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MX2011005669A - Anticuerpos humanos contra el factor tisular. - Google Patents

Anticuerpos humanos contra el factor tisular.

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MX2011005669A
MX2011005669A MX2011005669A MX2011005669A MX2011005669A MX 2011005669 A MX2011005669 A MX 2011005669A MX 2011005669 A MX2011005669 A MX 2011005669A MX 2011005669 A MX2011005669 A MX 2011005669A MX 2011005669 A MX2011005669 A MX 2011005669A
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antibody
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amino acid
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MX2011005669A
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Ole Baadsgaard
Paul Parren
Tom Vink
Willem Karel Bleeker
Sandra Verploegen
David P E Satijn
Rene M A Hoet
Vibeke Miller Breinholt
Eva Ehrnrooth
Mischa Houtkamp
Maroeska Oudshoorn
Rob N De Jong
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Genmab As
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Publication date
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Abstract

Se dan a conocer anticuerpos monoclonales, humanos, aislados los cuales se enlazan al TF humano y composiciones y moléculas relacionadas a base de los anticuerpos. También se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos y métodos terapéuticos y de diagnóstico para utilizar los anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS HUMANOS CONTRA EL FACTOR TISULAR Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos al factor tisular en particular al factor tisular humano, y usos de estos anticuerpos, en particular su uso en el tratamiento del cáncer, inflamación y enfermedades vasculares .
Antecedentes de la Invención El factor tisular (TF, por sus siglas en inglés) , también llamado tromboplastina , factor III o CD142 es una proteína que está presente en el tejido subendotelial , plaquetas y leucocitos necesarios para el inicio de la formación de trombina a partir del zimogen protrombina. La formación de trombina conduce finalmente a la coagulación de la sangre. El factor tisular hace posible que las células inicien las cascadas de coagulación de la sangre y funciona como el receptor de alta afinidad para el factor de coagulación VII. El complejo resultante proporciona un evento catalítico que es responsable del inicio de las cascadas de proteasa de coagulación por medio de la proteólisis limitada, específica. A diferencia de los otros cofactores de estas cascadas de proteasa, los cuales circulan como precursores no funcionales, este factor es un potente iniciador que es completamente funcional cuando es expresado sobre las EF: 220132 superficies de las células.
El factor tisular es el receptor de la superficie celular para la serina proteasa factor Vlla (FVIIa) . Se ha descubierto que el enlace del FVIIa al factor tisular inicia los procesos de señalización dentro de la célula, esta función de señalización desempeña un papel en la angiogénesis . Mientras que la angiogénesis es un proceso normal en el crecimiento y desarrollo, así como también en la curación de heridas también es un paso fundamental en la transición de tumores de un estado inactivo a un estado maligno: cuando las células cancerosas obtienen la capacidad de producir proteínas que participan en la angiogénesis, denominadas factores de crecimiento angiogénicos, estas proteínas son liberadas por el tumor en los tejidos cercanos y propician que nuevos vasos sanguíneos broten de los vasos sanguíneos, saludables, existentes hacia y dentro del tumor. Una vez que los nuevos vasos sanguíneos entran al tumor, éste puede expandir rápidamente su tamaño e invadir el tejido local y los órganos. A través de los nuevos vasos sanguíneos, las células cancerosas pueden escapar además dentro de la circulación y alojarse en otros órganos para formar nuevos tumores (metástasis) .
Además, el TF desempeña un papel en la inflamación. Se da por hecho que el papel del TF es mediado por la coagulación de la sangre (A. J. Chu: "Tissue factor mediates inflammation" en Archives of biochemistry and biophysics, 2005, volumen 440, No. 2, páginas 123-132). Por consiguiente, la inhibición del TF por ejemplo por medio de anticuerpos monoclonales anti-TF es de importancia en la interrupción del ciclo de coagulación- inflamación en la contribución no únicamente a la anti - inflamación sino también a enfermedades vasculares .
La expresión del TF se observa en muchos tipos de cáncer y está asociada con una enfermedad más agresiva. -Adicionalmente , el TF humano también existe en una forma soluble alternativamente empalmada, asHTF . Se ha descubierto recientemente que el asHTF promueve el crecimiento de tumores (Hobbs y colaboradores 2007 Thrombosis Res. 120(2) S13-S21).
Los anticuerpos que se enlazan al TF han sido dados a conocer en la técnica anterior: El documento WO98/40408 da a conocer anticuerpos que se pueden enlazar al TF humano nativo, ya sea solo o presente en un complejo de TF:VIIa, impidiendo de manera efectiva que el factor X se enlace al TF o ese complejo y reduciendo en consecuencia la coagulación de la sangre. Se da a conocer que los anticuerpos se pueden utilizar para aliviar trombosis después de un procedimiento médico invasivo tal como una cirugía arterial o cardíaca o para eliminar la coagulación de la sangre que se origina a partir del uso de una implementación médica. Además, se dan a conocer anticuerpos que se emplean en métodos de diagnóstico in vivo que incluyen la imagenología de diagnóstico in vivo del TF humano, nativo.
El documento WO04/094475 proporciona anticuerpos capaces de enlazarse al factor tisular humano, los cuales no inhiben la coagulación de la sangre mediada por un factor en comparación con un control de plasma normal. No se describen anticuerpos humanos. Se afirma que el anticuerpo se puede utilizar para el tratamiento del cáncer.
El documento WO03/093422 se refiere a anticuerpos que se enlazan con mayor afinidad al complejo de TF:VIIa que al TF solo. Se propone el uso de los anticuerpos como anticoagulante en el tratamiento de ciertas enfermedades, tales como sepsis, coagulación intravascular diseminada, apoplejía isquémica, trombosis, síndromes coronarios agudos y coagulopatía en cáncer avanzado.
El documento W001/27079 da a conocer composiciones y métodos para inhibir la proliferación anormal de células, particularmente la proliferación de células endoteliales , tal como el cáncer, desarrollo anormal de embriones, funcionamiento defectuoso de respuestas inmunes, así como también angiogénesis relacionada con la neovasularización y crecimiento de tumores. Se proponen muchas sustancias activas, inclusive anticuerpos, pero no se dan a conocer anticuerpos específicos.
El documento WO03/037361 se refiere al uso de un agonista o antagonista de TF para un tratamiento relacionado con la apoptosis.
El documento O03/029295 se refiere a anticuerpos humanos, aislados que inmunorreaccionan con el TF humano para inhibir el enlace del factor de coagulación Vlla. Sin embargo, la solicitud no da a conocer un solo ejemplo de un anticuerpo que tenga estas propiedades.
Una variedad de terapias de anticuerpos monoclonales están aprobadas para tratar diferentes tipos de tumores, que incluyen por ejemplo bevacizumab (AvastinR) , cetuximab (ErbituxMR) , panitumumab (VectibixMR) y trastuzumab (HerceptinMR) .
Breve Descripción de la Invención Aunque se ha logrado un gran avance, permanece la necesidad de métodos mejorados para tratar enfermedades serias, por ejemplo un tratamiento mejorado del cáncer, con base en anticuerpos terapéuticos.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos anti-TF humanos, sumamente específicos y efectivos, novedosos para el uso médico. Los anticuerpos de la invención exhiben características de enlace al TF que difieren de los anticuerpos descritos en la técnica. En las modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención tienen una alta afinidad hacia el factor tisular humano, median la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) , inhiben el enlace del FVIIa al TF, inhiben la fosforilación de ERK y la liberación de IL8 inducida por FVIIa, no inhiben o inhiben pobremente la coagulación.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Alineamiento de secuencias de los anticuerpos de la presente invención. La CDRl, CDR2 y CDR3 de acuerdo con IMGT están resaltadas: las secuencias en letra cursiva representan la región CDRl, las secuencias subrayadas representan la región CDR2, las secuencias en letra negrita representan la región CDR3 (cuyo título es "Alineamiento de secuencias" , Las secuencias de los anticuerpos de la presente invención se proporcionan a continuación. La SEC ID NO. se lista entre paréntesis a la derecha de la secuencia. La CDRl, CDR2 y CDR3 de acuerdo con Kabat están resaltadas: las secuencias en letra cursiva representan la CDRl, las secuencias subrayadas representan la CDR2 , las secuencias en letra negrita representan la CDR3 ) .
Figura 2: Secuencias de IgG4 (SEC ID NO: 113-114) SEC ID NO: 113: La secuencia de aminoácidos de la región CH de tipo silvestre de la IgG4 humana. La secuencia en letras cursivas representa la región CH1, la secuencia resaltada representa la región de rótula, la secuencia regular representa la región CH2 y la secuencia subrayada representa la región CH3.
SEC ID NO: 114: La secuencia de aminoácidos de la región CH sin rótula de una IgG4 humana (cuyos títulos son "SEC ID NO: 113: La secuencia de aminoácidos de la región CH de tipo silvestre de la IgG4 humana", La secuencia en letras cursivas representa la región CH1, la secuencia resaltada representa la región de rótula, la secuencia regular representa la región CH2 y la secuencia subrayada representa la región CH3 y "SEC ID NO: 114: La secuencia de aminoácidos de la región CH sin rótula de una IgG4 humana") .
Figuras 3A-3C: Enlace de HuMabs anti-TF al dominio extracelular del TF (cuyos títulos son (Fig. 3A) "TFECDhis en ELISA, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 3B) "ELISA de TFECDhis, bloque cruzado II" y "ELISA de TFECDhis, bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. El enlace de HuMabs anti-TF al dominio extracelular del TF en Enlace de ELISA se determinó por medio de un ensayo ELISA) .
Figuras 4A-4C: Enlace de HuMabs anti-TF al TF enlazado a la membrana (cuyos títulos son (Fig. 4A) "FACS de MDA-MB-231, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 4B) "FACS de MDA-MB-231, grupo de bloque cruzado II" y (Fig. 4C) "FACS de MDA-MB-231, grupo de bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. Enlace de HuMabs anti-TF al TF enlazado a la membrana en células MDA-MD-231. El enlace se determinó por medio de un análisis de FACS) .
Figuras 5A-5C: Inhibición del enlace de FVIIa al TF (cuyos títulos son (Fig. 5A) "ELISA de inhibición del FVIIa, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 5B) "ELISA de inhibición del FVIIa, grupo de bloque cruzado II" y (Fig. 5C) "ELISA de inhibición del FVIIa, grupo de bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. Inhibición del enlace del FVIIa al TF. El enlace del FVIIa y la inhibición por parte de los HuMabs específicos para el TF de este enlace, se midió por medio de un ensayo ELISA) .
Figuras 6A-6C: Inhibición de la fosforilación de ERK inducida por FVIIa (cuyos títulos son (Fig. 6A) "Inhibición de ERK-P A431, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 6B) "Inhibición de la producción de ERK-P A431, grupo de bloque cruzado II" e (Fig.6C) "Inhibición de ERK-P A431, grupo de bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. La inhibicion del FVIIa indujo la fosforilación de ERK.
Figura 6D: Inhibición de la fosforilación de ERK inducida por FVIIa (cuyo título es "Inhibición de la fosforilación de ERK inducida por el FVIIa, utilizando el análisis de inmunotransferencia Western") .
Figuras 7A-7C: Inhibición de la liberación de IL-8 inducida por FVIIa (cuyos títulos son (Fig. 7A) "Inhibición de la producción de IL-8, MDA-MB-231 grupo de bloque cruzado I", (Fig. 7B) "Inhibición de la producción de IL-8, MDA-MB-231 grupo de bloque cruzado II" e (Fig. 7C) "Inhibición de la producción de IL-8, MDA-MB-231 bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. Inhibición de la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa. Las células MDA-MB-231 se cultivaron en un medio libre de suero, los anticuerpos específicos para el TF y el FVIIa se agregaron. La IL-8 inducida por el FVIIa se midió por medio de un ensayo ELISA) .
Figuras 8A-8C: Inhibición de la generación del FXa (cuyos títulos son (Fig. 8A) "Inhibición de la generación del FXa, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 8B) "Inhibición de la generación del FXa, grupo de bloque cruzado II" e (Fig. 8C) "Inhibición de la generación del FXa, bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. Inhibición de la generación del FXa. La capacidad de los HuMabs específicos para el TF para inhibir la generación del FXa se sometió a prueba en un ensayo en el cual se midió la conversión del FX al FXa por el complejo de TF/FVIIa utilizando un substrato colorimétrico específico para el FXa) .
Figuras 9A-9C: Inhibición de la coagulación de la sangre (cuyos títulos son (Fig. 9A) "Tiempo de coagulación, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 9B) "Tiempo de coagulación, grupo de bloque cruzado II" y (Fig. 9C) "Tiempo de coagulación, bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. Inhibición de la coagulación de la sangre. La inhibición de la coagulación de la sangre por parte de los TF-HuMabs se midió en un ensayo que determinaba el tiempo de coagulación inducida por el TF) .
Figuras 10A-10C: Los TF-HuMabs inducen la lisis de células Bx-PC3 por medio de la ADCC (cuyos títulos son (Fig. 10A) "ADCC de células Bx-PC3, grupo de bloque cruzado I", (Fig. 10B) "ADCC de células Bx-PC3, bloque cruzado II" y (Fig. 10C) "ADCC de células Bx-PC3, bloque cruzado III (II/III)", respectivamente. Los TF-HuMabs indujeron la lisis de células Bx-PC3 por medio de la ADCC) .
Figuras 11A-11D: Deposición de componentes de complemento C3c y C4c sobre células objetivo (cuyos títulos son (Fig. 11A) "Deposición de C4c sobre MDA-MB-231", "Deposición de C3c sobre MDA-MB-231", (Fig. 11B) "Deposición de C4c sobre BxPC3" y (Fig. 11C) "Deposición de C3c sobre BxPC3" , respectivamente. Deposición de complemento).
Figura 12: Análisis inmunohistoquímico del enlace de TF-HuMabs a glomérulos (cuyo título es "Análisis inmunohistoquímico del enlace de TF-HuMabs al riñon humano normal" ) .
Figura 13: Análisis inmunohistoquímico del enlace de TF-HuMabs a tumores pancreáticos (cuyo título es "Análisis inmunohistoquímico del enlace de TF-HuMabs a tumores pancreáticos") .
Figuras 14A-14B: Eficacia in vivo de TF-HuMabs en el xenoinjerto de tumor MDA-MB-231 establecido (cuyos títulos son (Fig. 14A) "Tamaño del tumor/grupo" y (Fig. 14B) "Promedio y SEM - Día 88", respectivamente. Eficacia in vivo de TF-HuMabs en el xenoinjerto de tumor MDA-MB-231 establecido en almohadillas adiposas mamarias de ratones SCID) .
Figura 15 : Tiempo de sangrado determinado en monos cynomolgus con inyecciones intravenosas del HuMab específico para el TF 011. El anticuerpo se administró en el día 1 (0 mg/kg) , 8 (1 mg/kg) , 15 (10 mg/kg) y 22 (100 mg/kg) (cuyo título es "Tiempo de sangrado (minutos) , determinado en monos cynomolgus con inyecciones intravenosas del HuMab específico para el TF 011. El anticuerpo se administró en el día 1 (0 mg/kg) , 8 (1 mg/kg) , 15 (10 mg/kg) y 22 (100 mg/kg) . El tiempo de sangrado funcional y la pérdida de sangre se determinaron 1, 24 y 120 horas después de la dosificación) .
Figuras 16A-16B: Eficacia in vivo de TF-HuMabs en un xenoinjerto de tumor BX-PC3 profiláctico y establecido (cuyos títulos son (Fig. 16A) "Tratamiento preventivo de BxPC3, Promedio y SEM" . Mediciones repetidas de ANOVA bifactorial, seguido por la prueba posthoc de Bonferroni : 111 vs KLH; de d28 hacia adelante: P<0.05, de d32 hacia adelante: P<0.01 y (Fig. 16B) "Tratamiento terapéutico de BxPC3 , Promedio y SEM". Mediciones repetidas de ANOVA bifactorial, seguido por la prueba posthoc de Bonferroni : 111 vs KLH: de d35 hacia adelante: P<0.05, respectivamente).
Figuras 17A-17B: Construcción de entremezclado y dominios del TF (cuyos títulos son (Fig. 17A) "Construcción de entremezclado de TFhs , que contiene los dominios TFmm" y (Fig. 17B) "Construcción de entremezclado de TFmm, que contiene los dominios TFhs", respectivamente).
Figuras 18A-180: Enlace de anticuerpos anti-TF a construcciones de entremezclado del TF (cuyos títulos son (Fig. 18A) "IgGl -1015-003", (Fig. , 18B) "IgGl-1015- 011" , (Fig. 18C) "IgGl-•1015- 013" , (Fig. 18D) "IgGl-1015-017" , (Fig. 18E) "IgGl -1015- 025" , (Fig 18F) IgGl-1015-027" , (Fig. 18G) "IgGl -1015- 042" , (Fig 18H) IgGl-1015-044" , (Fig. 181) "IgGl -1015- 087" , (Fig 18J) IgGl-1015-092" , (Fig. 18K) "IgGl -1015- 098" , (Fig 18L) IgGl-1015-101" , (Fig. 18M) "IgGl -1015- 109" , (Fig. 18N) "IgGl-1015-111" e (Fig. 180) "IgGl -1015- 114" , respectivamente Enlace de HuMabs anti -TF a las construcciones de entremezclado del TF expresadas en las células HEK293F. Se muestran los perfiles de enlace de los HuMabs anti-TF a las diferentes construcciones de entremezclado del TF expresadas en las células HEK293F, medido por medio de FACS . Cada panel muestra datos de un clon principal. En el eje x se ilustran las diferentes construcciones; simulado, TFhs, TFmm, TFhsmm, TFmmhs, TFhsl-41mm, TFhs42-84mm, TFhs85-122mm, TFhsl23 - 137mm, TFhsl38-159mm, TFhsl60-184mm, TFhsl85-225mm, TFhs226-250mm, TFmml-47hs, TFmm48-90hs, TFmm91-122hs , TFmml23-137hs , TFmml38-159hs, TFmml60-184hs, TFmml85-225hs, TFmm226-250hs) .
Figura 19: Enlace de fragmentos Fab del HuMab-TF a un dominio extracelular del TF, ELISA (cuyo título es "ELISA de Fragmentos Fab del HuMab-TF" . Enlace de fragmentos Fab del HuMab-TF al dominio extracelular del TF, determinado por medio de un ensayo ELISA) .
Figura 20: Enlace de fragmentos Fab del HuMab-TF a un dominio extracelular del TF, FACS (cuyo título es "FACS en BxPC3". Enlace de fragmentos Fab del HuMab-TF al TF celular, determinado por medio de FACS en células BxPC3.
Figuras 21A-21D: Perfil de enlace de HuMabs anti-TF dependiente del número de moléculas de TF expresadas (cuyos títulos son (Fig. 21A) "Células MDA-MB-231 (-900,000 moléculas de TF/célula)", (Fig. 21B) "Células AsPC-1 (-175,000 moléculas de TF/célula)", (Fig. 21C) "Células SK-OV-3 (-60,000 moléculas de TF/célula)" y (Fig. 21D) "Células S 480 (-20,000 moléculas de TF/célula)", respectivamente. El perfil de enlace de los HuMabs anti-TF es dependiente del número de moléculas de TF expresadas. El enlace de los HuMabs anti-TF a líneas de células que expresan diferentes niveles de TF se determinó por medio de FACS) .
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Los términos "factor tisular", "TF" , "CD142", "antígeno de factor tisular" , "antígeno de TF" y "antígeno de CD142" se utilizan de manera intercambiable en este documento y, a menos que se especifique de otra manera, incluyen cualquier variante, isoforma y homólogo de especie del factor tisular humano los cuales son expresados naturalmente por células o son expresados en células transfectadas con el gen del factor tisular.
El término "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoproteínas relacionadas estructuralmente que consisten de dos pares de cadenas de polipéptidos , un par de cadenas de bajo peso molecular ligeras (L) y un par de cadenas pesadas (H) , todas las cuatro pueden estar inter-conectadas por enlaces de disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas ha sido bien caracterizada. Véase por ejemplo Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W. , ed. , 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989) ) . En resumen, cada cadena pesada está comprendida típicamente de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como VH o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida típicamente de tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida típicamente de una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida típicamente de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables las cuales pueden ser hipervariables en la secuencia y/o forma de bucles definidos estructuralmente) , también denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) , interpuestas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FRs, por sus siglas en inglés) . Cada VH y VL está compuesta típicamente de tres CDRs y cuatro FRs, ordenadas de la terminación amino a la terminación carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3, FR4 (véase también Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196 , 901-917 (1987)). Típicamente, la numeración de los residuos de aminoácidos en esta región es de acuerdo con IMGT., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (las frases tales como numeración de residuos de dominio variable como en Kabat o de acuerdo con Kabat se refieren en este documento a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera) . Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal, real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o una inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de aminoácido individual (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de la CDR2 VH y residuos insertados (por ejemplo los residuos 82a, 82b y 82c, etcétera de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos se puede definir para un anticuerpo determinado por medio del alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de acuerdo con Kabat "estándar" .
El término "anticuerpo" (Ab) en el contexto de la presente invención se refiere a una molécula de inmunoglobulina, un fragmento de una molécula de inmunoglobulina o un derivado de cualquiera de los mismos, el cual tiene la capacidad de enlazarse específicamente a un antígeno bajo condiciones fisiológicas típicas con una vida media de periodos de tiempo significativos, tales como por lo menos aproximadamente 30 minutos, por lo menos aproximadamente 45 minutos, por lo menos aproximadamente una hora, por lo menos aproximadamente dos horas, por lo menos aproximadamente cuatro horas, por lo menos aproximadamente 8 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 o más días etcétera, o cualquier otro periodo relevante, definido funcionalmente (tal como un tiempo suficiente para inducir, promover, mejorar y/o modular una respuesta fisiológica asociada con un anticuerpo que se enlaza al antígeno y/o un tiempo suficiente para que el anticuerpo obtenga una actividad efectora) . Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de inmunoglobulina contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos (Abs) pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospederos, inclusive varias células del sistema inmune (tales como células efectoras) y componentes del sistema de complemento tal como Clq, el primer componente en la ruta clásica de activación del complemento. Un anticuerpo anti-TF también puede ser un anticuerpo biespecífico, diacuerpo o molécula similar (véase por ejemplo PNAS EUA 90 (14) , 6444-8 (1993) para una descripción de los diacuerpos) . En realidad, los anticuerpos biespecíficos , diacuerpos y similares, proporcionados por la presente invención pueden enlazarse a cualquier objetivo adecuado además de una porción de factor tisular o complejo de factor tisular FVIIa. Como se indicara anteriormente, el término anticuerpo en este documento, a menos que se establezca de otra manera o se contradiga claramente por el contexto, incluye fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de enlazarse específicamente al antígeno. Se ha mostrado que la función de enlace a antígenos de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de enlace incluidos dentro del término "anticuerpo" incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 o un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab) ; (ii) fragmentos F(ab' )2/ fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por una conexión de disulfuro en la región de rótula; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente de los dominios VL y VH, (v) un fragmento dAb ( ard y colaboradores, Nature 341 , 544-546 (1989)), que consiste esencialmente de un dominio VH y también llamados anticuerpos de dominio (Holt y colaboradores; Trends Biotechnol. Noviembre de 2003; 21 ( 11) : 484- 90 ) ; (vi) anticuerpos camélidos o nanocuerpos (Revets y colaboradores; Expert Opin Biol Ther. Enero de 2005; 5(l):lll-24) y (vii) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR) . Adicionalmente , aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes , por un conector sintético que hace posible que sean construidos como una cadena de proteína individual en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como anticuerpos de cadena individual o Fv de cadena individual (scFv) , véase por ejemplo Bird y colaboradores, Science 242 , 423-426 (1988) y Huston y colaboradores, PNAS EUA 85, 5879-5883 (1988)). Estos anticuerpos de cadena individual están comprendidos dentro del término anticuerpo a menos que se observe de otra manera o sea indicado claramente por el contexto. Aunque estos fragmentos están incluidos generalmente dentro del significado de anticuerpo, son colectivamente y cada uno independientemente características únicas de la presente invención, que exhiben diferentes propiedades biológicas y utilidad. Estos y otros fragmentos de anticuerpos útiles en el contexto de la presente invención se plantean adicionalmente en este documento. También se debe entender que el término anticuerpo, a menos que se especifique de otra manera, también incluye anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales (mAbs) , polipéptidos similares a anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos que retienen la capacidad de enlazarse específicamente al antígeno (fragmentos de enlace a antígenos) proporcionados por medio de cualquier técnica conocida, tal como la escisión enzimática, síntesis de péptidos y técnicas recombinantes . Un anticuerpo como se generó puede poseer cualquier isotipo.
Un "anticuerpo anti-TF" es un anticuerpo como se describiera anteriormente, el cual se enlaza específicamente al antígeno del factor tisular.
El término "anticuerpo humano", como se utiliza en este documento, tiene por objeto incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por medio de la mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o durante el reordenamiento de genes o por medio de la mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se utiliza en este documento, no tiene por objeto incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tal como un ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura humanas.
En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención se aisla. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en este documento, tiene por objeto referirse a un anticuerpo el cual está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente al factor tisular está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlazan específicamente a antígenos diferentes del factor tisular) . Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un epítopo, isoforma o variante del factor tisular humano puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (tales como homólogos de especies del factor tisular). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una modalidad de la presente invención, dos o más anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferentes especificidades de enlace a antígenos se combinan en una composición bien definida.
Cuando se utiliza en este documento en el contexto de dos o más anticuerpos, el término "compite con" o "compite de manera cruzada con" indica que los dos o más anticuerpos compiten por el enlace al TF, por ejemplo compiten por el enlace al TF en el ensayo descrito en el Ejemplo 6 en este documento. Para algunos pares de anticuerpos, la competencia en el ensayo del Ejemplo 6 solo se observa cuando un anticuerpo es revestido sobre la placa y el otro se utiliza para competir, y no viceversa. El término "compite con" cuando se utiliza en este documento también tiene por objeto cubrir estos anticuerpos de combinaciones.
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utilizan en este documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición molecular individual. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad y afinidad de enlace individual por un epítopo particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que exhiben una especificidad de enlace individual los cuales tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden generar por medio de un hibridoma el cual incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico o transcromosómico, tal como un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera, fusionados a una célula inmortalizada.
Como se utiliza en este documento, el término "enlace" en el contexto del enlace de un anticuerpo a un antígeno predeterminado es típicamente un enlace con una afinidad que corresponde a un valor ¾ de aproximadamente 10"7 M o menos, tal como de aproximadamente 10"8 M o menos, tal como de aproximadamente 10"9 M o menos, de aproximadamente 10"10 M o menos o de aproximadamente 1CT11 M o incluso menos cuando se determina por ejemplo por medio de la tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIAcore 3000^ utilizando el antígeno como el ligando y el anticuerpo como el analito y se enlaza al antígeno predeterminado con una afinidad que corresponde a un valor ¾ que es por lo menos diez veces más bajo, tal como por lo menos 100 veces más bajo, por ejemplo por lo menos 1,000 veces más bajo, tal como por lo menos 10,000 veces más bajo, por ejemplo por lo menos 100,000 veces más bajo que su afinidad para enlazarse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente del antígeno predeterminado o un antígeno relacionado estrechamente.
La cantidad con la cual es más baja la afinidad es dependiente del valor ¾ del anticuerpo, de modo que cuando el valor ¾ del anticuerpo es muy bajo (es decir, el anticuerpo es sumamente específico) , entonces la cantidad con la cual la afinidad para el antígeno es más baja que la afinidad por un antígeno no específico puede ser por lo menos 10,000 veces.
El término "ka" (sec-1) , como se utiliza en este documento, se refiere a la constante de tasa de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno . El valor también es referido como el valor ^-desactivado · El término "ka" (M"1 x sec"1) , como se utiliza en este documento, se refiere a la constante de tasa de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
El término (M) , como se utiliza en este documento, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
El término "K¾" (NT1) , como se utiliza en este documento, se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno y se obtiene al dividir el valor ka por el valor ka.
La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden variantes funcionales de la región VL, región VH o una o más CDRs de los anticuerpos de los ejemplos. Una variante funcional de una VL, VH o CDR utilizada en el contexto de un anticuerpo anti-TF aún permite que el anticuerpo retenga por lo menos una proporción sustancial (por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) de la afinidad/avidez y/o la especificidad/selectividad del anticuerpo precursor y en algunos casos este anticuerpo anti-TF se puede asociar con una afinidad, selectividad y/o especificidad más grande que el anticuerpo precursor.
Estas variantes funcionales retienen típicamente una identidad de secuencia significativa con el anticuerpo precursor. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, los cuales es necesario que se introduzcan para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden realizar utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes posteriores.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz WSgapdna.CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de l, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y .
Miller, Coraput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)) el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12 y una penalización por espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970) ) el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com) , utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
La secuencia de variantes de CDR puede diferir de la secuencia de la CDR de las secuencias del anticuerpo precursor a través de sustituciones principalmente conservadoras; por ejemplo por lo menos aproximadamente 35%, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 75% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 85% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 95% o más (por ejemplo, aproximadamente 65-99%, tal como aproximadamente 96%, 97% o 98%) de las sustituciones en la variante son reemplazos conservadores de residuos de aminoácidos.
La secuencia de variantes de CDR puede diferir de la secuencia de la CDR de las secuencias del anticuerpo precursor a través de sustituciones principalmente conservadoras; por ejemplo por lo menos 10, tal como por lo menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 de las sustituciones en la variante son reemplazos conservadores de residuos de aminoácidos.
En el contexto de la presente invención, las sustituciones conservadoras pueden ser definidas por sustituciones dentro de las clases de aminoácidos reflejadas en una o más de las siguientes tres tablas: Clases de residuos de aminoácidos para sustituciones conservadoras Clases de sustituciones conservadoras, alternativas de residuos de aminoácidos 1 A S T 2 D E 3 N Q 4 R K 5 I L M 6 F Y W Clasificaciones Físicas y Funcionales Alternativas Residuos de Aminoácidos Las agrupaciones de sustituciones más conservadoras incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutaraina .
