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WO2024167361A1 - 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 안정화된 제제 - Google Patents

재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 안정화된 제제 Download PDF

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Publication number
WO2024167361A1
WO2024167361A1 PCT/KR2024/001962 KR2024001962W WO2024167361A1 WO 2024167361 A1 WO2024167361 A1 WO 2024167361A1 KR 2024001962 W KR2024001962 W KR 2024001962W WO 2024167361 A1 WO2024167361 A1 WO 2024167361A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pharmaceutical preparation
protein
buffer
present
paragraph
Prior art date
Application number
PCT/KR2024/001962
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
송동호
Original Assignee
(주)지바이오로직스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)지바이오로직스 filed Critical (주)지바이오로직스
Publication of WO2024167361A1 publication Critical patent/WO2024167361A1/ko

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Definitions

  • the present invention relates to a stabilized preparation comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein, and to a pharmaceutical preparation capable of stably preserving galectin 9 protein by combining it with a buffer and a stabilizer.
  • Galectin-9 is a beta-galactoside lectin protein isolated from mouse embryonic kidney. Galectin-9 consists of two carbohydrate recognition domains (CRDs) and a link peptide region connecting them, and the N-terminal Carbohydrate Recognition Domain (NCRD) and the C-terminal Carbohydrate Recognition Domain (CCRD) are connected by this link peptide region. Galectin-9 is one of the ligands for HAVCR2 (Tim-3), and is known to bind to Tim-3, induce apoptosis of Tim-3-positive Th1 cells, and suppress autoimmune inflammation by inhibiting excessive Th1 responses.
  • CCDs carbohydrate recognition domains
  • NCRD N-terminal Carbohydrate Recognition Domain
  • CCRD C-terminal Carbohydrate Recognition Domain
  • galectin-9 has been observed in various cancers such as regional melanoma, Hodgkin's disease, liver cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, and colon cancer, and studies have been conducted to produce mutants to utilize it as a therapeutic agent.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a recombinant stabilized galectin 9 protein has been disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2022-0068158.
  • formulation design is required in order to technically apply it to the human body by administering it to a patient.
  • formulations show a large difference in the efficacy and stability applied to the human body depending on the type of additive, mixing ratio, etc., and they need to be closely examined not only for the duration after administration, drug distribution, metabolism, excretion, but also for the packaging condition, packaging container, etc.
  • poorly soluble drugs they can be taken using capsules, but there is a problem that they are difficult to take depending on the manufacturing method or ratio, so various studies are required as a formulation.
  • antibodies have low stability, they lose their efficacy due to denaturation, oxidation, aggregation, decomposition, etc., and in some cases, they can cause risks such as toxicity. Therefore, various efforts are required to manufacture pharmaceutical formulations that are stable, effective, and easy to use.
  • the inventors of the present invention completed the present invention by conducting extensive research on a formulation for stabilizing recombinant galectin 9 protein and discovering a highly stable formulation.
  • Patent Document 0001 Republic of Korea Publication Patent No. 10-2022-0068158
  • the present invention aims to provide a pharmaceutical preparation capable of stably preserving a recombinant stabilized galectin 9 protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation comprising (1) a recombinant stabilized galectin 9 protein; (2) a buffer; and (3) a stabilizer.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is a protein having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein comprises a deletion of the first amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is 1 to 20 mg/ml.
  • the buffer is at least one selected from the group consisting of citrate, phosphate, histidine, glycine, acetate, tartrate, aspartate, lactate, gluconate, glutamate, succinate, and combinations thereof.
  • the buffer has a pH of 4.5 to 7.
  • the buffer has a concentration of 5 to 20 mM.
  • the stabilizer comprises (i) one or more carbohydrates or sugars; and (ii) one or more amino acids or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the carbohydrate or sugar is selected from the group consisting of mannitol, sorbitol, xylitol, maltitol, lactitol, sucrose, trehalose, mannose, maltose, lactose, xylose, ribose, glucose, raffinose, dextran, cyclodextrin, cellobiose, isomaltose, arabinose, glucosamine and fructose.
  • the carbohydrate or sugar is selected from the group consisting of trehalose and mannitol.
  • the amino acid is selected from the group consisting of glycine, alanine, serine, threonine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, histidine, lysine and arginine.
  • the carbohydrate or sugar comprises one or more carbohydrates or sugars, each of which is 1 to 5 w/v%.
  • the amino acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is present in an amount of 1 to 20 mg/ml.
  • the stabilizer further comprises polysorbate.
  • the stabilizer further comprises 0.001 to 0.05 w/v% of polysorbate 80.
  • the pharmaceutical preparation is in a liquid or lyophilized form.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation for preventing or treating bone disease, comprising a therapeutically effective amount of the pharmaceutical preparation.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation for preventing cancer or treating an autoimmune disease, comprising a therapeutically effective amount of the pharmaceutical preparation.
  • the present invention provides a use of a pharmaceutical preparation in the manufacture of a drug for preventing or treating bone disease.
  • the present invention also provides a use of the pharmaceutical formulation in the manufacture of a drug for preventing or treating cancer or autoimmune diseases.
  • the present invention provides a use of the pharmaceutical preparation for preventing or treating bone disease.
  • the present invention provides a use of the pharmaceutical preparation for preventing or treating cancer or autoimmune diseases.
  • the present invention provides a method for treating bone disease, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical preparation to a subject.
  • the present invention provides a method for treating cancer or an autoimmune disease, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical preparation to a subject.
  • the present invention relates to a pharmaceutical preparation comprising a galectin 9 recombinant protein, and has an advantage in that it can provide a preparation with high stability by using a buffer, etc.
  • Figure 1 is a diagram showing the results of a comparative experiment of histidine buffer and PBS buffer.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of a comparative experiment of acetate buffer and PBS buffer.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of a comparative experiment of histidine acetate buffer and sodium acetate buffer.
  • Figures 4a to 4c are diagrams showing the results of a titer test according to the pH of a histidine acetate buffer.
  • Figure 5 is a diagram showing the properties according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3-3).
  • Figure 6 is a diagram showing the properties according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3-6).
  • Figure 7 is a diagram showing the results of SDS PAGE analysis according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3-6).
  • Figures 8a to 8d are diagrams showing SEC HPLC analysis results according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3-6).
  • Figures 9a to 9d are diagrams showing the results of IEX HPLC analysis according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3-6).
  • Figures 10a to 10b are diagrams showing Potency results according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3-6).
  • the present invention relates to a pharmaceutical preparation comprising (1) a recombinant stabilized galectin 9 protein; (2) a buffer; and (3) a stabilizer.
  • the recombinant stabilized galectin-9 protein has a molecular structure that is more stable against protease while maintaining the sugar chain recognition activity of wild type galectin-9.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is a recombinant protein produced by modifying the link region connecting two CRDs (Carbohydrate Recognition Domains) of wild-type galectin 9 having the structure of NCRD-linker-CCRD and the CCRD (C-terminal Carbohydrate Recognition Domain; C-terminal domain).
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which all of the peptides in the linker region are deleted, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) at positions 1 to 10 in CCRD (SEQ ID NO: 2) is deleted and Ala (Alarine; A) at position 13 is replaced with Pro (Proline; P), and may include an amino acid sequence having a sequence identity of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and may additionally include an amino acid sequence manufactured for a specific purpose of increasing a targeting sequence, a tag, a labeled residue, a half-life, or peptide stability.
  • the recombinant protein of the present invention can be obtained by various methods widely known in the art.
  • it can be produced by a method of producing it using polynucleotide recombination and a protein expression system, a method of synthesizing it in vitro through chemical synthesis such as peptide synthesis, and a cell-free protein synthesis method.
  • polynucleotide used in the present invention is a polymer in which nucleotides are linked, and serves to transmit genetic information.
  • it may include a sequence that encodes a recombinant protein of SEQ ID NO: 1 and has a sequence homology of 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more to a polynucleotide sequence encoding the recombinant protein.
  • homology used in the present invention is intended to indicate the degree of similarity with a wild type amino acid sequence or polynucleotide sequence, and a comparison of such homology can be performed using a comparison program widely known in the art, and the homology between two or more sequences can be calculated as a percentage (%).
  • prevention means any act of inhibiting or delaying the onset of a disease by administering a composition.
  • treatment means any action by which the symptoms of the disease are improved or beneficially changed by administration of the composition.
  • pharmaceutical preparation means a finished product manufactured by filling, lyophilizing, and/or dissolving a raw solution containing a composition.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is a protein having an amino acid sequence having 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein comprises a deletion of the first amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein in the pharmaceutical formulation may be contained in an amount of 0.01 to 400 mg/ml.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein may be contained in an amount of 0.01 to 250 mg/ml, more specifically, 0.01 to 150 mg/ml, 0.01 to 120 mg/ml, 0.01 to 100 mg/ml, 0.1 to 80 mg/ml, 0.1 to 60 mg/ml, or 0.1 to 40 mg/ml.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein comprises 0.1 to 20 mg/ml, 0.1 to 18 mg/ml, 0.1 to 16 mg/ml, 0.1 to 15 mg/ml, 1 to 15 mg/ml, 2 to 15 mg/ml, 3 to 15 mg/ml, 4 to 15 mg/ml, or 5 to 15 mg/ml.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is at 5.5 to 15 mg/ml, 6 to 15 mg/ml, 6.5 to 15 mg/ml, 7 to 15 mg/ml, 7.5 to 15 mg/ml, 7.5 to 14.5 mg/ml, 7.5 to 14 mg/ml, 7.5 to 13.5 mg/ml, 7.5 to 13 mg/ml, or 7.5 to 12.5 mg/ml.
  • the buffer is at least one selected from the group consisting of citrate, phosphate, histidine, glycine, acetate, tartrate, aspartate, lactate, gluconate, glutamate, succinate, and combinations thereof.
  • the buffer is at least one selected from the group consisting of phosphate, histidine, acetate, and combinations thereof.
  • the buffer is histidine acetate. In the present invention, including histidine can exhibit advantageous effects in terms of stability and pH control.
  • the buffer does not contain a sodium salt.
  • the buffer has a pH of 4 to 7.
  • the pH of the buffer can be 4.5 to 7, more specifically, 4.6 to 7, 4.7 to 7, 4.8 to 7, 4.9 to 7, or 5 to 7.
  • the pH of the buffer is 5.1 to 7, 5.2 to 7, 5.3 to 7, 5.4 to 7, 5.5 to 7, 5.5 to 6.9, 5.5 to 6.8, 5.5 to 6.7, 5.5 to 6.6, or 5.5 to 6.5.
  • the pH of the buffer is 5.6 to 6.5, 5.65 to 6.5, 5.6 to 6.5, 5.65 to 6.5, 5.7 to 6.5, 5.75 to 6.5, 5.75 to 6.4, 5.75 to 6.35.
  • the buffer in the pharmaceutical formulation may be included at 0.01 to 50 mM.
  • the buffer has a concentration of 0.01 to 45 mM, more specifically, 0.01 to 40 mM, 0.01 to 35 mM, 0.01 to 30 mM, or 0.01 to 25 mM.
  • the buffer has a concentration of 0.1 to 25 mM, 0.1 to 24 mM, 0.1 to 23 mM, 0.1 to 23 mM, 0.1 to 22 mM, 0.1 to 21 mM, 1 to 21 mM, 2 to 21 mM, 3 to 21 mM, or 4 to 21 mM.
  • the buffer has a concentration of 4 to 20.5 mM, 4 to 20 mM, 4.5 to 20 mM, or 5 to 20 mM.
  • the stabilizer comprises (i) one or more carbohydrates or sugars; and (ii) one or more amino acids or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the carbohydrate or sugar may include all of sugar, sugar alcohol, sugar acid, and sugar derivative, and may include, but is not limited to, glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, glycerol, iresritol, arabitol, xylitol, mannitol, sorbitol, galactitol, fusitol, iditol, maltitol, lactitol, maltotriitol, maltotetraitol, and the like.
  • the amino acid may include a natural amino acid or a non-natural amino acid, and may include, but is not limited to, glycine, alanine, serine, threonine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and the like.
  • the carbohydrate or sugar is selected from the group consisting of mannitol, sorbitol, xylitol, maltitol, lactitol, sucrose, trehalose, mannose, maltose, lactose, xylose, ribose, glucose, raffinose, dextran, cyclodextrin, cellobiose, isomaltose, arabinose, glucosamine and fructose.
  • the carbohydrate or sugar is selected from the group consisting of mannitol and trehalose.
  • the stabilizer comprises one or more carbohydrates or sugars, each of which is 0.01 to 10 w/v%.
  • the one or more carbohydrates or sugars contained in the stabilizer may be 0.01 to 9.5 w/v%, 0.01 to 9 w/v%, 0.01 to 8.5 w/v%, 0.01 to 8 w/v%, 0.01 to 7.5 w/v%, 0.5 to 7.5 w/v%, or 1 to 7.5 w/v%.
