[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2024155066A1 - 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물 - Google Patents

뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2024155066A1
WO2024155066A1 PCT/KR2024/000764 KR2024000764W WO2024155066A1 WO 2024155066 A1 WO2024155066 A1 WO 2024155066A1 KR 2024000764 W KR2024000764 W KR 2024000764W WO 2024155066 A1 WO2024155066 A1 WO 2024155066A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
transferrin receptor
amino acid
present
sequence
Prior art date
Application number
PCT/KR2024/000764
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
류성언
송다빈
김명빈
권민경
강주섭
김희진
Original Assignee
주식회사 시그널바이오
한양대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 시그널바이오, 한양대학교 산학협력단 filed Critical 주식회사 시그널바이오
Publication of WO2024155066A1 publication Critical patent/WO2024155066A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to an anti-human transferrin receptor antibody with improved blood-brain barrier crossing efficiency, and a multispecific antibody and pharmaceutical composition using the same. More specifically, it relates to an antibody that can exhibit excellent blood-brain barrier crossing efficiency even after humanization of the 128.1 antibody. It relates to human transferrin receptor antibodies, multispecific antibodies and pharmaceutical compositions using the same.
  • the blood-brain-barrier (BBB) is a barrier that exists between the brain and blood vessels, protecting the regulatory function of the central nervous system from pathogens and potentially dangerous substances by selectively permeating only nutrients or metabolites necessary for the brain. plays an important role.
  • BBB blood-brain-barrier
  • affinity control does not have a significant direct effect on improving the blood-brain barrier permeability, and even if mutations for affinity control are introduced, there is a problem that the effect of improving permeability decreases during the humanization process of the antibody.
  • the inventors of the present invention were able to overcome the limitations of the prior art by designing an anti-transferrin receptor antibody that has excellent passage efficiency through the blood-brain barrier even after humanization of the antibody using conversion of the antibody-receptor sugar chain interaction structure. discovered and completed the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide an anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) with improved efficiency of crossing the blood-brain barrier.
  • Another object of the present invention is to provide a multispecific antibody produced using the anti-human transferrin receptor antibody.
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases containing the anti-human transferrin receptor antibody or multispecific antibody.
  • the present invention provides an anti-human transferrin receptor antibody with improved efficiency of crossing the blood-brain barrier.
  • the anti-human transferrin receptor antibody according to the present invention includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a humanized sequence thereof, and amino acids 26 (glycine, G26), 28 (serine, S28), and 30 of SEQ ID NO: 1.
  • Heavy chain variable region (VH) in which one or more amino acid residues (threonine, T30) are replaced with another amino acid; and a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a humanized sequence thereof.
  • the humanized sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2 to 8.
  • the humanized sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 may be selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 10 to 19.
  • G26, S28, and T30 are glycine (G), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), aspartic acid (D), glutamic acid (E), and asparagine (N), respectively.
  • S serine
  • T threonine
  • G26, S28, and T30 may each be substituted with glutamic acid (E), histidine (H), asparagine (N), or glycine (G).
  • E glutamic acid
  • H histidine
  • N asparagine
  • G glycine
  • the substitution may include one or more of G26E, S28H, S28N, S28G, and T30H.
  • one or more drug compounds may be conjugated to the antibody.
  • the present invention also provides a multispecific antibody using the anti-human transferrin receptor antibody.
  • the multispecific antibody is a multispecific antibody comprising at least one first binding domain that binds to the human transferrin receptor (hTfR) and at least one second binding domain that binds to the target molecule, wherein the first binding domain
  • the domain may include the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention.
  • the target molecule of the second binding domain may be a target protein for cancer treatment, a cell signaling protein, a human phosphorylation enzyme protein, a human dephosphorylation enzyme protein, etc.
  • the target molecules of the second binding domain include chondroitin sulfate, beta-secretase 1 (BACE1), gamma-secretase, and amyloid beta.
  • BACE1 beta-secretase 1
  • Abeta epidermal growth factor receptor (EGFR), tau, apolipoprotein E4 (ApoE4), alpha-synuclein, CD20, huntingtin protein , prion protein (PrP), leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), amyloid precursor protein (APP), p75 neurotrophin receptor (p75NTR), caspase It may be caspase 6 or glucocerebrosidase.
  • one or more drug compounds may be conjugated to the multispecific antibody.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases containing the above antibody.
  • the target disease of the pharmaceutical composition may be a brain disease
  • the brain disease may include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, traumatic brain injury, stroke, Can be selected from the group consisting of Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, alcoholic cranial nerve disease, alcoholic dementia, and Wernicke-Korsakoff's syndrome. there is.
  • the target disease of the pharmaceutical composition may be cancer
  • the cancer may be selected from the group consisting of pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, blood cancer, bone marrow cancer, brain cancer, lung cancer, and skin cancer.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a disease, comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition to an individual in need thereof.
  • a mutation that regulates structural conversion by sugar chain interaction is introduced into an anti-human transferrin receptor antibody, thereby providing an antibody that exhibits excellent blood-brain barrier crossing efficiency even after humanization. Accordingly, when the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention is used in a multispecific antibody or antibody-drug conjugate, proteins or drug compounds for treating brain diseases or cancer can be efficiently delivered.
  • FIG 1 shows Kabat numbering of the heavy chain variable region (VH) of antibody 128.1 used in the present invention.
  • Figure 2 shows SDS PAGE results for the Fab fragment of the humanized anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows SDS PAGE results for the Fab fragment of the chimeric anti-hTfR Y27H mutant antibody according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a shows the tertiary structure of the entire Fab for the humanized anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4b shows the results of structural comparison of the antibody before and after humanization.
  • Figure 5a shows the tertiary structure of the entire Fab for the chimeric anti-hTfR Y27H mutant antibody according to an embodiment of the present invention
  • Figure 5b shows the results of structural comparison between the wild-type antibody and the antibody after the Y27H mutation.
  • Figure 6 shows the results of measuring receptor affinity for a humanized anti-hTfR antibody before and after humanization according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the 2D classification results of the image of the transferrin receptor and antibody complex identified in one embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the structure of the Fab and transferrin receptor dimer of the transferrin receptor and antibody complex identified in one example of the present invention.
  • Figure 9a shows a sphere whose radius is the range of histidine residues based on C ⁇ of S28 in the interaction site between the antibody variable region and the transferrin receptor sugar chain, according to an embodiment of the present invention
  • Figure 9b shows the existing sphere This is a comparison between the structure of the identified transferrin receptor and the structure bound to the antibody.
  • Figure 10 shows the results of additional modeling of the sugar chain region that was not clearly observed in cryogenic microscopy analysis of the transferrin receptor and antibody complex in one embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows the absorbance signal intensity of the antibody according to the framework sequence in the humanized sequence used in one embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of measuring the receptor affinity of a humanized anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 shows the results of measuring blood-brain barrier permeability of a humanized anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to an anti-transferrin receptor antibody with improved efficiency of crossing the blood-brain barrier.
  • Anti-transferrin receptor antibody refers to an antibody that binds to the transferrin receptor (TfR).
  • TfR transferrin receptor
  • the term "anti-transferrin receptor antibody” used in the present invention may be an antibody that undergoes endocytosis when bound to the human transferrin receptor (human TfR, hTfR), and has an amino acid sequence derived from human antibody 128.1. You can have it.
  • the term “antibody” includes molecules derived from immunoglobulin (Ig) that are immunologically reactive with specific antigen(s), and the immunoglobulin includes IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, It may be IgA, IgE, IgD or IgM.
  • the term “antibody” includes both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, chimeric antibodies (e.g., humanized murine antibodies), humanized antibodies, and heterologous antibodies (e.g., bispecific antibodies, It is meant to include forms produced through genetic engineering, such as specific antibodies).
  • chimeric antibody refers to an antibody in which the variable region is from a non-human species and the constant region is from a different species (e.g., human).
  • humanized antibody refers to a non-human antibody that has been genetically engineered to include non-human variable domains modified to have a high level of sequence homology to human antibody constant and variable domains.
  • the humanized antibody can be produced by grafting the complementarity determining region (CDR) of a non-human antibody onto the homologous human acceptor framework region (FR).
  • CDR complementarity determining region
  • the anti-human transferrin receptor antibody is an antibody protein containing a variable region, and its form can be changed and produced depending on the purpose.
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention may be a whole antibody having both Fab and Fc regions, antibody fragments, and recombinant antibodies thereof.
  • the antibody fragment and recombinant antibody may be in the form of Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv) 2 , etc., or in the form of linking them to the Fc region.
  • the term “mutation” is meant to include substitution, insertion, and/or deletion of amino acid residues.
  • the mutation in the present invention includes substitution of amino acid residues. Substitution of amino acid residues is indicated by the amino acid residue present in the parent wild-type protein, the amino acid residue number, and the order of the substituted amino acid residue.
  • Anti-transferrin receptor antibodies are antibodies that bind to the transferrin receptor, which is present in large quantities in the blood-brain barrier.
  • the anti-transferrin receptor antibody binds tightly to the receptor, and while endocytosis (endocytosis) occurs easily, it has the characteristic of not being easily separated from the receptor when exocytosis (exocytosis) occurs. As a result, the anti-transferrin receptor antibody cannot enter the brain and remains attached to the blood-brain barrier cells, which reduces the delivery efficiency of the therapeutic agent.
  • antibodies are produced using the antigen-binding region of human antibody 128.1, which has been reported to cause endocytosis by binding to the human transferrin receptor, and can be used to produce not only chimeric antibodies but also humanized antibodies. Antibodies and mutants with excellent blood-brain barrier permeability were developed.
  • the anti-human transferrin receptor antibody designed in the present invention binds to the human transferrin receptor (hTfR) of the blood-brain barrier and can enter the cell membrane through endocytosis and is easily subject to exocytosis.
  • the anti-hTfR antibody of the present invention has excellent transcytosis efficiency for blood-brain barrier cells and can enter the brain without remaining in blood-brain barrier cells.
  • the anti-hTfR antibody of the present invention and the protein that promotes nerve cell growth are produced in the form of a multispecific antibody, a brain disease treatment with improved brain delivery effect can be provided.
  • the anti-human transferrin receptor antibody with improved efficiency of crossing the blood-brain barrier according to the present invention includes an amino acid sequence based on the heavy chain variable region (VH) and/or light chain variable region (VL) of human antibody 128.1.
  • the numbering in the amino acid sequence of the variable region of the human antibody 128.1 follows Kabat numbering.
  • Figure 1 shows the Kabat numbering of the heavy chain variable region (VH) of human antibody 128.1. With reference to this, the number of each amino acid constituting the heavy chain variable region of human antibody 128.1 can be confirmed.
  • the heavy chain variable region (VH) of the anti-human transferrin receptor antibody according to the present invention may be a sequence variant derived from the heavy chain variable region of human antibody 128.1.
  • the heavy chain variable region sequence subject to the mutation is the human antibody 128.1 heavy chain variable region (SEQ ID NO: 1) or a humanized sequence thereof, and the humanized sequence may be one of SEQ ID NOs: 2 to 8.
  • the light chain variable region (VL) of the anti-human transferrin receptor antibody according to the present invention may be a sequence derived from the light chain variable region of human antibody 128.1.
  • the sequence of the light chain variable region is the human antibody 128.1 light chain variable region (SEQ ID NO: 9) or a humanized sequence thereof, and the humanized sequence may be one of SEQ ID NOs: 10 to 19.
  • the antibody into which the humanized variable region was introduced exhibits permeability to the blood-brain barrier.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region may each include an amino acid sequence that is at least 90%, preferably at least 95%, and more specifically at least 98% identical to the amino acid sequence shown in the SEQ ID NO.
  • anti-human transferrin receptor antibody 128.1 which has been reported to cause endocytosis by binding to the transferrin receptor, interacts with the sugar chain region of the receptor when it binds to the transferrin receptor, and this interaction It was found that the structure of the transferrin receptor is converted. Additionally, it was discovered that transferrin receptor mutations that regulate this structural transformation are essential for improving the efficiency of anti-human transferrin receptor antibodies crossing the blood-brain barrier.
  • the antibody residues in the sugar chain interaction site are adjacent to the CDR grafting site for humanization of the antibody, so that humanization of the antibody and optimization of the efficiency of passing the blood-brain barrier are interrelated, and taking this into consideration, we have taken this into consideration that humanization is possible while also allowing the blood-brain barrier. Provides new mutations with optimized barrier passage efficiency.
  • the anti-human transferrin receptor antibody is an anti-human transferrin receptor antibody or humanized antibody comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 2.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • one or more amino acid residues among amino acids 26 (glycine, G26), amino acids 28 (serine, S28), and amino acids 30 (threonine, T30) of the heavy chain variable region may be substituted with another amino acid.
  • the anti-transferrin receptor antibody of the present invention is a humanized antibody, and has amino acids 26 (glycine, G26), 28 (serine, S28), and 30 of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 8.
  • amino acids 26 glycine, G26
  • 28 serine, S28
  • 30 of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 8.
  • one or more of G26, S28, and T30 are each amino acids other than alanine (A), that is, glycine (G), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), and aspartic acid.
