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WO2023214578A1 - ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよびその構築 - Google Patents

ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよびその構築 Download PDF

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Publication number
WO2023214578A1
WO2023214578A1 PCT/JP2023/017130 JP2023017130W WO2023214578A1 WO 2023214578 A1 WO2023214578 A1 WO 2023214578A1 JP 2023017130 W JP2023017130 W JP 2023017130W WO 2023214578 A1 WO2023214578 A1 WO 2023214578A1
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WO
WIPO (PCT)
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virus
nucleic acid
nucleic acids
derived
plasmid
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/017130
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English (en)
French (fr)
Inventor
俊介 齋藤
謙爾 柘植
勇哉 西村
Original Assignee
株式会社シンプロジェン
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Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社シンプロジェン filed Critical 株式会社シンプロジェン
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    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries

Definitions

  • the present disclosure provides methods for efficiently producing virus-derived construct plasmids.
  • the present disclosure also provides virus-derived construct plasmid libraries.
  • Patent Document 1 Various virus-derived constructs such as adenovirus vectors (Patent Document 1) have been developed for gene therapy, vaccine therapy, etc.
  • virus-derived constructs For the preparation of virus-derived constructs, it is usually necessary to introduce the virus-derived construct plasmid into producer cells. Therefore, it is necessary to synthesize and construct a virus-derived construct plasmid.
  • Virus-derived construct plasmids are usually individually designed and produced, and improving plasmid performance, such as yield of virus-derived constructs, often involves significant effort.
  • the present inventors have discovered a method for efficiently producing various virus-derived construct plasmids. Based on this knowledge, the present disclosure provides methods for generating various virus-derived construct plasmids from a starting plasmid. Furthermore, the present inventors also provide libraries of virus-derived construct plasmids produced by such methods.
  • a method for producing a virus-derived construct plasmid comprising: providing a set of starting plasmids comprising at least a portion of the nucleic acid sequences necessary to construct a virus-derived construct, said set of starting plasmids comprising a corresponding set of alternative unit nucleic acids; the set of surrogate unit nucleic acids comprising at least one set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences; treating the set of starting plasmids with restriction enzymes to prepare a mixed solution containing cleavage substitute unit nucleic acid fragments; ligating the cleavage substitute unit nucleic acid fragments to form an integrated nucleic acid; contacting the accumulated nucleic acid with a transformed organism to form a virus-derived construct plasmid; method including.
  • (Item 2) The method of any of the above items for producing a collection of virus-derived construct plasmids.
  • (Item 3) The method of any of the preceding items, wherein at least one of the set of initiation plasmids comprises a transcription initiation sequence that is operative in animal cells, producing a virus-derived construct plasmid containing said transcription initiation sequence that is operative in animal cells.
  • (Item 4) The method of any of the above items, wherein the set of starting plasmids includes three or more types of starting plasmids.
  • (Item 5) The method of any of the preceding items, wherein the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises at least two sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences.
  • (Item 6) The method according to any of the above items, further comprising the step of selecting a virus-derived construct plasmid excellent in a desired function from a collection of virus-derived construct plasmids formed.
  • the desired function is the production amount of a virus-derived construct.
  • (Item 8) The method according to any of the above items, wherein the desired function is the amount of impurities mixed into the target virus-derived constituent composition.
  • each of said set of starting plasmids contains the necessary nucleic acid sequences to construct a virus-derived construct.
  • at least a portion of the starting plasmid is a plasmid produced by the method of item 1.
  • said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises at least two sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising nucleic acid sequences encoding at least a portion of different subtypes of the same gene.
  • each of said set of starting plasmids comprises three or more surrogate unit nucleic acids comprising at least a portion of the nucleic acid sequences necessary to construct said virus-derived construct.
  • each of said set of starting plasmids comprises three or more surrogate unit nucleic acids comprising at least a portion of the nucleic acid sequences necessary to construct said virus-derived construct.
  • the method according to any of the above items comprising adding a barcode nucleic acid in the step of ligating to form an integrated nucleic acid.
  • each of said set of starting plasmids contains the necessary nucleic acid sequences to construct said virus-derived construct of about 10 kb or more.
  • the nucleic acid sequence necessary for constructing the virus-derived construct is (A) a nucleic acid sequence containing a terminal repeat sequence; (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor; (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein; (D) a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor. (Item 19) The method of any of the preceding items, wherein the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids encoding promoters of different types or orientations.
  • the set of corresponding alternative unit nucleic acids is (A) a nucleic acid sequence containing a terminal repeat sequence; (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor; (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein; (D) a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor; (E) a nucleic acid sequence encoding a promoter; (F) a nucleic acid sequence encoding a desired gene; (G) at least two sets of corresponding alternative unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences selected from nucleic acid sequences involved in host cell biosynthesis.
  • the nucleic acid sequences involved in the biosynthesis of the host cell include SV40 Large T antigen (SV40LTA), TAX, Kras, Myc, MIR17HG, BCL-2, BCL-XL, PDIA2, XBP1, HSPA5, PC (pyruvate carboxylase), PDK. , HIF1A, NRF2, and CPSF6.
  • SV40LTA Large T antigen
  • TAX TAX
  • Kras TAX
  • Myc MIR17HG
  • BCL-2 BCL-XL
  • PDIA2 XBP1
  • HSPA5 pyruvate carboxylase
  • PDK. pyruvate carboxylase
  • HIF1A HIF1A
  • NRF2 CPSF6
  • said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence encoding a desired gene, and a set of corresponding surrogate unit nucleic acids adjacent upstream thereof comprising a different nucleic acid sequence encoding a promoter; Any of the above items, including sets.
  • said starting plasmid comprises a nucleic acid sequence comprising two terminal repeat sequences, and said surrogate unit nucleic acid encoding said desired gene is present between said two terminal repeat comprising nucleic acid sequences.
  • virus-derived construct is selected from viral vectors, virus-like particles (VLPs), oncolytic viruses and viral replicons.
  • the virus-derived constituents include alphavirus, vaccinia virus, measles virus, influenza virus, vesicular stomatitis virus, coronavirus, Sindbis virus, Semliki Forest virus, herpes simplex virus, retrovirus, lentivirus, rabies virus, and Sendai virus. , adeno-associated virus, adenovirus, reovirus, Coxsackie virus, and Newcastle disease virus.
  • the virus-derived composition is a virus-derived composition of a virus selected from the group consisting of adeno-associated virus, adenovirus, retrovirus, lentivirus, herpes simplex virus, and Sendai virus. .
  • the virus-derived construct is a virus-derived construct of a virus selected from the group consisting of an adeno-associated virus or a lentivirus.
  • the virus-derived construct is a viral vector of adeno-associated virus.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different inverted terminal repeats (ITRs) from any of adeno-associated virus serotypes 1 to 12 and variants thereof; Any of the above methods.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • the starting plasmid contains a promoter, a desired gene, and a terminator from upstream between the 5'ITR and 3'ITR.
  • said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding functional cofactors derived from at least one of adenovirus, herpesvirus, papillomavirus, bocavirus and simian virus. Any of the above items, including sets.
  • Said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding functional cofactors derived from any of adenovirus serotypes 1 to 52 and variants thereof. Item either way.
  • the functional cofactors include adenovirus E1A, E1B, E2A, E4, and VA, herpesvirus UL5, UL8, UL30, UL42, UL52, ICP0, ICP4, ICP8, and ICP22, papillomavirus E1, E2, and The method of any of the preceding items, comprising at least one of E6, Bocavirus NP1, NS2, NS4, and BocaSR, and Simian Virus Large T antigen.
  • said set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence encoding said functional cofactor, and corresponding alternative unit nucleic acids adjacent upstream thereof comprising a different nucleic acid sequence encoding a promoter; Any method of the above items, including a set of.
  • the starting plasmid comprises E2A, E4, and VA.
  • said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding rep.
  • the method of any of the preceding items, wherein the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding caps.
  • the cap includes at least one of VP1, VP2, VP3, AAP and MAAP.
  • the set of corresponding alternative unit nucleic acids comprises a set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence encoding the cap, and a set of corresponding alternative unit nucleic acids adjacent upstream thereof comprising a different nucleic acid sequence encoding a promoter.
  • any of the above items including: (Item 46) Item 43, wherein the set of corresponding surrogate unit nucleic acids encoding cap comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence from any of adeno-associated virus serotypes 1 to 12 and variants thereof. Method described. (Item 47) The method of any of the above items, wherein the starting plasmid contains a 5'ITR, promoter, desired gene, 3'ITR, rep, cap and functional cofactors.
  • the starting plasmid contains 5'ITR, 3'ITR, rep and cap, one of the rep and cap is located downstream of the region flanked by the 5'ITR and 3'ITR, and the other is located downstream of the region flanked by the 5'ITR and 3'ITR.
  • Said starting plasmid comprises two ITRs and other parts of the nucleic acid sequence necessary to construct said virus-derived construct, said other parts being outside the region flanked by said two ITRs. Item either way.
  • the starting plasmid comprises a 5'ITR, a promoter, a desired gene, a 3'ITR, a rep, a cap and a functional cofactor in that order.
  • the starting plasmid comprises a first promoter, a first rep, a second promoter, a second rep, a third promoter and a cap in this order.
  • the virus-derived construct is a lentivirus viral vector.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different long terminal repeats (LTRs) or variants thereof derived from lentiviruses.
  • LTRs long terminal repeats
  • the starting plasmid contains a promoter, a desired gene, and a terminator from upstream between the 5'LTR and 3'LTR.
  • the starting plasmid contains two or more sets of the promoter, desired gene, and terminator.
  • said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding structural proteins selected from gag, pol, VSV-G and env. .
  • said set of corresponding alternative unit nucleic acids comprises a set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence encoding said structural protein and a set of corresponding alternative unit nucleic acids adjacent upstream thereof comprising a different nucleic acid sequence encoding a promoter; Any of the above items, including sets.
  • the virus-derived construct is an adenovirus viral vector.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different inverted terminal repeats (ITRs) derived from an adenovirus.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding structural proteins selected from L1, L2, L3, L4 and L5. .
  • said set of corresponding alternative unit nucleic acids comprises a set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence encoding said structural protein and a set of corresponding alternative unit nucleic acids adjacent upstream thereof comprising a different nucleic acid sequence encoding a promoter; Any of the above items, including sets. (Item 66) of the above items, wherein the set of corresponding surrogate unit nucleic acids encoding structural proteins comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences derived from any of adenovirus serotypes 1 to 52 and variants thereof. Either way.
  • any of the above items, wherein said set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding functional cofactors selected from E1A, E1B, E2A, E2B and E4.
  • Method. said set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence encoding said functional cofactor, and corresponding alternative unit nucleic acids adjacent upstream thereof comprising a different nucleic acid sequence encoding a promoter; Any method of the above items, including a set of.
  • the item above, wherein the set of corresponding surrogate unit nucleic acids encoding functional cofactors comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence derived from any of adenovirus serotypes 1 to 52 and variants thereof. Either way.
  • a virus-derived construct plasmid library comprising a virus-derived construct plasmid containing three or more alternative unit nucleic acids as a series of parallel alternative unit nucleic acids, said virus-derived construct plasmid library comprising different nucleic acid sequences. comprising a plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences, wherein the parallel surrogate unit nucleic acids on each virus-derived construct plasmid of said plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences are about 10 kb or more; Virus-derived construct plasmid library with length.
  • a virus-derived construct plasmid library comprising a plurality of virus-derived construct plasmids, wherein a different portion in combination in the plurality of virus-derived construct plasmids includes a nucleic acid sequence that is a promoter or a functional cofactor. product plasmid library.
  • Elements constituting different parts in combinations of a plurality of virus-derived construct plasmids in the virus-derived construct plasmid library contain promoters, and the promoters in the plurality of virus-derived construct plasmids are naturally associated with different genes.
  • said plurality of sets of corresponding alternative unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences, (A) a nucleic acid sequence containing a terminal repeat sequence; (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor; (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein; (D) A virus-derived construct plasmid library according to any of the above items, comprising a set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising at least one different nucleic acid sequence from the nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • Each virus-derived construct plasmid is (A) a nucleic acid sequence containing a terminal repeat sequence; (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor; (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein; (D) A virus-derived construct plasmid library according to any of the above items, comprising a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor. (Item 77) The virus-derived construct plasmid library of any of the above items, wherein said plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences comprise surrogate unit nucleic acids having a GC content of 75% or more.
  • the plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences include a plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids allowing for 64 or more different parallel surrogate unit nucleic acid combinations, and each virus-derived construct A virus-derived construct plasmid library of any of the above items, wherein the plasmids contain the same number of parallel alternative unit nucleic acids.
  • a method of producing a virus-derived construct comprising: (Item 82) producing a collection of virus-derived construct plasmids by any of the methods listed above; introducing the collection of virus-derived construct plasmids into producer cells to form virus-derived constructs to construct a virus-derived construct library;
  • a method of producing a virus-derived construct library comprising: (Item 83) The method of any of the above items, wherein the step of introducing the virus-derived construct plasmid into a producer cell comprises introducing a single virus-derived construct plasmid into the producer cell.
  • (Item 84) The method according to any of the above items, wherein at least a portion of the nucleic acid contained in the virus-derived construct plasmid is integrated into the chromosome of the producer cell.
  • (Item 85) Producer cells produced by any of the methods listed above.
  • (Item 86) A virus-derived construct produced by any of the methods listed above.
  • (Item 87) A composition containing a virus-derived constituent produced by any of the methods described above.
  • the structure of the seed plasmid used in the examples is shown schematically.
  • the structures of the five types of seed plasmids that were initially produced are shown schematically.
  • the structure of eight seed plasmids with additional seed plasmids is shown schematically.
  • the genome copy number of rAAV produced from each plasmid of Control, #20, #24, and #46 is shown.
  • the vertical axis shows the number of genome copies per mL.
  • the results of measurement of purified rAAV produced from plasmid #46 by mass photometry are shown.
  • the horizontal axis shows the measured mass (kDa) and the vertical axis shows the counts detected in the corresponding mass.
  • An example of a plasmid structure envisioned for the construction of a virus-derived construct plasmid is shown.
  • An example of a plasmid structure envisioned for the construction of a virus-derived construct plasmid is shown.
  • An example of a plasmid structure envisioned for the construction of a virus-derived construct plasmid is shown.
  • An example of a plasmid structure envisioned for the construction of a virus-derived construct plasmid is shown.
  • An example of a plasmid structure envisioned for the construction of a virus-derived construct plasmid is shown.
  • the structure of the seed plasmid constructed in Example 4 to create a combinatorial library is shown schematically.
  • Example 4 shows the AAV particle production ability of the viral vector plasmid clone obtained in Example 4.
  • the horizontal axis shows the clone number, and the vertical axis shows the amount of AAV particles produced (genome copy number).
  • the structure of the seed plasmid constructed in Example 5 to create a combinatorial library is shown schematically.
  • 2 shows the AAV particle production ability of the viral vector plasmid clone obtained in Example 5.
  • the horizontal axis shows the clone number, and the vertical axis shows the amount of AAV particles produced (genome copy number).
  • plasmid refers to a circular DNA that exists separately from a chromosome in a cell or exists separately from a chromosome when introduced into a cell. Because the methods of the present disclosure may use plasmids as starting materials to produce plasmids, the plasmids used as starting materials in the methods may be referred to as "starting plasmids" and the produced plasmids may be referred to as “product plasmids.” The totality of starting plasmids present in or to form one reaction solution may be referred to herein as a "set of starting plasmids.”