  • the one or more carbohydrates or sugars included in the stabilizer are in an amount of 1 to 6 w/v%, 1 to 5.9 w/v%, 1 to 5.8 w/v%, 1 to 5.7 w/v%, 1 to 5.6 w/v%, 1 to 5.5 w/v%, 1 to 5.4 w/v%, 1 to 5.3 w/v%, 1 to 5.2 w/v%, 1 to 5.1 w/v%, or 1 to 5 w/v%.
  • the stabilizer may comprise two or more carbohydrates or sugars. Specifically, two or more carbohydrates or sugars are included, and one carbohydrate or sugar is 1 to 3 w/v%, 1.1 to 3 w/v%, 1.2 to 3 w/v%, 1.3 to 3 w/v%, 1.4 to 3 w/v%, 1.5 to 3 w/v%, 1.5 to 2.9 w/v%, 1.5 to 2.8 w/v%, 1.5 to 2.7 w/v%, 1.5 to 2.6 w/v%, or 1.5 to 2.5 w/v%.
  • the other carbohydrate or sugar is 3 to 5 w/v%, 3.1 to 5 w/v%, 3.2 to 5 w/v%, 3.3 to 5 w/v%, 3.4 to 5 w/v%, 3.5 to 5 w/v%, 3.5 to 4.9 w/v%, 3.5 to 4.8 w/v%, 3.5 to 4.7 w/v%, 3.5 to 4.6 w/v%, or 3.5 to 4.5 w/v%.
  • the stabilizer comprises two or more carbohydrates or sugars, wherein one carbohydrate or sugar is present in an amount of 1.5 to 2.5 w/v%, 1.55 to 2.5 w/v%, 1.6 to 2.5 w/v%, 1.65 to 2.5 w/v%, 1.7 to 2.5 w/v%, 1.75 to 2.5 w/v%, 1.75 to 2.45 w/v%, 1.75 to 2.4 w/v%, 1.75 to 2.35 w/v%, 1.75 to 2.3 w/v%, or 1.75 to 2.25 w/v%.
  • the other carbohydrate or sugar is 3.5 to 4.5 w/v%, 3.55 to 4.5 w/v%, 3.6 to 4.5 w/v%, 3.65 to 4.5 w/v%, 3.7 to 4.5 w/v%, 3.75 to 4.5 w/v%, 3.75 to 4.45 w/v%, 3.75 to 4.4 w/v%, 3.75 to 4.35 w/v%, 3.75 to 4.3 w/v%, or 3.75 to 4.25 w/v%.
  • the carbohydrate or sugar comprises trehalose and mannitol. Further, in one embodiment of the present invention, the carbohydrate or sugar comprises trehalose and mannitol, each of which is 1 to 10 w/v%.
  • the mannitol is 1 to 9 w/v%, 1 to 8 w/v%, 1 to 7 w/v%, 1 to 6 w/v%, 1 to 5 w/v%, 1.5 to 5 w/v%, 2 to 5 w/v%, 2.5 to 5 w/v%.
  • the mannitol is present in an amount of 3.5 to 4.5 w/v%, 3.55 to 4.5 w/v%, 3.6 to 4.5 w/v%, 3.65 to 4.5 w/v%, 3.7 to 4.5 w/v%, 3.75 to 4.5 w/v%, 3.75 to 4.45 w/v%, 3.75 to 4.4 w/v%, 3.75 to 4.35 w/v%, 3.75 to 4.3 w/v%, or 3.75 to 4.25 w/v%.
  • the trehalose is 1 to 3 w/v%, 1.1 to 3 w/v%, 1.2 to 3 w/v%, 1.3 to 3 w/v%, 1.4 to 3 w/v%, 1.5 to 3 w/v%, 1.5 to 2.9 w/v%, 1.5 to 2.8 w/v%, 1.5 to 2.7 w/v%, 1.5 to 2.6 w/v%, or 1.5 to 2.5 w/v%.
  • the trehalose is present in an amount of 1.5 to 2.5 w/v%, 1.55 to 2.5 w/v%, 1.6 to 2.5 w/v%, 1.65 to 2.5 w/v%, 1.7 to 2.5 w/v%, 1.75 to 2.5 w/v%, 1.75 to 2.45 w/v%, 1.75 to 2.4 w/v%, 1.75 to 2.35 w/v%, 1.75 to 2.3 w/v%, or 1.75 to 2.25 w/v%.
  • the amino acid is selected from the group consisting of glycine, alanine, serine, threonine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, histidine, lysine and arginine.
  • the amino acid is glycine.
  • the amino acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is present in an amount of 0.01 to 20 mg/ml.
  • the amino acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is present at 0.01 to 19 mg/ml, 0.01 to 18 mg/ml, 0.01 to 17 mg/ml, 0.01 to 16 mg/ml, 0.01 to 15 mg/ml, 0.01 to 14 mg/ml, 0.01 to 13 mg/ml, 0.01 to 12 mg/ml, 0.01 to 11 mg/ml, 0.01 to 10 mg/ml, 0.1 to 10 mg/ml, 0.2 to 10 mg/ml, 0.3 to 10 mg/ml, 0.4 to 10 mg/ml, 0.5 to 10 mg/ml, 0.6 to 10 mg/ml, 0.7 to 10 mg/ml, 0.8 to 10 mg/ml, 0.9 to 10 mg/ml, or 1 to 10 mg/ml.
  • the amino acid or pharmaceutically acceptable salt thereof is 1 to 10 mg/ml, 1.5 to 10 mg/ml, 2 to 10 mg/ml, 2.5 to 10 mg/ml, 2.5 to 9.5 mg/ml, 2.5 to 9 mg/ml, 2.5 to 8.5 mg/ml, 2.5 to 8 mg/ml, or 2.5 to 7.5 mg/ml.
  • the amino acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is present at 2.6 to 7.5 mg/ml, 2.7 to 7.5 mg/ml, 2.8 to 7.5 mg/ml, 2.9 to 7.5 mg/ml, 3 to 7.5 mg/ml, 3 to 7 mg/ml, 3 to 6.5 mg/ml, 3 to 6.4 mg/ml, 3 to 6.3 mg/ml, 3 to 6.2 mg/ml, 3 to 6.1 mg/ml, or 3 to 6 mg/ml.
  • the stabilizer further comprises a nonionic surfactant.
  • Nonionic surfactants include, but are not limited to, pluronics, polysorbates, poloxamers, and the like.
  • the stabilizer further comprises polysorbate.
  • the polysorbate is polysorbate 20, polysorbate 80 or a combination thereof.
  • the stabilizer further comprises 0.001 to 0.05 w/v% of polysorbate 20, polysorbate 80 or a combination thereof.
  • the polysorbate 20 or polysorbate 80 is present in an amount of 0.001 to 0.02 w/v%, 0.002 to 0.02 w/v%, 0.003 to 0.02 w/v%, 0.004 to 0.02 w/v%, 0.005 to 0.02 w/v%, 0.005 to 0.019 w/v%, 0.005 to 0.018 w/v%, 0.005 to 0.017 w/v%, 0.005 to 0.016 w/v%, or 0.005 to 0.015 w/v%.
  • the polysorbate 20 or 80 is present in an amount of 0.006 to 0.015 w/v%, 0.0065 to 0.015 w/v%, 0.007 to 0.015 w/v%, 0.0075 to 0.015 w/v%, 0.0075 to 0.014 w/v%, 0.006 to 0.013 w/v% or 0.006 to 0.0125 w/v%.
  • the pharmaceutical preparation has a reference potency of 60 to 130%. Specifically, the pharmaceutical preparation has a reference potency of 70 to 120%.
  • the pharmaceutical preparation has a purity (SEL-HPLC) of 90% or more. Specifically, the purity is 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, and more specifically, the purity is 95% or more.
  • the pharmaceutical preparation is in a liquid or lyophilized form.
  • the pharmaceutical preparation is a lyophilized formulation.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention exhibits higher stability in a lyophilized formulation than in a liquid formulation.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention may have a different form depending on the form of a specific product, and may exist in a filled form, such as a tube, cartridge, syringe, polymer vial, glass vial, etc., but is not limited thereto.
  • the present invention can be filled, etc., by a method by a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs.
  • the present invention relates to a vial filled with the pharmaceutical preparation.
  • the present invention relates to a syringe filled with the pharmaceutical preparation.
  • the present invention may be a method of manufacturing a finished vial filled with the pharmaceutical preparation by preparing a stock solution containing 1/2 part by weight of protein and excipients based on 1 part by weight of a finished product filled with the pharmaceutical preparation, and filling a vial with twice the volume of the prepared stock solution.
  • 1 mL of a stock solution containing 0.5 to 10 mg/ml of recombinant stabilized galectin 9 protein, 0.5 to 5 w/v% of mannitol, 0.5 to 5 w/v% of trehalose, 0.5 to 10 mg/ml of amino acid, and 0.0005 to 0.025 w/v% of polysorbate is filled into 2 mL per vial and then lyophilized to produce a finished product containing 1 to 20 mg/ml of recombinant stabilized galectin 9 protein, 1 to 10 w/v% of mannitol, 1 to 10 w/v% of trehalose, 1 to 20 mg/ml of amino acid, and 0.001 to 0.05 w/v% of polysorbate, and more specifically, 5 to 6 mg/ml of recombinant stabilized galectin 9 protein, 2 w/v% of mannitol, 1 w/v% of trehalose, and amino acid.
  • the method may be, but is not limited to, manufacturing a finished product comprising 10 to 12 mg/ml of recombinant stabilized galectin 9 protein, 4 w/v% of mannitol, 2 w/v% of trehalose, 5 mg/ml of amino acid, and 0.01 w/v% of polysorbate by filling 1 mL of the original solution containing 2.5 mg/ml of recombinant stabilized galectin 9 protein, 2 mL per vial, and then lyophilizing the solution.
  • the present invention relates to a pharmaceutical preparation for preventing or treating bone disease, comprising a therapeutically effective amount of the pharmaceutical preparation.
  • the bone disease may be at least one selected from the group consisting of osteoporosis, bone defects, osteomalacia, osteopenia, osteogenesis imperfecta, osteogenesis imperfecta, primary bone tumors, degenerative bone diseases, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, fractures, osteonecrosis, periodontal diseases, inflammatory alveolar bone resorption diseases, inflammatory bone resorption diseases, and Paget's disease, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a pharmaceutical preparation for preventing cancer or treating autoimmune diseases, comprising a therapeutically effective amount of the pharmaceutical preparation.
  • the cancer may be at least one selected from the group consisting of colon cancer, lung cancer, thyroid cancer, stomach cancer, breast cancer, brain cancer, osteosarcoma, glioblastoma, melanoma, glioma, glioblastoma, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, bladder cancer, kidney cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, esophageal cancer, colon cancer, rectal cancer, large intestine cancer, pancreatic cancer, blood cancer, leukemia, myeloid leukemia, lymphoma, head and neck cancer, skin cancer, and liver cancer, but is not limited thereto.
  • the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE), insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, autoimmune encephalomyelitis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, discoid lupus erythematosus, photosensitivity dermatosis, autoimmune arthritis, myasthenia gravis, thyroiditis, experimental uveitis, Hashimoto's thyroiditis, primary myxedema, thyrotoxicosis, pernicious anemia, autoimmune atrophic gastritis, Addison's disease, premature menopause, male infertility, juvenile diabetes, Goodpasture's syndrome, pemphigoid, sympathetic ophthalmia, phacoemulsifying uveitis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic leukopenia, primary biliary cirrhosis, chronic
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, acute disseminated encephalomyelitis (ADEM), acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis, Addison's disease, agammaglobulinemia, allergic asthma, allergic rhinitis, alopecia areata, amyloidosis, ankylosing spondylitis, antibody-mediated transplant rejection, anti-GBM/anti-TBM nephritis, antiphospholipid antibody syndrome (APS), autoimmune angioedema, autoimmune aplastic anemia, autoimmune dysautonomia, autoimmune hepatitis, autoimmune hyperlipidemia, autoimmune immunodeficiency, autoimmune inner ear disease (AIED), autoimmune myocarditis, autoimmune pancreatitis, autoimmune diabetic retinopathy, autoimmune thrombocytopenic purpura (ATP), autoimmune thyroid disease, autoimmune urticaria, axonal and neuronal neuropathy, Balo disease, Behcet
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical preparation in the manufacture of a drug for preventing or treating bone disease.
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical formulation in the manufacture of a drug for preventing or treating cancer or autoimmune diseases.
  • the present invention relates to the use of pharmaceutical preparations for the prevention or treatment of bone diseases.
  • the present invention relates to the use of pharmaceutical preparations for the prevention or treatment of cancer or autoimmune diseases.
  • the present invention relates to a method for treating bone disease, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical preparation to a subject.
  • the present invention relates to a method for treating cancer or autoimmune disease, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical preparation to a subject.
