JP2001213804A - 抗組織因子抗体の複合体 - Google Patents
抗組織因子抗体の複合体Info
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- JP2001213804A JP2001213804A JP2000022898A JP2000022898A JP2001213804A JP 2001213804 A JP2001213804 A JP 2001213804A JP 2000022898 A JP2000022898 A JP 2000022898A JP 2000022898 A JP2000022898 A JP 2000022898A JP 2001213804 A JP2001213804 A JP 2001213804A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な抗ヒト組織因子抗体複合体の提供。
【解決手段】 抗ヒト組織因子抗体と、化学療法剤、ト
キシン又は血管新生阻害剤との複合体であり、抗腫瘍医
薬組成物の活性成分として有用である。
キシン又は血管新生阻害剤との複合体であり、抗腫瘍医
薬組成物の活性成分として有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は医薬の分野に属し、
抗組織因子抗体を含んで成る複合体に関する。
抗組織因子抗体を含んで成る複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在まで、血管内皮細胞を広く認識する
マーカーとしてはCD31，CD36，Ulex europaeus-Iagglut
inin (UEA-1)、また一般に活性化され大型化した血管内
皮細胞に発現されるマーカーとしてはvon Willebrand f
actor (vWF), ICAM-1 (CD54)，E-selectinが知られてい
る。
マーカーとしてはCD31，CD36，Ulex europaeus-Iagglut
inin (UEA-1)、また一般に活性化され大型化した血管内
皮細胞に発現されるマーカーとしてはvon Willebrand f
actor (vWF), ICAM-1 (CD54)，E-selectinが知られてい
る。
【０００３】一方、腫瘍組織内に存在する血管内皮細胞
（腫瘍血管内皮細胞）には正常組織では発現していない
特異的な抗原を発現していることが推察されており、現
在まで様々な腫瘍血管内皮細胞を認識するＥ−９抗体
（Wang, J.M. et al., Int. J.Cancer (1993) 54, 3
6)、抗FB５（endosialin) 抗体（Rettig, W.J. Pro. Na
tl. Sci. USA (1992) 89, 10832)、Ｈ４／18抗体（Cotr
an, R.S. et al., J. Exp.Med. (1986) 164, 661)、Q B
END／10抗体（Ramani, P. et al., Histopathology (19
90) 17, 237) 、EN４／EN３抗体（Schlingemann, R.O.
et al., Amer. J.Pathol. (1991) 138, 1335) 、BMA120
抗体（Schlingemann, R.O. et al., Amer.J. Pathol.
(1991) 138, 1335) 、EN７／44抗体（Hagemeier, H.H.
et al., Int. J. Cancer (1986) 38, 481), PAL−Ｅ抗
体（Schlingemann, R.O. et al., Amer. J. Pathol. (1
991) 138, 1335) 、 HEC−１抗体（Gougos, A. et al.,
J.Immunol. (1988) 141, 1934)、TEC4, TEC11 抗体（T
horpe, P.E. et al., Am. Assoc. Cancer Res. (abstra
ct) (1994) 35, 379)等のモノクローナル抗体が報告さ
れてきた。しかしながら、腫瘍血管内皮細胞を標的とす
る薬物のキャリアーとして上市されたモノクローナル抗
体は未だ存在しない。
（腫瘍血管内皮細胞）には正常組織では発現していない
特異的な抗原を発現していることが推察されており、現
在まで様々な腫瘍血管内皮細胞を認識するＥ−９抗体
（Wang, J.M. et al., Int. J.Cancer (1993) 54, 3
6)、抗FB５（endosialin) 抗体（Rettig, W.J. Pro. Na
tl. Sci. USA (1992) 89, 10832)、Ｈ４／18抗体（Cotr
an, R.S. et al., J. Exp.Med. (1986) 164, 661)、Q B
END／10抗体（Ramani, P. et al., Histopathology (19
90) 17, 237) 、EN４／EN３抗体（Schlingemann, R.O.
et al., Amer. J.Pathol. (1991) 138, 1335) 、BMA120
抗体（Schlingemann, R.O. et al., Amer.J. Pathol.
(1991) 138, 1335) 、EN７／44抗体（Hagemeier, H.H.
et al., Int. J. Cancer (1986) 38, 481), PAL−Ｅ抗
体（Schlingemann, R.O. et al., Amer. J. Pathol. (1
991) 138, 1335) 、 HEC−１抗体（Gougos, A. et al.,
J.Immunol. (1988) 141, 1934)、TEC4, TEC11 抗体（T
horpe, P.E. et al., Am. Assoc. Cancer Res. (abstra
ct) (1994) 35, 379)等のモノクローナル抗体が報告さ
れてきた。しかしながら、腫瘍血管内皮細胞を標的とす
る薬物のキャリアーとして上市されたモノクローナル抗
体は未だ存在しない。
【０００４】組織因子は血液凝固の開始に重要な役割を
果たしていることで知られており、播種性血管内凝固症
候群(DIC) にかかわる重要な因子の一つと考えられてい
る。一方、血管新生因子であるVEGF（Zucher, S., et a
l., Int. J. Cancer, 75, 780-786, 1998)や TGF−β
（Vrana., J. A., et al., Cancer Res., 56, 5063-507
0, 1996)、 TNF−α（Zhang, Y, et al., J. Clin. Inv
est., 97, 2213-2224, 1996)、IL−１等のサイトカイン
によって血管内皮細胞に組織因子が誘導されることが報
告され、近年、組織因子は血管新生に関わる因子の一つ
と考えられるようになってきている（Koomagi, R, Vol
m, M., Int. J. Cancer, 79, 19-2, 1998)。
果たしていることで知られており、播種性血管内凝固症
候群(DIC) にかかわる重要な因子の一つと考えられてい
る。一方、血管新生因子であるVEGF（Zucher, S., et a
l., Int. J. Cancer, 75, 780-786, 1998)や TGF−β
（Vrana., J. A., et al., Cancer Res., 56, 5063-507
0, 1996)、 TNF−α（Zhang, Y, et al., J. Clin. Inv
est., 97, 2213-2224, 1996)、IL−１等のサイトカイン
によって血管内皮細胞に組織因子が誘導されることが報
告され、近年、組織因子は血管新生に関わる因子の一つ
と考えられるようになってきている（Koomagi, R, Vol
m, M., Int. J. Cancer, 79, 19-2, 1998)。
【０００５】さらに、免疫組織染色にて良性乳腺腫瘍患
者の腫瘍組織管腔形成血管内皮では組織因子発現が陰性
であったのに対して、乳癌患者の癌組織の腫瘍血管内皮
の組織因子発現が確認（Contrino, J., et al., Nature
Medicine, 2, 209-215, 1996)されている。また、多く
のヒト腫瘍細胞株および腫瘍より凝固能（procoagulant
assy, PCA) を指標にして組織因子活性が報告（Edward
s, R. L., et al., Thrombosis and Haematosis, 69, 2
05-213, 1993) されており、組織因子を癌抗原としても
利用可能であると考えられる。
者の腫瘍組織管腔形成血管内皮では組織因子発現が陰性
であったのに対して、乳癌患者の癌組織の腫瘍血管内皮
の組織因子発現が確認（Contrino, J., et al., Nature
Medicine, 2, 209-215, 1996)されている。また、多く
のヒト腫瘍細胞株および腫瘍より凝固能（procoagulant
assy, PCA) を指標にして組織因子活性が報告（Edward
s, R. L., et al., Thrombosis and Haematosis, 69, 2
05-213, 1993) されており、組織因子を癌抗原としても
利用可能であると考えられる。
【０００６】従って、抗組織因子抗体は腫瘍血管内皮あ
るいは組織因子を発現している腫瘍に対して特異的な薬
物キャリヤーとなる可能性があると考えられる(WO94/05
328)。しかしながら、抗組織因子抗体がインターナライ
ズして薬物キャリヤーとして、薬物を腫瘍血管内皮細胞
内に送達させ、抗腫瘍効果を発現させることが可能か否
かは知られていない。
るいは組織因子を発現している腫瘍に対して特異的な薬
物キャリヤーとなる可能性があると考えられる(WO94/05
328)。しかしながら、抗組織因子抗体がインターナライ
ズして薬物キャリヤーとして、薬物を腫瘍血管内皮細胞
内に送達させ、抗腫瘍効果を発現させることが可能か否
かは知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗組織因子
抗体のインターナリゼーションを利用して抗腫瘍剤等を
腫瘍細胞または腫瘍血管内皮細胞に導入し、腫瘍細胞の
増殖を阻害するための新規な手段を提供しようとするも
のである。
抗体のインターナリゼーションを利用して抗腫瘍剤等を
腫瘍細胞または腫瘍血管内皮細胞に導入し、腫瘍細胞の
増殖を阻害するための新規な手段を提供しようとするも
のである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、種々研究した結果、抗ヒト組織因子
抗体とトキシン複合体が、組織因子を細胞表面に発現し
ているヒト癌細胞に対して極めて低濃度で蛋白質合成阻
害効果を示すこと、さらに、抗組織因子抗体は組織因子
の凝固能に関する中和活性の有無にかかわらず、そのト
キシン複合体が、組織因子を細胞表面に発現しているヒ
ト癌細胞に対して殺細胞効果を示すことを確認すること
に成功し、その結果、抗組織因子抗体が組織因子を発現
する細胞にインターナライズ（Internalize)し、その際
に該抗体に連結した他の物質を該物質に導入することが
できること、および抗組織因子抗体は組織因子の中和活
性によらず目的を達成できることを発見し、本発明を完
成した。
題を解決するため、種々研究した結果、抗ヒト組織因子
抗体とトキシン複合体が、組織因子を細胞表面に発現し
ているヒト癌細胞に対して極めて低濃度で蛋白質合成阻
害効果を示すこと、さらに、抗組織因子抗体は組織因子
の凝固能に関する中和活性の有無にかかわらず、そのト
キシン複合体が、組織因子を細胞表面に発現しているヒ
ト癌細胞に対して殺細胞効果を示すことを確認すること
に成功し、その結果、抗組織因子抗体が組織因子を発現
する細胞にインターナライズ（Internalize)し、その際
に該抗体に連結した他の物質を該物質に導入することが
できること、および抗組織因子抗体は組織因子の中和活
性によらず目的を達成できることを発見し、本発明を完
成した。
【０００９】従って、本発明は、組織因子に対する抗体
（抗組織因子抗体）又は抗原結合能を有するその断片と
化学療法剤とを連結して成る複合体を提供する。本発明
はまた、抗組織因子抗体又は抗原結合能を有するその断
片とトキシンとを連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒ
ト組織因子に結合する抗組織因子抗体又は抗原結合能を
有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを連結し
て成る複合体を提供する。
（抗組織因子抗体）又は抗原結合能を有するその断片と
化学療法剤とを連結して成る複合体を提供する。本発明
はまた、抗組織因子抗体又は抗原結合能を有するその断
片とトキシンとを連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒ
ト組織因子に結合する抗組織因子抗体又は抗原結合能を
有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを連結し
て成る複合体を提供する。
【００１０】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシ
ンとを連結して成る複合体を提供する。本発明はまた、
抗組織因子モノクローナル抗体又は抗原結合能を有する
その断片と化学療法剤またはトキシンとを連結して成る
複合体を提供する。本発明はまた、抗原結合能を有する
その断片と化学療法剤またはトキシンとを連結して成る
複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシ
ンとを連結して成る複合体を提供する。本発明はまた、
抗組織因子モノクローナル抗体又は抗原結合能を有する
その断片と化学療法剤またはトキシンとを連結して成る
複合体を提供する。本発明はまた、抗原結合能を有する
その断片と化学療法剤またはトキシンとを連結して成る
複合体を提供する。
【００１１】本発明はまた、再構成ヒト抗組織因子抗体
又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはト
キシンとを連結して成る複合体を提供する。本発明はま
た、再構成ヒト抗体又は抗原結合能を有するその断片と
化学療法剤またはトキシンとを連結して成る複合体を提
供する。本発明はまた、抗組織因子抗体又はその抗原結
合活性を有するFab, F(ab ′)2, scFv, (scFv)2 と化学
療法剤またはトキシンとを連結して成る複合体を提供す
る。本発明はまた、組織因子に対する抗体又は抗原結合
能を有するその断片と抗腫瘍剤とを連結して成る複合体
を提供する。
又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはト
キシンとを連結して成る複合体を提供する。本発明はま
た、再構成ヒト抗体又は抗原結合能を有するその断片と
化学療法剤またはトキシンとを連結して成る複合体を提
供する。本発明はまた、抗組織因子抗体又はその抗原結
合活性を有するFab, F(ab ′)2, scFv, (scFv)2 と化学
療法剤またはトキシンとを連結して成る複合体を提供す
る。本発明はまた、組織因子に対する抗体又は抗原結合
能を有するその断片と抗腫瘍剤とを連結して成る複合体
を提供する。
【００１２】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片と、メルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
（Carpoplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキセート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、又はビン
デシン(Vindesine) とを連結してなる複合体を提供す
る。
抗原結合能を有するその断片と、メルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
（Carpoplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキセート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、又はビン
デシン(Vindesine) とを連結してなる複合体を提供す
る。
【００１３】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片とサイトカインとを連結し
て成る複合体を提供する。本発明はまた、組織因子に対
する抗体又は抗原結合能を有するその断片とインターロ
イキン−２(IL-2)、腫瘍壊死因子α(TNF- α) 、インタ
ーフェロン(IFN)とを連結して成る複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片とサイトカインとを連結し
て成る複合体を提供する。本発明はまた、組織因子に対
する抗体又は抗原結合能を有するその断片とインターロ
イキン−２(IL-2)、腫瘍壊死因子α(TNF- α) 、インタ
ーフェロン(IFN)とを連結して成る複合体を提供する。
【００１４】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片とジフテリアトキシンＡ鎖
（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエンド
トキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖（Rici
n A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated ricin
A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Gelonin)、ポ
ークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed anti-
viral protein from seeds) 、ブリオジン（Briodin)、
サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin)、モモル
コキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianthin 3
2)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン（Mode
ccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン（Volkes
in) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチン（Trit
in）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン（Trichoki
rin)とを連結して成る複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片とジフテリアトキシンＡ鎖
（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエンド
トキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖（Rici
n A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated ricin
A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Gelonin)、ポ
ークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed anti-
viral protein from seeds) 、ブリオジン（Briodin)、
サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin)、モモル
コキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianthin 3
2)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン（Mode
ccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン（Volkes
in) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチン（Trit
in）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン（Trichoki
rin)とを連結して成る複合体を提供する。
【００１５】本発明はまた、抗組織因子抗体又は抗原結
合能を有するその断片と化学療法剤とをリンカーにより
連結して成る複合体を提供する。本発明はまた、抗組織
因子抗体又は抗原結合能を有するその断片とトキシンと
をリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、ヒト組織因子に結合する抗組織因子抗体又は
抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシ
ンとをリンカーにより連結して成る複合体を提供する。
合能を有するその断片と化学療法剤とをリンカーにより
連結して成る複合体を提供する。本発明はまた、抗組織
因子抗体又は抗原結合能を有するその断片とトキシンと
をリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、ヒト組織因子に結合する抗組織因子抗体又は
抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシ
ンとをリンカーにより連結して成る複合体を提供する。
【００１６】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシ
ンとをリンカーにより連結して成る複合体を提供する。
本発明はまた、抗組織因子モノクローナル抗体又は抗原
結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンと
をリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、抗組織因子抗体（IFO No. 50382)又は抗原結
合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを
リンカーにより連結して成る複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシ
ンとをリンカーにより連結して成る複合体を提供する。
本発明はまた、抗組織因子モノクローナル抗体又は抗原
結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンと
をリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、抗組織因子抗体（IFO No. 50382)又は抗原結
合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを
リンカーにより連結して成る複合体を提供する。
【００１７】本発明はまた、再構成ヒト抗組織因子抗体
又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはト
キシンとをリンカーにより連結して成る複合体を提供す
る。本発明はまた、再構成ヒト抗組織因子抗体又は抗原
結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンと
をリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、抗組織因子抗体又はその抗原結合活性を有す
るFab, F(ab ′)2又はscFvと化学療法剤またはトキシン
とをリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本
発明はまた、組織因子に対する抗体又は抗原結合能を有
するその断片と抗腫瘍剤とをリンカーにより連結して成
る複合体を提供する。
又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはト
キシンとをリンカーにより連結して成る複合体を提供す
る。本発明はまた、再構成ヒト抗組織因子抗体又は抗原
結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンと
をリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本発
明はまた、抗組織因子抗体又はその抗原結合活性を有す
るFab, F(ab ′)2又はscFvと化学療法剤またはトキシン
とをリンカーにより連結して成る複合体を提供する。本
発明はまた、組織因子に対する抗体又は抗原結合能を有
するその断片と抗腫瘍剤とをリンカーにより連結して成
る複合体を提供する。
【００１８】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片と、メルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
（Carboplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキサート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、又はビン
デシン(Vindesine) とをリンカーにより連結してなる複
合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片と、メルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
（Carboplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキサート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、又はビン
デシン(Vindesine) とをリンカーにより連結してなる複
合体を提供する。
【００１９】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片とサイトカインとをリンカ
ーにより連結して成る複合体を提供する。本発明はま
た、組織因子に対する抗体又は抗原結合能を有するその
断片とインターロイキン−２(IL-2)、腫瘍壊死因子α(T
NF- α) 、インターフェロン（ＩＦＮ）とをリンカーに
より連結して成る複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片とサイトカインとをリンカ
ーにより連結して成る複合体を提供する。本発明はま
た、組織因子に対する抗体又は抗原結合能を有するその
断片とインターロイキン−２(IL-2)、腫瘍壊死因子α(T
NF- α) 、インターフェロン（ＩＦＮ）とをリンカーに
より連結して成る複合体を提供する。
【００２０】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片とジフテリアトキシンＡ鎖
（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエンド
トキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖（Rici
n A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated ricin
A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Gelonin)、ポ
ークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed anti-
viral protein from seeds) 、ブリオジン（Briodin)、
サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin)、モモル
コキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianthin 3
2)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン（Mode
ccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン（Volkes
in) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチン（Trit
in）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン（Trichoki