Los grupos adicionales de aminoácidos también se pueden formular utilizando los principios descritos en, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2a Ed. 1993) , W. H. Freeman and Company.
En una modalidad de la presente invención, la conservación en términos de propiedades hidropáticas/hidrófilas y el peso/tamaño de los residuos también se retiene sustancialmente en una CDR variante en comparación con una CDR de un anticuerpo de los ejemplos (por ejemplo, la clase de peso, el registro hidropático o ambos de las secuencias son retenidos por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95% o más (por ejemplo, aproximadamente 65-99%) ) . Por ejemplo, las sustituciones de residuos conservadoras se pueden basar también o alternativamente en el reemplazo de grupos de conservación basados en el peso de base fuerte o débil, los cuales son conocidos en la técnica.
La retención de residuos similares puede ser medida también o alternativamente mediante un registro de similitud, determinado por medio del uso de un programa BLAST (por ejemplo, BLAST 2.2.8 disponible a través de the NCBI utilizando los parámetros estándar BLOSUM62, Espacio Abierto=ll y Espacio Extendido=l) . Las variantes adecuadas exhiben típicamente por lo menos aproximadamente 45%, tal como por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95% o más (por ejemplo, aproximadamente 70-99%) de similitud con el péptido precursor .
Como se utiliza en este documento, "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgD, IgA, IgE o IgM) que es codificada por los genes de región constante de cadena pesada.
El término "epítopo" significa un determinante proteínico con capacidad de enlace específico a un anticuerpo. Los epítopos consisten usualmente de agrupaciones superficiales de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen usualmente características estructurales, tridimensionales, específicas, así como también características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen debido a que el enlace a los primeros pero no a los últimos se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender residuos de aminoácidos implicados directamente en el enlace (también llamados componentes inmunodominantes del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, los cuales no están implicados directamente en el enlace, tales como residuos de aminoácidos los cuales son bloqueados de manera efectiva por el péptido que se enlaza específicamente al antígeno (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la huella del péptido que se enlaza específicamente al antígeno) .
Como se utiliza en este documento, un anticuerpo humano se "deriva de" una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene a partir de un sistema utilizando secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo al inmunizar un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humana o al seleccionar una colección de genes de inmunoglobulina humana y en donde la secuencia seleccionada del dominio V de anticuerpo humano es por lo menos 90%, tal como por lo menos 95%, por ejemplo por lo menos 96%, tal como por lo menos 97%, por ejemplo por lo menos 98% o tal como por lo menos 99% idéntica en la secuencia del dominio V de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, fuera de la CDR3 de cadena pesada, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana particular exhibirá no más de 20 diferencias de aminoácidos, por ejemplo no más de 10 diferencias de aminoácidos, tal como no más de 9 , 8, 7, 6 o 5, por ejemplo no más de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.
Como se utiliza en este documento, el término "inhibe el crecimiento" (por ejemplo refiriéndose a células, tales como células de tumor) tiene por objeto incluir cualquier disminución mesurable en el crecimiento de células cuando se ponen en contacto con un anticuerpo anti-TF en comparación con el crecimiento de las mismas células que no están en contacto con un anticuerpo anti-TF, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de un cultivo de células por al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o 100%. Esta disminución en el crecimiento de las células puede ocurrir por medio de una variedad de mecanismos, por ejemplo fagocitosis de células efectoras, ADCC, CDC y/o apoptosis.
El término "molécula biespecífica" tiene por objeto incluir cualquier agente, tal como una proteína, péptido o complejo de proteínas o péptidos, que tenga dos diferentes especificidades de enlace. Por ejemplo, la molécula puede enlazarse a, o puede interactuar con, (a) un antígeno de la superficie celular y (b) un receptor Fe sobre la superficie de una célula efectora. El término "anticuerpo biespecífico" tiene por objeto incluir cualquier anticuerpo anti-TF, el cual es una molécula biespecífica . El término "anticuerpos biespecífieos" también incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecífieos , bivalentes en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptido individual, pero utilizando un conector que es muy corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando en consecuencia a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace a antígenos (véase por ejemplo Holliger, P. y colaboradores, PNAS EUA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, R.J. y colaboradores, Structure 2 , 1121-1123 (1994)).
Un "anticuerpo deficiente en la función efectora" o un "anticuerpo deficiente de la función efectora" se refiere a un anticuerpo el cual tiene una capacidad significativamente reducida o nula para activar uno o más mecanismos efectores, tal como la activación del complemento o el enlace a receptores Fe. De esta manera, los anticuerpos deficientes en la función efectora tienen una capacidad significativamente reducida o nula para mediar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Un ejemplo de este anticuerpo es IgG4.
El término "anticuerpo monovalente" significa en el contexto de la presente invención que una molécula de anticuerpos es capaz de enlazarse a una molécula individual del antígeno y de esta manera no es capaz de reticular el antígeno .
El término "anticuerpo de IgG4 estabilizado" se refiere a un anticuerpo de IgG4 el cual ha sido modificado para reducir el intercambio de medias moléculas (véase van der Neut Kolfschoten M y colaboradores, (2007) Science 14; 317(5844) y referencias en el mismo y también Labrijn y colaboradores, (2009) Nature Biotechnology, 27, 767-771.
Como se utiliza en este documento, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune la cual está implicada en la fase efectora de una respuesta inmune, contrariamente a las fases cognitivas y de activación de una respuesta inmune. Las células inmunes ejemplares incluyen una célula de origen mieloide o linfoide, por ejemplo linfocitos (tales como células B y células T que incluyen células T citolíticas (CTLs, por sus siglas en inglés) ) , células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos , células polimorfonucleares , tales como neutrófilos, granulocitos , mastocitos y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fe específicos y llevan a cabo funciones inmunes específicas. En algunas modalidades, una célula efectora es capaz de inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , tal como una célula asesina natural, capaz de inducir la ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrófagos, los cuales expresan el FcR están implicados en la eliminación específica de células objetivo y la presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmune o el enlace a células que presentan antígenos. En algunas modalidades, una célula efectora puede destruir un antígeno objetivo o célula objetivo. La expresión de un FcR particular en una célula efectora puede ser regulada por factores humorales tales como citocinas. Por ejemplo, se ha descubierto que la expresión de FcyRI es regulada por incremento por el interferón y (IFN-?) y/o G-CSF. Esta expresión mejorada incrementa la actividad citotóxica de las células que llevan el FcRI contra objetivos. Una célula efectora puede destruir o lisar un antígeno objetivo o una célula objetivo.
El término "vector," como se utiliza en este documento, tiene por objeto referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido unida. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedera dentro de la cual se introducen (por ejemplo vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (tales como los vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera con la introducción en la célula hospedera y en consecuencia se replican junto con el genoma del hospedero. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos de manera operativa. Estos vectores son referidos en este documento como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos . En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma del vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la presente invención tiene por objeto incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (tales como retrovirus defectuosos en. la replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) , los cuales sirven para funciones equivalentes.
El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), como se utiliza en este documento, tiene por objeto referirse a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión. Se debe entender que estos términos tienen por objeto referirse no únicamente a la célula objetivo particular, sino también a la progenie de esta célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas a causa de ya sea una mutación o influencias ambientales, esta progenie puede no ser idéntica, de hecho, a la célula precursora, pero aún está incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" como se utiliza en este documento. Las células hospederas recombinantes incluyen, por ejemplo, transíectomas , tales como células de CHO, células HEK293, células NS/0 y células linfocíticas .
El término "transíectoma" , como se utiliza en este documento, incluye células hospederas, eucarióticas , recombinantes que expresan el anticuerpo, tales como células de CHO, células NS/0, células HEK293, células de plantas o células de hongos incluyendo las células de levadura.
El término "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes o transcromosomas de cadena pesada y/o ligera humanos (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y el cual es capaz de expresar anticuerpos completamente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera humano y ya sea un transgen de cadena pesada humano o un transcromosoma de cadena pesada humano, de tal manera que el ratón produce anticuerpos anti-FT humanos cuando es inmunizado con el antígeno de TF y/o células que expresan el TF. El transgen de cadena pesada humano se puede integrar en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para los ratones transgénicos , por ejemplo ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCol2, o el transgen de cadena pesada humano se puede mantener extracromosómicamente, como es el caso para los ratones KM transcromosómicos que se describen en el documento O02/43478. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos (referidos colectivamente en este documento como "ratones transgénicos") son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para un antígeno determinado (tales como IgG, IgA, IgM, IgD y/o IgE) al someterse a la recombinación V-D-J y cambio de isotipo. El animal no humano transgénico también se puede utilizar para la producción de anticuerpos contra un antígeno específico al introducir genes que codifican este anticuerpo específico, por ejemplo al unir de manera operativa los genes a un gen el cual es expresado en la leche del animal .
"Tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad efectiva de un compuesto terapéuticamente activo de la presente invención con el propósito de facilitar, mejorar, detener o erradicar (curar) los síntomas o estados de enfermedad.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo anti-TF para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente benéficos.
Un anticuerpo "anti- idiotípico" (Id) es un anticuerpo el cual reconoce determinantes únicos que están asociados generalmente con el sitio de enlace a antígenos de un anticuerpo.
Aspectos y modalidades adicionales de la invención Como se describiera anteriormente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo humano el cual se enlaza al Factor Tisular humano.
En una modalidad, el anticuerpo se enlaza al dominio extracelular del Factor Tisular con una afinidad aparente (EC50) de 3 nM o menos, tal como 0.50 nM o menos, por ejemplo 0.35 nM o menos, tal como 0.20 nM o menos, por ejemplo 0.1 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 13.
En otra modalidad, el anticuerpo se enlaza a células de mamífero que expresan el Factor Tisular, tales como las células A431 transíectadas con una construcción que codifica el Factor Tisular, preferiblemente con una afinidad aparente (EC50) de 10 nM o menos, por ejemplo 8 nM o menos, tal como 5 nM o menos, por ejemplo 2 nM o menos, tal como 1 nM o menos, por ejemplo 0.5 nM o menos, tal como 0.3 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 14.
En otra modalidad, el anticuerpo es capaz de inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en las células A431, preferiblemente con un valor EC50 de 2 nM o menos, por ejemplo 1 nM o menos, tal como 0.7 nM o menos o 0.3 nM o menos, tal como 0.2 nM o menos o 0.1 nM o menos o 0.05 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 20.
En otra modalidad, el anticuerpo es efectivo en la inhibición del crecimiento de tumores MDA-MB-231 establecidos, cuando se determina por medio del método descrito en el Ejemplo 24 y/o en la inhibición del crecimiento de tumores BxPC3 establecidos, cuando se determina por medio del método descrito en el Ejemplo 26.
En otra modalidad, el anticuerpo inhibe la coagulación sanguínea inducida por el factor tisular, preferiblemente con una concentración de inhibición media menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por ejemplo menor que 2 nM, tal como menor que 1 nM cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 19.
En otra modalidad, el anticuerpo no inhibe la coagulación. En una modalidad, la coagulación es inhibida con un máximo de 30%, tal como 25%, tal como 20%, tal como 15%, tal como 10% o tal como 5% comparado con el nivel nativo.
En una modalidad adicional, el anticuerpo inhibe el enlace de FVIIa al Factor Tisular, preferiblemente con un valor máximo de inhibición mayor que 80%, tal como mayor que 90% cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 15.
En una modalidad adicional, el anticuerpo inhibe la liberación de IL-8 inducida por FVIIa por parte de las células MDA-MB-231, preferiblemente con un valor máximo de inhibición mayor que 40%, tal como mayor que 50%, por ejemplo mayor que 60%, cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 17.
En una modalidad adicional, el anticuerpo inhibe la conversión del FX en FXa por medio del complejo de TF/FVIIa, preferiblemente por menos de 50%, por ejemplo menos de 40%, tal como en el intervalo de 1-30%, cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 18.
En una modalidad adicional, el anticuerpo compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65.
En una modalidad adicional, el enlace del anticuerpo de la invención al Factor Tisular no implica la totalidad de los tres residuos siguientes: W en la posición 45, K en la posición 46 o Y en la posición 94 del Factor Tisular. En una modalidad aún adicional, el enlace no implica ninguno de los siguientes residuos: en la posición 45, K en la posición 46 o Y en la posición 94 (estos números se refieren al TF maduro, las posiciones equivalentes en la entrada de Genbank NP_001984 son 77, 78 y 126) .
En otra modalidad del anticuerpo de la invención, el anticuerpo compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
En una modalidad adicional, el anticuerpo inhibe la fosforilación de ERK inducida por FVIIa, preferiblemente con una concentración de inhibición media menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por ejemplo menor que 2 nM cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 16.
En una modalidad adicional, el anticuerpo inhibe la fosforilación de ERK preferiblemente con una concentración de inhibición media menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por ejemplo menor que 2 nM cuando se determina como se describe en el ensayo del Ejemplo 16 y no inhibe la liberación de IL-8 inducida por FVII como se describe en el ensayo del Ejemplo 17 por más de 10% como máximo. En una modalidad adicional, el anticuerpo es capaz de inducir la deposición de C3c y C4c, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inducir la deposición de C3c y C4c como se determina en el Ejemplo 21.
En una modalidad adicional, los fragmentos Fab de anticuerpo se enlazan al dominio extracelular del factor tisular como se describe en el ejemplo 28 con un valor EC50 inferior a 0.1 µg/mL, tal como inferior a 0.05 µg/mL, por ejemplo inferior a 0.04 g/mL, medido por medio de un ensayo ELISA.
En una modalidad adicional, los fragmentos Fab de anticuerpo se enlazan al dominio extracelular del factor tisular como se describe en el ejemplo 28 con un valor EC50 superior a 1.0 µ9/p?1?, medido por medio de un ensayo ELISA.
En una modalidad adicional, los fragmentos Fab de anticuerpo se enlazan al dominio extracelular del factor tisular como se describe en el ejemplo 28 con un valor EC50 inferior a 10 µ /t??, tal como inferior a 1 ^g/ml¡, por ejemplo inferior a 0.5 o inferior a 0.2 µ9/p??..
En una modalidad adicional, el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 42-84 mm, que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 42-84, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
En una modalidad adicional, el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 85-122, que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 85-122, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
En una modalidad adicional, el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 123-137 mm que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 123-137, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
En una modalidad adicional, el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 185-225 mm que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 185-225, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
En una modalidad adicional, el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a tanto la construcción de entremezclado 226-250 mm que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 226-250, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
En una modalidad adicional, el anticuerpo muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a más de una construcción de entremezclado. En una modalidad, un anticuerpo muestra un enlace reducido a la construcción 42-84 mm así como también a la construcción 85-122 mm. En una modalidad, un anticuerpo muestra un enlace reducido a la construcción 123-137 mm así como también a la construcción 185-225 mm. En una modalidad, un anticuerpo muestra un enlace reducido a la construcción 123-137 mm así como también a la construcción 185-225 mm y además a la construcción 226-250 mm .
En una modalidad adicional, el anticuerpo es capaz de inducir la deposición de C3c y C4c, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inducir la deposición de C3c y C4c como se determina en el Ejemplo 21.
En una modalidad del anticuerpo de la invención, el anticuerpo - compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65 y - no compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID NO: 12, - la SEC ID NO: 16, - la SEC ID NO: 20, - la SEC ID NO: 24, - la SEC ID NO: 28, o b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 12 o una variante de la misma, en donde la variante comprende una modificación en una o más de las posiciones 2, 3, 6, 9 y 11, preferiblemente donde la modificación es una sustitución, más preferiblemente donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste de a. R es sustituido por K cuando está en la posición 2, b. S es sustituido por A o T cuando está en la posición 3, c. G es sustituido por T cuando está en la posición 6, d. L es sustituido por F cuando está en la posición 9 y e. S es sustituido por Y cuando está en la posición 11.
En otra modalidad, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 66, 67 y 68, b) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 14, 15 y 16 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 70, 71 y 72, c) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 18, 19, 20 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 74, 75 y 76, d) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 22, 23 y 24 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 78, 79 y 80, e) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 26, 27 y 28 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 82, 83 y 84 o f) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID N0:9, 13, 17, 21 y 25 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:9, 13, 17, 21, 21 y 25.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VL que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 65, 69, 73, 77 y 81 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 65, 69, 73, 77 y 81.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 65 , b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:69, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 77, e) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID N0:81 O f) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo - compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65 y - compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID NO: 8, - la SEC ID NO: 52, o b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 6, 7 y 8 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 62, 63 y 64, b) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 50, 51 y 52 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 106, 107 y 108 o c) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 5 y 49 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 5 y 49.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VL que tiene c) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 61 y 105 o d) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 61 y 105.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 5 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 61 , b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 105 O c) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo no compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65 y - compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID NO: 32, - la SEC ID NO:36, - la SEC ID NO: 40, - la SEC ID NO: 56, o b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 30, 31 y 32 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 86, 87 y 88, b) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 34, 35 y 36 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 90, 91 y 92, c) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 38, 39 y 40 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 94, 95 y 96, d) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 54, 55 y 56 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 110, 11 y 112 o e) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 29, 33, 37 y 53 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:29, 33, 37 y 53.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VL que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:85, 89, 93 y 109 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:85, 89, 93 y 109.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 29 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 85, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:89, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:93, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID N0:109 O e) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende un anticuerpo que compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID N0:4, - la SEC ID NO: 44, - la SEC ID NO: 48, O b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
En una modalidad adicional, el anticuerpo com rende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO : 2 , 3 y 4 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 58, 59 y 60, b) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 42, 43 y 44 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 98, 99 y 100, c) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO:46, 47 y 48 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 102, 103 y 104 o d) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 1 , 41 y 45 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:l, 41 y 45.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una VL que tiene c) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 57, 97 y 101 o d) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 57, 97 y 101.
En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 1 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 57, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 101 o d) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
En una modalidad aún adicional, el anticuerpo de la invención tiene una afinidad por el factor tisular la cual es menor que 5 nM, tal como menor que 3.5 nM, por ejemplo menor que 2 nM cuando se determina por medio del método descrito en el Ejemplo 22 en este documento.
Un grupo particularmente interesante de anticuerpos de la invención tiene un enlace al Factor Tisular el cual se caracteriza por una avidez normal o alta y una constante de disociación alta (kd) . Como se demuestra en este documento, estos anticuerpos pueden exhibir un enlace específico para tumores ya que se enlazan al tejido canceroso, pero no se enlazan o se enlazan menos a tejidos saludables. Sin ser limitado por ninguna teoría específica, se plantea la hipótesis de que este grupo de anticuerpos solo se enlaza bien a células que expresan altos niveles de TF, debido a que el enlace solo es eficiente si es bivalente. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen los anticuerpos 044, 098 y 111, como se describe en este documento.
Por consiguiente, en una modalidad, el anticuerpo de la invención tiene una kd mayor que 10"3 sec"1 cuando se determina por medio del método de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en este documento y una avidez menor que 5 nM, tal como menor que 1 nM, por ejemplo menor que 0.2 nM cuando se determina por medio del método de avidez descrito en el Ejemplo 22 en este documento.
En otra modalidad, el anticuerpo de la invención tiene una kd mayor que 10"3 sec"1, cuando se determina por medio del método de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en este documento y/o una ka mayor que 5 x 104, Mol"1 sec'1 cuando se determina por medio del método de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en este documento.
En una modalidad adicional, el anticuerpo no exhibe un enlace al tejido saludable, en particular no exhibe enlace a glomérulos humanos, por ejemplo como se determina en el ensayo descrito en el Ejemplo 23, pero exhibe enlace a tumores pancreáticos, por ejemplo como se determina en el ensayo descrito en el Ejemplo 23 en este documento.
En una modalidad aún adicional, el anticuerpo es efectivo en la inhibición del crecimiento de tumores BX-PC3 establecidos cuando se determina por medio del método descrito en el Ejemplo 26 en este documento.
En otra modalidad, el anticuerpo de la invención tiene una o más de las siguientes propiedades: inhibición de la proliferación, inhibición de la angiogénesis de tumores, inducción de la apoptosis de células tumorales, enlace al Factor Tisular alternativamente empalmado.
En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención compite por el enlace al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID N0:65, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 1 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 57, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 5 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 61, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 69, e) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73, f) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 77, g) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 81, h) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 85, i) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 89, j) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93, k) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97, 1) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:101, m) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 105 o n) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:109 En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se enlaza al mismo epítopo en el Factor Tisular que un anticuerpo que tiene: a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 1 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 57 , c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 5 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 69, e) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73, f) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 77, g) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:81, h) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 85, i) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 89, j) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93, k) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97, 1) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO.101, m) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:105 o n) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID N0:109.
En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención comprende: una región variable de cadena pesada derivada de una secuencia de VH de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste de: IGHV1-18*01, IGHV3-23*01, IGHV3-30*01, IGHV3-33*01, IGHV3-33*03, IGHVl-69*20, IGHVl-69*04 e IGHV5- 51*01 y/o una región variable de cadena ligera derivada de una secuencia de VK de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste de: IGKV3-20*01, IGKV1-13*02, IGKV3-11*01 e IGKV1D-16*01.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-TF que comprende una región VH que tiene la secuencia expuesta en las SEC ID NO: 9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 o 53 o una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
La variante de la secuencia expuesta en las SEC ID NO:9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 o 53 puede tener por lo menos 80% de identidad con cualquiera de las secuencias, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo monoclonal anti-TF aislado comprende una secuencia de VL expuesta en las SEC ID NO:65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 o 105 o una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras .
La variante de la secuencia expuesta en las SEC ID NO:65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 o 105 puede tener por lo menos 80% de identidad con cualquiera de las secuencias, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad, el anticuerpo comprende a) una región VL que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NO: 65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 o 105 y una región VH que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID N0:9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 o 53, b) una variante de cualquiera de las anteriores, en donde la variante solo tiene preferiblemente sustituciones conservadoras en las secuencias.
En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 65 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO : 9 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 9 o la SEC ID NO: 65 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 57 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO : 1 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO : 1 o la SEC ID NO: 57 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 61 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO : 5 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO : 5 o la SEC ID NO: 61 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región. VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 69 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 13 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 13 o la SEC ID NO: 69 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 73 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 17 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 17 o la SEC ID NO: 73 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 77 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 21 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 21 o la SEC ID NO: 77 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 81 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 25 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 25 o la SEC ID NO: 81 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 85 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 29 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 29 o la SEC ID NO: 85 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 89 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 33 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 33 o la SEC ID NO: 89 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 93 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 37 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 37 o la SEC ID NO: 93 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 97 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 41 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 41 o la SEC ID NO: 97 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 101 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 45 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 45 o la SEC ID NO: 101 respectivamente, tal como por lo menos 85% de / identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 105 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 49 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 49 o la SEC ID NO: 105 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende una región VL que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 109 y una región VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 53 o una variante de cualquiera de las dos secuencias, las variantes tienen ya sea a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tal como sustituciones conservadoras o b) por lo menos 80% de identidad con la SEC ID NO: 53 o la SEC ID NO: 109 respectivamente, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden producir por ejemplo por medio del método de hibridoma descrito primero por Kohler y colaboradores, Nature 256 , 495 (1975) o se pueden producir por medio de métodos de ADN recombinante . Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de colecciones de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y colaboradores, Nature 352 , 624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener de cualquier fuente adecuada. De esta manera, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener de hibridomas preparados a partir de células B esplénicas de murino obtenidas de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo en forma de células que expresan el antígeno sobre la superficie o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés. Los anticuerpos monoclonales también se pueden obtener de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de humanos o mamíferos no humanos inmunizados tales como ratas, conejos, perros, primates, etcétera.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el factor tisular se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmune humano preferiblemente que el sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en este documento como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y son referidos colectivamente en este documento como "ratones transgénicos" .
El ratón HuMAb contiene minisitios de un gen de inmunoglobulina humana que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana no reordenadas de cadena variable y constante pesada (µ y ?) y variable y constante ligera (?) , junto con mutaciones fijadas como objetivo que inactivan los sitios endógenos de cadena µ y ? (Lonberg, N. y colaboradores, Nature 368, 856-859 (1994)). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o ? de ratón en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos introducidos de cadena pesada y ligera se someten al cambio de clase y la mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgG,K humanos de alta afinidad (Lonberg, N. y colaboradores, (1994) , supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113 , 49-101 (1994) , Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol . Vol . 13_ 65-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995) ) . La preparación de ratones HuMAb se describe en detalle en Taylor, L. y colaboradores, Nucleic Acids Research 2_0, 6287-6295 (1992) , Chen, J. y colaboradores, International Immunology 5_, 647-656 (1993) , Tuaillon y colaboradores, J. Immunol. 152 , 2912-2920 (1994), Taylor, L. y colaboradores, International Immunology 6_, 579-591 (1994), Fishwild, D. y colaboradores, Nature Biotechnology 14_, 845-851 (1996) . Véase también los documentos US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, O 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.
Los ratones HCo7 tienen una alteración JKD en sus genes endógenos de cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen y colaboradores, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgen de cadena ligera kappa humano KCo5 (como se describe en Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14_, 845-851 (1996) ) y un transgen de cadena pesada humano HCo7 (como se describe en el documento US 5,770,429).
Los ratones HCol2 tienen una alteración JKD en sus genes endógenos de cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen y colaboradores, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgen de cadena ligera kappa humano KCo5 (como se describe en Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14_, 845-851 (1996) ) y un transgen de cadena pesada humano HCol2 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424) .
En la cepa de ratones KM, el gen endógeno de cadena ligera kappa de ratón ha sido alterado homocigosamente como se describe en Chen y colaboradores, EMBO J. 12_, 811-820 (1993) y el gen endógeno de cadena pesada de ratón ha sido alterado homocigosamente como se describe el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratones lleva un transgen de cadena ligera kappa humano, KCo5, como se describe en Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14_, 845-851 (1996) . Esta cepa de ratones también lleva un transcromosoma de cadena pesada humano compuesto del fragmento del cromosoma 14 hCF (SC20) como se describe en el documento O 02/43478.
Los esplenocitos de estos ratones transgénicos se pueden utilizar para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con técnicas bien conocidas. Los anticuerpos monoclonales o policlonales humanos de la presente invención, o los anticuerpos de la presente invención que se originan de otras especies, también se pueden generar de manera transgénica a través de la generación de otro mamífero no humano o planta que es transgénico para las secuencias de interés de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina y la producción del anticuerpo de una forma recuperable del mismo. En relación con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos se pueden producir en, y se pueden recuperar de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véase por ejemplo los documentos US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 y US 5, 741, 957.
Además, los anticuerpos humanos de la presente invención o los anticuerpos de la presente invención de otras especies se pueden generar a través de tecnologías de tipo expresión que incluyen, sin limitación, expresión en fagos, expresión retroviral, expresión ribosomal y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en el campo y las moléculas resultantes se pueden sujetar a la maduración adicional, tal como la maduración por afinidad, estas técnicas son bien conocidas en el campo (véase por ejemplo Hoogenboom y colaboradores, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (expresión en fagos) , Vaughan y colaboradores, Nature Biotech 14, 309 (1996) (expresión en fagos) , Hanes y Plucthau, PNAS EUA 94, 4937-4942 (1997) (expresión ribosomal) , Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (expresión en fagos) , Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla y colaboradores, PNAS EUA 6378-6382 (1990), Russel y colaboradores, Nucí. Acids Research 21, 1081-1085 (1993) , Hogenboom y colaboradores, Immunol . Reviews 130 , 43-68 (1992), Chis ell y McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) y el documento US 5,733,743). Si se utilizan tecnologías de expresión para producir anticuerpos que no son humanos, estos anticuerpos se pueden humanizar.
El anticuerpo de la invención puede ser de cualquier isotipo. La selección del isotipo será guiada típicamente por las funciones efectoras deseadas, tal como la inducción de ADCC. Los isotipos ejemplares son IgGl , IgG2 , IgG3 e IgG4. Se puede utilizar cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera humanas, kappa o lambda. Si se desea, la clase de un anticuerpo anti-TF de la presente invención puede ser cambiada por medio de métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que fue originalmente IgM puede se cambiado de clase a un anticuerpo IgG de la presente invención. Además, las técnicas de cambio de clase se pueden utilizar para convertir una subclase de IgG a otra, por ejemplo de IgGl a IgG2. De esta manera, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención puede ser cambiada por medio del cambio de isotipo a, por ejemplo, un anticuerpo de IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgD, IgA, IgE o IgM para varios usos terapéuticos. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de IgGl, por ejemplo una IgGl,K.
En una modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente un anticuerpo de IgGl, en particular un anticuerpo de IgGl,K. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena individual.
Los fragmentos de anticuerpos se pueden obtener por ejemplo por medio de la fragmentación utilizando técnicas convencionales y los fragmentos se pueden seleccionar por la utilidad de la misma manera que aquella descrita en este documento para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab' )2 se pueden generar al tratar un anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab' )2 resultante se puede tratar para reducir las conexiones de disulfuro para producir fragmentos Fab' . Los fragmentos Fab se pueden obtener al tratar un anticuerpo de IgG con papaína; los fragmentos Fab' se pueden obtener con la digestión con pepsina del anticuerpo de IgG. Un fragmento F(ab') también se puede producir al enlazar el Fab' descrito posteriormente por vía de un enlace de tioéter o un enlace de disulfuro. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo obtenido al cortar un enlace de disulfuro de la región de rótula del F(ab')2- El fragmento Fab' se puede obtener al tratar un fragmento F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol . El fragmento de anticuerpo también se puede generar por medio de la expresión de ácidos nucleicos que codifican estos fragmentos en células recombinantes (véase por ejemplo Evans y colaboradores, J. Immunol . Meth. 184 , 123-38 (1995)). Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de un fragmento F(ab')2 podría incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y una región de rótula de la cadena H, seguidos por un codón de detención de traducción para producir esta molécula truncada de fragmento de anticuerpo.