  • An expression vector containing a gene encoding a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence of sequence number 1 was constructed, and the expression vector was introduced into Escherichia coli by the heat shock method. Expression of the recombinant protein was performed by culturing E. coli in LB medium containing 50 ⁇ g/ml kanamycin, and adding arabinose when the absorbance at 600 nm reached 0.7, thereby inducing expression of the recombinant protein.
  • the cells in which expression of the recombinant protein had been induced were lysed and filtered, and the target protein was captured using a cation exchange method, an affinity column, etc., to obtain a highly pure recombinant stabilized galectin 9 protein in high yield.
  • the recombinant stabilized galectin-9 protein (hereinafter referred to as recombinant galectin-9) manufactured in the above Manufacturing Example 1 was used to manufacture a formulation.
  • the composition of each formulation is as shown in the following Experimental Examples.
  • the purified solution was subjected to ultrafiltration (UF)/dilution filtration (DF) to 11 to 15 mg/mL using 5 mM histidine acetate (HisAce) pH 6.0, then diluted with 2 w/v% mannitol, 1 w/v% trehalose, and 2.5 mg/mL glycine to manufacture a protein concentration of 5 to 7 mg/mL, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and finally filled at 2.0 mL/vial and lyophilized.
  • UF ultrafiltration
  • DF deution filtration
  • HisAce histidine acetate
  • the pH was measured using a pH meter containing a glass electrode. The pH was measured at least twice and the average value was reported.
  • Protein concentration was measured using a Thermo UV spectrophotometer. Measurements were performed according to the SOP method (PD-DPD-EQU-088-01). For all evaluations, the extinction coefficient was 1.0 AU ⁇ mL ⁇ mg -1 ⁇ cm -1 , and the sample was measured at least twice with 2.5 ⁇ L, and the average value was reported.
  • sample concentration was 1.0 mg/mL or higher
  • sample was diluted to 1.0 mg/mL with the mobile phase before SEC analysis, and 50 ⁇ g sample was injected into the HPLC for analysis.
  • SEC-HPLC was performed using a Hitachi Chromaster CM5000 with an Agilent TSKgel 2000SWxl (7.8 mm ⁇ 300 mm, 5 ⁇ m) and a UV detector (detection wavelength: 280 nm).
  • the analysis was performed under the conditions of a column temperature of 25 °C, a loading volume of 50 ⁇ L, a mobile phase (300 mM sodium chloride, 10% isopropyl alcohol, and 50 mM phosphate buffer (pH 6.8 ⁇ 0.1)), and a solvent flow (0.4 mL/min).
  • SDS-PAGE was analyzed using a heat block (DAIHAN MaXtableTM10H), an electrophoresis system (Bio-Rad BR 165-8033FC), and a rocker (Daihan RK-1D).
  • the test solution was diluted 3:1 in 4x sample buffer and heated at 98°C for 5 minutes.
  • the protein standard and sample were each placed into the grooves of a 12% acrylamide gel and electrophoresed at 100 V for 90 minutes.
  • the gel with separated proteins was stained with CBB R-250 solution for 30 minutes on a rocker. Destaining was performed with a destainning solution for 30 minutes on a rocker, and when the background destaining was complete, the dark band around 31 kD was identified and analyzed.
  • a 1 mL vial of Molt 4 T-cell was thawed at 37°C for 1 to 2 minutes.
  • the cells were added to 10 mL of culture medium (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin in RPMI1640) and centrifuged at 1,300 rpm and room temperature (24°C) for 3 minutes.
  • the culture medium was removed, and fresh culture medium was added to suspend the cells so that the concentration was 2 to 4 ⁇ 10 5 cells/mL, placed in a 25 cm 2 culture flask, and cultured in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • the culture medium was changed to maintain 2 to 4 ⁇ 10 5 cells/mL. After that, the cell doubling time and density were confirmed and maintained.
  • a titer test was performed using Molt 4 T-cells with a doubling time of 24 hours and a density of 95% for 2 weeks.
  • the cells were diluted using fresh culture medium so that the cell density was 5.6 ⁇ 10 4 cells/mL.
  • 90 ⁇ L was dispensed into each well of a 96-plate and cultured for 24 hours in an incubator with 5% CO 2 at 37°C.
  • the test solution was diluted to 300, 100, 30, 10, 3, 1, and 0 ⁇ g/mL in PBS(-) and 10 ⁇ L of the diluted sample was added to each well so that the final concentrations in the medium were 30, 10, 3, 0.3, 0.1, and 0 ⁇ g/mL.
  • the cells were cultured for 24 hours in an incubator with 5% CO 2 at 37°C. After that, 10 ⁇ L of detection solution (WST-1) was added to each well, and the reaction was performed for 2 hours in a 37°C, 5% CO2 incubator, and the OD value at 450 nm was measured using a micro plate reader. The change in OD value and LD50 were calculated from a 4 parameter logistic fit.
  • Osmolality was measured using an osmometer. The accuracy of the osmometer before and after the test was checked using a Clinitrol 290 mOsm/kg reference solution, and 20 ⁇ L of each sample was used for analysis.
  • sGal-9 protein The stability of sGal-9 protein was evaluated through the pH/buffer system under stress conditions (37 °C ). In each experiment, 2 mg/mL of sGal-9 was used. The experiment was conducted over 4 weeks according to the appearance analysis of Experimental Example 1. The buffer conditions are as shown in Table 1 below.
  • Buffer Surfactant F01 20 mM histidine (His) pH 6.0 0.02% PS80 (Polysorbate 80) F02 20 mM PBS(Phosphate buffer) pH 7.4 F03 20 mM acetate pH 5.0
  • Figure 1 shows the results of comparing histidine buffer and PBS buffer. As shown in Figure 1, it was confirmed that precipitation occurred in the PBS buffer, confirming that the protein in the histidine buffer was more stable than in the case where the PBS buffer was used.
  • Table 2 and Figure 2 show the results comparing acetate buffer and PBS buffer. As shown in Table 2 and Figure 2, there was a difference in the particle number measured at 25°C 3 days after PBS filtering, confirming that acetate buffer was superior to PBS buffer. (#1: 20 mM PBS, 50 mM NaCl, pH7.3, 0.26 mg/ml / #2: in acetate buffer pH5.0, 0.62 mg/ml / #3: in acetate buffer pH5.3, 0.62 mg/ml / #4: #2 after filtration / #5: #3 after filtration)
  • the stability of sGal-9 protein was evaluated by the same method as in ⁇ Experimental Example 2-1> above.
  • the experiment was conducted over a period of two weeks by performing appearance, UV, pH, SEC-HPLC, SDS-PAGE, and potency tests according to Experimental Example 1.
  • the buffer conditions are as shown in Table 3 below.
  • Buffer Surfactant F01 20 mM histidine acetate (His Ace) pH 6.0 0.04% PS80 (Polysorbate 80) F02 20 mM sodium acetate (Na Ace) pH 7.4
  • histidine acetate showed milky white particles or a large number of particles at 25°C and 40°C, but sodium acetate showed no particles in terms of appearance. However, it was confirmed that the protein in the histidine acetate buffer was more stable than that in the case of using the sodium acetate buffer in terms of purity and potency.
  • the stability of sGal-9 protein was evaluated by the same method as in ⁇ Experimental Example 2-1> above. The experiment was conducted over 4 weeks by performing appearance, UV, pH, protein concentration (100 ⁇ ), SEC-HPLC, osmolality, and potency tests according to Experimental Example 1.
  • the buffer conditions are as shown in Table 8 below.
  • Buffer pH density Sucrose (sucrose) Glycine (glycine) PS (polysorbate 80) mg/mL w/v% mg/mL w/v% F01 20 mM histidine acetate (His Ace) pH 5.0 2 8 2 0.04 F02 20 mM histidine acetate (His Ace) pH 6.0
  • UV, pH, protein concentration (100 ⁇ ), SEC-HPLC and osmolality tests were performed. After 1 week, UV, pH, protein concentration (100 ⁇ ), SEC-HPLC and potency tests were performed at 40°C. After 4 weeks, UV, pH, protein concentration (100 ⁇ ), SEC-HPLC and potency tests were performed at 25°C.
  • histidine buffer pH 6.0
  • histidine buffer pH 5.0
  • sGal-9 protein appeared stably when 8% sucrose, 0.04 polysorbate 80, and 2 mg/ml glycine were used as excipients.
  • histidine acetate buffer pH 6.0 was superior to other pHs.
  • other excipients such as polysorbate 20 (PS 20) or glycine were not clearly observed.
  • the stability of sGal-9 protein was evaluated by the same method as in ⁇ Experimental Example 2-1> above.
  • the buffer conditions are as shown in Table 19 below.
  • the buffer and pH were maintained at 10 mM histidine acetate pH 6.0, and the excipients and formulations were compared.
  • the lyophilized formulation was prepared by preparing sGal-9 protein by excipient, filling a 10 ml vial with 10 mg of sGal-9, and then lyophilizing. The analysis was performed by dissolving the lyophilized sample in 1.0 ml of deionized water at each time point.
  • Buffer pH Sucrose (Sucroese) PS 80 (polysorbate 80) Glycine (Glycine) (w/v %) (w/v %) (mg/ml) C1 10 mM His-Ace 6.0 8 - 5 C2 6.0 8 0.01 5
  • Buffer Sucrose (Sucroese) Mannitol (Mannitol) Trehalose (Trehalose) Glycine (Glycine) PS 80 (w/v %) (w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %) C1 10 mM His-Ace (pH 6.0) 8 - - 5 0.01 C2 - 5 - 5 0.01 C3 - 4 2 5 0.01 C4 2 4 - 5 0.01
  • Buffer Buffer Mannitol (Mannitol) Trehalose (Trehalose) Glycine (Glycine) PS80 (w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %) C1 10mM HisAce pH6.0 4 2 5 - C2 4 2 5 0.01
  • a freeze-dried formulation was prepared according to the same method as in ⁇ Manufacturing Examples 2 and 3> above.
  • the excipient conditions are as shown in Table 38 below.
  • sGal-9 protein stability was evaluated by the same method as in the above ⁇ Experimental Example 2-1>. The purpose is to compare the sGal-9 protein stability in 2% mannitol and 4% mannitol by SEC-HPLC, IEX-HPLC, SDS PAGE, protein, and Potency tests. The test results are as shown in Tables 39 and 40 below.
  • the sGal-9 protein according to the present invention exhibited excellent stability in a lyophilized formulation containing 10 mM histidine acetate buffer (pH6.0), 4 w/v% mannitol, 2 w/v% trehalose, 0.01 w/v% polysorbate 80, and 5 mg/ml glycine per 10 mg of sGal-9 protein, compared to cases where other excipients or other buffers were used.
  • the present invention relates to a pharmaceutical preparation comprising a galectin 9 recombinant protein, and can provide a preparation with high stability by using a buffer, etc.

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Abstract

본 발명은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 안정화된 제제에 관한 것으로, 완충액, 안정화제 등을 배합함에 따라와 조합함에 따라 안정성이 높아진 약학 제제에 관한 것이다.

Description

재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 안정화된 제제
본 발명은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 안정화된 제제에 관한 것으로, 완충액 및 안정화제와 조합함에 따라 갈렉틴 9 단백질을 안정하게 보존할 수 있는 약학 제제에 관한 것이다.
갈렉틴 9은 마우스 배아 신장에서 분리된 베타-갈락토시드 렉틴 단백질(beta-galactoside lectin protein)이다. 갈렉틴 9은 2개의 당쇄 인식 부위(당 인식 도메인, carbohydrate recognition domain: CRD)와 이들을 잇는 링크 펩티트 영역으로 이루어져 있고, 이 링크 펩티드 영역에 의해 N 말단 도메인(N-terminal Carbohydrate Recognition Domain; NCRD)과 C 말단 도메인(C-terminal Carbohydrate Recognition Domain; CCRD)이 연결된 것이다. 갈렉틴 9은 HAVCR2(Tim-3)에 대한 리간드 중 하나로, Tim-3에 결합하여 Tim-3 양성 Th1 세포의 아포토시스를 유도하고, 과잉의 Th1 반응을 저해시킴으로써 자가 면역성의 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 갈렉틴 9은 부위흑색종, 호지킨병, 간암, 췌장암, 위암, 대장암 등 다양한 암에서 관찰되어 왔고, 이를 치료제로 이용하기 위해 개변체를 제조하는 등의 연구가 이루어져 왔다. 이와 관련하여, 대한민국공개특허 제10-2022-0068158호에서 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 공개된 바 있다. 다만, 공개된 바에 따르더라도, 환자에 투여하여 기술적으로 인체에 적용하기 위해서는 제제설계가 요구된다.
