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WO2024047035A1 - Diagnostic method for prostate cancer - Google Patents

Diagnostic method for prostate cancer Download PDF

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Publication number
WO2024047035A1
WO2024047035A1 PCT/EP2023/073662 EP2023073662W WO2024047035A1 WO 2024047035 A1 WO2024047035 A1 WO 2024047035A1 EP 2023073662 W EP2023073662 W EP 2023073662W WO 2024047035 A1 WO2024047035 A1 WO 2024047035A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
value
ratios
prostate cancer
serum
calcium
Prior art date
Application number
PCT/EP2023/073662
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Anton Eisenhauer
Original Assignee
Geomar Helmholtz-Zentrum Für Ozeanforschung Kiel - Stiftung Des Öffentlichen Rechts
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geomar Helmholtz-Zentrum Für Ozeanforschung Kiel - Stiftung Des Öffentlichen Rechts filed Critical Geomar Helmholtz-Zentrum Für Ozeanforschung Kiel - Stiftung Des Öffentlichen Rechts
Publication of WO2024047035A1 publication Critical patent/WO2024047035A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
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    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood

Definitions

  • the invention relates to a method for early diagnosis of the pathology of a disease in patients suspected of having prostate cancer.
  • prostate cancer is the most common cancer among men in Germany at 22.7%. In 2017, 62,230 new cases were diagnosed in Germany.
  • the prostate-specific antigen (PSA) value is now used for the early detection of prostate cancer, although the significance of the PSA value is often questioned due to its low specificity.
  • US 2014/0322740 A1 proposes a more specific protein-based marker test (HSSK-Hic-Q) as an improved diagnostic method for prostate cancer compared to the PSA test. A distinction can be made here between malignant and benign tumors.
  • HSSK-Hic-Q protein-based marker test
  • AWMF oncology guideline program
  • the (PSA) value is still recommended for the early detection of prostate cancer.
  • the problem of the low specificity of the PSA test is addressed by a phased wait-and-see diagnosis that is aimed at the occurrence of bone metastases.
  • Bone metastases are detected using imaging methods such as dual X-ray absorptiometry (DXA) or magnetic resonance imaging (MRI).
  • DXA dual X-ray absorptiometry
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the problem with these imaging procedures is that no generally valid objective value is determined; the correct interpretation of the images requires a great deal of experience.
  • DXA often only reveals abnormalities when a significant portion of the bone mass has already disappeared. Therefore, earlier diagnosis of the pathology of a possible disease in patients with suspected prostate cancer is desirable.
  • DE 10 2018 214 660.8 has a method for diagnosing a disease that is associated with reduced bone density and/or calcium loss, which is based on the determination of isotope ratios.
  • Prostate cancer is not necessarily classified as such diseases as there are both osteolytic and osteoblastic stages of prostate cancer.
  • US 2014/0273248 A1 focuses on the observational support of drug therapy for bone cancer through analytical measurement of calcium isotopes in urine, blood or other tissue. Reference is also made to the possible Detection of incipient metastasis in osteoblastic prostate cancer through a possible increase in bone growth and the resulting positive shift in the bone mineral balance of calcium isotopes. US 2014/0273248 A1 further states that in practice an evaluation of the bone mineral balance of the calcium isotopes is carried out through serial measurements, which is compared with a baseline of the isotopes that is individual for each patient. However, with regard to other types of cancer than bone cancer, which is the focus of the text, only one assumption is revealed that this approach could be transferred to this.
  • the object of the invention is achieved by a method for the early diagnosis of the pathology of a possible disease in patients with suspected prostate cancer, comprising the following steps: i. Determination of isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes in a sample of blood from the patient with suspected prostate cancer. ii. Comparison of the value determined in step i with the interval defined by a threshold value
  • the assignment MO means that there is no change in bone density and therefore no metastasis and the assignment M1 means that an osteolytic stage (osteoporotic or bone-dissolving event) has been reached, there is a loss of calcium and metastases in the skeleton have already been formed and
  • the assignment M2 means that there is an osteoblastic metastasis finding with proliferating and heavily mineralizing metastases.
  • the term pathology of a possible disease in patients with suspected prostate cancer is understood in particular to mean the absence or presence of an osteolytic or osteoblastic metastasis stage.
  • the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using mass spectrometry.
  • the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using laser-induced fluorescence.
  • the method according to the invention has significant advantages over the methods currently used for detecting prostate cancer, consisting of anamnesis, positive PSA test and monitoring of possible bone metastases.
  • the pathology in relation to the formation of osteolytic, i.e. bone-dissolving, and osteoblastic, i.e. bone-forming, metastases can be diagnosed much earlier and more correctly.
  • the method according to the invention makes it possible to assign not only benign and malignant changes in the prostate, but in the latter case also to the pathology in relation to the formation of osteolytic and osteoblastic Metastases.
  • a pre-selection of critical cases is first made using a second indicator, for example a positive PSA test (usually >4 - 10 ml/l depending on age), even if the sensitivity of the PSA test is only 21%. and the affected person still has a 1 in 5 chance of not having the cancer (false positive assumption).
  • a second indicator for example a positive PSA test (usually >4 - 10 ml/l depending on age), even if the sensitivity of the PSA test is only 21%. and the affected person still has a 1 in 5 chance of not having the cancer (false positive assumption).
  • the calcium isotope ratio will then be determined, for example weekly, for all patients who test positive in a PSA test to see whether the value changes. Statistically, it is expected that 70% of suspected prostate cancer cases will not develop any metastases at all (MO cases) and only about 30% of suspected prostate cancer cases will develop metastases in the bone (M1 cases).
  • Micro-metastases initially form and must be detected as early as possible to guarantee healing. However, the latter are only inadequately or not at all recognized by imaging procedures in the early stages. The result is that the bone metastases develop very quickly and go from the initial osteolytic state of pure bone dissolution, as in osteoporosis, but with higher rates, to the osteoblastic state, with then high rates of uncontrolled mineralization (M2 cases). This is exactly where the method according to the invention comes into play.
  • the method according to the invention can already detect changes caused by the early cancer-related osteolysis of micro-metastases in the range of 0.1 g and less, which corresponds to one ten-thousandth of the bone mass, or 0.1% of the bone mass.
  • the method according to the invention for finding micro-metastases in prostate cancer therefore has a very high sensitivity in the range of less than 0.1% and is therefore suitable for the first time to distinguish between the states MO, M1 and M2 by means of a simpler method compared to imaging methods and faster measurement. This very early detection of the transition from MO to M1 then allows targeted treatment/therapy for the patient with a very high expectation of healing.
  • the core of the invention can be seen in the applicability of the fixed threshold values for the diagnostic classification into three different stages of prostate cancer, which was previously neither known nor expected.
  • US 2014/0273428 A1 the measurement of the ratio of Ca isotopes for the diagnosis and observation of bone cancer is proposed.
  • the detection of metastases resulting from prostate and breast cancer is planned.
  • osteoblastic metastases only occur in cases of prostate cancer, while osteolytic metastases are observed in breast cancer.
  • An early diagnosis in patients in whom there is an uncertain suspicion of prostate cancer, for example due to a positive PSA test, is not planned or possible.
  • the calcium isotope values of US 2014/0273428 A1 do not refer to a threshold value that is independent of the data set, so no clear statement can be made as to whether mineralization or demineralization is really present.
  • an ⁇ 44Cain is mentioned as a balance value, but is not quantified, so that a clear assignment to "mineralization” or “demineralization” cannot be made due to osteolytic or osteoblastic conditions in everyday clinical practice.
  • US 2014/0273428 A1 which represents the teaching that metastasis as a result of prostate cancer leads to osteoblastic metastases, the expert has no reason to assume that an early diagnosis in patients in whom prostate cancer is only suspected exists that could provide meaningful results or even assignment to distinguishable states.
  • US 2014/0273428 A1 does not suggest a generally valid threshold value for distinguishing between the MO, M1 and M2 states and the detection of the state of absence of metastases and the associated possibility of preserving the prostate as part of a wait-and-see diagnosis.
  • the following steps can additionally be carried out before step i: an anamnesis and/or a test with a protein-based marker.
  • the diagnostic method according to the invention is therefore preferably used to further diagnose and/or supplement a previously established suspicion based on anamnesis and/or a positive protein-based marker test.