rin)とをリンカーにより連結して成る複合体を提供す
る。
抗原結合能を有するその断片とジフテリアトキシンＡ鎖
（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエンド
トキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖（Rici
n A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated ricin
A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Gelonin)、ポ
ークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed anti-
viral protein from seeds) 、ブリオジン（Briodin)、
サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin)、モモル
コキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianthin 3
2)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン（Mode
ccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン（Volkes
in) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチン（Trit
in）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン（Trichoki
rin)とをリンカーにより連結して成る複合体を提供す
る。
【００２１】本発明はまた、抗組織因子抗体又は抗原結
合能を有するその断片と化学療法剤とを中間支持体によ
り連結して成る複合体を提供する。本発明はまた、抗組
織因子抗体又は抗原結合能を有するその断片とトキシン
とを中間支持体により連結して成る複合体を提供する。
本発明はまた、配列番号７に記載のアミノ酸配列からな
るヒト組織因子に結合する抗組織因子抗体又は抗原結合
能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを中
間支持体により連結して成る複合体を提供する。
合能を有するその断片と化学療法剤とを中間支持体によ
り連結して成る複合体を提供する。本発明はまた、抗組
織因子抗体又は抗原結合能を有するその断片とトキシン
とを中間支持体により連結して成る複合体を提供する。
本発明はまた、配列番号７に記載のアミノ酸配列からな
るヒト組織因子に結合する抗組織因子抗体又は抗原結合
能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを中
間支持体により連結して成る複合体を提供する。
【００２２】本発明はまた、抗組織因子モノクローナル
抗体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤また
はトキシンとを中間支持体により連結して成る複合体を
提供する。本発明はまた、組織因子抗体又は抗原結合能
を有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを中間
支持体により連結して成る複合体を提供する。本発明は
また、再構成ヒト抗組織因子抗体又は抗原結合能を有す
るその断片と化学療法剤またはトキシンとを中間支持体
により連結して成る複合体を提供する。
抗体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤また
はトキシンとを中間支持体により連結して成る複合体を
提供する。本発明はまた、組織因子抗体又は抗原結合能
を有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを中間
支持体により連結して成る複合体を提供する。本発明は
また、再構成ヒト抗組織因子抗体又は抗原結合能を有す
るその断片と化学療法剤またはトキシンとを中間支持体
により連結して成る複合体を提供する。
【００２３】本発明はまた、再構成ヒト抗組織因子抗体
又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはト
キシンとを中間支持体により連結して成る複合体を提供
する。本発明はまた、抗組織因子抗体又はその抗原結合
活性を有するFab, F(ab ′)2, scFv又はsc(Fv)2 と化学
療法剤またはトキシンとを中間支持体により連結して成
る複合体を提供する。本発明はまた、組織因子に対する
抗体又は抗原結合能を有するその断片と抗腫瘍剤とを中
間支持体により連結して成る複合体を提供する。
又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤またはト
キシンとを中間支持体により連結して成る複合体を提供
する。本発明はまた、抗組織因子抗体又はその抗原結合
活性を有するFab, F(ab ′)2, scFv又はsc(Fv)2 と化学
療法剤またはトキシンとを中間支持体により連結して成
る複合体を提供する。本発明はまた、組織因子に対する
抗体又は抗原結合能を有するその断片と抗腫瘍剤とを中
間支持体により連結して成る複合体を提供する。
【００２４】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片と、メルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
（Carboplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキサート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、又はビン
デシン(Vindesine) とを中間支持体により連結してなる
複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片と、メルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
（Carboplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキサート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、又はビン
デシン(Vindesine) とを中間支持体により連結してなる
複合体を提供する。
【００２５】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片とサイトカインとを中間支
持体により連結して成る複合体を提供する。本発明はま
た、組織因子に対する抗体又は抗原結合能を有するその
断片とインターロイキン−２(IL-2)、腫瘍壊死因子α(T
NF- α) 、インターフェロン(IFN)とを中間支持体によ
り連結して成る複合体を提供する。
抗原結合能を有するその断片とサイトカインとを中間支
持体により連結して成る複合体を提供する。本発明はま
た、組織因子に対する抗体又は抗原結合能を有するその
断片とインターロイキン−２(IL-2)、腫瘍壊死因子α(T
NF- α) 、インターフェロン(IFN)とを中間支持体によ
り連結して成る複合体を提供する。
【００２６】本発明はまた、組織因子に対する抗体又は
抗原結合能を有するその断片とジフテリアトキシンＡ鎖
（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエンド
トキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖（Rici
n A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated ricin
A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Gelonin)、ポ
ークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed anti-
viral protein from seeds) 、ブリオジン（Briodin)、
サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin)、モモル
コキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianthin 3
2)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン（Mode
ccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン（Volkes
in) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチン（Trit
in）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン（Trichoki
rin)とを中間支持体により連結して成る複合体を提供す
る。
抗原結合能を有するその断片とジフテリアトキシンＡ鎖
（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエンド
トキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖（Rici
n A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated ricin
A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Gelonin)、ポ
ークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed anti-
viral protein from seeds) 、ブリオジン（Briodin)、
サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin)、モモル
コキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianthin 3
2)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン（Mode
ccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン（Volkes
in) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチン（Trit
in）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン（Trichoki
rin)とを中間支持体により連結して成る複合体を提供す
る。
【００２７】本発明はまた、上記に記載した複合体を含
んで成る医薬組成物を提供する。本発明はまた、上記に
記載した複合体を含んで成る抗腫瘍作用を有する医薬組
成物を提供する。
んで成る医薬組成物を提供する。本発明はまた、上記に
記載した複合体を含んで成る抗腫瘍作用を有する医薬組
成物を提供する。
【００２８】
【発明の実施の形態】本発明において使用される抗組織
因子抗体に対する抗原は、すでに知られている。本発明
に使用される抗組織因子抗体を得るための抗原として
は、組織因子を発現している細胞または、遺伝子組換え
によって組織因子を発現させた細胞（大腸菌等）でもよ
く、また、そのような細胞から精製又は半精製組織因子
蛋白質でもよい。この様な細胞としては、例えば従来技
術の項に前記した種々の細胞株を使用することができ
る。
因子抗体に対する抗原は、すでに知られている。本発明
に使用される抗組織因子抗体を得るための抗原として
は、組織因子を発現している細胞または、遺伝子組換え
によって組織因子を発現させた細胞（大腸菌等）でもよ
く、また、そのような細胞から精製又は半精製組織因子
蛋白質でもよい。この様な細胞としては、例えば従来技
術の項に前記した種々の細胞株を使用することができ
る。
【００２９】本発明に使用される抗体は、ポリクローナ
ル抗体でも、モノクローナル抗体でもよいが、特にモノ
クローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、基
本的に公知技術を使用し、以下のようにして作成でき
る。すなわち組織因子もしくは組織因子発現細胞、例え
ばヒト膀胱癌由来細胞Ｊ82株を感作抗原として使用し
て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られ
る免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と
融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクロー
ナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって
作成できる。
ル抗体でも、モノクローナル抗体でもよいが、特にモノ
クローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、基
本的に公知技術を使用し、以下のようにして作成でき
る。すなわち組織因子もしくは組織因子発現細胞、例え
ばヒト膀胱癌由来細胞Ｊ82株を感作抗原として使用し
て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られ
る免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と
融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクロー
ナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって
作成できる。
【００３０】感作抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定されるものではないが、細胞融合に作用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用さ
れる。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にし
たがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗
原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することによ
り行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphat
e-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸
濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、
フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺
乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。ま
た、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができ
る。
特に限定されるものではないが、細胞融合に作用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用さ
れる。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にし
たがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗
原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することによ
り行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphat
e-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸
濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、
フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺
乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。ま
た、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができ
る。
【００３１】このように免疫し、血清中に所望の抗体レ
ベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細
胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫
細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞
と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエロー
マ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３
（P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123 : 1548, 1978), p3
-U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunolog
y81 : 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6 : 511-5
19, 1976)，NPC-11（Cell, 8 : 405-415, 1976), SP2/0
(Nature, 276 : 269-270, 1978),ＦＯ（J. Immunol. M
eth. 35 : 1-21, 1980), S194（J. Exp. Med. 148 : 31
3-323, 1978), R210 (Nature, 277 : 131-133, 1979)
等が好適に使用される。
ベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細
胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫
細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞
と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエロー
マ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３
（P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123 : 1548, 1978), p3
-U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunolog
y81 : 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6 : 511-5
19, 1976)，NPC-11（Cell, 8 : 405-415, 1976), SP2/0
(Nature, 276 : 269-270, 1978),ＦＯ（J. Immunol. M
eth. 35 : 1-21, 1980), S194（J. Exp. Med. 148 : 31
3-323, 1978), R210 (Nature, 277 : 131-133, 1979)
等が好適に使用される。
【００３２】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインら
の方法（Milsteinら、Methods Enzymol. 73 : 3-46, 19
81)等に準じて行うことができる。より具体的には、前
記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の
栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例え
ば、ポリエチレングリコール(PEG) 、センダイウィルス
(HVJ) 等が使用され、更に所望により融合効率を高める
ためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用する
こともできる。
合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインら
の方法（Milsteinら、Methods Enzymol. 73 : 3-46, 19
81)等に準じて行うことができる。より具体的には、前
記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の
栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例え
ば、ポリエチレングリコール(PEG) 、センダイウィルス
(HVJ) 等が使用され、更に所望により融合効率を高める
ためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用する
こともできる。
【００３３】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１
０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液
としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適
なRPMI1640培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細
胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さ
らに、牛胎児血清(FCS) 等の血清補液を併用することも
できる。
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１
０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液
としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適
なRPMI1640培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細
胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さ
らに、牛胎児血清(FCS) 等の血清補液を併用することも
できる。
【００３４】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％
（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的
とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続い
て、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去す
る操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好
ましくない細胞融合等を除去できる。
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％
（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的
とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続い
て、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去す
る操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好
ましくない細胞融合等を除去できる。
【００３５】当該ハイブリドーマは、通常の選択培養
液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することに
より選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅す
るのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。つい
で、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生
するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニン
グが行われる。
液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することに
より選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅す
るのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。つい
で、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生
するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニン
グが行われる。
【００３６】また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitro
で所望の抗原蛋白質または抗原発現細胞で感作し、感作
Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合さ
せ、特定の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有す
る所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878
参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有す
るトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を
投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得しても
よい（国際特許出願公開番号WO93-12227, WO92-03918,
WO94-02602, WO94-25585, WO96-34096, WO96-33735、米
国特許番号US5545806 参照）。
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitro
で所望の抗原蛋白質または抗原発現細胞で感作し、感作
Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合さ
せ、特定の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有す
る所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878
参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有す
るトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を
投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得しても
よい（国際特許出願公開番号WO93-12227, WO92-03918,
WO94-02602, WO94-25585, WO96-34096, WO96-33735、米
国特許番号US5545806 参照）。
【００３７】このようにして作製されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。
【００３８】本発明には、モノクローナル抗体として、
抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマから
クローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを
宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組
換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A.K.
