MX2008011287A

MX2008011287A - Regeneracion y reparacion de tejido oral.

Info

Publication number: MX2008011287A
Application number: MX2008011287A
Authority: MX
Inventors: Dario C Eklund
Original assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-03-05
Publication date: 2008-11-14
Also published as: WO2007103865A3; CA2644489A1; EP1998787A4; AU2007223276A1; US20090130068A1; RU2498808C2; RU2498808C9; EP1998787A2; CN101489395A; US9782515B2; AU2007223276B2; RU2008138596A; WO2007103865A2; CA2644489C; JP2009528856A; US20180214606A1

Abstract

Se describe un método para tratar una condición oral de un sujeto injertando construcciones de tejido cultivado al tejido oral. Las construcciones de tejido cultivado comprenden células cultivadas y componentes de matriz extracelular endógenamente producidos sin el requerimiento de componentes de matriz exógena o soporte de red o miembros de andamio. Algunas construcciones de tejido de la invención están compuestas de múltiples capas de células o más de un tipo de célula. Las construcciones de tejido de la invención tienen características morfológicas y funciones similares a tejidos de los que se derivan sus células y su resistencia los hace fácilmente manejables. Las construcciones de tejido cultivado preferidas de la invención comprenden células derivadas de tejido humano.

Description

REG ENERACION Y REPARACION DE TEJ I DO ORAL CAM PO DE LA I NVENCION La invención está en el campo de ingeniería de tejido, en particular para el uso de una construcción de tej ido cultivado para regeneración y reparación de tejido oral .

ANTEC EDENTES DE LA I NVENCION El campo de ingeniería de tejido combi na métodos de bioi ngeniería con los principios de ciencias de la vida para entender las relaciones estructurales y funcionales en tejidos de mam ífero normales y patológicos. El objetivo de la i ngeniería de tejido es el desarrollo y aplicación final de substitutos biológicos para restaurar, mantener o mejorar las uniones de tejido. De esta manera , a través de la ingeniería de tejido, es posible diseñar y fabricar un tejido de biodiseñado en un laboratorio. Los tej idos biodiseñados pueden incluir células que usualmente están asociadas con un tej ido humano o mam ífero natural andamios de matriz sintética o exógena . El nuevo tejido biod iseñado debe ser funcional cua ndo se i njerta sobre un huésped y será incorporado permanentemente dentro del cuerpo de huésped o bi-remodelado progresivamente por células del paciente huésped receptor. La fabricación de un tejido equivalente sin un miembro de soporte o andamio conduce a retos científicos para crear el nuevo tejido biodiseñado. La mayoría de los procedimientos de i njerto de tejido suave oral se hacen usado tejido autólogo a partir del paladar. Aunque esto pudiera trabajar muy bien en algunos de los procedimientos, tiene la desventaja de requerir la creación de un "sitio donador que puede ser bastante doloroso para los pacientes. Ese sitio donador adicional también proporciona tejido limitado, significando que solo pocos dientes pueden ser tratados a la vez. Esto puede resultar en la necesidad de múltiples cirugías o que el dentista solo trate los "peores dientes" aún cuando pueda haber varios dejads sin tratar que también podrían beneficiarse de un procedimiento de injerto.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se dirige a métodos para tratar una condición oral de un sujeto al injertar una construcción de tejido cultivado al tejido oral del sujeto. Las construcciones de tejido cultivado de la invención comprenden células cultivadas y componentes de matriz extracelular producida endógenamente sin el requerimiento de componentes de matriz exógena o soporte de red o miembros de andamio. De esta manera, la invención puede hacerse de manera ventajosa completamente a partir de células humanas, y componentes de matriz humana producidos por esas células para uso en humanos. El injerto de construcciones de tejido cultivado comprende fibroblastos que producen componentes de matriz extracelular sin la adición de ya sea componentes de matriz exógena, soporte de red o miembros de andamio.

Las construcciones de tejido cutivado comprenden fibroblastos que producen componentes de matriz extracelular en un sistema de medio definido y/o sin el uso de componentes biológicos no derivados de humanos o no definidos, tales como, extractos de órgano o suero bovino. Adicionalmente, las construcciones de tejido cultivado pueden hacerse mediante sembrado serial de células de diferentes tipos, los cuales producen una construcción de tejido cultivado que imita la composición celular y estructuras de tejido de tejidos naturales. De manera específica, esta construcción de tejido cultivado comprende al menos una capa de células epiteliales aplicadas sobre una capa de células de fibroblastos cultivadas. Todavía de manera adicional, la construcción de tejido es producida y auto-ensamblada por células cultivadas sin la necesidad de soporte de andamio o la adición de componentes de matriz extracelular exógena. El injerto de construcciones de tejido cultivado de esta invención también comprende una mezcla de gel de una solución de colágeno con un agente contráctil. Adicionalmente, los injertos de construcción de tejido cultivado comprenden una capa de gel de colágeno comprendiendo colágeno con un agente contráctil dispuesto sobre una capa de un gel de colágeno acelular. Todavía en otra modalidad de la presente invención, las células epiteliales son adicionadas a la capa comprendiendo el gel de colágeno y el agente contráctil.

Las características de fuerza de las construcciones de tejido las hacen manejables para que sean removidas de manera fácil y pelable del aparato de cultivo en el cual son formadas y directamente transplantadas sin la necesidad de algún soporte o portador en aplicaciones cl ínicas o de prueba. Las construcciones de tejido de la invención son indicadas para el tratamiento de pacientes con afecciones de tejido oral , tales como encía oral en retroceso, pérdida de papilas interdentales, deficiencia alveolar, implante oral en falla , defectos de bifurcación dental y pacientes en necesidad de reconstrucción de tejido siguiendo resecciones de tumores maxilofaciales.

DESCRI PCION DE LAS FIG U RAS La Figura 1 es una gráfica que muestra el i ncremento en concentración de colágeno como es determinado por el ensayo de hidroxi prol ina según se compara con el n úmero de células en la construcción dérmica derivada de prepucio neonatal humano descrita en el Ejemplo 1 . La FIG. 2 es una gráfica de datos que ilustra la contracción con cél ulas de fi broblasto de un látex de colágeno hidratado; La FIG . 3 es una gráfica de datos que il ustra la contracción con cél ulas de fibroblasto de látex de colágeno hidratado teniendo diferentes contenidos de colágeno; La FIG. 4 es una gráfica de datos que il ustran la contracción con células de fibroblasto de látex de colágeno h idratado conteniendo diferentes números de células de fibroblasto; La FIG. 5 es una gráfica de datos indicando la capacidad contrácil de células de fibroblasto en látex de colágeno hidratado empleando céljlas de diferentes niveles de duplicación de población; La FIG. 6 es una gráfica de datos que ilustra el efecto de 10.0 .mu.g/ml de la citocalasina B en la capacidad de células de fibroblasto para contraer un látex de colágeno hidratado; La FIG. 7 es una gráfica de datos que ilustra el efecto de 0.36 .mu.g/ml del inhibidor colcemid sobre la capacidad de células de fibroblasto para contraer un látex de colágeno hidratado; La FIG. 8 es una gráfica de datos que ilustra el efecto de citosina arabinósido en la capacidad de células de fibroblasto para contraer un látex de colágeno hidratado. La FIG. 9 es una gráfica que ilustra el efecto de trombina en la contracción mediante plaquetas de látex de colágeno a una concentración de trombina de 4.0 unidades/ml; La FIG. 10 es una gráfica que ilustra la contracción de látex de colágeno como una función de una concentración de plaquetas y la presencia de trombina a una concentración de 4.0 unidades/ml; Las FIGS. 1 1 A-1 1 D son gráficas que ilustran la contracción de látex de látex de colágeno como una función del tipo y concentración de colágeno empleado; y La FIG . 12 es una gráfica que ilustra los efectos de los inhibidores citocalasina B y colcemid en la concentración de látex de colágeno hidratado por plaquetas. La FIG. 13 es una vista isométrica, parcialmente separada, de un aparato de acuerdo con la presente invención. La FIG. 14 es una vista isométrica esquemática del aparato mostrado en la FIG. 1 3. La FIG . 1 5 es cortada a lo largo de 3-3 a través del aparato mostrado en la FIG. 13. La FIG. 16 es una vista isométrica, parcialmente separada, de otro aparato de acuerdo con la presente invención. La FIG. 1 7 es una vista esquemática desde arriba del aparato mostrado en la FIG. 16. La FIG. 18 es una sección esquemática a lo largo de 6-6 a través del aparato mostrado en la FIG. 16.

DESCRI PCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención se dirige a métodos para tratar una condición oral de un sujeto al injertar una construcción de tejido cultivado. Se debería notar que "construcción de tejido cultivado", "tejido vivo diseñado", "construcción de célula-matriz", "capa de célula-matriz", "equivalente de piel", "tejido vivo" y "tejido conector vivo", puede ser usado intercambiablemente como modalidades de las construcciones de tejido cultivado de la presente invención. Hasta ahora, las construcciones de tejido vivo diseñado actuales no son completamente ensamblados de célula y deben depender de ya sea la adición o incorporación de componentes de matriz exógena o miembros sintéticos para estructura o soporte, o ambos. Las construcciones de tejido biodiseñadas descritas en la presente exhiben muchas de las características naturales del tejido a partir del cual sus células son derivadas. Las construcciones de tejido asi producidas pueden ser usadas para tratar una condición oral de un paciente. Una modalidad preferida es una construcción de célula-matriz comprendiendo un primer tipo de célula y matriz extracelular producida endógenamente, en donde el primer tipo de célula es capaz de sintetizar y secretar matriz extracelular para producir la construcción de célula-matriz. Otra modalidad preferida es una construcción de bicapa comprendiendo un primer tipo de célula y matriz extraceluar producida endógenamente y una capa de células de un segundo tipo dispuesto sobre ella o dentro de la construcción de célula-matriz formada por el primer tipo de célula. Una modalidad más preferida es una construcción de célula-matriz comprendiendo fibroblastos, tales como aquéllos derivados de dermis, para formar una construcción dérmica cultivada. Otra modalidad más preferida es una construcción de célula-matriz comprendiendo fibroblastos, tales como aquéllos derivados de dermis, para formar una construcción dérmica cultivada con una capa de queratinocitos cultivados sobre ella para formar una capa epidérmica para resultar en una construcción de piel de bicapa cultivada. Las construcciones de piel cultivada de la invención expresan muchas características físicas, morfológicas y bioquímicas de piel natural. En una modalidad aún más preferida, la construcción de célula- matriz es una construcción de tejido que es similar a la capa dérmica de la piel, una construcción dérmica humana, que es formada en un sistema definido comprendiendo células derivadas de humano que no utiliza componentes químicamente indefinidos durante su cultivo. En la modalidad más preferida, las construcciones de tejido de la invención son fabricadas en un sistema químicamente definido comprendiendo células derivadas de humano sino componentes biológicos no humanos o químicamente no definidos o células. En otra modalidad de esta invención, las construcciones de tejido cultivado comprenden una mezcla de gel comprendiendo una solución de colágeno y un agente contráctil . En la modalidad preferida de la invención, las construcciones de tejido cultivado comprenden una primera capa comprendiendo un gel de colágeno acelular y una segunda capa dispuesta en la primera capa, en donde la segunda capa comprende un segundo gel de colágeno conteniendo colágeno y un agente contráctil. En una modalidad aún más preferida de la invención, la segunda capa de colágeno con un agente contráctil es sembrada con células de queratinocitos.

A: Aplicaciones para las construcciones de tejido cultivado La construcción de tejido de cultivo de la invención puede aplicarse para tratar condiciones orales, tales como, encía oral en retroceso, pérdida de papilas interdentales, deficiencia de reborde alveolar, consecuencias de un implante oral fallido o de recesión de tumor maxilofacial.

Generalmente se acuerda que una zona funcional de encía unida alrededor de cada diente es necesaria para la salud. En la ausencia de este tejido, la recesión de encía frecuentemente ocurre, resultando en la pérdida de una porción de la placa cortical creando un peor pronóstico para el diente. Además, la mucosa facial para los dientes sin una zona funcional de encía unida es frecuentemente encontrada inflamada a pesar el buen cuidado casero del sujeto. Esta inflamación tiene el potencial de provocar pérdida de hueso alrededor del diente. Desde fines de la década de 1 960, este tipo de problema ha sido corregido de manera rutinaria mediante un injerto autógeno libre. La mucosa es removida facial al diente en cuestión y tejido queratinizado es recolectado del paladar y suturado al lecho de injerto. Inicialmente, el injerto es soportado mediante una circulación plasmática y posteriormente es revascularizado desde el lecho circundante. El éxito de este tipo de injerto llega casi al 100%. Sin embargo, existe un fuerte deseo por la mayoría de los sujetos para tratar de identificar un material donador que pudiera ser usado en lugar del tejido del paladar. Esto, por supuesto, reduciría el número de sitios quirúrgicos necesarios para este procedimiento a la mitad. Una variedad de materiales donadores substitutos han sido usados con los años. Piel de cadáver secada por congelación ha sido usada en el pasado y recientemente un injerto dérmico aceluar ha sido usado como un material donador. Aunque extremadamente remoto, el riesgo de infección potencial asocido con estos tipos de materiales dérmicos (principalmente AI DS y hepatitis) sirve como un freno relativo para su uso. Además de eso, el resultado estético final de injertos que utilizan este material donador es usualmente menor que el ideal.

