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WO2024096418A1 - 배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물 - Google Patents

배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2024096418A1
WO2024096418A1 PCT/KR2023/016501 KR2023016501W WO2024096418A1 WO 2024096418 A1 WO2024096418 A1 WO 2024096418A1 KR 2023016501 W KR2023016501 W KR 2023016501W WO 2024096418 A1 WO2024096418 A1 WO 2024096418A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extract
indigo
crape myrtle
fraction
inflammatory
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/016501
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤치영
김상윤
오은석
박지연
송지혜
엄근향
Original Assignee
주식회사 엠에스코스팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020230133002A external-priority patent/KR20240063763A/ko
Application filed by 주식회사 엠에스코스팜 filed Critical 주식회사 엠에스코스팜
Publication of WO2024096418A1 publication Critical patent/WO2024096418A1/ko

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical or cosmetic composition having anti-inflammatory, anti-pruritic, anti-allergic and anti-odor effects.
  • a pharmaceutical or cosmetic composition having anti-inflammatory, anti-pruritic, anti-allergic and anti-odor effects.
  • it relates to an anti-inflammatory, anti-inflammatory and cosmetic composition containing complex extracts of Lagerstroemia indica and Persicaria tinctoria as active ingredients. It relates to a composition having anti-pruritic, anti-allergic and antibody odor effects.
  • Crape myrtle is a tree that has beautiful red flowers and is also used for medicinal purposes.
  • Crape myrtle is a deciduous small tree belonging to the Asteraceae family, and its scientific name is Lagerstroemia indica. It is native to southern China, but about 30 species are distributed in Korea, Japan, Australia, etc.
  • Patent Document 1 discloses that an extract obtained by extracting a mixture of leaves, stems, and roots of Crape Myrtle with alcohol having 1 to 4 carbon atoms suppresses and prevents allergic reactions by inhibiting the synthesis of inflammatory cytokines, chemokines, and immunoglobulin IgE. It is done.
  • indigo is an annual herb from the dicotyledonous family Nodule and is native to China. Its leaves have indigo and have been used as an indigo dye.
  • Cheongdae is differentiated from indigo as it is a processed indigo product with a pigment made by processing the whole plant of indigo, woecheong, maram, and mokram.
  • a processed indigo product "Composition for treating psoriasis or rhinitis containing Angelica gigas root extract and indirubin concentrate" (Korean Patent Publication No. 10-2021-0150829, Patent Document 2) uses green root as a raw material. Technology for manufacturing indirubin concentrate and using it to treat psoriasis or rhinitis has been disclosed.
  • Patent Document 1 KR 10-2011-0050938 (2011.05.17)
  • Patent Document 2 KR 10-2021-0150829 (2021.12.13)
  • the pharmaceutical or cosmetic composition having anti-inflammatory, anti-pruritic, anti-allergic and anti-odor effects containing the complex extract of Crape myrtle and indigo of the present invention as an active ingredient is anti-inflammatory, anti-pruritic and anti-inflammatory through the complex extract of Crape myrtle and indigo.
  • the object is to provide a pharmaceutical or cosmetic composition having allergy and antibody odor efficacy.
  • composition of the present invention is characterized by containing a complex extract of Crape Myrtle and Indigo as an active ingredient.
  • a pharmaceutical or cosmetic composition that has anti-inflammatory, anti-pruritic, anti-allergic and antibody odor effects using a complex extract of Crape myrtle and Indigo as an active ingredient.
  • Figure 1 shows the results of RP-18 silica TLC analysis of hot water extract, EtOH extract, and EA fraction extract of crape myrtle (Li) and indigo (Pt).
  • Figure 2 shows Crape Myrtle and clove fractions by open colume.
  • Figure 3 shows the results of analysis of anti-pruritic and anti-inflammatory activities of RP-18 silica open column fraction of Crape myrtle (Li) EtOH extract.
  • Figure 4 shows the results of analysis of anti-pruritic and anti-inflammatory activity of RP-18 silica open column fraction against Pt EtOH extract.
  • Figure 5 shows the 365nm wavelength analysis results for batch binding extract, EtOH, EA fraction, and RP-18 silica fraction using synthetic adsorbent resin.
  • FIG. 6 shows the results of HPLC peak pattern analysis for the potency fraction (PtB) of the open column fraction.
  • FIGs 7 and 8 show the results of HPLC peak pattern analysis for the efficacy fractions (LiB, LiC) of the crape myrtle open column fraction.
  • Figure 9 shows the results of comparative analysis of antioxidant activity of EtOH extract and EA fraction extract of Crape Myrtle and Indigo using DPPH method and ABTS method.
  • Figure 10 shows the results of analysis of the inhibition activity of trans-2-nonenal production, the causative agent of Gaeryeongchwi.
  • Figure 11 shows the cytotoxicity evaluation results of crape myrtle and indigo extracts.
  • Figure 12 shows the results of analysis of the cytoprotective effect in keratinocytes exposed to H 2 O 2 .
  • Figure 13 shows the results of analysis of the expression regulation of MMP-1 and COL1A1 in response to H 2 O 2 damage in keratinocytes.
  • Figure 14 shows the results of evaluating the antioxidant effect of crape myrtle and indigo extracts.
  • Figure 15 shows the results of analysis of the regulation of skin itching-related factors of Crape Myrtle and Indigo.
  • Figure 16 shows the results of analysis of the effect of crape myrtle and indigo on inhibiting inflammatory response.
  • Figure 17 shows the results of analysis of the inhibitory activity of itching and inflammatory factors secreted by HMC-1 by ELISA.
  • Figure 18 shows the skin primary stimulation reading results.
  • Figure 19 shows transepidermal water loss measurement values.
  • Figure 20 shows the results of changes in transepidermal water loss measurement values according to the time of evaluation.
  • FIG 21 shows the measurement results of transepidermal water loss (TEWL) improvement rate (%) according to the time of evaluation.
  • TEWL transepidermal water loss
  • FIG. 22 shows VAS measurement values and change rate
  • Figure 24 shows transepidermal water loss measurement values and change rate.
  • Figure 25 shows the results of changes in transepidermal water loss measurement values according to the time of evaluation.
  • Figure 27 shows skin moisture content measurement results according to evaluation time points.
  • the pharmaceutical or cosmetic composition of the present invention is characterized by containing a complex extract of Crape myrtle and Indigo as an active ingredient.
  • the extract may be the extract itself, or may be a fraction obtained by fractionating the extract.
  • Fractions can be fractionated using a layer separation method using an organic solvent, or open column fraction extraction using RP-18 silica.
  • a batch binding extraction method using a synthetic adsorbent is appropriate.
  • the composite extract is preferably an extract of a mixture of Crape Myrtle and Indigo at a weight ratio of 3:1 to 9.
  • the method for preparing fractions using the layer separation method is as follows.
  • the hexane layer contains lipid components such as unsaturated fatty acids, sterols, and fatty acid esters contained in crape myrtle and indigo, and high molecular substances such as pectin, cellulose, and lignin.
  • EA ethyl acetate
  • the EA layer contains essential oil components such as flavonoids such as anthocyanins, catechins, and quercetin, sapogens such as isatin and isatin 7-glucoside, carotenoids, limonene, and terpenes.
  • flavonoids such as anthocyanins, catechins, and quercetin
  • sapogens such as isatin and isatin 7-glucoside
  • carotenoids such as limonene, and terpenes.
  • components such as lipid components, polymer substances, flavonoids, saponins, and essential oils of crape myrtle and indigo can be separated. This is a necessary process to further maximize the effectiveness of each ingredient.
  • the open column fraction extraction method can proceed as follows.
  • RP-18 silica is a material with high affinity for polar solvents and adsorbs substances contained in 80% EtOH extract well.
  • MeOH is a solvent with very low polarity, and it desorbs substances adsorbed on RP-18 silica well.
  • TLC is a method of separating substances using a thin membrane, allowing the location and size of the separated substances to be confirmed.
  • the amount of fraction obtained through each fractionation method is divided by the amount of 80% EtOH extract to calculate the yield per unit g.
  • the yield is used as an indicator to evaluate the efficiency of the fractionation method.
  • the effective fractions are selected by evaluating the cytotoxic, anti-inflammatory, antioxidant, antibacterial, and antiviral efficacy of each fraction.
  • the effective fraction is a fraction that exhibits the desired efficacy and is a candidate for the final fraction.
  • the final fraction is a fraction that exhibits the desired efficacy and can be produced economically.
  • the hexane layer can be selected as the final fraction.
  • the active ingredients of the crape myrtle and indigo complex extract can be effectively separated and the final fraction can be selected.
  • Filter paper serves to remove fine impurities contained in the extract.
  • a synthetic adsorbent is added to the 80% EtOH extract and adsorbed at room temperature for 3 days.