  • A alanine
  • G glycine
  • V valine
  • L leucine
  • I isoleucine
  • D glutamic acid
  • E asparagine
  • N glutamine
  • Q proline
  • P proline
  • P proline
  • P proline
  • F phenylalanine
  • F tryptophan
  • W lysine
  • K tryptophan
  • C cysteine
  • M methionine
  • Y arginine (R), histidine (H), serine (S), or threonine (T).
  • G26, S28, and T30 may be replaced with glutamic acid (E), histidine (H), asparagine (N), or glycine (G), respectively.
  • G26 can be substituted with glutamic acid (E)
  • S28 can be substituted with histidine (H)
  • T30 can be substituted with histidine (H).
  • the heavy chain variable region may include one or more amino acid mutations among G26E, S28H, S28N, S28G, and T30H.
  • the heavy chain variable region may further include mutations of other amino acids in addition to the above substitutions.
  • amino acid number 27 tyrosine, Y27
  • the heavy chain variable region may be substituted with another amino acid, and specifically, the heavy chain variable region may further include an amino acid mutation of Y27H.
  • the Y27H mutation can improve the blood-brain barrier permeability of the chimeric 128.1 antibody, but when the 128.1 antibody is humanized, there is a problem in that the permeability improvement effect due to the Y27H mutation does not appear.
  • this problem is solved by introducing the above-mentioned heavy chain variable region mutation. Rather than simply controlling antibody-receptor affinity, transcytosis efficiency is improved by using antibody-receptor sugar chain interaction and resulting receptor structural conversion. By improving this, the blood-brain barrier permeability of the humanized 128.1 antibody can be greatly improved.
  • the blood-brain barrier permeability is greatly improved, whereas when the Y27H mutation is introduced into a humanized antibody, the permeability is decreased.
  • G26E it was confirmed that blood-brain barrier permeability was improved when one or more mutations among S28H, S28N, S28G, and T30H were introduced, or when the above mutation was additionally introduced into the Y27H mutation.
  • the mutant antibody provided by the present invention can be used to efficiently deliver therapeutic proteins, antibody Fabs, or small molecule compounds that can be used to treat brain diseases to brain tissue.
  • a therapeutic protein or antibody Fab a bispecific antibody having a mutant antibody on one arm and a therapeutic protein/antibody Fab on the other arm can be used.
  • a linker appropriate for the mutant antibody can be used to deliver the small molecule. It can be used by attaching a compound to create an antibody-drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody-drug conjugate
  • cancer cells overexpress the transferrin receptor, and the mutant antibody provided in the present invention can be used to effectively deliver a therapeutic agent targeting a disease target inside cancer cells into cancer cells, so it can also be useful in the development of cancer therapeutic agents.
  • the mutant antibody according to the present invention since the mutant antibody according to the present invention has effective transcytosis, it can easily reach the disease target in the cytoplasm by facilitating the endosome escape process inside cancer cells.
  • the present invention also provides a multispecific antibody using the anti-human transferrin receptor antibody.
  • multispecific antibody refers to an antibody that can bind to two or more different antigens or receptors, for example, a bispecific antibody, a trispecific antibody. ), etc., and includes forms produced through genetic engineering.
  • the multispecific antibody may include one or more domains (first binding domain) that bind to the human transferrin receptor (hTfR) and one or more other domains (2nd binding domain) that bind to the target molecule.
  • the multispecific antibody according to the present invention may further include one or more binding domains (multiple binding domains) that are different from the first binding domain and the second binding domain.
  • various treatment strategies can be proposed by binding to other target molecules in addition to the targets of the first and second binding domains.
  • binding domain is interpreted to include all antibody-derived proteins, bio-derived proteins, and artificially designed interaction proteins.
  • the second binding domain and the multiple binding domain may each independently include a biologically derived protein or an artificially designed interaction protein in addition to an antibody-derived protein.
  • a multispecific antibody of the invention may comprise a first binding domain that binds to the human transferrin receptor, a second binding domain that binds a target molecule, and an Fc region, in which case the first binding domain and the second binding domain.
  • the binding domain may have a structure linked to the Fc region.
  • a fusion protein produced to have multispecificity using a linker other than an Fc region-derived protein may also be included in the scope of the multispecific antibody of the present invention.
  • the multispecific antibody of the present invention has the variable region sequence of the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention in one arm (first binding domain), and the other arm (second binding domain) is used to treat brain diseases. It may contain a therapeutic protein capable of binding to a target molecule.
  • the multispecific antibody of the present invention binds to the human transferrin receptor through the first binding domain and easily passes through the blood-brain barrier through transcytosis, effectively delivering the therapeutic protein of the second binding domain to brain tissue. You can.
  • the first binding domain is a region including a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), and its form can be changed and produced depending on the purpose.
  • the first binding domain may be in the form of Fab including VH-CH1 and VL-CL, fragments thereof, and recombinant form.
  • the first binding domain may be in the form of Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv) 2 , etc.
  • the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of the first binding domain may include the amino acid sequence derived from the above-described 128.1 antibody or a variant thereof. Accordingly, the first binding domain can effectively induce transcytosis through the human transferrin receptor and transport the multispecific antibody into the brain.
  • the second binding domain may include a protein that binds to a target molecule, for example, an antigen-binding region of an antibody that binds to a target molecule, or a therapeutic protein. In one embodiment of the present invention, the second binding domain may bind to a target molecule to promote neuronal growth.
  • the antigen-binding region of the antibody that binds to the target molecule refers to the part of the antibody that specifically binds to part or all of the antigen (target molecule) and includes a region complementary to part or all of the antigen. can do.
  • the form of the antigen-binding region is not particularly limited, and may be in the form of Fab, sdAb, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv) 2 , etc.
  • the Fab form includes the CH1 domain of the variable region (VH) and constant region (CH) of the heavy chain, and the variable region (VL) and constant region (CL) of the light chain, and a disulfide bond is formed between CH1 and CL.
  • the sdAb form refers to a single-domain variable fragment and refers to one variable region domain.
  • the scFv form refers to a single-chain variable fragment in which variable regions are connected, and refers to a recombinant domain in which the VH and VL regions are connected with a peptide linker.
  • the di-scFv form refers to a recombination domain in which two scFvs are connected by a linker.
  • the linker may be any linker known in the art, and may be a peptide consisting of 5 to 20 amino acids.
  • the linker may be composed of one or more amino acids selected from the group consisting of G, A, S, P, E, T, D and K.
  • the linker may be (GGGGX) n , where X is preferably A or S, and n is preferably a natural number from 1 to 4.
  • the dsFv form is similar to scFv in that the variable regions are connected as a disulfide-linked variable fragment, but it refers to a recombinant domain in which the VH and VL regions are connected by a disulfide bond rather than a linker.
  • the (dsFv) 2 form refers to a recombination domain in which two dsFvs are connected by a linker.
  • the target molecule of the second binding domain may be a target protein for cancer treatment, a cell signaling protein, a human phosphorylation enzyme protein, a human dephosphorylation enzyme protein, etc.
  • Target molecules of the second binding domain include chondroitin sulfate, beta-secretase 1 (BACE1), gamma-secretase, amyloid beta (Abeta), and epithelium.
  • the second binding domain is a protein that promotes nerve cell growth and may include a protein derived from PTPsigma (Protein Tyrosine Phosphatase sigma) described in Korean Patent Application No. 10-2021-0117865 of the present applicant. You can.
  • PTPsigma Protein Tyrosine Phosphatase sigma
  • first binding domain and the second binding domain may be linked to each chain of the Fc region.
  • Fc region refers to the C-terminal region including CH2 and CH3 domains (or CH2, CH3, and CH4 domains) of the heavy chain constant region of immunoglobulin, and is a wild-type Fc region. and its variants.
  • the immunoglobulin that serves as the parent of the Fc region may be IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, preferably IgG1.
  • the Fc region may refer to a region extending from residue 221 of a human IgG1 heavy chain to the C-terminus, or a region further including a hinge in the region.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region is according to the EU numbering, which defines the numbering of residues in human immunoglobulin heavy chains.
  • wild-type Fc region includes an amino acid sequence that matches the amino acid sequence of the Fc region of an immunoglobulin found in nature.
  • Fc region variant includes one or more amino acid residues that are different from the wild-type Fc region, and can be abbreviated as “Fc variant.”
  • the Fc variant may have about 80% or more homology, preferably about 90% or more, with the parent wild-type Fc region sequence.
  • each chain of the Fc region may include sequences 221 to 447 of the heavy chain of IgG1.
  • the heavy chain sequence numbers 221 to 447 of the IgG1 can be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 below.
  • each binding domain and Fc region may be connected by 0 to 20 amino acid residues. That is, the binding domain and the Fc region may be directly connected or may be connected through a linker consisting of 1 to 20 amino acids. At this time, each binding domain may be linked to the N-terminus, C-terminus, or an amino acid located between them, and preferably, may be linked to the N-terminus of the Fc region.
  • the first binding domain may be connected to 1 to 3 of the four binding sites including the two N-termini and the two C-termini of the dimer of the Fc region, and among the remaining sites,
  • the second binding domain may be linked to one or more sites.
  • recombinant variants can be formed in the Fc region to form multispecific antibodies.
  • the dimer when the first binding domain and the second binding domain are respectively attached to the two chains of the Fc region dimer, the dimer can be formed by introducing a recombinant variant.
  • a recombinant mutant for forming the dimer a knob-into-hole (KiH) mutation or a knob-into-hole disulfide (KiHss) mutation can be used.
  • the knob-into-hole technology is designed to ensure that only heterodimers are formed between the heavy chains of antibody fragments.
  • the knob is designed to have a side chain protruding into the opposite chain and is inserted into a hole in the opposite domain. Because of this, heavy chains cannot be homodimerized due to side chain collisions, and only heterodimerization is possible.
  • one of the two chains constituting the Fc region may have a knob structure, and the other may have a hole structure.
  • the chain in which the knob or hole is formed is called the Fc-knob or Fc-knob, respectively. It is referred to as Fc-hole.
  • the Fc-knob can be formed by substituting one or more amino acids in the chain constituting the Fc region with a large amino acid selected from the group consisting of tryptophan (W), arginine (R), phenylalanine (F), and tyrosine (Y).
  • the Fc-knob may be one in which the T366W mutation is formed in sequences 221 to 447 of the IgG1-Fc heavy chain.
  • the Fc-hole can be formed by substituting one or more amino acids in the chain constituting the Fc region with a small amino acid selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T), and valine (V).
  • a small amino acid selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T), and valine (V).
  • the Fc-hole includes T366S, L368A, and Y407V in sequences 221 to 447 of the IgG1-Fc heavy chain. A mutation may have formed.
  • the multispecific antibody has a first binding domain in the form of a Fab linked to an Fc-hole and a second binding domain comprising a therapeutic protein that binds to a target molecule linked to an Fc-knob. It can have a structure.
  • multispecific binding when attaching the first binding domain and the second binding domain to the N-terminus and C-terminus (or vice versa) of each Fc chain, multispecific binding is performed using an Fc homodimer. It is possible to produce enemy antibodies. In this case, it can be called an Fc homodimer multispecific antibody.
  • the multispecific antibody of the present invention can easily pass through the blood-brain barrier through the domain that binds to the anti-human transferrin receptor antibody, and as a result, the domain that binds to the target molecule and exerts a therapeutic effect is effectively delivered to the brain, providing excellent brain function. It can show disease treatment effects.
  • the mutant antibody according to the present invention since the mutant antibody according to the present invention has effective transcytosis, the therapeutic agent targeting the disease target inside cancer cells can be effectively delivered into the cancer cells, so it can be usefully used in the development of cancer therapeutic agents.
  • a drug compound may be conjugated to the anti-human transferrin receptor antibody or multispecific antibody of the present invention to form an antibody-drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the antibody-drug conjugate is for delivering a small molecule drug compound to brain tissue using transcytosis of an anti-human transferrin receptor antibody through the human transferrin receptor.
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention or a multiplex using the same Attaching a drug compound to a specific antibody can improve the delivery efficiency of drugs that are difficult to pass through the blood-brain barrier.
  • the drug may be linked to the C-terminus and/or N-terminus of each antibody chain, as well as to one or more amino acid residues within the chain.
  • the drug can be conjugated using an appropriate linker.
  • the drug may include drug compounds, growth inhibitors, toxins, radioisotopes, miRNA, siRNA, shRNA, etc. known in the art.
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention can be used in pharmaceutical compositions or biosensors. Accordingly, the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases containing the anti-human transferrin receptor antibody.
  • the pharmaceutical composition may be used for treating brain diseases.
  • the mutant antibody of the present invention can easily pass through the blood-brain barrier through the domain that binds to the anti-human transferrin receptor antibody, and as a result, the domain that binds to the target molecule and exerts a therapeutic effect is effectively delivered to the brain, providing excellent treatment for brain diseases. It can show an effect.
  • the brain disease includes Parkinson's disease, Alzheimer's disease, traumatic brain injury, stroke, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis. It may include one or more selected from the group consisting of lateral sclerosis, spinal cord injury, alcoholic cranial nerve disease, alcoholic dementia, and Wernicke-Korsakoff's syndrome.
  • a multispecific antibody prepared by fusion with a protein that promotes nerve cell growth when using a multispecific antibody prepared by fusion with a protein that promotes nerve cell growth according to an embodiment of the present invention, it can be used to treat Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and accidental brain injury. It can be effectively used to prevent or treat brain diseases such as traumatic brain injury.
