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WO2024184607A1 - Conjugués ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant et le tissu osseux - Google Patents

Conjugués ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant et le tissu osseux Download PDF

Info

Publication number
WO2024184607A1
WO2024184607A1 PCT/FR2024/050278 FR2024050278W WO2024184607A1 WO 2024184607 A1 WO2024184607 A1 WO 2024184607A1 FR 2024050278 W FR2024050278 W FR 2024050278W WO 2024184607 A1 WO2024184607 A1 WO 2024184607A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
conjugate
mam
interest
formula
Prior art date
Application number
PCT/FR2024/050278
Other languages
English (en)
Inventor
Alain Morere
Geoffrey DEPAEPE
Ilaria Basile
Marie Maynadier
Elodie MORERE
Khaled El Cheikh
Marcel Garcia
Original Assignee
Nanomedsyn
Universite De Montpellier
Ecole Nationale Superieure De Chimie De Montpellier
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanomedsyn, Universite De Montpellier, Ecole Nationale Superieure De Chimie De Montpellier, Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Nanomedsyn
Publication of WO2024184607A1 publication Critical patent/WO2024184607A1/fr

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the field of therapeutic chemistry. It relates more particularly to conjugates comprising:
  • M6P mannose 6-phosphate
  • C6P-CI cation-independent mannose 6-phosphate receptor
  • the invention also relates to the process for preparing said conjugates and their medical use, of a therapeutic or diagnostic type.
  • the conjugates of the invention are particularly suitable for use in the treatment of bone pathologies and/or pathologies affecting both bone tissue and soft tissues.
  • pathologies affecting both bone and soft tissue include lysosomal diseases such as mucopolysaccharidoses.
  • Lysosomal diseases also called lysosomal storage diseases, are rare metabolic diseases in which a specific lysosomal enzyme is defective, leading to substrate accumulation and therefore tissue damage.
  • Enzyme replacement therapy is a therapy often used to treat these rare diseases. It consists of the administration of recombinant lysosomal enzymes that will be directed to the lysosomes via RM6P-CI thanks to the M6P residues present at the end of their glycosylated chains. Only seven of the fifty-three lysosomal storage diseases benefit from enzyme replacement therapy (ERT).
  • lysosomal diseases we can particularly mention the group of mucopolysaccharidoses, which includes seven different diseases, and which is characterized by damage to bone tissue, including cartilage and soft tissues. Skeletal involvement in these diseases includes bone deformities and most types of joint stiffness.
  • Lysosomal enzymes have a short half-life in the blood circulation due to the rapid binding of lysosomal enzymes to M6P receptors present in most organs. Therefore, improvement of bone tissue damage in patients with mucopolysaccharidoses is very limited even after long-term treatment, and targeting this bone tissue is therefore of primary importance for improving treatments.
  • HA Hydroxyapatite
  • Some bone tissue proteins can bind to hydroxyapatite (HA) via their negatively charged amino acid repeating sequence, namely the amino acid aspartate (represented by “Asp” or “D”) and the amino acid glutamate (represented by “Glu” or “E”). These repeating sequences chaining six of these amino acids are called E6 and D6 type polyanionic peptides.
  • Asp amino acid aspartate
  • Glu amino acid glutamate
  • polyanionic peptides were applied to human N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) and P-glucuronidase (GUSB) enzymes. These enzymes, labeled with E6 and D6 amino acid sequences, have reduced clearance from the bloodstream in mice with mucopolysaccharidosis types IVA and VII, and are retained longer in bone, with substantial residual enzyme activity.
  • GALNS N-acetylgalactosamine-6-sulfatase
  • GUSB P-glucuronidase
  • the conjugates of the invention more particularly comprise M6P analogues which exhibit both an affinity for the cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CM6P-CI) but also for bone tissue, and in particular for hydroxyapatite.
  • C6P-CI cation-independent mannose 6-phosphate receptor
  • the conjugates of the invention exhibit excellent stability in physiological fluids.
  • the present invention relates to a conjugate characterized in that it has the following general formula (I):
  • X represents a bisphosphonate group
  • [Chem2] a hydroxybisphosphonate group [Chem3] a halobisphosphonate group [Chem4] with T representing a halogen Cl or F, a malonate group [Chem5] a phosphonoacetate group [Chem6] with Z representing independently of each other H; an alkali metal chosen from Na, Li or K; an ammonium NF; n is an integer ranging from 0 to 2; Li represents a radical chosen from the group comprising *-ON **,
  • ni is an integer ranging from 1 to 1000, preferably from 1 to 20, and more preferably still from 1 to 10,
  • Yi represents a product of interest Y, said product of interest Y being selected from the group comprising proteins, in particular antibodies and lysosomal enzymes, nanoparticles, cytotoxic compounds and markers for medical imaging, Yi forming covalent bond(s) with Li.
  • the present invention relates to a process for preparing a conjugate of formula (I) as defined above.
  • the present invention relates to a conjugate of formula (I) for medical use, of diagnostic or therapeutic type. It relates in particular to a conjugate of formula (I) for use as a medicament in the treatment of bone pathologies and/or pathologies affecting both bone tissue and soft tissues.
  • FIG. 1 illustrates the process for preparing the triflate intermediate 6: 2-bromoethyl 2,3,4-tri-O-benzoyl-6-(trifluoromethanesulfonate)-a-D-mannopyranoside, which will serve as a precursor for the synthesis of the compounds of formula (II) called MAM-1 or 11 and MAM-2 or 14 respectively.
  • FIG. 4 illustrates the general synthesis scheme of conjugates of formula (I) in which is equal to 1, depending on the meaning of the reactive chemical group L of the M6P analogue of general formula (II).
  • Figure 4 point 1/ illustrates the reaction between the oxy-amine function of the M6P analogue of formula (II) with an aldehyde function (-CHO) (previously generated during an oxidative process) of a product of interest Y (such as an antibody or a lysosomal enzyme).
  • the product Y is represented by Yi’-CHO, Y1’ representing the product Y without its functional group L’ equal to -CHO.
  • the analogue (II) is called MAM-1 when X is a bisphosphonate group and n is equal to 0 and MAM-2 when X is a malonate group and n is equal to 0.
  • Figure 4 point 21 illustrates the reaction between the squarate function of the analogue of M6P of formula (II) with an amine function (-NH2) of a product of interest Y.
  • the product of interest Y is represented by Yi’-NH2, Y1’ representing Y without its functional group L’ equal to -NH2.
  • Figure 4 point 3/ illustrates the reaction between the maleimide function of the analogue of M6P of formula (II) with a thiol function (-SH) of a product of interest Y.
  • the product of interest Y is represented by Yi’-SH, Y1’ representing Y without its functional group L’ equal to -SH.
  • Figure 4 point 4/ illustrates the reaction between the carbonylacrylic function of the M6P analogue of formula (II) with a thiol function of a product of interest Y.
  • FIG. 5 illustrates the cytotoxicity on healthy fibroblasts of the compounds of formula (II) MAM-1 and MAM-2 in comparison with the compound mannose 6-phosphate (M6P) and with an analogous compound of M6P, namely the compound called "AMFA", a compound whose formula is close to that of a compound of formula (II), namely with n equal to zero and L equal to ONH2 but with X which represents a phosphonate group -CH2- P(O)(OH)2.
  • the abscissa axis represents the molar concentration of the compounds M6P (black histogram), AMFA (gray histogram), MAM-1 (white histogram) and MAM-2 (hatched histogram).
  • the ordinate axis represents the cell survival of the compounds. The cell survival observed in the presence of M6P was taken as the value of 100%.
  • FIG. 6 illustrates the interactions between RM6P-CI and compounds of formula (II) MAM-1 and MAM-2 in comparison with compounds M6P and AMFA.
  • the x-axis represents the molar concentration of compounds M6P (dotted curve), AMFA (gray curve with square patterns), MAM-1 (black curve with round patterns) and MAM-2 (light gray curve with a cross).
  • the y-axis represents the percentage of binding of said compounds to RM6P-CI.
  • FIG. 7 illustrates the adsorption to hydroxyapatite (HA) of the compounds of formula (II) MAM-1 and MAM-2 and of the compounds M6P, AMFA, zoledronate and medronic acid.
  • the x-axis represents, respectively from left to right: M6P (black histogram), AMFA (white histogram), MAM-1 (dark gray histogram), MAM-2 (hatched histogram), zoledronate (dotted histogram) and medronic acid (light gray histogram).
  • the y-axis represents the percentage of compounds adsorbed to HA.
  • FIG. 8 illustrates the cytotoxicity on healthy fibroblasts of the conjugates of the invention of formula (I), namely Myo-MAM-1 and Myo-MAM-2, in comparison with the Myo-AMFA conjugate and with the commercial Myozyme ® enzyme alone (which is the alpha-alglucosidase enzyme).
  • the x-axis represents the molar concentration of the compounds Myozyme ® (black histogram), Myo-AMFA (grey histogram), Myo-MAM-1 (white histogram) and Myo-MAM-2 (hatched histogram).
  • the y-axis represents the cell survival in the presence of the compounds. The cell survival observed in the presence of Myozyme was taken as the value of 100%.
  • FIG. 9 illustrates the interactions between RM6P-CI and the antibody Infliximab alone or functionalized by the compounds of formula (II) MAM-1 and MAM-2 or by the compound AMFA.
  • the x-axis represents the molar concentration of the compounds M6P (dotted curve on the far right), Infliximab (gray curve with square pattern), Infliximab-AMFA (gray curve with triangle pattern), Infliximab-MAM-1 (black curve with cross pattern) and Infliximab-MAM-2 (light gray curve with asterisk pattern).
  • the y-axis in each of these figures represents the percentage binding of the compounds to RM6P-CI.
  • FIG. 10 illustrates the adsorption to hydroxyapatite (HA) of the antibody Infliximab alone or coupled to the compounds of formula (II) MAM-1 and MAM-2 or to AMFA.
  • the abscissa axis represents, respectively from left to right: Infliximab (black histogram), Infliximab-MAM-1 (white histogram), Infliximab-MAM-2 (gray histogram) and Infliximab-AMFA (hatched histogram).
  • the ordinate axis represents the percentage of compounds adsorbed to HA.
  • conjugate means a compound comprising two parts linked together by a covalent bond.
  • the first part of the conjugate represents at least one M6P analogue while the second part of the conjugate Yi represents a product of interest Y selected from the group comprising proteins (such as antibodies, lysosomal enzymes etc.), nanoparticles, cytotoxic compounds and markers for medical imaging.
  • proteins such as antibodies, lysosomal enzymes etc.
  • the product of interest Y denotes the “free” product of interest when it does not form a bond with the M6P analogue.
  • the product of interest Yi denotes the product of interest Y when the latter is covalently linked to the M6P analogue via the Li radical.
  • the free product of interest Y can be represented by Yi’-L’, with L’ representing a functional group or a reactive function carried by the product of interest Y.
  • L represents a functional group or a reactive function carried by the product of interest Y.
  • Y/ represents the product of interest Y without its functional group L’.
  • the terms “functional group”, “reactive function” or “reactive chemical group” may be used interchangeably. Each of these terms denotes a group carried by the product of interest Y (or carried by the M6P analogue) capable of reacting with a group carried by the M6P analogue (or carried by the product of interest Y).
  • the M6P analogue corresponds to the formula delimited by the large parenthesis.
  • the integer indicates the number of M6P analogue(s) linked to the product of interest Yi.
  • M6P analogue(s) may be covalently linked to a product of interest. These M6P analogues are linked to the product of interest via the Li radical.
  • An M6P analogue is understood to mean a compound that differs from natural M6P but exhibits a high interaction capacity with RM6P-CI.
  • An “interaction” in the present application means a non-covalent type bond.
  • M6P denotes mannose 6-phosphate
  • RM6P-CI denotes cation-independent mannose 6-phosphate receptor
  • RM6P-CI is a ubiquitous receptor that is present both in the cytoplasm and at the cell membrane. Its role is in particular to internalize by endocytosis into the cell molecules carrying the recognition marker mannose 6-phosphate (M6P).