  • Synthetic adsorbents have high affinity for flavonoids, saponins, essential oils, and water-soluble substances. Therefore, the components contained in the 80% EtOH extract are effectively adsorbed.
  • the extract is eluted from the synthetic adsorbent with 95% EtOH. 95% EtOH effectively desorbs substances adsorbed on synthetic adsorbents.
  • a rotary evaporator removes EtOH by heating it and evaporating it.
  • Standardization for potency fractions can be performed by the following process.
  • the effective extract is diluted to a concentration of 5 mg/mL using 100% MeOH.
  • the efficacy extract By diluting the efficacy extract to a concentration of 5 mg/mL, it can be adjusted to a concentration suitable for HPLC analysis.
  • the C18 column is a column with high affinity for polar solvents, and can effectively separate components such as flavonoids, saponins, and essential oils contained in effective extracts.
  • 100% MeOH is a solvent with very low polarity, and can easily desorb substances adsorbed on a C18 column.
  • the quantity, quality, and purity of ingredients contained in the efficacy fraction can be evaluated. Based on these evaluation results, the quality of the efficacy fraction can be managed and the active ingredients of the efficacy fraction can be accurately measured.
  • Hot water extracts were prepared by hot water extracting crape myrtle (Li) and indigo (Pt), respectively, and EtOH extracts were prepared by extracting them in 80% EtOH.
  • Each extract was filled into RP-18 silica (Code. 12061-11) and then loaded onto an open column.
  • the extract was separated using 100% MeOH as a mobile phase, and the extract was separated using RP-18 silica TLC. was analyzed at a wavelength of 365 nm.
  • the 80% EtOH extract of Crape Myrtle was obtained through open column fractionation to obtain 7 fractions A to G according to a 365 nm spot, and the 80% EtOH extract of Indigo was obtained through open column fractionation to obtain 6 fractions A to F according to a 365 nm spot. .
  • Figure 2 shows the Crape myrtle fraction and clove fraction by open column.
  • HMC-1 cultured for 48 hours was diluted to a concentration of 5x10 5 cell/mL using complete growth media, and then the diluted cells were distributed in a 24-well plate and cultured in a CO 2 incubator for 3 hours. Then, after 3 hours of incubation, the Crepe myrtle EtOH extract and the Indigo EtOH extract obtained in Experimental Example 1 were each diluted in complete growth media and treated.
  • the cells were cultured for 1 hour, then treated with PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50nM) and Ionomycin (2uM) and cultured for 3 hours.
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50nM
  • Ionomycin (2uM) Ionomycin
  • a porous synthetic adsorbent made of a copolymer of styrene and divinyl benzene (DVB) has a large number of pores distributed and has a high specific surface area, resulting in excellent adsorption capacity.
  • the particle surface is hydrophobic, so when organic substances are adsorbed, hydrophobic groups in organic molecules are smoothly adsorbed.
  • An 80% EtOH extract was obtained by mixing dried crape myrtle and indigo powder at a weight ratio of 1:1 and 80% EtOH at a 5:1 ratio, and filter paper was used to remove suspended matter from the 80% EtOH extract. .
  • the synthetic adsorbent was added to the 80% EtOH extract and adsorbed at room temperature for 3 days. After washing the adsorbed synthetic adsorbent for 1 hour using D.W, 30% EtOH, and 50% EtOH, the above synthesis was performed with 95% EtOH. The extract was eluted from the adsorbent and then all EtOH was removed using a rotary evaporator to prepare the extract.
  • the extract prepared in this way was analyzed at a wavelength of 365 nm, and a comparison with the extract separated using EtOH extract, EA extract, and RP-18 silica TLC is shown in Figure 5.
  • This method avoids the use of harmful organic solvents, contains a large amount of effective fractions, and allows efficient removal of unnecessary components (strongly polar or strongly nonpolar).
  • the HPLC peak patterns for the potent fraction (PtB) of the open column fraction of Pa ., the potent fraction (LiB) of the open column fraction of Crape myrtle, and the potent fraction (LiC) of the open column fraction of Crape myrtle were analyzed.
  • the effective extract was diluted to a concentration of 5 mg/mL using 100% MeOH, and HPLC system was used with C18 column (Young Jin Biochrom Co., Ltd. C18 4.6*250mm col.) as the stationary phase and 100% MeOH as the mobile phase. was analyzed.
  • Figure 6 is HPLC peak pattern analysis of the efficacy fraction (PtB) of the open column fraction (Column, Young Jin Biochrom Co. Ltd., C18 4.6*250mm; Eluent, 100% MeOH), and Figure 7 is Crape Myrtle open column.
  • HPLC peak pattern analysis of the efficacy fraction (LiB) of the fraction Cold, Young Jin Biochrom Co. Ltd., C18 4.6*250mm; Eluent, 100% MeOH
  • Figure 8 shows the efficacy fraction (LiC) of the crape myrtle open column fraction.
  • Table 8 shows the efficacy fraction (LiC) of the crape myrtle open column fraction.
  • the standard of the effective fraction was determined using peak pattern analysis using HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis.
  • the PtB fraction showed major Rets of 9.088, 13.9691, and 15.557 in HPLC analysis using a C18 column.
  • the LiB fraction among the crape myrtle open column fractions showed major Rets of 11.835 and 12.567 in HPLC analysis using a C18 column.
  • time, and the LiC fraction among the Crape myrtle open column fractions showed major Rets of 15.644, 17.037, and 17.905 in HPLC analysis using a C18 column. It showed time.
  • DPPH stock solution (10mM DPPH, Cat. No: 044150, MD) as a 250uM working solution, dispense DPPH working solution, sample stock solution, MeOH, and DMSO into a 96-well plate as shown in the table below, and incubate at room temperature. After reacting for 10 minutes, the absorbance at a wavelength of 517 nm was measured.
  • Negative control DPPH working solution 100 ⁇ l MeOH: 147.5 ⁇ l DMSO: 2.5 ⁇ l Positive control DPPH working solution: 100 ⁇ l L-Ascorbic acid stock solution: 2.5 ⁇ l MeOH: 147.5 ⁇ l Test DPPH working solution: 100 ⁇ l Sample stock solution: 2.5 ⁇ l MeOH: 147.5 ⁇ l Total volume 250 ⁇ l
  • ABTS 1 tablet (Cat. No: A9941) was prepared as a working solution by putting it in 100 mL of D.W. After adding potassium persulfate to the ABTS working solution at a final concentration of 2.6mM, reacting at room temperature and dark conditions for 16 hours, 96 ABTS/potassium persulfate working solution, sample stock solution, MeOH, and DMSO were dispensed into a well plate as shown in the table below, then reacted for 10 minutes at room temperature in the dark, and then the absorbance at a wavelength of 732 nm was measured.
  • both the EtOH extract and the EA fraction extract showed strong antioxidant efficacy starting from a low concentration (1 ⁇ g/mL), and the indigo plant began to show antioxidant activity at a concentration of 10 ⁇ g/mL.
  • Palmitoleic acid (CAS. No: 76169), Cumene hydroperoxide (CAS. No: 247502) and sample stock solution were dispensed into a 1.5mL tube, the sealed sample was reacted at 37°C for 5 days, and then GC/FID was used.
  • trans-2-nonenal (CAS. No: 07592)
  • EtOH extract or EA fraction extract of Indigo and Crape Myrtle was added to the mixture of palmitoleic acid and initiator (100ug/mL), and after reaction in a shaking incubator for 5 days, trans-2-nonenal was detected using GC/FID.
  • trans-2-nonenal was produced when palmitoleic acid and initiator (Cumene hydroperoxide) were mixed at a 10:1 ratio and reacted in a shaking incubator for 5 days.
  • the EtOH extract of indigo was found to inhibit the production of trans-2-nonenal, a decomposition product of palmitoleic acid in the skin, by 26%
  • the EA fraction extract of Crape myrtle was found to inhibit the production of trans-2-nonenal, a decomposition product of palmitoleic acid in the skin. It was shown to inhibit the production of trans-2-nonenal by 31%.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line, were cultured at 1 ⁇ 10 4 cell/mL in a 12-well plate for 24 hours, and the HaCaT cells were treated with crape myrtle and indigo extracts at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL. Cultured for 24 or 48 hours.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line, were cultured at 1 ⁇ 10 4 cell/mL in a 12-well plate for 24 hours, and the HaCaT cells were treated with crape myrtle and indigo extracts at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL. After culturing for 24 hours, the cells were treated with 1mM H 2 O 2 for 24 hours, then the cells were treated with EZ-cytox reagent and reacted in an incubator for 1 hour, and then 200 ⁇ l of medium was transferred to a 96-well plate. Then, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using an ELISA reader.