  • the particularly advantageous aspect of the invention is the combination of a test with an insensitive marker such as PSA, typically with a sensitivity in the range of only 21%, with a very sensitive threshold value determination.
  • an insensitive marker such as PSA
  • the invention further relates to a device for the early diagnosis of the pathology of a possible prostate cancer disease, comprising a) means for determining isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes in a patient's blood sample, b) a storage medium for storing the determined value of the isotope ratios or quantitative ratios, c) means for Comparison of the stored value with an interval defined as a threshold value -0.91%o ⁇ ⁇ 44/42 Ca serum value ⁇ -0.79%o, which is stored in the storage medium, d) evaluation unit for assigning the comparison to one of three previously defined situations MO, M1 and M2 stored in the storage medium, where
  • MO -0.91%o ⁇ ⁇ 44/42 Ca serum value ⁇ -0.79%o
  • M1 ⁇ 44/42 Ca serum value ⁇ -0.91%o
  • M2 ⁇ 44/42 Ca serum value > -0.79%o, and e) output unit for outputting the situation MO, M 1 or M2 determined during the evaluation.
  • Figure 1 shows the ⁇ 44/42 Ca serum values of 20 randomly selected patients who tested positive for prostate cancer as a function of patient age.
  • the two dotted lines show the tolerance range ( ⁇ 0.06%o) of the threshold value (-0.85%o).
  • a and B There are two cases, designated A and B, in which an assignment to the MO situation based on traditional procedures (anamnesis, PSA value, imaging procedures) is not correct.
  • the doctor will take a blood sample from the patient with a normal amount of blood required for blood tests (approx. 8 ml). The blood sample is left to stand for half an hour and then centrifuged. The resulting blood serum is separated from the blood cake. Only blood serum is used for further chemical preparation.
  • an amount of serum is removed that corresponds to an absolute amount of 50 pg calcium.
  • the calcium is extracted from the blood until a solution with a concentration of approx. 5 ppm is available for mass spectrometric measurement.
  • the blood can be prepared for chemical extraction of calcium using the following procedure:
  • the digested samples are taken from the MW. In the hood, the solutions are transferred one after the other into beakers and placed on the heating plate to dry (overnight).
  • the samples are transferred to the tubes for mass spectrometric measurement on the Neptune® (plasma mass spectrometer, ThermoFisher) and measured there.
  • Neptune® plasma mass spectrometer, ThermoFisher
  • spectroscopic methods can also be used to determine the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes, which use the mass dependence of the hyperfine structure of the spectral lines by means of light emission.
  • MC-ICP-MS Multi-Collector-Ionization Coupled - Mass spectrometer
  • ThermoFisher, Neptune This method is briefly described below, but can also be used as an alternative measured in a thermionic mass spectrometer.
  • the aim is to determine the calcium isotope composition in blood serum.
  • Calcium isotope measurements are performed on an MC-ICPMS (Neptune®, Thermo Fisher Scientific).
  • the mass spectrometer is equipped with nine Faraday cups, eight of which are movable. These are set up so that the atomic masses (u) 42, 43, 43.5 and 44 can be measured simultaneously.
  • an APEX IR sample introduction system (Elemental Scientific®) is used. All measurements are carried out in medium resolution (m/Am - 4000) on the interference-free plateau of the low-mass side of the central measurement peak. This is achieved by selecting an appropriate mean cup mass of 4.687 ⁇ 0.001u and verifying it daily.
  • the instrumental fractionation (“mass bias”) is corrected by using the “Standard Sample Bracketing (SSB)” procedure.
  • the measurement of a sample is corrected by measurements of a 5 pg/ml Ca solution prepared from a 10000 pg/ml Ca-ICP standard solution. Each sample is measured at least four times during a session and their average value is used for further procedures.
  • the measured Ca-ICP standard solution serves as the primary reference material.
  • chemically unprocessed NIST SRM 915a material is measured at the beginning and end of each session and these results are compared to those of chemically processed NIST SRM 915a.
  • the average difference between processed and unprocessed SRM 915a should generally be less than 0.01%, so that Ca isotope fractionation during chemical cleaning can be considered negligible.
  • the “on-peak” approach is used for background correction.
  • the measured intensities of a 1% HNO 3 solution are subtracted from the intensities of the subsequent sample measurements.
  • the measurements are checked for residual doubly charged strontium ( 84 Sr, 86 Sr and 88 Sr) to ensure correct measurement of the intensities of the 42 Ca, 43 Ca and 44 Ca masses.
  • residual doubly charged strontium 84 Sr, 86 Sr and 88 Sr
  • the intensity ratios of the masses 42/43.5, 43/43.5 and 44/43.5 of a 2 pg/ml Sr solution are measured at the beginning of each session. These ratios are then used to calculate the intensities of doubly charged Sr from the measured intensities of mass 43.5 of a given sample.
  • ⁇ 44/42 Ca values of NIST SRM 1486 and IAPSO seawater standard measured during the measurement phase are compared with published values.
  • the measured calcium isotope values are reported in the usual ö notation: where ( 44 Ca/ 42 Ca) sample is the ratio of the blood sample measured in the mass spectrometer and ( 44 Ca/ 42 Ca) standard is the calcium isotope ratio of an internationally known and certified ratio. This procedure allows international comparability of the measured isotope ratios.

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Abstract

The present invention relates to a method for the early diagnosis of the pathology of a possible illness in patients suspected of having prostate cancer, comprising the following steps: i. determining isotope ratios or quantity ratios of calcium isotopes in a sample of the blood of the patient suspected of having prostate cancer. ii. comparing the value determined in step i with the interval -0.91‰ < δ44/42 CaSerum value < -0.79 ‰ defined by a threshold value, iii. assigning, based on the comparison from step ii, to one of three defined situations M0, M1 and M2 where M0: -0.91‰ < δ44/42 CaSerum value < -0.79 ‰ M1: δ44/42 CaSerum value < -0.91‰ M2: δ44/42 CaSerum value > -0.79‰.

Description

Diagnosemethode für Prostatakrebs Diagnostic method for prostate cancer
Die Erfindung betrifft eine Methode zur frühzeitigen Diagnose der Pathologie einer Erkrankung bei Patienten mit Verdacht auf Prostata krebs. The invention relates to a method for early diagnosis of the pathology of a disease in patients suspected of having prostate cancer.
Gemäß der Deutschen Krebsgesellschaft ist Prostatakrebs mit 22,7% die häufigste Krebserkrankung von Männern in Deutschland. Im Jahr 2017 wurden in Deutschland 62.230 Neuerkrankungen diagnostiziert. According to the German Cancer Society, prostate cancer is the most common cancer among men in Germany at 22.7%. In 2017, 62,230 new cases were diagnosed in Germany.
Zur Früherkennung von Prostatakarzinomen wird heute der Prostataspezifische-Antigen (PSA)-Wert genutzt, obwohl die Aussagekraft des PSA-Wertes aufgrund der geringen Spezifität häufig in Frage gestellt wird. So schlägt die US 2014/0322740 A1 einen spezifischeren proteinbasierten Marker-Test (HSSK-Hic-Q) zur gegenüber dem PSA-Test verbesserten Diagnosemethode für Prostata- Krebs vor. Es kann hier zwischen bösartigen und gutartigen Tumoren unterschieden werden. Laut Leitlinienprogramm Onkologie (Deutsche Krebsgesellschaft, Deutsche Krebshilfe, AWMF): S3-Leitlinie Prostatakarzinom, Langversion 6.0, 2021 , AWMF Registernummer: 043/0220L, wird jedoch zur Früherkennung von Prostatakarzinomen weiterhin der (PSA)-Wert empfohlen. The prostate-specific antigen (PSA) value is now used for the early detection of prostate cancer, although the significance of the PSA value is often questioned due to its low specificity. US 2014/0322740 A1 proposes a more specific protein-based marker test (HSSK-Hic-Q) as an improved diagnostic method for prostate cancer compared to the PSA test. A distinction can be made here between malignant and benign tumors. However, according to the oncology guideline program (German Cancer Society, German Cancer Aid, AWMF): S3 guidelines for prostate cancer, long version 6.0, 2021, AWMF registration number: 043/0220L, the (PSA) value is still recommended for the early detection of prostate cancer.
