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WO2024153185A1 - 包含bcl-2家族蛋白降解剂的抗体药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

包含bcl-2家族蛋白降解剂的抗体药物偶联物及其制备方法和用途 Download PDF

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Publication number
WO2024153185A1
WO2024153185A1 PCT/CN2024/073029 CN2024073029W WO2024153185A1 WO 2024153185 A1 WO2024153185 A1 WO 2024153185A1 CN 2024073029 W CN2024073029 W CN 2024073029W WO 2024153185 A1 WO2024153185 A1 WO 2024153185A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
mmol
antigen
cancer
ala
Prior art date
Application number
PCT/CN2024/073029
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
蔡家强
肖亮
薛彤彤
宋帅
Original Assignee
苏州宜联生物医药有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 苏州宜联生物医药有限公司 filed Critical 苏州宜联生物医药有限公司
Publication of WO2024153185A1 publication Critical patent/WO2024153185A1/zh

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4155—1,2-Diazoles non condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
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    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present disclosure belongs to the field of medical technology, and relates to an antibody-drug conjugate, a compound, a drug-linker conjugate comprising a BCL-2 family protein degrader, and a preparation method thereof, as well as the use thereof in preventing and/or treating diseases associated with abnormal cell activity, including but not limited to preventing and/or treating tumor diseases.
  • the BCL-2 protein family is one of the core regulatory mechanisms of apoptosis (also called programmed cell death). It can receive and transmit intrinsic intracellular signals or external environmental stress signals, such as nutritional or hypoxic stress, DNA damage, excessive activation of oncogenes, endoplasmic reticulum stress, etc., and mainly plays a leading role in the intrinsic apoptosis pathway.
  • intrinsic intracellular signals or external environmental stress signals such as nutritional or hypoxic stress, DNA damage, excessive activation of oncogenes, endoplasmic reticulum stress, etc.
  • One subclass is antagonistic to cell apoptosis, including 6 proteins, namely BCL-XL, BCL-2, BCL-W, Mcl-1, BCL-B and Bfl-1, which are mainly located on mitochondria to protect mitochondria from adversity damage.
  • the other two subclasses promote cell apoptosis, and one subclass is the final executor of mitochondrial damage, including Bax and Bak.
  • the rest are all classified as BH3-only subclasses, which can directly sense various cell adversity stress signals.
  • the interaction between BCL-2 family proteins that antagonize and promote apoptosis determines the fate of cells. About 50% of tumors have abnormal overexpression of BCL-2 family proteins that antagonize apoptosis, which is an important component of resistance to chemotherapy, radiotherapy, targeted therapy and other therapies.
  • ABT-199 a highly selective inhibitor of BCL-2
  • Hypomethylating agents such as the DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine
  • 5-azacytidine can reduce the expression of Mcl-1 in AML cells, thereby synergizing with selective BCL-2 inhibitors.
  • BCL-XL protein is highly expressed in a variety of blood tumors and solid tumors
  • the synergistic inhibition of BCL-XL, BCL-2 and MCL-1 can further overcome the drug resistance of ABT-199 and can be used for the treatment of solid tumors.
  • preclinical studies of Navitoclax ABT-263 found that it showed good activity in small cell lung cancer cell lines and mouse models.
  • the inhibition of BCL-XL has strong hematological toxicity and side effects.
  • the clinical trial of ABT-263 was not successful.
  • the BCL-XL protein degrader designed using the protac principle can effectively avoid the impact on platelet production (Weizhou Zhang, NATURE COMMUNICATIONS, 2021, 12, 1281), and is used for tumor treatment, such as acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, leukemia, lymphoma, esophageal cancer, lung cancer (such as small cell lung cancer, non-small cell lung cancer and lung adenocarcinoma), bladder cancer, gastric cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer, endometrial cancer, colon cancer, liver cancer, kidney cancer, non-Hodgkin's lymphoma, central nervous system tumors (such as glioma, glioblastoma multiforme, glioma or sar
  • ADC drugs combine the tumor targeting effect of antibodies with the high activity of bioactive molecules, becoming a biological missile with highly anticipated efficacy and safety advantages.
  • Antibodies guide ADCs to bind to target cells, achieve tumor tissue enrichment, and reduce non-target tissue exposure.
  • the bound ADCs are then internalized by cells, and small molecule drugs are released through enzymatic hydrolysis under the action of specific enzymes in cells to treat diseases.
  • ADCs composed of small molecule BCL-2 family protein degraders and tumor-targeted antibodies can achieve tumor enrichment, while utilizing the catalytic degradation activity of BCL-2 family protein degraders at low concentrations to achieve the therapeutic effect of BCL-XL degraders, while eliminating or reducing the toxic side effects caused by BCL-2 family protein inhibitors acting on non-disease tissues, thereby improving the therapeutic effect.
  • the present disclosure provides an antibody-drug conjugate comprising a BCL-2 family protein degrader, and a preparation method and use thereof.
  • the present disclosure provides an antibody drug conjugate as shown in Formula I,
  • Tb is an antibody or an antigen-binding fragment thereof
  • q is the drug-antibody coupling ratio
  • L is a linker
  • D is a chimeric fragment targeting degradation of BCL-2 family proteins.
  • the BCL-2 family protein degradation targeting chimera is selected from: selective and non-selective BCL-2 protein degradation targeting chimera, BCL-xl protein degradation targeting chimera and MCL-1 protein degradation targeting chimera.
  • the BCL-2 family protein degradation targeting chimera comprises a BCL-2 family protein binding portion and a ubiquitinating enzyme binding portion.
  • the ubiquitinase binding moiety is selected from the group consisting of an E1 ubiquitin activating enzyme, an E2 ubiquitin conjugating enzyme, and an E3 ubiquitin ligase binding moiety.
  • D has a structure shown in Formula I and is connected to the linker L via its hydroxyl or amine group;
  • B is a BCL-2 family protein binder fragment
  • Z is the connecting part between B and A
  • A is an E3 ubiquitin ligase binding fragment, which binds to the E3 ubiquitin ligase.
  • B is a structural unit of formula I-1 or I-2, wherein formula I-1 is:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are each independently selected from H, NH 2 , OH, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C3-6 cycloalkyl and Y 1 -Y 2 ;
  • Y 1 is selected from a direct bond, a C1-6 alkyl group, a C1-6 alkoxy group, a C2-6 alkenyl group and a C2-6 alkynyl group;
  • Y2 is selected from -OR5a , -NR5aR5b , Bit 1 is connected to Y 1 ;
  • Each M is independently selected from a direct bond, -CR 6a R 6b -;
  • R 5a , R 5b , R 6a , R 6b are each independently selected from H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C3-6 cycloalkyl;
  • R 6 is selected from RcSO 2 -, -NO 2 ;
  • R c is selected from C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C3-6 cycloalkyl;
  • n is selected from any integer between 0 and 6;
  • Bit 1 is connected to Z
  • Y3 is selected from a direct bond, -O-, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C3-6 cycloalkyl, 4-10 membered heterocyclyl, C6-10 aryl, 5-10 membered heteroaryl;
  • Y 4 is selected from a direct bond, NH 2 , a 4-10 membered heterocyclyl, a C6-10 aryl, a 5-10 membered heteroaryl, wherein the 4-10 membered heterocyclyl, the C6-10 aryl, the 5-10 membered heteroaryl is optionally substituted by one or more NH 2 , OH, halogen;
  • x is 0 or 1.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently selected from H, NH 2 , fluorine, chlorine, bromine, C 1-4 alkyl,
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently selected from H, NH 2 , chloro, methyl,
  • R 1 and R 2 are each independently selected from H, NH 2 , halogen, or
  • R 1 and R 2 are each independently selected from H, NH 2 , chloro,
  • R 1 is H, NH 2 , or halogen, preferably halogen.
  • R 1 is H, NH 2 , or chlorine, preferably chlorine.
  • R 2 is H, or NH 2 , preferably hydrogen.
  • R 3 and R 4 are each independently H, C1-4 alkyl,
  • R 3 and R 4 are each independently selected from H, methyl,
  • R 3 is C 1-4 alkyl.
  • R 3 is methyl
  • R 4 is C1-4 alkyl, Preferably, it is C1-4 alkyl, or More preferably
  • R4 is methyl, Preferably, methyl, More preferably, it is methyl, or More preferably
  • R 5 is H, or Y 1 -Y 2 ; wherein Y 1 is a direct bond; Y 2 is Preferably
  • R5 is H.
  • R 6 is RcSO 2 —.
  • Y 1 is selected from C1-4 alkyl, C1-4 alkoxy, C2-4 alkenyl, C2-4 alkynyl.
  • Y 1 is C 1-4 alkyl.
  • Y 1 is -CH 2 -.
  • Y 2 is selected from -OH, -NH 2 , Bit 1 is connected to Y 1 .
  • Y 2 is NH 2
  • Bit 1 is connected to Y 1 .
  • Y2 is Bit 1 is connected to Y 1 .
  • Y2 is Bit 1 is connected to Y 1 .
  • M is selected from a direct bond and CH 2 .
  • R 5a , R 5b , R 6a , R 6b are each independently selected from H and C 1-4 alkyl.
  • R 5a , R 5b , R 6a , R 6b are each independently selected from H and methyl.
  • R c is selected from C1-4 alkyl, C1-4 haloalkyl, C1-4 alkoxy, C3-6 cycloalkyl.
  • R c is C1-4 haloalkyl, preferably C1-2 haloalkyl, more preferably halomethyl.
  • R c is selected from methyl and trifluoromethyl.
  • R c is trifluoromethyl
  • m is selected from 0, 1, 2, 3.
  • m is 1 or 2, preferably 1.
  • Y 3 -Y 4 is
  • the C1-6 alkyl group is each independently a C1-4 alkyl group, preferably a C1-2 alkyl group, and more preferably a methyl group.
  • the halogen is each independently preferably fluorine, chlorine or bromine, more preferably chlorine.
  • the halogen in the haloalkyl group is independently preferably fluorine, chlorine or bromine, more preferably fluorine.
  • B is a structural unit of formula I-1.
  • B is a structural unit of formula I-1
  • R 1 is H, NH 2 , or halogen;
  • R 2 is H, or NH 2 ;
  • R 3 is C1-4 alkyl;
  • R 4 is C1-4 alkyl,
  • R 5 is H, or Y 1 -Y 2 ;
  • Y 1 is a direct bond, Y 2 is Position 1 is connected to Y 1 ;
  • R 6 is RcSO 2 -;
  • R c is C1-4 haloalkyl;
  • m is 1 or 2;
  • R 5a and R 5b are each independently selected from H and C1-4 alkyl.
  • B is selected from the following structures, and position 1 is connected to Z:
  • Z is selected from Bit 1 is connected to B, bit 2 is connected to A;
  • W and V are each independently selected from
  • Positions 1 and 2 can be connected to their adjacent atoms respectively;
  • M 1 , M 2 and M 3 are each independently selected from a direct bond, -O-, -S-, -NR-, -CR 2 -, C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, C1-6 alkoxy, 4-10 membered heterocyclyl, 6-12 membered spirocyclyl, 6-12 membered paracyclyl, C6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, and M 1 , M 2 and M 3 are the same or different at each occurrence;
  • R is selected from H, C1-4 alkyl
  • q1, q2, q3, q4 and q5 are each independently selected from any integer between 0 and 20.
  • W and V are each independently
  • M 1 , M 2 and M 3 are each independently C 1-6 alkyl.
  • M 1 , M 2 and M 3 are each independently selected from -O-, -S-, -CR 2 -, -CH 2 CH 2 O-,
  • Z is selected from Bit 1 is connected to B, and bit 2 is connected to A.
  • Z is
  • A is selected from
  • A is selected from
  • Bit 1 is connected to Z.
  • A is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-phenyl
  • L is The structure shown in FIG. 1 , wherein L 1 is an extension unit, L 2 is a connection unit, L 3 is an amino acid unit, and L 4 is a spacer unit.
  • the present disclosure provides an antibody drug conjugate as shown in Formula II,
  • Tb is an antibody or an antigen-binding fragment thereof
  • q is the drug-antibody coupling ratio
  • L 1 is selected from:
  • Position 1 is connected to the S atom, and position 2 is connected to L 2 ;
  • L 2 is selected from Position 1 is connected to L 1 , position 2 is connected to L 3 ;
  • n is selected from any integer between 0 and 10;
  • Y is selected from CH 2 , Wherein position 2 is connected to X;
  • X is selected from CR m R n , NR m ;
  • R m , R n are each independently selected from H, Me;
  • L 3 is selected from an amino acid residue or a short peptide consisting of 2-10 amino acid residues; the amino acid residue is selected from a natural amino acid residue, a non-natural amino acid residue, an amino acid residue represented by AA 1 or a stereoisomer thereof;
  • R a and R b are each independently selected from H and And Ra and Rb are not H at the same time;
  • Ra and Rb together with the carbon atom to which they are commonly attached, form a 4-10 membered heterocyclic ring, which is optionally substituted with one or more R0 ;
  • r, r1 are each independently selected from any integer between 0 and 20;
  • R m1 and R n1 are each independently selected from H, C1-6 alkyl, and C3-6 cycloalkyl;
  • R m1 and R n1 together with the nitrogen atom to which they are commonly attached form a 4-10 membered heterocyclic ring, wherein the 4-10 membered heterocyclic ring is optionally substituted by one or more R 0' ;
  • R 0 and R 0' are each independently selected from C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, -NR m2 R n2 and a 4-10 membered heterocyclyl optionally substituted by C1-6 alkyl;
  • R m2 and R n2 are each independently selected from H and C1-6 alkyl
  • L 4 is absent or present; when L 4 is present, L 4 is selected from Position 1 is connected to L 3 , and position 2 is connected to D;
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is an antibody or antigen-binding fragment thereof that has tumor cell surface antigen binding activity and tumor cell endocytosis activity.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is an antibody or antigen-binding fragment thereof that has antigen-binding activity and has no or weak tumor cell endocytosis activity.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a non-endocytosed antigen on the surface of a tumor cell.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is an antibody or antigen-binding fragment thereof that does not have tumor cell endocytosis activity.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is an antibody or antigen-binding fragment thereof that has the activity of binding to tumor cell surface antigens and has the activity of tumor cell endocytosis.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is a non-human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, or a fully human antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is a probody, a bispecific antibody, or a multispecific antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, complementarity determining region fragment, single chain antibody (eg, scFv).
  • Tb is an antibody or an antigen-binding fragment thereof having endocytosis activity.
  • Tb is an antibody or an antigen-binding fragment thereof that has the activity of binding to a tumor cell surface antigen.
  • the target of the antibody or its antigen-binding fragment is selected from: B7H3, CD20, CD19, CD30, GPNMB, Her2, Trop-2, EGFR, Her3, GD-2, CD79b and BCMA, etc.
  • Tb is an anti-B7H3 antibody or an antigen-binding fragment thereof, an anti-Trop-2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, an anti-Her 2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, an anti-Her3 antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an anti-EGFR antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-B7H3 antibody or an antigen-binding fragment thereof, such as 1D1-01, 2E3-02 antibodies, enoblituzumab, mirzotamab, omburtamab or an antigen-binding fragment thereof.
  • the VH sequence of 1D1-01 is shown as SEQ ID NO: 1, and the VL sequence is shown as SEQ ID NO: 2.
  • the heavy chain sequence of 1D1-01 is shown as SEQ ID NO: 3, and the light chain sequence is shown as SEQ ID NO: 4.
  • the VH sequence of 2E3-02 is shown as SEQ ID NO: 5, and the VL sequence is shown as SEQ ID NO: 6.
  • the heavy chain sequence of 2E3-02 is shown as SEQ ID NO: 7, and the light chain sequence is shown as SEQ ID NO: 8.
  • Tb is an anti-B7H3 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-Trop-2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, such as datopotamab, sacituzumab, or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-Trop-2 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-Her 2 antibody or an antigen-binding fragment thereof, such as anbenitamab, coprelotamab, disitamab, gancotamab, margetuximab, pertuzumab, timigutuzumab, zanidatamab, Trastuzumab, Pertuzumab or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-Her2 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, such as trastuzumab, pertuzumab, or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-Her3 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-Her3 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tb is an anti-EGFR antibody or an antigen-binding fragment thereof, such as demupitamab, depatuxizumab, futuximab, imgatuzumab, laprituximab, losatuxizumab, matuzumab, modotuximab, necitumumab, nimotuzumab, panitumumab, pimurutamab, serclutamab, tomozuotuximab, zalutumumab, Cetuximab or an antigen-binding fragment thereof.
  • an anti-EGFR antibody or an antigen-binding fragment thereof such as demupitamab, depatuxizumab, futuximab, imgatuzumab, laprituximab, losatuxizumab, matuzumab, modotuximab, necitumumab, nimotuzumab, panitumumab, pimurutamab, ser
  • Tb is an anti-EGFR monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody has an antibody that binds to the B7H3 antigen but does not have endocytosis activity.
  • the Anti-B7H3 antibody has a VH of SEQ ID NO: 2 and a VL of SEQ ID NO: 1 described in WO2021168379A1.
  • the antibody has an antibody that binds to the GD-2 antigen but does not have endocytosis activity.
  • the Anti-GD2 antibody has a VH of SEQ ID NO: 4 and a VL of SEQ ID NO: 3 described in WO2021168379A1.
  • the antibody has an antibody that binds to the CD20 antigen but does not have endocytosis activity.
  • type II CD20-specific antibodies have been shown to be poorly internalized by CD20-positive target cells, other so-called “type I” CD20-specific antibodies have been found to be internalized and degraded to some extent, depending on the expression level of activating and inhibitory Fc ⁇ Rs on the target cells that interact with them.
  • the antibody has an antibody that binds to the CD20 antigen but does not have endocytosis activity is a "type II" CD20-specific antibody, such as obinutuzumab.
  • the antibody has an antibody that binds to a non-endocytic antigen (e.g., ALCAM/CD166).
  • the antibody is an antibody comprising VH of SEQ ID No: 73 and VL of SEQ ID No: 74, VH of SEQ ID No: 75 and VL of SEQ ID No: 76, VH of SEQ ID No: 77 and VL of SEQ ID No: 78, or VH of SEQ ID No: 79 and VL of SEQ ID No: 88 in EP3911682A1.
  • q is selected from any integer between 0.1-8.0. In a preferred embodiment, q is selected from any integer between 0.1-8.0.
  • q is selected from any value between 2-8.
  • q is selected from 2, 4, 6, and 8.
  • L1 is selected from:
  • the 1 position is connected to the S atom, and the 2 position is connected to L2 .
  • L2 is selected from Preferably Position 1 is connected to L1 , and position 2 is connected to L3 .
  • L2 is selected from
  • Bit 1 is connected to L1
  • bit 2 is connected to L3.
  • n is any integer between 1-8.
  • n is selected from 1, 2, and 3.
  • Y is CH 2 , Wherein position 2 is connected to X.
  • X is CH 2 , NH, or C(CH 2 ) 2 .
  • L 1 -L 2 are selected from Bit 1 is connected to S, and bit 2 is connected to L3.
  • L 1 -L 2 are selected from
  • Bit 1 is connected to S, and bit 2 is connected to L3.
  • L3 is selected from the amino acid residues Val, D-Val, Cit, Phe, Lys, Lys(Ac), Leu, Gly, Ala, Asn, Asp, Arg, AA1 , or a short peptide consisting of 2-10 amino acid residues selected from Val, Cit, Phe, Lys, D-Val, Leu, Gly, Ala, Asn, Asp, AA1 .
  • L3 is selected from Val, Cit, Lys, D-Val, Leu, Gly, Ala, Asn, AA1 , Val-Cit, Val-Lys, Cit-Val, Cit-Ala, Val-Ala, Lys-Val, Val-Lys(Ac), Phe-Lys, Phe-Lys(Ac), Ala-Ala, Val- AA1 , Ala- AA1 , Gly- AA1 , AA1- Gly, Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-Asn, Ala-Ala-Asp, Val- AA1- Gly, Ala-AA1 - Gly, Gly- AA1 -Gly, Lys-Ala-Ala-Asn, Lys-Ala-Ala-Asp, Gly-Phe-Gly, Gly-Gly-Phe-Gly, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg,
  • L 3 is selected from Val-Cit, Val-Lys, Val-AA 1 and Val-AA 1 -Gly.
  • L3 is selected from Position 1 is connected to L2 , and position 2 is connected to L4 or D.
  • L3 is selected from Position 1 is connected to L2 , and position 2 is connected to L4 or D.
  • either Ra or Rb is H, and the other is
  • Ra and Rb together with the carbon atom to which they are attached, form a 5-6 membered heterocyclic ring substituted with R0 .
  • Ra and Rb together with the carbon atom to which they are attached, form a piperidine or piperazine ring substituted with R0 .
  • Ra and Rb together with the carbon atom to which they are attached, form a piperidine ring substituted with R0 .
  • Ra and Rb together with the carbon atom to which they are attached, form Carbon atom No. 1 is the carbon atom that is bonded to Ra and Rb .
  • r, r1 are each independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, and 5.
  • r, r1 are each independently selected from 0 and 4.
  • r is 0 and r is 4.
  • R m1 and R n1 are each independently selected from H and C1-6 alkyl.
  • R m1 , R n1 are each independently selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, and n-butyl.
  • R m1 and R n1 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5-6 membered heterocyclic ring optionally substituted with R o' .
  • R m1 and R n1 together with the nitrogen atom to which they are attached form a piperidine ring or a piperazine ring optionally substituted with R 0 ' .
  • R m1 and R n1 together with the nitrogen atom to which they are attached form Nitrogen atom No. 1 is the nitrogen atom that is bonded to R m1 and R n1 .
  • R 0 and R 0′ are each independently selected from C1-6 alkyl, —NR m2 R n2 , and a 5-6 membered heterocyclyl optionally substituted with C1-6 alkyl.
  • R 0 is selected from C 1-6 alkyl and a 5-6 membered heterocyclyl substituted by C 1-6 alkyl, wherein the 5-6 membered heterocyclyl is selected from piperidinyl and piperazinyl.
  • R 0 is selected from methyl, ethyl, and a 5-6 membered heterocyclyl substituted with methyl, the 5-6 membered heterocyclyl being piperidinyl.
  • R 0 is selected from methyl and a 5-6 membered heterocyclyl substituted with methyl, the 5-6 membered heterocyclyl being piperidinyl.
  • R 0 is selected from methyl, ethyl and
  • R is selected from methyl
  • R 0′ is selected from C 1-6 alkyl and —NR m2 R n2 .
  • R 0′ is selected from methyl and -NR m2 R n2 .
  • R m2 and R n2 are methyl.
  • amino acid residue represented by AA 1 is selected from
  • amino acid residue represented by AA 1 is selected from
  • L4 is absent.
  • L3 is Bit 2 is connected to D.
  • L4 is selected from Bit 1 is connected to L 3 and bit 2 is connected to D.
  • the linker is selected from:
  • D is selected from the following structures, which are connected to L through the O or N atom at position 1 in the molecule:
  • D is selected from the above structures, which is connected to L3 or L4 through the O or N atom at position 1 in the molecule.
  • the antibody drug conjugate is selected from the following:
  • the antibody drug conjugate is selected from the following:
  • the present disclosure provides a drug-linker conjugate as shown in formula III,
  • Lg is a group that can react with an antibody;
  • L 1 , L 2 , L 3 , L 4 and D are defined as described in any embodiment of the present disclosure.
  • Lg is selected from halogen, sulfone, tertiary amine salt (Me 3 N + , Et 3 N + ), diazonium salt, -OMs, MeSO 2 -, CF 3 SO 3 -, p-toluenesulfonyl, Substituted phenoxy, the substituents include halogen and nitro.
  • Lg is selected from F, Cl, Br, MeSO 2 —, pentafluorophenoxy; more preferably, Lg is MeSO 2 —.
  • L1 and Lg- L1 comprise the following features
  • Lg is a leaving group when reacting with an antibody; preferably, Lg is selected from halogen, sulfone, tertiary amine salt (Me 3 N + , Et 3 N + ), diazonium salt, -OMs, MeSO 2 -, CF 3 SO 3 -, p-toluenesulfonyl; more preferably, Lg is selected from F, Cl, Br, MeSO 2 -; particularly preferably, Lg is MeSO 2 -; L 2 , L 3 , L 4 and D are defined as described in any embodiment of the present disclosure;
  • L1 When L1 is When Lg-L 1 is
  • L 2 , L 3 , L 4 and D are as described in any embodiment of the present disclosure.
  • the drug-linker conjugate is selected from the following:
  • the present disclosure provides a BCL-2 family protein degrader having a structure shown in Formula Ic, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof;
  • the BCL-2 family protein degrader is selected from the following:
  • the present disclosure provides a linker in an antibody drug conjugate, the structure of which is shown below:
  • bit 1 is connected to Tb, bit 2 is connected to D;
  • L1, L2, L3 and L4 are as described in any embodiment of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a method for preparing an antibody drug conjugate of formula II, comprising:
  • Tb, L 1 , L 2 , L 3 , L 4 , Lg and D are as defined in any embodiment of the present disclosure.
  • the method comprises the step of coupling the antibody Tb with the drug-linker conjugate Lg- L1 - L2 - L3 - L4 -D shown in formula III in a suitable solvent and conditions to form a CS bond.
  • the ratio of the amount of Tb to the amount of the drug-linker conjugate is 1:(1-20), such as 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:(10-20), 1:(12-20), 1:(14-20), 1:(16-20) or 1:(18-20).
  • the coupling reaction is carried out in water and/or an organic solvent.
  • the organic solvent is selected from N,N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, N-methylpyrrolidone, nitriles (eg, acetonitrile), alcohols (eg, methanol, ethanol), or any combination thereof.
  • the method further comprises the step of purifying the coupling product.
  • the coupling product is purified by chromatography.
  • the chromatography method comprises one or more of ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, or affinity chromatography.
  • the present disclosure provides a method for preparing a drug-linker conjugate Lg-L 1 -L 2 -L 3 -L 4 -D represented by formula III, comprising:
  • Compound IV is coupled with a dipeptide to obtain compound V, and compound V is further deprotected and coupled with the corresponding carboxylic acid to obtain target compound VI.
  • the structure of the drug, dipeptide or carboxylic acid part can also be changed to obtain other desired target products.
  • the present disclosure provides a pharmaceutical composition, which comprises the aforementioned antibody-drug conjugate, or a stereoisomer of the antibody-drug conjugate, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned compound, or a stereoisomer of the compound, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned drug-linker conjugate, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof, and optionally one or more pharmaceutical excipients.
  • the present disclosure provides the aforementioned antibody-drug conjugate, or a stereoisomer of the antibody-drug conjugate, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned compound, or a stereoisomer of the compound, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned drug-linker conjugate, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned pharmaceutical composition for use in the preparation of a drug for treating and/or preventing a disease associated with abnormal cell activity (e.g., a cancer disease).
  • a disease associated with abnormal cell activity e.g., a cancer disease
  • the present disclosure provides a method for preventing and/or treating a disease associated with abnormal cell activity (e.g., a cancer disease), comprising: administering to an individual in need thereof an effective amount of the aforementioned antibody-drug conjugate, or a stereoisomer of the antibody-drug conjugate, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned compound, or a stereoisomer of the compound, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned drug-linker conjugate, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof; or the aforementioned pharmaceutical composition.
  • a disease associated with abnormal cell activity e.g., a cancer disease
  • the cancer disease described in the present disclosure is selected from one or more of esophageal cancer (e.g., esophageal adenocarcinoma or esophageal squamous cell carcinoma), brain tumor, lung cancer (e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, or lung adenocarcinoma), squamous cell carcinoma, bladder cancer, gastric cancer, ovarian cancer, peritoneal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer, endometrial cancer, colorectal cancer (e.g., colon cancer or rectal cancer), liver cancer, kidney cancer, urothelial carcinoma, solid tumors, non-Hodgkin's lymphoma, central nervous system tumors (e.g., glioma, glioblastoma multiforme, glioma, or sarcoma), acute lymphoblastic leukemia, prostate cancer, and thyroid cancer.
  • esophageal cancer
  • the disease is selected from one or more of acute lymphoblastic leukemia, colon cancer, gastric cancer, non-small cell lung cancer and lung adenocarcinoma, preferably selected from one or more of acute lymphoblastic leukemia, colon cancer, gastric cancer and non-small cell lung cancer, and more preferably selected from one or more of gastric cancer, colon cancer and non-small cell lung cancer.
  • the cancer disease is a cancer disease associated with HER2, TROP2, B7H3, HER3, or EGFR.
  • the cancer disease is a solid tumor or a hematological tumor.
  • examples of the term "pharmaceutically acceptable salts” are organic acid addition salts formed by organic acids that form pharmaceutically acceptable anions, including but not limited to formates, acetates, propionates, benzoates, maleates, fumarates, succinates, tartrates, citrates, ascorbates, ⁇ -ketoglutarates, ⁇ -glycerophosphates, alkylsulfonates or arylsulfonates; the arylsulfonates are benzenesulfonates or p-toluenesulfonates.
  • Suitable inorganic salts may also be formed, including but not limited to hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, nitrates, bicarbonates and carbonates, sulfates or phosphates, etc.
  • compositions can be obtained using standard procedures well known in the art, for example, by reacting a sufficient amount of a basic compound with a suitable acid affording a pharmaceutically acceptable anion.
  • stereoisomer means an isomer formed due to at least one asymmetric center.
  • compounds with one or more (e.g., one, two, three, or four) asymmetric centers it can produce racemic mixtures, single enantiomers, diastereomeric mixtures, and individual diastereomers.
  • Specific individual molecules can also exist as geometric isomers (cis/trans).
  • the compounds of the present invention can exist as mixtures (commonly referred to as tautomers) of two or more structurally different forms in rapid equilibrium.
  • tautomers include keto-enol tautomers, phenol-ketone tautomers, nitroso-oxime tautomers, imine-enamine tautomers, etc. It is to be understood that the scope of the present application covers all such isomers or mixtures thereof in any proportion (e.g., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%).
  • Solid lines (-), solid wedges, or dashed wedges may be used in this disclosure to depict carbon-carbon bonds of the compounds of the present invention.
  • the use of solid lines to depict bonds to asymmetric carbon atoms is intended to indicate that all possible stereoisomers at the carbon atom are included (e.g., specific enantiomers, racemic mixtures, etc.).
  • the use of solid or dashed wedges to depict bonds to asymmetric carbon atoms is intended to indicate that the stereoisomers shown exist. When present in a racemic mixture, real and dashed wedges are used to define relative stereochemistry, not absolute stereochemistry.
  • the compounds of the present invention are intended to exist in the form of stereoisomers (which include cis and trans isomers, optical isomers (e.g., R and S enantiomers), diastereomers, geometric isomers, rotational isomers, conformational isomers, atropisomers, and mixtures thereof).
  • the compounds of the present invention may exhibit more than one type of isomerism and consist of mixtures thereof (e.g., racemic mixtures and diastereoisomer pairs).
  • the compounds of the present disclosure may exist in the form of solvates (preferably hydrates), wherein the compounds of the present disclosure contain a polar solvent as a structural element of the crystal lattice of the compound, in particular water, methanol or ethanol.
  • a polar solvent as a structural element of the crystal lattice of the compound, in particular water, methanol or ethanol.
  • the amount of the polar solvent, in particular water, may be present in a stoichiometric or non-stoichiometric ratio.
  • the present disclosure further includes within its scope prodrugs of the compounds of the present invention.
  • prodrugs will be functional group derivatives of the compounds that are easily converted into the desired therapeutically active compound in vivo. Therefore, in these cases, the term "administration" used in the methods of treatment of the present disclosure should include the use of one or more prodrug forms of the claimed compounds to treat various diseases or conditions, but the prodrug forms are converted into the above-mentioned compounds in vivo after administration to the individual.
  • “Design of Prodrug” ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985, conventional methods for selecting and preparing suitable prodrug derivatives are described.
  • the pharmaceutical excipients refer to excipients and additives used in the production of drugs and the preparation of prescriptions. They refer to substances that have been reasonably evaluated in terms of safety and are included in pharmaceutical preparations in addition to active ingredients. In addition to excipients, carriers, and improving stability, pharmaceutical excipients also have important functions such as solubilization, solubilization, and sustained and controlled release. They are important ingredients that may affect the quality, safety, and effectiveness of drugs. According to their sources, they can be divided into natural products, semi-synthetic products, and fully synthetic products.
  • solvents propellants, solubilizers, cosolvents, emulsifiers, colorants, adhesives, disintegrants, fillers, lubricants, wetting agents, osmotic pressure regulators, stabilizers, glidants, flavoring agents, preservatives, suspending agents, coating materials, fragrances, anti-adhesives, antioxidants, chelating agents, penetration enhancers, pH regulators, buffers, plasticizers, surfactants, foaming agents, defoamers, thickeners, inclusion agents, humectants, absorbents, diluents, flocculants and deflocculating agents, filter aids, release retardants, etc.; according to their route of administration, they can be divided into oral, injection, mucosal, transdermal or topical administration, nasal or oral inhalation administration and ocular administration, etc.
  • the same pharmaceutical excipients can be used in drug preparations with different routes of administration and
  • the pharmaceutical composition can be prepared into various suitable dosage forms according to the administration route, such as injections, implants, etc.
  • the pharmaceutical composition or suitable dosage form may contain 0.01 mg to 1000 mg of the compound of the present disclosure or its pharmaceutically acceptable salt or conjugate, preferably 0.1 mg to 800 mg, preferably 0.5-500 mg, preferably 0.5 to 350 mg, and particularly preferably 1-250 mg.
  • the pharmaceutical composition can be used in the form of an injection, including an injection solution, a sterile powder for injection, and a concentrated solution for injection.
  • the vehicles and solvents which may be used include water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile fixed oils may be used as a solvent or suspending medium, such as mono- or di-glycerides.
  • treatment generally refers to obtaining a desired pharmacological and/or physiological effect.
  • the effect may be preventive, in terms of completely or partially preventing a disease or its symptoms; and/or therapeutic, in terms of partially or completely stabilizing or curing a disease and/or side effects caused by a disease.
  • Treatment encompasses any treatment of a patient's disease, including: (a) preventing a disease or symptom from occurring in a patient who is susceptible to the disease or symptom but has not yet been diagnosed with the disease; (b) suppressing the symptoms of a disease, i.e., preventing its development; or (c) alleviating the symptoms of a disease, i.e., causing the disease or symptom to regress.
  • the term "individual” includes humans or non-human animals.
  • Exemplary human individuals include human individuals (referred to as patients) suffering from diseases (e.g., diseases described in the present disclosure) or normal individuals.
  • non-human animal in the present disclosure includes all vertebrates, such as non-mammals (e.g., birds, amphibians, reptiles) and mammals, such as non-human primates, livestock and/or domesticated animals (e.g., sheep, dogs, cats, cows, pigs, etc.).
  • the term "effective dose” refers to that amount of a compound which, when administered, will relieve to some extent one or more of the symptoms of the condition being treated.
  • the term "antibody drug conjugate” refers to a substance obtained by connecting a drug molecule to an antibody or its antigen binding fragment portion or a targeting portion.
  • the drug molecule is connected to the antibody or its antigen binding fragment via a connector.
  • the connector can be broken in a specific environment (e.g., an intracellular low pH environment) or under a specific action (e.g., the action of a lysosomal protease), thereby separating the drug molecule from the targeting portion or the antibody or its antigen binding fragment.
  • the connector comprises a cleavable or non-cleavable unit, such as a peptide or a disulfide bond.
  • the drug molecule and the antibody or its antigen binding fragment or the targeting portion can be directly connected by a covalent bond, and the covalent bond can be broken under a specific environment or action, thereby separating the drug molecule from the antibody or its antigen binding fragment portion or the targeting portion.
  • amino acid refers to an organic compound containing a basic amino group and an acidic carboxyl group, and is composed of an amino group (NH2), a carboxyl group (COOH) and a side chain.
  • drug refers to a BCL-2 family protein degradation targeting chimera.
  • linker refers to a fragment that connects a drug molecule to an antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • antibody is interpreted in its broadest sense, including complete monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) formed by at least two complete antibodies, as long as they have the desired biological activity.
  • antibody and “immunoglobulin” can be used interchangeably.
  • the term "monoclonal antibody” refers to an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the antibodies constituting the population are identical except for a small number of naturally occurring mutations that may be present.
  • Monoclonal antibodies have a high specificity for one determinant (epitope) of an antigen, whereas polyclonal antibodies, in contrast, contain different antibodies for different determinants (epitopes).
  • monoclonal antibodies have the advantage that they can be synthesized without contamination by other antibodies.
  • the modifier "monoclonal” herein indicates that the antibody is characterized by being derived from a substantially homogeneous population of antibodies and should not be construed as requiring production by a particular method.
  • monoclonal antibodies also specifically include chimeric antibodies, that is, a portion of the heavy chain and/or light chain is identical or homologous to a certain type, class or subclass of antibody, and the remaining portion is identical or homologous to another type, class or subclass of antibody, as long as they have the desired biological activity (see, for example, US 4,816,567; and Morrison et al., 1984, PNAS, 81: 6851-6855).
  • Chimeric antibodies that can be used in the present disclosure include primatized antibodies, which contain variable region antigen binding sequences from non-human primates (such as ancient monkeys, orangutans, etc.) and human constant region sequences.
  • antibody fragment refers to a portion of an antibody, preferably the antigen binding or variable region.
  • antibody fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , Fd, Fv, dAb and complementarity determining region fragments, diabodies, linear antibodies and single-chain antibody molecules.
  • bispecific antibody also known as “bifunctional antibody conjugate” refers to a conjugate formed by a first antibody (fragment) and a second antibody (fragment) through a coupling arm, which retains the activity of each antibody and thus has bifunctionality and bispecificity.
  • multispecific antibody includes, for example, trispecific antibodies, which are antibodies with three different antigen-binding specificities, and tetraspecific antibodies, which are antibodies with four different antigen-binding specificities.
  • complete antibody refers to an antibody comprising an antigen-binding variable region and a light chain constant region (CL), a heavy chain constant region (CH1, CH2 and CH3).
  • the constant region can be a native sequence (e.g., a human native constant region sequence) or an amino acid sequence variant thereof.
  • a complete antibody is preferably a complete antibody with one or more effector functions.
  • antibody is a modified antibody, including an antibody or an antibody fragment, that can specifically bind to its target and can be coupled to a masking group, wherein the masking group refers to a cleavage constant for the binding ability of the antibody or antibody fragment to its target that is at least 100 times, 1000 times, or 10,000 times greater than the cleavage constant for the binding ability of the antibody or antibody fragment to its target without the coupled masking group.
  • a "humanized" form of a non-human (e.g., mouse) antibody refers to a chimeric antibody that contains a minimal amount of non-human immunoglobulin sequence.
  • Most humanized antibodies are those in which the hypervariable region residues of a human recipient immunoglobulin are replaced with non-human (e.g., mouse, rat, rabbit, or non-human primate) hypervariable region residues (donor antibody) having the desired specificity, affinity, and function.
  • the framework region (FR) residues of the human immunoglobulin are also replaced with non-human residues.
  • humanized antibodies may also contain residues that are not present in the recipient antibody or the donor antibody. These modifications are intended to further optimize the performance of the antibody.
  • Humanized antibodies generally contain at least one, usually two, variable regions in which all or nearly all of the hypervariable loops correspond to those of non-human immunoglobulins, while the FRs are completely or almost completely sequences of human immunoglobulins. Humanized antibodies may also contain at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc, usually human immunoglobulin Fc).
  • Fc immunoglobulin constant region
  • Intact antibodies can be divided into different "classes” based on the amino acid sequence of the heavy chain constant region.
  • the five main classes are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, several of which can be further divided into different "subclasses" (isotypes), such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2.
  • the heavy chain constant regions of different classes of antibodies are called ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ , respectively.
  • the subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known in the art.
  • the amino acid substitution in the antibody is substituted with L-amino acids, it is not limited thereto.
  • one or more D-amino acids may be included in the antibody peptide chain. Peptides containing D-amino acids are more stable and less prone to degradation in the oral cavity, intestinal tract or plasma than peptides containing only L-amino acids.
  • the monoclonal antibodies used in the present disclosure can be produced by many methods.
  • the monoclonal antibodies used in the present disclosure can be obtained by the hybridoma method using cells of many species (including mice, hamsters, rats and humans) (see, e.g., Kohler et al., 1975, Nature, 256: 495), or by recombinant DNA technology (see, e.g., US 4,816,567), or isolated from phage antibody libraries (see, e.g., Clackson et al., 1991, Nature, 352: 624-628; and Marks et al., 1991, Journal of Molecular Biology, 222: 581-597).
  • Tb is Trastuzumab or Pertuzumab.
  • Trastuzumab is a monoclonal antibody against Her 2, and its amino acid sequence is known to those skilled in the art. Its schematic sequence can be found, for example, in CN103319599. The last Lys is easily deleted but does not affect the biological activity, see Dick, L.W. et al., Biotechnol. Bioeng., 100: 1132-1143.
  • the anti-Trop-2 antibody is RS7 described in U.S. Patent No. 7,517,964 (i.e., Sacituzumab of the present disclosure); and hRS7 described in US2012/0237518 (i.e., Sacituzumab of the present disclosure).
  • the anti-Trop-2 antibody that can be used in the present disclosure can also be obtained by screening the method of vector design, construction, and construction of an antibody library displaying antibodies disclosed in CN103476941A, or can be obtained by screening the method of Sorrento Therapeutics, Inc. The library was screened.
  • ErbB2 and Her2/neu are used interchangeably, and both represent the native sequence human Her2 protein (Genebank accession number: X03363, see, e.g., Semba et al., 1985, PNAS, 82: 6497-6501; and Yamamoto et al., 1986, Nature, 319: 230-234) and its functional derivatives, such as amino acid sequence variants.
  • ErbB2 represents the gene encoding human Her2
  • neu represents the gene encoding rat p185neu.
  • the compounds or conjugates of the present disclosure are capable of inhibiting or killing cells expressing ErbB2 receptors, such as breast cancer cells, ovarian cancer cells, gastric cancer cells, endometrial cancer cells, salivary gland cancer cells, lung cancer cells, renal cancer cells, colon cancer cells, thyroid cancer cells, pancreatic cancer cells, bladder cancer cells or liver cancer cells.
  • cells expressing ErbB2 receptors such as breast cancer cells, ovarian cancer cells, gastric cancer cells, endometrial cancer cells, salivary gland cancer cells, lung cancer cells, renal cancer cells, colon cancer cells, thyroid cancer cells, pancreatic cancer cells, bladder cancer cells or liver cancer cells.
  • Trop-2 or TROP2 refers to human trophoblast cell-surface antigens 2, also known as TACSTD2, M1S1, GA733-1, EGP-1, which is a cell surface receptor expressed by many human tumor cells (such as breast cancer, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer).
  • the compounds or conjugates of the present disclosure can inhibit or kill cells expressing TROP2 receptors, such as breast cancer cells, colorectal cancer cells, lung cancer cells, pancreatic cancer cells, ovarian cancer cells, prostate cancer cells or cervical cancer cells.
  • Tb is a monoclonal antibody against B7H3, or an antigen-binding fragment thereof.
  • the anti-B7H3 antibody includes all anti-B7H3 antibodies in the prior art, for example, see CN112521512, WO2021027674, WO2021021543, WO2021006619, CN111662384, CN111454357, WO2020151384, WO2020140094, WO2020103100, WO2020102779, WO2020063673, WO2020047257, WO2020041626, CN110684790, CN110642948, WO2019225787, WO2019226017, US20 190338030, CN110305213, WO2018 209346, WO2018177393, US9150656, WO2016106004, WO2016044383, WO2016033225, WO2015181267, US20120294796, WO2011109400, CN10110
  • C1-6 alkyl specifically refers to the independently disclosed methyl, ethyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl and C6 alkyl.
  • C1-6 alkyl refers to a straight or branched alkyl group containing 1 to 6 carbon atoms, including, for example, “C1-3 alkyl” or “C1-4 alkyl", “C1-2 alkyl", methyl, ethyl, etc. Specific examples include, but are not limited to: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl.
  • C2-6 alkenyl refers to a linear, branched or cyclic alkenyl group containing at least one double bond and having 2 to 6 carbon atoms, including, for example, "C2-4 alkenyl” etc.
  • Examples thereof include, but are not limited to, vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 1,3-butadienyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 1,3-pentadienyl, 1,4-pentadienyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 1,4-hexadienyl, cyclopentenyl, 1,3-cyclopentadienyl, cyclohexenyl, 1,4-cyclohexadienyl etc.
  • C2-6 alkynyl refers to a straight or branched alkynyl group containing at least one triple bond and having 2 to 6 carbon atoms, including, for example, "C2-4 alkynyl” etc. Examples thereof include, but are not limited to, ethynyl, propynyl, 2-butynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-methyl-2-pentynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 5-methyl-2-hexynyl etc.
  • halogen includes fluorine, chlorine, bromine, iodine.
  • C3-6 cycloalkyl refers to a saturated cyclic alkyl group containing 3 to 6 carbon atoms, including cyclopropane (ie, cyclopropyl), cyclobutane (ie, cyclobutyl), cyclopentane (ie, cyclopentyl), and cyclohexyl.
  • C1-6 alkoxy refers to an alkyl group as defined above attached to the parent molecular moiety through an oxygen atom, including, for example, "C1-3 alkoxy” or "C1-4 alkoxy”. Specific examples include, but are not limited to, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentyloxy, hexyloxy, and the like.
  • C1-6 haloalkyl refers to an alkyl group as defined above attached to the parent molecular moiety through a halogen, including, for example, "C1-3 haloalkyl” or “C1-4 haloalkyl”. Specific examples include, but are not limited to, chloromethyl, fluoroethyl, bromo Propyl, etc.
  • the term "4-10 membered heterocyclyl” refers to a cyclic group containing 4-10 ring atoms (at least one of which is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom).
  • the term "4-6 membered heterocyclyl” refers to a cyclic group containing 4-6 ring atoms (at least one of which is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom).
  • the ring atoms (e.g., carbon atoms, nitrogen atoms or sulfur atoms) in the cyclic structure may be oxo-substituted.
  • “4-8 membered heterocyclyl” includes, for example, “4-8 membered nitrogen-containing heterocyclyl”, “4-8 membered oxygen-containing heterocyclyl”, “4-7 membered heterocyclyl”, “4-7 membered oxygen-containing heterocyclyl”, “4-7 membered heterocyclyl”, “4-6 membered heterocyclyl”, “5-7 membered heterocyclyl”, “5-6 membered heterocyclyl”, “5-6 membered nitrogen-containing heterocyclyl”, and includes but is not limited to oxocyclobutane, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, piperidinyl, piperazinyl, tetrahydropyranyl, homopiperazinyl and the like.
  • the term "4-10 membered heterocycle” refers to a ring containing 4-10 ring atoms (at least one of which is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom).
  • the term “5-6 membered heterocycle” refers to a ring containing 5-6 ring atoms (at least one of which is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom), including but not limited to pyrrolidine, tetrahydrofuran, piperidine, piperazine, tetrahydropyran and the like.
  • 6-12 membered spirocyclyl refers to a cyclic structure containing 6-12 ring carbon atoms formed by two or more cyclic structures sharing one carbon atom.
  • the carbon atoms in the cyclic structure can be oxo-substituted.
  • 6-12 membered spirocyclyl includes, for example, “6-11 membered spirocyclyl”, “6-10 membered spirocyclyl”, “7-10 membered spirocyclyl”, “7-9 membered spirocyclyl”, “7-8 membered spirocyclyl”, “9-10 membered spirocyclyl”, “3-10 membered spirocyclyl”, etc., including but not limited to
  • 6-12-membered cycloalkyl refers to a cycloalkyl containing 6-12 ring carbon atoms formed by two or more cycloalkyls sharing two adjacent atoms, including "6-11-membered cycloalkyl”, “6-10-membered cycloalkyl”, “6-8-membered cycloalkyl”, “10-12-membered cycloalkyl”, “7-10-membered cycloalkyl", etc., including but not limited to
  • aryl refers to a monocyclic or polycyclic hydrocarbon group having aromaticity, such as a 6-10-membered aryl group, a 5-8-membered aryl group, etc. Specific examples include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, anthracenyl, phenanthrenyl, etc.
  • the "6-10-membered aryl group” refers to an aryl group containing 6-10 ring atoms.
  • C6-10 aryl group refers to an aryl group containing 6-10 carbon atoms.
  • heteroaryl refers to a cyclic group with aromaticity, wherein at least one ring atom is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom.
  • the ring atoms (such as carbon atoms, nitrogen atoms or sulfur atoms) in the ring structure can be oxoed.
  • 5-10 yuan heteroaryl 5-6 yuan heteroaryl, 5-10 yuan nitrogen-containing heteroaryl, 6-10 yuan oxygen-containing heteroaryl, 6-8 yuan nitrogen-containing heteroaryl, 5-8 yuan oxygen-containing heteroaryl, etc.
  • furyl thienyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, 1,2,3-triazolyl, 1,2,4-triazolyl, 1,2,3-oxadiazolyl, 1,2,4-oxadiazolyl, 1,2,5-oxadiazolyl, 1,3, 4-oxadiazolyl, pyridinyl, 2-pyridonyl, 4-pyridonyl, pyrimidinyl, 1,4-dioxinyl, 2H
  • the reagents and raw materials used in the present disclosure are commercially available.
  • the antibody-drug conjugate of the BCL-2 family protein degrader disclosed in the present invention can achieve at least one of the following technical effects:
  • the antibody-drug conjugates disclosed herein have targeting selectivity and can be enriched in targeted cells;
  • the antibody-drug conjugate disclosed in the present invention has extracellular lysis ability and is still effective against tumors with low or no antigen expression, thus solving the drug resistance problem related to the mechanism of antibody-drug conjugates.
  • the nuclear magnetic resonance ( 1 H NMR) was measured using a Bruker 400 MHz nuclear magnetic resonance instrument; the measurement solvent was deuterated methanol (CD 3 OD), deuterated chloroform (CDCl 3 ) or hexadeuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d 6 ); the internal standard substance was tetramethylsilane (TMS).
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MS mass spectrometry
  • Example 1.1 Synthesis of 6-azido-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(hydroxymethyl)phenyl)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-yl)amino)-3-methyl-1-oxobutan-2-yl)hexanamide (INT1).
  • Example 1.2 Synthesis of (R)-7-(4-(3-((4-(N-(4-(4-((4′-chloro-4,4-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoyl)sulfamoyl)-2-((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)amino)-4-(phenylthio)butyl)piperazin-1-yl)-7-oxoheptanoic acid (INT2).
  • compound INT2-6 300 mg, 0.27 mmol was dissolved in a mixed solution of THF (0.5 mL), EtOH (0.5 mL) and water (0.5 mL), and LiOH.H 2 O (19.40 mg, 0.81 mmol) was added under stirring to react for 1 h.
  • the reaction was detected by LCMS.
  • the reaction solution was concentrated to obtain an aqueous solution of lithium salt, and 1N HCl solution was added to adjust the pH to 2-3. Solids precipitated, which were filtered and the filter cake was dried to obtain the target compound INT2 (240 mg).
  • LCMS (ESI) [M+H] + 1116.77.
  • Example 1.3 Synthesis of allyl ((S)-3,3-dimethyl-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)carbamoyl)-4-(((4-nitrophenoxy)carbonyl)oxy)pyrrolidin-1-yl)-1-oxobutan-2-yl)carbamate (INT3).
  • Example 1.4 Synthesis of tert-butyl ((S)-5-((S)-2-(6-azidohexanamido)-3-methylbutanamido)-6-((4-(hydroxymethyl)phenyl)amino)-6-oxohexyl)carbamate (INT4).
  • Example 1.7 Synthesis of (5S,8S)-8-(4-(dimethylamino)butyl)-1-(9H-fluoren-9-yl)-5-isopropyl-3,6,9,12-tetraoxo-2,15-dioxa-4,7,10,13tetraazaheptadecan-17-oic acid (INT7).
  • Example 1.8 (2S,4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-)(4-(N-(4-(4-(S)-4-(S)-12-(S)2-amino-3-methylbutyramido)-2,17-dimethyl-3,8,11-trioxo-5-oxa-2,7,10,17-tetraazaoctadecyl)-4′-chloro-4-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-[ Synthesis of ((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide (INT8).
  • Example 1.10 Synthesis of 3-(2-(4-(2-(methylsulfonyl)pyrimidin-5-yl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-5-oxo-3,9,12,15,18,21,24,27,30-nonyloxy-6-azatricarboxylic acid (INT10).
  • Example 1.11 Synthesis of (2S,4R)-1-((2S)-2-(7-(4-((3R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-chloro-4-methyl-4-((methylamino)methyl)-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoyl)sulfamoyl)-2-((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)amino)-4-(phenylthio)butyl)piperazin-1-yl)-7-oxoheptanoyl)-3,3-dimethylbutanoyl)-4-hydroxy-N-((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide (INT11).
  • Example 1.12 Synthesis of 39-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-5,34-dioxo-3,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxa-6,33-diazatriacontanoic acid (INT12).
  • Example 1.13 Synthesis of 4-(4-((4′-((tert-butoxycarbonyl)amino)-4,4-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoic acid (INT13).
  • Example 1.14 Synthesis of 4-(4-((3′-((tert-butoxycarbonyl)amino)-4,4-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoic acid (INT14).
  • Example 1.15 Synthesis of (R)-4-(4-(phenylthio)-3-((4-aminosulfonyl-2-((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)amino)butyl)piperazine-1-carboxylic acid allyl ester (INT15).
  • INT15-3 (1.1 g, 3.15 mmol) was dissolved in 1,4-dioxane (20 mL), and N,N-diisopropylethylamine (954 mg, 9.45 mmol) and 4-fluoro-3-((trifluoromethyl)sulfonyl)benzenesulfonamide (1.16 g, 3.78 mmol) were added in sequence. The atmosphere was replaced with nitrogen three times. The reaction solution was stirred at 60°C for 16 h, and the reaction was monitored by LCMS.
  • Example 1.17 Synthesis of (S)-ethyl 4-(4-((4-(((tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino)methyl)-4′-chloro-4-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoate and (R)-ethyl 4-(4-((4-(((tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino)methyl)-4′-chloro-4-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoate (INT17-P1 & INT17-P2).
  • Example 2.2 Synthesis of (2S,4R)-1-((S)-2-(7-(4-(R)-3-(4-(N-(4-(((R)-4′-chloro-4-((2-hydroxy-N-methylacetylamino)methyl)-4-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-2-yl)methyl)piperazin-1-yl)benzoyl)sulfamoyl)-2-(((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)amino)-4-(phenylthio)butyl)piperazin-1-yl)-7-oxoheptylamido)-3,3-dimethylbutanoyl)-4-hydroxy-N-((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide (PL-2).
  • Example 2.5 Synthesis of N1-((4′-chloro-6-((4-(4-(((4-(4-(2-hydroxyacetyl)piperazin-1-yl)-1-(phenylthio)butan-2-yl)amino)-3-((trifluoromethyl)sulfonyl)phenyl)sulfonyl)carbamoyl)phenyl)piperazin-1-yl)methyl)-4-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-[1,1′-biphenyl]-4-yl)methyl)-N10-((S)-1-((2S,4R)-4-hydroxy-2-(((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)carbamoyl)pyrrolidin-1-yl)-3,3-dimethyl-1-oxobutan-2-yl)decanamide (PL-5).
  • aqueous phase was extracted with dichloromethane (50 mL x 2), the organic phases were combined, washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the crude product was purified by column chromatography (phase A: H 2 O containing 0.1% FA, phase B: acetonitrile) to obtain the target compound DL001-2 (270 mg).
  • LCMS (ESI) [M+H] + 989.5.
  • Example 3.2 4-((S)-6-amino-2-((S)-3-methyl-2-(6-(4-(2-(methylsulfonyl)pyrimidin-5-yl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamido)butanamido)hexanamido)benzyl((3R,5S)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-chloro-4,4-dimethyl-3,4,5,6-tetrazolyl) Synthesis of 3-(((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)carbamoyl)pyrrolidin-3-yl)carbonate (DL002).
  • Example 3.5 (2S, 4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((S)-4′-chloro-4-((12S, 15S)-12-(4-(dimethylamino)butyl)-15-isopropyl-2-methyl-22-(2-(methylsulfonyl)pyrimidin-5-yl)-3,8,11,14,17-pentaoxo-5-oxa-2,7,10,13,16-pentaazadocosapenta-21-yne- Synthesis of ((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide (DL005).
  • Example 3.6 (2S, 4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((R)-4′-chloro-4-((12S, 15S)-12-(4-(dimethylamino)butyl)-15-isopropyl-2-methyl-22-(2-(methylsulfonyl)pyrimidin-5-yl)-3,8,11,14,17-pentaoxo-5-oxa-2,7,10,13,16-pentaaza Synthesis of ((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide (DL006).
  • Example 2 Preparation and identification of antibodies: Refer to the method disclosed in WO2022170971A1 to prepare anti-B7H3 antibodies: 1D1-01 and 2E3-02; wherein 1D1-01 involves the sequence SEQ ID NO: 1 (1D1-01VH), SEQ ID NO: 2 (1D1-01VL), SEQ ID NO: 3 (1D1-01HC) and SEQ ID NO: 4 (1D1-01LC), 2E3-02 involves the sequence SEQ ID NO: 5 (2E3-02VH), SEQ ID NO: 6 (2E3-02VL), SEQ ID NO: 7 (2E3-02HC) and SEQ ID NO: 8 (2E3-02LC), see the sequence table for specific sequences.
  • 1D1-01 involves the sequence SEQ ID NO: 1 (1D1-01VH), SEQ ID NO: 2 (1D1-01VL), SEQ ID NO: 3 (1D1-01HC) and SEQ ID NO: 4 (1D1-01LC
  • 2E3-02 involves the sequence SEQ ID NO: 5 (2E3-02VH), S
  • LC represents antibody light chain
  • HC represents antibody heavy chain
  • DAR1 represents a drug-linker conjugate comprising a light chain or a heavy chain coupled to one drug
  • DAR2 represents a drug-linker conjugate comprising a light chain or a heavy chain coupled to two drug
  • DAR3 represents a drug-linker conjugate comprising a light chain or a heavy chain coupled to three drug.
  • LC, HC, DAR1, DAR2, and DAR3 are as described above.
  • DAR value Drug-antibody coupling ratio
  • Sample treatment Take 50 ⁇ g of ADC sample, dilute it to 0.5 mg/ml with ultrapure water, then add DTT (1 ⁇ l, 1 M), mix well and centrifuge to take the supernatant.
  • trastuzumab light chain was coupled to 1 toxin molecule (LC+DAR1 ratio was 91%), and the heavy chain was coupled to 2 and 3 toxin molecules (HC+DAR2 ratio was 3%, HC+DAR3 ratio was 93%), and the antibody-drug conjugation ratio (DAR value) of HER2-ADC-02 was calculated to be 7.5.
  • Drug-antibody coupling ratio (DAR value) determination method instrument information, mass spectrometry parameters: same as Example 3.2
  • Example 4.1 Detection of inhibitory activity of ADC on in vitro cell activity
  • HT29, NCI-H358 (HT29 and NCI-H358 are B7H3-positive tumor cells) and Calu-3 (Calu-3 is B7H3-negative tumor cells) tumor cells were digested by conventional methods using trypsin, and the number of cells in the tubes was collected and the corresponding detection medium was used. (containing 2% FBS) and resuspended, and 2000-5000 cells/well were added to a 96-well plate. 100uL of B7H3-ADC-01 (DAR8) diluted with 2% FBS medium was added to a 96-well plate, starting from a concentration of 150 ⁇ g/ml, and diluted 3 times (12 concentration gradients).
  • N87 (1640 + 10% FBS) tumor cells were cultured in a 37°C, 5% CO2 incubator and cell-specified culture medium according to conventional methods. N87 tumor cells were digested with trypsin, and the cells were collected and counted. The cells were resuspended to 50,000/ml in the corresponding complete culture medium and added to a 96-well plate at 100ul/well.
  • the ADC to be tested was diluted with complete culture medium, with the drug concentration starting from 125nM and 4-fold dilution for a total of 9 gradients. 100uL of the diluted ADC was added to a 96-well plate containing 100ul culture medium and cells. Incubate at 37°C 5% CO2 for 4 days.
  • GraphPad software was used to draw a dose-dependent cell proliferation inhibition graph and analyze its half-inhibitory concentration (IC50, nM).
  • test results show that the ADC molecules disclosed in the present invention have significant proliferation inhibition activity on the N87 tumor cell line.
  • the test results are shown in Table 2.
  • the cells in the 96-well plate were cultured at 37°C and 5% CO 2 .
  • the test results show that the BCL-2 family protein degrader (Payload) disclosed in the present invention has obvious proliferation inhibition activity on MOLT-4 cells.
  • the test results are shown in Table 4.