  • M6P mannose 6-phosphate
  • the conjugate of formula (I) of the invention is particularly advantageous in that it has several interaction capacities with several targets such as RM6P-CI, bone tissue or a molecule of therapeutic interest.
  • the conjugate (I) of the invention more particularly has a capacity for interaction with RM6P-CI (via the M6P analogue), a capacity for interaction at the level of bone tissue, more particularly at the level of HA (via the M6P analogue and more particularly the X group), but also a capacity for interaction with molecules of therapeutic interest via the compound of interest Yi.
  • the compound of interest Yi is an antibody
  • said antibody may interact for example with a molecule of therapeutic interest which would be a target antigen.
  • the target antigen refers to a membrane or extracellular molecule of therapeutic or diagnostic interest, in particular a molecule whose overexpression induces a pathological state or is associated with a pathological condition or whose expression is involved in a pathological disorder.
  • glycosaminoglycans which accumulate and create lysosomal storage diseases such as mucopolysaccharidoses, growth factors or membrane proteins involved in the growth of cancers, and in particular primary bone cancers or cancerous metastases in bone tissue, factors involved in bone pathologies and which can be used in imaging for the diagnosis or therapeutic targeting of osteoporosis or bone metastases from breast, kidney, prostate, thyroid and lung cancers.
  • Bone tissue refers to a connective tissue that is metabolically active and consists of several cell types and a hard matrix. This matrix is mineralized by calcium and phosphorus salts that constitute hydroxyapatite and contains large amounts of collagen fibers.
  • conjugate (I) means its capacity to form non-covalent interactions with the above-mentioned targets, namely with:
  • the ability of the conjugate to interact with its targets can also be referred to as the affinity of the conjugate with its targets.
  • Affinity more specifically refers to the strength or intensity of the interaction between the conjugate and its targets.
  • binding capacity of the conjugate (I) refers to its ability to form covalent-type bonds in the case where the Yi part of the conjugate (I) contains a function capable of creating a covalent bond with a molecule of therapeutic interest.
  • the radical L2 is more particularly derived from the transformation of the functional group L’ carried by the product of interest Y1 when the latter forms a covalent bond with the analogue of M6P.
  • the conjugate of formula (I) is characterized in that is an integer equal to 1, and in that said conjugate is chosen from the group comprising: [Chem10] with X, n and Y'i as defined above.
  • the conjugate of the invention is characterized in that Yi represents an antibody Y, or a fragment of antibody Y comprising at least one domain of interaction with the antigen, or a lysosomal enzyme Y.
  • the conjugate (I) is characterized in that Yi represents an antibody Y chosen from the group comprising monoclonal antibodies, chimeric antibodies, human or humanized antibodies, and chain antibodies heavy and light, single-chain antibodies, bispecific or multispecific antibodies and nanobodies.
  • the conjugate of the invention is more particularly characterized in that Yi represents an antibody Y which is an immunoglobulin of type IgG, in particular of subtype IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, or an immunoglobulin of type IgE, IgD, IgA or IgM.
  • the conjugate of the invention is more particularly characterized in that Yi represents a lysosomal enzyme Y whose expression is altered and involved in mucopolysaccharidoses for which bone growth is altered.
  • the conjugate of formula (I) as defined above can also be characterized in that it has an affinity, measured by the 50% inhibiting concentration (IC50), with respect to the mannose 6-phosphate cation independent receptor (RM6P-CI) ranging from 10' 4 M to 10' 9 M, and preferably ranging from 10' 5 M to 10' 8 M.
  • IC50 50% inhibiting concentration
  • R6P-CI mannose 6-phosphate cation independent receptor
  • the conjugate of formula (I) as defined above can also be characterized in that it has an adsorption capacity on hydroxyapatite present in bone tissue.
  • conjugates of the invention are also very advantageous due to the structure of their spacer arm.
  • spacer arm means the part located after the oxygen carried by the anomeric carbon of the cyclic structure of the M6P analogue, which forms the junction with the product of interest Y1, namely the part “-(CH2)2(O-CH2-CH2)n-Li-” (see conjugate of formula (I)).
  • the structure of this spacer arm is particularly simple from a chemical point of view and allows efficient grafting with the product of interest.
  • Products of interest Y1 considered alone and/or molecules of therapeutic interest interacting with these products of interest Y1 are therefore specifically addressed to the endo-lysosomal system and to hydroxyapatite via the conjugates (I) of the invention.
  • the conjugates according to the invention therefore have numerous applications in the field of diagnosis and therapy, and in particular in enzyme replacement therapies combined with a bone targeting strategy for the treatment of lysosomal storage diseases in the human body or in animals. These conjugates can also find applications in the field of treatment of bone cancers or osteoporosis.
  • the present invention relates to a process for preparing a conjugate of formula (I) as defined above, characterized in that the following are reacted:
  • L is a reactive chemical group selected from the group consisting of -O-NH2, [Chem 15]
  • the compound of formula (II) is an analogue of M6P. It is the reactive chemical group L carried by the analogue of M6P of formula (II) which will react with the functional group L' of the product of interest Y in order to form a covalent bond between the product of interest Y and the analogue of M6P and thus obtain the conjugate of formula (I) of the invention.
  • the radical L2 previously mentioned with regard to Y1 (namely Y1 is represented by the group L2-Y’I) is more particularly derived from the transformation of the functional group L’ carried by the product of interest Y (Y being represented by the group L’-Y’i,) when Y forms a covalent bond with the analogue of M6P and is then represented by Y1.
  • spacer arm refers to the part located after the oxygen carried by the anomeric carbon of the cyclic structure of the M6P analogue and which includes the reactive chemical group L, namely the part (CH2)2(O-CH2-CH2)n-L.
  • the simplicity of the structure of the spacer arm contributes to the advantages presented by the conjugates of formula (I) of the invention.
  • This simplicity of the spacer arm makes it possible in particular to easily synthesize the compounds of formula (II) and then to carry out a particularly interesting and effective coupling with a product of interest Y.
  • the synthesis of the conjugates of formula (I) is thus effective and easy to implement.
  • L groups of the M6P analogue as defined above can be respectively referred to in a simplified manner as “oxy-amine”, “squarate”, “maleimide” and “group comprising a carbonylacrylic function”.
  • M6P analogues of formula (II) can be represented by the acronym “MAM”, the acronym MAM meaning “medronic acid mimic”.
  • the analogues of M6P of formula (II) will be chosen from table 1 below.
  • the use of the analogues (II) described in Table 1 makes it possible on the one hand to carry out a particularly interesting and effective coupling with a product of interest Y and on the other hand makes it possible to interact effectively both with the RM6P-CI and with the bone tissue.
  • the analogues of formula (II) are those in which the L group is an “oxy-amine” or a “squarate”.
  • the L group of the compound (II) will bind at the level of a carbonyl function previously generated on an oligosaccharide chain/part of the glycosidic part of the antibody or of the lysosomal enzyme.
  • the glycosidic part of the antibody mentioned above is more particularly that located at the level of the Fc region of the antibody.
  • the L group of the compound (II) will bind at an appropriate amino acid residue of the peptide chain/part of the antibody or the lysosomal enzyme.
  • Examples of a suitable amino acid residue include an amine group from a lysine or a thiol group from a cysteine.
  • Examples of the L group of compound (II) include a squarate group, a maleimide group or a carbonylacrylic group.
  • Figure 4 illustrates a general synthesis scheme of the conjugates (I) of the invention with X representing a bisphosphonate or a malonate, depending on the respective definitions of the reactive chemical group L of the M6P analogue of general formula (II).
  • the carbonyl function (-CHO) of the product of interest Y reacts with the oxy-amine function of the compound of formula (II). If Y represents an antibody, this coupling mode occurs for example at the level of an oligosaccharide chain of the glycosidic part located on the Fc part of the antibody.
  • conjugates (I) of the invention due to their advantageous properties, are particularly interesting for use in the field of therapy or in the field of diagnosis.
  • composition characterized in that it comprises: - a conjugate as defined above,
  • the conjugate of the invention of formula (I) is present in a therapeutically effective amount in the composition of the invention.
  • “Therapeutically effective amount” means a dosage sufficient to produce a desired result, for example, an amount sufficient to achieve beneficial or desired therapeutic (including preventive) results, such as a reduction in the level of an element whose extracellular or membrane overexpression is responsible for a pathology or is implicated in a pathological condition.
  • An effective amount may require one or more administrations.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising:
  • the present invention also relates to a conjugate of formula (I) as defined above or a pharmaceutical composition as defined above, for medical use, of the therapeutic or diagnostic type.
  • the invention more particularly relates to a conjugate of formula (I) as defined above or a pharmaceutical composition as defined above, for use as a medicament in the treatment of bone pathologies and/or pathologies affecting both bone tissue and soft tissues.
  • bone pathology examples include:
  • osteoporosis and osteomalacia bone dystrophies (such as Paget's disease of the bone), osteonecrosis, benign bone tumors (osteomas, osteoblastomas, etc.), benign cartilage tumors (enchondromas, osteochondromas, etc.), certain forms of arthritis (particularly osteoarthritis),
  • Some of the primary bone tumors are malignant such as adamantinomas and osteosarcomas occurring in children and adolescents, and chondrosarcomas, chordomas, malignant giant cell tumors which are more common in adults. In their early stages, these tumors remain localized in bone tissue but can metastasize to soft tissues such as the lung in an advanced stage.
  • pathologies affecting both bone and soft tissue include:
  • certain bone cancers such as Ewing's sarcoma, fibrosarcomas and lymphomas undifferentiated bone tissue with a soft tissue component from the moment of formation,
  • lysosomal storage diseases such as mucopolysaccharidoses (MPS-I, MPS-I I, MPS-I II, MPS-IV, MPS-V, MPS-VI and MPS-VII), Fabry disease and Pompe disease.
  • the conjugate or the pharmaceutical composition is suitable for use in the treatment of a pathology chosen from the group comprising osteoporosis, bone cancer, lysosomal storage disease.
  • the invention also relates to a conjugate of formula (I) as defined above or a pharmaceutical composition as defined above, for use in a diagnostic method.
  • the invention relates to the conjugate of formula (I) or the pharmaceutical composition for use as defined above, characterized in that the conjugate or the pharmaceutical composition is in a form suitable for administration by parenteral, intravenous or subcutaneous route.
  • the analogues of M6P synthesized in this example are the compounds of formula (II) called respectively MAM-1 or 11 and MAM-2 or 14 whose developed formulas are respectively the following:
  • positions 2, 3 and 4 are then benzoylated by the action of benzoyl bromide to form compound 4 ("2,3,4-tri-O-benzoyl-6-O-((4-methoxyphenyl)diphenylmethyl))-aD-mannopyranoside").
  • Synthon 5 (“2,3,4-tri-O-benzoyl-aD-mannopyranoside de 2-bromoethyle”) is obtained after selective deprotection of the trityl group in the presence of cerium ammonium nitrate (CAN) in an acetonitrile/water mixture, at reflux. The yield over 3 steps is 45%.
  • Position 6 of compound 5 is then activated in the form of triflate, thanks to the cold addition of triflic anhydride to the sugar in the presence of 2,6-di-ferf-butyl-4-methylpyridine.
  • Compound 6 is thus obtained with a yield of 90% after purification.
  • Conditions and reagents (i) BF3.Et2O, 2-Bromoethanol, DCM, TA, 20 h; (ii) MeONa, MeOH, TA, 1 h; (iii) MMTrCI, Pyridine, TA, 5 h; (iv) BzCI, Pyridine, 0°C, 19h; (v) CAN, ACN/H 2 O (95:5), 82°C, 2 h; (vi) Tf20, 2,6-Di-ferf-butyl-4-methylpyridine, DCM, -40°C, 30 min.
  • the triflate synthon 6 is transformed into the bisphosphonate intermediate 7 (“2,3,4-tri-O-benzoyl-6-deoxy-6-bis(diethoxyphosphinyl)methylene-aD-mannopyranoside of 2-bromoethyl”) by adding, in the cold, a solution of tetraethyl methylenebisphosphonate anion prepared in a suspension of sodium hydride (NaH) in tetrahydrofuran (THF). The yield of this step is 50%.