Dem Problem der geringen Spezifität des PSA-Testes wird durch eine abgestuft abwartende Diagnostik, die auf das Auftreten von Knochenmetastasen gerichtet ist, begegnet. Der Nachweis der Knochenmetastasen erfolgt dabei durch bildgebende Verfahren wie die Dual X-ray Absorptiometry (DXA) oder die Magnetresonanztomographie (MRT). Problematisch bei diesen bildgebenden Verfahren ist es, dass kein allgemeingültiger objektiver Wert ermittelt wird, sondern die richtige Interpretation der Bilder sehr viel Erfahrung voraussetzt. Hinzu kommt auch, dass sich in der DXA häufig erst dann Auffälligkeiten zeigen, wenn bereits ein erheblicher Teil der Knochenmasse verschwunden ist. Eine frühzeitigere Diagnose der Pathologie einer möglichen Erkrankung bei Patienten mit Verdacht auf Prostatakrebs ist daher wünschenswert. The problem of the low specificity of the PSA test is addressed by a phased wait-and-see diagnosis that is aimed at the occurrence of bone metastases. Bone metastases are detected using imaging methods such as dual X-ray absorptiometry (DXA) or magnetic resonance imaging (MRI). The problem with these imaging procedures is that no generally valid objective value is determined; the correct interpretation of the images requires a great deal of experience. In addition, DXA often only reveals abnormalities when a significant portion of the bone mass has already disappeared. Therefore, earlier diagnosis of the pathology of a possible disease in patients with suspected prostate cancer is desirable.
Die DE 10 2018 214 660.8 hat ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die mit einer verminderten Knochendichte und/oder Calcium Verlust einhergeht, zum Inhalt, welches auf der Bestimmung von Isotopenverhältnissen beruht. Prostatakrebs wird nicht notwendigerweise zu solchen Erkrankungen gezählt, da es sowohl osteolytische als auch osteoblastische Stadien des Prostatakrebs gibt. DE 10 2018 214 660.8 has a method for diagnosing a disease that is associated with reduced bone density and/or calcium loss, which is based on the determination of isotope ratios. Prostate cancer is not necessarily classified as such diseases as there are both osteolytic and osteoblastic stages of prostate cancer.
Die US 2014/0273248 A1 beschreibt im Schwerpunkt die beobachtende Begleitung einer medikamentösen Therapie von Knochenkrebs durch analytische Messung der Kalziumisotope in Urin, Blut oder anderem Gewebe. Es wird auch Bezug genommen auf die mögliche Detektion einer einsetzenden Metastasierung bei osteoblastischem Prostatakrebs durch eine mögliche Erhöhung des Knochenwachstums und dadurch verursachter positiven Verschiebung in der Knochen-Mineralbalance der Kalziumisotope. Weiter führt die US 2014/0273248 A1 aus, dass in der Praxis eine Auswertung der Knochen-Mineralbalance der Kalziumisotope durch serielle Messungen vorgenommen wird, welche mit einer für jeden Patienten individuellen Basislinie der Isotope verglichen wird. Es wird jedoch hinsichtlich anderer Krebsarten als für den im Zentrum der Schrift stehenden Knochenkrebs nur eine Annahme offenbart, dass dieses Vorgehen hierauf übertragen werden könnte. US 2014/0273248 A1 focuses on the observational support of drug therapy for bone cancer through analytical measurement of calcium isotopes in urine, blood or other tissue. Reference is also made to the possible Detection of incipient metastasis in osteoblastic prostate cancer through a possible increase in bone growth and the resulting positive shift in the bone mineral balance of calcium isotopes. US 2014/0273248 A1 further states that in practice an evaluation of the bone mineral balance of the calcium isotopes is carried out through serial measurements, which is compared with a baseline of the isotopes that is individual for each patient. However, with regard to other types of cancer than bone cancer, which is the focus of the text, only one assumption is revealed that this approach could be transferred to this.
Es ist Aufgabe der Erfindung ein neues Verfahren zur frühzeitigen Diagnose der Pathologie einer möglichen Erkrankung bei Patienten, zur Verfügung zu stellen. Dies soll bevorzugt für solche Patienten gelten, bei denen auf Basis einer vorherigen Anamnese und/oder eines vorherigen Tests mit proteinbasiertem Marker der Verdacht auf Prostatakrebs besteht. Das Verfahren soll einfacher und schneller auszuführen sein als die bisher bekannten Verfahren. It is the object of the invention to provide a new method for the early diagnosis of the pathology of a possible disease in patients. This should preferably apply to patients in whom prostate cancer is suspected based on a previous medical history and/or a previous test with a protein-based marker. The method should be easier and quicker to carry out than the previously known methods.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur frühzeitigen Diagnose der Pathologie einer möglichen Erkrankung bei Patienten mit Verdacht auf Prostatakrebs, umfassend die folgenden Schritte: i. Bestimmen von Isotopenverhältnissen oder Mengenverhältnissen von Calciumisotopen in einer Probe von Blut des Patienten mit Verdacht auf Prostata krebs. ii. Vergleich des in Schritt i ermittelten Wertes mit dem durch einen Schwellenwert definiertem Intervall The object of the invention is achieved by a method for the early diagnosis of the pathology of a possible disease in patients with suspected prostate cancer, comprising the following steps: i. Determination of isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes in a sample of blood from the patient with suspected prostate cancer. ii. Comparison of the value determined in step i with the interval defined by a threshold value
-0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o iii. Zuordnung anhand des Vergleichs aus Schritt ii zu einem der drei definierten Situationen MO, M1 und M2 wobei -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o iii. Assignment based on the comparison from step ii to one of the three defined situations MO, M1 and M2 where
MO: -0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o MO: -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o
M1 : δ44/42 CaSerum-Wert < -0,91%o M1: δ 44/42 Ca serum value < -0.91%o
M2: δ44/42 CaSerum-Wert > -0,79%o darstellt. M2: δ 44/42 Ca serum value > -0.79%o.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die Zuordnung MO, dass keine Änderung der Knochendichte und damit keine Metastasierung vorliegt und die Zuordnung M1 bedeutet, dass ein osteolytisches Stadium (osteoporotisches oder knochenauflösendes Geschehen) erreicht ist, Calcium Verlust vorliegt und Metastasen im Skelett bereits gebildet wurden und die Zuordnung M2 bedeutet, dass ein osteoblastischer Metastasen-Befund mit wuchernden und stark mineralisierenden Metastasen vorliegt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff der Pathologie einer möglichen Erkrankung bei Patienten mit Verdacht auf Prostatakrebs insbesondere die Abwesenheit, das Vorliegen eines osteolytischen oder osteoblastischen Metastasen-Stadiums verstanden. In the sense of the present invention, the assignment MO means that there is no change in bone density and therefore no metastasis and the assignment M1 means that an osteolytic stage (osteoporotic or bone-dissolving event) has been reached, there is a loss of calcium and metastases in the skeleton have already been formed and The assignment M2 means that there is an osteoblastic metastasis finding with proliferating and heavily mineralizing metastases. For the purposes of the present invention, the term pathology of a possible disease in patients with suspected prostate cancer is understood in particular to mean the absence or presence of an osteolytic or osteoblastic metastasis stage.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe der Massenspektrometrie. In a preferred embodiment of the invention, the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using mass spectrometry.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe der Laserinduzierten Fluoreszenz. In an alternative embodiment of the invention, the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using laser-induced fluorescence.
Das Vorgehen bei der Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe der Laserinduzierten Fluoreszenz kann der Fachmann beispielsweise der US10302565B2 entnehmen. The procedure for determining the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes using laser-induced fluorescence can be found by a person skilled in the art, for example, in US10302565B2.
Es zeigte sich, dass das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den zurzeit genutzten Verfahren zur Erkennung von Prostatakrebs bestehend aus Anamnese, positivem PSA-Test und der Überwachung von möglicherweise auftretenden Knochenmetastasen deutliche Vorteile bringt. It has been shown that the method according to the invention has significant advantages over the methods currently used for detecting prostate cancer, consisting of anamnesis, positive PSA test and monitoring of possible bone metastases.