  • HaCaT cells were cultured in a 6-well plate for 24 hours, treated with crape myrtle and indigo extracts at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL for 24 hours, and then placed at regular intervals in the center of the bottom of the plate. After scratching, the cells were treated with 1mM H 2 O 2 for 24 hours, and then the cells proliferated in the scratched empty space were observed using an optical microscope.
  • Figure 12 shows the cell protective effect of Indigo and Crape Myrtle on human keratinocytes (HaCaT cells) exposed to H 2 O 2 according to this experiment. This is the result of an experiment in which the extract was treated at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL for 24 hours, then treated with 1mM H 2 O 2 for 24 hours, and then cell viability was measured using EZ-cytox.
  • the cell survival rate decreased by H 2 O 2 in normal cells was significantly increased when treated with Crape Myrtle and Indigo extracts at concentrations of 0.01, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL. has been confirmed to have a skin cell protective effect.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line, were cultured in a 6-well plate for 24 hours, and the HaCaT cells were treated with Crape myrtle and indigo extracts at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL. After culturing for 24 hours, 1mM of H 2 O 2 was treated for 24 hours.
  • RIPA buffer was added to the treated cells to extract proteins, and the extracted proteins were quantified using the bicinchoninic acid (BCA) method.
  • the quantified protein sample was separated by 8-12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel (SDS-PAGE) electrophoresis, and the separated protein was transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) using transfer buffer, followed by 5% skim milk. After blocking for 1 hour, a specific primary antibody was reacted overnight at 4°C.
  • SDS-PAGE sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour, and then treated with Enhanced chemiluminiscence system (ECL) reagent using chemiDoc imaging systems (Bio-Rad). Protein expression was analyzed.
  • ECL Enhanced chemiluminiscence system
  • Figure 13 shows the regulation of expression of MMP-1 and COL1A1 in response to H 2 O 2 damage of Indigo and Crape Myrtle in human keratinocytes (HaCaT cells). This is the result of confirming the regulation of skin barrier-related factors COL1A1 and MMP-1 by the extract using western blot method.
  • Crape myrtle extract reduced the expression level of MMP-1 by 27.77% at a concentration of 1 ⁇ g/mL, and at a concentration of 0.1 ⁇ g/mL.
  • the expression level of COL1A1 increased by 13.36%.
  • the expression level of MMP-1 was reduced by 26.08% and the expression level of COL1A1 was increased by 12.8%.
  • Crape myrtle and indigo extracts were confirmed to contribute to the regulation of skin barrier-related factors in skin cells.
  • HaCaT cells human-derived keratinocytes
  • Crape myrtle extract increased the activity of HO-1 in normal cells at concentrations of 0.01, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL compared to H 2 O 2 treatment, and at concentrations of 0.5 and 1 ⁇ g/mL. increased SOD2 activity.
  • Indigo extract was found to increase HO-1 activity in normal cells at concentrations of 0.01, 0.1, 0.5, and 1 ⁇ g/mL compared to H 2 O 2 treatment.
  • the expression of IL-6 and TNF- ⁇ increased after treating human-derived keratinocytes with H 2 O 2 , and increased with H 2 O 2 when treated with crape myrtle and indigo extracts at different concentrations.
  • the cytokines were not changed.
  • HMC-1 cultured for 48 hours was diluted to a concentration of 5x10 5 cell/mL using complete growth media, the diluted cells were distributed in a 24-well plate, and cultured in a CO 2 incubator for 3 hours.
  • the extract was diluted in complete growth media, incubated for 1 hour, then treated with PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50nM) and Ionomycin (2uM) and incubated for 3 hours.
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50nM
  • Ionomycin (2uM) Ionomycin
  • EzWay Human IL-4 ELISA Kit (Cat. No: K1331214), EzWay Human IL-6 ELISA Kit (Cat. No: K1331229), Human IL-13 ELISA Kit (Cat. No: K0331235), EzWay Human IL-31 ELISA Prepare a kit (Cat. No: K1331233) and Histamine ELISA kit (Cat. No: ab213975), and dilute the Standard Protein, Detection Anti-body, and HRP Conjugate enclosed in the ELISA KIT with D.W and Dilution buffer according to the ELISA KIT protocol. Then, the reagent was prepared.
  • Dispense 50ul or 100 ⁇ l of the prepared control and experimental group samples into Anti-body coated microplates according to the ELISA KIT treat the dispensed samples with the same amount of Detection Anti-body, and attach a plate sealer to the Anti-body coated microplate. After reacting in a shaking incubator at room temperature for more than 2 hours, shake off all the liquid in the well, add 200 ⁇ l of Wash Buffer, shake, and shake again. After repeating the process 3 times, all remaining Wash Buffer was removed, and then 100 ⁇ l of HRP Conjugate was dispensed into each anti-body coated microplate and reacted in a shaking incubator for 30 minutes.
  • HMC-1 human mast cell-1
  • each extract was treated at concentrations of 1, 10, and 100 ⁇ g/mL, N, Negative control; C, Positive control.
  • the detection value of each protein is expressed as a value comparing the secretion amount of the target protein in the negative control (N) compared to the positive control (C), and the sample treated with the EtOH extract of Pt and Li and the ethyl acetate (EA) extract.
  • IL-4 showed a reduction rate of 8 to 10% in the EA fractional extract, Crape myrtle EtOH extract, and EA fractional extract.
  • IL-6 showed the greatest reduction rate in the EA fractional extract of Indigo and also showed a reduction rate of up to 98.2% in the fractional extract of Crape myrtle EA.
  • IL-31 showed a decrease rate of 49% at a concentration of 100 ⁇ g/mL of Crape Myrtle EtOH extract, and Histamine showed a decrease rate of up to 32% in the EtOH extract of Crepe myrtle and up to 50% in the fractionated extract of Crape Myrtle EA. .
  • the experiment caused final skin irritation based on three criteria: safety zone depending on the product, products causing irritation at a frequency exceeding 20% of the test subjects, and test products in which an irritation reaction of +2 or more was observed in more than 10% of the total test subjects at each reading. It was determined whether or not.
  • FIG 19 shows transepidermal water loss (TEWL) measurement values.
  • Figure 20 is a graph showing the change in transepidermal water loss measurements in the two groups according to the time of evaluation.
  • the p -value in the graph is a statistical result of the change before and after using the product. (Paired t -test: ** p -value ⁇ 0.01, *** p -value ⁇ 0.001)
  • Figure 21 shows the improvement rate (%) in transepidermal water loss in the two groups according to the time of evaluation.
  • p -value is the statistical result of the change between the two groups. (Mann-whitney test: ⁇ p -value ⁇ 0.05)
  • the transepidermal water loss was measured and the transepidermal water loss was significantly reduced 3 and 7 days after using the product compared to before using the product (day 0) in both the test product used area and the test product unused area (day 0). p ⁇ 0.01).
  • VAS evaluation transdermal water loss measurement, skin moisture content measurement
  • Figure 22 shows the VAS (Visual Analogue Scale) measurement values and change rate
  • Figure 23 shows the itching evaluation results according to the evaluation time.
  • the p -value represents the statistical results of changes before and after using the product. (: Paired t -test: *** p -value ⁇ 0.001)
  • the improvement rate was 38.03% after 4 weeks of using the product and 76.84% after 8 weeks of using the product.
  • FIGS 24 and 25 show the results of transepidermal water loss measurement.
  • Figure 24 shows the transepidermal water loss measurement values and change rate
  • Figure 25 shows the transepidermal water loss measurement results according to the time of evaluation.
  • the p -value is the statistical result of the change before and after using the product. (Paired t -test: *** p -value ⁇ 0.001)
  • Figures 26 and 27 show the skin moisture content measurement results.
  • Figure 26 shows the skin moisture content measurement values and change rate
  • Figure 27 shows the skin moisture content measurement results according to the evaluation time.
  • the p -value is the statistical result of the change before and after using the product. (Paired t -test: *** p -value ⁇ 0.001)

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Abstract

본 발명은 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물에 관한 것으로, 배롱나무와 쪽의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의해 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물이 제공된다.

Description

배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물
본 발명은 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물에 관한 것으로, 특히, 배롱나무(Lagerstroemia indica) 및 쪽(Persicaria tinctoria) 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 조성물에 관한 것이다.
배롱나무는 붉은색의 꽃이 아름답고, 약용으로도 쓰이는 나무이다. 배롱나무는 부처꽃과에 속하는 낙엽 소교목으로, 학명은 Lagerstroemia indica이다. 중국 남부가 원산지이지만, 한국, 일본, 오스트레일리아 등지에 약 30여 종이 분포하고 있다.
배롱나무와 관련하여 최근에는 꽃 추출물이 항염, 항산화, 항균, 항바이러스 등의 효능이 있다는 연구 결과가 발표되면서, 화장품, 의약품, 식품 등의 원료로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
배롱나무에 관한 기술로는 "배롱나무의 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지 예방 또는 개선용 약학적 조성물"(한국 공개특허공보 제10-2011-0050938호, 특허문헌 1)이 공개되어 있다.