B. Construcciones de tejido de cultivo comprendiendo una capa estructural de al menos un tipo de células productoras de capa extracelular con matriz extracelular producida endógenamente Una modalidad preferida de la invención comprende una capa estructural de al menos un tipo de células productoras de matriz extracelular y componentes de matriz extracelular producida endógenamente, más simplemente llamada "matriz", en donde la matriz es sintetizada completamente por células y ensamblada al cultivar las células. Esta capa es llamada en la presente una "construcción de célula-matriz" o una "capa de célula-matriz" debido a que las células se secretan y contienen a ellas mismas dentro y a tavés de su matriz. Como se describe en la solicitud de paente estadounidense copendiente serial no. 09/523,809, presentada el 03/03/200, incorporada en la presente por referencia en su totalidad, las construcciones de tejido cultivado no requieren, así no incluyen, componentes de matriz exógena, esto es, componentes de matriz no producidos por las células cultivadas pero introducidas por otros medios. En una modalidad más preferida, la construcción de célula-matriz producida por fibroblastos dérmicos es mostrada para tener una concentración predominante de colágeno similar a piel natural. Como es evidenciado por microscopía electrónica, la matriz es fibrosa por naturaleza comprendiend colágeno que exhibe el parón de bandas de 67 nm de cuarta etapa, así como organización de empaque de fibrillas o haces de fibrillas similares a colágeno natural. SDS-PAGE de reducción retardada ha detectado la presencia tanto de colágeno tipo I como tipo I II en estas construcciones, los tipos de colágeno proedominantes encontrados en piel humana natural. Usando técnicas de inmunohistoquímica estándar (IHC) , la construcción de célula-matriz dérmica mancha positivamente para decorina, un proteoglicano de sulfato de dermatano conocido por estar asociado con fibrillas de colágeno y se cree que reguan el diámetro de fibrilla in vivo. La decorina también puede ser visualizada en la construcción con TEM. El tejido producido también mancha positivo para tenascina, una glicoproteína de matriz extracelular encontrada, por ejemplo, en mesénquima o tejidos bajo reparación. Mucho como el tejido bajo reparación in vivo, el tejido producido en cultivo ha mostrado aumentar su proporción de colágeno tipo I a tipo I I I conforme se forma la matriz. Aunque no se desea ligar a una teoría, se cree que las células llenan el espacio abierto entre ellas rápidamente con una matriz suelta análoga al tejido de granulación comprendido por la mayoría de colágeno tipo I I I y fibronectina, y entonces remodelan esta matriz suelta con una matriz más densa comprendida pricipalmente de colágeno tipo I . La célula-matriz producida ha mostrado contener glicosaminoglicanos (GAG), tal como ácido hialurónico (HA); fibronectina; proteoglicanos además de decorina, tal com biglicano y versicano; y, un perfil de glicosaminoglicanos sulfatados, tales como, ácido di-hialurónico; di-condroitin-O-sulfato; di-condroitin-4-sulfato; di-condroitin-6-sulfato; di-condroitin-4,6-sulfato; di-condroitin-4-sulfato-UA-2S ; y di-condroitin-6- sulfato-UA-2S. Estas características estructurales y bioquímicas se exhiben a sí mismas conforme la construcción se desarrolla en cultivo y son evidentes distintivamente cuando la construcción se aproxima a su forma final. La presencia de estos componentes en construcción de célula-matriz dérmica cultivada completamente formada indica que la construcción tiene características estructurales y bioquímicas que se aproximan a aquélla de dermis normal. Aunque la lista antes mencionada es una lista de características bioquímicas y estructurales de una construcción de célula-matriz cultivada formada a partir de fibroblastos dérmicos, se debería reconocer que las construcciones de célula-matriz cultivada formadas a partir de otros tipos de fibroblastos producirá muchas de estas características y otras fenotípicas para tipo de tejido a partir del cual son originadas. En algunos casos, los fibroblastos pueden ser inducidos para expresar componentes no fenotípicos ya sea por exposición química o contacto, tensiones físicas o por medios transgénicos. Otra modalidad preferida de la invención es una capa de célula-matriz teniendo una segunda capa de células dispuestas en ella. La segunda capa de células es cultivada en la capa de célula-matriz para formar una construcción detejido bicapa biodiseñada. En una modalidad más preferida, las células de la segunda son de origen epitelial. En la modalidad más preferida, la segunda capa comprende queratinocitos humanos cultivados que junto con una primera capa de célula-matriz, una construcción de célula-matriz formada a partir de fibroblastos dérmicos y matriz endógena para formar una capa dérmica, comprenden una construcción de piel viva. Cuando se forma completamente, la capa epidérmica es una capa de múltiples capas, estratificada y bien diferenciada de queratinocitos que exhiben una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo. La construcción de piel tiene una membrana de basamento bien desarrollada presente en la unión dérmica-epidérmica como se exhibe mediante microscopía de transmisión de electrones (TEM). La membrana de basamento parece más gruesa alrededor de hemidesmosomas, marcados por fibrillas de anclaje que están comprendidas por colágeno tipo VI I , como es visualizado por TEM. Las fibrillas de anclaje pueden verse que salen de la membrana de basamento atrapa las fibrillas de colágeno en la capa dérmica. Estas fibrillas de anclaje, así como otros componentes de membrana de basamento, son secretadas por queratinocitos. También es sabido que aunque los queratinocitos son capaces de secretar componentes de membrana de basamento por sí mismo, una membrana de basamento reconocible no formará en la ausencia de fibroblastos. El manchado inmunohistoquímico de la construcción de piel de la presente inveción también ha mostrado que está presente laminina, una proteína de membrana de basamento. En un método preferido de la invención para formar una construcción de célula-matriz, un primer tipo de célula, un tipo de célula productor de matriz extacelular, se siembra a un substrato, se cultiva e induce para sintetizar y secretar una matriz extracelular organizada alrededor de ellas para formar una construcción de célula-matriz. En otro método preferido de la invención, una superficie de la construcción de célula-matriz es sembrada con células de un segundo tipo de célula y se cultivan para formar una construcción de tejido bicapa. En un método más preferido, una construcción de piel de espesor completo teniendo características similares a piel humana natural es formada al cultivar fibroblastos, tales como fibroblastos dérmicos humanos, bajo condiciones suficientes para inducir la síntesis de matriz para formar una célula-matriz de células dérmicas y matriz, una capa dérmica, sobre la cual las células epiteliales humanas, tales como queratinocitos, se siembran y cultivan bajo condiciones suficientes para formar una capa epidérmica estratificada completamente diferenciada. Por lo tanto, un método para obtener las construcciones de tejido cultivado de la presente invención comprende: (a) cultivar al menos un tipo de célula productor de matriz extracelular en la ausencia de componentes de matriz extracelular exógena o un miembro de soporte estructural; y (b) estimular las células de paso (a) para sintetizar, secretar y organizar componentes de matriz extracelular para formar una construcción de tejido comprendida por células y matriz sintetizada por esas células; en donde los pasos (a) y (b) pueden hacerse de manera simultánea o consecutiva. Para forma una construcción de tejido cultivado bicapa comprendiendo una construcción de célula-matriz y una segunda capa celular sobre ella, el método comprende adicionalmente el paso de: (c) cultivar células de un segundo tipo sobre una superficie de la construcción detejido formada para producir ua construcción de tejido bicapa. Un tipo de célula productora de matriz extracelular para usarse en la invención puede ser cualqier tipo de célula capaz de producir y secretar componentes de matriz extracelular y organizar los componentes de matriz extracelular para formar una construcción de célula-matriz. Más de un tipo de célula productora de matriz extracelular puede cultivarse para formar una construcción de célula-matriz. Células de diferentes tipos de célula u orígenes de tejido pueden cultivarse junto como una mezcla para producir componentes complementarios y estructuras similares a aquéllos encontrados en tejidos naturales. Por ejemplo, el tipo de célula productora de matriz extracelular puede tener otros tipos de células mezclados con él para producir una cantidad de matriz extracelular que no es producida normalmente por el primer tipo de célula. De manera alternativa, el tipo de célula productora de matriz extracelular también puede mezclarse con otros tipos de célula que forman estructuras de tejido especializadas en el tejido pero no contribuyen substancialmente a la formación global del aspecto de matriz de la construcción de célula-matriz, tal como en ciertas construcciones de piel de la invención. Aunque cualquier tipo de célula productora de matriz extracelular puede usarse de acuerdo con esta invención, los tipos de célula preferidos para usarse en esta invención son derivados de mesénquima. Tipos de célula más preferidos son fibroblastos, células estromales y otras células de tejido conectivo de soporte, muy preferiblemente fibroblastos dérmicos humanos encontrados en dermis humana para la producción de una construcción dérmica humana. Las células de fibroblasto, en general, producen una variedd de proteínas de matriz extracelular, principalmente colágeno. Existen varios tipos de colágenos producidos por fibroblastos, sin embargo, el colágeno tipo I es el más frecuente in vivo. Las cepas de células de fibroblastos humanos pueden derivarse de una variedad de fuentes, incluyendo pero no limitando a prepucio masculino de neonato, dermis, tendón , pulmón, cordones umbilicales, cartílago, uretra, estroma córneo, mucosa oral e intestino. Las células humanas pueden incluir pero no necesitan limitarse a fibroblastos, pero pueden incluir: células de músculo suave, condrocitos y otras célula de tejido conectivo de origen mesenquimal. Se prefiere, pero no se requiere, que el origen de la célula productora de matriz usada en la producción de una construcción de tejido sea derivado de un tipo de tejido que se asemeja o imita después de emplear los métodos de cultivo de la invención. Por ejemplo, en la modalidad donde una construcción de piel es producida, la célula productora de matriz preferida es un fibroblasto, de preferencia de origen dérmico. En otra modalidad preferida, los fibroblastos aislados mediante microdisección de las papilas dérmicas de folículos pilosos pueden usarse para producir la matriz sola o en asociación con otros fiboblastos. En la modalidad donde se produce una construcción de córnea, la célula productora de matriz es derivada de estroma córneal. Los donadores de células pueden variar en desarrollo y edad. Las células pueden ser derivadas de tejidos donadores de embriones, neonatos o individuos más grandes incluyendo adultos. Las células progenitoras embriónicas, tales como células madre mesenquimales pueden usarse en la invención e inducidas para diferenciar par desarrollarse en el tejido deseado. Aunque se prefieren células humanas para usarse en la invención, las células a ser usadas en el método no están limitadas a células de fuentes humanas. Las células de otras especies mamíferas incluyendo, pero no limitantes a, fuentes equinas, caninas, porcinas, bovinas y ovinas; o especies de roedores, tales como, ratón o rata. Además, las células que son células recombinantes o transfectadas de manera espontánea, química o viral o células genéticamente diseñadas también pueden usarse en esta invención. Para esas modalidades que incorporan más de un tipo celular, las mezclas quiméricas de células normales de dos o más fuentes; mezclas de células transfectadas o modificadas genéticamente y normales; o mezclas de células de dos o más fuentes de tejido o especie pueden usarse. Las células recombinantes o genéticamente diseñadas pueden usarse en la producción de la construcción de célula-matriz para crear una construcción de tejido que actúa como un injerto de entrega de medicamento para un paciente que necesita niveles incrementados de productos de células naturales o tratamiento con un terapéutico. Las células pueden producir y entregar al paciente vía los productos de células recombinantes de injerto, factores de crecimiento, hormonas, péptidos o proteínas durante una cantidad continua de tiempo o según sea necesario cuando se señala biológica, química o térmicamente debido a las condiciones presentes en el paciente. Es deseable una expresión de producto de gene de plazo largo o corto, dependiendo del uso de indicación de la construcción de tejido cultivado. La expresión de largo plazo es deseable cuando la construcción de tejido cultivada es implantada para entregar productos terapéuticos a un paciente durante un periodo prolongado. De manera contraria, se desea la expresión a corto plazo en casos donde la construcción de tejido cultivado es injertada a un paciente teniendo una herida, donde las células de la construcción de tejido cultivado son para promover la curación normal o casi-normal o para reducir la cicatrización del sitio herido. Una vez que la herida ha sanado, los productos de gene de la construcción de tejido cultivado ya no son necesarios o pueden ya no ser deseados en el sitio. Las células también pueden ser genéticamente diseñadas para expresar proteínas o diferentes tipos de componentes de matriz extracelular, los cuales son ya sea "normales" pero expresados a altos niveles o modificados en alguna manera para hacer un dispositivo de injerto comprendiendo matriz extracelular y células vivas que es terapéuticamente ventajoso para curación de heridas mejorada, neovascularización facilitada o dirigida o formación de cicatriz o queloide minimizada. Estos procedimientos son conocidos de manera general en la técnica y son descritos en Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación molecular, un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), incorporado en la presente por referencia. Todos los tipos de células antes mencionados son incluidos dentro de la definición de una "célula productora de matriz" como se usa en esta invención. El componente de matriz extracelular mayor predominante producido por fibroblastos es colágeno fibrilar, en particular colágeno tipo I . El colágeno fibrilar es un componente clave en la estructura de célula-matriz; sin embargo, esta invención no será limitada a las matrices comprendidas por solo esta proteína o tipo de proteína. Por ejemplo, otros colágenos, tanto colágeno fibrilar como no fibrilar de la familia de colágeno, tales como colágeno tipos I I , I I I , IV, V, VI , VI I , VII I , IX, X, XI , XI I , XI I I , XIV, XV, XVI , VXI I , XVI I I , XIX, pueden producirse mediante el uso del tipo celular apropiado. De manera similar, otras proteínas de matriz, las cuales pueden ser producidas y depositadas usando el método actual incluyen, pero no están limitadas a elastina; proteglicanos, tales como decorina o biglicano; o glicoproteínas, tal como tenascina; vitronectina; fibronectina; laminina, trombospondina I y glicosaminoglicanos (GAG), tal como ácido hialurónico (HA). La célula productora de matriz es cultivada en un recipiente adecuado para cultivo de tejido o célula animal, tal como una placa, matraz o botella de rodillo de cultivo, lo cual permite la formación de una estructura similar a tejido tridimensional . Las superficies de crecimiento celular adecuadas sobre las cuales las células pueden cultivarse pueden ser cualquier material biológicamente compatible al cual las células pueden adherirse y proporcionar un medio de anclaje para la construcción de célula-matriz a formar. Los materiales tales como, vidrio, acero inoxidable; polímeros, incluyendo policarbonato, poliestireno, cloruro de polivinilo, polivinilideno, polidimetilsiloxano, fluoropolímeros y etileno propilen fluorado; y substrato de silicio, incluyendo sílice fusionado, polisilicio o cristales de silicio pueden usarse como una superficie de crecimiento celular. El material de superficie de crecimiento celular puede ser tratado o modificado químicamente, cargado electrostáticamente o recubierto con biológicos, tais como, poli-l-lisina o péptidos. Un ejemplo de un recubrimiento de péptido es péptido RGD. Aunque la construcción de tejido de la invención puede cultivarse en una superficie de crecimiento célular sólida, se prefiere una superficie de crecimiento celular con poros que comunican tanto las superficies superior como inferior de la membrana para permitir el contacto bilateral delmedio a la construcción de tejido en desarrollo o para contacto de solo por abajo del cultivo. El contacto bilateral permite al medio contactar tanto las superficies superior como inferior de la construcción en desarrollo para máxima exposición de área de superficie a los nutrientes contenidos en el medio. El medio también puede contactar solo el fondo de la construcción de tejido cultivado en formación, de manera que la superficie superior puede estar expuesta al aire, como en el desarrollo de una construcción de piel cultivada. El recipiente de cultivo preferido es uno que utilice una inserción portadora, un miembro permeable tratado con cultivo, tal como una membrana porosa que es suspendida en el medio conteniendo recipiente cultivado. Normalmente, la membrana es asegurada a un extremo del miembro tubular o marco de trabajo que es insertado dentro de interfases con una base, tal como una placa petri o de cultivo que puede ser cubierta con una tapa. Los recipientes de cultivo que incorporan una inserción portadora con una membrana porosa son conocidos en la técnica y son preferidos para realizar la invención y son descritos en una variedad de patentes estadounidenses en el campo, algunos de los cuales se han hecho comercialmente disponibles, incluyendo por ejemplo: 5,766,937, 5,466,602, 5,366,893, 5,358,871 , 5,21 5,920, 5,026,649, 4,871 ,674, 4,608, 342, cuyas descripciones se incorporan en la presente. Cuando estos tipos de recipientes de cultivo son empleados, la construcción de tejido es producida en una superficie de la membrana, de preferencia la superficie superior, que mira hacia arriba y el cultivo es contacto por medio celular en ambas superficies superior e inferior. Los poros en la superficie de crecimiento permiten el paso de medio de cultivo para proporcionar nutrientes al lado inferior del cultivo a través de la membrana, permitiendo así las células a ser alimentadas de manera bilateral o única desde el lado inferior. Un tamaño de poro preferido es uno que es suficientemente pequeño que no permite el crecimiento de células a través de la membrana, todavía suficientemente grande para permitir el paso libre de nutrientes contenidos en medio de cultivo a la superficie inferior de la construcción de célula-matriz, tal como mediante acción capilar. Los tamaños de poro preferidos son aproximadamente menores que 3 mieras, pero varían entre aproximadamente 0.1 mieras hasta aproximadamente 3 mieras, más preferiblemente entre aproximadamente 0.2 mieras hasta aproximadamente 1 miera y muy preferiblemente aproximadamente 0.4 mieras hasta aproximadamente 0.6 mieras de tamaños de poro son empleados. En el caso de fibroblastos dérmicos humanos, el material más preferido es policarbonato teniendo un tamaño de poro entre aproximadamente 0.4 hasta aproximadamente 0.6 mieras. El tamaño de poro máximo depende no solamente del tamaño de la célula sino también de la capacidad de la célula para alterar su forma y pasar a través de la membrana. Es importante que la construcción similar a tejido se adhiera a la superficie, pero no incorpore o envuelva el substrato de manera que sea removible de ella, tal como mediante pelado con fuerza mínima. El tamaño y forma de la construcción de tejido formada es dictado por el tamaño de la superficie de recipiente o membrana sobre la cual crece. Los substratos pueden ser redondos o angulares o configurados con ángulos de esquinas redondeadas, o con forma irregular. Los substratos también pueden ser planos o contorneados como un molde para producir una construcción configurada para tener zona interfacial con una herida o imitar la estructura física de tejido natural . Para responder a áreas de superficie mayores del substrato de crecimiento, proporcionalmente más células son sembradas a la superficie y un mayor volumen de medio es necesario para bañar y nutrir de manera suficiente las células. Cuando la construcción de tejido es finalmente formada, ya sea que sea una construcción de célula-matriz de capa simple o una construcción de bicapa, es removido mediante pelado del substrato de membrana anes de injertar a unpaciente. Las construcciones de tejido cultivado de la invención no se basan en miembros sintéticos o bioreabsorbibles para, tal como un miembro de malla para la formación de las construcciones de tejido. El miembro de malla es organizado como un material tejido, de punto o de filtro. En sistemas donde un miembro de malla es empleado, las células son cultivadas en el miembro de malla y que crecen en cualquier lado y dentro de los intersticios de la malla para envolver e incorporar la malla dentro de la construcción de tejido. La construcción final formada mediante métodos que incorporan tal malla, se confían en ella para soporte físico y para volumen. Ejemplos de construcciones de tejido de cultivo que dependen de miembros de malla sintética son encontradas en las patentes estadounidenses números 5,580,781 , 5,443,950, 5,266,480, 5,032,508, 4,963,489 para Naughton, et al. El sistema para la producción de la capa de célula-matriz puede ser ya sea estático o puede emplear un medio de perfusión para el medio de cultivo. En el sistema estático, el medio de cultivo está quieto y relativamente sin movimiento, como contrasta con el sistema de perfusión donde el medio está en movimiento. La perfusión de medio afecta la viabilidad de las células y aumenta el desarrollo de la capa de matriz. Medios de perfusión incluyen, pero no están limitado a: usar una barra de agitación magnética o impulsor motorizado en el plato de cultivo subyacente (por abajo) o adyacente al portador de substrato conteniendo la membrana de cultivo para agitar el medio; bombear el medio dentro o a través de la placa o cámara de cultivo; agitar suavemente la placa de cultivo en una plataforma de agitación o rotatoria; o rodar, si se produce en una botella de rodillo. Otros medios de perfusión pueden ser determinados por alguien experto en la técnica para usarse en el método de la invención. Las formulaciones de cultivo de medio adecuadas para usarse en la presente son seleccionadas con base en los tipos de células a ser cultivados y la estructura de tejido a ser producida. El medio de cultivo que es usado y las condiciones de cultivo específicas necesarias para promover el crecimiento celular, síntesis de matriz y viabilidad dependerá del tipo de célula siendo cultivada. En algunos casos, al como en la fabricación de construcciones de piel de bicapa biodiseñadas de la presente invención, la composición de medio varía con cada etapa de fabricación ya que diferentes complementación es necesaria para diferentes propósitos. En un método preferido, la capa de célula-matriz es formada bajo condiciones definidas, esto es, cultivada en medio químicamente definido. En otro método preferido, una construcción de tejido comprende una capa de célula-matriz provista con una segunda capa de células dipsuesta y cultivada sobre ella, en donde ambos tipos de células son cultivados en un sistema de medio de cultivo definido. De manera alternativa, la construcción de tejido comprende una capa de célula-matriz fabricada bajo condiciones de medio definidas y una segunda capa formada sobre ella bajo condiciones de medio no definidas. Por el contrario, la construcción de tejido comprende una capa de célula-matriz puede ser fabricada bajo condiciones de medio no definidas y la segunda capa formada sobre ella bajo condiciones de medio definidas. El uso de medio de cultivo químicamente definido es preferido, esto es, medio libre de extractos de tejido u órgano de animal no definidos, por ejemplo, suero, extracto de pituitaria , extracto hipotalámico, extracto de placenta o extracto embriónico o proteínas y factores secretados por células alimentadoras. En una modalidad más preferida, el medio está libre de componentes no definidos y componentes biológicos definidos derivados de fuentes no humanas. Aunque la adición de componentes no definidos no es preferida, puede usarse de acuerdo con los métodos descritos en cualquier punto en cultivo con el fin de fabricar exitosamente una construcción de tejido. Cuando la invención es realizada utilizando células humanas clasificadas usando componentes químicamente definidos derivados de fuentes animales no humanas, la construcción de tejido resultante es una construcción de tejido humano definido. Los equivalentes funcionales sintéticos también pueden ser adicionados a medio químicamente definido de complemento dentro del alcance de la definición de químicamente definido para usarse en el método de fabricación más preferido. En general, alguien de habilidad en al técnica de cultivo celular será capaz de determinar equivalentes humanos naturales, recombinantes humanos o sintéticos a componentes animales comúnmente conocidos para complementar el medio de cultivo de la invención sin investigación o experimentación indebida. Las ventajas para usar tal construcción en la clínica es que la preocupación de contaminación de vidrus de especie cruzada o animal adventicio e infección es disminuida. En el escenario de prueba, las ventajas de una construcción químicamente definida es que cuando se prueba, no existe posibilidad de que los resultados sean confundidos debido a la presencia de los componentes no definidos. El medio de cultivo es comprendido por una base de nutrientes usualmente complementada de manera adicional con otros componentes. El técnico experto puede determinar bases de nutrientes apropiadas en la técnica de cultivo de células animales con expectativas razonables para producir exitosamente una construcción de tejido de la invención. Muchas fuentes de nutrientes comercialmente disponbles son útiles en la práctica de la presente invención. Estas incluyen fuentes de nutrientes comercialmente disponibles, las cuales suministran sales inorgánicas, una fuente de energía, aminoácidos y vitaminas B, tales como Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM); medio esencial mínimo (MEM); M199; RPMI 1640; medio de Dulbecco modificado de Iscobe (EDMEM). Medio esencial mínimo (MEM) y M1 99 requieren complementación adicional con precursores de fosfolípidos y aminoácidos no esenciales. Las mezclas ricas en vitaminas comercialmente disonbiles que suministran aminoácidos adicionales, ácidos nucleicos, cofactores de enzimas, precursores de fosfolípidos y sales inorgánicas incluyen F-12 de Ham, F-1 0 de Ham, NCTC 109 y NCTC 1 35. A pesar de concentraciones variantes, todo el medio basal proporciona una fuente de nutrientes básica para células en la forma de glucosa, aminoácidos, vitaminas e iones inorgánicos, junto con otros componentes de medio básicos. El medio de base más preferido de la invención comprende una base de nutritentes de ya sea Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) libre de calcio o de bajo calcio, o de manera alernativa, DMEM y F-12 de Ham entre una proporción 3-a-1 a una proporción 1 -a-3, respectivamente. El medio de base es complementado con componentes, tales como, aminoácidos, factores de crecimiento y hormonas. El medio de cultivo definido para el cultivo de células de la invención son como se describe en la patente estadounidense no. 5,71 2, 163 para Parenteau y en la publicación de PCT internacional no. WO 95/31473, cuyas descripciones son incorporadas en la presente por referencia. Otros medios son conocidos en la técnica, tales como aquéllos descritos en Ham y McKeehan, Methods in Enzymology (Métodos en enzimología), 58:44-93 (1979), o para otros medios definidos químicamente apropiados, en Bottenstein et al. , Methods in Enzymology (Métodos en enzimología), 58:94-109 (1797). En la modalidad preferida, el medio de base es complementado con los siguientes componentes conocidos para el técnico experto en cultivo celular animal; insulina, transferrina, triyodotrionina (T3), y cualquiera o ambas etanolamina y o-fosforil-etanolamina, en donde las concentraciones y substituticiones para los complementos pueden determinarse por el técnico experto. La insulina es una hormona de polipéptido que promueve la captación de glucosa y aminoácidos para proporcionar beneficios a largo plazo sobre múltiples pasos. La complementación de insulina o factor de crecimiento como insulina (IGF) es necesario para cultivo de largo plazo ya que habrá superión eventual de la capacidad de las céulas a captar glucosa y aminoácidos y posible degradación del fenotipo celular. La insulina puede derivarse de ya sea fuentes animales, por ejemplo, bovino, humana, o mediante medios recombinantes, tal como insulina recombinante humana. Por lo tanto, una insulina humana calificaría como un componente químicamente definido no derivado de una fuente biolóica no humana. La complementación de insulina es aconsejable para cultivo serial y es provisto al medio a un amplio rango de concentraciones. Un rango de concentración preferido está entre aproximadamente 0.1 µg/ml hasta aproximadamente 500 µg/ml, más preferiblemente a aproximadamente 5 µg/ml hasta aproximadamente 400 µg/ml y muy preferiblemente a aproximadamente 375 µg/ml. Las concentraciones apropiadas para la complementación de factor de crecimiento similar a insulina, tal como IGF-1 o IGF-2, pueden determinarse fácilmente por alguien de habilidad en la técnica para los tipos de células elegidos para cultivo. La transferrina está en el medio para regulación de transporte de hierro. El hierro es un elemento en trazas esencial encontrado en el suero. Como el hierro puede ser tóxico para las células en su forma libre, en el suero es suministrado a células unidas a transferrina a un rango de concentración de preferencia entre aproximadamente 0.05 hasta aproximadmente 50 µg/ml, más preferiblemente a aproximadamente 5 µg/ml. La triyodotironina (T3) es un componente básico y es la forma activa de hormona tiroide que es incluida en el medio para mantener las velocidades de metabolismo celular. La triyodotrionina es complementada al medio a un rango de concentración entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 400 pM, más preferiblemente entre aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 pM y muy preferiblemente a aproximadamente 20 pM. Cualquiera o ambas etanolamina y o-fosforil-etanolamina, las cuales son fosfolípidos, son adicionados cuya función es un importante precursor en la trayectoria de inositol y metabolismo de ácidos grasos. La complementación de lípidos que son encontrados normalmente en suero es necesaria en un medio libre de suero. La etanolamina y o-fosforil-etanolamina son provistas a medio a un rango de concentración entre aproximadamente 1 0"6 hasta aproximadamente 1 0"2 , m 's preferiblemente a aproximadamente 1 x 10"4 M . A lo largo de la duración de cultivo, el medio de base es complementado adicionalmente con otros componentes para inducir la síntesis o diferenciación o para mejorar el crecimiento celular, tal como hidrocortisona, selenio y L-glutamina. La hidrocortisona ha sido mostrada en cultivo de queratinocitos para promover el fenotipo de queratinocitos y por lo tanto intensificar características diferenciadas, tal como contenido de involucrina y queratinocito transglutaminasa (Rubín et al . , J . Cell Physiol . , 138:208-214 (1986)). Por lo tanto, la hidrocortisona es un aditivo deseable en casos donde estas características son benéficas, tal como en la formación de injertos de hoja de queratinocito o construcciones de piel. La hidrocortisona puede ser provista a un rango de concentración de aproximadamente 0.01 ug/ml hasta aproximadamente 4.0 µg/ml, muy preferiblemente entre aproximadamente 0.4 µg/ml hasta 16 ug/ml. El selenio es adicionado a medio libre de suero para recomplementar los elementos en trazas de selenio normalmente provistos por el suero. El selenio puede ser provisto a un rango de concentración de aproximadamente 1 0"9 M hasta aproximadamente 10"7 M; muy preferiblemente a aproximadamente 5.3 x 1 0"8 M. El aminoácido L-glutamina está presente en algunas bases de nutriente y puede adicionarse en casos donde no hay o están presentes cantidades insuficientes. La L-glutamian también puede ser provista en forma estable, tal como aquélla vendida bajo la marca, GlutaMAX-1 M R (Gibco BRL, Grand Island, NY). Gluta AX-1 M R es la forma de dipéptido estable de L-alanil-L-glutamina y puede ser usada de manera intercambiable con L-glutamina y es provista en concentraciones equimolares com un substituto a L-glutamina. El dipéptido proporciona estabilidad a L-glutamina de degradación sobre el tiempo en almacenamiento y durante la incubación que puede conducir a incertidumbre en la concentración efectiva de L-glutamina en medio. Normalmente, el medio de base es complementado con de preferencia entre aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 6 mM, más preferiblemente entre aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 5 mM, y muy preferiblemente 4 mM L-glutamina o GlutaMAX-1 R. Los factores de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) también pueden adicionarse al medio para auxiliar en el establecimiento de los cultivos a través de la escala celular y sembrado. El EGF en forma natural o forma recombinante puede usarse. Las formas humanas, naturales o recombinantes, de EGF son preferidas para usarse en el medio cuando se fabrica un equivalente de piel no conteniendo componentes biológicos no humanos. El EGF es un componente opcional y puede ser provisto a una concentración entre aproximadamente 1 hasta 1 5 ng/ml, más preferiblemente entre aproximadamente 5 hasta 1 0 ng/ml. El medio descrito antes es preparado normalmente como se expone a continuación. Sin embargo, se debería entender que los componentes de la presente invención puede prepararse y ensamblarse usando metodología convencional compatible con sus propiedades físicas. Es bien sabido en la técnica substituir ciertos componentes con un agente que actúa equivalente funcionalmente o análogo apropiado para los propósitos de disponiblidad o economía y llegan a un resultado similar. Los factores de crecimiento que ocurren de manera natural pueden ser substituidos con factores de crecimiento recombinantes o sintéticos que tienen cualidades similares y resultados cuando se usan en el desempeño de la invención. Los medios de acuerdo con la presente invención son estériles. Los componentes estériles son comprados estériles o se hacen estériles mediante procedimientos convencionales, tales como, filtración, después de la preparación. Los procedimientos asépticos apropiados fueron usados a tavés de los siguientes Ejemplos. DMEM y F-12 son combinados primero y los componentes individuales son adicionados entonces para completar el medio. Las soluciones madre de todos los componentes pueden ser almacenadas a -20°C, con la excepción de fuente de nutrientes que pueden ser almacenadas a 4°C. Todas las soluciones madre son preparadas a concentraciones finales de 500X listadas antes. Una solución madre de insulina, transferrina y triyodotironina (todas de Sigma) es preparada como sigue: triyodotironina es disuelta inicialmente en etanol absoluto en ácido clorhídrico (HCI) 1 N a una proporción 2: 1 . La insulina es disuelta en HC diluido (aproximadamente 0.1 N) y la transferrina es disuelta en agua. Las tres se mezclan y diluyen entonces en agua a una concentración de 500X. La etanolamina y o-fosforil-etanolamina se disuelven en agua a una concentración de 500X y son esterilizadas por filtro. La progesterona es disuelta en etanol absoluto y diluida con agua. La hidrocortisona es disuelta en etanol absoluto y diluida en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). El seleni es disuelto en agua a concentración de 500X y esterlizada por filtro. El EGF es comprado estéril y es disuelto en PBS. A la adenina es difiícil de disolver pero puede disolverse mediante cualquier variedad de método conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. La albúmina de suero puede ser adicionada a ciertos componentes con el fin de estabilizarse en solución y son derivados actualmente ya sea de fuentes humanas o animales. Por ejemplo, la albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA) pueden adicionarse para almacenamiento prolongado para mantener la actividad de las soluciones madre de progesterona y EGF. El medio puede ser usado ya sea inmediatamente después de la preparación o, almacenarse a 4°C. Si se almacena, EGF no debería ser adcionado hasta el momento de uso. Con el fin de formar la capa de célula-matriz mediante el cultivo de células productoras de matriz, el medio es complementado con agentes adicionales que promueven la síntesis de matriz y deposición por las células. Estos agentes complementarios son compatibles con las células, definidos como un alto grado de pureza y están libres de contaminantes. El medio usado para producir la capa de célula-matriz es llamada "medio de producción de matriz". Para preparar el medio de producción de matriz, el medio de base es complementado con un derivado de ascorbato, tal como ascorbato de sodio, ácido ascórbico, o uno de sus derivados más químicamente estables, tales como, n-hidrato de sal de fosfato magnesio de ácido L-ascórbico. El ascorbato es adicionado para promover la hiroxilación de prolina y secreción de procolágeno, un precursor soluble a moléculas de colágeno depositadas. El ascorbato también ha sido mostrado por ser un cofactor importante para el procesamiento post-traslacional de otras enzimas así como un sobre-regulador de síntesis de colágeno tipo I y tipo I II : Aunque no se desea ligar a una teoría, complementar el medio con aminoácidos involucrados en la síntesis de proteínas conserva la energía celular al no requerir que las células produzcan los aminoácidos por ellas mismas. La adición de prolina y glicina es preferida ya que son, así como la forma hidroxilada de prolina, hidroxiproplina, aminoácidos básicos que hacen la estructura de colágeno. Aunque no se requiere, el medio de producción de matriz es complementado opcionalmente con un polímero neutral. Las construcciones de célula-matriz de la invención pueden ser producidas sin un polímero neutral, pero nuevamente no se desea que se ligue a una teoría, su presencia en el medio de producción de matriz puede procesar colágeno y deposición de manera más consistente entre muestras. Un polímero neutral preferido es polietilenglicol (PEG), el cual se ha mostrado que promueve el procesamiento in vitro del procolágeno de precursor soluble producido mediante las células cultivadas a colágeno depositado de matriz. El PEG de grado de cultivo de tejido dentro del rango entre aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 4000 MW (peso mlecular), más preferiblemente entre aproximadamente 3400 hasta aproximadamente 3700 MW es preferido en el medio de la invención. Las concentraciones de PEG preferidas son para usarse en el método, pueden estar a concentraciones a aproximadamente 5% p/v o menos, de preferencia aproximadmente 0.01 % p/v hasta aproximadmente 0.5% p/v, más preferiblemente entre aproximadamente 0.025% p/v hasta aproximadamente 0.2% p/v, muy preferiblemente aproximadamente 0.05% p/v. Otros polímeros neutrales de grado de cultivo tales como dextrano, de preferencia dextrano T-40, o polivinilpirrolidona (PVP), de preferencia en el rango de 30,000-40,000 MW, también puede usarse a concentraciones a aproximadamente 5% p/v o menos, de preferencia entre aproximadamente 0.01 % p/v hasta aproximadamente 0.5 p/v, más preferiblemente entre aproximadamente 0.025% p/v hasta aproximadmente 0.2% p/v, muy preferiblemente aproximadamente 0.05% p/v. Otros agentes compatibles con células y de grado de cultivo celular que intensifican procesamiento y deposición de colágeno pueden ser indagados por el rutinario experto en la técnica de cultivo de células de mamífero.

