condición devastadora y representa una indicación médica caracterizada por una alta necesidad médica. La mayoría de las lesiones de la médula espinal son lesiones por contusión o compresión y la lesión principal usualmente es seguida por mecanismos de lesión secundarios (mediadores inflamatorios por ejemplo, citocinas y quimioleucinas) que empeoran la lesión y dan como resultado un agrandamiento del área de lesión, en ciertos casos de más 10 veces. Estos mecanismos primarios y secundarios en la SCI son muy similares a aquéllos en la lesión cerebral causados por otros medios, por ejemplo, la apoplejía. No existe tratamiento satisfactorio y la inyección de bolos de altas dosis de metilprednisolona (MP) es la única terapia utilizada dentro del marco de tiempo estrecho de 8 h post-lesión. Este tratamiento, sin embargo, solamente se prevé que previene la lesión secundaria sin causar ninguna recuperación funcional significativa. Es fuertemente criticada la falta de eficacia inequívoca y los efectos adversos severos, como la inmunosupresión con subsecuentes infecciones y severas alteraciones musculares histopatológicas. No se aprueban otros fármacos, sustancias biológicas o moléculas pequeñas, que estimulen el potencial regenerativo endógeno, aunque los prometedores principios de tratamiento y candidatos de fármacos han mostrado su eficacia en modelos animales de SCI en años recientes. En gran medida la falta de recuperación funcional en la SCI humana es causada por factores que inhiben el crecimiento de neuritas, en sitios de lesión, en tejido cicatrizado, en la mielina así como en células asociadas con la lesión. Tales factores son las proteínas asociadas con la mielina NogoA, OMgp y MAG, RGM A, los CSPG asociados con la cicatrización (Proteoglicanos de Sulfato de Condroitina) y los factores inhibidores en astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo, en el sitio de la lesión no solamente se encuentran moléculas inhibidoras del crecimiento sino también factores estimuladores del crecimiento de neuritas como las neurotrofinas, laminina, L1 y otros. Este conjunto de moléculas inhibidoras del crecimiento y promotoras del crecimiento de neuritas pueden explicar que bloqueando solo factores, como el NogoA o RGM A, se obtiene como resultado una recuperación funcional significativa en modelos de roedores con SCI , debido a una reducción de las influencias inhibidoras que podrían cambiar el balance de inhibición crecimiento respecto a la promoción de crecimiento. Sin embargo, no se completaron las recuperaciones observadas con el bloqueo de una sola molécula inhibidora de la excrecencia de las neuritas. Para lograr recuperaciones más rápidas y más pronunciadas ya sea bloqueando dos moléculas inhibidoras de la excrecencia de las neuritas, por ejemplo, Nogo y RGM A, o bloqueando una molécula inhibidora de la excrecencia de las neuritas y mejorando las funciones de una molécula inhibidora de la excrecencia de las neuritas, por ejemplo, Nogo y neutrofinas, o bloqueando un molécula inhibidora de la excrecencia de las neuritas, por ejemplo, Nogo y una molécula pro-inflamatoria por ejemplo, TNF, puede ser deseable (ver McGee AW, et al. (2003) Trends Neurosci. , 26: 193; Marco Domeniconi, et al. (2005) J. Neurol. Sci. , 233: 43; Milán Makwanal , et al. (2005) FEBS J. 272:2628; Barry J . Dickson (2002) Science, 298: 1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al. (2005) J . Neurosci. Res. 79:273; Tara Karnezis, et al. (2004) Nature Neuroscience, 7: 736; Gang Xu, et al. (2004) J. Neurochem. , 91 : 1018).
En un aspecto, se provee una proteína de enlace de DVD que enlaza la esclerostina humana puede también unir un o ambos pares objetivo tales como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM A; OMGp y RGM A; RGM A y RGM B; CSPGs y RGM A; agrecano, midkina, neurocano, versicano, fosfacano, Te38 y TNF-a; anticuerpos específicos del globulómero ?ß combinados con anticuerpos que promueven el brote de dendritas & axones. La patología de las dendritas es una señal muy temprana de AD y se sabe que NOGO A restringe el crecimiento de las dendritas. Se puede combinar tal tipo de ab con cualquier AB candidato a SCI (proteínas de mielina). Otros objetivos de proteína de enlace de DVD pueden incluir cualquier combinación NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG u Omgp. Adicionalmente, los objetivos también pueden incluir cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la inhibición de neuritas, por ejemplo, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, semaforinas, efrinas, ?ß soluble, citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL-1 ), quimiocinas (por ejemplo, MI P 1 a), moléculas que inhiben la regeneración de nervios. La eficacia de anti-nogo/anti-RGM A o proteínas de enlace DVD se pueden validar en modelos animales preclínicos de lesión de la médula espinal. Además, estas proteínas de enlace DVD se pueden construir y analizar su eficacia en los modelos animales y la mejor proteína de enlace de DVD se puede seleccionar analizándola en pacientes humanos. Además, se puede construir la proteína de enlace de DVD en la que se focalizan dos distintos sitios de enlace de ligandos en un solo receptor por ejemplo, receptor Nogo el cual enlaza tres ligandos Nogo, Ompg, y MAG y RAGE que enlaza el ?ß y S100 A. Además, los inhibidores de la excrecencia de neuritas por ejemplo, nogo y receptor nogo, también juegan un papel en la prevención de la regeneración de nervios en enfermedades ¡nmunológicas como la esclerosis múltiple. La inhibición de la interacción del receptor nogo-nogo se ha mostrado que mejora la recuperación en modelos animales de esclerosis múltiple. Por lo tanto, las proteínas de enlace DVD que pueden bloquear la función de un mediador inmune, por ejemplo, una IL-12 similar a la citocina, y una molécula inhibidora de la excrecencia de las neuritas, por ejemplo, Nogo o RGM, pueden ofrecer una eficacia más rápida y mayor que el boqueo de una molécula ya sea inmune o inhibidora de la excrecencia de las neuritas. En general, los anticuerpos no cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) de una manera eficiente y relevante. Sin embargo, en ciertos padecimientos neurológicos, por ejemplo, la apoplejía, traumatismo encefálico, esclerosis múltiple, etc. , la BBB puede comprometerse y permite la penetración aumentada de proteínas de enlace DVD y anticuerpos en el cerebro. En otras condiciones neurológicas, donde no ocurre la fuga de la BBB, se puede emplear la focalización de sistemas de transporte endógenos, incluyendo los transportadores mediados por vehículos tales como la glucosa y vehículos de aminoácidos y estructuras/receptores de células que median la transcitosis mediada por el receptor en el endotelio vascular de la BBB, permitiendo así el transporte trans-BBB de la proteína de enlace de DVD. Las estructuras en la BBB permiten que tal transporte incluya aunque no está limitado al receptor de insulina, receptor de transferrina, LRP y RAGE. Además, las estrategias permiten el uso de proteínas de enlace DVD también como transbordos para transportar fármacos potenciales en el SNC incluyendo fármacos de bajo peso molecular, nano-partículas y ácidos nucleicos (Coloma MJ, et al. (2000) Pharm Res. 1 7(3):266-74; Boado RJ , et al. (2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55).
VI . H. Trastornos oncológicos La terapia de anticuerpo monoclonal ha emergido como una modalidad terapéutica importante para cáncer (von Mehren et al. , Annu. Rev. Med. , 54: 343-69 (2003)). Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales induciendo apoptosis, redirigiendo la citotoxicidad, interfiriendo con interacciones del ligando-receptor, o previniendo la expresión de proteínas que son críticas al fenotipo neoplásico. Además, los anticuerpos pueden dirigir componentes de los microambientes del tumor, perturbando estructuras vitales tales como la formación de la vasculatura asociada al tumor. Los anticuerpos pueden también dirigir receptores cuyos ligandos son factores de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidermal. El anticuerpo de este modo inhibe los ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular del enlace a células tumorales dirigidas. Alternativamente, los anticuerpos pueden inducir una red anti-idiotipo, citotoxicidad mediada por el complemento, o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). El uso de anticuerpo específico dual que dirige dos mediadores del tumor separados probablemente dará beneficio adicional comparado con una terapia mono-específica.
Otra modalidad proporciona una proteína de enlace-DVD que se enlaza a esclerostina humana también puede ser capaz de enlazar otro objetivo involucrado en enfermedades oncológicas que incluyen, pero no se limitan a: IGFR, IGF, VGFR1 , PDGFRb, PDGFRa, IGF1 .2, ERB3, CDCP, 1 BSG2, ErbB3, CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, I L12A, I L1 A, IL1 B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF1 0, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, EN01, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, N0X5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KL 6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1 , APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1 , PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, EN02, EN03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PR0K2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-cadherina), CDKN1B (p27Kip1). CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-caten¡na), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (Gelsolin), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glicoproteína 130), ITGA6 (a6 integrina), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspina), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (tromboespondina-1 ), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, AZGP1 (zinc-a-glicoproteína), BPAG1 (plectina), CD N1A (p21 Wap1/Cip1 ), CLDN7 (claudina-7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 integrina), ITGB4 (b 4 integrina), KLF5 (GC Box BP), KRT1 9 (queratina 19), KRTHB6 (queratina tipo I I específica del cabello), MACMARCKS, MT3 (metalotionectina-l l l), MUC 1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21 Rac2), S100A2, SCGB1 D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1 ) , SPRR1 B (Spr1 ), THBS1 , THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94), RON , c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fosfatidilserina, ROB04, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD1 38, CD56, CD33, CD2, CD1 37, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1 , MTSP1 , MSP, EPHB2, EPHA1 , EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SI P, APRI L, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1 , PSMA, PSCA, SCD1 , y CD59.
VI I . Composición Farmacéutica Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, o porción de enlace al antígeno del mismo, de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos y son útiles en, pero no se limitan a, diagnosticar, detectar, o monitorear un trastorno, en prevenir, tratar, manejar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas de los mismos, y/o en investigación. En una modalidad específica, se proporciona una composición que comprende uno o más anticuerpos. En otra modalidad, se proporciona la composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de los anticuerpos que tratan un trastorno en el cual la actividad de SOST es perjudicial. En una modalidad, los agentes profilácticos o terapéuticos se conocen por ser útiles por o que han sido o actualmente están siendo usados en la prevención, tratamiento, manejo o alivio de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De conformidad con estas modalidades, la composición puede además comprender un portador, diluyente o excipiente.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo pueden ser incorporados en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes que retardan la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, salina, salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Portadores farmacéuticamente aceptables pueden además comprender cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, preservativos o amortiguadores, los cuales mejoran la vida de anaquel o efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Se conocen varios sistemas de suministro y pueden ser usados para administrar uno o más anticuerpos o la combinación de uno o más anticuerpos y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, manejar, tratar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por el receptor (véase, e. g. , Wu y Wu, J. Biol. Chem. , 262: 4429-4432 ( 1 987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector. Se proporcionan métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico e incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural , administración ¡ntratumoral, y administración mucosal (por ejemplo, rutas intranasal y oral). Además, la administración pulmonar puede ser empleada, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. Véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,01 9,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934, 272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. Una modalidad proporciona un anticuerpo o porción de anticuerpo, terapia de combinación, o una composición administrada usando tecnología de suministro de fármaco pulmonar Alkermes AI R® (Alkermes, I nc. , Cambridge, Massachusetts, US). En una modalidad específica proporcionada, agentes profilácticos o terapéuticos son administrados ¡ntramuscularmente, intravenosamente, intratumoralmente, oralmente, intranasalmente, pulmonarmente, o subcutáneamente. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden ser administrados por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de los revestimientos mucocutáneos o epiteliales (por ejemplo, mucosa oral, rectal, y mucosa intestinal, etc.) y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una modalidad, el enlace específico de nanotubos de carbono acoplados al anticuerpo (CNTs) a células de tumor ¡n vitro, seguido por su ablación altamente específica con luz casi infrarroja (NI R) puede ser usada para dirigir células tumorales. Por ejemplo, lípidos polares biotinilados pueden ser usados para preparar dispersiones de CNT no citotóxicas, biocompatibles, estables, que son entonces unidas a uno o dos diferentes proteínas de enlace-DVD derivatizadas de avidina neutralitas dirigidas contra uno o más antígenos tumorales (por ejemplo, CD22) (Chakravarty, P. et al. (2008J Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 105:8697-8702).
Una modalidad específica proporcionada puede ser deseable para administrar los agentes profilácticos o terapéuticos localmente al área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no por medio de limitación, infusión local, por inyección, o por medio de un implante, el implante es de un material poroso o no poroso, que incluye membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®), o matrices de colágeno. Una modalidad proporciona una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos antagonistas, es administrada localmente al área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, manejar, y/o aliviar un trastorno o un síntoma del mismo. Otra modalidad proporciona una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos administrados localmente al área afectada de un sujeto en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de un anticuerpo para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.
En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico puede ser suministrado en un sistema de liberación sostenida o controlada. En una modalidad, una bomba puede ser usada para lograr liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery, 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med., 321: 574). Otra modalidad proporciona materiales poliméricos que pueden ser usados para lograr liberación controlada o sostenida de las terapias (véase, por ejemplo, Goodson, J. M., Chapter 6, In Medical Applications of Controlled Reléase, Vol. II, Applications and Evaluation, (Langer and Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1984), pp. 115-138; Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patente Estadounidense No. 5,679,377; Patente Estadounidense No. 5,916,597; U.S. Patent No. 5,912,015; Patente Estadounidense No. 5,989,463; Patente Estadounidense No. 5,128,326; Publicación de PCT No. WO 99/15154; y Publicación de PCT No. WO 99/20253. Ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilen glicol), poliláctidos (PLA), poli(láctido-co-glicólidos) (PLGA), y poliortoésteres. En una modalidad, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estables en almacenaje, estériles y biodegradables. En aún otra modalidad, un sistema de liberación controlada o sostenida puede ser colocado en proximidad al objetivo terapéutico o profiláctico, de este modo requiriendo solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol.2, pp. 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada son discutidos en la revisión por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Cualquier técnica conocida por uno de habilidad en la técnica se proporciona y puede ser usada para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,526,938, Publicación de PCT WO 91/05548, Publicación de PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cáncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology, 39: 179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 50: 372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polimeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24: 853-854, y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760.
Se proporciona una modalidad especifica donde la composición es un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico o profiláctico, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de su agente terapéutico o profiláctico, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolos de manera que llega a ser intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (véase Patente Estadounidense No. 4,980,286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un disparo de gen; Biolístic, Dupont), o revestimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes transfectantes, o administrándolos en enlace a un péptido similar a homeobox el cual se conoce por entrar al núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del DNA de la célula hospedera por expresión por recombinación homologa.
Se proporciona una composición farmacéutica formulada para ser compatible con su ruta propuesta de administración. Ejemplos de rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermal, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdermal (por ejemplo, tópica), transmucosal, y rectal. En una modalidad específica, la composición es formulada de conformidad con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos. Típicamente las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. Donde sea necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocamno, para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
Si las composiciones están siendo administradas tópicamente, las composiciones pueden ser formuladas en la forma de un ungüento, crema, parche transdermal, loción, gel, champú, atomizador, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por uno de habilidad en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 1 9th ed. , Mack Pub. Co. , Easton, Pa. (1995). Para formas de dosificación no atomizables, formas viscosas a semi-sólidas o sólidas que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica, por ejemplo, mayor que el agua son típicamente empleadas. Formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, pomadas, bálsamos y similares, los cuales, si se desean, son esterilizados o mezclados con agentes auxiliares (por ejemplo, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes, amortiguadores o sales) por influenciar varias propiedades, tales como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas de dosificación tópica adecuadas incluyen preparaciones en aerosol atomizables en donde el ingrediente activo, por ejemplo, en combinación con un portador inerte sólido o líquido, es envasado en una mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propulsante gaseoso, tal como FREON®) o en una botella apretable. Humectantes o humectadores pueden también ser agregados a composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Ejemplos de tales ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica.
Si el método comprende administración intranasal de una composición, la composición puede ser formulada en una forma de aerosol, atomización , neblina o en la forma de gotas. En particular, se proporcionan agentes profilácticos o terapéuticos y pueden ser convenientemente suministrados en la forma de una presentación en atomización de aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación unitaria puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Cápsulas y cartuchos (compuestos de, por ejemplo, gelatina) para uso en un inhalador o insuflador pueden ser formulados que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Si el método comprende administración oral, pueden ser formuladas composiciones oralmente en la forma de tabletas, cápsulas, saquillos, cápsulas de gel, soluciones, suspensiones, y similares. Las tabletas o cápsulas pueden ser preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes enlazantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenadores (por ejemplo lactosa, celulosa microcristalina, o fosfato hidrógeno de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauriisulfato de sodio). Las tabletas pueden ser recubiertas por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, pero no se limita a, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden ser presentadas como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Tales preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) ; y preservativos (por ejemplo, metil o propil-p- hidroxibenzoatos o ácido ascórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, saborizantes, colorantes y agentes endulzantes como sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden ser adecuadamente formuladas para liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de un(os) agente(s) profiláctico(s) o terapéutico(s).
El método proporcionado puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente aerosolizante. Véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,01 9,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/1 9244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. Una modalidad específica proporciona un anticuerpo, terapia de combinación, y/o composición administrada usando tecnología de suministro de fármaco pulmonar AIkermes AI R® (AIkermes, Inc. , Cambridge, Mass.).
El método proporcionado puede comprender administración de una composición formulada para administración parenteral por inyección (por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiple) con un preservativo agregado. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en la forma en polvo para constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril) antes del uso.
Los métodos proporcionados pueden adicionalmente comprender administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas por implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, las composiciones pueden ser formuladas con materiales hidrofóbicos o poliméricos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente soluble (por ejemplo, como una sal escasamente soluble).
Los métodos proporcionados abarcan administración de composiciones formuladas como formas de sal o neutrales. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de ácidos clorhídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc. , y aquellos formados con cationes tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.
En general, los ingredientes de las composiciones son suministrados ya sea separadamente o mezclados en conjunto en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o saquillo indicando la cantidad de agente activo. Donde el modo de administración es infusión, la composición puede ser dispensada con una botella de infusión que contiene salina o agua de grado farmacéutico estéril. Donde el modo de administración es por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o salina puede ser proporcionada de manera que los ingredientes pueden ser mezclados previo a la administración.
En particular, también se proporciona que uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas es envasado en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o saquillo indicando la cantidad del agente. Una modalidad proporciona uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas suministrados como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado y puede ser reconstituido (por ejemplo, con agua o salina) a la concentración apropiada para administración a un sujeto. Una modalidad proporciona uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas suministrados como un polvo liofilizado estéril seco en un contenedor herméticamente sellado a una dosificación unitaria de al menos 5 mg, por ejemplo, al menos 1 0 mg, al menos 1 5 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o composiciones farmacéuticas deben ser almacenados a entre 2°C y 8°C en su contenedor original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas deben ser administrados dentro de 1 semana, por ejemplo, dentro de 5 días, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, o dentro de 1 hora después de ser reconstituidos. Una modalidad alternativa proporciona uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas suministrados en forma líquida en un contenedor herméticamente sellado indicando la cantidad y concentración del agente. En una modalidad, la forma líquida de la composición administrada es suministrada en un contenedor herméticamente sellado al menos 0.25 mg/ml, por ejemplo, al menos 0.5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2.5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 1 5 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 1 00 mg/ml. La forma líquida debe ser almacenada a entre 2°C y 8°C en su contenedor original.
Se proporcionan anticuerpos y porciones de anticuerpos que pueden ser incorporadas en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. En una modalidad, el anticuerpo o porciones de anticuerpo serán preparadas como una solución inyectable que contiene 0.1 -250 mg/ml del anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta de ya sea una forma de dosificación líquida o liofilizada en un vial ámbar o siles, ampolleta o jeringa pre-llenada. El amortiguador puede ser L-histidina (1 -50 mM), óptimamente 5-10mM, a pH 5.0 a 7.0 (óptimamente pH 6.0). Otros amortiguadores adecuados incluyen pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio puede ser usado para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Los crioprotectores pueden ser incluidos para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% de sacarosa (óptimamente 0.5-1 .0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Agentes de volumen pueden ser incluidos para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1 -10% de manitol (óptimamente 2-4%). Los estabilizadores pueden ser usados en formas de dosificación tanto líquidas como sólidas, principalmente 1 -50 mM de L-Metionina (óptimamente 5-1 0 mM). Otros agentes de volumen adecuados que incluyen glicina, arginina, pueden ser incluidos como 0-0.05% de polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01 %). Tensoactivos adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y tensoactivos BRIJ. Se proporciona la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo preparados como una solución inyectable para administración parenteral, y puede además comprender un agente útil como un adyuvante, tal como aquellos usados para incrementar la absorción o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo) . Un adyuvante particularmente útil es hialuronidasa (tal como hialuronidasa humana recombinante Hylenex®). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana después de la administración parenteral, particularmente administración subcutánea. También permite mayores volúmenes del sitio de inyección (es decir, más de 1 mi) con menos dolor e incomodidad y mínima incidencia de las reacciones del sitio de inyección (véase, WO 2004/078140 y Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2006104968).
Las composiciones proporcionadas pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. Una forma ejemplar depende del modo propuesto de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones típicas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a aquellas usadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. Un modo ejemplar de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad, el anticuerpo es administrado por inyección o infusión intravenosa. En otra modalidad, el anticuerpo es administrado por inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenaje. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos liofilizados, estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, métodos ejemplares de preparación son secado a vacío y secado por atomización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede ser llevada aproximadamente incluyendo, en la composición, un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Se proporcionan anticuerpos y porciones de anticuerpo administrados por una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, una ruta/modo ejemplar de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como se apreciará por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede ser preparado con un portador que protegerá el compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdermales, y sistemas de suministro microencapsulados. Los polímeros biocompatibles, biodegradables, pueden ser usados, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentados o en general conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, I nc. , New York, 1 978.
En ciertas modalidades proporcionadas, un anticuerpo o porción de anticuerpo puede ser oralmente administrado, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea), también puede ser encerrados en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimidos en tabletas, o incorporados directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica, los compuestos pueden ser incorporados con excipientes y usados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto por de otro modo administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación.
Los compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados en las composiciones. Las modalidades proporcionan un anticuerpo o porción de anticuerpo coformulado con y/o coadministrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los cuales la actividad de SOST es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo anti- SOST o porción de anticuerpo puede ser coformulado y/o coadministrado con uno o más anticuerpos adicionales que se enlazan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se enlazan a otras citocinas o que se enlazan a moléculas de la superficie celular). Además, uno o más anticuerpos pueden ser usados en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los agentes terapéuticos administrados, de este modo evitando toxicidades posibles o complicaciones asociadas con varias monoterapias.
En ciertas modalidades, un anticuerpo a SOST o fragmento del mismo está ligado a un vehículo que extiende la vida media conocido en la técnica. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, el dominio Fe, polietilenglicol, y dextrano. Tales vehículos se describen, por ejemplo, en US Serie No. 09/428,082 y Publicación publicada de PCT No. WO 99/25044.
En una modalidad específica, se proporcionan secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótido que codifican un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico de la invención se administran para tratar, prevenir, manejar o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo por medio de terapia de gene. La terapia de gene se refiere a terapia realizada por administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que se puede expresar. En estas modalidades proporcionadas, los ácidos nucleicos producen su agente profiláctico o terapéutico o anticuerpo codificado que media un efecto profiláctico o terapéutico.
Se proporcionan algunos de los métodos para terapia del gene en la técnica. Para revisiones generales de los métodos de terapia de gen, véase Goldspiel et al. , 1993, Clinical Pharmacy, 12: 488-505; Wu et al. , "Delivery systems for gene therapy," Biotherapy, 3: 87-95 (1991 ); Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. , 32: 573-596; Mulligan, Science, 260: 926- 932 (1993); y Morgan and yerson, "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. , 62: 191 -21 7 (1993); Robinson, C , Trends Biotechnol. , 1 1 : 155 (1 993). Métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de DNA recombinante los cuales pueden ser usados se describen en Ausubel et al . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1 993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Descripciones detalladas de varios métodos de terapia de gene se describen en la publicación de solicitud Estadounidense No. US 2005/0042664.