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Abstract

一种包含BCL-2家族蛋白降解剂的式（I）所示抗体药物偶联物及其制备方法，其中Tb为抗体或其抗原结合片段或靶向部分，q为药物抗体偶联比，L为连接体，D为BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体片段，所述BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体包含BCL-2家族蛋白结合部分和泛素化酶结合部分。所述抗体药物偶联物能够用于预防和/或治疗肿瘤疾病。

Description

包含BCL-2家族蛋白降解剂的抗体药物偶联物及其制备方法和用途
本申请要求申请日为2023/1/18的中国专利申请2023100667601的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本公开属于医药技术领域，涉及一种包含BCL-2家族蛋白降解剂的抗体药物偶联物、化合物、药物连接体偶联物及其制备方法，以及其在预防和/或治疗与细胞活动异常相关的疾病，包括但不限于在预防和/或治疗肿瘤疾病中的用途。
背景技术
BCL-2蛋白家族是细胞凋亡(也叫程序性细胞死亡)的核心调节机制之一，可以接收和传递内在胞内信号或外部环境应激信号，如营养或缺氧胁迫、DNA损伤、致癌基因过量激活、内质网应激胁迫等，主要在内在凋亡途径(Intrinsic pathway)中起主导作用。人体中一共有27个BCL-2家族的蛋白成员。按照序列和功能分析可以分成三个亚类。一亚类是拮抗细胞凋亡的，包括6个蛋白，即BCL-XL、BCL-2、BCL-W、Mcl-1、BCL-B和Bfl-1，它们主要定位于线粒体上保护线粒体免于逆境损伤。另两亚类是促进细胞凋亡的，一亚类是线粒体损伤的最终执行者，包括Bax和Bak。其余都归于BH3-only亚类，可以直接感应各种不同细胞逆境胁迫信号。拮抗和促进细胞凋亡的BCL-2家族蛋白之间相互作用，它们的动态平衡决定细胞的生死命运。约50％的肿瘤存在拮抗凋亡的BCL-2家族蛋白异常过量表达，是化疗、放疗、靶向疗法和其它疗法抗药性的重要组成部分。
BCL-2高选择性抑制剂venetoclax(ABT-199)于2016年4月11日被FDA加速批准二线用于染色体17p缺失异常的CLL患者。低甲基化剂，如DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine)，可降低AML细胞中Mcl-1的表达，从而与选择性BCL-2抑制剂有协同作用。2018年11月，FDA批准ABT-199和5-azacytidine联合治疗75岁及以上患者的新诊AML或因合并症而无法进行强化诱导化疗的患者。尽管BCL-XL蛋白在多种血液肿瘤和实体肿瘤中高表达，能够协同抑制BCL-XL、BCL-2和MCL-1可以进一步克服ABT-199的耐药性，并且可以用于实体肿瘤的治疗，如Navitoclax(ABT-263)临床前期研究发现在小细胞肺癌的细胞系和小鼠的模型上表现出良好的活性，但由于BCL-XL对血小板的生成和维护的重要生理功能，抑制BCL-XL具有很强的血液毒副作用，最终ABT-263临床实验没有取得成功。
为了降低血液毒性，基于血小板生成系统缺少E3连接酶的表达，利用protac原理设计的BCL-XL蛋白降解剂可以有效的避免对血小板生成的影响(Weizhou Zhang，NATURE COMMUNICATIONS，2021，12，1281)，用于肿瘤治疗，例如急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、白血病、淋巴瘤、食管癌、肺癌(例如小细胞性肺癌、非小细胞性肺癌和肺腺癌)、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、结肠癌、肝癌、肾癌、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤(例如神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤或肉瘤)、眼癌(眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤)、前列腺癌、肾上腺皮质癌、骨癌、甲状腺癌或鼻咽癌等。如最近的专利公开：WO2021146536，WO2020163823，WO2019144117，WO 2021146536。
同时，ADC药物融合了抗体的肿瘤靶向作用和生物活性分子的高活性，成为一种生物导弹，具有非常可期待的疗效和安全性优势。抗体引导ADC结合到靶细胞，实现肿瘤组织富集作用，减少非靶组织暴露，结合的ADC随后被细胞内化，小分子药物在细胞内通过特定酶作用下发生的酶解释放，治疗疾病。因此可以期待由小分子BCL-2家族蛋白降解剂和肿瘤靶向抗体联合组成的ADC可以实现肿瘤富集，同时利用BCL-2家族蛋白降解剂低浓度下的催化降解活性，实现BCL-XL降解剂的治疗作用，同时消除或降低BCL-2家族蛋白抑制剂作用于非疾病组织而引起的毒副作用，提高治疗效果。
为此，本公开提供了一种包含BCL-2家族蛋白降解剂的抗体药物偶联物及其制备方法和用途。
发明内容
在本公开的第一方面，本公开提供式I所示的抗体药物偶联物，
或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，
其中：
Tb为抗体或其抗原结合片段；
q为药物抗体偶联比；
L为连接体；
D为BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体片段。
在一些实施方案中，所述BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体选自：选择性和非选择性的BCL-2蛋白降解靶向嵌合体、BCL-xl蛋白降解靶向嵌合体和MCL-1蛋白降解靶向嵌合体。
在一些实施方案中，所述BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体包含BCL-2家族蛋白结合部分和泛素化酶结合部分。
在一些实施方案中，所述泛素化酶结合部分选自：E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶结合部分。
在一些实施方案中，D具有式I所示结构，通过其存在的羟基或胺基与连接体L相连；
其中：
B为BCL-2家族蛋白结合剂片段；
Z为B和A的连接部分；
A为E3泛素连接酶结合片段，其结合到E3泛素连接酶。
在一些实施方案中，B为式I-1或I-2的结构单元，其中式I-1为：
通过羟基或氨基与Z相连；
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、NH2、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基和Y1-Y2；
Y1选自直接键、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基和C2-6炔基；
Y2选自-OR5a、-NR5aR5b、 1位和Y1相连；
各M独立地选自直接键、-CR6aR6b-；
R5a、R5b、R6a、R6b各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基；
R6选自RcSO2-、-NO2；
Rc选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基；
m选自0到6之间的任意整数；
式I-2为：
1位与Z相连；
其中，
Y3选自直接键、-O-、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、4-10元杂环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基；
Y4选自直接键、NH2、4-10元杂环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基，所述的4-10元杂环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基任选地被一个或多个NH2、OH、卤素取代；
x为0或1。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、NH2、氟、氯、溴、C1-4烷基、
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、NH2、氯、甲基、
在一些实施方案中，R1和R2各自独立地选自H、NH2、卤素、或
在一些实施方案中，R1和R2各自独立地选自H、NH2、氯、
在一些实施方案中，R1为H、NH2、或卤素，优选为卤素。
在一些实施方案中，R1为H、NH2、或氯，优选为氯。
在一些实施方案中，R2为H、或NH2，优选为氢。
在一些实施方案中，R3和R4各自独立地为H、C1-4烷基、
在一些实施方案中，R3和R4各自独立地选自H、甲基、
在一些实施方案中，R3为C1-4烷基。
在一些实施方案中，R3为甲基。
在一些实施方案中，R4为C1-4烷基、优选为C1-4烷基、或更优选为
在一些实施方案中，R4为甲基、优选为甲基、 更优选为甲基、或进一步优选为
在一些实施方案中，R5为H、或Y1-Y2；其中，Y1为直接键；Y2为优选为
在一些实施方案中，R5为H。
在一些实施方案中，R6为RcSO2-。
在一些实施方案中，Y1选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基。
在一些实施方案中，Y1为C1-4烷基。
在一些实施方案中，Y1为-CH2-。
在一些实施方案中，Y2选自-OH、-NH2、1位和Y1相连。
在一些实施方案中，Y2为NH2、1位和Y1相连。
在一些实施方案中，Y2为1位和Y1相连。
在一些实施方案中，Y2为1位和Y1相连。
在一些实施方案中，M选自直接键和CH2。
在一些实施方案中，R5a、R5b、R6a、R6b各自独立地选自H和C1-4烷基。
在一些实施方案中，R5a、R5b、R6a、R6b各自独立地选自H和甲基。
在一些实施方案中，Rc选自C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C3-6环烷基。
在一些实施方案中，Rc为C1-4卤代烷基，优选为C1-2卤代烷基，更优选为卤代甲基。
在一些实施方案中，Rc选自甲基和三氟甲基。
在一些实施方案中，Rc为三氟甲基。
在一些实施方案中，m选自0、1、2、3。
在一些实施方案中，m为1或2，优选为1。
在一些实施方案中，Y3-Y4为
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、Y1、R5a、R5b、R6a和R6b中，所述的C1-6烷基各自独立地为C1-4烷基，优选为C1-2烷基，更优选为甲基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4中，所述的卤素各自独立地优选为氟、氯或溴，更优选为氯。
在一些实施方案中，Rc中，所述的卤代烷基中的卤素各自独立地优选为氟、氯或溴，更优选为氟。
在一些实施方案中，B为所述式I-1的结构单元。
在一些实施方案中，B为式I-1的结构单元，
通过氨基与Z相连；
其中，R1为H、NH2、或卤素；R2为H、或NH2；R3为C1-4烷基；R4为C1-4烷基、 R5为H、或Y1-Y2；Y1为直接键，Y2为1位和Y1相连；R6为RcSO2-；Rc为C1-4卤代烷基；m为1或2；R5a和R5b各自独立地选自H和C1-4烷基。
在一些实施方案中，B选自下列结构，1位与Z相连：

在一些实施方案中，Z选自1位与B相连，2位与A相连；
W、V各自独立地选自
1位、2位可分别与其相邻的原子相连；
M1、M2和M3各自独立地选自直接键、-O-、-S-、-NR-、-CR2-、C1-6烷基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基、4-10元杂环基、6-12元螺环基、6-12元并环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，且M1、M2和M3每次出现的时候为相同或不同；
R选自H、C1-4烷基；
q1、q2、q3、q4和q5各自独立地选自0到20之间的任意整数。
在一些实施方案中，W和V各自独立地为
在一些实施方案中，M1、M2和M3各自独立地为C1-6烷基。
在一些实施方案中，M1、M2和M3各自独立地选自选自-O-、-S-、-CR2-、-CH2CH2O-、
在一些实施方案中，Z选自 1位和B相连，2位和A相连。
在一些实施方案中，Z为
在一些实施方案中，A选自
1位和Z相连。
在一些实施方案中，A选自
1位和Z相连。
在一些实施方案中，A为
在一些实施方案中，L为所示结构，其中，L1为延伸单元，L2为连接单元，L3为氨基酸单元，L4为间隔单元。
在本公开的第二方面，本公开提供式II所示的抗体药物偶联物，
或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，
其中：
Tb为抗体或其抗原结合片段；
q为药物抗体偶联比；
L1选自：
1位和S原子相连，2位与L2相连；
L2选自1位与L1相连，2位与L3相连；
n选自0-10之间的任意整数；
Y选自CH2、式中2位和X相连；
X选自CRmRn，NRm；
Rm、Rn各自独立地选自H、Me；
L3选自氨基酸残基或由2-10个氨基酸残基组成的短肽；所述的氨基酸残基选自天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基、AA1所示氨基酸残基或其立体异构体；
AA1所示氨基酸残基的结构如下所示，
其中：
Ra、Rb各自独立地选自H和且Ra、Rb不同时为H；
或者，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成4-10元杂环，所述4-10元杂环任选地被一个或多个R0所取代；
r、r1各自独立地选自0-20之间的任意整数；
Rm1、Rn1各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基；
或者，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成4-10元杂环，所述4-10元杂环任选地被一个或多个R0’所取代；
R0、R0’各自独立地选自C1-6烷基、C3-6环烷基、-NRm2Rn2和任选被C1-6烷基取代的4-10元杂环基；
Rm2、Rn2各自独立地选自H和C1-6烷基；
L4不存在或存在，L4存在时，L4选自1位与L3相连，2位与D相连；
D的定义如本公开中任一方案所述。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为具有肿瘤细胞表面抗原结合活性且具有肿瘤细胞内吞活性的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为具有抗原结合活性且肿瘤细胞内吞活性无或弱的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为结合肿瘤细胞表面非内吞抗原的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为不具有肿瘤细胞内吞活性的抗体或其抗原结合片段。
在一些优选地实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为具有结合肿瘤细胞表面抗原活性且具有肿瘤细胞内吞活性的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或全人抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段前抗(Probody)、双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)。
在一些实施方案中，Tb为具有内吞活性的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为具有结合肿瘤细胞表面抗原活性的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的靶点选自：B7H3、CD20、CD19、CD30、GPNMB、Her2、Trop-2、EGFR、Her3、GD-2、CD79b和BCMA等。
在一些实施方案中，Tb为抗B7H3抗体或其抗原结合片段、抗Trop-2抗体或其抗原结合片段、抗Her 2抗体或其抗原结合片段、抗Her3抗体或其抗原结合片段或抗EGFR抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗B7H3抗体或其抗原结合片段，例如1D1-01、2E3-02抗体、enoblituzumab，mirzotamab，omburtamab或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述1D1-01的VH序列如SEQ ID NO：1所示，VL序列如SEQ ID NO：2所示。在一些实施方案中，所述1D1-01的重链序列如SEQ ID NO：3所示，轻链序列如SEQ ID NO：4所示。
在一些实施方案中，所述2E3-02的VH序列如SEQ ID NO：5所示，VL序列如SEQ ID NO：6所示。在一些实施方案中，所述2E3-02的重链序列如SEQ ID NO：7所示，轻链序列如SEQ ID NO：8所示。
在一些实施方案中，Tb为抗B7H3单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗Trop-2抗体或其抗原结合片段，例如datopotamab，sacituzumab或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗Trop-2单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗Her 2抗体或其抗原结合片段，例如anbenitamab，coprelotamab，disitamab，gancotamab，margetuximab，pertuzumab，timigutuzumab，zanidatamab，Trastuzumab，Pertuzumab或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗Her2单克隆抗体或其抗原结合片段，例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗Her3抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗Her3单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗EGFR抗体或其抗原结合片段，例如demupitamab，depatuxizumab，futuximab，imgatuzumab，laprituximab，losatuxizumab，matuzumab，modotuximab，necitumumab，nimotuzumab，panitumumab，pimurutamab，serclutamab，tomuzotuximab，zalutumumab，Cetuximab或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，Tb为抗EGFR单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体具有结合B7H3抗原但不具有内吞活性的抗体。比如WO2021168379A1的INV721和I7-01。更具体的，Anti-B7H3的抗体具有WO2021168379A1所述的SEQ ID NO：2的VH和SEQ ID NO：1的VL。
在一些实施方案中，所述抗体具有结合GD-2抗原但不具有内吞活性的抗体。比如WO2021168379A1的INV721和GD2-5。更具体的，Anti-GD2的抗体具有WO2021168379A1所述的SEQ ID NO：4的VH和SEQ ID NO：3的VL。
在一些实施方案中，所述抗体具有结合CD20抗原但不具有内吞活性的抗体。尽管已显示所谓的“II型”CD20特异性抗体很难被CD20阳性靶细胞内化，但已发现其他所谓的“I型”CD20特异性抗体某种程度上被内化并降解，这取决于与其相互作用的靶细胞上激活和抑制FcγR的表达水平。在一些实施方案中，所述抗体具有结合CD20抗原但不具有内吞活性的抗体为II型”CD20特异性抗体，例如obinutuzumab。
在一些实施方案中，所述抗体具有结合非内吞(例如ALCAM/CD166)抗原活性的抗体。在一些实施方案中，所述抗体为包含EP3911682A1中SEQ ID No：73的VH和SEQ ID No：74的VL，SEQ ID No：75的VH和SEQ ID No：76的VL，SEQ ID No：77的VH和SEQ ID No：78的VL，或，SEQ ID No：79的VH和SEQ ID No：88的VL所示的抗体。
在一些实施方案中，q选自0.1-8.0之间的任意数值，在优选地实施方案中，q选自0.1-8.0之间的任意整数。
在一些实施方案中，q选自2-8之间的任意数值。
在一些实施方案中，q选自2、4、6和8。
在一些实施方案中，L1选自：
1位和S原子相连，2位与L2相连。
在一些实施方案中，L2选自 优选为 1位与L1相连，2位与L3相连。
在一些实施方案中，L2选自
优选为1位和L1相连，2位和L3相连。
在一些实施方案中，n为1-8之间任一整数。
在一些实施方案中，n选自1、2、3。
在一些实施方案中，Y为CH2、式中2位和X相连。
在一些实施方案中，X为CH2、NH或C(CH2)2。
在一些实施方案中，L1-L2选自 1位和S相连，2位和L3相连。
在一些实施方案中，L1-L2选自
1位和S相连，2位和L3相连。
在一些实施方案中，L3选自氨基酸残基Val、D-Val、Cit、Phe、Lys、Lys(Ac)、Leu、Gly、Ala、Asn、Asp、Arg、AA1或由2-10个选自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Asp、AA1的氨基酸残基组成的短肽。
在一些实施方案中，L3选自Val、Cit、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、AA1、Val-Cit、Val-Lys、Cit-Val、Cit-Ala、Val-Ala、Lys-Val、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Ala-Ala、Val-AA1、Ala-AA1、Gly-AA1、AA1-Gly、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Asp、Val-AA1-Gly、Ala-AA1-Gly、Gly-AA1-Gly、Lys-Ala-Ala-Asn、Lys-Ala-Ala-Asp、Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Phe、Val-Lys-Gly、Val-Lys-Gly-Gly、Val-Lys和Lys-Ala-Asn。
在一些实施方案中，L3选自Val-Cit、Val-Lys、Val-AA1和Val-AA1-Gly。
在一些实施方案中，L3选自 1位与L2相连，2位与L4或D相连。
在一些实施方案中，L3选自 1位与L2相连，2位与L4或D相连。
在一些实施方案中，Ra、Rb中，任一个为H，另一个为
在一些实施方案中，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成被R0取代的5-6元杂环。
在一些实施方案中，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成被R0取代的哌啶环或哌嗪环。
在一些实施方案中，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成被R0取代的哌啶环。
在一些实施方案中，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成1号碳原子为与Ra和Rb共同相连的碳原子。
在一些实施方案中，r、r1各自独立地选自0、1、2、3、4和5。
在一些实施方案中，r、r1各自独立地选自0和4。
在一些实施方案中，r为0，r1为4。
在一些实施方案中，Rm1、Rn1各自独立地选自H和C1-6烷基。
在一些实施方案中，Rm1、Rn1各自独立地选自H、甲基、乙基、正丙基和正丁基。
在一些实施方案中，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成任选被R0’取代的5-6元杂环。
在一些实施方案中，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成任选被R0’取代的哌啶环或哌嗪环。
在一些实施方案中，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成 1号氮原子为与Rm1和Rn1共同相连的氮原子。
在一些实施方案中，R0、R0’各自独立地选自C1-6烷基、-NRm2Rn2和任选被C1-6烷基取代的5-6元杂环基。
在一些实施方案中，R0选自C1-6烷基和被C1-6烷基取代的5-6元杂环基，所述5-6元杂环基选自哌啶基和哌嗪基。
在一些实施方案中，R0选自甲基、乙基和被甲基取代的5-6元杂环基，所述5-6元杂环基为哌啶基。
在一些实施方案中，R0选自甲基和被甲基取代的5-6元杂环基，所述5-6元杂环基为哌啶基。
在一些实施方案中，R0选自甲基、乙基和
在一些实施方案中，R0选自甲基和
在一些实施方案中，R0’选自C1-6烷基和-NRm2Rn2。
在一些实施方案中，R0’选自甲基和-NRm2Rn2。
在一些实施方案中，Rm2、Rn2为甲基。
在一些实施方案中，AA1所示氨基酸残基选自
在一些实施方案中，AA1所示氨基酸残基选自
在一些实施方案中，L4不存在。
在一些实施方案中，当L4不存在时，L3为2位与D相连。
在一些实施方案中，L4选自1位与L3相连，2位与D相连。
在一些实施方案中，连接体选自：