Cuando las cél ulas productoras de células son confluentes, el medio de cultivo es complementado con componentes que ayudan a síntesis de matriz, secreción u organización , se dice que las células son esti muladas para formar una construcción de tejido comprendida por células y matriz sintetizada por esas células. Por lo tanto, una formulación de medio de producción de matriz preferida comprende: una mezcla de bse 3: 1 de Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina) y medio F-1 2 de Ham complementado con ya sea 4 mM L-gl utamina equivalene, 5 ng/ml de factor de creci miento epidérmico, 0.4 µg/ml de hidrocortisona, 1 x 1 0"4 M etanolamina, 1 x 1 0"4 M o-fosforil-etanolamina, 5 µg/ml de nsulina, 5 µg/ml transferrina , 20 pM triyodotironi na, 6.78 ng/m de selenio, 5 ng/ml de ácido L-ascórbico, 0.2 µg/ml de L-prolina y 0.1 µg/ml de glicina. Al medio de producción , pueden adicionarse otros agentes farmacológicos al cultivo para alterar la naturaleza, cantidad o tipo de la matriz extracel ular secretada . Estos agentes pueden incluir factores de crecimiento de polipéptido, factores de transcripción o sales i norgánicas para sobre-regular la transcripción de colágeno. Ejemplos de factores decrecimiento de polipéptido incluyen factor de crecimiento en transformación beta 1 (TG F-ß ? ) y activador de plasmi nógeno de tejido (TPA), ambos conocidos por sobre-regular la síntesis de colágeno. Raghow et al . , Jornal of Clinical Investigation , 79: 1 285-1 288 (1987) ; Pardes et al. , Journal of I nvestigative Dermatology, 1 00: 549 (1 993) . Un ejemplo de una sal i norgánica que esti mula la producción de colágeno es cerio. Shivakumar et al , Journal of Molecular and Cellu lar Cardiology 24:775-780 (1 992) . Los cultivos son mantenidos en un incubador para asegurar las condiciones ambientales suficientes de temperatura controlada, humedad y mezcla de gases para el cultivo de células. Las condiciones preferidas están entre aproximadamente 34°C hasta aproximadmente 38°C, más preferiblemente 37 ± 1 °C con una atmósfera entre aproximadamente 5-1 0 ± 1 % C02 y una humedad relativa (Rh) entre aproximadamente 80-90%. En la modalidad preferida, la construcción de célula-matriz es una construcción dérmca formada de fibroblastos dérmicos y su matriz secretada. De preferencia, los fibroblastos dérmicos humanos son usados, derivados como células primarias a partir de dermis o más preferiblemente de serialmente pasados o subcultivados de stocks o bancos de células establecidos que han sido clasificados contra contaminación viral y bacteriana y probados por pureza. Las célas son cultivadas bajo condiciones suficientes en medio de crecimiento para provocar que proliferen a un número apropiado para sembrar las células al substrato de cultivo sobre lo cual se formará una construcción de célula-matriz. De manera alternativa, las células de stocks de células congelados pueden ser sembrados directamente al substrato de cultivo.

Una vez que se han obtenido los números de células suficientes, las células son recolectadas y sembradas sobre una superficie de cultivo adecuada y cultivadas bajo condiciones de crecimiento apropiadas para formar una lámina confluente de células. En la modalidad preferida, las células son sembradas en una membrana porosa que es sumergida para permitir contacto de medio desde abajo del cultivo a través de los poros y directamente hacia arriba. De preferencia, las células son suspendidas ya sea en medio de base o crecimiento y son sembradas en la superficie de cultivo celular a una densidad entre aproximadamente 1 x 105 células/cm2 hasta aproximadamente 6.6 x 105 células/cm2, más preferiblemente entre aproximadamente 3 x 1 05 células/cm2 hasta aproximadamente 6.6 x 105 células (células por centímetro cuadrado de área de la superficie). Los cultivos son cultivados en medio de crecimiento para establecer el cultivo y son cultivados a entre aproximadamente 80% hasta 100% de confluencia tiempo en el cual son inducidos químicamente al cambiar el medio a medio de producción de matriz con el fin de sobre-regular la síntesis y secreción de matriz extracelular. En un método alterno, las células son sembradas directamente en medio de producción para eliminar la necesidad a cambiar del medio básico al medio de producción, pero es un método que requiere mayores densidades de sembrado. Durante el cultivo, los fibroblastos organizan las moléculas de matriz secretada para formar una estructura similar a tejido tridimensional, pero no exhiben fuerzas contráctiles significativas para provocar que a construcción de célula-matriz en formación se contraiga y pele a sí misma del substrato de cultivo. Los intercambios de medios se hacen cada dos o tres días con medio de producción de matriz fresco y con tiempo, la matriz secretada aumenta en espesor y organización. El tiempo necesario para crear una construcción de célula-matriz es dependiente de la capacidad de la densidad de sembrado inicial, el tipo de célula, la edad de la línea celular, y la capacidad de la línea celular a sintetizar y secretar matriz. Cuando se forma completamente, las construcciones de la invención tienen espesor a granel debido a la matriz fibrosa producida y organizada por las células; no son cultivos celulares confluentes ordinarios o confluentes en exceso donde las células pueden ser adherentes de manera suelta una a otra. La calidad fibrosa da a las construcciones propiedades similares a tejido cohesivas a diferencia de los cultivos ordinarios, debido a que resisten el daño físico, tal como rasgado o quebrado, con manejo rutinario en una instalación clínica. En la fabricación de una construcción dérmica cultivada, las céulas formarán una matriz organizada alrededor de sí mismas en la superficie de cultivo celular de preferencia al menos aproximadamente 30 mieras en espesor o más, más preferiblemente entre aproximadamente 60 hasta aproximadamente 1 20 mieras de espesor a través de la superficie de la membrana; sin embargo, los espesores así obtenidos en exceso de 120 mieras y son adecuados para usarse en aplicaciones de prueba o clínicas donde tales espesores mayores son necesarios. En un método más preferido, una capa de célula epitelial es aplicada a una superficie, de preferencia, la superficie superior, que mira hacia arriba de la construcción de célula-matriz. Para la construcción de célula-matriz, las células epiteliales pueden ser sembradas y cultivadas sobre las mismas para frmar una construcción de tejido de múltiples capas. En el método más preferido, los queratinocitos derivados de la piel son cultivados sobre la construcción celular para formar una construcción de la piel. En otras modalidades preferidas, las células epiteliales de córnea, también llamadas queratinocitos córneos, pueden ser sembrados en la construcción de célula-matriz para formar una construcción córnea. Las células epiteliales de la mucosa oral pueden ser cultivadas en la construcción de célula-matriz para formar una construcción de mucosa oral. Las células epiteliales del esófago pueden ser sembradas sobre la construcción de célula-matriz para formar una construcción de tejido esofágico. Las células uroepiteliales del tracto uregenital pueden sembrarse en la construcción de célula-matriz para formar una construcción de uroepitelio. Otras células de origen epitelial pueden seleccionarse para formar una construcción de tejido a partir de la cual esas células fueron derivadas. Los métodos para proporcionar células epidérmicas a un substrato dérmico y métodos para su cultivo, incluyendo inducción de diferenciación y cornificación para formar una capa de queratinocitos diferenciada son conocidos en la técnica y son descritos en la patente estadounidense n. 5,712, 163 para Parenteau, et al. y en la patente estadounidense no. 5,536,65 para Kemp, et al, cuyos contenidos son incorporados en la presente por referencia en su totalidad. Normalmente para realizar la epidermilización de la construcción de célula-matriz, los queratinocitos son sembrados a la construcción de célula-matriz y cultivados sobre ella hasta que la capa es aproximadamente de una a tres capas celulares de espesor. Los queratinoctos son inducidos para diferenciarse para formar una epidermis multicapa y entonces inducirse para cornificarse para formar un estrato córneo. En el método para formar una capa epidérmica diferenciada, los queratinocitos subcultivados son tomados del stock celular y sus números celulares son expandidos. Cuando un número de células necesario ha sido obstenido, se liberan del substrato de cultivo, se suspenden, cuentan, diluyen y entonces se siembran a la superficie superior de la construcción de célula-matriz a una densidad de entre aproximadamente 4.2 x 103 células/cm2 hasta aproximadamente 5.0 x 105 células/cm2, más preferiblemente entre aproximadamente 1 .0 x 104 células/cm2 hasta aproximadamente 10 x 105 células /cm2, y muy preferiblemente a aproximadamente 4.5 x 1 04 células/cm2. Las construcciones son incubadas entonces durante entre aproximadamente 60 hasta aproximadamente 90 minutos a 37 ± 1 °C, 10% C02 para permitir que los queratinocitos se unan. Después de la incubación, las construcciones son sumergidas en medio de epidermalización. Después de un lapso suficiente en cultivo, los queratinocitos proliferan y se esparcen para formar una monocapa confluente a través de la construcción de célula-matriz. Una vez confluente, la formulación de medi de cutivo es cambiada a medio de diferenciación para inducir la diferenciación celular. Cuando un epitelio multicapa se ha formado, el medio de cornificación es usado entnces y el cultivo es llevado a la inerfase aire-líquido. Para la diferenciación y cornificación de queratinocitos, las células son expuestas a una interfase aire-líquido seca o de baja humedad. Un interfase seca o de baja humedad puede ser caracterizada por intentar duplicar los niveles de baja humedad de la piel. Con el tiempo, los queatinocitos expresarán la mayoría o todas las queratinas y otras características encontradas con la piel natural cuando se exponen a estas condiciones. Como se menciona antes, el sistema para la producción de una construcción de célula-matriz puede ser usada en la formación de una construcción córnea. Las células epiteliales córneas pueden ser derivadas de una variedad de fuentes de mamífero. La célula epitelial preferida es un célula epitelial córnea de conejo o humano (queratinocito córneo), pero cualquier queratinocito córneo de mamífero puede ser usado. Otros queratinocitos epiteliales, tales como aquéllos derivados de esclerótica (porción opaca blanca exerior) del ojo o epidermis puede substituirse, pero son preferibles los queatinocitos córneos. En el método para formar una construcción córnea, el medio es removido de la inserción de cultivo (coneniend la construcción de célula-matriz) y su alrededor. Se expanden células epiteliales córneas de conejo normales vía subcultivo, son tripsinizadas para removerlas del substrato de cultivo, suspendidas en medio de cultivo y sembradas en la parte superior de la membrana a una densidad entre aproximadamente 7.2 x 104 hasta aproximadamente 1 .4 x 1 05 células/cm2. Las construcciones son incubadas enotnces sin medio durante aproximadamente cuatro horas a 37 ± 1 °C, 1 0% C02 para permitir que las células epiteliales se unan. Después de la incubación, las construcciones son sumergidas en medio de mantenimiento córneo (CMM) (Johnson et a. , 1 92). Las células epiteliales son cultivadas hasta que la construcción de célula- matriz es cubierta con las células epiteliales. La entereza de cobertura epitelial puede ser indagada por una variedad de métodos, para ilustración al machar el cultivo con una solución de sulfato Nile Blue (1 : 10,000 en solución amortiguada de fosfato) . Una vez que la construcción de célula-matriz es cubierta, después de aproximadamente siete días, las construcciones son transferidas asépticamente a nuevas charolas de cultivo con suficiente medio de mantenimiento córneo (CMM) para alcanzar un nivel de fluido justo a la superficie de la construcción para mantener una interfase de humedad sin la submersión de la capa epitelial . Las construcciones son incubadas a 37 ± 1 °C, 10% C02, y más de 60% de humedad, con CMM, haciendo cambios de medio, según sea necesario, normalmente tres veces por semana. Para la diferenciación, pero no la cornificación de la capa de células epiteliales, como es necesario en la producción de una construcción córena, la superficie de células epiteliales es expuesta a una interfase de aire-líquido húmeda. Los métodos para proporcionar una interfase de aire-líquido húmeda son descritos en la patente estadounidense no. 5,374,515 para Parenteau. Como se describe en la presente, el término "interfase de humedad" pretende significa un ambiente de cultivo, el cual es regulado de manera que la superficie de la construcción está humedad, con alta humedad, pero no seca o sumergida. El nivel exacto de humedad en el ambiente no es crítico, per debería ser suficientemente húmedo para evitar la formación de células cornificadas. Una interfase húmeda puede ser caracterizada porque trata de duplicar los niveles de humedad similares al ojo humano.

En una modalidad preferida alternaiva, una siembra de una segunda célula productora de matriz puede realizarse en una primera construcción de célula-matriz formada para obtener una construcción de célula-matriz más espesa o una construcción de célula-matriz bicapa. La segunda siembra puede ser realizada con el mismo tipo o cepa de célula o con un diferente tipo de célula o cepa, dependiendo del resultado deseado. La segunda siempra es realizada bajo las mismas condiciones que emplean los prcedimientos y medio de producción de matriz usado en la producción de la primera capa. Un resultado para realizar la segunda siembra con un diferente tipo celular es tener una matriz formada con diferentes perfiles de componentes de matriz o densidad de empaque de matriz para afectar la curación de heridas cuando la construcción es injertada a un paciente. La primera siembra de células produce una matriz análoga a la capa reticular de dermis, una capa más densamente empacada de colágeno tipo I y componentes de matriz extracelar constituyentes. La segunda siembra de células produciría una matriz similar a la capa papilar de dermis caracterizada por fibrillas de colágeno más sueltas y matriz extracelular. Otro resultado es que el segundo tipo de células puede producir una substancia terapéutica que también afectaría la curación de heridas, tal como captación de injerto o integración de injerto mejorada o la minimización o prevención de formación de cicatriz. En otra modalidad preferida, las poblaciones de células mezcladas de dos o más tipos de células pueden cultivarse juntas durante la formación de una construcción de célula-matriz siempre que al menos uno de los tipos de células usados sea capaz de sintetizar la matriz extracelular. El segundo tipo de célula puede ser uno necesario para realizar otras funciones de tejido o para desarrollar características estructurales particulares de la construcción de tejido. Por ejemplo, en la producción de una construcción de piel , las células de papila dérmica o células epiteliales de partes asociadas pueden cultivarse con las células productoras de matriz para permitir la formación de apéndices epiteliales o sus componentes. Los apéndices epidérmicos, tales como estructuras o componentes de glándulas sudoríparas o sebáceas o estructuras o componentes de folículos pilosos, pueden formarse cuando se cultivan junto con las células productoras de matriz. Las células epiteliales pueden derivarse de las estructuras de apéndices de glándula y cabello ubicadas en dermis profunda, tal como mediante microdisección e incluyen células écrinas, células mioepiteliales, células sectretorias glandulares, células madre de folículo piloso. Otros tipos de células encontrados normalmente en la piel que constituyen piel también pueden ser adicionados, tales como, melanoictos, células de Langerhans y células de Merkel. De manera similar, las células endoteliales vasculares pueden ser co-cultivadas para producir componentes rudimentarios para nueva formación de vasculatura. Los adipocitos también pueden ser cultivados con las células productoras de matriz para formar una construcción usada para cirugía reconstructiva. Como modo alterno de enrega de este segundo tipo de célula, las células pueden sembrarse localmente como una mancha o como un arreglo de cualquier número de manchas de células en o dentro de una matriz de tejido de célula en formación o completamente formada para desarrollo localizado de estas estructuras. Para sembrar las células dentro de la construcción de célula-matriz, las células pueden ser inyectadas entre las superficies superior e inferior, dentro de la célula-matriz, para que las células crezcan, formen estructuras especializadas y desempeñen su función especializada. Para producir una construcción de tejido en tres capas, una primera siembra de células que comprende un tipo de célula productora de matriz o un tipo de célula no productora de matriz es sembrada en el substrato de cultivo durante un tiempo suficiente para producir una construcción de célula-matriz o una capa celular. Una vez que la primera construcción de célula-matriz y capa celular es formada, una segunda siembra de células comprendiendo un tipo de célula productora de matriz es sembrada en la superficie superior de la primera construcción de célula-matriz o capa celular y es cultivado durante un tiempo bajo condiciones suficientes para formar una segunda construcción de célula-matriz en la primera construcción. En la segunda construcción de célula-matriz, una tercera siembra de un tercer tipo celular es sembrada y cultivada bajo condiciones suficientes para producir la tercer capa. Como un ejemplo, para producir una construcción córnea de tres capas, la célula del primer tipo de célula puede estar comprendida por células de origen endotelial, tal como células endotliales córneas; el segundo tipo celular puede comprender células de origen de tejido conectivo, tal como queratocitos córneos; y el tercer tipo celular puede comprender células de origen epitelial, tales como células epiteliales córneas. Como otro ejemplo de una construcción de tres capas de la piel, la célula de la primera siembra puede ser de origen vascular para proporcionar componentes para vascularización, las células de la segunda siembra pueden comprender fibroblastos dérmicos para formar una construcción de célula-matriz para servir como una construcción dérmica y las células de la tercera siembre pueden ser queratinocitos epidérmicos para formar una capa epidérmica. Las construcciones de tejido de la invención pueden almacenarse a temperaturas criogénicas cuando se emplean métodos de vitrificación o crioconservación. Los métodos para vitrificación de construcciones de tejido son descritos en la patente estadounidense no. 5,518,878 y métodos para la crioconservación son descritos en las patentes estadounidenses nos. 5,689,961 y 5,891 ,617 y en la solicitud de PCT internacional WO 96/24018, cuyas descripciones son incorporadas en la presente por referencia.

C: Construcciones de tejido de cultivo comprendiendo una mezcla de gel de una solución de colágeno con un agente contráctil. En otra modalidad de esta invención, las construcciones de tejido cultivado comprenden una mezcla de gel comprendiendo una solución de colágeno y un agente contráctil. Esta construcción de tejido cjultivado es producida al formar un látex de colágeno hidratado, in vitro, como se describe en la patente estadounidense no. 4,485,096 para Bell incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Este látex es contraído en una construcción de tejido cultivado con un agente contráctil incorporado en ella. Ejemplos de agentes contráctiles son células de fibroblasto y plaquetas sanguíneas. Un equivalente de piel puede ser producido a partir de este substrato de tejido conectivo vivo al platinar células de queratinocitos sobre él y proporcionar su crecimiento. Este equivalente de piel es diferente de manera única de las pieles artificiales previamente descritas debido a que su organización básica es similar a aquélla de la piel y sus células constituyentes vivas pueden incluso ser donadas por un receptor de injerto potencial. Los equivalentes de glándula/órgano o equivalentes de vasos pequeños pueden formarse a partir de los látex de colágeno hidratado contraídos descritos en la presente. De esta manera, puede verse que la construcción de tejido cultivado producida de acuerdo con esta invención ofrece el potencial para producir tejido vivo, equivalentes de tejido, glándula y órgano de muchos tipos y funciones. Tales equivalentes pueden incluso ser fabricados y almacenados como inventarios hasta que surja la necesidad de emplearlos. Una de las principales ventajas de tales construcciones de tejido cultivado es que pueden emplearse en un huésped diferente del donador de las células uadas para producir las construcciones de tejido cultivado sin sufrir de los serios problemas de rechazo que pudiera esperarse. Esto se debe a que la selección contra células responsables de rechazo por un sistema inmune de receptor tiene lugar cuando las células usadas para la fabricación del tejido vivo son propagadas de acuerdo con la invención. Además, ciertas células pierden su capacidad para estimular el rechazo cuando se conservan en cultivo de tejido bajo ciertas condiciones de acuerdo con reportes de investigación recientes. Los látex de colágeno hidratado pueden prepararse empleando colágeno derivado de tendón de cola de rata y colágeno de piel de ternera. Otras fuentes de colágeno incluyendo piel fetal humana han sido empleados y todavía otras fuentes serían adecuadas. Las soluciones de colágeno son preparadas y mantenidas bajo condiciones ligeramente ácidas. Los látex son formados al adicionar células de fibroblasto con medio de nutrientes y base que eleva el pH lo suficiente para precipitar las fibrillas de colágeno de la solución. La preparación de látex de colágeno hidratado es descrita con más detalle en las siguientes referencias, cuyas enseñanzas son incorporadas por referencia: Elsdale, T. y Bard, J. "Collagen Substraía For Studies On Cell Behavior" (Substratos de colágeno para estudios sobre comportamiento celular), J. Cell Biol. 54, 626-637 (1972); Ehrmann, R. L. y Gey, G.O. , "The Growth of Cells on A Transparent Gel of Reconstituted Rat-Tail Collagen" (E crecimiento de células en un gel transparente de colágeno de cola de rata reconstituido", J. Ntl. Cáncer Inst. , 16, 1375-1403 (1956); Emermann, J.T. y Pitelka, D. R. , "Hormonal Effects on Intracellular and Secreted Casein ¡n Cultures of Mouse Mammary Epithelial Cells on Floating Collagen Membranes" (Efectos hormonales sobre caseína intracelular y secretada en cultivos de células epiteliales mamarias de ratón sobre membranas de colágeno flotantes", In Vitro, 1 3, 316-328 (1977); Michalopoulous, G. Y Pitot, H .C. , "Primary Culture of Parenchymal Liver Cels n Callagen Membranes" (Cultivo primario de células de hígado parenquimal sobre membranas de colágeno), Exp. Cell Res. 94, 70-78 (1 975); Gey, G.O. Svotelis, M. , Foard, M. y Bang, F.B. , "Long-Term Growth of Chiken Fibroblasts On A Collagen Substrate" (Crecimiento a largo plazo de fibroblsts de pollo en un substrato de colágeno) , Exp. Cell Res. , 84, 63-71 (1 974); y Hillis, W. D. y Band, F.B. , "The Cultivation of Human Embryonic Liver Cells" (El cultivo de células de hígado embriónico humanas), Exp. Cell Res. , 26, 9-36 (1962). Las células de fibroblasto realmente usadas en los experimentos descritos en la presente como un agente contráctil fueron fibroblastos de prepucio humano y fibroblastos dérmicos de conejillos de Indias. Los fibroblastos de otras fuentes también han sido usados, y se cree, de hecho, que los fibroblastos de cualquier animal vertebrado serían adecuados para contraer látex de colágeno hidratado. Una técnica conveniente para formar simultáneamente el látex y platinar células en los mismos involucra neutralizar una solución de colágeno ácida mantenida en una placa de cultivo con medio de nutrientes conteniendo células de fibroblasto. Sobre la neutralización, las fibrillas de colágeno precipitan de la solución para formar los látex con células de fibroblasto dispersas homogéneamente a través de ellos. Las células y látex de colágeno son mantenidas entonces bajo condiciones que permiten que las células se unan al látex de colágeno y lo contraen a una fracción de su tamaño original, proporcionando por ello el tejido vivo. La incorporación de células de fibroblasto en látex de colágeno hidratado provoca que los látex se contraigan conforme el agua atrapada es exrpimida. Si la superficie en la cual el látex fue formado no es humectable, por ejemplo, una placa hidrofóbica, el tejido resultante es de geometría regular. En placas de cultivo de tejido, algunas células migran del látex a la superficie de placa y la contracción del látex no es siempre regular. Cuando una superficie no humectable, tal como una placa de Petri bacteriológica es usada, el látex permanece casi un disco perfecto conforme su radio es disminuidos por las células. Las células de fibroblasto son encontradas dispersas homogéneamente a tavés de los látex de colágeno y no meramente sobre la superficie del látex. Esto simula entonces, la capa dérmica de humanos y otros mamíferos. En la ausencia de células, los látex no experimentan cambio en el radio. Por ejemplo, el medio acondicionado preparado al cultivar 1 x106 células de fibroblasto de prepucio humano durante cinco días en medio de nutrientes no provocó contracción cuando ninguna célula estaba presente. Los látex de colágeno contraído con células se asemejan a la piel o dermis; aún cuando se contrae parcialmente, tienen consistencia razonable y pueden ser manejados fácilmente. Cuando se forman primero con células, los látex son casi transparentes pero gradualmente se vuelven opacos conforme el agua se excluye y el diámetro es reducido. Después de una disminución de 20-39 veces en el área de látex tienen una consistencia gomosa firme, un tinte rosa blanquecino y pueden estirarse un poco sin rasgarse o deformarse.

