KR0149955B1

KR0149955B1 - 융합단백질을 이용한 인간 글루카곤의 제조방법

Info

Publication number: KR0149955B1
Application number: KR1019950040452A
Authority: KR
Inventors: 신항철; 김대영
Original assignee: 김용구; 주식회사한일합섬
Priority date: 1995-11-09
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 1999-03-30
Also published as: KR970027106A

Abstract

본 발명은 종양괴사인자를 융합파트너로하여 대장균에서 인간 글루카곤과 종양괴사인자의 융합단백질을 발현시켜 고수율로 인간 글루카곤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

융합단백질을 이용한 인간 글루카곤의 제조방법

제1도는 플라스미드 pTID4KG의 제조과정을 나타낸다.

제2도는 대장균 용균액의 SDS-PAGE 이다.

M : 분자량 마-커

레인 1 : IPTG유도 6시간 후에 대장균 용균액 총량

레인 2 : IPTG유도 6시간 후에 대장균 용균액의 가용성 단백질

레인 3 : IPTG유도 6시간 후에 CaCl₂침전에 의한 펠렛

레인 4 : IPTG유도 6시간 후에 CaCl₂침전에 의한 상등액

제3도는 표준 글루카곤과 역상 HPLC에 의해 정제한 재조합 글루카곤의 트립신 분석.

A : 인간 글루카곤 표준품

B : 재조합 글루카곤

제4도는 정제된 글루카곤의 전자질량 분광도이다.

본 발명은 융합 단백질을 이용한 인간 글루카곤의 제조방법에 관한 것이다.

다시 말하자면, 본 발명은 종양괴사인자를 융합파트너로 하여 대장균에서 인간 글루카곤과 종양괴사인자의 융합단백질을 발현시켜 고수율로 인간 글루카곤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

글루카곤은 29개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드로서 랑겔한스섬의 A 세포에서 합성된다. 간에서의 글루카곤은 글리코겐의 분해와 글루코스 생성을 활성화시킴으로써, 인슐린과 조화를 이루어 혈중의 포도당 농도를 조절하여 당뇨병을 치료하는데 중요한 역할을 한다. 또한 글루카곤은 인슐린에 의한 저혈당증 치료제, β-아드레날린 차단제의 과량복용시 회복제, 인슐린 분비의 촉진제, 또는 위장관 이완제로도 사용된다.

종래 글루카곤을 제조하기 위하여 여러가지 방법이 시도되었다. 먼저 소나 돼지의 글루카곤의 아미노산 서열은 인간 글루카곤의 아미노산 서열과 동일한 점에 착안하여 소나 돼지의 취장액에서 글루카곤을 추출하고 정제하는 방법이 시도되었다.

그러나 동물의 장기에 존재하는 글루카곤의 양이 워낙 적기 때문에 동물의 장기에서 글루카곤을 충분량 추출하는 것은 매우 어려운 일이었다. 그후 유전자 재조합 기술을 이용하여 좀 더 손쉽게 글루카곤을 대량 생산할 수 있는 방법을 찾게 되었다.

유전자 재조합 방법은 사람 또는 동물장기에서 어렵게 얻어지던 여러 단백질들을 미생물을 이용하여 손쉽게 얻는 것을 가능케 하였다.

즉 원하는 단백질의 유전자를 발현 플라스미드에 클로닝한 후 이 발현 플라스미드로 적당한 숙주세포를 형질전환시켜 얻어지는 형질전환체를 배양하여 원하는 단백질을 얻을 수 있다.

글루카곤을 제조하기 위하여 재조합 글루카곤 발현벡터를 효모 또는 대장균에서 직접 발현시키는 방법이 시도되었으나, 숙주내 세포에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 생성되는 글루카곤이 분해되어 생산성이 좋지 않았다. 즉 숙주세포로 미생물 특히 대장균을 이용한 경우, 만들고자 하는 단백질이 대장균내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량 10,000 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드를 발현시킬 경우 이러한 경향이 심하다(Wetzel, R. Goedelel, D. V., Peptides 5, 1-64, 1983).

글루카곤은 활성을 나타내기 위하여 진핵세포의 번역후 변형과정이 필요없기 때문에, 글루카곤을 대량생산하기 위해서는 대장균에서 발현시키는 것이 가장 좋다. 그러나 글루카곤은 대장균내에서 분해되기 때문에 수율이 떨어진다.