En una modalidad, el anticuerpo anti-TF es un anticuerpo monovalente, preferiblemente un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab) (incorporado en este documento a manera de referencia) que tiene una supresión de la región de rótula. Por consiguiente, en una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monovalente, en donde el anticuerpo anti-TF se construye por medio de un método que comprende : i) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monovalente, la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo anti-TF específico para el antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica la región CL constante de una Ig, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y la secuencia de nucleótidos que codifica la región CL de una Ig se unen juntas de manera operable, y en donde, en el caso de un subtipo de IgGl, la secuencia de nucleótidos que codifica la región CL ha sido modificada de tal manera que la región CL no contiene ningún aminoácido capaz de formar enlaces de disulfuro o enlaces covalentes con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CL en presencia de la IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano; ii) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo monovalente, la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica la región CH constante de una Ig humana, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región CH ha sido modificada de tal manera que la región que corresponde a la región de rótula y, como es requerido por el subtipo de Ig, otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprenden ningún residuo de aminoácido el cual participa en la formación de enlaces de disulfuro o enlaces inter-cadena pesada covalentes o no covalentes estables con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CH de la Ig humana en presencia de una IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y la secuencia de nucleótidos que codifica la región CH de la Ig se unen juntas de manera operable; üi) proporcionar un sistema de expresión de células para producir el anticuerpo monovalente; iv) producir el anticuerpo monovalente al coexpresar las construcciones de ácido nucleico de (i) y (ii) en células del sistema de expresión de células de (iii) .
Similarmente , en una modalidad, el anticuerpo anti- TF es un anticuerpo monovalente, el cual comprende (i) una región variable de un anticuerpo de la invención como se describe en este documento o una parte de enlace a antígenos de la región y (ii) una región CH de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, que comprende las regiones CH2 y CH3 , en donde la región CH o un fragmento de la misma ha sido modificada de tal manera que la región que corresponde a la región de rótula y, si la inmunoglobulina no es un subtipo IgG4( otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprenden ningún residuo de aminoácido, el cual es capaz de formar enlaces de disulfuro con una región CH idéntica u otros enlaces inter-cadena pesada covalentes o no covalentes estables con una región CH idéntica en presencia de la IgG humana policlonal.
En una modalidad adicional, la cadena pesada del anticuerpo anti-TF monovalente ha sido modificada de tal manera que la rótula completa ha sido suprimida.
En una modalidad adicional, el anticuerpo monovalente es del subtipo IgG4 (véase la SEC ID NO: 114, una variante sin rótula de la SEC ID NO: 113), pero la región CH3 ha sido modificada de modo que se han hecho una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Thr (T) en la posición 234 ha sido reemplazado por Ala (A) ; Leu (L) en la posición 236 ha sido reemplazado por Ala (A) ; Leu (L) en la posición 236 ha sido reemplazado por Val (V) ; Phe (F) en la posición 273 ha sido reemplazado por Ala (A) ; Phe (F) en la posición 273 ha sido reemplazado por Leu (L) ; Tyr (Y) en la posición 275 ha sido reemplazado por Ala (A) .
En otra modalidad adicional, la secuencia del anticuerpo monovalente ha sido modificada de modo que no comprende ningún sitio receptor para la glicosilación unida a N.
Los anticuerpos anti-TF de la invención también incluyen anticuerpos de cadena individual. Los anticuerpos de cadena individual son péptidos en los cuales las regiones Fv de cadena pesada y ligera están conectadas. En una modalidad, la presente invención proporciona una Fv de cadena individual (scFv) en donde las cadenas pesadas y ligeras en la Fv de un anticuerpo anti-TF de la presente invención se unen con un conector peptídico flexible (típicamente de aproximadamente 10, 12, 15 o más residuos de aminoácidos) en una cadena de péptidos individual. Los métodos para producir estos anticuerpos se describen por ejemplo en el documento US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg and Moore eds . Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994) , Bird y colaboradores, Science 242 , 423-426 (1988), Huston y colaboradores, PNAS EUA 85, 5879-5883 (1988) y McCafferty y colaboradores, Nature 348 , 552-554 (1990) . El anticuerpo de cadena individual puede ser monovalente, si se utiliza únicamente una VH y VL individuales, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL.
En una modalidad, el anticuerpo anti-TF de la invención es un anticuerpo deficiente de la función efectora. Estos anticuerpos son particularmente útiles cuando el anticuerpo es para el uso en la estimulación del sistema inmune a través del bloqueo de los efectos inhibitorios del TF. Para estas aplicaciones, puede ser ventajoso que el anticuerpo no tenga funciones efectoras, tal como la ADCC, ya que pueden conducir a una citotoxicidad indeseada.
En una modalidad, el anticuerpo anti-TF deficiente de la función efectora es un anticuerpo de IgG4 estabilizado. Los ejemplos de anticuerpos de IgG4 estabilizados, adecuados son anticuerpos en donde la arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada de la IgG4 humana, la cual se indica en el índice EU como en Kabat y colaboradores, es sustituida por lisina, treonina, metionina o leucina, preferiblemente lisina (descrito en el documento WO2006033386 (Kirin) ) y/o en donde la región de rótula comprende una secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys .
En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-TF de IgG4 estabilizado es un anticuerpo de IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición que corresponde a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, lie y Leu en la posición que corresponde a 405 y en donde el anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales, pero no comprende una secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys en la región de rótula. Preferiblemente, el anticuerpo comprende un residuo de Lys o Ala en la posición que corresponde a 409 o la región CH3 del anticuerpo ha sido reemplazada por la región CH3 de una IgGl humana, de una IgG2 humana o de una IgG3 humana.
En una modalidad aún adicional, el anticuerpo anti-TF de IgG4 estabilizado es un anticuerpo de IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición que corresponde a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, lie y Leu en la posición que corresponde a 405 y en donde el anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys en la región de rótula. Preferiblemente, el anticuerpo comprende un residuo de Lys o Ala en la posición que corresponde a 409 o la región CH3 del anticuerpo ha sido reemplazada por la región CH3 de una IgGl humana, de una IgG2 humana o de una IgG3 humana.
En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-TF deficiente de la función efectora es un anticuerpo de un tipo diferente de IgG4, por ejemplo IgGl, IgG2 o IgG3 el cual ha sido mutado de tal manera que la capacidad para mediar las funciones efectoras, tal como la ADCC, ha sido reducida o incluso eliminada. Estas mutaciones han sido descritas por ejemplo en Dall'Acqua F y colaboradores, J Immunol . 177 (2) : 1129-1138 (2006) y Hezareh M, J Virol.; 75 (24) : 12161-12168 (2001) .
En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se conjuga con otra porción, tal como una porción citotóxica, un radioisótopo o un fármaco. Estos anticuerpos se pueden producir al conjugar químicamente la otra porción al lado N-terminal o al lado C-terminal del anticuerpo anti-TF o un fragmento del mismo (por ejemplo, una cadena H, cadena L de anticuerpo anti-TF o un fragmento específico/selectivo anti-TF de las mismas) (véase, por ejemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Estos derivados de anticuerpo conjugados también se pueden generar por medio de la conjugación en residuos o azúcares internos, donde sea apropiado.
En general, los anticuerpos anti-TF descritos en este documento se pueden modificar por medio de la inclusión de cualquier número adecuado de estos aminoácidos modificados y/o asociaciones con estos sustituyentes conjugados. La idoneidad en este contexto se determina generalmente por la capacidad de retener por lo menos sustancialmente la selectividad y/o especificidad hacia el TF asociada con el anticuerpo anti-TF precursor no derivatizado . La inclusión de uno o más aminoácidos modificados puede ser ventajosa en, por ejemplo, el incremento de la vida media en el suero de polipéptidos , la reducción de la antigenicidad de polipéptidos o el incremento de la estabilidad en almacenamiento de polipéptidos. El (los) aminoácido (s) se modifica(n), por ejemplo, de manera co-traducción o postraducción durante la producción recombinante (por ejemplo, glicosilación unida a N en las configuraciones N-X-S/T durante la expresión en células de mamífero) o es (son) modificado (s) por medios sintéticos. Los ejemplos no limitantes de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glicosilado, aminoácido sulfatado, aminoácido prenilado (por ejemplo, farnesilado, geranilgeranilado) , aminoácido acetilado, aminoácido acilado, aminoácido conjugando con PEG, aminoácido biotinilado, aminoácido carboxilado, aminoácido fosforilado y similares. Las referencias adecuadas para guiar a una persona de experiencia en la modificación de aminoácidos están saturadas por toda la bibliografía. Los protocolos ejemplares se encuentran en Walker (1998) Protein Protocols On Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ. El aminoácido modificado se puede seleccionar por ejemplo de un aminoácido glicosilado, aminoácido conjugado con PEG, aminoácido farnesilado, aminoácido acetilado, aminoácido biotinilado, aminoácido conjugado con una porción de lípido o aminoácido conjugado con un agente de derivatización orgánico.
Los anticuerpos anti-TF también se pueden modificar químicamente por medio de la conjugación covalente a un polímero para incrementar por ejemplo su vida media en circulación. Los polímeros ejemplares, y los métodos para unirlos a los péptidos, se ilustran por ejemplo en los documentos US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 y US 4,609,546. Los polímeros ilustrativos, adicionales, incluyen polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular entre aproximadamente 1,000 y aproximadamente 40,000, tal como entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 20,000, por ejemplo, aproximadamente 3,000-12,000 g/mol).
En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-TF que es conjugado a una segunda molécula que se selecciona de un radionúclido, enzima, substrato de enzima, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente , etiqueta de péptido o partícula magnética. En una modalidad, un anticuerpo anti-TF se puede conjugar a uno o más fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos (oligonucleótidos) , nucleasas, hormonas, inmunomoduladores , ligandos quelatantes, compuestos de boro, compuestos fotoactivos, tintes y similares. Estos y otros agentes adecuados se pueden acoplar ya sea directa o indirectamente a un anticuerpo anti-TF de la presente invención. Un ejemplo del acoplamiento indirecto de un segundo agente es el acoplamiento por medio de una porción separadora. Estos separadores, a su vez, pueden ser ya sea solubles o insolubles (véase por ejemplo Diener y colaboradores, Science 231 , 148 (1986)) y se pueden seleccionar para hacer posible la liberación del fármaco del anticuerpo anti-TF en un sitio objetivo y/o bajo condiciones particulares. Los ejemplos adicionales de agentes que se pueden acoplar a un anticuerpo anti-TF incluyen lectinas y péptidos fluorescentes.
En una modalidad, se proporcionan anticuerpos anti-TF que comprenden uno o más aminoácidos radioetiquetados . Un anticuerpo anti-TF radioetiquetado se puede utilizar para propósitos tanto de diagnóstico como terapéuticos (la conjugación a moléculas radioetiquetadas es otra característica posible) . Los ejemplos no limitantes de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no están limitadas a, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc y 1251, 1311 y 186Re. Los métodos para preparar aminoácidos radioetiquetados y derivados de péptidos relacionados son conocidos en la técnica (véase por ejemplo Junghans y colaboradores, en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición,' Chafner y Longo, eds . , Lippincott Raven (1996)) y los documentos US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 y US 5,697,902. Por ejemplo, un radioisótopo se puede conjugar por medio de un método de cloramina T.
En una modalidad, un anticuerpo anti-TF de la invención comprende un ácido nucleico conjugado o una molécula asociada con ácido nucleico. En una faceta de ese tipo de la presente invención, el ácido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotóxica. En una modalidad, el ácido nucleico conjugado es un ácido nucleico antisentido (por ejemplo una molécula antisentido fijada como objetivo S100A10. La cual también puede, ser un componente independiente en una composición de combinación o un método de administración de combinación de la presente invención -véase por ejemplo Zhang y colaboradores, J Biol Chem. 279(3) , 2053-62 (2004)). En una modalidad, el ácido nucleico conjugado es una molécula de ARN inhibitoria (por ejemplo, una molécula de AR si) . En una modalidad, el ácido nucleico conjugado es un ácido nucleico inmunoestimulador (por ejemplo una molécula de ADN que contiene una configuración de CpG inmunoestimuladora) . En una modalidad, el ácido nucleico conjugado es un cásete de expresión que codifica la expresión de un gen supresor de tumores, una vacuna anticancerosa, una citocina anticancerosa o un agente apoptótico. Estos derivados también pueden comprender la conjugación de un ácido nucleico que codifica la expresión de una o más proteínas citotóxicas, tales como toxinas de plantas y bacterias .
En una modalidad, un anticuerpo anti-TF se conjuga a una molécula de ácido nucleico funcional . Los ácidos nucleicos funcionales incluyen moléculas antisentido, moléculas de ácido nucleico interferentes (por ejemplo, moléculas de ARJSTsi) , aptámeros, ribozimas, moléculas formadoras de estructuras triplex y secuencias de guía externas. Las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica poseída por una molécula objetivo o las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden poseer una actividad de novo independiente de cualquier otra molécula.
En otra modalidad, un anticuerpo anti-TF de la invención se conjuga con un aptámero.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-TF el cual se conjuga con una ribozima .
Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo anti-TF a la(s) molécula(s) conjugada (s) , tal como aquellas descritas anteriormente, que incluyen aquellos métodos descritos por Hunter y colaboradores, Nature 144 , 945 (1962), David y colaboradores, Biochemistry 13_, 1014 (1974) , Pain y colaboradores, J. Immunol . eth. 40, 219 (1981) y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 3_0, 407 (1982) . Numerosos tipos de compuestos citotóxicos se pueden unir a proteínas a través del uso de un grupo reactivo en el compuesto citotóxico o a través del uso de un agente de reticulación. Un grupo reactivo común que formará un enlace covalente estable in vivo con una amina es el isotiocianato (Means y colaboradores, Chemical modifications of proteins (Holden-Day, San Francisco 1971) páginas 105-110) . Este grupo reacciona preferentemente con el grupo e-amina de lisina. La maleimida es un grupo reactivo utilizado comúnmente para formar un enlace covalente estable in vivo con el grupo sulfhidrilo en cisteína (Ji., Methods Enzymol 91, 580-609 (1983) ) . Los anticuerpos monoclonales son incapaces típicamente de formar enlaces covalentes con iones de radiometal, pero se pueden unir al anticuerpo indirectamente a través del uso de agentes quelatantes que se unen covalentemente a los anticuerpos. Los agentes quelatantes se pueden unir a través de aminas (Meares y colaboradores, Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) y grupos sulfhidral (Koyama, Chem. Abstr. 120 , 217262t (1994)) de residuos de aminoácidos y también a través de grupos de carbohidratos (Rodwell y colaboradores, PNAS EUA 83, 2632-2636 (1986), Quadri y colaboradores, Nucí. Med. Biol . 20_, 559-570 (1993)). Puesto que estos agentes quelatantes contienen dos tipos de grupos funcionales, uno para enlazarse a iones de metal y el otro para unir el quelato al anticuerpo, son referidos comúnmente como agentes quelatantes bifuncionales (Sundberg y colaboradores, Nature 250 , 587-588 (1974) ) .
En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF humano, conjugado a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Estos conjugados son referidos en este documento como "inmunoconjugados" . Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son referidos como "inmunotoxinas" .
Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que elimine) las células. Para una descripción de estas clases de fármacos las cuales son bien conocidas en la técnica, y sus mecanismos de acción, véase Goodman y colaboradores, Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8a Ed. , Macmillan Publishing Co . , 1990. Las técnicas adicionales que son relevantes para la preparación de inmunotoxinas de anticuerpos se proporcionan por ejemplo en Vitetta, Immunol . Today 14, 252 (1993) y el documento US 5,194,594.
Los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidro-testosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina) , agentes de alquilación (tales como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida , busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, mitomicina C, cisplatina y otros derivados de platino, tal como carboplatina) antibióticos (tales como dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) , doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) ) , toxina de difteria y moléculas relacionadas (tales como cadena de difteria A y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas) , toxina de ricina (tales como ricina A o una toxina de cadena de ricina A desglicosilada) , toxina del cólera, una toxina tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV) , toxina LT, toxina C3 , toxina Shiga, toxina pertussis, toxina del tétanos, inhibidor de proteasa Bowman-Birk de soya, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y toxinas de enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas incluyen ribonucleasa (R asa) , DNasa I, enterotoxina-A de Staphylococcus , proteína antiviral de hierba carmesí, toxina de difterina y endotoxina de Pseudomonas . Véase, por ejemplo, Pastan y colaboradores, Cell 47, 641 (1986) y Goldenberg, Calif. A Cáncer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Los agentes terapéuticos, los cuales se pueden administrar en combinación con un anticuerpo anti-TF de la presente invención como se describe en alguna otra parte en este documento, también pueden ser candidatos para porciones terapéuticas que son útiles para la conjugación con un anticuerpo anti-TF de la presente invención.
En una modalidad, el anticuerpo anti-TF de la presente invención se une a un conector quelatante, por ejemplo tiuxetan, el cual permite que el anticuerpo sea conjugado con un radioisótopo.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo anti-TF de la invención como se describiera anteriormente en este documento y una segunda especificidad de enlace, tal como una especificidad de enlace hacia una célula efectora humana, un receptor Fe humano o un receptor de células T. 0 una especificidad de enlace hacia otro epítopo del TF.
Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden incluir además una tercera especificidad de enlace, además de una especificidad de enlace anti-TF y una especificidad de enlace hacia una célula efectora humana, un receptor Fe humano o un receptor de células T.
Las moléculas de anticuerpos biespecíficas , ejemplares de la invención comprenden (i) dos anticuerpos uno con una especificidad hacia el TF y otro hacia un segundo objetivo que se conjugan juntos, (ii) un anticuerpo individual que tiene una cadena específica para el TF y una segunda cadena específica para una segunda molécula y (iii) un anticuerpo de cadena individual que tiene especificidad hacia el TF y una segunda molécula. Típicamente, el segundo objetivo/segunda molécula es una molécula diferente del TF. En una modalidad, la segunda molécula es un antígeno de cáncer/antígeno asociado con tumores tal como un antígeno carcinoembriónico (CEA) , antígeno específico de la próstata (PSA) , RAGE (antígeno renal) , a-fetoproteína, CAMEL (antígeno reconocido por CTL en el melanoma) , antígenos de CT (tales como MAGE-B5, -B6 , -C2, -C3 y D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE y SAGE) , antígenos de mucina (por ejemplo, MUC1, mucina-CA125 , etcétera), antígenos de gangliosida, tirosinasa, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7 y Ep-CAM. En una modalidad, la segunda molécula es una integrina asociada con el cáncer, tal como la integrina a5ß3. En una modalidad, la segunda molécula es un factor angiogénico u otro factor de crecimiento asociado con el cáncer, tal como un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , angiogenina y receptores de los mismos, particularmente receptores asociados con el progreso del cáncer (por ejemplo uno de los receptores HER1-HER4 , c-met o RON). Otras proteínas asociadas con el progreso del cáncer planteadas en este documento también pueden ser las segundas moléculas adecuadas.
En una modalidad, un anticuerpo biespecífico de la presente invención es un diacuerpo. Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en un heteroconjugado se puede acoplar a avidina y el otro a biotina. Estos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células indeseadas (véase por ejemplo el documento US 4,676,980) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer utilizando cualquier método de reticulación conveniente.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión que codifica un anticuerpo de la invención .
En una modalidad, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 1 - 112.
En otra modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de VH seleccionadas del grupo que consiste de: las SEC ID NO:9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 y 53.
En una modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de CDR3 VH seleccionadas del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 y 56.
En otra modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de VL seleccionadas del grupo que consiste de: las SEC ID NO:65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 y 105.
En otra modalidad, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de CDR3 VL seleccionadas del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104 y 108.
En una modalidad particular, el vector de expresión de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica variantes de una o más de las secuencias de aminoácidos anteriores, las variantes tienen a lo sumo 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras o por lo menos 80% de identidad con cualquiera de las secuencias, tal como por lo menos 85% de identidad o 90% de identidad o 95% de identidad, tal como 96% de identidad o 97% de identidad o 98% de identidad o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.
En una modalidad adicional, el vector de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de una cadena ligera, una cadena pesada o cadenas tanto ligeras como pesadas de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo humano.
Estos vectores de expresión se pueden utilizar para la producción recombinante de anticuerpos de la invención.
Un vector de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo vectores de ácidos nucleicos cromosómicos , no cromosómicos y sintéticos (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de expresión) . Los ejemplos de estos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos y vectores de ácido nucleico viral (ARN o ADN) . En una modalidad, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-TF está comprendido en un vector de ADN o ARN desnudo, que incluye, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe por ejemplo en Sykes y Johnston, Nat Biotech 17 , 355-59 (1997)), un vector de ácido nucleico compactado (como se describe por ejemplo en los documentos US 6,077,835 y/o O 00/70087) , un vector de plásmido tal como pBR322, pUC 19/18 o pUC 118/119, un vector de ácido nucleico dimensionado mínimamente de "mosquito" como se describe por ejemplo en Schakowski y colaboradores, Mol Ther 3_, 793-800 (2001) ) o como una construcción precipitada de vector de ácido nucleico, tal como una construcción precipitada de CaP04 (como se describe por ejemplo en el documento WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS EUA 83^, 9551-55 (1986) , Wigler y colaboradores, Cell 14, 725 (1978) y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 1_, 603 (1981)) . Estos vectores de ácido nucleico y el uso de los mismos son bien conocidos en el campo (véase por ejemplo los documentos US 5,589,466 y US 5,973,972) .
En una modalidad, el vector es adecuado para la expresión del anticuerpo anti-TF en una célula bacteriana. Los ejemplos de estos vectores incluyen vectores de expresión tales como BlueScriptMR (Stratagene) , vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264 , 5503-5509 (1989) , vectores pET (Novagen, Madison WI) y similares) .
Un vector de expresión puede ser también o alternativamente un vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Se puede emplear cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constituíbles o inducibles tal como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubel y colaboradores, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y iley InterScience Nueva York (1987) y Grant y colaboradores, Methods in Enzymol 153 , 516-544 (1987) ) .
Un ácido nucleico y/o vector también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de secreción/localización, la cual puede dirigir un polipéptido, tal como una cadena de polipéptido insipiente, al espacio periplásmico o dentro de medios de cultivo de células. Estas secuencias son conocidas en el campo e incluyen péptidos líderes o de señal de secreción, secuencias de fijación como objetivo de orgánulos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención E , secuencias de tránsito mitocondriales , secuencias de tránsito de cloroplastos) , secuencias de localización/anclaje a la membrana (por ejemplo, secuencias de transferencia de detención, secuencias de anclaje a GPI) y similares.
En un vector de expresión de la invención, los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-TF pueden comprender o pueden estar asociados con cualquier promotor, potenciador u otros elementos que facilitan la expresión adecuados. Los ejemplos de estos elementos incluyen promotores de expresión fuertes (por ejemplo, promotor/potenciador de C V-IE humano así como también promotores de RSV, SV40, SL3-3, MMTV y HIV LTR) , secuencias de terminación poli (A) efectivas, un origen de replicación para el producto plásmido en E. coli, un gen de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable y/o un sitio de clonación conveniente (por ejemplo, un policonector) . Los ácidos nucleicos también pueden comprender un promotor inducible en lugar de un promotor constitutivo tal como CMV-IE (el artífice experto reconocerá que estos términos son realmente descriptores de un grado de expresión de genes bajo ciertas condiciones) .
En una modalidad, el vector de expresión que codifica anticuerpos anti-TF se puede colocar en y/o se puede suministrar a la célula hospedera o animal hospedero por vía de un vector viral.
En un aspecto aún adicional, la invención se refiere a una célula hospedera eucariótica o procariótica recombinante, tal como un transfectoma, que produce un anticuerpo de la invención como se define en este documento o una molécula biespecífica de la invención como de define en este documento. Los ejemplos de células hospederas incluyen células de levadura, de bacterias y de mamíferos, tales como células de CHO o HEK. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico integrado de manera estable en el genoma celular que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti-TF de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmido, fagémido o elemento de expresión lineal, el cual comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti-TF de la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un hibridoma el cual produce un anticuerpo de la invención como se define en este documento. En un aspecto aún adicional, la invención se refiere a un animal no humano transgénico que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, en donde el animal o planta produce un anticuerpo de la invención. La generación de estos hibridomas y animales transgénicos ha sido descrita anteriormente.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo anti-TF de la invención, el método comprende los pasos que consisten en a) cultivar un hibridoma o una célula hospedera de la invención como se describiera anteriormente en este documento y b) purificar el anticuerpo de la invención de los medios de cultivo.
En un aspecto principal adicional, la invención se refiere a un anticuerpo anti-TF como se define en este documento o una molécula biespecífica como se define en este documento para el uso como medicamento.
En un aspecto aún adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende: - un anticuerpo anti-TF como se define en este documento o una molécula biespecífica como se define en este documento y - un portador farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como también cualquier otro adyuvante o excipiente conocido de acuerdo con técnicas convencionales tales como aquellas dadas a conocer en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edición, Gennaro, Ed. , Mack Publishing Co . , Easton, PA, 1995.
Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como también cualquier otro adyuvante o excipiente conocido deben ser adecuados para el compuesto seleccionado de la presente invención y el modo de administración seleccionado. La idoneidad para los portadores y otros componentes de las composiciones farmacéuticas se determina con base en la falta de un impacto negativo significativo sobre las propiedades biológicas deseadas del compuesto o composición farmacéutica seleccionado de la presente invención (por ejemplo, menos de un impacto sustancial (inhibición relativa de 10% o menos, inhibición relativa de 5% o menos, etcétera)) sobre el enlace a antígenos .
Una composición farmacéutica de la presente invención también puede incluir diluyentes, materiales de relleno, sales, amortiguadores, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20MR o Tween-80MR) , estabilizadores (por ejemplo, azúcares o aminoácidos libres de proteínas), conservadores, fijadores de tejido, solubilizadores y/u otros materiales adecuados para la inclusión en una composición farmacéutica.
Se ha reportado que en las células cancerosas, tales como las células de cáncer colorrectal humano, la expresión del TF está bajo el control de 2 eventos de transformación principales que impulsan el progreso de la enfermedad (activación del oncogén K-ras e inactivación del supresor de tumores p53), de una manera dependiente de la proteína cinasa activada por MEK/mitógeno (MAPK) y fosfatidilinositol 3' -cinasa (PI3K) (Yu y colaboradores (2005) Blood 105:1734.
Las células cancerosas que sobreexpresan el TF pueden ser objetivos particularmente buenos para los anticuerpos anti-TF de la invención, puesto que se pueden enlazar más anticuerpos por célula. De esta manera, en una modalidad, un paciente que padece cáncer que es tratado con un anticuerpo anti-TF de la invención es un paciente, por ejemplo un paciente que padece cáncer pancreático, cáncer pulmonar o cáncer colorrectal quien ha sido diagnosticado que tiene una o más mutaciones en K-Ras y/o una o más mutaciones en p53 en sus células tumorales.
En una modalidad alternativa, el paciente que es tratado con un anticuerpo anti-TF de la invención es un paciente, por ejemplo un paciente que padece cáncer pancreático, cáncer pulmonar o cáncer colorrectal, quien no tiene una mutación en K-Ras. Sin ser limitado por ninguna teoría específica, es posible que algunas células tumorales que tienen activación de K-Ras sean menos susceptibles al tratamiento con anticuerpos anti-TF, debido a que los efectos de los anticuerpos anti-TF sobre los mecanismos de señalización intracelulares pueden ser menos efectivos en células en las cuales el K-Ras está activado.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo la cual es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o la amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico anterior del paciente que es tratado y factores similares que son bien conocidos en las técnicas médicas .
La composición farmacéutica se puede administrar por medio de cualquier ruta y modo adecuado. Las rutas adecuadas para la administración de un compuesto de la presente invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y pueden ser seleccionadas por aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica.
En una modalidad, una composición farmacéutica de la presente invención se administra por la ruta parenteral .
Las frases "administración parenteral" y "administrado por la ruta parenteral" utilizadas en este documento significan modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por medio de una inyección, e incluyen la inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardíaca , intradérmica, intraperitoneal , intratendinosa, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , intracraneal, intratorácica , epidural e intraesternal .
En una modalidad, esa composición farmacéutica se administra por medio de una inyección o infusión intravenosa o subcutánea.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y la totalidad de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes de isotonicidad, antioxidantes y agentes retardantes de la absorción adecuados y similares que son compatibles fisiológicamente con un compuesto de la presente invención.
Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados los cuales se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de olivo, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón y aceite de ajonjolí, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa , goma de tragacanto y ásteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo y/o varios amortiguadores. Otros portadores son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce el campo. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención está contemplado.
La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por medio del uso de surfactantes .
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables por ejemplo (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelatantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético, (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender agentes de isotonicidad, tales como azúcares, polialcoholes , tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro de sodio en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la ruta de administración seleccionada tales como conservadores, agentes de humedecimiento, agentes de emulsión, agentes de dispersión, conservadores o amortiguadores, los cuales pueden mejorar la vida útil en almacenaje o la efectividad de la composición farmacéutica. Los compuestos de la presente invención se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados . Estos portadores pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polímeros biodegradables , biocompatibles tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico solo o con una cera u otros materiales bien conocidos en la técnica. Los métodos para la preparación de estas formulaciones son conocidos generalmente para aquellas personas expertas en la técnica. Véase por ejemplo, Sustained y Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En una modalidad, los compuestos de la presente invención se pueden formular para asegurar la distribución apropiada in vivo. Los portadores farmacéuticamente aceptables para la administración parenteral incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables, estériles. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención está contemplado.
Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas para la inyección deben ser típicamente estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada que sea adecuada para una alta concentración de fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión acuoso o no acuoso que contiene por ejemplo agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por medio del uso de surfactantes . En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como glicerol, manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede propiciar al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables, estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes por ejemplo, como se enumeraron anteriormente, como se requiera, seguido por la microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos por ejemplo de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables, estériles, los ejemplos de métodos de preparación son el secado al vacío y secado por congelamiento ( liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado, adicional de una solución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo.