일반적으로, 제제화는 첨가물의 종류, 배합비율 등에 따라 인체에 적용되는 유효성과 안정성에 큰 차이를 나타내고, 투여후 지속시간, 약물분포, 대사, 배설 등 뿐만 아니라, 포장상태, 포장용기 등에 따라서도 면밀히 검토될 필요가 있다. 예를 들어, 난용성 약물의 경우 캡슐제를 이용하여 복용될 수 있으나, 그 제조방법이나 비율 등에 따라 복용이 어렵다는 문제가 있어 제제로서의 다양한 연구가 요구된다. 또한, 항체가 안정성이 낮은 경우 변성, 산화, 응집, 분해 등에 따라 효능을 잃어버리고, 경우에 따라서는 독성과 같은 위험을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 안정적이면서 유효하고 사용이 용이한 의약 제제의 제조를 위해 다양한 노력이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 재조합 갈렉틴 9 단백질의 안정화를 위해 제제에 관하여 많은 연구를 거친 결과, 안정성이 높은 제제를 밝혀냄에 따라 본 발명을 완성하였다.
선행문헌
(특허문헌 0001) 대한민국공개특허 제10-2022-0068158호
본 발명은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 안정하게 보존할 수 있는 약학 제제를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질; (2) 완충제; 및 (3) 안정화제;를 포함하는 약학 제제를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 1 내지 20mg/ml이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 시트레이트(citrate), 포스페이트(phosphate), 히스티딘(histidine), 글리신(glycine), 아세테이트(acetate), 타르트레이트(tartrate), 아스파테이트(aspartate), 락테이트(lactate), 글루코네이트(gluconate), 글루타메이트(glutamate), 석시네이트(succinate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 pH가 4.5 내지 7이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 농도가 5 내지 20mM이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 (i) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 및 (ii) 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;으로 이루어진다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 자일로스, 리보스, 글루코스, 라피노스, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 셀로비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민 및 과당으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 트레할로스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 하나 이상의 탄수화물 또는 당을 포함하고, 각각 1 내지 5w/v%이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 1 내지 20mg/ml이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 폴리소르베이트를 더 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 0.001 내지 0.05w/v%의 폴리소르베이트 80을 더 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제는 액상 또는 동결건조 제형이다.
또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 약학 제제를 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 약학 제제를 포함하는 암 예방 또는 자가면역질환 치료용 약학 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학제제의 골질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학 제제의 암 또는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학제제의 골질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학제제의 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학제제의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학제제의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 자가면역질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 갈렉틴 9 재조합 단백질을 포함하는 약학 제제에 관한 것으로, 완충제 등을 사용함에 따라 안정성이 높은 제제를 제공가능하다는 점에 이점이 있다.
도 1은 히스티딘 완충액 및 PBS 완충액의 비교실험결과를 나타낸 도이다.
도 2는 아세테이트 완충액 및 PBS 완충액의 비교실험결과를 나타낸 도이다.
도 3은 히스티딘 아세테이트 완충액 및 소디움 아세테이트 완충액의 비교실험결과를 나타낸 도이다.
도 4a 내지 4c는 히스티딘 아세테이트 완충액의 pH에 따른 역가시험결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예(실험예 3-3)에 따른 성상을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예(실험예 3-6)에 따른 성상을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예(실험예 3-6)에 따른 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8a 내지 8d는 본 발명의 일 실시예(실험예 3-6)에 따른 SEC HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9a 내지 9d는 본 발명의 일 실시예(실험예 3-6)에 따른 IEX HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10a 내지 10b는 본 발명의 일 실시예(실험예 3-6)에 따른 Potency 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 (1) 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질; (2) 완충제; 및 (3) 안정화제;를 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 야생형 갈렉틴 9(wild type Galectin-9)의 당쇄 인식 활성을 유지하면서도 프로테아제에 대하여 보다 안정적인 분자 구조를 갖는다.
구체적으로, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 NCRD-링커-CCRD의 구조를 가지는 야생형 갈렉틴 9의 2개의 CRD(Carbohydrate Recognition Domain)를 잇는 링크 영역 및 CCRD(C-terminal Carbohydrate Recognition Domain; C 말단 도메인)를 개변하여 제조한 재조합 단백질이다. 보다 구체적으로 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 상기 링커 영역의 펩티드가 전부 결실되고, CCRD(서열번호 2)에서 1 내지 10 위치의 아미노산 서열(서열번호 3)이 결실 및 13 위치의 Ala(Alarine; A)가 Pro(Proline; P)로 치환된 것으로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩티드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 단백질은 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)"는 뉴클레오티드가 결합된 중합체로서, 유전 정보를 전달하는 역할을 한다. 본 발명의 목적상, 서열번호 1의 재조합 단백질을 코딩하며, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상동성"은 야생형 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “약학 제제”는 조성물을 포함하는 원액을 충진, 동결건조, 및/또는 용해 후 제조된 완제를 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제에서 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 0.01 내지 400mg/ml가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 0.01 내지 250mg/ml, 더 구체적으로, 0.01 내지 150mg/ml, 0.01 내지 120mg/ml, 0.01 내지 100mg/ml, 0.1 내지 80mg/ml, 0.1 내지 60mg/ml, 또는 0.1 내지 40mg/ml을 포함할 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 0.1 내지 20mg/ml, 0.1 내지 18mg/ml, 0.1 내지 16mg/ml, 0.1 내지 15mg/ml, 1 내지 15mg/ml, 2 내지 15mg/ml, 3 내지 15mg/ml, 4 내지 15mg/ml, 또는 5 내지 15mg/ml을 포함한다. 더 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 5.5 내지 15mg/ml, 6 내지 15mg/ml, 6.5 내지 15mg/ml, 7 내지 15mg/ml, 7.5 내지 15mg/ml, 7.5 내지 14.5mg/ml, 7.5 내지 14mg/ml, 7.5 내지 13.5mg/ml, 7.5 내지 13mg/ml, 또는 7.5 내지 12.5mg/ml이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 시트레이트(citrate), 포스페이트(phosphate), 히스티딘(histidine), 글리신(glycine), 아세테이트(acetate), 타르트레이트(tartrate), 아스파테이트(aspartate), 락테이트(lactate), 글루코네이트(gluconate), 글루타메이트(glutamate), 석시네이트(succinate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 포스페이트(phosphate), 히스티딘(histidine), 아세테이트(acetate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 보다 더 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 히스티딘 아세테이트 (Histidine acetate)이다. 본 발명에서 히스티딘을 포함하는 것이 안정성 및 pH 조절 측면에서 유리한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 소디움 염을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 pH가 4 내지 7이다. 구체적으로, 상기 완충제의 pH는 4.5 내지 7, 더 구체적으로, 4.6 내지 7, 4.7 내지 7, 4.8 내지 7, 4.9 내지 7, 또는 5 내지 7일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제의 pH는 5.1 내지 7, 5.2 내지 7, 5.3 내지 7, 5.4 내지 7, 5.5 내지 7, 5.5 내지 6.9, 5.5 내지 6.8, 5.5 내지 6.7, 5.5 내지 6.6, 또는 5.5 내지 6.5이다. 더 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제의 pH는 5.6 내지 6.5, 5.65 내지 6.5, 5.6 내지 6.5, 5.65 내지 6.5, 5.7 내지 6.5, 5.75 내지 6.5, 5.75 내지 6.4, 5.75 내지 6.35이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제에서 상기 완충제는 0.01 내지 50mM이 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 완충제는 농도가 0.01 내지 45mM, 더 구체적으로, 0.01 내지 40mM, 0.01 내지 35mM, 0.01 내지 30mM, 또는 0.01 내지 25mM이다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 농도가 0.1 내지 25mM, 0.1 내지 24mM, 0.1 내지 23mM, 0.1 내지 23mM, 0.1 내지 22mM, 0.1 내지 21mM, 1 내지 21mM, 2 내지 21mM, 3 내지 21mM, 또는 4 내지 21mM이다. 더 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 완충제는 농도가 4 내지 20.5mM, 4 내지 20mM, 4.5 내지 20mM, 또는 5 내지 20mM이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 (i) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 및 (ii) 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;으로 이루어진다.
본 발명에서, 탄수화물 또는 당은 당, 당 알코올, 당산, 당 유도체를 모두 포함할 수 있고, 예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 글리세롤, 이레스리톨, 아라비톨, 자일리톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 이디톨, 말티톨, 락티톨, 말토트리이톨, 말토테트라이톨 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 포함할 수 있고, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 자일로스, 리보스, 글루코스, 라피노스, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 셀로비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민 및 과당으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 만니톨 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 하나 이상의 탄수화물 또는 당을 포함하고, 각각 0.01 내지 10w/v%이다. 구체적으로, 상기 안정화제에 포함되는 하나 이상의 탄수화물 또는 당은 0.01 내지 9.5w/v%, 0.01 내지 9w/v%, 0.01 내지 8.5w/v%, 0.01 내지 8w/v%, 0.01 내지 7.5w/v%, 0.5 내지 7.5w/v%, 또는 1 내지 7.5w/v%일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제에 포함되는 하나 이상의 탄수화물 또는 당은 1 내지 6w/v%, 1 내지 5.9w/v%, 1 내지 5.8w/v%, 1 내지 5.7w/v%, 1 내지 5.6w/v%, 1 내지 5.5w/v%, 1 내지 5.4w/v%, 1 내지 5.3w/v%, 1 내지 5.2w/v%, 1 내지 5.1w/v%, 또는 1 내지 5w/v%이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 둘 이상의 탄수화물 또는 당을 포함할 수 있다. 구체적으로, 둘 이상의 탄수화물 또는 당이 포함되고, 하나의 탄수화물 또는 당은 1 내지 3w/v%, 1.1 내지 3w/v%, 1.2 내지 3w/v%, 1.3 내지 3w/v%, 1.4 내지 3w/v%, 1.5 내지 3w/v%, 1.5 내지 2.9w/v%, 1.5 내지 2.8w/v%, 1.5 내지 2.7w/v%, 1.5 내지 2.6w/v%, 또는 1.5 내지 2.5w/v%이다. 또한, 다른 하나의 탄수화물 또는 당은 3 내지 5w/v%, 3.1 내지 5w/v%, 3.2 내지 5w/v%, 3.3 내지 5w/v%, 3.4 내지 5w/v%, 3.5 내지 5w/v%, 3.5 내지 4.9w/v%, 3.5 내지 4.8w/v%, 3.5 내지 4.7w/v%, 3.5 내지 4.6w/v%, 또는 3.5 내지 4.5w/v%이다. 더 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 안정화제는 둘 이상의 탄수화물 또는 당을 포함하고, 하나의 탄수화물 또는 당은 1.5 내지 2.5w/v%, 1.55 내지 2.5w/v%, 1.6 내지 2.5w/v%, 1.65 내지 2.5w/v%, 1.7 내지 2.5w/v%, 1.75 내지 2.5w/v%, 1.75 내지 2.45w/v%, 1.75 내지 2.4w/v%, 1.75 내지 2.35w/v%, 1.75 내지 2.3w/v%, 또는 1.75 내지 2.25w/v%이다. 또한, 다른 하나의 탄수화물 또는 당은 3.5 내지 4.5w/v%, 3.55 내지 4.5w/v%, 3.6 내지 4.5w/v%, 3.65 내지 4.5w/v%, 3.7 내지 4.5w/v%, 3.75 내지 4.5w/v%, 3.75 내지 4.45w/v%, 3.75 내지 4.4w/v%, 3.75 내지 4.35w/v%, 3.75 내지 4.3w/v%, 또는 3.75 내지 4.25w/v%이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 트레할로스 및 만니톨을 포함한다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 탄수화물 또는 당은 트레할로스 및 만니톨을 포함하고, 각각 1 내지 10w/v%이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 만니톨은 1 내지 9w/v%, 1 내지 8w/v%, 1 내지 7w/v%, 1 내지 6w/v%, 1 내지 5w/v%, 1.5 내지 5w/v%, 2 내지 5w/v%, 2.5 내지 5w/v%. 3 내지 5w/v%, 3.1 내지 5w/v%, 3.2 내지 5w/v%, 3.3 내지 5w/v%, 3.4 내지5 w/v%, 3.5 내지 5w/v%, 3.5 내지 4.9w/v%, 3.5 내지 4.8w/v%, 3.5 내지 4.7w/v%, 3.5 내지 4.6w/v%, 또는 3.5 내지 4.5w/v%이다. 더 구체적으로, 상기 만니톨은 3.5 내지 4.5w/v%, 3.55 내지 4.5w/v%, 3.6 내지 4.5w/v%, 3.65 내지 4.5w/v%, 3.7 내지 4.5w/v%, 3.75 내지 4.5w/v%, 3.75 내지 4.45w/v%, 3.75 내지 4.4w/v%, 3.75 내지 4.35w/v%, 3.75 내지 4.3w/v%, 또는 3.75 내지 4.25w/v%이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 트레할로스는 1 내지 3w/v%, 1.1 내지 3w/v%, 1.2 내지 3w/v%, 1.3 내지 3w/v%, 1.4 내지 3w/v%, 1.5 내지 3w/v%, 1.5 내지 2.9w/v%, 1.5 내지 2.8w/v%, 1.5 내지 2.7w/v%, 1.5 내지 2.6w/v%, 또는 1.5 내지 2.5w/v%이다. 더 구체적으로, 상기 트레할로스는 1.5 내지 2.5w/v%, 1.55 내지 2.5w/v%, 1.6 내지 2.5w/v%, 1.65 내지 2.5w/v%, 1.7 내지 2.5w/v%, 1.75 내지 2.5w/v%, 1.75 내지 2.45w/v%, 1.75 내지 2.4w/v%, 1.75 내지 2.35w/v%, 1.75 내지 2.3w/v%, 또는 1.75 내지 2.25w/v%이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산은 글리신이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 0.01 내지 20mg/ml이다. 구체적으로, 상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 0.01 내지 19mg/ml, 0.01 내지 18mg/ml, 0.01 내지 17mg/ml, 0.01 내지 16mg/ml, 0.01 내지 15mg/ml, 0.01 내지 14mg/ml, 0.01 내지 13mg/ml, 0.01 내지 12mg/ml, 0.01 내지 11mg/ml, 0.01 내지 10mg/ml, 0.1 내지 10mg/ml, 0.2 내지 10mg/ml, 0.3 내지 10mg/ml, 0.4 내지 10mg/ml, 0.5 내지 10mg/ml, 0.6 내지 10mg/ml, 0.7 내지 10mg/ml, 0.8 내지 10mg/ml, 0.9 내지 10mg/ml, 또는 1 내지 10mg/ml이다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 1 내지 10mg/ml, 1.5 내지 10mg/ml, 2 내지 10mg/ml, 2.5 내지 10mg/ml, 2.5 내지 9.5mg/ml, 2.5 내지 9mg/ml, 2.5 내지 8.5mg/ml, 2.5 내지 8mg/ml, 또는 2.5 내지 7.5mg/ml이다. 보다 더 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 2.6 내지 7.5mg/ml, 2.7 내지 7.5mg/ml, 2.8 내지 7.5mg/ml, 2.9 내지 7.5mg/ml, 3 내지 7.5mg/ml, 3 내지 7mg/ml, 3 내지 6.5mg/ml, 3 내지 6.4mg/ml, 3 내지 6.3mg/ml, 3 내지 6.2mg/ml, 3 내지 6.1mg/ml, 또는 3 내지 6mg/ml이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 비이온성 계면활성제를 더 포함한다. 비이온성 계면활성제는 예를 들면, 플루로닉, 폴리소르베이트, 폴록사머 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 폴리소르베이트를 더 포함한다. 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이의 조합이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 안정화제는 0.001 내지 0.05w/v%의 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이의 조합을 더 포함한다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80은 0.001 내지 0.02w/v%, 0.002 내지 0.02w/v%, 0.003 내지 0.02w/v%, 0.004 내지 0.02w/v%, 0.005 내지 0.02w/v%, 0.005 내지 0.019w/v%, 0.005 내지 0.018w/v%, 0.005 내지 0.017w/v%, 0.005 내지 0.016w/v%, 또는 0.005 내지 0.015w/v%이다. 더 구체적으로, 상기 폴리소르베이트 20 또는 80은 0.006 내지 0.015w/v%, 0.0065 내지 0.015w/v%, 0.007 내지 0.015w/v%, 0.0075 내지 0.015w/v%, 0.0075 내지 0.014w/v%, 0.006 내지 0.013w/v% 또는 0.006 내지 0.0125w/v%이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제는 60 내지 130% 기준 역가를 가지는 것이다. 구체적으로, 상기 약학 제제는 70 내지 120% 기준 역가를 가지는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제는 순도(SEL-HPLC)가 90% 이상이다. 구체적으로, 순도가 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 더 구체적으로 순도가 95% 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제는 액상 또는 동결건조 제형이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 약학 제제는 동결건조 제형이다. 본 발명 약학 제제는 액상에 비해 동결건조 제형에서 안정성이 높게 나타난다.