La esclerostina juega un papel crítico en la patología asociada con una variedad de enfermedades que involucran elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida; Enfermedades Relacionadas con I nmunodeficiencia Adquirida; anemia permiciosa adquirida; Síndromes coronarios agudos; dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor); Polineuritis Idiopática Aguda; enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano; enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano; Poliradiculoneuropatía Desmielinante I nflamatoria Aguda; Isquemia Aguda; enfermedad hepática aguda; fiebre reumática aguda; mielitis transversa aguda; Enfermedad de Addison; síndrome de angustia respiratoria adulta (aguda); Enfermedad de Still en adulto; cirrosis alcohólica; lesión hepática inducida por alcohol; enfermedades alérgicas; alergia; alopecia; Alopecia areata; Enfermedad de Alzheimer; Anafilaxis; espondilitis alquilosante; enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante; Síndrome de Anticuerpo Anti-fosfolípido; anemia aplásica; Arteriesclerosis; artropatía; asma; enfermedad aretomatosa/arteriosclerosis; aterosclerosis; alergia atópica; eczema atópico; Dermatitis atópica; hipotiroidismo autoinmune atrófico; enfermedad bulosa autoinmune; Dermatitis autoinmune; diabetes autoinmune; Trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococco; Enteropatía Autoinmune; enfermedad hemolítica autoinmune; hepatitis autoinmune; Pérdida auditiva autoinmune; Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (ALPS); hipoglicemia mediada autoinmune; Miocarditis autoinmune; neutropenia autoinmune; insuficiencia ovárica prematura autoinmune; trombocitopenia autoinmune (AITP); enfermedad autoinmune de la tiroides; uveítis autoinmune; bronquiolitis obliterante; enfermedad de Behcet; Blefaritis; Bronquiectasis; penfigoide buloso; caquexia; Enfermedad Cardiovascular; Síndrome antifosfolípido catastrófico; Enfermedad Celiaca; Espondilosis Cervical; clamidia; coleostasis; hepatitis activa crónica; neumonía eosinofílica crónica; síndrome de fatiga crónica; enfermedad inmune cónica asociada con transplante de órgano; isquemia crónica; enfermedades hepáticas crónicas; candidiasis mucocutánea crónica; penfigoide cicatricial; Síndrome Clínicamente Aislado (CIS) con riesgo de Esclerosis Múltiple; inmunodeficiencia variada común (hipogamaglobulinemia variable común); enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad del tejido conectivo; Conjuntivitis; Anemia hemolítica positiva de Coombs; Trastorno psiquiátrico de comienzo infantil; enfermedad pulmonarmente obstructiva crónica (COPD); enfermedad de Crohn; hepatitis autoinmune criptogénica; alveolitis fibrosante criptogénica; Dacriocistitis; depresión; dermatitis escleroderma; dermatomiositis; enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositosis/polimiositosis; retinopatía diabética; Diabetes mellitus; cardiomiopatía dilatada; lupus eritematoso discoide; hernia de disco; prolapso de disco; coagulación intravascular diseminada; Hepatitis inducida por fármaco; enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco; inmune anemia hemolítica inducida por fármaco; Endocarditis; Endometriosis; endoftalmitis; sinovitis enteropática; Episcleritis; Eritema multiforme; eritema multiforme principal; infertilidad femenina; fibrosis; enfermedad pulmonar fibrótica; penfigoide gestacional; arteritis de células gigantes (GCA); glomerulonefritis; hipotiroidismo autoinmune bociógeno (Enfermedad de Hashimoto); Síndrome del Buen pastor; artritis gotosa; enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD); Enfermedad de Grave; infección de estreptococcos grupo B (GBS); Síndrome de Guillain-Barré (GBS); enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis; fiebre del heno; insuficiencia cardiaca; anemia hemolítica; Purpurea de Henoch-Schoenlein; Hepatitis B; Hepatitis C; Síndrome de Hughes; Corea de Huntington; hipertiroidismo; hiperparatiroidismo; leucopenia idiopática; tromocitopenia idiopática; Enfermedad de Parkinson idiopática; neumonía intersticial idiopática; enfermedad hepática idiosincrática; alergia mediada por IgE; anemia hemolítica inmune; Miositis de Cuerpo de Inclusión; enfermedades infecciosas; enfermedad inflamatoria ocular infecciosa; enfermedad inflamatoria del intestino; enfermedad desmielinante inflamatoria; enfermedad cardiaca inflamatoria; enfermedad renal inflamatoria; diabetes mellitus dependiente de la insulina; neumonitis intersticial; IPF/UI P; Iritis; artritis crónica juvenil; anemia perniciosa juvenil; artritis reumatoide juvenil; Enfermedad de Kawasakie; queratitis; Keratojuntivitis sicca; enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier; Parálisis de Landry; Histiocitosis de células de Langerhan; enfermedad IgA lineal; Livedo reticularis; artritis de Lyme; enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica; Degeneración Macular; infertilidad idiopática masculina o NOS; malignidades; vasculitis microscópica de los ríñones; Poliangütis microscópica; enfermedad pulmonar asociada con enfermedad del tejido conectivo mezclado; Morbus Bechterev; Trastornos Neurales Motores; penfigoide de membrana mucosa; esclerosis múltiple (todos los subtipos: progresiva primaria, progresiva secundaria, remitente recidivante etc.); Insuficiencia de órgano múltiple; Enfermedad Libre Real/encefalitis miálgica; Miastenia Gravis; Síndrome Mielodisplásico; infarto al miocardio; Miocarditis; síndrome nefrótico; Trastornos de Raíz Nerviosa; Neuropatía; Esteatohepatitis no alcohólica; Hepatitis No A No B; Neuritis óptica; rechazo al transplante de órgano; osteoartritis; Osteólisis; cáncer de ovario; insuficiencia ovárica; Pancreatitis; Enfermedades parasíticas; Enfermedad de Parkinson; Pauciarticular JRA; penfigoide; pénfigo foliáceo; pénfigo vulgar; enfermedad oclusiva de la arteria periférica (PAOD); enfermedad vascular periférica (PVD); enfermedad de arteria periférica (PAD); uveítis facogénica; flebitis; Poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa); Policondritis; Polimialgia Reumática; Poliosis; JRA Poliarticular; Síndrome de Deficiencia Poliendocrina; Polimiositis; deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II ; polimialgia reumática (PMR); enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa; enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria; Síndrome post-bomba; insuficiencia ovárica prematura; cirrosis biliar primaria; mixoedema primario; parquinsonismo primario; colangitis esclerosante primaria; hepatitis esclerosante primaria; vasculitis primaria; cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma); Prostatitis; psoriasis; psoriasis tipo 1 ; psoriasis tipo 2; artritis psoriática; artropatía psoriática; hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo; manifestación pulmonar de poliarteritisnodosa; Aplasia de células rojas puras; I nsuficiencia Adrenal Primaria; fibrosis por radiación; artritis reactiva; Enfermedad de Reiter; Neuromielitis óptica recurrente; enfermedad renal de NOS; Restenosis; artritis reumatoide; enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide; Enfermedad cardiaca reumática; SAPHO (sinovitis, acné, pustulósis, hiperostosis, y osteítis); sarcoidosis; Esquizofrenia; Síndrome de Schmidt; Escleroderma; Amiloidosis Secundaria; Choque pulmonar; Escleritis; Ciática; Insuficiencia Adrenal Secundaria; síndrome de sepsia; artritis séptica; choque séptico; artropatía seronegativa; enfermedad del tejido conectivo asociada con silicona; Enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren; Síndrome de Sjogren, Dermatosis de Sneddon-Wilkinson; autoinmunidad del esperma; espondiloartropatía; espondilitis anquilosantes; Síndrome de Stevens-Johnson (SJS); Enfermedad de Still; apoplejía; oftalmía simpatética; síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; lupus eritematoso sistémico; enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico; esclerosis sistémica; enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica; enfermedad/arteritis de Takayasu; arteritis Temporal; Enfermedades mediadas Tipo Th 1 y Tipo Th2; tiroiditis; síndrome de choque tóxico; retinitis toxoplásmica; necrólisis epidermal tóxica; mielitis transversa; TRAPS (Síndrome Periódico Asociado al receptor tipo-1 del factor necrosis del tumor (TNFR)); resistencia a la insulina tipo B con acantosis nigra; reacción alérgica Tipo 1 ; hepatitis autoinmune tipo-1 (hepatitis lupoide o autoinmune clásica); hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM); Diabetes Tipo I I ; artropatía eolítica ulcerativa; colitis ulcerativa; Urticaria; neumonía intersticial usual (U IP); uveítis; enfermedad pulmonar difusa vasculítica; Vasculitis; conjuntivitis vernal; retinitis viral; vitíligo; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH); Granulomatosis de Wegener; degeneración macular de Wet; cicatrización de heridas; o yersinia y artropatía asociada con salmonella.
Los anticuerpos y porción de anticuerpos pueden ser usados para tratar humanos que sufren de enfermedades autoinmunes, en particular aquellos asociados con inflamación, artritis reumatoide (RA), osteoartritis, psoriasis, esclerosis múltiple (MS), y otras enfermedades autoinmunes.
Un anticuerpo o porción de anticuerpo también puede ser administrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
En una modalidad proporcionada, las enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y métodos incluyen, pero no se limitan a, cánceres primarios y metastásicos, que incluyen carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y ductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (que incluyen riñon, vejiga, y urotelio), tracto genital femenino (que incluye cerviz, útero y ovarios así como también coriocarcinoma y enfermedad trofoblásica gestacional, tracto genital masculino (que incluyen tumores de próstata, vesículas seminales, testículos y células germinales) , glándulas endocrinas (que incluyen, las glándulas tiroides, suprarrenales y pituitarias), y piel, así como también hemangiomas, melanomas, sarcomas (que incluyen aquellas que se originan de hueso y tejido blando así como también sarcoma Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y meninges (que incluyen astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas, y meningiomas), tumores sólidos que se originan de malignidades hematopoyéticas tales como leucemias, y linfomas (linfomas tanto Hodgkin' como no Hodgkin).
En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo o porción de enlace al antígeno del mismo usado para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de un tumor. Tal tratamiento puede involucrar administración del anticuerpo o porción de enlace al antígeno del mismo solo o en combinación con otro agente o tratamiento terapéutico, tal como radioterapia y/o un agente quimioterapéutico.
Se proporcionan anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos que pueden ser combinados con agentes que incluyen pero no se limitan a, agentes antineoplásicos, radioterapia, quimioterapia tal como agentes de alquilación de DNA, cisplatino, carboplatino, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxel, taxol, doxorubicina, gemcitabina, gemzar, antraciclinas, adriamicina, inhibidores de topoisomerasa I , inhibidores de topoisomerasa II , 5-fluorouracilo (5-FU) , leucovorina, irinotecano, inhibidores de tirosina cinasa del receptor (por ejemplo, erlotinib, gefitinib), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , inhibidores de cinasa, y siRNAs.
También se proporciona una proteína de enlace administrada con uno o más agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de varias enfermedades.
Se proporcionan anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos que pueden ser usados solos o en combinación para tratar tales enfermedades. Se debe entender que los anticuerpos o porción de enlace al antígeno de los mismos pueden ser usados solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, el agente adicional es seleccionado por el experto en la técnica por su propósito propuesto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica por ser útil para tratar la enfermedad o condición a ser tratada por el anticuerpo. El agente adicional también puede ser un agente que imparte un atributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición.
Se debe entender además, que las combinaciones las cuales están siendo incluidas son aquellas combinaciones útiles para su uso propuesto. Los agentes expuestos abajo son para propósitos ilustrativos y no están propuestos para ser limitados. Las combinaciones pueden ser los anticuerpos y al menos un agente adicional seleccionado de las listas de abajo. La combinación puede también incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada pueda realizar su función propuesta.
Combinaciones ejemplares son fármacos anti-inflamatorios no esteroideos también referidos como NSAI DS los cuales incluyen fármacos como ibuprofeno. Otras combinaciones ejemplares son corticoesteroides que incluyen prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos de uso de esferoides pueden ser reducidos o aún eliminados por disminuyendo la dosis de esteroide requerida cuando se tratan pacientes en combinación con los anticuerpos anti-esclerostina. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para artritis reumatoide con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo pueden ser combinados se proporcionan e incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: fármaco(s) anti-inflamatorio(s) supresivo(s) de citocina (CSAI Ds); anticuerpos a o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, I L-1 , I L-2, I L-3, IL-4, I L-5, I L-6, IL-7, IL-8, I L-1 5, IL-16, IL-1 8, I L-21 , interferonas, EMAP-I I , GM-CSF, FGF, y PDGF. Anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos, pueden ser combinados con anticuerpos a las moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1 ), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos que incluyen CD154 (gp39 o CD40L).
Combinaciones ejemplares de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada inflamatoria subsecuente e inmune; ejemplos ejemplares incluyen antagonistas del TNF como anticuerpos TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7, (Publicación de PCT No. WO 97/291 31 ), CA2 (Remicade™), CDP 571 , y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados de los mismos, (p75TNFR1 gG (Enbrel™) o p55TNFR1 gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima que convierte TNFa (TACE); de manera similar inhibidores de IL-1 (inhibidores de la enzima que convierte Interleucina-1 , I L-1 RA etc.) pueden ser efectivos por la misma razón. Otras combinaciones ejemplares incluyen Interleucina 1 1 . Aún otra combinación ejemplar son otros jugadores clave de la respuesta autoinmune los cuales pueden actuar paralelos a, dependientes de o en conjunto con la función SOST. Aún otra combinación ejemplar son inhibidores anti-CD4 sin agotamiento. Aún otras combinaciones ejemplares incluyen antagonistas de la ruta co-estimuladora CD80 (B7.1 ) o CD86 (B7.2) que incluyen anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonísticos.
Los anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos, también pueden ser combinados con agentes, tales como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, colquicina, corticosteroides (oral, inhalado e inyección local), agonistas adrenoreceptores beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, quetotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAI Ds, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes los cuales interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tales como TNF- o I L-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa por ejemplo, I RAK, NI K, I KK, p38, o MAP), Inhibidores de enzima que convierte I L- 1 ß , Inhibidores de enzima que convierte TNFa (TACE), Inhibidores de señalización de células-T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima que convierte la angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel™ y p55TNFRIgG (Lenercept)), slL-1 Rl , s I L- 1 Rl I , sl L-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, I L-4, IL-1 0, I L-1 1 , I L-1 3 y TGF3), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxeno, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato sódico de oro, aspirina, acetónido de triamcinolona, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenaco, piroxicam, etodolac, diclofenaco sódico, oxaprozina, hcl de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenaco sódico/misoprostol, fentanilo, anaquinra, recombinante humano, hcl de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofeno, alendronato sódico, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaína, indometacina, sulf de glucosamina/condroitina, hcl de amitriptilína, sulfadiazina, hcl de oxicodona/acetaminofeno, hcl de olopatadina, misoprostol, naproxeno sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, I L-1 TRAP, M RA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-1 8, Anti-IL1 5, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801 , y Mesopram . Combinaciones ejemplares incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o severa, ciclosporina.
Agentes adicionales no limitantes los cuales también pueden ser usados en combinación con una proteína de enlace para tratar artritis reumatoide (RA) incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: fármaco(s) anti-inflamatorio(s) no esteroideos (NSAIDs); fármaco(s) anti-inflamatorio(s) supresivo(s) de citocina (CSAIDs); CDP-571 /BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNFa humanizado; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anticuerpo anti-TNFa quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-lgG/etanercept (proteína de fusión IgG del receptor TNF de 75 kD; Immunex; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNF-lgG (proteína de fusión IgG del receptor de TNF de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado sin agotamiento; IDEC/SmithKIine; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión IL-2; Seragen; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (citocina antiinflamatoria; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante, citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-4; Agonistas IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-1RA (antagonista del receptor IL-1; Synergen/Amgen); anaquinra (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (proteína de enlace a TNF soluble; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (inhibidor de Tipo IV de fosfodiesterasa; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); MK-966 (Inhibidor de COX-2; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); lloprost (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S82); metotrexato; talidómida (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con talidómida (por ejemplo, Celgen); leflunomida (inhibidor de citocina y anti-inflamatorio; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S 1 31 ; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexámico (inhibidor de activación del plasminógeno; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism ( 1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284) ; T-614 (inhibidor de citocina; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); prostaglandina E 1 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); Tenidap (fármaco anti-inflamatorio no esteroideo; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280); Naproxeno (fármaco anti-inflamatorio no esteroideo; véase por ejemplo, Neuro Report (1 996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (fármaco anti-inflamatorio no esteroideo); I buprofeno (fármaco anti-inflamatorio no esteroideo); Piroxicam (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); Diclofenaco (fármaco anti-inflamatorio no esteroideo); Indometacina (fármaco anti-inflamatorio no esteroideo); Sulfasalazina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281 ); Azatioprina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1 996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281 ); Inhibidor de ICE (inhibidor de la enzima que convierte a interleucina-1 ß); inhibidor zap-70 y/o Ick (inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o Ick); inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R (inhibidores del factor de crecimiento celular endotelial vascular o receptor del factor de crecimiento celular endotelial vascular; inhibidores de la angiogénesis); fármacos antiinflamatorios corticosteroides {por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF-convertasa; anticuerpos anti-IL-12; anticuerpos anti-I L-18; interleucina-11 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S296); interleucina-13 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S308); inhibidores de interleucina-17 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S120); oro; penicilamina; cloroquina; clorambucilo; hidroxicloroquina; ciclosporina; ciclofosfamida; irradiación linfoide total; globulina anti-timocito; anticuerpos anti-CD4; CD5-toxinas; péptidos oralmente administrados y colágeno; lobenzarit disódico; Agentes Reguladores de Citocina (CRAs) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligo-desoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor-1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; ogoteina; polisulfato de glicosaminoglicano; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de semillas vegetales y pescado; véase por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am., 21: 759-777); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; globulina inmune intravenosa; zileuton; azaribina; ácido micofenónico (RS-61443); tacrólimo (FK-506); sirolimo (rapamicina); amiprilosa (terafectina); cladribina (2-clorodesoxiadenosina); metotrexato; inhibidores de bcl-2 (véase Bruncko, Milán et al., Journal of Medicinal Chemistry (2007), 50(4), 641-662); antivirales y agentes moduladores inmunes.
En una modalidad, la proteína de enlace o porción de enlace al antígeno del mismo, se administra en combinación con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de artritis reumatoide (RA): inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; leflunomida; naproxeno; valdecoxib; sulfasalazina; metilprednisolona; ibuprofeno; meloxicam ; acetato de metilprednisolona; tiomalato sódico de oro; aspirina; azatioprina; acetónido de triamcinolona; napsilato de propoxifeno/apap; folato; nabumetona; diclofenaco; piroxicam; etodolac; diclofenaco sódico; oxaprozina; hcl de oxicodona; bitartrato de hidrocodona/apap; diclofenaco sódico/misoprostol; fentanilo; anaquinra, recombinante humano; hcl de tramadol; salsalato; sulindac; cianocobalamina/fa/piridoxina; acetaminofeno; alendronato sódico; prednisolona; sulfato de morfina; clorhidrato de lidocaína; indometacina; sulf de glucosaminato/condroitina; ciclosporina; hcl de amitriptilina; sulfadiazina; hcl de oxicodona/acetaminofeno; hcl de olopatadina; misoprostol; naproxeno sódico; omeprazol; mofetil micofenolato; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; I L-18 BP; IL-12/23; anti-I L 18; anti-I L 1 5; BI RB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485, CDC-801 ; y mesopram.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para enfermedad inflamatoria del intestino con los cuales una proteína de enlace se puede combinar incluyen los siguientes: budesonido; factor de crecimiento epidermal; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; Antagonistas del receptor I L-1 ; mAbs anti-I L-1 ß; anti-I L-6 mAbs; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos piridinil-imidazol; anticuerpos a, o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, I L-1 , I L-2, IL-6, I L-7, I L-8, IL-15, I L-16, I L-17, IL-18, EMAP-I I, GM-CSF, FGF, y PDGF. Anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos a moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAI Ds, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes los cuales interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, I KK, p38 o MAP), Inhibidores de enzima que convierte l L- 1 ß , Inhibidores de enzima que convierte el TNFa, Inhibidores de señalización de células-T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima que convierte la angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, sl L-1 Rl , si L- 1 Rl I , SIL-6R) y citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, I L-1 0 , I L-1 1 , IL-13 y TGF ) e inhibidores bcl-2.
Ejemplos de agentes terapéuticos para enfermedad de Crohn en los cuales una proteína de enlace se puede combinar incluyen los siguientes: Antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (Publicación de PCT No. WO 97/291 31 ; HUMIRA®), CA2 (REMICADE), CDP 571 , Constructos de TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL®) e inhibidores p55TNFRIgG (LENERCEPT™)) e inhibidores de PDE4. Anticuerpos o porciones de enlace al antígeno de los mismos, se pueden combinar con corticosteroides, por ejemplo, budesónido y dexametasona. Proteínas de enlace o porciones de enlace al antígeno de las mismas, también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes los cuales interfieren con la síntesis o acción de citocinas proinflamatorias tales como IL-1 , por ejemplo, I nhibidores de enzima que convierte I L-1 ß y I L-1 ra. Anticuerpos o porción de enlace al antígeno del mismo también pueden ser usados con Inhibidores de señalización de células-T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa 6-mercaptopurinas. Proteínas de enlace o porciones de enlace al antígeno de las mismas, se pueden combinar con i L-1 1 . Proteínas de enlace o porciones de enlace al antígeno de las mismas, se pueden combinar con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, metilprednisolona succinato sódico, sulfato de atrop/difenoxilato, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, agua-dextrosa/ciprofloxacina, bitartrato de hidrocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, flucocinónido, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofloxacina, sulfato de hiosciamina, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de midazolam, hcl de oxicodona/acetaminofeno, clorhidrato de prometazina, fosfato sódico, sulfametoxazol/timetoprim , celecoxib, policarbophil, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de codeína/apap, hcl de colesevelam , cianocobalamina, ácido fótico, levofloxacina, metilprednisolona, natalizumab y gamma-interferón Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple (MS) con los cuales las proteínas de enlace se puede combinar incluyen los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-ß? a (Avonex; Biogen); interferón-ß1 b (Betaseron; Chiron/Berlex); interferón a-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß1 ?-IF (Serono/lnhale Therapeutics), Peginterferón a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1 ; Copaxona; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos a, o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, I L-1 , IL-2, IL-6, I L-7, I L-8, I L-23, IL-1 5, I L-1 6, IL-18, EMAP-I I , GM-CSF, FGF, y PDGF. Proteínas de enlace se pueden combinar con anticuerpos a moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD1 9, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Proteínas de enlace también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAI Ds, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes los cuales interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP), Inhibidores de enzima que convierte IL-1 ß , inhibidores de TACE, Inhibidores de señalización de células-T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima que convierte la angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, slL-1 Rl, slL-1 Rll, SIL-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF ) e inhibidores bcl-2.
Ejemplos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiples en los cuales proteínas de enlace se pueden combinar incluyen interferón-ß, por ejemplo, IFN ia e ??? ?^ copaxona, corticosteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, Inhibidores de TNF, y anticuerpos al ligando CD40 y CD80.
Las proteínas de enlace también se pueden combinar con agentes, tales como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, clorhidrato de xeliprodeno, fampridina, acetato de glatirámero, natalizumab, sinnabidol, a-inmunocina NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas del receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposoma), THC.CBD (agonista canabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpo del receptor anti-IL-6, neurovax, pirfenidona alotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-RI, talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas de VLA-4 (por ejemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de gamma interferón, antagonistas de IL-4.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Angina con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, mononitrato de isosórbido, succinato de metoprolol, atenolol, tartrato de metoprolol, besilato de amlodipina, clorhidrato de diltiazem, dinitrato de isosórbido, bisulfato de clopidogrel, nifedipina, atorvastatina cálcica, cloruro de potasio, furesómido, simvastatina, hcl de verapamil, digoxina, clorhidrato de propranolol, carvedilol, lisinopril, espironolactona, hidroclorotiazida, maleato de enalaprilo, nadolol, ramipril, enoxaparina sódica, heparina sódica, valsarían, clorhidrato de sotalol, fenofibrato, ezetimibe, bumetanida, losarían potásico, lisinopril/hidroclorotiazida, felodipina, captopril, fumarato de bisoprolol.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Espondilitis Anquilosante con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: ibuprofeno, diclofenaco y misoprostol, naproxeno, meloxicam, indometacina, diclofenaco, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazina, Metotrexato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercept, infliximab.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Asma con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: albuterol, salmeterol/fluticasona, montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesónido, prednisona, xinafoato de salmeterol, hcl de levalbuterol, sulfato de albuterol/ipratropio, prednisolona fosfato sódico, acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, metilprednisolona succinato sódico, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna del virus de la influenza, metilprednisolona, trihidrato de amoxicilina, flunisólido, inyección por alergia, cromolin sódico, clorhidrato de fexofenadina, flunisólido/mentol, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo de ayuda inhalador, guaifenesina, fosfato sódico de dexametasona, hcl de moxifloxacina, hiclato de doxiciclina, guaifenesina/d-metorfano, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, clorhidrato de cetrizina, fuorato de mometasona, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, hcl de cetirizina/pseudoefed, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozil, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona, sulfato de metaproterenol.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para COPD con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: sulfato de albuterol/ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, metilprednisolona succinato sódico, montelukast sódico, budesónido, fumarato de formoterol, acetónido de triamcinolona, levofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, hcl de levalbuterol, flunisólido, ceftriaxona sódica, trihidrato de amoxicilina, gatifloxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato, flunisólido/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, sulfato de metaproterenol, metilprednisolona, fuorato de mometasona, p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p-efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R, R)-formoterol, TgAAT, Cilomilast, Roflumilast.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para HCV con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: lnterferón-alfa-2a, I nterferón-alfa-2b, I nterferón-alfa con 1 , Interferón-alfa-n1 , interferón pegilada-alfa-2a, Interferón pegilada-alfa-2b, ribavirina, Peginterferón alfa-2b + ribavirina, Ácido Ursodesoxicólico, ácido glicirrícico, timalfasina, maxamina, VX-497 y algunos compuestos que se usan para tratar HCV a través de la intervención con los siguientes objetivos: polimerasa del HCV, proteasa del HCV, helicasa del HCV, HCV I RES (sitio de entrada del ribosoma interno).