  • the intermediate 8 (“6-deoxy-6-bis(diethoxyphosphinyl)methylene-aD-mannopyranoside of 2-bromoethyl”) is obtained after methanolysis of the benzoate groups thanks to the action of a methanolic solution of sodium methanolate, with a yield of 50%.
  • Compound 9 (“6-deoxy-6-bis(diethoxyphosphinyl)methylene-2-(phthalimidoxy)ethyl aD-mannopyranoside”) is obtained in 55% yield after nucleophilic substitution of bromine by the anion of A/-hydroxyphthalimide formed with NaH in hot THF.
  • Silylation of positions 2, 3 and 4 of the intermediate is achieved by adding trimethylsilyl chloride and triethylamine in dichloromethane, to obtain derivative 10 (“2,3,4-tri-O-trimethylsilyl-6-deoxy-6-bis(diethoxyphosphinyl)methylene-2-(phthalimidoxy)ethyl aD-mannopyranoside”) in quantitative yield.
  • the final product MAM-1 (or 11) (“2-aminooxyethyl 6-deoxy-6-bis(dihydroxyphosphinyl)methylene-aD-mannopyranoside") is obtained following two successive deprotection reactions.
  • the alkyl groups of the bisphosphonate are converted by transesterification to the corresponding trimethylsilyl esters using the Rabinowitz reaction using trimethylsilyl chloride TMSCI in the presence of sodium iodide NaI and triethylamine NEt 3 in acetonitrile.
  • TMSCI trimethylsilyl chloride
  • Treatment with hydrazine monohydrate in methanol MeOH gives the final MAM-1 (11) with a 2-step yield of 78% after purification.
  • Triflate 6 is transformed into compound 12 (“methyl (2,3,4-tri-O-benzoyl-6,7-dideoxy-7-methoxycarbonyl-a-D-manno-octopyranoside de 2-bromoethyle) uronate”) with a yield of 85% after reaction with the anion of dimethyl malonate previously prepared by the action of NaH in THF.
  • the bromine atom of compound 12 is then substituted by the anion of A/-hydroxyphthalimide prepared with sodium bicarbonate NaHCOs in DMF, at 65 °C.
  • Compound 13 (“2,3,4-tri-O-benzoyl-6,7-dideoxy-7-methoxycarbonyl-a-D-manno-octopyranoside de 2-(phtalimidoxy)ethyle) uronate de calendaryl”) is thus obtained in a yield of 92%.
  • Compound 13 is then treated with hydrazine monohydrate in MeOH, then with a solution of 1 M NaOH in THF to produce the final compound MAM-2 (or 14) (“2-aminooxyethyl (6,7-dideoxy-7-carboxy-a-D-manno-octopyranoside) uronic acid”) in a yield of 42% over the 2 steps.
  • the compounds MAM-1 and MAM-2 will be compared in particular in the following to another analogue of M6P, namely the compound called AMFA whose developed formula is as follows:
  • This AMFA compound is synthesized according to a protocol described in document WO 2011/000958.
  • the compounds MAM-1 and MAM-2 differ from the AMFA compound in that the X group is respectively a bisphosphonate in MAM-1 and a malonate in MAM-2 while in the AMFA compound the X group is a phosphonate.
  • the compounds MAM-1, MAM-2 and AMFA will also be compared to the commercially purchased compound mannose 6-phosphate (M6P).
  • the lysosomal enzyme tested is commercially available under the name Myozyme ®. This is the enzyme alpha alglucosidase (or acid alpha glucosidase). It can be represented in the following by “Myo”. It contains in its structure M6P residues allowing the targeting of RM6P-CI. The lysosomal enzyme Myo is used for the treatment of Pompe disease by enzyme replacement therapy.
  • infliximab which is a chimeric monoclonal antibody of the lgG1 type that does not have M6P residues in its structure. It can be represented in the following as “Infli”.
  • the conjugates thus formed may indifferently be represented in the present application by “MAM-1-Myo” or “Myo-MAM-1”, “MAM-2-Myo” or “Myo-MAM-2”, “MAM-1-Infli” or “lnfli-MAM-1”, “MAM-2-lnfli” or “lnfli-MAM-2”, “AMFA-Myo” or “Myo-AMFA”, “AMFA-Infli” or “Infli-AMFA”.
  • the conjugates of the invention are those which comprise the MAM-1 or MAM-2 part.
  • the MAM-1 or MAM-2 part of the conjugate (I) interacts both with the RM6P-CI and with the hydroxyapatite (HA).
  • M6P analogues MAM-1, MAM-2 and AMFA
  • Y Myo or Infliximab
  • M6P analogue MAM-1, MAM-2 and AMFA
  • a product of interest Y Myo or Infliximab
  • Oxidation of oligosaccharide chains of the product of interest Y (Myo or Infliximab)
  • M6P analogues MAM-1, MAM-2 and AMFA
  • M6P analogue (MAM-1, MAM-2 or AMFA) is added and incubated for 2 h at room temperature. Finally, the samples are dialyzed in water for samples tested by MALDITOF mass spectrometry or in a buffer containing 25 mM phosphate, 2% mannitol and 0.005% polysorbate 80 overnight.
  • a MALDI-TOF mass spectrometry analysis was used to evaluate the number of “M6P analogue” residues grafted onto the product of interest Y. Table 2 below represents the average number of grafted M6P analogues, calculated from two MALDI-TOF analyses.
  • the M6P analogues of formula (II) of the invention namely the compounds MAM-1 and MAM-2, were biologically compared to the AMFA analogue and to M6P. Indeed, the compounds AMFA and M6P are known not to exhibit cellular toxicity and to have interaction capacities with RM6P-CI. [0069] 1/ Evaluation of the cytotoxicity of MAM-1 and MAM-2 analogues
  • MAM-1 and MAM-2 analogues of formula (II) were evaluated in comparison with that of M6P and the AMFA analogue on healthy human fibroblasts according to the protocol described below.
  • Cells are seeded in 96-well plates (Maxisorp Nunc) in an incubator at 37°C containing 5% CO2. They are then treated according to a concentration gradient (10' 3 to 10' 6 M) of analogues. After 72 h, a solution of MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) is added and incubation is continued for 4 h at 37°C. The crystals formed are then dissolved with a DMSO/EtOH solution (1:1). Cell survival is measured using a spectrophotometer at 540 nm.
  • MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
  • MAM-1 and MAM-2 analogues were evaluated for their affinity for the RM6P-CI receptor in comparison with AMFA and M6P.
  • affinity refers to the intensity of the interaction of M6P analogues for RM6P-CI.
  • a test based on the competition of interaction with RM6P-CI is performed according to the protocol described below.
  • 96-well plates (Maxisorp Nunc) are incubated overnight at 4°C with 200 pL of PM6P (pentamannose 6-phosphate) at a concentration of 200 pg.mL' 1 , in carbonate buffer (NaHCO3/Na2CC>3 0.1 M, pH 9.6). The next day, the solution containing residual PM6P is discarded and the wells are saturated, for 1 h at room temperature, with 360 pL 1% gelatin (Type A from Porcine Skin) diluted in PBS (1.9 mM NaF ⁇ PC , 8.1 mM Na2PC>4 and 154 mM NaCI, pH 7.4). The wells are then rinsed 5 times with PBS supplemented with 0.2% gelatin.
  • PM6P penentamannose 6-phosphate
  • carbonate buffer NaHCO3/Na2CC>3 0.1 M, pH 9.6
  • the wells are then rinsed 5 times with PBS supplemented with 0.2% gelatin.
  • test compounds MAM-1, MAM-2, AMFA and M6P
  • concentrations from 10' 3 to 10' 6 M
  • R6Pb previously biotinylated RM6P-Cl
  • the method is based on the inverse determination of the amount of analogues not bound to hydroxyapatite, by 31 P or 1 H NMR analysis.
  • two tubes are prepared containing an equal amount of analogues.
  • a defined amount of hydroxyapatite is introduced beforehand and the two tubes are then placed under agitation. After centrifugation, an equal volume of the supernatant of each tube is taken and a defined amount of standards is added in addition during conditioning for NMR analysis.
  • the area of the signals corresponding to the analogues and that of the standard are measured and the ratio of the two areas is carried out.
  • the adsorption capacity of the analogues MAM-1, MAM-2, AMFA and M6P is evaluated according to this method and compared to those of commercial therapeutic compounds used in the treatment of bone diseases, namely zoledronate and medronic acid.
  • the compounds M6P, AMFA and MAM-2 demonstrate a significantly lower adsorption capacity for HA than the bisphosphonate derivatives, with a value close to 30% for MAM-2.
  • Example 4 Biological evaluation of the conjugates of the invention
  • the cytotoxicity of the Myo-MAM-1, Myo-MAM-2 conjugates of the invention of formula (I) and the Myo-AMFA conjugate was evaluated in comparison with the lysosomal enzyme Myo alone. on healthy human fibroblasts, according to the same protocol as described in Example 3. The cells were incubated with increasing concentrations (100-1000 ng/mL) of conjugates for 72 h. The results obtained are illustrated in Figure 8. The Myo-MAM-1, Myo-MAM-2 and Myo-AMFA conjugates show their safety on human fibroblasts.
  • grafting the MAM-1 and MAM-2 analogues of the invention and the AMFA analogue to Infliximab provides an antibody with affinity for RM6P-CI, whereas Infliximab has no affinity, consistent with the absence of an M6P group in its structure.
  • the affinity of the Infli-AMFA, Infli-MAM-1 and Infli-MAM-2 conjugates is comparable for interaction with RM6P-CI, indicating that the addition of several bispecific analogues of the MAM-1 or MAM-2 type advantageously creates an affinity 10 times greater than that of M6P.

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouveaux conjugués présentant une formule générale (I) telle que définie à la revendication 1. Les conjugués de l'invention comprennent 1/ au moins un analogue du mannose 6- phosphate (M6P), ledit analogue du M6P ciblant à la fois le récepteur du mannose 6- phosphate cation-indépendant (RM6P-CI) et le tissu osseux et 2/ un produit d'intérêt Y. L'invention concerne également le procédé de préparation desdits conjugués et leur utilisation médicale, de type thérapeutique ou diagnostique. Les conjugués de formule (I) de l'invention sont particulièrement intéressants pour une utilisation comme médicament, en particulier dans le traitement de pathologies osseuses et/ou de pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous.

Description

Description
Titre : Conjugués ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation- indépendant et le tissu osseux
Domaine technique
[0001] La présente invention relève du domaine de la chimie thérapeutique. Elle concerne plus particulièrement des conjugués comprenant :
1/ au moins un analogue du mannose 6-phosphate (M6P), ledit analogue du M6P ciblant à la fois le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant (RM6P-CI) et le tissu osseux et,
2/ un produit d’intérêt Y.
L’invention concerne également le procédé de préparation desdits conjugués et leur utilisation médicale, de type thérapeutique ou diagnostique. Les conjugués de l’invention sont particulièrement appropriés pour une utilisation dans le traitement de pathologies osseuses et/ou de pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous.
A titre d’exemple de pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous on pourra citer des maladies lysosomales comme par exemple les mucopolysaccharidoses.
Technique antérieure
[0002] Les maladies lysosomales, encore appelées maladies de surcharge lysosomales, sont des maladies métaboliques rares dans lesquelles une enzyme lysosomale spécifique est défectueuse, ce qui entraîne une accumulation de substrat et donc des lésions tissulaires. La thérapie enzymatique substitutive (TES) est une thérapie souvent utilisée pour traiter ces maladies rares. Elle consiste en l’administration d’enzymes lysosomales recombinantes qui vont être dirigées vers les lysosomes via le RM6P-CI grâce aux résidus M6P présents à l’extrémité de leurs chaînes glycosylées. Seulement sept des cinquante- trois maladies de surcharge lysosomales bénéficient de la thérapie enzymatique substitutive (TES). Parmi les maladies lysosomales on pourra plus particulièrement citer le groupe des mucopolysaccharidoses, qui comprend sept maladies différentes, et qui se caractérise par une atteinte du tissu osseux, y compris du cartilage et des tissus mous. L’atteinte squelettique de ces maladies associe les déformations osseuses et la plupart des types de raideurs articulaires.