Las soluciones inyectables, estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por la microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables, estériles, los ejemplos de métodos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelamiento ( liofilización) que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado, adicional de una solución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un compuesto de la presente invención o una combinación de compuestos de la presente invención .
Como se describiera anteriormente, en un aspecto, la invención se refiere al anticuerpo de la invención como se define en este documento o una molécula biespecífica de la invención como se define en este documento para el uso como medicamento .
Los anticuerpos anti-TF de la invención se pueden utilizar para una variedad de propósitos. En particular, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para el tratamiento de varias formas de cáncer. En un aspecto, los anticuerpos monoclonales anti-TF de la invención se utilizan para el tratamiento de varios tipos de cánceres sólidos tales como: tumores del sistema nervioso central, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pulmonar (tal como cáncer pulmonar de células no pequeñas) , cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer hepático y biliar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer prostético, cáncer endometrial, cáncer ovárico, melanoma maligno, sarcoma (tejido suave por ejemplo hueso y músculo) , tumores de origen primario desconocido (es decir primarios desconocidos) , leucemia, cáncer de médula ósea (tal como mieloma múltiple) , leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y linfoma no Hodgkiniano, cáncer de piel, glioma, cáncer del cerebro, útero y recto.
Además la inflamación autoinmune, tal como miopatías o esclerosis múltiple, se puede fijar como objetivo con los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención .
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de hemostasia .
Los trastornos hemostáticos relacionados con el cáncer también pueden ser fijados como objetivo con la presente intervención.
Las enfermedades adicionales con inflamación, tales como miopatías, artritis reumatoide, osteoartritis , espondilitis anquilosante, gota, espondiloartropatías , espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artropatía psoriática, espondilitis enterapátrica, artropatía juvenil, artropatía reactiva, artritis infecciosa o pos-infecciosa, artritis tuberculosa, artritis viral, artritis fungal, artritis sifilítica, glomerulonefritis , enfermedad renal en etapa terminal, lupus eritematoso sistémico, enterocolitis regional, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino, fibrosis cística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma, asma alérgico, bronquitis, bronquiolitis aguda, bronquiolitis crónica, fibrosis pulmonar idiopática o esclerosis múltiple se pueden fijar como objetivo con los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de la hemostasia .
Las enfermedades hemostáticas relacionadas con el cáncer también pueden ser fijadas como objetivo con la presente intervención.
También las enfermedades vasculares tales como restenosis vascular, enfermedad vascular miocardíaca, enfermedad vascular cerebral, retinopatía y degeneración macular, inclusive pero no limitado a AMD húmeda se pueden tratar con anticuerpos monoclonales anti-TF.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de pacientes con riesgo cardiovascular, tal como aterosclerosis, hipertensión, diabetes, dislipidemia y síndrome coronario agudo, inclusive pero no limitado a Infarto de Miocardio Agudo, apoplejía.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para la inhibición de trombosis, tal como DVT, embolismo renal, embolismo pulmonar, trombosis arterial o para tratar trombosis que ocurren después de una cirugía arterial, injertos de desviación vascular periférica o injertos de desviación de arterias coronarias, derivaciones arterio-venosas , remoción de una implementación, tal como una endoprótesis o catéter.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para la inhibición de la lesión por reperfusión isquémica renal.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de la hiperlipoproteinemia, hiperparatiroidismo .
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de vasculitis, vasculitis ANCA-positiva, enfermedad de Behcet.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para bloquear una insuficiencia respiratoria inducida por un traumatismo, tal como Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda, Lesión Pulmonar Aguda.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para bloquear la disfunción de órganos inducida por infección, tal como la insuficiencia renal, Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda, Lesión Pulmonar Aguda.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para tratar varios trastornos tromboembólieos tales como aquellos que se originan de la angioplastía , infarto de miocardio, angina inestable y estenosis de arteria coronaria.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles en un entorno profiláctico para tratar complicaciones mediadas por el TF para infecciones sistémicas, tales como sepsis o neumonía.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles como un tratamiento profiláctico de pacientes con vasos ateroscleróticos en riesgo de trombosis.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de una enfermedad de injerto contra hospedero.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para incrementar el injerto de células beta en el transplante de islotes, para prevenir la vasculopatía de aloinjerto cardíaco (CAV, por sus siglas en inglés), para prevenir el rechazo agudo de injerto.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades donde están presentes micropartículas circulantes que exponen el factor tisular, tales como pero no limitadas a la trombosis vascular, diabetes tipo II, AMI , hipertensión arterial pulmonar.
Similarmente, la invención se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa el TF, que comprende la administración, a un individuo necesitado del mismo, de un anticuerpo o una molécula biespecífica de la invención. En una modalidad, la célula tumoral está implicada en el cáncer, tal como cáncer prostático, cáncer pulmonar (tal como cáncer pulmonar de células no pequeñas) , cáncer de mama, cáncer colorrectal (tal como cáncer colorrectal metastático) , cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer ovárico, melanoma cutáneo, leucemia-cáncer de la médula ósea (tal como mieloma múltiple) , leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y linforna no Hodgkiniano, cáncer de piel, cáncer de próstata, glioma, cáncer del cerebro, ríñones, útero, vejiga y recto.
También, la invención se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal que se enlaza al TF humano para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, tal como una de las indicaciones de cáncer específicas que se mencionaran anteriormente.
En una modalidad, la selección de los pacientes que son tratados con un anticuerpo anti-TF se basa en el nivel del factor tisular (TF) en su orina y/o sangre. En una modalidad particular, el paciente que es tratado tiene un nivel relativamente alto de TF en la orina y/o sangre. Por ejemplo, el paciente que es tratado puede tener un nivel de TF en la orina mayor que 20 ng/ml , tal como mayor que 40 ng/ml, por ejemplo mayor que 100 ng/ml, tal como mayor que 200 ng/ml. Alternativamente, o además, el nivel de TF en el suero de los pacientes puede ser mayor que 100 pg/ml, tal como mayor que 200 pg/ml. Esto se puede determinar por ejemplo utilizando un ensayo ELISA.
En una modalidad adicional de los métodos de tratamiento de la presente invención, la eficacia del tratamiento está siendo supervisada durante la terapia, por ejemplo en puntos de tiempo predeterminados. En una modalidad, la eficacia puede ser supervisada al medir el nivel de TF en la orina o sangre, por ejemplo por medio de un ensayo ELISA. En otra modalidad, la eficacia se puede determinar por medio de la visualización del área de la enfermedad, por ejemplo al realizar una o más exploraciones de PET-CT, por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-TF etiquetado, tal como un anticuerpo anti-TF etiquetado de la presente invención. Adicionalmente , los anticuerpos anti-TF etiquetados, tales como los anticuerpos anti-TF etiquetados de la invención, se podrían utilizar para detectar tumores productores de TF por ejemplo utilizando una exploración de PET-CT.
Los regímenes de dosificación en los métodos de tratamiento y usos anteriores se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, varias dosis divididas se pueden administrar a través del tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales se pueden formular en una forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en este documento se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que son tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la presente invención es dictada por y dependiente directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se logra y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para combinar este compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.
Las dosificaciones eficientes y los regímenes de dosificación para los anticuerpos anti-TF dependen de la enfermedad o condición que es tratada y pueden ser determinados por las personas expertas en la técnica. Un intervalo ejemplar, no limitante para una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención es aproximadamente 0.1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-50 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0.1-20 mg/kg, tal como aproximadamente 0.1-10 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0.5, aproximadamente tal como 0.3, aproximadamente 1 o aproximadamente 3 mg/kg.
Un médico o veterinario que tiene experiencia ordinaria en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar con dosis del anticuerpo anti-TF empleadas en la composición farmacéutica a niveles más bajos que aquel requerido con el propósito de lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será aquella cantidad del compuesto que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Esta dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. La administración puede ser por ejemplo intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea y por ejemplo se puede administrar cerca del sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición farmacéutica se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas por separado en intervalos apropiados durante todo el día, opcionalmente , en formas de dosificación unitarias. Mientras que sea posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto como una composición farmacéutica como se describiera anteriormente .
En una modalidad, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por medio de una infusión en una dosificación semanal de aproximadamente 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Esta administración se puede repetir, por ejemplo, de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. La administración se puede realizar por medio de una infusión continua durante un periodo de 2 a 24 horas tal como de 2 a 12 horas.
En una modalidad, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por medio de una infusión continua lenta durante un periodo prolongado, tal como más de 24 horas, con el propósito de reducir los efectos colaterales tóxicos.
En una modalidad, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar en una dosificación semanal de 250 mg a 2000 mg, tal como por ejemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, durante hasta 8 veces, tal como de 4 a 6 veces. La administración se puede realizar por medio de una infusión continua durante un periodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Este régimen se puede repetir una o más veces como sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses. La dosificación se puede determinar o ajustar al medir la cantidad de compuesto de la presente invención en la sangre con la administración al tomar por ejemplo una muestra biológica y utilizar anticuerpos anti - idiotípicos los cuales fijan como objetivo la región de enlace a antígenos de los anticuerpos anti-TF de la presente invención.
En una modalidad, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por medio de una terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un periodo de 6 meses o más.
En una modalidad, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por medio de un régimen que incluye una infusión de un anticuerpo anti-TF de la presente invención seguido por una infusión de un anticuerpo anti-TF de la presente invención conjugado con un radioisótopo. El régimen se puede repetir, por ejemplo, de 7 a 9 días después.
Como ejemplos no limitantes, el tratamiento de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar como una dosificación diaria de un compuesto de la presente invención en una cantidad de aproximadamente 0.1-100 mg/kg, tal como 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, al día, en por lo menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o alternativamente, por lo menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento o cualquier combinación de los mismos, utilizando dosis individuales o divididas durante cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas o cualquier combinación de los mismos.
Una "cantidad efectiva" para una terapia para tumores también se puede medir por su capacidad para estabilizar el progreso de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir el cáncer se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar al examinar la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento de células o para inducir la apoptosis por medio de ensayos in vitro conocidos para el practicante experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o de otra manera puede mejorar los síntomas en un sujeto. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica sería capaz de determinar estas cantidades con base en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición o ruta de administración particular seleccionada .
Un anticuerpo anti-TF también se puede administrar profilácticamente con el propósito de reducir el riesgo de desarrollar un cáncer, retardar el comienzo de la aparición de un evento en el progreso del cáncer y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión. Esto puede ser especialmente útil en pacientes en donde es difícil localizar un tumor que se sabe que está presente debido a otros factores biológicos.
Los anticuerpos anti-TF también se pueden administrar en una terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes terapéuticos que son relevantes para la enfermedad o condición que es tratada. Por consiguiente, en una modalidad, el medicamento que contiene anticuerpo es para la combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente citotóxico, quimioterapéutico o anti -antiogénico Esta administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial. Para la administración simultánea, los agentes se pueden administrar como una composición o como composiciones separadas, como sea apropiado. De esta manera, la presente invención también proporciona métodos para tratar un trastorno que involucra células que expresan el TF como se describiera anteriormente, métodos los cuales comprenden la administración de un anticuerpo anti-TF de la presente invención combinado con uno o más agentes terapéuticos adicionales como se describe posteriormente.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan el TF en un sujeto, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF de la presente invención y por lo menos un agente quimioterapéutico a un sujeto necesitado del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF de la presente invención y por lo menos un agente quimioterapéutico a un sujeto necesitado del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-TF de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica que es administrada con por lo menos un agente quimioterapéutico para tratar el cáncer.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un antimetabolito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina y agentes similares.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un agente de alquilación, tal como mecloretamina , tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, dacarbazina (DTIC) , procarbazina, mitomicina C, cisplatina y otros derivados de platino, tal como carboplatina y agentes similares.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un agente anti -mitótico, tal como taxanos, por ejemplo docetaxel y paclitaxel y alcaloides de vinca, por ejemplo vindesina, vincristina, vinblastina y vinorelbina .
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un inhibidor de topoisomerasa, tal como topotecan o irinotecan.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un fármaco citostático, tal como etopósido y tenipósido.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un inhibidor de factor de crecimiento, tal como un inhibidor de ErbBl (EGFR) (tal como Iressa, erbitux (cetuximab) , tarceva y agentes similares) , un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como herceptina y agentes similares) y agentes similares.
En una modalidad, este agente quimioterapéutico se puede seleccionar de un inhibidor de tirosina cinasa, tal como imatinib (GlivecMR, Gleevec STI571MR) , lapatinib, PTK787/ZK222584 y agentes similares.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan el TF en un sujeto, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF de la presente invención y por lo menos un inhibidor de la angiogénesis , neovascularización y/u otra vascularización a un sujeto necesitado del mismo.
Los ejemplos de estos inhibidores de angiogénesis son inhibidores de urocinasa, inhibidores de metaloproteasa de matriz (tales como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 y agentes similares), inhibidores de la migración y proliferación de células endoteliales (tales como TNP-470, esqualamina, 2-metoxiestradiol , combretastatinas , endostatina, angiostatina, penicilamina , SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ) , R115777 (Janssen Pharmaceutica , Inc, Titusville, NJ) y agentes similares) , antagonistas de factores de crecimiento angiogénicos (tales como ZD6474, SU6668, anticuerpos contra agentes angiogénicos y/o sus receptores (tales como VEGF, bFGF y angiopoyetina-1) , talidomida, análogos de talidomida (tal como CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogénica (tal como angiozima) , interferón a (tal como interferón (X2a) , suramina y agentes similares) , inhibidores de cinasa de VEGF-R y otros inhibidores de tirosina cinasa anti-angiogénicos (tal como SU011248) , inhibidores de la señalización de integrina/supervivencia específica de células endoteliales (tal como vitaxina y agentes similares) , antagonistas/ligandos quelatantes de cobre (tales como tetratiomolibdato, captopril y agentes similares) , carboxiamido-triazol (CAI) , ABT-627, C 101, interleucina-12 (IL-12) , IM862, PNU145156E así como también moléculas de nucleótidos que inhiben la angiogénesis (tales como ADNc antisentido de VEGF, ADNc que codifica la angiostatina , ADNc que codifica el p53 y ADNc que codifica el receptor-2 de VEGF deficiente) y agentes similares.
Otros ejemplos de estos inhibidores de la agiogénesis, neovascularización y/u otra vasculatización son derivados de heparina anti-angiogénicos y moléculas relacionadas (por ejemplo, heperinasa III), temozolomida, NK4 , factor inhibitorio de la migración de macrófagos (MIF) , inhibidores de ciclooxigenasa-2 , inhibidores del factor 1 inducible por hipoxia, isoflavonas de soya anti-angiogénicas , oltipraz, fumagillina y análogos de la misma, análogos de somatostatina , polisulfato de pentosan, tecogalan sódico, dalteparina, tumstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticuerpos contra otros objetivos relevantes (tales como mAbs anti-alfa-v/beta-3 integrina y anti-quinostatina) y agentes similares.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser un inmunógeno anti-cáncer, tal como un antígeno de cáncer/antígeno asociado con tumores (por ejemplo, molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM/TACSTDl) , mucina 1 (MUC1) , antígeno carcinoembriónico (CEA) , glicoproteína asociada con tumores 72 (TAG-72), gplOO, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7 , vacunas virales asociadas con el cáncer (por ejemplo, vacunas del virus de papiloma humano) , proteínas de choque térmico derivadas de tumores y agentes similares. Una variedad de otros antígenos de cáncer/antígenos asociados con tumores adecuados descritos en alguna otra parte en este documento y moléculas similares conocidas en la técnica se pueden utilizar también o alternativamente en esta modalidad. Los péptidos inmunógenos anti -cancerosos también incluyen "vacunas" anti-idiotípicas tales como anticuerpos anti-idiotípicos BEC2 , Mitumomab, CeaVac y anticuerpos anti-idiotípicos relacionados, un anticuerpo anti - idiotípico para el anticuerpos MG7 y otros anticuerpos anti - idiotípicos anticancerosos (véase por ejemplo Birebent y colaboradores, Vaccine. 21(15), 1601-12 (2003), Li y colaboradores, Chin Med J (Engl) . 114(9), 962-6 (2001), Schmitt y colaboradores, Hybridoma. 13_(5) , 389-96 (1994) , Maloney y colaboradores, Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri y colaboradores, J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl y colaboradores, Int J Cáncer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen y colaboradores, Cytokines Mol Ther. 2 (4) , 231-8 (1996) y Maruyama, J Immunol Methods . 264(1-2), 121-33 (2002)). Estos Abs anti-idiotípicos se pueden conjugar opcionalmente con un portador, el cual puede ser una molécula portadora sintética (típicamente inerte) , una proteina (por ejemplo hemocianina de lapa californiana ( LH, por sus siglas en inglés) (véase por ejemplo Ochi y colaboradores, Eur J Immunol . 17 (11) , 1645-8 (1987)) o una célula (por ejemplo un glóbulo rojo -véase por ejemplo Wi y colaboradores, J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)).
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser una citocina anti -cancerosa , una quimiocina o una combinación de las mismas. Los ejemplos de citocinas y factores de crecimiento adecuados incluyen IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNOC (por ejemplo, INFa2b) , IFN , GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, factor de células madre, ancestim y TNFCC. Las quimiocinas adecuadas pueden incluir quimiocinas Glu-Leu-Arg (ELR) -negativas tales como IP-10, MCP-3, MIG y SDF-lOC de las familias de quimiocinas CXC y C-C humanas. Las citocinas adecuadas incluyen derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina y proteínas de fusión de citocina. Estos y otros métodos o usos que involucran ácidos nucleicos que codifican péptidos de origen natural en este documento se pueden realizar alternativa o adicionalmente por medio de técnicas de "activación de genes" y regulación por incremento de genes de recombinación homologa, tal como se describe en los documentos US 5,968,502, US 6,063,630 y US 6,187,305 y EP 0505500.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser un regulador del control del ciclo celular/apoptosis (o "agente regulador"). Un regulador del control del ciclo celular/apoptosis puede incluir moléculas que fijan como objetivo y modulan los reguladores del control del ciclo celular/apoptosis tales como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) cinasas dependientes de ciclina que sobreestimulan el ciclo celular (tales como flavopiridol (L868275, HMR1275) , 7-hidroxiestaurosporina (UCN-01, W-2401) y roscovitina (R-roscovitina, CYC202) ) y (iii) moduladores de telomerasa (tales como BIBR1532, SOT-095, GR 163 y composiciones descritas por ejemplo en los documentos US 6,440,735 y US 6,713,055). Los ejemplos no limitantes de moléculas que interfieren con las rutas apoptóticas incluyen un ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) /ligando de apoptosis-2 (Apo-2L) , anticuerpos que activan los receptores del TRAIL, IFNs y Bcl-2 antisentido.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser un agente de regulación hormonal, tal como agentes que son útiles para una terapia anti-andrógeno y anti -estrógeno . Los ejemplos de estos agentes de regulación hormonal son tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol , etinil-estradiol/estinilo, un antiandrógeno (tal como flutaminde/eulexina) , una progestina (tal como caproato de hidroxiprogesterona, medroxi-progesterona/provera, acepato de megestrol/megace) , un adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona , prednisona) , hormona liberadora de la hormona luteinizante (y análogos de la misma y otros agonistas de LHRH tales como buserelin y goserelin) , un inhibidor de aromatasa (tales como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citraden, exemestano) , un inhibidor de hormonas (tal como octreotida/sandostatina) y agentes similares.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser un agente anti-anérgico (por ejemplo compuestos de moléculas pequeñas, proteínas, glicoproteínas o anticuerpos que rompen la tolerancia a antígenos de tumores y cáncer) . Los ejemplos de estos compuestos son moléculas que bloquean la actividad de CTLA-4, tal como MDX-010 (ipilimumab) (Phan y colaboradores, PNAS EUA 100, 8372 (2003)) .
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser un ácido nucleico o vector que contiene un gen supresor de tumores tal como un adenovirus deficiente de replicación que codifica el p53/SCH58500 de tipo silvestre recombinante humano, etcétera; ácidos nucleicos antisentido fijados cómo objetivo hacia oncogenes, genes mutados o desregulados; o ARNsi fijado como objetivo hacia genes mutados o desregulados. Los ejemplos de objetivos supresores de tumores incluyen, por ejemplo, BRCA1 , RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2 , LH1 y DCC .
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser un ácido nucleico anti-canceroso, tal como genasense (augmerosen/G3139) , LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989) , LE-AON/LEraf-AON (oligonucleótido antisentido de c-raf encapsulado con liposomas/ISIS-5132) , MG98 y otros ácidos nucleicos antisentido que fijan como objetivo PKCOC, clusterina, IGFBPs, proteína cinasa A, ciclina DI o Bcl-2h.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente puede ser una molécula de AR inhibitoria anti-cancerosa (véase por ejemplo Lin y colaboradores, Curr Cáncer Drug Targets. 1{3) , 241-7 (2001) , Erratum in: Curr Cáncer Drug Targets. 3_(3), 237 (2003) , Lima y colaboradores, Cáncer Gene Ther. .11 (5) , 309-16 (2004) , Grzmil y colaboradores, Int J Oncol . 4(1) , 97-105 (2004) , Collis y colaboradores, Int J Radiat Oncol Biol Phys . 57 (2 Suppl) , S144 (2003) , Yang y colaboradores, Oncogene . 22(36) , 5694-701 (2003) y Zhang y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun. 303 (4) , 1169-78 (2003)) .
Las composiciones y métodos de administración de combinación de la presente invención también incluyen la administración de vacunas de ácido nucleico, tales como vacunas de ADN desnudo que codifican estos antígenos de cáncer/antígenos asociados con tumores (véase por ejemplo los documentos US 5,589,466, US 5,593,972, US 5,703,057, US 5,879,687, US 6,235,523 y US 6,387,888) . En una modalidad, el método de administración de combinación y/o la composición de combinación comprenden una composición de vacuna antologa. En una modalidad, la composición de combinación y/o el método de administración de combinación comprenden una vacuna de células completas o una célula que expresa citocinas (por ejemplo un fibroblasto que expresa IL-2 recombinante , una célula dendrítica que expresa citocina recombinante y similares) (véase por ejemplo Kowalczyk y colaboradores, Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly y colaboradores, Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) y Tirapu y colaboradores, Curr Gene Ther. 2(1) , 79-89 (2002) . Otro ejemplo de este planteamiento de células autólogas que puede ser útil en los métodos de combinación de la presente invención es el método de Inmunoterapia Personalizada MyVaxMR (referido previamente como GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, EUA) .
En una modalidad, la presente invención proporciona composiciones de combinación y métodos de administración de combinación en donde un anticuerpo anti-TF se combina o se co-administra con un virus, proteínas virales y similares. Los virus deficientes de replicación, que tienen generalmente la capacidad de uno o solo algunos ciclos de replicación in vivo, y que son dirigidos hacia células tumorales, pueden ser por ejemplo componentes útiles de estas composiciones y métodos. Estos agentes virales pueden comprender o pueden estar asociados con ácidos nucleicos que codifican inmunoestimulantes , tales como GM-CSF y/o IL-2. Los virus tanto naturalmente oncolíticos como oncolíticos recombinantes (por ejemplo virus HSV-1, reovirus, adenovirus deficientes de replicación y sensibles a la replicación, etcétera) pueden ser componentes útiles de estos métodos y composiciones. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención proporciona composiciones de combinación y métodos de administración de combinación en donde un anticuerpo anti-TF se combina o co-administra con un virus oncolítico. Los ejemplos de estos virus incluyen adenovirus oncolíticos y virus del herpes, los cuales pueden ser o no virus modificados (véase por ejemplo Shah y colaboradores, J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles y colaboradores, Surgery. 134 (2) , 357-64 (2003) , Sunarmura y colaboradores, Páncreas. 2_8(3), 326-9 (2004), Teshigahara y colaboradores, J Surg Oncol . 8_5(1), 42-7 (2004), Varghese y colaboradores, Cáncer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner y colaboradores, Cáncer Res. 59_(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) y Zwiebel y colaboradores, Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
Las composiciones de combinación y los métodos de administración de combinación de la presente invención también pueden involucrar métodos de inmunoterapia de "células completas" y "adoptivos". Por ejemplo, estos métodos pueden comprender la infusión o re- infusión de células del sistema inmune (por ejemplo linfocitos que infiltran tumores (TILs, por sus siglas en inglés) , tales como células T CD4+ y/o CD8+ (por ejemplo células T expandidas con antígenos específicos para tumores y/o mejoramientos genéticos) , células B que expresan anticuerpos u otras células que producen/presentan anticuerpos, células dendríticas (por ejemplo, células dendríticas recombinantes de expresión anti-citocinas, células dendríticas cultivadas con un agente de expansión de DC tal como GM-CSF y/o Flt3-L y/o células dendríticas cargadas con antígenos asociados con tumores) , células NK anti-tumorales , comúnmente llamadas células híbridas o combinaciones de las mismas. Los lisados de células también pueden ser útiles en estos métodos y composiciones. Las "vacunas" celulares en las pruebas clínicas que pueden ser útiles en estos aspectos incluyen los lisados de células CanvaxinMR, APC-8015 (Dendreon) , HSPPC-96MR (Antigenics) y MelacineMR. Los antígenos liberados de células cancerosas y mezclas de los mismos (véase por ejemplo Bystryn y colaboradores, Clinical Cáncer Research Vol . 7, 1882-1887, Julio de 2001) , mezclados opcionalmente con adyuvantes tal como alúmina, también pueden ser componentes en estos métodos y composiciones de combinación.
En una modalidad, un anticuerpo anti-TF se puede suministrar a un paciente en combinación con la aplicación de un método de vacunación interna. La vacunación interna se refiere a la muerte inducida de células de tumores o cancerosas, tal como la muerte inducida por fármacos o inducida por radiación de células tumorales, en un paciente, que conduce típicamente a la producción de una respuesta inmune dirigida hacia (i) las células tumorales en su conjunto o (ii) partes de las células tumorales que incluyen (a) proteínas secretadas, glicoproteínas u otros productos, (b) proteínas o glicoproteínas asociadas con la membrana u otros componentes asociados con o insertados en membranas y/o (c) proteínas intracelulares u otros componentes intracelulares . Una respuesta inmune inducida por la vacunación interna puede ser humoral (es decir, mediada por anticuerpos-complemento) o mediada por células (por ejemplo, el desarrollo y/o incremento de linfocitos T citotóxicos endógenos que reconocen las células tumorales eliminadas internamente o partes de las mismas) . Además de la radioterapia, los ejemplos no limitantes de fármacos y agentes que se pueden utilizar para inducir la muerte de células tumorales y la vacunación interna son agentes quimioterapéuticos convencionales, inhibidores del ciclo celular, fármacos anti-angiogénesis , anticuerpos monoclonales , agentes inductores de la apoptosis e inhibidores de la transducción de señales .
Los ejemplos de otros agentes anti -cancerosos , los cuales pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente son agentes de inducción de diferenciación, análogos de ácido retinoico (tal como la totalidad de ácido trans-retinoico, ácido 13-cis-retinoico y agentes similares) , análogos de vitamina D (tales como seocalcitol y agentes similares), inhibidores de ErbB3 , ErbB4, IGF- IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2 , Flt4, FGFR1 , FGFR2 , FGFR3 , FGFR4 , TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 y agentes similares .
Los ejemplos de otros agentes anti -cancerosos , los cuales pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente son catepsina B, moduladores de la actividad de catepsina D deshidrogenasa, glutationa-S-transferasa (tal como glutacilcisteína sintetasa y lactato deshidrogenasa) y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos , los cuales pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente son estramustina y epirubicina .
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos , los cuales pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente son un inhibidor de HSP90 como 17-alil-amino-geldanamicina, anticuerpos dirigidos contra un antígeno de tumor tales como PSA, CA125, KSA, etcétera, integrinas como integrina ß?, inhibidores de VCAM y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anti -cancerosos , los cuales pueden ser relevantes como agentes terapéuticos para el uso en combinación con un anticuerpo anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente son inhibidores de calcineurina (tales como valspodar, PSC 833 y otros inhibidores de MDR-1 o p-glicoproteínas) , inhibidores de TOR (tales como sirolimus, everolimus y rapamcina) e inhibidores de mecanismos "que se dirigen a linfocitos" (tal como FTY720) y agentes con efectos sobre la señalización de células tales como inhibidores de moléculas de adhesión (por ejemplo anti-LFA, etcétera) .
En una modalidad, el anticuerpo anti-TF de la invención es para el uso en combinación con uno o más anticuerpos terapéuticos, tales como bevacizumab (AvastinMR) , zalutumumab, cetuximab (ErbituxMR) , panitumumab (VectibixM ) , ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab (LucentisMR) , Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tysabri, Xolair, raptiva, nimotuzumab, rituximab y/o trastuzumab (HerceptinMR) . Otros anticuerpos terapéuticos los cuales se pueden utilizar en combinación con el anticuerpo de la presente invención son aquellos dados a conocer en el documento WO98/40408 (anticuerpos que se pueden enlazar al TF humano, nativo) , el documento O04/094475 (anticuerpos capaces de enlazarse al factor tisular humano, los cuales no inhiben la coagulación de la sangre mediada por factores en comparación con un control de plasma normal) , el documento WO03/093422 (anticuerpos que se enlazan con mayor afinidad al complejo de TF:VIIa que al TF solo) o el documento WO03/037361 (agonista o antagonista de TF para el tratamiento relacionado con la apoptosis) .