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Fibrosis Pulmonar Idiopática con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: prednisona, azatioprina, albuterol, colquicina, sulfato de albuterol, digoxina, gamma interferón, metilprednisolona sod succ, lorazepam, furesomido, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicina d, alteplasa, propionato de fluticasona, levofloxacina, sulfato de metaproterenol, sulfato de morfina, hcl de oxicodona, cloruro de potasio, acetónido de triamcinolona, tacrólimo anhidro, calcio, interferón-alfa, metotrexato, mofetil micofenolato, Gamma-interferóna-1 ß· Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Infarto al miocardio con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosórbido, digoxina, furesómido, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalaprilo, torsemida, retavasa, losartan potásico, hcl de quinapril/mag carb, bumetanida, alteplasa, enalaprilat, clorhidrato de amiodarona, m-hidrato de hcl de tirofiban, clorhidrato de diltiazem , captopril, irbesartan, valsartan, clorhidrato de propranolol, fosinopril sódico, clorhidrato de lidocaína, eptifibátido, cefazolin sódico, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, clorhidrato de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, hcl de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, atorvastatina cálcica, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de meperidina, dinitrato de isosórbido, epinefrina, clorhidrato de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/simvastatina, avasimiba, cariporido.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Psoriasis con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol , acetónido de triamcinolona, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, flucocinónido, diprop de betametasona aumentada, acetónido de fluocinolona, acitretina, champú de alquitrán, valerato de betametasona, fuorato de mometasona, quetoconazol, pramoxina/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenolido, urea, betametasona, propionato de clobetasol/emoll, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, formula humectante, ácido fólico, desonido, pimecrólimo, alquitrán de carbono, diacetato de diflorasona, folato de etanercept, ácido láctico, metoxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, protector solar, halcinonido, ácido salicílico, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de carbón, alquitrán de carbono/ácido salicílico, alquitrán de carbono/ácido salicílico/azufre, desoximetasona, diazepam, emoliente, flucocinónido/emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/na lact, aceite mineral/aceite de maní, petróleo/miristato de isopropilo, psoralen, ácido salicílico, jabón/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, ¡nfliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrólimo, pimecrólimo, PUVA, UVB, sulfasalazina.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Artritis psoriática con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: metotrexato, etanercept, rofecoxib, celecoxib, ácido fólico, sulfasalazina, naproxeno, leflunomida, acetato de metilprednisolona, indometacina, sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, diprop de betametasona aumentada, infliximab, metotrexato, folato, acetónido de triamcinolona, diclofenaco, dimetilsulfóxido, piroxicam, diclofenaco sódico, cetoprofeno, meloxicam, metilprednisolona, nabumetona, tolmetin sódico, calcipotrieno, ciclosporina, diclofenaco sódico/misoprostol, flucocinónido, sulf de glucosaminato, tiomalato sódico de oro, bitartrato de hidrocodona/apap, ibuprofeno, risedronato sódico, sulfadiazina, tioguanina, valdecoxib, alefacept, efalizumab e inhibidores bcl-2.
Se proporcionan ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Restenosis con los cuales las proteínas de enlace pueden ser combinadas e incluyen los siguientes: sirolimus, paclitaxel, everolimus, tacrólimo, Zotarolimus, acetaminofeno.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para Ciática con los cuales las proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: bitartrato de hidrocodona/apap, rofecoxib, hcl de ciclobenzaprina, metilprednisolona, naproxeno, ibuprofeno, hcl de oxicodona/acetaminofeno, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína/apap, hcl de tramadol/acetaminofeno, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, clorhidrato de lidocaína, diclofenaco sódico, gabapentina, dexametasona, carisoprodol, trometamina de cetorolaco, indometacina, acetaminofeno, diazepam, nabumetona, hcl de oxicodona, hcl de tizanidina, diclofenaco sódico/misoprostol, napsilato de propoxifeno/apap, asa/oxicod/oxicodona ter, ibuprofeno/hidrocodona bit, hcl de tramadol, etodolac, hcl de propoxifeno, hcl de amitriptilina, carisoprodol/codeína fos/asa, sulfato de morfina, multivitaminas, naproxeno sódico, citrato de orfenadrina, temazepam.
Ejemplos de agentes terapéuticos para SLE (Lupus) en los cuales proteínas de enlace se pueden combinar se proporcionan e incluyen los siguientes: NSAI DS, por ejemplo, diclofenaco, naproxeno, ibuprofeno, piroxicam, indometacina; Inhibidores de COX2, por ejemplo, Celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; anti-malariales, por ejemplo, hidroxicloroquina; Esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budesónido, dexametasona; Citotóxicos, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, mofetil micofenolato, metotrexato; inhibidores de PDE4 o inhibidores de la síntesis de purina, por ejemplo Cellcept. Proteínas de enlace también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, Imuran y agentes los cuales interfieren con la síntesis, producción o acción de citocinas proinflamatorias tales como I L-1 , por ejemplo, inhibidores de caspasa como Inhibidores de enzima que convierten I L- 1 ß y I L-1 ra. Proteínas de enlace también pueden ser usadas con Inhibidores de señalización de células-T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa; o moléculas que dirigen las moléculas de activación de células-T, por ejemplo, anticuerpos de la familia CTLA-4-lgG o anti-B7, anticuerpos de la familia anti-PD-1 . Proteínas de enlace se pueden combinar con I L-1 1 o anticuerpos anti-citocina, por ejemplo, fonotolizumab (anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos del receptor anti-receptor, por ejemplo, anticuerpo del receptor anti-I L-6 y anticuerpos a moléculas de la superficie de células-B. Anticuerpos o porción de enlace al antígeno de los mismos también se pueden usar con LJP 394 (abetimus), agentes que agotan o inactivan células-B, por ejemplo, Rituximab (anticuerpo anti-CD20), linfostat-B (anticuerpo anti-BlyS), Antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (Publicación de PCT No. WO 97/291 31 ; HUMI RA®), CA2 (REMICADE®), CDP 571 , Constructos de TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL®* y p55TNFRIgG (LENERCEPT®)) e inhibidores bcl-2, debido a que la sobre expresión de bcl-2 en ratones transgénicos ha sido demostrada por causar un fenotipo similar a lupus (véase Marquina, Regina et al. , Journal of Immunology (2004), 172(1 1 ), 7177-7185), por lo tanto se espera que la inhibición tenga efectos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo del mismo. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede ser determinada por una persona experta en la técnica y puede variar de conformidad con factores tales como el estado de enfermedad, edad , sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual algunos efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo, o porción de anticuerpo, son compensados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos, previo a, o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menos que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, un bolo único puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas con el tiempo o las dosis pueden ser proporcionalmente reducidas o incrementadas como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. El término "forma unitaria de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación son dictadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto profiláctico o terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos tales como un compuesto activo para el tratam iento de sensibilidad en individuos.
Se observa que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición a ser aliviada . Se entiende además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados con el tiempo de conformidad con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona q ue administra o superficie la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación expuestos aquí son ejemplares solamente y no están propuestos para limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada .
VI I I . Diagnóstico La divulgación aquí tam bién proporciona aplicaciones de diagnóstico. Esto se aclara adicionalmente a continuación . Se proporcionan anticuerpos que en lazan a esclerostina y se pueden emplear en cualquiera de una variedad de formatos para detectar esclerostina in vivo, in vitro, o ex vivo (es decir, en células o tejidos que se han obtenido a partir de un individuo vivo, sometido a un procedimiento, posteriormente regresado al individuo) . Las proteínas de enlace a DVD ofrecen la ventaja ad icional de ser capaces de enlazar a un epítope de esclerostina así como otros antígenos o epítopes en diversos formatos de ensayo de d iagnóstico y detección .
I . Método de Prueba La presente divulgación también proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de una esclerostina, o un fragmento del mismo, ("analito") en una muestra de prueba utilizando al menos una proteína de enlace anti-esclerostina o una porción de enlace al antígeno de la misma, incluyendo una proteína de enlace a DVD, como aquí se describe. En el método se puede utilizar cualquier ensayo adecuado como es conocido en el arte. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el inmunoensayo, tal como el inmunoensayo de emparedado (por ejemplo, inmunoensayos de emparedado de proteína de enlace a DVD, monoclonal y/o policlonal o cualquier variación del mismo (por ejemplo, monoclonal/proteína de enlace a DVD, proteína de enlace a DVD/policlonal, etcétera), incluyendo detección de radioisótopo (radioinmunoensayo (RIA)) y detección de enzimas (inmunoensayo de enzimas (EIA) o ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) (por ejemplo, ensayos ELISA Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN))), el inmunoensayo de inhibición competitiva (por ejemplo, hacia adelante y reversa), el inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), la técnica de inmunoensayo de enzimas multiplicadas (EMIT), la transferencia de energía de resonancia bioluminiscente (BRET), y el ensayo quimioluminiscente homogéneo, etcétera. En un inmunoensayo basado en SELDI , un reactivo de captura que enlaza específicamente un analito (o un fragmento del mismo) de interés se une a la superficie de una sonda de espectroscopia de masas, tal como un arreglo de chip proteico preactivado. Posteriormente, el analito (o un fragmento del mismo) se captura específicamente en el biochip, y el analito capturado (o un fragmento del mismo) se detecta mediante espectroscopia de masas. Alternativamente, el analito (o un fragmento del mismo) se puede eluir a partir del reactivo de captura y detectar mediante MALDI (ionización/desorción láser asistida por matriz) tradicional o mediante SELDI . Un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes, en particular uno que emplea el analizador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L), es un ejemplo de un inmunoensayo.
Los métodos bien conocidos en el arte para colectar, manipular y procesar orina, sangre, suero y plasma, y otros fluidos corporales, se utilizan en la práctica de la presente divulgación, por ejemplo, cuando la proteína de enlace anti-esclerostina según se describe aquí se emplea como un reactivo de inmunodiagnóstico y/o en un kit de inmunoensayo del analito. La muestra de prueba puede comprender radicales adicionales además del analito de interés, tales como anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, drogas, enzimas, receptores, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y/o polinucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera obtenida a partir de un sujeto. Puede ser necesario o deseado que una muestra de prueba, particularmente sangre entera, sea tratada antes del inmunoensayo como aquí se describe, por ejemplo, con un reactivo de pretratamiento. Incluso en los casos donde no es necesario el pretratamiento (por ejemplo, la mayoría de las muestras de orina), el pretratamiento opcionalmente se puede realizar (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial).
El reactivo de pretratamiento puede ser cualquier reactivo apropiado para el uso con el inmunoensayo y los kits. El pretratamiento opcionalmente comprende: (a) uno o más solventes (por ejemplo, metanol y etilenglicol) y opcionalmente, sal, (b) uno o más solventes y sal, y opcionalmente, detergente, (c) detergente, o (d) detergente y sal. Los reactivos de pretratamiento son conocidos en el arte, y tal pretratamiento se puede emplear, por ejemplo, como se utiliza para los ensayos en los analizadores ARCH ITECT®, AxSYM®, y Abbott TDx (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L), como se describe en la literatura (véase, por ejemplo, Yatscoff et al. , Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), y Wallemacq et al. , Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1 999)), y/o como está comercialmente disponible. Adicionalmente, el pretratamiento se puede realizar como se describe en la Patente Norteamericana de Abbott No. 5, 135,875; en la Publicación de Patente Europea No. 0 471 293; en la Publicación PCT No. WO 2008/082984; y la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2008/0020401 . El reactivo de pretratamiento puede ser un agente heterogéneo o un agente homogéneo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, el reactivo de pretratamiento precipita la proteína de enlace al analito (por ejemplo, la proteína que puede enlazar a un analito o un fragmento del mismo) presente en la muestra. Tal etapa de pretratamiento comprende remover cualquier proteína de enlace al analito separando de la proteína de enlace al analito precipitada el sobrenadante de la mezcla formado por la adición del agente de pretratamiento a la muestra. En tal ensayo, el sobrenadante de la mezcla en ausencia de cualquier proteína de enlace se utiliza en el ensayo, procediendo directamente a la etapa de captura del anticuerpo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento homogéneo no hay tal etapa de separación. La mezcla entera de la muestra de prueba y el reactivo de pretratamiento se contactan con un ligando específico, etiquetado, para el analito (o un fragmento del mismo), tal como un anticuerpo anti-analito etiquetado (o un fragmento antagónicamente reactivo del mismo) . El reactivo de pretratamiento empleado para tal ensayo típicamente se diluye en la mezcla de la muestra de prueba pre-tratada, ya sea antes o durante la captura por el primer ligando específico. A pesar de tal dilución, una cierta cantidad del reactivo de pretratamiento todavía está presente (o permanece) en la mezcla de la muestra de prueba durante la captura. Un ligando específico, etiquetado, ejemplar, puede ser una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma).
En un formato heterogéneo, después de que la muestra de prueba se obtiene a partir de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que se evalúa para un analito (o un fragmento del mismo) y un primer ligando específico, en donde el primer ligando específico y cualquier analito contenido en la muestra de prueba forman un complejo primer ligando específico-analito. En una modalidad, el primer ligando específico es un anticuerpo anti-analito o un fragmento del mismo. El primer ligando específico puede ser una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) según se describe aquí. El orden en el cual se agregan la muestra de prueba y el primer ligando especifico para formar la mezcla no es crítico. En una modalidad, el primer ligando específico se inmoviliza sobre una fase sólida. La fase sólida utilizada en el inmunoensayo (para el primer ligando específico y, opcionalmente, el segundo ligando específico) puede ser cualquier fase sólida conocida en el arte, tal como, pero no limitado a, una partícula magnética, una cuenta, un tubo de ensayo, una placa de microtítulo, una cubeta, una membrana, una molécula de soporte, una película, un papel de filtro, un disco y un chip.
Después de que se forma la mezcla que contiene el complejo primer ligando específico-analito, cualquier analito no enlazado se remueve del complejo utilizando cualquier técnica conocida en el arte. Por ejemplo, el analito no enlazado se puede remover mediante lavado. Deseablemente, sin embargo, el primer ligando específico está presente en exceso de cualquier analito presente en la muestra de prueba, tal que todo el analito que está presente en la muestra de prueba se enlaza por el primer ligando específico.
Después de que se remueve cualquier analito no enlazado, un segundo ligando específico se agrega a la mezcla para formar un complejo primer ligando específico-analito-segundo ligando específico.
El segundo ligando específico es, por ejemplo, un anticuerpo anti-analito que se enlaza a un epítope en el analito que difiere del epítope en el analito enlazado por el primer ligando específico. Adicionalmente, en una modalidad, el segundo ligando específico se etiqueta con o contiene una etiqueta detectable como se describe anteriormente. El segundo ligando específico puede ser una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) según se describe aquí.
Se puede utilizar cualquier etiqueta detectable adecuada como se conoce en el arte. Por ejemplo, la etiqueta detectable puede ser una etiqueta radiactiva (tal como 3H, 125l , 35S, 14C, 32P, y 33P), una etiqueta enzimática (tal como peroxidasa de rábano picante, peroxidasa alcalina, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, y similares), una etiqueta quimioluminiscente (tal como ásteres de acridina, tioésteres, o sulfonamidas; ésteres de fenantridinio, isoluminol, luminol, y similares), una etiqueta fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos (por ejemplo, seleniuro de cadmio terminado con sulfuro de cinc), una etiqueta termométrica, o una inmuno-etiqueta de reacción en cadena de polimerasa. Una introducción a las etiquetas, procedimientos de etiquetado y detección de etiquetas se encuentra en Polak and Van Noorden, I ntroduction to I mmunocytochemistry, 2a ed. , Springer Verlag, N.Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que es un catálogo y manual combinado publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Una etiqueta fluorescente se puede utilizar en FPIA (véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, y 5,352,803). Un compuesto de acridina se puede emplear como una etiqueta detectable en un ensayo quimioluminiscente homogéneo o heterogéneo (véase, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett.5: 3779-3782 (2003)).
Un compuesto de acridina ejemplar es una acridina-9-carboxamida. Los métodos para preparar las acridina-9-carboxamidas se describen en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem., 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron, 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett., 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem., 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Ratón, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett., 5: 3779-3782 (2003); y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,468,646, 5,543,524 y 5,783,699. Otro compuesto de acridina ejemplar es un aril éster de acridina-9-carboxilato. Un ejemplo de un aril éster de acridina-9-carboxilato es 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinafluorosulfonato (disponible a partir de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar aril ésteres de acridina-9-carboxilato se describen en McCapra et al. , Photochem . Photobiol. , 4: 1 1 1 1 -21 (1 965); Razavi et al. , Luminescence, 15: 245-249 (2000); Razavi et al. , Luminescence, 1 5: 239-244 (2000); y la Patente Norteamericana No. 5,241 ,070. Detalles adicionales referentes al aril éster de acridina-9-carboxilato y su uso se plantean en la US 2008-0248493.
Los ensayos quimioluminiscentes (por ejemplo, utilizando acridina como se describe anteriormente u otros agentes quimioluminiscentes) se pueden realizar de conformidad con los métodos descritos en Adamczyk et al. , Anal. Chim . Acta, 579(1 ): 61 -67 (2006). Mientras que se puede utilizar cualquier formato de ensayo adecuado, un quimioluminómetro de microplacas (Mithras LB-940, Berthold Technologies U. S. A. , LLC, Oak Ridge, TN) permite el ensayo de múltiples muestras de pequeños volúmenes rápidamente.
El orden en que la muestra de prueba y el(los) ligando(s) específico(s) se agregan para formar la mezcla para el ensayo quimioluminiscente no es crítico. Si el primer ligando específico se etiqueta de manera detectable con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto de acridina, se forman complejos primer ligando específico-analito etiquetados de manera detectable. Alternativamente, si se utiliza un segundo ligando específico y el segundo ligando específico se etiqueta de manera detectable con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto de acridina, se forman complejos primer ligando específico-analito-segundo ligando específico etiquetados de manera detectable. Cualquier ligando específico no enlazado, ya sea etiquetado o no etiquetado, se puede remover de la mezcla utilizando cualquier técnica conocida en el arte, tal como lavado.
Peróxido de hidrógeno se puede generar in situ en la mezcla o se puede proporcionar o suministrar a la mezcla (por ejemplo, la fuente del peróxido de hidrógeno siendo uno o más amortiguadores u otras soluciones que son conocidas por contener peróxido de hidrógeno) antes, simultáneamente con, o después de la adición de un compuesto de acridina anteriormente descrito. El peróxido de hidrógeno se puede generar in situ de varias maneras tal como sería aparente para uno experto en el arte.
Tras la adición simultánea o subsiguiente de al menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, a saber, una señal quimioluminiscente, indicativa de la presencia del analito. La solución básica contiene al menos una base y tiene un pH mayor que o igual a 10, por ejemplo, mayor que o igual a 12. Ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de amonio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio, y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica agregada a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Con base en la concentración de la solución básica utilizada, un experto en el arte puede fácilmente determinar la cantidad de solución básica a agregar a la muestra.
La señal quimioluminiscente que se genera se puede detectar utilizando técnicas de rutina conocidas por aquellos expertos en el arte. Con base en la intensidad de la señal generada, se puede cuantificar la cantidad de analito en la muestra. Específicamente, la cantidad de analito en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de analito presente se puede cuantificar comparando la cantidad de luz generada a una curva estándar para el analito o mediante comparación a un estándar de referencia. La curva estándar se puede generar utilizando diluciones seriales o soluciones de concentraciones conocidas de analito mediante espectroscopia de masas, métodos gravimétricos, y otras técnicas conocidas en el arte. Mientras que lo anterior se describe con énfasis sobre el uso de un compuesto de acridina como el agente quimioluminiscente, uno de habilidad ordinaria en el arte puede fácilmente adaptar esta descripción para el uso de otros agentes quimioluminiscentes.
Los inmunoensayos del analito en general se pueden llevar a cabo utilizando cualquier formato conocido en el arte, tal como, pero no limitado a, un formato de emparedado. Específicamente, en un formato de inmunoensayo, se emplean al menos dos anticuerpos para separar y cuantificar el analito, tai como el analito humano, o un fragmento del mismo en una muestra. Más específicamente, los al menos dos anticuerpos se enlazan a diferentes epítopes en un analito (o un fragmento del mismo) formando un complejo inmune, que se refiere como un "emparedado". En general, en los inmunoensayos se pueden utilizar uno o más anticuerpos para capturar el analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba (estos anticuerpos frecuentemente son referidos como un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y se pueden utilizar uno o más anticuerpos para enlazar una etiqueta detectable (a saber, cuantificable) al emparedado (estos anticuerpos frecuentemente son referidos como el "anticuerpo de detección", los "anticuerpos de detección", el "conjugado", o los "conjugados"). De esta manera, en el contexto de un formato de inmunoensayo de emparedado, una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) según se describe aquí se puede utilizar como un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección, o ambos. Por ejemplo, una proteína de enlace a DVD que tiene un dominio que puede enlazar un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) se puede utilizar como un anticuerpo de captura y/u otra proteína de enlace a DVD que tiene un dominio que puede enlazar un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) se puede emplear como un anticuerpo de detección. A este respecto, una proteína de enlace a DVD que tiene un primer dominio que puede enlazar un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que puede enlazar un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) se pueden utilizar como un anticuerpo de captura y/o un anticuerpo de detección. Alternativamente, una proteína de enlace a DVD que tiene un primer dominio que puede enlazar un epítope en un primer analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que puede enlazar un epítope en un segundo analito (o un fragmento del mismo) se pueden utilizar como un anticuerpo de captura y/o un anticuerpo de detección para detectar, y opcionalmente cuantificar, dos o más analitos. En caso que un analito pueda estar presente en una muestra en más de una forma, tal como una forma monomérica y una forma dlmérica/multimérica, que pueden ser homoméricas o heteroméricas, una proteína de enlace a DVD que tiene un dominio que puede enlazar un epítope que sólo está expuesto en la forma monomérica y otra proteína de enlace a DVD que tiene un dominio que puede enlazar un epítope en una parte diferente de una forma dimérica/multimérica se pueden utilizar como anticuerpos de captura y/o anticuerpos de detección, permitiendo por consiguiente la detección, y la cuantificación opcional, de diferentes formas de un analito dado. Adicionalmente, emplear proteínas de enlace a DVD con diferenciales afinidades dentro de una sola proteína de enlace a DVD y/o entre proteínas de enlace a DVD puede proporcionar una ventaja de avidez. En el contexto de los inmunoensayos como aquí se describe, en general puede ser útil o deseado incorporar uno o más enlazadores dentro de la estructura de una proteína de enlace a DVD. Cuando está presente, óptimamente el enlazador debe ser de suficiente longitud y flexibilidad estructural para habilitar el enlace de un epítope por los dominios interiores así como el enlace de otro epítope por los dominios exteriores. A este respecto, si una proteína de enlace a DVD puede enlazar dos analitos diferentes y un analito es mayor que el otro, deseablemente el analito mayor se enlaza por los dominios exteriores.
Hablando de forma general , una muestra que se prueba para (por ejemplo, que se sospecha que contiene) una proteína SOST (o un fragmento de la misma) se puede contactar con al menos un anticuerpo (o anticuerpos) de captura y al menos un anticuerpo de detección (que puede ser un segundo anticuerpo de detección o un tercer anticuerpo de detección o incluso un anticuerpo sucesivamente numerado, por ejemplo, cómo donde el anticuerpo de captura y/o detección comprende múltiples anticuerpos) ya sea simultáneamente o secuencialmente y en cualquier orden. Por ejemplo, la muestra de prueba se puede contactar primero con al menos un anticuerpo de captura y posteriormente (secuencialmente) con al menos un anticuerpo de detección. Alternativamente, la muestra de prueba se puede contactar primero con al menos un anticuerpo de detección y posteriormente (secuencialmente) con al menos un anticuerpo de captura. En todavía otra alternativa, la muestra de prueba se puede contactar simultáneamente con un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección.
En el formato de ensayo de emparedado, una muestra que se sospecha contiene SOST (o un fragmento de la misma) primero se pone en contacto con al menos una primera proteína de enlace de captura (por ejemplo, el anticuerpo SOST) bajo condiciones que permiten la formación de un complejo primera proteína de enlace/SOST. Si se utiliza más de una proteína de enlace de captura, se forma un complejo primera proteína de enlace de captura/SOST que comprende dos o más proteínas de enlace de captura. En un ensayo de emparedado, las proteínas de enlace, es decir, por ejemplo, la al menos una proteína de enlace de captura, se utilizan en cantidades de exceso molar de la cantidad máxima de analito SOST (o un fragmento del mismo) esperado en la muestra de prueba. Por ejemplo, se puede utilizar desde aproximadamente 5 pg hasta aproximadamente 1 mg de anticuerpo por ml_ de amortiguador (por ejemplo, amortiguador de recubrimiento de micropartículas).
Los inmunoensayos de inhibición competitiva, que se utilizan a menudo para medir pequeños analitos debido a que se requiere el enlace mediante sólo un anticuerpo, comprenden formatos secuenciales y clásicos. En un inmunoensayo de inhibición competitiva secuencial, una proteína de enlace de captura para esclerostina se recubre sobre un pozo de una placa de microtítulo u otro soporte sólido. Cuando la muestra que contiene la esclerostina se agrega al pozo, la esclerostina enlaza a la proteína de enlace de captura. Después del lavado, se agrega al pozo una cantidad conocida de esclerostina etiquetada (por ejemplo, biotina o peroxidasa de rábano picante (HRP)). Es necesario un sustrato para una etiqueta enzimática para generar una señal. Un ejemplo de un sustrato adecuado para HRP es 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Después del lavado, la señal generada por el analito etiquetado se mide y es inversamente proporcional a la cantidad de esclerostina en la muestra. En un inmunoensayo de inhibición competitiva clásico, una proteína de enlace para esclerostina se recubre sobre un soporte sólido (por ejemplo, un pozo de una placa de microtítulo). Sin embargo, a diferencia del inmunoensayo de inhibición competitiva secuencial, la muestra y la esclerostina etiquetada se agregan al pozo al mismo tiempo. Cualquier esclerostina en la muestra compite con la esclerostina etiquetado para enlazar a la proteína de enlace de captura. Después del lavado, la señal generada por la esclerostina etiquetada se mide y es inversamente proporcional a la cantidad de esclerostina en la muestra.
Opcionalmente, antes de contactar la muestra de prueba con la al menos una proteína de enlace de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), la al menos una proteína de enlace de captura se puede enlazar a un soporte sólido, lo que facilita la separación del complejo primera proteína de enlace/esclerostina (o un fragmento del mismo) a partir de la muestra de prueba. El sustrato al cual se enlaza la proteína de enlace de captura puede ser cualquier soporte sólido o fase sólida adecuada que facilite la separación del complejo anticuerpo de captura-analito a partir de la muestra.