Überraschenderweise kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr viel frühzeitiger und richtiger die Pathologie in Bezug auf die Bildung von osteolytischen, d.h. knochenauflösenden, und osteoblastischen, d.h. knochenbildenden, Metastasen diagnostiziert werden. Surprisingly, with the help of the method according to the invention, the pathology in relation to the formation of osteolytic, i.e. bone-dissolving, and osteoblastic, i.e. bone-forming, metastases can be diagnosed much earlier and more correctly.
Gegenüber Verfahren der Frühdiagnose, die einzig auf dem Einsatz proteinbasierter Marker beruhen ergibt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit der Zuordnung nicht nur zu gutartigen und bösartigen Veränderungen der Prostata, sondern im letzteren Fall auch zu der Pathologie in Bezug auf die Bildung von osteolytischen und osteoblastischen Metastasen. Compared to early diagnosis methods that are based solely on the use of protein-based markers, the method according to the invention makes it possible to assign not only benign and malignant changes in the prostate, but in the latter case also to the pathology in relation to the formation of osteolytic and osteoblastic Metastases.
Aus den gemessenen Kalziumisotopen Daten im Vergleich zu den Schwellenwerten im Urin und Blutserum kann eine Aussage über die Kalzium Bilanz eines Menschen gemacht werden, d.h. ob der Kalziumverlust über den Urin höher ist im Vergleich zu der für die Knochenmineralisation benötigte Menge an Kalzium (osteoporotisches Geschehen). Der Unterschied des erfindungsgemäßen Verfahrens zu den Verfahren des Standes der Technik kann insbesondere auch darin gesehen werden, dass die Bestimmung ob ein osteoporotisches Geschehen vorliegt oder nicht eine hinreichende aber nicht notwendige Bedingung für das Vorhandensein eines metastasierenden Prostatakarzinom ist. In einer bevorzugen Ausgestaltung des vorliegenden Verfahrens zunächst eine Vorauswahl der kritischen Fälle mittels eines zweiten Indikators z.B. einem positiven PSA-Test (in der Regel >4 - 10 ml/l altersabhängig) getroffen werden, auch wenn die Sensitivität des PSA Tests nur bei 21% und der Betroffene immer noch eine Chance von 1 zu 5 hat, den Krebs nicht zu haben (Falsch-Positive Annahme). From the measured calcium isotope data compared to the threshold values in urine and blood serum, a statement can be made about a person's calcium balance, i.e. whether the calcium loss through urine is higher compared to the amount of calcium required for bone mineralization (osteoporotic events). . The difference between the method according to the invention and the methods of the prior art can be seen in particular in the fact that the determination of whether an osteoporotic event is present or not is a sufficient but not necessary condition for the presence of a metastatic prostate carcinoma. In a preferred embodiment of the present method, a pre-selection of critical cases is first made using a second indicator, for example a positive PSA test (usually >4 - 10 ml/l depending on age), even if the sensitivity of the PSA test is only 21%. and the affected person still has a 1 in 5 chance of not having the cancer (false positive assumption).
Gleichwohl wird man aus einer Risikobewertung heraus dann für alle in einem PSA Test positiv getesteten Patienten eine beispielsweise wöchentliche Bestimmung des Kalziumisotopenverhältnisses machen, um zu sehen ob sich der Wert ändert. Statistisch ist zu erwarten, dass 70% der Prostata Verdachtsfälle überhaupt keine Metastasen ausbilden (MO-Fälle) und es nur bei ca. 30% der Prostatakrebsverdachtsfälle zu Metastasen in den Knochen kommt (M1-Fälle). Nevertheless, as part of a risk assessment, the calcium isotope ratio will then be determined, for example weekly, for all patients who test positive in a PSA test to see whether the value changes. Statistically, it is expected that 70% of suspected prostate cancer cases will not develop any metastases at all (MO cases) and only about 30% of suspected prostate cancer cases will develop metastases in the bone (M1 cases).
Es bilden sich zunächst "Mikro-Metastasen", die so früh wie möglich erkannt werden müssen, um eine Heilung zu garantieren. Letztere werden aber durch die bildgebenden Verfahren im frühen Stadium nur unzureichend bzw. gar nicht erkannt. Die Folge ist, dass sich die Knochenmetastasen sehr schnell entwickeln und vom anfänglichen osteolytischen Zustand der puren Knochenauflösung, wie bei Osteoporose, aber mit höheren Raten, in den osteoblastischen Zustand, mit dann hohen Raten unkotrollierter Mineralisierung, übergehen (M2-Fälle). Genau hier setzt das erfindungsgemäße Verfahren an. Die erfindungsgemäße Methode kann bereits Veränderungen durch die frühe Krebs-bedingte Osteolyse von Mikro- Metastasen im Bereich von 0.1 g und weniger erkennen, dies entspricht einem zehntausendstel der Knochenmassen, oder 0.1 %o der Knochenmasse. “Micro-metastases” initially form and must be detected as early as possible to guarantee healing. However, the latter are only inadequately or not at all recognized by imaging procedures in the early stages. The result is that the bone metastases develop very quickly and go from the initial osteolytic state of pure bone dissolution, as in osteoporosis, but with higher rates, to the osteoblastic state, with then high rates of uncontrolled mineralization (M2 cases). This is exactly where the method according to the invention comes into play. The method according to the invention can already detect changes caused by the early cancer-related osteolysis of micro-metastases in the range of 0.1 g and less, which corresponds to one ten-thousandth of the bone mass, or 0.1% of the bone mass.
Das erfindungsgemäße Verfahren für das Auffinden von Mikro-Metastasen bei Prostatakrebs weist somit eine sehr hohe Sensitivität im Bereich von weniger als 0.1 %o auf und ist daher erstmals geeignet, zwischen den Zuständen MO, M1 und M2 im Wege einer im Vergleich zu bildgebenden Verfahren einfacheren und schnelleren Messung zu unterscheiden. Diese sehr frühe Erkennung des Übergangs von MO zu M1 erlaubt dann eine gezielte Behandlung/Therapie des Patienten mit einer sehr hohen Heilungserwartung. The method according to the invention for finding micro-metastases in prostate cancer therefore has a very high sensitivity in the range of less than 0.1% and is therefore suitable for the first time to distinguish between the states MO, M1 and M2 by means of a simpler method compared to imaging methods and faster measurement. This very early detection of the transition from MO to M1 then allows targeted treatment/therapy for the patient with a very high expectation of healing.
Der Kern der Erfindung kann mit anderen Worten gesehen werden in der Anwendbarkeit der festen Schwellenwerte für die diagnostische Einordnung in drei verschiedene Stadien von Prostatakrebs, welche bisher weder bekannt noch zu erwarten war. In der US 2014/0273428 A1 wird die Messung des Verhältnisses von Ca-Isotopen zur Diagnose und Beobachtung von Knochenkrebs vorgeschlagen. Es ist wird unter anderem die Detektion von Metastasen infolge von Prostata- und Brustkrebs vorgesehen. Bei vorliegendem Prostata-Krebs kommt es nach den Erkenntnissen der US 2014/0273428 A1 alleinig zu osteoblastischen Metastasen während bei Brustkrebs osteolytische Metastasen beobachten werden. Eine frühzeitige Diagnose bei Patienten bei denen z.B. auf Grund eines positiven PSA-Tests der unsichere Verdacht auf Prostata- Krebs besteht, ist nicht vorgesehen oder möglich. In other words, the core of the invention can be seen in the applicability of the fixed threshold values for the diagnostic classification into three different stages of prostate cancer, which was previously neither known nor expected. In US 2014/0273428 A1 the measurement of the ratio of Ca isotopes for the diagnosis and observation of bone cancer is proposed. Among other things, the detection of metastases resulting from prostate and breast cancer is planned. According to the findings of US 2014/0273428 A1, osteoblastic metastases only occur in cases of prostate cancer, while osteolytic metastases are observed in breast cancer. An early diagnosis in patients in whom there is an uncertain suspicion of prostate cancer, for example due to a positive PSA test, is not planned or possible.