본 발명 약학 제제는 구체적인 제품의 형태에 따라 형태는 달라질 수 있고, 충진된 형태로, 튜브, 카트리지, 주사기, 폴리머 바이알, 유리 바이알 등에 충진된 형태로 존재할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의한 방법에 의해 충진 등을 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 상기 약학 제제가 충진된 바이알(vial)에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 상기 약학 제제가 충진된 시린지(syringe)에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 상기 약학 제제가 충진된 완제 1 중량부를 기준으로 1/2 중량부로 단백질 및 부형제를 포함하는 원액을 제조하고, 제조된 원액을 2배 용량으로 바이알에 충진하여 상기 약학 제제가 충진된 완제 바이알을 제조하는 것일 수 있다. 구체적으로, 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 0.5 내지 10mg/ml, 만니톨 0.5 내지 5w/v%, 트레할로스 0.5 내지 5w/v%, 아미노산 0.5 내지 10mg/ml, 폴리소르베이트 0.0005 내지 0.025w/v%를 포함하는 원액 1mL를 바이알 당 2mL 충진 후 동결건조하여, 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 1 내지 20mg/ml, 만니톨 1 내지 10w/v%, 트레할로스 1 내지 10w/v%, 아미노산 1 내지 20mg/ml, 폴리소르베이트 0.001 내지 0.05w/v%를 포함하는 완제를 제조하는 것일 수 있고, 더 구체적으로, 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 5 내지 6mg/ml, 만니톨 2w/v%, 트레할로스 1w/v%, 아미노산 2.5mg/ml, 폴리소르베이트 0.005w/v%를 포함하는 원액 1mL를 바이알 당 2mL 충진 후 동결건조하여, 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 10 내지 12mg/ml, 만니톨 4w/v%, 트레할로스 2w/v%, 아미노산 5mg/ml, 폴리소르베이트 0.01w/v%를 포함하는 완제를 제조하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 약학 제제를 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 제제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골결손, 골연화증, 골감소증, 골형성 부전증, 골형성 장애, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 퇴행성 골질환, 골 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 골괴사, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파제트병 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 약학 제제를 포함하는 암 예방 또는 자가면역질환 치료용 약학 제제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐암, 갑상선암, 위암, 유방암, 뇌암, 골육종, 교아종, 흑색종, 신경교종, 교모세포종, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 담낭암, 담도암, 식도암, 결장암, 직장암, 대장암, 췌장암, 혈액암, 백혈병, 골수성 백혈병, 림프종, 두경부암, 피부암 및 간암으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 자가면역질환은 전신홍반루푸스(SLE), 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 유년성 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 원판상 홍반성 낭창, 광과민성 피부질환, 자가면역관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 및 원판상 LE로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 자가면역질환의 예는, 비제한적 예로서, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 알레르기 천식, 알레르기 비염, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항체매개 이식 거부반응, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질항체 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성빈혈, 자가면역 자율신경이상증, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍증, 자가면역 내이질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 당뇨망막병증, 자가면역 혈소판감소성자반병(ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 액손 및 뉴런 신경장애, 발로병(Balo disease), 베체트병, 유천포창, 심근증, 캐슬맨병, 소아 지방변증, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창, 크론병, 코간 증후군, 한랭응집소병, 선천성 심장 차단, 콕사키(coxsackie) 심근염, 크레스트(CREST) 질환, 본태성혼합한냉글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 탈수초성 신경장애(demyelinating neuropathies), 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시속신경수염), 원판상 루프스, 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 자궁내막증, 호산성 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두동맥염), 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 다발성맥관염 육아종증(GPA: granulomatosis with polyangiitis), 그레이브스병, 귈랑-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모노 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반병, 임신포진, 저감마글로부민혈증, 고감마글로불린혈증, 특발성 혈소판감소성자반병(ITP), IgA 신장병, IgG4 관련 경화성 질환, 면역조절 지질단백질, 포함체 근육염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존형 당뇨병(제1형), 간질성 방광염, 소아 관절염, 소아 당뇨병, 가와사키 증후군, 이튼 람베르트 증후군, 백혈구파쇄성맥관염, 편평태선, 경화성태선, 목질결막염, 선상 IgA 질환(LAD), 루프스(SLE), 라임병, 메니에르병, 현미경 다발성맥관염, 혼합 결합 조직병(MCTD), 의미불명 단클론성 감마병증(MGUS), 잠식성각막궤양, 뮈샤 하버만 병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시속신경수염(데빅병), 호중구감소증, 안구반흔성 유천포창, 시신경염, 재발성 류마티즘, PANDAS(연쇄구균 감염 관련 소아기 자가면역성 신경정신과적 질환), 방종양성 소뇌 변성, 발작성 야간혈색소 요증(PNH), 안면편측 위축증, 파소네지(Parsonnage)-터너 증후군, 중간부 포도막염(pars planitis)(주변부 포도막염), 천포창, 말초신경병증, 정맥주위 뇌척수염(perivenous encephalomyelitis), 악성빈혈, POEMS 증후군, 결절성다발성동맥염, 제I형, 제II형, 및 제III형 자가면역 다산성(polyglandular) 증후군, 다발성근육통 류마티즘, 다발성근염, 심근경색후증후군, 심막절개술후증후군, 프로게스테론 피부염, 원발담즙성간경변, 일차성 경화성 담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐섬유증, 괴저성 농피증, 순수적혈구 무형성증, 레이노 현상, 반사성교감신경성이영양증, 라이터 증후군, 재발성 다발 연골염, 하지불안증후군, 후복막섬유증, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 시미트 증후군, 공막염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 전신근강직 증후군(stiff person syndrome), 아급성세균성심내막염(SBE), 수작 증후군(Susac's syndrome), 교감성 안염, 타까야수동맥염, 측두동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성자반병(TTP), 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 횡단척수염, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직질환(UCTD), 포도막염, 맥관염, 수포성 피부염(vesiculobullous dermatosis), 백반, 발덴슈트롬 마크로글로불린혈증(WM), 및 베게너 육아종증(다발성맥관염 육아종증(GPA))을 포함한다.
또한, 본 발명은 약학제제의 골질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학 제제의 암 또는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학제제의 골질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학제제의 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학제제의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약학제제의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 자가면역질환의 치료 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질(sGal-9)의 제조
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 상기 발현 벡터를 heat shock 방법에 의거하여 대장균(E. coli)에 도입하였다. 재조합 단백질의 발현은, 대장균을 50㎍/㎖ kanamycin 함유 LB 배지로 배양하고, 600nm에서의 흡광도가 0.7에 달한 시점에서 아라비노즈를 첨가하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하여 행했다. 그 다음, 재조합 단백질의 발현을 유도한 세포를 용해 및 여과하고, 표적 단백질을 양이온 교환방법 및 affinity 칼럼 등을 사용해 포획하여, 순도가 높은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 높은 수율로 수득하였다.
<제조예 2> 안정화된 제제의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 재조합 안정화 갈렉틱 9 단백질(이하, 재조합 갈렉틴-9)을 사용하여 제제를 제조하였다. 각 제제의 조성은 하기 실험예에 나타난 바와 같다. 일 예에서, 정제액을 5mM 히스티틴 아세테이트(HisAce) pH6.0를 이용하여 11~15mg/mL로 한외여과(UF)/희석여과(DF) 후, 만니톨(Mannitol) 2 w/v%, 트레할로스(Trehalose) 1 w/v%, 글리신 2.5mg/mL를 희석하여 5~7mg/mL의 단백농도로 제조한 후, 0.2㎛ 필터로 필터링하여 최종적으로 2.0mL/vial로 충진 후 동결건조하였다.
<실험예 1> 완충액(buffer) 평가 방법
<실험예 1-1> 외관(Appearance)
모든 샘플의 외관은 SOP 방법(PD-DPD-LAB-001-07)에 따라, 투명도, 색상 및 가시 입자를 포함한 외관을 YB-2 라이트 박스를 사용하여 흑백 배경에서 조사하였다.
<실험예 1-2> pH
pH는 유리 전극을 포함하는 pH 미터를 사용하여 측정하였다. pH는 두 번 이상 측정하여 평균값을 기재하였다.
<실험예 1-3> 단백질 농도(Protein concentration)
단백질 농도는 Thermo UV 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 측정은 SOP 방법(PD-DPD-EQU-088-01)에 따라 측정하였으며, 모든 평가 시 흡광 계수는 1.0 AU × mL × mg-1 × cm-1, 샘플은 2.5μL로 두 번 이상 측정하여 평균값을 기재하였다.
<실험예 1-4> 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)
SEC-HPLC는 하기 절차에 의해 진행하였다.
샘플 농도가 1.0mg/mL 이상인 경우, SEC 분석 전 이동상으로 샘플을 1.0mg/mL로 희석하고, 50μg 샘플을 HPLC에 주입하여 분석을 진행하였다. SEC-HPLC는 Agilent TSKgel 2000SWxl(7.8mm × 300mm, 5μm) 및 UV 검출기(검출파장: 280nm)를 포함하는 Hitachi Chromaster CM5000을 사용하였다. 컬럼 온도 25℃, 로딩 부피 50μL, 이동상(300mM 염화나트륨, 10% 이소프로필알코올, 및 50mM 인산 완충액(pH6.8±0.1)), 용매 흐름(0.4mL/min)의 조건으로 분석하였다.