Ejemplos incluyen un pozo de una placa, tal como una placa de microtítulo, un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sílice, agarosa, dextrano, o gelatina), una película polimérica (por ejemplo, poliacrilamida), cuentas (por ejemplo, cuentas de poliestireno o cuentas magnéticas), una tira de un filtro/membrana (por ejemplo, nitrocelulosa o nailon), micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas magnetizables (por ejemplo, micropartículas que tienen núcleos de óxido de cromo u óxido férrico y recubrimientos homo- o hetero-poliméricos y radios de aproximadamente 1 -1 0 mieras)). El sustrato puede comprender un material poroso adecuado con una adecuada afinidad superficial para enlazar antígenos y suficiente porosidad para permitir el acceso mediante los anticuerpos de detección. Un material microporoso es en general preferido, aunque se puede utilizar un material gelatinoso en un estado hidratado. Tales sustratos porosos están, por ejemplo, en la forma de láminas que tienen un espesor de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mm, por ejemplo, aproximadamente 0.1 mm. Mientras que el tamaño de poro puede variar bastante, por ejemplo, el tamaño de poro es desde aproximadamente 0.025 hasta aproximadamente 1 5 mieras, por ejemplo, desde aproximadamente 0.15 hasta aproximadamente 15 mieras. La superficie de tales sustratos se puede activar mediante procesos químicos que causan el enlace covalente de un anticuerpo al sustrato. Resulta entonces el enlace irreversible, en general mediante adsorción a través de fuerzas hidrofóbicas, del antígeno o el anticuerpo al sustrato; alternativamente, se puede utilizar un agente de acoplamiento químico u otro medio para enlazar de manera covalente el anticuerpo al sustrato, en tanto tal enlace no interfiera con la habilidad del anticuerpo para enlazar al analito. Alternativamente, el anticuerpo se puede enlazar con micropartículas, que previamente se han recubierto con estreptavídina (por ejemplo, Cuentas Magnéticas DYNAL®, Invitrogen, Carlsbad, CA) o biotina (por ejemplo, utilizando micropartículas recubiertas con estreptavídina Power-BindTM-SA-MP (Seradyn, Indianápolis, I N)) o anticuerpos monoclonales específicos a anti-especies. Si es necesario, el sustrato se puede derivatizar para permitir la reactividad con diversos grupos funcionales en el anticuerpo. Tal derivatización requiere el uso de ciertos agentes de acoplamiento, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida, y 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Si se desea, uno o más reactivos de captura, tales como los anticuerpos (o fragmentos de los mismos), cada uno de los cuales es específico para el(los) analito(s), se pueden unir a las fases sólidas en diferentes posiciones físicas o direccionables (por ejemplo, tal como en una configuración de biochip (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,225,047; Publicación PCT No. WO 99/51773; la Patente Norteamericana No. 6,329,209; Publicación PCT No. WO 00/56934; y la Patente Norteamericana No. 5,242,828)). Si el reactivo de captura se une a una sonda de espectroscopia de masas como el soporte sólido, la cantidad de analito enlazado a la sonda se puede detectar mediante espectroscopia de masas de ionización/desorción láser. Alternativamente, una sola columna se puede empacar con diferentes cuentas, que se derivatizan con el uno o más reactivos de captura, capturando por consiguiente el analito en un solo lugar (véase, las tecnologías basadas en cuentas, derivatizadas de anticuerpos, por ejemplo, la tecnología xMAP de Luminex (Austin, TX)).
Después de que la muestra de prueba que se ensaya para el analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), la mezcla se incuba para permitir la formación de un complejo primer anticuerpo (o múltiples anticuerpos)-analito (o un fragmento del mismo). La incubación se puede llevar a cabo en un pH de desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 10.0, en una temperatura de desde aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 45°C, y durante un periodo desde al menos aproximadamente un (1 ) minuto hasta aproximadamente dieciocho (1 8) horas, por ejemplo, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 24 minutos, por ejemplo, durante aproximadamente 4 hasta aproximadamente 1 8 minutos. El inmunoensayo aquí descrito se puede llevar a cabo en una etapa (queriendo decir que la muestra de prueba, al menos un anticuerpo de captura y al menos un anticuerpo de detección se agregan todos secuencialmente o simultáneamente a un recipiente de reacción) o en más de una etapa, tal como dos etapas, tres etapas, etcétera.
Después de la formación del complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo), el complejo posteriormente se contacta con al menos un anticuerpo de detección bajo condiciones que permiten la formación de un complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo)/segundo anticuerpo de detección. Mientras que se titula por claridad como el "segundo" anticuerpo (por ejemplo, segundo anticuerpo de detección), de hecho, donde se utilizan múltiples anticuerpos para la captura y/o detección, el al menos un anticuerpo de detección puede ser el segundo, tercer, cuarto, etcétera, anticuerpos utilizados en el inmunoensayo. Si el complejo anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo) se contacta con más de un anticuerpo de detección, entonces se forma un complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo)/(múltiples) anticuerpo de detección. Al igual que con el anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), cuando el al menos un (por ejemplo, el segundo y cualquiera subsiguiente) anticuerpo de detección se pone en contacto con el complejo anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo), se requiere un periodo de incubación bajo condiciones similares a aquellas descritas anteriormente para la formación del complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo)/(segundo o múltiples) anticuerpo de detección. En una modalidad, al menos un anticuerpo de detección contiene una etiqueta detectable. La etiqueta detectable se puede enlazar con al menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, el segundo anticuerpo de detección) antes de, simultáneamente con, o después de la formación del complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo)/(segundo o múltiples) anticuerpo de detección. Se puede utilizar cualquier etiqueta detectable conocida en el arte (véase la discusión anterior, incluyendo de las referencias Polak and Van Noorden (1 997) y Haugland (1 996)).
La etiqueta detectable se puede enlazar a los anticuerpos ya sea directamente o a través de un agente de acoplamiento. Un ejemplo de un agente de acoplamiento que se puede utilizar es EDAC (clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida), que está comercialmente disponible a partir de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Otros agentes de acoplamiento que se pueden utilizar son conocidos en el arte. Los métodos para enlazar una etiqueta detectable a un anticuerpo son conocidos en el arte. Adicionalmente, muchas etiquetas detectables se pueden comprar o sintetizar que ya contienen grupos extremos que facilitan el acoplamiento de la etiqueta detectable al anticuerpo, tales como Ester de CPSP- Acridina (es decir, 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-10-(3-sulfopropil)acridinacarboxamida) o Éster de SPSP-Acridina (es decir, N 10-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridina-9- carboxamida).
El complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito/(segundo o múltiples) anticuerpo de detección puede estar, pero no tiene que estar, separado del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación de la etiqueta. Por ejemplo, si el al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura) se enlaza a un soporte sólido, tal como un pozo o una cuenta, la separación se puede lograr removiendo el fluido (de la muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Alternativamente, si el al menos primer anticuerpo de captura se enlaza a un soporte sólido, se puede contactar simultáneamente con la muestra que contiene analito y el al menos un segundo anticuerpo de detección para formar un complejo primer (múltiples) anticuerpo/analito/segundo (múltiples) anticuerpo, seguido por la remoción del fluido (muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Si el al menos un primer anticuerpo de captura no se enlaza a un soporte sólido, entonces el complejo (primer o múltiples) anticuerpo de captura/analito/(segundo o múltiples) anticuerpo de detección no tiene que ser removido de la muestra de prueba para la cuantificación de la cantidad de la etiqueta.
Después de la formación del complejo etiquetado anticuerpo de captura/analito/anticuerpo de detección (por ejemplo, el complejo primer anticuerpo de captura/analito/segundo anticuerpo de detección), la cantidad de etiqueta en el complejo se cuantifica utilizando las técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, si se utiliza una etiqueta enzimática, el complejo etiquetado se reacciona con un sustrato para la etiqueta que da una reacción cuantificable tal como el desarrollo de color. Si la etiqueta es una etiqueta radiactiva, la etiqueta se cuantifica utilizando medios apropiados, tal como un contador de centelleo. Si la etiqueta es una etiqueta fluorescente, la etiqueta se cuantifica estimulando la etiqueta con una luz de un color (que se conoce como la "longitud de onda de excitación") y detectando otro color (que se conoce como la "longitud de onda de emisión") que se emite por la etiqueta en respuesta a la estimulación. Si la etiqueta es una etiqueta quimioluminiscente, la etiqueta se cuantifica detectando la luz emitida ya sea visualmente o utilizando luminómetros, película de rayos X, película fotográfica de alta velocidad, una cámara CCD, etcétera. Una vez que se ha cuantificado la cantidad de la etiqueta en el complejo, la concentración del analito o un fragmento del mismo en la muestra de prueba se determina mediante medios apropiados, tal como mediante el uso de una curva estándar que se ha generado utilizando diluciones seriales de analito o un fragmento del mismo de concentración conocida. Aparte de utilizar diluciones seriales de analito o un fragmento del mismo, la curva estándar se puede generar gravimétricamente, mediante espectroscopia de masas y mediante otras técnicas conocidas en el arte.
En un ensayo de micropartículas quimioluminiscentes que emplea el analizador ARCH ITECT®, el pH del diluente del conjugado debe ser aproximadamente 6.0 +/- 0.2, el amortiguador de recubrimiento de micropartículas se debe mantener en aproximadamente temperatura ambiente (es decir, en desde aproximadamente 1 7 hasta aproximadamente 27°C), el pH del amortiguador de recubrimiento de micropartículas debe ser aproximadamente 6.5 +/- 0.2, y el pH del diluente de micropartículas debe ser aproximadamente 7.8 +/- 0.2. En una modalidad, los sólidos son menos de aproximadamente 0.2%, tal como menos de aproximadamente 0.1 5%, menos de aproximadamente 0.14%, menos de aproximadamente 0.1 3%, menos de aproximadamente 0.12%, o menos de aproximadamente 0.1 1 %, tal como aproximadamente 0.1 0%.
Los FPIAs se basan en los principios del inmunoensayo de enlace competitivo. Un compuesto fluorescentemente etiquetado, cuando se excita mediante una luz linealmente polarizada, emitirá una fluorescencia que tiene un grado de polarización inversamente proporcional a su tasa de rotación. Cuando un complejo rastreador-anticuerpo fluorescentemente etiquetado se excita mediante una luz linealmente polarizada, la luz emitida permanece altamente polarizada debido a que se le restringe al fluoroforo rotar entre el momento en que se absorbe la luz y el momento en que se emite la luz. Cuando un compuesto rastreador "libre" (es decir, un compuesto que no está enlazado a un anticuerpo) se excita mediante la luz linealmente polarizada, su rotación es mucho más rápida que el conjugado rastreador-anticuerpo correspondiente producido en un inmunoensayo de enlace competitivo. Los FPIAs son ventajosos sobre los RIAs en vista de que no hay sustancias radiactivas que requieran manipulación y eliminación especial. Adicionalmente, los FPIAs son ensayos homogéneos que se pueden realizar fácilmente y rápidamente.
En vista de lo antedicho, se proporciona un método para determinar la presencia, cantidad, o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El método comprende ensayar la muestra de prueba por un analito (o un fragmento del mismo) mediante un ensayo (i) empleando (i') al menos uno de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, una variante de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, y una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) que puede enlazar a un analito, y (?') al menos una etiqueta detectable y (ii) que comprende comparar una señal generada por la etiqueta detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba a una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en un control o calibrador. El calibrador opcionalmente es parte de una serie de calibradores, en que cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores por la concentración del analito.
El método puede comprender (i) contactar la muestra de prueba con al menos un primer ligando específico para el analito (o fragmento del mismo) de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, una variante de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, o una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) que puede enlazar a un analito a fin de formar un complejo primer ligando específico/analito (o fragmento del mismo), (ii) contactar el complejo primer ligando específico/analito (o fragmento del mismo) con al menos un segundo ligando específico para el analito (o fragmento del mismo) de un anticuerpo anti-analito etiquetado de manera detectable, un fragmento etiquetado de manera detectable de un anticuerpo anti-analito que puede enlazar al analito, una variante etiquetada de manera detectable de un anticuerpo anti-analito que puede enlazar al analito, un fragmento etiquetado de manera detectable de una variante de un anticuerpo anti-analito que puede enlazar al analito, o una proteína de enlace a DVD etiquetada de manera detectable (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) a fin de formar un complejo primer ligando específico/analito (o fragmento del mismo)/segundo ligando específico, y (iii) determinar la presencia, cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo primer ligando específico/analito (o fragmento del mismo)/segundo ligando específico formado en (ii). Puede ser preferible un método en el cual al menos un primer ligando específico para el analito (o un fragmento del mismo) y/o al menos un segundo ligando específico para el analito (o un fragmento del mismo) es una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) según se describe aquí.
Alternativamente, el método puede comprender contactar la muestra de prueba con al menos un primer ligando específico para un analito SOST (o un fragmento del mismo) de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, una variante de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede enlazar a un analito, o una proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) y contactar simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, la muestra de prueba con al menos un segundo ligando específico, que puede competir con el analito (o un fragmento del mismo) para enlazar con al menos un primer ligando específico y que es un analito etiquetado de manera detectable, un fragmento etiquetado de manera detectable del analito que puede enlazar al primer ligando específico, una variante etiquetada de manera detectable del analito que puede enlazar al primer ligando específico, o un fragmento etiquetado de manera detectable de una variante del analito que puede enlazar al primer ligando específico. Cualquier SOST (o un fragmento del mismo) presente en la muestra de prueba y el al menos un segundo ligando específico compiten entre sí para formar un complejo primer ligando específico/analito (o fragmento del mismo) y un complejo primer ligando específico/segundo ligando específico, respectivamente. El método adicionalmente comprende determinar la presencia, cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo primer ligando específico/segundo ligando específico formado en (ii), en donde la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo primer ligando específico/segundo ligando específico es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba.
Los métodos anteriormente mencionados adicionalmente pueden comprender diagnosticar, pronosticar, o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente de quien se obtuvo la muestra de prueba. Si el método adicionalmente comprende evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente de quien se obtuvo la muestra de prueba, el método opcionalmente comprende además modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según se necesite para mejorar la eficacia. El método se puede adaptar para el uso en un sistema automatizado o un sistema semi-automatizado.
Con respecto a los métodos de ensayo (y el kit para el mismo), puede ser posible emplear anticuerpos anti-analito comercialmente disponibles o métodos para la producción del anti-analito como se describe en la literatura. Los suministros comerciales de diversos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA), y R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN).
En general, un nivel predeterminado se puede emplear como un estándar de comparación para evaluar los resultados obtenidos tras el ensayo de una muestra de prueba para el analito o un fragmento del mismo, por ejemplo, para detectar un padecimiento o un riesgo de padecimiento. En general, al hacer tal comparación, el nivel predeterminado se obtiene corriendo un ensayo particular un suficiente número de veces y bajo condiciones apropiadas tal que se pueda hacer la vinculación o asociación de la presencia, cantidad o concentración del analito con una fase particular o punto final de un padecimiento, desorden o condición o con indicios clínicos particulares. Típicamente, el nivel predeterminado se obtiene con ensayos de sujetos (o poblaciones de sujetos) de referencia. El analito medido puede incluir fragmentos del mismo, productos de degradación del mismo, y/o productos de escisión enzimática del mismo.
En particular, con respecto a un nivel predeterminado según se emplea para monitorear la progresión del padecimiento y/o el tratamiento, la cantidad o concentración del analito o un fragmento del mismo puede ser "inalterada", "favorable" (o "favorablemente alterada"), o "desfavorable" (o "desfavorablemente alterada"). "Elevada" o "incrementada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es mayor que un nivel o rango típico o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o que es mayor que otro nivel o rango de referencia (por ejemplo, una muestra de línea base o anterior). El término "aminorada" o "reducida" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es menor que un nivel o rango típico o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o que es menor que otro nivel o rango de referencia (por ejemplo, una muestra de línea base o anterior). El término "alterada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra que se altera (incrementa o disminuye) sobre un nivel o rango típico o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o sobre otro nivel o rango de referencia (por ejemplo, una muestra de línea base o anterior).
El nivel o rango típico o normal para el analito se define de conformidad con la práctica estándar. Debido a que los niveles de analito en algunas instancias serán muy bajos, se puede considerar que ha ocurrido un denominado nivel alterado o alteración cuando hay cualquier cambio neto según se compara al nivel o rango típico o normal, o el nivel o rango de referencia, que no se puede explicar por el error experimental o la variación de la muestra. De esta manera, el nivel medido en una muestra particular se comparará con el nivel o rango de los niveles determinados en muestras similares de un denominado sujeto normal. En este contexto, un "sujeto normal" es por ejemplo un individuo sin padecimiento detectable alguno, y un paciente o población "normal" (en ocasiones referido como "control") es por ejemplo uno que no exhibe padecimiento detectable alguno, respectivamente. Adicionalmente, dado que el analito no se encuentra rutinariamente en un nivel alto en la mayor parte de la población humana, un "sujeto normal" se puede considerar un individuo sin cantidad o concentración incrementada o elevada, detectable, sustancial, del analito, y un paciente o población "normal" (en ocasiones referido como "control") es uno que no exhibe la cantidad o concentración incrementada o elevada, detectable, sustancial, del analito. Un "sujeto aparentemente normal" es uno en el cual el analito aún no se ha evaluado o actualmente está siendo evaluado. Se dice que el nivel de un analito es "elevado" cuando el analito es normalmente no detectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o está dentro de un rango de desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 75 percentiles de las poblaciones normales) , pero se detecta en una muestra de prueba, así como cuando el analito está presente en la muestra de prueba en un nivel mayor que el nivel normal. De esta manera, entre otras cosas, la divulgación proporciona un método para seleccionar un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, un padecimiento, desorden, o condición particular. El método de ensayo también puede involucrar el ensayo de otros marcadores y similares.
Consecuentemente, los métodos aquí descritos también se pueden utilizar para determinar si o no un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un padecimiento, desorden o condición dada. Específicamente, tal método puede comprender las etapas de: (a) determinar la concentración o cantidad de esclerostina (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba de un sujeto (por ejemplo, utilizando los métodos aquí descritos, o los métodos conocidos en el arte); y (b) comparar la concentración o cantidad de esclerostina (o un fragmento del mismo) determinada en la etapa (a) con un nivel predeterminado, en donde, si la concentración o cantidad de analito determinada en la etapa (a) es favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto no tiene o está en riesgo de un padecimiento, desorden o condición dada. Sin embargo, si la concentración o cantidad de esclerostina determinada en la etapa (a) es desfavorable con respecto al nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto tiene o está en riesgo de un padecimiento, desorden o condición dada.
Adicionalmente, se proporciona aquí un método para monitorear la progresión del padecimiento en un sujeto. Óptimamente el método que comprende las etapas de: (a) determinar la concentración o cantidad de esclerostina en una muestra de prueba de un sujeto; (b) determinar la concentración o cantidad de SOST en una muestra de prueba posterior del sujeto; y (c) comparar la concentración o cantidad de analito según se determina en la etapa (b) con la concentración o cantidad de esclerostina determinada en la etapa (a), en donde si la concentración o cantidad determinada en la etapa (b) está inalterada o es desfavorable cuando se compara a la concentración o cantidad de esclerostina determinada en la etapa (a), entonces se determina que el padecimiento en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado. En contraste, si la concentración o cantidad de esclerostina según se determina en la etapa (b) es favorable cuando se compara a la concentración o cantidad de esclerostina según se determina en la etapa (a) , entonces se determina que el padecimiento en el sujeto ha descontinuado, retrocedido o mejorado.
Opcionalmente, el método adicionalmente comprende comparar la concentración o cantidad de analito de esclerostina según se determina en la etapa (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Adicionalmente, opcionalmente el método comprende tratar el sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo si la comparación muestra que la concentración o cantidad de analito según se determina en la etapa (b), por ejemplo, está desfavorablemente alterada con respecto al nivel predeterminado.
Aún más, los métodos se pueden utilizar para monitorear el tratamiento en un sujeto que recibe tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente, tales métodos involucran proporcionar una primera muestra de prueba de un sujeto antes de que el sujeto haya sido administrado con una o más composiciones farmacéuticas. Después, se determina la concentración o cantidad de esclerostina en una primera muestra de prueba de un sujeto (por ejemplo, utilizando los métodos aquí descritos o como es conocido en el arte). Después de que se determina la concentración o cantidad de esclerostina, opcionalmente la concentración o cantidad de esclerostina se compara posteriormente a un nivel predeterminado. Si la concentración o cantidad de esclerostina según se determina en la primera muestra de prueba es menor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto no es tratado con una o más composiciones farmacéuticas. Sin embargo, si la concentración o cantidad de esclerostina según se determina en la primera muestra de prueba es mayor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto es tratado con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo que el sujeto es tratado con la una o más composiciones farmacéuticas se puede determinar por uno experto en el arte (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser desde aproximadamente siete (7) días hasta aproximadamente dos años, por ejemplo, desde aproximadamente catorce (14) días hasta aproximadamente un ( 1 ) año).
Durante el curso de tratamiento con la una o más composiciones farmacéuticas, posteriormente se obtienen segunda y subsiguientes muestras de prueba del sujeto. El número de muestras de prueba y el tiempo en el cual se obtienen dichas muestras de prueba del sujeto no son críticos. Por ejemplo, una segunda muestra de prueba se podría obtener siete (7) días después de que sujeto es primero administrado con la una o más composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de prueba se podría obtener dos (2) semanas después de que sujeto es primero administrado con la una o más composiciones farmacéuticas, una cuarta muestra de prueba se podría obtener tres (3) semanas después de que sujeto es primero administrado con la una o más composiciones farmacéuticas, una quinta muestra de prueba se podría obtener cuatro (4) semanas después de que sujeto es primero administrado con la una o más composiciones farmacéuticas, etcétera.
Después de que se obtiene cada segunda o subsiguiente muestra de prueba del sujeto, se determina la concentración o cantidad de analito esclerostina en la segunda o subsiguiente muestra de prueba (por ejemplo, utilizando los métodos aquí descritos o como es conocido en el arte). La concentración o cantidad de esclerostina según se determina en cada una de las segunda y subsiguientes muestras de prueba posteriormente se compara con la concentración o cantidad de analito según se determina en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que fue originalmente, opcionalmente, comparada con el nivel predeterminado). Si la concentración o cantidad de esclerostina según se determina en la etapa (c) es favorable cuando se compara a la concentración o cantidad de analito según se determina en la etapa (a), entonces se determina que el padecimiento en el sujeto ha descontinuado, retrocedido o mejorado, y el sujeto debe continuar siendo administrado con las una o más composiciones farmacéuticas de la etapa (b). Sin embargo, si la concentración o cantidad determinada en la etapa (c) está inalterada o es desfavorable cuando se compara a la concentración o cantidad de analito según se determina en la etapa (a), entonces se determina que el padecimiento en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado, y el sujeto debe ser tratado con una concentración más alta de la una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en la etapa (b) o el sujeto debe ser tratado con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de la una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en la etapa (b). Específicamente, el sujeto se puede tratar con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de las una o más composiciones farmacéuticas que el sujeto había recibido previamente para disminuir o aminorar dicho nivel de analito del sujeto.
En general, para los ensayos en los cuales se puede realizar la prueba repetitiva (por ejemplo, el monitoreo de la progresión del padecimiento y/o la respuesta al tratamiento), una segunda o subsiguiente muestra de prueba se obtiene en un periodo en el tiempo después de que se ha obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Específicamente, una segunda muestra de prueba del sujeto se puede obtener minutos, horas, días, semanas o años después de que se ha obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba se puede obtener del sujeto en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 1 5 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 1 1 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0 años, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0 años, aproximadamente 5.5 años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8.5 años, aproximadamente 9.0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años después de que se obtiene la primera muestra de prueba del sujeto.
Cuando se utiliza para monitorear la progresión del padecimiento, el ensayo anteriormente mencionado se puede utilizar para monitorear la progresión del padecimiento en sujetos que sufren de condiciones agudas. Las condiciones agudas, también conocidas como condiciones de cuidado crítico, se refieren a los padecimientos amenazantes para la vida, agudos u otras condiciones médicas críticas que involucran, por ejemplo, el sistema cardiovascular o el sistema excretor. Típicamente, las condiciones de cuidado crítico se refieren a aquellas condiciones que requieren intervención médica aguda en un entorno hospitalario (incluyendo, pero no limitado a, la sala de emergencias, la unidad de cuidados intensivos, el centro de trauma, u otro entorno de cuidado emergente) o la administración por un paramédico u otro personal médico del campo. Para las condiciones de cuidado crítico, el monitoreo repetitivo se hace en general dentro de un marco de tiempo más corto, a saber, minutos, horas o días (por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 1 5 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días), y el ensayo inicial asimismo se realiza en general dentro de un marco de tiempo más corto, por ejemplo, aproximadamente minutos, horas o días del comienzo del padecimiento o la condición.
Los ensayos también se pueden utilizar para monitorear la progresión del padecimiento en los sujetos que sufren de condiciones crónicas o no agudas. El cuidado no crítico o, las condiciones no agudas, se refiere a las condiciones aparte del padecimiento amenazante para la vida, agudo, u otras condiciones médicas críticas que involucran, por ejemplo, el sistema cardiovascular y/o el sistema excretor. Típicamente, las condiciones no agudas incluyen aquellas de término más largo o duración crónica. Para las condiciones no agudas, el monitoreo repetitivo en general se realiza con un marco de tiempo más largo, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 1 2 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 1 6 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 1 8 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 d ías, aproximadamente 3 d ías, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días , aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 1 0 semanas, aproximadamente 1 1 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 1 3 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 1 5 semanas , aproximadamente 1 6 semanas, aproximadamente 1 7 semanas, aproximadamente 1 8 semanas, aproximadamente 1 9 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0 años, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0 años, aproximadamente 5.5. años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8.5 años, aproximadamente 9.0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años), y el ensayo inicial asimismo se realiza en general dentro de un marco de tiempo más largo, por ejemplo, aproximadamente horas, días, meses o años del comienzo del padecimiento o la condición.