在一些实施方案中，D选自下列结构，其通过分子中1位的O或N原子与L相连：


在一些实施方案中，D选自上列结构，其通过分子中1位的O或N原子与L3或L4相连。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物选自以下：





在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物选自以下：
在本公开的第三方面，本公开提供式III所示的药物连接体偶联物，
或所述药物连接体偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，
其中，
Lg为可以和抗体发生反应的基团；L1、L2、L3、L4和D的定义如本公开中任一方案所述。
在一些实施方案中，Lg选自卤素、砜基、三级胺盐基(Me3N+、Et3N+)、重氮盐基、-OMs、MeSO2-、CF3SO3-、对甲苯磺酰基、取代的苯氧基，所述取代基包括卤素、硝基。
在一些实施方案中，Lg选自F、Cl、Br、MeSO2-、五氟苯氧基；更优选地；Lg为MeSO2-。
在一些实施方案中，L1和Lg-L1包含如下特征，
(1)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(2)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(3)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(4)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(5)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(6)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(7)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(8)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(9)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(10)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；
(11)当L1为时，Lg-L1为2位与L2相连；L2、L3、L4和D的定义如本公开中任一方案所述。
在一些实施方案中，当L1的定义如本公开中任一方案所述且不为时，Lg为和抗体反应时的离去基团；优选地，Lg选自卤素、砜基、三级胺盐基(Me3N+、Et3N+)、重氮盐基、-OMs、MeSO2-、CF3SO3-、对甲苯磺酰基；更优选地，Lg选自F、Cl、Br、MeSO2-；特别优选地，Lg为MeSO2-；L2、L3、L4和D的定义如本公开中任一方案所述；
当L1为时，Lg-L1为L2、L3、L4和D的定义如本公开中任一方案所述。
在一些实施方案中，所述药物连接体偶联物选自以下：





在本公开的第四方面，本公开提供式Ic所示结构的BCL-2家族蛋白降解剂、其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；
其中，
B、Z和A定义如本公开中任一方案所述。
在一些实施方案中，所述BCL-2家族蛋白降解剂选自以下：