  • the OGAB (Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis) method used in the method of the present disclosure is a method in which a circular plasmid is generated in a transformed organism by incorporating the accumulated nucleic acid into this organism (details can be found in the present specification). (described elsewhere). Any organism capable of taking up non-circular long nucleic acids and producing plasmids can be used in the OGAB method, and such organisms are referred to herein as "transformed organisms.”
  • a nucleic acid to be introduced into a transformed organism is referred to herein as an "accumulated nucleic acid," and typically an accumulated nucleic acid has a tandem repeat structure in which nucleic acid units having the same sequence appear repeatedly in the same direction.
  • unit nucleic acid refers to a nucleic acid fragment having a partial sequence constituting the sequence of an integrated nucleic acid or a portion that produces such a nucleic acid fragment, typically an overhanging sequence generated by restriction enzyme treatment. Refers to a nucleic acid fragment having at both ends or a nucleic acid region sandwiched between two protruding sequences generated by restriction enzyme treatment.
  • the term "corresponding" between a plurality of unit nucleic acids refers to a relationship in which these unit nucleic acids, which are nucleic acid fragments, have the same protruding sequence, or a plurality of nucleic acid molecules each containing these unit nucleic acids (typically, This refers to a relationship in which the same overhanging sequence is produced when a plasmid (plasmid) is treated with a specific restriction enzyme.
  • unit nucleic acids that correspond to each other are referred to as "alternative unit nucleic acids", and when fragmented alternative unit nucleic acids are assembled to produce an integrated nucleic acid and a plasmid is formed by the OGAB method, the alternative unit nucleic acids are , may be integrated at the same location on the plasmid (eg, unit nucleic acids at the same rank counting from the start of transcription).
  • the base sequences other than the protruding sequence of the plurality of alternative unit nucleic acids may be the same or different.
  • the totality of surrogate unit nucleic acids present in one reaction solution, or present in a set of starting plasmids to form one reaction solution, may be referred to herein as a "set of surrogate unit nucleic acids.” It is used with a set of alternative unit nucleic acids at position A, etc.
  • the term "parallel” refers to a relationship in which the unit nucleic acids, which are nucleic acid fragments, have different protruding sequences, or a relationship in which the unit nucleic acids (typically, plasmids) containing these unit nucleic acids are used. Refers to a relationship that produces different overhanging sequences when treated with a specific restriction enzyme. Typically, parallel unit nucleic acids are present on the same plasmid.
  • two unit nucleic acids being "adjacent" refers to a relationship in which these unit nucleic acids have complementary protruding sequences, or a relationship in which a nucleic acid molecule (typically a plasmid) containing these unit nucleic acids is Refers to a relationship that produces complementary overhanging sequences when treated with a restriction enzyme, and typically refers to a relationship located on both sides of the cut point of restriction enzyme treatment.
  • the collection of parallel unit nucleic acids present on a plasmid or produced when a plasmid is treated with a restriction enzyme may be referred to herein as a "series of parallel unit nucleic acids.” A series of parallel unit nucleic acids on a starting plasmid 1, etc. are used.
  • nucleic acid that can be defined by a terminal or overhanging sequence of a nucleic acid molecule refers to the form of a nucleic acid fragment having a terminal or overhanging portion of the sequence and potentially this terminal, unless otherwise specified. It can refer to any partial region in a nucleic acid molecule that can form a portion or an overhang. When a "nucleic acid fragment" is described, it actually has a terminal or overhanging portion of the sequence.
  • Bacillus subtilis is an aerobic Gram-positive catalase-positive bacterium that is ubiquitous in soil and plants, and is present in the gastrointestinal tract of ruminants and humans.
  • Bacillus amyloliquefaciens which has a size of .8 x 2 to 3 ⁇ m, is mesophilic, has an optimal growth temperature of 25 to 40 degrees Celsius, and forms spores, and its scientific name is Bacillus subtilis or a closely related Bacillus genus bacterium. Refers to any non-pathogenic bacteria with natural transformation ability, including Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, etc.
  • the Bacillus subtilis is the Marburg strain 168, which is a strain with high natural transformation potential among Bacillus subtilis, or its derivative strain RM125.
  • Strain 168 is the most genetically studied Gram-positive bacterium, and along with strain RM125, it is available from ATCC (American Type Culture Collection), etc., and it is harmless to humans and animals, and the OGAB method can be applied to it. Since this is known, it can be suitably used in the present disclosure.
  • library refers to a collection of homogeneous materials (plasmids, viral vectors, etc.) with similar structures. Similar structures include having similar base sequence lengths (for example, within 10% difference in base length), having the same number of unit nucleic acids in a series of parallel unit nucleic acids, and functions of parts with different structures. are the same (for example, different serotypes of the same gene, promoters that function in the same host cell), etc.
  • packing cell refers to a cell for producing a virus-derived construct plasmid.
  • virus-derived construct plasmid refers to a plasmid for producing a virus-derived construct in a producer cell, which contains a gene to be carried in the virus-derived construct.
  • the virus-derived construct plasmid contains the sequence of the gene (desired gene) to be expressed in the target cell of the virus-derived construct between two terminal repeat sequences, and also contains a promoter and other elements (e.g. enhancer, terminator, etc.).
  • producer cell refers to a cell capable of producing a desired virus-derived construct, in which the genes necessary for the production of the virus-derived construct are expressed from the chromosome and the introduced plasmid. It can be a cell.
  • a desired virus-derived construct can be produced by introducing the virus-derived construct plasmid of the present disclosure into producer cells.
  • AAV adeno-associated virus
  • E1A and E1B are required for its production, but since HEK293 has these, they can be removed from the helper plasmid.
  • Other cells can also function as producer cells if they are modified to have such functional cofactors.
  • animal cells refer to cells obtained from animals (humans, mice, rats, monkeys, dogs, etc.) or cells obtained by modifying cells obtained from animals.
  • virus-derived construct refers to a nucleic acid construct that at least partially has a structure derived from a virus, or a construct containing a protein produced therefrom.
  • Virus-derived constructs include viral vectors, virus-like particles (VLPs), oncolytic viruses (including those that have been modified to grow only in cancer cells), and viral replicons (including those that have been modified to proliferate only in cancer cells) (viral genomes capable of self-replication).
  • viral vector refers to a construct that has at least a portion of a structure derived from a virus and is capable of introducing nucleic acids into target cells.
  • viral vectors are in the form of viral particles that contain viral structural proteins and nucleic acids that include heterologous genes.
  • nucleic acid sequence necessary to construct a virus-derived construct refers to a nucleic acid sequence (e.g., a combination of nucleic acid sequences) that allows a producer cell containing the same to produce a virus-derived construct.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the virus-derived construct include a nucleic acid sequence encoding a structural protein of the virus, a nucleic acid sequence encoding a packaging factor, and two terminal repeat sequences of the virus; and a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • a "nucleic acid sequence encoding a functional cofactor” includes, for example, a nucleic acid sequence encoding a structural protein of a virus, a nucleic acid sequence encoding a packaging factor, and any virus-derived construct other than the two terminal repeat sequences of a virus. It may contain or consist essentially of the nucleic acid sequences necessary for its construction. The nucleic acid sequences of each of these may vary from virus-derived construct to virus-derived construct. These details are described elsewhere in this specification. In a preferred embodiment, the nucleic acid sequences necessary to construct the virus-derived construct may utilize advantageous sequences common to AAV and adenovirus, more preferably sequences advantageous to AAV.
  • sequences common to such AAVs and adenoviruses include the desired gene between the inverted terminal repeats (ITRs) and functional cofactors, rep, cap, or L1, L2, L3, L4, L5.
  • Sequences that are advantageous for AAV include the desired gene between the ITRs and may include functional cofactors, rep, and cap. It has the characteristic that the functional cofactors, rep, and cap can be placed outside the two ITRs.
  • such examples include, but are not limited to, the sequences of certain functional cofactors E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4.
  • packaging factor includes proteins that encapsulate the viral genome in structural proteins, and examples include rep and ⁇ .
  • packaging factors include adenovirus serotypes 1-52 or adeno-associated virus serotypes 1-12, or variants thereof (rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80, etc.) can be used.
  • This protein may be a natural protein or may be one in which mutations have been introduced artificially. Those into which "artificial mutations" have been introduced can be produced, for example, by introducing appropriate mutations into the sequences of natural products described in known literature.
  • structural protein refers to a protein produced from genes carried by a virus, at least a portion of which is present on the surface (e.g., traverses the envelope) of the virus or virus-derived construct. . Structural proteins may be responsible for infectivity of cells.
  • capsid refers to a protein produced from a gene carried by a virus that is present on the surface (optionally enclosed in an envelope) of a virus or a virus-derived construct, and refers to ” is also called.
  • tandem repeat nucleic acid sequence
  • Any repeat sequence used in the art can be used in this disclosure. Typically, promoter sequences occur repeatedly.
  • terminal repeat sequence is a general term for nucleic acid sequences of biological genomes in which the same sequence is repeated (especially several times or more) and is present at the ends.
  • terminal repeats include, but are not limited to, inverted terminal repeats (ITR) and long terminal repeats (LTR).
  • the terminal repeat sequences are adenovirus serotypes 1 to 52, adeno-associated virus serotypes 1 to 12, or variants thereof (rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2 - QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80, etc.) can be used.
  • the terminal repeat sequence may be a natural one or one in which mutations have been introduced artificially. Those into which "artificial mutations" have been introduced can be produced, for example, by introducing appropriate mutations into the sequences of natural products described in known literature.
  • the term "functional cofactor” refers to a gene that supports the amplification of a virus that cannot grow on its own.
  • functional cofactors include, for example, nucleic acid sequences encoding packaging factors of the virus, as well as constructs derived from any virus other than the two terminal repeat sequences of the virus, for constructing, propagating, improving activity, and reducing toxicity. These include, but are not limited to, the nucleic acid sequences necessary to do so.
  • Functional cofactors that can be used include, but are not limited to, for example, E1A, E1B, E2A, E2B, E4, RPE, WRPE, PPT, oPRE, enhancer, insulator, silencer sequences, and the like.
  • loaded nucleic acid refers to a nucleic acid carried by a virus-derived construct (such as a viral vector). Whether or not it is a loaded nucleic acid can be confirmed by treating a virus-derived construct preparation with DNase to degrade nucleic acids outside the virus particle, inactivating DNase, and then checking the nucleic acid extracted from the virus particle. can. Whether or not it is a loaded nucleic acid can also be confirmed by examining the sequence (preferably full length or near full length) of the obtained nucleic acid product.
  • host cell refers to a cell (including the progeny of such a cell) into which an exogenous nucleic acid or protein or virus or virus-derived construct has been introduced.
  • Protein Polypeptide and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. Amino acids may be natural or non-natural, or may be modified amino acids. The term also encompasses natural or artificially modified polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling moiety).
  • Polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. Examples of nucleic acids include DNA, RNA, cDNA, mRNA, rRNA, tRNA, microRNA (miRNA), and lncRNA. The term also includes “polynucleotide derivatives.” “Polynucleotide derivative” refers to a polynucleotide that includes a nucleotide derivative or has an unusual internucleotide linkage.
  • Nucleotide derivative refers to a nucleotide having a structure different from the normal nucleotides used in natural DNA or RNA, such as locked nucleic acid (LNA), 2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid (2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid, ENA), other bridged nucleic acid (BNA), hexitol nucleic acid (HNA), amide bridged nucleic acid (Amido -bridged nucleic acid, AmNA), morpholino nucleic acids, tricyclo-DNA (tcDNA), polyether nucleic acids (see, for example, US Pat. No.
  • internucleotide bonds that are different from normal ones include, for example, oligonucleotide bonds in which a phosphodiester bond is converted to a phosphorothioate bond, and oligonucleotides in which a phosphodiester bond is converted to an N3'-P5' phosphoroamidate bond. Examples include inter-oligonucleotide bonds in which ribose and phosphodiester bonds are converted into peptide-nucleic acid bonds.
  • nucleic acid sequence may also include conservatively modified variants (e.g., degenerate codon substitutions) and complementary sequences thereof, as well as the explicitly indicated sequence. It is intended to include. Specifically, degenerate codon substitutions create sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and/or deoxyinosine residue.
  • variants based on specific wild-type sequences include known variants (e.g., rh10, DJ, DJ/8, PHP .eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80, etc.), as well as at least 70% of the original sequence. , at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or at least 99.5% sequence identity. It will be done.
  • the term "gene” refers to a nucleic acid portion that performs a certain biological function.
  • This biological function can include encoding a polypeptide or protein, encoding a protein-non-coding functional RNA (rRNA, tRNA, microRNA (miRNA), lncRNA, etc.), or encoding a polypeptide, protein or protein-coding function.
  • rRNA protein-non-coding functional RNA
  • miRNA microRNA
  • lncRNA lncRNA
  • a gene herein includes transcriptional and translational control elements such as promoters, terminators, enhancers, insulators, silencers, origins of replication, and internal ribosome entry sites. sequence, and the nucleic acid portions required for packaging into virus particles.
  • gene product may refer to a polypeptide, protein, or non-protein-encoding functional RNA encoded by a gene.
  • two genes being in cis refers to the presence of those genes on the same nucleic acid molecule or on a complementary strand (in the case of a double-stranded nucleic acid) nucleic acid molecule.
  • two genes being in trans means that in a certain cell (in a certain organism) these genes are located on the same nucleic acid molecule or on a complementary strand (in the case of a double-stranded nucleic acid) nucleic acid molecule.
  • a gene present on the genome and a gene on a nucleic acid introduced with a virus-derived construct can be in trans.
  • whether two genes are in trans can be determined based on the state at which the two genes are simultaneously present in the cell (eg, upon introduction of the nucleic acid into the cell).
  • one gene refers to a gene that has a continuous sequence in a form that normally (highest frequency or probability of 50% or more) exists on the genome of a certain organism.
  • two exons encoding a protein can be two genes.
  • the nucleic acid portion containing the promoter sequence and the protein-encoding sequence can be one gene.
  • the nucleic acid sequence need not be a continuous sequence; for example, multiple exons encoding a protein are collectively referred to as the gene for that protein.
  • nucleic acid does not contain the gene or does not exhibit the normal function of the gene (e.g., the ability to produce a functional protein). This refers to containing modified genes.
  • operably linked refers to transcriptional and translational regulatory sequences (e.g., promoters, enhancers, etc.) or translational regulatory sequences that have expression (operation) of the desired sequence. It means to be placed at the bottom.
  • a promoter to be operably linked to a gene, it is typically placed immediately upstream of the gene, but does not necessarily need to be placed adjacent to it.
  • transcription and translation regulatory sequences collectively refer to promoter sequences, polyadenylation signals, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, origins of replication, enhancers, IRES, etc., which cooperate to Enables replication, transcription and translation of coding sequences in human cells. Not all of these transcriptional-translational control sequences necessarily need to be present, so long as replication, transcription, and translation of the selected coding sequence is possible in the appropriate host cell. Those skilled in the art can readily identify regulatory nucleic acid sequences from public information. Furthermore, those skilled in the art will be able to identify transcriptional translational control sequences that are applicable to the intended use, eg in vivo, ex vivo or in vitro.
  • promoter refers to a segment of a nucleic acid sequence that controls transcription of an operably linked nucleic acid sequence.