[0003] Il n’ existe actuellement aucune TES efficace qui cible à la fois les tissus mous et le tissu osseux. Le défi de cibler à la fois les tissus mous et le tissu osseux représente un problème médical majeur pour les patients souffrant en particulier de mucopolysaccharidoses. Afin de cibler à la fois le tissu osseux et les tissus mous, il est nécessaire de préparer une nouvelle génération de ligands combinant un ciblage osseux efficace et un ciblage modéré du RM6P-CI, afin d’éviter une accumulation des enzymes lysosomales par les tissus mous.
[0004] Les enzymes lysosomales ont une demi-vie courte dans la circulation sanguine en raison de la liaison rapide des enzymes lysosomales aux récepteurs du M6P présents dans la plupart des organes. Par conséquent, l’amélioration des lésions du tissu osseux chez les patients atteints de mucopolysaccharidoses est très limitée, même après un traitement à long terme, et le ciblage de ce tissu osseux est donc de première importance pour améliorer les traitements.
[0005] L’hydroxyapatite (HA) est un composant inorganique majeur du tissu osseux qui est absent dans les tissus mous. Certaines protéines du tissu osseux (ostéopontine, sialoprotéine osseuse, etc.) peuvent se lier à l’hydroxyapatite (HA) via leur séquence répétitive d’acides aminés chargés négativement, à savoir l’acide aminé aspartate (représenté par « Asp » ou « D ») et l’acide aminé glutamate (représenté par « Glu » ou « E »). Ces séquences répétitives enchaînant six de ces acides aminés sont appelées peptides polyanioniques de type E6 et D6. Dans le document Tomatsu, S. et al. (Mol. Gen. Metab. 2015, 114, 94-109), les peptides polyanioniques ont été appliqués à l’enzyme N- acétylgalactosamine-6-sulfatase humaine (GALNS) et à l’enzyme P-glucuronidase (GUSB). Ces enzymes, marquées par les séquences d’acides aminés de type E6 et D6, ont une élimination réduite de la circulation sanguine chez des souris atteintes de mucopolysaccharidose de type IVA et VII, et sont retenues plus longtemps dans l’os, avec une activité enzymatique résiduelle substantielle.
[0006] Le document WO 2011/000958 décrit des analogues isostères synthétiques du mannose 6-phosphate (M6P) présentant une affinité pour le RM6P-CI allant de 10'4 à 10'9 M. Ces analogues du M6P, appelés « AMFA » (« Analogues synthétiques du Mannose 6- phosphate Fonctionnalisés en position Anomère ») ont été conçus pour être greffés sélectivement, par l’intermédiaire d’un bras espaceur, sur des glycoprotéines, et plus particulièrement sur les chaînes oligosaccharidiques d’une enzyme lysosomale. Ce greffage préserve à la fois la structure tridimensionnelle de l’enzyme et son activité enzymatique. De plus les composés bifonctionnels issus de ce greffage présentent une bonne stabilité dans le sang. Dans le document El Cheikh, K. et al (Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55,14774-14777), un composé AMFA comprenant une extrémité phosphonate a été greffé sur l’enzyme alpha-glucosidase acide (GAA) par l’intermédiaire d’un bras espaceur pour le traitement de la maladie de Pompe, qui est une maladie lysosomale affectant principalement les muscles. Cependant ces composés, même s’ils s’avèrent intéressants pour le traitement de maladies de surcharge lysosomale, ne permettent pas de traiter spécifiquement des altérations du tissu osseux. [0007] Les Inventeurs ont maintenant mis au point de nouveaux conjugués comprenant des analogues isostères du mannose 6-phosphate (M6P) aux propriétés particulièrement avantageuses. On entend par « isostère du M6P », un composé chimique synthétique présentant la même activité biologique que le M6P mais avec une stabilité améliorée.
Les conjugués de l’invention comprennent plus particulièrement des analogues du M6P qui présentent à la fois une affinité pour le récepteur du mannose 6-phosphate cation- indépendant (RM6P-CI) mais également pour le tissu osseux, et en particulier pour l’hydroxyapatite. En outre, les conjugués de l’invention présentent une excellente stabilité dans les liquides physiologiques.
Résumé
[0008] Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante
[Cheml]
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
X représente un groupement bisphosphonate
[Chem2]
Figure imgf000005_0002
un groupement hydroxybisphosphonate [Chem3]
Figure imgf000006_0001
un groupement halogénobisphosphonate [Chem4]
Figure imgf000006_0002
avec T représentant un halogène Cl ou F, un groupement malonate [Chem5]
Figure imgf000006_0003
un groupement phosphonoacétate [Chem6]
Figure imgf000006_0004
avec Z représentant indépendamment l’un de l’autre H; un métal alcalin choisi parmi Na, Li ou K ; un ammonium NF ; n est un entier allant de 0 à 2 ; Li représente un radical choisi dans le groupe comprenant *-O-N=**,
[Chem7]
Figure imgf000007_0001
avec * indiquant le point d’attachement de Li au groupe (O-CH2-CH2)n et ** indiquant le point d’attachement de Li à Yi ; ni est un entier allant de 1 à 1000, de préférence de 1 à 20, et plus préférentiellement encore de 1 à 10,
Yi représente un produit d’intérêt Y, ledit produit d’intérêt Y étant choisi dans le groupe comprenant des protéines, notamment des anticorps et des enzymes lysosomales, des nanoparticules, des composés cytotoxiques et des marqueurs pour l’imagerie médicale, Yi formant liaison(s) covalente(s) avec Li.
[0009] Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus.
[0010] Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet un conjugué de formule (I) pour une utilisation médicale, de type diagnostique ou thérapeutique. Elle porte notamment sur un conjugué de formule (I) pour une utilisation comme médicament dans le traitement de pathologies osseuses et/ou de pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous.
Brève description des dessins
[0011] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig. 1
[0012] [Fig. 1] illustre le procédé de préparation de l’intermédiaire triflate 6 : le 2,3,4-tri-O- benzoyl-6-(trifluorométhanesulfonate)-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle, qui servira comme précurseur pour la synthèse des composés de formule (II) dénommés respectivement MAM-1 ou 11 et MAM-2 ou 14.
Fig. 2
[0013] [Fig. 2] illustre le procédé de préparation du composé de formule (II), dénommé MAM-1 ou 11 , dans laquelle X représente un groupement bisphosphonate avec Z = H, n est égal à zéro et L représente ONH2, à partir du précurseur 6.
Fig. 3
[0014] [Fig. 3] illustre le procédé de préparation du composé de formule (II), dénommé MAM-2 ou 14, dans laquelle X représente un groupement malonate avec Z = H, n est égal à zéro et L représente ONH2, à partir du précurseur 6.
Fig. 4
[0015] [Fig. 4] illustre le schéma de synthèse général des conjugués de formule (I) dans laquelle est égal à 1 , en fonction de la signification du groupe chimique réactif L de l’analogue du M6P de formule générale (II).
La figure 4 point 1/ illustre la réaction entre la fonction oxy-amine de l’analogue du M6P de formule (II) avec une fonction aldéhyde (-CHO) (préalablement générée lors d’un processus oxydatif) d’un produit d’intérêt Y (comme un anticorps ou une enzyme lysosomale). Le produit Y est représenté par Yi’-CHO, Y1’ représentant le produit Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -CHO. L’analogue (II) est dénommé MAM-1 lorsque X est un groupement bisphosphonate et n est égal à 0 et MAM-2 lorsque X est un groupement malonate et n est égal à 0.
La figure 4 point 21 illustre la réaction entre la fonction squarate de l’analogue du M6P de formule (II) avec une fonction amine (-NH2) d’un produit d’intérêt Y. Le produit d’intérêt Y est représenté par Yi’-NH2, Y1’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -NH2. La figure 4 point 3/ illustre la réaction entre la fonction maléimide de l’analogue du M6P de formule (II) avec une fonction thiol (-SH) d’un produit d’intérêt Y. Le produit d’intérêt Y est représenté par Yi’-SH, Y1’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH.
La figure 4 point 4/ illustre la réaction entre la fonction carbonylacrylique de l’analogue du M6P de formule (II) avec une fonction thiol d’un produit d’intérêt Y. [0016] [Fig. 5] illustre la cytotoxicité sur des fibroblastes sains des composés de formule (II) MAM-1 et MAM-2 en comparaison avec le composé mannose 6-phosphate (M6P) et avec un composé analogue du M6P, à savoir le composé dénommé « AMFA », composé dont la formule est proche de celle d’un composé de formule (II), à savoir avec n est égal à zéro et L égal à ONH2 mais avec X qui représente un groupement phosphonate -CH2- P(O)(OH)2. L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés M6P (histogramme noir), AMFA (histogramme gris), MAM-1 (histogramme blanc) et MAM-2 (histogramme hachuré). L’axe des ordonnées représente la survie cellulaire des composés. La survie cellulaire observée en présence de M6P a été prise comme valeur du 100%.
Fig. 6
[0017] [Fig. 6] illustre les interactions entre le RM6P-CI et les composés de formule (II) MAM-1 et MAM-2 en comparaison avec les composés M6P et AMFA. L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés M6P (courbe pointillée), AMFA (courbe grise aux motifs carrés), MAM-1 (courbe noire aux motifs ronds) et MAM-2 (courbe gris clair avec une croix). L’axe des ordonnées représente le pourcentage de liaison desdits composés au RM6P-CI.
Fig. 7
[0018] [Fig. 7] illustre l’adsorption à l’hydroxyapatite (HA) des composés de formule (II) MAM-1 et MAM-2 et des composés M6P, AMFA, zolédronate et acide médronique. L’axe des abscisses représente, respectivement de gauche à droite : M6P (histogramme noir), AMFA (histogramme blanc), MAM-1 (histogramme gris foncé), MAM-2 (histogramme hachuré), zolédronate (histogramme pointillé) et acide médronique (histogramme gris clair). L’axe des ordonnées représente le pourcentage de composés adsorbés à HA.
Fig. 8
[0019] [Fig. 8] illustre la cytotoxicité sur des fibroblastes sains des conjugués de l’invention de formule (I), à savoir Myo-MAM-1 et Myo-MAM-2, en comparaison avec le conjugué Myo- AMFA et avec l’enzyme Myozyme ® commerciale seule (qui est l’enzyme alpha- alglucosidase). L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés Myozyme ® (histogramme noir), Myo-AMFA (histogramme gris), Myo-MAM-1 (histogramme blanc) et Myo-MAM-2 (histogramme hachuré). L’axe des ordonnées représente la survie cellulaire en présence des composés. La survie cellulaire observée en présence de Myozyme a été prise comme valeur du 100%.
Fig. 9 [0020] [Fig. 9] illustre les interactions entre le RM6P-CI et l’anticorps Infliximab seul ou fonctionnalisé par les composés de formule (II) MAM-1 et MAM-2 ou par le composé AMFA. L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés M6P (courbe en pointillée tout à droite), Infliximab (courbe grise avec motif carré), Infliximab-AMFA (courbe grise avec motif triangle), lnfliximab-MAM-1 (courbe noire avec motif croix) et Infliximab- MAM-2 (courbe gris clair avec motif astérisque). L’axe des ordonnées dans chacune de ces figures représente le pourcentage de liaison des composés au RM6P-CI.
Fig. 10
[0021] [Fig. 10] illustre l’adsorption à l’hydroxyapatite (HA) de l’anticorps Infliximab seul ou couplé aux composés de formule (II) MAM-1 et MAM-2 ou à AMFA. L’axe des abscisses représente, respectivement de gauche à droite : Infliximab (histogramme noir), lnfliximab- MAM-1 (histogramme blanc), lnfliximab-MAM-2 (histogramme gris) et Infliximab-AMFA (histogramme hachuré). L’axe des ordonnées représente le pourcentage de composés adsorbés à HA.
Description détaillée
[0022] Les conjugués de formule (I)
[0023] Comme indiqué, la présente invention a pour objet un conjugué de formule (I) telle que ci-dessus définie. On entend par « conjugué » au sens de l’invention un composé comprenant deux parties liées entre elles par une liaison covalente.