在本公开的第五方面，本公开提供一种抗体药物偶联物中的连接体，其结构如下所示：
其中，1位与Tb相连，2位与D相连；
L1、L2、L3、L4的定义如本公开中任一方案所述。
在本公开的第六方面，本公开提供制备式II所示的抗体药物偶联物的方法，其包括：
将抗体Tb与式III所示的药物连接体偶联物Lg——L1—L2—L3—L4—D进行偶联反应；
其中，
Tb、L1、L2、L3、L4、Lg和D定义如本公开中任一方案所述。
具体地，所述方法包括将抗体Tb与式III所示的药物连接体偶联物Lg——L1—L2—L3—L4—D在合适的溶剂和条件下进行偶联反应形成C-S键的步骤。
在一些实施方案中，所述Tb与所述药物连接体偶联物的物质的量的比为1∶(1-20)，如1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶(10-20)、1∶(12-20)、1∶(14-20)、1∶(16-20)或1∶(18-20)。
在一些实施方案中，所述偶联反应在水和/或有机溶剂中进行。
在一些实施方案中，所述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、腈类(例如乙腈)、醇类(例如甲醇、乙醇)或其任意组合。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将偶联产物进行纯化的步骤。
在一些实施方案中，通过层析方法对所述偶联产物进行纯化。
在一些实施方案中，所述层析方法包括离子交换层析、疏水层析、反相层析或亲和层析中的一种或多种。
在本公开的第七方面，本公开提供制备式III所示药物连接体偶联物Lg——L1—L2—L3—L4—D的方法，其包括：
化合物IV通过二肽偶联得到化合物V，化合物V进一步脱保护并和相应羧酸偶联得到目标化合物VI。利用相同方法，也可以改变药物或二肽或羧酸部分结构，得到其它需要的目标产物。
本公开提供了药物组合物，其包含如前述的抗体药物偶联物、或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如前述的化合物、或所述化合物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如前述的药物连接体偶联物、其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物以及任选的一种或多种药用辅料。
本公开提供了前述的抗体药物偶联物、或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者前述的化合物、或所述化合物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如前述的药物连接体偶联物、其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者前述的药物组合物在制备治疗和/或预防与细胞活动异常相关的疾病(例如癌症疾病)的药物中的用途。
本公开提供了预防和/或治疗与细胞活动异常相关的疾病(例如癌症疾病)的方法，其包括：给予有需要的个体预防和/或治疗有效量的前述的抗体药物偶联物、或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者前述的化合物、或所述化合物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如前述的药物连接体偶联物、其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者前述的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开所述癌症疾病选自食管癌(例如食管腺癌或食管鳞状细胞癌)、脑瘤、肺癌(例如小细胞性肺癌、非小细胞性肺癌或肺腺癌)、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌(例如结肠癌或直肠癌)、肝癌、肾癌、尿路上皮癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤(例如神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤或肉瘤)、急性淋巴母细胞白血病、前列腺癌和甲状腺癌中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述疾病选自急性淋巴母细胞白血病、结肠癌、胃癌、非小细胞性肺癌和肺腺癌中的一种或多种，优选选自急性淋巴母细胞白血病、结肠癌、胃癌和非小细胞性肺癌结肠癌中的一种或多种，更优选选自胃癌、结肠癌和非小细胞性肺癌结肠癌中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述癌症疾病为与HER2、TROP2、B7H3、HER3、EGFR相关的癌症疾病。
在一些实施方案中，所述癌症疾病为实体肿瘤或血液肿瘤。
在本公开中，除非另有说明，否则本公开中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本公开中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
如本公开所使用，术语“药学上可接受的盐”的例子是由形成药学上可以接受的阴离子的有机酸形成的有机酸加合盐，包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；所述芳基磺酸盐为苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。也可形成合适的无机盐，包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐等。
药学上可接受的盐可使用本领域熟知的标准程序获得，例如，通过将足量的碱性化合物和提供药学上可以接受的阴离子的合适的酸反应。
如本公开所使用，术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)不对称中心的化合物中，其可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。类似地，本发明的化合物可以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合物(通常称作互变异构体)存在。互变异构体的代表性实例包括酮-烯醇互变异构体、苯酚-酮互变异构体、亚硝基-肟互变异构体、亚胺-烯胺互变异构体等。要理解，本申请的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的异构体或其混合物。
本公开中可使用实线(——)、实楔形或虚楔形描绘本发明的化合物的碳-碳键。使用实线以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，包括该碳原子处的所有可能的立体异构体(例如，特定的对映异构体、外消旋混合物等)。使用实或虚楔形以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，存在所示的立体异构体。当存在于外消旋混合物中时，使用实及虚楔形以定义相对立体化学，而非绝对立体化学。除非另外指明，否则本发明的化合物意欲可以立体异构体(其包括顺式及反式异构体、光学异构体(例如R及S对映异构体)、非对映异构体、几何异构体、旋转异构体、构象异构体、阻转异构体及其混合物)的形式存在。本发明的化合物可表现一种以上类型的异构现象，且由其混合物(例如外消旋混合物及非对映异构体对)组成。
本公开中，表示连接部分的连接点。
本公开的化合物可以溶剂合物(优选水合物)的形式存在，其中本公开的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。
本公开在其范围内进一步包括本发明的化合物的前药。通常这样的前药会是所述化合物的官能团衍生物，其易于在体内转化成期望的治疗活性化合物。因此，在这些情况中，用于本公开的治疗方法的术语“给药”应包括用所要求保护的化合物中的一种或多种的前药形式来治疗各种疾病或病症，但是在向个体给药后所述前药形式在体内转化成上述化合物。例如，在“Design of Prodrug”，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985中，描述了选择和制备适合的前药衍生物的常规方法。
本公开中，所述药用辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。根据其来源可分为天然物、半合成物和全合成物。根据其作用与用途可分为：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等；根据其给药途径可分为口服、注射、黏膜、经皮或局部给药、经鼻或口腔吸入给药和眼部给药等。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。
所述药物组合物可根据给药途径制成各种适宜的剂型。例如注射剂、植入剂等。其中，所述的药物组合物或适宜的剂型可以含有0.01mg至1000mg的本公开的化合物或其药学上可接受的盐或偶联物，适宜含有0.1mg至800mg，优选含有0.5-500mg，优选含有0.5至350mg，特别优选1-250mg。
所述药物组合物可以注射剂形式用药，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。其中， 可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
本公开使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本公开使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
在本公开中，术语“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本公开所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本公开中术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
本公开中，术语“有效剂量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一种或多种症状的化合物的量。
本公开中，术语“抗体药物偶联物”是指药物分子与抗体或其抗原结合片段部分或靶向部分连接得到的物质。在本公开的部分实施方案中，药物分子与抗体或其抗原结合片段通过连接体相连。所述连接体在特定环境(例如胞内低pH值环境)中或特定作用(例如溶酶体蛋白酶的作用)下能够断裂，从而使药物分子与靶向部分或抗体或其抗原结合片段分离。在本公开的部分实施方案中，所述连接体包含可切割或不可切割的单元，例如肽或二硫键。在本公开的部分实施方案中，药物分子与抗体或其抗原结合片段或靶向部分直接可以通过共价键相连，所述共价键在特定环境或作用下能够断裂，从而使药物分子与抗体或其抗原结合片段部分或靶向部分分离。
本公开中，术语“氨基酸”是指含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，由氨基基团(NH2)、羧基(COOH)和一个侧链组成。
本公开中，术语“药物”指BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体。
本公开中，术语“连接体”是指将药物分子与抗体或其抗原结合片段部分连接起来的片段。
本公开中，术语“抗体”取其最广义的解释，包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体以及由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们具有所需的生物学活性。在本公开中，“抗体”和“免疫球蛋白”可以互换使用。
在本公开中，术语“单克隆抗体”指抗体来自一群基本均一的抗体，即构成该集群的各抗体完全相同，除了可能存在的少量天然突变。单克隆抗体具有针对抗原的一个决定簇(表位)的高特异性，而与其相对的多克隆抗体则包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除了特异性之外，单克隆抗体的优点还在于合成时可以不受其他抗体的污染。此处修饰语“单克隆”表示该抗体的特征在于来自一个基本均一的抗体群，而不应理解成需由特殊方法制得。
在本公开的部分实施方案中，单克隆抗体还特别包括嵌合抗体，即重链和/或轻链的一部分与某种、某类或某亚类抗体相同或同源，其余部分则与另一种、另一类或另一亚类抗体相同或同源，只要它们具有所需的生物学活性(参见例如US 4,816,567；和Morrison等人，1984，PNAS，81：6851-6855)。可用于本公开的嵌合抗体包括灵长类化(primatized)抗体，其包含来自非人灵长类(例如古猴、猩猩等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列。
术语“抗体片段”是指抗体的一部分，优选是抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区片段，二抗体(diabody)，线性抗体和单链抗体分子。
术语“双特异性抗体”亦称为“双功能抗体偶联物”，是指由第一抗体(片段)和第二抗体(片段)通过偶联臂所形成的偶联物，该偶联物保留了各自抗体的活性，故具有双功能和双特异性。
术语“多特异性抗体”包括例如三特异性抗体和四特异性抗体，前者是具有三种不同抗原结合特异性的抗体，而后者是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。
术语“完整抗体”指包含抗原结合可变区和轻链恒定区(CL)、重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的抗体。恒定区可以是天然序列(例如人天然恒定区序列)或其氨基酸序列变体。完整抗体优选是具有一种或多种效应功能的完整抗体。
术语“前抗(Probody)”是一种修饰的抗体，包括一种抗体或一种抗体片段，能专门与其靶点结合，能够与掩蔽基团耦合，其中掩蔽基团指对抗体或抗体片段与其靶点的结合能力的裂解常数比没有耦合掩蔽基团的抗体或抗体片段与其靶点的结合能力的裂解常数至少大100倍或1000倍、或者10000倍。
在本公开中，非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指包含最少量非人免疫球蛋白序列的嵌合抗体。大多数人源化抗体是人接受者免疫球蛋白的超变区残基被置换成具有所需特异性、亲和力和功能的非人(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)超变区残基(供者抗体)。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基也被置换成非人残基。而且，人源化抗体还可以包含受者抗体或供者抗体中没有的残基。这些修饰是为了进一步优化抗体的性能。人源化抗体一般包含至少一个，通常是两个可变区，其中所有或几乎所有超变环(hypervanable loops)与非人免疫球蛋白的相对应，而FR则完全或几乎完全是人免疫球蛋白的序列。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc，通常是人免疫球蛋白Fc)的至少一部分。有关细节参见例如Jones等人，1986，Nature，321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332：323-329；和Presta，1992，Curr Op Struct Bwl 2：593-596。
完整抗体可根据重链恒定区的氨基酸序列分为不同的“类”。主要的五类是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类还可以分为不同的“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗体不同类的重链恒定区分别称为α、β、ε、γ和μ。免疫球蛋白不同类的亚基结构和三维构型是本领域中公知的。
在本公开中，尽管大多数情况下抗体中的氨基酸取代是被L-氨基酸取代，但也不限于此。在一些实施方案中，抗体肽链中可以包括一个或多个D-氨基酸。包含D-氨基酸的肽在口腔、肠道或血浆中比仅包含L-氨基酸的肽更加稳定而不易降解。
本公开所用的单克隆抗体可以由许多方法生产。例如，用于本公开的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法，使用许多物种(包括小鼠、仓鼠、大鼠和人的细胞)获得(参见例如Kohler等人，1975，Nature，256：495)，或者通过重组DNA技术制得(参见例如US 4,816,567)，或者从噬菌体抗体库中分离得到(参见例如Clackson等人，1991，Nature，352：624-628；和Marks等人，1991，Journal of Molecular Biology，222：581-597)。
在本公开的部分实施方案中，Tb为Trastuzumab或Pertuzumab。Trastuzumab是抗Her 2的单克隆抗体，其氨基酸序列是本领域技术人员已知的，其示意性序列可参见，例如CN103319599，末位Lys是容易缺失的但不影响生物活性，参见Dick，L.W.等人，Biotechnol.Bioeng.，100：1132-1143。
在本公开的部分实施方案中，抗Trop-2抗体为记载于美国专利第7,517,964号中的RS7(即本公开Sacituzumab)；以及记载于US2012/0237518中的hRS7(即本公开Sacituzumab)。可用于本公开的抗Trop-2抗体还可以通过CN103476941A中公开的载体设计、构建和构建展示抗体的抗体库的方法筛选获得，也可以索伦托医疗公司(Sorrento Therapeutics，Inc.)的文库进行筛选获得。
在本公开中，ErbB2和Her2/neu可互换使用，二者均表示天然序列的人Her2蛋白(Genebank登录号：X03363，参见例如Semba等人，1985，PNAS，82：6497-6501；和Yamamoto等人，1986，Nature，319：230-234)及其功能性衍生物，例如氨基酸序列变体。ErbB2表示编码人Her2的基因，neu表示编码大鼠p185neu的基因。在部分实施方案中，本公开的化合物或偶联物能够抑制或杀伤表达ErbB2受体的细胞，例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、唾液腺癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、甲状腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞或肝癌细胞。
在本公开中Trop-2或TROP2是指人滋养层细胞表面抗原-2(human trophoblast cell-surface antigens 2)，又称为TACSTD2、M1S1、GA733-1、EGP-1，其是由许多人类肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌)细胞表达的细胞表面受体。在部分实施方案中，本公开的化合物或偶联物能够抑制或杀伤表达TROP2受体的细胞，例如乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞或宫颈癌细胞。
在本公开的部分实施方案中，Tb为抗B7H3的单克隆抗体，或其抗原结合的片段。在一些实施方案中，所述抗B7H3抗体包括所有现有技术中的抗B7H3抗体，例如，参见CN112521512，WO2021027674，WO2021021543，WO2021006619，CN111662384，CN111454357，WO2020151384， WO2020140094，WO2020103100，WO2020102779，WO2020063673，WO2020047257，WO2020041626，CN110684790，CN110642948，WO2019225787，WO2019226017，US20190338030，CN110305213，WO2018209346，WO2018177393，US9150656，WO2016106004，WO2016044383，WO2016033225，WO2015181267，US20120294796，WO2011109400，CN101104639，WO2004093894，WO2002010187，WO2001018021。
本公开中，除非以其他方式明确指出，在本公开中通篇采用的描述方式“各...独立地选自”和“...各自独立地选自”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
AA1所示氨基酸残基的结构中，若r为0，则本领域技术人员可以理解的是，AA1所示氨基酸残基的结构将变为
AA1所示氨基酸残基的结构中，若Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成4-10元杂环，所述4-10元杂环任选地被一个或多个R0所取代，其中，术语“所述4-10元杂环任选地被一个或多个R0所取代”的含义为，所述4-10元杂环可以不被取代，也可以被一个或多个R0所取代，且所述多个R0中，各R0的定义可以相同，也可以不同。其余类似的定义可以参照前述内容进行理解。
在本说明书的各部分，本公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本公开包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
在本公开中，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
在本公开中，术语“C1-6烷基”表示直链或支链的含有1-6个碳原子的烷基，包括例如“C1-3烷基”或“C1-4烷基”，“C1-2烷基”，甲基，乙基等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基。
在本公开中，术语“C2-6烯基”是指含有至少一个双键且碳原子数为2-6的直链、支链或环状的烯基，包括例如“C2-4烯基”等。其实例包括但不限于：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1，3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1，3-戊二烯基、1，4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，4-己二烯基、环戊烯基、1，3-环戊二烯基、环己烯基、1，4-环己二烯基等。
在本公开中，术语“C2-6炔基”是指含有至少一个三键且碳原子数为2-6的直链或支链的炔基，包括例如“C2-4炔基”等。其实例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、5-甲基-2-己炔基等。
在本公开中，术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘。
在本公开中，术语“C3-6环烷基”是指含有3-6个碳原子的饱和环状烷基，包括环丙烷基(即环丙基)、环丁烷基(即环丁基)、环戊烷基(即环戊基)、环己基。
在本公开中，术语“C1-6烷氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的如上文所定义的烷基，包括例如“C1-3烷氧基”或“C1-4烷氧基”。具体实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
在本公开中，术语“C1-6卤代烷基”是指通过卤素连接至母体分子部分的如上文所定义的烷基，包括例如“C1-3卤代烷基”或“C1-4卤代烷基”。具体实例包括但不限于氯代甲基、氟代乙基、溴代 丙基等。
在本公开中，术语“4-10元杂环基”是指含有4-10个环原子(其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的环状基团。术语“4-6元杂环基”是指含有4-6个环原子(其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的环状基团。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。“4-8元杂环基”包括例如“4-8元含氮杂环基”、“4-8元含氧杂环基”、“4-7元杂环基”、“4-7元含氧杂环基”、“4-7元杂环基”、“4-6元杂环基”、“5-7元杂环基”、“5-6元杂环基”、“5-6元含氮杂环基”，包括但不限于氧代环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、高哌嗪基等。
在本公开中，术语“4-10元杂环”是指含有4-10个环原子(其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的环。术语“5-6元杂环”是指含有5-6个环原子(其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的环，包括但不限于吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、哌嗪、四氢吡喃等环。
在本公开中，术语“6-12元螺环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用一个碳原子所形成的、含有6-12个成环碳原子的环状结构。任选地，环状结构中的碳原子可以被氧代。“6-12元螺环基”包括例如、“6-11元螺环基”、“6-10元螺环基”、“7-10元螺环基”、“7-9元螺环基”、“7-8元螺环基”、“9-10元螺环基”、“3-10元螺环基”等，包括但不仅限于
等。
在本公开中，术语“6-12元并环基”是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子所形成的、含有6-12个环碳原子的环状结构，包括“6-11元并环基”、“6-10元并环基”、“6-8元并环基”、“10-12元并环基”、“7-10元并环基”等，包括但不限于
等。
在本公开中，术语“芳基”是指具有芳香性的单环或多环烃基，例如6-10元芳基、5-8元芳基等。具体的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基等。所述“6-10元芳基”是指含有6-10个环原子的芳基。所述“C6-10芳基”是指含有6-10个碳原子的芳基。
在本公开中，术语“杂芳基”是指具有芳香性的环状基团，其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。具体实例包括但不限于5-10元杂芳基、5-6元杂芳基、5-10元含氮杂芳基、6-10元含氧杂芳基、6-8元含氮杂芳基、5-8元含氧杂芳基等，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、1，4-二氧杂环己二烯基、2H-1，2-噁嗪基、4H-1，2-噁嗪基、6H-1，2-噁嗪基、4H-1，3-噁嗪基、6H-1，3-噁嗪基、4H-1，4-噁嗪基、哒嗪基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1，2，4，5-四嗪基、氮杂环庚三烯基、1，3-二氮杂环庚三烯基、氮杂环辛四烯基等。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选为条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本公开所用试剂和原料均市售可得。
发明的有益效果：
本公开所述BCL-2家族蛋白降解剂的抗体药物偶联物能够实现下述至少一种技术效果：
(1)降低BCL-XL抑制剂的用量，同时由于抗体药物偶联物的瘤内富集，减少抑制BCL-XL带来的血小板降低的毒性；克服了BCL-XL抑制剂以及蛋白降解剂因血小板毒性不能成药的问题；
(2)将BCL-XL蛋白降解剂的每天静脉给药变成每2-4周一次静脉给药，提高患者顺应性和便利性；
(3)本公开的抗体药物偶联物具有靶向选择性，能够在靶向细胞内富集；
(4)本公开的抗体药物偶联物具有胞外裂解能力，对抗原低表达或不表达的肿瘤依然有效，解决抗体药物偶联物机理相关的耐药问题。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本公开作进一步说明，但这并非是对本公开的限制。本领域技术人员根据本公开的教导，可以做出各种修改或改进，而不脱离本公开的基本思想和范围。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本公开中的缩写具有以下含义：
制备方案
以下的实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振(1H NMR)或质谱(MS)来确定。
核磁共振(1H NMR)的测定仪器使用Bruker 400MHz核磁共振仪；测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)、氘代氯仿(CDCl3)或六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)；内标物质为四甲基硅烷(TMS)。
实施例中使用的核磁共振(NMR)图谱中的缩写示于以下。
s：单峰(singlet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、dd：双二重峰(double doublet)、qd：四二重峰(quartet doublet)、ddd：双双二重峰(double double doublet)、 ddt：双双三重峰(double double triplet)、dddd：双双双二重峰(double double double doublet)、m：多重峰(multiplet)、br：宽峰(broad)、J：偶合常数、Hz：赫兹、DMSO-d6：氘化二甲基亚砜。δ值用ppm值表示。
质谱(MS)的测定仪器使用Agilent(ESI)质谱仪，型号为Agilent 6120B。
实施例1.中间体合成
实施例1.1：6-叠氮-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(INT1)的合成。
步骤一：
将化合物INT1-1(481.90mg，1.27mmol)和6-叠氮己酸(200mg，1.27mmol)溶于DMF(5mL)中，冰浴降温至0℃，一次性加入缩合剂DMTMM(456.86mg，1.65mmol)。保持0℃搅拌反应2h。LCMS监测反应。反应液用快速Flash纯化(A：H2O含0.05％FA，B：乙腈)，制备液冷冻干燥，得目标化合物INT1(500mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝519.32.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.92(s，1H)，8.09(d，J＝7.6Hz，1H)，7.86(d，J＝8.7Hz，1H)，7.54(d，J＝8.5Hz，2H)，7.23(d，J＝8.5Hz，2H)，5.98(t，J＝5.6Hz，1H)，5.43(s，2H)，4.42(s，2H)，4.41-4.33(m，1H)，4.19(dd，J＝8.5，7.0Hz，1H)，3.29(t，J＝6.9Hz，2H)，3.07-2.85(m，2H)，2.25-2.07(m，2H)，2.00-1.90(m，1H)，1.77-1.22(m，10H)，0.93-0.71(m，6H).
实施例1.2：(R)-7-(4-(3-((4-(N-(4-(4-((4′-氯-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酸(INT2)的合成。
步骤一：
将化合物INT2-1(2.0g，4.77mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)中，室温下加入2-碘酰基苯甲酸(4.01 g，14.32mmol)，加毕，将反应液置于70℃油浴反应4h。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)检测反应。反应液冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT2-2(1.8g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝418.14.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.57(s，1H)，7.89(d，J＝7.5Hz，2H)，7.68(d，J＝7.5Hz，2H)，7.52(d，J＝8.2Hz，1H)，7.44-7.36(m，4H)，7.32(m，4H)，7.18(m，1H)，4.34-4.28(m，2H)，4.20(m，1H)，4.10(m，1H)，3.06(m，2H)，2.79(m，1H)，2.60(m，1H).
步骤二：
将化合物INT2-2(1g，2.40mmol)，7-氧代-7-(哌嗪-1-基)庚酸甲酯(0.58g，2.4mmol)溶于DCM(20mL)中，室温搅拌10min，加入醋酸硼氢化钠(1.53g，7.20mmol)，继续搅拌反应1h，LCMS监测反应。向该反应液中加入饱和氯化铵(20mL)搅拌淬灭反应，加DCM(10mL)稀释反应液，分液，水相用DCM(10mL x 2)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水溶液(2 x 20mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(CH2Cl2/MeOH梯度洗脱)纯化，得目标化合物INT2-3(1.12g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝644.41.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.69(dd，J＝7.5，5.1Hz，2H)，7.34(m，9H)，7.17(t，J＝7.3Hz，1H)，4.32(d，J＝6.9Hz，2H)，4.21(t，J＝6.8Hz，1H)，3.62(m，2H)，3.57(s，3H)，3.04(m，2H)，2.27(m，10H)，1.91(s，1H)，1.85-1.71(m，2H)，1.62(m，1H)，1.49(m，5H)，1.25(m，2H).
步骤三：
将化合物INT2-3(1.12g，1.74mmol)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌下加入二乙胺(0.35g，4.85mmol)，继续搅拌反应1h。LCMS检测反应。该反应液用油泵浓缩至恒重，得目标产物INT2-4(730mg)，直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝422.31.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.86(m，4H)，7.21-7.15(m，1H)，3.57(s，3H)，3.39-3.35(m，4H)，3.11-3.04(m，1H)，2.97-2.90(m，2H)，2.37(m，2H)，2.33-2.19(m，10H)，1.72(m，1H)，1.53-1.42(m，5H)，1.29-1.22(m，2H).
步骤四：
将化合物INT2-4(730mg，1.73mmol)和4-氟-3-((三氟甲基)磺酰)苯磺酰胺(531.53mg，1.73mmol)溶于DMF(10mL)中，室温搅拌下加入DIPEA(447.17mg，3.46mmol)，搅拌过夜，LCMS检测反应。向反应液中加入DCM(40mL)稀释反应液，分别用水(50mL x 2)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(CH2Cl2/MeOH梯度洗脱)纯化，得目标化合物INT2-5(890mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝709.19.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.98(d，J＝2.2Hz，1H)，7.85(dd，J＝9.3，2.3Hz，1H)，7.37-7.28(m，5H)，7.24-7.18(m，1H)，7.06(d，J＝9.4Hz，1H)，6.92(d，J＝9.0Hz，1H)，4.11(m，1H)，3.57(m，4H)，3.31(m，4H)，2.27(m，10H)，2.19-2.09(m，2H)，1.80-1.70(m，1H)，1.48(m，5H)，1.25(m，2H)。
步骤五：
将化合物INT2-5(241mg，0.34mmol)，4-(4-((4′-氯-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(149.26mg，0.34mmol)，EDCI(130.36mg，0.68mmol)和DMAP(83.08mg，0.68mmol)溶于DCM(5mL)中，反应液在室温下搅拌72h。LCMS检测反应。反应液直接减压浓缩，粗品经柱层析(EA∶MeOH＝40∶1洗脱)纯化，得目标化合物INT2-6(300mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1130.40.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.11(s，1H)，7.94(d，J＝9.0Hz，1H)，7.71(d，J＝8.6Hz，2H)，7.40-7.27(m，5H)，7.18(d，J＝7.1Hz，1H)，7.12(d，J＝8.0Hz，2H)，6.97(m，1H)，6.84(m，2H)，4.07(m，1H)，3.56(s，4H)，3.27-3.16(m，8H)，2.67(m，3H)，2.32-2.16(m，10H)，1.99(m，4H)，1.77(m，1H)，1.58-1.37(m，8H)，1.24(m，6H)，0.97(s，6H)，0.87-0.81(m，2H).
步骤六：
室温下，将化合物INT2-6(300mg，0.27mmol)溶于THF(0.5mL)，EtOH(0.5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，搅拌下加入LiOH.H2O(19.40mg，0.81mmol)反应1h。LCMS检测反应。反应液浓缩得锂盐的水溶液，加入1N HCl溶液调pH＝2-3，有固体析出，过滤，滤饼干燥，得到目标化合物INT2(240mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1116.77.
实施例1.3：((S)-3，3-二甲基-1-((2S，4R)-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)吡咯烷-1-基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙酯(INT3)的合成。
步骤一：
将化合物INT3-1(750mg，1.42mmol)和DIPEA(734mg，5.68mmol)加入DMF(5mL)中，冰浴降温至0℃，缓慢滴加双(4-硝基苯)碳酸酯(1.7g，5.68mmol)的DMF(5mL)溶液。加毕室温搅拌反应16h。LCMS检测反应。反应液加DCM(50mL)稀释，加水(50mL)，萃取分液，水相用二氯甲烷萃取(30mL x 2)，合并有机相用饱和食盐水洗涤(100mL x 3)，无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝58∶42)纯化，得目标化合物INT3(980mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝694.74.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.99(s，1H)，8.51(d，J＝7.6Hz，1H)，8.38-8.27(m，2H)，7.66-7.59(m，2H)，7.45-7.37(m，5H)，5.93-5.78(m，1H)，5.36-5.19(m，2H)，5.17-5.04(m，1H)，4.98-4.86(m，1H)，4.54(t，J＝8.6Hz，1H)，4.50-4.36(m，2H)，4.30(d，J＝13.8Hz，1H)，4.12-4.05(m，1H)，3.81-3.73(m，1H)，2.47-2.42(m，4H)，2.11-2.00(m，1H)，1.39(d，J＝7.0Hz，3H)，0.98(s，9H).
实施例1.4：((S)-5-((S)-2-(6-叠氮基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-6-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(INT4)的合成。
步骤一：
将化合物INT4-1(670mg，1.49mmol)和6-叠氮己酸(234mg，1.49mmol)溶于DMF(5mL)中，冰浴降温至0℃，一次性加入缩合剂DMTMM(618mg，2.23mmol)。保持0℃搅拌反应2h。LCMS检测反应。反应液经反相柱层析(乙腈：H2O含0.1％FA＝10％-80％)纯化，得目标化合物INT4(840mg)。LCMS(ESI)[M+H-100]+＝490.38.
实施例1.5：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-(4-(N-(4-([(S)-4′-氯-4-甲基-4-((甲基氨基)甲基)-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(INT5)的合成。
步骤一：
将化合物INT5-1(1g，1.68mmol)溶于MeOH/THF/水的混合溶液(12mL，1∶1∶1)中，加入一水氢氧化锂(120mg，5.04mmol)，反应液在60℃下搅拌16h。将反应液减压浓缩除去MeOH和THF，再用稀盐酸(1M)调节pH至5～6，有大量固体析出，过滤，滤饼溶于乙酸乙酯，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT5-2(808mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝568.3.
步骤二：
将化合物INT5-2(400mg，0.70mmol)，化合物INT2-5(500mg，0.70mmol)溶于DCM(20mL)中，加入TEA(1g，10.58mmol)，EDCI(269mg，1.41mmol)，DMAP(171mg，1.41mmol)。反应液在30℃下搅拌反应16h。反应液直接减压浓缩，粗品经柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得目标化合物INT5-3(450mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1258.4.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.14(s，1H)，9.76(s，1H)，8.19(d，J＝2.2Hz，1H)，8.01(d，J＝9.1Hz，1H)，7.77(d，J＝8.3Hz，2H)，7.42(d，J＝7.9Hz，2H)，7.30(d，J＝7.4Hz，2H)，7.24(t，J＝7.6Hz，2H)，7.19-7.13(m，4H)，6.97(s，2H)，4.52-4.33 (m，1H)，4.17-4.05(m，2H)，3.98-3.86(m，2H)，3.70-3.57(m，4H)，3.22-3.11(m，6H)，2.93-2.78(m，8H)，2.37-2.29(m，5H)，2.19(t，J＝7.3Hz，3H)，2.15-2.10(m，2H)，2.03-1.95(m，2H)，1.56-1.45(m，8H)，1.42(s，9H)，1.32-1.23(m，5H)，0.98(s，3H)，0.88(t，J＝7.3Hz，1H).
步骤三：
将化合物INT5-3(450mg，0.36mmol)溶在THF和水(18mL，2∶1)的混合溶剂中，加入一水氢氧化锂(26mg，1.08mmol)，反应液在室温下搅拌反应16h。用稀盐酸(1M)调节反应液pH至5～6，再用乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有机相用饱和食盐水洗涤(30mL×2)，水洗涤(20mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT5-4(400mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1244.4.
步骤四：
将化合物INT5-4(300mg，0.24mmol)，化合物INT5-5(159mg，0.36mmol)溶于DCM(10mL)中，加入TEA(72mg，0.72mmol)，HATU(183mg，0.48mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h。向反应液中加入水(40mL)淬灭，DCM(40mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤(40mL×2)、水洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得标化合物INT5-6(190mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1671.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.99(s，2H)，8.37(d，J＝7.8Hz，1H)，8.15(d，J＝1.8Hz，1H)，8.00-7.95(m，1H)，7.79(d，J＝9.1Hz，1H)，7.73(d，J＝8.2Hz，2H)，7.45-7.42(m，2H)，7.40-7.37(m，4H)，7.36-7.29(m，2H)，7.28-7.24(m，2H)，7.19-7.12(m，3H)，7.09-7.02(m，1H)，6.95(s，1H)，6.89(d，J＝8.6Hz，2H)，5.10(d，J＝3.4Hz，1H)，4.97-4.88(m，1H)，4.52(d，J＝9.2Hz，1H)，4.45-4.38(m，1H)，4.29(s，1H)，4.11(s，1H)，3.63-3.59(m，2H)，3.13-3.07(m，14H)，2.93-2.87(m，4H)，2.46(s，3H)，2.33-2.23(m，8H)，2.14-2.09(m，2H)，2.02-1.98(m，2H)，1.88-1.73(m，2H)，1.52-1.45(m，6H)，1.41(s，9H)，1.39(s，2H)，1.37(s，2H)，1.27-1.23(m，3H)，1.20(s，4H)，1.18(s，9H)，1.17(s，4H).
步骤五：
将化合物INT5-6(200mg，0.12mmol)溶于EA(2mL)中，加入HCl/EA溶液(10mL，3M)，反应液在室温下搅拌反应1h。反应液减压浓缩，得目标化合物INT5的盐酸盐(200mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1571.5.
实施例1.6：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-(4-(N-(4-([(R)-4′-氯-4-甲基-4-((甲基氨基)甲基)-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(INT6)的合成。
步骤一：
将化合物INT6-1(500mg，0.84mmol)溶于MeOH、THF和水的混合溶液(6mL，1∶1∶1)中，加入一水氢氧化锂(40mg，1.68mmol)，反应液在60℃下搅拌反应16h。将反应液减压浓缩除去MeOH和THF，再用稀盐酸(1M)调节pH至5～6，有大量固体析出，过滤，滤饼溶于乙酸乙酯，经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得目标化合物INT6-2(420mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝568.9.
步骤二：
将化合物INT6-2(200mg，0.35mmol)，化合物INT2-5(227mg，0.32mmol)溶于DCM(10mL)中，加入TEA(162mg，1.6mmol)，EDCI(93mg，0.48mmol)，DMAP(88mg，0.48mmol)。反应液在30℃下搅拌反应16h。反应液减压浓缩，粗品经柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得目标化合物INT6-3(145mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1258.1.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.21(d，J＝7.6Hz，1H)，8.10(d，J＝1.9Hz，1H)，7.93(dd，J＝9.1，1.7Hz，1H)，7.71(d，J＝8.9Hz，2H)，7.46-7.32(m，5H)，7.29(t，J＝7.6Hz，2H)，7.19(t，J＝7.2Hz，1H)，7.14(d，J＝8.4Hz，2H)，6.94(dd，J＝16.3，8.5Hz，2H)，6.82(d，J＝9.0Hz，3H)，4.13-4.04(m，1H)，3.57(s，4H)，3.18(s，6H)，3.13-3.10(m，1H)，2.92-2.85(m，3H)，2.83-2.74(m，2H)，2.60-2.55(m，1H)，2.30-2.25(m，5H)，2.24-2.19(m，3H)，2.13-2.09(m，1H)，2.09-2.04(m，1H)，1.97-1.92(m，1H)，1.79-1.68(m，1H)，1.57-1.43(m，8H)，1.41(s， 9H)，1.35-1.30(m，1H)，1.28-1.22(m，5H)，1.18(t，J＝7.1Hz，2H)，0.94(s，3H)，0.88-0.83(m，1H).
步骤三：
将化合物INT6-3(310mg，0.24mmol)溶于THF和水(18mL，2/1)的混合溶剂中，加入一水氢氧化锂(18mg，0.74mmol)，反应液在室温下搅拌反应16h。用稀盐酸(1M)调节反应液pH至5～6，再用乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有机相用饱和食盐水洗涤(30mL×2)，水洗涤(20mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT6-4(280mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1244.0.
步骤四：
将化合物INT6-4(330mg，0.27mmol)，化合物INT5-5(142mg，0.32mmol)溶于DCM(10mL)中，加入TEA(54mg，0.53mmol)，HATU(201mg，0.53mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h。向反应液中加入水(40mL)淬灭，DCM(40mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤(40mL×2)，水洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得目标化合物INT6-5(337mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1672.4.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.98(d，J＝5.7Hz，1H)，8.37(d，J＝7.8Hz，1H)，8.13(d，J＝1.0Hz，1H)，7.98-7.93(m，1H)，7.79(d，J＝9.3Hz，1H)，7.72(d，J＝8.7Hz，2H)，7.46-7.31(m，9H)，7.26(t，J＝7.6Hz，2H)，7.18(d，J＝7.2Hz，1H)，7.13(d，J＝8.2Hz，2H)，7.01(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94-6.89(m，1H)，6.86(d，J＝8.6Hz，2H)，5.10(d，J＝3.3Hz，1H)，4.96-4.87(m，1H)，4.51(d，J＝9.3Hz，1H)，4.42(t，J＝7.9Hz，1H)，4.31-4.25(m，1H)，4.13-4.05(m，1H)，3.60(s，2H)，3.40-3.35(m，2H)，3.24-3.18(m，5H)，3.17(s，1H)，2.90-2.85(m，3H)，2.82-2.73(m，1H)，2.45(s，4H)，2.33-2.19(m，9H)，2.13-2.06(m，2H)，2.04-1.90(m，4H)，1.85-1.74(m，2H)，1.58-1.42(m，8H)，1.40(s，9H)，1.39-1.33(m，4H)，1.31-1.19(m，7H)，0.93(s，13H).
步骤五：
将化合物INT6-5(337mg，0.20mmol)溶于EA(2mL)中，加入HCl/EA溶液(10mL，3M)，反应液在室温下搅拌反应1h。反应液减压浓缩，得目标化合物INT6的盐酸盐(310mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1572.6.
实施例1.7：(5S，8S)-8-(4-(二甲氨基)丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5-异丙基-3，6，9，12-四氧代-2，15-二氧杂-4，7，10，13四氮杂十七烷-17-酸(INT7)的合成。
步骤一：
将化合物INT7-1(50.0g，107.07mmol)溶于MeOH(1000mL)中，加入醋酸钠(17.6g，214.1mmol)，冰浴条件下，加入多聚甲醛(57.8g，642.4mmol)，搅拌30min，再向反应体系中加入氰基硼氢化钠(13.5g，214.1mmol)，加毕，恢复至室温，反应液在室温下搅拌反应过夜；LCMS监测反应；反应液减压浓缩，粗品直接经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-70％)纯化，得目标化合物INT7-2(25g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝496.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.96(s，1H)，8.19(d，J＝7.5Hz，1H)，7.89(d，J＝7.5Hz，2H)，7.75(d，J＝7.4Hz，2H)，7.42-7.40(m，3H)，7.37-7.27(m，2H)，4.33-4.25(m，1H)，4.24-4.18(m，2H)，3.94-3.85(m，1H)，3.01-2.89(m，2H)，2.68(d，J＝4.7Hz，6H)，2.06-1.91(m，2H)，1.78-1.68(m，1H)，1.65-1.58(m，2H)，1.38-1.28(m，2H)，1.27-1.22(m，1H)，0.93-0.83(m，6H).
步骤二：
将化合物INT7-2(4.7g，9.5mmol)，化合物INT7-3(2.4g，9.5mmol)溶于DMF(50mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(3.2g，8.6mmol)，N，N-二异丙基乙胺(3.7g，28.5mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h；LCMS监测反应；反应液加入水(200mL)，EA(200mL*3)萃取，合并有机相，有机相经饱和食盐水(150mL*3)洗涤，无水Na2SO4干燥过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得目标化合物INT7-4(1.5g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝730.4.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.70(t，J＝6.6Hz，1H)，8.25(t，J＝6.2Hz，1H)，8.08(d，J＝7.3Hz，1H)，7.90(d，J＝7.5Hz，2H)，7.74(d，J＝7.3Hz，2H)，7.43-7.32(m，10H)，5.15(s，2H)，4.66-4.60(m，2H)，4.33-4.24(m，2H)，4.24-4.19(m，2H)，4.16(s，2H)，3.92-3.86(m，1H)，3.73(d，J＝5.9Hz，2H)，2.91-2.82(m，2H)，2.66(s，6H)，2.02-1.94(m，1H)，1.74-1.64(m，1H)，1.60-1.51(m，3H)，1.31-1.26(m，2H)，0.85(t，J＝6.0Hz，6H).
步骤三：
将化合物INT7-4(1.3g，1.7mmol)溶于EtOH(40mL)和EA(20mL)的混合溶剂中，加入Pd/C(400mg)，氢气置换三次，反应液于氢气氛围下搅拌反应16h；LCMS监测反应；反应液过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT7(780mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝640.4.
实施例1.8：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-)(4-(N-(4-(4-(S)-4-(S)-12-(S)2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-2，17-二甲基-3，8，11-三氧代-5-氧杂-2，7，10，17-四氮杂十八烷基)-4′-氯-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(INT8)的合成。
步骤一：
将化合物INT5(60mg，0.038mmol)，INT7(29mg，0.045mmol)溶于DMF(3mL)中，加入DIPEA(15mg，0.114mmol)，HATU(29mg，0.076mmol)。反应液在室温下搅拌16h。向反应液中加入水(40mL)淬灭，DCM(40mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤(40mL×2)、水洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，粗品经正相柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得目标化合物 INT8-1(45mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1097.2.
步骤二：
将化合物INT8-1(20mg，0.018mmol)溶于DMF(3mL)中，加入二乙胺(6mg，0.091mmol)，反应液在室温下搅拌2h。反应液减压浓缩，得目标化合物INT8(20mg)，直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝986.5.
实施例1.9：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-)(4-(N-(4-(4-(R)-4-(S)-12-(S)2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-2，17-二甲基-3，8，11-三氧代-5-氧杂-2，7，10，17-四氮杂十八烷基)-4′-氯-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(INT9)的合成。
步骤一：
将化合物INT6(100mg，0.06mmol)溶于DMF(2mL)中，再依次加入化合物INT7(49mg，0.07mmol)、HATU(48mg，0.12mmol)和DIPEA(33mg，0.24mmol)，加毕后，反应液室温下搅拌2h。向反应液中加入水(20mL)淬灭反应，乙酸乙酯萃取(20mL x 3)，合并有机相用饱和食盐水洗涤(20mL×1)、水洗涤(20mL×1)，无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，粗品经正相柱层析(DCM∶MeOH＝20∶1)纯化，得目标化合物INT9-1(105mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1097.3.
步骤二：
将化合物INT9-1(70mg，0.06mmol)溶于THF(2mL)，再加入二乙胺(31mg，0.6mmol)，反应液室温下搅拌1h。反应液直接减压浓缩，得目标化合物INT9(50mg)，直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝1971.8.
实施例1.10：32-(4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-5-氧代-3，9，12，15，18，21，24，27，30-壬氧基-6-氮杂三甲酸(INT10)的合成。
步骤一：
将化合物INT10-1(2.0g，13.3mmol)溶于THF和水(128mL，1∶1)的混合溶液中，加入过氧硫酸氢钾复合盐(40.8g，66.7mmol)，室温搅拌16h。反应液过滤，滤液用乙酸乙酯(150mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(100mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT10-2(2.5g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝182.9.
步骤二：
将化合物INT10-2(160mg，0.88mmol)，化合物INT10-3(622mg，0.88mmol)溶于叔丁醇和水(10mL，1∶1)的混合溶液中，加入硫酸铜(28mg，0.18mmol)和维生素C钠(35mg，0.18mmol)，反应液在室温下搅拌2h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％HCl＝5％-80％)纯化，得目标化合物INT10(170mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝737.3.
实施例1.11：(2S，4R)-1-((2S)-2-(7-(4-((3R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-氯-4-甲基-4-((甲基氨基)甲基)-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(INT11)的合成。
步骤一：
将化合物INT17(1g，1.68mmol)溶于甲醇(12mL)，四氢呋喃(6mL)和水(6mL)的混合溶液 中，加入一水氢氧化锂(120mg，5.04mmol)。反应液在60℃下搅拌反应16小时。LCMS监测反应。向反应液中滴加1N HCl水溶液，调节pH至5～6，有大量固体析出，过滤，滤饼溶于乙酸乙酯，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物INT11-1(808mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝568.3.
步骤二：
将化合物INT11-1(400mg，0.70mmol)，INT2-5(500mg，0.70mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，依次加入三乙胺(1.06g，10.58mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(269mg，1.41mmol)，4-二甲氨基吡啶(171mg，1.41mmol)。反应液在30℃下搅拌反应16h。LCMS监测反应。反应液减压浓缩，粗品经柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得目标化合物(450mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1258.4.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.14(s，1H)，9.76(s，1H)，8.19(d，J＝2.2Hz，1H)，8.01(d，J＝9.1Hz，1H)，7.77(d，J＝8.3Hz，2H)，7.42(d，J＝7.9Hz，2H)，7.30(d，J＝7.4Hz，2H)，7.24(t，J＝7.6Hz，2H)，7.19-7.13(m，4H)，6.97(s，2H)，4.52-4.33(m，1H)，4.17-4.05(m，2H)，3.98-3.86(m，2H)，3.70-3.57(m，4H)，3.22-3.11(m，6H)，2.93-2.78(m，8H)，2.37-2.29(m，5H)，2.19(t，J＝7.3Hz，3H)，2.15-2.10(m，2H)，2.03-1.95(m，2H)，1.56-1.45(m，8H)，1.42(s，9H)，1.32-1.23(m，5H)，0.98(s，3H)，0.88(t，J＝7.3Hz，1H).
步骤三：
将化合物INT11-2(450mg，0.36mmol)溶于四氢呋喃(14mL)和水(7mL)中，加入一水氢氧化锂(26mg，1.08mmol)。反应液在室温下搅拌反应16h。LCMS监测反应。向反应液中滴加1N HCl水溶液，调节pH至5～6，经乙酸乙酯萃取(30mL*3)，合并有机相经饱和食盐水30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物(400mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1244.4.
步骤四：
将化合物INT11-3(300mg，0.24mmol)，INT5-5(159mg，0.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三乙胺(72mg，0.72mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(183mg，0.48mmol)。反应液在室温下搅拌反应1h。LCMS监测。向反应液中加入水(15mL)，经二氯甲烷(25mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经制备TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得目标化合物(190mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1671.6.
步骤五：
将化合物INT11-4(200mg，0.12mmol)溶于盐酸/乙酸乙酯(10mL，3M)中。反应液在室温下搅拌反应1h。LCMS监测反应。反应液减压浓缩，得目标化合物INT11的盐酸盐(200mg)。
LCMS(ESI)[M+H]+＝1571.5.
实施例1.12：39-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，34-二氧代-3，9，12，15，18，21，24，27，30-九氧杂-6，33-二氮杂三十九烷酸(INT12)的合成。
步骤一：
将化合物INT12-1(550mg，1.0mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，氮气保护下加入Pd/C(100mg)，氢气置换三次，反应液于氢气氛围下室温搅拌反应2h。LCMS监测反应。将反应液过滤，滤 液减压浓缩，得到目标化合物(500mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝529.7.
步骤二：
将化合物INT12-2(500mg，1.0mmol)，化合物INT12-3(310mg，1.0mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(4mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(390mg，3.0mmol)，反应液在室温下搅拌反应2h。LCMS监测反应。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％盐酸＝5％-95％)纯化，得目标化合物INT12(300mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝722.3.
实施例1.13：4-(4-((4′-((叔丁氧基羰基)氨基)-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(INT13)的合成。
步骤一：
将化合物INT13-2(4.0g，18.16mmol)溶于DMF(60mL)中，加入TEA(7.1g，69.85mmol)，室温搅拌20min后依次加入碘化钠(628mg，4.19mmol)，INT13-1(3.9g，13.97mmol)。反应液在氮气保护下，80℃搅拌反应2h，LCMS监测反应。将反应液冷却至室温，向反应液中加入水(100mL)淬灭，EA(100mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(EA∶PE＝0～15％)纯化，得目标化合物INT13-3(4.1g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝422.8.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.91(d，J＝9.0Hz，2H)，6.85(d，J＝9.0Hz，2H)，3.86(s，3H)，3.36-3.25(m，4H)，3.15(s，2H)，2.62-2.50(m，6H)，2.04(s，2H)，1.47(t，J＝6.7Hz，2H)，0.96-0.92(m，6H).
步骤二：
将化合物INT13-3(3.0g，7.12mmol)，(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.5g，10.68mmol)，[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(260mg，0.36mmol)和碳酸钾(2.5g，17.80mmol)溶于1，4-dioxane(80mL)和水(16mL)中，氮气保护下，升温至100℃搅拌反应6h，LCMS监测反应。将反应液冷却至室温，向反应液中加入水(100mL)淬灭，EA(100mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析((EA∶PE＝0～18％))纯化，得目标化合物INT13-4(2.7g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝534.4.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.30(s，1H)，7.75(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(d，J＝7.6Hz，2H)，6.95-69.0(m，4H)，3.76(s，3H)，3.24(s，6H)，2.77(s，2H)，2.26-2.22(m，6H)，1.98(s，2H)，1.47(s，9H)，0.97(s，6H).