Borrebaeck, Janes, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCL
ONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom b
y MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマから
クローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを
宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組
換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A.K.
Borrebaeck, Janes, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCL
ONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom b
y MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
【００３９】具体的には、目的とする抗体を産生するハ
イブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リ
ンパ球等を癌遺伝子（oncogene) 等により不死化させた
細胞から、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｍＲ
ＮＡを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えばグ
アニジン超遠心法（Chirgwin, J.M.ら、Biochemistry(1
979) 18, 5294-5299)，AGPC法（Chmczynski, P.ら、(19
87) 162, 156-159)等により全ＲＮＡを調製し、mRNA Pu
rification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調
製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pha
rmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製すること
ができる。
イブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リ
ンパ球等を癌遺伝子（oncogene) 等により不死化させた
細胞から、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｍＲ
ＮＡを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えばグ
アニジン超遠心法（Chirgwin, J.M.ら、Biochemistry(1
979) 18, 5294-5299)，AGPC法（Chmczynski, P.ら、(19
87) 162, 156-159)等により全ＲＮＡを調製し、mRNA Pu
rification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調
製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pha
rmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製すること
ができる。
【００４０】得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて
抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、
AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthe
sisKit 等を用いて行うことができる。また、cDNAの合
成および増幅を行うには５′−Ampli FINDER RACE Kit
(Clontech 製）およびＰＣＲを用いた 5′-RACE 法（Fr
ohman, M.A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)
85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. ら、Nucleic Acids Re
s. (1989) 17, 2919-2932)を使用することができる。得
られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、
ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベ
クターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択し
て所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡ
の塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確
認する。
抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、
AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthe
sisKit 等を用いて行うことができる。また、cDNAの合
成および増幅を行うには５′−Ampli FINDER RACE Kit
(Clontech 製）およびＰＣＲを用いた 5′-RACE 法（Fr
ohman, M.A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)
85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. ら、Nucleic Acids Re
s. (1989) 17, 2919-2932)を使用することができる。得
られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、
ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベ
クターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択し
て所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡ
の塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確
認する。
【００４１】目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮ
Ａが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）
をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組
み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、
抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでも
よい。本発明で使用される抗体を製造するには、後述の
ように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサ
ー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベク
ターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細
胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
Ａが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）
をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組
み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、
抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでも
よい。本発明で使用される抗体を製造するには、後述の
ように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサ
ー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベク
ターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細
胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００４２】抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）
または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで
宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およ
びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み
込んで宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開
番号WO94/11523参照）。本発明では、ヒトに対する異種
抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変し
た遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric) 抗
体、ヒト型化（Humanized)抗体又はヒト化抗体を使用で
きる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造す
ることができる。
または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで
宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およ
びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み
込んで宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開
番号WO94/11523参照）。本発明では、ヒトに対する異種
抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変し
た遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric) 抗
体、ヒト型化（Humanized)抗体又はヒト化抗体を使用で
きる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造す
ることができる。
【００４３】キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体
Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードす
るＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿
主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出
願公開番号EP125023、国際特許出願公開番号WO95/14041
参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメ
ラ抗体を得ることができる。
Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードす
るＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿
主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出
願公開番号EP125023、国際特許出願公開番号WO95/14041
参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメ
ラ抗体を得ることができる。
【００４４】ヒト型化抗体は、再構成（reshaped) ヒト
抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗
体の相補性決定領域（CDR ; complementarity determin
ingregion) をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであ
り、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧
州特許出願公開番号EP125023、国際特許出願公開番号WO
95/14041参照）。
抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗
体の相補性決定領域（CDR ; complementarity determin
ingregion) をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであ
り、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧
州特許出願公開番号EP125023、国際特許出願公開番号WO
95/14041参照）。
【００４５】具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗
体のフレームワーク領域（FR ; framework region)を連
結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバー
ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌ
クレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮ
Ａをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次い
で発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生
させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP23
9400、国際特許出願公開番号WO95/14041参照）。
体のフレームワーク領域（FR ; framework region)を連
結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバー
ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌ
クレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮ
Ａをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次い
で発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生
させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP23
9400、国際特許出願公開番号WO95/14041参照）。
【００４６】ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲ
は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択
される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な
抗原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のＦＲのア
ミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Re
s. (1993) 53, 851-856)。キメラ抗体と、ヒト型化抗体
には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。好ましいヒト抗体
Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１，Ｃ
γ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。また、
抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗
体Ｃ領域を修飾してもよい。
は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択
される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な
抗原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のＦＲのア
ミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Re
s. (1993) 53, 851-856)。キメラ抗体と、ヒト型化抗体
には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。好ましいヒト抗体
Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１，Ｃ
γ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。また、
抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗
体Ｃ領域を修飾してもよい。
【００４７】キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物抗体由来
のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗
体はヒト以外の哺乳動物抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由
来のＦＲおよびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原
性が低下しているため、本発明に使用される抗体として
有用である。本発明で使用される抗体は、本発明に好適
に使用され得るかぎり、抗体断片や抗体修飾物であって
よい。例えば、抗体断片としては、Fab,F(ab′)2, Fvま
たはシングルチェインFv(scFv)が挙げられる。scFvはＨ
鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた構造を有
する。また、抗体を構成するアミノ酸配列の一つまたは
複数個のアミノ酸残基が変異、置換、欠失または挿入を
受けた抗体も本発明において抗体として使用されうる。
のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗
体はヒト以外の哺乳動物抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由
来のＦＲおよびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原
性が低下しているため、本発明に使用される抗体として
有用である。本発明で使用される抗体は、本発明に好適
に使用され得るかぎり、抗体断片や抗体修飾物であって
よい。例えば、抗体断片としては、Fab,F(ab′)2, Fvま
たはシングルチェインFv(scFv)が挙げられる。scFvはＨ
鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた構造を有
する。また、抗体を構成するアミノ酸配列の一つまたは
複数個のアミノ酸残基が変異、置換、欠失または挿入を
受けた抗体も本発明において抗体として使用されうる。
【００４８】これらの抗体断片を得るためには、抗体を
酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を
生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺
伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当
な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al.,
J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Ho
rwitz, A.H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-
496, Academic Press,Inc., Plueckthun, A. & Skerra,
A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Aca
demic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymolo
gy (1989) 121,652-663, Rousseaux, J. et al., Metho
ds in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R.E. e
t al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 参照）。
酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を
生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺
伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当
な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al.,
J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Ho
rwitz, A.H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-
496, Academic Press,Inc., Plueckthun, A. & Skerra,
A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Aca
demic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymolo
gy (1989) 121,652-663, Rousseaux, J. et al., Metho
ds in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R.E. e
t al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 参照）。
【００４９】ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領
域を連結することにより得られる（国際特許出願公開番
号WO88-09344, WO95-14041参照）。このｓｃＦｖにおい
て、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、
ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J.S. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85,587
9-5883)。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領
域域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来
であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーと
しては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の
一本鎖ペプチドが用いられる（米国特許5525491 参
照）。
域を連結することにより得られる（国際特許出願公開番
号WO88-09344, WO95-14041参照）。このｓｃＦｖにおい
て、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、
ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J.S. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85,587
9-5883)。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領
域域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来
であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーと
しては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の
一本鎖ペプチドが用いられる（米国特許5525491 参
照）。
【００５０】ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体
のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および
Ｌ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型と
し、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を
用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチド
リンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々
Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を
組み合せて増幅することにより得られる。
のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および
Ｌ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型と
し、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を
用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチド
リンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々
Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を
組み合せて増幅することにより得られる。
【００５１】また、一旦scFvをコードするＤＮＡが作製
されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発
現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得
ることができる。また、その宿主を用いて常法に従っ
て、scFvを得ることができる。これら抗体断片は、前述
のようにその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生
させることができる。本願特許請求の範囲でいう「抗
体」にはこれらの抗体断片も包含される。これらの抗体
断片は、抗体分子に比べて分子量が小さいため、生体に
おいて組織移行性が優れており、抗体と同様の機能を有
する分子として有用である。
されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発
現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得
ることができる。また、その宿主を用いて常法に従っ
て、scFvを得ることができる。これら抗体断片は、前述
のようにその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生
させることができる。本願特許請求の範囲でいう「抗
体」にはこれらの抗体断片も包含される。これらの抗体
断片は、抗体分子に比べて分子量が小さいため、生体に
おいて組織移行性が優れており、抗体と同様の機能を有
する分子として有用である。
【００５２】抗体修飾物として、ポリエチレングリコー
ル(PEG) 等の各種分子と結合した抗体を使用することも
できる。抗体になされる修飾とは、化学的結合を導入す
ることによる修飾であってもよいし、抗体のアミノ酸配
列になされる修飾であってもよい。本願特許請求の範囲
でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。
このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に修飾
を施すことによって得ることができる。これらの方法は
この分野においてすでに確立されている。
ル(PEG) 等の各種分子と結合した抗体を使用することも
できる。抗体になされる修飾とは、化学的結合を導入す
ることによる修飾であってもよいし、抗体のアミノ酸配
列になされる修飾であってもよい。本願特許請求の範囲
でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。
このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に修飾
を施すことによって得ることができる。これらの方法は
この分野においてすでに確立されている。
【００５３】前記のように構築した抗体遺伝子は、公知
の方法により発現させ、抗体を取得することができる。
哺乳類細胞を使用する場合、常用される有用なプロモー
ター／エンハンサー、発現される抗体遺伝子、その３′
側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあ
るいはそれを含むベクターにより発現させることができ
る。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒト
サイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー
（human cytomegalovirus immediate early promoter/e
nhancer)を挙げることができる。
の方法により発現させ、抗体を取得することができる。
哺乳類細胞を使用する場合、常用される有用なプロモー
ター／エンハンサー、発現される抗体遺伝子、その３′
側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあ
るいはそれを含むベクターにより発現させることができ
る。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒト
サイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー
（human cytomegalovirus immediate early promoter/e
nhancer)を挙げることができる。
【００５４】また、その他に本発明で使用される抗体発
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオールウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス４０（SV40）等のウィルスプロモータ
ー／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１