La première partie du conjugué représente au moins un analogue du M6P tandis que la deuxième partie du conjugué Yi représente un produit d’intérêt Y choisi dans le groupe comprenant des protéines (telles que des anticorps, des enzymes lysosomales etc.), des nanoparticules, des composés cytotoxiques et des marqueurs pour l’imagerie médicale.
Le produit d’intérêt Y désigne le produit d’intérêt « libre » lorsqu’il ne forme pas de liaison avec l’analogue du M6P.
Le produit d’intérêt Yi désigne le produit d’intérêt Y lorsque ce dernier est lié de façon covalente à l’analogue du M6P par l’intermédiaire du radical Li.
Le produit d’intérêt Y libre peut être représenté par Yi’-L’, avec L’ représentant un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par le produit d’intérêt Y. Autrement dit, Y/ représente le produit d’intérêt Y sans son groupe fonctionnel L’.
C’est le groupe fonctionnel L’ de Y qui va réagir avec un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par l’analogue du M6P afin de former une liaison covalente entre le produit d’intérêt Y et l’analogue du M6P et obtenir ainsi le conjugué de formule (I) de l’invention.
Dans la présente demande, on peut employer indifféremment les termes « groupe fonctionnel », « fonction réactive » ou « groupe chimique réactif ». Chacun de ces termes désigne un groupe porté par le produit d’intérêt Y (ou porté par l’analogue du M6P) capable d’entrer en réaction avec un groupe porté par l’analogue du M6P (ou porté par le produit d’intérêt Y).
Dans la formule (I), l’analogue du M6P correspond à la formule délimitée par la grande parenthèse. L’entier indique le nombre d’analogue(s) du M6P lié(s) au produit d’intérêt Yi. Selon l’invention, analogue(s) du M6P peut (peuvent) être lié(s) de façon covalente à un produit d’intérêt. Ces analogues du M6P sont liés au produit d’intérêt par l’intermédiaire du radical Li.
On entend par un analogue du M6P un composé qui diffère du M6P naturel mais qui présente une capacité d’interaction élevée au RM6P-CI. Une « interaction » désigne dans la présente demande une liaison de type non covalente.
Dans toute la demande, M6P désigne le mannose 6-phosphate et RM6P-CI désigne le récepteur mannose 6-phosphate cation-indépendant.
Le RM6P-CI est un récepteur ubiquitaire qui est présent à la fois dans le cytoplasme et à la membrane des cellules. Son rôle est notamment d’internaliser par endocytose dans la cellule des molécules portant le marqueur de reconnaissance mannose 6-phosphate (M6P). Le conjugué de formule (I) de l’invention est particulièrement avantageux en ce sens qu’il présente plusieurs capacités d’interaction avec plusieurs cibles telles que le RM6P-CI, le tissu osseux ou encore une molécule d’intérêt thérapeutique.
Ainsi le conjugué (I) de l’invention présente plus particulièrement une capacité d’interaction au RM6P-CI (par l’intermédiaire de l’analogue du M6P), une capacité d’interaction au niveau du tissu osseux, plus particulièrement au niveau de l’HA (par l’intermédiaire de l’analogue du M6P et plus particulièrement du groupement X), mais également une capacité d’interaction à des molécules d’intérêt thérapeutique par l’intermédiaire du composé d’intérêt Yi.
Ainsi, si le composé d’intérêt Yi est un anticorps, alors ledit anticorps pourra interagir par exemple avec une molécule d’intérêt thérapeutique qui serait un antigène cible. L’antigène cible se réfère à une molécule membranaire ou extracellulaire d’intérêt thérapeutique ou de diagnostic, en particulier une molécule dont la surexpression induit un état pathologique ou est associée à une condition pathologique ou dont l’expression est impliquée dans un trouble pathologique.
A titre d’exemple de molécules d’intérêt thérapeutique en interaction avec les composés d’intérêt Yi on pourra notamment citer les glycosaminoglycanes qui s’accumulent et créent les maladies de surcharge lysosomales telles que les mucopolysaccharidoses, des facteurs de croissance ou des protéines membranaires impliqués dans la croissance des cancers, et en particulier des cancers osseux primitifs ou des métastases cancéreuses dans le tissu osseux, des facteurs impliqués dans les pathologies osseuses et pouvant servir dans l’imagerie pour le diagnostic ou le ciblage thérapeutique de l’ostéoporose ou des métastases osseuses provenant de cancers du sein, du rein, de la prostate, de la thyroïde et du poumon.
Le tissu osseux désigne un tissu conjonctif qui est métaboliquement actif et constitué de plusieurs types cellulaires et d’une matrice dure. Cette matrice est minéralisée par des sels de calcium et de phosphore qui constituent l’hydroxyapatite et contient de grandes quantités de fibres de collagène.
On entend par « capacité d’interaction » du conjugué (I), sa capacité à former des interactions non-covalentes avec les cibles ci-dessus mentionnées, à savoir avec :
- le RM6P-CI par l’intermédiaire de l’analogue du M6P,
- l’HA du tissu osseux par l’intermédiaire du groupement X de l’analogue du M6P,
- une molécule d’intérêt thérapeutique par l’intermédiaire du composé d’intérêt Yi.
La capacité d’interaction du conjugué avec ses cibles peut également être désignée par l’affinité du conjugué avec ses cibles. L’affinité correspond plus particulièrement à la force ou à l’intensité de l’interaction entre le conjugué et ses cibles.
La « capacité de liaison » du conjugué (I) désigne sa capacité à former des liaisons de type covalentes dans le cas où la partie Yi du conjugué (I) contient une fonction capable de créer une liaison covalente avec une molécule d’intérêt thérapeutique.
[0024] Dans le conjugué de formule (I) telle que définie ci-dessus, Yi peut plus particulièrement être représenté par le groupement L2-Y’I dans lequel Y’i représente le produit d’intérêt Y lié à Li par l’intermédiaire du radical L2 avec L2 choisi dans le groupe comprenant =CH- , -NH- et -S-, ledit Y1 pouvant ainsi être représenté par =CH-Y’i , -NH-Y’1 et -S-Y’i.
Le radical L2 est plus particulièrement issu de la transformation du groupe fonctionnel L’ porté par le produit d’intérêt Y1 lorsque ce dernier forme une liaison covalente avec l’analogue du M6P.
[0025] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, le conjugué de formule (I) est caractérisé en ce que est un entier égal à 1 , et en ce que ledit conjugué est choisi dans le groupe comprenant : [Chem10]
Figure imgf000013_0001
avec X, n et Y’i tels que définis ci-dessus.
[0026] Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le conjugué de l’invention est caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y, ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine d’interaction avec l’antigène, ou une enzyme lysosomale Y.
[0027] Selon un mode de réalisation de l’invention, le conjugué (I) est caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y choisi dans le groupe comprenant les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques, les anticorps humains ou humanisés, les anticorps à chaînes lourde et légère, les anticorps à chaîne unique, les anticorps bispécifiques ou multispécifiques et les nanocorps.
[0028] Selon encore un mode de réalisation particulièrement avantageux, le conjugué de l’invention est plus particulièrement caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y qui est une immunoglobuline de type IgG, en particulier de sous-type lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4, ou une immunoglobuline de type IgE, IgD, IgA ou IgM.
[0029] Selon encore un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, le conjugué de l’invention est plus particulièrement caractérisé en ce que Yi représente une enzyme lysosomale Y dont l’expression est altérée et impliquée dans les mucopolysaccharidoses pour lesquelles la croissance osseuse est altérée.
[0030] Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le conjugué de formule (I) tel que ci-dessus défini peut également être caractérisé en ce qu’il présente une affinité, mesurée par la concentration inhibant de 50% (IC50), vis-à-vis du récepteur du mannose 6- phosphate cation indépendant (RM6P-CI) allant de 10'4 M à 10'9 M, et de préférence allant de I O’5 M à IO’8 M.
[0031] Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le conjugué de formule (I) tel que ci-dessus défini peut également être caractérisé en ce qu’il présente une capacité d’adsorption sur I’ hydroxyapatite présente dans le tissu osseux.
[0032] La propriété de double capacité d’interaction des conjugués (I) de l’invention, à savoir au niveau du RM6P-CI (et donc au niveau des compartiments endo-lysosomaux de la cellule) et au niveau du tissu osseux est notamment due au choix judicieux du groupement X du conjugué de formule (I).
Par ailleurs les conjugués de l’invention sont également très avantageux de par la structure de leur bras espaceur. On entend par « bras espaceur » la partie située après l’oxygène porté par le carbone anomérique de la structure cyclique de l’analogue du M6P, qui fait la jonction avec le produit d’intérêt Y1, à savoir la partie « -(CH2)2(O-CH2-CH2)n-Li- » (voir conjugué de formule (I)). La structure de ce bras espaceur est notamment simple sur le plan chimique et permet un greffage efficace avec le produit d’intérêt.
Des produits d’intérêt Y1 considérés seuls et/ou des molécules d’intérêt thérapeutique interagissant avec ces produits d’intérêt Y1 sont donc spécifiquement adressés au système endo-lysosomal et à I’ hydroxyapatite via les conjugués (I) de l’invention.
Les conjugués selon l’invention présentent donc de nombreuses applications dans le domaine du diagnostic et de la thérapie, et en particulier dans les thérapies enzymatiques de substitution combinées à une stratégie de ciblage osseux pour le traitement des maladies de surcharge lysosomale dans le corps humain ou chez l’animal. Ces conjugués peuvent aussi trouver des applications dans le domaine du traitement des cancers osseux ou de l’ostéoporose.
[0033] Procédé de préparation des conjugués de formule (I)
[0034] Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l’on fait réagir :
- un produit d’intérêt Y avec
- ni composé(s) répondant à la formule générale (II) suivante
[Chem14]
Figure imgf000015_0001
dans laquelle X, n et sont tels que définis ci-dessus,
L est un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant -O-NH2, [Chem 15]
Figure imgf000015_0002
[Chem 17]
Figure imgf000016_0001
ledit groupe L du composé (II) formant liaison(s) covalente(s) avec groupe(s) fonctionnel(s) porté(s) par ledit produit d’intérêt Y.
[0035] Le composé de formule (II) est un analogue du M6P. C’est le groupe chimique réactif L porté par l’analogue du M6P de formule (II) qui va réagir avec le groupe fonctionnel L’ du produit d’intérêt Y afin de former une liaison covalente entre le produit d’intérêt Y et l’analogue du M6P et obtenir ainsi le conjugué de formule (I) de l’invention.
Le radical L2 précédemment mentionné à propos de Y1 (à savoir Y1 est représenté par le groupement L2-Y’I) est plus particulièrement issu de la transformation du groupe fonctionnel L’ porté par le produit d’intérêt Y (Y étant représenté par le groupement L’-Y’i,) lorsque Y forme une liaison covalente avec l’analogue du M6P et est alors représenté par Y1.
Les composés de formule (II) sont particulièrement intéressants de par la simplicité de leur bras espaceur. On entend par « bras espaceur » la partie située après l’oxygène porté par le carbone anomérique de la structure cyclique de l’analogue du M6P et qui comprend le groupe chimique réactif L, à savoir la partie (CH2)2(O-CH2-CH2)n-L.
En effet, la simplicité de la structure du bras espaceur participe aux avantages présentés par les conjugués de formule (I) de l’invention. Cette simplicité du bras espaceur permet notamment de synthétiser aisément les composés de formule (II) puis de réaliser un couplage particulièrement intéressant et efficace avec un produit d’intérêt Y. La synthèse des conjugués de formule (I) est ainsi efficace et aisée à mettre en oeuvre.
[0036] Les groupes L de l’analogue du M6P tels que ci-dessus définis (par ordre d’apparition) peuvent être respectivement dénommés de façon simplifiée, « oxy-amine », « squarate », « maléimide » et « groupe comprenant une fonction carbonylacrylique ».
[0037] Les analogues du M6P de formule (II) peuvent être représentés par le sigle « MAM », l’acronyme MAM signifiant « mime de l’acide médronique ».
[0038] Selon un mode de réalisation de l’invention les analogues du M6P de formule (II) seront choisis dans le tableau 1 ci-dessous.