Die Kalziumisotopenwerte der US 2014/0273428 A1 beziehen sich nicht auf einen vom Datensatz unabhängigen Schwellenwert, also wird keine klare Aussage darüber getroffen werden können, ob wirklich Mineralisation oder Demineralisation vorliegt. In Abbildung 2 in US 2014/0273428 A1 wird zwar ein ö44Cain, als Gleichgewichtswert erwähnt, aber nicht quantifiziert, so dass eine eindeutige Zuordnug zu "Mineralisierung" oder "Demineralisierung" aufgrund osteolytischer oder osteoblastärer Bedingungen im klinischen Alltag nicht getroffen werden kann. Die in US 2014/0273428 A1 getroffene Unterteilung ob "gesund" oder "krank" bezieht sich immer auf den statistischen Mittelwert des betrachteten Datensatzes, der aber auch aufgrund des kleinen Datensatzes mit einem hohem statistischen Fehler belastet ist, der die Interpretation in die eine oder andere Richtung generell erschwert, abgesehen davon dass es sich stets um Daten von Patienten mit Knochenkrebs handelt. The calcium isotope values of US 2014/0273428 A1 do not refer to a threshold value that is independent of the data set, so no clear statement can be made as to whether mineralization or demineralization is really present. In Figure 2 in US 2014/0273428 A1, an δ44Cain is mentioned as a balance value, but is not quantified, so that a clear assignment to "mineralization" or "demineralization" cannot be made due to osteolytic or osteoblastic conditions in everyday clinical practice. The division made in US 2014/0273428 A1 whether "healthy" or "sick" always refers to the statistical mean of the data set under consideration, which is also subject to a high statistical error due to the small data set, which makes the interpretation one way or the other other direction is generally difficult, apart from the fact that it always involves data from patients with bone cancer.
Weiterhin wird nicht darauf eingegangen, wie ein unter Osteoporose leidender Patient von einem metastasierenden Prostatakrebs im osteolytischen Zustand zu unterscheiden ist. Eine Vorauswahl muss daher anhand eines von den Kalziumisotopen unabhängigen Kriteriums, dem PSA Test, wie von der Erfindung vorgesehen vorgenommen werden. Das Problem ist dabei den Übergang vom MO zum M1 Stadium mittels der Kalzium Isotope zu erkennen, dies ist nur durch klar definierte Schwellenwerte möglich, die eine Abgrenzung und Differenzierung zwischen den Stadien MO, M1 und M2 ermöglichen. Dies gelingt im Unterschied zur US 2014/0273428 A1 mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Furthermore, it is not discussed how a patient suffering from osteoporosis can be distinguished from metastatic prostate cancer in an osteolytic state. A preselection must therefore be carried out using a criterion independent of the calcium isotopes, the PSA test, as provided for by the invention. The problem is to recognize the transition from the MO to the M1 stage using the calcium isotopes; this is only possible through clearly defined threshold values that enable delimitation and differentiation between the MO, M1 and M2 stages. In contrast to US 2014/0273428 A1, this is achieved with the method of the present invention.
Ausgehend von der US 2014/0273428 A1, welche die Lehre vertritt, dass Metastasierung in Folge von Prostata- Krebs zu osteoblastischen Metastasen führt, hat der Fachmann keinen Grund anzunehmen, dass eine frühzeitige Diagnose bei Patienten, bei denen nur der Verdacht auf Prostata- Krebs besteht sinnvolle Ergebnisse oder gar die Zuordnung zu unterscheidbaren Zuständen liefern könnte. Insbesondere ein allgemeingültiger Schwellenwert zur Unterscheidung der MO, M1 und M2 Zustände und die Detektion des Zustands der Abwesenheit von Metastasen und der damit verbundenen Möglichkeit des Erhalts der Prostata im Rahmen einer abwartenden Diagnose, ist durch die US 2014/0273428 A1 nicht nahegelegt. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können vor Schritt i zusätzlich folgende Schritte ausgeführt werden: eine Anamnese und/oder ein Test mit proteinbasiertem Marker. Based on US 2014/0273428 A1, which represents the teaching that metastasis as a result of prostate cancer leads to osteoblastic metastases, the expert has no reason to assume that an early diagnosis in patients in whom prostate cancer is only suspected exists that could provide meaningful results or even assignment to distinguishable states. In particular, US 2014/0273428 A1 does not suggest a generally valid threshold value for distinguishing between the MO, M1 and M2 states and the detection of the state of absence of metastases and the associated possibility of preserving the prostate as part of a wait-and-see diagnosis. In a further embodiment of the method according to the invention, the following steps can additionally be carried out before step i: an anamnesis and/or a test with a protein-based marker.
Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren ist damit bevorzugt einzusetzen, um einen vorher festgestellten Verdacht aufgrund einer Anamnese und/oder positiv ausgewertetem proteinbasiertem Marker-Test weiter zu diagnostizieren und/oder diese zu ergänzen. The diagnostic method according to the invention is therefore preferably used to further diagnose and/or supplement a previously established suspicion based on anamnesis and/or a positive protein-based marker test.
Das besonders vorteilhafte der Erfindung ist in einer bevorzugten Ausgestaltung daher insbesondere die Kombination eines Tests mit einem insensitiven Markers wie PSA, typischerweise mit einer Sensitivität im Bereich von nur 21%, mit einer sehr sensitiven Schwel lenwertbestim mung . In a preferred embodiment, the particularly advantageous aspect of the invention is the combination of a test with an insensitive marker such as PSA, typically with a sensitivity in the range of only 21%, with a very sensitive threshold value determination.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur frühzeitigen Diagnose der Pathologie einer möglichen Prostatakrebserkrankung umfassend a) Mittel zur Bestimmung von Isotopenverhältnissen oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen in einer Blutprobe eines Patienten, b) ein Speichermedium zum Speichern des ermittelten Wertes der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse, c) Mittel zum Vergleich des gespeicherten Wertes mit einem als Schwellenwert definierten Intervall -0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o, welches im Speichermedium hinterlegt ist, d) Auswerteeinheit zur Zuordnung des Vergleichs zu einem von drei zuvor definierten und im Speichermedium hiintergelgten Situationen MO, M1 und M2, wobei The invention further relates to a device for the early diagnosis of the pathology of a possible prostate cancer disease, comprising a) means for determining isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes in a patient's blood sample, b) a storage medium for storing the determined value of the isotope ratios or quantitative ratios, c) means for Comparison of the stored value with an interval defined as a threshold value -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o, which is stored in the storage medium, d) evaluation unit for assigning the comparison to one of three previously defined situations MO, M1 and M2 stored in the storage medium, where
MO: -0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o M1: δ44/42 CaSerum-Wert < -0,91%o MO: -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o M1: δ 44/42 Ca serum value < -0.91%o
M2: δ44/42 CaSerum-Wert > -0,79%o darstellt, und e) Ausgabeeinheit zur Ausgabe der bei der Auswertung ermittelten Situation MO, M 1 oder M2. Die 8m3/m2 Ca Werte lassen sich nach der folgenden Formel auch auf andere Ca- Isotopenverhältnisse (beispielsweise unter Beteiligung von 40Ca, 41Ca, 46Ca, 48Ca, 43Ca) übertragen: ln(m3 /m2) äm3/m2Ca = äm3/mlCa x mit m3 > m2 > m1. M2: δ 44/42 Ca serum value > -0.79%o, and e) output unit for outputting the situation MO, M 1 or M2 determined during the evaluation. The 8 m3/m2 Ca values can also be transferred to other Ca isotope ratios (for example involving 40 Ca, 41 Ca, 46 Ca, 48 Ca, 43 Ca) using the following formula: ln(m3 /m2) ä m3/ m2 Ca = ä m3/ml Ca x with m3 > m2 > m1.
Auf diese Weise können in Sinne der Erfindung auch andere Calciumisotopenverhältnisse bestimmt werden, die dann auf den beanspruchten δ44/42 CaSerum-Wert des Schrittes ii) umgerechnet werden. In this way, other calcium isotope ratios can also be determined in accordance with the invention, which are then converted to the claimed δ 44/42 Ca serum value of step ii).
Im Folgenden soll die Allgemeinheit der Lehre nicht einschränkend das erfindungsgemäße Verfahren und seine Vorteile erläutert werden. The following is intended to explain the method according to the invention and its advantages without restricting the generality of the teaching.