α（HEF1α) などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エ
ンハンサーを用いればよい。例えば、SV40プロモーター
／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Na
ture (1979) 277, 108) 、また、HEF1αプロモーター／
エンハンサーを使用する場合、Mizushima らの方法（Nu
cleic Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実
施することができる。
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオールウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス４０（SV40）等のウィルスプロモータ
ー／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１
α（HEF1α) などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エ
ンハンサーを用いればよい。例えば、SV40プロモーター
／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Na
ture (1979) 277, 108) 、また、HEF1αプロモーター／
エンハンサーを使用する場合、Mizushima らの方法（Nu
cleic Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実
施することができる。
【００５５】大腸菌の場合、常用される有用なプロモー
ター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体
遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。
例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araB
プロモーターを挙げることができる。lacZプロモーター
を使用する場合、Wardらの方法（Nature (1098) 341,54
4-546 ; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araBプロモ
ーターを使用する場合、Betterらの方法（Science (198
8) 240, 1041-1043)に従えばよい。
ター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体
遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。
例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araB
プロモーターを挙げることができる。lacZプロモーター
を使用する場合、Wardらの方法（Nature (1098) 341,54
4-546 ; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araBプロモ
ーターを使用する場合、Betterらの方法（Science (198
8) 240, 1041-1043)に従えばよい。
【００５６】抗体分泌のためのシグナル配列としては、
大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル
配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4
379)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体
を分離した後、抗体の構造を適切にフォールド（refol
d) して使用する（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ
９６−３０３９４、日本特許出願公告特公平７−９３８
７９を参照）。
大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル
配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4
379)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体
を分離した後、抗体の構造を適切にフォールド（refol
d) して使用する（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ
９６−３０３９４、日本特許出願公告特公平７−９３８
７９を参照）。
【００５７】複製起源としては、SV40ポリオーマウィル
ス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰ
Ｖ）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿
主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは
選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラ
ーゼ(APH) 遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（Ecogpt) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)
遺伝子等を含むことができる。本発明で使用される抗体
の製造のために、任意の産生系を使用することができ
る。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin viv
o の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細
胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げ
られる。
ス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰ
Ｖ）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿
主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは
選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラ
ーゼ(APH) 遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（Ecogpt) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)
遺伝子等を含むことができる。本発明で使用される抗体
の製造のために、任意の産生系を使用することができ
る。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin viv
o の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細
胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げ
られる。
【００５８】真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物
細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞として
は、（１）哺乳類細胞、例えばCHO (J. Exp. Med. (199
5) 108, 945)、COS 、ミエローマ、BHK (baby hamster
kidney) 、HeLa、Vero、（２）両生類細胞、例えばアフ
リカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (198
1) 291, 358-340)、あるいは（３）昆虫細胞、例えばsf
9, sf21, Tn5が知られている。CHO 細胞としては、特に
ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)やCH
O K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)
を好適に使用することができる。
細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞として
は、（１）哺乳類細胞、例えばCHO (J. Exp. Med. (199
5) 108, 945)、COS 、ミエローマ、BHK (baby hamster
kidney) 、HeLa、Vero、（２）両生類細胞、例えばアフ
リカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (198
1) 291, 358-340)、あるいは（３）昆虫細胞、例えばsf
9, sf21, Tn5が知られている。CHO 細胞としては、特に
ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)やCH
O K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)
を好適に使用することができる。
【００５９】植物細胞としては、Nicotiana tabacum 由
来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよ
い。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス
（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えばアス
ペルギウス（Aspergillus)属、例えばアスペルギウス・
ニガー（Aspergillus niger)などが知られている。原核
細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。
細菌細胞としては、大腸菌（E.coli) 、枯草菌が知られ
ている。
来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよ
い。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス
（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えばアス
ペルギウス（Aspergillus)属、例えばアスペルギウス・
ニガー（Aspergillus niger)などが知られている。原核
細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。
細菌細胞としては、大腸菌（E.coli) 、枯草菌が知られ
ている。
【００６０】これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を
形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitro
で培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の
方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM, MEM, R
PMI1640 IMDMを使用することができる。その際、牛胎児
血清(FCS) 等の血清補液を併用することもできるし、無
血清培養してもよい。また、抗体遺伝子を導入した細胞
を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivo にて抗体を
産生してもよい。
形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitro
で培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の
方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM, MEM, R
PMI1640 IMDMを使用することができる。その際、牛胎児
血清(FCS) 等の血清補液を併用することもできるし、無
血清培養してもよい。また、抗体遺伝子を導入した細胞
を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivo にて抗体を
産生してもよい。
【００６１】一方、in vivo の生産系としては、動物を
使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物ま
たは植物の体内で抗体を産生させ、回収する。動物を使
用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウ
シを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Bio
technology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を
用いる場合、トランスジェニック動物を用いることがで
きる。
使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物ま
たは植物の体内で抗体を産生させ、回収する。動物を使
用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウ
シを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Bio
technology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を
用いる場合、トランスジェニック動物を用いることがで
きる。
【００６２】例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのよ
うな乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝
子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺
伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの
胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容し
たヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその
子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジ
ェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を
増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニック
ヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Te
chnology (1994) 12, 699-702)。
うな乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝
子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺
伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの
胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容し
たヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその
子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジ
ェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を
増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニック
ヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Te
chnology (1994) 12, 699-702)。
【００６３】また、昆虫としては、例えばカイコを用い
ることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝
子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、こ
のカイコの体液より所望の抗体を得る（Susumu, M. et
al., Nature (1985) 315, 592-594)。さらに植物を使用
する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコ
を用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクタ
ー、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをAgrobact
erium tumefaciens のようなバクテリアに導入する。こ
のバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacum に感
染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian,
K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24,131-13
8)。
ることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝
子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、こ
のカイコの体液より所望の抗体を得る（Susumu, M. et
al., Nature (1985) 315, 592-594)。さらに植物を使用
する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコ
を用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクタ
ー、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをAgrobact
erium tumefaciens のようなバクテリアに導入する。こ
のバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacum に感
染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian,
K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24,131-13
8)。
【００６４】上述のようにin vitroまたはin vivo の産
生系にて抗体を産生する場合、抗体のＨ鎖またはＬ鎖を
コードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿
主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖および
Ｌ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込
んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開
番号WO94-11523参照）。宿主への発現ベクターの導入方
法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法
（Virology (1973) 52, 456-467)やエレクトロポレーシ
ョン法（EMBO J.(1982) 1, 841-845)等が用いられる。
生系にて抗体を産生する場合、抗体のＨ鎖またはＬ鎖を
コードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿
主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖および
Ｌ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込
んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開
番号WO94-11523参照）。宿主への発現ベクターの導入方
法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法
（Virology (1973) 52, 456-467)やエレクトロポレーシ
ョン法（EMBO J.(1982) 1, 841-845)等が用いられる。
【００６５】前記のように産生、発現された抗体は、細
胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができ
る。本発明で使用される抗体の分離、精製は、通常の蛋
白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すれ
ばよく、何ら限定されるものではない。例えば、アフィ
ニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカ
ラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選
択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる
（Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and
David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができ
る。本発明で使用される抗体の分離、精製は、通常の蛋
白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すれ
ばよく、何ら限定されるものではない。例えば、アフィ
ニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカ
ラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選
択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる
（Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and
David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
【００６６】アフィニティークロマトグラフィーに用い
るカラムとしては、例えばプロテインＡカラム、プロテ
インＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用い
る担体として、例えばHyper D, POROS, Sepharose F.F.
(Pharmacia)等が挙げられる。アフィニティークロマト
グラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマ
トグラフィー等が挙げられる（Strategies forProtein
Purification and Characterization : A Laboratory C
ourse Manual.Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, 1996)。
るカラムとしては、例えばプロテインＡカラム、プロテ
インＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用い
る担体として、例えばHyper D, POROS, Sepharose F.F.
(Pharmacia)等が挙げられる。アフィニティークロマト
グラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマ
トグラフィー等が挙げられる（Strategies forProtein
Purification and Characterization : A Laboratory C
ourse Manual.Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, 1996)。
【００６７】これらのクロマトグラフィーは、液相クロ
マトグラフィー、例えばHPLC, FPLC等の液相クロマトグ
ラフィーを用いて行うことができる。得られた抗体の濃
度測定は、吸光度の測定または酵素結合免疫吸着検定法
（enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)等によ
り行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場
合には、得られた抗体をＰＢＳで適当に希釈した後、２
８０nmの吸光度を測定する。例えば、ヒト抗体の場合、
１mg／mlを１．３５ODとして算出すればよい。
マトグラフィー、例えばHPLC, FPLC等の液相クロマトグ
ラフィーを用いて行うことができる。得られた抗体の濃
度測定は、吸光度の測定または酵素結合免疫吸着検定法
（enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)等によ
り行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場
合には、得られた抗体をＰＢＳで適当に希釈した後、２
８０nmの吸光度を測定する。例えば、ヒト抗体の場合、
１mg／mlを１．３５ODとして算出すればよい。
【００６８】また、ELISA による場合は以下のように測
定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液
（pH９．６）で１μｇ／mlに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ
（TAGO製）１００μｌを９６穴プレート（Nunc製）に加
え、４℃で一晩インキュベートし、抗体を固層化する。
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗
体または抗体を含むサンプル、あるいは濃度標準品とし
て既知の濃度のヒトＩｇＧ（CAPPEL製）１００μｌを添
加し、室温にて１時間インキュベートする。
定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液
（pH９．６）で１μｇ／mlに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ
（TAGO製）１００μｌを９６穴プレート（Nunc製）に加
え、４℃で一晩インキュベートし、抗体を固層化する。
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗
体または抗体を含むサンプル、あるいは濃度標準品とし
て既知の濃度のヒトＩｇＧ（CAPPEL製）１００μｌを添
加し、室温にて１時間インキュベートする。
【００６９】洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォ
スファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（BIO SOURCE製）１００
μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄
後、基質溶液を加えインキュベートの後、MICROPLATE R
EADER Model 3550 (Bio-Rad製）を用いて４０５nmでの
吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。また、
抗体の濃度測定には、BIAcore (Pharmacia製）を使用す
ることができる。
スファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（BIO SOURCE製）１００
μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄
後、基質溶液を加えインキュベートの後、MICROPLATE R
EADER Model 3550 (Bio-Rad製）を用いて４０５nmでの
吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。また、
抗体の濃度測定には、BIAcore (Pharmacia製）を使用す
ることができる。
【００７０】本発明で使用される抗体の抗原結合活性の
評価は、通常知られた方法、例えばELISA, EIA（酵素免
疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗
体法を用いることができる（Antibodies : A Laborator
y Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, 1988)。上記抗体の活性評価には、BI
Acore (Pharmacia製）を使用することができる。本発明
において、「トキシン」とは、微生物、動物又は植物由
来の細胞毒性を示す種々の蛋白質やポリペプチド等を意
味する。例えば既知のトキシンとして、次のものを挙げ
ることができる。
評価は、通常知られた方法、例えばELISA, EIA（酵素免
疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗
体法を用いることができる（Antibodies : A Laborator
y Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, 1988)。上記抗体の活性評価には、BI
Acore (Pharmacia製）を使用することができる。本発明
において、「トキシン」とは、微生物、動物又は植物由
来の細胞毒性を示す種々の蛋白質やポリペプチド等を意
味する。例えば既知のトキシンとして、次のものを挙げ
ることができる。
【００７１】ジフテリアトキシンＡ鎖（Diphtheria tox
in A Chain) (Langone J.J., et al., Methods in Enzy
mology, 93, 307-308, 1983)、シュードモナスエンドト
キシン（Pseudomonas Endotoxin) (Nature Medicine,2,
350-353, 1996)、リシンＡ鎖（Ricin A Chain) (Fulto
n R.J., et al., J. Biol. Chem., 261,5314-5319, 198
6 ; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173,
1987 ; Cumber A.J. et al., J. Immunol. Methods, 13
5, 15-24, 1990 ; Wawrzynczak E.J., et al., Cancer
Res., 50, 7519-7562, 1990 ; Gheeite V., et al., J.
Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991) ;
in A Chain) (Langone J.J., et al., Methods in Enzy
mology, 93, 307-308, 1983)、シュードモナスエンドト
キシン（Pseudomonas Endotoxin) (Nature Medicine,2,
350-353, 1996)、リシンＡ鎖（Ricin A Chain) (Fulto
n R.J., et al., J. Biol. Chem., 261,5314-5319, 198
6 ; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173,
1987 ; Cumber A.J. et al., J. Immunol. Methods, 13
5, 15-24, 1990 ; Wawrzynczak E.J., et al., Cancer
Res., 50, 7519-7562, 1990 ; Gheeite V., et al., J.
Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991) ;
【００７２】無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated Ricin
A Chain) (Thorpe P.E., et al.,Cancer Res., 47, 59
24-5931, 1987) ;Ａ鎖（A Chain) (Wawrzynczak E.J.,
et al., Br. J. Cancer, 66, 361-366,1992 ; Wawrzync
zak E.J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990
; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1
987 ; Thorpe P.E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5
931, 1987) ;ゲロニン（Gelonin) (Sivam G., et al.,
Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A.J. et a
l., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990 ; Wawrzy
nczak E.J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 19
90 ; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 8
9, 341-346, 1992) ;
A Chain) (Thorpe P.E., et al.,Cancer Res., 47, 59
24-5931, 1987) ;Ａ鎖（A Chain) (Wawrzynczak E.J.,
et al., Br. J. Cancer, 66, 361-366,1992 ; Wawrzync
zak E.J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990
; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1
987 ; Thorpe P.E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5
931, 1987) ;ゲロニン（Gelonin) (Sivam G., et al.,
Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A.J. et a
l., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990 ; Wawrzy
nczak E.J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 19
90 ; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 8
9, 341-346, 1992) ;
【００７３】ポークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ;
Pokeweed anti-viral protein fromseeds) (Bolognesi
A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 199
2) ;ブリオジン（Briodin) (Bolognesi A., et al., Cl
in. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992) ;サポリン（S
aporin) (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immuno
l., 89, 341-346, 1992) ;
Pokeweed anti-viral protein fromseeds) (Bolognesi
A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 199
2) ;ブリオジン（Briodin) (Bolognesi A., et al., Cl
in. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992) ;サポリン（S
aporin) (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immuno
l., 89, 341-346, 1992) ;
【００７４】モモルジン（Momordin) (Cumber A.J., et
al., J. Immunol. Methods, 135,15-24, 1990 ; Wawrz
ynczak E.J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1
990; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 8
9, 341-346, 1992) ;モモルコキン（Momorcochin) (Bol
ognesi A., et al., Clin. exp. Immunol.,89, 341-34
6, 1992) ;ジアンシン３２（Dianthin 32) (Bolognesi
A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 199
2) ;ジアンシン３０（Dianthin 30) (Stirpe F., Barbi
eri L., FEBS letter 195,1-8, 1986) ;
al., J. Immunol. Methods, 135,15-24, 1990 ; Wawrz
ynczak E.J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1
990; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 8
9, 341-346, 1992) ;モモルコキン（Momorcochin) (Bol
ognesi A., et al., Clin. exp. Immunol.,89, 341-34
6, 1992) ;ジアンシン３２（Dianthin 32) (Bolognesi
A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 199
2) ;ジアンシン３０（Dianthin 30) (Stirpe F., Barbi
eri L., FEBS letter 195,1-8, 1986) ;
【００７５】モデッシン（Modeccin) (Stirpe F., Barb
ieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986) ;ビスカミン
（Viscumin) (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 1
95, 1-8, 1986) ;ボルケシン（Volkesin) (Stirpe F.,
Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986) ;ドデカン
ドリン（Dodecandrin) (Stirpe F., Barbieri L., FEBS
letter 195,1-8, 1986) ;
ieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986) ;ビスカミン
（Viscumin) (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 1
95, 1-8, 1986) ;ボルケシン（Volkesin) (Stirpe F.,
Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986) ;ドデカン
ドリン（Dodecandrin) (Stirpe F., Barbieri L., FEBS
letter 195,1-8, 1986) ;
【００７６】トリチン（Tritin）(Stirpe F., Barbieri
L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);ルフィン（Luffin)
(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 19
86);トリコキリン（Trichokirin) (Casellas P., et a
l., Eur. J. Biochem. 176,581-588, 1988 ; Bolognesi
A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346,199
2)。
L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);ルフィン（Luffin)
(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 19
86);トリコキリン（Trichokirin) (Casellas P., et a
l., Eur. J. Biochem. 176,581-588, 1988 ; Bolognesi
A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346,199
2)。
【００７７】抗腫瘍剤としては、メルファラン（Melpha
lan) (Rowland G.F., et al., Nature 255, 487-488, 1
975) ;シスプラチン（Cis-platinum) (Hurwitz E. and
Haimovich J., Method In Enzymology 178, 369-375, 1
986 ; Schechter B., et al., Int. J. Cancer 48, 167
-172, 1991) ;カルボプラチン（Carboplatin) (Ota,
Y., et al., Asia-Oceania J. Obstet.Gynaecol. 19, 4
49-457, 1993) ;マイトマイシンＣ（Mitomycin C) (Nog
uchi, A., et al., Bioconjugate Chem. 3, 132-137, 1
992) ;
lan) (Rowland G.F., et al., Nature 255, 487-488, 1
975) ;シスプラチン（Cis-platinum) (Hurwitz E. and
Haimovich J., Method In Enzymology 178, 369-375, 1
986 ; Schechter B., et al., Int. J. Cancer 48, 167
-172, 1991) ;カルボプラチン（Carboplatin) (Ota,
Y., et al., Asia-Oceania J. Obstet.Gynaecol. 19, 4
49-457, 1993) ;マイトマイシンＣ（Mitomycin C) (Nog
uchi, A., et al., Bioconjugate Chem. 3, 132-137, 1
992) ;
【００７８】アドリアマイシン（Adriamycin (Doxorubi
cin)) (Shih, L.B., et al., Cancer Res. 51 4192-419
8, 1991 ; Zhu, Z., et al., Cancer Immunol. Immumot
her40, 257-267, 1995 ; Trail, P.A., et al., Scienc
e 261, 212-215, 1993 ; Zhu, Z., et al., Cancer Imm
unol. Immumother 40, 257-267, 1995 ; Kondo, Y.,et
al., Jpn. J. Cancer Res. 86 1072-1079, 1995 ; Zhu,
Z., et al., Cancer Immunol. Immumother 40, 257-26
7, 1995 ; Zhu, Z., et al., Cancer Immunol. Immumot
her 40, 257-267, 1995) ;
cin)) (Shih, L.B., et al., Cancer Res. 51 4192-419
8, 1991 ; Zhu, Z., et al., Cancer Immunol. Immumot
her40, 257-267, 1995 ; Trail, P.A., et al., Scienc
e 261, 212-215, 1993 ; Zhu, Z., et al., Cancer Imm
unol. Immumother 40, 257-267, 1995 ; Kondo, Y.,et
al., Jpn. J. Cancer Res. 86 1072-1079, 1995 ; Zhu,
Z., et al., Cancer Immunol. Immumother 40, 257-26
7, 1995 ; Zhu, Z., et al., Cancer Immunol. Immumot
her 40, 257-267, 1995) ;
【００７９】ダウノルビシン（Daunorubicin) (Dillma
n, R.O. et al., Cancer Res. 48, 6097-6102, 1988 ;
Hudecz, F., et al., Bioconjugate Chem. 1, 197-204,
1990; Tukada Y. et al., J. Natl. Cancer Inst. 75,
721-729, 1984) ;ブレオマイシン（Bleomycin) (Manab
e, Y., et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 115,
1009-1014, 1983) ;ネオカルチノスタチン（Neocarzino
statin) (Kitamura K., et al., Cancer Immunol. Immu
mother 36, 177-184, 1993 ; Yamaguchi T., et al., J
pn. J. Cancer Res. 85, 167-171, 1994) ;
n, R.O. et al., Cancer Res. 48, 6097-6102, 1988 ;
Hudecz, F., et al., Bioconjugate Chem. 1, 197-204,
1990; Tukada Y. et al., J. Natl. Cancer Inst. 75,
721-729, 1984) ;ブレオマイシン（Bleomycin) (Manab
e, Y., et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 115,
1009-1014, 1983) ;ネオカルチノスタチン（Neocarzino
statin) (Kitamura K., et al., Cancer Immunol. Immu
mother 36, 177-184, 1993 ; Yamaguchi T., et al., J
pn. J. Cancer Res. 85, 167-171, 1994) ;
【００８０】メトトレキセート（Methotrexate) (Kralo
vec, J., et al., Cancer Immunol.Immumother 29, 293
-302, 1989 ; Kulkarni, P.N., et al., Cancer Res. 4
1,2700-2706, 1981 ; Shin, L.B., et al., Int. J. Ca
ncer 41, 832-839, 1988 ;Gamett M.C., et al., Int.
J. Cancer 31, 661-670, 1983) ;５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine) (Shin, L.B., Int. J. Cancer 46,
1101-1106, 1990) ;５−フルオロ−２′−デオキシウリ
ジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine) (Goerlach A., et
al., Bioconjugate Chem. 2, 96-101, 1991) ;
vec, J., et al., Cancer Immunol.Immumother 29, 293
-302, 1989 ; Kulkarni, P.N., et al., Cancer Res. 4
1,2700-2706, 1981 ; Shin, L.B., et al., Int. J. Ca
ncer 41, 832-839, 1988 ;Gamett M.C., et al., Int.
J. Cancer 31, 661-670, 1983) ;５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine) (Shin, L.B., Int. J. Cancer 46,
1101-1106, 1990) ;５−フルオロ−２′−デオキシウリ
ジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine) (Goerlach A., et
al., Bioconjugate Chem. 2, 96-101, 1991) ;
【００８１】シトシンアラビノシド（Cytosine arabino
side) (Hurwitz E., et al., J. Med. Chem. 28, 137-1
40, 1985) ;アミノプテリン（Aminopterin) (Kanellos
J., et al., Immunol. Cell. Biol. 65, 483-493, 198
7) ;ビンクリスチン(Vincristine) (Johnson J.R., et
al., Br. J. Cancer 42, 17, 1980) ;ビンデシン(Vinde
sine) (Johnson J.R., et al., Br. J. Cancer 44, 472
-475, 1981) ;などが挙げられる。
side) (Hurwitz E., et al., J. Med. Chem. 28, 137-1
40, 1985) ;アミノプテリン（Aminopterin) (Kanellos
J., et al., Immunol. Cell. Biol. 65, 483-493, 198
7) ;ビンクリスチン(Vincristine) (Johnson J.R., et
al., Br. J. Cancer 42, 17, 1980) ;ビンデシン(Vinde
sine) (Johnson J.R., et al., Br. J. Cancer 44, 472
-475, 1981) ;などが挙げられる。
【００８２】抗組織因子抗体又は抗原結合能を有するそ
の断片とトキシン又は化学療法剤が、それら自身が有す
る連結基を介して直接結合される場合の連結基は、ＳＨ
基を用いたジスルフィド結合が挙げられる。抗体のＦｃ
領域の分子内ジスルフィド結合を例えばジチオトレイト
ール等にて還元し、トキシンのジスルフィド結合を同様
に還元して、両者をジスルフィド結合にて連結する。連
結前に例えばエルマン試薬（Ellman's reagent) にて抗
体かトキシンのいずれか一方を活性化し両者をジスルフ
ィド結合させる。
の断片とトキシン又は化学療法剤が、それら自身が有す
る連結基を介して直接結合される場合の連結基は、ＳＨ
基を用いたジスルフィド結合が挙げられる。抗体のＦｃ
領域の分子内ジスルフィド結合を例えばジチオトレイト
ール等にて還元し、トキシンのジスルフィド結合を同様
に還元して、両者をジスルフィド結合にて連結する。連
結前に例えばエルマン試薬（Ellman's reagent) にて抗
体かトキシンのいずれか一方を活性化し両者をジスルフ
ィド結合させる。
【００８３】抗組織因子抗体又は抗原結合能を有するそ
の断片とトキシン又は化学療法剤が、それら自身が有す
る連結基を介して直接結合される場合の連結基は、例え
ばダウノルビシン（Hurwitz, E. et al., Cancer Res.
35, 1175-1181, 1975)、アドリアマインシ（ドキソルビ
シン；Mohamed, G. et al., Pro. A.A.C.R. 27, 317,19
86)(Kulkarni, P.N. et al., Cancer Res. 41, 2700-27
06, 1981)活性エステル法（N-hydroxysuccinimide法）
活性エステル法(Kulkarni, P.N. et al., Cancer Res.
41, 2700-2706, 1981 Mixed anhydride Mixed anhydrid
e Burnstein, S. et al., J. MED. Chem. 20, 950-952,
1977)ジアゾ反応により連結される化学療法剤として
は、例えばMTX (De Carvalho, S. et al., Nature (Lon
don) 202,255-258, 1964)が使用される。
の断片とトキシン又は化学療法剤が、それら自身が有す
る連結基を介して直接結合される場合の連結基は、例え
ばダウノルビシン（Hurwitz, E. et al., Cancer Res.
35, 1175-1181, 1975)、アドリアマインシ（ドキソルビ
シン；Mohamed, G. et al., Pro. A.A.C.R. 27, 317,19
86)(Kulkarni, P.N. et al., Cancer Res. 41, 2700-27
06, 1981)活性エステル法（N-hydroxysuccinimide法）
活性エステル法(Kulkarni, P.N. et al., Cancer Res.
41, 2700-2706, 1981 Mixed anhydride Mixed anhydrid
e Burnstein, S. et al., J. MED. Chem. 20, 950-952,
1977)ジアゾ反応により連結される化学療法剤として
は、例えばMTX (De Carvalho, S. et al., Nature (Lon
don) 202,255-258, 1964)が使用される。
【００８４】連結基としてアミノ基、カルボキシル基、
メルカプト基等を２個以上有する化合物が挙げられ、抗
体又は抗原結合能を有するその断片およびトキシン又は
酵素が有するカルボキシル基又はアミノ酸と、リンカー
が提供するカルボキシル基、アミノ酸、メルカプト基等
との間に形成されるエステル結合、アミド結合、チオエ
ステル結合等により連結される。例えば次の物質が使用
される。
メルカプト基等を２個以上有する化合物が挙げられ、抗
体又は抗原結合能を有するその断片およびトキシン又は
酵素が有するカルボキシル基又はアミノ酸と、リンカー
が提供するカルボキシル基、アミノ酸、メルカプト基等
との間に形成されるエステル結合、アミド結合、チオエ
ステル結合等により連結される。例えば次の物質が使用
される。
【００８５】Ｎ−スクシニミジル ３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（SPDP : N-Succinimidyl 3-(2
-pyridylditio) propinate) (Wawrzynczak E.J., et a
l., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990 ; Thorpe P.
E., et al., Cancer Res., 47,5924-5931, 1987) ;ＬＣ
−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（LC-SPDP : LC-Succinimidyl 3-(2-pyridyldi
tio) propinate) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Tech
niques, 230-232, 1996) ;
ジチオ）プロピオネート（SPDP : N-Succinimidyl 3-(2
-pyridylditio) propinate) (Wawrzynczak E.J., et a
l., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990 ; Thorpe P.