  • the target disease of the pharmaceutical composition may be cancer. Since the mutant antibody according to the present invention has effective transcytosis, the therapeutic agent targeting the disease target inside the cancer cell can be effectively delivered into the cancer cell, so it can be usefully used as a cancer therapeutic agent.
  • the cancer may be selected from the group consisting of pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, blood cancer, bone marrow cancer, brain cancer, lung cancer, and skin cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody of the present invention.
  • the pharmaceutically acceptable carriers are those commonly used in formulations and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Includes, but is not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. It can be administered.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. It can be administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in the form of a sterile injectable solution, lyophilized formulation, pre-filled syringe solution, oral formulation, topical formulation, or suppository according to conventional methods. there is.
  • a sterile injectable solution lyophilized formulation
  • pre-filled syringe solution pre-filled syringe solution
  • oral formulation topical formulation
  • suppository a sterile injectable solution
  • oral formulation formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include at least one other therapeutic or diagnostic agent.
  • it may further include interferon, anti-S protein monoclonal antibody, anti-S protein polyclonal antibody, nucleoside analog, DNA polymerase inhibitor, or siRNA agent.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. You can.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be 0.001 to 100 mg/kg.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating brain diseases, which method includes administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an anti-human transferrin receptor antibody of the present invention, a multispecific antibody using the same, or an antibody-drug conjugate. may include.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating cancer, which method includes administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an anti-human transferrin receptor antibody of the present invention, a multispecific antibody using the same, or an antibody-drug conjugate. It can be included.
  • the subject of administration may be a subject, specifically a subject in need of an anti-human transferrin receptor antibody or a multispecific antibody using the same, and the subject may be an animal, typically a mammal. there is.
  • the amino acid sequences of the existing anti-human transferrin receptor antibody 128.1 VH and VL were compared with the VH and VL sequences of the human antibody registered in the NCBI database.
  • the AbYsis program was used to distinguish the CDR region and FR region of the 128.1 antibody sequence using methods such as Kabat and IMGT, and the same operation was performed for the human antibody candidate.
  • the amino acid sequence of the CDR region isolated from the 128.1 antibody and the FR sequence isolated from the human antibody candidate were recombined according to the method of Kabat, IMGT, etc. to produce a humanized candidate sequence.
  • the produced sequence was reviewed to remove elements that were likely to cause instability through humanization.
  • amino acids corresponding to the Vernier zone were found and changes occurring in those amino acids due to humanization were examined.
  • a humanized expected structure model file was created through the AlphaFold program. Based on the generated model file, amino acids that were likely to cause structural instability were identified and reflected in the design of the humanized sequence, and the optimized sequence was selected.
  • the chimeric 128.1 VH and VL wild type sequences, which serve as the starting point for the humanized sequences, and the humanized sequences used in the experiment are as follows.
  • the crystal structures were identified and analyzed by comparing the humanized anti-transferrin receptor antibody and the chimeric anti-transferrin receptor antibody Y27H mutant.
  • VH and VL sequences of anti-human transferrin receptor antibody 128.1 were synthesized (Bioneer).
  • the variable regions of the heavy and light chains are amplified by polymerase chain reaction (PCR), and human IgG C H 1 or C H 1-Fc region and His-tag are in the heavy chain, and human kappa chain C L was inserted into the pcDNA 3.1/myc-His A plasmid vector (Invitrogen) contained in the light chain portion.
  • Antibody proteins were expressed in expiCHO-S TM (Thermo Fisher Scientific). Cell culture was performed in a humidified CO 2 incubator using a 125mL Erlenmeyer cell culture flask. ExpiFectamine TM CHO/plasmid DNA complexes were created and used to transfect plasmids encoding antibodies and Fab fragments. On the 10th day after transfection, the cell culture was harvested and the protein was purified using Hitrap Talon column (Cytiva).
  • Fab fragment crystals of the humanized anti-human transferrin receptor antibody were grown at 18°C using the sitting drop vapor diffusion method.
  • X-ray diffraction data were obtained by protecting the crystal with a solution containing 20% ethylene glycol in a composition of 0.2M ammonium sulfate, 0.1M sodium acetate trihydrate pH 4.6, 24% polyethylene glycol 6,000.
  • X-ray diffraction experiments were performed at Pohang Accelerator beamline 7A, and crystals were diffracted with a resolution of 1.6 ⁇ .
  • X-ray diffraction data were obtained by protecting the crystals with a 2M ammonium sulfate solution containing 30% glycerol. X-ray diffraction experiments were performed at Pohang Accelerator beamline 7A, and crystals were diffracted with a resolution of 2.5 ⁇ .
  • the tertiary structure was identified and refined by molecular replacement method using the PHENIX program.
  • the statistical results of X-ray diffraction data processing of the humanized anti-human transferrin receptor antibody Fab fragment crystals are shown in Table 1, and the statistical results of tertiary structure refinement of the Fab fragment crystals are shown in Table 2.
  • the tertiary structure was identified and refined by molecular replacement method using the PHENIX program.
  • the statistical results of X-ray diffraction data processing of the chimeric anti-human transferrin receptor antibody Y27H mutant Fab fragment crystals are shown in Table 3, and the statistical results of tertiary structure refinement of the Fab fragment crystals are shown in Table 4.
  • Figure 4a shows the tertiary structure of the entire Fab
  • Figure 4b shows the structural comparison results of the antibody before and after humanization.
  • each CDR showed a consistent form.
  • RMSD root mean square deviation
  • TfR transferrin receptor
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • a gene fragment encoding the human transferrin receptor protein was amplified through PCR (amino acids 121-760). The gene was inserted into the pcDNA 3.1/myc-His A plasmid vector (Invitrogen) containing the human IgG Fc region gene using restriction enzymes and T4 ligase, and a His-tag was attached to the C-terminus of the expressed protein. It was made possible. An HRV-3C protease recognition sequence was inserted between human IgG Fc and transferrin receptor.
  • Human transferrin receptor protein with human IgG Fc and His-tag was expressed in expiCHO-S TM (Thermo Fisher Scientific). Transient transfection was performed by mixing the plasmid encoding the corresponding recombinant protein with ExpiFectamine TM CHO reagent. After transfection, the cells were cultured in a CO 2 incubator for about 10 days, and the cell culture medium was separated by centrifugation. The culture medium was incubated with HRV-3C protease to sever the connection between the transferrin receptor and human IgG Fc, and purified with Ni-NTA resin (QIAGEN) to obtain transferrin receptor protein. The purified transferrin receptor protein was mixed with anti-human transferrin receptor antibody Fab fragments and then subjected to size exclusion chromatography.
  • Samples were prepared by loading a complex of human transferrin receptor protein and anti-human transferrin receptor antibody Fab fragment onto a glow-discharged Quantifoil R1.2/1.3 grid and then processing it with a Vitrobot Mark IV (FEI) device. Image data was acquired by photographing the grid produced using a 200kV Glacios electron microscope equipped with Falcon4.
  • FEI Vitrobot Mark IV
  • FIG. 7 shows an image of the transferrin receptor and antibody complex classified through 2D classification
  • Figure 8 shows the structure of the dimeric complex of Fab (bottom) and transferrin receptor (top).
  • Model resolution ( ⁇ ) 4.6 (FSC 0.5) Map sharpening B-factor ( ⁇ 2 ) -332 Model composition atoms / protein residues / glycans 13818 / 1728 / 18 B factors ( ⁇ 2 )Protein / glycan 119 / 234 Bond r.m.s.d.lengths ( ⁇ ) / angles (°) 0.003 / 0.672 Molprobity score 2.04 Ramachandran plot (%) Favored / allowed / outliers 92.19 / 7.46 / 0.35
  • the effect of antibody mutations on the transferrin receptor was analyzed through the complex structure of the transferrin receptor and antibody.
  • the structure of the transferrin receptor complex bound to the antibody was compared with the structure of the previously identified transferrin receptor using the secondary structure matching superpose method.
  • Figure 9a shows a sphere whose radius is the range of histidine residues based on C ⁇ of Ser28 in the interaction site between the antibody variable region and the transferrin receptor sugar chain
  • Figure 9b shows the structure of the transferrin receptor whose structure was previously identified and the antibody. The results of the comparison of the combined structures are shown.
  • the structure of the transferrin receptor dimer in the transferrin receptor complex bound to the antibody was wider than other structures.
  • the complex structure showed unexpected results in which the antibody interacted with the sugar chain portion of the transferrin receptor, and it was observed that the binding of the antibody affected the overall structure of the transferrin receptor.
  • Y27H In the case of the existing mutation (Y27H), it is interpreted that it is present in the sugar chain interaction site and causes a structural change between the sugar chain and the transferrin receptor, and this structural change in the transferrin receptor is interpreted to have increased the efficiency of passing the BBB during the transcytosis process.
  • the hydrophobic residue tyrosine was originally located inside the protein, but was replaced with histidine and protruded from the surface, destabilizing the antibody, and the structural modification of the antibody deepened due to overlap with the CDR grafting site during the humanization process.
  • the Y27H mutation in the antibody may interfere with BBB passage.
  • the existing mutation Y27H it can be used as a useful mutation when applied in the form of a chimeric antibody without humanization.
  • humanization is desirable, and for this purpose, the above structural information was synthesized to design mutations that modify the sugar chain structure and the structure of the transferrin receptor to be advantageous for transcytosis but do not affect humanized CDR grafting. Screened.
  • the designed mutation sequence is as follows. Kabat numbering was used to designate the sequence number, and the mutated portion in the humanized 128.1 sequence was underlined.
  • Mutations that improve BBB permeability in humanized antibodies can also be used in the form of chimeric antibodies, whose sequences are as follows. Kabat numbering was used to designate the sequence number, and the mutated part of the chimeric 128.1 sequence was underlined.
  • the gene was synthesized and cloned into the pcDNA 3.1 / myc-His A plasmid vector (Invitrogen).
  • the IMGT type CDR region definition was used. It is also possible to use Kabat-style CDR region definition by applying humanized sequence selection principles similar to this example. Also, in some cases, it is possible to mix the IMGT method and the Kabat method.
  • hBMEC Primary microvascular endothelial cells from human brain were purchased from Cell systems (ACBRI 376). T-75 flasks were coated with Attachment Factor TM (Cell systems) before use for cell culture. Attachment Factor TM (5 mL) pre-warmed at 37°C was added to the T-75 flask and removed after 10 seconds. Cells were thawed and grown to 80 - 90% confluence in a humidified incubator at 37°C and 5% CO 2 using Complete Classic culture medium (Cell systems) supplemented with CultureBoost TM (Cell systems). Afterwards, it was washed with pre-warmed PBS, trypsin-EDTA was added, and then incubated at 37°C for 5 minutes.
  • Cell systems Complete Classic culture medium
  • CultureBoost TM CultureBoost
  • Transwell inserts 24-well, 0.4 ⁇ m filter, SPL
  • Attachment Factor TM Attachment Factor TM as described above.
  • the hBMEC cells obtained as above were seeded at 20 x 10 3 cells/well in the upper chamber of the transwell plate and incubated for 48 hours.
  • HRP-attached control IgG was added to the upper chamber and incubated at 37°C for 2 hours, and then the culture fluid from the upper and bottom chambers was recovered.
  • the control IgG infiltrated by adding the TMB solution was quantitatively measured.
  • antibodies contained in fresh supplemented complete culture were added to the upper chamber by replacing half of the buffer and incubated at 37°C, and the culture in the lower chamber was recovered after 4 hours of incubation.
  • Blood-brain barrier permeability was analyzed by measuring the infiltrating antibodies using sandwich ELISA using a plate coated with anti-human IgG antibody.
  • Table 7 shows the results of permeability experiments for chimeric antibodies, humanized antibodies, and their mutations produced in Preparation Examples 1-1 to 1-3.
  • the two antibodies showed similar properties when measuring the amount of blood-brain barrier cell passage of the pre-humanized antibody (chimeric antibody) and the humanized antibody.
  • the chimeric antibody VH chain (ch-VH) showed a significant increase in permeability due to the Y27H mutation;
  • the humanized antibody VH chain (hz-VH)
  • the permeability was actually reduced due to the Y27H mutation.
  • Figure 13 is a graph showing the results of the cerebrovascular cell permeability analysis, in which antibodies having framework regions derived from L2+H19, L9+H15, L10+H16, L20+H13, L21+H13, etc. penetrate primary microvascular endothelium. It showed transit activity against cells. In the case of the antibody showing transit activity, it was determined that humanization was achieved without loss of function, and it was found that the sequence could be used as a humanization sequence for the 128.1 antibody.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체에 당쇄 상호작용에 의한 구조 변환을 조절하는 돌연변이를 도입하여 인간화 후에도 우수한 뇌혈관장벽 통과 효율을 나타내는 항체를 제공할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 다중특이적 항체나 항체-약물 접합체에 이용하는 경우 뇌질환 또는 암 치료용 단백질이나 약물 화합물을 효율적으로 전달할 수 있다.

Description

뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물
본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 128.1 항체의 인간화 후에도 우수한 뇌혈관장벽 통과 효율을 나타낼 수 있는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물에 관한 것이다.