En otra modalidad, dos o más anticuerpos diferentes de la invención como se describe en este documento se utilizan en combinación para el tratamiento de una enfermedad. Las combinaciones particularmente interesantes incluyen dos o más anticuerpos no competidores. De esta manera, en una modalidad, un paciente es tratado con una combinación de un anticuerpo del Grupo de bloque cruzado I definido en este documento con un anticuerpo del Grupo II o III, como se define en este documento. En otra modalidad, un paciente es tratado con una combinación de un anticuerpo del Grupo II como se define en este documento posteriormente con un anticuerpo del Grupo III. Esta terapia de combinación puede conducir al enlace de un número incrementado de moléculas de anticuerpo por célula, lo cual puede proporcionar una eficacia incrementada, por ejemplo por vía de la activación de la lisis mediada por el complemento.
En una modalidad, un anticuerpo anti-TF se puede administrar en relación con el suministro de uno o más agentes que promueven el acceso del anticuerpo anti-TF o la composición de combinación al interior de un tumor. Estos métodos se pueden llevar a cabo por ejemplo en asociación con el suministro de una relaxina, la cual es capaz de relajar un tumor (véase por ejemplo el documento US 6,719,977) . En una modalidad, un anticuerpo anti-TF de la presente invención se puede enlazar a un péptido que penetra las células (CPP, por sus siglas en inglés) . Los péptidos que penetran las células y péptidos relacionados (tales como anticuerpos diseñados que penetran las células) se describen por ejemplo en Zhao y colaboradores, J Immunol Methods . 254(1-2) , 137-45 (2001), Hong y colaboradores, Cáncer Res. 6J) (23) , 6551-6 (2000) . Lindgren y colaboradores, Biochem J. 377 (Pt 1) , 69-76 (2004) , Buerger y colaboradores, J Cáncer Res Clin Oncol . 129 (12) , 669-75 (2003) , Pooga y colaboradores, FASEB J. 12 (1) , 67-77 (1998) y Tseng y colaboradores, Mol Pharmacol . 6_2(4), 864-72 (2002) .
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan el TF en un sujeto, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF y por lo menos un agente antiinflamatorio a un sujeto necesitado del mismo.
En una modalidad, este agente ant i -inflamatorio se puede seleccionar de aspirina y otros salicilatos, inhibidores de Cox-2 (tales como rofecoxib y celecoxib) , NSAIDs (tales como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenaco , piroxicam, ketoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozina e indometacina) , anticuerpos anti-IL6R, anticuerpos anti-IL8 (por ejemplo anticuerpos descritos en el documento WO2004058797 , por ejemplo 10F8) , anticuerpos anti-IL15 (por ejemplo anticuerpos descritos en los documentos WO03017935 y WO2004076620) , anticuerpos anti-IL15R, anticuerpos anti-CD4 (por ejemplo zanolimumab) , anticuerpos anti-CDlla (por ejemplo, efalizumab) , anticuerpos anti-alfa-4/beta-l integrina (VLA4) (por ejemplo natalizumab) , CTLA4-Ig para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, prednisolona, prednisona, fármacos antireumáticos modificadores de enfermedades (DMARDs, por sus siglas en inglés) tales como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inhibidores de la síntesis de pirimidina (tal como leflunomidea, agentes bloqueadores de receptores de IL-1 (tal como anakinra) , agentes bloqueadores de TNF-oc (tales como etanercept, infliximab y adalimumab) y agentes similares .
En una modalidad, este agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar de ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato de mofetilo, corticosteroides tales como prednisona, metotrexato, sales de oro, sulfasalazina , antimaláricos, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15 -desoxiespergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506) , 0KT3 , anti-timocito globulina, timopentina, timosina-oc y agentes similares .
En una modalidad, este agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar de anticuerpos inmunosupresores, tales como anticuerpos que se enlazan a p75 del receptor de IL-2, anticuerpos contra CD25 (por ejemplo aquellos descritos en el documento WO2004045512 , tales como AB1, AB7, AB11 y AB12) o anticuerpos que se enlazan por ejemplo a MHC, CD2 , CD3 , CD4 , CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNY, TNF-OC, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, CDlla o CD58 o anticuerpos que se enlazan a sus ligandos.
En una modalidad, este agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar de moléculas solubles de IL-15R, IL-10, B7 (B7-1, B7-2, variantes de las mismas y fragmentos de las mismas), ICOS y OX40, un inhibidor de un regulador de células T negativas (tal como un anticuerpo contra CTLA4) y agentes similares.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan el TF en un sujeto, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF y un anticuerpo anti-C3b(i) a un sujeto necesitado del mismo.
En una modalidad, un agente terapéutico para el uso en combinación con anticuerpos anti-TF para tratar los trastornos descritos anteriormente se puede seleccionar de inhibidores de histona desacetilasa (por ejemplo fenilbutirato) y/o agentes de reparación de ADN (por ejemplo enzimas de reparación de ADN y composiciones relacionadas tal como dimericina) .
Los métodos de la presente invención para tratar un trastorno descrito anteriormente que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF también pueden comprender una terapia fotodinámica, dirigida, anti-cancerosa (por ejemplo una terapia de láser anti-cancerosa - la cual se puede practicar opcionalmente con el uso de un agente de fotosensibilizacion, véase por ejemplo Zhang y colaboradores, J Control Reléase. 93^2), 141-50 (2003)), terapias de ondas de sonido y ondas de choque anti-cancerosas (véase por ejemplo Kambe y colaboradores, Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)) y/o terapia nutracéutica anti-cancerosa (véase por ejemplo Roudebush y colaboradores, Vet Clin North Am Small Anim Pract . 34 (1) , 249-69, viii (2004) y Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004). Del mismo modo, un anticuerpo anti-TF se puede utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno descrito anteriormente para ser administrada con una terapia fotodinámica, dirigida, anti-cancerosa (por ejemplo una terapia de láser anti-cancerosa - la cual se puede practicar opcionalmente con el uso de un agente fotosensibilizador, terapias de ondas de sonido y ondas de choque anti-cancerosas y/o una terapia nutracéutica anticancerosa) .
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno que involucra células que expresan el TF en un sujeto, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invención y una radioterapia a un sujeto necesitado del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer, método el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invención y una radioterapia a un sujeto necesitado del mismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invención, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer para ser administrada en combinación con una radioterapia.
Se proporciona la radioterapia que puede comprender radiación o la administración asociada de productos radiofarmacéuticos a un paciente. La fuente de radiación puede ser ya sea externa o interna con respecto al paciente que es tratado (el tratamiento con radiación puede ser, por ejemplo, en la forma de una terapia de radiación de haz externo (EBRT) o braquiterapia (BT) ) . Los elementos radioactivos que se pueden utilizar en la práctica de estos métodos incluyen, por ejemplo, radio, cesio-137, iridio-192, americio-241 , oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yoduro- 123, yoduro-131 e indio-111.
En una modalidad aidcional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer, método el cual comprende la administración a un sujeto necesitado del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invención en combinación con la cirugía.
Como se describiera anteriormente, una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar en una terapia de combinación, es decir, combinada con uno o más agentes relevantes para la enfermedad o condición a ser tratada ya sea como composiciones farmacéuticas separadas o con un compuesto dé la presente invención coformulado con uno o más agentes terapéuticos adicionales como se describiera anteriormente. Estas terapias de combinación pueden requerir dosificaciones más bajas del compuesto de la presente invención y/o los agentes co-administrados , evitando de esta manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias .
Además de lo anterior, las otras terapias de combinación interesantes incluyen lo siguiente : • Para el tratamiento del cáncer pancreático, un anticuerpo anti-TF en combinación con un antimetabolito, tal como 5-fluorouracilo y/o gemcitabina, posiblemente en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: 90Y-hPAM4, ARO 100, ARQ- 197, AZD-6244, bardoxolona de metilo, cixutumumab, (IMC-A12) , folitixorina de calcio, GVAX, ipilimumab, KRX-0601, merbarona, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh- Apo2L, TLN-4601, trabedersen, volociximab (M200) , WX- 671, pemetrexed, rubitecan, ixabepilona, OCX- 0191Vion, 216586-46-8, lapatinib, matuzumab, imatinib, sorafinib, trastuzumab, exabepilona, erlotinib, avastina y cetuximab, • Para el tratamiento del cáncer colorrectal, un anticuerpo anti-TF en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: gemcitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oxaliplatina, irinotecan, 5-FU/LV, Capecitabina, UFT, agentes fijadores de objetivos de EGFR, tales como cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab; inhibidores de VEGF o inhibidores de tirosina cinasa tal como sunitinib.
Para el tratamiento del cáncer de mama, un anticuerpo anti-TF en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: antimetabolitos, antraciclinas , taxanos, agentes de alquilación, epotilonas antihormonales (femar, tamoxifen etcétera) , inhibidores de ErbB2 (Her2/neu) (tales como herceptina y agentes similares) , CAF/FAC (ciclofosfamida , doxorrubicina, 5FU) AC (ciclo, doxo) , CMF (ciclo, metotrexato, 5FU) , Docetaxel + capecitabina, GT (paclitaxel, gemcitabina) FEC (ciclo, epi, 5FU) en combinación con herceptina: Paclitaxel +/- carboplatina, Vinorelbina, Docetaxel, CT en combinación con lapatinib; Capecitabina, Para el tratamiento del cáncer de vejiga, un anticuerpo anti-TF en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: antimetabolitos (gemcitabina, alimta, metotrexato), análogos de platino (cisplatina, carboplatina) , inhibidores de EGFr (tales como cetuximab o zalutumumab) , inhibidores de VEGF (tal como Avastin) doxorrubicina, inhibidores de tirosina cinasa tales como gefitinib, trastuzumab, agente anti-mitótico, tales como taxanos, por ejemplo paclitaxel y alcaloides de vinca, por ejemplo vinblastina.
Para el tratamiento del cáncer de próstata, un anticuerpo anti-TF en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: terapias hormonales/antihormonales ; tales como antiandrógenos , agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) y agentes quimioterapéuticos tales como taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vinblastina, ixabepilona, • Para el tratamiento del cáncer ovárico, un anticuerpo anti-TF en combinación con uno o más compuestos seleccionados de: un agente anti-mitótico, tales como taxanos y alcaloides de vinca, caelix, topotecan.
Usos de diagnóstico Los anticuerpos anti-TF de la invención también pueden ser útiles para propósitos de diagnóstico. De esta manera, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo anti-TF como se define en este documento.
En una modalidad, los anticuerpos anti-TF de la presente invención se pueden utilizar in vivo o in vitro para diagnosticar enfermedades en donde las células activadas que expresan el TF desempeñan un papel activo en la patogénesis, al detectar los niveles de TF o los niveles de células las cuales contienen TF sobre la superficie de su membrana. Por ejemplo, esto se puede lograr al poner en contacto una muestra a ser sometida a prueba, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo anti-TF bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y el TF. La formación del complejo luego se detecta (por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA) . Cuando se utiliza una muestra de control junto con la muestra de prueba, el complejo se detecta en ambas muestras y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de TF en la muestra de prueba.
De esta manera, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para detectar la presencia de un antígeno de TF, o una célula que expresa TF, en una muestra que comprende : - poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-TF de la invención o una molécula biespecífica de la invención, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y el TF; y - analizar si se ha formado un complejo.
En una modalidad, el método se realiza in vitro. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para la identificación de, y la diagnosis de células y tejidos invasivos y otras células fijadas como objetivo por los anticuerpos anti-TF de la presente invención y para la supervisión del progreso de los tratamientos terapéuticos, el estado después del tratamiento, el riesgo de desarrollar cáncer, el progreso del cáncer y similares.
En un ejemplo de este ensayo de diagnóstico, la presente invención proporciona un método para diagnosticar el nivel de células invasivas en un tejido que comprende formar un inmunocomplejo entre un anticuerpo anti-TF y tejidos potenciales que contienen TF y detectar la formación del inmunocomplejo, en donde la formación del inmunocomplejo se correlaciona con la presencia de células invasivas en el tejido. El contacto se puede realizar in vivo, utilizando anticuerpos aislados, etiquetados y técnicas de imagenología estándar, o se puede realizar in vitro sobre muestras de tejido.
Los anticuerpos anti-TF se pueden utilizar para detectar péptidos y fragmentos de péptidos que contienen TF en cualquier muestra biológica adecuada por medio de cualquier técnica adecuada. Los ejemplos de inmunoensayos convencionales proporcionados por la presente invención incluyen, sin limitación, un ensayo ELISA, RIA, ensayos de FACS, ensayos de resonancia de plasmón, ensayos cromatográficos , inmunohistoquímica de tejido, inmunotransferencia Western y/o inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-TF. Los anticuerpos anti-TF de la presente invención se pueden utilizar para detectar el TF y fragmentos del TF de humanos. Las etiquetas adecuadas para el anticuerpo anti-TF y/o anticuerpos secundarios utilizados en estas técnicas incluyen, sin limitación, varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa ; los ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona , fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína , rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina ; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol ; y los ejemplos de un material radioactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S y 3H.
Los anticuerpos anti-TF también se pueden someter a ensayo en una muestra biológica por medio de un inmunoensayo de competencia utilizando estándares de péptidos de TF etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-TF no etiquetado. En este ensayo, la muestra biológica, el (los) estándar (es) de péptidos de TF etiquetado (s) y los anticuerpos anti-TF se combinan y la cantidad de estándar de TF etiquetado que se enlaza al anticuerpo anti-TF no etiquetado se determina. La cantidad de péptido de TF en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de estándar de TF etiquetado que está enlazado al anticuerpo anti-TF .
Los anticuerpos anti-TF son particularmente útiles en la imagenología in vivo de tumores. La imagenología in vivo de tumores asociada con el TF se puede realizar por medio de cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, el etiquetado con 99Tc o el etiquetado con otro isótopo emisor de rayos gamma se puede utilizar para etiquetar anticuerpos anti-TF en tumores o complejos de anticuerpo anti-TF:TF etiquetados (por ejemplo, etiquetados con FITC) secundarios de tumores y se pueden obtener imágenes con una cámara de centelleo gamma (por ejemplo, un dispositivo Elscint Apex 409ECT) , utilizando típicamente un colimador de alta resolución de baja energía o un colimador multiuso de baja energía. Los tejidos teñidos luego se pueden valorar por el conteo de radioactividad como un indicador de la cantidad de péptidos asociados con el TF en el tumor. Las imágenes obtenidas por medio del uso de estas técnicas se pueden utilizar para valorar la biodistribución del TF en un paciente, mamífero o tejido, por ejemplo en el contexto del uso de TF o fragmentos de TF como un biomarcador para la presencia de células cancerosas invasivas. Las variaciones en esta técnica pueden incluir el uso de la imagenología de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) para mejorar la imagenología sobre las técnicas de cámaras gamma. Los métodos y principios de inmunoscintigrafías similares se describen en, por ejemplo, Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes" , en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, Gennaro y colaboradores, (eds.), páginas 624-652 (Mack Publishing Co . , 1990) y Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies" en Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto y colaboradores, (eds.) (Chapman & Hall 1993). Estas imágenes también se pueden utilizar para el suministro fijado como objetivo de otros agentes anticancerosos, los ejemplos de los cuales se describen en este documento (por ejemplo, agentes apoptóticos, toxinas o composiciones de quimioterapia CHOP) . Por otra parte, estas imágenes pueden servir también o alternativamente como la base para técnicas quirúrgicas para eliminar tumores. Adicionalmente , estas técnicas de imagenología in vivo pueden permitir la identificación y localización de un tumor en una situación donde se identifica que un paciente tiene un tumor (debido a la presencia de otros biomarcadores , metástasis, etcétera), pero el tumor no puede ser identificado por medio de técnicas analíticas tradicionales. Todos estos métodos son características de la presente invención.
La imagenología in vivo y otros métodos de diagnóstico proporcionados por la presente invención son particularmente útiles en la detección de micrometástasis en un paciente humano (por ejemplo, un paciente que no ha sido diagnosticado previamente con cáncer o un paciente en un periodo de recuperación/remisión de un cáncer) . Se ha demostrado que las células cancerosas de un carcinoma, las cuales pueden constituir hasta 90% de todas las células cancerosas, por ejemplo, se tiñen muy bien con composiciones de conjugados de anticuerpo anti-TF. La detección con anticuerpos monoclonales anti-TF descritos en este documento puede ser indicativa de la presencia de carcinomas que son agresivos/invasivos y también o alternati amente proporciona una indicación de la factibilidad del uso de un anticuerpo monoclonal anti-TF relacionado contra estas micrometástasis .
En una modalidad, la presente invención proporciona un método de imagenología in vivo en donde un anticuerpo anti-TF de la presente invención se conjuga con un agente radio-opaco promotor de la detección, el anticuerpo conjugado se administra a un hospedero, tal como por medio de la inyección en el torrente sanguíneo y se somete a ensayo la presencia y ubicación del anticuerpo etiquetado en el hospedero. A través de esta técnica y cualquier otro método de diagnóstico proporcionado en este documento, la presente invención proporciona un método para examinar la presencia de células relacionadas con enfermedades en un paciente humano o una muestra biológica tomada de un paciente humano.
Para la imagenología de diagnóstico, los radioisótopos se pueden enlazar a un anticuerpo anti-TF ya sea directa o indirectamente por medio del uso de un grupo funcional intermediario. Los grupos funcionales, intermediarios, útiles incluyen ligandos quelatantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido dietilentriaminopentaacético (véase por ejemplo el documento US 5, 057, 313) .
Además de los radioisótopos y los agentes radio-opacos, los métodos de diagnóstico se pueden realizar utilizando anticuerpos anti-TF que se conjugan con tintes (tal como con el complejo de biotina-estreptavidina) , agentes de contraste, compuestos o moléculas fluorescentes y agentes potenciadores (por ejemplo iones paramagnéticos) para la imagenología por resonancia magnética (MRI) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,331,175, la cual describe técnicas de MRI y la preparación de anticuerpos conjugados con un agente potenciador de MRI). Estos agentes de diagnóstico/detección se pueden seleccionar de agentes para el uso en la imagenología por resonancia magnética y compuestos fluorescentes. Con el propósito de cargar un anticuerpo anti-TF con metales radioactivos o iones paramagnéticos, puede ser necesario hacerlo reaccionar con un reactivo que tiene una cola larga a la cual se une una multiplicidad de grupos quelatantes para enlazar los iones. Esta cola puede ser un polímero tal como una polilisina, un polisacárido u otra cadena derivatizada o derivatizable que tiene grupos pendientes a los cuales se pueden enlazar los grupos quelatantes tales como, por ejemplo, porfirinas, poliaminas, éteres de corona, bistiosemicarbazonas , polioximas y grupos similares que se sabe que son útiles para este propósito. Los quelatos se pueden acoplar a anticuerpos anti-TF utilizando químicas estándar.
De esta manera, la presente invención proporciona conjugados de diagnóstico del anticuerpo anti-TF, en donde el anticuerpo anti-TF se conjuga con un agente de contraste (tal como para la imagenología por resonancia magnética, tomografía computarizada o agente mejorador de contraste ultrasónico) o un radionúclido que puede ser, por ejemplo, un isótopo emisor gamma, beta, alfa, de electrones Auger o de positrones.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para detectar la presencia de un antígeno de TF, o una célula que expresa el TF, en una muestra que comprende - un anticuerpo anti-TF de la invención o una molécula biespecífica de la invención; e - instrucciones para el uso del kit.
En una modalidad, la presente invención proporciona un kit para la diagnosis del cáncer que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo anti-TF y uno o más reactivos para detectar el enlace del anticuerpo anti-TF a un péptido de TF. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas u otras etiquetas detectables . Los reactivos también pueden incluir anticuerpos o reactivos secundarios o terciarios para reacciones enzimáticas, en donde las reacciones enzimáticas generan un producto que puede ser visualizado. En una modalidad, la presente invención proporciona un kit de diagnóstico que comprende uno o más anticuerpos anti-TF de la presente invención en forma etiquetada o no etiquetada en recipiente (s) adecuado(s), reactivos para las incubaciones para un ensayo indirecto y substratos o agentes de derivatización para la detección en este ensayo, dependiendo del carácter de la etiqueta. También se pueden incluir reactivo (s) de control e instrucciones.
También se pueden suministrar kits de diagnóstico para el uso con un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF conjugado/etiquetado, para la detección de una actividad celular o para la detección de la presencia de péptidos de TF en una muestra de tejido u hospedero. En estos kits de diagnóstico, así como también en los kits para usos terapéuticos descritos en alguna otra parte en este documento, un anticuerpo anti-TF se puede proporcionar típicamente en una forma liofilizada en un recipiente, ya sea solo o en conjunción con anticuerpos adicionales específicos para una célula o péptido objetivo. Típicamente, un portador aceptable, farmacéutico (por ejemplo, un diluyente inerte) y/o componentes del mismo, tal como un amortiguador de Tris, fosfato o carbonato, estabilizadores, conservadores, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo albúmina de suero o similares, también se incluye (típicamente en un recipiente separado para el mezclado) y reactivos adicionales (también típicamente en recipiente (s) separado (s) ) . En ciertos kits, también se incluye un anticuerpo secundario capaz de enlazarse al anticuerpo anti-TF, el cual está presente típicamente en un recipiente separado. El anticuerpo secundario se conjuga típicamente con una etiqueta y se formula de manera similar al anticuerpo anti-TF de la presente invención. Utilizando los métodos descritos anteriormente y en cualquier otra parte en este documento, los anticuerpos anti-TF se pueden utilizar para definir subconjuntos de células cancerosas/tumorales y caracterizar estas células y tejidos/crecimientos relacionados .
La detección in situ se puede realizar al retirar un espécimen histológico de un paciente y proporcionar la combinación de anticuerpos anti-TF etiquetados de la presente invención a este espécimen. El anticuerpo anti-TF de la presente invención se puede proporcionar al aplicar o al recubrir el anticuerpo anti-TF etiquetado de la presente invención sobre una muestra biológica. A través del uso de este procedimiento, es posible determinar no únicamente la presencia del TF o fragmentos del TF sino también la distribución de estos péptidos en el tejido examinado (por ejemplo, en el contexto de la valoración de la diseminación de células cancerosas) . Utilizando la presente invención, aquellas personas de experiencia ordinaria percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como, procedimientos de tinción) se pueden modificar con el propósito de lograr esta detección in sifcu.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo anti- idiotípico el cual se enlaza a un anticuerpo anti-TF de la invención como se describe en este documento .
Un anticuerpo anti-idiotípico (Id) es un anticuerpo el cual reconoce determinantes únicos asociados generalmente con el sitio de enlace a antígenos de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar al inmunizar un animal de la misma especie y tipo genético que la fuente de un mAb anti-TF con el mAb para el cual se está preparando un anticuerpo anti-Id. El animal inmunizado puede reconocer y responder típicamente a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización al producir un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti -Id) . Estos anticuerpos se describen por ejemplo en el documento US 4,699,880. Estos anticuerpos son características adicionales de la presente invención.
Un anticuerpo anti-Id también se puede utilizar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en todavía otro animal, que produce un comúnmente llamado anticuerpo anti-anti-Id. Un anticuerpo anti-anti-Id puede ser idéntico epitópicamente al mAb original, el cual indujo el anticuerpo anti-Id. De esta manera, al utilizar anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica. Los anticuerpos anti-Id se pueden variar (produciendo en consecuencia variantes de anticuerpos anti-Id) y/o se pueden derivatizar por medio de cualquier técnica adecuada, tal como aquellas descritas en cualquier otra parte en este documento con respecto a los anticuerpos anti-TF de la presente invención. Por ejemplo, los mAbs anti-Id se pueden acoplar a un portador tal como la hemocianina de lapa californiana (KLH) y se pueden utilizar para inmunizar ratones BALB/c. Los sueros de estos ratones contendrán típicamente anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de enlace similares, si no es que idénticas, a un anticuerpo para el TF original/precursor.
La presente invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos los cuales no deben interpretarse como una limitación adicional.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Construcciones de expresión para el factor tisular (TF) Se generaron construcciones completamente optimizadas con codones para la expresión del TF o sus dominios extracelulares en células HEK, NSO o CHO. Las proteínas codificadas por estas construcciones son idénticas al acceso de Genbank NP_001984 para el TF. Las construcciones contenían sitios de restricción adecuados para la clonación y una secuencia de Kozak óptima (Kozak, 1987) . Las construcciones se clonaron en el vector de expresión de mamífero pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington, Renner y colaboradores 1992), obteniendo el pEE13.4TF. La PCR se utilizó para amplificar la parte que codifica el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) (aminoácidos 1-251) del TF, de la construcción sintética, agregando una etiqueta His C-terminal que contenía 6 residuos de His (TFECDHis) . La construcción se clonó en pEE13.4 y se secuenció completamente para confirmar la exactitud de la construcción.
Ejemplo 2 Expresión transitoria en células HEK-293F Las células 293 -F FreestyleMR (un subclón de HEK-293 adaptado para un medio Freestyle de crecimiento en suspensión y definido químicamente, (HEK-293F) ) se obtuvieron de Invitrogen y se transíectaron con el ADN plásmido apropiado, utilizando 293fectinMR (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el caso de la expresión de anticuerpos, los vectores de cadena pesada y cadena ligera apropiados, como se describe en el Ejemplo 10, fueron co-expresados .
Ejemplo 3 Expresión semi-estable en células NSO El pEE13.4TF se transfectó de manera estable en células NSO y los clones estables se seleccionaron con el crecimiento en ausencia de glutamina y en presencia de 7.5 flM de metilsulfoximina (MSX) . Una reserva de clones se desarrolló en cultivo de suspensión mientras que se mantenía la presión de selección. Las reservas se sometieron a prueba por la expresión de TF por medio del análisis de FACS y se aseguraron para el uso adicional.
Ejemplo 4 Expresión estable en células CHO El pEE13.4TF se transfectó de manera estable en células CHO-K1SV (Lonza Biologics) y los clones estables se seleccionaron con el crecimiento en ausencia de glutamina y en presencia de MSX 50 |0M. Los clones individuales se eligieron y se expandieron y se sometieron a prueba por la expresión de TF por medio del análisis de FACS como se describe posteriormente. Los clones de alta expresión se seleccionaron y se aseguraron para el uso adicional.
Ejemplo 5 Purificación de TF etiquetado con His El TFECDhis se expresó en células I HEK-293F. La etiqueta de his en TFECDHis hace posible la purificación con la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada. En este proceso, un ligando quelatante fijado sobre la resina cromatográfica se carga con cationes Co2+ . El sobrenadante que contiene TFECDHis se incuba con la resina en un modo discontinuo (es decir solución) . La proteína etiquetada con His se enlaza fuertemente a las perlas de resina, mientras que las otras proteínas presentes en el sobrenadante de cultivo no se enlazan fuertemente. Después de la incubación, las perlas se recuperan del sobrenadante y se empacan en una columna. La columna se lava con el propósito de eliminar las proteínas enlazadas débilmente. Las proteínas de TFECDHis enlazadas fuertemente luego se eluyen con un amortiguador que contiene imidazol, el cual compite con el enlace de His a Co2+ . El eluyente se elimina de la proteína por medio del intercambio de amortiguador en una columna de desaliniciación.
Ejemplo 6 Procedimiento de inmunización de ratones transgénicos Los ratones HuMab se inmunizaron cada quince días alternando con 5xl06 células NSO-TF transíectadas semi-estables o con 20 g de proteína de TFECDHis. Se realizaron ocho inmunizaciones en total, cuatro inmunizaciones intraperitoneales (IP) y cuatro inmunizaciones subcutáneas (SC) en la base de la cola. La primera inmunización con células se realizó en adyuvante completo de Freunds (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) . Para todas las otras inmunizaciones, las células se inyectaron IP en PBS y el TFECDHis se inyectó SC utilizando un adyuvante incompleto de Freunds (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) . Cuando se descubrió que los títulos en el suero eran suficientes (dilución de suero de 1/50 o inferior encontrada positiva en el ensayo de examen específico para antígenos como se describe en el Ejemplo 7 en por lo menos 2 eventos de examen cada dos semanas, secuenciales ) , los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces por la ruta intravenosa (IV) con 10 µ9 de proteína de TFECDHis en 100 µ? de PBS, 4 y 3 días antes de la infusión. La primera inmunización con células se realizó en CFA, o para todas las otras inmunizaciones (7) las células se inyectaron IP en PBS. Cuando se descubrió que los títulos en el suero eran suficientes, los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces IV con 1x10s células NS0-TF transíectadas , semi -estables transitoriamente en 100 µ? de PBS, 4 y 3 días antes de la infusión.
Cuando se descubrió que los títulos en el suero eran suficientes (definido como antes), los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces por la ruta intravenosa (IV) con 10 µg de proteína de TFECDHis en 100 µ? de PBS, 4 y 3 días antes de la infusión.
Ejemplo 7 Ensayo de examen específico para antígenos homogéneo La presencia de anticuerpos anti-TF en sueros de ratones inmunizados o el sobrenadante de cultivo de hibridoma o transfectoma de HuMab (anticuerpo monoclonal humano) se determinó por medio de ensayos de examen específicos para antígenos homogéneos (cuatro cuadrantes) utilizando Fluorometric Micro volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) .
Para esto, se utilizó una combinación de 3 ensayos a base de células y un ensayo a base de perlas. En los ensayos a base de células, se determinó el enlace a TH1015-TF (células HEK-293F que expresan de manera transitoria el TF; producidas como se describiera anteriormente) y A431 (que expresan el TF en la superficie de la célula) así como también las células de tipo silvestre HEK293 (no expresan el TF, control negativo) . En el ensayo a base de perlas, se determinó el enlace al' TF biotinilado acoplado en una perla de estreptavidina (SB1015-TF) .
Las muestras se agregaron a las cédulas/perlas para permitir el enlace al TF. Subsecuentemente, el enlace de HuMab se detectó utilizando un conjugado fluorescente (IgG-Cy5 anti-humano de cabra; Jackson ImmunoResearch) . El anticuerpo anti-TF humano de ratón (ERL; acoplado a Alexa-647 en Genmab) se utilizó como control positivo, el suero reservado de ratón HuMAb y el anticuerpo de ratón-Chrompure Alexa647 se utilizaron como controles negativos. Las muestras se exploraron utilizando un Sistema de Detección Celular Applied Biosystems 8200MR (8200 CDS) y los "conteos x fluorescencia" se utilizaron como lectura.