<실험예 1-5> 단백질 전기영동(SDS-PAGE)
SDS-PAGE는 Heat block(DAIHAN MaXtable™10H), Electrophoresis system(Bio-Rad BR 165-8033FC) 및 Rocker(Daihan RK-1D)를 사용하여 분석하였다. 검액을 4x 샘플 버퍼에 3:1로 희석하여 98℃에서 5분간 가열하였다. 12% 아크릴아마이드 겔에 단백질 표준물질(Protein Standard)과 샘플을 홈에 각각 넣은 후 100V에서 90분간 전기영동 하였다. 단백질이 분리된 겔을 CBB R-250 용액으로 30분간 라커(Rocker)에서 염색하였다. 탈색 용액(Destainning solution)으로 30분간 라커에서 탈색하고, 배경 탈색이 완료되면 31kD 부근 진한 밴드를 확인하여 분석하였다.
<실험예 1-6> 역가 시험(Potency)
세포주 준비
Molt 4 T-cell 바이알 1mL를 37℃에서 1~2분간 녹였다. 배양 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 in RPMI1640) 10mL에 세포를 넣고, 1,300rpm, 상온(24℃)에서 3분동안 원심분리하였다. 배양 배지를 제거하고, 2~4×105세포/mL가 되도록 새 배양배지를 넣어 세포를 풀고, 25cm2 배양 플라스크에 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이후, 세포가 1×106세포/mL가 되면, 배양 배지를 바꾸어 2~4×105세포/mL를 유지하였다. 그 후, 세포 배가 시간(doubling time), 밀도를 확인하고 유지시켰다.
역가 시험
2주 동안 세포의 배가 시간이 24시간이고, 밀도가 95%인 Molt 4 T-cell을 사용하여 역가 시험을 진행하였다. 세포의 밀도가 5.6×104 세포/mL가 되도록 새 배양 배지를 사용하여 희석하였다. 96 플레이트 웰에 90μL씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 검액을 PBS(-)에 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0μg/mL로 희석하여 배지 내 최종 농도가 30, 10, 3, 0.3, 0.1, 0μg/mL가 되도록 희석한 샘플 10μL를 각 웰에 넣었다. 이 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 그 후, 검출 용액(WST-1)을 10μL씩 각 웰에 넣은 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간동안 반응시키고, 마이크로 플레이트 리더(micro plate reader)를 사용하여 450nm의 OD값을 측정하였다. 4 파라미터 로지스틱 핏(4 parameter logistic fit)에서 OD값 변화와 LD50을 계산하였다.
<실험예 1-7> 삼투질 농도(Osmolality)
삼투질 농도는 삼투압계를 사용하여 측정하였다. 테스트 전후의 삼투압계 정확도는 Clinitrol 290mOsm/kg 기준 용액으로 확인하였고, 각 샘플 20μL를 사용하여 분석하였다.
<실험예 2> 액상 제형
<실험예 2-1> 완충액 비교분석 (1)
스트레스 조건(37℃)에서의 pH/완충액 시스템을 통해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 각 실험에서 sGal-9 농도는 2mg/mL를 사용하였다. 실험예 1에 따른 외관분석으로, 실험은 4주에 걸쳐 진행되었다. 완충액의 조건은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
완충액(Buffer) 계면활성제
(surfactant)
F01 20 mM 히스티딘(His) pH 6.0 0.02% PS80
(Polysorbate 80)
F02 20 mM PBS(Phosphate buffer) pH 7.4
F03 20 mM 아세테이트(acetate) pH 5.0
실험결과는 도 1, 도 2 및 표 2에 나타난 바와 같다.
도 1은 히스티딘 완충액과 PBS 완충액을 비교한 결과이며, 도 1에 나타난 바와 같이 PBS 버퍼는 침전이 나타나는 것을 확인하여, 히스티딘 완충액의 단백질이 PBS 완충액을 사용한 경우에 비해 안정한 것을 확인하였다.
표 2 및 도 2는 아세테이트 완충액과 PBS 완충액을 비교한 결과이며, 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, PBS 필터링 후 3일 뒤 25℃에서 측정한 입자 개수(particle number)에서 차이를 나타내어 아세테이트 완충액이 PBS 완충액에 비해 우수한 것을 확인하였다. (#1 : 20mM PBS, 50mM NaCl, pH7.3, 0.26mg/ml / #2 : in acetate buffer pH5.0, 0.62mg/ml / #3 : in acetate buffer pH5.3, 0.62mg/ml / #4 : #2 after filtration / #5 : #3 after filtration)
외관(Appearance)
구분 T0 25 ℃ / 3일 후
#1 SO, P+ SO, P+
#2 CL, P CL, P
#3 CL, P CL, P
#4 CL, PF CL, P(2)
#5 CL, PF CL, P(>10)
(* CL(=clear liquid) / P(=particle) / P(n)(=particle number) / PF(= particle free))
<실험예 2-2> 완충액 비교분석 (2) (소디움 염)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 실험예 1에 따른 외관, UV, pH, SEC-HPLC, SDS-PAGE 및 역가 시험으로, 실험은 2주에 걸쳐 진행되었다. 완충액 조건은 하기 표 3에 나타난 바와 같다.
완충액(Buffer) 계면활성제
(surfactant)
F01 20 mM 히스티딘 아세테이트
(His Ace)		 pH 6.0 0.04% PS80
(Polysorbate 80)
F02 20 mM 소디움 아세테이트
(Na Ace)		 pH 7.4
T0에서 외관, UV, pH, SEC-HPLC, SDS-PAGE 및 역가 시험을 수행하였고, 1주 후 외관, UV, pH- SEC-HPLC, SDS-PAGE 시험을 수행하였으며, 2주 후 외관, UV, pH, SEC-HPLC, SDS-PAGE, 및 역가 시험을 수행하였다.
- 외관 실험결과는 하기 표 4 및 도 3에 나타난 바와 같다.
구분 외관(Appearance)
T0 40 ℃ 25 ℃
1w 2w 1w 2w
F01 C, CL, P O, P++ O, P++ C, SO, P+ C, CL, P++
F02 C, CL, PF SO, PF SO, PF C, CL, PF C, CL, PF
(* C(=colorless) / SY(=slightly yellow)/ Y(=yellow)/ CL(=Clear liquid)/ SO(=slightly opalescent liquid)/ O(=opalescent liquid)/ FP(=free of visible particles) / PO(=particles observed, <5) / PO+(=a few visible particles)/ PO++(=many visible particles))
- SEC-HPLC 실험결과는 표 5 및 표 6에 나타난 바와 같다.
구분 완충액 T0 25 ℃，1 w 40 ℃，1w
Main HMW LMW Main HMW LMW Main HMW LMW
F1 His Ace 6.0 89.5 10.5 ND 78.6 21.4 ND 42.4 44.3 13.3
F2 Na Acetate 5.0 73.0 27.0 ND 51.8 46.5 ND 0 75.2 24.8
구분 완충액 25 ℃，2 w 40 ℃，2w
Main HMW LMW Main HMW LMW
F1 His Ace 6.0 78.4 21.6 ND 0 76.8 23.2
F2 Na Acetate 5.0 43.4 54.7 1.9 0 68.8 31.2
- 역가 시험 결과는 표 7에 나타난 바와 같다.
구분 완충액 농도
(mg/mL)		 T0 40oC，2 w 25oC，2w
Potency(μg/mL) Max
(OD450-OD630)		 Min
(OD450-OD630)		 Potency(μg/mL) Max
(OD450-OD630)		 Min
(OD450-OD630)		 Potency(μg/mL) Max
(OD450-OD630)		 Min
(OD450-OD630)
F1 His Ace 6.0 4.2 1.76 0.25 0.13 NA 0.27 0.27 2.32 0.26 0.14
F2 Na Acetate 5.0 4.5 2.56 0.25 0.13 NA 0.27 0.27 6.46 0.27 0.14
SG Standard 0.263 3.65 0.24 0.13 5.69 0.27 0.15 4.59 0.27 0.14
표 4 및 도 3에 나타난 바와 같이, 히스티딘 아세테이트는 25℃ 및 40℃에서 유백색 입자가 보이거나, 다수의 입자가 관찰되었으나, 소디움 아세테이트는 외관상 입자가 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 다만, 순도와 역가 측면에서 히스티딘 아세테이트 완충액의 단백질이 소디움 아세테이트 완충액을 사용한 경우에 비해 안정한 것을 확인하였다.
또한, 표 5 내지 7에 나타난 바와 같이, 소디움 염의 형태가 sGal-9 단백질의 안정성에 부정적인 영향을 미치는 것을 확인하여, 소디움 염의 형태는 제제로 부적절한 것을 확인하였다.
<실험예 2-3> 완충액 비교분석 (3) (pH/부형제)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 실험예 1에 따른 외관, UV, pH, 단백질 농도(100μ), SEC-HPLC, 삼투질 농도 및 역가 시험으로, 실험은 4주에 걸쳐 진행되었다. 완충액 조건은 하기 표 8에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 pH 농도 수크로스
(sucrose)		 글리신
(glycine)		 PS
(polysorbate 80)
mg/mL w/v% mg/mL w/v%
F01 20 mM 히스티딘 아세테이트
(His Ace)		 pH 5.0 2 8 2 0.04
F02 20 mM 히스티딘 아세테이트
(His Ace)		 pH 6.0
T0에서 외관, UV, pH, 단백질 농도(100μ), SEC-HPLC 및 삼투질 농도 실험을 수행하였고, 1주 후 40℃에서 UV, pH, 단백질 농도(100μ), SEC-HPLC 및 역가 시험을 수행하였으며, 4주 후 25℃에서 UV, pH, 단백질 농도(100μ), SEC-HPLC 및 역가 시험을 수행하였다.
- 외관, pH, 농도 및 삼투질 농도 실험결과는 하기 표 9 및 표 10에 나타난 바와 같다.
구분 완충액 pH 농도
(mg/ml)		 외관(Appearance) Osmolality
(mOsm/kg)
T0 40 ℃ 25 ℃
1 w 4 w
F1 20 mM
His-Ace		 5.0 2.0 C,CL,PF C,CL,PF C,CL,PF 296
F2 6.0 C,CL,PF C,CL,PF C,CL,PF 297
(* C(=colorless) / CL(=clear liquid) / PF(= particle free))
구분 완충액 pH 농도
(mg/ml)		 pH 농도(Concentration)
T0 40 ℃ 25 ℃ T0 40 ℃ 25 ℃
1 w 4 w 1w 4 w
F1 20 mM
His-Ace		 5.0 2.0 5.0 5.0 5.0 2.0 2.1 2.0
F2 6.0 6.0 6.0 6.0 1.9 1.9 2.0
- SEC-HPLC 실험결과는 표 11에 나타난 바와 같다.
구분 완충액 pH 농도
(mg/ml)		 T0 40 ℃, 1W 25 ℃, 4W
%Monomer
(Main)Peak		 HMW LMW %Monomer
(Main)Peak		 HMW LMW %Monomer
(Main)Peak		 HMW LMW
F1 20 mM
His-Ace		 5.0 2 95.2 4.8 ND 3.2 95.8 1.1 69.2 30.8 ND
F2 6.0 92.7 7.3 ND 89.2 10.8 ND 93.0 7.0 ND
- 역가 시험 결과는 표 12 내지 표 14 및 도 4a 내지 4c에 나타난 바와 같다.
(B201-20210301-T0 = F1 / B201-20210302-T0 = F2)
T0에서 역가 시험 결과
구분 농도
(mg/ml)		 Potency
(μg/mL)		 Max
(OD450-OD630)		 Min
(OD450-OD630)
F1 2.0 4.11 0.37 0.13
F2 2.0 4.12 0.37 0.13
SG Standard 0.263 5.37 0.35 0.15
1주 후 40℃에서 역가 시험 결과
구분 농도
(mg/ml)		 Potency
(μg/mL)		 Max
(OD450-OD630)		 Min
(OD450-OD630)
F1 2.1 NA 0.37 0.39
F2 2.0 6.63 0.37 0.16
SG Standard 0.263 5.44 0.37 0.16
4주 후 25℃에서 역가 시험 결과
구분 농도
(mg/ml)		 Potency
(μg/mL)		 Max
(OD450-OD630)		 Min (OD450-OD630)
F1 2.0 4.88 0.37 0.14
F2 2.0 4.12 0.37 0.14
SG Standard 0.263 4.37 0.36 0.17
상기 실험결과로부터, 히스티딘 완충액(pH6.0)이 히스티딘 완충액(pH5.0)보다 우수하게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 부형제로 8% 수크로스, 0.04 폴리소르베이트 80 및 2mg/ml 글리신을 부형제로 사용하는 경우, sGal-9 단백질이 안정적으로 나타나는 것을 확인하였다.