뇌혈관장벽(blood-brain-barrier, BBB)은 뇌와 혈관 사이에 존재하는 장벽으로서, 뇌에 필요한 영양소나 대사물질만을 선택적으로 투과시켜 병원체나 잠재적인 위험 물질로부터 중추신경계의 조절기능을 보호하는 중요한 역할을 한다. 그런데 이러한 뇌혈관장벽의 선택적 투과성으로 인해 뇌질환 치료제의 유입까지 차단되기 때문에, 많은 뇌질환 치료제가 표적 세포까지 전달되지 못하여 임상에서 효과를 보이기 어렵다는 문제가 있다.
관련하여, 면역글로불린(IgG)을 주입하였을 때 매우 낮은 비율(약 0.1%)만이 중추 신경계(CNS) 구획 내로 투과할 수 있을 것이라는 연구 내용이 발표된 바 있다(Felgenhauer, Klinische Wochenschrift 52, 1158-1164 (1974) 참조). 또한, 저분자 치료제의 경우에도 지질 용해도가 높고 분자량이 매우 작은 일부 약제만이 뇌혈관장벽을 통과할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 이와 같이 뇌혈관장벽에 의해 치료제 물질의 효과가 제한되는바, 뇌질환 치료제 개발에 있어서 뇌혈관장벽의 통과 효율을 향상시키는 것이 매우 중요하며, 이를 위해 다양한 전략이 시도되어 왔다.
저분자 치료제의 경우, 소수성 성질을 갖도록 변형시키는 등 뇌혈관장벽 투과도를 향상시킬 수 있는 유도체를 설계하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0045101호에서는 칼슘의존성 클로라이드 채널 차단제 T16Ainh-A01를 구조변형시킨 아미노페닐티아졸 유도체를 설계하여 치료 효율 및 뇌혈관장벽 투과율을 향상시킨 기술을 개시하고 있다.
한편, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병 등의 뇌질환은 일반적인 지질 용해성 저분자 치료제가 효과를 나타내기 어렵기 때문에 단백질이나 항체 치료제의 개발이 이루어지고 있다. 그런데 단백질이나 항체 치료제는 뇌혈관장벽의 세포막을 직접 통과하는 것이 불가능하므로, 뇌혈관장벽을 이루는 세포에 존재하는 내인성 수용체를 통한 트랜스사이토시스(transcytosis, 세포통과) 경로를 이용하는 방법이 시도되었다. 뇌혈관장벽에 존재하는 내인성 수용체에 결합하는 항체는 수용체와 함께 엔도사이토시스(endocytosis, 세포내이입)되어 세포 내로 들어갔다가, 반대쪽으로 엑소사이토시스(exocytosis, 세포외배출)됨으로써 뇌혈관장벽을 횡단할 수 있다. 이 때, 항체에 치료용 단백질이나 치료용 항체의 항원결합 영역을 부착하면, 이와 같은 치료용 물질이 뇌 안으로 들어가도록 설계할 수 있다.
종래에는 뇌혈관장벽 투과능 향상을 위하여 항체와 수용체의 친화도를 조절하는 것이 핵심이라고 알려져 왔다. 그러나, 뇌혈관장벽 투과능 향상에 있어 친화도 조절이 직접적으로 큰 영향을 미치지는 않으며, 친화도 조절을 위한 돌연변이를 도입한다 하더라도 항체의 인간화 과정에서 투과능 향상 효과가 감소한다는 문제가 있었다.
이러한 상황에서, 본 발명의 발명자들은 항체와 수용체 당쇄 상호작용 구조의 변환을 이용하여 항체 인간화 후에도 뇌혈관장벽의 통과 효율이 우수한 항 트랜스페린 수용체 항체를 설계함으로써 상술한 종래 기술의 한계를 극복할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR 항체)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 이용하여 제작된 다중특이적 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 서열을 포함하며, 상기 서열번호 1의 26번 아미노산(글라이신, G26), 28번 아미노산(세린, S28) 및 30번 아미노산(트레오닌, T30) 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함한다.
본 발명에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 인간화 서열은 서열번호 2 내지 8로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 서열번호 9의 아미노산 서열의 인간화 서열은 서열번호 10 내지 19로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 G26, S28 및 T30 중 하나 이상은 각각 글라이신(G), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 라이신(K), 시스테인(C), 메티오닌(M), 티로신(Y), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 G26, S28 및 T30 중 하나 이상은 각각 글루탐산(E), 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 또는 글라이신(G)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 치환은 G26E, S28H, S28N, S28G 및 T30H 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항체에는 하나 이상의 약물 화합물이 접합될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 이용한 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 다중특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)와 결합하는 하나 이상의 제1 결합 도메인 및 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체로서, 상기 제1 결합 도메인이 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 제2 결합 도메인의 표적 분자는 암치료용 표적단백질, 세포신호전달 단백질, 인간 인산화 효소 단백질, 인간 탈인산화 효소 단백질 등일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제2 결합 도메인의 표적 분자는 콘드로이친 황산염(chondroitin sulfate), 베타 세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 감마 세크레타제(Gamma-secretase), 아밀로이드 베타(amyloid beta, Abeta), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 타우(tau), 아포지단백질 E4(apolipoprotein E4, ApoE4), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), CD20, 헌팅틴 단백질(Huntingtin protein), 프리온 단백질(prion protein, PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75 neurotrophin receptor, p75NTR), 카스파제 6(caspase 6) 또는 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 다중특이적 항체에는 하나 이상의 약물 화합물이 접합될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물의 표적 질환은 뇌질환일 수 있으며, 상기 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury), 뇌졸중(Stroke), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물의 표적 질환은 암일 수 있으며, 상기 암은 췌장암, 간암, 위암, 혈액암, 골수암, 뇌암, 폐암 및 피부암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체에 당쇄 상호작용에 의한 구조 변환을 조절하는 돌연변이를 도입하여 인간화 후에도 우수한 뇌혈관장벽 통과 효율을 나타내는 항체를 제공할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 다중특이적 항체나 항체-약물 접합체에 이용하는 경우 뇌질환 또는 암 치료용 단백질이나 약물 화합물을 효율적으로 전달할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용되는 항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH)의 카밧(Kabat) 넘버링을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화 anti-hTfR 항체의 Fab 절편에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 anti-hTfR Y27H 돌연변이 항체의 Fab 절편에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화 anti-hTfR 항체에 대한 Fab 전체의 삼차구조를 나타내고, 도 4b는 인간화 이전 항체와 이후 항체의 구조 비교 결과를 나타낸다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 anti-hTfR Y27H 돌연변이 항체에 대한 Fab 전체의 삼차구조를 나타내고, 도 5b는 야생형 항체와 Y27H 돌연변이 이후 항체의 구조 비교 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화 anti-hTfR 항체에 대해 인간화 전후의 수용체 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 확인한 트랜스페린 수용체와 항체 복합체의 이미지의 2D classification 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 확인한 트랜스페린 수용체와 항체 복합체의 Fab 및 트랜스페린 수용체 이량체의 구조를 나타낸 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 항체 가변부위와 트랜스페린 수용체 당쇄의 상호작용 부위에 있는 S28의 Cα를 기준으로 히스티딘 잔기의 범위를 반지름으로 하는 구체를 표시하여 나타낸 것이고, 도 9b는 기존에 규명된 트랜스페린 수용체의 구조와 항체가 결합한 구조를 비교하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 트랜스페린 수용체와 항체 복합체에 대해 초저온현미경 분석에서 선명하게 관측되지 않은 당쇄 부위를 추가적으로 모델링한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 인간화 서열에서 프레임워크 서열에 따른 항체의 흡광도 신호 세기를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화 anti-hTfR 항체의 수용체 친화도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화 anti-hTfR 항체의 뇌혈관장벽 투과도 측정 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 개선된 항 트랜스페린 수용체 항체에 관한 것이다.
항 트랜스페린 수용체 항체(anti-TfR antibody)란 트랜스페린 수용체(TfR)에 결합하는 항체를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 사용되는 용어 "항 트랜스페린 수용체 항체"는 인간 트랜스페린 수용체(human TfR, hTfR)와 결합했을 때 엔도사이토시스(endocytosis)가 일어나는 항체일 수 있고, 인간항체 128.1 유래의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"란 면역학적으로 특정 항원(들)과 반응성을 갖는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig) 유래의 분자를 포함하며, 상기 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM일 수 있다. 또한, 상기 용어 "항체"는 다클론항체 및 단일클론항체를 모두 포함하며, 키메릭 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체), 인간화 항체 및 이종결합항체(예를 들면, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함하는 의미이다.
본 발명에서, 용어 "키메릭 항체"는 가변 영역이 비-인간 종으로부터 유래하고, 불변 영역이 상이한 종(예를 들어, 인간)으로부터 유래하는 항체를 나타낸다.
본 발명에서, 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인 및 가변 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 갖도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 포함하도록 유전자 조작된 비-인간 항체를 의미한다. 상기 인간화 항체는 비-인간 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 상동성 인간 수용자 프레임워크 영역(FR) 상에 이식함으로써 제작될 수 있다.
본 발명에서, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 가변영역을 포함하는 항체 단백질로서 그 형태는 목적에 따라 변경하여 제작할 수 있다. 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 Fab 및 Fc 영역을 모두 갖는 전체 항체(whole antibody), 항체 단편 및 이들의 재조합 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편 및 재조합 항체는 Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv)2 등의 형태, 또는 이들을 Fc 영역과 연결한 형태일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "돌연변이"는 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 의미로, 바람직하게, 본 발명에서 돌연변이는 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 아미노산 잔기의 치환은 모체가 되는 야생형 단백질에 존재하는 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 번호 및 치환된 아미노산 잔기의 순서로 나타낸다.
항 트랜스페린 수용체 항체는 뇌혈관장벽에 다량 존재하는 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체이다. 상기 항 트랜스페린 수용체 항체는 수용체에 단단히 결합하여 엔도사이토시스(endocytosis, 세포내이입)는 잘 일어나는 반면, 엑소사이토시스(exocytosis, 세포외배출)가 일어날 때 수용체로부터 잘 떨어지지 않는 특징이 있다. 이로 인해 항 트랜스페린 수용체 항체가 뇌 안으로 들어가지 못하고 뇌혈관장벽 세포에 붙어 있게 되어 치료제 물질의 전달 효율이 떨어지는 문제가 발생한다.
본 발명에서는 인간 트랜스페린 수용체와 결합하여 엔도사이토시스가 일어나는 것으로 보고된 인간항체 128.1의 항원결합 영역을 이용하여 항체를 제작하고, 키메릭 항체(chimeric antibody) 뿐만 아니라 인간화 항체(humanized antibody) 제작시에도 뇌혈관장벽 투과도가 우수한 항체 및 돌연변이를 개발하였다. 본 발명에서 설계된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 뇌혈관장벽의 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)에 결합하여 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포막에 이입 가능하면서 엑소사이토시스(exocytosis)가 용이하다.
이에 따라 본 발명의 anti-hTfR 항체는 뇌혈관장벽 세포에 대한 트랜스사이토시스(transcytosis) 효율이 우수하여 뇌혈관장벽 세포에 잔류하지 않고 뇌 안으로 들어갈 수 있다. 또한, 본 발명의 anti-hTfR 항체와 신경세포 성장을 촉진하는 단백질을 다중특이적 항체 형태로 제작하면 뇌 전달 효과가 향상된 뇌질환 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따라 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는, 인간항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH) 및/또는 경쇄 가변영역(VL)을 바탕으로 한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서, 상기 인간항체 128.1의 가변영역의 아미노산 서열에서 번호 지정은 카밧(Kabat) 넘버링에 따른다. 도 1은 인간항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH)의 카밧(Kabat) 넘버링을 도시한 것으로, 이를 참조하면 인간항체 128.1의 중쇄 가변영역을 구성하는 각 아미노산의 번호를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 중쇄 가변영역(VH)은 인간항체 128.1 중쇄 가변영역으로부터 유래한 서열의 변이체일 수 있다. 상기 변이 대상이 되는 중쇄 가변영역 서열은 인간항체 128.1 중쇄 가변영역(서열번호 1) 또는 이의 인간화 서열로서, 상기 인간화 서열은 서열번호 2 내지 8 중 하나일 수 있다.
[서열번호 1] 키메릭 128.1 VH
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 2] 인간화 128.1 VH
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYSFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
[서열번호 3] 128.1 CDR + IGHV1-8*02 FR 서열 (H13)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTINWVRQATGQGLEWMGWINPHNGGTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 4] 128.1 CDR + IGHV1-18*01 FR 서열 (H15)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTISWVRQAPGQGLEWMGWINPHNGGTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTVTVSS
[서열번호 5] 128.1 CDR + IGHV1-18*03 FR 서열 (H16)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTISWVRQAPGQGLEWMGWINPHNGGTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDMAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 6] 128.1 CDR + IGHV1-18*03 FR 서열 (H17)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTISWVRQAPGQGLEWMGWINPHNGGTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 7] 128.1 CDR + IGHV1-18*03 FR 서열 (H19)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTISWVRQAPGQGLEWMGWINPHNGGTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDMAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 8] 128.1 CDR + IGHV1-18*03 FR 서열 (H20)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMHWVRQAPGQGLEWMGIINPHNGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
본 발명에 따른 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 경쇄 가변영역(VL)은 인간항체 128.1 경쇄 가변영역으로부터 유래한 서열일 수 있다. 상기 경쇄 가변영역의 서열은 인간항체 128.1 경쇄 가변영역(서열번호 9) 또는 이의 인간화 서열로서, 상기 인간화 서열은 서열번호 10 내지 19 중 하나일 수 있다.