Ej emplo 8 Generación de hibridoma de HuMab Los ratones HuMab con suficiente desarrollo de título específico para antígenos (definido como antes) se sometieron a la eutanasia y el bazo y los nodulos linfáticos que flanqueaban la aorta abdominal y la vena cava se recolectaron. La fusión de esplenocitos y células de nodulos linfáticos a una línea de células de mieloma de ratón se realizó por medio de la electrofusión utilizando un Sistema de Electrofusión CEEF 50MR (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, EUA) , esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La selección y el cultivo de los hibridomas de HuMab resultantes se realizó con base en protocolos estándar (por ejemplo como se describe en Coligan J. E., Bierer, B. E., Margulies, D. H., Shevach, E. M. y Strober, W. , eds . Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006) .
Ej emplo 9 Espectrometría de masas de anticuerpos purificados Las alícuotas pequeñas de 0.8 mi de sobrenadante que contenía anticuerpo de la etapa de 6 pocilios o HyperflaskMR se purificaron utilizando columnas PhyTipMR que contenían resina de Proteína G (PhyNexus Inc., San José, EUA) en una estación de trabajo Sciclone ALH 3000MR (Caliper Lifesciences , Hopkinton, EUA) . Las columnas PhyTtipMR se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero los amortiguadores se reemplazaron por: Amortiguador de Enlace PBS (B.Braun, Medical B.V., Oss, Países Bajos) y Amortiguador de Elusión Glicina-HCl 0.1 M pH 2.7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Alemania) . Después de la purificación, las muestras se neutralizaron con Tris HCl 2 M pH 9.0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos). Alternativamente, en algunos casos volúmenes más grandes de sobrenadante de cultivo se purificaron utilizando la cromatografía en columna de afinidad de Proteína A.
Después de la purificación, las muestras se colocaron en una placa de 384 pocilios (Waters, placa de pocilios cuadrados de 100 ul , parte # 186002631) . Las muestras se desglicosilaron durante toda la noche a 37°C con N-glicosidasa F (Roche no. de catálogo 11365177001) . Se agregó DTT (15 mg/ml) (1 µ?/pocillo) y se incubó durante 1 hora a 37 CC. Las muestras (5 o 6 ul) se desalinizaron en un dispositivo Acquity UPLCMR (Waters, Milford, EUA) con una columna BEH300 C18, 1.7 2. lx 50 rara a 60 °C. El agua MQ y el acetonitrilo de grado LC-MS (Biosolve, no. de catálogo 01204101, Valkenswaard, Los Países Bajos) ambos con ácido fórmico al 0.1% (Fluka, no. de catálogo 56302, Buchs, Alemania) , se utilizaron como los Eluyentes A y B, respectivamente. Los espectros de masas de la ionización por electropulverización de tiempo de vuelo se registraron en línea en un espectrómetro de masas micrOTOFMR (Bruker, Breraen, Alemania) que operaba en el modo de iones positivos. Antes del análisis, una escala de 900-3000 m/z se calibró con la mezcla ES tuningMR (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA) . Los espectros de masas se simplificaron con el software DataAnalysisMR v. 3.4 (Bruker) utilizando la búsqueda del algoritmo de Entropía Máxima para pesos moleculares entre 5 y 80 kDa.
Después de la simplificación, las masas de cadenas pesadas y ligeras resultantes para todas las muestras se compararon con el propósito de encontrar anticuerpos duplicados. En la comparación de las cadenas pesadas, la posible presencia de variantes de lisina C-terminales se tomó en cuenta. Esto dio por resultado una lista de anticuerpos únicos, donde único se define como una combinación única de cadenas pesadas y ligeras. En el caso donde se encontraron anticuerpos duplicados, los resultados de otras pruebas se utilizaron para decidir cual era el mejor material para continuar con los experimentos.
El análisis MS de los pesos moleculares de las cadenas pesadas y ligeras de los 118 hibridomas específicos para el TF produjo 70 anticuerpos únicos (combinación única de cadena pesada/cadena ligera) . Estos se caracterizaron en una variedad de ensayos funcionales, que identificaban 14 candidatos principales, anticuerpos específicos para el TF. Ejemplo 10 Análisis de secuencias de los dominios variables de HuMab anti-TF y clonación en vectores de expresión El ARN total de los HuMabs anti-TF se preparó a partir de 5xl06 células de hibridoma y el ADN 5'-RACE-Complementario (ADNc) se preparó a partir de 100 ng de ARN total, utilizando el kit de Amplificación de ADNc SMART RACEMR (Clontech) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las regiones de codificación VH (región variable de cadena pesada) y VL (región variable de cadena ligera) se amplificaron por medio de la PCR y se clonaron en el vector pCR-Blunt II -TOPO (Invitrogen) utilizando el kit de clonación Zero Blunt PCR (Invitrogen) . Para cada HuMab, 16 clones VL y 8 clones VH se secuenciaro . Las secuencias se proporcionan en el Listado de Secuencias y la Figura 1 en este documento.
La Tabla 1A y la Tabla IB (posteriores) proporcionan una visión general de la información de las secuencias de anticuerpos y las secuencias de línea germinal más homologas.
Tabla 1? Homologías de cadenas pesadas longitudes Identidad con GEN J y GEN D de CDR- A GEN V y alelo la REGION V, % alelo alelo IMG" IGHVl-69*02 o IGHV1- 97.57% (281/288 IGHD6 003 IGHJ4*02 8, 8, 11] 69*04 nt) 13*01 95.49% (275/288 IGHD2 098 IGHVl-69*04 IGHJ3*02 8, 11] nt) 21*02 96.53% (278/288 IGHD1 011 IGHV3-23*O1 IGHJ4*02 8, 11] nt) 26*01 98.26% (283/288 IGHD2 017 IGHV3-23*01 IGHJ2*01 8, 13] nt) 15*01 97.92% (282/288 IGHD7 092 IGHV3-23*01 IGHJ4*02 8, 11] nt) 27*01 95.83% (276/288 IGHD7 101 IGHV3-23*01 IGHJ4*02 8, 11] nt) 27*01 97.57% (281/288 IGHD7 025 IGHV3-30-3*01 IGHJ4*02 8, 13] nt) 27*01 96.18% (277/288 IGHD7 109 IGHV3-30-3*01 IGHJ4*02 8, 13] nt) 27*01 97.57% (281/288 IGHD3 111 IGHV3-30-3*01 IGHJ4*02 8, 13] nt) 10*01 94.44% (272/288 IGHD3 114 IGHV3-33*01 o IGHV3-33*03 IGHJ6*02 8, 12] nt) 10*01 99.65% (287/288 IGHD6 013 IGHV5-51*01 IGHJ3*02 8, 191 nt) Tabla IB Homologías de cadenas ligeras Identidad con la REGION V, GEN J y longitudes Ab GEN V y alelo % (nt) alelo de CDR-I GT 003 IGKV1-13*02 99.28% (277/279 nt) IG J4*01 [6, .3 , .9] 011 IGKV1D-16*01 98.57% (275/279 nt) IGKJ2*01 [6. .3. .9] 013 IGKV1D-16*01 98.57% (275/279 nt) IG J5*01 [6, .3 .9] 092 IGKV1D-16*01 99.28% (277/279 nt) IG J2*01 [6 .3 .10] 098 IG V1D-16*01 100.00% (279/279 nt) IGKJ2*01 [6 .3 .9] 101 IGKV1D-16*01 100.00% (279/279 nt) IGKJ2*01 [6 .3 .10] 025 IGKV3-11*01 100.00% (279/279 nt) IGKJ4*01 [6 .3 .9] 109 IGKV3 -11*01 99.64% (278/279 nt) ¦ IGKJ4*01 [6.3.9] 017 IG V3-2O*01 99.29% (280/282 nt) IG J1*01 [7.3.9] 114 IGKV3-20*01 99.65% (281/282 nt) IGKJ4*01 [7.3.8] Referencias para el listado de secuencias: Región VH SEC ID No: 1 VH 013 SEC ID No: 2 VH 013, CDR1 SEC ID No: 3 VH 013, CDR2 SEC ID No: 4 VH 013, CDR3 SEC ID No: 5 VH 114 SEC ID No: 6 VH 114, CDR1 SEC ID No: 7 VH 114, CDR2 SEC ID No: 8 VH 114, CDR3 SEC ID No: 9 VH 011 SEC ID No: 10 VH 011, CDR1 SEC ID No: 11 VH 011, CDR2 SEC ID No: 12 VH 011, CDR3 SEC ID No: 13 VH 017-D12 SEC ID No: 14 VH 017-D12, CDR1 SEC ID NO: 15 VH 017-D12, CDR2 SEC ID NO: 16 VH 017-D12, CDR3 SEC ID No: 17 VH 042 SEC ID No: 18 VH 042, CDR1 SEC ID No: 19 VH 042, CDR2 SEC ID No: 20 VH 042, CDR3 SEC ID No: 21 VH 092-A09 SEC ID No: 22 VH 092-A09, CDR1 SEC ID No: 23 VH 092-A09, CDR2 SEC ID No: 24 VH 092-A09, CDR3 SEC ID No: 25 VH 101 SEC ID No: 26 VH 101, CDR1 SEC ID No: 27 VH 101, CDR2 SEC ID No: 28 VH 101, CDR3 SEC ID No: 29 VH 003 SEC ID No: 30 VH 003, CDR1 SEC ID No: 31 VH 003, CDR2 SEC ID No: 32 VH 003, CDR3 SEC ID No: 33 VH 025 SEC ID No: 34 VH 025, CDR1 SEC ID No: 35 VH 025, CDR2 SEC ID NO: 36 VH 025, CDR3 SEC ID No: 37 VH 109 SEC ID No: 38 VH 109, CDR1 SEC ID No: 39 VH 109, CDR2 SEC ID No: 40 VH 109, CDR3 SEC ID No: 41 VH 044 SEC ID No: 42 VH 044, CDR1 SEC ID No: 43 VH 044, CDR2 SEC ID No: 44 VH 044, CDR3 SEC ID No: 45 VH 087-Lg6 SEC ID No: 46 VH 087-Lg6, CDR1 SEC ID No: 47 VH 087-Lg6, CDR2 SEC ID No: 48 VH 087-Lg6, CDR3 SEC ID No: 49 VH 098 SEC ID NO: 50 VH 098, CDR1 SEC ID No: 51 VH 098, CDR2 SEC ID No: 52 VH 098, CDR3 SEC ID No: 53 VH 111 SEC ID No: 54 VH 111, CDR1 SEC ID No: 55 VH 111, CDR2 SEC ID No: 56 VH 111, CDR3 Región VL SEC ID No: 57 VL 013 SEC ID No: 58 VL 013, CDRl SEC ID No: 59 VL 013, CDR2 SEC ID No: 60 VL 013, CDR3 SEC ID No: 61 VL 114 SEC ID NO: 62 VL 114, CDRl SEC ID No: 63 VL 114, CDR2 SEC ID No: 64 VL 114, CDR3 SEC ID No: 65 VL 011 SEC ID No: 66 VL 011, CDRl SEC ID No: 67 VL 011, CDR2 SEC ID No: 68 VL 011, CDR3 SEC ID No: 69 VL 017-D12 SEC ID No: 70 VL 017-D12, CDRl SEC ID No: 71 VL 017-D12, CDR2 SEC ID No: 72 VL 017-D12, CDR3 SEC ID No: 73 VL 042 SEC ID No: 74 VL 042, CDRl SEC ID No: 75 VL 042, CDR2 SEC ID No: 76 VL 042, CDR3 SEC ID No: 77 VL 092-A09 SEC ID No: 78 VL 092-A09, CDR1 SEC ID No: 79 VL 092-A09, CDR2 SEC ID No: 80 VL 092-A09, CDR3 SEC ID No: 81 VL 101 SEC ID No: 82 VL 101, CDR1 SEC ID No: 83 VL 101, CDR2 SEC ID No: 84 VL 101, CDR3 SEC ID No: 85 VL 003 SEC ID No: 86 VL 003, CDR1 SEC ID No: 87 VL 003, CDR2 SEC ID No: 88 VL 003, CDR3 SEC ID No: 89 VL 025 SEC ID No: 90 VL 025, CDR1 SEC ID No: 91 VL 025, CDR2 SEC ID NO: 92 VL 025, CDR3 SEC ID NO: 93 VL 109 SEC ID No: 94 VL 109, CDR1 SEC ID No: 95 VL 109, CDR2 SEC ID No: 96 VL 109, CDR3 SEC ID No: 97 VL 044 SEC ID No: 98 VL 044, CDR1 SEC ID No: 99 VL 044, CDR2 SEC ID No: 100 VL 044, CDR3 SEC ID No: 101 VL 087 SEC ID No: 102 VL 087, CDR1 SEC ID No: 103 VL 087, CDR2 SEC ID No: 104 VL 087, CDR3 SEC ID No: 105 VL 098 SEC ID No: 106 VL 098, CDR1 SEC ID No: 107 VL 098, CDR2 SEC ID No: 108 VL 098, CDR3 SEC ID No: 109 VL 111 SEC ID No: 110 VL 111, CDR1 SEC ID No: 111 VL 111, CDR2 SEC ID No: 112 VL 111, CDR3 Ejemplo 11 Purificación de anticuerpos El sobrenadante de cultivo se pasó a través filtros sin salida de 0.2 y se cargó en columnas Proteína A de 5 mi (rProtein A FF, Amersham Bioscience) y se eluyó con ácido cítrico-NaOH 0.1 M, pH 3. El eluato se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 2 M, pH 9 y se dializó durante toda la noche para NaH2P0 12.6 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4 (B.Braun). Después, las muestras de diálisis se filtraron en condiciones estériles en filtros sin salida de 0.2 µt?. La pureza se determinó por medio de SDS-PAGE y la concentración se midió por medio de la nefelometría y la absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos purificados se prorratearon y se almacenaron a -80 °C. Una vez descongeladas, las alícuotas de anticuerpos purificados se mantuvieron a 4°C. La espectrometría de masas se realizó para identificar la masa molecular de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos expresadas por los hibridomas como se describe en el Ejemplo 9.
Ejemplo 12 Estudios de competencia cruzada de anticuerpos utilizando un ensayo ELISA de emparedado Los pocilios de placas de ELISA se revistieron durante toda la noche a +4°C con cada uno de los HuMabs anti-TF (0.5 o 2 µg/ml 100 µL/pocillo) diluidos en PBS . Los pocilios de ELISA se lavaron con PBS, se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con suero de pollo al 2% (v/v) (Gibco, Paisley, Escocia) en PBS y se lavaron nuevamente con PBS. Subsecuentemente, 50 µL de HuMab anti-TF (10 µ9/??? seguido por 50 µ?_ de TFECDHis (0.5 o 1 µ9/t?1) (generado en Genmab; Ejemplo 5) se agregaron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (mientras se agitaba). Las placas se lavaron 3 veces con PBST (PBS+0.05% de TweenMR) y se incubaron con biotina anti-his diluida 1:2000 BAM050 durante una hora a temperatura ambiente (mientras se agitaban) . Las placas se lavaron y se incubaron con Estreptavidina-poli-HRP (Sanquin, Amsterdam, Los Países Bajos) durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavaron nuevamente. La reacción se desarrolló adicionalmente con ABTS (Roche Diagnostics) a temperatura ambiente en la oscuridad, se detuvo después de 15 minutos por la adición de ácido oxálico al 2% (p/v) y se midió al absorbancia a 405 nm.
La Tabla 2 muestra que 3 grupos de bloques cruzados (grupos de anticuerpos que compiten entre sí por el enlace a TFECDHis) se pudieron identificar, con los anticuerpos 013, 044 y 087-Lg6 que pertenecen a un grupo de bloque cruzado (grupo I), los anticuerpos 011, 017-D12, 42, 092-A09 y 101 que pertenecen a otro grupo de bloque cruzado (grupo II) y los anticuerpos 003, 025, 109 y 111 que pertenecen a un tercer grupo de bloque cruzado (grupo III) . Se descubrió que el anticuerpo 114 compite por el enlace a TFECDHis con anticuerpos de tanto el grupo II como el grupo de bloque cruzado III. El anticuerpo 098 que se enlaza al TFECDHis podría ser completado por anticuerpos tanto del grupo II como del grupo de bloque cruzado III.
I II 0.5 ug ds 2 ug de 2 ug de 0.5 ug de 0.5 ug de 0.5 u 5 0.5 ug de 0.5 ug de ilsnto recxi ínrLsTto i! Q reahriirtlento ra -O Tabla 2 - Competencia de anticuerpos anti-TF por el enlace a TFECDHÍS Los cuadros color blanco indican la ausencia de competencia por el enlace, los cuadros color gris claro indican la competencia parcial por el enlace y los cuadros color gris oscuro indican la competencia por el enlace al TFECDHis.
Ejemplo 13 Enlace de los Hu ab anti-TF al dominio extracelular de TF en un ensayo ELISA La especificidad de los HuMabs anti-TF obtenidos se evaluó por medio de un ensayo ELISA. Las placas de ELISA (Microlon; Greiner Bio-One) se revistieron durante toda la noche a +4°C con 0.5 µg/mL de TFECDHis en PBS, pH 7.4. Las placas de ELISA revestidas se vaciaron y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con suero de pollo la 2% (v/v) (Gibco, Paisley, Escocia) en PBS y se lavaron con PBS que contenía 0.05% de Tween 20MR (PBST) . Subsecuentemente, los HuMabs, diluidos en serie en PBSTC (PBS complementado con 2% de suero de pollo (v/v) y 0.05% de Tween-20MR (v/v), se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación (300 rpm) . Los HuMabs enlazados se detectaron utilizando anticuerpos de IgG anti-humano de cabra conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch) diluidos 1:5,000 en PBSTC, los cuales se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación (300 rpm) . La reacción se desarrolló adicionalmente con ABTS (Roche Diagnostics) a temperatura ambiente en la oscuridad, se detuvo después de 15-30 minutos por la adición de ácido oxálico al 2% (p/v) y luego se midió la absorbancia a 405 nm.
El HuMab- LH (un anticuerpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de lapa californiana) ) , se utilizó como control negativo. El anticuerpo anti-TF humano de ratón (ERL) se utilizó como control positivo (IgG anti-ratón etiquetada con HRP como conjugado) . Las curvas de enlace se analizaron utilizando una regresión no lineal (respuesta a la dosis sigmoide con pendiente variable) utilizando el software GraphPad Prism V4.03.
Como se puede observar en las Figuras 3A-3C, todos los anticuerpos anti-TF se enlazaron a TFECDHis. Los valores EC50 para los HuMabs son el promedio de 3 experimentos y variaron entre 0.09 y 0.46 nM (Tabla 3 a continuación) .
Tabla 3 : grupo TF HuMab EC50 nM I 13 0.24 I 44 0.14 I 87-Lg6 0.09 II 11 0.16 II 017-D12 0.25 II 42 0.23 II 092-A09 0.18 II 101 0.28 tt/ttt 98 0.13 II/III 114 0.17 III 3 0.46 III 25 0.34 III 109 0.27 III 111 0.11 Ejemplo 14 Enlace de HuMabs anti-TF al TF enlazado a la membrana El enlace de los HuMabs anti-TF al TF enlazado a la membrana se determinó por medio de un análisis de FACS, utilizando células CHO transfectadas con TF o líneas de células tumorales que expresan el TF MDA-MB-231, (transfectadas con luciferasa) A431 y Bx-PC3.
Las células se resuspendieron en PBS (2 x 106 células/ml) , se colocaron en placas de 96 pocilios con fondo en forma de V (50 µ?/pocilio) . 50 µ? de HuMab diluidos en serie en amortiguador de FACS (PBS complementado con 0.1% de BSA y 0.02% de Na-azida) se agregaron a las células y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Después del lavado tres veces con amortiguador de FACS, se agregaron 50 µ? de IgGFc antihumano de cabra conjugada con ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch) , diluida 1:100 en amortiguador de FACS. Después de 30 minutos sobre hielo (en la oscuridad) , las células se lavaron tres veces y el enlace específico de los HuMabs se detectó por medio de la citometría de flujo en un dispositivo FACSCalibur (BD Biosciences) . El HuMab-KLH se utilizó como control negativo. El anticuerpo anti-TF de ratón seguido por la IgGFc anti-ratón conjugada con PE se utilizó como control positivo. Las curvas de enlace se analizaron utilizando una regresión no lineal (respuesta a la dosis sigmoide con pendiente variable) utilizando el software GraphPad Prism V4.03. (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) .
Las Figuras 4A-4C muestran un ejemplo de las curvas de enlace de HuMabs específicos para el TF a las células MDA-MB-231. La Tabla 4 proporciona una visión general de los valores EC50 de enlace de los HuMabs específicos para el TF a las células CHO transfectadas con TF (S1015-TF) , células MDA-MB-231, A431 y Bx-PC3.
MDA-MB-231 BX-PC3 A431 S1015-TP-012 I 13 1.58 2451 1.86 1305 8.04 3622 1.07 5207 I 44 0.87 1881 1.88 1136 1.45 2646 2.13 5021 I 87-LgS 8.28 1107 7.19 1030 nt nt nt nt II 11 0.47 2143 1.01 1280 0.20 2606 1.32 5654 II 017-D12 1.33 2401 1.61 1422 1.24 3296 1.21 5792 II 42 0.25 1S18 2.45 1701 nt nt nt nt II 092-A09 0.53 2290 0.84 1262 0.83 3137 1.32 5409 II 101 0.85 2071 2.25 1220 3.16 2934 1.77 5859 II/III 98 0.99 195S 1.38 1151 1.40 2755 0.96 5229 II/III 114 0.47 2438 0.80 1407 0.90 3433 1.72 6095 III 3' 3.20 1798 4.98 1106 6.94 2530 2.06 4247 I II 25 0 . 69 2254 0 . 88 1320 5 . 19 3170 0 . 73 5808 I I I 109 2 . 16 2052 4 . 04 1324 1 . 74 3124 0 . 92 5629 I I I 111 1 . 03 1774 1 . 83 1128 2 . 88 3043 0 . 55 5353 Tabla 4 - Visión general de los valores EC50 e índice de fluorescencia promedio máximo (MFI máx.) determinados por medio de un análisis de FACS del enlace de HuMabs específicos para el TF a diferentes tipos de células Los valores EC50 son nM. MFI Máx. para las células MDA-MB-231, BxPC3 y A431 a 30 µg/mL de anticuerpo, para S1015-TF a 7.5 de anticuerpo.
Ejemplo 15 Inhibición del enlace de FVIIa al TF La inhibición del enlace del FVIIa al TFECDHis por los TF-HuMabs se midió por medio de un ensayo ELISA. Las placas de ELISA se revistieron durante toda la noche, con TFECDHis (0.5 ILg/m , 100 L por pocilio) . Las placas se vaciaron, se bloquearon con PBS que contenía 2% de suero de pollo (v/v) (1 hora, temperatura ambiente) y se vaciaron nuevamente. Las diluciones en serie 4 veces de TF-HuMabs o HuMab-KLH (control negativo) se agregaron a los pocilios seguido por el FVIIa a la concentración EC50 (100 nM) y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (mientras se agitaban, 300 rpm) . Las placas se lavaron y se incubaron con anti-FVIIa de conejo (2.5 µg/mL; Abcam) como antes . Las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo de IgG-HRP anti-conejo de cerdo (1:2,500; DAKO) .
Después del lavado los complejos inmunes se visualizaron utilizando ABTS como substrato. La reacción se detuvo por la adición de ácido oxálico al 2% v/v seguido por la medición de densidad óptica a 405 nm utilizando un lector de ELISA. La concentración de anticuerpo necesaria para obtener 50% de inhibición (IC50) se calculó utilizando el software GraphPad Prism (análisis de regresión no lineal) .
Las Figuras 5A-5C muestran que los anticuerpos de los grupos de bloque cruzado II y III inhibieron eficientemente el enlace del FVIIa al TF, mientras que los anticuerpos del grupo de bloque cruzado I no inhibieron (o inhibieron a un grado mucho menor) el enlace del FVIIa.
La Tabla 5 muestra los valores IC50 y los valores de inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición del enlace del FVIIa al TF por los HuMabs específicos para el TF. grupo TF HuMab IC50 nM inhibición máx.
I 13 19.3 27 I 44 0.8 54 I 87-Lg6 na 35 II 11 1.1 91 II 017-D12 1.9 90 II 42 2.7 88 II 092-A09 1.5 90 II 101 0.6 84 II/III 98 0.8 85 II/III 114 1.3 90 III 3 1.9 89 III 25 2.1 90 III 109 1.7 90 III 111 1.7 79 Tabla 5 - Valores IC50 y valores de inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición del enlace del FVIIa al TF por los HuMabs específicos para el TF Ejemplo 16 Inhibición de la fosforilación de ERK inducida por el FVIIa Con el enlace del factor de coagulación VI la (FVIIa) al TF, se provocó la fosforilación de la cinasa activada por mitógenos (p42 y p44 MAPK o ERK1 y ERK2) . La línea de células de carcinoma epidermoide A431 expresa altos niveles de TF y después de la estimulación con el FVIIa se indujo una fosforilación de ERK (ERK-P) óptima (de 3 a 5 veces) , medida utilizando el ensayo de ERK AlphaScreen SurefireMR (Perkin Elmer) , dentro de 10 minutos.
Las células A431 (30,000 células por pocilio) se sembraron en placas TC de 96 pocilios y se cultivaron O/N (37°C, 5% de C02, 85% de humedad) en medio libre de suero (RPMI que contenía 20% de HSA y penicilina/estreptomicina) . El medio luego se reemplazó por DME (sin aditivos) y las células se incubaron durante 1.5 horas. Se agregaron diluciones seriales 3 veces de TF-HuMabs o HuMab-KLH y las células se incubaron durante 0.5 horas. Las células luego se estimularon con el FVIIa a una concentración EC80 (50 nM; 10 minutos; 37°C, 5% de C02, 85% de humedad) . Las células se lavaron una vez con PBS y se lisaron utilizando 25 µL de amortiguador de lisis (Perkin Elmer, kit Surefire) . Los lisados se centrifugaron (3 minutos, 330 x g, temperatura ambiente) . Cuatro L de sobrenadante se transfirieron a placas ProxiplatesMR de 384 pocilios (Perkin Elmer) . 7 µ? de mezcla de amortiguador de Reacción/amortiguador de Activación que contenía las perlas AlphaScreenMR (Perkin Elmer, kit Surefire) se agregaron y las placas se incubaron en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente . Las placas se leyeron utilizando el protocolo "Surefire Plus" de EnVision technology.
Las Figuras 6A-6C muestran que, medido utilizando el ensayo de ERK AlphaScreen SurefireMR, el anticuerpo 013 no inhibe la fosforilación de ERK inducida por el FVIIa, los anticuerpos 044 y 111 inhiben moderadamente la fosforilación de ERK y todos los otros anticuerpos bloquean eficientemente la fosforilación de ERK.
La Tabla 6 muestra los valores IC50 y los valores de inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición de la fosforilación de ERK inducida por el FVIIa por los HuMabs específicos para el TF, medidos utilizando el ensayo de ERK AlphaScreen Surefire Tabla 6 - Valores IC50 y valores de inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición de la fosforilación de ERK inducida por el FVIIa (medida utilizando el ensayo de ERK AlphaScreen Surefire10* por los HuMabs específicos para el TF Los resultados obtenidos en el ensayo de ERK AlphaScreen Surefire^ se confirmaron por medio del análisis de Inmunotransferencia Western, utilizando las líneas de células HaCaT y BxPC3. 30,000 células/pocilio se sembraron en DMEM que contenía concentraciones mínimas de suero (medio de inanición) y se cultivaron durante toda la noche. Las células se cultivaron adicionalmente durante 2 horas en DMEM sin suero, los anticuerpos anti-TF se agregaron durante los 30 minutos finales del cultivo. Las células se estimularon con el FVIIa 0, 10 o 50 nM durante 10 minutos (37°C) y se lisaron subsecuentemente en amortiguador de lisis de células (50 uL de amortiguador de lisis por pocilio, 30-60 minutos de lisis bajo condición de agitación, temperatura ambiente) . 25 L de SDS que contenía amortiguador de muestra se agregaron a cada muestra. Las muestras se cargaron en geles de SDS-PAGE, se condujeron y se transfirieron utilizando los procedimientos estándar de inmunotransferencia Western. Las manchas se bloquearon con TBSTlx que contenía 5% de proteína irrelevante (ELK) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las manchas se incubaron con anticuerpo anti-E K-P de conejo (O/N, 4°C) . Las manchas se lavaron con TBSTlx y se incubaron con IgG-HRP anti-conejo (1 hora, temperatura ambiente) , se lavaron, se desarrollaron utilizando substrato de HRP y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de Imagenología Optigo Ultima^ (Isogen Life Sciences) .
La Figura 6D muestra los resultados en las células BxPC3 para un sub-panel de anticuerpos. La fosforilación de ERK inducida por 10 nM de FVIIa no fue inhibida por el anticuerpo 013, mientras que fue inhibida eficientemente por los anticuerpos 111, 044 y 025 (este último como un ejemplo para todos los otros HuMabs específicos para el TF descritos en este documento) . La fosforilación de ERK inducida más fuerte (FVIIa 50 nm) no fue inhibida por los anticuerpos 013, 111 y 044, pero fue inhibida por el anticuerpo 025.