<실험예 2-4> 완충액 비교분석 (4) (pH)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. pH 범위 및 부형제에 따른 실험을 진행하였으며, 완충액 조건은 하기 표 15에 나타난 바와 같다.
구분 완충액 pH 수크로스
(sucrose)		 글리신
(glycine)		 PS 20
(polysorbate 20)
w/v% mg/ml w/v%
C1 20 mM
His-Ace		 5.0 8 - -
C2 6.0 8 - -
C3 7.0 8 - -
C4 6.0 8 - 0.02
C5 6.0 8 2 0.02
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 16에 나타난 바와 같다.
C1 C2 C3 C4 C5
T0 Purity: SEC-HPLC Area(%) 92.5 92.2 89.6 85.4 85.4
단백질 농도
(A280 / BF)		 2.0 / 2.01 2.1 / 1.78 2.1 / 1.76 2.2 / 2.24 2.2 / 2.3
역가시험
Potency (ug/ml)		 6.39 5.03
T4D Purity: SEC-HPLC Area(%) 35.44 / 97.1 66.83 90.17 90.14
단백질 농도
(A280)		 2.3 / 2.09 2.2 / 1.8 2.9 / 1.96 2.4 / 1.96 2.6 / 1.82
역가시험
Potency
(ug/ml)		 > 31.5 4.56 5.90 3.26 5.51
상기 실험결과로부터, 히스티딘 아세테이트 완충액 pH6.0이 다른 pH인 경우보다 우수하게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20, PS 20) 또는 글리신과 같은 다른 부형제의 효과가 명확하게 나타나지는 않는 것을 확인하였다.
<실험예 2-5> 완충액 비교분석 (5) (농도)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 농도에 따른 실험을 진행하였으며, 완충액 조건은 하기 표 17에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 만니톨
(Mannitol)		 수크로스
(Sucroese)		 PS 20
(polysorbate 20)		 글리신
(Glycine)
(w/v %) (w/v %) (w/v %) (mg/ml)
C1 20mM His-Ace pH6.0 - 8 - 5
C2 - 8 0.02 5
C3 5 - - 5
C4 10mM His-Ace pH6.0 - 8 - 5
C5 - 8 0.02 5
C6 30mM His-Ace pH6.0 - 8 - 5
C7 - 8 0.02 5
C8 5 - - 5
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 18에 나타난 바와 같다.
구분 20mM His-Ace / 5mg/ml Glycine 10mM His-Ace / 5mg/ml Glycine 30mM His-Ace / 5mg/ml Glycine
8% Sucrose 8% Sucrose
0.02% PS20		 5% Mannitol 8% Sucrose 8% Sucrose
0.02% PS20		 8% Sucrose 8% Sucrose
0.02% PS20		 5% Mannitol
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
T0 Purity(%) 96.74 86.79 96.41 96.17 95.55 96.13 96.70 91.73
A280 / BF (mg/ml) 2.52 / 2.45 2.44 / 2.42 1.84 / 1.84 1.80 / 1.85 1.77 / 1.91 2.46 / 2.34 2.45 / 2.35 1.79 / 1.89
Potency (ug/ml) 0.94 0.887 1.765 0.884 0.598 0.703 0.998 0.803
T2W Purity(%) 97.30 96.23 96.37 97.79 96.71 95.60 92.19 94.25
A280 / BF (mg/ml) 2.98 / 2.28 3.30 / 2.16 2.15 / 1.68 2.01 / 1.47 2.21 / 1.53 3.00 / 2.32 3.75 / 1.88 2.47 / 1.35
Potency (ug/ml) 3.00 4.34 3.71 2.74 3.94 2.98 5.88 4.12
T3W Purity(%) 95.80 93.53 95.08 97.91 97.08 94.10 88.69 95.70
A280 / BF (mg/ml) 3.26 / 1.79 3.93 / 1.69 2.57 / 1.18 2.13 / 1.34 2.46 / 1.26 3.42 / 1.65 4.34 / 1.42 3.08 / 0.97
Potency (ug/ml) 3.172 ± 0.471 5.778 ± 0.455 3.328 ±0.189 1.696 ±0.361 1.919 ±0.264 1.921 ±0.310 3.965 ±1.258 0.587 ± 0.249
상기 실험결과로부터, 히스티딘 아세테이트 완충액은 10mM, 20mM, 30mM 순으로 단백질이 안정적인 것으로 나타나, 30mM에 비해 10mM, 및 20mM의 농도에서 안정적인 것을 확인하였다.
<실험예 2-6> 완충액 비교분석 (6)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 완충액 조건은 하기 표 19에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 만니톨
(Mannitol)		 수크로스
(Sucroese)		 PS 20
(polysorbate 20)		 글리신
(Glycine)
(w/v %) (w/v %) (w/v %) (mg/ml)
C1 20mM His-Ace pH6.0 - 8 - 5
C2 - 8 0.02 5
C3 5 - - 5
C4 10mM His-Ace pH6.0 - 8 - 5
C5 - 8 0.02 5
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 20에 나타난 바와 같다.
구분 20mM His-Ace / 5mg/ml Glycine 10mM His-Ace / 5mg/ml Glycine
8% Sucrose 8% Sucrose
0.02% PS20		 5% Mannitol 8% Sucrose 8% Sucrose
0.02% PS20
C1 C2 C3 C4 C5
T0 Purity(%) 98.16 98.06 / 97.17 99.35 97.90
A280 / BF (mg/ml) 2.04 / 1.95 2.05 / 2.24 2.06 / 1.80 1.93 / 1.97 2.07 / 2.34
Potency
(ug/ml)		 7.642 ± 1.873 2.447 ± 0.559 3.113 ± 0.394 2.630 ± 0.473 1.248 ± 0.113
T2W Purity(%) 91.84 85.76 90.24 92.83 80.63
A280 / BF (mg/ml) 2.49 / 2.07 3.53 / 1.67 2.53 / 1.64 2.23 / 1.60 2.82 / 1.61
Potency (ug/ml) 2.454 ± 0.455 5.551 ± 3.583 4.771 ± 1.287 5.084 ± 1.298 5.834 ± 1.624
상기 실험결과로부터, 히스티딘 아세테이트 완충액은 10mM에서 가장 효과적이며, 수크로스를 사용한 경우 더 안정적인 것을 확인하였다.
<실험예 3> 동결건조 제형
상기 실험예 2로부터 얻은 결과를 기초로, 버퍼 및 pH를 10mM 히스티틴아세테이트 pH6.0으로 유지하고, 부형제 및 제형을 비교하였다. 동결건조 제형은 sGal-9 단백질을 부형제별로 제조한 후, 10ml 바이알(vial)에 sGal-9이 10mg이 되도록 충진한 후 동결건조하여 제조하였다. 분석은 각 time point에서 동결건조된 시료를 1.0ml 탈이온수에 용해시킨 후 분석하였다.
<실험예 3-1> 부형제 비교분석 (1)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 부형제 조건은 하기 표 21에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 pH 수크로스
(Sucroese)		 PS 80
(polysorbate 80)		 글리신
(Glycine)
(w/v %) (w/v %) (mg/ml)
C1 10 mM
His-Ace		 6.0 8 - 5
C2 6.0 8 0.01 5
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 22에 나타난 바와 같다.
구분 10mM His-Ace pH6.0 / 8% 수크로스,
5mg/ml 글리신 		10mM His-Ace pH6.0 / 8% 수크로스,
5mg/ml 글리신 / 0.01% PS80
25℃ 37℃ 25℃ 37℃
FD 전 Purity(%) 97.94 98.23
A280
(mg/ml)		 2.26 (11.3mg) 2.30 (11.5mg)
Potency
(ug/ml)		 1.18±0.07 1.71±0.16
T0
(FD 후)		 Purity
(%)		 97.07 96.29
A280
(mg/ml)		 8.52 9.42
Potency
(ug/ml)		 0.78±0.16 1.76±0.15
T2W (37℃)

T3W (25℃)		 T3W(25℃) T2W(37℃) T3W(25℃) T2W(37℃)
Purity
(%)		 95.71 92.87 96.00 71.98
A280
(mg/ml)		 8.26 8.90 9.05 9.46
Potency
(ug/ml)		 1.358±0.136 1.062±0.028
(비고 - 1.124, 1.346±0.217)
상기 실험결과로부터, 2주차(T2W) 분석 시 가혹조건(37℃)에서 순도가 감소하는 것을 확인하였다. 또한, PS80(0.01%)을 포함하는 경우 안정성이 감소하는 것을 확인하였다.
<실험예 3-2> 부형제 비교분석 (2)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 부형제 조건은 하기 표 23에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 수크로스
(Sucroese)		 만니톨
(Mannitol)		 트레할로스
(Trehalose)		 글리신
(Glycine)		 PS 80
(w/v %) (w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %)
C1 10 mM
His-Ace
(pH 6.0)		 8 - - 5 0.01
C2 - 5 - 5 0.01
C3 - 4 2 5 0.01
C4 2 4 - 5 0.01
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 24 및 표 25에 나타난 바와 같다.
구분 C1 C2 C3 C4 STD
FD 전 Purity
(%)		 96.81 99.47 96.43 96.82 97.19
A280
(mg/ml)		 3.23 3.21 3.21 3.26 1.85
T0 Purity
(%)		 97.82 97.63 97.82 97.71 96.53
A280
(mg/ml)		 9.55 9.72 9.82 9.69
T0
(5℃, 1d)		 Purity
(%)		 97.52 97.4 97.54 97.56 97.69
A280
(mg/ml)		 9.41 9.54 9.83 9.82
C1 C2 C3 C4 STD
상온 37℃ 상온 37℃ 상온 37℃ 상온 37℃
FD 전 Purity
(%)		 96.81 99.47 96.43 96.82 97.19
A280
(mg/ml)		 3.23 3.21 3.21 3.26 1.85
T0
 Purity
(Area%)		 97.82 97.63 97.82 97.71 96.53
A280
(mg/ml)		 9.55 9.72 9.82 9.69
T1W
(37℃)		 Purity
(%)		 96.9 97.65 97.57 97.67 96.78
A280
(mg/ml)		 9.54 9.75 9.70 9.66
T2W (25℃) Purity
(%)		 98.09 97.94 98.03 97.71 97.06
A280
(mg/ml)		 9.74 9.65 9.91 9.90
상기 실험결과로부터, 24시간 동안 각 실험 데이터(SEC-HPLC, UV, PAGE)의 변화가 없는 것을 확인하였다. 또한, 만니톨(Mannitol) 함유시 안정적인 것을 확인하였다.
<실험예 3-3> 부형제 비교분석 (3)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 부형제 조건은 하기 표 26에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 만니톨
(Mannitol)		 트레할로스
(Trehalose)		 글리신
(Glycine)		 PS80
(w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %)
C1 10mM HisAce
pH6.0		 5 - 5 -
C2 4 2 5 0.01
C3 4 2 5 -
C4 5 5 - -
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 27 및 표 28에 나타난 바와 같다.
구분 C1 C2 C3 C4 STD
FD 전 Purity
(%)		 97.48 95.95 98.20 98.21 97.36
A280
(mg/ml)		 3.23 3.21 3.21 3.26
Potency
(ug/ml)		 1.91±0.18 2.05±0.04 2.16±0.143 1.860±0.29 1.59±0.45
T0 Purity
(%)		 97.10 96.66 96.49 96.82
A280
(mg/ml)		 10.09 9.85 9.88 9.27
Potency
(ug/ml)		 2.274±0.300 2.812±0.421 2.446±0.216 3.366±0.448 3.059±0.46
C1 C2 C3 C4 STD
T4W
상온(25℃)		 Purity
(%)		 96.20 95.97 95.63 96.05
A280
(mg/ml)		 1.542 1.445 1.367 1.389
Potency
(ug/ml)		 3.286±0.324 2.450±0.181 2.447±0.714 3.241±0.234 3.059±0.46
T4W
(37℃)		 Purity
(%)		 94.14 96.24 95.63 96.63
A280
(mg/ml)		 1.533 1.427 1.380 1.308
Potency
(ug/ml)		 3.792±0.29
(63%/std.)		 3.063±0.07
(77%/std.)		 3.451±0.33
(69%/std.)		 2.42±0.26
(98%/std.)		 2.37±0.29
상기 실험결과로부터, 트레할로스(Trehalose) 함유 시, 안정적인 것을 확인하였다.
<실험예 3-4> 부형제 비교분석 (4)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 부형제 조건은 하기 표 29에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 만니톨
(Mannitol)		 트레할로스
(Trehalose)		 글리신
(Glycine)		 PS80 디티오트레이톨
(DTT)
(w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %) (mM)
C1 10mM HisAce
pH6.0		 4 2 5 -
C2 4 2 5 0.01
C3 4 2 5 0.01 1.0
C4 4 2 5 - 1.0
C5 2 4 5 - -
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 30 내지 표 32에 나타난 바와 같다.