Adicionalmente, los ensayos anteriormente mencionados se pueden realizar utilizando una primera muestra de prueba obtenida a partir de un sujeto donde la primera muestra de prueba se obtiene a partir de una fuente, tal como orina, suero o plasma. Opcionalmente, los ensayos anteriormente mencionados posteriormente se pueden repetir utilizando una segunda muestra de prueba obtenida a partir del sujeto donde la segunda muestra de prueba se obtiene a partir de otra fuente. Por ejemplo, si la primera muestra de prueba se obtuvo a partir de la orina, la segunda muestra de prueba se puede obtener a partir del suero o plasma. Los resultados obtenidos a partir de los ensayos utilizando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba se pueden comparar. La comparación se puede utilizar para evaluar el estatus de un padecimiento o condición en el sujeto.
Adicionalmente, la presente divulgación también se refiere a métodos para determinar si un sujeto predispuesto a o que sufre de un padecimiento, desorden o condición dada se beneficiará del tratamiento. En particular, la divulgación se refiere a métodos y productos de diagnóstico de acompañantes del analito. De esta manera, el método para "monitorear el tratamiento del padecimiento en un sujeto" como aquí se describe óptimamente también puede comprender además seleccionar o identificar los candidatos para la terapia.
De esta manera, en modalidades particulares, la divulgación también proporciona un método para determinar si un sujeto que tiene, o está en peligro de, un padecimiento, desorden o condición dada es un candidato para la terapia. En general, el sujeto es uno quien ha experimentado algún síntoma de un padecimiento, desorden o condición dada o quien de hecho ha sido diagnosticado como que tiene, o que está en riesgo de, un padecimiento, desorden o condición dada, y/o quien demuestra una cantidad o concentración desfavorable de analito o un fragmento del mismo, como aquí se describe.
El método opcionalmente comprende un ensayo como aquí se describe, donde el SOST se avalúa antes y después del tratamiento de un sujeto con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, particularmente con un producto farmacéutico relacionado a un mecanismo de acción que involucra el analito), con terapia inmunosupresora, o mediante terapia de inmunoabsorción, o donde el analito se evalúa después de tal tratamiento y la concentración o la cantidad de analito se compara contra un nivel predeterminado. Una concentración o cantidad desfavorable de SOST observada después del tratamiento confirma que el sujeto no se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado, mientras que una concentración o cantidad favorable de analito observada después del tratamiento confirma que el sujeto se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado. Esta confirmación ayuda con el manejo de los estudios clínicos, y la provisión de cuidado mejorado del paciente.
Se sobreentiende que, mientras que ciertas modalidades aquí son ventajosas cuando se emplean para evaluar un padecimiento, desorden o condición dada como aquí se discute, los ensayos y kits se pueden emplear para evaluar el analito en otros padecimientos, desórdenes y condiciones. El método de ensayo también puede involucrar el ensayo de otros marcadores y similares.
El método de ensayo también se puede utilizar para identificar un compuesto que mejora un padecimiento, desorden o condición dada. Por ejemplo, una célula que expresa el analito se puede contactar con un compuesto candidato. El nivel de expresión de analito en la célula contactada con el compuesto se puede comparar con aquel en una célula de control utilizando el método de ensayo aquí descrito.
I I . Kits También se proporciona un kit para ensayar una muestra de prueba para la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El kit comprende al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para esclerostina (o un fragmento del mismo) e instrucciones para ensayar la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo). El al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo) puede incluir una composición que comprende una proteína de enlace anti-esclerostina, tal como un anticuerpo monoclonal o proteína de enlace a DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), según se describe aquí y que opcionalmente se inmoviliza sobre una fase sólida.
El kit puede comprender al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para un analito SOST mediante inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes, e instrucciones para ensayar la muestra de prueba para un analito SOST mediante ¡nmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes. Por ejemplo, el kit puede comprender al menos un ligando específico para SOST, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-esclerostina (o un fragmento del mismo que puede enlazar al analito SOST, una variante del mismo que puede enlazar al analito, o un fragmento de una variante que puede enlazar al analito) o una proteína de enlace a DVD anti-esclerostina (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), cualquiera de los cuales se puede etiquetar de manera detectable. Alternativamente o adicionalmente, el kit puede comprender el analito SOST etiquetado de manera detectable (o un fragmento del mismo que puede enlazar a un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito o una proteína de enlace a DVD anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma)), que puede competir con cualquier analito en una muestra de prueba para enlazar a un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito (o un fragmento del mismo que puede enlazar al analito, una variante del mismo que puede enlazar al analito, o un fragmento de una variante que puede enlazar al analito) o una proteína de enlace a DVD anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) , cualquiera de los cuales se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. El kit puede comprender un calibrador o control, por ejemplo, un analito aislado o purificado. El kit puede comprender al menos un recipiente (por ejemplo, un tubo, tiras o placas de microtítulo, que puede estar ya recubiertos por ejemplo con un primer ligando específico) para llevar a cabo el ensayo, y/o un amortiguador, tal como un amortiguador de ensayo o un amortiguador de lavado, cualquiera de los cuales se puede proporcionar como una solución concentrada, una solución del sustrato para la etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta enzimática) , o una solución de detención. En una modalidad, el kit comprende todos los componentes, es decir, reactivos, estándares, amortiguadores, diluentes, etcétera, que son necesarios para realizar el ensayo. Las instrucciones pueden estar en forma de papel o en forma legible por computadora, tal como un disco, CD, DVD, o similares.
Cualquier proteína de enlace, tal como una proteína de enlace anti-esclerostina o una proteína de enlace a DVD anti-analito, o un rastreador puede incorporar una etiqueta detectable como aquí se describe, tal como un fluoróforo, un radical radiactivo, una enzima, una etiqueta de biotina/avidina, un cromóforo, una etiqueta quimioluminiscente, o similares, o el kit puede incluir reactivos para llevar a cabo el etiquetado detectable. Los anticuerpos, calibradores y/o controles se pueden proporcionar en recipientes separados o se pueden pre-dispensar en un formato de ensayo apropiado, por ejemplo, en placas de microtítulo.
Opcionalmente, el kit incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores, y controles positivos). La preparación de los reactivos de control de calidad es bien conocida en el arte y se describe en hojas de inserto para una variedad de productos de ¡nmunodiagnóstico. Los miembros del panel de sensibilidad opcionalmente se utilizan para establecer las características de desempeño del ensayo, y adicionalmente opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del kit de inmunoensayo, y la estandarización de los ensayos.
El kit o equipo opcionalmente también puede incluir otros reactivos requeridos para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico o para facilitar las evaluaciones del control de calidad, tales como amortiguadores, sales, enzimas, co-factores de las enzimas, sustratos de las enzimas, reactivos de detección, y similares. Otros componentes, tales como amortiguadores y soluciones para el aislamiento y/o ei tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, los reactivos de pretratamiento), también se pueden incluir en el kit. El kit adicionalmente puede incluir uno o más controles distintos. Uno o más de los componentes del kit pueden estar liofilizados, en cuyo caso el kit puede adicionalmente comprender reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los diversos componentes del kit opcionalmente se proporcionan en recipientes adecuados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtítulo. El kit adicionalmente puede incluir recipientes para retener o almacenar una muestra (por ejemplo, un recipiente o cartucho para una muestra de orina). Donde sea apropiado, el kit opcionalmente también puede contener recipientes de reacción, recipientes de mezclado, y otros componentes que facilitan la preparación de los reactivos o la muestra de prueba. El kit también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar a la obtención de una muestra de prueba, tal como una jeringa, pipeta, fórceps, cuchara medida, o similar.
Si la etiqueta detectable es al menos un compuesto de acridina, el kit puede comprender al menos una acridina-9-carboxamida, al menos un aril éster de acridina-9-carboxilato, o cualquier combinación de los mismos. Si la etiqueta detectable es al menos un compuesto de acridina, el kit también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como un amortiguador, una solución, y/o al menos una solución básica. Si se desea, el kit puede contener una fase sólida, tal como una partícula magnética, cuenta, tubo de ensayo, placa de microtítulo, cubeta, membrana, molécula de soporte, película, papel filtro, disco o chip.
I I I. Adaptación del Kit y el Método El kit (o los componentes del mismo), así como el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba mediante un ensayo, tal como un inmunoensayo como aquí se describe, se pueden adaptar para el uso en una variedad de sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en donde la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y como se vende comercialmente por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, I L) como ARCH ITECT®.
Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semi-automatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluyen el sustrato al cual el primer ligando específico (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) o una proteína de enlace a DVD anti-analito (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma) se une; de cualquier manera, la formación de emparedado y la reactividad del analito pueden ser afectadas), y la longitud y el tiempo de las etapas de captura, detección y/o cualquier etapa de lavado opcional. Mientras que un formato no automatizado, tal como ELISA, puede requerir un tiempo de incubación relativamente más largo con la muestra y el reactivo de captura (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCH ITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT®). De modo semejante, mientras que un formato no automatizado, tal como ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, tal como el reactivo conjugado, durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para el ARCHITECT®).
Otras plataformas disponibles a partir de Abbott Laboratories incluyen, pero no se limitan a, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,294,404), PRISM®, EIA (cuenta), y Quantum™ I I , así como otras plataformas. Adicionalmente, los ensayos, kits y componentes de los kits se pueden emplear en otros formatos, por ejemplo, en sistemas de ensayo electroquímicos u otros sistemas de ensayo manuales o de punto de cuidado. La presente divulgación es, por ejemplo, aplicable al sistema de inmunoensayo electroquímico comercial Punto de Cuidado de Abbott (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realiza inmunoensayos de emparedado. Los inmunodetectores y sus métodos de manufactura y operación en dispositivos de prueba de un solo uso se describen, por ejemplo en, la Patente Norteamericana No. 5,063,081 , Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0170881 , Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0018577, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0054078, y Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2006/01 60164.
En particular, con respecto a la adaptación de un ensayo del analito al sistema l-STAT®, la siguiente configuración es ejemplar. Un chip de silicio microfabricado se manufactura con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de cloruro de plata-plata. En uno de los electrodos de trabajo, cuentas de poliestireno (0.2 mm de diámetro) con anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito inmovilizado (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) o proteína de enlace a DVD anti-analito (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma), se adhieren a un recubrimiento polimérico de alcohol polivinílico patrón sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho l-STAT® con un formato fluídico adecuado para el ¡nmunoensayo. En una porción de la pared de la cámara del cartucho que retiene la muestra hay una capa que comprende un ligando específico para un anaiito, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo que puede enlazar al anaiito) o una proteína de enlace a DVD anti-analito (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma que puede enlazar al anaiito), cualquiera de los cuales se puede etiquetar de manera detectable. Dentro del saco de fluido del cartucho hay un reactivo acuoso que incluye fosfato de p-aminofenol.
En la operación, una muestra que se sospecha contiene un anaiito se agrega a la cámara de retención del cartucho de prueba, y el cartucho se inserta en el lector l-STAT®. Después de que el ligando específico para un anaiito se ha disuelto en la muestra, un elemento de bomba dentro del cartucho mete la muestra a la fuerza en un conducto que contiene el chip. Aquí se oscila para promover la formación del emparedado. En la penúltima etapa del ensayo, el fluido se fuerza fuera del saco y dentro del conducto para lavar la muestra fuera del chip y dentro de una cámara de desecho. En la etapa final del ensayo, la etiqueta de fosfatasa alcalina reacciona con el fosfato de p-aminofenol para escindir el grupo fosfato y permitir que el p-aminofenol liberado se oxide electroquímicamente en el electrodo de trabajo. Con base en la corriente medida, el lector es capaz de calcular la cantidad de anaiito en la muestra por medio de un algoritmo incorporado y la curva de calibración determinada en la fábrica.
Además, se sobreentiende que los métodos y los kits como aquí se describe necesariamente abarcan otros reactivos y métodos para llevar a cabo el inmunoensayo. Por ejemplo, se abarcan diversos amortiguadores tales como son conocidos en el arte y/o que se pueden preparar u optimizar fácilmente para ser empleados, por ejemplo, para lavado, como un diluente del conjugado, diluente de micropartículas, y/o como un diluente del calibrador. Un diluente del conjugado ejemplar es el diluente del conjugado ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) y que contiene ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), una sal, un bloqueador de proteínas, un agente antimicrobiano, y un detergente. Un diluente del calibrador ejemplar es el diluente del calibrador humano ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L), que comprende un amortiguador que contiene MES, otra sal, un bloqueador de proteínas, y un agente antimicrobiano. Adicionalmente, como se describe en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 12/650,241 (véase, también PCT/US2009/069846), la generación de señal mejorada se puede obtener, por ejemplo, en un formato de cartucho l-Stat, utilizando una secuencia de ácidos nucleicos asociada al anticuerpo señal como un amplificador de señal.
Será fácilmente aparente para aquellos expertos en el arte que son obvias otras adaptaciones y modificaciones adecuadas de los métodos aquí descritos y se puede realizar utilizando equivalentes adecuados sin desviarse del alcance o las modalidades aquí divulgadas.
Habiendo descrito ahora eso que se proporciona en detalle, lo mismo se comprenderá más claramente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen únicamente para propósitos de ilustración y no pretenden ser limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1 : Anticuerpos SOST Anti-Humanos Ejemplo 1.1 : Identificación de proteínas completamente humanas de enlace a esclerostina por sistemas de despliegue in vitro Ejemplo 1.1 .1 : Selecciones de Anticuerpos Anticuerpos monoclonales de esclerostina anti-humanos completamente humanos se aislaron por tecnologías de despliegue in vitro a partir de bibliotecas de anticuerpo humano por su capacidad para unirse a las proteínas de esclerostina humanas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada variable (VH) y ligera variable (VL) se determinaron a partir del secuenciamiento de DNA.
Ejemplo 1 .1.2: Maduración de afinidad de la proteína de enlace a esclerostina anti-humana completamente humana AE1 0-6 La proteína de enlace humana AE1 0-6 a esclerostina humana se maduró de afinidad por tecnología de despliegue in vitro. El alineamiento de secuencia mostró que el anticuerpo de Esclerostina AE10-6 porta la identidad más alta a las líneas germinales humanas VH 1 -24/JH 1 e IGKV7-46/J L2. Para mejorar la afinidad de AE 10-6 a Esclerostina, se identificaron residuos CDR hipermutados de otras secuencias de anticuerpo humano en la base de datos IgBLAST que también portan alta identidad a las líneas germinales VH 1 -24 e IGKV7-46. Los residuos de CDR AE 10-6 correspondientes entonces se sometieron a mutagénesis limitada por PCR con cebadores que tienen baja degeneración en estas posiciones para crear dos bibliotecas de anticuerpo en el formato scFv adecuado para despliegue de superficie. La primera biblioteca contiene mutaciones en los residuos 34, 51 , 54, 57 y 95 a 100c en CDR1 , 2 y 3 de VH (numeración Kabat); la segunda biblioteca en los residuos 27b, 29, 30, 52, 53, 55 y 91 a 96 en las tres CDRr de VL. Para incrementar además la identidad de AE1 0-6 a las secuencias de armazón de la línea germinal humana, se introdujeron degeneraciones binarias en las posiciones 30 (T/S), 50 (G/R) y 52 (D/N) en la primera biblioteca. También, la posición 105 de VH fue de línea germinal (P/Q) en la primera biblioteca. Se introdujeron degeneraciones binarias en las posiciones de VL 24 (K/R), 33 (V/L), 54 (R/L), 55 (H/Q), 56 (T/S), 91 (H/S) y 96 (F/Y) en la segunda biblioteca, (véase tabla 1 ). También, la posición 2 de la VL fue de línea germinal (T/A) en la segunda biblioteca.
La tabla de abajo (Tabla 5) proporciona una lista de secuencias de aminoácido de VH y VL de la proteína de enlace AE10-6 completamente humana las cuales se sometieron al protocolo de selección de maduración de afinidad. Los residuos de am inoácido de CDRs individuales de cada una de las secuencias VH y VL están indicados en negritas.
Tabla 5. Residuos de aminoácido encontrados durante la maduración de afinidad de anticuerpo AE 10-6 anti-Esclerostina Estas bibliotecas AE 1 0-6 fueron transformadas y desplegadas en las superficies celulares a ser seleccionadas contra una baja concentración de Escierostina biotinilada por clasificación celular activada por fluorescencia después magnética. Las selecciones para mejorar la constante de asociación, constante de disociación, o ambas se llevaron a cabo y las secuencias de proteína de anticuerpo de clones AE 1 0-6 modulados de afinidad se recuperaron de células y convirtieron nuevamente al formato IgG para caracterización adicional.
Las tablas abajo proporcionan una lista de secuencias de aminoácido de regiones VH (Tabla 6) y VL (Tabla 7) de anticuerpos de Escierostina humana completamente madurada de afinidad derivadas de AE 10-6. Los residuos de aminoácido de CDRs individuales de cada una de las secuencias de VH están indicados en negritas.
Tabla 6. Secuencias de VH de variantes AE1 0-6 de afinidad madurada Tabla 7. Secuencias de VL de variantes AE10-6 de afinidad madurada Las tablas a continuación proporcionan una lista de clones AE 1 0-6 los cuales se convierten en proteínas IgG para caracterización , tanto secuencias de VH (Tabla 8) como VL (Tabla 9) .
Tabla 8. Secuencias de clones convertidos de IgG Tabla 9. Secuencias de VL de clones convertidos de IgG Se prepararon pares de cadena pesada y ligera como sigue n la Tabla 10: Tabla 10. Pares de cadena pesada y ligera de clones de afinidad madurada de AE10-6 Ejemplo 1.1.3: Maduración de afinidad de la proteína de enlace a esclerostina anti-humana completamente humana MSL10 La proteína de enlace humana MSL10 a TNF humano fue madurada de afinidad por tecnología de despliegue in vitro. Las secuencias de VH y VL del anticuerpo MSL10 parental se proporcionan abajo.
VH de MSL10 Parental (SEC ID NO:2018) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDDYALHWVRQAP GKGLEWVSGISWHGDFIDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRVEDM AIYYCAGNNRGYGGLDVWGQGTTVTVSS VL de MSL 1 .1 Parental (SEC I D NO: 201 9) QSGLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPG TAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGS SGTSASLAI SG LQSEDEADYYCAAWD DSLNGSYVFGGGTKLTVL Para mejorar la afinidad de MSL10 a esclerostina, se identificaron residuos CDR h iperm utados de otras secuencias de anticuerpo humano en la base de datos IgBLAST que también porta alta identidad a l íneas germinales humanas . Los residuos de CDR MSL 1 0 correspond ientes fueron entonces sometidos a mutagénesis l imitada por PCR con cebadores que tienen baja degeneración en estas posiciones para crear dos bibliotecas de anticuerpo en el formato scFv adecuado para despliegue de superficie.
Las tablas abajo proporcionan una lista de secuencias de aminoácido de regiones de VH (Tabla 14) y VL (Tabla 1 5) de anticuerpos de esclerostina completamente humana de afinidad madurada derivados de MSL1 0. Los residuos de aminoácido de CDRs i nd ividuales de cada una de las secuencias de VH están indicados en negrita.
Tabla 14. Secuencias de VH de variantes MSL1 0 de afinidad madurada Tabla 15. Secuencias de VL de variantes MSL10 de afinidad madurada La tabla siguiente (Tabla 1 6) proporciona una lista de secuencias de aminoácido de VH y VL de u n anticuerpo MSL1 0 SOST completamente humano. Los residuos de am inoácido de CDRs individuales de cada una de las secuencias de VH y VL están indicados en negritas.
Tabla 1 6: Lista de Secuencias de Ami noácido de Regiones de VH y VL de Anticuerpos SOST Completamente Humanos Las secuencias de las CDR individuales de las regiones VH y VL de los anticuerpos SOST completamente humanos en la tabla anterior pueden ser alineados para proporcionar secuencias CDR de consenso tal como aquellas en la tabla siguiente (Tabla 17).
Tabla 1 7: Secuencias de consenso de CDRs de Anticuerpo SOST Ejemplo 1.2: Caracterización Funcional de Anticuerpos SOST Humanos Ejemplo 1.2.1: Protocolos de Ensayo Inmunosorbente Ligado a la Enzima (ELISA) de Esclerostina ELISA de Enlace Directo Se usó el siguiente protocolo para caracterizar el enlace de anticuerpos SOST a SOST humano por ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA). Las placas de ELISA se recubrieron con 50 µ? por cavidad de IgG-Fc anti-ratón de cabra a 2µg/ml durante la noche a 4°C (Jackson cat# 115-005-164). Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween. Se agregaron 50 µ? de anticuerpo diluido a "\[ig/m\ en PBS/0.1% de BSA a las cavidades apropiadas e incubó por 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween. Se agregaron 50 µ? de biotina-SOST diluida serial a cavidades apropiadas e incubó por 1 hora a TA. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween. Se agregaron 50 µ? de Estreptavidina (Thermo Scientific cat# 21126) diluida 1:10,000 en PBS/0.1% de BSA a las cavidades apropiadas e incubó por 1 hora a TA. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween. Se agregaron 50 µ? de TMB (Zymed cat# 002023) a las cavidades apropiadas y la reacción se dejó proceder por 1 minuto. La reacción se detuvo con 50µ? de H2S04 2N y se leyó la absorbancia a 450nm.
ELISA de Captura de Fe Anti-humana Se diluyó anticuerpo específico a Fe anti-humana en amortiguador de bicarbonato sódico 0.2 molar (pH 9.4) a 1pg/ml. Las placas se recubrieron con 100 µ? por cavidad a TA por 2 horas. Se condujo el bloqueo de capacidad de enlace adicional a TA por 1 hora por adición de 200µ? de 5% de leche seca sin grasa en PBS a cada cavidad. Después del lavado de laca, se agregaron 10?µ? de ?.dµ?/??? de anticuerpos individuales diluidos a cada cavidad por duplicado. Las placas se incubaron por 1 hora a TA y lavaron. Se agregaron 100µ I de 1:6 de esclerostina biotina rh serialmente diluida (rcino/rrat/rratón) de 100nM a 0.001nM a cada cavidad y la placa se incubó por TA por una hora. Después del lavado, se agregaron 1:10,000 de SA-HRP diluido a 120µ? por cavidad. Una incubación de 15 minutos con SA-HRP a TA se siguió por un lavado. Finalmente, 120 µ? de sustrato TMB de Invitrogen (CAT#00-2023 Lot#425820A) se agregaron a cada cavidad y se dejó desarrollar el color por 10 minutos. La reacción se detuvo con 60 µ? de ácido sulfúrico 2N. La placa se leyó a 450 nm, se recolectaron los datos y analizaron.
ELISA de Captura Anti-Biotina Se diluyó anti-biotina de cabra (Sigma CAT B3640-1MG) en amortiguador de bicarbonato sódico 0.2M (Pierce CAT 28382 Lot IA 109342) pH 9.4 a una concentración de *\vg/m\. La placa se recubrió a 100µ? por cavidad a TA por 2 horas. El bloqueo de la capacidad de enlace adicional se condujo a TA por 1 hora por adición de 200 µ? de 5% de leche seca sin grasa en PBS a cada cavidad. Después del lavado, 100µ I de 2µg/ml de esclerostina rh de biotina (rcino/rrata/rratón) se agregaron a cada cavidad. Las muestras se incubaron a TA por 1 hora.
Después del lavado de la placa, 10?µ? de anticuerpos 1 :6 serialmente diluidos se agregaron a las capas partiendo a 25pg/ml. Las muestras se incubaron a TA por una hora y la placa se lavó. Se agregó Fc-HRP antihumano diluido 1 :5000 (Jackson CAT#1 09-036-098) a 120µ? por cavidad e incubó a TA por 30 minutos. Después del lavado, se agregaron 120 µ? de sustrato TMB a cada cavidad (Invitrogen CAT#00-2023 Lot#425820A). El color se desarrolló por 5 a 1 0 minutos. La reacción se detuvo con 60 µ? de ácido sulfúrico 2N. La placa se leyó a 450nm, y los datos se recolectaron y analizaron. Se identificaron varios anticuerpos específicos de esclerostina usando este formato (Tabla 1 1 ).