  • a promoter contains specific sequences that are sufficient for recognition, binding, and initiation of transcription by RNA polymerase.
  • a promoter may contain sequences that regulate RNA polymerase recognition, binding, or transcription initiation.
  • nucleic acid sequence refers to a segment of a nucleic acid sequence that has the function of increasing the efficiency of expression of a gene of interest.
  • silica refers to a segment of a nucleic acid sequence that has the function of reducing the expression efficiency of a gene of interest, contrary to an enhancer.
  • insulator refers to a segment of a nucleic acid sequence that has a cis-regulatory function that regulates the expression of genes located at distant positions on a DNA sequence.
  • terminal refers to a segment of a nucleic acid sequence located downstream of a protein-encoding region and responsible for terminating transcription when a nucleic acid is transcribed into mRNA.
  • an "origin of replication” refers to a DNA double helix partially formed by binding of a protein that recognizes the nucleic acid sequence (e.g., initiator DnaA protein, etc.) or by synthesis of RNA. refers to a segment of a nucleic acid sequence that is unwound and replication begins.
  • an internal ribosome entry site refers to a nucleic acid segment that facilitates ribosome entry or retention during translation of a nucleic acid sequence downstream thereof.
  • homology of nucleic acids refers to the degree of identity between two or more nucleic acid sequences, and generally “having homology” refers to a high degree of identity or similarity. say. Therefore, the higher the homology between two nucleic acids, the higher the identity or similarity of their sequences.
  • two types of nucleic acids have homology can be determined by direct sequence comparison or by hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two nucleic acid sequences, typically there is at least 50% identity, preferably at least 70% identity, more preferably at least 80%, 90%, 95% identity between the nucleic acid sequences. , 96%, 97%, 98% or 99% identical, then the genes have homology.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three-letter symbol or the one-letter symbol recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by their commonly recognized one-letter codes.
  • comparisons of similarity, identity, and homology of amino acid and base sequences are calculated using default parameters using BLAST, a sequence analysis tool. Identity searches can be performed using, for example, NCBI's BLAST 2.10.1+ (published June 18, 2020). The identity value in this specification usually refers to the value obtained when alignment is performed using the above-mentioned BLAST under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameters, the highest value is taken as the identity value. When identity is evaluated in multiple areas, the highest value among them is taken as the identity value. Similarity is a value that takes into account similar amino acids in addition to identity.
  • references to a biological material refer to a biological function similar to, if not to the same extent as, the biological material's biological function. It is understood that it is also a reference to variants of the biological substance (eg, variants with modifications in the amino acid sequence) that exhibit a good effect on the biological substance. Such variants include fragments of the original molecule, spanning amino acid or nucleic acid sequences of the original biological material of the same size, or fragments of the original that are aligned by alignment by computer homology programs known in the art.
  • Variants can include molecules with modified amino acids (e.g., modified by disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, or phosphorylation) or modified nucleotides (e.g., modified by methylation).
  • modified amino acids e.g., modified by disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, or phosphorylation
  • modified nucleotides e.g., modified by methylation
  • stringent conditions refer to well-known conditions commonly used in the field. As the stringent conditions, for example, the following conditions can be adopted. (1) using low ionic strength and high temperature for washing (e.g., 0.015 M sodium chloride/0.0015 M sodium citrate/0.1% sodium dodecyl sulfate at 50 °C); (2) during hybridization.
  • a denaturing agent such as formamide (e.g., 50% (v/v) formamide and 0.1% bovine serum albumin/0.1% Ficoll/0.1% polyvinylpyrrolidone/50 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 at 42 °C; and 750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate), or (3) 20% formamide, 5x SSC, 50mM sodium phosphate (pH 7.6), 5x Denhard's solution, 10% dextran sulfate, and 20mg/ml denaturation. Incubate overnight at 37 °C in a solution containing sheared salmon sperm DNA, then wash the filter with 1x SSC at approximately 37-50 °C.
  • formamide e.g. 50% (v/v) formamide and 0.1% bovine serum albumin/0.1% Ficoll/0.1% polyvinylpyrrolidone/50 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 at 42 °C; and 750mM sodium chloride, 75
  • the formamide concentration may be 50% or more. Wash times may be 5, 15, 30, 60, or 120 minutes or longer. There are multiple factors that can affect the stringency of hybridization reactions, such as temperature and salt concentration.For details, refer to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). . Examples of "highly stringent conditions" are 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, 65-68°C, or 0.015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, and 50% formamide, 42 It is °C.
  • sequences that hybridize under stringent conditions preferably include sequences containing only the A sequence or only the T sequence.
  • Moderate stringency conditions can be readily determined by those skilled in the art based on the length of the DNA, for example, and are described by Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, No. 3, Vol.
  • polypeptides as used in this disclosure include those encoded by nucleic acid molecules that hybridize under highly or moderately stringent conditions to nucleic acid molecules encoding the polypeptides specifically described in this disclosure. Also included are polypeptides.
  • a "corresponding" amino acid or nucleic acid has or has a similar effect in a certain polypeptide molecule or polynucleotide molecule as a given amino acid or nucleotide in a polypeptide or polynucleotide that serves as a reference for comparison.
  • an antisense molecule it can be a similar portion in an ortholog that corresponds to a particular portion of the antisense molecule.
  • Corresponding amino acids can be identified, for example, by cysteination, glutathionylation, SS bond formation, oxidation (e.g., oxidation of methionine side chains), formylation, acetylation, phosphorylation, glycosylation, myristylation, etc. amino acids.
  • the corresponding amino acid may be an amino acid responsible for dimerization.
  • Such "corresponding" amino acids or nucleic acids may be a range of regions or domains. In such cases, therefore, the regions or domains are referred to herein as "corresponding" regions or domains.
  • a "corresponding" gene e.g., a polynucleotide sequence or molecule
  • a gene e.g, a polynucleotide sequence or molecule
  • a gene corresponding to a given gene may be an ortholog of that gene.
  • a serotype 1 AAV cap may correspond to a serotype 2 AAV cap.
  • a corresponding gene in a certain virus can be found by searching a sequence database for that virus using the gene sequence of the virus as a reference for the corresponding gene as a query sequence.
  • the term "activity" herein refers to the function of a molecule in the broadest sense.
  • Activity generally includes, but is not intended to be limiting, a biological, biochemical, physical, or chemical function of the molecule.
  • Activity includes, for example, enzymatic activity, the ability to interact with other molecules, and the ability to activate, promote, stabilize, inhibit, suppress, or destabilize the function of other molecules. stability, and the ability to localize to specific subcellular locations. Where applicable, the term also relates to the function of protein complexes in the broadest sense.
  • biological function refers to a specific function that the gene, nucleic acid molecule, or polypeptide may have in a living body when referring to a certain gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto. Examples include, but are not limited to, specific cell surface structure recognition ability, enzymatic activity, and ability to bind to specific proteins. In the present disclosure, examples include, but are not limited to, functions that a certain promoter is recognized in a specific host cell.
  • biological function may be exerted by “biological activity.”
  • biological activity refers to the activity that a certain factor (e.g., polynucleotide, protein, etc.) may have in vivo, and it exhibits various functions (e.g., transcriptional promotion activity). For example, activities in which interaction with one molecule activates or inactivates another molecule are also included. For example, if a factor is an enzyme, its biological activity includes its enzymatic activity. Another example is where an agent is a ligand, including binding of that ligand to a corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art.
  • activity refers to or reveals a binding (either direct or indirect) that affects a response (i.e., has a measurable effect in response to some exposure or stimulus); refers to a variety of measurable indicators, including, for example, the amount of upstream or downstream proteins or other similar measures of function in a host cell.
  • infectious virus or virus-derived construct refers to the ability of the virus or virus-derived construct to introduce the nucleic acid within the virus or virus-derived construct into a cell by attachment to or membrane fusion of the virus or virus-derived construct. refers to The "replication capacity" of a virus or virus-derived construct refers to its ability to produce infectious virus particles or virus-derived construct particles within infected cells.
  • transformation As used herein, the terms “transformation,” “transduction,” and “transfection” are used interchangeably, unless otherwise stated, and refer to the introduction of a nucleic acid (as appropriate by a virus or virus) into a host cell. derived construct).
  • any method that introduces a nucleic acid into a host cell can be used, such as using competent cells, electroporation, a method using a particle gun (gene gun), and a calcium phosphate method.
  • particle gun gene gun
  • calcium phosphate method Various well-known techniques such as
  • a purified substance or biological factor refers to one in which at least a portion of the factors naturally associated with the biological factor have been removed. Therefore, the purity of the biological agent in a purified biological agent is typically higher (ie, more concentrated) than the state in which the biological agent normally exists.
  • the term "purified” as used herein preferably means at least 75%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% by weight. It means that the same type of biological agent is present.
  • the materials used in this disclosure are preferably "purified" materials.
  • the term "medicinal ingredient” refers to any ingredient that can constitute a medicine, such as active ingredients (those that exhibit medicinal efficacy by themselves), additive ingredients (which are not expected to have medicinal efficacy by themselves), Examples include ingredients that are expected to play a certain role (for example, excipients, lubricants, surfactants, etc.) when included as a medicine.
  • the pharmaceutical component may be a single substance or a combination of multiple substances or agents. Any combinations such as combinations of active ingredients and additive ingredients, combinations of adjuvants and active ingredients, etc. may also be included.
  • active ingredient refers to an ingredient that exerts the intended medicinal effect, and may be a single ingredient or a plurality of ingredients.
  • additional component refers to any component that is not expected to have medicinal efficacy but plays a certain role when included as a medicine, such as a pharmaceutically acceptable carrier, a stabilizer, Examples include auxiliary agents, solubility improvers, solubilizers, diluents, excipients, buffers, binders, diluents, flavorings, and lubricants.
  • drug drug
  • agent agent
  • factor factor
  • any term can be used as long as it can achieve the intended purpose. It may also be a substance or other element (eg, light, radioactivity, heat, energy such as electricity).
  • Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (including, for example, DNA such as cDNA and genomic DNA, and RNA such as mRNA), Saccharides, oligosaccharides, lipids, organic small molecules (e.g., hormones, ligands, information transmitters, organic small molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (e.g., small molecule ligands, etc.)) , composite molecules thereof, and mixtures thereof.
  • proteins proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (including, for example, DNA such as cDNA and genomic DNA, and RNA such as mRNA), Saccharides, oligosaccharides,
  • conjugate or “complex molecule” refers to any construct that includes two or more moieties.
  • the other part may be a polypeptide or another substance (e.g., a substrate, a sugar, a lipid, a nucleic acid, another hydrocarbon, etc.). You can.
  • two or more parts constituting a complex may be bonded by a covalent bond or by other bonds (e.g., hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.) may have been done.
  • label refers to the presence (eg, substance, energy, electromagnetic waves, etc.) for distinguishing a target molecule or substance from others.
  • labeling methods include the RI (radioisotope) method, the fluorescence method, the biotin method, and the chemiluminescence method.
  • RI radioisotope
  • fluorescence method the fluorescence method
  • biotin method the chemiluminescence method.
  • chemiluminescence method When a plurality of target proteins or factors or means for capturing them are labeled by a fluorescence method, they are labeled with fluorescent substances having mutually different maximum fluorescence emission wavelengths. The difference in maximum fluorescence emission wavelength is preferably 10 nm or more.
  • Fluorescent materials include Alexa TM Fluor, although any label that does not affect function can be used.
  • Alexa TM Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series that supports a wide range of fluorescence wavelengths, and has a very low fluorescence compared to other fluorescent dyes with corresponding wavelengths. It is stable, bright and has low pH sensitivity.
  • Examples of the combination of fluorescent dyes having a maximum fluorescence wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa TM 555 and Alexa TM 633, a combination of Alexa TM 488 and Alexa TM 555, and the like.
  • Other fluorescent labels include cyanine dyes (eg, Cy3, Cy5, etc.
  • such labels can be utilized to modify the target so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art, and those skilled in the art can implement such methods as appropriate depending on the label and the intended target.
  • kits refers to a unit in which parts to be provided (eg, virus-derived constructs, instructions, etc.) are provided, usually divided into two or more compartments.
  • This kit format is preferable when the purpose is to provide a composition that should not be provided mixed for reasons of stability etc., but is preferably mixed immediately before use.
  • kits preferably include instructions or instructions describing how to use the parts provided or how to treat the reagents.
  • the kit When the kit is used as a reagent kit herein, the kit usually includes instructions describing how to use the virus-derived construct, etc.
  • instructions describe instructions for a physician or other user on how to use the present disclosure.
  • This instruction sheet contains words instructing the administration of the medicament of the present disclosure. Additionally, the instructions may include language instructing the dosage form.
  • This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the regulatory authority of the country where the disclosure will be made (e.g., the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.), and approved by that regulatory authority. It will be clearly stated that it was received.
  • the instruction sheet is a so-called package insert, and is usually provided in a paper medium, but is not limited to this, and may be provided in the form of an electronic medium (e.g., a home page provided on the Internet, e-mail), etc. can also be provided.
  • the present disclosure provides methods for making various virus-derived construct plasmids from a starting plasmid (eg, a virus-derived construct plasmid of the present disclosure).
  • the method of making a virus-derived construct plasmid of the present disclosure comprises providing a set of starting plasmids containing at least a portion of the nucleic acid sequences necessary to construct the virus-derived construct, comprising: the set of starting plasmids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids, the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising at least one set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising a different nucleic acid sequence; A step of preparing a mixed solution containing the cleaved surrogate unit nucleic acid fragment by treatment with a restriction enzyme, a step of ligating the cleaved surrogate unit nucleic acid fragment to form an integrated nucleic acid, and
  • the unit nucleic acid fragments generated by restriction enzyme treatment of the starting plasmid have approximately equimolar moles, and the transformed organism can be efficiently transformed without the need for complicated adjustment of the number of moles of unit nucleic acid fragments. It is possible to create integrated nucleic acids that can be taken up. Additionally, by including a set of corresponding surrogate unit nucleic acids with different nucleic acid sequences in the set of starting plasmids, the surrogate unit nucleic acids that are incorporated into a particular position of the product plasmid are randomly selected from among the set of corresponding surrogate unit nucleic acids.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences, and 16 or more, 27 or more. 32 or more, 64 or more, 81 or more, 128 or more, 243 or more, 256 or more, 512 or more, 729 or more, 1024 or more, or more different parallel alternative unit nucleic acids possible.
  • the method of generating virus-derived construct plasmids of the present disclosure generates a collection of virus-derived construct plasmids.
  • at least one of the set of starting plasmids comprises a transcription initiation sequence that is operative in an animal cell, and comprises a transcription initiation sequence that is operative in an animal cell.
  • a virus-derived construct plasmid is created.
  • the methods of making virus-derived construct plasmids of the present disclosure use three or more starting plasmids.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises at least two sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences.
  • a virus-derived construct plasmid produced by the method of producing a virus-derived construct plasmid of the present disclosure can be used as a starting plasmid to be subjected to the next round of the method of producing a virus-derived construct plasmid of the present disclosure.
  • the method for producing a virus-derived construct plasmid of the present disclosure further includes the step of selecting a virus-derived construct plasmid excellent in a desired function from a collection of virus-derived construct plasmids formed.
  • desired functions that serve as selection criteria include the amount of virus-derived constructs produced per plasmid, the amount of virus-derived constructs produced per producer cell, and the amount of impurities generated when producing virus-derived constructs from plasmids. , the purity of the target virus-derived construct when producing the virus-derived construct from the plasmid, etc.