E., et al., Cancer Res., 47,5924-5931, 1987) ;ＬＣ
−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート（LC-SPDP : LC-Succinimidyl 3-(2-pyridyldi
tio) propinate) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Tech
niques, 230-232, 1996) ;
【００８６】スルホ−ＬＣ−スクシニミジル ３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（Sulfo-LC-SPDP :
Sulfo-LC-Succinimidyl 3-(2-pyridylditio) propinat
e) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Techniques, 230-2
32, 1996) ;Ｎ−スクシニミジル ３−（２−ピリジル
ジチオ）ブチレート（SPDB : N-Succinimidyl 3-(2-pyr
idylditio) butyrate) (Wawrzynczak E.J., et al., B
r. J.Cancer, 66, 361-366, 1992) ;スクシニミジロキ
シカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン
（SMPT: Succinimidyloxycarbonyl- α- (2-pyridyldit
io) toruene) (Thorpe P.E.,et al., Cancer Res., 47,
5924-5931, 1987) ;
−ピリジルジチオ）プロピオネート（Sulfo-LC-SPDP :
Sulfo-LC-Succinimidyl 3-(2-pyridylditio) propinat
e) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Techniques, 230-2
32, 1996) ;Ｎ−スクシニミジル ３−（２−ピリジル
ジチオ）ブチレート（SPDB : N-Succinimidyl 3-(2-pyr
idylditio) butyrate) (Wawrzynczak E.J., et al., B
r. J.Cancer, 66, 361-366, 1992) ;スクシニミジロキ
シカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン
（SMPT: Succinimidyloxycarbonyl- α- (2-pyridyldit
io) toruene) (Thorpe P.E.,et al., Cancer Res., 47,
5924-5931, 1987) ;
【００８７】ＬＣ−スクシニミジロキシカルボニル−α
−（２−ピリジルジチオ）トルエン（LC-SMPT : LC-Suc
cinimidyloxycarbonyl- α- (2-pyridylditio) toruen
e) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Techniques, 232-2
35, 1996) ;スルホ−ＬＣ−スクシニミジロキシカルボ
ニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（Sulfo-LC
-SMPT : Sulfo-LC-Succinimidyloxycarbonyl- α- (2-p
yridylditio) toruene) (Hermanson G.T., BIOCONJUGAT
E Techniques, 232-235, 1996) ;
−（２−ピリジルジチオ）トルエン（LC-SMPT : LC-Suc
cinimidyloxycarbonyl- α- (2-pyridylditio) toruen
e) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Techniques, 232-2
35, 1996) ;スルホ−ＬＣ−スクシニミジロキシカルボ
ニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（Sulfo-LC
-SMPT : Sulfo-LC-Succinimidyloxycarbonyl- α- (2-p
yridylditio) toruene) (Hermanson G.T., BIOCONJUGAT
E Techniques, 232-235, 1996) ;
【００８８】スクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）ブチレート（SMPB : Succinimidyl-4-(p-malei
midophenyl) butyrate) (Hermanson G.T., BIOCONJUGAT
E Techniques, 242-243, 1996) ;スルホ−スクシニミジ
ル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Sulf
o-SMPB : Sulfo-Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)
butyrate) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Technique
s, 242-243, 1996) ;ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ハイドロキシスクシニミドエステル（MBS :m-Maleimido
benzoly-N-hydroxysuccinimide ester) (Hermanson G.
T., BIOCONJUGATE Techniques, 237-238, 1996) ;
ェニル）ブチレート（SMPB : Succinimidyl-4-(p-malei
midophenyl) butyrate) (Hermanson G.T., BIOCONJUGAT
E Techniques, 242-243, 1996) ;スルホ−スクシニミジ
ル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Sulf
o-SMPB : Sulfo-Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)
butyrate) (Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Technique
s, 242-243, 1996) ;ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ハイドロキシスクシニミドエステル（MBS :m-Maleimido
benzoly-N-hydroxysuccinimide ester) (Hermanson G.
T., BIOCONJUGATE Techniques, 237-238, 1996) ;
【００８９】スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ハイドロキシスクシニミドエステル（Sulfo-MBS : Sulf
o-m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)
(Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Techniques, 237-238,
1996) ;Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒド
ライド（SAMSA : S-Acetyl mercaptosuccinic anhydrid
e) (Casellas P., et al., Eur. J. Biochem. 176, 581
-588, 1988) ;ジメチル ３，３−ジチオビスプロリオ
ニミデート（DTBP : Dimethyl 3,3 ′-ditiobisprorion
imidate) (Casellas P., et al., Eur. J. Biochem. 17
6, 581-588, 1988) ;２−イミノチオレーン（2-Iminoti
olane) (Thorpe P.E., et al., Cancer Res., 47, 5924
-5931, 1987) 。
ハイドロキシスクシニミドエステル（Sulfo-MBS : Sulf
o-m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)
(Hermanson G.T., BIOCONJUGATE Techniques, 237-238,
1996) ;Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒド
ライド（SAMSA : S-Acetyl mercaptosuccinic anhydrid
e) (Casellas P., et al., Eur. J. Biochem. 176, 581
-588, 1988) ;ジメチル ３，３−ジチオビスプロリオ
ニミデート（DTBP : Dimethyl 3,3 ′-ditiobisprorion
imidate) (Casellas P., et al., Eur. J. Biochem. 17
6, 581-588, 1988) ;２−イミノチオレーン（2-Iminoti
olane) (Thorpe P.E., et al., Cancer Res., 47, 5924
-5931, 1987) 。
【００９０】中間支持体としては、ペプチド、例えばポ
リＬ−グルタミン酸(PGA) 、カルボキシメチルデキスト
ラン、デキストラン、アミノデキストラン、アビジン・
ビオチン、シス・アコニット酸、グルタミン酸ジヒドラ
ジド、ヒト血清アルブミン(HSA) 等が用いられる。抗組
織因子抗体又は抗原結合能を有するその断片は、組織因
子抗原を発現している細胞にインターナライズすること
ができる。従って、抗組織因子抗体又は抗原結合能を有
するその断片、リンカー、中間支持体連結された種々の
化学療法剤やトキシンは、抗組織因子抗体のインターナ
リゼーションと共に細胞に効率よく導入され、細胞内で
それらの薬理効果を発揮する。
リＬ−グルタミン酸(PGA) 、カルボキシメチルデキスト
ラン、デキストラン、アミノデキストラン、アビジン・
ビオチン、シス・アコニット酸、グルタミン酸ジヒドラ
ジド、ヒト血清アルブミン(HSA) 等が用いられる。抗組
織因子抗体又は抗原結合能を有するその断片は、組織因
子抗原を発現している細胞にインターナライズすること
ができる。従って、抗組織因子抗体又は抗原結合能を有
するその断片、リンカー、中間支持体連結された種々の
化学療法剤やトキシンは、抗組織因子抗体のインターナ
リゼーションと共に細胞に効率よく導入され、細胞内で
それらの薬理効果を発揮する。
【００９１】従って、本発明の抗組織因子抗体又は抗原
結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンを
連結して成る複合体は、種々の化学療法剤又はトキシン
を細胞に導入するための医薬組成物として有用である。
組織因子は腫瘍細胞に広く分布しているから、本発明の
医薬組成物は特に抗腫瘍作用のある医薬組成物として有
用である。この効果は、例えば抗組織因子抗体又は抗原
結合能を有するその断片とトキシンを含んで成る本発明
の複合体、例えばイムノトキシン又は遊離のトキシンを
組織因子を発現している細胞に添加した場合、前者にお
いて殺細胞効果が高かったことにより証明された。
結合能を有するその断片と化学療法剤またはトキシンを
連結して成る複合体は、種々の化学療法剤又はトキシン
を細胞に導入するための医薬組成物として有用である。
組織因子は腫瘍細胞に広く分布しているから、本発明の
医薬組成物は特に抗腫瘍作用のある医薬組成物として有
用である。この効果は、例えば抗組織因子抗体又は抗原
結合能を有するその断片とトキシンを含んで成る本発明
の複合体、例えばイムノトキシン又は遊離のトキシンを
組織因子を発現している細胞に添加した場合、前者にお
いて殺細胞効果が高かったことにより証明された。
【００９２】本発明の抗組織因子抗体又は抗原結合能を
有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを連結し
て成る複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物
は、経口的あるいは非経口的に全身あるいは局所的に投
与することができる。非経口的投与としては、例えば、
点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下
注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適
宜投与方法を選択することができる。本発明の複合体ま
たは該複合体を含んで成る医薬組成物は、腫瘍に既に悩
まされる患者に、症状を治癒するか、あるいは少なくと
も部分的に阻止するために十分な量で投与される。
有するその断片と化学療法剤またはトキシンとを連結し
て成る複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物
は、経口的あるいは非経口的に全身あるいは局所的に投
与することができる。非経口的投与としては、例えば、
点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下
注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適
宜投与方法を選択することができる。本発明の複合体ま
たは該複合体を含んで成る医薬組成物は、腫瘍に既に悩
まされる患者に、症状を治癒するか、あるいは少なくと
も部分的に阻止するために十分な量で投与される。
【００９３】また、本発明の複合体または該複合体を含
んで成る診断用組成物は、腫瘍に既に悩まされる患者の
体内の腫瘍の局在をイメージングするために投与され
る。例えば、有効投与量は、一回につき体重１kgあたり
０．０１mgから１００mgの範囲で選ばれる。あるいは、
患者あたり１〜１０００mg、好ましくは５〜５０mgの投
与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の複合
体または該複合体を含んで成る医薬組成物はこれらの投
与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患
者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発
明の複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物は、
投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に
含むものであってもよい。
んで成る診断用組成物は、腫瘍に既に悩まされる患者の
体内の腫瘍の局在をイメージングするために投与され
る。例えば、有効投与量は、一回につき体重１kgあたり
０．０１mgから１００mgの範囲で選ばれる。あるいは、
患者あたり１〜１０００mg、好ましくは５〜５０mgの投
与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の複合
体または該複合体を含んで成る医薬組成物はこれらの投
与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患
者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発
明の複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物は、
投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に
含むものであってもよい。
【００９４】このような担体および添加物の例として、
水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ
ニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラ
チン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポ
リエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステア
リルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトー
ス、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げ
られる。
水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ
ニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラ
チン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポ
リエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステア
リルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトー
ス、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げ
られる。
【００９５】使用される添加物は、剤型に応じて上記の