步骤三：
将化合物INT13-4(825mg，1.55mmol)溶于THF∶H2O(125mL，4∶1)的混合溶剂中，加入氢氧化钠(248mg，6.18mmol)，反应液在70℃搅拌反应48h，LCMS监测反应。反应液用饱和柠檬酸水溶液调pH至5～6，有大量固体析出，过滤，滤饼用水(30mL)洗涤，干燥，得目标化合物INT13(721mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝520.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.18(s，1H)，9.27(s，1H)，7.73(d，J＝8.8Hz，2H)，7.26(t，2H)，7.18(t，J＝7.7Hz，1H)，6.90(d，J＝8.9Hz，2H)，6.68(d，J＝7.3Hz，1H)，3.23(s，4H)，2.76(s，2H)，2.28(s，4H)，2.21(s，2H)，1.99(s，2H)，1.46(s，9H)，1.43(s，2H)，0.97(s， 6H).
实施例1.14：4-(4-((3′-((叔丁氧基羰基)氨基)-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(INT14)的合成。
步骤一：
将化合物INT13-3(3.0g，7.11mmol)，(3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)硼酸(2.5g，10.68mmol)，[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(260mg，0.36mmol)和碳酸钾(2.5g，17.80mmol)溶于1，4-dioxane/H2O(96mL，5∶1)中，反应液在氮气保护下，100℃搅拌6h，LCMS监测反应。待反应液冷却至室温，向反应液中加入水(50mL)淬灭，EA(50mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(EA∶PE＝0～18％)纯化，得目标化合物INT14-1(3.5g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝535.0.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.27(s，1H)，7.76(d，J＝8.8Hz，2H)，7.27(t，J＝7.5Hz，2H)，7.18(t，J＝7.8Hz，1H)，6.93(d，J＝8.9Hz，2H)，6.68(d，J＝7.4Hz，1H)，3.77(s，3H)，3.29-3.19(m，4H)，2.76(s，2H)，2.34-2.25(m，4H)，2.25-2.16(m，2H)，2.00(s，2H)，1.47(s，9H)，1.43(s，2H)，0.98(s，6H).
步骤二：
将化合物INT14-1(4.2g，7.81mmol)溶于THF∶H2O(125mL，4∶1)中，加入氢氧化钠(1.3g，31.25mmol)，反应液在110℃搅拌反应48h，LCMS监测反应。用饱和柠檬酸调节反应液pH至5～6，有大量固体析出，过滤，滤饼用水洗涤，干燥，得目标化合物INT14(2.9g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝520.3.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.21(s，1H)，9.26(s，1H)，7.73(d，J＝8.9Hz，2H)，7.26(t，2H)，7.18(t，J＝7.8Hz，1H)，6.90(d，J＝9.0Hz，2H)，6.68(d，J＝7.5Hz，1H)，3.23(s，4H)，2.76(s，2H)，2.28(s，4H)，2.21(s，2H)，1.99(s，2H)，1.46(s，9H)，1.44-1.38(m，2H)，0.97(s，6H).
实施例1.15：(R)-4-(4-(苯硫基)-3-((4-氨基磺酰基-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)丁基)哌嗪-1-羧酸烯丙酯(INT15)的合成。
步骤一：
将化合物INT2-2(2.5g，5.95mmol)溶于二氯甲烷(12mL)中，依次加入三乙胺(4.8g，23.79mmol)、INT15-1(1.01g，5.95mmol)。将反应体系降温至0℃，加入三乙酰氧基硼氢化钠(3.8g，8.92mmol)。反应液在室温下搅拌反应1h，LCMS监测反应。将反应液用水(50mL)淬灭，二氯甲烷萃取(80mL×3)，合并有机相用饱和食盐水洗涤(50mL×2)、水洗涤(50mL×2)，无水硫酸钠 干燥，抽滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化，得目标化合物(2.1g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝572.4.
步骤二：
将INT15-2(2.1g，3.67mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，再加入二乙胺(1.3g，18.39mmol)，反应液在室温下搅拌反应4h，TLC监测反应。反应液直接减压浓缩，得目标化合物(1.1g)，直接用于下一步反应。
步骤三：
将INT15-3(1.1g，3.15mmol)溶于1，4-二氧六环(20mL)中，依次加入N，N-二异丙基乙胺(954mg，9.45mmol)，4-氟-3-((三氟甲基)磺酰基)苯磺酰胺(1.16g，3.78mmol)，氮气置换3次，反应液在60℃下搅拌反应16h，LCMS监测反应。将反应液冷却至室温，倒入水(250mL)中，乙酸乙酯(70mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤(80mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经层析柱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶9)纯化，得目标化合物(1.5g)。LCMS(ESI)[M+Na]+＝659.2.
实施例1.16：(S)-2-((S)-2-(2，2-二甲基-4-(4-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丁酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(INT16)的合成。
步骤二：
将化合物INT16-2(1g，2.95mmol)溶在N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入N，N，N′，N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(1g，2.65mmol)，N，N-二异丙基乙胺(0.95g，7.38mmol)于反应液中，反应液在室温下搅拌反应30min，然后加入化合物INT16-1(808mg，2.95mmol)，继续搅拌反应1h，LCMS监测反应。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O＝5％-50％)纯化，得目标化合物INT16(400mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝596.4.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.54(s，2H)，9.19(s，1H)，7.64(d，J＝8.1Hz，1H)，7.51(d，J＝7.5Hz，1H)，6.04(s，1H)，5.44(s，2H)，4.52-4.34(m，2H)，4.12-4.04(m，1H)，4.03-3.92(m，1H)，3.44(s，3H)，2.99-2.81(m，2H)，2.28-2.18(m，1H)，2.17-2.07(m，2H)，1.77-1.64(m，1H)，1.58-1.47(m，1H)，1.42-1.31(m，2H)，1.23(d，J＝13.6Hz，6H)，0.90-0.84(m，6H).
实施例1.17：(S)-4-(4-((4-(((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)甲基)-4′-氯-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯和(R)-4-(4-((4-(((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)甲基)-4′-氯-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(INT17-P1&INT17-P2)的合成。
步骤一：
将化合物INT17-1(800mg，0.23mmol)溶于四氢呋喃(8mL)中，再缓慢加入甲胺的四氢呋喃溶液(2.3mL，2.3mmol)，加毕，室温下搅拌反应5min，再加入硼氢化钠(1.6g，3.45mmol)，反应液在室温下搅拌反应2h。LCMS监测反应。向反应液中加饱和氯化铵(80mL)淬灭后，用乙酸乙酯(60mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(60mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤 液减压浓缩，粗品经层析柱(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化，得目标化合物INT17-2(1.0g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝496.3.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.90(d，J＝8.9Hz，2H)，7.33(d，J＝8.4Hz，2H)，7.04(d，J＝8.3Hz，2H)，6.81(d，J＝9.0Hz，2H)，4.32(q，J＝7.1Hz，2H)，3.37(s，4H)，3.23-3.07(m，2H)，2.93(dd，J＝26.6，12.5Hz，2H)，2.78(s，3H)，2.66(d，J＝22.8Hz，4H)，2.41-2.30(m，3H)，1.82-1.60(m，2H)，1.36(t，J＝9.1，5.2Hz，3H)，1.31-1.24(m，2H)，1.20(s，3H).
步骤二：
将化合物INT17-2(8.0g，16.1mmol)，二碳酸二叔丁酯(3.5g，16.1mmol)和三乙胺(3.3g，32.2mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，反应液在室温下搅拌反应30min。TLC监测反应。向反应液中加入二氯甲烷(100mL)稀释，再用水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化，得目标化合物INT17(4.1g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝596.7.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.90(d，J＝9.0Hz，2H)，7.27(d，2H)，7.00(d，J＝8.1Hz，2H)，6.81(d，J＝9.0Hz，2H)，4.32(q，J＝7.1Hz，2H)，3.31-3.08(m，6H)，3.01-2.90(m，3H)，2.80(s，2H)，2.39-2.32(m，4H)，2.28(s，2H)，2.08(dd，J＝44.2，18.1Hz，2H)，1.63-1.50(m，2H)，1.47(s，9H)，1.36(t，J＝7.1Hz，3H)，0.99(s，3H).
步骤三：
将化合物INT17(3.5g)按照下表所述拆分方法进行拆分，得目标化合物INT17-P1(1.3g，保留时间RT＝4.439min)和INT-P2(1.4g，保留时间RT＝5.374min)。
拆分方法
实施例2.BCL-2家族蛋白降解剂(Payload)的合成
实施例2.1：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-)((S)-4′-氯-4-(-(2-羟基-N-甲基乙酰胺)甲基)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-(1，1′-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧庚烷酰胺-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(PL-1)的合成。
步骤一：
将化合物INT5(30mg，0.02mmol)，乙醇酸(3mg，0.04mmol)溶于DMF(2mL)中，加入TEA(6mg，0.06mmol)，DMTMM(8mg，0.03mmol)，反应液在30℃下搅拌反应16h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-95％)纯化，得目标化合物PL-1的三氟乙酸盐(2.2mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1629.1.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.99(s，1H)，8.36(d，J＝7.8Hz，1H)，8.18(d，J＝2.0Hz，1H)，8.03-7.94(m，1H)，7.77(t，J＝8.3Hz，3H)，7.43(t，J＝6.7Hz，4H)，7.39-7.36(m，2H)，7.29(d，J＝7.4Hz，2H)，7.26-7.23(m，3H)，7.21-7.15(m，4H)，7.14-7.12(m，2H)，7.02-6.95(m，4H)，5.75(s，1H)，4.95-4.87(m，1H)，4.51(d，J＝9.4Hz，1H)，4.43-4.39(m，1H)，4.28(s，1H)，4.13(s，2H)，3.64-3.57(m，8H)，3.01-2.98(m，3H)，2.89(s，2H)，2.73(s，2H)，2.57-2.54(m，6H)，2.45(s，3H)，2.34-2.27(m，4H)，2.16-2.08(m，4H)，2.05-1.96(m，4H)，1.86-1.72(m，2H)，1.52-1.44(m，6H)，1.37(d，J＝6.9Hz，3H)，1.28-1.22(m，8H)，1.00(s，3H)，0.93(s，9H).
实施例2.2：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-(R)-3-(4-(N-(4-(((R)-4′-氯-4-((2-羟基-N-甲基乙酰氨基)甲基)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-(((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(PL-2)的合成。
步骤一：
将化合物INT6(50mg，0.03mmol)，乙醇酸(6.8mg，0.09mmol)溶于DMF(1mL)中，加入TEA(10mg，0.09mmol)，DMTMM(17mg，0.06mmol)，反应液在30℃下搅拌反应16h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-95％)纯化，得目标化合物PL-2的三氟乙酸盐(3mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1630.7.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.98(s，1H)，8.35(d，J＝7.9Hz，1H)，8.18(d，J＝2.5Hz，1H)，7.99(dd，J＝9.2，2.6Hz，1H)，7.77(d，J＝8.9Hz，3H)，7.45-7.40(m，4H)，7.38(d，J＝8.3Hz，2H)，7.29(d，J＝7.5Hz，2H)，7.26-7.14(m，8H)，6.99-6.92(m，3H)，4.95-4.88(m，1H)，4.51(d，J＝9.5Hz，1H)，4.41(t，J＝8.0Hz，1H)，4.28(s，1H)，4.13(s，2H)，3.93-3.86(m，2H)，3.62-3.57(m，2H)，3.40-3.33(m，5H)，3.23-3.18(m，3H)，3.14-3.05(m，4H)，2.99(s，3H)，2.98-2.89(m，5H)，2.45(s，3H)，2.34-2.22(m，7H)，2.19-2.08(m，5H)，2.04-1.95(m，4H)，1.84-1.74(m，1H)，1.53-1.43(m，6H)，1.39-1.35(m，3H)，1.30-1.27(m，2H)，1.16(t，J＝7.2Hz，3H)，1.00(s，3H)，0.93(s，9H).
实施例2.3：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-氨基-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(PL-3)的合成。
步骤一：
将化合物INT13(160mg，0.22mmol)，化合物INT2-5(138mg，0.24mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(69mg，0.33mmol)，4-二甲氨基吡啶(182mg，0.64mmol)，三乙胺(74mg，0.55mmol)溶于DCM(5mL)中，加完后反应液室温搅拌反应3h。LCMS监测反应，向反应液中加入水(50mL)淬灭，DCM(50mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(MeOH∶DCM＝0～10％)纯化，得目标化合物PL-3-1(200mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1210.5.
步骤二：
将化合物PL-3-1(200mg，0.16mmol)溶于THF∶H2O(10mL，1∶1)，加入一水氢氧化锂(21mg，0.87mmol)，反应液在室温下搅拌反应2h，LCMS监测反应。用稀盐酸(1N)调节反应液pH至5～6，再用EA(30mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物PL-3-2(150mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1196.4.
步骤三：
将化合物PL-3-2(100mg，0.05mmol)，INT5-5(55mg，0.06mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(77mg，0.10mmol)，三乙胺(110mg，0.20mmol)溶于DCM(10mL)中，反应液室温搅拌反应2h。LCMS监测反应。向反应液中加入水(10mL)淬灭，DCM(10mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥有，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(MeOH∶DCM＝0～10％)纯化，得目标化合物(130mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1622.9.
步骤四：
将化合物PL-3-3(130mg，0.08mmol)溶于DCM(5mL)中，然后加入TFA(2mL)，反应液在室温下搅拌反应2h，LCMS监测反应。反应液减压浓缩，粗品经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-70％)纯化，得目标化合物PL-3(15mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1522.8.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)10.19(s，1H)，9.02-8.97(m，1H)，8.38(d，J＝7.7Hz，1H)，8.18(s，1H)，7.99(d，J＝10.2Hz，1H)，7.83-7.74(m，3H)，7.44(d，J＝7.9Hz，2H)，7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，7.29(d，J＝7.4Hz，2H)，7.26-7.11(m，9H)，6.97(t，J＝7.6Hz，3H)，4.97-4.84(m，1H)，4.51(d，J＝8.9Hz，1H)，4.42(t，J＝7.4Hz，2H)，4.28(s，1H)，4.22(s，1H)，4.07-3.97(m，1H)，3.88(d，J＝14.8Hz，3H)，3.59(s，3H)，3.37-3.31(m，6H)，3.20-2.94(m，6H)，2.87-2.64(m，4H)，2.46(s，3H)，2.35-2.22(m，6H)，2.21-2.13(m， 6H)，2.07-1.93(m，3H)，1.84-1.74(m，1H)，1.47(s，6H)，1.37(d，J＝6.8Hz，3H)，1.01(s，6H)，0.93(s，9H).
实施例2.4：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-氨基-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(PL-4)的合成。
步骤一：
将化合物INT14(182mg，0.40mmol)，化合物INT2-5(273mg，0.44mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(91mg，0.45mmol)，4-二甲氨基吡啶(84mg，0.45mmol)，三乙胺(91mg，0.75mmol)溶于DCM(5mL)中，加完后反应液置于室温搅拌反应3h。LCMS监测反应。向反应液中加入水(30mL)淬灭，DCM(30mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(MeOH∶DCM＝0～10％)纯化，得目标化合物PL-4-1(300mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1210.4.
步骤二：
将化合物PL-4-1(280mg，0.23mmol)溶在THF∶H2O(10mL，1∶1)，加入一水氢氧化锂(28mg，1.2mmol)，反应液在室温下搅拌反应2h，LCMS监测反应。用稀盐酸(1N)调节反应液pH至5～6，再用EA(30mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得目标化合物PL-4-2(200mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1196.4.
步骤三：
将化合物PL-4-2(180mg，0.15mmol)，INT5-5(99mg，0.18mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(138mg，0.30mmol)，三乙胺(198mg，3.0mmol)溶于DCM(5mL)中，反应液室温搅拌反应2h。向反应液中加入水(30mL)淬灭，DCM(30mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(MeOH∶DCM＝0～10％)纯化，得目标化合物PL-4-3(150mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1623.6.
步骤四：
将化合物PL-4-3(300mg，0.18mmol)溶于DCM(5mL)中，再加入HCl/1，4-dioxane(5mL，4N)， 加毕，反应液室温搅拌反应2h。LCMS监测反应。反应液直接减压浓缩，粗品经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-70％)纯化，得目标化合物PL-4(18mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1522.9.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.45(s，1H)，8.98(s，1H)，8.35(d，J＝8.1Hz，1H)，8.19(d，J＝2.2Hz，1H)，8.00(d，J＝8.9Hz，1H)，7.78(d，J＝8.6Hz，3H)，7.43(d，J＝8.2Hz，2H)，7.38(d，J＝8.3Hz，2H)，7.29(d，J＝7.6Hz，2H)，7.23(t，J＝7.6Hz，2H)，7.18-7.13(m，2H)，7.08(d，J＝9.1Hz，1H)，6.97(d，J＝9.0Hz，3H)，6.65-6.55(m，1H)，6.41(s，2H)，4.94-4.88(m，1H)，4.51(d，J＝9.1Hz，1H)，4.40(d，J＝8.1Hz，2H)，4.28(s，1H)，4.15-4.10(m，2H)，3.92-3.84(m，3H)，3.64-3.56(m，4H)，3.44-3.33(m，6H)，3.22-2.94(m，6H)，2.92-2.72(m，4H)，2.45(s，4H)，2.35-2.22(m，6H)，2.14-2.09(m，2H)，1.99(d，J＝11.0Hz，4H)，1.84-1.75(m，1H)，1.53-1.42(m，7H)，1.37(d，J＝7.0Hz，3H)，1.00(s，6H)，0.93(s，10H).
实施例2.5：N1-((4′-氯-6-((4-(4-(((4-(((R)-4-(4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)氨基甲酰基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)-4-甲基-2，3，4，5-四氢-[1，1′-联苯]-4-基)甲基)-N10-((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)癸二酰胺(PL-5)的合成。
步骤一：
将化合物PL-5-1(1.5g，2.7mmol)，化合物INT15(1.7g，2.7mmol)溶于DCM(40mL)中，加入三乙胺(5.2g，40.5mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.0g，5.4mmol)，4-二甲氨基吡啶(658mg，5.4mmol，反应液在30℃下搅拌反应16h，LCMS监测反应。反应液减压浓缩，粗品经柱层析(MeOH∶DCM＝0～10％)纯化，得目标化合物(1.8g)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1172.3.
步骤二：
将化合物PL-5-2(400mg，0.34mmol)溶于1，4-dioxane(10mL)中，再加入HCl/1，4-dioxane(10mL，4N)，加毕后室温搅拌反应2h，LCMS监测反应。反应液减压浓缩，得目标化合物PL-5-3得盐酸盐(380mg)，直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝1072.2.
步骤三：
将化合物PL-5-3(150mg，0.14mmol)，化合物PL-5-4(88mg，0.14mmol)溶于DMF(5mL) 中，加入N，N-二异丙基乙胺(90mg，0.7mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(80mg，0.21mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h，LCMS监测反应。向反应液中加入水(30mL)淬灭，DCM(30mL x 3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤、水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(MeOH∶DCM＝0～10％)纯化，得目标化合物PL-5-5(150mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1682.5.
步骤四：
将化合物PL-5-5(150mg，0.09mmol)，1，3-二甲基巴比妥酸(56mg，0.36mmol)溶于DCM/MeOH(20mL，1∶1)中，加入四(三苯基膦)钯(21mg，0.02mmol)。反应在氮气保护下50℃搅拌反应2h，LCMS监测反应。反应液减压浓缩，粗品经柱层析纯化(MeOH∶DCM＝0～10％)，得目标化合物(80mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1599.3.
步骤六：
将化合物PL-5-6(40mg，0.03mmol)，乙醇酸(4mg，0.5mmol)溶于DMF(3mL)中，加入三乙胺(8mg，0.8mmol)，4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(15mg，0.05mmol)。反应液在30℃下搅拌反应16h，LCMS监测反应。反应液经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-70％)纯化，得目标化合物PL-5(10mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝829.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.17(s，1H)，9.92(s，1H)，9.28(s，1H)，8.99(s，1H)，8.36(d，J＝7.7Hz，1H)，8.18(d，J＝1.9Hz，1H)，8.05-7.97(m，1H)，7.85(s，1H)，7.77(d，J＝8.9Hz，2H)，7.46-7.40(m，4H)，7.38(d，J＝8.2Hz，2H)，7.29(d，J＝7.4Hz，2H)，7.23(t，J＝7.5Hz，2H)，7.17(t，J＝7.0Hz，3H)，7.04-6.91(m，3H)，5.00-4.84(m，2H)，4.51(d，J＝9.3Hz，2H)，4.46-4.38(m，2H)，4.28(s，2H)，4.13(s，6H)，3.92(s，6H)，3.62-3.57(m，3H)，3.46-3.30(m，6H)，3.19(s，4H)，2.97(s，3H)，2.86-2.63(m，2H)，2.45(s，3H)，2.31-2.19(m，3H)，2.17-2.04(m，6H)，1.86-1.70(m，1H)，1.49(d，J＝6.8Hz，6H)，1.38(s，3H)，1.36(s，2H)，1.24(d，J＝10.4Hz，8H)，0.94(s，9H).
实施例3.药物-连接体的合成
实施例3.1：(3R，5S)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-氯-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)磺酰胺基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基(4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)己酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)碳酸酯(DL001)的合成。
步骤一：
将化合物INT3(350mg，0.50mmol)和化合物INT1(233.37mg，0.45mmol)加入DMF(5mL)中，溶解完全后依次加入HOBT(135.12mg，1.0mmol)，DIPEA(129.24mg，1.0mmol)，DMAP(73.3mg，0.6mmol)。加毕氮气保护下室温搅拌反应16h。LCMS检测反应。反应液用快速柱层析(A：H2O含0.05％FA，B：乙腈)纯化，得目标化合物DL001-1(400mg)。
LCMS(ESI)[M+H]+＝1073.10.
步骤二：
将化合物DL001-1(480mg，0.45mmol)加入DCM(10mL)和甲醇(1mL)中，溶解完全后依次加入四(三苯基膦)钯(104mg，0.09mmol)，1，3-二甲基巴比妥酸(351mg，2.25mmol)，加毕置换氩气，室温搅拌反应30min。LCMS检测反应。反应液加DCM(50mL)稀释，向反应液中加水(50mL)，萃取分液，水相用二氯甲烷萃取(50mLx2)，合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(A相：H2O含0.1％FA，B相：乙腈)纯化，得目标化合物DL001-2(270mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝989.5.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.06(s，1H)，8.99(s，1H)，8.53(d，J＝7.7Hz，1H)，8.12(d，J＝7.4Hz，1H)，7.85(d，J＝8.6Hz，1H)，7.62(dd，J＝8.7，6.8Hz，2H)，7.51-7.39(m，2H)，7.42-7.28(m，4H)，5.99(s，1H)，5.44(s，2H)，5.20(s，1H)，5.15-5.03(m，2H)，4.90(t，J＝7.1Hz，1H)，4.46(t，J＝8.6Hz，1H)，4.37(d，J＝7.0Hz，1H)，4.19(dd，J＝8.6，6.8Hz，1H)，3.99(d，J＝12.4Hz，1H)，3.67(d，J＝8.9Hz，1H)，3.31-3.27(m，1H)，3.05-2.90(m，3H)，2.53-2.51(m，2H)，2.45(s，3H)，2.25-2.08(m，2H)，2.02-1.90(m，2H)，1.75-1.21(m，15H)，0.95(s，9H)，0.84(dd，J＝11.9，6.7Hz，6H).
步骤三：
将化合物DL001-2(93.28mg，0.084mmol)加入DMF(1mL)中，依次加入HATU(43.35mg，0.11mmol)，DIPEA(14.73mg，0.11mmol)，加毕室温搅拌30min；然后加入化合物物INT2(75mg，0.076mmol)的DMF(1mL)溶液。LCMS检测反应。反应液加DCM(30mL)稀释，向反应液中加水(30mL)，萃取分液，水相用DCM萃取(20mLx2)，合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥， 过滤，滤液减压浓缩，粗品经制备TLC(DCM∶MeOH＝8∶1)纯化，得目标化合物DL001-3(60mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1044.6.
步骤四：
将化合物DL001-3(60mg，0.029mmol)和5-乙炔基-2-(甲基磺酰基)嘧啶(11mg，0.058mmol)加入DMSO∶H2O(0.5mL，4∶1)中，一次性加入溴化亚铜(7mg，0.044mmol)，加毕室温搅拌1h；LCMS检测反应。反应液加入DMF(0.8mL)助溶，经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.1％TFA＝15％～60％)纯化，得目标化合物DL001(24mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1135.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.20(s，1H)，10.04(s，1H)，9.81(s，1H)，9.48(s，3H)，8.97(d，J＝18.4Hz，2H)，8.43(d，J＝7.6Hz，1H)，8.17(d，J＝2.2Hz，1H)，8.12(d，J＝7.4Hz，1H)，8.00(dd，J＝9.2，2.3Hz，1H)，7.86(t，J＝8.4Hz，2H)，7.77(d，J＝8.6Hz，2H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.42(t，J＝8.3Hz，4H)，7.36(d，J＝8.2Hz，2H)，7.32(d，J＝8.3Hz，2H)，7.28(d，J＝7.3Hz，2H)，7.22(t，J＝7.5Hz，2H)，7.19-7.09(m，4H)，6.97(dd，J＝9.0，3.1Hz，3H)，6.03(s，1H)，5.15(s，1H)，5.12-5.00(m，2H)，4.90(p，J＝6.7Hz，1H)，4.55-4.32(m，6H)，4.22-4.08(m，3H)，4.03(d，J＝11.9Hz，2H)，3.92(s，2H)，3.60(s，2H)，3.44(s，3H)，3.37(dt，J＝14.7，8.8Hz，5H)，3.16(s，3H)，3.07-2.74(m，8H)，2.45(s，3H)，2.37-1.82(m，17H)，1.74-1.17(m，21H)，0.97(d，J＝24.0Hz，15H)，0.81(dd，J＝11.9，6.7Hz，6H).
实施例3.2：4-((S)-6-氨基-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)己酰胺基)丁酰胺基)己酰胺基)苄基((3R，5S)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-氯-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)氨基磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基)碳酸酯(DL002)的合成。
步骤一：
将化合物INT3(690mg，0.99mmol)和化合物INT4(496mg，0.84mmol)加入DMF(5mL)中，随后依次加入HOBT(267mg，1.98mmol)，DIEA(256mg，1.98mmol)，DMAP(145mg，1.19mmol)，加毕室温搅拌反应16h。LCMS检测反应，反应液用反相柱层析(乙腈：H2O含0.1％FA＝10％-80％)纯化，得目标化合物DL002-1(400mg)。LCMS(ESI)[M+Na]+＝1167.17.
步骤二：
将化合物DL002-1(250mg，0.22mmol)加入DCM(5mL)和甲醇(0.5mL)中，溶解完全后依次加入四(三苯基膦)钯(25mg，0.02mmol)，1，3-二甲基巴比妥酸(86mg，0.55mmol)，加毕氩气置换，室温搅拌反应30min。LCMS检测反应。反应液加DCM(20mL)稀释，向反应液中加水(30mL)，萃取分液，水相用DCM(20mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经反相柱层析(乙腈：H2O含0.1％FA＝10％-80％)纯化，得目标化合物DL002-2(170mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1060.59.
步骤三：
将化合物DL002-2(140mg，0.13mmol)加入DMF(2mL)中，依次加入HATU(49mg，0.13mmol)，DIEA(33.6mg，0.26mmol)，加毕室温搅拌30min；然后加入化合物物INT2(160mg，0.14mmol)的DMF(1mL)溶液。LCMS监测反应。反应液加DCM(20mL)稀释，向反应液中加水(30mL)，萃取分液，水相用DCM(20mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经制备TLC(MeOH∶DCM＝12.5％)纯化，得目标化合物DL002-3(136mg)。LCMS(ESI)[M/3+H]+＝720.18.
步骤四：
将化合物DL002-3(170mg，0.079mmol)和5-乙炔基-2-(甲基磺酰基)嘧啶(29mg，0.16mmol)加入二甲亚砜/水(0.5mL，4/1)中，一次性加入溴化亚铜(17mg，0.12mmol)，加毕室温搅拌1h，LCMS监测反应。反应液加入DMF助溶，经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.1％FA＝10％-80％)纯化，得目标化合物DL002-4(55mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1170.7.
步骤五：
配制DCM(3mL)和TFA(0.5mL)的混合溶液，然后加入DL002-4(45mg)，在常温下搅拌20min，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)监测反应，反应液常温减压浓缩，粗品经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.1％FA＝10％-80％)纯化，得目标化合物DL002的甲酸盐(20mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1120.2.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.20(s，1H)，10.05(s，1H)，9.59(s，1H)，9.48(s，2H)，8.97(d，J＝17.3Hz，2H)，8.43(d，J＝7.6Hz，1H)，8.20-8.11(m，2H)，7.99(d，J＝10.3Hz，1H)，7.87(d，J＝8.3Hz，2H)，7.77(d，J＝8.6Hz，2H)，7.70(s，3H)，7.60(d，J＝8.2Hz，2H)，7.42(t，J＝8.3Hz，4H)，7.40-7.25(m，6H)，7.22(t，J＝7.5Hz，2H)，7.15(dd，J＝7.9，5.3Hz，4H)，7.00-6.93(m，2H)，5.15(s，1H)，5.07(q，J＝12.1Hz，2H)，4.90(t，J＝7.2Hz，1H)，4.46(t，J＝7.0Hz，2H)，4.44-4.31(m，3H)，4.15(t，J＝7.7Hz，2H)，3.89(dd，J＝97.1，11.3Hz，15H)，3.60(s，2H)，3.44(s，3H)，3.36(dd，J＝17.4，9.9Hz，2H)，3.17(s，2H)，3.01-2.73(m，6H)，2.45(s，3H)，2.36-2.17(m，7H)，2.20-2.05(m，2H)，2.03(s，2H)，2.01-1.82(m，3H)，1.67(d，J＝31.7Hz，1H)，1.54(d，J＝7.0Hz，3H)，1.47(s，9H)，1.36(d，J＝7.0Hz，3H)，1.30-1.20(m，7H)，0.97(d，J＝22.0Hz，15H)，0.81(dd，J＝11.0，6.7Hz，6H).
实施例3.3：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((S)-4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二丙基氨基)丁基)-15-异丙基-2-甲基-22-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-3，8，11，14，17-五氧代-5-氧杂-2，7，10，13，16-五氮杂二十二烷-21-炔-1-基)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL003)的合成。
步骤一：
将化合物INT5(180mg，0.11mmol)，DL003-1(66mg，0.17mmol)溶于DMF(10mL)中，加入TEA(57mg，0.57mmol)，DMTMM(84mg，0.22mmol)，反应液在30℃下搅拌16h。反应液减压浓缩，粗品经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL003-2(80mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1938.7.
步骤二：
将化合物DL003-2(20mg，0.01mmol)溶于DMF(3mL)中，加入二乙胺(2mg，0.03mmol)，反应液在室温下搅拌2h。反应液直接减压浓缩，得目标化合物DL003-3(20mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1716.4.
步骤三：
将化合物DL003-3(80mg，0.05mmol)，化合物DL003-4(30mg，0.05mmol)溶于DMF(3mL)中，加入DIPEA(18mg，0.14mmol)，HATU(20mg，0.05mmol)，反应液在室温下搅拌1h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL003的三氟乙酸盐(7mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1139.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.17(s，1H)，9.85(s，1H)，9.35(s，1H)，9.12(s，2H)，8.99(s，1H)，8.69-8.61(m，1H)，8.36(d，J＝7.9Hz，1H)，8.22-8.16(m，2H)，8.09(d，J＝7.4Hz，1H)，8.04-7.97(m，1H)，7.94(d，J＝8.2Hz，1H)，7.82-7.74(m，3H)，7.45-7.42(m，3H)，7.38(d，J＝8.2Hz，2H)，7.29(d，J＝7.3Hz，2H)，7.23(t，J＝7.5Hz，2H)，7.17(t，J＝8.4Hz，3H)，7.01-6.93(m，3H)，4.94-4.89(m，1H)，4.63-4.58(m，2H)，4.51(d，J＝9.3Hz，1H)，4.41(t，J＝7.9Hz，2H)， 4.30-4.27(m，1H)，4.27-4.24(m，1H)，4.19-4.14(m，4H)，3.77-3.71(m，5H)，3.65-3.56(m，6H)，3.41(s，3H)，3.41-3.29(m，6H)，3.22-3.12(m，4H)，3.03-2.96(m，10H)，2.89-2.75(m，4H)，2.58-2.53(m，4H)，2.45(s，3H)，2.36-2.29(m，4H)，2.29-2.20(m，2H)，2.19-2.09(m，4H)，2.07-1.93(m，3H)，1.87-1.72(m，4H)，1.65-1.56(m，8H)，1.54-1.44(m，6H)，1.37(d，J＝7.0Hz，3H)，1.33-1.20(m，4H)，0.99(s，3H)，0.96-0.92(m，9H)，0.92(s，3H)，0.90(s，3H)，0.88-0.83(m，6H).
实施例3.4：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((R)-4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二丙基氨基)丁基)-15-异丙基-2-甲基-22-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-3，8，11，14，17-五氧代-5-氧杂-2，7，10，13，16-五氮杂二十二烷-21-炔-1-基)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL004)的合成。
步骤一：
将化合物INT6(110mg，0.07mmol)，DL003-1(54mg，0.14mmol)溶于DMF(5mL)中，加入TEA(22mg，0.21mmol)，DMTMM(39mg，0.14mmol)，反应液在30℃下搅拌反应16h。反应液减压浓缩，粗品经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL004-1(100mg)。
LCMS(ESI)[M/2+H]+＝969.8.
步骤二：
将化合物DL004-1(100mg，0.05mmol)溶于DMF(3mL)中，加入二乙胺(19mg，0.25mmol)，反应液在室温下搅拌反应2h。反应液直接减压浓缩，得目标化合物DL004-2(88mg)，直接用于下一步反应。
LCMS(ESI)[M+H]+＝1714.8.
步骤三：
将化合物DL004-2(88mg，0.05mmol)，化合物DL003-4(30mg，0.05mmol)溶于DMF(3mL)中，加入DIPEA(18mg，0.14mmol)，HATU(20mg，0.05mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL004(5mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1139.7.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.11(s，2H)，8.98(s，1H)，8.63(t，J＝6.3Hz，1H)，8.36(d，J＝8.2Hz，1H)，8.17(t，J＝5.3Hz，1H)，8.14(s，1H)，8.06(t，J＝5.5Hz，2H)，7.92(t，J＝8.2Hz，2H)，7.78(d，J＝9.3Hz，1H)，7.71(d，J＝8.3Hz，2H)，7.43(d，J＝8.2Hz，2H)，7.40-7.33(m，7H)，7.29(t，J＝7.5Hz，2H)，7.20(d，J＝7.0Hz，1H)，7.12(d，J＝8.0Hz，2H)，6.83(d，J＝9.6Hz，1H)，6.77(d，J＝8.6Hz，2H)，6.70(d，J＝9.0Hz，1H)，5.34-5.30(m，1H)，5.12-5.07(m，1H)，4.91(t，J＝7.3Hz，1H)，4.59(m，2H)，4.51(d，J＝9.4Hz，1H)，4.42(t，J＝7.8Hz，1H)，4.30-4.26(m，1H)，4.24-4.17(m，2H)，4.16(s，2H)，4.05-3.97(m，1H)，3.74-3.69(m，2H)，3.61-3.57(m，2H)，3.41(s，3H)，3.14-3.06(m，6H)，2.97(s，3H)，2.92-2.81(m，6H)，2.77-2.65(m，4H)，2.45(s，3H)，2.34-2.19(m，18H)，2.14-2.09(m，2H)，2.03-1.94(m，6H)，1.87-1.74(m，4H)，1.74-1.66(m，2H)，1.62-1.40(m，17H)，1.37(d，J＝7.0Hz，3H)，0.93(s，9H)，0.90-0.81(m，15H).
实施例3.5：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((S)-4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二甲基氨基)丁基)-15-异丙基-2-甲基-22-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-3，8，11，14，17-五氧代-5-氧杂-2，7，10，13，16-五氮杂二十二烷-21-炔-1-基)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL005)的合成。
步骤一：
将化合物INT8(45mg，0.023mmol)，化合物DL005-1(7mg，0.027mmol)溶于DMF(4mL)中，加入DIPEA(9mg，0.69mmol)，HATU(13mg，0.035mmol)，反应液在室温下搅拌反应16h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL005的甲酸盐(6mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1111.2.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.12(s，2H)，8.98(s，1H)，8.63(s，1H)，8.36(s，1H)，8.19(s，3H)，8.06(s，2H)，7.93(s，2H)，7.77(s，1H)，7.74-7.66(m，2H)，7.43(s，3H)，7.40-7.34(m，5H)，7.30(s，2H)，7.24-7.17(m，1H)，7.16-7.08(m，2H)，6.88-6.74(m，3H)，6.70(s，1H)，5.14(s，1H)，4.93(s，2H)，4.60(s，2H)，4.56-4.47(m，2H)，4.43(s，2H)，4.28(s，2H)，4.25-4.14(m，5H)，4.00(s，3H)，3.75-3.69(m，4H)，3.65-3.59(m，5H)，3.52(s，3H)，3.44-3.40(m，3H)，3.11(s，4H)，2.98(s，3H)，2.91(s，2H)，2.75(s，3H)，2.46(s，3H)，2.42(s，6H)，2.27(s，9H)，2.13(s，4H)，2.02-1.91(m，4H)，1.82(s，4H)，1.70(s，3H)，1.54-1.43(m，8H)，1.40-1.36(m，2H)，1.27(d，J＝17.8Hz，4H)，0.94(s，12H)，0.85(s，6H).
实施例3.6：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((R)-4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二甲基氨基)丁基)-15-异丙基-2-甲基-22-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-3，8，11，14，17-五氧代-5-氧杂-2，7，10，13，16-五氮杂 二十二烷-21-炔-1-基)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL006)的合成。
步骤一：
将化合物INT9(50mg，0.025mmol)溶于DMF(1mL)中，再依次加入化合物DL005-1(7.5mg，0.027mmol)、HATU(19.3mg，0.050mmol)和DIPEA(9.8mg，0.075mmol)，反应液室温下搅拌反应2h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL006的甲酸盐(15mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1111.2.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.11(s，2H)，8.98(s，1H)，8.61(t，J＝4.6Hz，1H)，8.38-8.32(m，4H)，8.19(s，1H)，8.09-8.03(m，2H)，7.97-7.89(m，2H)，7.79(d，J＝7.4Hz，1H)，7.71(d，J＝8.8Hz，2H)，7.43(d，J＝6.8Hz，2H)，7.40-7.37(m，4H)，7.30(t，J＝7.7Hz，2H)，7.21(d，J＝7.5Hz，2H)，7.13(d，J＝9.0Hz，2H)，6.82(d，J＝9.5Hz，1H)，6.76(d，J＝8.1Hz，2H)，6.68-6.65(m，1H)，5.33(t，J＝4.6Hz，1H)，4.96-4.88(m，1H)，4.63-4.56(m，2H)，4.51(d，J＝8.5Hz，1H)，4.42(t，J＝9.9Hz，1H)，4.28(d，J＝6.2Hz，1H)，4.21-4.15(m，4H)，4.07-3.94(m，2H)，3.74-3.67(m，4H)，3.62-3.59(m，3H)，3.14-3.07(m，10H)，2.97(s，3H)，2.76-2.72(m，2H)，2.69-2.67(m，1H)，2.46(s，3H)，2.30-2.22(m，12H)，2.11(s，6H)，2.05-1.96(m，10H)，1.85-1.77(m，4H)，1.74-1.60(m，4H)，1.50-1.44(m，8H)，1.39-1.36(m，4H)，1.29-1.26(m，6H)，0.95-0.93(m，9H)，0.87-0.82(m，9H).
实施例3.7：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((S)-4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二甲基氨基)丁基)-15-异丙基-2-甲基-48-(4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3，8，11，14，17，21-六氧代-5，19，25，28，31，34，37，40，43，46-十氧杂-2，7，10，13，16，22-六氮杂四十八烷)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL007)的合成。
步骤一：
将化合物INT8(45mg，0.023mmol)，化合物INT10(20mg，0.027mmol)溶于DMF(4mL)中，加入DIPEA(9mg，0.69mmol)，HATU(13mg，0.035mmol)。反应液在室温下搅拌反应16h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-95％)纯化，得目标化合物DL007的三氟乙酸盐(8mg)。LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1345.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.19(s，1H)，9.96(s，1H)，9.50(s，2H)，9.42(s，1H)，8.99(s，1H)，8.92(s，1H)，8.73-8.59(m，1H)，8.36(d，J＝7.8Hz，1H)，8.22-8.17(m，2H)，8.08-7.98(m，2H)，7.90(d，J＝8.5Hz，1H)，7.83-7.72(m，3H)，7.43(t，J＝6.6Hz，4H)，7.38(d，J＝8.1Hz，2H)，7.29(d，J＝7.4Hz，2H)，7.24(d，J＝5.6Hz，2H)，7.22-7.11(m，4H)，7.03-6.91(m，3H)，4.95-4.88(m，1H)，4.69-4.65(m，2H)，4.63-4.56(m，2H)，4.51(d，J＝9.4Hz，1H)，4.41(t，J＝8.0Hz，2H)，4.28(s，4H)，4.22(d，J＝7.6Hz，2H)，4.16(d，J＝15.2Hz，4H)，4.144.10(m，2H)，4.03(s，3H)，4.01(s，4H)，3.97(d，J＝2.4Hz，3H)，3.93-3.86(m，6H)，3.75-3.68(m，3H)，3.67-3.58(m，4H)，3.55(d，J＝5.3Hz，3H)，3.51-3.42(m，30H)，3.41-3.32(m，4H)，3.29-3.24(m，2H)，3.21-3.15(m，2H)，3.12(s，1H)，3.03-2.92(m，6H)，2.75(d，J＝4.4Hz，6H)，2.45(s，3H)，2.37-2.20(m，5H)，2.20-2.10(m，3H)，2.06-1.97(m，2H)，1.84-1.65(m，2H)，1.65-1.53(m，4H)，1.52-1.45(m，4H)，1.37(d，J＝7.0Hz，3H)，1.34-1.20(m，4H)，0.99(s，3H)，0.93(s，9H)，0.89-0.80(m，6H).
实施例3.8：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-(((R)-4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二甲基氨基)丁基)-15-异丙基-2-甲基-48-(4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3，8，11，14，17，21-六氧代-5，19，25，28，31，34，37，40，43，46-十氧杂-2，7，10，13，16，22-六氮杂四十八烷)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL008)的合成。
步骤一：
将化合物INT9(50mg，0.025mmol)溶于DMF(1mL)中，再依次加入INT10(21mg，0.027mmol)、HATU(19.3mg，0.050mmol)和DIPEA(9.8mg，0.075mmol)，加毕后，反应液室温下搅拌反应2h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL008的三氟乙酸盐(23mg)。LCMS(ESI)[M+H]+＝1345.9.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.14(s，1H)，9.49(s，2H)，9.17(s，1H)，9.03(s，1H)，8.99(s，1H)，8.90(s，1H)，8.64(t，J＝6.5Hz，1H)，8.35(d，J＝7.9Hz，1H)，8.23-8.15(m，2H)，8.11-7.96(m，2H)，7.89(d，J＝8.3Hz，1H)，7.77(d，J＝8.8Hz，2H)，7.49-7.40(m，4H)，7.40-7.33(m，2H)，7.33-7.26(m，2H)，7.26-7.21(m，2H)，7.21-7.12(m，4H)，7.02-6.90(m，3H)，4.97-4.87(m，1H)，4.68-4.64(m，1H)，4.65-4.55(m，2H)，4.51(d，J＝9.3Hz，1H)，4.41(t，J＝8.2Hz，2H)，4.31-4.22(m，2H)，4.22-4.16(m，2H)，4.16-4.10(m，1H)，4.07-4.00(m，2H)，3.99-3.94(m，2H)，3.92-3.86(m，2H)，3.81-3.71(m，2H)，3.70-3.58(m，6H)，3.57-3.53(m，5H)，3.53-3.48(m，19H)，3.47-3.44(m，20H)，3.24-3.06(m，10H)，3.05-2.95(m，6H)，2.92-2.81(m，4H)，2.79-2.70(m，6H)，2.47-2.40(m，4H)，2.37-2.26(m，4H)，2.24-2.19(m，1H)，2.19-2.05(m，4H)，2.05-1.91(m，3H)，1.85-1.77(m，1H)，1.74-1.66(m，1H)，1.65-1.54(m，4H)，1.54-1.42(m，5H)，1.37(d，J＝6.9Hz，3H)，1.32-1.19(m，4H)，1.00(s，3H)，0.97-0.90(m，8H)，0.89-0.77(m，5H).
实施例3.9：(2S，4R)-1-((2S)-2-(7-(4-((3R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-氯-4-((12S，15S)-12-(4-(二甲基氨基)丁基)-55-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-异丙基-2-甲基-3，8，11，14，17，21，50-七氧代-5，19，25，28，31，34，37，40，43，46-十氧杂--2，7，10，13，16，22，49-七氮杂五十五烷)-4-甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL009)的合成。
步骤一：
将化合物INT11(100mg，0.06mmol)，化合物INT7(41mg，0.06mmol)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(21mg，0.16mmol)，HATU(25mg，0.06mmol)，反应液在30℃下搅拌16h。向反应液中加入水(40mL)淬灭，DCM(40mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤(40mL×2)、水(40mL×2) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经柱层析(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，得目标化合物DL009-1(75mg)。
LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1097.1.
步骤二：
将化合物DL009-1(100mg，0.05mmol)溶于DMF(1mL)中，加入二乙胺(10mg，0.14mmol)，反应液在室温下搅拌2h。反应液减压浓缩，得目标化合物DL009-2(120mg)。
LCMS(ESI)[M/2+H]+＝986.0.
步骤三：
将化合物DL009-2(120mg，0.06mmol)，INT12(44mg，0.06mmol)溶于DMF(1mL)中，加入DIPEA(20mg，0.15mmol)，HATU(23mg，0.06mmol)，反应液在室温下搅拌反应1h。反应液直接经反相柱层析(乙腈：H2O含0.05％FA＝5％-50％)纯化，得目标化合物DL009的甲酸盐(7mg)。
LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1337.6.
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.26(s，1H)，8.99(s，1H)，8.66(s，1H)，8.37(d，J＝7.8Hz，1H)，8.19(d，J＝13.2Hz，3H)，8.06(s，1H)，7.99(s，1H)，7.91(d，J＝8.7Hz，1H)，7.79(d，J＝9.1Hz，4H)，7.44(d，J＝8.4Hz，4H)，7.38(d，J＝8.4Hz，2H)，7.29(d，J＝7.2Hz，2H)，7.26-7.20(m，3H)，7.16(d，J＝7.0Hz，3H)，7.01(s，2H)，6.96(s，3H)，5.32(s，1H)，4.91(s，1H)，4.60(s，2H)，4.51(d，J＝9.2Hz，1H)，4.41(s，2H)，4.28(s，2H)，4.18(s，2H)，4.01(s，2H)，3.97(s，2H)，3.72(s，2H)，3.59(s，3H)，3.50(s，34H)，3.26(d，J＝6.0Hz，4H)，3.17(d，J＝5.6Hz，5H)，2.99(s，6H)，2.75(d，J＝4.2Hz，6H)，2.67(s，1H)，2.45(s，3H)，2.33(s，3H)，2.23(s，2H)，2.12(s，2H)，2.05-1.96(m，9H)，1.79(s，1H)，1.69(s，1H)，1.59(s，4H)，1.46(s，10H)，1.37(d，J＝6.9Hz，3H)，1.24(s，15H)，1.16(s，2H)，1.00(s，3H)，0.93(s，9H)，0.85(dd，J＝12.4，6.3Hz，9H).
实施例3.10：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-((R)-3-((4-(N-(4-(4-((4′-((S)-2-((S)-2-(2，2-二甲基-4-(4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丁酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰胺基)-4，4-二甲基-3，4，5，6-四氢-[1，1′-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(DL010)的合成。
步骤一：
将化合物PL-3(50mg，0.03mmol)，INT16(25mg，0.04mmol)，1-丙基磷酸酐(105mg，0.15 mmol)以及三乙胺(30mg，0.09mmol)溶于DMF(1mL)中，反应液在室温下搅拌反应3h，LCMS监测反应。反应液经制备高效液相色谱(乙腈：H2O含0.05％TFA＝5％-70％)纯化，得目标化合物DL010(18mg)。
LCMS(ESI)[M/2+H]+＝1051.2.
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.08(s，1H)，9.47(s，2H)，8.99(s，1H)，8.93(s，1H)，8.39-8.33(m，1H)，8.18(s，1H)，8.10(d，J＝8.5Hz，1H)，8.01(d，J＝9.6Hz，1H)，7.77(d，J＝7.8Hz，3H)，7.58(d，J＝8.0Hz，2H)，7.44(d，J＝8.0Hz，2H)，7.38(d，J＝8.2Hz，3H)，7.29(d，J＝8.1Hz，2H)，7.23(t，J＝7.6Hz，3H)，7.18-7.12(m，2H)，7.10(s，1H)，7.02(d，J＝8.3Hz，2H)，6.96(d，J＝8.3Hz，4H)，6.03-5.91(m，1H)，5.48-5.27(m，2H)，4.92(t，J＝7.2Hz，1H)，4.52(d，J＝9.6Hz，1H)，4.41(t，J＝8.0Hz，5H)，4.31-4.27(m，1H)，4.18-4.11(m，2H)，3.93(dd，J＝11.6，8.1Hz，2H)，3.66-3.53(m，7H)，3.02-2.88(m，7H)，2.46(s，4H)，2.36-2.28(m，4H)，2.27-2.18(m，4H)，2.17-2.10(m，5H)，2.05-1.97(m，6H)，1.84-1.77(m，1H)，1.51-1.44(m，8H)，1.38(d，J＝7.0Hz，4H)，1.27-1.20(m，14H)，1.00(s，6H)，0.94(s，10H)，0.91-0.86(m，7H).
实施例2.抗体的制备和鉴定：参见WO2022170971A1中公开的方法制备抗B7H3抗体：1D1-01和2E3-02；其中1D1-01涉及序列SEQ ID NO：1(1D1-01VH)、SEQ ID NO：2(1D1-01VL)、SEQ ID NO：3(1D1-01HC)和SEQ ID NO：4(1D1-01LC)，2E3-02涉及序列EQID NO：5(2E3-02VH)、SEQ ID NO：6(2E3-02VL)、SEQ ID NO：7(2E3-02HC)和SEQ ID NO：8(2E3-02LC)，具体序列见序列表。
实施例3.抗体-药物偶联物(ADC)的制备
实施例3.1：B7H3-ADC-01的制备
取25ml 2E3-02抗体(抗B7H3，浓度28.5mg/ml，20mM醋酸缓冲液)，向其中加入25ml 20mM醋酸缓冲液稀释，随后添加1ml含有0.25M EDTA的水溶液并混匀，用0.5M磷酸氢二钠水溶液调样品pH至7.6后加入抗体4.5倍当量的20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)溶液并混匀，室温下反应90min。最后加入抗体10倍当量的溶解在DMSO中的DL-001，混匀后继续室温反应2h。反应结束后使用30KDa的超滤管将样品置换到pH为5.5的10mM组氨酸缓冲液中并去除低分子物质，最后将样品浓缩以获得含有抗B7H3抗体ADC组合物的溶液B7H3-ADC-01(DAR8)，质谱法测定DAR值为8.0。
实施例3.2：Her2-ADC-01的制备
取0.4mL Trastuzumab抗体(20.4mg/mL)，用0.004mL 20mM PB+100mM依地酸二钠溶液(pH 7.6)稀释，以0.5M Na2HPO4溶液调pH至7.76，加入20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，0.0152ml，0.304μmol)溶液混匀，室温放置90min。向上述溶液加入DL009(1.846mg，12倍抗体物质摩尔数量)的二甲基亚砜(0.0662mL)溶液，混匀，室温静置2h，完毕后采用离心超滤管(Merck，Amicon Ultra-15)进行换液，缓冲液置换为pH5.9的20mM His-Hcl缓冲溶液。得到DL009与Trastuzumab抗体的偶联产物Her2-ADC-01。质谱法测定DAR值为5.8。