  • Impurities include outer shell protein that does not contain a nucleic acid sequence, outer shell protein that contains an incomplete nucleic acid sequence, incomplete outer shell protein, incomplete nucleic acid sequence, and self-replication ability (genetic recombination during the production process). (containing a wild-type virus-like nucleic acid sequence generated by a virus), etc. (virus-derived constructs that have a structure different from the complete nucleic acid or protein assumed from the nucleic acid sequence of the plasmid, such as introduction of mutations and cleavages) may be considered incomplete).
  • the method of making a virus-derived construct plasmid of the present disclosure may include adding a barcode nucleic acid during the step of ligating to form an integrated nucleic acid, so that the Differentiation of virus-derived construct plasmids may be facilitated.
  • the method of producing a virus-derived construct plasmid of the present disclosure can be performed to improve the partial structure of a virus-derived construct plasmid.
  • this is a virus-derived construct plasmid comprising a combination of parallel alternative unit nucleic acids of the virus-derived construct plasmid selected in the above step of selecting a virus-derived construct plasmid superior in the desired function. It can be carried out by preparing.
  • virus-derived construct plasmid superior in a desired function the combination of elements on that plasmid may be considered favorable for the desired function, so information on the nucleic acid sequence of the plasmid or the resulting amino acid
  • a structure similar to this combination of elements may be constructed on another plasmid with reference to sequence information, or a specific region may be excised from that plasmid and transferred to another plasmid.
  • the methods of making virus-derived construct plasmids of the present disclosure can be carried out to do so.
  • the elements for examining structural variations include (A) a nucleic acid sequence containing a terminal repeat sequence, (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor, (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein, (D) a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor, (E) a nucleic acid sequence encoding a promoter, (F) a nucleic acid sequence encoding a desired gene, and (G) a host.
  • Examples include nucleic acid sequences involved in cell biosynthesis.
  • variants of different serotypes, variants, different promoters that function in the same host cell, etc.
  • the desired This may facilitate the design of virus-derived construct plasmids with excellent functions.
  • those skilled in the art can appropriately determine the elements to be included in the alternative unit nucleic acid. For example, when considering an appropriate combination of a promoter and a desired gene, a set of corresponding alternative unit nucleic acids containing different promoter sequences is prepared, and a set of corresponding alternative unit nucleic acids containing different desired gene sequences is prepared as an adjacent alternative unit nucleic acid.
  • a set of corresponding surrogate unit nucleic acids can be prepared to carry out the methods of making virus-derived construct plasmids of the present disclosure. Thereafter, multiple combinations of promoters and desired genes with relatively excellent performance are selected, and a set of corresponding alternative unit nucleic acids is prepared as unit nucleic acids containing combinations of these promoters and desired genes at the same time. , in combination with a corresponding set of alternative unit nucleic acids containing different ITR sequences, and by implementing the method of making virus-derived construct plasmids of the present disclosure, suitable combinations of promoters, desired genes and ITRs can be explored. can.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences encoding a desired gene, and a promoter. It comprises a set of corresponding alternative unit nucleic acids upstream thereof containing different encoding nucleic acid sequences.
  • the present disclosure provides a method of making an adeno-associated virus-derived construct plasmid in Bacillus subtilis, a method of making a virus-derived construct plasmid of the present disclosure, a virus-derived construct plasmid produced by such a method, and a method of making an adeno-associated virus-derived construct plasmid in Bacillus subtilis.
  • the virus-derived construct plasmids and/or libraries thereof of the present disclosure may be generated by the OGAB method.
  • the OGAB (Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis) method is a method for producing a circular plasmid in a transformed organism by incorporating an integrated nucleic acid into the organism. With the OGAB method, plasmids containing large-sized nucleic acids can be easily prepared.
  • the unit nucleic acids used to prepare the assembled nucleic acids may be prepared as unit vectors (mainly for the construction of new plasmids), as described in detail below, or by cutting the constructed plasmids. May be prepared. Below, the procedure for producing an integrated nucleic acid for incorporation into a transformed organism will be explained.
  • Unit nucleic acids can be produced by any known method, for example, by polymerase chain reaction (PCR) or chemical synthesis.
  • a unit nucleic acid is a sequence or part thereof encoding a desired protein (therapeutic protein, protein constituting a virus-derived construct, etc.), a sequence controlling a gene (promoter, enhancer, etc.), a sequence for manipulating the nucleic acid (restriction enzyme recognition sequences, etc.).
  • each unit nucleic acid can be configured to produce a specific protruding sequence so that multiple types of unit nucleic acids are arranged in a specific order and/or characteristic direction when incorporated into an integrated nucleic acid. Since a large number of unit nucleic acids can ultimately be assembled on a plasmid, one or more unit nucleic acids may be designed to encode one or more genes with a long base length. Examples of genes with long base lengths include a group of genes that constitute a series of metabolic pathways.
  • a unit vector can be prepared by ligating a unit nucleic acid and an additional nucleic acid different from the unit nucleic acid.
  • the use of unit vectors may allow for easier handling of unit nucleic acids.
  • the additional nucleic acid may be a linear nucleic acid or a circular plasmid.
  • the unit vector can also have a circular structure, and therefore can be used, for example, to transform E. coli.
  • the additional nucleic acid may include an origin of replication such that the unit vector is replicated in the host into which it is introduced.
  • all unit nucleic acids for constructing a given aggregate nucleic acid may be ligated to the same type of additional nucleic acid, thereby reducing size differences between unit vectors and combining multiple types of units. Vector handling may be easier.
  • a unit nucleic acid for constructing an integrated nucleic acid may be linked to different types of additional nucleic acids.
  • the ratio (base length of unit nucleic acid)/(base length of unit vector) or its average is 50% or less, 40% or less. % or less, 30% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 7% or less, 5% or less, 2% or less, 1.5% or less, 1% or less, or 0.5% or less.
  • the larger the size of the additional nucleic acid than the unit nucleic acid may allow for more uniform handling of different types of unit vectors.
  • the unit nucleic acid and the additional nucleic acid can be linked by any method such as ligation using DNA ligase or TA cloning method.
  • the ratio (base length of unit nucleic acid)/(base length of unit vector) or its average is 1% or more, 0 It may be .3% or more, 0.1% or more, 0.03% or more, 0.01% or more, 0.003% or more, or 0.001% or more, which may facilitate manipulation of the unit vector.
  • the length of the unit nucleic acid is 10 bp or more, 20 bp or more, 50 bp or more, 70 bp or more, 100 bp or more, 200 bp or more, 500 bp or more, 700 bp or more, 1000 bp or more, or 1500 bp or more, and 5000 bp or less, 5000 bp or less, It can be 2000 bp or less, 1500 bp or less, 1200 bp or less, 1000 bp or less, 700 bp or less or 500 bp or less.
  • the accumulated nucleic acids include 2 or more types, 4 or more types, 6 or more types, 8 or more types, 10 or more types, 15 or more types, 20 or more types, 30 or more types, 40 or more types, 50 or more types, 60 or more, 70 or more, 80 or more, 90 or more, or 100 or more, and 1000 or less, 700 or less, 500 or less, 200 or less, 120 or less, 100 or less, 80 or less, 70 It can be constructed from up to 60 types, up to 70 types, or up to 50 types of unit nucleic acids. By adjusting the number of moles of each unit nucleic acid (or unit vector) to be approximately the same, a desired integrated nucleic acid having a tandem repeat structure can be efficiently produced.
  • the unit nucleic acids may have a base length that is approximately equal to the number of unit nucleic acids that divide one set of repeat sequences in the integrated nucleic acid. By doing so, it may become easier to adjust the number of moles of each unit nucleic acid (or unit vector). In one embodiment, the unit nucleic acids are 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less of the base length obtained by dividing one set of repetitive sequences in the integrated nucleic acid approximately equally by the number of unit nucleic acids. , may have an increased or decreased base length of no more than 7% or no more than 5%.
  • the unit nucleic acid can be designed to have a non-palindromic sequence (a non-palindromic sequence) at the end of the unit nucleic acid.
  • a non-palindromic sequence a non-palindromic sequence
  • the non-palindromic sequence of the unit nucleic acid designed in this way is made into a protruding sequence, a structure in which the unit nucleic acids are linked to each other while maintaining the order in the integrated nucleic acid can be easily provided.
  • An integrated nucleic acid can be constructed by linking unit nucleic acids to each other. When a plurality of unit nucleic acids exist on the same starting plasmid, unit nucleic acid fragments are produced by cleaving this starting plasmid, and integrated nucleic acids can be constructed by ligating these unit nucleic acid fragments together.
  • a unit nucleic acid can be prepared by cutting out a unit vector using a restriction enzyme or the like.
  • the integrated nucleic acid can include one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more, or ten or more sets of repetitive sequences. .
  • the repetitive sequences in the assembly nucleic acid can include the sequence of the unit nucleic acid and, optionally, the sequence of the assembly vector nucleic acid.
  • the integrated nucleic acid may have a sequence that allows the nucleic acid to replicate in a transformed organism.
  • a sequence that enables replication of a nucleic acid in a transformed organism may include an effective origin of replication in the transformed organism (eg, Bacillus subtilis).
  • the sequence of the replication origin effective in Bacillus subtilis is not particularly limited, but for example, pTB19 (Imanaka, T., et al. J.Gen.Microbioi. 130, 1399) has a ⁇ -type replication mechanism.
  • the integrated nucleic acid may include additional base sequences as necessary.
  • the integrated nucleic acid may include base sequences that control transcription and translation, such as promoters, operators, activators, and terminators.
  • the promoter when using Bacillus subtilis as a host is Pspac (Yansura, D. and Henner, D.J. Pro. Natl. Acad. Sci, USA 81), whose expression can be controlled by IPTG (isopropyl s-D-thiogalactopyranoside). 439-443. (1984.)), or the Pr promoter (Itaya, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 602-604. (1999)).
  • a unit nucleic acid can form a repeating structure that maintains a fixed order and orientation in an integrated nucleic acid.
  • unit nucleic acids are constructed such that the base sequences of the overhanging ends of unit nucleic acids cut out from unit vectors are complementary to each other, thereby creating a repeating structure that maintains a fixed order and orientation in the assembled nucleic acids. formation may be possible.
  • the overhang may have a nonbatch sequence and may be either a 5' overhang or a 3' overhang.
  • a unit nucleic acid having an overhanging end can be excised from a unit vector using a restriction enzyme.
  • the unit vector may have one or more restriction enzyme recognition sequences.
  • each restriction enzyme recognition sequence may be recognized by the same restriction enzyme or different restriction enzymes.
  • a unit vector may contain a pair of regions recognized by the same restriction enzyme such that a complete unit nucleic acid region is contained between these regions.
  • Restriction enzymes used include, but are not particularly limited to, type II restriction enzymes, such as AarI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, FokI, SfaNI, etc.
  • type II restriction enzymes such as AarI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, FokI, SfaNI, etc.
  • Type IIS restriction enzymes can be used and these restriction enzymes can be capable of creating overhanging ends at a distance from the recognition sequence outside of the recognition sequence.
  • the unit vector does not include a region recognized by the Type IIS restriction enzyme in the unit nucleic acid region.
  • the unit vector may contain the region recognized by the restriction enzyme at the end of the unit nucleic acid region.
  • the restriction enzyme treatment when using the same type of restriction enzyme to cut out unit nucleic acids from multiple unit vectors, the restriction enzyme treatment can be performed in a solution containing the multiple unit vectors, increasing the efficiency of the work. It can be improved.
  • the types of restriction enzymes used to produce a certain integrated nucleic acid can be, for example, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1. , the variation in molar numbers between unit nucleic acids can be reduced.
  • a unit nucleic acid excised from a unit vector can be easily purified by any known fractionation method such as agarose gel electrophoresis.
  • the unit nucleic acids and, if necessary, the integrated vector nucleic acids can be ligated to each other using DNA ligase or the like. Thereby, integrated nucleic acids can be produced.
  • the ligation of a unit nucleic acid and optionally an assembly vector nucleic acid can be performed in the presence of components such as polyethylene glycol (e.g., PEG2000, PEG4000, PEG6000, PEG8000, etc.) and salts (e.g., monovalent alkali metals, sodium chloride, etc.). It can be carried out below.
  • the concentration of each unit nucleic acid in the ligation reaction solution is not particularly limited, and may be 1 fmol/ ⁇ l or more.
  • the ligation reaction temperature and time are not particularly limited, and may be 37° C. for 30 minutes or more.
  • the composition comprising the unit nucleic acids and optionally the integrating vector nucleic acids may be subjected to any conditions that inactivate the restriction enzymes. Good (e.g. phenol/chloroform treatment).
  • the unit nucleic acids can be adjusted to approximately the same number of moles using the method described in WO2015/111248.
  • the (parallel) unit nucleic acid fragments produced by cleaving this starting plasmid are naturally adjusted to the same molar number.
  • the total moles of sets of (parallel) alternative unit nucleic acids produced by mixing and cutting multiple starting plasmids are also naturally adjusted to be the same.
  • By adjusting the number of moles of unit nucleic acids to be approximately the same a desired integrated nucleic acid having a tandem repeat structure can be efficiently produced.
  • the concentration of the unit vector or unit nucleic acid the number of moles of the unit nucleic acid can be adjusted.
  • Plasmids can be formed in the transformed organism by contacting the accumulated nucleic acid with the transformed organism.
  • the transformed organism includes bacteria of the genus Bacillus, bacteria of the genus Streptococcus, bacteria of the genus Haemophilus, bacteria of the genus Neisseria, and the like.
  • Bacillus bacteria include B. subtilis, B. subtilis. megaterium, B. stearothermophilus (moderate hyperthermia bacteria) and the like.
  • the transformed organism is Bacillus subtilis.
  • the transformed organism into which the integrated nucleic acid is taken up is competent and capable of actively taking up the nucleic acid.
  • Competent refers to a state in which a cell has become more permeable to exogenous substances (eg, nucleic acids).
  • Bacillus subtilis in a competent state cleaves a double-stranded nucleic acid as a substrate on the cell, degrades one of the two strands from this cleavage point, and degrades the other single strand. Taken into the bacterial body. The imported single strand can be repaired into a circular double stranded nucleic acid within the bacterial body.
  • any known method can be used to render the transformed organism competent, for example, Bacillus subtilis can be transformed using the method described in Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746 (1961). A method can be used to achieve a competent state. As the transformation method, any known method suitable for each transformed organism can be used.
  • the disclosure provides a virus-derived construct plasmid.
  • elements of virus-derived construct plasmids are described below, any element or combination of elements can be included in a substitute unit nucleic acid to carry out the methods of making virus-derived construct plasmids of the present disclosure.
  • the elements of the virus-derived construct plasmid described below apply to both the starting plasmid and the product plasmid.
  • the elements of the virus-derived construct plasmids described below also apply to the virus-derived construct plasmid libraries of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a plasmid operably linked to at least a portion of the nucleic acid sequences necessary to construct a virus-derived construct.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the virus-derived construct include (A) a nucleic acid sequence comprising a terminal repeat sequence (e.g., derived from any of serotypes 1-12 or variants thereof); (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor (which may be derived from, for example, rep, any of adeno-associated virus serotypes 1-12 or variants thereof); and (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure comprises two, three, or four of the nucleic acid sequences of (A)-(D).
  • the nucleic acid sequences necessary to construct a virus are located in a cohesive region on a virus-derived construct plasmid.