[0039] [Tableau 1]
Figure imgf000017_0001
[0040] Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention, l’utilisation des analogues (II) décrits dans le tableau 1 permet d’une part d’effectuer un couplage particulièrement intéressant et efficace avec un produit d’intérêt Y et d’autre part permet d’interagir efficacement à la fois avec le RM6P-CI et avec le tissu osseux.
[0041] Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, les analogues de formule (II) sont ceux dont le groupe L est une « oxy-amine » ou un « squarate ».
[0042] Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, si Y représente par exemple un anticorps ou une enzyme lysosomale, le groupe L du composé (II) va se lier au niveau d’une fonction carbonyle préalablement générée sur une chaîne/partie oligosaccharidique de la partie glycosidique de l’anticorps ou de l’enzyme lysosomale.
La partie glycosidique de l’anticorps susmentionnée est plus particulièrement celle située au niveau de la région Fc de l’anticorps.
A titre d’exemple de groupe L du composé (II), on pourra citer le groupe oxy-amine.
[0043] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le groupe L du composé (II) va se lier au niveau d’un résidu acide aminé approprié de la chaîne/partie peptidique de l’anticorps ou de l’enzyme lysosomale.
A titre d’exemple d’un résidu acide aminé approprié on pourra citer un groupe amine provenant d’une lysine ou encore un groupe thiol provenant d’une cystéine. A titre d’exemple de groupe L du composé (II), on pourra citer un groupe squarate, un groupe maléimide ou un groupe carbonylacrylique.
[0044] La figure 4 illustre un schéma de synthèse général des conjugués (I) de l’invention avec X représentant un bisphosphonate ou un malonate, en fonction des définitions respectives du groupe chimique réactif L de l’analogue du M6P de formule générale (II).
Comme indiqué et montré sur la figure 4, point 1/, la fonction carbonyle (-CHO) du produit d’intérêt Y réagit avec la fonction oxy-amine du composé de formule (II). Si Y représente un anticorps, ce mode de couplage intervient par exemple au niveau d’une chaîne oligosaccharidique de la partie glycosidique située sur la partie Fc de l’anticorps.
Concernant le mode de couplage du composé de formule (II) comprenant le groupe squarate (voir figure 4 point 2/), si Y représente un anticorps, ce dernier intervient par exemple au niveau d’un résidu lysine de la partie peptidique d’un anticorps, à savoir plus particulièrement au niveau de la fonction amine.
Concernant le mode de couplage du composé de formule (II) avec un groupe maléimide (voir figure 4 point 3/), si Y représente un anticorps, ce dernier intervient au niveau d’un résidu cystéine de la partie peptidique de l’anticorps, à savoir plus particulièrement au niveau de la fonction thiol.
Concernant le mode de couplage du composé de formule (II) comprenant une fonction carbonylacrylique (voir figure 4 point 4/), si Y représente un anticorps, ce dernier intervient au niveau d’un résidu cystéine de la partie peptidique de l’anticorps, à savoir plus particulièrement au niveau de la fonction thiol.
Tous ces modes de couplage sont particulièrement avantageux car ils ne créent pas ou créent peu d’encombrement au niveau des autres fonctions réactives de l’anticorps (comme par exemple les récepteurs FcRn de l’anticorps), ce qui permet avantageusement à l’anticorps de préserver ses propriétés naturelles.
Un anticorps a plus particulièrement été cité comme exemple de composé Y. Cependant les modes de couplage sur des résidus lysine et/ou cystéine ci-dessus décrits sont également applicables à toutes protéines ou peptides non glycosylés.
[0045] Utilisation des conjugués (I) dans une méthode de traitement thérapeutique ou de diagnostic
[0046] Pour les raisons mentionnées précédemment, les conjugués (I) de l’invention, de par leurs propriétés avantageuses, sont particulièrement intéressant pour une utilisation dans le domaine de la thérapie ou dans le domaine du diagnostic.
[0047] Selon un autre aspect de l’invention, il est proposé une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend : - un conjugué tel que défini ci-dessus,
- au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Le conjugué de l’invention de formule (I) est présent en une quantité thérapeutiquement efficace dans la composition de l’invention.
Par "quantité thérapeutiquement efficace", on entend un dosage suffisant pour produire un résultat souhaité, par exemple, une quantité suffisante pour obtenir des résultats thérapeutiques (y compris préventifs) bénéfiques ou souhaités, tels qu'une réduction du taux d’un élément dont la surexpression extracellulaire ou membranaire est responsable d’une pathologie ou est impliquée dans une condition pathologique. Une quantité efficace peut nécessiter une ou plusieurs administrations.
[0048] Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant :
- une quantité thérapeutiquement efficace du conjugué de formule (I),
- au moins un autre agent thérapeutiquement actif,
- éventuellement au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0049] La présente invention concerne également un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation médicale, de type thérapeutique ou diagnostique.
[0050] A cet égard, l’invention a plus particulièrement pour objet un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation comme médicament dans le traitement des pathologies osseuses et/ou de pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous.
A titre d’exemple de pathologie osseuse on pourra citer :
- l’ostéoporose et l’ostéomalacie, les dystrophies osseuses (comme la maladie osseuse de Paget), les ostéonécroses, les tumeurs bénignes des os (ostéomes, ostéoblastomes etc.), les tumeurs bénignes du cartilage (enchondromes, ostéochondromes etc.), certaines formes d’arthrite (notamment l’arthrose),
- certaines tumeurs osseuses primitives qui trouvent leur origine dans un os.
Certaines des tumeurs osseuses primitives sont malignes telles que les adamantinomes et les ostéosarcomes survenant chez des enfants et adolescents, et les chondrosarcomes, chordomes, tumeurs malignes à cellules géantes qui sont plus fréquentes chez les adultes. A leur stade précoce, ces tumeurs restent localisées au niveau de tissu osseux mais peuvent métastaser vers des tissus mous tels que le poumon à un stade avancé.
A titre d’exemple de pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous, on pourra citer
- certains cancers de l’os tels que le sarcome d’Ewing, les fibrosarcomes et lymphomes osseux indifférenciés présentant une composante de tissu mou dès leur formation,
- des cancers de l’os qui se développent à partir des cellules métastatiques ayant migré à partir d’une tumeur primaire localisée dans un tissu mou (sein, poumon, rein, prostate, thyroïde, colon etc.),
- un cancer développé à partir de la moelle osseuse tel que le myélome multiple,
- des maladies de surcharge lysosomale comme par exemple les mucopolysaccharidoses (MPS-I, MPS-I I, MPS-I II , MPS-IV, MPS-V, MPS-VI et MPS-VII), la maladie de Fabry et la maladie de Pompe.
[0051] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, le conjugué ou la composition pharmaceutique est appropriée pour une utilisation dans le traitement d’une pathologie choisie dans le groupe comprenant l’ostéoporose, un cancer de l’os, une maladie de surcharge lysosomale.
[0052] L’ invention a également pour objet un conjugué de formule (I) tel que défini ci- dessus ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation dans une méthode de diagnostic.
[0053] Selon un mode de réalisation avantageux, l’invention a pour objet le conjugué de formule (I) ou la composition pharmaceutique pour une utilisation telle que ci-dessus définie, caractérisée en ce que le conjugué ou la composition pharmaceutique est sous une forme adaptée pour une administration par voie parentérale, intraveineuse ou sous-cutanée.
Exemples
[0054] Les exemples qui suivent font référence aux figures 1 à 10 et décrivent la synthèse des analogues du M6P de formule (II) et des conjugués (I) de l’invention, ainsi que l’étude de leur effets biologiques. Les analogues du M6P de formule (II) de l’invention seront également comparés à l’analogue du M6P dénommé AMFA (composé notamment décrit dans le document WO 2011/000958) et au composé mannose 6-phosphate M6P.
[0055] Exemple 1 : Synthèse des analogues du M6P
[0056] Les analogues du M6P synthétisés dans cet exemple sont les composés de formule (II) dénommés respectivement MAM-1 ou 11 et MAM-2 ou 14 dont les formules développées sont respectivement les suivantes :
[Chem18]
Figure imgf000021_0001
[0057] Préparation du synthon 6, précurseur commun aux composés MAM-1 et MAM-2
La synthèse du composé 6 (« 2,3,4-tri-O-benzoyl-6-O-(trifluorométhanesulfonyl)-a-D- mannopyranoside de 2-bromoéthyle ») est illustrée à la figure 1 . Le composé de départ est le 1 ,2,3,4, 6-penta-O-acétyl a-D-mannose sur lequel est introduit en position anomère un groupement bromoéthoxy à l’aide de diéthyléthérate de trifluorure de bore et de 2- bromoéthanol dans du dichlorométhane pour former le composé 1 (« 2,3,4,6-tétra-O-acétyl- a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle ») avec un rendement de 80%. Les acétates présents sur les positions 2, 3, 4 et 6 du composé 1 ont ensuite subi une méthanolyse en présence d’une solution de méthanolate de sodium dans du méthanol pour former le composé 2 (« a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle ») avec un rendement de 100%. La position 6 du dérivé 2 est ensuite protégée avec du chlorure de monométhoxytrityle dans de la pyridine pour donner l’intermédiaire 3 (« 6-O-méthoxytrityl-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle »). Successivement, les positions 2, 3 et 4 sont ensuite benzoylées par l’action du bromure de benzoyle pour former le composé 4 (« 2,3,4-tri-O-benzoyl-6-O-((4- méthoxyphenyl)diphénylméthyl))-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle »). Le synthon 5 (« 2,3,4-tri-O-benzoyl-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle ») est obtenu après déprotection sélective du groupement trityle en présence de nitrate de cérium et d’ammonium (CAN) dans un mélange acétonitrile/eau, à reflux. Le rendement sur 3 étapes est de 45%. La position 6 du composé 5 est ensuite activée sous la forme de triflate, grâce à l’addition à froid d’anhydride triflique sur le sucre en présence de 2,6-di-ferf-butyl-4- méthylpyridine. Le composé 6 est ainsi obtenu avec un rendement de 90% après purification. Conditions et réactifs : (i) BF3.Et2O, 2-Bromoéthanol, DCM, TA, 20 h ; (ii) MeONa, MeOH, TA, 1 h ; (iii) MMTrCI, Pyridine, TA, 5 h ; (iv) BzCI, Pyridine, 0°C, 19h ; (v) CAN, ACN/H2O (95 :5), 82°C, 2 h ; (vi) Tf20, 2,6-Di-ferf-butyl-4-méthylpyridine, DCM, -40°C, 30 min.
[0058] Préparation du composé « bisphosphonate » MAM-1 (ou 11 ) répondant à la formule (11)
Le composé MAM-1 (ou 11 ) répond à la formule (II) dans laquelle X représente un groupement bisphosphonate avec Z = H, n est égal à zéro et L représente ONH2, à partir du précurseur 6. Ce composé pourra être appelé composé « bisphosphonate » MAM-1 .
La synthèse du composé MAM-1 (ou 11 ) est illustrée à la figure 2.
Le synthon triflate 6 est transformé en intermédiaire bisphosphonate 7 (« 2,3,4-tri-O- benzoyl-6-désoxy-6-bis(diéthoxyphosphinyl)méthylène-a-D-mannopyranoside de 2- bromoéthyle ») en additionnant, à froid, une solution d’anion de méthylènebisphosphonate de tétraéthyle préparé dans une suspension d’hydrure de sodium (NaH) dans du tétrahydrofurane (THF). Le rendement de cette étape est de 50%. L’intermédiaire 8 (« 6- désoxy-6-bis(diéthoxyphosphinyl)méthylène-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle ») est obtenu après méthanolyse des groupements benzoates grâce à l’action d’une solution méthanolique de méthanolate de sodium, avec un rendement de 50%. Le composé 9 (« 6- désoxy-6-bis(diéthoxyphosphinyl)méthylène-a-D-mannopyranoside de 2- (phtalimidoxy)éthyle ») est obtenu avec un rendement de 55% après substitution nucléophile du brome par l’anion du A/-hydroxyphthalimide formé avec du NaH dans du THF à chaud. La silylation des positions 2, 3 et 4 de l’intermédiaire est réalisée en ajoutant du chlorure de triméthylsilyl et de la triéthylamine dans du dichlorométhane, afin d’obtenir le dérivé 10 (« 2,3,4-tri-O-triméthylsilyl-6-désoxy-6-bis(diéthoxyphosphinyl)méthylène-a-D- mannopyranoside de 2-(phtalimidoxy)éthyle ») avec un rendement quantitatif. Le produit final MAM-1 (ou 11) (« 6-désoxy-6-bis(dihydroxyphosphinyl)méthylène-a-D- mannopyranoside de 2- aminooxyéthyle ») est obtenu à la suite de deux réactions successives de déprotection. Dans un premier temps, les groupements alkyles du bisphosphonate sont convertis par transestérification en esters de triméthylsilyle correspondants grâce à la réaction de Rabinowitz employant du chlorure de triméthylsilyle TMSCI en présence d’iodure de sodium Nal et de triéthylamine NEt3 dans de l’acétonitrile. Un traitement avec de l’hydrazine monohydratée dans du méthanol MeOH permet d’obtenir le MAM-1 final (11 ) avec un rendement sur 2 étapes de 78% après purification.