表中，LC代表抗体轻链；HC代表抗体重链；DAR1代表包含轻链或重链偶联1个药物连接体偶联物；DAR2代表包含轻链或重链偶联2个药物连接体偶联物；DAR3代表包含轻链或重链偶联3个药物连接体偶联物。下文中LC、HC、DAR1、DAR2、DAR3如上说明。
测定曲妥珠单抗轻链偶联1个毒素分子(LC+DAR1比例为68％)、重链偶联3个毒素分子(HC+DAR3的比例为74％)，由此计算HER2-ADC-01的药物抗体偶联比(DAR值)为5.8。
药物抗体偶联比(DAR值)测定方法：
样品处理：取ADC样品50μg，用超纯水稀释到0.5mg/ml，然后加入的DTT(1μl，1M)，混匀后离心取上清液。
仪器信息：
液相参数：
质谱参数：
实施例3.3：Her2-ADC-02的制备
取0.3mL Trastuzumab抗体(24.7mg/mL)，用0.003mL 20mM PB+100mM依地酸二钠溶液(pH7.6)稀释，以0.5M Na2HPO4溶液调pH至7.5，在上述溶液中加入20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，0.0138ml，0.276μmol)溶液混匀，25℃水浴90min。向上述溶液中加入DL009(2.086mg，10倍抗体物质摩尔数量)的二甲基亚砜(0.1496mL)溶液，混匀，25℃水浴2h，完毕后采用离心超滤管(Merck，Amicon Ultra-15)进行换液，缓冲液置换为20mM His-Hcl，pH5.9缓冲溶液。得到DL009与Trastuzumab抗体的偶联产物Her2-ADC-02。质谱法测定DAR值为7.5。