이에 대장균내에서 발현되는 글루카곤의 분해를 막고 글루카곤의 안정성을 높여 수율을 향상시키기 위한 연구가 진행되어 글루카곤을 대장균에서 융합단백질로서 발현시키는 방법이 보고되었다.

다시 말하자면 글루카곤은 29개의 아미노산으로 이루어지는 작은 크기의 폴리펩타이드로서 대장균내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지므로, 수율을 높이기 위하여 숙주체에서 안정되게 축적되도록 단백질에 융합시킨 융합체로서 생산하는 것이다.

보통 선택된 숙주에서 풍부하게 생산되는 것을 알려진 단백질을 암호하는 유전자에, 만들고자 하는 펩타이드를 암호하는 유전자를 연결하여 생산하는데, 숙주에서 풍부하게 생성되는 것으로 알려진 단백질의 예로는 베타-갈락토시다제(β-Galactosidase), 단백질 A(protein A), 글루타치온 에스-전달효소(glutathione S-transferase)등이 있다. Jun Ishizaki 등은 인간 인터페론-γ을 융합파트너로 이용하여 글루카곤을 제조하는 방법을 보고한 바 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992 36: 483-486).

인간 인터페론-γ을 융합파트너로 이용하는 경우 이들 융합단백질은 친화크로마토그라피를 이용하여 융합단백질을 정제하기가 용이한 장점이 있는 반면에, 제조하고자 하는 폴리펩타이드에 비해 상대적으로 크기가 커서 만들어낸 후 융합부분의 크기에 따라 펩타이드의 수율이 떨어진다는 단점이 있다. 또한 융합단백질은 불용성 상태로 있어서, 6M 구아니딘 용액으로 가용성 상태로 만들어준 후 단백질 분해효소를 처리하면 불완전 분해를 하기 때문에 수율이 떨어진다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 글루카곤의 수율을 높이기 위하여 연구한 결과, 종양괴사인자를 융합파트너로 이용하여 융합부분의 크기를 기존방법에 비해 월등히 감소시킴으로서 수율이 증대되고, 융합단백질이 가용성 형태로 발현됨으로서 정제공정이 단순화되어 수율이 더욱 더 증대됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 융합파트너로서는 비교적 적은 분자량을 가지고 있으며, 대장균내에서 융해상태로 발현되는 종양괴사인자를 이용하여 글루카곤과 종양괴사인자의 융합단백질을 발현시킴으로써 글루카곤을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 종양괴사인자를 융합파트너로 하여 융합단백질을 발현시키는 방법에 대하여 연구하여 특허출원한 바 있다(특허출원 제94-7018호). 종양괴사인자는 157개의 아미노산으로 구성되어 있으며 병풍 구조를 가지고 있는 단백질로서 대장균내에서 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있으며, 종양괴사인자 전체의 아미노산 서열 또는 일부의 아미노산 서열을 융합파트너로 이용할 수 있다.

본 발명에서는 TNF 아미노산 서열중 N말단 57 아미노산 서열을 암호하는 174bp 유전자를 글루카곤의 융합파트너로 이용함으로써 융합파트너 부분을 더욱 줄여서 전체적인 수율을 증가시킨다.

종양괴사인자를 코딩하는 DNA 전체 또는 일부를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 합성한 후, 준비된 DNA를 발현벡터에 삽입하고 그 벡터의 DNA 3' 말단쪽에 글루카곤을 암호하는 DNA를 삽입시킨 후 그 벡터를 적당한 숙주에 도입하여 만들어진 형질 전환체를 배양하여 융합단백질을 생산할 수 있다.

배양된 세포들은 라이소자임분해, 동결융해 또는 초음파 파쇄 등으로 처리한 후, 원심분리나 여과를 통해 융합단밸질을 함유하는 상등액을 얻는다.

SDS-PAGE로 확인해 본 결과 글루카곤과 종양괴사인자의 융합단백질은 가용성 형태(soluble form)로 발현됨을 알 수 있다. 10mM 칼슘클로라이드(CaCl₂)를 처리하여 융합단백질을 응집시키면 소량의 대장균 자체단백질과 더불어 대부분의 융합단백질이 응집된다. 응집된 단백질을 반응용액으로 녹인뒤 엔테로카이네즈를 넣어 반응시켜 융합단백질에서 글루카곤을 분리시킨다. 역상 크로마토그라피를 하여 융합단백질로 부터 분리된 글루카곤을 정제한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 좀 더 상세히 설명하고자 한다. 그러나 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

[종양괴사인자 유전자를 포함하는 플라스미드 pT1의 제조]

U937 세포주로의 종양괴사인자 M3 cDNA를 주형으로하여 N말단 57개의 아미노산 서열을 암호하는 174bp 유전자를 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR방법으로 증폭하였다.