[서열번호 9] 키메릭 128.1 VL
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTRLEIR
[서열번호 10] 인간화 128.1 VL
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTKLEIK
[서열번호 11] 128.1 CDR + IGKV1-5*02 FR 서열 (L2)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIICRASSSIDYLAWYQQKPGKAPKLLIYDTSSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 12] 128.1 CDR + IGKV1-16*01 FR 서열 (L7)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSIDYLAWFQQKPGKAPKSLIYDTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 13] 128.1 CDR + IGKV1-17*01 FR 서열 (L9)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSIDYLGWYQQKPGKAPKRLIYDTSSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 14] 128.1 CDR + IGKV1-17*02 FR 서열 (L10)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSIDYLGWYQQKPGKAPKRLIYDTSSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 15] 128.1 CDR + IGKV1-17*03 FR 서열 (L11)
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASSSIDYLAWFQQKPGKVPKRLIYDTSSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 16] 128.1 CDR + IGKV1D-13*01 FR 서열 (L12)
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSIDYLAWYQQKPGKAPKLLIYDTSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 17] 128.1 CDR + IGKV3-11*01 FR 서열 (L15)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSIDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSNRATGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 18] 128.1 CDR + IGKV3D-20*02 FR 서열 (L20)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSIDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQRNSYPWTFGQGTRLEIK
[서열번호 19] 128.1 CDR + PDB ID 3NFP 경쇄 FR 서열 (L21)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSSIDYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCHQRNSYPWTFGQGTKVEVK
상기 가변영역을 구성하는 아미노산 서열과 관련하여, 본 발명의 실시예에서는 상기 인간화 가변영역을 도입한 항체가 뇌혈관장벽에 대해 투과성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게 95% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 트랜스페린 수용체와 결합하여 엔도사이토시스가 일어난다고 보고된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-human transferrin receptor antibody) 128.1이 트랜스페린 수용체와 결합할 때 수용체의 당쇄부위와 상호작용하고, 이 상호작용이 트랜스페린 수용체의 구조를 변환시킨다는 것을 규명하였다. 또한, 이 구조변환을 조절하는 트랜스페린 수용체 돌연변이들이 항-인간 트랜스페린 수용체 항체의 뇌혈관장벽 통과효율을 향상시키는데 필수적이라는 것을 발견하였다.
본 발명에서는 이러한 당쇄 상호작용 부위의 항체 잔기들이 항체의 인간화를 위한 CDR grafting 부위와 인접하여 항체의 인간화와 뇌혈관장벽 통과 효율 최적화가 서로 연관되어 있다는 것을 밝히고, 이를 고려하여 인간화가 가능하면서도 뇌혈관장벽 통과 효율이 최적화된 신규 돌연변이를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는, 서열번호 1의 중쇄 가변영역(VH) 및 서열번호 2의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이의 인간화 항체에서, 중쇄 가변영역의 26번 아미노산(글라이신, G26), 28번 아미노산(세린, S28) 및 30번 아미노산(트레오닌, T30) 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 항 트랜스 페린 수용체 항체는 인간화 항체로서, 서열번호 2 내지 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 26번 아미노산(글라이신, G26), 28번 아미노산(세린, S28) 및 30번 아미노산(트레오닌, T30)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10 내지 19로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 G26, S28 및 T30 중 하나 이상은 각각 알라닌(A)을 제외한 아미노산, 즉 글라이신(G), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 라이신(K), 시스테인(C), 메티오닌(M), 티로신(Y), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 상기 G26, S28 및 T30 중 하나 이상은 각각 글루탐산(E), 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 또는 글라이신(G)으로 치환될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 G26은 글루탐산(E)으로 치환될 수 있고, S28은 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 또는 글라이신(G)으로 치환될 수 있으며, T30은 히스티딘(H)으로 치환될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 중쇄 가변영역은 G26E, S28H, S28N, S28G 및 T30H 중 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
또한, 상기 중쇄 가변영역은 상기 치환 외에 다른 아미노산의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 중쇄 가변영역에서 27번 아미노산(티로신, Y27)이 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 구체적으로 상기 중쇄 가변영역은 Y27H의 아미노산 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
상기 Y27H 돌연변이는 키메릭 128.1 항체의 뇌혈관장벽 투과도를 향상시킬 수 있으나, 상기 128.1 항체를 인간화한 경우에는 Y27H 돌연변이에 의한 투과도 향상 효과가 나타나지 않는 문제가 있었다. 본 발명에서는 상기와 같은 중쇄 가변영역 돌연변이를 도입하여 이와 같은 문제를 해결한 것으로, 단순한 항체-수용체 친화도 조절이 아니라 항체-수용체 당쇄 상호작용 및 이에 따른 수용체 구조변환을 이용하여 트랜스사이토시스 효율을 향상시킴으로써, 인간화 128.1 항체의 뇌혈관장벽 투과도를 크게 향상시킬 수 있다.
관련하여, 본 발명의 실시예에서는, 키메릭 항체에 Y27H 돌연변이를 도입하는 경우 뇌혈관장벽 투과도가 크게 향상되는 반면, 인간화 항체에 Y27H 돌연변이를 도입한 경우 투과도가 저하되는 현상이 나타났으나, G26E, S28H, S28N, S28G 및 T30H 중 하나 이상의 돌연변이를 도입하거나 Y27H 돌연변이에 상기 돌연변이를 추가 도입한 경우 뇌혈관장벽 투과도가 향상되는 결과를 확인하였다.
이에 따라, 본 발명에서 제공하는 돌연변이 항체는 뇌질환 치료에 사용할 수 있는 치료용 단백질, 항체 Fab 또는 저분자 화합물을 뇌 조직으로 효율적으로 전달하는데 사용할 수 있다. 이때 치료용 단백질 혹은 항체 Fab를 전달할 때는 한쪽 팔에는 돌연변이 항체, 다른 한쪽 팔에는 치료용 단백질/항체 Fab를 갖는 이중특이성 항체를 사용할 수 있고, 저분자 화합물을 전달할 때에는 돌연변이항체에 적절한 linker를 이용하여 저분자 화합물을 부착하여 항체-약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)를 만들어서 사용할 수 있다.
대부분의 암세포에는 트랜스페린 수용체가 과발현되어 있는데, 본 발명에서 제공하는 돌연변이 항체는 암세포 내부의 질환표적을 대상으로 하는 치료제를 암세포 내로 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있으므로 암 치료제 개발에도 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 돌연변이 항체는 트랜스사이토시스가 효과적이므로, 암세포 내부에서 엔도좀 탈출(endosome escape) 과정을 원활하게 하여 세포질 안의 질환 표적에 손쉽게 도달할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 이용한 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에서, 용어 "다중특이적 항체(multispecific antibody)"란 서로 다른 2종 이상의 항원 또는 수용체에 결합할 수 있는 항체, 예를 들어 이중특이적 항체(bispecific antibody), 삼중특이적 항체(trispecific antibody) 등을 포함하는 의미로서, 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명에서, 상기 다중특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)와 결합하는 하나 이상의 도메인(제1 결합 도메인) 및 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 다른 도메인(제2 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인과 상이한 1종 이상의 결합 도메인(다중 결합 도메인)을 더 포함하는 것도 가능하다. 이 경우, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인의 표적 외에 다른 표적 분자에도 결합하여 다양한 치료 전략을 제안할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "결합 도메인"은 항체 유래 단백질, 생체 유래 단백질 및 인공 설계된 상호작용 단백질을 모두 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, 상기 제2 결합 도메인 및 다중 결합 도메인은, 각각 독립적으로, 항체 유래 단백질 외에 생체 유래 단백질 또는 인공 설계된 상호작용 단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 다중특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체와 결합하는 제1 결합 도메인, 표적 분자에 결합하는 제2 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 이 경우 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 Fc 영역에 연결된 구조를 가질 수 있다. 또는, Fc 영역 유래 단백질이 아닌 링커를 이용하여 다중특이성을 갖도록 제작한 융합단백질도 본 발명의 다중특이적 항체의 범주에 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 다중특이적 항체는 한쪽 팔(제1 결합 도메인)에 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 가변영역 서열이 존재하고, 다른 한쪽 팔(제2 결합 도메인)에는 뇌질환 치료를 위한 표적 분자에 결합할 수 있는 치료용 단백질을 포함할 수 있다. 이로써, 본 발명의 다중특이적 항체는 제1 결합 도메인을 통해 인간 트랜스페린 수용체와 결합되고 트랜스사이토시스를 통해 뇌혈관장벽을 용이하게 통과하여, 제2 결합 도메인의 치료용 단백질을 뇌 조직에 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인은 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 영역으로, 그 형태는 목적에 따라 변경하여 제작할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인은 VH-CH1 및 VL-CL을 포함하는 Fab 형태, 이의 단편 및 재조합 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 결합 도메인은 Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv)2 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체에서, 상기 제1 결합 도메인의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)은 상술한 128.1 항체 유래의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 이에 따라, 제1 결합 도메인이 인간 트랜스페린 수용체를 통해 트랜스사이토시스를 효과적으로 유도하여 다중특이적 항체를 뇌 안으로 수송할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체에서, 상기 제2 결합 도메인은 표적 분자와 결합하는 단백질, 예를 들어 표적 분자에 결합하는 항체의 항원결합 영역, 또는 치료용 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 표적 분자와 결합되어 신경세포 성장을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 제2 결합 도메인에서, 표적 분자에 결합하는 항체의 항원결합 영역은 항원(표적 분자)의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 의미할 수 있다. 상기 항원결합 영역의 형태는 특별히 제한되지 않으며, Fab 형태 뿐만 아니라 sdAb, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv)2 등의 형태일 수 있다.
Fab 형태는 중쇄의 가변영역(VH) 및 불변영역(CH)의 CH1 도메인, 및 경쇄의 가변영역(VL) 및 불변영역(CL)을 포함하고, 상기 CH1 및 CL 사이에 이황화결합이 형성된 형태이다. 또한, sdAb 형태는 단일 도메인 가변 단편(single-domain variable fragment)을 의미하며, 하나의 가변영역 도메인을 의미한다.
한편, scFv 형태는 가변영역이 이어진 형태의 단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment)을 의미하는 것으로, VH 및 VL 영역을 펩타이드 링커(linker)로 연결한 재조합 도메인을 의미한다. 또한, di-scFv 형태는 두개의 scFv가 링커로 연결된 재조합 도메인을 의미한다. 상기 링커는 당해 기술 분야에 알려진 링커를 적절하게 사용할 수 있으며, 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 바람직하게, 상기 링커는 G, A, S, P, E, T, D 및 K로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 링커는 (GGGGX)n일 수 있으며, X는 A 또는 S인 것이 바람직하고, n은 1 내지 4의 자연수인 것이 바람직하다.
또한, dsFv 형태는 이황화-결합 가변 단편(disulfide-linked variable fragment)으로서 가변영역이 이어진 형태라는 점에서 scFv와 유사하나, VH 및 VL 영역을 링커가 아닌 이황화결합으로 연결한 재조합 도메인을 의미한다. (dsFv)2 형태는 두 개의 dsFv가 링커로 연결된 재조합 도메인을 의미한다.
상기 제2 결합 도메인의 표적 분자는 암치료용 표적단백질, 세포신호전달 단백질, 인간 인산화 효소 단백질, 인간 탈인산화 효소 단백질 등일 수 있다.
상기 제2 결합 도메인의 표적 분자는 콘드로이친 황산염(chondroitin sulfate), 베타 세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 감마 세크레타제(Gamma-secretase), 아밀로이드 베타(amyloid beta, Abeta), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 타우(tau), 아포지단백질 E4(apolipoprotein E4, ApoE4), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), CD20, 헌팅틴 단백질(Huntingtin protein), 프리온 단백질(prion protein, PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75 neurotrophin receptor, p75NTR), 카스파제 6(caspase 6), 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase) 등일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 신경세포 성장을 촉진하는 단백질로서 본 출원인의 대한민국 특허출원 제10-2021-0117865호에 기재된 PTPsigma (Protein Tyrosine Phosphatase sigma) 유래의 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 Fc 영역의 각 사슬에 연결된 형태를 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄불변영역 중 CH2 및 CH3 도메인(또는, CH2, CH3 및 CH4 도메인)을 포함하는 C-말단 영역을 의미하며, 야생형(wild-type) Fc 영역 및 그의 변이체를 포괄하는 의미로 사용된다. 상기 Fc 영역의 모체가 되는 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1일 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1 중쇄의 221번 잔기로부터 C-말단에 이르는 영역, 또는 상기 영역에 힌지를 더 포함하는 영역을 의미할 수 있다. Fc 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 인간 면역글로불린 중쇄 내의 잔기 번호를 정의하는 EU 넘버링에 따른다.