测定曲妥珠单抗轻链偶联1个毒素分子(LC+DAR1比例为91％)、重链偶联2个、3个毒素分子(HC+DAR2的比例为3％、HC+DAR3的比例为93％)，由此计算HER2-ADC-02的抗体-药物偶联比(DAR值)为7.5。
药物抗体偶联比(DAR值)测定方法、仪器信息、质谱参数：同实施例3.2
液相参数：
实施例4.抗体药物偶联物(ADC)的生物活性测试
实施例4.1：ADC对体外细胞活性的抑制活性检测
使用胰酶通过常规方法对HT29、NCI-H358(HT29和NCI-H358为B7H3阳性肿瘤细胞)和Calu-3(Calu-3为B7H3阴性肿瘤细胞)肿瘤细胞进行消化，收集管细胞数，用对应的检测培养基 (含2％FBS)重悬，将2000-5000细胞/孔加至96孔板。2％FBS培养基稀释的B7H3-ADC-01(DAR8)加入100uL至96孔板，浓度从150μg/ml起始，3倍稀释(12个浓度梯度)。37℃5％CO2培养7天，然后每孔加入CCK8试剂20μL，反应至2-6小时，酶标仪读数(检测波长为450nm)。测试结果表明，本公开的ADC分子对HT29、NCI-H358、Calu-3肿瘤细胞均具有杀伤作用，但对Calu-3杀伤效果弱(IC50＞107ng/ml)，说明本公开的ADC分子在体外B7H3阳性与阴性肿瘤细胞中，具有很好的选择靶向性杀伤作用。
实施例4.2：ADC对N87肿瘤细胞增殖抑制活性测试
一、实验原理及方法：采用ADC处理N87肿瘤细胞，通过cell titer glo检测其细胞增殖抑制能力。其中，关键物料信息见表1：
表1关键物料
二、实验步骤：按照常规方法即37℃、5％CO2培养箱及细胞指定培养基培养N87(1640+10％FBS)肿瘤细胞。使用胰酶对N87肿瘤细胞进行消化，收集细胞并计数。使用对应的完全培养基重悬细胞至50000/ml，将细胞加至96孔板，100ul/孔。使用完全培养基稀释待测ADC，药物浓度从125nM起始，4倍稀释共9个梯度。已稀释的ADC 100uL加入至含100ul培养基及细胞的96孔板。37℃5％CO2培养4天。孵育结束后，每孔加入50ul cell titer glow底物，室温孵育5分钟后检测全波长荧光值。使用GraphPad软件作剂量依赖的细胞增殖抑制图并分析其半数抑制浓度(IC50，nM)。
三、实验结论：
测试结果表明，本公开的ADC分子在N87肿瘤细胞系上有明显的增殖抑制活性。测试结果如表2所示。
表2.ADC对N87细胞增殖抑制活性测试结果
实施例5.BCL-2家族蛋白降解剂(Payload)的体外细胞活性测试
实施例5.1：BCL-2家族蛋白降解剂(Payload)对MOLT-4肿瘤细胞增殖抑制活性测试
一、测试方法：
a)所有细胞株于37℃，5％CO2条件下培养于完全培养基。
b)收获处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。
c)使用完全培养基调整细胞密度，随后接种于96孔细胞培养板，每孔接种180μL，共5000个细胞。
d)将96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2条件下培养。
e)配制10倍药物溶液，待测化合物工作浓度最高浓度为50μM，10个浓度，5倍稀释；然后转移连续稀释化合物各20μL至96孔细胞板的相应实验孔中，每个药物浓度设置三个复孔。
f)将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2条件下继续培养120小时，之后进行2.0分析。
g)融化CellCounting-Lite 2.0 Luminescent Cell Viability Assay试剂并平衡细胞板至室温30分钟。
h)每孔加入等体积的CellCounting-Lite 2.0 Luminescent Cell Viability Assay溶液。
i)在定轨摇床上振动5分钟使细胞裂解。
j)将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号。
k)读取冷光值，收集数据。
其中，关键物料信息见表3
表3关键物料
二、实验结论：
测试结果表明，本公开的BCL-2家族蛋白降解剂(Payload)在MOLT-4细胞上具有明显的增殖抑制活性。测试结果如表4所示。
表4 Payload对MOLT-4细胞增殖抑制活性测试结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。另外各实施例之间的技术方案可以相互结合，但必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础；当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