Conditions et réactifs : (i) MDPTE, NaH, THF, 0°C, 5 h ; (ii) MeONa, MeOH, 0°C, 3h ; (iii) /V-Hydroxyphthalimide, DBU, THF, 60°C, 4 h ; (iv) TMSCI, Et3N, DCM, 0°C, 20 min ; (v) TMSCI, Nal, Et3N, ACN, 50°C, 24 h ; (vi) N2H4.H2O, MeOH, TA, 24 h. [0059] Préparation du composé « malonate » MAM-2 (ou 14) répondant à la formule (II) Le composé MAM-2 (ou 14) répond à la formule (II) dans laquelle X représente un groupement malonate avec Z = H, n est égal à zéro et L représente ONH2, à partir du précurseur 6. Ce composé pourra être appelé composé « malonate » MAM-2.
La synthèse du composé MAM-2 (ou 14) est illustrée à la figure 3.
Le triflate 6 est transformé en composé 12 (« (2,3,4-tri-O-benzoyl-6,7-didésoxy-7- méthoxycarbonyl-a-D-manno-octopyranoside de 2-bromoéthyle) uronate de méthyle ») avec un rendement de 85% après réaction avec l’anion du malonate de diméthyle préalablement préparé par l’action de NaH dans du THF. L’atome de brome du composé 12 est ensuite substitué par l’anion du A/-hydroxyphthalimide préparé avec du bicarbonate de sodium NaHCOs dans du DMF, à 65°C. Le composé 13 (« 2,3,4-tri-O-benzoyl-6,7- didésoxy-7-méthoxycarbonyl-a-D-manno-octopyranoside de 2-(phtalimidoxy)éthyle) uronate de méthyle ») est ainsi obtenu avec un rendement de 92%. Le composé 13 est ensuite traité avec de l’hydrazine monohydratée dans du MeOH, puis avec une solution de NaOH 1 M dans du THF pour produire le composé final MAM-2 (ou 14) (« Acide (6,7- didésoxy-7-carboxy-a-D-manno-octopyranoside de 2- aminooxyéthyle) uronique ») avec un rendement de 42% sur les 2 étapes.
Conditions et réactifs : (i) Malonate de diméthyle, NaHCOs, THF, 0°C, 5 h ; (ii) N- hydroxyphthalimide, DBU, DMF, 65°C, 22 h ; (iii) N2H4.H2O, MeOH, 0°C, 2h30 ; (iv) NaOH 1 M, THF, 0°C, 2h30
[0060] Préparation du composé AMFA
Les composés MAM-1 et MAM-2 seront notamment comparés dans ce qui suit à un autre analogue du M6P, à savoir le composé dénommé AMFA dont la formule développée est la suivante :
[Chem20]
Figure imgf000023_0001
Ce composé AMFA est synthétisé selon un protocole décrit dans le document WO 2011/000958. Les composés MAM-1 et MAM-2 se différencient du composé AMFA en ce que le groupement X est respectivement un bisphosphonate dans MAM-1 et un malonate dans MAM-2 alors que dans le composé AMFA le groupement X est un phosphonate. Les composés MAM-1 , MAM-2 et AMFA seront également comparés au composé mannose 6-phosphate (M6P) acheté dans le commerce.
[0061] Exemple 2 : Préparation des conjugués de l’invention
[0062] Deux produits d’intérêt Y, à savoir une enzyme lysosomale et un anticorps, ont respectivement été fonctionnalisés avec des analogues du M6P, à savoir avec les composés de formule (II) de l’invention MAM-1 et MAM-2, mais aussi avec le composé AMFA.
[0063] L’ enzyme lysosomale testée est achetée dans le commerce sous la dénomination Myozyme ®. Il s’agit de l’enzyme alpha alglucosidase (ou alpha glucosidase acide). Elle peut être représentée dans ce qui suit par « Myo ». Elle contient dans sa structure des résidus M6P permettant le ciblage du RM6P-CI. L’enzyme lysosomale Myo est utilisée pour le traitement de la maladie de Pompe par thérapie enzymatique substitutive.
L’anticorps testé est l’infliximab, qui est un anticorps monoclonal chimérique de type lgG1 qui ne possède pas de résidus M6P dans sa structure. Il peut être représenté dans ce qui suit par « Infli ».
[0064] Les conjugués ainsi formés peuvent indifféremment être représentés dans la présente demande par « MAM-1 -Myo » ou « Myo-MAM-1 », « MAM-2-Myo » ou « Myo- MAM-2 », « MAM-1 -Infli » ou « lnfli-MAM-1 », « MAM-2-lnfli » ou « lnfli-MAM-2 », « AMFA- Myo » ou « Myo-AMFA », « AMFA-Infli » ou « Infli-AMFA ».
Les conjugués de l’invention sont ceux qui comprennent la partie MAM-1 ou MAM-2. Avantageusement selon l’invention la partie MAM-1 ou MAM-2 du conjugué (I) interagit à la fois avec le RM6P-CI et avec l’hydroxyapatite (HA).
[0065] Couplage et quantification des analogues du M6P (MAM-1 , MAM-2 et AMFA) avec un produit d’intérêt Y (Myo ou Infliximab)
Le couplage d’un analogue du M6P (MAM-1 , MAM-2 et AMFA) avec un produit d’intérêt Y (Myo ou Infliximab) est réalisé grâce à la fonction éthyloxyamine présente sur le bras espaceur de MAM-1 , MAM-2 et AMFA, qui permet la formation d’une liaison covalente de type oxime avec les fonctions aldéhydes préalablement générées par oxydation ménagée sur les chaînes oligosaccharidiques du produit d’intérêt Y (Myo ou Infliximab).
Le couplage d’un produit d’intérêt Y comprenant une fonction aldéhyde (générée par oxydation) avec un composé de formule (II) comprenant un bras espaceur avec une fonction éthyloxyamine (donc avec n égal à zéro et L= -ONH2) est illustré en figure 4 point 1/.
Oxydation des chaînes oligosaccharidiques du produit d’intérêt Y (Myo ou Infliximab)
Une quantité de 0,5 mg/mL de produit d’intérêt Y et une solution 1 mM de métapériodate de sodium (NaIC ) sont mis à réagir dans 0,1 M tampon phosphate pH 6,25 pendant 30 min à 4°C dans l'obscurité. Le glycérol (concentration finale 272 mM) est ajouté pendant 5 min à 0°C pour arrêter la réaction et l'échantillon est filtré sur une colonne PD-10 en utilisant un tampon phosphate 25 mM pH 7.
Couplage des analogues du M6P (MAM-1 , MAM-2 et AMFA) avec Myo ou Infliximab
Après l’étape d’oxydation ménagée, un excès d’analogue du M6P (MAM-1 , MAM-2 ou AMFA) est ajouté et incubé pendant 2 h à température ambiante. Enfin, les échantillons sont dialysés dans l’eau pour les échantillons testés en spectrométrie de masse MALDITOF ou dans un tampon contenant 25 mM phosphate, 2% mannitol et 0,005% polysorbate 80 pendant une nuit. Une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis d’évaluer le nombre de résidus « analogue du M6P » greffés sur le produit d’intérêt Y. Le tableau 2 ci-dessous représente le nombre moyen d’analogues du M6P greffés, calculé à partir de deux analyses MALDI-TOF.
[0066] [Tableau 2]
Figure imgf000025_0001
[0067] Remargues et conclusion
Dans cette condition d’oxydation par 1 mM NalÛ4 le greffage des AMFA, MAM-1 et MAM-2 est évalué à 3,9 à 4,8 analogues du M6P par molécule d’Infliximab et seulement 0,9 à 1 ,1 analogue du M6P par Myo. Ceci indique une plus grande sensibilité à l’oxydation des chaînes glycosylées de Infliximab par rapport à celles de Myo qui peut être due à des différences dans la nature des chaînes oligosaccharidiques les composant.
[0068] Exemple 3 : Evaluation biologique des analogues M6P
Les analogues M6P de formule (II) de l’invention, à savoir les composés MAM-1 et MAM- 2, ont été comparés sur le plan biologique à l’analogue AMFA et au M6P. En effet, les composés AMFA et M6P sont connus pour ne pas présenter de toxicité cellulaire et pour avoir des capacités d’interaction avec le RM6P-CI. [0069] 1/ Évaluation de la cytotoxicité des analogues MAM-1 et MAM-2
La cytotoxicité des analogues MAM-1 et MAM-2 de formule (II) a été évaluée en comparaison avec celle du M6P et l’analogue AMFA sur des fibroblastes humains sains selon le protocole décrit ci-dessous.
Protocole expérimental :
Les cellules sont ensemencées dans des plaques de 96 puits (Maxisorp Nunc) dans une étuve à 37°C contenant 5% CO2. Elles sont ensuite traitées selon un gradient de concentrations (10‘3 à 10'6 M) d’analogues. Après 72 h une solution de MTT (bromure de 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tétrazolium) est ajoutée et l’incubation est poursuivie pendant 4 h à 37°C. Les cristaux formés sont ensuite dissous avec une solution DMSO/EtOH (1 :1 ). La mesure de la survie cellulaire est effectuée au spectrophotomètre à 540 nm.
Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 5. Il ressort de cette figure que les composés MAM-1 , MAM-2, AMFA et M6P ne sont pas cytotoxiques sur les deux lignées cellulaires même à des concentrations élevées.
[0070] 2/ Affinité des analogues MAM-1 et MAM-2 pour le RM6P-CI
Les analogues MAM-1 et MAM-2 ont été évalués pour leur affinité pour le récepteur RM6P- Cl en comparaison avec l’AMFA et le M6P. Comme déjà indiqué, l’affinité désigne l’intensité de l’interaction des analogues du M6P pour le RM6P-CI. Pour ce faire, un test basé sur la compétition d’interaction avec le RM6P-CI est réalisé selon le protocole décrit ci-dessous. Protocole expérimental :
Des plaques de 96 puits (Maxisorp Nunc) sont incubées une nuit à 4°C avec 200 pL de PM6P (pentamannose 6-phosphate) à la concentration de 200 pg.mL'1, dans le tampon carbonate (NaHCO3/Na2CC>3 0,1 M, pH 9.6). Le lendemain, la solution contenant le PM6P résiduel est écartée et les puits sont saturés, pendant 1 h à température ambiante, avec 360 pL gélatine 1% (Type A from Porcine Skin) diluée dans PBS (1 ,9 mM NaF^PC , 8,1 mM Na2PC>4 et 154 mM NaCI, pH 7.4). Les puits sont ensuite rincés 5 fois par PBS additionné de 0,2% gélatine. Tous les lavages ainsi que les dilutions sont réalisés dans PBS additionné de 0,2% gélatine. Les composés à tester (MAM-1 , MAM-2, AMFA et M6P) aux différentes concentrations (de 10'3 à 10'6 M) sont pré-incubés en présence du RM6P- Cl préalablement biotinylé (RM6Pb) (2,5 pg.mL'1) pendant 20 min, puis 200 pL du mélange sont incubés dans les puits pendant 2 h, à température ambiante. Après 3 lavages, les puits sont incubés pendant 1 h avec une solution 3.10'8 M de streptavidine-peroxydase. Après 3 autres lavages, 200 pL de solution contenant 1 mg.mL'1 OPD (o-phenylènediamine et 1 pL 30% H2O2.mL'1 dans tampon citrate pH 5,0) est ajoutée. Après 20 min d’incubation dans l’obscurité et à température ambiante, les densités optiques sont mesurées à 450 nm. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 6. Les données indiquent de très bonnes affinités de MAM-1 , MAM-2 et AMFA correspondant à des concentrations inhibitrices à 50% (IC50) de 3,2.10’5 M, 3,0.10’5 M, 4,5.10'5 M respectivement. Par comparaison l’affinité du M6P est de 2,4.10'5 M dans ces mêmes expériences.