  • a virus-derived construct plasmid having such a structure can be formed by incorporating a nucleic acid fragment containing a nucleic acid sequence necessary for constructing a virus into an original plasmid.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the virus comprise about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less, about 25% or less, about 20% of the total base length of the virus-derived construct plasmid. present in a continuous region with a base length of about 15% or less, about 10% or less, or about 5% or less.
  • elements other than the terminal repeats of the nucleic acid sequences necessary to construct the virus e.g., nucleic acid sequences encoding structural proteins of the virus, nucleic acid sequences encoding packaging factors, and functional cofactors
  • each element of the nucleic acid sequence necessary to construct the virus may be arranged in any order and position, and various arrangements other than those specifically shown in the drawings etc. It is understood that the following can be used.
  • a nucleic acid sequence described for a particular function such as a functional cofactor, contains multiple elements
  • the order and position of each element in the virus-derived construct plasmid can be arbitrary, unless otherwise specified, but any element (e.g. VA, E2A, E4) may be arranged consecutively (without any other genes in between).
  • genes or combinations of genes derived from viruses different from the source virus of the virus-derived construct plasmids such as adenoviruses, herpesviruses, papillomaviruses, bocaviruses and simian viruses, may be used.
  • the functional cofactors include E1A, E1B, E2A, E4, and VA of adenoviruses, UL5, UL8, UL30, UL42, UL52, ICP0, ICP4, ICP8, and ICP22 of herpesviruses, and ICP22 of papillomaviruses.
  • the nucleic acid sequence necessary to construct the virus includes two terminal repeat sequences of the virus, and the base length of the region sandwiched between the two terminal repeat sequences (excluding the terminal repeat sequence itself) is: It can be about 1 kb or more, about 5 kb or more, about 10 kb or more, about 20 kb or more, about 30 kb or more, about 40 kb or more, about 50 kb or more, about 70 kb or more, or about 100 kb or more.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the virus include two terminal repeats and other parts of the virus, and the other parts are outside the region sandwiched between the two terminal repeats. be positioned.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure includes a promoter, a desired gene, and a terminator from upstream between the 5'ITR and 3'ITR.
  • the nucleic acid sequences encoding structural proteins of the virus may be variants of wild-type sequences (eg, adeno-associated virus serotypes 1-12).
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure optionally include a promoter upstream of the element.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure may contain one of the nucleic acid sequences (B), (C), and (D) of the nucleic acid sequences necessary to construct the virus-derived construct or the genes contained therein. Alternatively, it may contain multiple upstream promoters.
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure may include one or more promoters upstream of one or more desired genes.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure includes a drug selection marker nucleic acid sequence between any two of the nucleic acid sequences (A)-(D).
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure includes a drug selection marker nucleic acid sequence between any two genes encoded by the nucleic acid sequences (A) to (D).
  • the set of surrogate unit nucleic acids encoding promoters comprises a set of corresponding surrogate unit nucleic acids encoding promoters of different types or orientations.
  • the promoter includes a drug-responsive promoter.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure are viral vectors, virus-like particles (VLPs), oncolytic viruses (including those modified to grow only in cancer cells), or viral replicons ( It is used to produce a self-replicable viral genome lacking the ability to produce virus particles.
  • VLPs virus-like particles
  • oncolytic viruses including those modified to grow only in cancer cells
  • viral replicons It is used to produce a self-replicable viral genome lacking the ability to produce virus particles.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure includes a nucleic acid sequence that promotes plasmid replication in a microbial host cell.
  • the nucleic acid sequence that promotes plasmid replication in B. subtilis is an origin of replication that operates in B. subtilis, such as oriC, and pTB19 (Imanaka, T., et al. J. Gen. Microbioi. 130, 1399 -1408. (1984)), pLS32 (Tanaka, T. and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246. (1998)), pAM ⁇ 1 (Swinfield, T. J., et al. Gene 87, 79-90 (1990)).
  • Nucleic acid sequences that promote plasmid replication in Bacillus subtilis include plasmids, parts thereof, origins of replication, or modified versions thereof, which are known to activate replication mechanisms such as rolling circle type, theta type, oriC, and phages. Can be mentioned.
  • the nucleic acid sequence that promotes plasmid replication in Bacillus subtilis is a sequence that is identical or similar to a known origin of replication (e.g., 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more than 99.5% sequence identity).
  • the nucleic acid sequences that promote plasmid replication in microbial host cells may be located within the contiguous region in which the nucleic acid sequences necessary to construct the virus are located, or may be located outside of this contiguous region. It's okay.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure can be made or used in cells of organisms other than B. subtilis, so that they contain transcriptional translational control sequences, such as origins of replication, promoters, and transcription termination sequences, that operate in those organisms. may be included. Transcription and translation control sequences for each organism are known and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure can be made or replicated in E. coli, yeast, etc., and thus can contain transcriptional translational control sequences that operate in these microorganisms.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure can be introduced into a producer cell and thus contain transcriptional translational regulatory sequences that are operative in the producer cell.
  • the producer cell can be an animal cell
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure can contain transcriptional translational control sequences that operate in animal cells.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure does not contain sequences for at least a portion of the genes of the entire genome of the virus.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure include nucleic acid sequences involved in host cell biosynthesis.
  • Nucleic acid sequences involved in host cell biosynthesis are nucleic acid sequences that include genes related to intracellular communication (metabolism, endoplasmic reticulum processing, etc.), anti-apoptosis, oxidative stress, and cell proliferation; Examples include V40 Large T antigen (SV40LTA), TAX, Kras, Myc, MIR17HG, BCL-2, BCL-XL, PDIA2, XBP1, HSPA5, PC (pyruvate carboxylase), PDK, HIF1A, NRF2, and CPSF6. .
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure contains the desired gene.
  • the desired gene can be placed between two terminal repeat sequences.
  • the desired gene in the virus-derived construct plasmid of the present disclosure may be ultimately included in the loaded nucleic acid of the virus-derived construct.
  • Such a desired gene may encode a therapeutic protein, a gene for gene therapy, a gene for gene cell therapy such as CART therapy, It may encode a protein-non-coding functional RNA (rRNA, tRNA, microRNA (miRNA), lncRNA, etc.), or it may encode a promoter, terminator, insulator, enhancer, silencer, origin of replication, etc. in combination with or independently of these.
  • the desired gene comprises a viral promoter (optionally upstream of the protein-coding gene), such as a cytomegalovirus promoter, CAG promoter, SV40 promoter, RSV promoter.
  • the desired gene comprises an IRES (optionally upstream of the protein-coding gene).
  • the desired gene is included in the virus-derived construct plasmid at the following positions, from upstream to promoter, desired gene, and terminator between the 5'LTR and 3'LTR. In one embodiment, more than one set of promoters, desired genes, and terminators are included in the virus-derived construct plasmid.
  • the desired gene can be integrated into the chromosome of the subject to whom the virus-derived construct is administered.
  • the desired gene may have the function of controlling the expression of a subject's naturally occurring gene, or may result in long-term protein expression.
  • virus-derived constructs based on adeno-associated viruses, retroviruses, etc. can integrate into a subject's chromosome.
  • the desired gene may be integrated into the therapeutic cell (eg, chromosome) (eg, via treatment of the cell with a virus-derived construct in vitro).
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure do not contain all of the genes necessary for the virus from which the virus-derived construct originates to propagate, so that the virus-derived construct produced is capable of propagation. It may be configured so that it is not provided.
  • the desired gene in the virus-derived construct plasmid of the present disclosure may include multiple genes.
  • the desired genes are 2 to 100, such as 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 7 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 20 or more, 25 or more, 30 or more, 40 or more, or 50 or more, and 100 or less, 90 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, 35 or less, 30 or more, 25 or less, 20 or less, 17 or less, 15 or less, 12 or less, or 10 May include the following genes:
  • the desired gene in the virus-derived construct plasmid of the present disclosure is about 0.1 to 1000 kbp, such as about 0.1 kbp or more, about 0.3 kbp or more, about 1 kbp or more, about 2 kbp or more, about 5 kbp or more, about 7 kbp or more, about 10 kbp or
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure can be constructed into complex structures containing multiple genes by the OGAB method, desired genes can also be constructed into complex structures. Since the size of the loaded nucleic acid can be limited depending on the type of virus-derived construct, the type of virus-derived construct may be selected depending on the size of the desired gene.
  • the desired gene comprises a plurality of genes, such that the therapeutic gene ( Therapeutic protein coding sequences, gene therapy genes, gene cell therapy genes, etc.) enable the coordinated expression of a series of enzymes that control metabolic cascades. It may be possible to deliver to a subject a nucleic acid having a
  • the proteins encoded by the desired genes in the virus-derived construct plasmids of the present disclosure include therapeutic polypeptides (e.g., replacement therapy), immunogenic polypeptides (e.g., pathogen polypeptides, cancer antigen polypeptide), etc.
  • therapeutic polypeptides include cystic fibrosis transmembrane regulatory protein (CFTR), dystrophin (mini- and microdystrophin, myostatin propeptide, follistatin, activin type II soluble receptor, IGF-1, anti-inflammatory polypeptides).
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane regulatory protein
  • dystrophin mini- and microdystrophin
  • myostatin propeptide myostatin propeptide
  • follistatin activin type II soluble receptor
  • IGF-1 anti-inflammatory polypeptides
  • sarcospan utrophin, miniutrophin, coagulation factors (e.g., factor VIII, factor IX, factor X, etc.), erythropoietin, angiostatin, endostatin, catalase, tyrosine hydroxylase, superoxide dismutase, leptin, LDL receptor body, lipoprotein lipase, ornithine transcarbamylase, ⁇ -globin, ⁇ -globin, spectrin, ⁇ 1-antitrypsin, adenosine deaminase, hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase, ⁇ -glucocerebrosidase, sphingomyelinase, lysosomal hexosa minidase A, branched-chain keto acid dehydrogenase, RP65 protein, cytokines (e.g., ⁇ -interferon, ⁇ -interfer
  • somatotropin insulin, insulin-like growth factors 1 and 2, platelet-derived growth factor, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, nerve growth factor, neurotrophic factor-3) and -4, brain-derived neurotrophic factor, bone morphogenetic protein, glial-derived growth factor, transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ ), lysosomal acid ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase A, tumor necrosis growth factor ⁇ soluble receptor body, S100A1, parvalbumin, adenylyl cyclase type 6, anti-inflammatory factors, anti-myostatin protein, aspartoacylase, suicide gene products (e.g., thymidine kinase, cytosine deaminase, diphtheria toxin, tumor necrosis factor), tumor suppressor genes products (eg, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, FAS-ligand, and the like.
  • suicide gene products e.g.
  • Pathogen polypeptides include cell surface proteins of pathogenic organisms such as bacteria, fungi, and parasites, and proteins expressed on the surface of viruses (eg, spike proteins, envelope proteins, capsid proteins, etc.).
  • pathogen polypeptides include orthomyxovirus immunogens (e.g., influenza virus hemagglutinin (HA), nucleoprotein), lentivirus immunogens (e.g., HIV or SIV envelope GP160 protein, matrix/capsid protein, gag, pol, env gene products), arenavirus immunogens (e.g., Lassa fever virus nuclear capsid protein, envelope glycoprotein), poxvirus immunogens (e.g., vaccinia L1 or L8 gene products), flavivirus immunogens (e.g., yellow fever virus viruses or Japanese encephalitis virus immunogens), filovirus immunogens (e.g.
  • orthomyxovirus immunogens e.g., influenza virus hemagglutinin (HA), nucle
  • Ebola virus or Marburg virus immunogens such as NP and GP gene products
  • bunyavirus immunogens e.g. RVFV, CCHF, SFS virus immunogens
  • coronaviruses Immunogens e.g., human coronavirus immunogens such as human coronavirus envelope glycoprotein
  • polio immunogens e.g., herpesvirus immunogens (e.g., CMV, EBV, HSV immunogens), mumps virus immunogens, measles virus immunogens,
  • rubella virus immunogens diphtheria toxin or other diphtheria immunogens, pertussis antigens, and hepatitis (eg, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, etc.) immunogens.
  • Cancer antigen polypeptides include BRCA1 gene product, BRCA2 gene product, gp100, tyrosinase, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, ⁇ -catenin, MUM-1, and caspase.
  • the desired gene can be a gene for treating a particular disease (eg, a gene therapy gene).
  • Genes to be selected for a specific disease can be appropriately selected by those skilled in the art. Examples of such diseases include infections caused by various pathogens, cystic fibrosis, hemophilia A, hemophilia B, thalassemia, anemia, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, Parkinson's disease, Huntington's disease, and muscular atrophy.
  • Lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, epilepsy, cancer (melanoma, adenocarcinoma, thymoma, lymphoma, sarcoma, lung cancer, liver cancer, colon cancer, leukemia, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer) cancer, ovarian cancer, cervical cancer, bladder cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, brain cancer, etc.), diabetes, muscular dystrophy, Gaucher disease, Hurler disease, adenosine deaminase deficiency, glycogen storage disease, congenital Emphysema, Lesch-Nyhan syndrome, Niemann-Pick disease, Tay-Sachs disease, Angelman syndrome, maple syrup urine disease, age-related macular degeneration, amaurosis, diabetic retinopathy, retinal degenerative disease, astrocytoma, glioblastoma , heart failure, peripheral artery disease, arthritis, joint disorder, intimal hyperplasia, AIDS, muscle wasting, kidney defici
  • the present disclosure provides a virus-derived construct plasmid library that includes the virus-derived construct plasmids of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a virus-derived construct plasmid library comprising a virus-derived construct plasmid comprising three or more alternate unit nucleic acids as a series of parallel alternate unit nucleic acids, and wherein said virus-derived construct
  • the product plasmid library comprises a plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences, and a parallel on each virus-derived construct plasmid of the plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences.
  • a surrogate unit nucleic acid can have a length of about 10 kb or more.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids in the virus-derived construct plasmid library comprises (A) a nucleic acid sequence comprising a terminal repeat sequence; (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor; (D) a nucleic acid sequence encoding a structural protein; and (D) a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • each virus-derived construct plasmid in the virus-derived construct plasmid library comprises (A) a nucleic acid sequence comprising a terminal repeat sequence; (B) a nucleic acid sequence encoding a packaging factor; and (C) It includes a nucleic acid sequence encoding a structural protein and (D) a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids in the virus-derived construct plasmid library comprises (A) a nucleic acid sequence encoding a desired gene located between terminal repeat sequences; (B) a packaging factor.
  • a set of corresponding alternative unit nucleic acids comprising at least one different nucleic acid sequence of: (C) a nucleic acid sequence encoding a structural protein; and (D) a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor; and a corresponding set of alternative unit nucleic acids upstream and adjacent thereof comprising different nucleic acid sequences encoding promoters.
  • the plurality of sets of corresponding surrogate unit nucleic acids comprising different nucleic acid sequences in the virus-derived construct plasmid library include surrogate unit nucleic acids with a GC content of 75% or more.
  • the set of corresponding surrogate unit nucleic acids of the virus-derived construct plasmid library comprises multiple sets of corresponding surrogate unit nucleic acids that allow for 64 or more different parallel surrogate unit nucleic acid combinations.
  • each virus-derived construct plasmid contains the same number of parallel alternative unit nucleic acids.
  • each virus-derived construct plasmid includes a barcode nucleic acid sequence.
  • each plasmid in the library may have the same sequence and order of the gene portions.