본 발명에서, 용어 "야생형 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 면역글로불린의 Fc 영역의 아미노산 서열과 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "Fc 영역의 변이체"는 야생형 Fc 영역과 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서, "Fc 변이체"로 약칭할 수 있다. 본 발명에서, 상기 Fc 변이체는 모체가 되는 야생형 Fc 영역 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역의 각 사슬은 IgG1의 중쇄 221 내지 447번 서열을 포함할 수 있다. 상기 IgG1의 중쇄 221 내지 447번 서열은 아래 서열번호 20의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.
[서열번호 20] IgG1 221-447
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
본 발명에서, 각 결합 도메인 및 Fc 영역은 0 내지 20개의 아미노산 잔기에 의해 연결될 수 있다. 즉, 상기 결합 도메인과 Fc 영역은 직접적으로 연결되거나, 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 링커(linker)를 통해 연결된 형태일 수 있다. 이 때, 각 결합 도메인은 Fc 영역의 N-말단, C-말단 또는 그 사이에 위치하는 아미노산에 연결될 수 있고, 바람직하게, N-말단에 연결될 수 있다.
예시적으로, Fc 영역의 이합체(이량체, dimer)의 두 N-말단 및 두 C-말단을 포함하는 4개의 결합 가능한 부위 중 1 내지 3부위에 제1 결합 도메인이 연결될 수 있고, 나머지 부위 중 하나 이상의 부위에 제2 결합 도메인이 연결될 수 있다. 또는, 제1 결합 도메인이 링커를 통해 제2 결합 도메인과 함께 연결된 다양한 오리엔테이션을 갖는 융합단백질을 제작하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서, Fc 영역에는 다중특이적 항체를 형성하기 위한 재조합 변이체가 형성될 수 있다.
예를 들어, 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인을 Fc 영역 이합체의 두 사슬에 각각 부착하는 경우, 재조합 변이체를 도입하여 이합체를 형성할 수 있다. 상기 이합체를 형성하기 위한 재조합 변이체로는 놉-인투-홀(knob-into-hole, KiH) 변이 또는 놉-인투-홀 다이설파이드(KiHss) 변이를 이용할 수 있다.
상기 놉-인투-홀 기술은 항체 단편의 중쇄 사이에 이종이합체 만이 형성되게 하기 위하여 설계된 기술이다. 여기에서, 놉(knob)은 반대측 사슬로 돌출된 측쇄를 가지도록 설계되어, 반대측 도메인의 홀(hole)에 삽입된다. 이로 인하여, 중쇄들은 측쇄 충돌로 인하여 동종이합체화(homodimerization) 될 수 없고, 이종이합체화(heterodimerization) 만이 가능하게 된다. 본 발명에서, Fc 영역을 구성하는 두개의 사슬 중 하나는 놉(knob) 구조를 갖고, 다른 하나는 홀(hole) 구조를 가질 수 있으며, 이 때 놉 또는 홀이 형성된 사슬을 각각 Fc-knob 또는 Fc-hole이라 지칭한다.
상기 Fc-knob은 Fc 영역을 구성하는 사슬에서 하나 이상의 아미노산을 트립토판(W), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)으로 구성된 군에서 선택되는 큰 아미노산으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, Fc-knob은 IgG1-Fc 중쇄 221 내지 447번 서열에 T366W 변이가 형성된 것일 수 있다.
상기 Fc-hole은 Fc 영역을 구성하는 사슬에서 하나 이상의 아미노산을 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 작은 아미노산으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, Fc-hole은 IgG1-Fc 중쇄 221 내지 447번 서열에 T366S, L368A 및 Y407V 변이가 형성된 것일 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시 형태에서, 다중특이적 항체는 Fab 형태의 제1 결합 도메인이 Fc-hole에 연결되고, 표적 분자에 결합하는 치료용 단백질을 포함하는 제2 결합 도메인이 Fc-knob에 연결된 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인을 각 Fc 사슬의 N-말단 및 C-말단(또는 그 반대)에 부착할 경우, Fc 동종이합체(homodimer)를 이용하여 다중특이적 항체를 제조하는 것이 가능하다. 이 경우 Fc 동종이합체 다중특이적 항체라 명명할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체에 결합하는 도메인을 통해 뇌혈관장벽을 용이하게 통과할 수 있고, 이로써 표적 분자와 결합하여 치료 효과를 발휘하는 도메인이 뇌에 효과적으로 전달되어 우수한 뇌질환 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 돌연변이 항체는 트랜스사이토시스가 효과적이므로, 이를 이용하면 암세포 내부의 질환표적을 대상으로 하는 치료제가 암세포 내로 효과적으로 전달될 수 있는바, 암 치료제 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 다중특이적 항체에는 약물 화합물이 접합되어, 항체-약물 결합체(antibody drug conjugate, ADC)를 형성할 수 있다.
상기 항체-약물 결합체는 인간 트랜스페린 수용체를 통한 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 트랜스사이토시스(transcytosis)를 이용하여 저분자 약물 화합물을 뇌 조직으로 전달하기 위한 것으로, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체에 약물 화합물을 부착하면 뇌혈관장벽을 통과하기 어려운 약물의 전달 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 약물은 항체 각 사슬의 C-말단 및/또는 N-말단 뿐 아니라 사슬 내의 아미노산 중 하나 이상의 잔기에 연결될 수 있다. 상기 약물은 적절한 링커(linker)를 이용하여 접합될 수 있다. 상기 약물로는 당해 기술 분야에 공지된 약물 화합물, 성장 억제제, 독소, 방사성 동위원소, miRNA, siRNA, shRNA 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 이를 이용한 다중특이적 항체 및 항체-약물 접합체는 약학 조성물 또는 바이오센서에 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 약학 조성물은 뇌질환 치료용일 수 있다. 본 발명의 돌연변이 항체는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체에 결합하는 도메인을 통해 뇌혈관장벽을 용이하게 통과할 수 있고, 이로써 표적 분자와 결합하여 치료 효과를 발휘하는 도메인이 뇌에 효과적으로 전달되어 우수한 뇌질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서, 상기 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury), 뇌졸중(Stroke), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시 형태에 따라 신경세포 성장을 촉진하는 단백질과 융합하여 제조된 다중특이적 항체를 이용하는 경우, 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury)과 같은 뇌질환의 예방 또는 질환에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 약학 조성물의 표적 질환은 암일 수 있다. 본 발명에 따른 돌연변이 항체는 트랜스사이토시스가 효과적이므로, 이를 이용하면 암세포 내부의 질환표적을 대상으로 하는 치료제가 암세포 내로 효과적으로 전달될 수 있는바, 암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 췌장암, 간암, 위암, 혈액암, 골수암, 뇌암, 폐암 및 피부암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 외에 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제 등의 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터페론, 항-S 단백질 단일클론 항체, 항-S 단백질 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라제 저해제 또는 siRNA 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001 내지 100㎎/㎏일 수 있다.
본 발명은 또한, 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 이를 이용한 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 약학 조성물을 유효량 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 이를 이용한 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 약학 조성물을 유효량 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 투여 대상은 개체(subject), 구체적으로는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체를 필요로 하는 개체일 수 있으며, 상기 개체는 동물일 수 있고, 통상적으로 포유동물일 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 제작 및 분석
1-1. 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 제작 방법
CDR grafting
항체의 인간화를 위하여 기존의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 128.1 VH 및 VL의 아미노산 서열과 NCBI 데이터베이스 상에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL 서열을 비교하였다. CDR grafting을 위해 AbYsis 프로그램을 이용하여 128.1 항체 서열의 CDR 영역과 FR 영역을 Kabat, IMGT 등의 방식으로 구분하였으며, 인간 항체 후보에 대하여도 동일한 작업을 수행하였다. 128.1 항체에서 분리된 CDR 영역의 아미노산 서열과 인간 항체 후보에서 분리된 FR 서열을 Kabat, IMGT 등의 방식에 따라 재조합하여 인간화 후보 서열을 제작하였다.
예상 모델 제작 및 아미노산 최적화
제작된 서열을 검토하여 인간화를 통해 불안정성이 유발될 수 있을 것으로 보이는 요소를 제거하였다. Biophi 프로그램을 통해 Vernier zone에 해당하는 아미노산을 찾아 인간화로 인해 해당 아미노산에 일어나는 변화를 검토하였다. 또한 AlphaFold 프로그램을 통해 인간화 예상 구조 모델 파일을 생성하였다. 생성된 모델 파일을 기반으로 구조적 불안정성을 유발할 수 있을 것으로 보이는 아미노산을 찾아내어 인간화 서열 설계에 반영하고, 최적화된 서열을 선별하였다. 인간화 서열의 출발이 되는 키메릭 128.1 VH 및 VL 야생형 서열과 실험에 사용한 인간화 서열은 다음과 같다.
키메릭 128.1 VH
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VL
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTRLEIR
인간화 128.1 VH
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYSFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VL
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTKLEIK
1-2. 항 트랜스페린 수용체 항체의 결정구조 규명 및 분석
인간화 항 트랜스페린 수용체 항체 및 키메릭 항 트랜스페린 수용체 항체 Y27H 돌연변이를 비교하여 결정구조를 규명하고 분석하였다.
유전자 클로닝
항 인간 트랜스페린 수용체 항체 128.1의 VH 서열과 VL 서열을 코딩하는 유전자 절편을 합성하였다(Bioneer). 중쇄와 경쇄의 가변영역을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하고, 이를 human IgG CH1 또는 CH1-Fc 영역과 His-tag를 중쇄 부분에 갖고 있고 human kappa chain CL을 경쇄 부분에 갖고 있는 pcDNA 3.1 / myc-His A 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다.
단백질 정제
항체 단백질을 expiCHO-STM (Thermo Fisher Scientific)에서 발현하였다. 세포배양은 125mL 엘렌마이어 세포배양 플라스크를 이용하여 humidified CO2 incubator에서 수행하였다. 항체 및 Fab 조각을 코딩하는 플라스미드를 트랜스펙션하기 위하여 ExpiFectamineTM CHO/plasmid DNA complexes를 만들어서 사용하였다. 트랜스펙션 후 10일차에 세포배양액을 harvest한 후 Hitrap Talon column (Cytiva)을 사용하여 단백질을 정제하였다.
상기 실험에서 정제된 인간화 항체 Fab의 SDS PAGE 결과를 도 2에 나타내고, 키메릭 Y27H 항체 Fab의 SDS PAGE 결과를 도 3에 나타내었다. SDS PAGE 결과에서, 좌측 두 개의 컬럼은 reduced 조건 결과이고, 우측 두 개의 컬럼은 non-reduced 조건 결과이다.
결정화 및 구조 규명
인간화 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 Fab 조각 결정을 sitting drop vapor diffusion 법으로 18℃에서 성장시켰다. 0.2M ammonium sulfate, 0.1M sodium acetate trihydrate pH 4.6, 24% polyethylene glycol 6,000 조성에 20% ethylene glycol을 포함한 solution으로 결정을 보호하여 X-선 회절 data를 획득하였다. X-선 회절 실험은 포항가속기 빔라인 7A에서 수행되었고 결정은 1.6Å의 해상도로 회절하였다.
키메릭 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 경우, 2M ammonium sulfate 조성에 30% glycerol을 포함한 solution으로 결정을 보호하여 X-선 회절 data를 획득하였다. X-선 회절 실험은 포항가속기 빔라인 7A에서 수행되었고 결정은 2.5Å의 해상도로 회절하였다.
인간화 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 Fab 조각 결정에 대한 회절데이터 처리 결과 space group 은 P21 이고 unit cell parameters는 a = 71.90Å, b = 84.82Å, c = 75.35Å, α = 90.00˚, β = 114.20˚, γ = 90.00˚로 확인되었다. 삼차구조는 PHENIX 프로그램을 이용하여 분자치환법으로 규명하였고 정밀화 하였다. 상기 인간화 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 Fab 조각 결정의 X-선 회절 자료 처리 통계 결과를 표 1에 나타내고, Fab 조각 결정의 삼차구조 정밀화 통계 결과를 표 2에 나타내었다.
Space group P21
a, b, c (Å) 71.90, 84.82, 75.35
α, β, γ (°) 90.00, 114.20, 90.00
Total number of reflections 301663
Unique reflections 98278
Resolution (Å) 29.01 - 1.63 (1.69 - 1.63)
Rmerge (%) 5.2 (17.1)
I/σ 14.11 (5.15)
CC1/2 0.997 (0.920)
Completeness (%) 95.95 (84.77)
Redundancy 3.1
Number of non-H atoms
Protein / non-protein		 6544 / 1145
Protein residues 858
Rwork / Rfree (%) 17.36 / 21.50
Aver. B-factor 17.3
Bond r.m.s.d.
lengths(Å) / angles(°)		 0.007 / 1.08
Ramachandran plot (%)
Favored / allowed / outliers		 97.40 / 2.48 / 0.12
키메릭 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 경우, 회절데이터 처리 결과 space group 은 P6122이고 unit cell parameters는 a = 113.26Å, b = 113.26Å, c = 210.26Å, α = 90.00˚, β = 90.00˚, γ = 120.00˚로 확인되었다. 삼차구조는 PHENIX 프로그램을 이용하여 분자치환법으로 규명하였고 정밀화 하였다. 상기 키메릭 항 인간 트랜스페린수용체 항체 Y27H 돌연변이 Fab 조각 결정의 X-선 회절 자료 처리 통계 결과는 표 3에 나타내고, Fab 조각 결정의 삼차구조 정밀화 통계 결과를 표 4에 나타내었다.