Die Abbildung 1 zeigt die δ44/42 CaSerum-Werte von 20 willkürlich ausgewählten Prostata- Krebspositiv getesteten Patienten als Funktion des Patientenalters. Figure 1 shows the δ 44/42 Ca serum values of 20 randomly selected patients who tested positive for prostate cancer as a function of patient age.
Die Zuordnung zu den Situationen MO, M1 und M2 erfolgte vor der Messung der Ca- Isotopenverhältnisse anhand der dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden Diagnoseverfahren (Anamnese und positiver PSA Test) und zusätzlich durch bildgebende Verfahren. The assignment to the situations MO, M1 and M2 was carried out before the measurement of the Ca isotope ratios using the current state of the art diagnostic procedures (anamnesis and positive PSA test) and additionally using imaging procedures.
Die dicke gestrichelte Linie zeigt den Gleichgewichtswert δ44/42CaGleichgewicht= -0,85 %o an. The thick dashed line indicates the equilibrium value δ 44/42 Ca equilibrium = -0.85%o.
Die beiden gepunkteten Linien zeigen den Toleranzbereich (±0.06 %o) des Schwellenwerts (-0.85 %o). The two dotted lines show the tolerance range (±0.06%o) of the threshold value (-0.85%o).
Es sind zwei Fälle, bezeichnet mit A und B zuerkennen, in denen eine Zuordnung aufgrund der traditionellen Verfahren (Anamnese, PSA-Wert, Bildgebende Verfahren) zur Situation MO nicht zutreffend ist. There are two cases, designated A and B, in which an assignment to the MO situation based on traditional procedures (anamnesis, PSA value, imaging procedures) is not correct.
Im Fall A zeigt sich eine Verminderung der Knochendichte, die möglicherweise auf nicht erkanntem osteolytischen Metastasen Befall zurückzuführen ist (M1). In case A there is a reduction in bone density, which may be due to unrecognized osteolytic metastases (M1).
Im Fall B zeigt sich eine nicht erkannte und nicht altersgerechte Mineralisierung der Knochen, so dass von einem wuchernden osteoblastischen Metastasen-Befund (M2) ausgegangen werden muss, der durch die traditionellen Verfahren jedoch noch als „ohne Befund, MO“ fälschlich klassifiziert wurde. Material und Methoden In case B, there is unrecognized and age-appropriate mineralization of the bones, so that a proliferating osteoblastic metastasis finding (M2) must be assumed, which was, however, incorrectly classified as “no findings, MO” by traditional methods. material and methods
Probenentnahme für Blut: Blood sampling:
Dem Patienten wird durch den Arzt eine Blutprobe mit einer normalen für Blutuntersuchungen benötigten Blutmenge (ca. 8 ml) entnommen. Die Blutprobe wird eine halbe Stunde stehen gelassen danach zentrifugiert. Das so entstandene Blutserum wird vom Blutkuchen getrennt. Für die weiteren chemischen Aufbereitungen wird ausschließlich Blutserum verwendet. The doctor will take a blood sample from the patient with a normal amount of blood required for blood tests (approx. 8 ml). The blood sample is left to stand for half an hour and then centrifuged. The resulting blood serum is separated from the blood cake. Only blood serum is used for further chemical preparation.
Für die weitere chemische Aufbereitung wird eine Serummenge entnommen, die einer absoluten Menge von 50 pg Calcium entspricht. For further chemical preparation, an amount of serum is removed that corresponds to an absolute amount of 50 pg calcium.
Extraktion des Calciums aus den Proben: Extraction of calcium from the samples:
In einem chemischen Verfahren wird das Calcium aus dem Blut extrahiert bis eine Lösung mit einer Konzentration von ca. 5 ppm zur massenspektrometrischen Messung zur Verfügung steht. In a chemical process, the calcium is extracted from the blood until a solution with a concentration of approx. 5 ppm is available for mass spectrometric measurement.
Die Aufbereitung des Blutes zur chemischen Extraktion des Calciums kann nach dem folgenden Verfahren erfolgen: The blood can be prepared for chemical extraction of calcium using the following procedure:
Chemische Probenaufbereitung zur Calcium Isotopenbestimmung in Blut Chemical sample preparation for calcium isotope determination in blood
Tag 1 day 1
• Die für den Mikrowellen(MW)aufschluss vorgeschriebenen Gefäße werden mit HNO3 und H2O2 befüllt. • The vessels prescribed for microwave (MW) digestion are filled with HNO 3 and H 2 O 2 .
• Die vorbereiteten Proben und Standards werden zu dem jeweiligen Gefäß pipettiert. • The prepared samples and standards are pipetted into the respective vessel.
• Gefäße werden verschlossen, das Mikrowellengerät wird gestartet und für 1.5 Stunden in die MW gestellt. • Vessels are closed, the microwave oven is started and placed in the MW for 1.5 hours.
• Die aufgeschlossenen Proben werden aus der MW geholt. Im Abzug werden die Lösungen nacheinander in Becher umgefüllt und auf die Heizplatte zum Trocknen (über Nacht) gestellt. • The digested samples are taken from the MW. In the hood, the solutions are transferred one after the other into beakers and placed on the heating plate to dry (overnight).
Tag 2 day 2
• Die aufgeschlossenen und über Nacht getrockneten Proben werden mit 1ml HNO3 +0.5ml H2O2 aufgenommen und wieder verschlossen für 3 Stunden gekocht. • The digested and dried overnight samples are taken up with 1ml HNO 3 +0.5ml H 2 O 2 and closed again and boiled for 3 hours.
• Becher öffnen und Lösung eintrocknen. • Getrocknete Proben werden in 1ml 2M HNO3 aufgenommen. • Open the beaker and let the solution dry. • Dried samples are taken up in 1ml 2M HNO 3 .
Tag 3 Day 3
• Die Konzentration des Calciums (Ca) wird an der Q-ICP-MS mittels Standardverfahren gemessen. • The concentration of calcium (Ca) is measured on the Q-ICP-MS using standard methods.
Tag 4 Day 4
• Um für die Säulenchromatographie immer die gleiche absoluten Ca Mengen (50 gCa) zu haben, wird die Menge an Säure, die für die automatisierte Messung an einer ESI PrepFast benötigt wird, berechnet und die Proben entsprechend verdünnt. • In order to always have the same absolute Ca amounts (50 g Ca ) for column chromatography, the amount of acid required for the automated measurement on an ESI PrepFast is calculated and the samples are diluted accordingly.
• Die Proben werden aus den Bechern in die PrepFAST® Röhrchen (Fa. Elemental Scientific) überführt. • The samples are transferred from the beakers into the PrepFAST® tubes (Elemental Scientific).
• Die Abtrennung der Erdalkalielemente erfolgt automatisch mittels des prepFAST® Gerätes (Fa. Elemental Scientific). • The alkaline earth elements are separated automatically using the prepFAST® device (Elemental Scientific).
Tag 5 Day 5
• Die nach Elementen getrennten Proben werden aus den Röhrchen wieder in die Becher überführt und zum Eintrocknen auf die Heizplatte gestellt. • The samples, separated according to elements, are transferred from the tubes back into the beakers and placed on the heating plate to dry.
• Nach Eintrocknung werden diese mit 1ml HNO3 und 0.5ml H2O2 erneut aufgenommen und für weitere 3 Stunden geschlossen gekocht. • After drying, they are taken up again with 1ml HNO 3 and 0.5ml H 2 O 2 and boiled closed for another 3 hours.
Tag 6 Day 6
• Die Becher mit den Proben werden geöffnet und eingetrocknet. • The beakers with the samples are opened and dried.
• Die Proben werden in10 ml HNO3 aufgenommen und 4 Stunden zur Equilibrierung stehen gelassen. • The samples are taken up in 10 ml HNO 3 and left to equilibrate for 4 hours.
• Die Proben werden in die Röhrchen für die massenspektrometrische Messung an der Neptune® (Plasmamassenspektrometer, Fa. ThermoFisher) überführt und dort gemessen. • The samples are transferred to the tubes for mass spectrometric measurement on the Neptune® (plasma mass spectrometer, ThermoFisher) and measured there.
Zur Bestimmung der Isotopenverhältnissen oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen können neben den massenspektrometrischen Verfahren auch spektroskopische Verfahren verwendet werden, welche mittels Lichtemission die Masseabhängigkeit der Hyperfeinstruktur der Spektrallinien nutzen. In addition to mass spectrometric methods, spectroscopic methods can also be used to determine the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes, which use the mass dependence of the hyperfine structure of the spectral lines by means of light emission.