상기 특허문헌 1에서는 배롱나무의 잎, 줄기, 뿌리 혼합물을 탄소수 1 내지 4의 알콜로 추출한 추출물이 염증성 사이토카인, 케모카인 및 면역글로불린 IgE의 합성 억제를 통해 알러지 반응을 억제하고, 예방하는 내용이 공개되어 있다.
한편, 쪽은 쌍떡잎식물 마디풀과의 한해살이풀로 중국이 원산지이며 잎은 인디고를 지니고 있어 남색의 염료로 사용해왔다.
청대는 쪽, 대청, 마람, 목람의 전초를 가공하여 만든 색소로 쪽 가공품으로 쪽과는 차별화된다.
쪽 가공품인 청대와 관련한 기술로, "참당귀 추출물 및 인디루빈 농축물을 포함하는 건선 또는 비염치료용 조성물"(한국 공개특허공보 10-2021-0150829호, 특허문헌 2)에는 청대를 원료로 하여 인디루빈 농축물을 제조하고, 이를 건선 또는 비염치료에 활용하는 기술이 공개되어 있다.
*선행기술문헌*
(특허문헌 1) KR 10-2011-0050938 (2011.05.17)
(특허문헌 2) KR 10-2021-0150829 (2021.12.13)
본 발명의 배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물은 배롱나무와 쪽의 복합 추출물을 통해 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물을 제공하려는 것이다.
본 발명의 조성물은 상기한 과제를 해결하기 위하여, 배롱나무와 쪽의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해, 배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 하여 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물이 제공된다.
도 1은 배롱나무(Li)와 쪽(Pt)의 열수추출물, EtOH추출물 및 EA분획추출물의 RP-18 silica TLC 분석 결과.
도 2는 open colume에 의한 배롱나무 및 쪽 분획물.
도 3은 배롱나무(Li) EtOH 추출물에 대한 RP-18 silica open column 분획물의 항소양 및 항염증 활성 분석 결과.
도 4는 쪽(Pt) EtOH 추출물에 대한 RP-18 silica open column 분획물의 항소양 및 항염증 활성 분석 결과.
도 5는 합성 흡착제 레진을 활용한 batch binding 추출물과 EtOH, EA분획, RP-18 silica 분획물에 대한 365nm 파장 분석 결과.
도 6은 쪽 open column 분획물의 효능 분획(PtB)에 대한 HPLC 피크패턴분석 결과.
도 7 및 8은 배롱나무 open column 분획물의 효능분획(LiB, LiC)에 대한 HPLC 피크패턴분석 결과.
도 9는 DPPH법과 ABTS법을 이용한 배롱나무 및 쪽의 EtOH 추출물과 EA 분획 추출물의 항산화 활성 비교 분석 결과.
도 10은 가령취 원인물질 trans-2-nonenal 생성 억제활성 분석 결과.
도 11은 배롱나무 및 쪽 추출물의 세포독성 평가 결과.
도 12는 H2O2에 노출시킨 각질형성세포에서 세포 보호 효과 분석 결과.
도 13은 각질형성세포에서 H2O2 손상에 대한 MMP-1과 COL1A1의 발현 조절 분석 결과.
도 14는 배롱나무 및 쪽 추출물의 항산화효과 평가 결과.
도 15는 배롱나무 및 쪽의 피부 가려움 관련 인자의 조절 분석 결과.
도 16은 배롱나무 및 쪽의 염증반응 억제 효과 분석 결과.
도 17은 ELISA에 의한 HMC-1에서 분비하는 소양 및 염증인자의 억제활성 분석 결과.
도 18은 피부 일차자극 판독 결과.
도 19는 경피수분손실량 측정값.
도 20은 평가 시점에 따른 경피수분손실량 측정값 변화 결과.
도 21은 평가 시점에 따른 경피수분손실량(TEWL) 개선율(%) 측정 결과.
도 22는 VAS 측정값 및 변화율
도 23은 평가 시점에 따른 가려움 평가 결과.
도 24는 경피수분손실량 측정값 및 변화율.
도 25는 평가 시점에 따른 경피수분손실량 측정값 변화 결과.
도 26은 피부 수분 함유량 측정값 및 변화율.
도 27은 평가 시점에 따른 피부 수분 함유량 측정 결과.
이하, 본 발명의 배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물에 대해 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 약학적 또는 화장료용 조성물은 배롱나무와 쪽의 복합추출물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.
여기 상기 추출물은 추출물 그 자체일 수도 있으며, 추출물을 분획한 분획물일 수도 있다.
분획물의 경우 유기용매를 사용한 층 분리법으로 분획하거나, RP-18 silica를 사용한 open column 분획 추출할 수도 있다.
바람직하기로는 합성흡착제를 활용한 batch binding 추출법이 적절하다.
더불어, 상기 복합추출물은 배롱나무와 쪽이 3 : 1 ~ 9의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물인 것이 바람직하다.
층 분리법을 사용하여 분획물을 제조하는 방법은 다음과 같다.
우선, 80% EtOH 추출물에 Hexane과 물을 넣어 녹인 후, 분획 깔때기에서 층을 분리한다. Hexane은 물에 녹지 않는 용매이기 때문에, Hexane 층에는 불용성 물질이, 물 층에는 가용성 물질이 분리된다
물 층을 수확한 후, Hexane 층을 수확한다.
Hexane 층에는 배롱나무와 쪽에 함유되어 있는 불포화 지방산, 스테롤, 지방산 에스테르 등의 지질 성분, 펙틴, 셀룰로오스, 리그닌 등과 같은 고분자 물질 등이 함유되어 있다.
이어서, 분리 수확한 상기 물 층에 에틸 아세테이트(EA)를 넣고 흔들어 섞은 후, 분획 깔때기에서 층을 분리한다. EA는 물과 약간 섞이는 용매이기 때문에, EA 층에는 물에 녹는 물질과 약간 녹는 물질이 분리된다.
그런 다음 아래의 물 층을 제거한 후, EA 층을 확보한다. EA 층에는 안토시아닌, 카테킨, 퀘르세틴 등의 플라보노이드, 이사틴, 이사틴 7-글루코사이드 등과 같은 사포진, 카로티노이드, 리모넨, 테르펜 등의 정유 성분이 함유되게 된다.
이러한 방법을 통해, 배롱나무와 쪽의 지질 성분, 고분자 물질, 플라보노이드, 사포닌, 정유 등의 성분을 각각 분리할 수 있다. 이는 각 성분의 효능을 더욱 극대화하기 위해 필요한 과정이다.
open column 분획 추출법은 다음과 같이 진행될 수 있다.
먼저, 80% EtOH 추출물을 RP-18 silica(Code. 12061-11)로 충진한 open column에 loading한다.
RP-18 silica는 극성 용매에 대해 친화력이 큰 물질로, 80% EtOH 추출물에 포함된 물질들을 잘 흡착한다.
그런 다음, 이동상으로 100% MeOH를 사용하여 추출물을 분리한다. MeOH는 극성이 매우 낮은 용매로, RP-18 silica에 흡착된 물질들을 잘 탈착시킨다.
분리가 완료되면 RP-18 silica TLC를 이용하여 분리한 추출물을 365nm 파장에서 분석한다. TLC는 얇은 막을 사용하여 물질을 분리하는 방법으로, 분리된 물질의 위치와 크기를 확인할 수 있다.
이러한 방법을 통해, 배롱나무와 쪽 복합추출물에 포함된 다양한 물질들을 분리하고, 각 물질의 특성을 분석할 수 있다.
참고로, RP-18 silica의 용매 친화력은 극성 용매에 대해 증가하고, 비극성 용매에 대해 감소한다. 따라서, 80% EtOH 추출물을 RP-18 silica로 분리하면, 극성 물질들이 먼저 이동하고, 비극성 물질들이 나중에 이동하게 된다.
최종 분획의 선정은 각 분획 방법에 대한 80% EtOH 추출물의 단위 g당 수득률을 계산하고, 각 분획의 세포효능 분석을 통한 유효 분획을 선정한 후, 수득률과 유효 분획에 따라 최종 분획을 선정할 수 있다.
구체적으로, 각 분획 방법을 통해 얻은 분획의 양을 80% EtOH 추출물의 양으로 나누어 단위 g당 수득률을 계산한다 수득률은 분획 방법의 효율성을 평가하는 지표로 사용된다.
더하여, 각 분획의 세포독성, 항염증, 항산화, 항균, 항바이러스 등의 효능을 평가하여 유효 분획을 선정한다. 유효 분획은 원하는 효능을 나타내는 분획으로, 최종 분획의 후보가 된다.