증폭된 DNA를 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한 효소 부위를 갖도록 하여 벡터 pET-3a의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다.

이렇게 만들어진 플라스미드를 pT1 이라고 명명하였다.

[실시예 2]

[TNF-융합 플라스미드 pT1D4KG의 제조]

인간 글루카곤 유전자를 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 제조하였다.

증폭된 DNA를 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단한 뒤 pT1의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT1D4KG 라고 명명하였다.

[실시예 3]

[형질전환체의 제조]

하나한(Hanahan)이 기술한 방법에 의해 발현 플라스미드 pT1D4KG로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켰다(Hanahan, D.(1985) DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press).

암피실린에 저항성이 있는 균주 Escherichia coli BL21를 선택하여 1995년 10월 17일에 기탁하였다(수탁번호 KCCM-10074호).

[실시예 4]

[형질전환체의 배양]

암피실린을 함유한 LB 배지에서 형질전환체를 37℃에서 배양하였다. O.D.(A600) 측정치가 0.4에서 0.8 사이일때 IPTG(최종농도 0.5mM)를 넣어 글루카곤 융합단백질의 발현을 유도하였다.

발현유도후 약 6시간 정도 더 배양한 다음 원심분리(6,000rpm)하여 대장균을 수확하였다.

[실시예 5]

[인간 글루카곤의 정제]

수확된 대장균을 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄 하였다.

SDS-PAGE로 확인해 본 결과 융합단백질은 가용성 형태(soluble form)로 발현됨을 알 수 있었다(제2도 참조).

글루카곤의 정제공정을 단순화하기 위하여 10mM 칼슘클로라이드(CaCl₂)를 처리하여 융합단백질을 응집시켰다. 그 결과 대부분의 융합 단백질이 소량의 대장균 자체단백질과 더불어 응집되어 있음을 확인하였다.

응집된 융합단백질을 적당량(0.4mg/ml)의 반응용액으로(50mM Tris pH 8.0 : 1M Urea) 녹인뒤 엔테로카이네이즈를 넣어(1.5 단위/mg) 37℃에서 20시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난뒤 역상 C₁₈고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 컬럼을 이용하여 융합단백질로부터 분리된 글루카곤을 정제하였다.

[실시예 6]

[분리정제된 글루카곤의 검증]

분리정제된 글루카곤에 대하여 트립신절단지도(제3도 참조), 질량분석(제4도 참조), 아미노산 조성분석(표 1 참조)을 한 결과 표준시료(Sigma 사에서 구입)와 정확히 일치하였다.

상기 실험결과에서 알 수 있는 바와같이, 인간 글루카곤 유전자를 TNF 유전자와 같이 발현시키면 융합단백질이 가용성 상태로 발현되며, 고수율로 얻어지는 것을 알 수 있다.

Claims

형질전환 미생물을 배양하여 글루카곤을 제조하는 방법에 있어서, 종양괴사인자 유전자를 융합파트너로 포함하는 융합단백질을 이용한 인간 글루카곤의 제조방법.
제1항에 있어서, 종양괴사인자의 아미노산 전 서열 또는 아미노산 서열중 일부가 치환된 형태의 종양괴사인자 뮤테인을 융합파트너로 이용하는 것을 특징으로 하는 인간 글루카곤의 제조방법.
제2항에 있어서, 종양괴사인자 뮤테인 M3의 N말단 57개의 아미노산을 융합파트너로 이용하는 것을 특징으로 하는 인간 글루카곤의 제조방법.
종양괴사인자 유전자와 인간 글루카곤 유전자를 포함하는 발현 플라스미드.
제4항에 있어서, 종양괴사인자 유전자가 뮤테인 M3의 N말단 57개의 아미노산을 코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드 pT1D4KG.
발현 플라스미드 pT1D4KG로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환 시켜 얻은 형질전환체(수탁번호 KCCM-10074호).
제6항의 형질전환 미생물을 배양하여 얻어지는 배양물로부터 융합 단백질을 분리하고 융합단백질을 분해하여 인간 글루카곤을 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 융합단백질을 엔테로카이네이즈로 분해하여 인간 글루카곤을 제조하는 방법.