El diámetro inicia de un látex es determinado por la cantidad de materiales usados y por la placa en la cual es formado. De esta manera, la contracción máxima es una medida arbitraria, pero está relacionada con un número celular y concentración de proteína. Aunque la mayoría de los látex de colágeno hidratado contraído se han formado como hojas, pueden formarse otras configuraciones. Los tubos, por ejemplo, pueden formarse al formar el látex contraído en un molde anular, o un guane de piel pudiera estar preparado en un molde apropiado. Los queratinocitos de piel humana, obtenidos en biopsias, se han depositado sobre látex de colágeno hidratado contraído. Lo mismo se hace con queratinocitos cultivados in vitro. Platinar los queratinocitos puede hacerse en el momento de que se forma el gel de matriz, en cualquier momento durante el periodo de contracción del látex, o cualquier tiempo después de que se ha completado la contracción. Dentro de tres días después de platinar suspensiones de queratinocitos disociados, las células formaron una capa confluente en la superficie de látex y el proceso de queratinización comienza conduciendo a la formación de una capa cornificada, la cual prevendría la pérdida de fluidos de tejido. Existen otros agentes contráctiles celulares, además de células de fibroblasto. Entre estas se encuentran células de músculo suave, células de músculo estriado y células de músculo cardíaco. La contracción de látex por un agente contráctil, tal como células de fibroblasto o plaquetas convierte el látex de colágeno en un equivalente de tejido de fuerza de tensión relativamente alta comparada con aquélla del vaciado de látex de colágeno sin un agente contrácil, cuando ambos son mantenidos bajo condiciones de 100% de humedad relativa. El vaciado sin un agente contráctil , el látex de colágeno tiene una consistencia similar a la gelatina fresca y se aleja del manejo. Los látex contraídos por plaquetas o células pueden ser manejados o células pueden ser manejadas, estiradas y suturadas sin daño. La fuerza de tensión ha sido probada al determinar el peso máximo durante un tiempo dado, el cual podría ser suspendido en látex contraídos. En un ejemplo, un látex de 5 mi de volumen formado en un plato de 5.3 cm de diámetro y contraído a aproximadamente 2 cm de diámetro por células de fibroblasto soportaron 3.5 gramos durante 7 min. Otro látex también de 5 mi de volumen en un plato de diámetro de 5.3 cm fue contraído a partir de una altura de 0.23 cm a una de 0.09 cm sin cambio de diámetro, por plaquetas y soportó 1 1 gramos durante 1 0 mintos. Se ha notado que la fuerza de tensión y otras propiedades, son una función de muchos parámetros, incluyendo los tipos y cantidades de colágeno y agente contráctil empleado y los otros aditivos empleados. El trabajo descrito en la presente, por ejemplo, empleó colágeno tipo I . Sin embargo, es sabido que el colágeno tipo I I I imparte fuerza de tensión adicional a la piel y vasos sanguíneos y así se esperaría que el uso de colágeno tipo I I I en los látex de colágeno descritos en la presente incrementarían su fuerza de tensión. De manera similar, la adición de glicosaminoglicanos, tal como ácido hialurónico, condroitin 4- sulfato y dermatan sulfato, se ha encontrado que mejora la fuerza de tensión propiedades de retención de agua. Los antibióticos, tales como penicilina, estreptomicina y fungizona también pueden ser adicionados, si se desea, para prevenir la infección microbiana. Aunque la mayoría del trabajo descrito en la presente se refiere a la formación de equivalentes de piel al cultivar queratinocitos en látex de colágeno contraído, otros tipos de células podrían ser cultivados sobre o en los látex. Ejemplos son células de músculo suave y estriado, cartílago, células óseas, células pancreáticas, células hepáticas, etc. Ciertos métodos y dispositivos han sido desarrollados para asistir en vaciar los látex de colágeno conraido hacia hojas de dimensiones controlables y/o varias configuraciones. Con las células de fibroblasto cmo el agente contráctil, los látex de colágeno sin restringir normalmente experimentan contracción en todas las dimensiones. Sin embargo, una hoja cuyos bordes son mantenidos fijos, se contrae solamente en la dimensión de espesor. Un dispositivo adecuado para restingir los bordes puede hacerse a partir de una hoja de malla de acero inoxidable de cualquier forma. La forma deseada a ser vaciada es cortada desde el centro de la malla de acero inoxidable después de lo cual el exceso de la hoja es recortado para dejar aproximadamente un borde de 1 .27 cm (media pulgada) de malla alrededor de la forma. Esto forma un marco de malla de acero inoxidable el cual puede depositarse en una charla recubierta con un material no pegajoso, tal como Teflon.RTM. politetrafluoroetileno, después de lo cual los componentes usados para formar el látex son introducidos. Cuando los componentes son vaciados y el látex se forma, llena las lagunas de la malla de acero a la cual es anclado. Conforme los elementos celulares del látex lo compactan al jalarlo junto con las fibrillas de colágeno, el volumen del látex disminuye, pero debido a que el perímetro es mantenido fijo, la dimensión que es reducida es el espesor. En el proceso, el látex pierde fluido. La ventaja especial del marco de acero es que el tamaño final del equivalente de tejido es exactamente el tamaño de las dimensiones interiores del marco y en particular, el látex adquiere fuerza adicional debido a la orientación de células impuesta por elmarco de restricción. Adicionalmente, debido a que las dimensiones del látex no cambian en ancho o longitud, si es vaciado en un marco rectangular, aún después de que es cortado del marco, es posible aplicar el componente epidérmico de equivalente de piel al equivalente dérmico tan pronto como un día después de vaciar el último, rasurando así al menos cuatro días del tiempo necesario para preparar un injerto de equivalente de piel a partir de una biopsia provista por un paciente. Los componentes de un látex pueden vaciarse en la charola recubierta para cubrir la malla de restricción. Conforme el látex se asienta, se vuelve anclado en la malla de manera que sobre contracción, la longitud y ancho permanecen sin cambios. Solamente el espesor disminuye. La dimensión última del espesor es una función de (1 ) el volumen inicial del látex, (2) la concentración celular y (3) el contenido de colágeno. La presencia de proteoglicanos, tal como ácido hialurónico y sulfato de condroitina , resulta en contracción i ncrementada y una disminución en el espesor de látex. La malla rectangular que sostiene el látex o equivalente dérmico sobre el cual Is céluls epidérmicas son sembradas, puede aplicarse intacta a una herida que requiere piel . Mientras está en su lugar, puede cortarse del perímetro interior de la mala inmediatamente o en algú n momento posterior, debido a q ue su presencia podría ayudar a mantener la integridad del injerto. Otra técnica y método, los cuales son útiles para anclar epidermis sobre el equivalente dérmico de preparaciones de equivalente de piel es como sigue. El equivalente dérmico es vaicado primero y una hoja plástica , por ejemplo, Teflon . R.TM. pol ietatrafl uoroeti leno, a través de la cual se han pasado puntadas y se permite que permanezcan en un patrón regular, es dejado sobre vaciado. Las hojas de plástico y puntadas son removidas 1 -4 d ías después, cuando el vaciado es sembrado concél ulas epidérmicas. Esto resulta en la formación de huecos en los cuales las células epidérmicas fluyen , proporcionando por ello mayor contacto de superficie entre la epidermis y equivalente dérmico. Las células glandulares y fol ículos, los cuales pueden ser aislados por una técnica de disociación enzimática, pudieran sembrarse con las suspensiones de cél uls epidérmicas para ocupar tales h uecos. Una ventaja principal del tejido vivo descrito en la presente es la ausencia de rechazo encontrado cuando el receptor es diferente del donador de las células empleadas para producir elequivalente de tejió. Por ejemplo, rechazos de equivalente de piel fabricados con células diferentes de aquéllas del receptor de injerto se han hecho para animales huéspedes. Los injertos de equivalente de piel hechos como se describe antes, pero que se asemejan con células de animales hebras de la cepa de ratas Sprague-Dwley han sido injertados a huéspes de rata Fischer macho y se permite que permanezcan en su lugar durante varios periodos. Puede ser generalizado que los injertos de equivalentes de cualquier clase, los cuales son fabricados sin células inmunes especializadas que son ubicuas en tejidos naturales, no serán rechazados debido a que los determinantes antigénicos responsables para rechazo de injerto no son expresados en las superficies de células incorporadas en tejidos equivalente. Su ausencia hace imposible que las células inmunes del huéspes sientan las células extrañas. Esto proporciona una oportunidad de reemplazar o adicionar tipos de céulas, tejido su órganos, los cuales necesita un receptor, debido a que los propios son deficientes o están ausentes.

D: Construcciones de tejido cultivdo comprendiendo un gel de colágeno en capas en un gel de colágeno Las construcciones de tejido cultivdo de esta modalidad, aunque similares tanto en métodos de preparación como uso para aquéllos que comprenden un látex de colágeno hidratado comprenden adicionalmente una capa de colágeno. Se ha descubierto que un vaciado de látex de colágeno en un gel de colágeno hidratado, acelular, en contacto con un miembro permeable no experimentan contracción radial o lateral substancial al tiempo que se contraen en la dimensión de espesor, eliminando así la necesidad de anclar el látex de colágeno sobre, por ejemplo, un marco de acero inoxidable, para control radial o laeral de contracción. A manera de un ejemplo, un vaciado de látex de colágeno de 24 mm de diámetro como se describe antes, pero sin un medio de anclaje, se contraería radialmente a un diámetro de 5 mm o menos. En contraste, un vaciado de látex de colágeno de 24 mm de diámetro en un gel de colágeno hidratado, acelular, en contacto con un miembro permeable, normalmente se contraerá radialmente a un diámetro de aproximadamente 5 mm. La eliminación del medio de anclaje para controlar la contracción lateral/radial ofrece ventajas en términos de reducción de costo y facilidad de fabricación de equivalentes de tejido. Se debería entender que tales medios de anclaje pueden ser usados en conjunción con gel de colágeno hidratado en contacto con un miembro permeable si es deseado. Un método para obtener los equivalentes de tejido de la presente invención comprende: (a) formar una mezcla comprendiendo colágeno y al menos un agente contráctil; y (b) aplicar la mezcla obtenida en el paso (a) a un gel de colágeno hidratado, acelular, en contacto con un miembro permeable, y mantener la mezcla y gel bajo condiciones las cuales permiten la formación del equivalente de tejido. En algunas modalidades de la presente invención, uno o más miembros absorbentes, incluyendo pero no limitando a, almohadillas fibrosas, almohadillas de algodón y geles, agarosa, se usan en conjunción con el gel de colágeno descrito antes. Tales miembros absorbentes han sido encontrados como que proporcionan un soporte físico de nivel y consistente y promueven el contacto niforme entre el equivalente de tejido y el medio de cultivo celular. Normalmente, el miembro absorbente es adyacene a la superficie del gel de colágeno opuesto al látex de colágeno hidratado. Donde el o los miembros absorbentes es(son) por sí mismo(s) un gel, por ejemplo, agarosa, el gel puede ser provisto junto con un medio de nutriente para proporcionar nutrientes al equivalente de tejido. Los siguientes puntos finales experimentales han sido monitoreados en equivalentes de tejido mantenidos con y sin el gel de colágeno hidratado y/o el miembro absorbente durante varias fases de desarrollo de un equivalente de tejido de piel: 1 . Utilización de glucosa; 2. El grado y calidad de estratificación epidérmica y cornificación; 3. pH de medio. El pH observdo de medio obtenido de equivalentes de tejido mantenidos con el o los miembros absorbentes fueron consistentemente mayores y más cercanos a pH fisiológico que equivalentes de tejido mantenidos en la ausencia de estos meimbros. Además, la utilización de glucosa fue observada por ser generalmente menor en eqivalentes de tejido mantenidos con el miembro absorbente. De manera sorprendente, se ha encontrado que la cornificación madura es promovida en equivalentes de tejido de piel hechos mediante el uso del o los miembros absorbentes comparados con equivalentes de piel hechos sin tales miembros. Aunque el mecanismo mediante el cual estos miembros absorbentes pueden influenciar la diferenciación epidérmica es desconocido, se postula que tales miembros pueden actuar com barreras de difusión, por ejemplo, una barrera de permeabilidad y pueden filtrar el medio y/o retener los productos celulares secretados en extrecha proximidad a los equivalentes de tejido. Los equivalentes de piel viva de la presente invención son preaprados como se describe antes, excepto que de acuerdo con esta modalidad, el látex de colágente hidratado es vaciado en un gel de colágeno hidratado, acelular. Un método para producir un equivalente de tejido de piel de acuerdo con la presente invención comprende: (a) formar una mezcla comprendiendo colágeno y al menos un agente contráctil ; (b) aplicar la mezcla obtenida en el paso (a) a un gel de colágeno hidratado, acelular, en contacto con un miembro permeable y mantener la mezcla y gel bajo condiciones las cuales permitan la formación del equivalente de tejido; y (c) sembrar el equivalente de tejido obtenido en el paso (b) con queratinocitos. A manera de antecedentes, un protocolo conveniente para vaciar los equivalentes de tejido de la presente invención , involucra mezclar rápidamente juntos una solución ácida de colágeno teniendo un pH de aproximadamente 3 a 4, con medio de nutrientes, ajustar el pH de la solución resultante, si es necesario, a aproximadmente pH 6.6 a pH 7.8, adicionar células de fibroblasto, transfiriendo la mezcla resultante (la "mezcla de vaciado") en un molde o dispositivo de vaciado apropiado teniendo un gel de colágeno hidratado, acelular, dispuesto en el mismo, y entonces incubar a una temperatura de preferencia de aproximadamente 35°C hasta 38°C. Es más conveniente ajustar el pH y combinar los ingredientes de la mezcla de vaciado de manera simultánea. Sin embargo, estos pasos pueden ser realizados en cualquier orden deseado, siempre que los pasos sean completados de manera que la mezcla de vaciado pueda ser transferida a un molde para asentado apropiado. Las fibrillas de colágeno precipitan a partir de la mezcla de vaciado como un resultado de calentar la solución y elevar el pH para formar un gel de colágeno hidratado contraído mediante un agente contráctil y dispuesto en gel de colágeno hidratado. Aunque los métodos para hacer tejido vivo provisto por esta modalidad son aplicables a la fabricación de equivalentes de tejido en general , estos métodos serán ilustrados en conexión con la producción de equivalentes de piel para usarse en aplicaciones de injerto de piel y en sistemas de prueba incorporando equivalentes de piel. Haciendo referencia a los dibujos, las FIGS. 1 3-1 5 ilustran una modalidad de un aparato para determinar la interacción de piel y uno o más agentes mediante el uso de equivalentes de tejido de piel de acuerdo con la presente invención, en donde múltiples recipientes 10,22 teniendo equivalentes de tejido de la presente invención dispuestos en ella son provistos en una base o sostén . El aparato mostrado en las FIGS . 1 3-1 5 también es provisto con un medio de cobertura 2. En algunas modalidades una cu bierta (no mostrada) es provista para cada recipiente 1 0, 20. La cubierta es seleccionada de cualqu ier material biocompatible, el cual sostendrá un sello en el recipiente los materiales de cubierta aceptable incluyen hojas de papel aluminio y pel ículas de barrera, las cuales pueden sellarse al aparato mediante medios de u n adhesivo o calor. U na pel ícula de poliéster sel lable con calor es particularmente útil en la práctica de la presente i nvención. Los recipientes para los equivalentes de tej ido comprenden un recipiente exterior 1 0 y un recipiente interior 20. El recipiente interior 20 es provisto con una orilla 50 para proporcionar medios para posicionar el recipiente interior 20 en el recipiente exterior 1 , definiendo por ello un área exterior 14 y un área interior 2. El reci piente interior 20 es provisto con un equivalente de tejido de piel 26, 28 dispuesto en gel de colágeno hidratado 25, el cual a su vez está dispuesto adyacente a un miembro permeable 24. El miembro permeable es unido de manera sellable al recipiente interior 20 para formar la superficie inferior del mismo. El equivalente de tejido de piel comprende dos capas 26, 28, comprendiendo la capa 28 una capa epidérmica , comprendiendo la capa 26 una capa dérmica. En algunas modalidades, un miembro de sellado 30 proporciona un sello entre la pared interior del recipiente i nterior 20 y el equivalente de piel 26, 28 y cubre el perímetro de gel de colágeno hidratado 25 en el caso donde el borde exterior del equivalente de tejido 26, 28 es posicionado hacia adentro de gel de colágeno hidratado 25.

En las modalidades dibujadas en las Figuras, el recipiente 10 es provisto con una abertura 21 , la cual proporciona acceso al área exterior 14. El aparato mostrado en la FIG. 1 5 es provisto adicionalmente con un miembro absorbente 32. Todavía en otras modalidades, la cámara exterior 14 puede tener un gel, no mostrado, dispuesto en ella. Las FIGS. 16-18 ilustran otra modalidad de un aparato para determinar la interacción de tejido y uno o más agentes mediante el uso de equivalentes de tejido de acuerdo con la presente invención. Los elementos similares a aquéllos en otras modalidades descritas son indicados por el mismo número. En esta modalidad, la cavidad exterior 10 es cuadrada y es provista con secciones elevadas 60 en el fondo sobre el cual el recipiente interior 20 puede ser posicionado. La cavidad exterior 10 en lugar de proyectarse hacia arriba desde el fondo del aparato, se forma como un bolsillo a partir de la parte superior del aparato. La cavidad exterior 10 es provista con medio de nutrientes para el equivalente de tejido. Tales medios son conocidos en la técnica. Los medios de nutrientes libres de suero preferidos son descritos en la solicitud de patente estadounidense copendiente ser. No. 361 ,041 . El volumen de medio debe ser seleccionado para llenar el recipiente exterior 14 a un nivel apropiado, con el fin de no formar un cabezal de presión el cual forzaría al medio a través del miembro permeable 24, el gel de colágeno hidratado 25, el equivalente de tejdo 26, 28, hacia el recipiente interior 20.

En algunas modalidades de la presente invención, el recipiente exterior 10 es provisto con un miembro absorbente 32, el cual está dispuesto en el recipiente exterior 1 0, con el fin de contactar la superficie exterior del miembro permeable 24. El miembro absorbente 32 debe ser compatible con equivalentes de tejido vivo. Los materiales preferidos para el miembro absorbente incluyen algodón, poliéster y rayón. Un material particularmente preferido es algodón absorbente. En general, se prefiere que el miembro absorbente esté libre de aditivos tales como detergentes. En otras modalidades de la presente invención, la cavidad exterior 10 es provista con un gel (no mostrado), tal como agarosa, el cual sirve para atrapar el medio. Debido a que el gel de agarosa puede ser adicionado justo hasta por abajo del nivel de las aberturas 21 , una mayor cantidad de medio de nutrientes se hace disponible al equivalente de tejido y suministro de nutrientes al equivalente de tejido 26, 28 no es agotado tan rápidamente. El uso de tales geles proporciona beneficios para almacenar y embarcar el aparato de la presente invención en términos de minimizar la fuga de los medios y contaminación potencial resultante del equivalente de tejido. Los recipientes exterior 10 e interior 20 pueden hacerse de cualquier material , el cual no reaccione con o tenga un efecto indeseable sobre los componentes del ensayo, incluyendo el equivalente de tejido. Por ejemplo, la mezcla de vaciado para el equivalente de tejido vivo no debe adhreirse a las paredes del recipiente interior durante la contracción, con el fin de interferir con la formación del equivalente de tejido. Se ha encontrado que los métodos usados para esterilizar el recipiente interior 20 puede impactar la adherencia del equivalente de tejido. Por ejemplo, el tejido en formación se adherirá a poliestireno, un material preferido para el recipiente interior, cuando se esteriliza mediante haz de electrones pero no cuando se esteriliza mediante óxido de etileno. En contraste, K-RESIN . RTM. polímero de butadieno-estireno, una aleación de poliestireno y butadieno y un material particularmente preferido para el recipiente interior, puede esterilizarse medinte haz de electrones sin provocar que el equivalente de tejido en formación se adhiera. (K-RESIN .RTM. polímero de butadieno-estireno es una marca comercial de Phillips Petroleum). En algunas modalidades, es deseable que los recipientes sean hechos de manera que el equivalente de tejido es visible a través del recipiente, por ejemplo, a través de las paredes del recipiente o a través de una ventana en el recipiente. Los materiales preferidos para el recipiente 10 incluyen poliestireno y PETG. El recipiente interior 20 puede ser de cualquier forma y volumen, el cual acomodará el tamaño y forma del equivalente de tejido deseado. Las dimensiones del recipiente nuevamente dependerán del tamaño y forma del equivalente de tejido deseado y los volúmenes de ensayo deseados. Por ejemplo, un recipiente teniendo un diámetro exterior de aproximadamente 25 mm y un volumen de aproximadamente 5 mi es útil para practicar la presente invención. En la modalidad mostrada en las FIGS. 13-15, múltiples recipientes son provistos en una base o sostén.

El miembro permeable 24 debe tener suficiente fuerza para soportar el gel de colágeno hidratado, acelular, 25 y el equivalente de tejido 26, 28. Las membranas porosas son útiles en la práctica de la presente invención. El tamaño de poro de tales membranas es seleccionado con el fin de proporcionar unión para el gel de colágeno hidratado, acelular, 25. Las membranas preferidas son hidrofílicas, tienen un espesor de aproximadamente 1 hasta 1 mm y diámetros de poro que varían desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 .mu. Los materiales preferidos para el miembro permeable 24 incluyen policarbonato. Un miembro permeable particularmente preferido es una membrana de policarbonato, de preferencia libre de agentes humectantes, comercialmente disponibles de Nuclepore y teniendo un tamaño de poro de aproximadamente 3 hasta 10 . mu . El medio sellador 30 puede hacerse de cualquier material, el cual sea inerte a las condiciones del ensayo y los equivalentes de tejido siendo usados, así como proporcione un buen sello entre el recipiente interior 20 y el equivalente de tejido. Los materiales preferidos incluyen polietileno, TEFLON. RTM. PTFE politetrafluoroetileno, una marca de E. l. Du Pont de Nemours and Company, policarbonato y nylon. El medio sellador es especialmente útil donde se desea mantener los contenidos del recipiente exterior separados de cualquier solución o substancia aplicados a la epidermis 25, por ejemplo, cuando se mide la difusión o permeación de una substancia a través de un equivalente de tejido. Tanto los equivalentes de tejido como el gel de colágeno hidratado acelular de acuerdo con la presente invención , pueden prepararse usando colágeno derivado de piel y tendón, incluyendo tendón de cola de rata, colágeno de piel de ternera y tendón de extensor de ternera. Otras fuentes de colágeno serían adecuadas. Una composición de colágeno particularmente preferidas derivadas de tendón de extensor digital común de ternera y métodos para derivar tales composiciones se describen en la solicitud de patente estadounidense co-pendiente ser. No. 07/407,465 presentada el 02/09/1 94, cuay descripción es incorporada en la presente por referencia. En un método de la presente invención, un gel de colágeno hidratado acelular 25 es preparado a partir de una composición de colágeno comprendiendo colágeno a aproximadamente 0.5 hasta 2.0mg/ml, de preferencia aproximadamente 0.9 hasta 1 .1 mg/ml y medios de nutrientes. Esta composición de colágeno es adicionada al recipiente interior 20 y mantenida bajo condiciones que permiten que la composición de colágeno se asiente y forme un gel de colágeno hidratado, acelular, de dimensiones adecuadas, normalmente de aproximadamente 1 hasta 5 mm de espesor, siendo un rango de espesor preferido de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 mm. Un gel de colágeno hidratado, acelular, 25 es de preferencia suficientemente grueso de manera que una porción permanece acelular conforme las células migran del equivalente de tejido hacia el gel de colágeno hidratado, acelular, y suficientemente delgada de manera que el equivalente de tejido no es removido indeseablemente de la fuente de nutrientes provista en el recipiente exterior 1 0. Un equivalente dérmico es vaciado a continuación en un gel de colágeno hidratado usando procedimientos de acuerdo con las patentes y como se describe más adelane en la presente. Una mezcla de vaciado conteniendo colágeno y fibroblastos es adicionada al recipiente interior 20 sobre un gel de colágeno hidratado, acelular 25 y mantenida bajo condiciones las cuales permiten que se forme el equivalente de tejido. Conforme el equivalente de tejido se forma en un gel de colágeno hidratado, acelular 25, se contrae radialmente. Sin embargo, un gel de colágeno hidratado acelular, 25 previene la excesiva contracción radial del equivalente de tejido sin la necesidad de medios de restricción mecánicos, tales como, metales texurizados y plásticos o sujetadores de lazo y gancho VELCRO. RTM, una marca comercial de Velero Corporation. Normalmente, los lados del equivalente de tejido 26 se inclinan hacia la periferia exterior de gel de colágeno hidratado 25 para formar una meseta como se muestra en las FIGS. 15 y 6 a 52. El equivalente de tejido 26 es sembrado ahora con células epiteliales para formar la capa epidérmica 28. Las células epidérmicas son sembradas en medio de cultivo a una concentración de aproximadamente 0.3x106 hasta 30x106. El volumen de células epidérmicas sembradas dependerá del tamaño de la meseta. La concentración de colágeno, el número de células y el volumen de la mezcla de vaciado puede controlarse para optimizar el diámetro y espesor del equivalente de tejido vivo. La mezcla de vaciado comprende células a una concentración de aproximadamente 1 .25 a 5x1 04 células/ml y colágeno a aproximadamente 0.5 hasta 2.0 mg/ml en un medio de nutrientes. Una concentración de células preferida es aproximadamente 2.5x1 0" células/ml. Se ha encontrado que la proporción del volumen de la mezcla de vaciado para el equvivalente de tejido al volumen de la mezcla de vaciado para el gel de colágeno hidratado, acelular, tiene un efecto sobre la viabilidad celular y diferenciación. Proporciones útiles, v/v, de mezcla de vaciado de equivalente de tejido a mezcla de vaciado de gel de colágeno son aproximadamente 3: 1 hasta 1 :3. Una proporción preferida en donde la concentración celular en el látex de colágeno es aproximadamente 2.5x105 células/ml es 3: 1 . La invención será entendida adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son puramente ejemplares por naturaleza y no pretenden ser utilizados para limitar el alcance de la invención. Los materiales usados en los siguientes ejemplos fueron obtenidos de fuentes indicadas en los ejemplos o hechos de acuerdo con las ublicaciones indicadas. Los procedimientos estériles fueron usados a través de los Ejemplos. Los equivalentes de tejido fueron matenidos bajo 10% de C02 en el incubador y se usaron procedimientos estériles a lo largo. Los siguientes ejemplos son provistos para explicar mejor la práctica de la presente invención y no deberían ser interpretados en manera alguna para limitar el alcance de la presente invención. Aquéllos expertos en la técnica reconocerán que varias modificaciones pueden hacerse a los métodos descritos en la presente, aunque no se aparta del espíritu y alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Formación de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio neonatal humano Los fibroblastos de prepucio neonatal humano (originado en Organogénesis, Inc. Cantón, MA) se sembraron a 5x105 células/162 cm2 de matraz tratado de cultivo de tejido (Costar Corp., Cambridge, MA, cat #3150) y se cultivaron en medio de crecimiento. El medio de crecimiento consistió de: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% suero de ternera recién nacida (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y 4 mM L-glutamina (BioWittaker, Walkersvielle, MD). Las células fueron mantenidas en un incubadora a 37 ± 1°C con una atmósfera de 10 ± 1% C02. El medio fue reemplazado con medio recién preparado cada dos a tres días. Después de 8 días en cultivo, las células se han cultivado a confluencia, es decir, las células han formado una monocapa empacada a lo largo del fondo del matraz de culivo de tejido y el medio fue aspirado del matraz de cultivo. Para enjuagar la monocapa, se adicionó solución salina amortiguada con fosfato filtrada para ser estéril al fondo de cada matraz de cultivo y entonces se aspiró de los matraces. Las células fueron liberadas del matraz al adicionar 5 mi de tripsina-verseno glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada matrz y se mece suavemente para asegurar una completa cobertura de la monocapa. Los cultivos fueron regresados a la incubadora. Tan pronto como las células fueron liberadas, 5 mi de SBTI (inhibidor de tripsina de soya) se adicionaron a cada matraz y se mezclaron con la suspensión para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión celular fue removida de los matrazces y se dividió uniformemente entre tubos de centrífuga cónicos, estériles. Las células fueron recolectadas por centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos. Las células fueron resuspendidas usando medio fresco a una concentración de 3.0 x 1 06 células/ml y se sembraron sobre inserciones tratadas con cultivo de tejido de 24 mm de diámetro, de tamaño de poro de 0.4 miera, (TRANSWELL®, Corning Costar) en una charola de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 106 células/inserción (6.6 x 105 células/cm2). Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 10 ± 1 % C02 y se alimentaron con medio de producción fresco cada 2 a 3 días durante 21 días. El medio de produción comprendió: una mezcla de base 3: 1 de DMEM y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX-1 R (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos a una concetración resultante de: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2% de suero de ternera recién nacida (Hyclon, Logan, Utah), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO) , 1 x 1 0"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, S.t Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co. , Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, I nc. #01 3-1 2061 ) , 0.2 µ9/?t?? de L-prolina (Sigma, St. Louis. MO) , 0.1 µ9/?t?? de glicina (Sigma, St. Louis, MO) y 0.05% poli-etilenglicol (PEG) 3400-3700 MW (grado de cultivo celular) (Sigma, St. Louis, MO) . Las muestras para análisis histológico fueron tomadas en los días 7, 14 y 21 y se fijaron en formalina, entonces se incrustaron en parafina. Las muestras fijadas en formalina se incrustaron en parafina y secciones de 5 micrómetros se mancharon con hematoxili n-eosina (H&E) de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. Usando portaobjetos manchados de H&E , se hicieron las mediciones de espesor a diez campos microscópicos escogidos aleatoriamente utilizando un ocular de 1 0X cargado con una retícula de 1 0 mm/100 micrómetros. Los resultados para dos cepas cel ulares diferentes de fibroblastos dérmicos humanos son resumidos en la Tabla 1 , la cual muestra el espesor de la construcción de célula-matriz conforme se desarrolla.