Tabla 1 1 Anticuerpos de esclerostina Ejemplo 1.2.2: Ensayo de Neutralización de Trayectoria Wnt TopFlash Se usó el siguiente protocolo para valorar las propiedades neutralizantes de esclerostina de mAbs y proteínas de enlace-DVD vía restauración de la actividad de trayectoria Wnt inhibida por esclerostina. Células H EK 293A (Invitrogen, cat#:51 -0036, lot# 737470) fueron establemente transducidas con Lentivirus TopFlash (SA Biosciences, cat CLS 01 8L-1 ) y un clon 1 G6 seleccionado se infectó además con lentivirus Wnt-1 (Origene Cat# SC303644), que resulta en clones que co-expresan Luciferasa y Wnt-1 . Un clon estable doble (clon #14) se ha mantenido en medio de cultivo: DMEM (I nvitrogen Cat#1 1965-092) con 10% de FBS Calificado (Invitrogen Cat#26140-079), Pen-Estrep (Invitrogen Cat#1 5140-122), L-glutamina (Invitrogen Cat#25030-081 2mM final), Piruvato Sódico (Invitrogen Cat#1 1360-070 final 1 mM) y 2.5Mg/ml de Puromicina (I nvivogen Cat#ant-pr-1 ) en matraces T75 hasta 80-90% de confluencia al día del ensayo. El ensayo se realizó en medio de ensayo: medio de cultivo sin puromicina. Esclerostina humana (Abbott), esclerostina ciño (Abbott), esclerostina murina y esclerostina de rata se sometieron a alícuotas y almacenaron congeladas a -80°C. Al día 1 , las células del clon#14 se plaquearon a 1 0,000 células por cavidad en 50 ul de medio de ensayo en placas de 96 cavidades de fondo transparente, de lado negro, tratadas con cultivo de tejido (Costar #3603) e incubaron a 37°C durante la noche (20-24 hrs). Al siguiente día (día 2) la solución base de esclerostina se diluyó a 60nM (4X) para humano y ciño y 200 nM (4X) para ratón y rata, en el medio de ensayo. Los anticuerpos anti-esclerostina se diluyeron, usualmente iniciando a 800nM (4X) en el medio de ensayo. El medio se removió de las placas con células y reemplazó con 50 µ?/cavidad de medio de ensayo fresco. Las células se incubaron después por 1 hr con 25µ? de 60nM (4X) para esclerostina humana y ciño o 25 µ? de 200 nM para esclerostina de ratón y rata. Después estos anticuerpos anti-esclerostina (25µ? de 4X) se agregaron a las células y las placas se incubaron durante la noche a 37°C (20-24 hrs). El volumen final en cada cavidad es 100 µ?. Al siguiente día (día3) las células se lavaron una vez con 200µ? de PBS (RT). Se usó el Kit Promega Luciferase #E1 501 para lisis celular y lectura de Luciferasa. Brevemente, se diluyó reactivo de lisis celular 5X (Promega, cat #E153A) con agua milliQ a 1 X y se agregan 20 µ? a cada cavidad. Para asegurar una lisis completa, la placa se rotó 500 rpm por 20 min. Se agregaron 100 µ? de reactivo de ensayo de Luciferasa (1 vial cat #E1 51 A sustrato + 10ml cat #E152A de amortiguador de ensayo) a cada cavidad. La placa se leyó en una máquina TopCount (Programa: Luciferasa 96, Ensayo 17: lectura 1 seg/cavidad).
La esclerostina humana recombinante es neutralizada AE1 0-6 AM2, AE1 0-6 AM3, AE10-6 AM5, AE 1 0-6 AM6, AE 1 0-6 AM7, AE10-6 AM8 con IC50 de 1 .5-7.7 nM de esclerostina de mono cinomólogo recombinante con IC50 de 4.7-21 .1 nM. Esclerostina de ratón recombinante es neutralizada AE 10-6 AM3, AE 10-6 AM7, AE 10-6 AM8 con IC50 de 9.6-1 1 .7 nM de esclerostina de rata recombinante con IC50 de 12.1 a 15.7 nM. Esclerostina humana recombinante neutralizada con anticuerpos AM 1 -1 1 MSL10 con IC50 de 3-23.3 nM . Esclerostina de mono cinomólogo recombinante neutralizada MSL1 0 AM6, MSL1 0 AM7, MSL1 0 AM8, MSL10 AM9, MSL1 0 AM1 0, MSL10 AM 1 1 con IC50 de 1 3.5-29.7 nM.
Ejemplo 1 .2.3: Medición de Afinidad de Anticuerpos de Esclerostina por Resonancia de Plasmón de Superficie El enlace de anticuerpos o DVD anti-esclerostina-TNF a esclerostina humana recombinante purificada, mono cinomólogo (ciño), rata y ratón y TNFa se determinó por mediciones a base de resonancia de plasmón de superficie con un instrumento Biacore T100 o T200 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) usando corridas de HBS-EP+ (10 mM de HEPES [pH 7.4], 150 mM de NaCI, 3 mM de EDTA, y 0.005% de tensoactivo P20) que contienen 150 mM de NaCI, y/o 10 mg/ml de carboximetil dextrano adicionales, 0.1 mg/ml de BSA a 25°C. Todos los químicos se obtuvieron de GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA o de otro modo de una fuente diferente como se describe en el texto. Aproximadamente 10,000 RU (ó 3000 RU cuando se usa el chip CM3) de anticuerpo policlonal específico del fragmento IgG anti-humano o anti-ratón de cabra (Fcy) (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluido en 10 mM de acetato sódico (pH 4.5) se inmovilizaron directamente a través de un chip biosensor de grado de investigación CM5 (o CM3) usando un kit de acoplamiento de amina de conformidad con las instrucciones del fabricante y procedimientos a 15 µg/m\. Las porciones sin reaccionar de la superficie del biosensor se bloquearon con etanolamina. Se usaron superficies de carboximetil dextrano modificadas en celdas de flujo 2, 3 y 4 como una superficie de reacción. El carboximetil dextrano modificado en la celda de flujo 1 se usó como la superficie de referencia. Se usó el software Biaevaluation T100 versión 2.0.2, GE Healthcare Life Sciences para ajusfar simultáneamente las fases de asociación y disociación de todas las inyecciones (usando análisis de ajuste 1:1 con Rmax local). Los anticuerpos purificados se diluyeron en amortiguador de corrida para captura a través de las superficies de reacción específicas de IgG antihumano o anti-ratón de cabra. Los anticuerpos a ser capturados como un ligando (1 pg/ml) se inyectaron sobre matrices de reacción a una velocidad de flujo de 10 µ?/minuto. Se determinaron las constantes de velocidad de asociación y disociación, kasoc (unidad M-1s-1) y kdisoc (unidad s-1) bajo una velocidad de flujo continuo de 50 µ?/minuto. Las constantes de velocidad se derivaron haciendo mediciones de enlace cinético a 6 a 8 diferentes concentraciones de antígeno que varían desde 0.39-50 nM para antígenos de esclerostina y 0.195-25nM para TNF. Al final de cada ciclo las superficies se generaron con inyección 10s de 50mM de NaOH o/y por inyección 10s de 10mM de Glicina a pH1.5 a una velocidad de flujo de 100 µ?/min. Se usó software de Instrument Biaevaluation apropiado, GE Healthcare Life Sciences para ajustar simultáneamente las constantes de asociación y disociación así como también la KD (usando análisis de ajuste global 1:1 con Rmax local). Se registró el enlace como una función de tiempo y se calcularon las constantes de velocidad cinética. En este ensayo, las velocidades de asociación tan rápidas como 107 M s 1 y velocidades de disociación tan lentas como 106s"1 pueden ser medidas. En casos donde la constante de disociación para ciertos anticuerpos/proteínas de enlace-DVD fue más lenta que 10"6 s"1, el d se asume por ser menor o igual a 1*10-6 s-1 y el valor de KD se calcula bajo la presunción de tales que en tales casos se hizo dividiendo la constante de asociación por 1*10 e y se proporcionó como "al menos".
Las velocidades cinéticas y de afinidad de clones MSL10 anti-esclerostina para esclerostina humana y ciño se proporcionan en la Tabla 12 abajo, mientras las velocidades de cinética y afinidad de clones AE10-6 para todas las especies SOST (humana, ciño, rata y ratón) se proporcionan en la Tabla 13 (los clones MSL1 0 no se enlazan a esclerostina de ratón y rata).
Tabla 12. Velocidades de cinética y afinidad de clones MSL10 anti- esclerostina para SOST humano y Tabla 1 3. Velocidades de cinética y afinidad e clones AE 1 0-6 anti-esclerostina para SOST ciño y humano Ejem plo 2 : Análisis de Farmacocinética de Anticuerpos SOST en Rata Se l levaron a cabo estud ios de farmacocinética de anticuerpos SOST anti-humanos humanos en ratas Sprague Dawley. Las ratas macho se dosificaron intravenosamente con una dosis única de 4 mg/kg de proteínas de anticuerpo y las muestras de suero se analizaron usando el método MSD qu imioluminiscente a base de captura de antígeno (Meso Scale Discovery). Se calcularon los parámetros de farmacocinética por análisis no compartamental usando WinNonlin.
Ejemplo 2.2.1 : Preparación de Suero de Rata Se adquirieron ratas Sprague-Dawley macho regular (de aproximadamente siete semanas de edad, que pesan 240-390 gramos) y alteraron quirúrgicamente (vena yugular canulada, JVC) de Charles Rlver Laboratories (Wilmington, MA). Los animales se alojaron en habitaciones mantenidas a temperatura constante y humedad bajo un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad, alimentadas con alimento normal para roedor y se dejaron a alimento y agua a albedrío. Las condiciones clínicas y de hidratación de los animales son monitoreadas diariamente.
Se recolectaron muestras de sangre (0.2 mL) a varios puntos de tiempo, se dejaron coagular por 30 minutos a temperatura ambiente, y centrifugaron por 8 minutos a 1 3,200 rpm . El suero es transferido a tubos eppendorf y almacenado congelado a -80°C.
Ejemplo 2.2.2: Ensayo de MSD Usado para Cuantificar el Anticuerpo SOST en Muestras de Suero PK Se lavaron placas de estreptavidina de MSD (Meso Scale Discovery) con salina amortiguada de fosfato que contiene 0.05% de Tween-20 (diluida de 10X PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Room, Worcester, MA y Tween-20, Sigma, St. Louis, MO). Las placas son bloqueadas con 150 pL/cavidad de solución de bloqueo (MSD Block, Meso Scale Discovery, diluida a 3% de concentración final en PBS) por 1 hora, cubiertas, con sacudimiento (600 rpm) a temperatura ambiente.
Previo al análisis, las muestras de suero son descongeladas en hielo, mezcladas suavemente y centrifugadas a 14,000 rpm por 3 minutos a 4°C en una centrífuga eppendord. Se prepararon muestras de control y curva estándar en suero de rata. Las muestras de estudio, muestras de curva estándar, blancos y muestras de control de calidad se incubaron en solución en una placa de 96 cavidades de cavidad profunda de 2 ml_ separada (Corning , Corning, NY) 1 : 1 : 1 = V:V:V con SOST humana biotinilada (0.1 ug/mL en amortiguador de ensayo) e IgG anti-humano de cabra sulfo-etiquetado (Meso Scale Discovery, 1 pg/mL en amortiguador de ensayo) por 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras son entonces transferidas a las placas MSD e incubadas por una hora adicional con sacudimiento (600 rpm) a temperatura ambiente. Las placas de MSD son lavadas y desarrolladas con Amortiguador de lectura 2x (Meso Scale Discovery). La quimioluminiscencia se mide dentro de diez minutos en el MSD Sector Imager 6000.
Las curvas estándares son analizadas usando un ajuste logístico de cuatro parámetros y las concentraciones de muestra se calcularon por el software XLfit4 versión 2.2.1 Build 16, (Microsoft Corporation , Redmond, WA). Los parámetros de farmacocinética se calcularon para cada animal usando software Winonlin versión 5.0.1 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA) por análisis no compartamental.
Ejemplo 3: Generación de Proteínas de Enlace-DVD SOST/TNF Ejemplo 3.1: Construcción de Constructos de DNA de Proteína de Enlace-DVD SOST/TNF Los dominios variables de anticuerpo anti-TNF de anticuerpo humano D2E7, desinmunizado D2E7, anticuerpo de ratón o humanizado MAK199, y anticuerpo de ratón o humanizado MAK195 se combinaron con múltiples dominios variables de anticuerpo SOST traslapando la amplificación de PCR con secuencias de DNA enlazadoras de intervención. Los productos de PCR amplificados fueron subclonados en vectores de expresión adecuados para expresión temporal en células HEK293 y las regiones de armazón lectoras abiertas se confirmaron por secuenciamiento antes de la expresión de la proteína de enlace-DVD.
Ejemplo 3.2: Expresión y Producción de Proteínas de Enlace-DVD SOST/TNF Se secuenciaron todos los constructos de cDNA de proteína de enlace-DVD, expandidos en E. coli y purificados de DNA usando Qiagen Hispeed Maxi Preps (CAT#12662, QIAGEN). El DNA de la proteína de enlace-DVD se transfectó en células 293E de fase log (0.5 x106/ml, viabilidad >95%) mezclando PEI y DNA @ relación 2:1 con 0.2 pg/ml de DNA de cadena pesada y 0.3 pg/ml de DNA de cadena ligera. Se formó el complejo de DNA:PEI a temperatura ambiente en sujetador TC por quince minutos antes de agregar a las células 293E. Veinticuatro horas después, se agregó 0.5% de TN1 a las células 293E. Al día cinco, los sobrenadantes se recolectaron para mediciones de titulador IgG 1 humano. El sobrenadante celular se recolectó al día siete y filtró a través de un filtro PES de 0.2 µ?. El sobrenadante se purificó usando Cromatografía de Afinidad de Sefarosa de Proteína A de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las proteínas de enlace-DVD purificadas se eluyeron de la columna por 0.1 M de glicina (pH 2.99) , amortiguadas por tris-HCI 2M o fosfato y/o dializaron en 15 mM de amortiguador de histidina (pH 6.0) inmediatamente. Las proteínas de enlace fueron cuantificadas por A280 y analizadas por espectrometría de masas y SEC.
Ejemplo 3.3: Secuencias de Constructos de Enlace-DVD SOST/TNF Se determinaron secuencias de aminoácido de cadena pesada y cadena ligera de proteínas de enlace-DVD capaces de enlazar a SOST y TNF humano. Las secuencias de aminoácido de cadenas pesadas variables, cadenas ligeras variables, y regiones constantes de proteínas de enlace-DVD SOST/TNF, se proporcionan en la tabla siguiente (Tabla 18).
Tabla 18: Secuencias de Regiones Variable y Constante de Proteínas de enlace-DVD SOST/TNF Ejemplo 3.4: Afinidad de Enlace de DVD-lgs Para medición de enlace simultáneo de dos antígenos a DVD, se capturaron DVD-lgs en un FC hulgG anti cabra a 5 µ?/min por 1 minuto. La esclerotina a 50 nM entonces se inyectó sobre la superficie capturada a 5 µ?/min por 10 min, para saturar en enlace DVD, seguido por coinyección de TNF 50 nM a 5 µ?/min por 10 min para verificar el enlace TNF al DVD, el cual el cual ya tiene unida a esta esclerotina. La superficie se regeneró con 10 inyecciones de NaOH 50 mM seguido por 10 inyecciones de Glicina 10 mM pH 5 a una velocidad de flujo de 100 µ?/min. El mismo experimento se repitió en la secuencia inversa de los antígenos en donde primero se inyectó TNF seguido por coinyección de esclerotina. Se proporcionaron perfiles de enlace ejemplares para DVD-Ig (Figura 7A) y DVD2623 (Figura 7B) de MAK199-1-GS-AE10-6AM7.
La afinidad y parámetros de cinética del enlace DVD-lg a SOST y TNF se proporcionaron en la Tabla 19 posterior. Se proporciona la descripción detallada del método usada en la sección.
Tabla 19. Afinidad y parámetros del enlace DVD-lg a esclerotina y TNF Ejemplo 3.5: Ensayo de Neutralización de Esclerotina de Trayectoria TopFlash Wnt Se realizó el ensayo que demuestra la neutralización de inhibición de eslcerotina de la trayectoria Wnt como se describe anteriormente. Esclerotina humana recombinante inhibida DVD2603, DVD2605, DVD2606, DVD2607, DVD2608, DVD2610, DVD2611, DVD2623, DVD2627, DVD2628, DVD2630, DVD2631, DVD2642, DVD2643, DVD2645, DVD2646, DVD2647, DVD2648, DVD2650, DVD2651, DVD2657, DVD2658 con IC50 de 12-24.4 nM. Esclerotina humana recombinante inhibida con MAK199-1-GS-AE10-6 AM7, MAK199-1-SS-AE10-6 AM7, MAK199-1 -GS-AE10-6 AM7 QL, MAK195/21 -GS-AE10-6 AM3, MAK195/21 -GS-AE10-6 AM8, diD2E7ss-GS-AE10-6 AM7, D2E7-GS-AE10-6 AM7, AE10-6 AM7-GS MAK195/21 con IC50 de 1.7-6.6 nM y esclerotina de mono cinomólogo recombinante con IC50 de 2-9.1 nM. Esclerotina de ratón recombinante inhibida con MAK199-1-GS-AE10-6 AM7, MAK199-1 -SS-AE10-6 AM7, MAK195/21 -GS-AE10-6 AM7, MAK195/21-SS-AE10-6 AM7, MAK195/21 -GS-AE10-6 AM3, MAK195/21-GS-AE10-6 AM8, diD2E7ss-GS-AE10-6 AM7, D2E7-GS-AE10-6 AM7, AE10-6 AM7-GS MAK195/21 con IC50 de 9.4-27.6 nM.
Ejemplo 3.6: Neutralización de TNF-a recombinante Se evalúo la potencia de neutralización de TNF-a en Neutralización L929 del ensayo TNF recombinante. Se hicieron crecer células de fibroblasto de ratón L929 semi-confluente (ATCC, cat# CCL-1™) y se recolectaron usando 0.25% de tripsina (Gibco, cat# 25200-056). Las células se lavaron con PBS (Gibco, cat#14190-144), se cuantificaron y resuspendieron a 5 x 105 células/ml en medio de ensayo completo que consiste de RPMI 1640 (Gibco, cat# 21870), 10% de Sueron de Bovino Fetal (Hyclone, cat# SH30070.03) 1% de L-Glutamina (Gibco, cat# 25030), 1% de Piruvato de Sodio (Gibco, cat# 113670), 1% de Aminos no Esencial (Gibco, cat# 11140), 50 unidades/ml de Penicilina/50 pg/ml de Estreptomicina (Gibco, cat# 15140), 55 µ? de 2-BME (Mercaptoetanol-Gibco, cat# 21985), y una concentración 2x de 2 g/ml de actinomicina D (Sigma, cat# A1410). Las células se sembraron en una placa de 96 cavidades (Cstar, cat#3599) a un volumen de 100 µ? correspondiente a 5 x 104 células/cavidad. Se diluyeron anticuerpos monoclonales (mAb), DVD-lgs™ e IgG control a una concentración de 4x en medio de ensayo y se realizaron diluciones seriales. Se diluyó TNF-a recombinante a una concentración 4x de 600 pg/ml en medio de ensayo. Todas las muestras de anticuerpo (mAbs o DVD-lgs™) se pre-incubaron con TNF-a recombinante a una relación de volumen 1:1 y se dejó incubar por 1 hora a 37°C, 5% de C02. En algunos casos, también se agregó esclerotina humana recombinante a la etapa de pre-incubación. Para estas condiciones, se pre-incubaron diluciones 8x de DVD-lg™, TNF-a recombinante (1200 ng/ml) y esclerotina humana (400 nM) y 50 µ? de medio de ensayo completo por 1 hora a 37°C, 5% de C02.
Se agregaron cien µ? de la solución mAb o DVD-lg™/TNF-a recombinante a las células en las placas a 100 µ? para una concentración fina de 1x de 150 pg/ml de TNF-a recombinante o DVD-Ig™ y 1 Mg/ml de actinomicina D. En casos en donde se agregó esclerotina humana, se agregó 100 µ? de la solución DVD-lg™/TNF-a recombinante/esclerotina humana/medio a las células en placas a 100 µ? para una concentración fina de 1x de 150 pg/ml de TNF-a recombinante, mAb o DVD-lg™, esclerotina humana (50 nM) y 1 µg/ml de actinomicina D. Las placas se incubaron durante la noche (16-24 horas) a 37°C, 5% de C02. Para cuantificar la viabilidad, se removieron 100 µ? de las cavidades y se agregó 10 µ? del reactivo WST-1 (Roche, cat# 11644807001). Las placas se incubaron a 37°C, 5% de C02 por unas 3-5 horas adicionales y se leyeron en un lector de placa ELISA Spectromax 190 a 420-600 nm OD. Los datos de neutralización se graficaron usando GraphPad Prism. Se calcularon los valores IC5o reportados usando el software de dosis de la curva sigmoidal GraphPad Prism y se proporcionaron en la Tabla 20 posterior.
Tabla 20. Neutral ización de TN F-a Recombinante Para demostrar que el enlace de esclerotina a los DVD-lg no afectan las propiedades de neutralización de TNF-a de las moléculas, los DVD-lg sin primero pre-incubados con SOST 50 nM al menos por 30 minutos y entonces se realiza el ensayo L929 con SOST 50 n M a través del experimento. Los resultados de este experimento se proporcionan la Tabla 21 posterior.
Tabla 21 . Ejemplo de comparación de neutralización TNF-a con y SOST 50 nM Ejemplo 4: Análisis de farmacocinética (PK) para DVD Ig TNF/Esclerotina Ratas JVC Sprague-Dawley machos que pesaron aproximadamente 280 g recibieron una dosis sola en la vena yugular con el DVD-lg o en anticuerpo parental a 5 mg/kg. Se recolectaron muestras de suero de la vena de la cola a 15 minutos, 4 y 24 horas, y 2, 3, 7, 10, 14, 21 y 28 días después de la dosificación. Las muestras de suero se congelaron a -80°C hasta en análisis.
Ratones CD1 machos que pesaron aproximadamente 28 g recobieron una dosis sola por la vena de la cola con el DVD-lg o en alticuerpo parental a 5 mg/kg. Se recolectaron muestras de sangre completa de la vena de la cola a 1 y 24 horas, y 4, 7, 1 0, 14 y 21 días después de la dosificación. Las muestras se congelaron a -80°C hasta en análisis.
Se realizaron bioanálisis de las muestras usando un ensayo MSD. Brevemente, se revistieron placas de estreptavidina con antígenos humanos biotinilados y se incubaron durante la noche. Las placas se bloquearon, y se agregaron las muestras de suero diluidas (concnetración de suero final fue 1 %) a las cavidades, y se usaron IgG anti-humano de cabra etiquetadas con Sulto-tag para detección. Se calcularon los parámetros de farmacocinética para cada animal con el software WinNonlin Versión 5.2.1 por análisis no compartimental usando ajuste trapezoidal lineal. Los parámetros PK obtenidos en ratón y rata se proporcionan en las Tablas 22 y 23 posteriores, respectivamente Tabla 22. Parámetros PK en Ratón Tabla 23. Parámetros PK en Rata Ejemplo 5: Evaluación de Dominios DVD Domains para Eficacia In Vivo Los dominios anti-esclerostina de los DVDs se evaluaron para eficacia in vivo usando un modelo PD agudo. Todos los DVD-lgs probados inducen formación de hueso incrementada en base al incremento en el biomarcador óseo, PINP. Se trataron ratones macho DBA/1 sin tratamiento, mayor de 10 semanas de edad, con una dosis única de DVD-lg, i.p. Tres días después de la inyección, se recolectó suero por medio de punción cardiaca y se probaron los niveles del biomarcados de formación ósea, PINP, por ELISA. Todos los DVD-lgs probados inducen incremento en la formación de hueso en base al incremento en niveles de suero del biomarcador óseo, PINP. Véase Tabla 24.
Tabla 24 Los dominios anti-TNF de los DVD se evaluaron para eficacia in vivo en un modelo de letalidad TFN humano/D-Galactosamina en el cual ratones hembra C57B16 sin tratamiento se trataron con el DVD, i. p. Dieciocho horas después de la dosis, los animales se estimularon con 0.5 g/ratón de TN F y 20 mg/ratón de D-Galactosamina intraperitonealmente y los animales se monitorearon dos veces al día para sobrevivencia. Los dominios TNF en todos los DVD-lg probados están activos y protegen a los ratones de TNF letalmente inducido. Véase Tabla 25.
Tabla 25 Eficacia de Anti-TNF, Anti-SOST, y Terapias Combinadas de anti-TNF y anti-SOST en un modelo de ratón con artritis inducida Las terapias de anti-TNF, anti-SOST, y terapias combinadas de anti-TNF y anti-SOST fueron evaluadas por su eficacia en la prevención de la artritis en un modelo de ratón de artritis inducida. Los ratones fueron inmunizados con colágeno en el día 0, reforzados con una inyección intraperitoneal de zimosan en el día 21 , y seleccionados en busca de signos clínicos de artritis los días 24-28 Los ratones fueron tratados a continuación, a partir del días de la inscripción con un terapéutico anti-TNF (anti-TNF, 1 2 mg/kg, inyección subcutánea, dos veces por semana) , un agente terapéutico (30 mg/kg, inyección subcutánea, dos veces por semana) anti- esclerostina, o los dos agentes terapéuticos combinados. Los ratones se evaluaron los cambios en el espesor de la pata en un período de 20 días, y en el día 44 a 48, el suero y los huesos se recogieron para el análisis de punto final. Como se muestra en la Figura 2A, los ratones tratados con el anticuerpo anti-TNF o las terapias combinadas exhiben menos inflamación de la pata que el grupo de control tratado con 0.9 % de solución salina . Además, el tratamiento combinado con terapias anti-TNF y anti-esclerostina mantuvieron o aumentaron el espesor del hueso tanto en el tobillo como en la columna vertebral, respectivamente, tal como se mide por micro-CT (Figuras 2B y 2C).
Se probó la neutralización de TNF y SOST en un modelo de artritis inducida (CIA) por colágeno de ratón terapéutico en el cual la terapia inicia cinco días después del comienzo de la inflamación, un punto de tiempo en el cual ha ocurrido pérdida de hueso moderada. Se inmunizaron ratones DBA/1 con colágeno en el día 0, y se reforzaron con Zymosan en el día 21 . A partir de los días 24-28 los ratones se matricularon en el estudio a base de los primeros signos clínicos de artritis. Cinco días después de la matricula, los ratones se dosificaron con 12 mg/kg de una mAb TNB anti-ratón, 30 mg/kg de una mAb anti-esclerotina, o una combinación de ambas mAbs dos veces por semana por dos semanas. La inflamación se monitoreó por medio de inchazón de la pata usando calibrador. El análisis CT micro de tobillos y espina se usaon para evaluar cambios en volumen/densidas ósea al término del estudio. Se sacrificó un grupo de ratones inmunizados en el día 5 después de los primeros signos de inflamación y la cantidad de pérdida de hueso en este punto de tiempo se valoró usando tomografía micro-computarizada (µ??). Como se demuestra en la Figura (4a) el tratamiento con tratamiento anti-TNF es efectivo para prevenir la inflamación cuando el tratamiento inicia a los 5 días después del comienzo de la enfermedad. El tratamiento con ya sea mAbs anti-TNA o con anti-esclerotina solo no previene la pérdida de hueso del tobillo artrítico, también la combinación de ambos mAbs protege de la pérdida de hueso adicional en este sitio (Figura 4b). En contraste, mientras la inhibición de TNF no protege el hueso esquelético, el hueso se restaura a niveles parecidos a los de los animales sin tratamiento en la espina de animales tratados con mAb anti-esclerotina, ya sea solo o en combinación con mAb anti-TNF (Figura 4c).