  • each plasmid in the library may have in common the structural feature of having a recognition sequence for a type II restriction enzyme at a specific location (eg, upstream or downstream of a given gene).
  • each plasmid in the library has the structural characteristic of having a type II restriction enzyme recognition sequence and the same sequence between the recognition sequences at a specific location (e.g., upstream or downstream of a given gene).
  • the plasmid contains a recognition sequence for a type II restriction enzyme, since in the CombiOGAB method it can be operationally efficient to use the same restriction enzyme to generate different cut ends.
  • the library comprises or consists of plasmids having common parts and parts that differ in combination. "Different in combination” means that the same elements of the combination are found on different plasmids in the library, but the same combination of elements is not found on different plasmids in the library. , refers to a combination of elements.
  • a "common portion" may include sequences that are found in all plasmids in the library.
  • promoter library is Promoter 1 + Gene A + Promoter 3 + Gene B Promoter 2 + Gene A + Promoter 3 + Gene B Promoter 1 + Gene A + Promoter 4 + Gene B Promoter 2 + Gene A + Promoter 4 + Gene B
  • the combination of promoter 1 and promoter 3 is a different part in combination.
  • elements that make up different parts in combination in plasmids in a library e.g., a promoter at a particular position
  • an element that has a similar function e.g., function as a promoter
  • an element that has a similar function can be used, but is not particularly limited to, an element that elements may be included in the corresponding positions of the plasmid.
  • virus-derived construct The virus-derived construct plasmids of the present disclosure are used to produce virus-derived constructs. In one embodiment, the present disclosure provides methods of making virus-derived constructs using the virus-derived construct plasmids of the present disclosure. In one embodiment, the present disclosure provides a composition containing a virus-derived construct or a virus-derived construct so produced.
  • Virus-derived constructs include alphavirus, vaccinia virus, measles virus, influenza virus, vesicular stomatitis virus, coronavirus, Sindbis virus, Semliki Forest virus, herpes simplex virus, retrovirus, lentivirus, rabies virus, Sendai virus, Included are virus-derived constructs based on adeno-associated virus, adenovirus, reovirus, coxsackievirus, and Newcastle disease virus.
  • the virus-derived construct is a retrovirus, lentivirus, adeno-associated virus, or adenovirus-based virus-derived construct.
  • the present disclosure provides methods of generating virus-derived construct libraries using the virus-derived construct plasmids of the present disclosure and the virus-derived construct libraries so generated.
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure is introduced into a producer cell to produce a virus-derived construct.
  • producer cells include human embryonic kidney cells (produced by transfecting human fetal kidney cells with adenovirus 5-cleaved DNA), 911 cells, PER.
  • C6 cells E1-transformed amniotic cells, E1-transformed A549 cells, GH329:HeLa cells, HEK293 cells, IT293SF cells, HEK293T, HEK293F, Vero cells, CHO cells, Sf9 cells, Freestyle(TM) 293-F, Expi293-F (trademark), Expi293 inducible, Expi293 NGT-Viral Production Cells 1.0, Viral Production Cells 2.0 (VPC2.0 cells), AAVpro (registered trademark) ) 293T Cell Line, Lenti-X (trademark) 293T Cell Line, FreeStyle Examples include, but are not limited to, CHO-S (trademark) cells, ExpiCHO-S (trademark), VirusExpress (trademark) 293 AAV-producing cells, VirusExpress (trademark) 293T lentivirus-producing cells, and the like.
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure is deficient in a small number (e.g., one, two, three, four, or five) of the genes of the virus of origin of the virus-derived construct; May include all other genes.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure is deficient in a portion of the gene set necessary for producing the virus-derived construct, and the virus-derived construct plasmid of the gene set is deleted. The genes involved are supplied in the producer cell in trans with the virus-derived construct plasmid.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure can be introduced into producer cells alone without combination with other plasmids to enable production of virus-derived constructs.
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure can be introduced into a producer cell in which the virus-derived construct plasmid expresses all of the genes that are deleted from the gene set necessary to produce the virus-derived construct.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure including AAV cap and rep, and adenovirus E2A, E4, and VA, can be used alone to transform the virus-derived constructs into HEK293 cells expressing adenovirus E1A and E1B. can be produced.
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure comprises another nucleic acid or a product of that gene that contains a gene in which the virus-derived construct plasmid is defective among the gene set necessary to produce the virus-derived construct (e.g. virus particles) into producer cells.
  • a virus-derived construct is produced by introducing a virus-derived construct plasmid into a producer cell infected with the virus of origin of the virus-derived construct and allowing homologous recombination to occur in the cell. I can do it.
  • the virus-derived construct plasmid used in this embodiment contains a desired gene and a nucleic acid sequence that has homology to any region of the genome of the source virus (eg, an intergenic region).
  • the virus-derived construct plasmid may have a structure that includes the desired gene between any genes of the genome of the virus of origin of the virus-derived construct being produced.
  • at least a portion of the nucleic acid contained in the viral-derived construct plasmid is integrated into the chromosome of the producer cell.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure includes a segment (LTR in retrovirus, ITR in AAV, etc.) for excision of the onboard nucleic acid of the source virus of the virus-derived construct to be produced, and in one embodiment, , containing the desired gene between this segment.
  • the virus-derived construct plasmids of the present disclosure contain between this segment the desired gene and a promoter and/or terminator operably linked thereto (e.g. including those that are).
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure does not contain genes necessary for replication of the virus from which the virus-derived construct originates between this segment.
  • a virus-derived construct plasmid of the present disclosure contains the packaging signal of the virus from which the virus-derived construct is produced.
  • the virus-derived constructs produced have structural proteins (such as capsids), which may be involved in binding to tissues or cells. Therefore, targeting of virus-derived constructs to tissues or cells can be adjusted by modifying the structural proteins to alter their binding properties to tissues or cells (or their surface structures).
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure may have a gene encoding a structural protein, and the structural protein may be modified.
  • modifications of structural proteins that modulate tissue or cell targeting may include other proteins, such as other viral capsids (e.g., capsids of other serotypes of viruses, VSV-G), antigen-binding regions of antibodies, substitution or fusion with a ligand protein (ligand for a cancer antigen, etc.).
  • Enveloped virus-derived constructs may also include cell membrane components of the producer cell in the envelope. Therefore, by modifying the cell membrane components of producer cells, targeting of enveloped virus-derived constructs to tissues or cells can be adjusted.
  • non-viral-derived materials such as lipid particles can be used to modulate targeting to cells.
  • the virus-derived constructs are derived from neural cells (such as cells of the peripheral or central nervous system, brain cells such as neurons and oligodendrocytes), lung cells, ocular cells (retinal cells, retinal pigment epithelium, corneal cells), epithelial cells (e.g. intestinal or respiratory epithelial cells), muscle cells (e.g.
  • skeletal muscle cells cardiomyocytes, smooth muscle cells, diaphragm muscle cells), dendritic cells, pancreatic cells (such as islet cells) ), designed to target liver cells, cardiomyocytes, bone cells (e.g., bone marrow stem cells), hematopoietic stem cells, spleen cells, keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells, prostate cells, germ cells, cancer cells, etc.
  • Surface structures such as receptors
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure may contain a gene encoding a protein that is an attenuated protein of the source virus of the virus-derived construct to be produced.
  • Virus-derived construct plasmids of the present disclosure can include genes encoding any known attenuated viral proteins.
  • the present disclosure provides a plasmid-containing composition comprising a population of virus-derived construct plasmids of the present disclosure.
  • the plasmid-containing composition has a CCC (covalently closed circular) purity of the plasmid of about 60% or more, about 70% or more, about 75% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more. % or more or about 95% or more.
  • the virus-derived construct plasmid of the present disclosure, the virus-derived construct plasmid library of the present disclosure, and the composition containing the virus-derived construct plasmid of the present disclosure produced by the method of the present disclosure cannot be completely analyzed in terms of plasmid three-dimensional structure, base modification, etc.
  • the feature that they are produced by the method of the present disclosure is one of the features that appropriately expresses the virus-derived construct plasmid, the virus-derived construct plasmid library, and the composition containing the virus-derived construct plasmid of the present disclosure. .
  • Adenovirus is a virus of the genus Mastadenovirus of the Adenoviridae family, and the virus particle is composed of a nucleocapsid and a double-stranded linear DNA genome, and has a regular icosahedral structure of 90 to 100 nm.
  • Adenovirus infection is initiated by adsorption of the virus capsid to the coxackie-adenovirus receptor (CAR) on the cell surface, and then the virus can enter the cell via integrins on the cell surface. Subsequently, the viral genome that escapes from the lysosome can reach the nucleus and result in replication of the viral genome.
  • CAR coxackie-adenovirus receptor
  • Viral replication is initiated by first expressing the E1A protein and activating the expression of other early proteins E1B, E2, E3, and E4.
  • the terminal protein (TP) expressed from E2 is covalently bound to deoxycytidine, and a complex is formed in which a polymerase is further bound to this, and replication is initiated.
  • the genome also contains five late transcription units (L1) that encode structural proteins, including pentons (L2), hexons (L3), scaffold proteins (L4), and fiber proteins (L5), and are under the control of a single promoter. , L2, L3, L4, and L5). Both ends of the genome contain inverted terminal repeats (ITRs) necessary for viral replication.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • Adenovirus particles After the structural proteins of the virus are translated in the cytoplasm, they translocate into the nucleus and form virus particles, where they recognize the packaging signal ( ⁇ ) of the viral genome and package the genome.
  • Adenoviruses also produce non-protein-coding VA RNA, which is encoded by the VA gene.
  • Adenovirus particles may have L2 and L3 capsids.
  • subgroup A e.g., serotypes 12, 18, and 31
  • B e.g., serotypes 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, and 50
  • subgroup C e.g., serotypes 1, 2, 5, and 6
  • subgroup D e.g., serotypes 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39 and 42-48
  • subgroup E e.g. serotype 4
  • subgroup F e.g. serotypes 40 and 41
  • unclassified serogroups eg, serotypes 49 and 51.
  • the adenovirus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the adenovirus-derived construct and the desired gene. In one embodiment, the adenovirus-derived construct plasmid contains the desired gene between the 5'ITR and 3'ITR. In one embodiment, the adenovirus-derived construct plasmid contains the desired gene, promoter and terminator between the 5'ITR and 3'ITR. In one embodiment, the adenovirus-derived construct plasmid does not contain one or more (e.g., all) of the nucleic acid sequences necessary to construct the adenovirus-derived construct between the 5'ITR and 3'ITR. .
  • the adenovirus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the adenovirus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the nucleic acid sequences necessary to construct the adenovirus-derived construct that are not included in the virus-derived construct plasmid are encoded in the chromosome of the producer cell. You can leave it there.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the adenovirus-derived construct include genes encoding E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4, L5, IX, IVa2. may include.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the adenovirus-derived construct can be all genes of the adenovirus except E3.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the adenovirus-derived construct include nucleic acid sequences encoding structural proteins (L2, L3) and nucleic acid sequences encoding packaging factors (E1A, E1B, E2A, E2B, E4), two terminal repeat sequences (5'ITR, 3'ITR), and a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • the nucleic acid sequence encoding the functional cofactor can be any adenoviral gene except L2, L3, E1A, E1B, E2A, E3, E2B, E4, 5'ITR, 3'ITR.
  • the adenovirus-derived construct plasmid may be free of one or more of VA, E1A, E1B, E2A, E2B, E4; The nucleic acid sequences necessary to do so include these. In certain embodiments, the adenovirus-derived construct plasmid does not include E1A and E1B. In one embodiment, the adenovirus-derived construct plasmid lacks E1A, and a desired gene may be inserted into this defective site.
  • VA RNA is known to interact with exportin, RISK, Dicer, etc. in humans, and by deleting VA from an adenovirus-derived construct plasmid, side effects on adenovirus-derived construct-infected cells can be reduced. Since E1A, E1B, E2A, E2B, and E4 may be genes necessary for adenovirus replication, an adenovirus-derived construct plasmid in which these genes are deleted may have reduced replication ability in infected cells.
  • the adenovirus-derived constructs of the present disclosure may be from human subgroup C, eg, serotype 2 or serotype 5.
  • the adenovirus-derived constructs of the present disclosure include serotype 12 (subgroup A), serotype 7 or serotype 35 (subgroup B), serotype 30 or serotype 36 (subgroup D), serotype It may be derived from type 4 (subgroup E) or serotype 41 (subgroup F).
  • Producer cells for producing adenovirus-derived constructs include cells such as HEK293, HEK293T, HEK293F, Hela, Sf9, and the like.
  • Adeno-associated virus is a linear single-stranded DNA virus of the Dependovirus genus of the Parvoviridae family, and the virus particles have a diameter of 20 to 26 nm.
  • Adenoviral elements are required for AAV replication.
  • a T-shaped hairpin structure called ITR inverted terminal repeat
  • ITR inverted terminal repeat
  • the left half of the genome contains the rep genes, which encode non-structural proteins, namely regulatory proteins that control replication and transcription (Rep78, Rep76, Rep52, Rep40), and the right half of the genome contains the genes that encode structural proteins (VP1, VP2, VP3).
  • rep genes which encode non-structural proteins, namely regulatory proteins that control replication and transcription (Rep78, Rep76, Rep52, Rep40)
  • structural proteins VP1, VP2, VP3
  • the life cycle of AAV is divided into latent infection and lytic infection.
  • the former is a case of infection alone, and is characterized by integration into the AAVS1 region (19q13.3-qter) of the long arm of chromosome 19 of the host cell. This integration is due to non-homologous recombination and involves Rep. It has been reported that Rep78/Rep76 binds to a base sequence (GAGC repeat sequence) that is present in common in the AAVS1 region and the Rep binding region of ITR. Therefore, when wild-type AAV infects a target cell, Rep binds to AAV ITR and AAVS1, and site-specific integration of the AAV genome into chromosome 19 is thought to occur through Rep's intervention.
  • helper virus such as an adenovirus
  • AAV replication occurs when a cell that is latently infected with AAV is further superinfected with the helper virus, and a large amount of virus is released due to cell destruction (lytic infection).
  • the AAV-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the AAV-derived construct and the desired gene. In one embodiment, the AAV-derived construct plasmid contains the desired gene between the 5'ITR and 3'ITR. In one embodiment, the AAV-derived construct plasmid contains the desired gene, promoter and terminator between the 5'ITR and 3'ITR. In one embodiment, the AAV-derived construct plasmid does not include one or more (eg, all) of the necessary nucleic acid sequences to constitute the AAV-derived construct between the 5'ITR and 3'ITR.
  • the AAV-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the AAV-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the nucleic acid sequences necessary to construct the AAV-derived construct that are not included in the virus-derived construct plasmid are encoded in the chromosome of the producer cell. You can.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the AAV-derived construct include the AAV 5'ITR, rep, cap, AAP (assembly activating protein), MAAP (membrane associated accessory protein) and 3'ITR, and adenovirus E1A, E1B, E2A, VA and E4.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the AAV-derived construct include a nucleic acid sequence encoding an AAV structural protein (cap), a nucleic acid sequence encoding an AAV packaging factor (rep), and a nucleic acid sequence encoding an AAV packaging factor (rep).
  • the AAV-derived construct plasmid may be free of one or more of rep, cap, VA, E1A, E1B, E2A, E4; Nucleic acid sequences necessary for the construction include these.