이어, 수득률이 높고, 유효 분획으로 선정된 분획을 최종 분획으로 선택한다. 최종 분획은 원하는 효능을 나타내면서도, 경제적으로 생산할 수 있는 분획이다.
예를 들어, 층 분리법을 통해 얻은 Hexane 층의 수득률이 20%이고, 항염증 효능이 우수하다면, Hexane 층을 최종 분획으로 선택할 수 있다.
이러한 방법을 통해, 배롱나무와 쪽 복합추출물의 유효 성분을 효과적으로 분리하고, 최종 분획을 선정할 수 있다.
한편, 합성흡착제를 활용한 batch binding 추출법을 사용할 수 있는데 다음과 같은 과정으로 진행된다.
우선, 배롱나무와 쪽 건조 분말과 80% EtOH를 5:1의 비율로 섞어 80% EtOH 추출액을 확보한다. 식물 건조 분말에 80% EtOH를 첨가하여 흔들어 주면, 식물에 함유된 물질들이 80% EtOH에 녹아 추출액이 된다.
이어, Filter paper를 이용하여 80% EtOH 추출액의 부유물을 제거한다. Filter paper는 추출액에 함유된 미세한 불순물을 제거하는 역할을 한다.
그런 다음 상기 80% EtOH 추출액에 합성흡착제를 첨가하여 상온에서 3일간 흡착한다. 합성흡착제는 플라보노이드, 사포닌, 정유 및 수용성 물질에 대해 높은 친화력을 가지고 있다. 따라서, 80% EtOH 추출액에 함유된 상기 성분들이 효과적으로 흡착된다.
이러한 합성흡착제는 batch binding 방식으로 추출할 수 있기 때문에, 대량 생산이 가능하다.
이어 D.W, 30% EtOH, 50% EtOH를 이용하여 각 1시간씩 흡착된 합성흡착제를 washing한다. D.W, 30% EtOH, 50% EtOH는 합성흡착제에 흡착된 불순물을 제거하는 역할을 한다.
상기 합성흡착제에서 95% EtOH로 추출물을 용출한다. 95% EtOH는 합성흡착제에 흡착된 물질들을 잘 탈착시킨다.
이어, 회전 증발 농축기를 사용하여 EtOH를 전부 제거한다. 회전 증발 농축기는 EtOH를 가열하여 증발시키는 방식으로 EtOH를 제거한다.
이러한 방법을 통해, 배롱나무와 쪽의 유효 성분을 효과적으로 분리하고, 수득률을 높일 수 있다.
효능 분획에 대한 표준화는 다음과 같은 과정으로 수행될 수 있다.
우선 효능 추출물을 100% MeOH를 사용하여 5mg/mL의 농도로 희석한다.
효능 추출물을 5mg/mL의 농도로 희석하면, HPLC 분석에 적합한 농도로 조절할 수 있다.
이어, C18 column을 고정상으로, 100% MeOH를 이동상으로 HPLC system으로 분석한다.
C18 column은 극성 용매에 대해 친화력이 큰 column으로, 효능 추출물에 포함된 플라보노이드, 사포닌, 정유 등의 성분을 효과적으로 분리할 수 있다. 100% MeOH는 극성이 매우 낮은 용매로, C18 column에 흡착된 물질들을 잘 탈착시킬 수 있다.
반복된 피크패턴 및 Ret. time으로 효능 분획의 피크패턴을 표준화한다.
동일한 조건으로 HPLC 분석을 반복하면, 효능 분획의 피크패턴과 Ret. time이 일정하게 나타난다. 이러한 피크패턴과 Ret. time을 표준화하여, 효능 분획의 품질을 관리할 수 있다.
HPLC 분석을 통해 효능 분획에 포함된 성분의 정량, 정성, 순도를 평가할 수 있다. 이러한 평가 결과를 바탕으로, 효능 분획의 품질을 관리하고, 효능 분획의 유효 성분을 정확하게 측정할 수 있다.
이하, 본 발명의 배롱나무 및 쪽의 복합추출물의 실험예에 대해 설명하기로 한다.
<실험예 1> 배롱나무 및 쪽(Persicaria tinctoria)에 대한 추출물의 분획화 및 최종 분획 선정
배롱나무(Li)와 쪽(Pt)를 각각 열수 추출한 열수 추출물을 준비하고, 80% EtOH에 추출한 EtOH 추출물을 준비하였다.
한편, 80% EtOH 추출물에 Hexane과 물을 넣어 녹인 후, 분획 깔때기에서 층을 분리한 후, 하부의 물 층을 분리 수확한 후, 물 층에 EA(에틸 아세테이트)를 첨가하여 흔들어 섞은 다음 분획 깔때기에서 아래의 물 층을 제거한 후, EA 층을 확보하여 EA분획추출물을 준비하였다.
RP-18 silica(Code. 12061-11)에 각각의 추출물을 충진한 다음 open column에 loading하고, 이동상으로 100% MeOH를 사용하여 추출물을 분리한 다음, RP-18 silica TLC를 이용하여 분리한 추출물을 365nm 파장에서 분석하였다.
배롱나무(Li)와 쪽(Pt)의 열수추출물, EtOH추출물 및 EA분획추출물의 RP-18 silica TLC 분석 결과는 도 1에 도시하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이 배롱나무와 쪽 모두 열수추출물, EtOH 추출물, EA분회추출물의 양상이 다름을 확인할 수 있다.
이어 상기 RP-18 silica TLC 분석의 365nm 파장에서 확인되는 각 부분 중 활성부분을 확인하기 위한 분석 수행하였다.
효능 활성 분획을 특정하기 위해 각 spot에 따른 배롱나무 7분획, 쪽 6분획을 구분하여 수합하였다.
배롱나무 80% EtOH추출물을 open column 분획법으로 365nm spot에 따른 A~G의 7분획을 확보하고, 쪽 80% EtOH추출물을 open column 분획법으로 365nm spot에 따른 A~F의 6분획을 확보하였다.
도 2에는 open column에 의한 배롱나무 분획물 및 쪽 분획물이 도시되어 있다.
<실험예 2> 사람의 비만세포(HMC-1 cell)에 대한 항염증 및 항소양 활성 분석(qRT-PCR에 의한 분석)
48시간 동안 배양된 HMC-1을 complete growth media를 이용하여 5x105 cell/mL의 농도로 희석한 후, 희석한 세포를 24-well plate에 분주한 후, CO2 incubator에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 3시간 배양 후 실험예 1에서 수득한 배롱나무 EtOH 추출물과 쪽 EtOH 추출물을 각각 complete growth media에 희석하여 처리하였다.
물질 처리 후 1시간 동안 배양한 후, PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50nM)와 Ionomycin(2uM)을 처리한 후 3시간 동안 배양하였다.
배양 처리가 끝난 후 HMC-1 세포를 EZ Total RNA Miniprep Kit(Enzynomics, Korea)를 이용하여 RNA를 추출한 후, ReverTra Ace -α- FSK-101(TOYOBO, Japan)를 사용해서 cDNA를 합성 처리하고, 분석하고자 하는 유전자의 primer와 TOPreal SYBR Green RT-qPCR Kit(Enzynomics, Korea)을 사용하여 sample을 준비한 후, MiniOpticon Real-Time PCR system(Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 유전자 발현 패턴을 분석하고, 분석 결과를 도 3 및 도 4에 도시하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이 배롱나무 EtOH 추출물에 대한 RP-18 silica open column 분획물의 항소양 및 항염증 활성 분석. 항소양 활성 관련 IL-4, IL-13 및 IL-31과 항염 활성 관련 IL-6, TNF-α의 qRT-PCR 분석 결과, IL-4에 대한 활성은 LiB 분획에서 강한 억제 활성을 나타내고, IL-13에 대한 활성은 LiA, LiB 및 LiD 분획에서 억제 활성을 나타내며, IL-6에 대한 활성은 LiB, LiC 분획에서 억제 활성을 나타내고, TNF-α에 대한 활성은 LiB 분획에서 강한 억제 활성을 나타냄을 알 수 있다.
또, 쪽 EtOH 추출물에 대한 RP-18 silica open column 분획물의 항소양 및 항염증 활성 분석. 항소양 활성 관련 IL-4, IL-13 및 IL-31과 항염 활성 관련 IL-6, TNF-α의 qRT-PCR 분석 결과, IL-13에 대한 활성은 PtB 분획이 강한 억제 활성을 나타내고, IL-31에 대한 활성은 PtB, PtC 분획에서 강한 억제 활성을 나타내며, IL-6에 대한 활성은 PtB, PtC 분획에서 강한 억제 활성을 나타내고, TNF-α에 대한 활성은 PtB 분획에서 억제 활성을 나타냄을 알 수 있다.
RP-18 silica open column 분획물의 분석을 통해 특정 부분이 염증 또는 소양증 관련 인자의 유전자 발현을 유도하는 것이 확인되었다.