Ya que la inhibición de TNF es inefectivo en controlar la inflamación en el modelo CIA de ratón, se usó un mecanismo antiinflamatorio alternativo para probar la capacidad de la inhibición de esclerotina para restaurar hueso en la articulación artrítica. La inhibición de ll_- 1 a y I L- 1 b combinada bloquea la inflamación cuando la dosificación comienza cinco días después del inicio de la inflamación para un estudio en el cual los ratones se inmunizaron con colágeno al día 0, se reforzaron con una inyección intraperitoneal de Zymosan en el día 21 , y seleccionado por signos clínicos de artritis a partir de los días 24-28. Los ratones se trataron dos veces a la semana a partir de los cinco días después del comienzo de la inflamación con terapéutico anti-IL 1 a (9 mg/kg, ip) y anti-I L 1 ß (4.5 mg/kg, ip), anti-esclerotina (30 mg/kg, ¡p) o una combinación de todos los tres mAbs. Se monitoreó la hinchazón de la pata durante los 20 días de tratamiento, después de lo cual se recolectaron suero y huesos para el análisis de punto final. La actividad anti-inflamatoria lograda con la inhibición combinada de I L-1 a e I L- 1 b es demostrada en la Figura 5a. El análisis CT micro del tobillo artrítico mostró que el bloqueo de inflamación combinada con la inhibición de esclerotina permite la restauración del hueso en el tobillo artrítico (Figura 5b). El análisis de hueso trabecular de las espinas lumbar de estos animales que muestran que la inhibición de esclerotina es capaz de restaurar el hueso esquelético solo o en combinación con bloqueo de inflamación (Figura 5c).
Ejemplo 6: Eficacia de Terapias anti-TNF, Anti-Esclerostina y Anti-TNF y Anti-Esclerostina Combinadas en un Modelo de Ratón de la Enfermedad de Crohn La pérdida de hueso esquelético es una co-morbidad común en pacientes con enfermedad de Crohn. Se probaron mAb anti-esclerotina, mAb anti-TNF y la combinación de ambos Abs en un modelo de rató de enfermedad de Crohn y se midieron los cambios en hueso trabecular en la espina lumbar.
Se recolectaron esplenocitos de ratones BALB/c hembras (Taconic) por ruptura mecánica y enriquecido para células CD4+ usando un kit de perlilla magnética de selección negativa (StemCell). Las células CD4+ purificadas se tiñeron con anti-GITR (receptor de la familia TNF inducido por glucocorticoide) etiquetado con fluoresceína (R&D Systems). Las células se analizaron por FACS (MoFlow Legacy) y se recolectaron menos del 40% de células teñidas con GITR. El análisis post-clasificación mostró que la población es CD4+GITR" con 95-98% de pureza. Las células se lavaron, re-suspendieron y 5x105 células se inyectaron i. p. , en ratones scid CB-17 hembras (Taconic). Los ratones receptores se monitorearon 2-3 veces/semana para peso corporal, presencia de pérdida o sangre en las heces, prolapso rectal y condición general. Un cohorte de animales se sacrificó en el Día 27 (día de inicio del tratamiento) por análisis histológico de colon y examen µ?? de espinas para determinar la enfermedad de línea base. El tratamiento consiste de dos inyecciones a la semana del vehículo (PBS), anti-TNF (15 mg/kg ip), anti-esclerotina (30 mg/kg ip) o ambos anti-TNF y anti-esclerotina, y se continuó hasta que el estudio se terminó en el Día 57 después de la inyección celular. Los animales se sacrificaron: se recolectó suero y se almacenó a -20°C hasta que se usó para determinación de niveles del anticuerpo. Se recolectaron los colon, se lavaron con PBS para remover la materia fecal , se pesaron y midieron, se colocaron en cásete histológico usando la técnica rodillo swiss, y se almacenaron en formalina al 10% hasta el procesamiento. Después se incrustaron con rapafina, las secciones se tiñeron con hemotoxilina y eosina, y se registró para la presencia de inflamación, daño de cripta, úlceras en mucosa y prolongación de la enfermedad. Existen 8 o 9 animales por grupo. Los animales que perdieron más del 20% de peso corporal inicial se sacrificaron de conformidad con las guías de IACUC. Adicionalmente, se recolectaron las espinas y se analizó el hueso trabecular en las vértebras L5 usando µ??. Anti-TNF solo o en combinación con mAb anti-esclerotina inhibe la inflamación intestinal mientras que mAb anti-esclerotina no (Figura 5a). En contraste, el tratamiento con mAb anti-esclerotina, solo o en combinación con anti-TNF fue capaz de restaurar pérdida de hueso en la espina lumbar a niveles parecidos en un animal sin tratamiento (Figura 5b) .
Incorporación por Referencia Las técnicas bien conocidas en el campo de biología molecular, suministro de fármaco, inmunología, biología molecular y biología celular se incorporan por referencia en su totalidad. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, técnicas descritas en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY ( 1 993); Ausubel, F. M. et al. eds. , Short Protocols In Molecular Biology (4ta Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938-X). Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1 984); Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed. , pp. 20 1 -16, Oxford University Press, New York, N .Y. , (1 999); Goodson , in Medical Applications of Controlled Reléase, vol. 2, pp. 1 1 5-1 38 (1984); Hammerling, et al. , in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y. , 1 981 ; Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed . 1 988); Kabat et al. , Secuencias de Proteins of Immunological I nterest (National Institutes of Health, Bethesda , Md. (1 987) y (1991 ); Kabat, E. A. , et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U. S. Department of Health and Human Services, NI H Publication No. 91 -3242; Kontermann y Dubel eds. , Antibody Engíneering (2001 ) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5); Kriegler, Gene Transfer y Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY ( 1990); Lu and Weiner eds. , Cloning y Expression Vectors for Gene Function Analyses (2001 ) BioTechniques Press. Westborough, Mass. 298 pp. (ISBN 1 -881299-21 -X), Medical Applications of Controlled Reléase, Langer and Wise (eds.), CRC Pres. , Boca Ratón, Fia. (1974); Oíd, R. W. & S. B. Primrose, Principies of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engíneering (3a Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01 31 8-4) ; Sambrook, J. et al. eds. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1 -3 (ISBN 0-87969-309-6); Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978; Winnacker, E. L. From Genes To Clones: I ntroduction To Gene Technology (1 987) VCH Publishers, N .Y. (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).
Además, los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de literatura, patentes, solicitudes de patente y sitios web) que pueden ser citados a través de esta solicitud son por la presente expresamente incorporadas por referencia en su totalidad para cualquier propósito, como las referencias citadas en la presente.
Equivalentes Lo que se proporciona puede ser expresado en otras formas sin apartarse del espíritu o características esenciales de lo mismo. Las modalidades precedentes descritas en la presente son por lo tanto consideradas en todos los respectos ilustrativas más que limitantes. El alcance es así indicado por las reivindicaciones anexas más que por la descripción precedentes, y todos los cambios que llegan dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones son por lo tanto planeadas para ser incluidas en la presente

Claims (65)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de enlace caracterizada porque comprende un dominio de enlace al antígeno capaz de enlazar esclerostina humana, el dominio de enlace al antígeno comprende al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de consenso.
2. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una CDR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de residuos 31-35 de la SEC ID NO: 3; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 3; residuos 99-108 de la SEC ID NO:3; residuos 23-34 de la SEC ID NO: 4; residuos 51-57 de la SEC ID NO: 4; residuos 90-101 de la SEC ID NO:4; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 5; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 5; residuos 99-115 de la SEC ID NO:5; residuos 23-33 de la SEC ID NO: 6; residuos 49-55 de la SEC ID NO: 6; residuos 88-96 de la SEC ID NO:6; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 7; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 7; residuos 99-107 de la SEC ID NO:7¡ residuos 23-33 de la SEC ID NO: 8; residuos 49-55 de la SEC ID NO: 8; residuos 88-95 de la SEC ID NO:8; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 9; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 9; residuos 99-107 de la SEC ID NO:9; residuos 24-39 de la SEC ID NO: 10; residuos 55-61 de la SEC ID NO: 10; residuos 94-112 de la SEC ID NO:10; residuos 31-35 de la SEC ID NO: 11; residuos 50-66 de la SEC ID NO: 11; residuos 99-111 de la SEC ID NO: 11; residuos 24-39 de la SEC ID NO: 12; residuos 55-61 de la SEC ID NO: 12; residuos 94-113 de la SEC ID N0:12; residuos 31-37 de la SEC ID NO: 13; residuos 52-69 de la SEC ID NO: 13; residuos 102-122 de la SEC ID NO:13; residuos 24-34 de la SEC ID NO: 14; residuos 50-56 de la SEC ID NO: 14; residuos 89-97 de la SEC ID NO:14; Residuos 31-35 de la SEC ID NO:1998; Residuos 50-66 de la SEC ID NO:1998; Residuos 99-110 de la SEC ID NO:1998; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:1999; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:1999; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:1999; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2000; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2000; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2000; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2001; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2001; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2001; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2002; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2002; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2002; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2003; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2003; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2003; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2004; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2004; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2004; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2005; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2005; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2005; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2006; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2006; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2006; Residuos 31-35 de la SEC ID NO.:2007; Residuos 50-66 de la SEC ID NO.:2007; Residuos 99-110 de la SEC ID NO.:2007; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2009; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2009; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2009; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2008; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2010; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2010; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2011; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2011; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2011; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2012; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2012; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2012; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2013; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2013; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2013; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2014; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2014; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2014; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2015; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2015; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2015; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2016; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2016; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2016; Residuos 23-36 de la SEC ID NO.:2017; Residuos 52-58 de la SEC ID NO.:2017; Residuos 101-109 de la SEC ID NO.:2017; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2020; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2020; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2020; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2021; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2021; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2021; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2022; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2022; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2022; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2023; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2023; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2023; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2024; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2024; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2024; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2025; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2025; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2025; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2026; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2026; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2026; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2027; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2027; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2027; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2028; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2028; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2028; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2029; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2029; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2029; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2030; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2030; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2030; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2031; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2031; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2031; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2032; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2032; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2032; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2033; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2033; Residuos 99 - 108 de la SEC ID NO:2033; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO:2034; Residuos 50 - 66 de la SEC ID NO:2034; Residuos 99 - 110 de la SEC ID NO.2034; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2035; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2035; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2035; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2036; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2036; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2036; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2037; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2035; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2037; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2038; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2038; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2038; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2039; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2039; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2039; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2040; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2040; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2040; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2041; Residuos 51-57 de la SEC ID NO..2041; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2041; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2042; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2042; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2042; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2043; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2043¡ Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2043; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2044; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2044; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2044; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2045; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2045; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2045; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2046; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2046; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2046; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2047; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2047; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2047; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2048; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2048; Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2048; Residuos 31 - 35 de la SEC ID NO.:2049; Residuos 51-57 de la SEC ID NO.:2049; y Residuos 90-101 de la SEC ID NO.:2049.
3. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína de enlace comprende al menos 3 CDRs.
4. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos 3 CDRs comprenden una serie de CDR de dominio variable seleccionada del grupo que consiste de:
5. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende al menos dos series de CDR de dominio variable.
6. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque al menos dos series de CDR de dominio variable son seleccionadas del grupo que consiste de Serie de CDR MSL1 0 de VH y la Serie de CDR MSL10 de VL; Serie de CDR MSL17 de VH y la Serie de CDR MSL1 7 de VL; Serie de CDR MSL9-8 de VH y la Serie de CDR MSL9-8 de VL; Serie de CDR MSK9 de VH and Serie de CDR MSK9 de VL; Serie CDR de MSK1 3 de VH y la Serie CDR de MSK1 3 de VL; Serie de CDR MSK21 de VH o Serie de CDR MSK21 de VL; Serie CDR de VH AE10-6 AM 1 y Serie CDR de VL AE10-6 AM 1 ; Serie CDR de VH AE1 0-6 AM2 y Serie CDR de VL AE10-6 AM2; Serie CDR de VH AE10-6 AM3 y Serie CDR de VL AE 1 0-6 AM3; Serie CDR de VH AE10-6 AM4 y Serie CDR de VL AE10-6 AM4; Serie CDR de VH AE10-6 AM5 y Serie CDR de VL AE 10-6 AM5; Serie CDR de VH AE10-6 AM6 y Serie CDR de VL AE10-6 AM6; Serie CDR de VH AE10-6 AM7 y Serie CDR de VL AE 10-6 AM7; Serie CDR de VH AE10-6 AM8 y Serie CDR de VL AE10-6 AM8; Serie CDR de VH AE10-6 AM9 y Serie CDR de VL AE 10-6 AM9; Serie CDR de VH AE1 0-6 AM 1 0 y Serie CDR de VL AE10-6 AM 10; Serie CDR de VH MSL10 AM 1 y Serie CDR de VL MSL10 AM 1 ; Serie CDR de VH MSL1 0 AM2 y Serie CDR de VL MSL10 AM2; Serie CDR de VH MSL10 AM3 y Serie CDR de VL MSL10 AM3; Serie CDR de VH MSL1 0 AM4 y Serie CDR de VL MSL1 0 AM4; Serie CDR de VH MSL10 AM5 y Serie CDR de VL MSL10 AM5; Serie CDR de VH MSL10 AM6 y Serie CDR de VL MSL10 AM6; Serie CDR de VH MSL10 AM7 y Serie CDR de VL MSL10 AM7; Serie CDR de VH MSL10 AM8 y Serie CDR de VL MSL10 A 8; Serie CDR de VH MSL10 AM9 y Serie CDR de VL MSL10 AM9; Serie CDR de VH MSL10 AM10 y Serie CDR de VL MSL10 A 10; Serie CDR de VH MSL10 AM1.2 y Serie CDR de VL MSL10 AM1.2; Serie CDR de VH MSL10 AM2.2 y Serie CDR de VL MSL10 AM2.2; Serie CDR de VH MSL10 AM3.2 y Serie CDR de VL MSL10 AM3.2; y Serie CDR de VH MSL10 AM4.2 y Serie CDR de VL MSL10 AM4.2.
7. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace comprende al menos un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14; SEC ID NOs 1719-1866; SEC ID NOs1867-1997; SEC ID NOs 1998-2007; SEC ID NOs 2008-2017; SEC ID NOs 2020-2034; y SEC ID NOs 2035-2049.
8. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer dominio variable comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs 3, 5, 7, 9, 11, 13, 1719-1866, 1998-2007, 2018, y 2020-2034 y en donde el segundo dominio variable comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS 4, 6, 8, 10, 12, 1867-1997, 2007-2017, 2019, y 2035-2049.
9. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace: (a) es capaz de modular una función biológica de esclerostina; (b) es capaz de neutralizar esclerostina; (c) en donde la esclerostina es esclerostina pro-humana; esclerostina humana-madura, o esclerostina humana-truncada; (d) en donde la proteína de enlace disminuye la capacidad de la esclerostina para unirse a su receptor; y/o (e) en donde la proteína de enlace neutralizante es capaz de reducir uno o más de modulación de Th1 ; modulación de Th2; modulación de Nk; modulación de neutrófilo; modulación de linaje monocito-macrófago; modulación de neutrófilo; modulación de eosinofilo; modulación de células B; modulación de citocina; modulación de quimíocina; modulación de molécula de adhesión; y modulación de reclutamiento celular.
10. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de asociación ( KaSoc) a esclerostina de al menos aproximadamente 1 02M 1 s 1 ; al menos aproximadamente 1 03M 1 s ; al menos aproximadamente 1 04M 1s 1 ; al menos aproximadamente 105M"1s" 1 ; o al menos aproximadamente 106M 1 s 1 ; como se mide por resonancia de plasmón de superficie.
1 1 . La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de desunión ( Kdisoc) a esclerostina de a lo sumo aproximadamente 10 3s"1 ; a lo sumo aproximadamente 10 4s 1 ; a lo sumo aproximadamente 10"5s"1; o a lo sumo aproximadamente 106s"\ como se mide por resonancia de plasmón de superficie.
12. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de disociación (KD) a esclerostina de a lo sumo aproximadamente 10~7 M; a lo sumo aproximadamente 108 M; a lo sumo aproximadamente 109 M; a lo sumo aproximadamente 1010 M; a lo sumo aproximadamente 10"11 M; a lo sumo aproximadamente 1012 M; y a lo sumo 10"13 M.
13. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica la secuencia de aminoácidosde la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1.
14. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13.
15. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 15.
16. Un método para producir una proteína capaz de enlazarse a esclerostina, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16 en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de enlace capaz de enlazarse a esclerostina.
17. Una proteína caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 16.
18. Un método para tratar un mamífero, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 17.
19. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 , y un portador farmacéuticamente aceptable.
20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 9, caracterizada porque comprende además al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en los cuales la actividad de esclerostina es perjudicial.
21 . La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el agente adicional es seleccionado del grupo que consiste de un agente terapéutico, agente de imagen, agente citotóxico, inhibidores de la angiogénesis; inhibidores de cinasa; bloqueadores de molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; etiqueta detectable o reportero; un antagonista del TNF; un anti-reumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscuiar, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un esteroide oral , una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citosina.
22. Un método para reducir la actividad de esclerostina humana caracterizado porque comprende poner en contacto la esclerostina humana con la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 , de manera que la actividad de esclerostina humana se reduce.
23. Un método para reducir la actividad de esclerostina humana en un sujeto humano que sufre de un trastorno en los cuales la actividad de esclerostina es perjudicial, caracterizado porque comprende administrar al sujeto humano la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 de manera que la actividad de esclerostina humana en el sujeto humano se reduce.
24. Un método caracterizado porque es para tratar un sujeto para una enfermedad o un trastorno en los cuales la actividad de esclerostina es perjudicial administrando al sujeto la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 de manera que se logra el tratamiento.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el trastorno es seleccionado del grupo que consiste de un trastorno respiratorio; asma; asma alérgica y no alérgica; asma debido a infección; asma debido a infección con virus sincitial respiratorio (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una condición que involucra inflamación de las vías respiratorias; eosinofilia; fibrosis y/o exceso de producción de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición inflamatoria y/o autoinmune de la piel; una condición inflamatoria y/o autoinmune de órganos gastrointestinales; enfermedad inflamatoria del intestino (I BD); colitis ulcerativa; enfermedad de Crohn; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática causada por virus de hepatitis B y/o C; escleroderma; tumores; un cáncer; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma Hodgkin; una infección viral; infección por HTLV-1 (por ejemplo, de HTLV-1 ); una supresión de la expresión de respuesta inmune tipo 1 protectora, y una supresión de la expresión de respuestas inmunes tipo 1 protectoras durante la vacunación.
26. Un método para tratar un paciente que sufre de un trastorno en los cuales la esclerostina es perjudicial caracterizado porque comprende la etapa de administrar la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1 antes, concurrente, o después de la administración de un segundo agente, en donde el segundo agente es seleccionado del grupo que consiste de un esteroide inhalado; un beta-agonista; un beta-agonista de corta acción o acción prolongada; un antagonista de leucotrienos o receptores de leucotrieno; ADVAI R; un inhibidor de IgE; un anticuerpo anti-lgE; XOLAI R; un inhibidor de fosfodiesterasa; un inhibidor de PDE4; una xantina; un fármaco anticolinérgico; un agente estabilizante de células mástil; Cromolina; un inhibidor I L-4; un inhibidor I L-5; un inhibidor de eotaxina/CCR3; un antagonista de histamina o sus receptores que incluyen H 1 , H2, H3, y H4; un antagonista de prostaglandina D o sus receptores DP1 y CRTH2; un antagonista del TNF; un fragmento soluble de un receptor de TNF; ENBREL; un antagonista de la enzima del TNF; un inhibidor de la enzima que convierte el TNF (TACE); un antagonista del receptor muscarínico; un antagonista TGF-beta; una gamma-interferón; perfenidona; un agente quimioterapéutico, metotrexato; leflunomida; sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, CCI-779; inhibidores COX2 o cPLA2; un NSAIDs; un inmunomodulador; un inhibidor p38; inhibidores TPL-2, MK-2 y NFkB; budesónido; factor de crecimiento epidermal; un corticosteroide; ciclosporina; sulfasalazina; un aminosalicilato; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; un inhibidor de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; un antioxidante; un inhibidor de tromboxano; un antagonista del receptor IL-1; un anticuerpo anti-IL-1 ß; un anticuerpo anti-IL-6; un factor de crecimiento; un inhibidor de elastasa; un compuesto de piridinil-imidazol; un anticuerpo o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF, o PDGF; un anticuerpo de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos; FK506; rapamicina; mofetil micofenolato; ibuprofeno; prednisolona; un inhibidor de fosfodiesterasa; un agonista de adenosina; un agente antitrombótico; un inhibidor del complemento; un agente adrenérgico; un inhibidor de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP; un inhibidor de la enzima que convierte I L- 1 ß ; un inhibidor de la enzima que convierte TNF-a; un inhibidor de la señalización de células-T; un inhibidor de metaloproteinasa; una 6-mercaptopurina; un inhibidor de la enzima que convierte angiotensina; un receptor de citocina soluble; un receptor TNF p55 soluble; un receptor TNF p75 soluble; si L-1 Rl ; sIL-1RII; SIL-6R; una citocina anti-inflamatoria; IL-4; IL-10; IL-11; SOST; y TGF-ß.
27. Una proteína de enlace caracterizada porque comprende una cadena de polipéptido, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en la cual VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición de que no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde (a) VD1 o VD2 comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624y 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y la proteína de enlace es capaz de unirse a esclerostina y a otro objetivo; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y eslcerostina; (c) VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, y 1682, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, y 1682, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse al TNF- y esclerostina.
28. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque VD1 -(X1 )n-VD2 comprende una secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 1661, 1671, y 1681.
29. Una proteína de enlace caracterizada porque comprende una cadena de polipéptido, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición de que no sea CL; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde (a) VD1 o VD2 comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y a otro objetivo; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, y 637, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, y 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a TNF-a y esclerostina.
30. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la VD1-(X1)n-VD2 comprende una secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236, 246, 256, 266, 276, 286, 296, 306, 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, 386, 396, 406, 416, 426, 436, 446, 456, 466, 476, 486, 496, 506, 516, 526, 536, 546, 556, 566, 576, 586, 596, 606, 616, 626, 636, 646, 656, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 756, 766, 776, 786, 796, 806, 816, 826, 836, 846, 856, 866, 876, 886, 896, 906, 916, 926, 936, 946, 956, 966, 976, 986, 996, 1006, 1116, 1126, 1136, 1146, 1156, 1166, 1176, 1186, 1196, 1206, 1216, 1226, 1236, 1246, 1256, 1266, 1276, 1286, 1296, 1306, 1316, 1326, 1336, 1346, 1356, 1366, 1376, 1386, 1396, 1406, 1416, 1426, 1436, 1446, 1456, 1466, 1476, 1486, 1496, 1506, 1516, 1526, 1536, 1546, 1556, 1566, 1576, 1586, 1596, 1606, 1616, 1626, 1636, 1646, 1656, 1666, 1676, y 1686.
31. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque (X1)n es (X1)0 y/o (X2)n es (X2)0.
32. Una proteína de enlace caracterizada porque comprende primera y segunda cadenas de polipéptido, en donde la primer cadena de polipéptido comprende un primer VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2) 1 ; y en donde la segunda cadena de polipéptido comprende un segundo VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo enlazador; X2 no comprende una región Fe; (X1 )n es (X1 )0 o (X1 ) 1 ; (X2)n es (X2)0 o (X2) 1 ; y en donde el primer y segundo enlazador X1 son el mismo o diferentes; en donde el primer enlazador X1 no es CH 1 y/o el segundo enlazador X1 no es CL y en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 1 04, 1 14, 124, 1 34, 144, 154, 164, 174, 1 84, 1 94, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1 024, 1034, 1044, 1 054, 1064, 1074, 1084, 1 094, 1 1 14, 1 124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y a otro objetivo; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, y 1682; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, y 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, y 1682; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1 537, 1 547, 1557, 1567, 1 577, 1587, 1 597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, y 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a TNF-a y esclerostina.
33. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 28, 29 o 32, caracterizada porque X1 o X2 es una secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste de la SEC I D NO: 1695, 1696, 1697, 1698, 1699, 1 700, 1 701 , 1702, 1703, 1 704, 1705, 1706, 1707, 1708, 1709, 1710, 1 71 1 , 1712, 1713, 1714, 1715, 1716, 2050, 2051 , 2052, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, y 2059.
34. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la proteína de enlace comprende dos primeras cadenas de polipéptidos y dos segundas cadenas de polipéptidos.
35. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 28, 29 o 32, caracterizada porque la región Fe es una región Fe de secuencia variante.
36. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 28, 29 o 32, caracterizada porque la región Fe es seleccionada del grupo que consiste de un IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.
37. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 28, 29 o 32, caracterizada porque la VD1 de la primera cadena de polipéptido y la VD1 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen del primero y segundo anticuerpo parental, respectivamente, o porción de enlace al antígeno del mismo.
38. La proteína de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 o 32, caracterizada porque en anticuerpo anti-TNF-a se une a TNF-a con una potencia diferente de la potencia con la cual el anticuerpo anti-esclerostina se une a esclerostina humana.