Las muestras también fueron sometidas a análisis de concentración de colágeno en los días 7, 14 y 21 . El contenido de colágeno fue estimado al emplear un ensayo colorimétrico para contenido de hidroxiprolina conocido en la técnica (Woessner, 1961 ). A esos mismos tiempos, también se determinó el número celular. La Tabla 2 es un resumen de concentración de colágeno y la Tabla 3 es un resumen de los datos de células de las construcciones de célula-matriz producidas a partir de dos diferentes cepas celulares (B1 56 y B1 19) usando el procedimiento descrito antes.

Las muestras de la matriz dérmica derivada de células humanas de los días 7, 14 y 21 fueron analizadas mediante SDS-PAGE de reducción retardada para determinar la composición de colágeno bandas alfa de colágeno tipo I y tipo I I I en las muestras. Las características bioquímicas de la matriz dérmica fueron determinadas usando métodos inmunohistoquímicos. La identificación de fibronectina se realizaron en secciones fijas en parafina usando el sistema de estrepavidina-biotina Zymed Histostain (Zymed Laboratories Inc. , South San Francisco, CA. La presencia de tenascina fe determinada mediante manchado de anticuerpo anti-tenascina primario (Dako, Carpintheria, CA) seguido por anticuerpo etiquetado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón (Calbiochem) como un anticuerpo secundario. Las muestras fueron visualizadas al aplicar diaminobencina (Sigma St. Louis, MO) y se contramancharon con rojo Nuclear Fast. La cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) se realizó en las muestras de día 21 usando el método previamente descrito (Farndale, 1986). El ensayo mostró la presencia de 0.44 gramos de GAG por cm2 en una muestra de matriz dérmica derivada de células humanas tomada 21 días post sembrado.

Ejemplo 2: Construcción de piel de espesor completo Usando una construcción dérmica formada usando el método descrito en el Ejempo 1 , los queratinocitos epidérmicos de prepucio nenatal humano normales (originados en Organogénesis, Inc. Canon, MA) se plantaron sobre la construcción de célula-matriz para formar la capa epidérmica de la construcción de piel. El medio fue removido asépticamente de la inserción de cultivo y sus alrededores. Los queratinocitos epidérmicos humanos normales fueron escalados a paso 4 a partir de stock celular de subcultivo congelado a confluencia. Las células fueron liberadas entonces a partir de los platos de cultivo usando tripsina-verseno, se depositaron, centrifugaron para formar una pella celular, se resuspendieron en medio de epidermalización, se contaron y sembraron en la parte superior de la membrana a una densidad de 4.5 x 1 04 células/cm2. Las construcciones se incubaron entonces durante 90 minutos a 37 ± 1 °C, 1 0% C02 para permitir que se unan los queratinocitos. Después de la incubación, las construcciones fueron sumergidas en medio de epidermalización. El medio de epidermalización está compuesto de: una mezcla de base 3: 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) y medio F-12 de Ham (Quality Biologcs Gaitersburg, MD) , complemenado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO); 1 x 10"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY) , 1 x 10 " M O-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Ouis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO); 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), 6.78 ng/ml de selenio o(Aldrich), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wi), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0.3% de suero de ternera recién nacida quelado (Hyclon, Logan, Utah), 0.628 ng/ml de progesterona (Amersham Arlington Heigts, IL) , 50 µg/ml de sal de sodio de L-ascorbato (Sigma Aldrich Fine ChemicalsCompany, Milwaukee, WI), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Life Technologies Inc. , MD) y 50 µ9/?t?? de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, IL). Las construcciones fueron cultivadas en el medio de epidermalización durante 2 días a 37 ± 1°C, 10% C02. Después de 2 días, la construcción fue sumergida en medios compuestos por mezcla 3:1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), complementado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO), 1 x 10" etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 x 10" o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St Louis, MO), 5 µ9/G?? de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0.3% de suero de ternera recién nacida quelado (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0.628 ng/ml de progesterona (Amersham, Arlington Heights, IL), 50 µg/ml ascorbato de sodio, 265 µg/ml de cloruro de calcio (Mallinckrodt, Chesterfield, MO), y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, IL). Nuevamente la construcción se incubó a 37 ± 1°C, 10% C02 durante 2 días. Después de los 2 días, el portador conteniendo la construcción fue transferida asépticamente a nuevas charolas de cultivo con una cantidad suficiente de medio de cornificación, 9 mi, para alcanzar un nivel de fluido justo a la superficie de la membrana portadora para mantener una inferíase seca para permitir la estratificación de la capa epitelial. Las construcciones fueron incubadas a 37 ± 1 °C, 1 0% C02, y baja humedad, en medios con cambios de medio cada 2-3 días durante 7 días. Este medio es compuesto por una mezla 1 : 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), complementado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO) , 1 x 10"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) , 6.78 ng/ml de selenio (Aldrich), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2% de suero de ternera recién nacida (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 µg/ml de ascorbato de sodio y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amdersham, Arlington Heights, I L). Desués de 7 días, la construcción fue alimentada durante 10 días más, con cambios cada 2-3 días con un medio de mantenimiento. Este medio de mantenimiento fue compuesto por: mezcla 1 : 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO), 1 x 10"4 etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO) , 5 µg/ml de insulina (Sigma, t. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louís, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 24.4 µg ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl) , 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 1 % de suero de ternera recién nacida ( BioWhittaker, Walkersville, MD), y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, IL). Las muestras finales fueron sometidas a procesamiento de heotoxilina y eosina como se describe en el Ejemplo 1 para determinar la apariencia gruesa bajo microscopía luminosa. La construcción resultante consistió de una capa menor (dérmica) consistiendo de fibroblastos rodeados por matriz teniendo características descritas en el Ejemplo 1 y se cubrió completamente por una capa de múltiples capas, estratificada y bien diferenciada de queratinocitos que exhiben una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo similar a aquél de piel in situ. La construcción de piel tiene una membrana de basamento bien desarrollado presente en la unión dérmica-epidérmica como se exhibió mediante microscopía de transmisión de electrones (TEM). La membrana de basamento parece más gruesa alrededor de los hemidesmosomas, marcado por fibrillas de anclaje que están comprendidas de colágeno tipo VI I , como es visualizado por TEM. Como se espera que estas fibrillas de anclaje pueden verse fácilmente saliendo de la membrana de basamento y atrapando las fibrillas de colágeno. La presencia de laminina, una glicoproteína de membrana de basamento, fue mostrada usando la técnica inmnoenzimática de avidina-biotina previamente descrita (Guesdon, 1 979).

Ejemplo 3: Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio de neonatal humano en medio químicamente definido Los fibroblastos de prepucio neonatal humano fueron expandidos usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . Las células fueron resuspendidas entonces a una concentración de 3 x 1 06 células/ml, y se sembraron sobre inserciones de membrana tratada con cultivo de tejido de 24 mm de diámetro, de 0.4 miera de tamaño de poro, en una charola de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 106 células/TW (6.6 x 105 células/cm2). Estas células fueron mantenidas entonces como el Ejemplo 1 con suero de ternera recién nacida omitido del medio a lo largo. Más específicamente, el medio contenía: una mezcla 3: 1 de base de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO), 1 x 1 0"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat #02400 grado ACS) , 1 x 10*4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), y 6.78 ng/m de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 µ?/Gp ? de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO); 0.1 µg ml de glicina (Sigma, St. Louis, MO) y 0.05% de poli-etilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras se verificaron en el día 7, 14 y 21 para concentración de colágeno y número celular usando los procedimientos descritos. Los resultados se resumen en las tablas 4 (número celular) y 5 (colágeno). Las muestras también fueron fijadas en formalina y se procesaron para manchado de hemotoxilina y eosina para análisis de microscopio luminoso como se describe en el Ejemplo 1 . La evaluación histológica demostró que las construcciones cultivadas en medio definido fue similar a aquéllas cultivadas en la presencia de 2% suero de ternera recién nacida. Las muestras también se mancharon positivamente para fibronectina, usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 .

Tabla 4: Colágeno ^g/ml) Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Cantidad 0 1 07.63±21 .96 329.85±27.63 465.83±49.46 promedio de colágeno en cada construcción (n=3) Tabla 5: Células (células/cmz) Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Número 6.6x105 7.8±2.2x105 9.6±2.5x1 05 1 .1 9±2.1 x1 05 promedio de células en cada construcción (n=3) Además de colágeno fibrilar endógenamente producido, también estuvieron presentes decorina y glicosaminoglicano en la construcción de célula-matriz.

Ejemplo 4: Construcción de piel de espesor completo formada usando medio químicamente definido Usando una construcción dérmica de 25 días formado por fibroblastos dérmicos humanos bajo condiciones químicamente definidos similares al método descrito en el Ejemplo 3, los queratinocitos epidérmicos de prepucio neonatal humano normal se sembraron en la superficie superior de la construcción de célula-matriz para formar la capa epidérmica de la construcción depiel. El medio fue removido asépticamente de la inserción de cultivo y sus alrededores. Los queratinocitos epidérmicos humanos normales fueron escalados a paso 4 a partir de stock celular de subcultivo congelado a confluencia. Las células fueron liberadas entonces de las placas de cultivo usando tripsina-verseno, se depositaron, centrifugaron para formar una pella celular, se resuspendieron en medio de epidermalización, se contaron y sembraron en la parte superior de la membrana a una densidad de 4.5 x 104 células/cm2. Las construcciones fueron incubadas entonces durante 90 minutos a 37 í 1 °C, 1 0% C02 para permitir que se unan los queratinocitos. Después de la incubación, las construcciones fueron sumergidas en medio de epidermalización. El medio de epidermalización está compuesto por una mezcla base 3: 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (no conteniendo glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD) y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), complementado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO), 1 x 10" 1 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM de triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), 6.78 ng/ml de selenio (Aldrich), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 µg/ml de sal de sodio de L-ascorbato (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 16 µ? ácido linoleico (Sigma, St. Louis, MO), 1 µ? acetato de tocoferol (Sigma, St. Louis, MO) y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, IL). Las construcciones fueron cultivadas en el medio de epidermalización durante 2 días a 37 ± 1 °C, 1 0 ± 1 % C02. Después de 2 días, el medio fue intercambiado con medio fresco compuesto como antes, y se regresó a la incubadora puesta a 37 ± 1 °C, 10 ± 1 % de C02 durante 2 días. Después de los 2 días, el portador conteniendo la construcción fue transferida asépticamente a nuevas charolas de cultivo con medio suficiente para lograr un nivel de fluido justo a la superficie de la membrana portadora para mantener la construcción en desarrollo en la interfase aire-líquido. El aire que contacta la superficie superior de la capa epidérmica en formación permite la estratificación de la capa epitelial. Las construcciones fueron incubadas a 37 ± 1 °C, 1 0% C02, y baja humedad, en medio con cambios de medio cada 2-3 días durante 7 días. Este medio contenía una mezcla 1 : 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMDEM) (sin contener glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), complementado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO), 5 x 1 0"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 5 x 1 0~4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Copany), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2.65 µg/ml de cloruro de calcio (Malinckrodt, Chesterfield, MO), 16 µ? ácido linoleico (Sigma, St. Louis, MO), 1 µ? acetato de tocoferol (Sigma, St. Louis, MO), 1 .25 mM serina (Sigma, St. Louis, MO), 0.64 mM cloruro de colina (Sigma, St. Louis, MO) y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, I L). Los cultivos fueron alimentados cada 2-3 días durante 14 días. Las muestras, por triplicado, fueron presentadas 10, 12 y 14 días después de que la construcción fue levantada a la interfase aire-líquido para procesamiento de hematoxilina y eosina como se describe en el Ejemplo 1 para determinar la apariencia gruesa bajo microscopía luminosa. La construcción resultante consistió de una capa inferior (dérmica) consistiendo de fibroblastos rodeada por matriz teniendo características como se describe en el Ejemplo 3 y se cubrió por una capa de queratinocitos estratificados y diferenciados.

Ejemplo 5: Formación in vitro de una matriz colagenosa por fibroblastos de tendón de aquiles humano Las construcciones de célula-matriz fueron formadas usando el mismo método descrito en el Ejemplo 1 reemplazando los fibroblastos de prepucio neonatal humano con fibroblastos de tendón de Aquiles humano (HATF). Siguiendo 21 días en el medio de producción, las muestras también fueron sometidas a manchado de H&E y determinación de espesor usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . La construcción resultante fue visualizada como una construcción como tejido de célula matriz con un espesor de 75.00 ± 27.58 mieras (n=2). El colágeno fibrilar endógenamente producido, decorina y glicosamioglicano también fueron presentes en la construcción.

Ejemplo 6: Formación in vitro de una matriz colagenosa por fibroblastos de prepucio neonatal humano transfectados Los fibroblasts dérmicos humanos transfectados fueron producidos usando el siguiente procedimiento. Un vial de productores virales de factor de crecimiento derivado de plaqueta jCRIP-43 (PDGF) (Morgan, J. et al.) se descongeló las células fueron sembradas en matraz de 2 x106 células/162 cm2 (Corning Costar, Cambridge, MA). Esos matraces fueron alimentados con un medio de crecimiento y se mantuvieron en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 10 ± 1 % C02. El medio de crecimiento consistió de: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternera recién nacida (HyClone Laboratories, Inc. , Logan, Utah) y 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), En el mismo día, 1 vial de fibroblasto de prepucio neonatal humano (HDB1 56) también se descongeló y platinó en un matraz de 1 .5 x 106 células/162 cm2 (Corning Costar, Cambridge, MA). Después de tres días, los productores virales de PDGF-43 jCRIP se recolectó y filtró a través de un filtro de 0.45 miera. Se adicionaron 8 µg/ml de polibreno a este medio empleado filtrado. El medio empleado se colocó entonces en HDF. En los siguientes dos días, los HDF se alimentaron con medio de crecimiento fresco. El día después de que los HDF se pasaron de p5 a p6 y se sembraron a una densidad de 2.5 x 106 células/162 cm2 de matraz (Corning Costar, Cambridge, MA). Ls céluls fueron pasadas como sigue: el medio empleado fue aspirado. Los matraces fueron enjuagados entonces con una solución amortiguada de fosfato para remover cualquier suero de ternera recién nacida residual. Las células fueron liberadas del matraz al adicionar 5 mi de tripsina- versno a cada matraz y mecer suavemente para asegurar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos fueron regresados a la incubadora. Tan pronto como las células fueron liberadas, se adicionaron 5 mi de SBTI (inhibidor de tripsina de soya) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión de célula/tripsina/SBTI se removió de los matraces y se dividió uniformemente entre tubos de centrífuga cónicos, estériles. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a aproximadamente 800-1 000 x g durante 5 minutos). Las células fueron resuspendidas en el medio de crecimiento para sembrar a la densidad listada. Después de dos días, las células fueron alimentadas con medio de crecimiento fresco. El siguiente día, las células fueron recolectadas como antes y se diluyeron a una densidad de 1 .5 x 106 células/ml en medio de crecimiento conteniendo 1 0% de suero de ternera recién nacida (NBCS) con 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron congeladas entonces 1 ml/criovial a aproximadamente -80°C. La producción de la matriz colagenosa para este ejemplo utiliza el mismo procedimiento que los Ejemplos 1 y 3, reemplazando los fibroblastos de prepucio neonatal humano con fibroblastos de prepucio neonatal humano transformados para producir altos niveles de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) como se describe antes. Las muestras fueron tmoadas para manchado de H&E como se describe antes en el día 1 8 post-sembrado. Las muestras también fueron manchadas usando los métodos de avidina-biotina por la presencia de fibronectina listada en el Ejemplo 10. Las muestras fueron tomadas en el día 18 post-sembrado para manchado de H E como se describe en el Ejemplo 1 y exhibieron una apariencia gruesa de célula-matriz similar a aquélla descrita en el Ejemplo 1 , con un espesor medio de 123.6 mieras (N = 1 ). El rendimiento de PDGF de las células transfectadas en la construcción de célula-matriz se midió para ser 1 00 ng/ml mediante ELISA a lo largo de la duración del cultivo (18 días), mientras que el rendimiento de control de PDGF no fue detectable.

Ejemplo 7: Uso de la construcción dérmica como un material de injerto Las construcciones de célula-matriz fueron preparadas de acuerdo con los métodos en el Ejemplo 1 usando fibroblastos dérmicos humanos derivados de prepucio de neonato y se injertaron sobre heridas de excisión completa creadas en ratones atímicos desnudos. Los ratones fueron injertados de acuerdo con los métodos descritos por Parenteau, et a. (1996), cuya descripción es incorporada en la presente. Los injertos fueron examinados a 14, 28 y 56 días para signos de adherencia al lecho herido, evidencia de contracción de herida, áreas de pérdida de injerto y presencia de vascularización (color). Las áreas de injerto fueron fotografiadas mientras estaban intactas en el ratón. Un número de ratones se sacrificaron en cada punto en el tiempo, y las áreas de injerto y sus alrededores se cortaron junto con un reborde circundante de piel de murino a al menos el panniculus carnosus. Las uniones entre el injerto y la piel de murino se conservaron en cada muestra. Las muestras de tejido explantadas fueron fijadas entonces en fosfato amortiguado 10% de formalina y fijación en metanol. Las muestras fijadas en formalina se procesaron para manchado de H&E de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . Los injertos fueron capaces de integrarse con la piel de ratón, con contracción mínima notada. Dentro de 14 días de injerto, la epidermis de ratón había migrado completamente sobre el injerto. Usando las muestras manchadas de H&E, los vasos fueron obvios dentro del injerto a 14 días y a lo largo del experimento. Mediante observación gruesa y por muestras manchadas de H&E, se determinó que el injerto persistió y la apariencia saludable permaneció conteniendo células vivas, ninguna gruesa (anormalidades, etc.) a lo largo del experimento.

Ejemplo 8: Uso de construcción de piel de espesor completo como un injerto de piel Las construcciones de piel de bicapa se prepararon como se describe en el Ejemplo 2 usando fibroblastos dérmicos humanos derivados de prepucio neonatal en la capa dérmica y queratinocitos humanos derivados de un prepucio neonatal diferente en la capa epidérmica. Las construcciones de piel fueron capaces de ser peladas manualmente de la membrana, manejadas sin soporte portador y colocadas sobre el sitio de injerto. Las construcciones de piel de bicapa fueron injertadas sobre las heridas de excisión completa creadas en ratones atímicos desnudos de acuerdo con los métodos descritos por Parenteau, et al . (1 996), cuya descripción es incorporada en la presente. Los puntos de tiempo para tomar muestras fueron días 7, 14, 28, 56 y 184 días post-injerto. Las áreas de injerto fueron fotografiadas al tiempo que está intacto en el ratón. Un número de ratones fueron sacrificados en cada punto en el tiempo y las áreas de injerto y sus alrededores se cortaron junto con un reborde circundante de piel de murino a al menos el panniculus carnosus. Las uniones entre el injerto y la piel de murino se conservaron en cada muestra. Las muestras de tejido explantadas se fijaron entonces en formalina 1 0% amortiguada con fosfato y fijación en metanol. Las muestras fijadas con formalina se procesaron para manchado de H/E de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . Los injertos integrados con el tejido huésped dentro de 7 días mediante observación gruesa así como mediante apariencia histológica. Mediante manchado de H&E, los vasos fueron visualizados creciendo en el injerto del tejido huésped dentro de 7 días de injerto. Los injertos permanecieron saludables y persistieron a través del experimento, con contracción mínima notada. Utilizando manchado de involucrina antihumana, la persisencia de células epidérmicas humanas se mostró para el periodo de injerto completo.

Ejemplo 9: Formación in vitro de una matriz mediante queratocitos córneos humanos Las células de queratocitos córneos humanos (originados en Organogénesis, Inc. Cantón, MA) se usaron en la producción de una construcción estromal de córnea. Los cultivos confluentes de queratocitos humanos se liberaron de sus substratos de cultivo usando trispina-verseno. Cuando se liberan, se usó el inhibidor de tripsina de soya para neutralizar el tripsina-verseno, la suspensión celular fue centrifugada, el sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron entonces en medio de base a una concentración de 3x1 06 células/ml. Las células se sembraron sobre transcavidades tratadas de cutivo de tejido de 24 mm de diámetro, de 0.4 miera de tamaño de oro, en una charla de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 106 células/TW (6.6 x 105 células/cm2). Estos cultivos fueron mantenidos durante la noche en medio de siembra. El medio de siembra fue compuesto por: una mezcla de base 3: 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medi F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD ca.), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF) (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY) , 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO), 1 x 10"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 x 1 0"4 M o-fosforil-etanlamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Ouis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl). Siguiendo esto, los cultivos fueron alimentados con medio de producción fresco. El medio de producción fue compuesto por: una mezcla de base 3: 1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology Lake Placid , NY), 2% de suero de ternera recién nacida (Hyclone, Logan, Utah), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO), 1 x 1 0" 1 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY grado ACS), 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/m de seienio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co. , Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Puré Chemical Company), 0.2 µg/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 µg/ml de glicina (Sigma, St. Louis, mO) y 0.05% poli-etilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, grado de cultivo celular). Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 10% ± 1 % C02 y se alimentaron con medio de produción fresco cada 2-3 días durante 20 días (para un total de 21 días de cltivo. Después de 21 días de cultivo, los queratocitos han depositado una capa de matriz de aproximadamente 40 mieras en espesor, como se mide mediante el método descrito en el Ejemplo 1 . también estuvieron presentes colágeno fibrilar endógenamente producido, decorina y glicosaminoglicano en la construción de célula-matriz.