이는, 유기용매 추출물의 경우 항염 및 항소양의 억제인자와 유발인자의 영향이 효능을 상쇄시키는 것으로 사료되며, 추출물의 효능을 극대화하기 위해서는 유발인자가 포함되지 않는 추출물을 확보하는 것이 중요함을 알 수 있다.
즉, 유발 물질의 함량을 최소화하고, 억제 활성 물질의 효능을 극대화 하는 분획의 조합 혹은 추출 방식이 필요함을 알 수 있다.
<실험예 3> 합성 흡착제를 활용한 batch binding 추출
합성흡착제로 스티렌(Styrene)과 디비닐 젠젠(DVB, Divinyl benzene) 공중합체의 다공성 합성흡착제는 다수의 세공이 분포하고 있어 비표면적이 높아 흡착 능력이 우수하다.
세공이 비교적 크기 때문에 흡착물질의 용리(Elution)가 용이하다.
또한, 입자 표면이 소수성을 띄고 있어서 유기물이 흡착될 때 유기분자 중의 소수성기 흡착이 원할하다.
배롱나무와 쪽을 건조하여 1:1의 중량비로 혼합한 분말과 80% EtOH를 5:1의 비율로 섞어 80% EtOH 추출액을 확보하고, Filter paper를 이용하여 80% EtOH 추출액의 부유물을 제거하였다.
그런 다음 상기 80% EtOH 추출액에 합성흡착제를 첨가하여 상온에서 3일간 흡착시키고, D.W, 30% EtOH, 50% EtOH를 이용하여 1시간씩 흡착된 합성흡착제를 washing한 후, 95% EtOH로 상기 합성흡착제에서 추출물을 용출한 다음 회전 증발 농축기를 사용하여 EtOH를 전부 제거하여 추출물을 제조하였다.
이렇게 제조된 추출물을 365nm 파장에서 분석하였으며, EtOH 추출물, EA 추출물, RP-18 silica TLC를 이용하여 분리한 추출물과 비교하여 도 5에 도시하였다.
도 5를 살펴보면, RP-18 silica 분획 추출에서 효능을 보인 C, D 분획이 다량 함유하며, 염증 등을 유발하는 E, F 분획이 효율적으로 제거된 추출물을 확보할 수 있음을 알 수 있다.
이 방식은 유해 유기용매의 사용을 피하고, 효능 분획을 다량 포함하며 불필요한 성분(강한 극성 또는 강한 비극성)을 효율적으로 제거할 수 있게 된다.
또, 유해한 성분을 효과적으로 제거하여 효능을 높이면서 생산현장에 필요한 대량생산에 용이하여 매우 경제적이고 효율적임을 알 수 있다.
특히, 생산현장에서 강한 극성 또는 강한 비극성의 성분은 제형(친지성 또는 친수성 용매)에 용해하기 어려운 문제가 있어 억제활성이 높은 EA 분획추출물을 활용하기 어렵지만, 강한 극성 또는 강한 비극성 성분을 추출방식에서 효율적으로 제거할 수 있어 제형 제작에 직접적인 활용이 가능하다.
<실험예 4> 쪽 및 배롱나무의 효능 분획에 대한 표준화(패턴 분석)
쪽의 open column 분획물의 효능 분획(PtB), 배롱나무 open column 분획물의 효능분획(LiB), 배롱나무 open column 분획물의 효능분획(LiC)에 대한 HPLC 피크 패턴을 분석하였다.
구체적으로 효능 추출물을 100% MeOH를 사용하여 5mg/mL의 농도로 희석하고, C18 column(Young Jin Biochrom Co., Ltd. C18 4.6*250mm col.)을 고정상으로, 100% MeOH를 이동상으로 HPLC system으로 분석하였다.
이때, 반복된 피크패턴 및 Ret. time으로 효능 분획의 피크패턴을 표준화하였다.
도 6은 쪽 open column 분획물의 효능 분획(PtB)에 대한 HPLC 피크패턴분석(Column, Young Jin Biochrom Co. Ltd., C18 4.6*250mm; Eluent, 100% MeOH)이며, 도 7은 배롱나무 open column 분획물의 효능분획(LiB)에 대한 HPLC 피크패턴분석(Column, Young Jin Biochrom Co. Ltd., C18 4.6*250mm; Eluent, 100% MeOH)이고, 도 8은 배롱나무 open column 분획물의 효능분획(LiC)에 대한 HPLC 피크패턴분석(Column, Young Jin Biochrom Co. Ltd., C18 4.6*250mm; Eluent, 100% MeOH)이다.
추출물의 최대 효능 분획에 대한 표준화를 위해 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석으로 피크패턴분석법으로 유효분획의 기준을 결정하였다.
쪽 open column 분획물 중 PtB 분획물은 C18 column을 사용한 HPLC 분석에서 9.088, 13.9691 15.557의 주요 Ret. time을 보였으며, 배롱나무 open column 분획물 중 LiB 분획물은 C18 column을 사용한 HPLC 분석에서 11.835와 12.567의 주요 Ret. time을 보였고, 배롱나무 open column 분획물 중 LiC 분획물은 C18 column을 사용한 HPLC 분석에서 15.644, 17.037, 17.905의 주요 Ret. time을 보였다.
<실험예 5> 항산화에 의한 항체취 효능 분석 실험(DPPH 및 ABTS를 이용한 항산화 활성 분석 및 가령취 원인물질 trans-2-nonenal 생성 억제활성 분석 실험)
<DPPH assay를 이용한 항산화 활성 분석>
DPPH stock solution(10mM DPPH, Cat. No: 044150,MD)을 250uM의 working solution으로 제조하고, 96-well plate에 DPPH working solution, sample stock solution, MeOH 및 DMSO를 다음 표와 같이 분주하고, 상온에서 10분간 반응시킨 후, 517nm 파장의 흡광도를 측정하였다.
Blank MeOH : 250㎕
Negative control DPPH working solution : 100㎕
MeOH : 147.5㎕
DMSO : 2.5㎕
Positive control DPPH working solution : 100㎕
L-Ascorbic acid stock solution : 2.5㎕
MeOH : 147.5㎕
Test DPPH working solution : 100㎕
Sample stock solution : 2.5㎕
MeOH : 147.5㎕
Total volume 250㎕
<ABTS assay를 이용한 항산화 활성 분석>
ABTS 1 tablet(Cat. No: A9941)을 100mL의 D.W에 넣어 working solution으로 제조하고, ABTS working solution에 최종농도 2.6mM 농도로 potassium persulfate를 넣은 후, 상온, 암조건에서 16시간 반응시킨 후, 96-well plate에 ABTS/potassium persulfate working solution, sample stock solution, MeOH 및 DMSO를 다음 표와 같이 분주한 다음 상온, 암조건에서 10분간 반응시킨 후, 732nm 파장의 흡광도를 측정하였다.
Blank MeOH : 200㎕
Negative control ABTS/potassium persulfate working solution : 190㎕
MeOH : 8㎕
DMSO : 2㎕
Positive control ABTS/potassium persulfate working solution : 190㎕
L-Ascorbic acid stock solution : 2㎕
MeOH : 8㎕
Test DPPH working solution : 190㎕
Sample stock solution : 2㎕
MeOH : 8㎕
Total volume 200㎕
상기 DPPH 및 ABTS를 이용한 항산화 활성 분석 결과는 도 9(DPPH법과 ABTS법을 이용한 배롱나무 및 쪽의 EtOH 추출물과 EA 분획 추출물의 항산화 활성 비교 분석. BL, Blank; N, Negative control; P, Positive control)에 도시되어 있다.
도면을 보면, 배롱나무의 경우 EtOH 추출물과 EA 분획 추출물 모두 낮은 농도(1㎍/mL)의 농도에서 부터 강한 항산화 효능을 보였으며, 쪽는 10㎍/mL의 농도에서 항산화 활성을 보이기 시작하였다.
Positive control과 비교하였을 때 동급의 효능을 보이는 쪽 EtOH 추출물 또는 EA 분획 추출물 10㎍/mL, 배롱나무 EtOH 추출물 또는 EA 분획 추출물 1㎍/mL의 농도가 항산화 활성 효능에 의의가 있음을 알 수 있다.
<가령취 원인물질 trans-2-nonenal 생성 억제활성 분석>
Palmitoleic acid(CAS. No: 76169), Cumene hydroperoxide(CAS. No: 247502) 및 sample stock solution을 1.5mL tube에 분주하고, 밀봉한 sample을 37℃에서 5일간 반응시킨 다음, GC/FID를 이용하여 표준품 Palmitoleic acid, trans-2-nonenal(CAS. No: 07592)과 비교 분석하여 도 10(추출물별 trans-2-nonenal 생성 억제활성. Negative control, only palmitoleic acid; Non-treated, palmitoleic acid and initiator(cumene hydroperoxide) 에 도시하였다.