  • AAV has been reported to have serotypes 1 to 12 based on its capsid. Also, rh10, DJ, DJ/8, PHP. eB, PHP. S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh. 74, AAV2.5, AAV-TT, and Anc80 serotypes have also been reported.
  • the AAV-derived constructs of the present disclosure may be made based on the appropriate serotype of AAV depending on the target tissue.
  • the (serotype): (target tissue) relationship may be selected as follows; (AAV1): (muscle, liver, airways, nerve cells), (AAV2): (muscle, liver, nerve cells).
  • AAV3 (muscle, liver, nerve cells), (AAV4): (muscle, ventricular ependymal cells), (AAV5): (muscle, liver, nerve cells, glial cells, airways), (AAV6): (muscles, liver, airways, nerve cells), (AAV7): (muscles, liver), (AAV8): (muscles, liver), (AAV9): (muscles, liver, airways).
  • Producer cells for producing AAV-derived constructs include cells such as HEK293, HEK293T, HEK293F, Hela, Sf9, and the like.
  • AAV capsids include capsids with targeted mutations (AAV2i8, AAV2.5, AAV-TT, AAV9.HR, etc.), capsids with random mutations (AAV-PHP.B, etc.), In silico designed capsids (such as Anc80) are included; in one embodiment, the AAV-derived constructs of the present disclosure may include these modified capsids, and the AAV-derived construct plasmids of the present disclosure encode these modified capsids. It may be constructed as follows.
  • nucleic acid sequence when a nucleic acid sequence is described as being derived from a particular serotype, the nucleic acid sequence may encode a wild-type capsid or may be based on a wild-type capsid with the above-mentioned modifications. It is contemplated that it may encode a capsid.
  • Retrovirus generally refers to a virus of the Retroviridae family. Retroviruses are double-stranded RNA enveloped viruses primarily characterized by the ability to reverse transcribe the genome from RNA to DNA. Virions are approximately 100-120 nm in length and contain a dimeric genome of identical positive RNA strands in complex with nucleocapsid proteins. The genome is enclosed in a capsid that contains the enzyme proteins necessary for viral infection: reverse transcriptase, integrase and protease. Matrix proteins form the outer layer of the capsid core that interacts with the envelope, a lipid bilayer derived from the host cell membrane, that surrounds the viral core particle.
  • This bilayer has immobilized viral envelope glycoproteins that recognize specific receptors on host cells and initiate the infection process.
  • Envelope proteins are formed by two subunits: the transmembrane (TM), which anchors the protein within the lipid membrane, and the surface (SU), which binds to cell receptors.
  • TM transmembrane
  • SU surface
  • Retroviruses include murine leukemia virus (MLV), human immunodeficiency virus (HIV), equine infectious anemia virus (EIAV), murine mammary tumor virus (MMTV), Rous sarcoma virus (RSV), Fujinami sarcoma virus (FuSV), Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV), FBR murine osteosarcoma virus (FBR MSV), Moloney murine sarcoma virus (Mo-MSV), Abelson murine leukemia virus (A-MLV), avian myelocytomatosis virus 29 (MC29) , and avian erythroblastosis virus (AEV), and lentiviruses.
  • MMV murine leukemia virus
  • HBV human immunodeficiency virus
  • EIAV equine infectious anemia virus
  • MMTV murine mammary tumor virus
  • RSV Rous sarcoma virus
  • FuSV Fujinami sarcom
  • Lentiviruses can be divided into “primate” and "non-primate”.
  • primate lentiviruses include human immunodeficiency virus (HIV), the causative agent of human acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), and simian immunodeficiency virus (SIV).
  • the group of non-primate lentiviruses includes the prototype "late-onset virus” Visna/Maedi virus (VMV), as well as the related caprine arthritis encephalitis virus (CAEV), equine infectious anemia virus (EIAV), and more recently Feline immunodeficiency virus (FIV), which was previously described, and bovine immunodeficiency virus (BIV).
  • retroviruses first attach to specific cell surface receptors. Upon entry into a susceptible host cell, the retroviral RNA genome is copied into DNA by reverse transcriptase. This DNA is transported into the host cell nucleus and then integrated into the host genome, a condition called provirus.
  • Proviruses are stable in host chromosomes during cell division and are transcribed like other cellular proteins. Proviruses encode the proteins and packaging machinery needed to make more viruses and can bud and leave the cell. When retroviruses bud from the host cell, they contain the host cell lipid membrane. In this way, host cell-derived membrane proteins become part of the retroviral particle.
  • the retrovirus genome contains four genes: gag (group-specific antigen), pro (protease), pol (polymerase), and env (envelope).
  • gag sequence encodes three major structural proteins: matrix protein, nucleocapsid protein, and capsid protein.
  • the pro sequence encodes a protease responsible for cleaving Gag and Gag-Pol during particle assembly, budding and maturation.
  • the pol sequences encode the enzymes reverse transcriptase and integrase, the former catalyzing the reverse transcription of the viral genome from RNA to DNA during the infection process, and the latter processing the LTR and transferring proviral DNA to the host. It plays a role in integrating into the cell genome.
  • the env sequence encodes both the SU and TM subunits of the envelope glycoprotein.
  • SU surface component
  • TM membrane-anchored transmembrane moiety
  • PPTs polypurine tracts
  • Examples include gender sequences.
  • the long terminal repeat (LTR) is approximately 600 nt long, of which the U3 region is 450 nt long, the R sequence is 100 nt long, and the U5 region is approximately 70 nt long.
  • the genomes of complex retroviruses can contain, in addition to gag, pro, pol, and env, accessory genes that regulate viral gene expression, assembly of infectious particles, and modulate viral replication in infected cells.
  • a typical lentivirus is HIV-1.
  • Lentiviruses may contain two control genes, tat and rev.
  • HIV-1 further includes vif, vpr, vpu and nef.
  • accessory genes such as vpx. These accessory genes are involved in the control of viral RNA synthesis and processing and other replication functions.
  • HIV also includes other structural landmarks (TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, INS), etc.
  • Lentiviral particles may contain the p24 capsid protein.
  • the retrovirus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the retrovirus-derived construct and the desired gene. In one embodiment, the retrovirus-derived construct plasmid contains the desired gene between the 5'LTR and 3'LTR. In one embodiment, the retrovirus-derived construct plasmid may include a primer binding site (PBS) and/or a polypurine tract (PPT) between the 5' LTR and the desired gene. In one embodiment, the retrovirus-derived construct plasmid may include a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) between the desired gene and the 3'LTR.
  • PBS primer binding site
  • PPT polypurine tract
  • WPRE woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element
  • the retrovirus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the retrovirus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the nucleic acid sequences necessary to construct the retrovirus-derived construct that are not included in the virus-derived construct plasmid are encoded in the chromosome of the producer cell. You can leave it there.
  • env may be replaced with the gene encoding VSV-G (vesicular stomatitis virus (VSV) glycoprotein G) during construction of the retrovirus-derived construct.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus
  • the retrovirus-derived construct (including lentivirus) plasmid may additionally contain the VSV-G gene.
  • the rabies virus glycoprotein gene (RV-G) or the intracellular A fusion glycoprotein (FuG-B) in which the domains are replaced with those of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) may be used, and retrovirus-derived constructs (including lentiviruses) plasmids may carry these genes. May include.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the retrovirus-derived construct include a nucleic acid sequence encoding a structural protein (gag), a packaging factor ( ⁇ ), and two terminal repeat sequences (5'LTR). , 3'LTR) and a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • the nucleic acid sequences encoding functional cofactors can be pro, pol, and env.
  • the retrovirus-derived construct plasmid may be free of one or more of gag, pro, pol, env, and in one embodiment, the components necessary to construct the retrovirus-derived construct. Nucleic acid sequences include these.
  • a retrovirus-derived construct plasmid in which pol is deleted may have a reduced ability to replicate in infected cells.
  • the retrovirus-derived construct plasmid does not contain one or more (e.g., all) of the nucleic acid sequences necessary to constitute the retrovirus-derived construct between the 5'LTR and 3'LTR. .
  • the retrovirus-derived construct plasmid contains the desired gene between the 5'LTR and 3'LTR.
  • the retrovirus-derived construct plasmid contains the desired gene, promoter, and terminator between the 5'LTR and 3'LTR.
  • the retrovirus-derived construct plasmid may be modified so that the U3 region of the LTR is deleted.
  • Producer cells for producing retrovirus-derived constructs include cells such as HEK293T.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the lentivirus-derived construct include nucleic acid sequences encoding structural proteins (gag, pol, VSV-G, env) and packaging factors (packaging signal ( ⁇ )). ) sequence), two terminal repeat sequences (5'LTR, 3'LTR), and a nucleic acid sequence encoding a functional cofactor.
  • the nucleic acid sequence encoding the functional cofactor can be rev.
  • the lentivirus-derived construct plasmid may be free of one or more of rev, gag, pro, pol, env; The necessary nucleic acid sequences include these.
  • a lentivirus-derived construct plasmid in which these are deleted may have a reduced ability to replicate in infected cells.
  • the lentivirus-derived construct plasmids include tat, vif, vpr, vpu, nef, vpx, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, INS, APP, MAAP, RPE, PPT, PRE, WRPE, oPRE. may include one or more of the following.
  • the lentivirus-derived construct plasmid does not include one or more (e.g., all) of the nucleic acid sequences necessary to constitute the lentivirus-derived construct between the 5'LTR and 3'LTR. .
  • the lentivirus-derived construct plasmid contains the desired gene between the 5'LTR and 3'LTR.
  • the lentivirus-derived construct plasmid contains the desired gene, promoter, terminator, and WPRE between the 5'LTR and 3'LTR.
  • the lentivirus-derived construct plasmid may be modified to lack the U3 region of LTR, TAT.
  • the retrovirus-derived construct plasmid may be modified so that the U3 region of the LTR is deleted.
  • Producer cells for producing lentivirus-derived constructs include cells such as HEK293T, HEK293, Hela, and the like.
  • Herpes simplex virus is a virus of the family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, and genus Simplexvirus. HSV particles have a diameter of about 100 nm and have a structure in which an icosahedral capsid is covered with an envelope. A linear double-stranded DNA of approximately 150 kbp is packaged inside the capsid, and the viral DNA genome encodes at least 74 types of viral proteins. The genes encoding these viral proteins are classified into three groups ( ⁇ , ⁇ , and ⁇ ) depending on the time of expression, and the expression of each group is regulated in a cascade.
  • the ⁇ gene group includes ⁇ 0, ⁇ 4, ⁇ 22, ⁇ 27, and ⁇ 47, and ⁇ 0, ⁇ 4, ⁇ 22, and ⁇ 27 encode proteins that control the expression of other viral genes. When the ⁇ genes are expressed, these gene products activate the expression of the ⁇ genes.
  • the ⁇ gene group mainly encodes proteins essential for viral DNA replication, such as the DNA polymerase complex and DNA primase/helicase complex, and enzymes involved in deoxyribonucleotide metabolism, such as thymidine kinase (TK) and ribonucleotide reductase. .
  • TK thymidine kinase
  • ribonucleotide reductase ribonucleotide reductase.
  • LAT latency associated transcript
  • LAP latency active promoter
  • HSV-derived constructs have a wide host range and can infect and proliferate in most cultured cells, (2) they can infect both dividing and non-dividing cells, and (3) they do not contain foreign genes. (4) Since it has its own TK, the antiviral drugs acyclovir and ganciclovir are effective, and even if unexpected proliferation occurs, it can be treated. (5) It exists stably as an episome within nerve cells, and depending on the promoter, gene expression can be sustained for a long period of time. (6) It exhibits pathogenicity in mice similar to that in humans, and can be used as a model animal. Also, strong cytotoxicity may be beneficial for tumor treatment.
  • the HSV-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the HSV-derived construct and the desired gene. In one embodiment, the HSV-derived construct plasmid contains a DNA origin of replication (ori) upstream of the desired gene. In one embodiment, the HSV-derived construct plasmid may include a LAP (e.g., between the ori and the desired gene) to allow long-term expression of the introduced gene in the host cell of the HSV-derived construct. . In one embodiment, the HSV-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the HSV-derived construct.
  • a LAP e.g., between the ori and the desired gene
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the HSV-derived construct are included in the virus-derived construct plasmid. and can be supplied in trans in a producer cell.
  • genes not included in the virus-derived construct plasmid may be encoded in the chromosome of the producer cell, or may be encoded in another nucleic acid molecule (e.g., a plasmid) introduced into the producer cell, Gene products of genes not contained in virus-derived construct plasmids (which may be in the form of virus particles) may be introduced into producer cells.
  • the nucleic acid molecule separate from the virus-derived construct plasmid of the present disclosure that is introduced into the producer cell may be deficient in one or more of a pac and a DNA origin of replication (ori). , it can be avoided that the onboard nucleic acid contains nucleic acids derived from this nucleic acid.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the HSV-derived construct can be all genes of HSV.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the HSV-derived construct may include genes encoding UL9, UL19, UL26, UL35, US6, US7, US11.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the HSV-derived construct can be all genes of HSV except one or more of ⁇ 0, ⁇ 22, ⁇ 47.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the HSV-derived construct can be all genes of HSV except ⁇ 22.
  • the HSV-derived construct plasmid may be free of one or more of ⁇ 0, ⁇ 4, ⁇ 22, ⁇ 27, ⁇ 47, which in one embodiment is required to construct the HSV-derived construct. Nucleic acid sequences include these.
  • the HSV-derived construct plasmid is deficient in one or both of the ⁇ 4 and ⁇ 27 genes.
  • the HSV-derived construct plasmid is deficient in ICP6.
  • the HSV-derived construct plasmid is deficient in ⁇ 4, ⁇ 22 and ⁇ 27.
  • the HSV-derived construct can be modified to be attenuated.
  • the HSV-derived construct plasmid is modified to lack one or more of thymidine kinase (TK), ribonucleotide reductase (RR), deoxyuridine triphosphatase (dUTPase), ⁇ 34.5. can be done.
  • the HSV-derived construct plasmid can be modified to introduce a gene encoding a cytokine (such as an immune activating cytokine) at the site of the ⁇ 34.5 deletion.
  • an HSV-derived construct deficient in these genes can be obtained by allowing a producer cell containing an HSV-derived construct plasmid deficient in these genes to produce the HSV-derived construct without supplying these genes.
  • TK can be highly expressed in cancer cells, so a TK-deficient HSV-derived construct can function selectively in cancer cells.
  • Producer cells for producing HSV-derived constructs include cells such as Hela and Vero.
  • Sendai virus is a negative-strand RNA virus classified into the family Paramyxoviridae and the genus Respirovirus. Sendai virus can also infect nondividing cells, including neurons. After Sendai virus infection, the viral genome is not integrated into the chromosome of the host cell and remains in the cytoplasm in the form of RNA.
  • genes encoding Sendai virus proteins include the N, P, M, F, HN, and L genes.
  • the N, P, M, F, HN and L genes encode nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemagglutinin neuraminidase and large proteins, respectively.
  • the wild-type Sendai virus genome contains a short 3' leader region (LE) followed by N (nucleocapsid protein), P (phosphoprotein), M (matrix protein), F (fusion protein), HN
  • Six genes encoding (hemagglutinin neuraminidase) and L (large protein) are lined up, and a short 5' trailer region (TR) exists at the other end.
  • Accessory proteins called C and V are also translated from the P gene region.
  • Sendai virus expresses genes by both tubulin and Sendai virus RNA polymerase (L protein) in the host cell cytoplasm. Sendai virus does not interact with host cell genomes and is not pathogenic to humans. These characteristics of Sendai virus suggest the safety of Sendai virus-derived constructs for humans.