Das Vorgehen bei der Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe der Laserinduzierten Fluoreszenz kann der Fachmann beispielsweise der US10302565B2 entnehmen. The procedure for determining the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes using laser-induced fluorescence can be found by a person skilled in the art, for example, in US10302565B2.
Alle Messwerte werden insbesondere relativ zum internationalen Standard SRM915a angegeben. Die Allgemeingültigkeit des Verfahrens nicht einschränkend wird im Folgenden die massenspektroskopische Ermittlung der Werte beschrieben. In particular, all measured values are given relative to the international standard SRM915a. Without limiting the generality of the method, the mass spectroscopic determination of the values is described below.
Massenspektrometrische Messung: Mass spectrometric measurement:
Diese Lösung wird in der Regel in einem Plasma-Massenspektrometer (MC-ICP-MS: Multi- Collector-Ionization Coupled - Mass-spectrometer) (z.B. ThermoFisher, Neptune) gemessen (Dieses Verfahren ist im Folgenden kurz beschrieben), können alternativ aber auch in einem Thermionenmassenspektrometer gemessen werden. Das Ziel ist es die Calciumisotopenzusammensetzung in Blutserum zu bestimmen. Im TIMS werden 44Ca/40Ca Verhältnisse und in dem MC-ICP-MS 44Ca/42Ca oder alternative Verhältnisse gemessen. Beide Isotopenverhältnisse sind in ihrer Aussage gleichwertig. Die Werte unterscheiden sich nur durch einen Faktor: 44Ca/40Ca = 2.05 · 44Ca/42Ca. This solution is usually measured in a plasma mass spectrometer (MC-ICP-MS: Multi-Collector-Ionization Coupled - Mass spectrometer) (e.g. ThermoFisher, Neptune) (This method is briefly described below), but can also be used as an alternative measured in a thermionic mass spectrometer. The aim is to determine the calcium isotope composition in blood serum. In the TIMS, 44 Ca/ 40 Ca ratios are measured and in the MC-ICP-MS, 44 Ca/ 42 Ca or alternative ratios are measured. Both isotope ratios are equivalent in their statement. The values differ by only one factor: 44 Ca/ 40 Ca = 2.05 · 44 Ca/ 42 Ca.
Bestimmung der Calciumisotopenzusammensetzung 44Ca/42Ca unter Verwendung eines Plasma-Masspektrometers: Determination of the calcium isotope composition 44 Ca/ 42 Ca using a plasma mass spectrometer:
Calciumisotopenmessungen werden an einem MC-ICPMS (Neptune®, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Der Massenspektrometer ist mit neun Faraday-Bechern ausgestattet, von denen acht beweglich sind. Diese werden so eingerichtet, dass die atomaren Massen (u) 42, 43, 43.5 und 44 simultan gemessen werden können. Um störende Ca- und Ar-Hydride (z. B. 40AriH2 auf 42Ca) zu unterdrücken, wird ein Probeneinführungssystem APEX IR (Elemental Scientific®) verwendet. Alle Messungen werden in mittlerer Auflösung (m/Am - 4000) auf dem störungsfreien Plateau der massearmen Seite des zentralen Mess-Peaks durchgeführt. Dies wird erreicht, indem eine geeignete mittlere Bechermasse von 4.687±0.001 u ausgewählt und täglich verifiziert wird.Calcium isotope measurements are performed on an MC-ICPMS (Neptune®, Thermo Fisher Scientific). The mass spectrometer is equipped with nine Faraday cups, eight of which are movable. These are set up so that the atomic masses (u) 42, 43, 43.5 and 44 can be measured simultaneously. To suppress interfering Ca and Ar hydrides (e.g. 40 AriH2 to 42 Ca), an APEX IR sample introduction system (Elemental Scientific®) is used. All measurements are carried out in medium resolution (m/Am - 4000) on the interference-free plateau of the low-mass side of the central measurement peak. This is achieved by selecting an appropriate mean cup mass of 4.687±0.001u and verifying it daily.
Die instrumentelle Fraktionierung („Mass-bias“) wird durch Anwendung des „Standard- Sample-Bracketing, (SSB)“ Verfahrens korrigiert. Die Messung einer Probe wird durch Messungen einer 5 pg/ml Ca Lösung, die aus einer 10000 pg/ml Ca-ICP-Standardlösung hergestellt wurde, korrigiert. Jede Probe wird mindestens vier Mal während einer Sitzung gemessen und deren Durchschnittswert für das weitere Vorgehen verwendet. Die Ca- Isotopenzusammensetzung wird als δ44/42Ca in Teilen pro Tausend (%o) angegeben: δ44/42Ca (%o) = [(44Ca/42Ca)Probe / (44Ca/42Ca)Referenz] - 1 The instrumental fractionation (“mass bias”) is corrected by using the “Standard Sample Bracketing (SSB)” procedure. The measurement of a sample is corrected by measurements of a 5 pg/ml Ca solution prepared from a 10000 pg/ml Ca-ICP standard solution. Each sample is measured at least four times during a session and their average value is used for further procedures. The Ca isotope composition is given as δ 44/42 Ca in parts per thousand (%o): δ 44/42 Ca (%o) = [( 44 Ca/ 42 Ca) sample / ( 44 Ca/ 42 Ca) reference ] - 1
Die gemessene Ca-ICP-Standardlösung dient als primäres Referenzmaterial. Die δ44/42CaICP- Werte werden dann unter Verwendung des gemessenen δ44/42CaICP-Wertes von NIST SRM 1486 in NIST SRM 915a umgewandelt: δ44/42CaSRM9i5a (Probe, %o) = δ44/42CaICP (Probe) - δ44/42CaICP (SRM 915a), d.h. alle Messwerte werden relativ zum internationalen Standard SRM915a angegeben. The measured Ca-ICP standard solution serves as the primary reference material. The δ 44/42 Ca ICP values are then converted from NIST SRM 1486 to NIST SRM 915a using the measured δ 44/42 Ca ICP value: δ 44/42 Ca SR M9i5a (sample, %o) = δ 44/42 Ca ICP (sample) - δ 44/42 Ca ICP (SRM 915a), i.e. all measured values are given relative to the international standard SRM915a.
Während jeder Sitzung wird zu Beginn und am Ende jeder Sitzung chemisch unverarbeitetes NIST SRM 915a Material gemessen und diese Ergebnisse mit denen von chemisch bearbeitetem NIST SRM 915a verglichen. Der durchschnittliche Unterschied zwischen prozessiertem und unverarbeitetem SRM 915a soll in der Regel weniger als 0.01 %o, so dass die Ca-Isotopenfraktionierung während der chemischen Reinigung vernachlässigbar angesehen werden kann. During each session, chemically unprocessed NIST SRM 915a material is measured at the beginning and end of each session and these results are compared to those of chemically processed NIST SRM 915a. The average difference between processed and unprocessed SRM 915a should generally be less than 0.01%, so that Ca isotope fractionation during chemical cleaning can be considered negligible.
Für die Hinterg rund korrektur wird der „On-Peak“-Ansatz verwendet. Die gemessenen Intensitäten einer 1% HNO3 -Lösung werden von den Intensitäten der nachfolgenden Probenmessungen subtrahiert. The “on-peak” approach is used for background correction. The measured intensities of a 1% HNO 3 solution are subtracted from the intensities of the subsequent sample measurements.
Zusätzlich werden die Messungen auf Reste von doppelt geladenem Strontium (84Sr, 86Sr und 88Sr) überprüft, um die korrekte Messung der Intensitäten der Massen von 42Ca, 43Ca und 44Ca sicherzustellen. Dazu wird zu Beginn jeder Sitzung die Intensitätsverhältnisse der Massen 42/43.5, 43/43.5 und 44/43.5 einer 2 pg/ml Sr - Lösung gemessen. Diese Verhältnisse werden dann verwendet, um die Intensitäten von doppelt geladenem Sr aus den gemessenen Intensitäten der Masse 43.5 einer gegebenen Probe zu berechnen. Additionally, the measurements are checked for residual doubly charged strontium ( 84 Sr, 86 Sr and 88 Sr) to ensure correct measurement of the intensities of the 42 Ca, 43 Ca and 44 Ca masses. For this purpose, the intensity ratios of the masses 42/43.5, 43/43.5 and 44/43.5 of a 2 pg/ml Sr solution are measured at the beginning of each session. These ratios are then used to calculate the intensities of doubly charged Sr from the measured intensities of mass 43.5 of a given sample.