Ejemplo 10: Formación in vitro de una matriz colagenosa por fibroblastos de prepucio neonatal humano sembrados en medio de producción Fibroblastos de prepucio neonatal humano (Originado en Organogénesis, Inc. Cantn, MA) se sembraron a 1 x 105 células/portadores de tratados de cultivo de tejido de 24 mm de diámetro, de 0.4 miera de tamaño de poro, en una charola de seis cavidades (TRANSWELL®, Costar Corp. Cambridge, MA) y se cltivaron en medio de crecimiento. El medio de crecimiento consistieron de: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 1 0% suero de ternera recién nacida (HyClone Laboratories, Inc. , Logan, Utah) y 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 10 ± 1 % C02. El medio fue reemplazado cada dos a tres días. Después de 9 días en cultivo, el medio fue aspirado de la placa de cultivo y se reemplazó con medio de producción. Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 10 ± 1 % C02 y se alimentaron con medio de producción fresco cada 2-3 días durante 21 días. El medio de producción fue compuesto por: una mezcla 3: 1 de base de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaitersburg, MD), 4mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 2% suero de ternera recién nacida (Hyclone, Logan, Utah), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO), 1 x 10"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY rado ACS), 1 x 10~4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma aldrich Fine Chemicals Co. , Milwaukee, Wl), 50 ng/m! de acido L-ascórbico (WAKO Puré Chemical Company), 0.2 µ9/??? de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 µ9/??? de glicina (Sigma, St. Louis, MO) y 0.05% de poli-etilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, grado de cultivo celular). Las muestras fueron tomadas en el día 21 y se fijaron en formalina, entonces se ncrustaron en parafina. Las muestras fijadas en formalina fueron incrustadas en parafina y secciones de 5 micrómetros fueron manchadas con hematoxilina-eosina (H&E) de acuerdo con técnicas usadas de manera rutinaria en la técnica. Usando portaobjetos manchados con H&E, se hicieron mediciones en diez campos microscópicos aleatoriamente escogidos utilizando un ocular de 10X (Olympus America Inc., Melville, NY) cargado con una retícula de 10mm/10 micrómetros (Olympus America Inc., Melville, NY). Las construcciones creadas usando este método son similares en estructura y composición bioquímica a aquéllas creadas con el Ejemplo 1, y tienen un espesor medido de 82.00 ± 7.64 mieras.

Ejemplo 11: Formación in vitro de una matriz colagenosa por fibroblastos dérmicos de cerdo Los fibroblastos dérmicos de cerdo (originados en Organogénesis, Inc. Cantón, MA) se sembraron a 5 x 105 células/162 cm2 de matraz tratado de cultivo de tejido (Cstar Corp, Cambridge, MA. Cat # 3150) y se cultivaron en medio de crecimiento como se describe antes. El medio de crecimiento consistió de: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternera fetal (HyClone Laboratories, Inc. , Logan, Utah) y 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 1 0% ± °% C02. El medio fue reemplazado cada dos a tres días. Sobre confluencia, que es que las células han formado una capa empacada en el fondo del matraz de cultivo de tejido, el medio fue aspirado de la placa de cultivo. Para enjuagar la monocpa, se adicionó solución salina amortiguada con fosfato estéril por filtración se adicionó a la monocapa y entonces se aspiró del plato. Las células fueron liberadas del matraz al adicionar 5 mi de tripsina-verseno glutmina (BioWhittaker, Walkersville, MD a cada matraz y mecer suavemente para asegurar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se regresaron a la incubadora. Tan pronto como las células se liberaron 5 mi de SBTI (inhibidor de tripsina de soya) se adicionaron a cada matraz y se mezclaron con la supsensión ceular para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión se removió de los matraces y se dividió uniformemente entre tubos de centrífuga cónicos, estériles. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos. Las células fueron resuspendidas y se diluyeron a una concentración de 3 x 106 células/ml y se sembraron sobre transcavidades tratadas con cultivo de tejido de 24 mm de diámetro, de 0.4 miera de tamaño de poro, en una charola de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 1 06 células/TW (6.6 x 105 células/cm2). Las células fueron mantenidas durante la noche en un medio de siembra. El medio de siembra consistió de: una mezcla de base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAXC (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 0.4 µg/ml de hidrocortionsa (Sigma St. Louis, MO), 1 x 10" M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY grado ACS), 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Puré Chemical Company), 0.2 µg/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO) y 0.1 µ9/??? de glicina (Sigma, St Louis, MO). Ls células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1°C con una atmósfera de 10 ± 1% C02 y se alimentaron con medio de producción fresco cada 2-3 días durante 7 días. El medio de producción fue compuesto por: una mezcla de base 3: de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMx (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotecnology, Lake Placid, NY), 2% de suero de ternera recién nacida (Hycone, Logan, Utah), 0.4 µg/ml de hidrocortisna (Sigma St. Louis, MO), 1. x 10*4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY graso ACS), 1 x 10'4 M o-fosforil-etanolamina (Sgma, St. Louis), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrna (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St Louis, MO) y 678 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, Wl) , 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Pure Cehical Company) , 0.2 µg/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 µg/ml de glicina (Sigma, St. Louis, MO) y 0.05% de poli-etilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO) de grado cultivo celular. Después de 7 días, el medio fue reemplazado con medio de producción sin suero de ternera recién nacida. Este medio fue alimentado fresco a las células cada 2-3 días durante 20 días más para un total de 28 días de cultivo. Las muestras fueron tomadas en el día 21 y se fijaron en formalina, entonces se incrustaron en parafina. Las muestras fijas en formalina se incrustaron en parafina y se mancharon secciones de 5 micrómetros con hematoxilina-eoxina (H&E) de acuerdo con técnicas usadas de manera acostumbrada en la técnica. Usando portaobjetos manchados de H&E, se hicieron mediciones en 10 campos microscópicos aleatoriamente escogidos utilizando un ocular de 10X (Olympus America Inc. , Melville, NY) cargado con una retícula de 10 mm/100 micrómetros (Olympus America Inc. , Meville, NY). La muestra exhibió una estructura compuesta por céulas y matriz con un espesor medido de 71 .20 ± 9.57 mieras. Además de colágeno fibrilar endógenamente producido, también estuvieron presentes decorina y glicosaminoglicano en la construcción de célula-matriz.

Ejemplo 12: Formación in vitro de una construcción de piel de bicapa conteniendo células de papila dérmica Se hizo una célula-matriz de acuerdo con el método en el Ejemplo 1 usando fibroblastos de prepucio neonatal humano como un primer tipo de célula productora de matriz. La célula-matriz fue sembrada localmente con manchas de células de papila dérmica como una segunda población celular, la cual fue sembrada a su vez con queratinocitos como una tercera población celular, para formar una capa epidérmica continua sobre la célula-matriz y las células de papila dérmica. Primero, se formó una construcción de célula-matriz usando fibroblastos dérmicos humanos (HDF) derivados de prepucio neonatal. HDF se escalaron al sembrarlas a 5 x 105 células/162 cm2 de matraz tratado de cultivo de tejido (Costar Corp. , Cambridge, MA) en medio de crecimiento consistiendo de: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (formulación de alta glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker.Walkersvile, MD) complementado con 10% de suero de ternera recién nacida (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc. , Logan, Utah) y 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD). Cuando son confluentes se libraron HDF de la placa usando tripsina-verseno y se resuspendieron usando medio fresco a una concentración de 3.0 x 106 células/ml, y se sembraron sobre inserciones tratadas de cultivo de tejido de 24 mm de diáemtro, de tamaño de poro de 0.4 miera (TRANSWELL®, Corning Costar) en una charla de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 1 06 células/inserció (6.6 x 105 células/cm2). Los cultivos de HDF se mantuvieron en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 1 0 ± 1 % C02 y se alimentó medio de producción fresco cada 2 a 3 días durante 23 días de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 1 .

Después de que la construcción de célula-matriz se había formado, se sembró con manchas de células de papilas dérmicas como una segunda población celular. Las células de papila dérmica son una población discreta de fibroblastos especializados rodeados por el bulbo piloso de folículos pilosos para jugar un papel de soporte en el crecimiento de cabello. Las papilas dérmicas pueden aislarse al microdisecar folículos pilosos y cultivarse in vitro usando el método descrito prevamente por Messenger, A.G. , The Culture of Dermal Papilla Cells from Human Hair Follicles (El cultivo de células de papilas dérmicas a partir de folículos pilosos humanos), Br. J . Dermatol. 1 10:685-9 (1 84), el método del cual es incorporado en la presente. Cuando un cultivo de células de papilas dérmicas alcanza confluencia, se forman agregados que pueden ser replatinados en matraces de cultivo para reformar nuevos agregados. Las papilas dérmicas fueron aisladas de una biopsia de piel obtenidas de un cerdo de 4 semanas de edad. Las células de las papilas dérmicas (PDP) fueron cultivadas serialmente en DMEM conteniendo 20% de NBCS hasta el paso 8. Después de 3 semanas de cultivo, las células PDP reformaron estructuras similares a papila dérmica, o agregados, que cada uno tuvo un diámetro de aproximadamente entre 90 hasta 21 0 mieras. Los agregados fueron removidos entonces de la placa de cultivo mediante pipeteado vigoroso de medio contra ellos, y entonces se sembraron sobre la matriz de colágeno humano a la densidad de 200 agregados por cm2. Los agregados fueron cultivados sumergidos durante unos 15 días adicionales en DMEM 20% NBCS con medio empleado intercambiado con medio fresco cada 2-3 días. Los cultivos de célula-matriz conteniendo células de papila dérmica sobre los mismos fueron sembrados con queratinocitos y se cultivaron para formar una capa epidérmica continua sobre la célula-matriz y las papilas dérmicas. Se hicieron dos construcciones diferentes: la priemra con queratinocitos humanos, la segunda con queratinocitos de cerdo. Los queratinocitos epidérmicos normales fueron aislados de prpecio neonatal umano (HEP), o de queratinocitos de cerdo (PEP) usando excrecencia de explante para establecer los cultivos primarios. Estas células fueron cultivadas entonces y expandidas hasta el paso 3 para la cepa de cerdo o hasta el paso 4 para la cepa humana. Después de aproximadamente 5 hasta 6 días de cultivo, las células fueron liberadas entonces de las placas de cultivo usando tripsina-verseno, se depositaron, centrifugaron para formar una pella celular, se resuspendieron en medio de epidermalización, se contaron y sembraron en la parte superior de la membrana a una densidad de 4.5 x 10" células/cm2 para células HEP, o 1 .6 x 105 células/cm2 para células PEP. Los cultivos epidermalizados fueron cultivados durante 1 2 días como se describe previamente en el Ejemplo 2. Las muestras finales fueron sometidas a procesamiento de hematoxilina y eosina para microscopía luminosa. Las construcciones de piel resultante exhibieron la organización morfológica básica similar a la piel: una capa dérmica consistiendo de fibroblastos rodeada por matriz endógenamente producida, incluyendo colágeno fibrilar endógenamente producido, decorina y glicosaminoglicano, áreas localizadas de células de papila dérmica y una capa estratificada, continua de queratinocitos a través de la construcción de célula-matriz y las papilas dérmicas. En ambas construcciones de tejido cubiertas con ya sea queratinocitos humanos o de cerdo, la papila dérmica mantuvo una estructura empacada que indujeron pequeñas ondulaciones del epitelio cubierto. Las células epiteliales diferencias están presentes frecuentemente cercanas a las células de papila dérmica.

Ejemplo 13: Medición de ácido hialurónico mediante ELISA de emparedado Se midió el ácido hialurónico (HA) en construcciones de célula-matriz formadas por fibroblastos dérmicos en medio conteniendo suero y medio químicamente definido de acuerdo con los métodos de los Ejemplos 1 y 3, respectivamente. Las construcciones de célula-matriz se formaron en portadores circulares de 75 mm de diámetro incorporando una membrana porosa (TRANSWELL®, Corning Costar). Extractos de las construcciones de célula-matriz se prepararon al adicionar 1 0 mi de amortiguador de acetato de amonio y 0.5 mg/ml de Proteinasa K a un tubo de prueba conteniendo una construcción de célula-matriz. La mezcla se incubó a 0°C durante la noche. Después de la terminación de digestión, la mezcla se giró hacia abajo y el extraco sobrenadante se transfirió a un tubo separado para ensayo de ácido hialurónico. Una placa de 96 cavidades fue recubierta con 50 µ? de 20 µg/ml de proteína de unión de HA en sol ución de NaHC03 0.1 M y se al macenó d urante la noche a 4°C. La placa se lavó entnces tres veces con 0.5% de NaCI conteniendo 0.05% Tween 20. A cada cavidad se adicionaron entonces 250 µ de sol ución bloqueadora (amortiguador de fosfato de sodio, 1 0 mmol , pH = 7.4 conteniendo 3% BSA y 0.9% NaC , PBS + 3% BSA) y la placa se incubó a RT durante 2 h. La placa se lavó entonces tres veces con 0.85% NaCI conteiendo 0.05% Tween 20. A la placa se adicionaron entonces 50 µ? de soluciones de HA estándares y extractos de ambas condiciones experi mentales, incluyendo varias diluciones de estas condiciones. La placa fue incubada a tem peratura ambiente (aproximadamente 20°C) durante 2 horas. La placa fue lavada entonces tres veces con 0.85% NaCI conteniendo 0.05% Tween 20 y a cada cavidad se adicionaron 50 µ9/??? de HA bioti nilado (dilución 1 :2000) y entonces se incubaron d urante 2 horas a temperatu ra ambiente. La placa se lavó entonces tres veces con 0.85% NaCI conteniendo 0.05% Tween 20 y entonces se adicionaron a cada cavidad 50 µ? de H RP-avidina D (dilución 1 : 3000). La placa se incubó entonces durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó entonces tres veces con 0.85% NaCI conteniendo 0.05% Tween 20 y a cada cavidad se adicionaron 1 00 µ? de solución de substrato de orto-fenilendiamina. La placa se incu bó a 37°C durante 10 minutos. La reacción se detuvo mediante adición de 50 µ? de HCI 1 M. Finalmente, usando un lector de placa, la absorbancia se leyó a 492 mm y se registró. Las mediciones de absorbancia se promediaron y convirtieron a medidas de cantidad . Las construcciones de célula-matriz circulares (75 mm de diámetro) formadas en un medio conteniendo suero se determinaron para contener cada una aproximadamente 200 µg de ácido hialurónico, mientras que aquéllas formadas en medio químicamente definido contenían cada una aproximadamente 1 .5 mg de ácido hialurónico.

Ejemplo 14: Prueba física y propiedades mecánicas de la construcción de célula-matriz producida Las propiedades mecánicas de las construcciones de Ejemplo 1 (construcción de célula-matriz), Ejemplo 2 (construcción de célula-matriz con una capa de queratinocitos sobre ella), y Ejemplo 3 (construcción de célula-matriz formada en medio definido) se cuantificaron mediante pruebas de inflación de membrana. Estas pruebas son similares a ensayos usados clínicamente (por ejemplo, Dermaflex®, Cyberderm Inc. , Media, PA y Cutameter®, Courage Khazaka, Colonia, Alemania), pero involucran mayores presiones incluyendo presiones capaces de explotar la membrana. La construcción de célula-matriz de muestra se dejó plana sobre un bloque de policarbonato centrado sobre una cavidad cilindrica de 1 00 mm de diámetro llenada con solución salina normotónica. Una placa de metal con un orificio circular correspondiente al diámetro de la cavidad cilindrica se colocó sobre la muestra y se aseguró al bloque. Las muestras fueron infladas entonces al infusionar solución salina adicional en la cavidad con una bomba de jeringa. La presión resultante se midió con un transductor de presión. La presurización se realizó hasta la falla de dispositivo, la fuerza de explosión, la cual promedió a 439.02 mm Hg para la construcción de célula-matriz generada mediante el método del Ejemplo 1 ; 998.52 mm Hg para las muestras de la construcción de célula-matriz con una capa de queratinocitos generada mediante el método del Ejemplo 2; y 1 542.26 mm de Hg para las muestras de construcción de célula-matriz formada en medio definido generadas de acuerdo con el método del Ejemplo 3. Para deteminar el punto de fusión térmica de la matriz dérmica, las muestras (construcción de célula-matriz), tomadas a 21 días, fueron preparadas usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . La temperatura de desnaturalización se determinó mediante análisis con calorímetro de exploración diferencial Mettler Toledo (Highston, NJ) (producto DSC #DSC12E). Para nuestros fines, la temperatura de fusión fue determinada al calentar la muestra desde 45 y 80°C a una velocidad de 1 °C minuto. La temperatura de desnaturalización promedio para las muestras es 60.8 ± 1 .2°C (n=3). La retención de sutura y fuerza de jalado de la matriz epidermalizada creada usando los procedimientos en los Ejemplos 1 (construcción de célula-matriz) y 3 (construcción de célula-matriz formada en medio definido) se midieron para determinar la suturabilidad de la construcción en ciertas situaciones clínicas. La fuerza de retención de sutura de la matriz dérmica humana de 21 días de edad se determinó usando el método descrito en la ubiicación de estándares de American National para prótesis de injerto vascular (Insrments, 1986) usando un sistema de prueba Mini-Bionex 858 (MTS Sistems Corporation, Minneapolis, Minn.) Para las muestras del Ejemlo 1 , (construcción de célula-matriz), la fuerza de tensión fue determinada como 365 N/m; para muestras preparadas de acuerdo con el Ejemplo 2 (construcción de célula-matriz con una capa de queratinocitos), la fueza de tensión fue 2720 N/m. La fuerza de retención de sutura para las muestras preparadas de acuerdo con el Ejemplo 1 fue 0.14 N; para esos preparados de acuerdo con el Ejemplo 2, 0.22 N . Las construcciones creadas como se describe en los Ejemplos 1 , 2 y 3 se han hecho tanto en diámetros de 24 mm como 75 mm. Las construcciones hechas mediante técnicas de cultivo de los 3 métodos son estructuras similares a tejido cohesivo , son empleadas fácilmente de la membrana con fuerza mínima, de aquí que son "pelables" y son capaces de ser manejadas y manipuladas físicamente para uso y prueba sin que ocurra daño.

Ejemplo 15: Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de pruepucio neonatales humano en medio químicamente definido Los fibroblastos de prepucio neonatal humano se expendieron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . Las células fueron resuspendidas entonces a una concentración de 3 x 1 06 células/ml, y se sembraron en inserciones de membrana tratada de cultivo de tejido de 24 mm de diámetro, de 0.4 miera de tamaño de poro, en una charola de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 106 células/TW (6.6 x 105 células/cm2). Las células en este ejemplo fueron cultivadas en medio químicamente definido a lo largo. El medio contenía: una mezcla de base 3: 1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 1 x 10" M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat # 02400 grado ACS), 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 5 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 µg/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 µg/ml de glicina (Sigma, St. Louis, MO). Al medio básico anterir, se adicionaron otros componentes en estas condiciones separadas: 1 . 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO), 0.05% poli-etilenglicl (PEG) (Sigma, St. Louis, MO). 2. 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO). 3. 375 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO), 6 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras fueron fijadas en formalina y se procesaron para manchado de hemotoxilina y eosina para análisis de microscopio luminoso. La evaluación histológica visual demostró que la Condición 2 careciendo de PEG demostró una matriz comparablemente similar como la Condición 1 conteniendo PEG. El análisis bioquímico midiendo el contenido de colágeno de la construcción mostró casi la misma cantidad de colágeno en ambos: 168.7 ± 7.98 µg/cm2 para la Condición 1 con PEG como se compara con 1 70.88 ± 9.07 µg/cm2 para la Condición 2 sin PEG. La Condición 3 conteniendo altos niveles de insulina e hidrocortisona mostraron una mayor expresión de matriz, incluyendo colágeno, en un punto en el tiempo más temprano que las otras dos condiciones. Además también estuvieron presentes colágeno fibrilar endógenamente producido, decorina y glicosaminoglicano en las construcciones de célula-matriz en todas las Condiciones. La construcción dérmica cultivada formada por el método de la Condición 2 de este Ejemplo es mostrada en la Figura 2. Mostrada en la Figura 2 está una fotomicrografía de una sección manchada con hematoxilina y eoxina, incrustada en parafina, fija, de una construcción de célula-matriz formada de fibroblastos dérmicos humanos cultivados en medio químicamente definido al día 21 . La membrana porosa parece como una banda translúcida delgada por debajo de la construcción y puede verse que las células crecen en la superficie de la membrana y no envuelven la membrana con la matriz. La Figura 3 muestra imágenes de microscopio de transmisión de electrones (TEM) de dos aumentos de construcción dérmica cultivada formada por el método de Condición 2 de este Ejemplo a los 21 días. La Figura 3A es un aumento de 7600X que muestra la alineación de fibras de colágeno endógenas entre los fibroblastos. La Figura 3B es un aumento de 1 9000X de fibras de colágeno endógenas completamente formadas demostrando el arreglo de fibrilla y empaque. En todas las Condiciones de este Ejemplo, las construcciones dérmicas cultivadas formadas comprenden fibroblastos dérmicos y matriz endógenamente producida. Todas han formado completamente fibrillas de colágeno en organización empacada dispuesta entre las células. Sus calidades fibrosas, espesor e integridad cohesiva dan a la construcción fuerza considerable para permitir que sea removida de manera pelable de la membrana de cultivo y manejada conforme es transferida a un paciente a ser tratado con la construcción , como en un injerto o implante.

Ejemplo 16: Construcción de piel de espesor completo Usando una construcción dérmica de 21 días formada por fibroblastos dérmicos humanos bajo condiciones químicamente definidas de acuerdo con el método de la Condición 2 (sin PEG) descrita en el Ejemplo 1 5, anterior, se sembraron queratinocitos epidérmicos de prepucio neonatal humano normales en la superficie superior de la construcción de célula-matriz para formar la capa epidérmica de la construcción de piel. El medio fue removido asépticamente de la inserción de cultivo y sus alrededores. Los queratinocitos epidérmicos humanos normales fueron escalados a paso 4 del stock celular de subcultivo congelado a confluencia. Las células fueron liberadas entonces de las placas de cultivo usando tripsina-verseno, depositadas, centrifugadas para formar una pella celular, resuspendidas en medio de epidermalización, se contaron y sembraron en la parte superior de la membrana a una densidad de 4.5 x 104 células/cm2. Las construcciones fueron incubadas entonces durante 90 minutos a 37 ± 1 °C, 10% C02 para permitir que se unan los queratinocitos. Después de la incubación , las construcciones fueron sumergidas en medio de epidermalización. El medio de epidermalización es compuesto por: una mezcla de base 3: 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (no conteniendo glucosa ni calcio, BioWhittaker, Waíkersville, MD) y medio F-1 2 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD) , complementado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma St. Louis, MO), 1 x 10 " M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY) , 1 x 10"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO) , 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) , 6.78 ng/ml de selenio (Aldrich), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 4 mM L-glutamina (BioWhitakker, Waíkersville, MD), 50 µg/ml de sal de sodio de L-ascorbato (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 16 µ? ácido linoleico (Sigma, St. Louis, 1 µ? acetato de tocoferol (Sigma, St. Louis, MO) y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights, I L). Las construcciones se cultivaron en el medio de epidermalización durante 2 días a 37 ± 1 °C, 10 ± 1 % C02 durante 2 días. Después de 2 días, el portador conteniendo la construcción se transfirió asépticamente a nuevas charilas de cultivo con medio suficiente para lograr un nivel de fluido justo a la superficie de la membrana portadora para mantener la construcción en desarrollo en la interfase aire-líquido. El aire que contacta la superficie superior de la capa epidérmica en formación permite la estratificación de la capa epitelial. Las construcciones fueron incubadas a 37 ± 1 °C, 10% C02, y baja humedad, en medio con cambios de medio cada 2-3 días durante 7 días. Este medio contenía una mezcla 1 : 1 de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (sin contener glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD) , medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), complementado con 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, MO), 5 x 10"4 M etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY), 5 x 10"4 o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO) , 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Comapny), 24.4 µg/ml de adenina (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2.65 µg/ml de cloruro de calcio (Mallinckrodt, Chesterfield, MO), 16 µ? ácido linoleico (Sigma, St. Louis, MO), 1 µ? acetato tocoferol (Sigma, St. Louis, MO), 1 .25 mM serina (Sigma, St. Louis, MO) , 0.64 mM cloruro de dina (Sigma, St. Louis, MO) y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina (Amersham, Arlington Heights I L). Los cultivos fueron alimentados cada 2-3 días, durante 14 días. Las muestras, por triplicado, se sometidos 1 0, 12 y 14 días después de que la construcción se levantó a la interfase de aire-líquido para procesamiento de hematoxilina y eosina como se describe en el Ejemplo 1 para determinar la apariencia gruesa bajo microscopía luminosa. La construcción resultante fue una construcción de piel bicapa, consistió de una capa dérmica inferior consistiendo de fibroblastos dérmicos rodeada por matriz cubierta por una capa epidérmica superior de queratinocitos estratificados y diferenciados. La construcción de piel de bicapa de este Ejemplo es mostrada en la Figura 4. La Figura 4 es una fotomicrografía de una sección manchada con hematoxilina y eosina, incrustada en parafina, fija, de una construcción de piel cultivada formada en medio químicamente definido en la ausencia de componentes de matriz exógena comprendiendo una construcción de célula-matriz formada a partir de fibroblastos dérmicos humanos cultivados en medio químicamente definido con una epidermis diferenciada, de múltiples capas, formada de queratinocitos humanos cultivados en medio químicamente definido.