中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限
定されるものではない。本発明はまた、本発明の複合体
と他の薬剤、生物学的製剤や合成医薬製剤などとの、同
時もしくは逐次的併用投与をも包含する。他の薬剤とし
ては、抗炎症薬や抗アレルギー薬、抗血小板薬、他の抗
腫瘍薬の中から選ばれる。
中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限
定されるものではない。本発明はまた、本発明の複合体
と他の薬剤、生物学的製剤や合成医薬製剤などとの、同
時もしくは逐次的併用投与をも包含する。他の薬剤とし
ては、抗炎症薬や抗アレルギー薬、抗血小板薬、他の抗
腫瘍薬の中から選ばれる。
【００９６】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１ ．抗組織因子抗体とゲロニンとの複合体（イム
ノトキシン）の作製 本発明の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体と植物（Ge
lonium multiflorum)の種子由来の蛋白質合成阻害活性
を有するトキシンであるゲロニン（gelonin, Inland La
boratories社）との複合体をThrope, P.E. et al., Can
cer Res. (1987) 47, 5924-5931 らの方法を用いて作製
した。同様にコントロール抗体(MOPC-31C)（ATCC CCL-1
30(Yoshida T.H. et al., J.Natl.Cancer Inst.(1968)4
1, 1083-1097）とゲロニンとの複合体を作製した。
説明する。実施例１ ．抗組織因子抗体とゲロニンとの複合体（イム
ノトキシン）の作製 本発明の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体と植物（Ge
lonium multiflorum)の種子由来の蛋白質合成阻害活性
を有するトキシンであるゲロニン（gelonin, Inland La
boratories社）との複合体をThrope, P.E. et al., Can
cer Res. (1987) 47, 5924-5931 らの方法を用いて作製
した。同様にコントロール抗体(MOPC-31C)（ATCC CCL-1
30(Yoshida T.H. et al., J.Natl.Cancer Inst.(1968)4
1, 1083-1097）とゲロニンとの複合体を作製した。
【００９７】１mLの50mMのリン酸ナトリウム−１５０mM
NaCl−５mM EDTA（pH７．０）緩衝液中に抗体２mgと
それに対して直前に０．０１mLのDMSOに溶解した３倍モ
ル量のＮ−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP, Pierce社）を添加し、室温
で１時間穏やかに攪拌して反応させた後、あらかじめ５
０mMリン酸ナトリウム−１５０mM NaCl−５mM EDTA
（pH７．０）緩衝液で平衡化した脱塩カラムFast Desal
ting Column 10/10 (Pharmacia Biotec 社）により未反
応のSPDPおよび塩類を除去してＰＤＰ基導入抗体を得
た。
NaCl−５mM EDTA（pH７．０）緩衝液中に抗体２mgと
それに対して直前に０．０１mLのDMSOに溶解した３倍モ
ル量のＮ−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP, Pierce社）を添加し、室温
で１時間穏やかに攪拌して反応させた後、あらかじめ５
０mMリン酸ナトリウム−１５０mM NaCl−５mM EDTA
（pH７．０）緩衝液で平衡化した脱塩カラムFast Desal
ting Column 10/10 (Pharmacia Biotec 社）により未反
応のSPDPおよび塩類を除去してＰＤＰ基導入抗体を得
た。
【００９８】一方、１mLの５０mMリン酸ナトリウム−１
５０mM NaCl−５mM EDTA（pH７．０）緩衝液中にゲロ
ニン１mgとそれに対して３倍モル量の２−イミノチオレ
ーン（２−IT，Piece 社）を添加し、室温で４５分間穏
やかに攪拌して反応させた後、あらかじめ５０mMリン酸
ナトリウム−１５０mM NaCl−５mM EDTA（pH７．０）
緩衝液で平衡化した脱塩カラムFast Desalting Column
10/10 (Pharmacia Biotech社）により未反応の２−ITお
よび塩類を除去して、ＳＨ基導入ゲロニンを得た。抗体
とゲロニンを結合させるため、ＰＤＰ基導入抗体とＳＨ
基導入ゲロニンを混合してCentricon 10 (Amicon社）に
て４度Ｃで５０００rpm 、１時間遠心濃縮しておよそ
０．５mLにした後、４℃で一晩静置した。
５０mM NaCl−５mM EDTA（pH７．０）緩衝液中にゲロ
ニン１mgとそれに対して３倍モル量の２−イミノチオレ
ーン（２−IT，Piece 社）を添加し、室温で４５分間穏
やかに攪拌して反応させた後、あらかじめ５０mMリン酸
ナトリウム−１５０mM NaCl−５mM EDTA（pH７．０）
緩衝液で平衡化した脱塩カラムFast Desalting Column
10/10 (Pharmacia Biotech社）により未反応の２−ITお
よび塩類を除去して、ＳＨ基導入ゲロニンを得た。抗体
とゲロニンを結合させるため、ＰＤＰ基導入抗体とＳＨ
基導入ゲロニンを混合してCentricon 10 (Amicon社）に
て４度Ｃで５０００rpm 、１時間遠心濃縮しておよそ
０．５mLにした後、４℃で一晩静置した。
【００９９】反応を終結させるため、ヨードアセトアミ
ド（ナカライテスク社）を反応液に終濃度０．５％にな
るように添加し、室温で３０分間穏やかに攪拌した。試
薬類と未反応のゲロニンを除去するため、反応液を４℃
で１２０００rpm 、１０分間遠心分離した上清をゲル濾
過カラムSuperdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech
社）で精製し、抗体とゲロニンの複合体を含むフラクシ
ョンを回収し、抗組織因子抗体とゲロニンとの複合体サ
ンプルとした。
ド（ナカライテスク社）を反応液に終濃度０．５％にな
るように添加し、室温で３０分間穏やかに攪拌した。試
薬類と未反応のゲロニンを除去するため、反応液を４℃
で１２０００rpm 、１０分間遠心分離した上清をゲル濾
過カラムSuperdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech
社）で精製し、抗体とゲロニンの複合体を含むフラクシ
ョンを回収し、抗組織因子抗体とゲロニンとの複合体サ
ンプルとした。
【０１００】実施例２．抗組織因子抗体とゲロニンとの
複合体（イムノトキシン）のヒト膀胱癌細胞Ｊ82に対す
る蛋白質合成阻害効果 抗組織因子抗体とゲロニンとの複合体とMOPC-31Cとゲロ
ニンとの複合体の各サンプルを、１０％ ＦＣＳ含有RP
MI−1640培地にて４００nMに調製して０．２２μｍの孔
径のフィルター（Millipore 社）により濾過滅菌した
後、各サンプルを１０倍希釈で３〜５段階希釈した溶液
を調製した。
複合体（イムノトキシン）のヒト膀胱癌細胞Ｊ82に対す
る蛋白質合成阻害効果 抗組織因子抗体とゲロニンとの複合体とMOPC-31Cとゲロ
ニンとの複合体の各サンプルを、１０％ ＦＣＳ含有RP
MI−1640培地にて４００nMに調製して０．２２μｍの孔
径のフィルター（Millipore 社）により濾過滅菌した
後、各サンプルを１０倍希釈で３〜５段階希釈した溶液
を調製した。
【０１０１】ヒト膀胱癌細胞Ｊ82を１０％ウシ胎児血清
(FCS) 含有RPMI−1640培地（Gibco社）に懸濁し、組織
培養用９６穴培養プレート（Corning 社）に１穴当たり
２×１０3 細胞（７５μＬ）播き、３７℃、５％ ＣＯ
2 の条件下で６時間培養した。抗体とゲロニンの複合体
サンプルの希釈液を９６穴培養プレート１穴当たりそれ
ぞれ２５μＬ添加した。サンプル添加後４８時間目に、
１０％ ＦＣＳ含有RPMI−1640培地を用いて１０倍希釈
した３−Ｈ−ロイシン（Amersham社、３７ MBq／mL，Ca
t No. TRK636) を９６穴培養プレートに１穴当たり１０
μＬ添加した。３７℃、５％ ＣＯ2 の条件下で更に２
０時間インキュベーションした後、培地を除去した。
(FCS) 含有RPMI−1640培地（Gibco社）に懸濁し、組織
培養用９６穴培養プレート（Corning 社）に１穴当たり
２×１０3 細胞（７５μＬ）播き、３７℃、５％ ＣＯ
2 の条件下で６時間培養した。抗体とゲロニンの複合体
サンプルの希釈液を９６穴培養プレート１穴当たりそれ
ぞれ２５μＬ添加した。サンプル添加後４８時間目に、
１０％ ＦＣＳ含有RPMI−1640培地を用いて１０倍希釈
した３−Ｈ−ロイシン（Amersham社、３７ MBq／mL，Ca
t No. TRK636) を９６穴培養プレートに１穴当たり１０
μＬ添加した。３７℃、５％ ＣＯ2 の条件下で更に２
０時間インキュベーションした後、培地を除去した。
【０１０２】Trypsin/EDTA (sigma 社、Cat No. T-404
9, lot No. 3387) を１穴当たり５０μＬ添加した。３
７℃、５％ ＣＯ2 の条件下で５分間インキュベーショ
ンした後、セルハーベスター（Micro96 HARVESTAR, SKA
TRON industries 社Type No. 1057)にて、細胞をガラス
フィルター（Printed Filter mat A, WALLAC社）に回収
した。取り込まれた３−Ｈ−ロイシン放射活性の測定
は、MicroBeta-1450 (WALLAC社、serial No. 4500162)
にて行った。コントロール（培地のみで測定）の値を１
００％として抗体−ゲロニン複合体の蛋白質合成阻害活
性を算出した。その結果を図１に示した。この結果、抗
ヒト組織因子抗体とゲロニン複合体は標的細胞特異的に
蛋白質合成阻害効果を示すことが明らかになった。
9, lot No. 3387) を１穴当たり５０μＬ添加した。３
７℃、５％ ＣＯ2 の条件下で５分間インキュベーショ
ンした後、セルハーベスター（Micro96 HARVESTAR, SKA
TRON industries 社Type No. 1057)にて、細胞をガラス
フィルター（Printed Filter mat A, WALLAC社）に回収
した。取り込まれた３−Ｈ−ロイシン放射活性の測定
は、MicroBeta-1450 (WALLAC社、serial No. 4500162)
にて行った。コントロール（培地のみで測定）の値を１
００％として抗体−ゲロニン複合体の蛋白質合成阻害活
性を算出した。その結果を図１に示した。この結果、抗
ヒト組織因子抗体とゲロニン複合体は標的細胞特異的に
蛋白質合成阻害効果を示すことが明らかになった。
【０１０３】実施例３．組織因子の血液凝固能の中和活
性を有する抗ヒト組織因子抗体および、中和活性を持た
ない抗ヒト組織因子抗体とゲロニンとの複合体（イムノ
トキシン）によるヒト膀胱癌細胞Ｊ82に対する殺細胞効
果 ヒト膀胱癌細胞Ｊ82を１０％ウシ胎児血清(FCS) 含有RP
MI−1640培地（Gibco社）に懸濁し、２．６７×１０4
細胞／mLに調製した細胞懸濁液を、組織培養用９６穴培
養プレート（Corning 社）に１穴当たり７５μＬ播き、
３７℃、５％ＣＯ2 の条件下で６時間培養した。
性を有する抗ヒト組織因子抗体および、中和活性を持た
ない抗ヒト組織因子抗体とゲロニンとの複合体（イムノ
トキシン）によるヒト膀胱癌細胞Ｊ82に対する殺細胞効
果 ヒト膀胱癌細胞Ｊ82を１０％ウシ胎児血清(FCS) 含有RP
MI−1640培地（Gibco社）に懸濁し、２．６７×１０4
細胞／mLに調製した細胞懸濁液を、組織培養用９６穴培
養プレート（Corning 社）に１穴当たり７５μＬ播き、
３７℃、５％ＣＯ2 の条件下で６時間培養した。
【０１０４】抗ヒト組織因子モノクローナル抗体ＡＴＲ
５から作製した抗ヒト組織因子抗体−ゲロニンとMOPC-3
1C−ゲロニンおよびゲロニンの各サンプルを、１０％
ＦＣＳ含有RPMI−1640培地にて調製して０．２２μｍの
孔径のフィルター（Millipore 社）により濾過滅菌した
溶液を調製した。各調製液を９６穴培養プレート１穴当
たり２５μＬ添加し、それぞれ終濃度を抗ヒト組織因子
抗体−ゲロニン複合体およびMOPC-31C−ゲロニン複合体
を１００nM、ゲロニンを１０microMとした。
５から作製した抗ヒト組織因子抗体−ゲロニンとMOPC-3
1C−ゲロニンおよびゲロニンの各サンプルを、１０％
ＦＣＳ含有RPMI−1640培地にて調製して０．２２μｍの
孔径のフィルター（Millipore 社）により濾過滅菌した
溶液を調製した。各調製液を９６穴培養プレート１穴当
たり２５μＬ添加し、それぞれ終濃度を抗ヒト組織因子
抗体−ゲロニン複合体およびMOPC-31C−ゲロニン複合体
を１００nM、ゲロニンを１０microMとした。
【０１０５】サンプルを添加して７１時間後にCell Tit
er 96 Aqueous One Solution Reagent (MTS 試薬、PROM
EGA 社）を１穴当たり２０μＬ添加した。３７℃、５％
ＣＯ2 条件下で１．５時間インキュベーションした後
に１０％ ＳＤＳ溶液を１穴当たり２５μＬ添加して反
応を止め、Microplate reader (Benchmark, Bio Rad
社）によりＯＤ４９０〜６２０nmを測定した。その結果
を図２に示した。この結果、抗ヒト組織因子モノクロー
ナル抗体−ゲロニン複合体は標的細胞に対して殺細胞効
果を示すことが明らかになった。
er 96 Aqueous One Solution Reagent (MTS 試薬、PROM
EGA 社）を１穴当たり２０μＬ添加した。３７℃、５％
ＣＯ2 条件下で１．５時間インキュベーションした後
に１０％ ＳＤＳ溶液を１穴当たり２５μＬ添加して反
応を止め、Microplate reader (Benchmark, Bio Rad
社）によりＯＤ４９０〜６２０nmを測定した。その結果
を図２に示した。この結果、抗ヒト組織因子モノクロー
ナル抗体−ゲロニン複合体は標的細胞に対して殺細胞効
果を示すことが明らかになった。
【０１０６】参考例．抗ＴＦモノクローナル抗体の作製 １．ヒトＴＦの精製 ヒト胎盤からのＴＦの精製は、Ｉｔｏらの方法（Ito,
T. らJ. Bioc hem. 114, 691-696, 1993)に準じて行っ
た。すなわち、ヒト胎盤を１０ｍＭ塩化ベンザミジン、
１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭジイ
ソプロピルフルオロフォスフェートおよび０．０２％ア
ジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ，
pH７．５）中でホモジナイズ後、沈殿を冷アセトンで脱
脂し、得られた脱脂粉末を２％ Triton X-100を含む上
記緩衝液に懸濁してＴＦを可溶化した。
T. らJ. Bioc hem. 114, 691-696, 1993)に準じて行っ
た。すなわち、ヒト胎盤を１０ｍＭ塩化ベンザミジン、
１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭジイ
ソプロピルフルオロフォスフェートおよび０．０２％ア
ジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ，
pH７．５）中でホモジナイズ後、沈殿を冷アセトンで脱
脂し、得られた脱脂粉末を２％ Triton X-100を含む上
記緩衝液に懸濁してＴＦを可溶化した。
【０１０７】この上清からConcanavalin A-Sepharose 4
B カラム（Pharmacia)および抗ＴＦ抗体を結合させたSe
pharose 4Bカラム（Pharmacia)を用いてアフィニティー
クロマトグラフィーを行い、精製ＴＦを得た。これを限
外濾過膜（PM-10, Amicon)で濃縮し、精製標品として４
℃で保存した。精製標品中のＴＦ含量は、市販の抗ＴＦ
モノクローナル抗体（American Diagnostica) とポリク
ローナル抗体（American Diagnostica) を組合せたSand
wich ELISAで、組換え型ＴＦを標準にして定量した。ま
た精製標品の純度は、４−２０％濃度勾配ポリアクリル
アミドゲルを用いてSDS-PAGEしたものを銀染色すること
で確認した。
B カラム（Pharmacia)および抗ＴＦ抗体を結合させたSe
pharose 4Bカラム（Pharmacia)を用いてアフィニティー
クロマトグラフィーを行い、精製ＴＦを得た。これを限
外濾過膜（PM-10, Amicon)で濃縮し、精製標品として４
℃で保存した。精製標品中のＴＦ含量は、市販の抗ＴＦ
モノクローナル抗体（American Diagnostica) とポリク
ローナル抗体（American Diagnostica) を組合せたSand
wich ELISAで、組換え型ＴＦを標準にして定量した。ま
た精製標品の純度は、４−２０％濃度勾配ポリアクリル
アミドゲルを用いてSDS-PAGEしたものを銀染色すること
で確認した。
【０１０８】２．免疫とハイブリドーマの作製 精製ヒトＴＦ（約７０mg／ml）を等用量のFreundの完全
アジュバント（Difco)と混合後、５週齢のBalb/c系雄性
マウス（日本チャールスリバー）の腹部皮下に、ＴＦと
して１０μｇ／マウスとなるように免疫した。１２，１
８及び２５日にはFreundの不完全アジュバントと混合し
たＴＦを５μｇ／マウスとなるように皮下に追加免疫
し、最終免疫として３２日にＰＢＳで希釈したＴＦ溶液
を５μｇ／マウスで腹腔内投与した。