39. La proteína de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 o 32, caracterizada porque el anticuerpo anti-TNF-a se une a TNF-a con una afinidad diferente de la afinidad con la cual el anticuerpo anti-esclerostina se une a esclerostina humana.
40. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 28, 29 o 32, caracterizada porque la proteína de enlace posee al menos una propiedad deseada exhibida por el anticuerpo anti-TNF-a o el anticuerpo anti-esclerostina relacionado con la especificidad al antígeno, afinidad al antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento al epítope, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinéticas, biodisponibilidad, reactividad cruzada del tejido, o enlace al antígeno ortólogo.
41 . Una proteína de enlace capaz de enlazar dos antígenos que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, caracterizada porque dos cadenas de polipéptidos comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde dos cadenas de polipéptidos comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo eniazador; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y en donde el primero y segundo eniazador X1 son los mismos o diferentes; en donde el primer eniazador X1 no es CH1 y/o el segundo eniazador X1 no es CL y en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y la proteína de enlace es capaz de unirse a esclerostina y a otro objetivo; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y esclerostina; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, y 1682; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, y 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse a esclerostina y TNF-a; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, 804, 814, 824, 834, 844, 854, 864, 874, 884, 894, 904, 914, 924, 934, 944, 954, 964, 974, 984, 994, 1004, 1014, 1024, 1034, 1044, 1054, 1064, 1074, 1084, 1094, 1114, 1124, 1134, 1144, 1154, 1164, 1174, 1184, 1194, 1204, 1214, 1224, 1234, 1244, 1254, 1264, 1274, 1284, 1294, 1304, 1314, 1324, 1334, 1344, 1354, 1364, 1374, 1384, 1394, 1404, 1414, 1424, 1434, 1444, 1454, 1464, 1474, 1484, 1494, 1504, 1514, 1524, 1534, 1544, 1554, 1564, 1574, 1584, 1594, 1604, 1614, 1624, 1634, 1644, 1654, 1664, 1674, y 1684, y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, 792, 802, 812, 822, 832, 842, 852, 862, 872, 882, 892, 902, 912, 922, 932, 942, 952, 962, 972, 982, 992, 1002, 1012, 1022, 1032, 1042, 1052, 1062, 1072, 1082, 1092, 1102, 1112, 1122, 1132, 1142, 1152, 1162, 1172, 1182, 1192, 1202, 1212, 1222, 1232, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1242, 1252, 1262, 1272, 1282, 1292, 1302, 1312, 1322, 1332, 1342, 1352, 1362, 1372, 1382, 1392, 1402, 1412, 1422, 1432, 1442, 1452, 1462, 1472, 1482, 1492, 1502, 1512, 1522, 1532, 1542, 1552, 1562, 1572, 1582, 1592, 1602, 1612, 1622, 1632, 1642, 1652, 1662, 1672, y 1682; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 529, 539, 549, 559, 569, 579, 589, 599, 609, 619, 629, 639, 649, 659, 669, 679, 689, 699, 709, 719, 729, 739, 749, 759, 769, 779, 789, 799, 809, 819, 829, 839, 849, 859, 869, 879, 889, 899, 909, 919, 929, 939, 949, 959, 969, 979, 989, 999, 1009, 1019, 1029, 1039, 1049, 1059, 1069, 1079, 1089, 1099, 1109, 1119, 1129, 1139, 1149, 1159, 1169, 1179, 1189, 1199, 1209, 1219, 1229, 1239, 1249, 1259, 1269, 1279, 1289, 1299, 1309, 1319, 1329, 1339, 1349, 1359, 1369, 1379, 1389, 1399, 1409, 1419, 1429, 1439, 1449, 1459, 1469, 1479. 1489, 1499, 1509, 1519, 1529, 1539, 1549, 1559, 1569, 1579, 1589, 1599, 1609, 1619, 1629, 1639, 1649, 1659, 1669, 1679, y 1689, y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, 797, 807, 817, 827, 837, 847, 857, 867, 877, 887, 897, 907, 917, 927, 937, 947, 957, 967, 977, 987, 997, 1007, 1017, 1027, 1037, 1047, 1057, 1067, 1077, 1087, 1097, 1107, 1117, 1127, 1137, 1147, 1157, 1167, 1177, 1187, 1197, 1207, 1217, 1227, 1237, 1247, 1257, 1267, 1277, 1287, 1297, 1307, 1317, 1327, 1337, 1347, 1357, 1367, 1377, 1387, 1397, 1407, 1417, 1427, 1437, 1447, 1457, 1467, 1477, 1487, 1497, 1507, 1517, 1527, 1537, 1547, 1557, 1567, 1577, 1587, 1597, 1607, 1617, 1627, 1637, 1647, 1657, 1667, 1677, y 1687, y la proteína de enlace es capaz de enlazarse al TNF-a y esclerostina.
42. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de asociación (Kasoc) a uno o más objetivos de al menos aproximadamente 102M'1s 1; al menos aproximadamente 103M"1s"1; al menos aproximadamente 104M"1s 1; al menos aproximadamente 105M~1s"1; o al menos aproximadamente 106M 1s"\ como se mide por resonancia de plasmón de superficie.
43. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de desunión (Kdisoc) a uno o más objetivos de a lo sumo aproximadamente 103s 1; a lo sumo aproximadamente 10" 4s"1; a lo sumo aproximadamente 105s ; o a lo sumo aproximadamente 10'6s 1, como se mide por resonancia de plasmón de superficie.
44. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de disociación (KD) a uno o más objetivos de a lo sumo aproximadamente 107 M; a lo sumo aproximadamente 108 M; a lo sumo aproximadamente 10"9 ; a lo sumo aproximadamente 10"10 M; a lo sumo aproximadamente 10 1 M; a lo sumo aproximadamente 10~12 M; o a lo sumo 10"13 M.
45. Un constructo de proteína de enlace caracterizado porque comprende una secuencia de proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 que comprende además un polipéptido enlazador y/o un dominio constante de inmunoglobulina.
46. El constructo de proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la proteína de enlace es una molécula de inmunoglobulina, un Fv enlazado a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, a scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo injertado a CDR, un anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, a Fab, un anticuerpo específico dual, a Fab', un anticuerpo biespecífico, a F(ab')2, a Fv, o una proteína de enlace-DVD.
47. El constructo de enlace de proteína de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la proteína de enlace comprende un dominio constante IgM humano, un dominio constante lgG4 humano, un dominio constante IgG 1 humano, un dominio constante IgE humano, un dominio constante lgG2 humano, un dominio constante lgG3 humano, o un dominio constante IgA humano.
48. El constructo de enlace de proteína de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende un dominio constante de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste de la SEC I D NO: 1691 , SEC I D NO: 1692, SEC I D NO: 1693, y SEC I D NO: 1694.
49. Un conjugado de enlace de proteína caracterizado porque comprende un constructo de proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 , el conjugado de proteína de enlace comprende además una molécula de inmunoadhesión , un agente de imagen, un agente terapéutico, o un agente citotóxico.
50. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica una secuencia de aminoácidosde la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 .
51 . Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica una secuencia de aminoácidosde constructo de proteína de enlace a esclerostina de conformidad con la reivindicación 50.
52. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51 .
53. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 52.
54. Un método para producir una proteína capaz de enlazarse a esclerostina, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 53, en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de enlace capaz de enlazarse a esclerostina.
55. Una proteína caracterizada porque es producida por el método de conformidad con la reivindicación 54.
56. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 , y un portador farmacéuticamente aceptable.
57. Un método para tratar un mamífero caracterizado porque comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 56.
58. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque comprende además al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en los cuales la actividad de esclerostina es perjudicial.
59. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque el agente adicional es seleccionado del grupo que consiste de un agente terapéutico, agente de imagen, agente citotóxico, inhibidores de la angiogénesis; inhibidores de cinasa; bloqueadores de molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; etiqueta detectable o reportero; un antagonista del TNF; un anti-reumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo (NSAI D), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una erítropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citosina.
60. Un método para reducir la actividad de esclerostina humana caracterizado porque comprende poner en contacto la esclerostina humana con la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 de manera que la actividad de esclerostina humana se reduce.
61 . Un método para reducir la actividad de esclerostina humana en un sujeto humano que sufre de un trastorno en los cuales la actividad de esclerostina es perjudicial, caracterizado porque comprende administrar al sujeto humano la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 de manera que la actividad de esclerostina humana en el sujeto humano se reduce.
62. Un método caracterizado porque es para tratar un sujeto para una enfermedad o un trastorno en los cuales la actividad de esclerostina es perjudicial administrando al sujeto la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 de manera que se logra el tratamiento.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el trastorno es seleccionado del grupo que consiste de un trastorno respiratorio; asma; asma alérgica y no alérgica; asma debido a infección; asma debido a infección con virus sincitial respiratorio (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una condición que involucra inflamación de las vías respiratorias; eosinofilia; fibrosis y/o exceso de producción de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición inflamatoria y/o autoinmune de la piel; una condición inflamatoria y/o autoinmune de órganos gastrointestinales; enfermedad inflamatoria del intestino (I BD); colitis ulcerativa; enfermedad de Crohn; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática causada por virus de hepatitis B y/o C; escleroderma; tumores; un cáncer; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma Hodgkin; una infección viral; infección por HTLV-1 (por ejemplo, de HTLV-1 ); una supresión de la expresión de respuesta inmune tipo 1 protectora, y una supresión de la expresión de respuestas inmunes tipo 1 protectoras durante la vacunación.
64. Un método para tratar un paciente que sufre de un trastorno en los cuales la esclerostina es perjudicial, caracterizado porque comprende la etapa de administrar la proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, 29, 32 o 41 antes, concurrente, o después de la administración de un segundo agente, en donde el segundo agente es seleccionado del grupo que consiste de un esteroide inhalado; un beta-agonista; un beta-agonista de corta acción o acción prolongada; un antagonista de leucotrienos o receptores de leucotrieno; ADVAI R; un inhibidor de IgE; un anticuerpo anti-lgE; XOLAIR; un inhibidor de fosfodiesterasa; un inhibidor de PDE4; una xantina; un fármaco anticolinérgico; un agente estabilizante de células mástil; Cromolina; un inhibidor IL-4; un inhibidor IL-5; un inhibidor de eotaxina/CCR3; un antagonista de histamina o sus receptores que incluyen H 1 , H2, H3, y H4; un antagonista de prostaglandina D o sus receptores DP 1 y CRTH2; un antagonista del TNF; un fragmento soluble de un receptor de TNF; ENBREL; un antagonista de la enzima del TNF; un inhibidor de la enzima que convierte el TNF (TACE); un antagonista del receptor muscarínico; un antagonista TGF-beta; una gamma- interferón; perfenidona; un agente quimioterapéutico, metotrexato; leflunómido; sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, CCI-779; inhibidores COX2 o cPLA2; un NSAIDs; un inmunomodulador; un inhibidor p38; inhibidores TPL-2, MK-2 y NFkB; budesónido; factor de crecimiento epidermal; un corticosteroide; ciclosporina; sulfasalazina; un aminosalicilato; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; un inhibidor de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; un antioxidante; un inhibidor de tromboxano; un antagonista del receptor IL-1; un anticuerpo anti-l L-1 B; un anticuerpo anti-IL-6; un factor de crecimiento; un inhibidor de elastasa; un compuesto de piridinil-imidazol; un anticuerpo o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF, o PDGF; un anticuerpo de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos; FK506; rapamicina; mofetil micofenolato; ibuprofeno; prednisolona; un inhibidor de fosfodiesterasa; un agonista de adenosina; un agente antitrombótico; un inhibidor del complemento; un agente adrenérgico; un inhibidor de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP; un inhibidor de la enzima que convierte IL-?ß; un inhibidor de la enzima que convierte TNF-a; un inhibidor de la señalización de células-T; un inhibidor de metaloproteinasa; una 6-mercaptopurina; un inhibidor de la enzima que convierte angiotensina; un receptor de citocina soluble; un receptor TNF p55 soluble; un receptor TNF p75 soluble; si L-1 Rl ; sIL-1RII; slL-6R; una citocina anti-inflamatoria; IL-4; IL-10; IL-11; SOST; y TGF-ß.
65. Un método para generar una proteína de enlace-DVD caracterizado porque comprende las etapas de a) obtener un primer anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, capaz de enlazarse a TNF-a; b) obtener un segundo anticuerpo parental o porción de enlace al antígeno del mismo, capaz de enlazarse a esclerostina humana; c) construir cadenas de polipéptidos que comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27, 29, 32 o 41 ; e) expresar las cadenas de polipéptidos; de manera que se genera una proteína de enlace-DVD.
MX2014004977A 2011-10-24 2012-10-24 Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina. MX2014004977A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161550724P 2011-10-24 2011-10-24
PCT/US2012/061666 WO2013063095A1 (en) 2011-10-24 2012-10-24 Immunobinders directed against sclerostin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2014004977A true MX2014004977A (es) 2014-09-11

Family

ID=47144147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014004977A MX2014004977A (es) 2011-10-24 2012-10-24 Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8999331B2 (es)
EP (1) EP2771360A1 (es)
JP (1) JP2014533659A (es)
CN (1) CN104203978A (es)
AR (1) AR088513A1 (es)
CA (1) CA2853258A1 (es)
HK (1) HK1200322A1 (es)
MX (1) MX2014004977A (es)
RU (1) RU2014120981A (es)
SG (1) SG11201401791WA (es)
TW (1) TW201323440A (es)
UY (1) UY34411A (es)
WO (1) WO2013063095A1 (es)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110014607A (ko) * 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CN102112494A (zh) 2008-06-03 2011-06-29 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2010006060A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2011127141A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Abbott Laboratories TNF-α BINDING PROTEINS
UY33543A (es) 2010-08-03 2012-02-29 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
BR112013004581A2 (pt) 2010-08-26 2017-06-27 Abbvie Inc imunoglobulinas de domínio variável dual e seus usos
AR084210A1 (es) * 2010-12-08 2013-05-02 Abbott Lab PROTEINAS DE UNION AL TNF-a
AU2012328921B2 (en) 2011-10-24 2017-05-11 Abbvie Inc. Immunobinders directed against TNF
SG11201401796SA (en) 2011-10-24 2014-10-30 Abbvie Inc Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
AU2012362326A1 (en) 2011-12-30 2014-07-24 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against IL-13 and/or IL-17
AR093311A1 (es) 2012-11-01 2015-05-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual contra el factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y el ligando involucrado en la señalizacion celula a celula a traves del receptor notch (dll4)
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
AR096601A1 (es) 2013-06-21 2016-01-20 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso
US9562101B2 (en) * 2013-06-21 2017-02-07 Novartis Ag Lectin-like oxidized LDL receptor 1 antibodies and methods of use
ES2866935T3 (es) 2014-01-10 2021-10-20 Anaptysbio Inc Anticuerpos dirigidos contra interleucina-33 (IL-33)
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
US10078778B2 (en) * 2015-01-15 2018-09-18 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and apparatus for in vitro single-cell identification and recovery
US10449250B2 (en) 2015-03-13 2019-10-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-sclerostin antibody, antigen binding fragment and medical use thereof
WO2016191246A2 (en) * 2015-05-22 2016-12-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibodies specific for a prame peptide
AU2016270373A1 (en) 2015-06-05 2018-01-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
MY196095A (en) 2016-03-23 2023-03-14 Seoul Nat Univ R&Db Foundation Antibody That Binds to Envelope Glycoprotein of Severe Fever With Thrombocytopenia Syndrome Virus and use for Same
BR112019005725A2 (pt) * 2016-09-23 2019-07-09 Abbvie Inc ajuste de dose
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN110167531A (zh) * 2017-01-11 2019-08-23 赛特瑞恩股份有限公司 稳定的液体调配物
CN108101984B (zh) * 2017-12-18 2019-10-15 中国人民解放军总医院 骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途
WO2019143585A1 (en) * 2018-01-17 2019-07-25 Eli Lilly And Company Compounds and methods targeting interleukin-19
FR3080376B1 (fr) * 2018-04-20 2022-12-09 Lab Francais Du Fractionnement Autoanticorps hautement sialyles et leurs utilisations
CN113891896B (zh) * 2019-05-07 2023-09-26 庄亚(北京)生物科技有限公司 单域抗体融合蛋白及其在止血中的应用
EP3982997A4 (en) * 2019-06-14 2023-09-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ANTIBODIES TO PD-1 AND METHOD OF USE THEREOF
CN118175993A (zh) * 2021-11-30 2024-06-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗sost抗体药物组合物及其用途

Family Cites Families (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
DE3587814T2 (de) 1985-03-30 1994-11-10 Marc Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
ATE111083T1 (de) 1986-10-22 1994-09-15 Abbott Lab Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze.
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5006309A (en) 1988-04-22 1991-04-09 Abbott Laboratories Immunoassay device with liquid transfer between wells by washing
US5089424A (en) 1988-06-14 1992-02-18 Abbott Laboratories Method and apparatus for heterogeneous chemiluminescence assay
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA1340288C (en) 1988-09-02 1998-12-29 Robert Charles Ladner Generation and selection of novel binding proteins
US5241070A (en) 1988-09-26 1993-08-31 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof
SE462454B (sv) 1988-11-10 1990-06-25 Pharmacia Ab Maetyta foer anvaendning i biosensorer
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5063081A (en) 1988-11-14 1991-11-05 I-Stat Corporation Method of manufacturing a plurality of uniform microfabricated sensing devices having an immobilized ligand receptor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
AU642932B2 (en) 1989-11-06 1993-11-04 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ES2139598T3 (es) 1990-07-10 2000-02-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
CA2048302A1 (en) 1990-08-15 1992-02-16 Victoria P. Meucci Solubilization reagent for biological test samples
US5135875A (en) 1990-08-15 1992-08-04 Abbott Laboratories Protein precipitation reagent
DE69130647T2 (de) 1990-08-24 1999-05-06 Ixsys, Inc., San Diego, Calif. Verfahren zur herstellung von oligonukleotiden mit regellosen codonen
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
WO1992011272A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
ES2330052T3 (es) 1991-03-01 2009-12-03 Dyax Corporation Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas.
CA2082160C (en) 1991-03-06 2003-05-06 Mary M. Bendig Humanised and chimeric monoclonal antibodies
EP1471142B1 (en) 1991-04-10 2008-11-19 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
AU666852B2 (en) 1991-05-01 1996-02-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
CA2069530A1 (en) 1991-06-03 1992-12-04 Cass J. Grandone Reagent pack for immunoassays
AU2238292A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
CA2119930C (en) 1991-09-23 2002-10-01 Hendricus R. J. M. Hoogenboom Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993020442A1 (en) 1992-03-30 1993-10-14 Abbott Laboratories Reagents and methods for the detection and quantification of thyroxine in fluid samples
US5352803A (en) 1992-03-30 1994-10-04 Abbott Laboratories 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
AU6132994A (en) 1993-02-02 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5565352A (en) 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
AU696293B2 (en) 1993-12-08 1998-09-03 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
AU3272695A (en) 1994-08-12 1996-03-07 Immunomedics Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0831880A4 (en) 1995-06-07 2004-12-01 Imclone Systems Inc ANTIBODIES AND FRAGMENTS OF ANTIBODIES INHIBITING TUMOR GROWTH
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US6331431B1 (en) 1995-11-28 2001-12-18 Ixsys, Inc. Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
PT929578E (pt) 1996-02-09 2003-09-30 Abbott Lab Bermuda Ltd Anticorpos humanos que se ligam a tnfalfa humano
US5985320A (en) 1996-03-04 1999-11-16 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
CA2277801C (en) 1997-01-16 2002-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
EP0971946B1 (en) 1997-01-21 2006-07-05 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
WO1999006834A2 (en) 1997-08-04 1999-02-11 Ixsys, Incorporated Methods for identifying ligand specific binding molecules
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
ATE340870T1 (de) 1998-04-03 2006-10-15 Compound Therapeutics Inc Adressierbare protein arrays
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
KR100617337B1 (ko) 1998-12-23 2006-08-31 화이자 인크. Ｃｔｌａ－４에 대한 인간 단일클론 항체
WO2000056934A1 (en) 1999-03-24 2000-09-28 Packard Bioscience Company Continuous porous matrix arrays
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CN101333256A (zh) 1999-03-25 2008-12-31 艾博特股份有限两合公司 结合人il-12的人抗体及其生产方法
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
CA2400868C (en) 2000-02-25 2012-12-04 Ira Pastan Anti-egfrviii scfvs with improved cytotoxicity and yield, immunotoxins based thereon, and methods of use thereof
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
EP1278778A2 (en) 2000-05-03 2003-01-29 Amgen Inc., Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
AU2001258567A1 (en) 2000-05-19 2001-11-26 Scancell Limited Humanised antibodies to the epidermal growth factor receptor
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
DE60114830T2 (de) 2000-06-28 2006-08-03 Glycofi, Inc. Verfahren zur herstellung modifizierter glycoproteine
PE20020132A1 (es) 2000-06-29 2002-03-04 Abbott Lab Anticuerpos de especificidad doble y metodos para la elaboracion y el uso de los mismos
KR20100031769A (ko) 2000-12-28 2010-03-24 알투스 파마슈티컬스 인코포레이티드 전항체 및 이의 단편의 결정과 이의 제조 및 사용 방법
EP1432444A4 (en) 2001-08-17 2005-11-02 Lilly Co Eli ANTI-BETA ANTIBODIES
JP4578098B2 (ja) 2001-10-01 2010-11-10 ダイアックス、コープ 多重鎖真核ディスプレイベクターとその使用
CN100423777C (zh) 2001-10-25 2008-10-08 杰南技术公司 糖蛋白组合物
WO2003039486A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
US7419821B2 (en) 2002-03-05 2008-09-02 I-Stat Corporation Apparatus and methods for analyte measurement and immunoassay
ES2442615T5 (es) 2002-07-18 2023-03-16 Merus Nv Producción recombinante de mezclas de anticuerpos
US20040018577A1 (en) 2002-07-29 2004-01-29 Emerson Campbell John Lewis Multiple hybrid immunoassay
ES2347239T3 (es) 2002-12-02 2010-10-27 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.
PL2405015T3 (pl) 2003-03-05 2016-09-30 Rozpuszczalna glikoproteina o aktywności hialuronizady (sHASEGP), sposób jej wytwarzania, jej zastosowania i zawierające ją kompozycje farmaceutyczne
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP1636270B1 (en) * 2003-06-16 2016-07-20 UCB Pharma S.A. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US20050042664A1 (en) 2003-08-22 2005-02-24 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US7723099B2 (en) 2003-09-10 2010-05-25 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with immuno-reference electrode
US7682833B2 (en) 2003-09-10 2010-03-23 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with improved sample closure
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
EP1769003A1 (en) 2004-07-06 2007-04-04 Bioren, Inc. HIGH AFFINITY ANTI-TNF-alpha ANTIBODIES AND METHOD
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
JP5364870B2 (ja) 2005-08-19 2013-12-11 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
NZ571757A (en) 2006-04-21 2012-01-12 Novartis Ag Antagonist anti-CD40 antibody pharmaceutical compositions comprising arginine-HCl and a citrate or citric acid buffer
US7883855B2 (en) 2006-07-21 2011-02-08 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
WO2008061013A2 (en) 2006-11-10 2008-05-22 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
WO2008133722A2 (en) 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
WO2008082984A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Non-denaturing lysis reagent for use with capture-in-solution immunoassay
ES2446293T3 (es) * 2007-03-20 2014-03-07 Eli Lilly & Company Anticuerpos anti-esclerostina
US7906293B2 (en) 2007-04-09 2011-03-15 Abbott Laboratories Acridinium phenyl esters useful in the analysis of biological
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
MX2010007729A (es) 2008-01-15 2010-08-04 Abbott Lab Vectores de expresion de mamifero mejorados y uso de los mismos.
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
EP2297209A4 (en) * 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
RU2015132478A (ru) 2009-03-05 2015-12-10 Эббви Инк. Связывающие il-17 белки
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011127141A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Abbott Laboratories TNF-α BINDING PROTEINS
UY33543A (es) 2010-08-03 2012-02-29 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CN103221257B (zh) 2010-10-07 2017-12-12 佛吉亚汽车座椅有限责任公司 用于改进座椅结构和环境配置的获取、分析和使用乘员身体规格的系统、方法和部件
AR084210A1 (es) 2010-12-08 2013-05-02 Abbott Lab PROTEINAS DE UNION AL TNF-a
AU2012328921B2 (en) 2011-10-24 2017-05-11 Abbvie Inc. Immunobinders directed against TNF
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
US8999331B2 (en) 2015-04-07
CN104203978A (zh) 2014-12-10
TW201323440A (zh) 2013-06-16
HK1200322A1 (en) 2015-08-07
UY34411A (es) 2013-05-31
AR088513A1 (es) 2014-06-18
EP2771360A1 (en) 2014-09-03
US20150266977A1 (en) 2015-09-24
US20130171096A1 (en) 2013-07-04
WO2013063095A1 (en) 2013-05-02
RU2014120981A (ru) 2015-12-10
CA2853258A1 (en) 2013-05-02
JP2014533659A (ja) 2014-12-15
SG11201401791WA (en) 2014-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8999331B2 (en) Immunobinders directed against sclerostin
US9481735B2 (en) IL-17 binding proteins
AU2011293253B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8716450B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
DK2571532T3 (en) IL-1 BINDING PROTEINS
AU2010310565B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20150104452A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20140234208A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120014957A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120258108A1 (en) Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US20090304693A1 (en) Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP3002299A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100074900A1 (en) Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2011005953A (es) Inmunoglobulinas de dominio variable dual y usos de las mismas.
MX2013007332A (es) Inmunoglobulinas de dominio variable doble biespecificas de il-1 alfa y beta y su uso.
MX2014006160A (es) Proteinas de union de il-1.
AU2016222339B2 (en) IL-1 binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
FA Abandonment or withdrawal