Claims (19)

  1. 式I所示的抗体药物偶联物，
    或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，
    其中：
    Tb为抗体或其抗原结合片段或靶向部分；
    q为药物抗体偶联比；
    L为连接体；
    D为BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体片段，所述BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体包含BCL-2家族蛋白结合部分和泛素化酶结合部分。
  2. 如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体选自：选择性BCL-2蛋白降解靶向嵌合体、非选择性的BCL-2蛋白降解靶向嵌合体、BCL-XL蛋白降解靶向嵌合体和MCL-1蛋白降解靶向嵌合体；
    优选地，所述泛素化酶结合部分选自：E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶结合部分。
  3. 如权利要求1或2所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述BCL-2家族蛋白降解靶向嵌合体D为具有式I所示结构的BCL-2家族蛋白降解剂，通过式I上存在的羟基或胺基与连接体L相连；
    其中：
    B为BCL-2家族蛋白结合剂片段；
    Z为B和A的连接部分；
    A为E3泛素连接酶结合片段，其结合到E3泛素连接酶。
  4. 如权利要求3所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种或多种：
    (1)所述B为式I-1或I-2的结构单元，
    通过羟基或胺基与Z相连，
    其中：
    R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、NH2、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基和Y1-Y2；
    Y1选自直接键、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基和C2-6炔基；
    Y2选自-OR5a、-NR5aR5b、 1位和Y1相连；
    各M独立地选自直接键、-CR6aR6b-；
    R5a、R5b、R6a、R6b各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基；
    R6选自RcSO2-、NO2；
    Rc选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基；
    m选自0到6之间的任意整数；
    (2)所述Z选自1位与B相连，2位与A相连；
    W、V各自独立地选自
    1位、2位可分别与其相邻的原子相连；
    M1、M2和M3各自独立地选自直接键、-O-、-S-、-NR-、-CR2-、C1-6烷基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基、4-10元杂环基、6-12元螺环基、6-12元并环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，且M1、M2和M3每次出现的时候为相同或不同；
    R选自H、C1-4烷基；
    q1、q2、q3、q4和q5各自独立地选自0到20之间的任意整数；
    (3)所述A选自
    1位和Z相连。
  5. 如权利要求3或4所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种或多种：
    (1)所述R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、NH2、氟、氯、溴、C1-4烷基、
    优选地，所述R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、NH2、氯、甲基、
    更优选地，所述R1和R2各自独立地选自H、NH2、氯、R3和R4各自独立地选自H、甲基、
    (2)所述Y1选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基；优选地，Y1为CH2；
    (3)所述Y2选自-OH、-NH2、1位和Y1相连；优选地，Y2为NH2、1位和Y1相连；
    (4)所述M选自直接键和CH2；
    (5)所述R5a、R5b、R6a、R6b各自独立地选自H和甲基；
    (6)所述Rc选自C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C3-6环烷基；
    优选地，Rc选自甲基和三氟甲基；
    (7)所述m选自0、1、2、3；
    (8)所述Y3-Y4为
    (9)所述M1、M2和M3各自独立地选自选自-O-、-S-、-CR2-、-CH2CH2O-、
  6. 如权利要求3-5任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种或多种：
    (1)所述B选自下列结构，1位与Z相连：


    (2)所述Z选自 1位和B相连，2位和A相连；
    (3)所述A选自
    1位和Z相连。
  7. 一种式II所示的抗体药物偶联物，
    或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，
    其中：
    Tb为抗体或其抗原结合片段；
    q为药物抗体偶联比；
    L1选自：
    1位和S原子相连，2位与L2相连；
    L2选自1位与L1相连，2位与L3相连；
    n选自0-10之间的任意整数；
    Y选自CH2、式中2位和X相连；
    X选自CRmRn，NRm；
    Rm、Rn各自独立地选自H、Me；
    L3选自氨基酸残基或由2-10个氨基酸残基组成的短肽；所述的氨基酸残基选自天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基、AA1所示氨基酸残基或其立体异构体；
    AA1所示氨基酸残基的结构如下所示，

    其中：
    Ra、Rb各自独立地选自H和且Ra、Rb不同时为H；
    或者，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成4-10元杂环，所述4-10元杂环任选地被一个或多个R0所取代；
    r、r1各自独立地选自0-20之间的任意整数；
    Rm1、Rn1各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基；
    或者，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成4-10元杂环，所述4-10元杂环任选地被一个或多个R0’所取代；
    R0、R0’各自独立地选自C1-6烷基、C3-6环烷基、-NRm2Rn2和任选被C1-6烷基取代的4-10元杂环基；
    Rm2、Rn2各自独立地选自H和C1-6烷基；
    L4不存在或存在，L4存在时，L4选自1位与L3相连，2位与D相连；
    D如权利要求1-6任一项所定义。
  8. 如权利要求7所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种：
    (1)所述Tb为：具有肿瘤细胞表面抗原结合活性且具有肿瘤细胞内吞活性的抗体或其抗原结合片段，具有抗原结合活性且肿瘤细胞内吞活性无或弱的抗体或其抗原结合片段，结合肿瘤细胞表面非内吞抗原的抗体或其抗原结合片段，或者，不具有肿瘤细胞内吞活性的抗体或其抗原结合片段；
    (2)所述Tb为具有结合肿瘤细胞表面抗原活性且具有肿瘤细胞内吞活性的抗体或其抗原结合片段；
    (3)所述Tb的靶点选自：B7H3、CD20、CD19、CD30、GPNMB、Her2、Trop-2、EGFR、GD-2，CD79b和BCMA；
    (4)所述Tb为抗B7H3抗体或其抗原结合片段、抗Her 2抗体或其抗原结合片段、抗Trop-2抗体或其抗原结合片段或抗EGFR抗体或其抗原结合片段；
    (5)所述Tb为抗B7H3抗体或其抗原结合片段，例如1D1-01、2E3-02抗体、enoblituzumab，mirzotamab，omburtamab或其抗原结合片段；优选地，Tb为2E3-02抗体；
    (6)所述Tb为抗Her2抗体或其抗原结合片段，例如anbenitamab，coprelotamab，disitamab，gancotamab，margetuximab，pertuzumab，timigutuzumab，zanidatamab，Trastuzumab，Pertuzumab或其抗原结合片段；优选地，Tb为Trastuzumab或Pertuzumab；例如，Tb为Trastuzumab；
    (7)所述Tb为抗Trop-2抗体或其抗原结合片段，例如datopotamab，sacituzumab或其抗原结合片段；
    (8)所述Tb为抗EGFR抗体或其抗原结合片段，例如demupitamab，depatuxizumab，futuximab，imgatuzumab，laprituximab，losatuxizumab，matuzumab，modotuximab，necitumumab，nimotuzumab，panitumumab，pimurutamab，serclutamab，tomuzotuximab，zalutumumab，Cetuximab或其抗原结合片段。
  9. 如权利要求7-8任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种或多种：
    (1)所述q选自0.1-8.0之间的任意数值，在优选地实施方案中，q选自0.1-8.0之间的任意整数；
    优选地，q选自2-8之间的任意数值；
    更优选地，q选自2、4、6和8；
    (2)所述L1选自：
    1位和S原子相连，2位与L2相连；
    (3)所述L2选自 1位与L1相连，2位与L3相连；
    优选地，L2选自 1位和L1相连，2位和L3相连；
    (4)所述n选自1、2、3、4、5、6、7、8；
    (5)所述Y为CH2、式中2位和X相连；
    (6)所述X为CH2、NH或C(CH2)2；
    (7)所述L3选自氨基酸残基Val、D-Val、Cit、Phe、Lys、Lys(Ac)、Leu、Gly、Ala、Asn、Asp、Arg、AA1或由2-10个选自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Asp、AA1的氨基酸残基组成的短肽；
    优选地，L3选自Val、Cit、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、AA1、Val-Cit、Val-Lys、Cit-Val、Cit-Ala、Val-Ala、Lys-Val、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Ala-Ala、Val-AA1、Ala-AA1、Gly-AA1、AA1-Gly、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Asp、Val-AA1-Gly、Ala-AA1-Gly、Gly-AA1-Gly、Lys-Ala-Ala-Asn、Lys-Ala-Ala-Asp、Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Phe、Val-Lys-Gly、Val-Lys-Gly-Gly、Val-Lys和Lys-Ala-Asn；
    更优选地，L3选自Val-Cit、Val-Lys、Val-AA1和Val-AA1-Gly；
    (8)所述Ra、Rb中，任一个为H，另一个为或者，Ra与Rb和与它们共同相连的碳原子一起，形成被R0取代的5-6元杂环；
    (9)所述r、r1各自独立地选自0、1、2、3、4和5；
    优选地，r、r1各自独立地选自0和4；
    更优选地，r为0，r1为4；
    (10)所述Rm1、Rn1各自独立地选自H和C1-6烷基；或者，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成任选被R0’取代的5-6元杂环；
    优选地，Rm1、Rn1各自独立地选自H、甲基、乙基、正丙基和正丁基；或者，Rm1与Rn1和与它们共同相连的氮原子一起，形成任选被R0’取代的哌啶环或哌嗪环；
    (11)所述R0、R0’各自独立地选自C1-6烷基、-NRm2Rn2和任选被C1-6烷基取代的5-6元杂环基；
    (12)所述Rm2、Rn2为甲基。
  10. 如权利要求7-9任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种或多种：
    (1)所述L1-L2选自 1位和S相连，2位和L3相连；
    优选地，L1-L2选自
    1位和S相连，2位和L3相连；
    (2)所述L3选自 1位与L2相连，2位与L4或D相连；
    优选地，L3选自 1位与L2相连，2位与L4或D相连；
    (3)所述AA1所示氨基酸残基选自
    优选地，AA1所示氨基酸残基选自
  11. 如权利要求7-10任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，满足下述条件中的一种或多种：
    (1)所述连接体选自：



    ；(2)所述D选自下列结构，其通过分子中1位的O或N原子与L相连：


  12. 如权利要求7-11任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物选自以下：




    ；优选地，所述抗体药物偶联物选自以下：
  13. 式III所示的药物连接体偶联物，
    Lg-L1-L2-L3-L4-D
    III
    或所述药物连接体偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，
    其中，
    当L1为时，1位和Lg相连，2位与L2相连；
    Lg为和抗体反应时的离去基团；L2、L3、L4和D的定义如权利要求3-10中任一项所述；
    当L1为时，Lg-L1为L2、L3、L4和D的定义如权利要求3-10中任一项所述。
  14. 如权利要求13所述的药物连接体偶联物，其特征在于，
    Lg选自卤素、砜基、三级胺盐基(Me3N+、Et3N+)、重氮盐基、-OMs、MeSO2-、CF3SO3-；
    优选地；Lg选自F、Cl、MeSO2-；
    更优选地；Lg选自F、MeSO2-。
  15. 如权利要求12-14任一项所述的药物连接体偶联物，其特征在于，所述药物连接体偶联物选自以下：




  16. 一种BCL-2家族蛋白降解剂，或其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，其中，所述BCL-2家族蛋白降解剂选自以下：



  17. 一种制备式II所示的抗体药物偶联物的方法，其包括：将抗体Tb与式III所示的药物连接体偶联物进行偶联反应；其中，Tb、L1、L2、L3、L4、Lg和D定义如权利要求3-11任一项所述；
    优选地，所述的方法包括将Tb与式III所示的药物连接体偶联物进行偶联反应形成C-S键的步骤；
    所述的Tb与所述的药物连接体偶联物的摩尔比可为1∶(1-20)，如1∶(2-20)、1∶(4-20)、1∶(6-20)、1∶(8-20)、1∶(10-20)、1∶(12-20)、1∶(14-20)、1∶(16-20)或1∶(18-20)；
    所述的偶联反应优选为在水和/或有机溶剂中进行；所述的有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、腈类溶剂和醇类溶剂中的一种或多种。
  18. 药物组合物，其包含如权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物、或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如权利要求13-15任一项所述的药物连接体偶联物、其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如权利要求16所述的化合物、或所述化合物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物以及任选的一种或多种药用辅料。
  19. 如权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物、或所述抗体药物偶联物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如权利要求16所述的化合物、或所述化合物的立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如权利要求13-15任一项的药物连接体偶联物、其立体异构体、其前药、其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；或者如权利要求18所述的药物组合物在制备治疗和/或预防与细胞活动异常相关的疾病(例如癌症疾病)的药物中的用途；
    优选地，所述癌症疾病选自食管癌(例如食管腺癌或食管鳞状细胞癌)、脑瘤、肺癌(例如小细胞性肺癌、非小细胞性肺癌或肺腺癌)、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌(例如结肠癌或直肠癌)、肝癌、肾癌、尿路上皮癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤(例如神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤或肉瘤)、急性淋巴母细胞白血病、前列腺癌和甲状腺癌中的一种或多种。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025036119A1 (zh) * 2023-08-11 2025-02-20 北京三秀生物医药科技有限公司 靶向Bcl-xL蛋白的PROTAC及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109152843A (zh) * 2016-05-20 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
CN112105360A (zh) * 2018-01-22 2020-12-18 生物风险投资有限责任公司 用于癌症治疗的bcl-2蛋白降解剂
CN112135637A (zh) * 2018-01-10 2020-12-25 财团法人生物技术开发中心 抗体protac偶联物
CN113209306A (zh) * 2014-12-09 2021-08-06 艾伯维公司 具有细胞渗透性的bcl-xl抑制剂的抗体药物缀合物
WO2021195598A2 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 Angiex, Inc. Degrader-antibody conjugates and methods of using same
CN113660937A (zh) * 2019-02-08 2021-11-16 佛罗里达大学研究基金公司 治疗剂和治疗方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113209306A (zh) * 2014-12-09 2021-08-06 艾伯维公司 具有细胞渗透性的bcl-xl抑制剂的抗体药物缀合物
CN109152843A (zh) * 2016-05-20 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
CN112135637A (zh) * 2018-01-10 2020-12-25 财团法人生物技术开发中心 抗体protac偶联物
CN112105360A (zh) * 2018-01-22 2020-12-18 生物风险投资有限责任公司 用于癌症治疗的bcl-2蛋白降解剂
CN113660937A (zh) * 2019-02-08 2021-11-16 佛罗里达大学研究基金公司 治疗剂和治疗方法
WO2021195598A2 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 Angiex, Inc. Degrader-antibody conjugates and methods of using same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025036119A1 (zh) * 2023-08-11 2025-02-20 北京三秀生物医药科技有限公司 靶向Bcl-xL蛋白的PROTAC及其应用

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