Ejemplo 17: Formación de una matriz colagenosa por fibroblastos bucales humanos El propósito de este experimento es producir una construcción de céula-matriz a partir de fibroblastos bucales aislados de tejido de mejilla humana. Los fibroblastos bucales fueron cultivados en matraces T-150 en DMEM conteniendo 1 0% medio NBCS. Después de 7 días, para expandir el número de células adicionalmente, las células bucales fueron recolectadas y pasadas en nueve matraces T-1 50 a 4.0x106 en DMEM conteniendo 10% medio NBCS y se cultivaron hasta confluencia momento en el cual las células fueron recolectadas. Para recolectar las células, el medio fue aspirado del matraz de cultivo. Para enjuagar la monocapa, se adicionó solución salina amortiguada con fosfato estéril por filtración al fondo de cada matraz de cultivo y entonces se aspiraron de los matraces. Las células fueron liberadas del matraz al adicionar 5 mi de tripsina-verseno glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada matraz y mecer suavemente para asegurar una cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se regresaron a la incubadora. Tan pronto como las células fueron liberadas, se adicionaron 5 mi de SBTI (inhibidor de tripsina de soya) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión celular fue removida de los matraces y dividida uniformemente entre tubos de centrífuga cónicos, estériles. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos. Las células fueron resuspendidas usando medio fresco a una concentración de 3.0 x 1 06 células/ml y se sembraron sobre inserciones tratadas de cultivo de tejido de 24 mm de diámetro, 0.4 miera de tamaño de poro (TRANSWELL®, Corning Costar) en una charola de seis cavidades a una densidad de 3.0 x 106 células/inserción (6.6 x 105 células/cm2). Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37 ± 1 °C con una atmósfera de 1 0 ± 1 % C02 y se alimentaron con medio conteniendo: una mezcla de base 3: 1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics, Gaithersbrg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 0.4 µg/ml de hidrocortisona (Sigma.St. Louis, MO), 1 . x 10"4 M etanolamina (Fluka , Ronkonkoma, NY cat #02400 grado ACS) , 1 x 1 0"4 M o-fosforil-etanolamina (Sigma , St. Louis, MO) , 5 µg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO) , 5 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , 20 pM triyodotironina (Sigma , St. Louis, MO) , y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fi ne Chemicals Company, Mi lwaukee, Wl) , 50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, I nc. ) , 0.2 µg/m\ de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO) , 0.1 µg/ml de glicina (Sigma, St Louis, MO) y 0.05% de poli-etilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO) . En el día 1 post-siembra , el medio fue reemplazado con medio de producción libre de suero, intercambiado cada 2-3 d ías durante 21 días. En el d ía 21 , las muestras se fijaron en formalina para histolog ía . Tres muestras se usaron para análisis de producción de proteína y colágeno.

La producción de colágeno para construcciones de diámetro de 24 mm promedió 51 9 µg por construcción después de 21 días de cultivo. La producción de proteína total para construcciones de diámetro de 24 mm promedió 210 µg por construcción después de 21 días de cultivo. Morfológicamente, la construcción de célula-matriz de fibroblastos bucales, una construcción de tejido cultivado de tejido conectivo oral , mostró fibroblastos bucales rodeados por matriz, al tiempo que físicamente, la construcción tuvo volumen físico e integridad .

Ejem plo 18 : Preparación de equivalente de tejido al contraer látex de colágeno sembrados con células de fibroblastos Las soluciones de colágeno crudo fueron preparadas como sigue. las colas de rata congeladas de ratas de 450 gm se descongelaron en 70% EtOH durante 20 minutos. Los haces de tendones se cortaron en 70% EtOH en una campana de flujo laminar. Los tendones individuales fueron sacados del estuche de tendón, se picaron y colocaron en ácido acético diluido (1 : 1 ,000) usando 250 mi por cola. Esta solución se dejó reposar durante 48 horas a 4°C, punto en el cual los tendones picados se han hinchado para ocupar el volmen total . Esta solución viscosa fue centrifugada a 23 k rpm en una ultracentrífuga Beckman L en un rotor SW25 durante 1 hora. El sobrenadante fue arrastrado y almacenado a 4°C como solución de colágeno crudo (Proteína "C"). Se preparó la solución de colágeno refinada al mezclar solución de colágeno crudo con NaOH 0.1 M en una proporción 6: 1 para neutralizar el ácido acético, sobre lo cual el colágeno se precipitó. Esta solución fue centrifugada a 1 500 rpm durante 5 minutos en una centrífuga clínica El sobrenadante fue desechado y un volumen igual de ácido acético fresco (1 : 1 ,000) fue introducido para resolubilizar el colágeno. Esta solución se almacenó a 4°C com solución de colágeno refinado (Proteína "R"). La concentración de proteína fue determinada mediante el método de Lowry et al. Ver Lowry, O. H . , Rosebrough, N .J. , Farr, N.J. y Randal, R.J. , J. Biol . Chem. , 193, 265-275 (1951 ) y Waddel, W.J. , J Lab y Clin. Med. 48, 31 1 -314 (1 956). Los látex de proteína fueron preparados en placas baceriológicas de Falcon de 60 mm a las cuales se adhieren pobremente los fiboblastos. Cada placa contenía: 1 . mi 5X medio McCoy 5a, 1 .0 mi de suero de ternera fetal, 0.25 mi de NaOH 0.1 M, 1 .5 mi de solución de colágeno y 1 .0 mi de fibroblastos suspendidos en medio 1 X McCoy. Las placas se llenaron primero con el volumen anterior de medio McCoy, suero y NaOH y entonces se separaron hasta que la suspensión de fiboblastos se preparó. La velocidad fue importante en adición simultánea de solución de colágeno y fibroblastos debido a que el gel comenzó a cuajarse inmediatamente. Las placas se colocaron en una incubadora a 37°C en una atmósfera de 5% C02 a 1 0% de humedad. Los geles que incorporan los fibroblastos se cuajaron completamente después de 1 0 minutos. Los fibroblastos empleados fueron fibroblastos de prepucio humano, cepa 1519, obtenidos del Human Genetic Cell Repository en el Institute for Medical Research en Camden, N.J. Estas células se cultivaron y mantuvieron en medio modificado de McCoy 5a con 20% de suero, penicilina y estreptomicina. Los cultivos estuvieron libres de micoplasma. El M. I .T. Cell Culture Center preparó y congeló células de cada décimo de nivel de duplicación de población (PDL). Para medir los diámetros de látex, las placas se colocaron en la parte superior de una regla métrica transparente en un fondo obscuro. La visibilidad óptima de bordes de gel fue obtenida al hacer brillar luz blanca horizontalmente contra el borde de la placa. Los geles contraídos fueron discos bien formados; mostraron diferencias muy ligeras de diámetro en varios puntos. El promedio de los ejes mayor y menor fue tomado como el diámetro.

Ejemplo 19: Medición de contracción de látex de colágeno hidratado por células de fibroblastos La contracción de un látex de colágeno hidratado preparada de acuerdo con los procedimientos de Ejemplo 1 8 y conteniendo 570 .mu.g/ml de Proteína "C" por 7.5x1 06 de fibroblstos de prepucio humano, cepa 151 9, 1 9a PDL, fue determinada. El medio se cambió en la placa en los días primero, cuarto y octavo. Los datos obtenidos fueron graficadas en la FIG. 3, lo cual indica una reducción de 1 12 veces de área de látex en poco más de siete días. Dentro de un día, había habido una contracción de área de siete veces.

EJEMPLO 20: Contracción de látex de colágeno hidratado de diferente concentración de proteína El efecto de concentración de proteína en látex de colágeno hidratado sobre contracción del látex fue determinado como sigue. Tres látex de colágeno hidratado fueron preparados de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 1 8, excepto que cada uno contenía una diferente concentración de Proteína "R". Fibroblastos de prepucio humano, cepa 1 519, 19a PDL fueron empleados y se cambió el medio en el cuarto día. Los datos obtenidos fueron graficados en la FIG. 4, donde puede verse que la velocidad de contracción de látex varió inversamente con concentración de proteína de gel. Las áreas de látex disminuyeron conforme el tiempo pasó.

Ejemplo 21 : Efecto de número de células sobre la contracción de látex de colágeno hidratado El efecto del número de células en la contracción de látex de colágeno hidratado fue determinado como sigue. Una variedad de látex de colágeno hidratado conteniendo 720 .mu .g/ml de Proteína "R" se prepararon de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 18. Fibroblastos de prepucio humano, cepa 151 9, se emplearon y el medio en cada uno de los cultivos se cambió en los días tercero, séptimo y décimo. Los controles se emplearon a los cuales no se adicionaron células. Además, cuatro series de experimentos fueron corridas, en las cuales números variantes de células fueron adicionados. Los datos obtenidos son graficados en FIG. 5 en la cual cada punto representa el promedio de la contracción de tres o cuatro látex. Las desviaciones no son mostradas debido a que fueron todas muy pequeñas (<.+-.1 .0 mm). Como puede verse, el número de células tuvo un efecto sobre la velocidad de contracción de látex pero esta diferencia en contracción se volvió menos significativa cmo una función de tiempo. Los diámetros de látex se aproximaron un número pequeño común para concentraciones por arriba de algún valor mínimo. Por arriba del valor mínimo, la relación entre velocidad de contracción de látex y número celular fue distintivamente no linear. Los látex con 8.1 x104 células no comenzaron a contraerse durante 24 horas. Estos látex escasamente poblados se retrasaron muy por detrás de los más densamente poblados a lo largo del periodo de los experimentos.

EJEMPLO 22: Capacidad contráctil en látex de colágeno hidratado de células de diferente PDL La capacidad contráctil en látex de colágeno hidratado de células de diferente nivel de duplicación de población (PDL) , esto es células que han experimando diferentes números de divisiones cel ulares, fue determinado como sigue. Los cultivos fueron formados de látex de colágeno hidratado preparados de acuerdo con los procedi mientos del Ejemplo 1 8 y conteniendo 720 . mu . g/ml de proteína "R" . El medio se cambió en los d ías tercero, séptimo y décimo. Los cultivos de control no conten ían cél ulas. Además, una serie de experimentos con células de PDL diferentes se realizaron. Los datos recolectados son graficados en F IG . 5 en a cual cada punto representa el promedio de tres o cuatro contracciones de látex. Las desviaciones fueron <. +-.1 .0. Como puede verse, las células de 35° PDL se desempeñaron tan bien como aquél las del 1 9° PDL, pero las células del 50° PDL fueron incapaces de contraer látex a una velocidad conmesurada .

Ejem plo 23: Efecto de citocalasina B sobre la capacidad de células para contraer un látex de colágeno hidratado El efecto del inhibidor citocalasina B sobre la capacidad de cél ulas para contraer un látex de colágeno hidratado fue determinado como sigue. Los látex de colágeno hidratado fueron preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 8, el cual conten ía u n contenido de Proteína "C" de 570 . mu.g/ml. La concentración de célu las de fibroblastos (prepucio humano, cepa 1 519, 19 PDL) en los cultivos fue 5.0x105. 10.0 .. mu.g/ml de citocalasina B se adicionaron a cada cultivo y el medio fue cambiado en los días cuarto y octavo. Los datos obtenidos son graficados en la FIG . 6 y como puede verse, esta concentración de citocalasina B bloqueó completamente la contracción de látex incluso a la concentración celular relativamente alta empleada.

Ejemplo 24: Efecto de colcemid sobre la concentración de látex de colágeno El efecto del inhibidor colcemid sobre la contracción de látex de proteína fue determinado como sigue. Los cultivos conteniendo látex de colágeno hidratado preparados de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 18, los cuales contenían 570 . mu.g/ml de Proteína "C". 0.36 . mu.g/ml de colcemid se adicionaron a cada uno de éstos excepto por los controles los cuales no contenían colcemid. El mismo n 'mero de células fue adicionado a ambos cultivos de preuba y cultivos de control y los datos obtenidos son graficados en la FIG. 7. Como puede verse, las células 45° PDL pasaron el desempeño de células 19° PDL, mientras que las células sin tratar de 45° PDL se quedaron atrás de las células sin tratar de 1 9° PDL. Está claro que colcemid puede usarse para regular la velocidad y grado de contracción de los látex.

Ejemplo 25: Efecto de citosina arabinósido sobre contracción de látex de colágeno por células de PDL diferente El efecto de 1 .0 . mu.g/ml de citosina arabinósido sobre contracción de látex de proteína por células de diferente nivel de PDL se probó como sigue. Los cultivos conteniendo látex de colágeno hidratado conteniendo Proteína "C" en una concentración de 570 . mu.g/ml se prepararon. Fibroblastos de prepucio humano, cepa 1 519, de 1 9° PDL o 47° PDL se adicionaron a ambos controles no conteniendo citosina arabinósido y cultivos de prueba conteniendo citosina arabinósido. Los datos obtenidos son graficados en la FIG. 8, donde puede verse que las células de 47° PDL sobredesempeñaron las células de PDL menor aún cuando fueron menos en número. En estos experimentos se usó citosina arabinósido para bloquear la síntesis de DNA y por ello mantener el número de células en la constante de látex.

Ejemplo 26: Formación de equivalente de piel empleando fibroblasos de prepucio humano y queratinocitos Un látex de colágeno hidratado fue preparado de acuerdo con los procedimientos de Ejempo 18, los cuales contenían 500 .mu.g/ml de Proteína "C". Fibroblastos de prepucio humano obtenidos en una biopsia se removieron de una placa de cultivo con una solución de EDTA tripsina. La suspensión de células simples fue centrifugada para pelletizar las células, después de lo cual las células fueron resuspendidas en medio de cultivo y entonces se depositaron en la parte superior de la matriz de colágeno hidratado siete días después de que las células de fibroblasto han sido introducidas. Dentro de tres días, las células de queratinocito se habían unido al substrato de látex y el proceso de queratinización comenzó conduciendo a la formación de un impervious cornium. Se hicieron observaciones histológicas por medio de microscopía de electrones.

Ejemplo 27: Estudios in vivo con equivalente de piel que emplea queratinocitos y fibroblastos de pie de conejillos de I ndias Se tomaron biopsias de piel de conejillos de Indias y se separó la dermis de la epidermis quirúrgicamente. La dermis fue disociada enzimáticamente en células constituyentes, las cuales fueron platinadas sobre placas de cultivo de tejido y se permitió que experimentaron la proliferación. Las células de cada animal experimental fueron cultivadas en placas separadas, de manera que su identidad fue conservada. Se hicieron tejidos in vitro al formar látex de colágeno hidratado contraídos de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 18, excepto empleando los fibroblastos de los conejillos de Indias. Algunos de los látex, después de la contracción, se platinaron de acuerdo con el Ejemplo 26 con células epidérmicas o queratinocitos tomados de segundas biopsias de manera que los queratinocitos así como fibroblastos en cada injerto fueron del animal, el cual se iba a volver el receptor del injerto. Los injertos de estos equivalentes de piel se hicieron en el dorso de los animales experimentales (conejillos de Indias) y se encontró que tales injertos fueron integrados profundamente en todos los niveles dentro de una semana. Desde abajo, se habían vascularizado; en el nivel de la dermis, las fibrillas de colágeno del injerto estaban entretejidas con aquéllas del tejido huésped circundante. En secciones histológicas, los injertos podrían ser distinguidos por su densidad de células de fibroblastos alta y por el grado reducido de birrefringencia como se compara con aquél de pie circundante cuando se ve a través de un microscopio de polarización. Incluso aquéllos injertos provistos calientes con epidermis fueron cubiertos completamente con una capa celular epidérmica (queratinocítos) de muchas células de profundidad. La capa fue continua con aquélla de la piel huésped adyacente. También fue claro que la contracción de herida dérmica fue inhibida por la presencia del injerto de equivalente de piel justo como cuando se hace un autoinjerto.

Ejemplo 28: Estudios in vivo con equivalente de piel empleando fibroblastos de piel de rata, células dérmicas y epidérmicas Formación de equivalente dérmico Una biopsia pequeña de un receptor de injerto potencial se cortó en fragmentos de 1 .0 mm2. Los fibroblastos crecieron de los fragmentos y poblaron la placa de cultivo de tejido Lux, y después de 4- días, los fragmentos fueron removidos y desecados o transferidos a nuevas placas. Se permitió que células en una o más placas se propagaron hasta que se volvieron casi confluentes, tiempo en el cual las células fueron removidas mediante tratamiento con tripsina, se lavaron y posteriormente se propagaron en matraces de cultivo de tejido. Aproximadamente se necesitaron 5x104 células por cada centímetro cuadrado de equivalente dérmico y un número de células apropiado fue vaciado al removerlas del substrato con tripsina después de lo cual se suspendieron y combinaron con una solución de colágeno, suero de rata y medio de cultivo de tejido. El colágeno se obtuvo al extraer tendones de cola de rata en 0.02 M ácido acético y purificando mediante centrifugación. Cuando se mantuvieron a un pH ácido y una concentración de proteína de 1 mg/ml , el colágeno fue una solución opalescente ligeramente viscosa. Consistió solamente de colágeno tipo I sin proteínas contaminantes detectables mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. En el momento en que el colágeno se combinó con las células y otros ingredientes, el pH se ajustó a 7.2 con NaOH , lo cual provocó que el colágeno se saliera de la solución en la forma de fibrillas. Conforme esto ocurrió, se formó un gel o látex en cada fluido fue atrapado. Las células en el látex fueron distribuidas más o menos uniformemente a través de él. Mediante un proceso de compactación activa de fibrillas de colágeno por las células, el látex fue transformado en un tejido de consistencia firme. El resultado fue pérdida de fluido atrapado y una disminución de muchas veces en volumen del látex original. Un tejido resultó, el cual constituía un equivalente dérmico (DE).

Adición de epidermis Las células epidérmicas disociados de los fragmentos de biopsia por medio de tripsina fueron distribuidas como una suspensión en el equivalente dérmico. En 2-4 días, las células epidérmicas formaron una hoja continua que cubrió el subestrato dérmico. Dentro de este tiempo, la hoja confluente de células comenzó a diferenciarse. Las uniones desmosomales, tonofilamentos y gránulos de queratohialina fueron evidentes y el proceso de queratinización procedió conduciendo a la formación de un estrato córneo impermeable. El proceso completo ocurriría in vitro en DE si se permitiera. Sin embargo, en este trabajo, el tejido de dos capas, vivo, fue considerado listo para injertarse tan pronto como las células epidérmicas formaron una hoja confluente, la cual sirvió como un equivalente de piel (SE). Los equivalentes de piel fueron injertados en un gran número de ratas con los siguientes resultados. Primero, por 3-5 días después del implante, la vascularización del injerto había comenzado y continuaron rápidamente sin que ocurriera necrosis o isquemia. En segundo lugar, con pocas excepciones, el injerto inhibió la contracción de herida. Cuando el injerto se hizo, la periferia de piel normal adyacente al injerto fue tatuada para marcar los límites de los injertos, un procedimiento que permitió el monitoreo con tiempo de las dimensiones del injerto. Las excepciones a la inhibición de contracción puede haber sido debido a cobertura inicial inadecuada del equivalente dérmico por la epidermis, a desalojamiento del injerto por el animal, o a formación de un látex inadecuado, el cual fue una función de la calidad de la preparación de colágeno usada. En un estudio de treinta y uno de tales injertos examinados en el momento de que el vendaje fue removido (9-14 días), siete inhibieron la contracción de herida completamente, quince bloquearon la contracción de herida por 75% o más y veintitrés la bloquearon por 50% o más. En otro estudio de cincuenta y dos injerto, la contracción de herida fue bloqueada en al menos 75-80% de los injertos. Aunque una variedad de injertos mostró una disminución en tamaño con el tiempo, la mayoría fue estabilizado por sesenta días y ninguno fue rechazado. Los injertos de gran tamaño (aproximadamente 8x12 cm) con coberturas epidérmicas buenas, bloquearon de manera efectiva la contracción de herida (75% o más) y se tomaron bien como reemplazos para piel quemada. Los injertos persistieron durante largos periodos, habiendo estado el más largo en su lugar por alrededor de dos años. Además de volverse bien vascularizado, la matriz del equivalente dérmico experimentó remodelado considerable durante los primeros pocos meses después del injerto. Cambios en su estructura se estudiaron al examinar la birrefringencia de sección histológica a partir de la cual fue evidente que la matriz exhibió birrefringencia por una semana después del injerto, un fenómeno no observado en tejido de granulación de edad comparable. Mientras que la birrefringencia aumentó en intensdad con el tiempo, el patrón, generalmente, no fue uno de la configuración de tejido de canasta característico de la dermis normal . Sin embargo, por diez semanas en la región de transición donde el injerto encuentra tejido normal, el patrón de tejido de canasta ha comenzó a desarrollarse. In vivo, las hipertrofias de epidermis, e incluso diez semanas después del injerto, fueron considerablemente más gruesas que el tejido norma adyacente. Las lenguas o espigas o epidermis fueron vistas penetrando el equivalente dérmico. De manera externa, durante un periodo de varios meses, la epidermis pareció un tanto escamosa y el injerto tuvo un tinte rojizo. Por alredeodr de los tres meses, los injertos fueron suaves y de color rosado asemejando piel normal de la rata albina pero careciendo de cabello. Un grado de escamosidad persistió incluso a siete meses, lo cual pudiera atribuirse a la ausencia de glándulas sebáceas.

Ejemplo 29: Preparación de equivalente de tejido mediante contracción de látex de colágeno con plaquetas Los concentrados de plaquetas anticuados fueron obenidos del Red Cross Blood Center en Boston, Mass. Los colágenos de tendones de cola de cerdo y rata fueron extraídos como se describe en el Ejemplo 1 8; el colágeno de piel de cerdo fue provisto por el Dr. Aul Ehrilch del Shriners' Burns Institute of Boston; y telógeno, un colágeno bovino, se obtuvo de Collagen Corporation, Palo Alto, Calif. Las concentraciones de colágeno fueron determinadas usando una modificación del método de Waddel . Ver Waddel, W.J. , J. Lab y Clin . Med. 48,31 1 -14 (1956). La fórmula empleada fue: . mu.g/ml=O. D. 21 5-0. D. 225/64.6. El concentrado de plaquetas, concentrado a 60x como se obtuvo de la Cruz Roja, fue concentrado adicionalmente mediante centrifugación durante 5 minutos en una centrífuga IEC PR-2 usando un rotor 253 a 4°C para remover los glóbulos rojos. El sobrenadante fue centrifugado entonces unos 50 minutos adicionales a 1 500 rpm usando el mismo rotor para concentrar las plaquetas. El sobrenadante fue arrastrado y usado para resuspender las pellas de plaquetas obtenidas.