Space group P6122
a, b, c (Å) 113.26, 113.26, 210.26
α, β, γ (°) 90.00, 90.00, 120.00
Total number of reflections 346900
Unique reflections 29521
Resolution (Å) 34.96 - 2.46 (2.55 - 2.46)
Rmerge (%) 7.0 (50.6)
I/σ 22.40 (5.18)
CC1/2 0.999 (0.890)
Completeness (%) 99.45 (98.99)
Redundancy 11.8
Number of non-H atoms
Protein / non-protein		 3259 / 222
Protein residues 426
Rwork / Rfree (%) 20.73 / 24.20
Aver. B-factor 49.6
Bond r.m.s.d.
lengths(Å) / angles(°)		 0.008 / 1.01
Ramachandran plot (%)
Favored / allowed / outliers		 95.95 / 4.05 / 0.00
구조 분석
항체의 인간화가 항체의 구조에 어떠한 영향을 끼쳤는지 알아보기 위하여 항체의 구조에 대한 분석을 실시하였다. 항체의 VH, VL 부위와 CH1, CL1 부위 간의 유연성이 분석에 끼치는 영향을 막기 위하여 분석에는 VH, VL 부위만을 사용하였다.
인간화 항체에 대한 구조 분석 결과로서, 도 4a에 Fab 전체의 삼차구조를 나타내고, 도 4b에 인간화 이전 항체와 이후 항체의 구조 비교 결과를 나타내었다.
인간화 이전 항체와 이후 항체의 구조를 Pymol 프로그램을 이용하여 겹친 결과, 각 CDR은 서로 일치되는 형태를 나타내었다. 동일 프로그램으로 Cα 평균제곱근편차 (RMSD)의 평균값을 계산한 결과 그 값이 0.58Å로서 두 항체 간의 구조적 차이가 적음을 확인하였다.
또한, 키메릭 Y27H 돌연변이 항체에 대한 구조 분석 결과로서, 도 5a에 Fab 전체의 삼차구조를 나타내고, 도 5b에 야생형 항체와 Y27H 돌연변이 이후 항체의 구조 비교 결과를 나타내었다.
야생형 항체와 도입 이후 Y27H 돌연변이 항체의 구조를 Pymol 프로그램을 이용하여 겹친 결과, VH 상의 CDR 구조가 변화하였음이 나타났다. CDR-H1의 야생형 Y27 Cα와 돌연변이 Y27H Cα 간의 거리는 7.8Å으로서, 그 형태가 크게 변화하였다. 측면에 있는 CDR-H3도 변화를 나타내어 대표적으로 야생형 Y97 Cα에 비하여 돌연변이 Y97 Cα는 2.4Å 이동하였음을 확인하였다.
항체 친화도 측정
인간화 항체에 대하여, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-human TfR antibody)의 트랜스페린 수용체(TfR) 결합 친화도를 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 측정하였다. 인간 TfR (2.5㎍/ml)을 96-well half area plate (Corning)에 4℃에서 overnight 코팅하였다. 항체는 50nM에서 0.64pM으로 5-fold 희석해서 준비하였다. 희석은 5% 스킴 밀크가 들어있는 PBS (pH 7.5) (블로킹 버퍼와 동일)로 수행하였다. 플레이트는 PBS (pH7.5)로 3회 세척한 후 블로킹 버퍼로 블로킹을 실온에서 2시간 시행하고 몇 번 더 세척하였다.
여러 농도의 anti-TfR 항체를 well에 넣어서 2시간동안 결합을 유도하였다. 그 후 결합하지 않은 항체들은 PBST로 두 번 세척하고 PBS로 두 번 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 인간 IgG 항체 (anti-human IgG antibody, AB frontier)를 첨가하고 2시간 인큐베이션 하였다. 항체 세척 단계 이후에 TMB 용액 50㎕를 첨가하고 37℃에서 20분 인큐베이션 하였다. 마지막으로, 동일한 부피의 스톱 용액을 첨가하고 섞은 후 EMax 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. TMB 인큐베이션 이외의 단계들은 상온에서 시행하였다.
인간화 이전과 인간화 이후 항체가 트랜스페린 수용체에 대하여 갖는 친화도를 측정한 결과를 도 6에 나타내었으며, 이를 통해 두 항체가 트랜스페린 수용체에 대하여 유사한 친화도를 나타내는 것을 확인하였다.
1-3. 인간화 항체와 수용체의 구조 규명 및 돌연변이 설계
유전자 클로닝
인간 트랜스페린 수용체 단백질을 코딩하는 유전자 절편을 PCR을 통하여 증폭하였다(아미노산 121-760). 해당 유전자를 제한효소와 T4 라이게이스를 이용하여 human IgG Fc 영역의 유전자가 들어있는 pcDNA 3.1 / myc-His A 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 삽입하였고, 발현되는 단백질의 C-말단에 His-tag가 연결되도록 하였다. human IgG Fc와 트랜스페린 수용체 사이에는 HRV-3C 단백질분해효소 인지 서열을 삽입하였다.
단백질 정제
human IgG Fc 및 His-tag를 가진 인간 트랜스페린 수용체 단백질을 expiCHO-STM (Thermo Fisher Scientific)에서 발현하였다. 해당 재조합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 ExpiFectamineTM CHO 시약을 혼합하여 일시적 트랜스펙션을 실시하였다. 트랜스펙션 후 세포를 CO2 incubator에서 약 10일 배양하고 세포배양액을 원심분리로 분리하였다. 배양액을 HRV-3C 단백질분해효소와 incubation 하여 트랜스페린 수용체와 human IgG Fc 간의 연결을 끊고, Ni-NTA resin (QIAGEN)로 정제하여 트랜스페린 수용체 단백질을 획득하였다. 정제된 트랜스페린 수용체 단백질은 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 Fab 조각을 혼합한 후 크기배제 크로마토그래피를 실시하였다.
초저온 전자현미경 자료 획득 및 처리
인간 트랜스페린 수용체 단백질과 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 Fab 조각의 복합체를 glow-discharge 된 Quantifoil R1.2/1.3 그리드에 로딩한 후 Vitrobot Mark IV (FEI) 장치로 처리하여 시료를 준비하였다. Falcon4를 장착한 200kV Glacios 전자현미경으로 제작된 그리드를 촬영하여 이미지 자료를 획득하였다.
자료의 처리에는 CryoSPARC 프로그램을 이용하였으며, 반복적인 2D classification 및 non-uniform refinement 작업을 거쳐 최종적으로 4.39Å의 전자밀도지도를 생성하였다. 도 7에 2D classification을 통해 분류한 트랜스페린 수용체와 항체 복합체의 이미지를 나타내었으며, 도 8에 Fab (아래측)과 트랜스페린 수용체(상측)의 이량체 복합체의 구조를 나타내었다.
또한, 전자밀도지도에 기반한 삼차구조모델은 Coot과 PHENIX 프로그램을 사용하여 정밀화를 진행하였으며, 인간 트랜스페린 및 항 인간 트랜스페린수용체 항체 Fab 조각의 초저온 전자현미경 자료획득 결과를 표 5에 나타내고, 구조 정밀화 결과를 표 6에 나타내었다.
Magnification x120,000
Voltage (kV) 200
Electron exposure (e-/Å2) 50
Defocus range (μm) -1.5 ~ -2.5
Pixel size (Å) 0.894
Symmetry C2
Initial particle image (no.) 5,838,242
Final particle image (no.) 278,400
Map resolution (Å) 4.39 (FSC=0.143)
Model resolution (Å) 4.6 (FSC=0.5)
Map sharpening B-factor (Å2) -332
Model composition
atoms / protein residues / glycans		 13818 / 1728 / 18
B factors (Å2)Protein / glycan 119 / 234
Bond r.m.s.d.lengths (Å) / angles (°) 0.003 / 0.672
Molprobity score 2.04
Ramachandran plot (%)
Favored / allowed / outliers		 92.19 / 7.46 / 0.35
구조 분석
트랜스페린 수용체와 항체의 복합체 구조를 통하여 항체의 돌연변이가 트랜스페린 수용체에 미치는 영향에 대하여 분석하였다.
이를 살펴보기 위하여 항체가 결합한 트랜스페린 수용체 복합체의 구조와 기존에 규명된 트랜스페린 수용체의 구조를 Secondary structure matching superpose 방식으로 겹쳐서 비교하였다.
도 9a에 항체 가변부위와 트랜스페린 수용체 당쇄의 상호작용 부위에 있는 Ser28의 Cα를 기준으로 히스티딘 잔기의 범위를 반지름으로 하는 구체를 표시하였으며, 도 9b에 기존에 구조가 규명된 트랜스페린 수용체의 구조와 항체가 결합한 구조 비교 결과를 나타내었다.
비교 결과, 항체가 결합한 트랜스페린 수용체 복합체에서 트랜스페린 수용체 이량체의 구조가 여타 구조에 비하여 너비가 넓음이 관측되었다. 특히 복합체 구조에서는 항체가 트랜스페린 수용체의 당쇄부분과 상호작용하는 예측하지 못한 결과가 나타났으며, 항체의 결합이 트랜스페린 수용체 전체의 구조에 영향을 미치고 있음이 관측되었다.
기존 돌연변이(Y27H)의 경우 당쇄 상호작용 부위에 존재하여 당쇄와 트랜스페린 수용체의 구조변화를 일으킨 것으로 해석되고, 이러한 트랜스페린 수용체의 구조변화가 트랜스사이토시스 과정의 BBB 통과 효율을 증대시킨 것으로 해석된다. 그러나 Y27H의 경우 소수성 잔기인 티로신이 원래 단백질 안쪽에 위치해 있다가 히스티딘으로의 치환에 의해 표면에 돌출되면서 항체가 불안정화 되고, 인간화 과정에서 CDR grafting 부위와의 중첩으로 인해 항체 구조변형이 심화되어, 인간화 항체의 Y27H 돌연변이는 BBB 통과를 방해할 수 있다.
항체가 당쇄에 미치는 영향과 트랜스페린 수용체 구조 변화의 연관성을 알아내기 위하여, 초저온현미경에서 선명하게 관측되지 않은 당쇄 부위를 추가적으로 모델링한 결과를 도 10에 나타내었다.
모델링 결과, 트랜스페린 수용체의 당쇄가 트랜스페린 수용체 이량체의 사이 공간을 상당 부분 점유할 것임이 드러났으며, 항체가 결합할 경우 이량체 사이 공간의 바깥쪽으로 당쇄가 움직이는 것이 제한되어 음성 전하를 가진 당쇄 간의 반발력으로 인해 트랜스페린 수용체 이량체의 구조에 변화가 올 수 있음을 예상할 수 있었다. 따라서 당쇄에 미치는 영향을 증대시키는 돌연변이의 도입이 트랜스페린 수용체 이량체의 구조에 더 큰 영향을 끼칠 수 있음을 설명하였다.
돌연변이 설계 및 분석
기존 돌연변이 Y27H의 경우, 인간화를 하지 않고 키메릭 항체 형태로 적용할 때는 유용한 돌연변이로 사용될 수 있다. 그러나 임상에서 부작용을 최소화하기 위해서는 인간화가 바람직하며, 이를 위하여 상기 구조정보를 종합하여 당쇄구조와 트랜스페린 수용체의 구조를 트랜스사이토시스에 유리하게 변형시키면서도 인간화의 CDR grafting에 영향을 미치지 않는 돌연변이들을 설계하고 스크리닝하였다. 설계된 돌연변이 서열은 다음과 같다. 서열번호 지정은 Kabat numbering을 이용하였고, 인간화 128.1 서열에서 돌연변이된 부분은 밑줄로 표시하였다.
중쇄(heavy chain) 신호펩타이드(signal peptide) 서열:
MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
경쇄(light chain) 신호펩타이드(signal peptide) 서열:
MDFQVQIFSFLLISASVILSR
인간화 128.1 VH G26E 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASEYSFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH S28H 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYHFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH S28N 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYNFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH G26E S28H 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASEYHFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH G26E S28N 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASEYNFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH G26E T30H 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASEYSFHGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH Y27H S28H 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGHHFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH Y27H S28G 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGHGFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH T30H 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYSFHGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 128.1 VH Y27H 돌연변이 서열:
EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGHSFTGYTMNWVKQKPGQGLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTTLTVSS
인간화 항체에서 BBB 투과도가 향상되는 돌연변이들은 키메릭 항체 형태로 사용될 수도 있으며, 이때의 서열은 다음과 같다. 서열번호 지정은 Kabat numbering을 이용하였고, 키메릭 128.1 서열에서 돌연변이된 부분은 밑줄로 표시하였다.