[0071] 3/ Adsorption des analogues MAM-1 et MAM-2 sur l’hydroxyapatite
La méthode repose sur le dosage inverse de la quantité d’analogues non liés à l’hydroxyapatite, par analyse RMN 31P ou 1H. Pour cela, deux tubes sont préparés contenant une quantité égale d’analogues. Dans l’un, une quantité définie d’hydroxyapatite est introduite au préalable et les deux tubes sont ensuite placés sous agitation. Après centrifugation, un volume égal du surnageant de chaque tube est prélevé et une quantité définie d’étalons est rajoutée en complément lors du conditionnement pour l’analyse RMN. Pour chaque tube, l’aire des signaux correspondant aux analogues et celle de l’étalon sont mesurées et le rapport des deux aires est effectué. La capacité d’adsorption des analogues MAM-1 , MAM-2, AMFA et du M6P est évaluée selon ce procédé et comparée à celles de composés thérapeutiques commerciaux utilisés dans le cadre du traitement de maladies osseuses, à savoir le zolédronate et l’acide médronique.
Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 7.
Il ressort de cette figure que l’analogue MAM-1 se lie totalement à l’hydroxyapatite comme les dérivés bisphosphonates thérapeutiques de l’art antérieur (le zolédronate et l’acide médronique). Ces résultats sont donc encourageants et prometteurs quant à la capacité des conjugués de l’invention comprenant de tels analogues du M6P de traiter efficacement des pathologies osseuses. En effet, même si des dérivés bisphosphonates ont été précédemment utilisés pour le traitement de pathologies osseuses, rien ne laissait supposer à l’homme de l’art qu’un analogue du M6P de formule (II) avec un groupement X tel que précédemment défini permettrait de conférer une double capacité d’interaction, à la fois au niveau du RM6P-CI mais également au niveau de l’HA.
Les composés M6P, AMFA et MAM-2 quant à eux démontrent une capacité d’adsorption à l’HA nettement inférieure aux dérivés bisphosphonates, avec une valeur proche de 30 % pour le MAM-2.
[0072] Exemple 4 : Evaluation biologique des conjugués de l’invention
[0073] Les conjugués testés dans cet exemple sont ceux précédemment décrits dans le tableau 2.
[0074] 1/ Évaluation de la cytotoxicité des conjugués Myo-MAM-1 et Myo-MAM-2
La cytotoxicité des conjugués Myo-MAM-1 , Myo-MAM-2 de l’invention de formule (I) et du conjugué Myo-AMFA a été évaluée en comparaison avec l’enzyme lysosomale seule Myo sur des fibroblastes humains sains, selon le même protocole que celui décrit dans l’exemple 3. Les cellules ont été incubées avec des concentrations croissantes (100-1000 ng/mL) de conjugués pendant 72 h. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 8. Les conjugués Myo-MAM-1 , Myo-MAM-2 et Myo-AMFA montrent leur innocuité sur les fibroblastes humains.
[0075] 2/ Affinité des conjugués lnfli-MAM-1 et lnfli-MAM-2 pour le RM6P-CI
Les conjugués lnfli-MAM-1 et lnfli-MAM-2 de l’invention de formule (I) et le conjugué Infli- AMFA ont été évalués pour leur affinité pour le récepteur RM6P-CI selon le même protocole que celui décrit dans l’exemple 3. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 9.
Il est intéressant de constater que le greffage des analogues MAM-1 et MAM-2 de l’invention et de l’analogue AMFA à l’Infliximab permet d’obtenir un anticorps affin pour le RM6P-CI alors que l’infliximab ne présente pas d’affinité, en accord avec l’absence de groupement M6P dans sa structure. L’affinité des conjugués Infli-AMFA, lnfli-MAM-1 et infli- MAM-2 est comparable pour l’interaction avec le RM6P-CI ce qui indique que l’addition de plusieurs analogues bispécifiques de type MAM-1 ou MAM-2 permet avantageusement de créer une affinité 10 fois supérieure à celle du M6P.
[0076] 3/ Adsorption des conjugués lnfli-MAM-1 , lnfli-MAM-2 sur l’hydroxyapatite
Les conjugués lnfli-MAM-1 , lnfli-MAM-2 de l’invention de formule (I) et le conjugué Infli- AMFA ont été évalués pour leur capacité d’adsorption sur l’hydroxyapatite selon le même protocole que celui décrit dans l’exemple 3. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 10.
Les résultats démontrent qu’environ 28% de l’infliximab s’adsorbe naturellement à l’hydroxyapatite (HA). Le greffage des analogues MAM-1 et MAM-2 à l’anticorps permet d’augmenter de façon significative l’adsorption à HA. Les 4,6 MAM-1 et 3,9 MAM-2 greffés à l’infliximab permettent d’augmenter de 20% et 25% respectivement l’adsorption de l’infliximab à l’HA. Les adsorptions équivalentes des lnfli-MAM-1 et lnfli-MAM-2 pour l’HA s’expliquent par l’effet de multivalence généré par la présence de 4,6 et 3,9 MAM greffés sur l’infliximab puisque lorsque le MAM-2 est considéré seul (c’est-à-dire quand il n’est pas couplé à un produit d’intérêt Y) il a une très faible affinité pour l’HA (voir exemple 3 figure 7).
Il est également intéressant de constater que le greffage de l’analogue AMFA à l’anticorps ne permet absolument pas d’augmenter l’adsorption de l’infliximab à l’HA mais au contraire a pour effet de la diminuer. Cela démontre encore une fois l’intérêt des analogues (II) de l’invention qui confèrent aux conjugués (I) de l’invention des propriétés particulièrement avantageuses. [0077] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.
Liste des documents cités Documents brevets
[0078] À toute fin utile, les documents brevets suivants sont cités :
- patcitl : WO 2011/000958.
Littérature non-brevet
[0079] À toute fin utile, les éléments non-brevets suivants sont cités : - nplcitl : Tomatsu, S. et al., Mol. Gen. Metab. 2015, 114, 94-109;
- nplcit2 : El Cheikh, K. et al Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55,14774-14777.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante
[Cheml]
Figure imgf000030_0001
dans laquelle :
X représente un groupement bisphosphonate
[Chem2]
Figure imgf000030_0003
un groupement halogénobisphosphonate
Figure imgf000030_0002
avec T représentant un halogène Cl ou F, un groupement malonate
[Chem5]
Figure imgf000031_0001
un groupement phosphonoacétate [Chem6]
Figure imgf000031_0002
avec Z représentant indépendamment l’un de l’autre H; un métal alcalin choisi parmi Na, Li ou K ; un ammonium NF ; n est un entier allant de 0 à 2 ; Li représente un radical choisi dans le groupe comprenant *-O-N=**,
[Chem7]
Figure imgf000031_0003
[Chem8]
Figure imgf000031_0004
[Chem9]
Figure imgf000032_0001
avec * indiquant le point d’attachement de Li au groupe (O-CH2-CH2)n et ** indiquant le point d’attachement de Li à Yi ; ni est un entier allant de 1 à 1000, de préférence de 1 à 20, et plus préférentiellement encore de 1 à 10,
Yi représente un produit d’intérêt Y, ledit produit d’intérêt Y étant choisi dans le groupe comprenant des protéines, notamment des anticorps et des enzymes lysosomales, des nanoparticules, des composés cytotoxiques et des marqueurs pour l’imagerie médicale, Yi formant liaison(s) covalente(s) avec Li.
[Revendication 2] Conjugué selon la revendication 1 , caractérisé en ce que Yi est représenté par le groupement l_2-Y’i dans lequel Y’i représente le produit d’intérêt Y lié à Li par l’intermédiaire du radical l_2 avec l_2 choisi dans le groupe comprenant =CH- , -NH- et -S-, ledit Yi pouvant ainsi être représenté par =CH-Y’i , -NH-Y’i et -S-Y’i.
[Revendication 3] Conjugué selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que est un entier égal à 1 et en ce que ledit conjugué de formule (I) est choisi dans le groupe comprenant :
[Chem10]
Figure imgf000032_0002
[Chem12]
Figure imgf000033_0001
avec X, n et Y’i tels que définis à la revendication 1 ou 2.
[Revendication 4] Conjugué selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y, ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine d’interaction avec l’antigène, ou une enzyme lysosomale Y.
[Revendication 5] Conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que Yi représente un anticorps Y qui est une immunoglobuline de type IgG, en particulier de sous-type IgG 1 , lgG2, lgG3 ou lgG4, ou une immunoglobuline de type IgE, IgD, IgA ou IgM.
[Revendication 6] Conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que Yi représente une enzyme lysosomale Y dont l’expression est altérée et impliquée dans les mucopolysaccharidoses pour lesquelles la croissance osseuse est altérée.
[Revendication 7] Conjugué selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il présente une affinité, mesurée par la concentration inhibant de 50% (IC50), vis- à-vis du récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) allant de 10'4 M à 10'9 M, et de préférence allant de 10'5 M à 10'8 M.
[Revendication 8] Conjugué selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu’il présente une capacité d’adsorption sur l’hydroxyapatite présente dans le tissu osseux.
[Revendication 9] Procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l’on fait réagir : - un produit d’intérêt Y avec
- ni composé(s) répondant à la formule générale (II)
[Chem14]
Figure imgf000034_0001
dans laquelle X, n et sont tels que définis à la revendication 1 ,
L est un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant -O-NH2,
[Chem15]
Figure imgf000034_0002
[Chem16]
Figure imgf000034_0003
et
[Chem17]
Figure imgf000034_0004
ledit groupe L du composé (II) formant liaison(s) covalente(s) avec groupe(s) fonctionnel(s) porté(s) par ledit produit d’intérêt Y. [Revendication 10] Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend :
- un conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 8,
- au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. [Revendication 11] Conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10, pour une utilisation comme médicament dans le traitement des pathologies osseuses et/ou des pathologies affectant à la fois le tissu osseux et les tissus mous. [Revendication 12] Conjugué ou composition pharmaceutique pour une utilisation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que la pathologie est choisie dans le groupe comprenant l’ostéoporose, un cancer de l’os, une maladie de surcharge lysosomale.
[Revendication 13] Conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10, pour une utilisation dans une méthode de diagnostic.
[Revendication 14] Conjugué ou composition pharmaceutique pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 11 à 13 caractérisée en ce que le conjugué ou la composition pharmaceutique est sous une forme adaptée pour une administration par voie parentérale, intraveineuse ou sous-cutanée.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011000958A1 (fr) 2009-07-03 2011-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Composés ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant
WO2021142377A2 (fr) * 2020-01-10 2021-07-15 Lycia Therapeutics, Inc. Composés et conjugués de liaison au récepteur de surface cellulaire
WO2023156730A1 (fr) * 2022-02-15 2023-08-24 Nanomedsyn Composés bifonctionnels ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011000958A1 (fr) 2009-07-03 2011-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Composés ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant
WO2021142377A2 (fr) * 2020-01-10 2021-07-15 Lycia Therapeutics, Inc. Composés et conjugués de liaison au récepteur de surface cellulaire
WO2023156730A1 (fr) * 2022-02-15 2023-08-24 Nanomedsyn Composés bifonctionnels ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EL CHEIKH, K. ET AL., ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 55, 2016, pages 14774 - 14777
TOMATSU, S ET AL., MOL. GEN. METAB, vol. 114, 2015, pages 94 - 109
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