Ejemplo 17 Inhibición de la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa La capacidad de los HuMabs específicos para el TF para inhibir la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa se sometió a prueba utilizando las células MDA-MB-231. Las células se sembraron en placas de 96 pocilios (60,000 células/pocilio) y se cultivaron (O/N, 37°C, 5% de C02) en DMEM que contenía CS, piruvato de sodio, 1 -glutamina, MEM NEAA y penicilina/estreptomicina. El medio de cultivo de tejido se eliminó, las células se lavaron dos veces en medio con alto contenido de calcio libre de suero (DMEM que contenía penicilina/estreptomicina) y se cultivaron en este medio durante 105 minutos adicionales. Las diluciones en serie de los anticuerpos se agregaron y las células se cultivaron durante 15 minutos. El FVIIa (Novo Nordisk; concentración final 10 nM) se agregó y las células se cultivaron durante 5 horas. El sobrenadante se eliminó y se centrifugó (300 x g, temperatura ambiente) . Las concentraciones de IL-8 en el sobrenadante se midieron utilizando un kit de ensayo ELISA de IL-8 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sanquin) .
Las Figuras 7A-7C muestran que los anticuerpos de los grupos de bloque cruzado II y III inhibieron eficientemente la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa por las células MDA-MB-231, con la excepción del anticuerpo 111 del grupo de bloque cruzado III. Los anticuerpos del grupo de bloque cruzado I (013, 044 y 87-Lg6) no inhibieron todos la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa.
La Tabla 7 muestra los valores IC50 y los valores de inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición de la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa por los HuMabs específicos para el TF. grupo TF HuMab IC50 nM inhibición máx .
I 13 na -0.3 I 44 74.6 17.2 I 87-Lg6 na 4.3 II 11 9.4 61.7 II 017-D12 9.0 65.8 II 42 14.9 53.7 II 092-A09 28.2 66.6 II 101 22.7 74.9 tt/t?t 98 9.3 59.0 II/III 114 9.2 71.5 III 3 23.7 76.2 III 25 23.1 75.6 III 109 13.6 70.4 III 111 >200 40.1 Tabla 7 - Valores IC50 y valores de Inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición de la liberación de IL-8 inducida por el FVIIa por los HuMabs específicos para el TF Ejemplo 18 Inhibición de la generación de FXa La capacidad de los HuMabs específicos para el TF para inhibir la generación del FXa se sometió a prueba en un ensayo en el cual la conversión de FX al FXa por el complejo de TF/FVIIa se mide utilizando un substrato específico para FXa colorimétrico . El TF (Inovina) se agregó a las placas de 96 pocilios de fondo plano, junto con una dilución en serie de HuMabs específicos para el TF, un control positivo (anticuerpo anti-TF de ratón) de control negativo (HuMab-KLH) (todos diluidos en amortiguador de Hepes que contenía CaCl2 3 mM) . Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se agregó FVIIa (concentración final 1 nM) y FX (ERL; concentración final 200 nM) . Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37°C. 50 µ? de cada pocilio se transfirieron a una placa de 96 pocilios que contenía amortiguador de detención (precalentado , 37°C) (EDTA 5 mM en 100 mi de amortiguador de Hepes) . El substrato específico para el FXa Chromogenix- 2765MR ( Instrumat ion Laboratory Company) se agregó, las placas se incubaron durante 60 minutos a 37°C y se midió la OD405 nm a 37°C.
Las Figuras 8A-8C muestran que el anticuerpo 017-D12 inhibió totalmente la generación del FXa, el anticuerpo 013 demostró una inhibición intermedia y otros anticuerpos mostraron una inhibición de baja a nula de la generación del FXa.
La Tabla 8 muestra los valores IC50 y los valores de inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición de la generación del FXa por los HuMabs específicos para el TF. grupo TF HuMab IC50 nM % de inhibición máx.
I 13 0.05 31 I 44 NA 3 I 87-Lg6 nt nt II 11 0.05 26 II 017-D12 0.28 84 II 42 nt nt II 092-A09 0.30 21 II 101 nt nt II/III 98 0.43 14 II/III 114 0.24 21 III 3 0.07 21 III 25 0.30 19 III 109 0.09 18 III 111 0.07 7 Tabla 8 - Valores IC50 y valores de Inhibición máxima (porcentaje) de la inhibición de la generación del FXa por los HuMabs específicos para el TF Ejemplo 19 Inhibición de la coagulación de la sangre La inhibición de la coagulación de la sangre por los TF-HuMabs se midió en un ensayo que determina el tiempo de coagulación inducida por TF. Las mezclas de 17 µ? de CaCl2 100 mM (concentración final 17 mM) , 10 µ? de innovina 1:100 (concentración final 1:1000), 23 µ? de amortiguador de HEPES IX y 50 µ? de anticuerpo diluido en serie se prepararon en placas de 96 pocilios. Cincuenta µ? de plasma humano reservados se agregaron a pocilios de placas Immulon 2BMR (Thermo Electron) . Cincuenta µ? de las mezclas de anticuerpos preparadas se agregaron a las placas Immulon 2bMR y el desarrollo de la coagulación a 405 nm se midió cada 15 segundos durante 25 minutos utilizando un lector de placas cinético. El incremento en la densidad óptica se representó gráficamente en el tiempo y el tiempo de coagulación (tl/2) se calculó. El tiempo de coagulación se representó gráficamente contra la concentración del anticuerpo. El valor IC50 de la inhibición de la coagulación inducida por el anticuerpo se calculó a partir de esto por medio de un análisis de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism.
Las Figuras 9A-9C muestran que los anticuerpos 044, 087 y 111 no inhibieron la coagulación de la sangre inducida por el TF, mientras que todos los otros anticuerpos si lo hicieron.
La Tabla 9 muestra los valores IC50 de la inhibición de la coagulación de la sangre por los HuMabs específicos para el TF. grupo TF HuMab IC50 nM I 13 0.6 I 44 NA I 87-Lg6 NA II 11 1.6 II 017-D12 2.6 II 42 1.5 II 092-A09 0.2 II 101 0.7 II/III 98 1.1 II/III 114 0.4 III 3 7.3 III 25 2.3 III 109 7.6 III 111 NA Tabla 9 - Valores IC50 de la inhibición de la coagulación de la sangre por los HuMabs específicos para el TF Ejemplo 20 Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos Preparación de las células objetivo: Las células objetivo que expresaban el TF (5xl06 células Bx-PC3, células MDA-MB-231 o células A431) se recolectaron, se lavaron (dos veces en PBS, 1500 rpm, 5 minutos) y se recolectaron en 1 mi de medio de cultivo RPMI 1640 complementado con Suero de Ternero Cósmico, Piruvato de Sodio, L-Glutamina, MEM NEAA y Penicilina/Estreptomicina, al cual se agregaron 100 µ?? de 51Cr (Cromio-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal , Los Países Bajos) . La mezcla se incubó en un baño de agua con agitación durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado de las células (dos veces en PBS, 1500 rpm, 5 minutos) , las células se resuspendieron en medio de cultivo y las células viables se contaron por medio de la exclusión de azul de tripano. Las células viables se llevaron a una concentración de lxlO5 células/ml.
Preparación de células efectoras : Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de las capas leucocitarias frescas (Sanquin, Amsterdam, Los Países Bajos) utilizando una centrifugación de densidad de Ficoll estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante (medio de separación de linfocitos; Lonza, Verviers, Francia) . Después de la resuspensión de células en un medio de cultivo, las células se contaron por medio de la exclusión de azul de tripano y se llevaron a una concentración de lxlO7 células/ml.
Configuración de la ADCC: 50 µ? de células objetivo etiquetadas con 51Cr se transfirieron a pocilios de microtítulo y 50 µ? de anticuerpo diluido en serie se agregaron, diluidos en medio de cultivo. Las células se incubaron (temperatura ambiente, 15 minutos) y se agregaron 50 µ? de células efectoras, dando por resultado una relación de efector con respecto al objetivo de 100:1. Para determinar el nivel máximo de lisis, 100 µ? de Triton-X100 al 5% se agregaron en lugar de las células efectoras; para determinar el nivel espontáneo de lisis, se agregaron 100 µ? de medio de cultivo; para determinar el nivel de lisis independiente del anticuerpo, se agregaron 50 µ? de células efectoras y 50 µ? de medio de cultivo) . Subsecuentemente, las células se incubaron O/N a 37°C, 5% de C02. Después de centrifugar las células (1200 rpm, 3 minutos) , 75 µ? de sobrenadante se transfirieron a tubos micrónicos . El Cr liberado se contó en un contador gamma y el porcentaje de lisis mediada por el anticuerpo se calculó de la siguiente manera: ( (cpm de muestra - cpm de lisis independiente del anticuerpo) / (cpm de lisis máxima - cpm de lisis espontánea) ) x 100% en donde cpm es conteos por minuto.
Las Figuras 10A-10C muestran que todos los TF-HuMabs sometidos a prueba indujeron la lisis de las células Bx-PC3 por medio de ADCC, no obstante con diferentes eficiencias (EC50) .
La Tabla 10 muestra los valores EC50 (nM) de la ADCC de diferentes líneas de células por los HuMabs específicos para el TF.
MDA-MB-321 BX-PC3 A431 grupo TF IC50 nM IC50 nM IC50 nM HuMab I 13 0.06 0.07 0.11 I 44 0.08 0.12 0.19 I 87-Lg6 nt nt nt II 11 0.07 0.22 0.06 II 017-D12 0.14 0.13 0.18 II 42 nt nt nt II 092-A09 0.11 0.13 0.22 II 101 0.10 0.09 0.01 tt/?t? 98 0.15 0.02 0.07 tt/t?? 114 0.07 0.07 0.08 III 3 0.29 0.17 0.58 III 25 0.24 0.15 0.16 III 109 0.12 0.06 0.13 III 111 0.84 0.22 1.56 Tabla 10 - Valores EC50 (??) de la ADCC de diferentes líneas de células por los HuMabs específicos para el TF E j emp lo 21 Deposición del complemento La deposición de fragmentos de complemento C3c y C4c a las células objetivo incubadas con TF-HuMab se midió por medio de un análisis de PACS . Las células objetivo que expresaban el TF (células Bx-PC3 o MDA-MB-231) se colocaron en placas de 96 pocilios de fondo redondo (Ixl0e5 células/pocilio) en RPMI que contenía 1% de BSA. El anticuerpo (30 µ9/p^) se agregó y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Veinticinco µL de suero humano reservado se agregaron a una fuente de complemento, el suero humano inactivado con calor se utilizó para determinar el enlace espontáneo del complemento. Las células se incubaron a 37°C durante 45 minutos. Las células se lavaron una vez y se incubaron con FITC C3c antihumano o FITC C4c antihumano (DAKO) en amortiguador de FACS y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Las muestras se analizaron utilizando FACS Canto.
Las Figuras 11A-11D muestran que los anticuerpos del grupo de bloque cruzado I no indujeron la deposición de C3c o C4c sobre las células ya sea BxPC3 o MDA - MB - 231. Todos los anticuerpos sometidos a prueba del grupo de bloque cruzado II no indujeron la deposición de C3c y C4c, como los anticuerpos del grupo de bloque cruzado III, con la excepción del anticuerpo 003.
E j em lo 22 : Estudios de Avidez/Afinidad Determinación de la afinidad: El anticuerpo que se enlaza al TF se analizó por medio de la resonancia de plasmón de la superficie en un dispositivo BIAcore 3000 (GE Healthcare) . El TFECDHis se utilizó para el análisis. Los anticuerpos HuMab (500 unidades de resonancia) se inmovilizaron en el mi c roc i rcui t o sensor CM-5 de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. En resumen, después de la activación de la superficie por EDC y NHS el anticuerpo HuMab se inyectó sobre la superficie activada de CM-5 en acetato de sodio 10 mM, pH que variaba de 4.0 a 5.5 a 5 µ?/minuto seguido por etanolamina 1 M para la desactivación. Las series de concentraciones de TFECDHis en el amortiguador de HBS-EP se inyectaron sobre los anticuerpos inmovilizados a una velocidad de flujo de 30 µ?/minuto durante 180 segundos. La regeneración de la superficie del HuMab se realizó por medio de la inyección de glicina-HCl 10 mM pH 2.0 o acetato de sodio 10 mM pH 3.0. El análisis cinético se realizó utilizando una substracción de referencia doble y el análisis de enlace modelo 1:1 (Langmuir) .
La Tabla 11 muestra para la mayoría de HuMabs la afinidad determinada en un intervalo (sub) nanomolar. No se pudieron determinar los parámetros cinéticos de todos los anticuerpos. El anticuerpo 044 proporcionó una variación alta en las constantes de disociación (kd) y tuvo altos residuos, lo cual significa que el ajuste de las curvas no fue bueno. Los anticuerpos 098, 111 y 087-Lg6 tuvieron constantes de disociación las cuales fueron muy altas para que el dispositivo Biacore 3000 las midiera. n.a. no medible = > 10 3 sec Tabla 11. Constantes cinéticas de TF-HuMabs para la reactividad con TFECDHis - mediciones de afinidad Determinación de la avidez : El enlace del TF (TFECDHis) a los HuMabs específicos para el TF se determinó esencialmente como se describiera anteriormente, siendo que el TFECDHis es inmovilizado sobre el microcircuito sensor CM-5 (300 unidades de resonancia) y las series de concentración de anticuerpos Humab utilizadas para el análisis cinético. El análisis cinético se realizó utilizando una substracción de referencia doble y el análisis de enlace modelo 1:1 (Langmuir) .
La Tabla 12 muestra las mediciones de avidez para los anticuerpos 11, 98, 109 y 111. Mientras que las mediciones de afinidad para los anticuerpos 98 y 111 indicaron constantes de disociación altas (más allá de los límites de determinación del dispositivo Biacore (es decir >10"3) ) , la determinación de la avidez reveló una interacción en el intervalo nanomolar.
Tabla 12. Constantes cinéticas del TFECDHIS para la reactividad con TF-HuMabs - mediciones de avidez Ejemplo 23: Análisis initiunohistoquímico del enlace a tejidos humanos normales y tumores pancreáticos El enlace de TF-HuMabs a varios tejidos humanos que se sabe que expresan el TF (colon, corazón, riñon, piel, pulmón y cerebro) se determinó por medio de la inmunohistoquímica (IHC) .
IHC sobre tejido congelado Las secciones de tejido congelado se cortaron (4-6 µp? de espesor) y se fijaron en acetona. La peroxidasa de tejido endógena (PO) se bloqueó y los cortes de tejido se pre-incubaron con suero humano normal para impedir el enlace no específico de anticuerpos aplicados posteriormente a los receptores Fe endógenos. Un Ab de ratón dirigido contra el TF humano (y un Ab de ratón de control negativo) se aplicó a los tejidos en una dilución óptima y se detectó subsecuentemente con Powervision-POMR (IgG de anti-ratón/-conejo de cabra) -PO. Los HuMabs específicos para el TF se acoplaron a la IgG anti-humano de cabra Fab' (Fe) -FITC y después se aplicaron a los cortes de tejido congelados en 3 diluciones, incluyendo una dilución óptima predeterminada. Subsecuentemente, el complejo de HuMab - Fab-FITC se detectó por medio de un anticuerpo anti-FITC de conejo y Powervision-PO^. La actividad de PO se visualizó con AEC como substrato y los núcleos se visualizaron con hematoxilina. La tinción se analizó por medio de un microscopio Brightfield.
IHC con un Ab de ratón sobre tejido fijado con formalina e incrustado en parafina (FFPE) Las biopsias de tejido FFPE se cortaron a 4 |im, se desparafinaron, se bloquearon para la peroxidasa de tejido endógena y se sujetaron a la recuperación de antígenos (pH6, amortiguador de citrato) . Antes de la incubación con el Ab de ratón, los cortes de tejido se preincubaron en suero humano normal para impedir el enlace no específico a los receptores Fe endógenos . El Ab de ratón dirigido contra el TF humano (y un Ab de ratón de control negativo) se aplicó a los cortes de tejido en una dilución óptima y se detectó subsecuentemente con Powervision-PC^ (IgG anti-ratón/-conejo de cabra) -P0. La actividad de PO se visualizó con AEC como substrato y los núcleos se visualizaron con hematoxilina. La tinción se analizó por medio de un microscopio Brightfield.
La Figura 12 muestra un ejemplo del enlace del anticuerpo 013 (tinción positiva) , el anticuerpo 011 (tinción positiva) , el anticuerpo 114 (tinción positiva) y el anticuerpo 111 (tinción intermedia) a los glomérulos del riñon. Los anticuerpos 098 y 044 no se enlazaron a los glomérulos.
La Tabla 13 proporciona una visión general de los resultados de tinción de todos los TF-HuMabs en todos los tejidos de riñon humano examinados .
IHC de glomérulos Grupo TF HuMab humanos I 13 + I 44 - I 87-Lg6 nt II 11 + II 017-D12 + II 42 nt II 092-A09 nt II 101 + II/III 98 - II/III 114 + III 3 + III 25 nt III 109 + III 111 +/- Tabla 13. Tinción de IHC de glomérulos humanos La Tabla 14 proporciona una visión general de los resultados de tinción de HuMabs específicos para el TF seleccionados en el riñon, colon, corazón, cerebro y piel humanos así como también en tumores pancreáticos humanos.
Tabla 14. Tinción de IHC de tejido humano normal y tumores pancreáticos El análisis de IHC del enlace de los TF-HuMabs a tumores pancreáticos humanos reveló una tinción positiva para todos los TF-HuMabs (ejemplificado en la Figura 13) .
Ejemplo 24: Tratamiento de xenoinjerto de tumor MDA-MB-231 establecido en almohadillas adiposas mamarias de ratones SCID La eficacia in vivo de los TF-HuMabs se determinó en tumores de xenoinjerto MDA-MB-231 ortotópicos, establecidos en ratones SCID. 2xl06 células de tumor en PBS se inyectaron s.c. En la segunda almohadilla adiposa mamaria de ratones hembra SCID, seguido por el tratamiento con TF-HuMabs o un mAb de control (HuMab-KLH) , iniciando en un momento en que los tamaños de los tumores comenzaron a medirse. Los anticuerpos se inyectaron en el día 21 (260 µg/ratón) , día 28 (130 µg/ratón) y día 42 (130 µg/ratón) . El volumen del tumor se determinó por lo menos 2x/semana. Los volúmenes (mm3) se calcularon a partir de las mediciones del calibrador (PLEXX) como 0.52 x (longitud) x (anchura)2.
La Figura 14 muestra que todos los anticuerpos 114, 111, 013, 098, 011 y 044 fueron efectivos en la inhibición del crecimiento de tumores MDA-MB-231 ortotópicos, establecidos. Ejemplo 25: Dosificación repetida piloto de un HuMab específico para el TF en monos cynomolgus Para obtener información inicial sobre la toxicidad de HuMabs específicos para el TF, inclusive una valoración de la capacidad de los anticuerpos para interferir con la cascada de coagulación y por lo tanto para incrementar potencialmente el riesgo de sangrado en animales expuestos, se realizó un estudio de dosificación repetida piloto en monos cynomolgus .
Dos monos cynomolgus machos y dos monos cynomolgus hembras {Macaca fascicularis) , aproximadamente de 2 años de edad, recibieron inyecciones intravenosas del anticuerpo 011: - día 1 de estudio: 0 mg/kg (únicamente vehículo) - día 8: 1 mg/kg; 1 mL/minuto - día 15: 10 mg/kg; 1 mL/minuto - día 22: 100 mg/kg; 1 mL/minuto Los animales fueron seguidos hasta el día 27, punto de tiempo en el cual los animales se sometieron a la eutanasia para la necropsia y evaluación histológica de los órganos .
Los puntos finales principales del estudio fueron: observaciones clínicas: signos de sangrado determinados diariamente de las encías, ojos. - tiempo de sangrado funcional y pérdida de sangre: determinados en los días 1, 8, 15 y 22 (1, 24 y 120 horas después de la dosificación) y en dos puntos de tiempo previos al ensayo. - sangre/trazas de sangre/coágulos: tinción de HE de todos los tejidos (determinado en tejidos obtenidos en el sacrificio final) sangre en la orina, heces, vómito: determinado diariamente/semanalmente .
No se observó toxicidad aparente de la dosificación incrementada, repetida del anticuerpo 011. Los animales no mostraron signos clínicos y no hubo una indicación de liberación de citocinas. Además, no hubo signos clínicos aparentes de un sistema de coagulación comprometido o sangrados sistémicos. En el punto de tiempo posterior a la dosificación de 1 hora, el tiempo de sangrado promedio en el Día 22 fue significativamente más alto que aquel observado en el Día 1 (p=0.012) . No hubo otras diferencias estadísticamente significativas entre los Días 8, 15 y 22 en comparación con el Día 1. Adicionalmente, se descubrió que no hubo toxicidad aparente para los órganos principales y no hubo efectos hematológicos adversos. La conclusión preliminar sobre la evaluación histológica de tejidos de este estudio es que no hubo descubrimientos histológicos en los cuatro animales tratados que se pudieran atribuir al tratamiento con el artículo de prueba.
La Figura 15 muestra los puntos de datos individuales para cada animal (muestras por duplicado) como una función del tiempo. El tiempo de sangrado para los 4 animales se determinó en los días 1, 8, 15 y 22 (1, 24 y 120 horas) y en dos puntos de tiempo previos al ensayo.
Ejemplo 26 Tratamiento preventivo y terapéutico de xenoin ertos de tumor BxPC3 en ratones SCID La eficacia in vivo de los TF-HuMabs en el tratamiento preventivo o terapéutico de xenoinj ertos de células BxPC3 en ratones SCID se determinó. 10x10s células de tumor BxPC3 en PBS se inyectaron s.c. en ratones hembra SCID, seguido por el tratamiento con TF-HuMabs o un mAb de control (HuMab-KLH) . Para el tratamiento preventivo, los anticuerpos (400 g/ratón) se inyectaron i.p. 1 hora después de la inducción del tumor. Para el tratamiento terapéutico, la inyección de anticuerpos (300 µg/ratón) se inició en el día 8 después de la inducción del tumor, seguido por inyecciones semanales de anticuerpos (150 g/ratón) . El volumen del tumor se determinó por lo menos 2x/semana. Los volúmenes (mm3) se calcularon a partir de las mediciones del calibrador (PLEXX) como 0.52 x (longitud) x (anchura)2.
Las Figuras 16A-16B muestran que los HuMabs específicos para el TF tienen la capacidad de tratamiento preventivo así como también terapéutico de los tumores de xenoinj erto BxPC3.
Ejemplo 27 Entremezclado de ADN entre TF de murino y humano para determinar los dominios importantes para el enlace de HuMabs anti-TF Para determinar los dominios importantes para el enlace de los HuMabs anti-TF al TF humano, el entremezclado de ADN se realizó entre el TF humano y de murino. Las construcciones de entremezclado se prepararon a partir de ADN que codifica el TF humano, al reemplazar dominios humanos por dominios de murino y de ADN que codifica el TF de murino al reemplazar dominios de murino por dominios de humano. Si un dominio en el TF humano es importante para el enlace de un HuMab anti-TF, el enlace se perderá con el reemplazo de ese dominio por el dominio de murino. El TF humano y el TF de murino son 57% homólogos a nivel de proteínas. La Figura 17A y la Figura 17B muestran las construcciones para el TF humano que contiene dominios de TF de murino (TFhs, que contiene dominios de TFmm) y para el TF de murino que contiene dominios de TF humano. Las células HEK293F se transíectaron de manera transitoria con las construcciones o con el vector solo (pcDNA3.3SP; simulado). El análisis de FACS se realizó esencialmente como se describiera supra, con 30 µg/mL de material parental purificado. El HuMab-KLH se utilizó como Ab de control .
Las Figuras 17A-17B muestran que todos excepto un HuMab anti-TF se enlazan solamente al TF humano y no al TF de murino. El HuMab-TF-003 muestra algo de enlace al TF de murino.
Las Figuras 18A-180 muestran los resultados para el enlace de los diferentes HuMabs anti-TF a las construcciones expresadas en las células HEK293F. Estos resultados se resumen en la Tabla 15. En esta Tabla, los HuMabs anti-TF se clasifican en grupos, con base en los dominios en el TF humano que son importantes para el enlace de estos HuMabs.
Tabla 15 Ejemplo 28 Enlace de fragmentos Fab de HuMabs anti-TF al dominio extracelular del TF, determinado por medio de un ensayo ELISA y al TF celular en células BxPC3, determinado por medio de FACS enlace de los fragmentos Fab de HuMabs anti TF al TF se midió por medio de un ensayo ELISA (dominio extracelular revestido de TF) y por medio de FACS (TF en células BxPC3) . El ensayo ELISA se realizó esencialmente como se describiera supra. Los fragmentos Fab enlazados se detectaron utilizando H+L anti-humano de burro conjugado con HRP . El análisis de FACS se realizó esencialmente como se describiera supra. La IgG antihumano de cabra conjugada con FITC (H+L) (Jackson) se utilizó para detectar los candidatos principales enlazados. La fluorescencia se midió en un dispositivo FACSCantoII. Las curvas de enlace se analizaron como se describiera supra, utilizando el software GraphPad Prism 5.
La Figura 19 muestra el enlace menor de los fragmentos Fab de los HuMab-TF- 098 y -111 al dominio extracelular del TF, en comparación con los fragmentos Fab del HuMab-TF- 011 , medido por medio de un ensayo ELISA.
La Figura 20 muestra el enlace menor de los fragmentos Fab de los HuMab-TF-098 y -111 al TF celular, en comparación con los fragmentos Fab del HuMab-TF- 011 , medido por medio de FACS en células BxPC3.
La Tabla 16 muestra los valores EC50 de los fragmentos Fab de HuMab-TF para el enlace al dominio extracelular del TF por medio de un ensayo ELISA y al TF celular por medio de FACS en células BxPC3.
Tabla 16 - Visión general de los valores EC50 para el enlace de los fragmentos Fab de HuMab-TF al dominio extracelular del TF, determinado por medio de un ensayo ELISA y al TF celular en células BxPC3 , determinado por medio de FACS Los valores EC50 están en µg/mL·. na - no se pudo calcular.
Ejemplo 29 Enlace de HuMabs anti-TF a líneas de células que expresan diferentes niveles de TF El enlace de los HuMabs anti-TF al TF enlazado a la membrana en líneas de células que expresan diferentes niveles de TF se determinó por medio de un análisis de FACS, esencialmente como se describiera supra . El anticuerpo anti-TF de ratón seguido por la IgGFc anti-ratón conjugada con PE se utilizó como un control positivo. La fluorescencia se midió en un dispositivo FACSCantoII. Las curvas de enlace se analizaron esencialmente como se describiera supra, utilizando el software GraphPad Prism 5. La cantidad de moléculas de TF en las líneas de células se determinó por medio de un kit QifiMR (Dako, Glostrup, Dinamarca) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se determinó que las células SW480 expresan -20,000 moléculas de TF por célula, las células SK-OV-3 expresan -60,000 moléculas por célula, las células AsPC-1 expresan -175,000 moléculas por célula y las células MDA-MB-231 expresan -900,000 moléculas por célula.
Figuras 21A-21D. Los HuMab-TF- 98 y -111 exhiben características de enlace similares a los HuMab-TF-11, -13 y -109 en la línea de células que expresa un alto contenido de TF MDA-MD-231. En las líneas de células con menos moléculas de TF por célula, por ejemplo las líneas de células SK-OV-3 y SW480, los HuMab-TF- 98 y -111 exhiben diferentes características de enlace en comparación con los otros anticuerpos HuMab-TF.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (88)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo humano, caracterizado porque se enlaza al factor tisular humano.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al dominio extracelular del factor tisular con una afinidad aparente (EC50) de 3 nM o menos, tal como 0.50 nM o menos, por ejemplo 0.35 nM o menos, tal como 0.20 nM o menos, por ejemplo 0.1 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 13.
3. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a células de mamífero que expresan el factor tisular, tales como las células A431 transíectadas con una construcción que codifica el factor tisular, preferiblemente con una afinidad aparente (EC50) de 10 nM o menos, por ejemplo 8 nM o menos, tal como 5 nM o menos, por ejemplo 2 nM o menos, tal como 1 nM o menos, por ejemplo 0.5 nM o menos, tal como 0.3 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 14.
4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en las células A431, preferiblemente con un valor EC50 de 2 nM o menos, por ejemplo 1 nM o menos, tal como 0.7 nM o menos o 0.3 nM o menos, tal como 0.2 nM o menos o 0.1 nM o menos o 0.05 nM o menos, cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 20.
5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es efectivo en la inhibición del crecimiento de tumores MDA-MB-231 establecidos, cuando se determina por medio del método descrito en el ejemplo 24 y/o en la inhibición del crecimiento de tumores BxPC3 establecidos, cuando se determina por medio del método descrito en el ejemplo 26.
6. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la coagulación sanguínea inducida por el factor tisular, preferiblemente con una concentración de inhibición media menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por ejemplo menor que 2 nM, tal como menor que 1 nM cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 19.
7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo inhibe el enlace de FVIIa al factor tisular, preferiblemente con un valor máximo de inhibición mayor que 80%, tal como mayor que 90% cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 15.
8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la liberación de IL-8 inducida por FVIIa por parte de las células MDA-MB-231, preferiblemente con un valor máximo de inhibición mayor que 40%, tal como mayor que 50%, por ejemplo mayor que 60%, cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 17.
9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la conversión del FX en FXa por medio del complejo de TF/FVIIa, preferiblemente menor que 50%, por ejemplo menor que 40%, tal como en el intervalo de 1-30%, cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 18.
10. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65.
11. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el enlace al factor tisular no involucra ninguno de los aminoácidos W en la posición 45, K en la posición 46 o Y en la posición 94 del factor tisular.
12. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la fosforilación de ERK inducida por FVIIa, preferiblemente con una concentración de inhibición media menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por ejemplo menor que 2 nM cuando se determina como se describe en el ensayo del ej emplo 16.
14. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y 9-13, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la fosforilación de ERK preferiblemente con una concentración de inhibición media menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por ejemplo menor que 2 nM cuando se determina como se describe en el ensayo del ejemplo 16 y no inhibe la liberación de IL-8 inducida por FVII como se describe en el ensayo del ejemplo 17 por más de 10% como máximo.
15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de inducir la deposición de C3c y C4c, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inducir la deposición de C3c y C4c como se determina en el ejemplo 21.
16. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los fragmentos Fab de anticuerpo se enlazan al dominio extracelular del factor tisular como se describe en el ejemplo 28 con un valor EC50 inferior a 0.1 µ9/?a--, tal como inferior a 0.05 por ejemplo inferior a 0.04 medido por medio de un ensayo ELISA.
17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque los fragmentos Fab de anticuerpo se enlazan al dominio extracelular del factor tisular como se describe en el ejemplo 28 con un valor EC50 superior a 1.0 µg/mL medido por medio de un ensayo ELISA.
18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque los fragmentos Fab de anticuerpo se enlazan al dominio extracelular del factor tisular como se describe en el ejemplo 28 con un valor EC50 inferior a 10 µg/mL, tal como inferior a 1 µg/mL, por ejemplo inferior a 0.5 o inferior a 0.2 µg/mL.
19. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 42-84 mm, que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 42-84, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
20. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 85-122 mm, que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 85-122, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
21. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 123-137 mm que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 123-137, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
22. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a la construcción de entremezclado 185-225 mm que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 185-225, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
23. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al factor tisular humano y no al factor tisular de murino y muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a tanto la construcción de entremezclado 226-250 mm que contiene la secuencia humana para el TF excepto por los aminoácidos 226-250, los cuales han sido reemplazados por una secuencia de ratón, como se describe en el ejemplo 27.
24. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-23, caracterizado porque muestra un enlace reducido en comparación con el enlace al TF humano a más de una construcción de entremezclado, tal como un enlace reducido • a la construcción de entremezclado 42-84 mm de conformidad con la reivindicación 19 y a la construcción de entremezclado 85-122 mm de conformidad con la reivindicación 20 o • a la construcción de entremezclado 123-137 mm de conformidad con la reivindicación 21 y a la construcción de entremezclado 185-225 mm de conformidad con la reivindicación 22 y a la construcción de entremezclado 226-250 mm de conformidad con la reivindicación 23.
25. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo - compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65 y no compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID NO: 12, - la SEC ID NO: 16, - la SEC ID NO: 20, - la SEC ID NO: 24, - la SEC ID NO: 28, o b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 12 o una variante del mismo, en donde la variante comprende una modificación en una o más de las posiciones 2, 3, 6, 9 y 11, preferiblemente donde la modificación es una sustitución, más preferiblemente donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste de a) R es sustituido por K cuando está en la posición 2, b) S es sustituido por A o T cuando está en la posición 3, c) G es sustituido por T cuando está en la posición 6, d) L es sustituido por F cuando está en la posición 9 y e) S es sustituido por Y cuando está en la posición 11.
28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 26, caracterizado porque el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 66, 67 y 68, b) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 14, 15 y 16 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 70, 71 y 72, c) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO:18, 19, 20 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 74, 75 y 76, d) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 22, 23 y 24 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 78, 79 y 80, e) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 26, 27 y 28 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 82, 83 y 84 o f) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 9, 13, 17, 21 y 25 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o l modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 9 , 13, 17, 21, 21 y 25.
30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende una VL que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:65, 69, 73, 77 y 81 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:65, 69, 73, 77 y 81.
31. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 69, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:77, e) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 81 o f) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
32. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque el anticuerpo - compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65 y - compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
33. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID NO: 8, - la SEC ID NO: 52, O b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 32, caracterizado porque el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 6, 7 y 8 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 62, 63 y 64, b) una región VH que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 50, 51 y 52 y una región VL que comprende las secuencias de CDRl, 2 y 3 de las SEC ID NO: 106, 107 y 108 o c) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
35. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 5 y 49 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 5 y 49.
36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende una VL que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 61 y 105 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 61 y 105.
37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 5 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 61, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:105 o c) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
38. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque el anticuerpo no compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65 y - compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93.
39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID NO: 32, - la SEC ID NO: 36, - la SEC ID NO:40, - la SEC ID NO: 56, O b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 38, caracterizado porque el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID O:30, 31 y 32 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 86, 87 y 88, b) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 34, 35 y 36 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO: 90, 91 y 92, c) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO:38, 39 y 40 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 94, 95 y 96, d) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 54, 55 y 56 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 110, 11 y 112 o e) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
41. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:29, 33, 37 y 53 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO:29, 33, 37 y 53.
42. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende una VL que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID N0:85, 89, 93 y 109 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 85, 89, 93 y 109.
43. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 85, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 89, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 109 o e) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
44. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 24, caracterizado porque el anticuerpo compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97.
45. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región CDR3 VH que tiene a) la secuencia expuesta en - la SEC ID N0:4, - la SEC ID NO: 44, - la SEC ID NO: 48, o b) una variante de cualquiera de las secuencias, tal como una variante que tiene a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservadoras.
46. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 44, caracterizado porque el anticuerpo comprende : a) una región VH que comprende las secuencias de CDR1 , 2 y 3 de las SEC ID NO : 2 , 3 y 4 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 58, 59 y 60, b) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 42, 43 y 44 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 98, 99 y 100, c) una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO:46, 47 y 48 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de las SEC ID NO: 102, 103 y 104 o d) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
47. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende una VH que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90% , por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 1 , 41 y 45 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO : 1 , 41 y 45.
48. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende una VL que tiene a) por lo menos 80% de identidad, tal como por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% o 100% de identidad con una secuencia de región VL seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 57, 97 y 101 o b) a lo sumo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia de región VH seleccionada del grupo que consiste de: las SEC ID NO: 57, 97 y 101.
49. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende: a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO:l y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 57, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 101 o d) una variante de cualquiera de los anticuerpos, en donde la variante tiene preferiblemente a lo sumo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoácidos, más preferiblemente sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias.
50. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo tiene una afinidad hacia el factor tisular la cual es menor que 5 nM, tal como menor que 3.5 nM, por ejemplo menor que 2 nM cuando se determina por medio del método descrito en el ejemplo 22 en este documento.
51. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo tiene una kd mayor que 10"3 sec"1 cuando se determina por medio del método descrito en el ejemplo 22 en este documento y/o una ka mayor que 5 x 104, mol"1 sec"1 cuando se determina por medio del método descrito en el ejemplo 22 en este documento.
52. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo tiene una kd mayor que 10"3 sec"1 cuando se determina por medio del método de afinidad descrito en el ejemplo 22 en este documento y una avidez menor que 5 nM, tal como menor que 1 nM, por ejemplo menor que 0.2 nM cuando se determina por medio del método de avidez descrito en el ejemplo 22 en este documento.
53. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o 51 o 52, caracterizado porque el anticuerpo no exhibe un enlace al tejido saludable, en particular no exhibe un enlace a los glomérulos humanos, por ejemplo como se determina en el ensayo descrito en el ejemplo 23, pero exhibe un enlace a tumores pancreáticos, por ejemplo como se determina en el ensayo descrito en el ejemplo 23 en este documento .
54. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o 51 a 53, caracterizado porque el anticuerpo es efectivo en la inhibición del crecimiento de tumores BX-PC3 establecidos cuando se determina por medio del método descrito en el ejemplo 26 en este documento.
55. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo tiene además una o más de las siguientes propiedades: inhibición de la proliferación, inhibición de la angiogénesis de tumores, inducción de la apoptosis de células tumorales, enlace al factor tisular alternativamente empalmado .
56. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , caracterizado porque compite por el enlace al factor tisular con un anticuerpo que comprende a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:65, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID N0:1 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 57, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 5 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 61, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 69, e) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73, f) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 77, g) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 81, h) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 85, i) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 89, j) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93, k) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:97, 1) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 101, m) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 105 o n) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 109.
57. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se enlaza al mismo epítopo en el factor tisular que un anticuerpo que tiene : a) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 9 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 65, b) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 1 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 57, c) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 5 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 61, d) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 13 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 69, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 17 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 73, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 21 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 77, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 25 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 81, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 29 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 85, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 33 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 89, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 93, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 41 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 97, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO:101, una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 105 O n) una región VH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 y una región VL que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 109.
58. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada derivada de una secuencia de VH de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste de: IGHV1-18*01, IGHV3-23*01, IGHV3-30*01r IGHV3-33*01, IGHV3-33*03, IGHVl-69*20, IGHVl-69*04 e IGHV5-51*01 y/o - una región variable de cadena ligera derivada de una secuencia de VK de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste de: IGKV3-20*01, IGKV1-13*02, IGKV3-11*01 e IGKV1D-16*01.
59. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente un anticuerpo de IgGl, en particular un anticuerpo de IgGl,K.
60. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga con otra porción, tal como una porción citotóxica, un radioisótopo o un fármaco.
61. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 15 a 49, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo deficiente de la función efectora .
62. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el anticuerpo anti-factor tisular deficiente de la función efectora es un anticuerpo de IgG4 humana estabilizado, tal como un anticuerpo en donde la arginina en la posición 409 en la región constante de cadena pesada de la IgG4 humana es sustituida por lisina, treonina, metionina o leucina, preferiblemente lisina y/o en donde la región de rótula comprende una secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys .
63. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 15 a 49, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monovalente.
64. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el anticuerpo monovalente se construye por medio de un método que comprende : i) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monovalente, la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica la región CL constante de una Ig, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y la secuencia de nucleótidos que codifica la región CL de una Ig se unen juntas de manera operable, y en donde, en el caso de un subtipo de IgGl, la secuencia de nucleótidos que codifica la región CL ha sido modificada de tal manera que la región CL no contiene ningún aminoácido capaz de formar enlaces de disulfuro o enlaces covalentes con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CL en presencia de la IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano; ii) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo monovalente, la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica la región CH constante de una Ig humana, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región CH ha sido modificada de tal manera que la región que corresponde a la región de rótula y, como es requerido por el subtipo de Ig, otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprenden ningún residuo de aminoácido el cual participa en la formación de enlaces de disulfuro o enlaces inter-cadena pesada covalentes o no covalentes estables con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CH de la Ig humana en presencia de una IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico para el antígeno seleccionado y la secuencia de nucleótidos que codifica la región CH de la Ig se unen juntas de manera operable; iü) proporcionar un sistema de expresión de células para producir el anticuerpo monovalente; iv) producir el anticuerpo monovalente al coexpresar las construcciones de ácido nucleico de (i) y (ii) en células del sistema de expresión de células de (iii) .
65. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el anticuerpo monovalente comprende (i) una región variable de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 26 o una parte de enlace a antígenos de la región y (ii) una región CH de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que comprende las regiones CH2 y CH3 , en donde la región CH o un fragmento de la misma ha sido modificada de tal manera que la región que corresponde a la región de rótula y, si la inmunoglobulina no es un subtipo IgG4, otras regiones de la región CH, tal como la región CH3 , no comprenden ningún residuo de aminoácido, el cual es capaz de formar enlaces de disulfuro con una región CH idéntica u otros enlaces inter-cadena pesada covalentes o no covalentes estables con una región CH idéntica en presencia de una IgG humana policlonal.
66. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, caracterizado porque la cadena pesada ha sido modificada de tal manera que la rótula completa ha sido suprimida.
67. Una molécula biespecífica, caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 62 y una segunda especificidad de enlace, tal como una especificidad de enlace hacia una célula efectora humana, un receptor Fe humano o un receptor de células T.
68. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEC ID NO : 1 - SEC ID NO: 112.
69. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de una cadena ligera, una cadena pesada o cadenas tanto ligeras como pesadas de un anticuerpo humano.
70. Una célula hospedera eucariótica o procariótica recombinante , caracterizada porque produce un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 59 o 61 a 66.
71. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54 o una molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 67 y un portador farmacéuticamente aceptable.
72. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66 o una molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 67, caracterizados porque es para el uso como un medicamento.
73. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer.
74. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 73, caracterizados porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de: tumores del sistema nervioso central, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer estomacal, cáncer hepático y biliar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer endometrial , cáncer ovárico, melanoma maligno, sarcoma, tumores de origen primario desconocido, cáncer de médula ósea, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y linfoma no hodgkiniano, cáncer de piel, glioma, cáncer del cerebro, útero y recto.
75. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer pancreático.
76. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer colorrectal .
77. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer ovárico.
78. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer de mama.
79. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer prostático.
80. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el uso es para el tratamiento del cáncer de vejiga.
81. El anticuerpo o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 72, caracterizados porque el medicamento es para el tratamiento del cáncer en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico .
82. Uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-66 o la molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 697 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
83. El uso de conformidad con la reivindicación 82, que comprende las características adicionales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74 a 81.
84. Un método para inhibir el crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa el factor tisular, caracterizado porque comprende la administración, a un individuo necesitado del mismo, de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66 o una molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 67.
85. Un método para producir un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 59 o 61 a 66, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en a) cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 70 y b) purificar el anticuerpo de los medios de cultivo.
86. Una composición de diagnóstico, caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67.
87. Un método para detectar la presencia del factor tisular en una muestra, caracterizado porque comprende : poner en contacto la muestra con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66 o una molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 67 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o moléculas biespecíficas y el factor tisular; y - analizar si se ha formado un complejo.
88. Un kit para detectar la presencia del factor tisular en una muestra, caracterizado porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66 o una molécula biespecífica de conformidad con la reivindicación 67; e - instrucciones para el uso del kit.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ540555A (en) 2002-11-15 2008-04-30 Genmab As Antibody therapeutics for treatingand/or preventing diseases associated with cells expressing CD25, including autoimmune diseases, inflammatory and hyperproliferative skin disorders
AU2009324092A1 (en) * 2008-12-03 2011-06-23 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
CN103154035B (zh) 2010-05-27 2017-05-10 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
BR112012031727B1 (pt) * 2010-06-15 2022-03-29 Genmab A/S Conjugado de droga-anticorpo, composição farmacêutica, e, uso do conjugado de droga- anticorpo
TWI807362B (zh) * 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
US8722044B2 (en) * 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
AU2012245116A1 (en) * 2011-04-20 2013-11-07 Genmab A/S Bispecific antibodies against HER2 and CD3
CN103796678B (zh) * 2011-04-20 2018-02-27 健玛保 针对her2的双特异性抗体
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
US9555109B2 (en) * 2012-01-20 2017-01-31 University Of Cincinnati Method of inhibiting cell proliferation induced by alternatively spliced tissue factor by administering a monoclonal antibody
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP2869845B1 (en) 2012-07-06 2019-08-28 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CA2896955C (en) 2013-01-10 2023-10-31 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
CN106133521A (zh) * 2013-10-02 2016-11-16 苏瑞科技有限公司 用于治疗异质肿瘤的病患特异性的免疫疗法
JP6590803B2 (ja) 2013-11-21 2019-10-16 ゲンマブ エー／エス 抗体−薬物コンジュゲート凍結乾燥製剤
WO2016077720A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 Protein One, Llc Binding agents and uses thereof
JP6858128B2 (ja) 2015-02-18 2021-04-14 エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド 癌治療のための免疫療法とサイトカイン制御療法との組み合わせ
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
CN107708811B (zh) 2015-04-21 2021-04-30 恩立夫克治疗有限责任公司 治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途
CN106467574B (zh) * 2015-08-20 2019-09-20 复旦大学 靶向于组织因子的抗体、其制备方法和用途
PT3347054T (pt) 2015-09-11 2021-07-15 Genmab As Regimes de dosagem para conjugados fármaco-anticorpo anti-tf
US11730761B2 (en) 2016-02-18 2023-08-22 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
CN106938051B (zh) * 2016-08-22 2019-10-11 复旦大学 靶向于组织因子的抗体-药物偶联物
EP3502141A4 (en) * 2016-08-22 2020-04-08 Fudan University TISSUE FACTOR TARGET ANTIBODIES, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF
EP3534953A4 (en) * 2016-11-02 2020-10-07 Vanderbilt University ANTIBODIES AGAINST HUMAN ZIKA VIRUS AND THEIR USE PROCEDURES
TW201922796A (zh) * 2017-10-30 2019-06-16 國立研究開發法人國立癌症研究中心 可用於實體腫瘤治療之抗體及其抗體－藥物共軛物以及含其之抗癌劑
SG11202003713TA (en) * 2017-11-02 2020-05-28 Genmab As Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
EP4495597A2 (en) 2018-01-04 2025-01-22 Iconic Therapeutics LLC Anti-tissue factor antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods
TWI841554B (zh) * 2018-03-21 2024-05-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 以鉑為主之劑與抗組織因子抗體－藥物共軛物的組合治療癌症之方法
KR20210044183A (ko) 2018-05-07 2021-04-22 젠맵 에이/에스 항-pd-1 항체 및 항-조직 인자 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법
CA3096705A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Genmab A/S Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
EP3836950A4 (en) * 2018-08-16 2022-04-06 Genmab A/S ANTI-TISSUE FACTOR ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CANCER
TWI844571B (zh) * 2018-10-30 2024-06-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
CN109840471B (zh) * 2018-12-14 2023-04-14 天津大学 一种基于改进Unet网络模型的可行道路分割方法
CN113330112B (zh) * 2018-12-21 2024-09-24 得克萨斯大学体系董事会 磷酸化的dicer抗体及其使用方法
EP3917564A4 (en) 2019-02-01 2022-12-21 NovaRock Biotherapeutics, Ltd. ANTI-CLAUDINE 18 ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE
JP7297928B2 (ja) 2019-04-17 2023-06-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 二重特異性抗体
EP4055051A1 (en) 2019-11-07 2022-09-14 Genmab A/S Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
TW202131954A (zh) 2019-11-07 2021-09-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 利用鉑類劑與抗組織因子抗體－藥物共軛體之組合來治療癌症之方法
JP2023520930A (ja) 2020-04-10 2023-05-22 シージェン インコーポレイテッド 電荷多様性リンカー
JP2023533937A (ja) 2020-06-29 2023-08-07 ジェンマブ エー／エス 抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートおよびがん治療におけるその使用
AU2021304359A1 (en) * 2020-07-10 2023-03-02 Iconic Therapeutics Llc Inflammatory disease treatment using anti-tissue factor antibodies
US20220089736A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-24 Janssen Biotech, Inc. Immune targeting molecules and uses thereof
IL301254A (en) 2020-09-11 2023-05-01 Janssen Biotech Inc Methods and compositions for modulating beta chain mediated immunity
MX2023004941A (es) 2020-11-08 2023-07-12 Seagen Inc Conjugado de anticuerpo y fármaco para terapia de combinación con inhibidor de células inmunitarias.
WO2022198231A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds
EP4326333A1 (en) 2021-04-20 2024-02-28 Seagen Inc. Modulation of antibody-dependent cellular cytotoxicity
KR20240015670A (ko) 2021-05-28 2024-02-05 씨젠 인크. 안트라사이클린 항체 접합체
TW202342517A (zh) * 2022-01-12 2023-11-01 美商艾康尼醫療有限責任公司 使用抗組織因子抗體之炎性疾病治療
PE20242179A1 (es) 2022-03-17 2024-11-07 Seagen Inc Conjugados de camptotecina
TW202408583A (zh) 2022-05-06 2024-03-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗組織因子抗體－藥物共軛體以治療癌症之方法
WO2024129756A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Seagen Inc. Site-specific engineered cysteine antibody drug conjugates

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077A (en) 1849-01-30 Improved hinged claw-wrench
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5223427A (en) 1987-03-31 1993-06-29 The Scripps Research Institute Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain
US5437864A (en) 1987-03-31 1995-08-01 The Scripps Research Institute Method of inhibiting blood coagulation in extracorporeal circulation by inhibiting human tissue factor
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
WO1989012463A1 (en) 1988-06-21 1989-12-28 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ES2125854T3 (es) 1989-08-09 1999-03-16 Rhomed Inc Radiomarcado directo de anticuerpos y otras proteinas con tecnetio o renio.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
ATE156189T1 (de) 1989-12-22 1997-08-15 Applied Research Systems Modifikation der endogenen genexpression mit hilfe eines regulatorischen elements mittels homologe rekombination
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
JP3149960B2 (ja) 1991-01-24 2001-03-26 財団法人化学及血清療法研究所 ヒト組織因子を定量する方法
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993001227A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
JPH05244988A (ja) 1992-03-04 1993-09-24 Green Cross Corp:The 抗組織因子モノクローナル抗体、及びこれによる免疫抑制剤
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU5093593A (en) 1992-08-28 1994-03-29 Scripps Research Institute, The Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5879677A (en) 1992-12-09 1999-03-09 The Scripps Research Institute Method for inhibition of cerebral tissue factor mediated reperfusion damage
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
AU693436B2 (en) 1993-03-09 1998-07-02 Genzyme Corporation Isolation of components of interest from milk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5879687A (en) 1994-04-22 1999-03-09 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
NZ288883A (en) 1994-07-11 1998-12-23 Univ Texas Conjugates comprising coagulation factors
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5703057A (en) 1995-04-07 1997-12-30 Board Of Regents The University Of Texas System Expression library immunization
ATE266726T1 (de) 1995-06-07 2004-05-15 Ortho Pharma Corp CDR-TRANSPLANTIERTE ANTIKÖRPER GEGEN ßTISSUE FACTORß UND VERFAHREN ZUR DEREN VERWENDUNG
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
JPH09302000A (ja) 1996-05-16 1997-11-25 Chemo Sero Therapeut Res Inst 抗組織因子モノクローナル抗体及び当該モノクローナル抗体を用いた組織因子凝固活性の測定法
US6593291B1 (en) 1997-02-06 2003-07-15 Entremed, Inc. Compositions and methods of use of ligands that bind components of the blood coagulation/clotting pathway for the treatment of cancer and angiogenic-based disease
US20040229282A1 (en) 1997-03-10 2004-11-18 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US5986065A (en) 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US6719977B1 (en) 1998-02-12 2004-04-13 The General Hospital Corporation Methods to potentiate cancer therapies
EP1068296B1 (en) 1998-03-31 2011-08-10 Geron Corporation Compositions for eliciting an immune response to a telomerase antigen
JP3998419B2 (ja) * 1998-04-03 2007-10-24 中外製薬株式会社 ヒト組織因子（ｔｆ）に対するヒト型化抗体およびヒト型化抗体の作製方法
EP1108035B1 (en) 1998-09-04 2007-08-08 Sanofi Pasteur Limited Treatment of cervical cancer
US6387888B1 (en) 1998-09-30 2002-05-14 American Foundation For Biological Research, Inc. Immunotherapy of cancer through expression of truncated tumor or tumor-associated antigen
DE60013773T2 (de) 1999-02-03 2005-11-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Methoden zur Herstellung von therapeutischen Kalziumphosphat Partikeln
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
EP2829609A1 (en) 1999-08-24 2015-01-28 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human CTLA-4 antibodies and their uses
JP2001213804A (ja) 2000-01-31 2001-08-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd 抗組織因子抗体の複合体
AU2001250814B2 (en) 2000-03-16 2007-02-15 Genentech, Inc. Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency
US6713055B2 (en) 2000-11-27 2004-03-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
US20040180051A1 (en) 2001-03-26 2004-09-16 Koji Suzuki Blood rheology improving agents
US7247304B2 (en) 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
JP4359503B2 (ja) 2001-08-23 2009-11-04 ゲンマブ エー／エス インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
DE60232733D1 (de) 2001-08-30 2009-08-06 Sinai School Medicine Alternativ gesplicter zirkulierender gewebefaktor
US20050169927A1 (en) * 2001-10-02 2005-08-04 Novo Nordisk A/S Human tissue factor antibodies
PL368989A1 (en) * 2001-10-02 2005-04-04 Novo Nordisk A/S Human tissue factor antibodies
TWI338009B (en) 2001-10-29 2011-03-01 Genentech Inc Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
AU2002336920A1 (en) 2001-11-02 2003-05-12 Novo Nordisk Health Care Ag Use of tissue factor agonist or tissue factor antagonist for treatment of conditions related to apoptosis
NZ535199A (en) 2002-02-22 2006-03-31 Prophy Med Ab Use of an inhibitor or antagonist against tissue factor
US7250168B2 (en) 2002-05-01 2007-07-31 Bayer Schering Pharma Ag Tissue factor targeted thrombomodulin fusion proteins as anticoagulants
WO2004007557A2 (en) 2002-07-12 2004-01-22 Novo Nordisk A/S Tf antagonist
WO2004010957A2 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
AU2003277832A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-25 Novo Nordisk A/S Humanized tissue factor antibodies
AU2003275948A1 (en) 2002-11-06 2004-06-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist and protein c polypeptides
AU2003275947A1 (en) 2002-11-06 2004-06-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist and a blood glucose regulator
NZ540555A (en) 2002-11-15 2008-04-30 Genmab As Antibody therapeutics for treatingand/or preventing diseases associated with cells expressing CD25, including autoimmune diseases, inflammatory and hyperproliferative skin disorders
ATE527278T1 (de) 2002-12-16 2011-10-15 Genmab As Humane monoklonale antikörper gegen interleukin 8 (il-8)
EP1587549A2 (en) 2003-01-22 2005-10-26 Novo Nordisk A/S Radiolabelled tissue factor binding agent and the use thereof
US20060034846A1 (en) 2003-04-14 2006-02-16 Mirella Ezban Use of TF antagonists
US7425328B2 (en) 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
EP1629014A2 (en) 2003-05-30 2006-03-01 Genentech, Inc. Polypeptides that bind an anti-tissue factor antibody and uses thereof
BRPI0410875A (pt) 2003-05-30 2006-07-04 Centocor Inc método de inibição do crescimento de tumor com anticorpos de fator antitecido
US7605235B2 (en) * 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
WO2005004793A2 (en) 2003-06-19 2005-01-20 Tanox Inc. Compositions and methods for treating coagulation related disorders
WO2005025623A2 (en) 2003-07-28 2005-03-24 Emory University Ef-24-factor vii conjugates
CA2542372A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Centocor, Inc. Method of promoting graft survival with anti-tissue factor antibodies
AU2004316290C1 (en) 2003-11-06 2012-02-02 Seagen Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
CN1889979B (zh) 2003-12-10 2012-09-19 米德列斯公司 Ip-10抗体及其用途
JP2007523099A (ja) 2004-02-20 2007-08-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 組み合わせ療法
CA2580981C (en) 2004-09-22 2013-10-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Stabilized human igg4 antibodies
EP1676574A3 (en) 2004-12-30 2006-07-26 Johnson &amp; Johnson Vision Care, Inc. Methods for promoting survival of transplanted tissues and cells
CA2626100A1 (en) 2005-10-21 2007-08-30 Genentech, Inc. Treatment for antiphospholipid-syndrome-related pregnancy complications
AU2006311661B2 (en) 2005-11-07 2011-05-26 The Scripps Research Institute Compositions and methods for controlling tissue factor signaling specificity
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2008030260A2 (en) 2005-12-22 2008-03-13 Genentech, Inc. Treatment of variola viral infections using a tissue factor inhibitor
US20080311034A1 (en) 2007-04-30 2008-12-18 Anderson Glenn M Anti-Tissue Factor Antibodies and Compositions with Enhanced Effector Function
UA109633C2 (uk) * 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
BR112012031727B1 (pt) 2010-06-15 2022-03-29 Genmab A/S Conjugado de droga-anticorpo, composição farmacêutica, e, uso do conjugado de droga- anticorpo

Also Published As

Publication number Publication date
CN106632678B (zh) 2022-05-31
NZ786274A (en) 2023-09-29
US20190169311A1 (en) 2019-06-06
PT2376537T (pt) 2016-12-26
JP7069095B2 (ja) 2022-05-17
EA201100923A1 (ru) 2011-12-30
JP2016138089A (ja) 2016-08-04
CN119331096A (zh) 2025-01-21
US20110300156A1 (en) 2011-12-08
IL212856A0 (en) 2011-07-31
WO2010066803A2 (en) 2010-06-17
BRPI0922350A2 (pt) 2016-01-12
IL212856A (en) 2016-09-29
CA2746101C (en) 2018-10-30
KR20170056025A (ko) 2017-05-22
EP3159358B1 (en) 2023-10-11
BRPI0922350B1 (pt) 2021-01-12
SG10201500140VA (en) 2015-03-30
MX338754B (es) 2016-04-29
EP2376537B1 (en) 2016-09-28
JP2020022461A (ja) 2020-02-13
CN106632678A (zh) 2017-05-10
US20180044431A1 (en) 2018-02-15
ES2604635T3 (es) 2017-03-08
US9150658B2 (en) 2015-10-06
US20160053020A1 (en) 2016-02-25
JP2022078018A (ja) 2022-05-24
WO2010066803A3 (en) 2010-08-19
CA2746101A1 (en) 2010-06-17
ZA201103723B (en) 2012-09-26
US20210171657A1 (en) 2021-06-10
KR101736447B1 (ko) 2017-05-16
AU2009324412A1 (en) 2011-06-30
KR20110104944A (ko) 2011-09-23
US20230416403A1 (en) 2023-12-28
CN102317319A (zh) 2012-01-11
KR101998492B1 (ko) 2019-07-09
SI2376537T1 (sl) 2017-02-28
JP6592491B2 (ja) 2019-10-16
JP2024001285A (ja) 2024-01-09
EP3159358A1 (en) 2017-04-26
CN102317319B (zh) 2016-06-29
US9714297B2 (en) 2017-07-25
JP6236056B2 (ja) 2017-11-22
EP2376537A2 (en) 2011-10-19
UA109633C2 (uk) 2015-09-25
JP5860285B2 (ja) 2016-02-16
JP2018038418A (ja) 2018-03-15
CA3017575A1 (en) 2010-06-17
JP2012511314A (ja) 2012-05-24
AU2009324412B2 (en) 2016-04-21
DK2376537T3 (en) 2017-01-23
BRPI0922350B8 (pt) 2021-05-25
EP4279140A2 (en) 2023-11-22
EP4279140A3 (en) 2024-01-31
PL2376537T3 (pl) 2017-06-30
MX355181B (es) 2018-04-09

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US20230416403A1 (en) Human antibodies against tissue factor and methods of use thereof
US9492565B2 (en) Human antibody drug conjugates against tissue factor
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