키메릭 128.1 VH G26E 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASEYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH S28H 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYHFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH S28N 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYNFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH G26E S28H 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASEYHFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH G26E S28N 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASEYNFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH G26E T30H 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASEYSFHGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH Y27H S28H 돌연변이 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGHHFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH Y27H S28G 돌연변이 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGHGFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
키메릭 128.1 VH T30H 돌연변이 서열:
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGHSFHGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
1-4. 인간배아 항체서열을 이용한 인간화 항체 제작 및 친화도 분석
기존의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 128.1 가변 영역의 아미노산 서열의 인간화를 위하여, IgBLAST 프로그램을 통하여 유사한 항체 germline 서열을 선별하고 Protein Data Bank 상에서 128.1 가변 영역의 아미노산 서열과 유사한 항체를 찾아 선별하였다. 그 중, V gene 및 J gene을 고려하여 마우스와 사람 단백질 서열의 유사성이 높은 아미노산 서열을 선별하였다.
각 서열 가변 영역의 프레임워크 영역(FR)과 항체 128.1의 상보적 결정 영역(CDR)을 조합한 뒤 유전자를 합성하여 pcDNA 3.1 / myc-His A 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 본 실시예에서는 IMGT 방식의 CDR 영역 정의를 사용하였다. 본 실시예와 비슷한 인간화 서열 선별 원칙을 적용하여 Kabat 방식의 CDR 영역 정의를 사용하는 것도 가능하다. 또한 경우에 따라 IMGT 방식과 Kabat 방식을 혼합하는 것도 가능하다.
96웰 플레이트에서 배양한 expiCHO-STM (Thermo Fisher Scientific)에 경쇄와 중쇄 벡터의 조합들을 일시적으로 트랜스펙션하여 항체의 발현을 시도하였다. 각 웰의 배지를 TfR 단백질을 코팅한 96웰 플레이트에 옮겨 담아 ELISA 기법을 통하여 TfR과의 결합 능력을 가지는 항체가 발현하는지 평가하였다. TfR과 결합한 항체를 감지하여 발생한 흡광도 신호의 세기를 항체의 프레임워크 서열에 따라 표시하면 도 11과 같다.
ELISA에서 관측된 신호의 세기가 야생형(WT) 항체 신호 세기의 절반 수준을 넘는 19개 항체를 선별하였다. 해당 항체를 expiCHO-STM 세포 25mL 배양액에서 증량하여 발현한 뒤 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제를 실시한 결과, 프레임워크(FR) 서열이 L2+H19, L7+H13, L9+H15, L10+H16, L11+H13, L11+H17, L12+H20, L15+H20, L20+H13 및 L21+H13에서 유래한 10개 항체가 발현 및 정제 과정에서 안정하였다. 해당 항체를 대상으로 TfR 단백질에 대한 친화도를 측정한 결과를 도 12에 나타내었으며, 상기 친화도 분석 결과로부터 상기 선별된 인간화 항체가 TfR 단백질에 대해 친화도를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 1: 뇌혈관장벽(BBB) 통과 assay
제조예 1에서 제작된 인간화 항체, 키메릭 항체 및 돌연변이 항체에 대하여 뇌혈관장벽 통과 분석을 수행하였다.
인간 뇌의 일차 미세혈관 내피세포(primary microvascular endothelial cells, hBMEC)를 Cell systems (ACBRI 376)에서 구매하여 사용하였다. T-75 플라스크를 세포배양에 사용전에 Attachment FactorTM (Cell systems)로 코팅하였다. 37℃에서 미리 데워놓은 Attachment FactorTM (5mL)를 T-75 플라스크에 넣고 10초 후에 제거하였다. 세포를 녹이고 80 - 90 % confluence까지 CultureBoostTM (Cell systems)로 보충한 Complete Classic 배양액(Cell systems)을 사용하여 37℃, 5% CO2의 습도 유지된 인큐베이터에서 길렀다. 그 후 미리 데워놓은 PBS 로 세척하고 트립신-EDTA를 넣은 다음, 5분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 5분 후에 차가운 complete culture 배양액을 넣어서 트립신을 불활성화시켰다. 세포 서스펜션을 15mL 코니컬 튜브에 옮기고 900g, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 배양액 상층부를 따라 버리고 세포를 37℃의 보충된 배양액에 재현탁(resuspension)하였다.
인비트로(in vitro) BBB 모델을 형성하는데 트랜스웰 인서트(transwell inserts, 24-well, 0.4㎛ filter, SPL)를 사용하고, 인서트를 Attachment FactorTM로 상술한 바와 같이 코팅하였다. 상기와 같이 얻어진 hBMEC cell 들을 트랜스웰 플레이트의 위쪽 챔버(upper chamber)에 20 x 103 cells/well로 시딩(seeding)하고 48시간 동안 인큐베이션하였다.
침투성(permeability)을 검증하기 위하여, HRP-부착 control IgG를 위쪽 챔버에 첨가하고 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후에 위쪽 챔버(upper chamber)와 아래쪽 챔버(bottom chamber)의 배양액을 회수하였다. TMB 용액을 첨가하여 침투한 control IgG를 정량적으로 측정하였다. 침투성 확인 후에 신선한 보충 complete 배양액에 들어 있는 항체들을 위쪽 챔버에 완충액 반을 치환하는 방식으로 넣은 후 37℃에서 인큐베이션 하고, 아래쪽 챔버의 배양액을 4시간 인큐베이션 후에 회수하였다. 항 인간 IgG 항체(anti-human IgG)로 코팅한 플레이트를 이용한 샌드위치 ELISA로 침투한 항체를 측정하여 뇌혈관장벽 투과도를 분석하였다.
아래 표 7은 제조예 1-1 내지 1-3에서 제작된 키메릭 항체, 인간화 항체 및 이들의 돌연변이에 대한 투과도 실험 결과를 나타낸 것이다.
사슬명 돌연변이 투과도
hz-VH G26E ++++
hz-VH S28H +++++
hz-VH S28N ++++
hz-VH G26E S28H +++
hz-VH G26E T30H ++++
hz-VH Y27H S28H +++
hz-VH Y27H S28G +++
hz-VH T30H +++
hz-VH Y27H +
ch-VH Y27H ++++
hz-VH none ++
ch-VH none ++
control 항체 none none
실험 결과, 인간화 이전 항체(키메릭 항체)와 인간화 항체의 뇌혈관장벽 세포 통과량을 측정했을 때 두 항체가 유사한 성질을 나타냄이 확인되었다. 한편, 키메릭 또는 인간화 항 트랜스페린 수용체 항체 야생형과 이의 Y27H 돌연변이가 뇌혈관장벽 세포를 통과하는 양을 측정한 결과, 키메릭 항체 VH 사슬(ch-VH)에서는 Y27H 돌연변이에 의해 투과도가 크게 상승하지만, 인간화 항체 VH 사슬(hz-VH)에서는 오히려 Y27H 돌연변이에 의해 투과도가 감소하는 결과가 나타났다.
반면, 본 발명에 따라 26번, 28번 및/또는 30번 잔기의 돌연변이를 도입하는 경우, 인간화 항체 상태에서도 뇌혈관장벽의 투과도가 크게 향상되는 결과가 나타났다. 이에 따라, 본 발명을 이용하면 뇌혈관장벽 투과도가 우수한 인간화 항 트랜스페린 수용체 항체를 제작할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 제조예 1-4에서 확인한 바와 같이 TfR과의 결합 능력이 나타나는 항체가 인간 뇌의 일차 미세혈관 내피세포(primary microvascular endothelial cells; Cell system; ACBRI 376)를 투과하는 능력을 측정하였다.
도 13은 상기 뇌혈관세포 투과능 분석 결과를 나타낸 그래프로서, L2+H19, L9+H15, L10+H16, L20+H13, L21+H13 등으로부터 유래한 프레임워크 영역을 갖는 항체가 일차 미세혈관내피세포에 대한 통과 활성을 나타내었다. 이와 같이 통과 활성이 나타나는 항체의 경우 기능을 상실하지 않고 인간화가 이루어진 것으로 판단하였는바, 128.1 항체의 인간화 서열로서 해당 서열의 이용이 가능함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 서열을 포함하며, 상기 서열번호 1의 26번 아미노산(글라이신, G26), 28번 아미노산(세린, S28) 및 30번 아미노산(트레오닌, T30) 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 중쇄 가변영역(VH); 및
    서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)
    을 포함하는, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 인간화 서열이 서열번호 2 내지 8로 구성된 군에서 선택되며,
    상기 서열번호 9의 아미노산 서열의 인간화 서열이 서열번호 10 내지 19로 구성된 군에서 선택되는, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 G26, S28 및 T30 중 하나 이상이 각각 글라이신(G), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 라이신(K), 시스테인(C), 메티오닌(M), 티로신(Y), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로 치환된, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 G26, S28 및 T30 중 하나 이상이 각각 글루탐산(E), 히스티딘(H), 아스파라긴(N) 또는 글라이신(G)으로 치환된, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 치환이 G26E, S28H, S28N, S28G 및 T30H 중 하나 이상을 포함하는, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체에 하나 이상의 약물 화합물이 접합된, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  7. 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)와 결합하는 하나 이상의 제1 결합 도메인 및 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체로서,
    상기 제1 결합 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 서열을 포함하며, 상기 서열번호 1의 26번 아미노산(글라이신, G26), 28번 아미노산(세린, S28) 및 30번 아미노산(트레오닌, T30) 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는, 다중특이적 항체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인의 표적 분자가 콘드로이친 황산염(chondroitin sulfate), 베타 세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 감마 세크레타제(Gamma-secretase), 아밀로이드 베타(amyloid beta, Abeta), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 타우(tau), 아포지단백질 E4(apolipoprotein E4, ApoE4), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), CD20, 헌팅틴 단백질(Huntingtin protein), 프리온 단백질(prion protein, PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75 neurotrophin receptor, p75NTR), 카스파제 6(caspase 6) 또는 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase)인, 다중특이적 항체.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인이 Fab, scFv, di-scFv, dsFv 및 (dsFv)2로 구성된 군에서 선택되는 형태인, 다중특이적 항체.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 Fc 영역에 연결된, 다중특이적 항체.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 항체에 하나 이상의 약물 화합물이 접합된, 다중특이적 항체.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체를 포함하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 뇌질환이 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury), 뇌졸중(Stroke), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 암이 췌장암, 간암, 위암, 혈액암, 골수암, 뇌암, 폐암 및 피부암으로 구성된 군에서 선택되는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2024/000764 2023-01-16 2024-01-16 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물 WO2024155066A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20230006283 2023-01-16
KR10-2023-0006283 2023-01-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024155066A1 true WO2024155066A1 (ko) 2024-07-25

Family

ID=91956213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2024/000764 WO2024155066A1 (ko) 2023-01-16 2024-01-16 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240114715A (ko)
WO (1) WO2024155066A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160011198A (ko) * 2013-05-20 2016-01-29 제넨테크, 인크. 항-트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법
KR20180020169A (ko) * 2015-06-24 2018-02-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 조정된 친화도를 갖는 항-트랜스페린 수용체 항체
KR20180020277A (ko) * 2015-06-24 2018-02-27 제이씨알 파마 가부시키가이샤 혈액뇌관문을 통과하는 항인간 트랜스페린 수용체 항체
US20200325237A1 (en) * 2018-12-21 2020-10-15 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160011198A (ko) * 2013-05-20 2016-01-29 제넨테크, 인크. 항-트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법
KR20180020169A (ko) * 2015-06-24 2018-02-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 조정된 친화도를 갖는 항-트랜스페린 수용체 항체
KR20180020277A (ko) * 2015-06-24 2018-02-27 제이씨알 파마 가부시키가이샤 혈액뇌관문을 통과하는 항인간 트랜스페린 수용체 항체
US20200325237A1 (en) * 2018-12-21 2020-10-15 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Thesis", 1 January 2021, GRADUATE SCHOOL OF HANYANG UNIVERSITY, Korea, article JANG, HYE HYEON: "Affinity engineering of anti-human transferrin receptor antibody for drug delivery across the blood-brain barrier", pages: 1 - 47, XP009557406 *
DATABASE Protein 9 February 2022 (2022-02-09), ANONYMOUS: "Chain H1, Fab ch128.1 heavy chain", XP093192823, retrieved from NCBI Database accession no. 6WLA_H1 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240114715A (ko) 2024-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014084607A1 (ko) 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도
WO2016137108A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2018194381A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2015058573A1 (zh) 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2019107812A1 (ko) 세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 항체 및 이의 용도
WO2014090053A1 (zh) 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2017065484A1 (ko) 효모접합을 이용한 항체 ch3 도메인 이종이중체 돌연변이쌍 제조방법 및 이에 의하여 제조된 ch3 돌연변이체 쌍
WO2020251316A1 (ko) α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도
WO2020080854A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2022177394A1 (ko) Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2021071319A1 (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
WO2021020846A1 (en) Anti-her2/anti-4-1bb bispecific antibody and use thereof
WO2019045477A1 (ko) 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
WO2012137993A1 (en) Antibodies against angiopoietins 1 and 2, and their use
WO2024155066A1 (ko) 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물
WO2021020845A1 (en) Anti-egfr/anti-4-1bb bispecific antibody and use thereof
WO2023287212A1 (ko) 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
WO2022240159A1 (ko) 항-tigit 항체 및 이의 용도
WO2021101349A1 (ko) Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 및 그 용도
WO2022145739A1 (en) Humanized antibody specific for cd22 and chimeric antigen receptor using the same
WO2023287238A1 (ko) 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물
WO2020209645A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24744846

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1