C1 C2 C3 C4 C5 STD
FD전 Purity
(%)		 97.59 96.92 96.44 96.94 97.40 95.91
A280
(mg/ml)		 1.518 1.718 1.725 1.53 1.587
Potency
(ug/ml)		 1.689±0.87 2.476±1.133 2.773±0.146 1.515±5.469 2.134±0.15 3.963
FD후
(T0)
 Purity
(%)		 97.08 97.14 96.28 96.37 96.72 96.46
A280
(mg/ml)		 1.296 1.442 1.418 1.353 1.347
Potency
(ug/ml)		 2.862±0.09 2.967±0.19 2.624±0.11 1.921±0.04 3.244±0.19 2.172±0.06
3.077±0.22
C1 C2 C3 C4 C5 STD
상온 (25℃) Purity
(%)		 96.46 96.78 96.31 96.42 96.49 95.63
A280
(mg/ml)		 1.37 1.48 1.49 1.38 1.38
Potency
(ug/ml)		 2.06±0.27 2.60±0.47 2.75±1.39 2.23±0.58 1.74±0.36 2.47
37℃ Purity
(%)		 96.43 96.64 96.14 95.74 96.28
A280 (mg/ml) 1.37 1.47 1.47 1.34 1.30
Potency (ug/ml) 5.84±0.71 6.85±0.90 6.02±1.18 5.01±1.39 2.17±0.58 5.60
C1 C2 C3 C4 C5 STD
저온 (5℃) Purity (%) 96.75 96.8 96.02 96.37 96.75
A280 (mg/ml) 9.279 10.111 10.122 9.415 9.372 1.8
Potency (ug/ml) 5.261±2.2 3.358±3.19 1.762±0.37 2.227±0.86 2.789±1.2 1.621±1.16
상온 (25℃) Purity (%) 96.44 96.75 96.16 96.44 96.68
A280 (mg/ml) 9.284 9.362 10.227 10.241 9.423 1.8
Potency (ug/ml) 2.911±0.04 2.732±0.17 2.897±0.27 3.746±1.3 2.789±1.2 2.106±0.35
37℃ Purity (%) 95.07 96.27 95.7 95.56 95.91
A280 (mg/ml) 9.29 9.97 10.11 9.34 9.32 1.8
Potency (ug/ml) 4.337±1.33 5.573±1.12 4.258±1.83 2.978±1.77 4.218±1.04 1.484±0.25
상기 실험결과로부터, 부형제 후보 간의 안정성이 크게 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
<실험예 3-5> 부형제 비교분석 (5)
상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. 부형제 조건은 하기 표 33에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 만니톨
(Mannitol)		 트레할로스
(Trehalose)		 글리신
(Glycine)		 PS80
(w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %)
C1 10mM
HisAce
pH6.0		 4 2 5 -
C2 4 2 5 0.01
- SEC-HPLC, 단백질 농도 및 역가시험결과는 하기 표 34 내지 표 37에 나타난 바와 같다.
C1 C2 STD
FD전 Purity
(%)		 96.48 96.60 89.33
A280
(mg/ml)		 11.0 11.4 1.9
Potency (ug/ml) 1.94±0.15 2.287±0.506 1.848±0.255
FD후
(T0)		 Purity
(%)		 95.57 96.16
A280
(mg/ml)		 10.8 10.6
Potency
(ug/ml)		 1.764±0.173 1.142±0.381
C1 C2 STD
(1.0mg/ml)
T1M
(25℃)		 Purity
(%)		 97.4 98.08 97.43
A280
(mg/ml)		 10.79 10.86 1.0
Potency
(ug/ml)		 2.179±0.181 (Std x 127.7%) 3.015±0.041 (std x 92.27%) 2.782±0.412, 1.723±0.117
T1M
(37℃)		 Purity
(%)		 97.88 97.51 97.43
A280
(mg/ml)		 10.88 11.13 1.0
Potency
(ug/ml)		 1.324±0.127 (std x 120.4%) 1.858±0.142 (std. x 96.5%)
C1 C2 STD
(1.8mg/ml)
T2M
(5℃)		 Purity
(%)		 97.32 97.52 98.72
A280
(mg/ml)		 10.82 10.92 1.8
Potency
(ug/ml)		 2.982±1.34 (74.08%) 2.229±0.62 (99.1%) 2.209±0.21
2.762±0.35
T2M
(25℃)		 Purity
(%)		 96.6 96.51 98.72
A280
(mg/ml)		 10.88 10.94
Potency
(ug/ml)		 2.766±0.93 (99.86%) 3.048±0.78 (90.62%)
T2M
(37℃)		 Purity
(%)		 97.07 96.67
A280
(mg/ml)		 10.86 10.83
Potency
(ug/ml)		 3.641±2.66 (75.8%) 3.609±0.37 (76.5%)
C1 C2 STD
(0.9mg/ml)
T3M
(25℃)		 Purity
(%)		 97.89 97.57
A280
(mg/ml)		 10.75 10.59
Potency
(ug/ml)		 1.512±0.41 (stdx157.7%) 1.776±0.15 (stdx134.3%) 2.385±0.26
T3M
(37℃)		 Purity
(%)		 97.57 96.83
A280
(mg/ml)		 10.64 10.48
Potency
(ug/ml)		 2.219±0.08 (stdx107.5%) 1.871±0.44 (stdx127.5%)
상기 실험결과로부터, PS80의 여부에 따른 안정성이 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
<실험예 3-6> 부형제 비교분석 (6)
상기 <제조예 2 및 3>과 동일한 방법에 따라 동결건조 제형을 제조하였다. 부형제 조건은 하기 표 38에 나타난 바와 같다.
구분 완충액
(Buffer)		 만니톨
(Mannitol)		 트레할로스
(Trehalose)		 글리신
(Glycine)		 PS80
(w/v %) (w/v %) (mg/ml) (w/v %)
C1 10mM
HisAce
pH6.0		 4 2 5 0.01
C2 2 2 5 0.01
또한, 상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법에 의해 sGal-9 단백질 안정성을 평가하였다. SEC-HPLC, IEX-HPLC, SDS PAGE, 단백질, 및 Potency 시험으로, 만니톨 2%와 만니톨 4%에서 sGal-9 단백질 안정성을 비교하기 위한 것이다. 시험결과는 하기 표 39 및 표 40에 나타난 바와 같다.
분석 항목 SEC IEX A280
(mg/ml) 		Potency (ug/ml)
Area % Area %
FD전 C1 97.73 96.88 10.78 1.277±0.102(87.16%), 1.075±0.038(96.59%)
C2 97.83 97.04 10.73 1.26±0.051(113.2%), 0.982±0.076(88.23%)
FD후 (10/7) C1 97.47 96.90 10.56 (97.96%) 0.984±0.051(89.05%), 0.992±0.068(89.77%)
C2 96.87 96.88 9.95
(92.73%)		 1.195±0.064(108.1%), 1.165±0.018(104.5%)
Wstd B8 (1mg/ml) 97.73 96.07 1.113±0.034
1.105±0.096
분석 항목 SEC IEX A280
(mg/ml) 		Potency (ug/ml)
Area % Area %
37℃
T1M
(11/7) 		C1 97.10 99.80 10.26 1.547±0.192 (std x 117.1%)
C2 97.23 99.83 9.89 1.365±0.027 (std x 132.7%)
37℃
T2M
(12/7) 		C1 97.21 98.65 10.2
(96.59%)		 1.845±0.013 (std x 72.9%)
C2 97.44 98.87 9.7
(97.49%)		 1.623±0.050 (std x 82.87%)
5℃
T3M
(1/10) 		C1 97.40 99.49 10.33 (97.82%) 1.474±0.03 (std x 100%)
C2 97.28 99.50 9.72 (97.69%) 1.23±0.10 (std x 116.3%)
25℃
T3M
(1/10) 		C1 98.10 99.55 10.41 (92.05%) 1.267±0.27 (std x 112.1%)
C2 98.17 99.50 9.91 (99.60%) 1.42±0.12 (std x 105%)
Wstd B8 (1.8mg/ml) 95.19
97.73		 98.14
96.07		 1.8165 1.811±0.069
1.345±0.048
따라서, 본 발명에 따른 sGal-9 단백질은 타 부형제 또는 타 완충액을 사용하는 경우와 비교하여, 동결건조 제형에서 sGal-9 단백질 10mg 당 히스티딘 아세테이트 완충액 10mM (pH6.0), 만니톨 4w/v%, 트레할로스 2w/v%, 폴리소르베이트80 0.01w/v% 및 글리신 5mg/ml에서 우수한 안정성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명은 갈렉틴 9 재조합 단백질을 포함하는 약학 제제에 관한 것으로, 완충제 등을 사용함에 따라 안정성이 높은 제제를 제공할 수 있다.
서열:
서열식별번호: 1
길이: 284
서열 타입: AA
특징 위치/한정자:
- REGION, 1..284
> note, sGal-9
- source, 1..284
> mol_type, protein
> organism, synthetic construct
잔기:
MAFSGSQAPY LSPAVPFSGT IQGGLQDGLQ ITVNGTVLSS SGTRFAVNFQ TGFSGNDIAF 60
HFNPRFEDGG YVVCNTRQNG SWGPEERKTH MPFQKGMPFD LCFLVQSSDF KVMVNGILFV 120
QYFHRVPFHR VDTISVNGSV QLSYISFQHP PYPMPFITTI LGGLYPSKSI LLSGTVLPSA 180
QRFHINLCSG NHIAFHLNPR FDENAVVRNT QIDNSWGSEE RSLPRKMPFV RGQSFSVWIL 240
CEAHCLKVAV DGQHLFEYYH RLRNLPTINR LEVGGDIQLT HVQT 284
서열식별번호: 2
길이: 146
서열 타입: AA
특징 위치/한정자:
- REGION, 1..146
> note, CCRD
- source, 1..146
> mol_type, protein
> organism, synthetic construct
잔기:
TPAIPPMMYP HPAYPMPFIT TILGGLYPSK SILLSGTVLP SAQRFHINLC SGNHIAFHLN 60
PRFDENAVVR NTQIDNSWGS EERSLPRKMP FVRGQSFSVW ILCEAHCLKV AVDGQHLFEY 120
YHRLRNLPTI NRLEVGGDIQ LTHVQT 146
서열식별번호: 3
길이: 10
서열 타입: AA
특징 위치/한정자:
- REGION, 1..10
> note, CCRD 1-10
- source, 1..10
> mol_type, protein
> organism, synthetic construct
잔기:
TPAIPPMMYP 10

Claims (33)

  1. (1) 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질;
    (2) 완충제; 및
    (3) 안정화제;를 포함하는 약학 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질인, 약학 제제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질인, 약학 제제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 것인, 약학 제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 1 내지 20mg/ml인, 약학 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 시트레이트(citrate), 포스페이트(phosphate), 히스티딘(histidine), 글리신(glycine), 아세테이트(acetate), 타르트레이트(tartrate), 아스파테이트(aspartate), 락테이트(lactate), 글루코네이트(gluconate), 글루타메이트(glutamate), 석시네이트(succinate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 약학 제제.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 포스페이트(phosphate), 히스티딘(histidine), 아세테이트(acetate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 약학 제제.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 히스티딘 아세테이트인, 약학 제제.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 pH가 4.5 내지 7인, 약학 제제.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 pH가 5.5 내지 6.5인, 약학 제제.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 농도가 5 내지 20mM인, 약학 제제.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 완충제는 농도가 5 내지 15mM인, 약학 제제.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 안정화제는
    (i) 하나 이상의 탄수화물 또는 당; 및
    (ii) 하나 이상의 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;으로 이루어진, 약학 제제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 탄수화물 또는 당은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 자일로스, 리보스, 글루코스, 라피노스, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 셀로비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민 및 과당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 제제.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 탄수화물 또는 당은 트레할로스 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 제제.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 제제.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 아미노산은 글리신인, 약학 제제.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 탄수화물 또는 당은 하나 이상의 탄수화물 또는 당을 포함하고, 각각 1 내지 10 w/v%인, 약학 제제.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 탄수화물 또는 당은 트레할로스 및 만니톨을 포함하고, 각각 1 내지 5 w/v%인, 약학 제제.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 아미노산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 1 내지 20mg/ml인, 약학 제제.
  21. 제13항에 있어서,
    상기 안정화제는 폴리소르베이트를 더 포함하는 것인, 약학 제제.
  22. 제13항에 있어서,
    상기 안정화제는 0.001 내지 0.05w/v%의 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이의 조합을 더 포함하는 것인, 약학 제제.
  23. 제13항에 있어서,
    상기 약학 제제는 액상 또는 동결건조 제형인, 약학 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학 제제가 충진된 바이알(vial).
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학 제제가 충진된 시린지(syringe).
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 치료학적 유효량을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학 제제.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 치료학적 유효량을 포함하는 암 예방 또는 자가면역질환 치료용 약학 제제.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 골질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 암 또는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 골질환의 예방 또는 치료 용도.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료 용도.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료 방법.
  33. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학제제의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 자가면역질환의 치료 방법.
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