Zur Qualitätssicherung werden die während der Messphase gemessenen δ44/42Ca- Werte von NIST SRM 1486 und IAPSO Meerwasserstandard mit publizierten Werten verglichen. Die Langzeit-Reproduzierbarkeit (2 SD = Standardabweichung) über einen Zeitraum von etwa zwei Monaten ist in der Regel besser als ±0.06 %o für alle analysierten Referenzmaterialien.For quality assurance, the δ 44/42 Ca values of NIST SRM 1486 and IAPSO seawater standard measured during the measurement phase are compared with published values. The long-term reproducibility (2 SD = standard deviation) over a period of approximately two months is generally better than ±0.06%o for all reference materials analyzed.
Zur weiteren Qualitätssicherung werden mehrere Kriterien angewendet, um Daten einer einzelnen Messung, einer einzelnen Probe und ganzer Sequenzen abzulehnen. Eine einzelne Messung oder Sequenz wird verworfen, wenn: For further quality assurance, multiple criteria are applied to reject data from a single measurement, a single sample, and entire sequences. A single measurement or sequence is discarded if:
• |δ44/42Ca - 2 δ43/42Ca|>0.2 %o gilt. • |δ 44/42 Ca - 2 δ 43/42 Ca|>0.2 %o applies.
• Eine Probenmessung wird verworfen, wenn die durchschnittliche Intensität außerhalb eines Intensitätsfensters von 70 bis 130 % liegt, verglichen mit der durchschnittlichen Intensität der 5pg/ml Ca ICP -Lösung oder NIST SRM 915a-Lösung derselben Charge. • A sample measurement is rejected if the average intensity is outside of an intensity window of 70 to 130% compared to the average intensity of the 5pg/mL Ca ICP solution or NIST SRM 915a solution of the same lot.
• Eine vollständige Sequenz wird abgelehnt, wenn mehr als eines der gemessenen internationalen Referenzmaterialien mehr als 0.2 %o vom Literaturwert entfernt ist oder die Daten nicht entlang der massenabhängigen Fraktionierungslinie fielen. • A complete sequence will be rejected if more than one of the measured international reference materials is more than 0.2%o away from the literature value or the data did not fall along the mass-dependent fractionation line.
Auswertung der Calcium-Isotopendaten: Evaluation of the calcium isotope data:
Die gemessenen Calcium Isotopenwerte werden in der üblichen ö-Notation berichtet:
Figure imgf000014_0001
wobei (44Ca/42Ca)Probe das im Massenspektrometer gemessene Verhältnis der Blutprobe ist und (44Ca/42Ca)Standard das Calcium Isotopenverhältnis eines international bekannten und zertifizierten Verhältnisses ist. Diese Vorgehensweise erlaubt eine internationale Vergleichbarkeit der gemessenen Isotopenverhältnisse. The measured calcium isotope values are reported in the usual ö notation:
Figure imgf000014_0001
where ( 44 Ca/ 42 Ca) sample is the ratio of the blood sample measured in the mass spectrometer and ( 44 Ca/ 42 Ca) standard is the calcium isotope ratio of an internationally known and certified ratio. This procedure allows international comparability of the measured isotope ratios.
Verzeichnis der Abbildungen: List of illustrations:
Abbildung 1 : δ44/42 CaSerum-Werte von Prostata-Krebspositiv getesteten Patienten Figure 1: δ44/42 Ca serum values of patients who tested positive for prostate cancer

Claims

Patentansprüche Patent claims
1. 1.
Verfahren zur frühzeitigen Diagnose der Pathologie einer möglichen Erkrankung bei Patienten mit Verdacht auf Prostatakrebs, umfassend die folgenden Schritte: i. Bestimmen von Isotopenverhältnissen oder Mengenverhältnissen von Calciumisotopen in einer Probe von Blut des Patienten mit Verdacht auf Prostata krebs. ii. Vergleich des in Schritt i ermittelten Wertes mit dem durch einen Schwellenwert definiertem Intervall A method for early diagnosis of the pathology of a possible disease in patients suspected of having prostate cancer, comprising the following steps: i. Determination of isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes in a sample of blood from the patient with suspected prostate cancer. ii. Comparison of the value determined in step i with the interval defined by a threshold value
-0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o iii. Zuordnung anhand des Vergleichs aus Schritt ii zu einem von drei definierten Situationen MO, M1 und M2 wobei -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o iii. Assignment based on the comparison from step ii to one of three defined situations MO, M1 and M2 where
MO: -0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o MO: -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o
M1 : δ44/42 CaSerum-Wert < -0,91%o M1: δ 44/42 Ca serum value < -0.91%o
M2: δ44/42 CaSerum-Wert > -0,79%o darstellt. M2: δ 44/42 Ca serum value > -0.79%o.
2. 2.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe der Massenspektrometrie erfolgt. Method according to claim 1, characterized in that the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using mass spectrometry.
3. 3.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe der Laserinduzierten Fluoreszenz erfolgt. Method according to claim 1, characterized in that the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using laser-induced fluorescence.
4. 4.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen mit Hilfe von spektroskopischen Verfahren, welche mittels Lichtemission die Masseabhängigkeit der Hyperfeinstruktur der Spektrallinien nutzen, erfolgt. Method according to claim 1, characterized in that the isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes are determined using spectroscopic methods which use the mass dependence of the hyperfine structure of the spectral lines by means of light emission.
5. 5.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt i zusätzlich folgende Schritte ausgeführt werden: eine Anamnese und/oder ein Test mit proteinbasiertem Marker. Method according to claim 1, characterized in that the following steps are additionally carried out before step i: an anamnesis and/or a test with a protein-based marker.
6. 6.
Vorrichtung zur frühzeitigen Diagnose der Pathologie einer möglichen Prostatakrebserkrankung umfassend a) Mittel zur Bestimmung von Isotopenverhältnissen oder Mengenverhältnisse von Calciumisotopen in einer Blutprobe eines Patienten, b) ein Speichermedium zum Speichern des ermittelten Wertes der Isotopenverhältnisse oder Mengenverhältnisse, c) Mittel zum Vergleich des gespeicherten Wertes mit einem als Schwellenwert definierten Intervall -0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o, welches im Speichermedium hinterlegt ist, d) Auswerteeinheit zur Zuordnung des Vergleichs zu einem von drei zuvor definierten und im Speichermedium hiintergelgten Situationen MO, M1 und M2, wobeiDevice for the early diagnosis of the pathology of a possible prostate cancer disease, comprising a) means for determining isotope ratios or quantitative ratios of calcium isotopes in a blood sample of a patient, b) a storage medium for storing the determined value of the isotope ratios or quantitative ratios, c) means for comparing the stored value with an interval -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o defined as a threshold value, which is stored in the storage medium, d) evaluation unit for assigning the comparison to one of three previously defined and in the storage medium background situations MO, M1 and M2, where
MO: -0,91%o < δ44/42 CaSerum-Wert < -0,79 %o MO: -0.91%o < δ 44/42 Ca serum value < -0.79%o
M1: δ44/42 CaSerum-Wert < -0,91%o M1: δ 44/42 Ca serum value < -0.91%o
M2: δ44/42 CaSerum-Wert > -0,79%o darstellt, und e) Ausgabeeinheit zur Ausgabe der bei der Auswertung ermittelten Situation MO, M 1 oder M2. M2: δ 44/42 Ca serum value > -0.79%o, and e) output unit for outputting the situation MO, M 1 or M2 determined during the evaluation.
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ANONYMOUS: "Direct measurement of calcium metabolism in patients with castration-resistant prostate cancer using a novel isotope tracing approach in urine. | Journal of Clinical Oncology", 20 May 2011 (2011-05-20), pages 1 - 3, XP093090986, Retrieved from the Internet <URL:https://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/jco.2011.29.15_suppl.e15083> [retrieved on 20231012] *

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