La concentración de plaquetas absoluta varió de un experimento al siguiente dependiendo de las concentraciones de plaquetas en la sangre de los donadores, pero todos los valores de concentración dentro de cada experimento se basan en el uso de una de muestras depositadas, las cuales son concentradas y entonces diluidas. Una concentración de plaquetas de 1 x es equivalente a la concentración de plaquetas en 1 .0 mi de sangre. Los látex de plaquetas fueron vaciados al combinar, en orden, lo siguiente: 2.3 mi de medio DMEM 1 .76x (Flow Laboratories), 1 .5 mi de colágeno de tendón de cola de rata, 0.25 mi de NaOH 0.1 N (la concentración de NaOH necesario para neutralizar el colágeno varió ligeramente dependiendo de la acidez de las preparaciones de colágeno usadas), y 0.45 mi de FBS (Flow Laboratoires). Esta mezcla se vació en una caja de Petri Falcon 0007 de 60 mm con 0.5 mi de un concentrado de plaquetas de 5x aplicado en pequeñas gotas en la superficie de placa. De manera alterna, todos los ingredientes se combinaron en un recipiente separado y se vaciaron en la caja de Petri vacía. Los látex resultantes fueron incubados a 37°C en una atmósfera de 90% aire/10% C02 de 100% de humedad. El espesor de látex fue controlado al incrementar o disminir el vaciado de volmen de látex total. No se observaron diferencias en las velocidades de contracción de látex como una función de procedimiento de vaciado. Las velocidades de contracción se determinaron al arrastrar e fluido liberado por el látex en una pipeta de 1 mi primero y las más grandes después, y entonces registrar el volumen de fluid retirado después de lo cual el fluido retirado fue regresado a la placa. Estas mediciones fueron repetidas cada hora hasta que el látex se había contraído de manera máxima. En esos látex teniendo una concentración de plaqueta de 1 x o menor, los bordes de látex fueron separados primero de la placa usando un escalpelo fino a fluido libre atrapado por abajo del látex para medición. Debido a que el látex liberará fluido adicional cuando se rasga, se tiene cuidado de evitar dañar el látex para obtener mediciones de flid liberado solo por contracción de plaquetas. Los experimentos también fueron conducidos para determinar el efecto de la adición de trombina (Sigma Chemicals) al manchar trombina y concentrado de plaquetas sobre la caja de Petri en gotitas discretas antes de la adición del colágeno de DMEM combinado, NaOH y FBS. La FIG. 9 es una gráfica de dats obtenidos, la cual ilustra el efecto de trombina sobre la contracción por plaquetas de látex de colágeno cuando la concentración de trombina fue 4.0 unidades/ml. La FIG . 10 es una gráfica que ilustra la contracción de látex obtenida como una función de concentración de plaquetas y la presencia de trombina a una concentración de 4.0 unidades/ml. Como puede verse, la reacción es bastante rápida. A una concentración de plaquetas de 1 x, 80-90% del fluido total, el cual será expresado ha tenido lugar por la tercera hora depués de vaciado del látex. Por seis horas, la reacción está esencialmente completa y el equilibrio es alcanzado; esto es, ninguna liberación de fluido adicional es observada bajo condiciones de 100% de humedad. En este punto, 20-80% del volmen de fluido inicial ha sido expresado del látex, con la cantidad precisa dependiendo de las concentraciones de plaquetas y colágeno y en otras variables de medio de vaciado. El proceso de contracción de látex de plaquetas resulta en la formación de un equivalente de tejido de fuerza de tensión relativamente alta comparada con aquélla de un vaciado de látex de colágeno sin plaquetas. Cuando se incluye trombina en la mezcla de vaciado con un número suficiente de plaquetas, el equivalente de tejido se forma más rápidamente como se indica por la FIG. 2. El equivalente de tejido conteniendo trombina tiene propiedades un tanto diferentes de aquéllas vaciadas sin ella, su fuerza de tensión es un tanto menor y su contenido de fluido menor. La fuerza de tensión fue medida al atar pesas en gramos a equivalentes de tejido después de vaciar y medir el tiempo de ruptura. La velocidad de contracción de látex de plaquetas está relacionado a la concentración de plaquetas. Aumentar la concentración de plaquetas acelera la velocidad de contracción de látex y resulta en un látex con fluido menos proporcionalmente, como puede verse en la FIG. 10.

Ejemplo 30: Efecto de concentración de proteína y tipo sobre la concentración por plaquetas El efecto de concentración de proteína y fuente sobre contracción de látex por plaquetas fue determinado al emplear colágeno de diferentes fuentes en diferentes concentraciones, pero de otra manera siguiendo los procedimientos del Ejemplo 2. Los datos resultantes son graficados en las FIGS . 1 1 A-1 1 D. Como puede verse, aumentar el contenido de colágeno del medio de vaciado reduce la velocidad de contracción y cantidad de fluido expresado. Estos rusultados corresponden generalmente a aquéllos obtenidos cuando los fibrolastos fueron usados como el agente contráctil. El colágeno de las cuatro fuentes diferentes empleadas funcionaron similarmente, excepto que el telógeno ofreció consideramente menos resitencia a la contracción que colágeno de las otras tres fuentes.

Ejemplo 31 : Efecto de inhibidores de citocalasina B y colcemid sobre la contracción de látex de colágeno por plaquetas Los efectos de los inhibidores citocalasina B y colcemid en la capacidad de plaquetas para contraer látex de colágeno hidratado fue determinada siguiendo los procedimientos generales del Ejemplo 29, excepto como sigue. La citocalasina B (Sigma Chemicals) y colcemid (CI BA Pharmaceutical Company) se adicionaron directamente a medio D EM concentrado para dar concentraciones finales en los 5 mi de volmen de látex de 10 .mu.g/ml y 0.5 . m.g/ml, respectivamente. Los datos obtenidos son graficados en la FIG. 12. Como puede verse, los látex vaciados con plaquetas en la presencia de citocalasina B fallaron en contraerse. Por otra parte, el colcemid no tuvo efecto aparente en la contracción de látex; esto era esperado debido a que colcemid es conocido por no tener efecto sobre la capacidad de plaquetas humanas para contraer coágulos de fibrina. La citocalasina B, por otra parte, estabiliza la forma discoide de plaquetas y previene la formación pseudópoda.

Ejemplo 32: Injerto de conejo Los equivalentes de tejido formados de látex de colágeno hidratado contraídos por plaquetas y adecuados para injertarse a las orejas de conejos fueron preparados como sigue. Las plaquetas fueron recolectadas de 10 mi de sangre de conejo tomadas del receptor de injerto potencial mediante punción al corazón, y se concentraron mediante centrifugación diferencial como se describe en el Ejemplo 29. los geles de plaquetas de conejo se vaciaron, también siguiendo los procedimientos del Ejemplo 29. Después de la contracción, los látex fueron sembrados con células epidérmicas derivadas de una biopsia del mismo conejo siguiendo los procedimientos del Ejemplo 28. El conejo anestesiado fue preparado para injerto al sujetar el cabello sobre el sitio de injerto. El lecho de injerto fue destacado y se colocaron marcas de tatuaje justo fuera de la periferia de la marca. El sitio fue lavado con 70% de etanol y todo el tejido hacia abajo a la facia que descansa sobe el cartílago fue removido. El equivalente de tejido fue liberado de la placa y se colocó en el lecho de injerto con los bordes del injerto ligeramente traslapando los bordes del lecho de injerto. El injerto fue sobrepuesto con tulle gras preparado al impregnar almohadillas de Telfa con vaselina. Las almohadillas de Telfa remojadas en solución de sal de Earle fueron colocadas sobre tulle gras. Se usó una almohadilla de espuma en la oreja para sostenerla en forma y la oreja se vendó con Elastoplast de tres pulgadas. Para prevenir que el conejo se quite el vendaje, ambas orejas fueron pegadas juntas con Elastoplast de tres pulgadas. Las vendas fueron removidas siete días después del injerto. El conejo se equipó con un collar isabelino para prevenir que se rascara por otros dos días. La región con injerto junto con un borde de piel normal fue cortada como una sola pieza de la oreja de conejo y se sumergió en 1 0% de formalina en amortiguador de fosfato 0.03 M. La piel se fijó durante la noche, se enjuagó con agua destilada, se deshidrató en etanol, se limpió en acetato de amilo seguido por tolueno y se incrustó en Paraplast t. Secciones de siete mieras fueron cortadas usando un microtomo rotatorio y estas se mancharon con hematoxilina y eosina. Los injertos fueron aceptados e inhibieron la contracción de herida en todos los experimentos. Más o menos, los injertos parecieron más blancos que la piel circundante, la superficie es un tanto escamosa y carecía de cabello. Incluso después de seis semanas, permanecía una pequeña costra ubicada centralmente. Un injerto el cual había sido colocado durante seis semanas, fue examinado histológicamente en parte para determinar el grado al cual el injerto fue infltrado por fibroblastos de tejido circundante. La densidad de fibroblastos en el injerto fue considerablemente mayor que aquélla del tejido adyacente. El injerto fue distinguido de tejido circundante mediante el nivel reducido de birrefringencia notada vista bajo un microscopio luminoso. La vascularización en el injerto pareció ser mayor que en tejido adyacente. El injerto fue distinguido adicionalmente de tejido circundante por la ausencia de derivados secundarios, esto es, folículos pilosos y glándulas sebáceas. La cobertura epidérmica del injerto fue marcadamente hipertrofiada.

Ejemplo 33: Estudios in vito de rechazo de equivalente de piel en ratas Formación de equivalente de piel Pequeñas piezas de piel fueron removidas de las espaldas de ratas hemabras Fischer-344 (Charles River Breeding Labs.). Estas biopsias fueron recortadas de tejido extraño, cortadas en piezas de 2- 3mm3 y secadas sobre la superficie de placas de cultivo de tejido Lux.

Los fibroblastos, los cuales crecieron de las biopsias fueron cultivados en modificación de Dulbecco de medio esencial mínimo de Eagle (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera fetal, penicilina, estreptomicina y fungizona (Flow Laboatoires) en una atmósfera de 10% C02 a 37°C. Los látex de colágeno fueron preparados siguiendo los procedimientos del Ejemplo 28. Brevemente, 2-8x1 05 células de fibroblasto fueron combinadas en una placa plástica de 1 00 mm con DME concentrado más 10% de suero de ternera fetal , antibióticos y 6 mg de colágeno de cola de rata en una dilución 1 : 100 de ácido acético en agua. Dentro de una semana, los fibroblastos habían contraído el látex de colágeno y una suspensión de células epidérmicas disociadas de una biopsia fresca fue estratificada sobre la superficie de látex. La toxina de cólera a 1 0 M, factor de crecimiento epidérmico a 2 . mu.g/ml e hidrocortisona a 0.4 .mu.g/ml, se adicionaron al medio para promover el crecimiento de células epidérmicas y las placas se movieron a una atmósfera de 5% C02. Dentro de una semana, las células epidérmicas formaron una hoja confluente en la superficie del látex de colágeno y el equivalente de piel estuvo listo para injerto. Para probar los aloinjertos, los látex fueron preparados con células de las ratas hembras Sprague-Dawley y se implantaron sobre ratas Fischer macho.

Procedimiento de injerto Ratas Fischer macho pesando aproximadamente 350-400 g fueron anestesiadas con fenobarbital de sodio. Un lecho de injerto de aproximadamente el mismo tamaño que el látex fue preparado al remover el espesor completo de la piel de la espalda de cada animal. El látex fue colocado en la herida y cubierto con una almohadilla Telfa impregnada con vaselina y una almohadilla Telfa remojada en solución de sal de Earle. Estas bandas fueron cubiertas al envolver el cuerpo con varias capas de elastoplast. A intervalos de tiempo que varían de nueve a trece meses después de que el injerto se aplicó originalmente, los animales fueron anestesiados nuevamente y el injerto completo fue cortado. La mitad del injerto se fijó en formalina amortiguada con fosfato, se deshidrató en etanol y se incrustó en parafina. Una porción central de la otra mitad del injerto se recortó de tejido de grasa subyacente, se cortó en piezas de 2-3 mm3 y se colocaron en cultivo de tejido para permitir que los fibroblastos residentes crezcan.

Preparación de los cariotipos La población de fibroblastos los cuales crecen de los injertos fue subcultivada para obtener tres a seis matraces T-1 5 de células que se dividen rápidamente. Los fibroblastos fueron tratados con colchicina a 2 .mu.g/ml durante cuatro horas, se agitaron de los matraces, se hincharon en medio hipotónico (1 parte de DMEM a 3 partes de H20 destilada), se secaron con aire sobre portaobjetos de vidrio y se mancharon con aceto-orceína. Veinte a treinta esparcimientos cromosómicos completos para cada punto en el tiempo fueron fotografiados y los cariotipos preparados para determinar la proporción de células femeninas en la población total de fibroblastos. Extracciones con células femeninas de Sprague-Dawley fueron recibidas y retenidas por huéspedes Fischer machos como es determinado por la presencia de células femeninas en el injerto 1 -2 meses después.

Ejemplo 34: Preparación de sistemas de prueba equivalentes de tejido de piel A. Un aparato similar a aquél mostrado en la FIG. 16 se usó para conducir el trabajo descrito posteriormente. La cubierta es removida al conducir la operación pero es mantenida de otra manera en su lugar para mantener la esterilidad. Información pertinente con respecto al aparato es listada a continuación: Recipiente exterior 10: Diámetro 38 mm Capacidad 35 mi Recipiente interior 20: Diámetro 24 mm Capacidad 4 mi Miembro permeable 24: Membrana de policarbonato de Nucleopore, tamaño de poro 3 . mu. espesor 5. mu.

B. Un gel de colágeno hidratado acelular, fue formado en el miembro permeable 24 como sigue: (1 ) Premezcla: 10X MEM 16.2 mi L-glutamina (200 mM) 1 .6 mi Gentamicina (50 mg/ml) 0.2 mi Suero bovino fetal 18.0 mi Bicarbonato de sodio (71 .2 mg/ml) 5.0 mi Las soluciones madre fueron mezclas a 37°C, combinando en la secuencia anterior, y almacenadas a 4°C duarnte aproximadamente 30 min en tubo de 50 mi (no gasificado). (2) 27.8 g de una solución de colágeno de 1 mg/ml (extraída por ácido de tendón de extensor digital común de ternera) en 0.05% v/v de ácido acético, se pesó en un tubo de 50 mi y se almacenó a 4°C durante 30 min. (3) 82 mi de la pre-mezcla descrita antes y 4 mi de DMEM completo (conteniendo 1 0%FBS, 4 mM L-glutamina, 50 .mu .g/ml de gentamicina) se adicionaron (y alícuotas de 1 mi se pipetearon en el recipiente interno 20 y se permitió que se gelificara en una campana. C. Equivalentes de tejido fueron vaciados con fibroblastos dérmicos humanos y se sembraron con células epidérmicas humanas (epiteliales) como se describe más adelante. Una descripción general de procedimentos y reactivos también puede encontrarse en las patentes y solicitud copendiente ser. No. 07/361 , 041 , presentada el 5 de junio de 1989. (1 ) Mezcla de vaciado: Se adicionaron 8.2 mi de la pre-mezcla descrita antes a 27.8 g de una solución de colágeno de 1 mg/ml en 0.05% v/v de ácido acético, como se describe en el paso A(2) anterior y 4 mi de fibroblasts dérmicos humanos (2.5x105 células/ml) se combinaron. Se pipetearon alícuotas de 3 mi en el recipiente 2 sobre el gel de colágeno hidratado, acelular, formado en el paso B(2) y se permitió que gelificaran. Se adicionaron 4.5 mi de DMEM completo al recipiente exterior 20 y entonces se incubaron a 376°C/1 0% C02 normalmente durante 4-8 días Se usó el siguiente medio: Componentes mSBM Hidrocortisona 1.1 .mu.M Insulina 5 .mu.g/ml Transferrina 5 .mu.g/ml Triyodotironina 20 pM Etanolamina 1x1 O"4 M o-fosforiletanolamina 1x1 O"4 M Adenina 0.18 mM Progesterona 2x10"9 M Selenio 5.26x10"8 M Suero bovino 0.3% Factor de crecimiento epidérmico 10 ng/ml DMEM libre de calcio 75% F-12 de Ham 25% Otros dos medios usados fueron idénticos con mSBM excepto se nota a continuación: cSBM SBM principal Progesterona 0 0 Suero bovino 2.0% 1% Factor de crecimiento epidérmico 1 ng/ml 1 ng/ml DMEM libre de calcio 50% 50% F-12 de Ham 50% 50% En algunos casos se adicionó cloruro de calcio al medio a 1 .8 mM: Esto es indicado como medio más calcio, por ejemplo, mSBM más calcio.

D. La Epidermalización se inició a 6 días después de vaciar el equivalente de tejido. (1 ) Epidermalización El medio del paso C anterior se removió tanto del recipiente interior 20 como del exterior 1 0. Una suspensión de 50 . mu.l de células epidérmicas humanas (3.33x106 células/ml) se colocó en el equivalente de tejido formado antes en el paso C anterior. El recipiente fue incubado entonces a 36°C y 1 0% C02 durante 4 horas. Se adicionaron entonces 12.0 mi de mSBM a la cámara exterior y 4 mi a la cavidad. El aparato se regresó entonces a la misma incubadora. (2) Diferenciación A 2 días post-epidermalización, el medio fue removido y reemplazado con mSBM más calcio. (3) Levantamiento con aire A 5 días post-epidermalización, se realizó el siguiente procedimiento: el medio fue removido de las cámaras interior y exterior. El recipiente interior 20 fue removido y se posicionaron dos volúmenes de almohadillas de algodón remojadas en cSBM más calcio se posicionaron en el fondo de la cámara exterior 10 y 9.0 mi de cSBM más calcio se adicionaron. El recipiente interior 20 se reemplazó entonces y el aparato se incubó a 35.5°C y 10% C02. (4) Mantenimiento Cada 4 días, el medio fue removido y reemplazado con SMB principal fresco más calcio.

Ejemplo 35: Preparación de sistemas de prueba incorporando agarosa Una solución de agarosa al 2% en agua fue esterilizada mediante autoclave, enfriada a 40°C y mezclada con un volumen igual de 2 SBM principal concentrado. Las almohadillas de algodón absorbente fueron removidas y 13 mi de la mezcla se vacían en el área exterior 14, se permitió que se cuajaran a 36°C (10% C02) y el aparato regresó a la incubadora para almacenamiento antes del embarque. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos antes son para fines ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de lo anterior que serán sugeridas a personas expertas en la técnica serán incluidas en el espíritu y panorama de esta aplicación y el alcance de las reivindicaciones aprobadas.

Ejemplo 36: Eficacia de una construcción de tejido cultivado para tratamiento de encías orales en retroceso El objetivo primario fue determinar si la construcción de tejido cultivado proporcionaría una zona funcional de encías unidas comparable con un injerto autógeno libre.

Durante este estudio, se enrolaron 25 sujetos. Los sujetos fueron de edades de al menos 18-70. Los primeros tres sujetos fueron usados para determinar las técnicas de manejo de material y quirúrgico y no se incluyeron en el análisis estadístico. Los pacientes subsecuentes fueron enrolados hasta que estos tres pacientes habían completado cuatro semanas de seguimiento. Los sujetos enrolados tuvieron al menos dos dientes no adyacentes con una zona insuficiente de encía unida, lo cual requería injerto de tejido. Los dos dientes seleccionados deben haber sido ubicados en cuadrantes contralaterales. La cobertura de raíz no fue indicada o desada en el momento del injerto. Los sujetos fueron tratados con ya sea la construcción de tejido cultivado de la invención o con un injerto autógeno libre. Los injertos fueron evaluados clínicamente para determinar el cambio en la encía unida y en al menos tres sujetos. Una pequeña biopsia fue tomada para permitir la evaluación histológica y comparación de ambos injertos. Variables de eficacia secundarias fueron los cambios de línea de base en ancho de tejido queratinizado, profundidad de retroceso, calificación de inflamación, igualación de color o textura del tejido injertado al tejido adyacente, resistencia a jalado de músculo oral , nivel de unión clínico, profundidad de sonda e incomodidad del sujeto. El estudio utilizó una comparación de tratamiento controlado, aleatorizada entre sujetos. La valoración de la cantidad de encía unida se generó a través de la construcción de tejido cultivado e injertos autógenos libres que había ocurrido en una semana post-operatoria, y en meses 1 , 3 y 6. El punto final primario había ocurrido en el mes 6.

Todas las evaluaciones post-operatorias fueron realizadas por el coordinador de investigación quien fue cegado a los procedimientos quirúrgicos realizados. El color, textura, inflamación y resistencia a jalado de músculo fueron calificados independientemente por un coordinador de investigación graduado. Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y Ejemplos para fines de claridad y entendimiento, será obvio para alguien de habilidad en la técnica, que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un método para tratar una condición oral de un sujeto, comprendiendo dicho método: i njertar una construcción de tejido cultivado a un tejido oral del sujeto, en donde dicha construcción de tejido cultivado comprende una capa de matriz extracelular y dicha matriz extracel ular comprende células de fibroblasto cultivado en la ausencia de componentes de matriz exógena o soportes de andamiaje.

2. El método de la reivi ndicación 1 , en donde la condición oral es seleccionada del grupo que consiste de encías orales en retroceso, pérdida de papila interdental , deficiencia de reborde alveolar, implante oral fallado, defecto de bifurcación dental y resección de tumor maxilofacial .

3. El método de la reivindicación 1 , en donde la matriz extracelular comprende: (i) colágeno fibrilar que muestra una organización de empaque de fibrillas y haces de fibrilla exibiendo un patrón de bandas de 67 nm de cuarta etapa; (ii) decorina; y (iii) glicosaminoglicanos.

4. El método de la reivindicación 1 , en donde las células de fibroblasto cultivadas son derivadas de tejido seleccionado del grupo que consiste de prepucio masculino de neonato, dermis, tendón , pulmón, uretra , cordón umbilical , estroma córneo, mucosa oral e intestino.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde las células de fibroblasto cultivadas son fibroblastos dérmicos.

6. El método de la reivindicación 1 , en donde las células de fibroblasto cultivadas son derivadas de tejido humano.

7. Un método para tratar una condición oral de un sujeto, comprendiendo dicho método: injertar una construcción de tejido cultivado a un tejido oral del sujeto, en donde dicha construcción de tejido cultivado comprende una primera capa de matriz extracelular y una segunda capa de células dispuesta en dicha primera capa, dicha matriz extracelular comprende células de fibroblastos cultivadas en la ausencia de componentes de matriz exógena y soportes de andamiaje, y dicha segunda capa de células comprende células epiteliales.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la condición oral es seleccionada del grupo que consiste de encías orales en retroceso, pérdida de papila interdental, deficiencia de reborde alveolar, implante oral fallado, defecto de bifurcación dental y resección de tumor maxilofacial.

9. El método de la reivindicación 7, en donde la matriz extracelular comprende: (i) colágeno fibrilar que muestra una organización de empaque de fibrillas y haces de fibrilla exhibiendo un patrón de bandas de 67 nm de cuarta etapa; (ii) decorina; y (iii) glicosaminoglicanos.

10. El método de la reivindicación 7, en donde las células epiteliales son seleccionadas del grupo que consiste de queratinocitos, células epiteliales córneas, células epiteliales de mucosa oral, células epiteliales esofágicas y células uroepiteliales. 1 1 . El método de la reivindicación 7, en donde dichas células de fibroblasto cultivadas contenidas dentro de dicha primera capa son derivadas de tejido seleccionado del grupo que consiste de prepucio masculino de neonato, dermis, tendón, pulmón, cartílago, uretra, estroma córneo, mucosa oral e intestino. 12. El método de la reivindicación 7, en donde las células de fibroblasto contenidas dentro de dicha primera capa son fibroblastos dérmicos. 13. El método de la reivindicación 1 2, en donde dicha matriz extracelular comprende además fibronectina y tenascina. 14. El método de la reivindicación 7, en donde las células de fibroblasto cultivadas y las células epiteliales son derivadas de tejido humano. 1 5. El método de la reivindicación 7, en donde la construcción de tejido cultivado comprende una segunda capa de células de queratinocitos dispuestas en la primera capa para formar una capa de células epidérmicas. 16. El método de la reivindicación 15, en donde la capa de células epidérmicas es de múltiples capas, estratificada, diferenciada y exhibe una capa basal , capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo; y en donde la construcción de piel cultivada de bicapa tiene una membrana de basamento presente en la unión de la primera y segunda capas. 17. Un método para tratar una condición oral de un sujeto, comprendiendo dicho método: injertar una construcción de tejido cultivado a un tejido oral del sujeto, en donde dicha construcción de tejido cultivado comprende una mezcla de gel de una solución de colágeno y un agente contráctil. 18. El método de la reivindicación 17, en donde la condición oral es seleccionada del grupo que consiste de encías orales en retroceso, pérdida de papila inerdental, deficiencia de reborde alveolar, implante oral fallado, defecto de bifurcación dental y resección de tumor maxilofacial. 1 9. El método de la reivindicación 17, en donde dicho agente contráctil comprende células de fibroblasto. 20. El método de la reivindicación 19, en donde las células de fibroblasto son derivadas de tejido humano. 21 . El método de la reivindicación 19, en donde las células de fibroblasto son derivadas de tejido seleccionado del grupo que consiste de prepucio masculino de neonato, dermis, tendón , pulmón, uretra, cordón umbilical, estroma córneo, mucosa oral e intestino. 22. Un método para tratar una condición oral de un sujeto, comprendiendo dicho método: injertar una construcción de tejido cultivado a un tejido oral del sujeto, en donde dicha construcción de tejido cultivado comprende una primera capa comprendiendo un gel de colágeno en la ausencia de células, y una segunda capa dispuesta en dicha primera capa, comprendiendo dicha segunda capa un segundo gel de colágeno conteniendo colágeno y un agente contráctil. 23. El método de la reivindicación 22, en donde la condición oral es seleccionada del grupo que consiste de encías orales en retroceso, pérdida de papila interdental, deficiencia de reborde alveolar, implante oral fallado, defecto de bifurcación dental y resección de tumor maxilofacial. 24. El método de la reivindicación 22, en donde el agente contráctil comprende células de fibroblasto. 25. El método de la reivindicación 24, en donde las células de fibroblastos son derivadas de tejido seleccionado del grupo que consiste de prepucio masculino de neonato, dermis, tendón, pulmón, uretra, cordón umbilical, estroma córneo, mucosa oral e intestino. 26. El método de la reivindicación 22, en donde la segunda capa comprende células epidérmicas humanas. 27. El método de la reivindicación 24, en donde las células de fibroblasto son derivadas de tejido humano. 28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 7, 17 y 22, en donde las células de fibroblasto son modificadas genéticamente para producir componentes de matriz extracelular. 29. El método de la reivindicación 28, en donde las células de fibroblasto son modificadas genéticamente para producir un factor de crecimiento, hormona, péptido o proteína.