Palmitoleic acid와 initiator 혼합물에 쪽 및 배롱나무의 EtOH 추출물 또는 EA분획 추출물을 첨가하여(100ug/mL) 진탕배양기에서 5일간 반응 후 trans-2-nonenal을 GC/FID를 이용하여 검출하였다.
도면을 보면, Palmitoleic acid와 initiator(Cumene hydroperoxide)를 10:1 비율로 혼합하여 진탕배양기에서 5일간 반응시 trans-2-nonenal이 생성되는 것이 GC/FID를 이용한 검출에서 확인되었다.
이때, 쪽 EtOH 추출물은 피부의 지방산(palmitoleic acid)의 분해물인 trans-2-nonenal이 생성되는 것을 26% 억제하는 것으로 나타났으며, 배롱나무 EA 분획 추출물은 피부의 지방산(palmitoleic acid)의 분해물인 trans-2-nonenal이 생성되는 것을 31% 억제하는 것으로 나타났다.
<실험예 6> 사람의 각질형성세포(HaCaT cell)에 대한 피부보습 및 피부장벽 유지 효능분석
<세포독성 평가 측정>
사람 Keratinocyte 세포주인 HaCaT 세포를 1×104 cell/mL로 12-well plate에 24시간 동안 배양하고, HaCaT 세포에 배롱나무 및 쪽 추출물을 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다.
그런 다음 EZ-cytox를 사용하여 세포 독성을 확인하여 그 결과를 도 11에 도시하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이 배롱나무 및 쪽 추출물을 농도별로 24, 48시간 처리 후, 0.01, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.
<세포증식 효과 측정>
사람 Keratinocyte 세포주인 HaCaT 세포를 1×104 cell/mL로 12-well plate에 24시간 동안 배양하고, HaCaT 세포에 배롱나무 및 쪽 추출물을 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양 후, 1mM의 H2O2를 24시간 동안 처리한 다음, 상기 세포에 EZ-cytox 시약을 처리하고 1시간동안 배양기에서 반응킨 후, 배지를 200㎕씩 96-well plate에 옮겨준 후 ELISA reader를 사용하여 450nm 파장의 흡광도를 측정하였다.
더불어, HaCaT 세포를 6-well plate에 24시간 동안 배양한 후 배롱나무 및 쪽 추출물을 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL의 농도로 24시간 처리한 후, Plate의 바닥 정 가운데를 일정한 간격으로 긁어준 후, 1mM의 H2O2를 24시간 동안 처리한 다음, 긁힌 빈 공간 안에 증식된 세포를 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.
도 12는 이 실험에 따라 H2O2에 노출시킨 사람의 각질형성세포(HaCaT cell)에서 쪽과 배롱나무의 세포 보호효과를 나타낸 것으로, 사람의 각질형성세포(HaCaT cell)에 배롱나무 및 쪽 추출물을 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL 농도로 24시간 동안 처리한 후, 1mM H2O2를 24시간 동안 처리한 다음 EZ-cytox를 사용하여 세포생존율을 측정한 실험 결과이다.
도면에 나타난 바와 같이 정상세포에서 H2O2에 의해 감소된 세포생존율은 배롱나무 및 쪽 추출물을 0.01, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL 농도로 처리 시 유의적으로 증가됨에 따라 배롱나무 및 쪽 추출물은 피부세포 보호효과를 나타낼 것으로 확인되었다.
또, 배롱나무 및 쪽 추출물이 피부세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 migration 정도를 광학현미경을 이용하여 관찰함. 세포보호효과 측정방법에서와 동일하게 처리한 후 관찰한 결과, 정상세포에 비해 H2O2 처리 시 세포증식이 감소되었으나 배롱나무 및 쪽 추출물의 0.01, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL 농도에서 세포증가 되었으며, 특히 0.5 및 1 ㎍/mL 농도에서 정상세포와 비슷한 수준의 세포 증식이 관찰되었다.
<웨스턴 블롯 분석>
사람 Keratinocyte 세포주인 HaCaT 세포를 6-well plate에 24시간 동안 배양하고, HaCaT 세포에 배롱나무 및 쪽 추출물을 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양 후, 1mM의 H2O2를 24시간 동안 처리하였다.
그런 다음 처리된 세포에 RIPA buffer를 넣어 단백질을 추출하고, 추출한 단백질을 bicinchoninic acid(BCA)법을 사용사여 정량하였다.
이어 정량된 단백질 시료를 8∼12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel(SDS-PAGE) 전기영동법으로 분리한 후, 분리된 단백질을 transfer buffer를 사용하여 polyvinylidene fluoride(PVDF)로 옮긴 다음, 5% skim milk로 1시간 blocking 후, 특정 1차 항체를 4℃에서 overnight 반응시켰다.
이어 Tris buffered saline with tween 20(TBS-T) 로 세척한 후 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, Enhanced chemiluminiscence system (ECL)시약을 처리하여 chemiDoc imaging systems(Bio-Rad)을 사용하여 단백질의 발현을 분석하였다.
도 13은 사람의 각질형성세포(HaCaT cell)에서 쪽과 배롱나무의 H2O2 손상에 대한 MMP-1과 COL1A1의 발현 조절을 나타낸 것으로, 사람 유래 피부세포(HaCaT cell)에서 배롱나무 및 쪽 추출물에 의한 피부장벽 관련 인자 COL1A1과 MMP-1의 조절을 western blot 방법을 사용하여 확인한 결과이다.
도 13을 보면 알 수 있듯이 정상세포에서 H2O2 (1 mM) 처리에 비해 배롱나무 추출물은 1 ㎍/mL 농도에서 MMP-1의 발현량을 27.77% 감소시켰으며, 0.1㎍/mL 농도에서 COL1A1의 발현량은 13.36% 증가하였다.
쪽 추출물은 1㎍/mL 농도에서 MMP-1 발현량은 26.08% 감소되었으며, COL1A1 발현량은 12.8% 증가되었다.
이에 따라. 배롱나무 및 쪽 추출물은 피부세포에서 피부장벽 관련인자 조절에 기여할 것으로 확인되었다.
<RT-PCR 분석>
사람 유래 각질형성세포(HaCaT cell)에서 배롱나무 및 쪽 추출물에 의한 항산화 효소 활성(HO-1, CAT, SOD2, GPx) 조절 효과를 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법을 사용하여 확인하였다.
실험 결과는 도 14에 도시하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이, 배롱나무 추출물은 정상세포에서 H2O2 처리에 비해 0.01, 0.1, 0.5 및 1㎍/mL 농도에서 HO-1의 활성을 증가시켰으며, 0.5 및 1㎍/mL 농도에서 SOD2 활성을 증가시켰다.
쪽 추출물은 정상세포에서 H2O2 처리에 비해 0.01, 0.1, 0.5 및 1 ㎍/mL 농도에서 HO-1 활성을 증가시키는 것으로 나타났다.
또한, 사람 유래 각질형성세포(HaCaT cell)에서 배롱나무 및 쪽 추출물에 의한 피부 가려움 관련 인자(IL-13, H1R)들의 조절 효과를 RT-PCR 방법을 사용하여 확인하여 그 결과를 도 15에 도시하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이, HaCaT cell에서 H2O2 처리에 의한 IL-13과 H1R 발현은 변화되지 않았으며, 배롱나무 및 쪽 추출물의 농도별 처리에 의해서도 변화를 보이지 않았다.
더불어, 사람 유래 각질형성세포(HaCaT cell)에서 배롱나무 및 쪽 추출물에 의한 염증성 cytokine (IL-6 및 TNF-α)의 활성 억제 효과를 RT-PCR 방법으로 확인하여 그 결과를 도 16에 도시하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이, 사람 유래 각질형성세포에 H2O2 처리한 후 IL-6와 TNF-α 발현은 증가되었으며, 배롱나무 및 쪽 추출물을 농도별로 처리하였을 때 H2O2에 의해 증가된 cytokine이 변화되지 않았다.
<실험예 7> 피부 소양증 및 염증 유발 사이토카인 억제 효능 분석
48시간 동안 배양된 HMC-1을 complete growth media를 이용하여 5x105 cell/mL의 농도로 희석하고, 희석한 세포를 24-well plate에 분주한 후, CO2 incubator에서 3시간 동안 배양한 다음, 추출물을 complete growth media에 희석하여 처리하고, 물질 처리 후 1시간 동안 배양한 후, PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50nM)와 Ionomycin(2uM)을 처리한 후 3시간 동안 배양하였다.