アジュバント（Difco)と混合後、５週齢のBalb/c系雄性
マウス（日本チャールスリバー）の腹部皮下に、ＴＦと
して１０μｇ／マウスとなるように免疫した。１２，１
８及び２５日にはFreundの不完全アジュバントと混合し
たＴＦを５μｇ／マウスとなるように皮下に追加免疫
し、最終免疫として３２日にＰＢＳで希釈したＴＦ溶液
を５μｇ／マウスで腹腔内投与した。
【０１０９】最終免疫の３日後に４匹のマウスから脾細
胞を調製し、細胞数で１／５のマウスミエローマ細胞株
P3U1とポリエチレングリコール法を用いて融合させた。
融合細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むRPMI−1640培地
（以下RPMI−培地とする）(Lifetech oriental) に懸濁
し、９６穴プレートに１匹のマウスにつき４００穴（約
４００個／穴）播種した。融合後、１，２，３，５日目
に培地の半量をHAT(大日本製薬）およびcondimed H1 (B
oehringer Mannheim GmbH)を含むRPMI−培地（以下HAT
−培地とする）に交換することで、ハイブリドーマのＨ
ＡＴ選択を行った。
胞を調製し、細胞数で１／５のマウスミエローマ細胞株
P3U1とポリエチレングリコール法を用いて融合させた。
融合細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むRPMI−1640培地
（以下RPMI−培地とする）(Lifetech oriental) に懸濁
し、９６穴プレートに１匹のマウスにつき４００穴（約
４００個／穴）播種した。融合後、１，２，３，５日目
に培地の半量をHAT(大日本製薬）およびcondimed H1 (B
oehringer Mannheim GmbH)を含むRPMI−培地（以下HAT
−培地とする）に交換することで、ハイブリドーマのＨ
ＡＴ選択を行った。
【０１１０】下記のスクリーニング法で選択したハイブ
リドーマは２回の限界希釈を行うことでクローン化し
た。限界希釈は、９６穴プレート２枚に一穴あたり０．
８個の細胞を播種した。検鏡により単一コロニーである
ことが確認できた穴について、下記に示したＴＦ結合活
性とＴＦ中和活性の測定を行いクローンを選択した。得
られたクローンはＨＡＴ−培地からRPMI−培地に馴化
し、馴化による抗体産生能の低下が無いことを確認した
うえで、再度限界希釈を行い、完全なクローン化を行っ
た。以上の操作により、ＴＦ／ファクターVIIa複合体と
ファクターＸとの結合を強く阻害する抗体６種（ＡＴＲ
−２，３，４，５，７及び８）を産生するハイブリドー
マが樹立できた。
リドーマは２回の限界希釈を行うことでクローン化し
た。限界希釈は、９６穴プレート２枚に一穴あたり０．
８個の細胞を播種した。検鏡により単一コロニーである
ことが確認できた穴について、下記に示したＴＦ結合活
性とＴＦ中和活性の測定を行いクローンを選択した。得
られたクローンはＨＡＴ−培地からRPMI−培地に馴化
し、馴化による抗体産生能の低下が無いことを確認した
うえで、再度限界希釈を行い、完全なクローン化を行っ
た。以上の操作により、ＴＦ／ファクターVIIa複合体と
ファクターＸとの結合を強く阻害する抗体６種（ＡＴＲ
−２，３，４，５，７及び８）を産生するハイブリドー
マが樹立できた。
【０１１１】３．腹水の作製および抗体の精製 樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行
った。すなわち、in vitroで継代したハイブリドーマ１
０6 個を、あらかじめ鉱物油を２回腹腔内に投与してお
いたBalb/c系雄性マウスの腹腔内に移植した。移植後１
〜２週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体の精製は、Protein A カラム（日本ガイ
シ）を装着したConSepLC100 システム(Millipore) を用
いて行った。
った。すなわち、in vitroで継代したハイブリドーマ１
０6 個を、あらかじめ鉱物油を２回腹腔内に投与してお
いたBalb/c系雄性マウスの腹腔内に移植した。移植後１
〜２週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体の精製は、Protein A カラム（日本ガイ
シ）を装着したConSepLC100 システム(Millipore) を用
いて行った。
【０１１２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Complex of anti-tissue factor antibody <130> 994674 <160> 1 <210> 1 <211> 295 <212> PRT <213> Homosapiens <220> <223> Amino acid sequence of human tissue factor <400> 1 <400> 2 Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val -30 -25 -20 Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala -15 -10 -5 -1 Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln 20 25 30 Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175 Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val 180 185 190 Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205 Cys MET Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile 210 215 220 Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile 225 230 235 240 Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu 245 250 255 Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser 260
【図１】図１は、本発明の抗ヒト組織因子抗体−ゲロニ
ン複合体、及び対照としてのMOPC-31C抗体−ゲロニン複
合体の、ヒト膀胱癌由来細胞Ｊ82により 3Ｈ−ロイシン
の取り込みに対する抑制効果（タンパク質合成抑制効
果）を比較して示すグラフである。
ン複合体、及び対照としてのMOPC-31C抗体−ゲロニン複
合体の、ヒト膀胱癌由来細胞Ｊ82により 3Ｈ−ロイシン
の取り込みに対する抑制効果（タンパク質合成抑制効
果）を比較して示すグラフである。
【図２】図２は、抗ヒト組織因子抗体ゲロニンとの複合
体、並びに対照としてのMOPC-31Cとゲロニンとの複合体
及びゲロニン単独、によるＪ８２細胞に対する殺細胞効
果を比較したグラフである。
体、並びに対照としてのMOPC-31Cとゲロニンとの複合体
及びゲロニン単独、によるＪ８２細胞に対する殺細胞効
果を比較したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 14/745 ＺＮＡ 14/745 ＺＮＡ 16/36 16/36 19/00 19/00 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (72)発明者 川田 洋充 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社内 (72)発明者 長尾 俊介 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA05 4C084 AA14 AA17 MA24 NA14 ZB261 ZB262 ZC012 4C085 AA14 AA24 AA26 CC03 CC23 DD59 EE01 KA04 KA05 LL18 4H045 AA11 AA30 BA10 BA33 BA34 BA41 BA42 BA50 BA53 CA40 CA46 DA04 DA14 DA15 DA75 DA76 DA83 DA86 EA28 FA72 FA73 FA74 HA05 HA07
Claims (25)
- 【請求項１】 組織因子に対する抗体（抗組織因子抗
体）又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤とを
連結して成る複合体。 - 【請求項２】 組織因子に対する抗体又は抗原結合能を
有するその断片とトキシンとをリンカーにより連結して
成る複合体。 - 【請求項３】 組織因子に対する抗体又は抗原結合能を
有するその断片と血管新生阻害剤とを連結して成る複合
体。 - 【請求項４】 前記組織因子が配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の
複合体。 - 【請求項５】 前記抗組織因子抗体がモノクローナル抗
体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項６】 前記抗組織因子抗体が再構成ヒト抗体で
ある請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項７】 前記再構成ヒト抗体がヒト抗体である、
である請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項８】 前記抗組織因子抗体の抗原結合能を有す
る断片が、Fab, F(ab ′)2, scFv又はsc(Fv)2 である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項９】 前記化学療法剤が、抗腫瘍剤である、請
求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項１０】 前記抗腫瘍剤がメルファラン（Melpha
lan)、シスプラチン（Cis-platinum) 、カルボプラチン
(Carboplatin)、マイトマイシンＣ（Mitomycin C)、ア
ドリアマイシン（Adriamycin ; Doxorubicin) 、ダウノ
ルビシン（Daunorubicin) 、ブレオマイシン（Bleomyci
n)、ネオカルチノスタチン（Neocarzinostatin) 、メト
トレキセート（Methotrexate) 、５−フルオロウリジン
（5-Fluorouridine)、５−フルオロ−２′−デオキシウ
リジン（5-Fluoro-2′-deoxyuridine)、シトシンアラビ
ノシド（Cytosine arabinoside) 、アミノプテリン（Am
inopterin)、ビンクリスチン(Vincristine) 、パクリタ
キセル(Paclitaxel)、ドセタキセル(Docetaxel) 又はビ
ンデシン(Vindesine) である、請求項９に記載の複合
体。 - 【請求項１１】 前記化学療法剤が、サイトカインであ
る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項１２】 前記サイトカインが、インターロイキ
ン−２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）またはイン
ターフェロン（ＩＦＮ）である、請求項１１に記載の複
合体。 - 【請求項１３】 前記トキシンが、ジフテリアトキシン
Ａ鎖（Diphtheria toxin A chain) 、シュードモナスエ
ンドトキシン（Pseudomonas endotoxin)、リシンＡ鎖
（Ricin A chain)、無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated
ricin A chain) 、Ａ鎖（A chain)、ゲロニン（Geloni
n)、ポークウィード抗ウィルス蛋白（PAP-s ; Pokeweed
anti-viral protein from seeds) 、ブリオジン（Brio
din)、サポリン（Saporin)、モモルジン（Momordin) 、
モモルコキン（Momorcochin)、ジアンシン３２（Dianth
in 32)、ジアンシン３０（Dianthin 30)、モデッシン
（Modeccin) 、ビスカミン（Viscumin) 、ボルケシン
（Volkesin) 、ドデカンドリン（Dodecandrin)、トリチ
ン（Tritin）、ルフィン（Luffin) 又はトリコキリン
（Trichokirin)である、請求項２及び４〜８のいずれか
１項に記載の複合体。 - 【請求項１４】 抗組織因子抗体又は抗原結合能を有す
るその断片と化学療法剤とをリンカーにより連結して成
る請求項１及び４〜１２のいずれか１項に記載の複合
体。 - 【請求項１５】 化学療法剤を結合あるいは内封したリ
ポソーム、ミセル、あるいは多孔質ポリマーをリンカー
により連結した抗組織因子抗体又は抗原結合能を有する
その断片を含んで成る複合体。 - 【請求項１６】 血管新生阻害剤を結合あるいは内封し
たリポソーム、ミセル、あるいは多孔質ポリマーをリン
カーにより連結し抗組織因子抗体又は抗原結合能を有す
るその断片を含んで成る複合体。 - 【請求項１７】 トキシンを結合あるいは内封したリポ
ソーム、ミセル、あるいは多孔質ポリマーをリンカーに
より連結した抗組織因子抗体又は抗原結合能を有するそ
の断片を含んで成る複合体。 - 【請求項１８】 前記リンカーが、３−（２−ピリジル
ジチオール）プロピオニルヒドラジド、Ｎ−スクシニミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｌ
Ｃ−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート、スルホ−ＬＣ−スクシニミジル ３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシニミジ
ル ３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート、スクシニ
ミジルオキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）
トルエン、ＬＣ−スクシニミジルオキシカルボニル−α
−（２−ピリジルジチオ）トルエン、スルホ−ＬＣ−ス
クシニミジルオキシカルボニル−α−（２−ピリジルジ
チオ）トルエン、スクシニミジル−４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート、スルホ−スクシニミジル ４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシスクシニミドエステ
ル、スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロ
キシスクシニミドエステル、Ｓ−アセチルメルカプトス
クシニックアンヒドライド、ジメチル ３，３−ジチオ
ビスプロリオニミデート又は２−イミノチオレーンであ
る、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項１９】 前記リンカーがペプチド、カルボキシ
メチルデキストラン（ＣＭ）、アジビン・ビオチン、ポ
リエチレングリコール(PEG) 、デキストラン、アミノデ
キストラン、シス・アコニット酸、グルタミン酸ジヒド
ラジド、又はヒト血清アルブミン(HSA) である、請求項
２〜１７のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項２０】 抗組織因子抗体又は抗原結合能を有す
るその断片と化学療法剤とを中間支持体により連結して
成る請求項１，４〜１２のいずれか１項に記載の複合
体。 - 【請求項２１】 抗組織因子抗体又は抗原結合能を有す
るその断片とトキシンとを中間支持体により連結して成
る請求項２〜８，１３及び１５〜１７のいずれか１項に
記載の複合体。 - 【請求項２２】 前記中間支持体がペプチド、カルボキ
シメチルデキストラン（ＣＭ）、アビジン・ビオチン、
ポリエチレングリコール(PEG) 、デキストラン、アミノ
デキストラン、又はヒト血清アルブミン(HAS) である、
請求項２０又は２１に記載の複合体。 - 【請求項２３】 請求項１〜２２のいずれか１項に記載
の複合体を含んで成る医薬組成物。 - 【請求項２４】 抗腫瘍作用を有する請求項２３に記載
の医薬組成物。 - 【請求項２５】 請求項１〜２３のいずれか１項に記載
の複合体を含んで成る診断用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000022898A JP2001213804A (ja) | 2000-01-31 | 2000-01-31 | 抗組織因子抗体の複合体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001213804A true JP2001213804A (ja) | 2001-08-07 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2001213804A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US7425328B2 (en) | 2003-04-22 | 2008-09-16 | Purdue Pharma L.P. | Tissue factor antibodies and uses thereof |
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