EzWay Human IL-4 ELISA Kit (Cat. No : K1331214), EzWay Human IL-6 ELISA Kit (Cat. No : K1331229), Human IL-13 ELISA Kit (Cat. No : K0331235), EzWay Human IL-31 ELISA Kit (Cat. No : K1331233), Histamine ELISA kit (Cat. No : ab213975)을 준비하고, ELISA KIT에 동봉된 Standard Protein과 Detection Anti-body 그리고 HRP Conjugate을 D.W와 Dilution buffer를 ELISA KIT protocol에 따라 희석하여 시약을 준비하였다.
준비한 대조군과 실험군 sample을 ELISA KIT에 따라 50ul 또는 100㎕를 Anti-body coated microplate에 분주하고, 분주한 sample에 동량의 Detection Anti-body을 처리한 후, Anti-body coated microplate에 plate sealer를 붙인 후 상온에서 2시간 이상 shaking incubator에서 반응 시킨 후, well에 있는 액체를 전부 털어낸 후 Wash Buffer 200㎕를 넣고 흔들어준 후 다시 털어낸다. 3회 반복 후 남아있는 Wash Buffer를 모두 제거한 다음, HRP Conjugate을 Anti-body coated microplate에 100㎕ 씩 분주하고 30분 동안 shaking incubator에서 반응 시켰다.
각 Well 마다 TMB solution을 분주하고 암조건에서 shaking incubator에서 반응시키고, Stop Solution을 각 well에 50㎕을 분주한 후, microplate reader에서 450nm 흡광도를 측정한 다음, 측정된 흡광도는 SoftMax Pro 5.4 프로그램을 통해 분석하였다.
ELISA에 의한 HMC-1(human mast cell-1)에서 분비하는 소양 및 염증인자의 억제활성은 아래 도 17에 도시하였다.
도 17에서 각 추출물은 1, 10, 100㎍/mL 농도로 처리한 것으로, N, Negative control; C, Positive control이다.
도면에서 각 단백질의 검출값은 Positive control(C) 대비 Negative control(N)과 Pt와 Li의 EtOH 추출물과 Ethyl acetate(EA) 추출물처리한 샘플에 타겟 단백질의 분비량을 비교 한 값으로 표기하였다.
도 17에서 IL-4는 쪽 EA 분획추출물, 배롱나무 EtOH 추출물과 EA 분획추출물에서 8 ~ 10%의 감소율을 보였다.
또, IL-6는 쪽 EA 분획추출물에서 가장 큰 감소율을 보이며, 배롱나무 EA 분획추출물에서도 최대 98.2%의 감소율을 보였다.
IL-31은 배롱나무 EtOH 추출물 100㎍/mL의 농도에서 49%의 감소율을 보였으며, Histamine은 쪽 EtOH 추출물에서 최대 32%의 감소율을 보이며, 배롱나무 EA 분획추출물에서 최대 50%의 감소율을 보였다.
하기의 실험예 8 내지 10은 상기 실험예 3의 추출 방식을 적용한 추출물을 적용하였다.
<실험예 8> 피부일차자극 안전성 평가 인체적용시험
식품의약품안전처 화장품 가이드라인 규정에 따라 시험기관에 피부일차자극 안전성 평가 인체적용시험을 의뢰하였으며, 실험 결과를 도 18에 나타내었다.
실험은 제품에 따른 safety zone, 시험 대상자 20% 초과 빈도로 자극 유발 제품, 매회 판독시 +2 이상 자극 반응이 총 시험 대상자의 10% 이상에서 관찰되는 시험 제품 등 3가지 기준에 따라 최종 피부 자극 유발 여부를 판정하였다.
도면을 보면 알 수 있듯이 패치 제거 후 30분, 24시간, 48시간에서 자극이 관찰되지 않았다.
<실험예 9> 피부장벽 강화 인체적용 실험
식품의약품안전처 화장품 가이드라인 규정에 따라 시험기관에 피부장벽 강화 인체적용 실험을 의뢰하여 그 결과를 도 19 내지 21에 도시하였다.
도 19는 경피수분손실량(TEWL) 측정값을 나타낸 것이다.
도 20은 평가 시점에 따른 두 군의 경피수분손실량 측정값 변화를 나타낸 그래프이다.
그래프에서 p-value는 제품 사용 전·후 변화에 대한 통계 결과이다.(Paired t-test : **p-value<0.01, ***p-value<0.001)
도 21은 평가 시점에 따른 두 군의 경피수분손실량 개선율(%)을 나타낸 것이다.
여기서 p-value는 두 군간 변화에 대한 통계 결과이다.(Mann-whitney test : †p-value<0.05)
도면을 보면 알 수 있듯이 경피수분손실량을 측정한 결과 시험 제품 사용부위와 시험 제품 미사용 부위 모두 제품 사용 전(0일)과 비교하여 제품 사용 3일후, 7일후에서 경피수분손실량이 유의적으로 감소(p<0.01)하였다.
또, 제품 사용 7일 후에서 제품 사용 부위가 미사용 부위보다 경피수분손실량 개선율이 유의적으로 높게 나타났다.(p<0.05).
<실험예 10> 가려움증 개선 효능 평가 인체적용시험
식품의약품안전처 화장품 가이드라인 규정에 따라 공인 시험·인증기관에 가려움증 개선 효능 평가 인체 적용 실험을 의뢰(VAS평가, 경피 수분 손실량 측정, 피부 수분 함유량 측정)하였다.
VAS 평가 결과는 도 22 내지 23에 도시하였다.
도 22는 VAS(Visual Analogue Scale) 측정값 및 변화율을 나타내었으며, 도 23은 평가 시점에 따른 가려움 평가 결과. p-value는 제품 사용 전·후 변화에 대한 통계 결과를 나타낸 것이다.(: Paired t-test : ***p-value<0.001)
VAS 평가 결과 가려움증 정도는 중증도의 가려움에서 가려움증 없음으로 변하였으며, 제품 사용 전(0주)과 비교하여 제품 사용 4주 후, 제품 사용 8주 후에서 통계적으로 유의미한 차이가 있게 나타났다.(p<0.001).
또, 제품 사용 전(0주)과 비교하여 제품 사용 4주 후 38.03%, 제품 사용 8주 후 76.84%의 개선율을 보였다. 아울러, 실험기간 동안 시험제품에 의한 피부 유해사례는 발생하지 않았다.
도 24 및 25에는 경피 수분 손실량 측정 결과가 나타나 있다.
도 24는 경피수분손실량 측정값 및 변화율이 나타나 있으며, 도 25에는 평가 시점에 따른 경피수분손실량 측정 결과가 도시되어 있다.
도 25에서 p-value는 제품 사용 전·후 변화에 대한 통계 결과이다.(Paired t-test : ***p-value<0.001)
경피 수분 손실량 측정 결과 제품 사용 전(0주)과 비교하여 제품 사용 4주 후, 제품 사용 8주 후에서 측정값이 통계적으로 유의미한 차이가 있게 나타났다.(p<0.001)
또, 제품 사용 전(0주)과 비교하여 제품 사용 4주 후 8.60%, 제품 사용 8주 후 20.20%의 개선율을 보였으며, 시험기간 동안 시험제품에 의한 피부 유해사례는 발생하지 않았다.
도 26 및 27에는 피부 수분 함유량 측정 결과가 도시되어 있다.
도 26에는 피부 수분 함유량 측정값 및 변화율이, 도 27에는 평가 시점에 따른 피부 수분 함유량 측정 결과가 도시되어 있다.
도 27에서 p-value는 제품 사용 전·후 변화에 대한 통계 결과이다.(Paired t-test : ***p-value<0.001)
피부 수분 함유량 측정 결과 제품 사용 전(0주)과 비교하여 제품 사용 4주 후, 제품 사용 8주 후에서 측정값이 통계적으로 유의미한 차이가 있게 나타났다.(p<0.001)
더불어 제품 사용 전(0주)과 비교하여 제품 사용 4주 후 12.60%, 제품 사용 8주 후 22.27%의 개선율을 보였으며, 시험기간 동안 시험제품에 의한 피부 유해사례는 발생하지 않았다.

Claims (3)

  1. 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물에 있어서,
    배롱나무와 쪽의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
    배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 복합추출물은 배롱나무와 쪽이 3 : 1 ~ 9의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물인 것을 특징으로 하는,
    배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 복합추출물은,
    상기 혼합물에 EtOH를 섞어 80% EtOH 추출액을 제조한 후, Filter paper를 이용하여 추출액의 부유물을 제거한 다음, 추출액에 다공성 합성흡착제를 첨가하여 상온에서 흡착시킨 후 상기 다공성 합성흡착제를 세척한 후, 95% EtOH로 상기 다공성 합성흡착제에서 추출물을 용출한 다음 회전 증발 농축기를 사용하여 EtOH를 제거하여 제조된 것을 특징으로 하는,
    배롱나무 및 쪽 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염, 항소양, 항알러지 및 항체취 효능을 갖는 약학적 또는 화장료용 조성물.
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