  • the M, F, and HN proteins may be responsible for Sendai virus virion formation and viral infection.
  • the N, P and L proteins may be responsible for the expression and replication of the viral genome.
  • the nucleic acid transcribed from the Sendai virus-derived construct plasmid in the producer cell becomes the loading nucleic acid of the Sendai virus-derived construct. Therefore, the following characteristics regarding the Sendai virus-derived construct plasmid may also be characteristics of the carrying nucleic acid of the Sendai virus-derived construct.
  • the Sendai virus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the Sendai virus-derived construct and a desired gene.
  • the desired gene may be located upstream and/or downstream of any of the Sendai virus genes (N, P, M, F, HN and L genes).
  • the Sendai virus-derived construct plasmid can contain an EIS sequence (transcription termination (E) sequence - intervening (I) sequence - transcription initiation (S) sequence) upstream or downstream of the desired gene, By doing so, expression of genes upstream or downstream of the desired gene can be promoted.
  • EIS sequence transcription termination (E) sequence - intervening (I) sequence - transcription initiation (S) sequence
  • the Sendai virus-derived construct plasmid can be modified to insert a sequence having a multiple of 6 bases (eg, a sequence containing the desired gene).
  • the Sendai virus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the Sendai virus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the Sendai virus-derived construct are included in the virus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the Sendai virus-derived construct can be all genes of Sendai virus.
  • the Sendai virus-derived construct plasmid contains the necessary nucleic acid sequences to constitute the Sendai virus-derived construct between the LE and the TR.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the Sendai virus-derived construct may include the N, P, V, C, M, F, HN, and L genes.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct a Sendai virus-derived construct can be all genes of Sendai virus except one or more of M, F, and HN.
  • the loaded nucleic acid may lose transmissibility in the host.
  • the Sendai virus-derived construct plasmid may be free of one or more of M, F, and HN; The array includes these.
  • the Sendai virus-derived construct plasmid may include a gene encoding bacteriophage T7 RNA polymerase.
  • the Sendai virus-derived construct plasmid may include the self-cleaving ribozyme Rbz.
  • the Sendai virus gene may be modified to reduce the antigenicity of the Sendai virus protein or to increase the efficiency of RNA transcription and replication.
  • one or more of the replication factors N, P, and L genes may be modified to enhance transcription or replication function.
  • the structural protein HN protein may be modified so that hemagglutinin activity and/or neuraminidase activity may be altered, reducing the stability of the virus in the blood. and changes in neuraminidase activity may alter the infectivity of the virus.
  • the F protein involved in membrane fusion may be modified.
  • modification may be made to delete the V gene, which is an accessory gene.
  • Producer cells for producing Sendai virus-derived constructs include cells such as BHK/T7.
  • Measles virus is an RNA virus classified into the genus Morbillivirus in the family Paramyxoviridae. Measles virus, like Sendai virus, has N, P, M, F, H and L genes.
  • the measles virus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the measles virus-derived construct and the desired gene.
  • the desired gene may be located upstream and/or downstream of any measles virus gene.
  • the measles virus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the measles virus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the measles virus-derived construct are included in the virus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct a measles virus-derived construct can be all genes of measles virus.
  • alphavirus refers to a virus of the Togaviridae family, Alphavirus genus.
  • Alphaviruses are enveloped RNA viruses that proliferate in the cytoplasm without passing through a DNA intermediate and can infect various cells via laminin receptors and the like.
  • the alphavirus genome is a single-stranded messenger sense RNA modified at the 5' end with a methylated cap and at the 3' end with poly(A) strands of various lengths.
  • Virus particles have a structure that contains the RNA genome in an icosahedral nucleocapsid.
  • the alphavirus genome contains genes encoding the nonstructural proteins nsp1, nsp2, nsp3, and nsp4, and genes encoding the structural proteins capsid (C) protein, E1 glycoprotein, and E2 glycoprotein.
  • Alphaviruses include Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus, Semliki Forest virus (SFV), Sindbis virus, Ross River virus, Western equine encephalitis virus, Eastern equine encephalitis virus, Chikungunya virus, S. A.
  • AR86 Everglade Virus, Mukambo Virus, Barma Forest Virus, Middelburg Virus, Pixna Virus, Onyonnyon Virus, Geta Virus, Sagiyama Virus, Bebal Virus, Mayaro Virus, Una Virus, Aura Virus , Whataroa virus, Babanky virus, Kijiragatche virus, Highland J virus, Fort Morgan virus, Nujumu virus, Buggy Clark virus, etc.
  • the alphavirus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the alphavirus-derived construct and the desired gene.
  • the desired gene may be placed between any of nsp1, nsp2, nsp3, and nsp4.
  • the alphavirus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the alphavirus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the alphavirus-derived construct are included in the alphavirus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • genes not included in the virus-derived construct plasmid may be encoded in the chromosome of the producer cell, or may be encoded in another nucleic acid molecule (e.g., a plasmid) introduced into the producer cell, Gene products of genes not contained in virus-derived construct plasmids (which may be in the form of virus particles) may be introduced into producer cells.
  • the nucleic acid molecule separate from the disclosed virus-derived construct plasmid that is introduced into the producer cell comprises one or more of a 5' alphavirus replication recognition sequence and a 3' alphavirus replication recognition sequence. It may be deleted, and it may be avoided that the loaded nucleic acid contains nucleic acids derived from this nucleic acid.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the alphavirus-derived construct can be all genes of the alphavirus.
  • the alphavirus-derived construct plasmid comprises one or more of the alphavirus genes other than the 5' alphavirus replication recognition sequence, nsp1, nsp2, nsp3, nsp4, and the 3' alphavirus replication recognition sequence.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the alphavirus-derived construct include these.
  • Rabies virus is a negative-strand single-stranded RNA virus of the Rhabdoviridae family, genus Lyssavirus, and the virus particles are cylindrical, bullet-shaped.
  • the cylinder has a length of about 180 nm and a diameter of about 75 nm. It has five genes encoding L (large protein), G (glycoprotein), N (nucleoprotein), P (phosphoprotein), and M (matrix protein). Among these, G protein may be associated with infectivity.
  • the genes are arranged in the order of N, P, M, G, and L starting from the leader site. The expression level of a gene closer to the Leader site may increase.
  • the rabies virus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the rabies virus-derived construct and the desired gene.
  • the desired gene may be located upstream and/or downstream of any of the N, P, M, G, L genes.
  • the rabies virus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the rabies virus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the rabies virus-derived construct are included in the virus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the rabies virus-derived construct can be all genes of the rabies virus.
  • the rabies virus derived construct plasmid may be free of one or more of N, P, M, G, L.
  • VSV Vesicular stomatitis virus
  • VSV is an RNA virus of the genus Vesiculovirus in the family Rhabdoviridae, and has a negative single-stranded RNA genome consisting of approximately 11 kb.
  • Vesicular stomatitis virus (VSV) like rabies virus, contains five genes encoding L (large protein), G (glycoprotein), N (nucleoprotein), P (phosphoprotein), and M (matrix protein). have
  • the VSV-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the VSV-derived construct and the desired gene.
  • the desired gene may be located upstream and/or downstream of any of the N, P, M, G, L genes.
  • the VSV-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the VSV-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the VSV-derived construct are included in the virus-derived construct plasmid. and can be supplied in trans in a producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct a VSV-derived construct can be all genes of VSV.
  • the VSV-derived construct plasmid may be free of one or more of N, P, M, G, L.
  • Virus particles of coronavirus (CoV) family viruses exhibit a circular (spherical) shape with a diameter of approximately 80 to 100 nm, and the envelope surrounding the nucleocapsid contains spike (S) protein and integral membrane (M) protein. ) protein and envelope (E) protein.
  • the CoV genome contains genes that are approximately 30 kb (+) strand RNA and encode non-structural proteins 1a and 1b from the 5' side, as well as downstream structural genes S, E, M, and N genes. However, there are also genes for several nonstructural proteins in the region immediately below the S gene.
  • the coronavirus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the coronavirus-derived construct and the desired gene. In one embodiment, the coronavirus-derived construct plasmid contains the desired gene between the 5'ITR and 3'ITR. In one embodiment, the coronavirus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the coronavirus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the coronavirus-derived construct are included in the virus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the coronavirus-derived construct can be all genes of the coronavirus.
  • the coronavirus-derived construct plasmid may be free of one or more of the coronavirus genes other than 1a, 1b; The necessary nucleic acid sequences include these.
  • Influenza virus is an enveloped virus with a negative-strand RNA genome belonging to the Orthomyxoviridae family.
  • the genome of influenza A virus is segmented into eight segments, which encode 11 types of proteins (PB1, PB2, PA, HA, NA, M1, M2, NS1, NS2/NEP, and NP). Both ends of the 5' untranslated region, 3' untranslated region, and translated region of influenza virus RNA can be packaging sequences.
  • the influenza virus-derived construct plasmid comprises the 5' end of the untranslated region of the segmented influenza virus RNA, the 5' end of the translated region, the desired gene, the 3' end of the translated region, and the 3' end of the segmented influenza virus RNA. May contain untranslated regions.
  • the influenza virus gene may be removed or maintained.
  • the retrovirus-derived construct plasmid may contain the nucleic acid sequences necessary to construct an influenza virus.
  • the nucleic acid sequences necessary to constitute an influenza virus may be PB1, PB2, PA, HA, NA, M1, M2, NS1, NS2/NEP and NP.
  • influenza virus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the influenza virus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the influenza virus-derived construct are included in the virus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • Vaccinia virus is an enveloped virus that belongs to the Poxviridae family and has a linear double-stranded DNA genome of about 190 Kbp. Vaccinia virus replicates only in the cytoplasm of host cells. During viral DNA replication, vaccinia virus separates into several infectious forms that differ in their outer membranes: intracellular mature virions (IMVs), intracellular enveloped virions (IEVs), cell-associated enveloped virions (CEVs), and extracellular enveloped virions ( EEV).
  • IMVs intracellular mature virions
  • IEVs intracellular enveloped virions
  • CEVs cell-associated enveloped virions
  • EEV extracellular enveloped virions
  • the vaccinia virus-derived construct plasmid contains the necessary nucleic acid sequences and desired genes to construct the vaccinia virus-derived construct.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the vaccinia virus-derived construct may encode the D1R, D2L, D3R, D4R, D5R, D6R, D7R, D8L, D11L, D13L genes.
  • the vaccinia virus-derived construct plasmid may be deleted in the gene encoding thymidine kinase.
  • a vaccinia virus-derived construct can be made by introducing a virus-derived construct plasmid into a producer cell infected with vaccinia virus and allowing homologous recombination to occur within the cell.
  • the vaccinia virus-derived construct plasmid used in this embodiment contains the desired gene and a nucleic acid sequence with homology to any region of the vaccinia virus genome.
  • the vaccinia virus-derived construct plasmid may contain the desired genes between the vaccinia virus genome and any of the vaccinia virus genes.
  • Viruses of the Reoviridae family have icosahedral virions with a diameter of approximately 60 to 80 nm, a genome of 10 to 12 linear double-stranded RNAs, and an enveloped virion. It is an RNA virus.
  • Viruses of the Reoviridae family include rotavirus and mammalian orthoreovirus (MRV). MRV has four serotypes: MRV-1, MRV-2, MRV -3, classified as MRV-4 type.
  • the 10 segmented dsRNA genome contains eight structural proteins: ⁇ 1 (L3 gene), ⁇ 2 (L2 gene), ⁇ 3 (L1 gene), ⁇ 1 (M2 gene), ⁇ 2 (M1 gene), ⁇ 1 (S1 gene), ⁇ 2 (S2 gene), ⁇ 3 (S4 gene) and four nonstructural proteins: ⁇ NS (M3 gene), ⁇ NSC (M3 gene), ⁇ NS (S3 gene), ⁇ 1s (S1 gene).
  • MRV is composed of a two-layered capsid, with an outer shell composed of ⁇ 1, ⁇ 3, and ⁇ 1, and an inner shell (core structure) composed of ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 2.
  • the core particle contains ⁇ 3, an RNA-dependent RNA polymerase, and ⁇ 2, a polymerase cofactor.
  • the nonstructural protein ⁇ NS plays a central role in the formation of the VF, which is a site of replication, and binds to various MRV proteins and recruits them into the VF.
  • ⁇ NSCs may not be essential for replication in cultured cells.
  • ⁇ NS interacts with ⁇ NS, has a high binding capacity for single-stranded RNA, and may be involved in the recruitment of positive-strand viral RNA into the VF.
  • ⁇ 1s is not essential for viral replication, it may be involved in pathogenesis.
  • the reovirus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the reovirus-derived construct and the desired gene.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the reovirus-derived construct may include the L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3, S4 genes.
  • the reovirus-derived construct plasmid may include L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3, S4 genes.
  • the reovirus-derived construct plasmid may not encode at least one of ⁇ NSC and ⁇ 1s.
  • the reovirus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the reovirus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the reovirus-derived construct are included in the virus-derived construct.
  • the plasmid can be supplied in trans with the producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct a reovirus-derived construct can be all genes of reovirus.
  • the reovirus-derived construct plasmid may be free of one or more of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3, S4.
  • Producer cells for producing reovirus-derived constructs include cells such as L929.
  • Coxsackievirus is a non-enveloped linear single-stranded positive-strand RNA virus that belongs to the genus Enterovirus in the Picornaviridae family.
  • Coxsackievirus which is an enterovirus, is composed of the following genes from 5' to 3': VP0 (VP4 and VP2), VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, and 3D, with the VP gene encoding the capsid. , other genes encode nonstructural proteins.
  • VP4 behaves like the amino terminus of VP2.
  • the coxsackievirus-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the coxsackievirus-derived construct and the desired gene.
  • the desired gene may be located upstream and/or downstream of any of the VP0, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D genes.
  • the coxsackievirus-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the coxsackievirus-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the coxsackievirus-derived construct are included in the virus-derived construct plasmid. and can be supplied in trans in a producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct a coxsackievirus-derived construct can be all genes of a coxsackievirus.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the coxsackievirus-derived construct can be 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D, VP1, VP2, VP3, VP4.
  • the coxsackievirus-derived construct plasmid may be free of one or more of VP0, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D.
  • Producer cells for producing coxsackievirus-derived constructs include cells such as H1299 and HeLa.
  • Newcastle disease virus is classified into the Paramyxoviridae family and is an enveloped linear minus-single-stranded RNA virus. From 3' to 5', the NDV genomic RNA contains nucleocapsid protein (NP), phosphoprotein (P), matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN), and large protein (L). Contains genes. Genomic RNA also includes a leader sequence at the 3' end. Fusion protein (F) is an integral membrane protein that is activated to promote fusion of the viral envelope with the host cell membrane. Matrix protein (M) is involved in virus assembly and interacts with the viral membrane and nucleocapsid proteins.
  • NP nucleocapsid protein
  • P phosphoprotein
  • M matrix protein
  • F fusion protein
  • HN hemagglutinin-neuraminidase
  • L large protein
  • Fusion protein is an integral membrane protein that is activated to promote fusion of the viral envelope with the host
  • Nucleocapsid protein is the major protein of the nucleocapsid and is associated with phosphoprotein (P) and large protein (L). Phosphoproteins (P) can undergo phosphorylation and participate in transcriptional regulation, methylation, phosphorylation and polyadenylation.
  • the large protein (L) gene encodes an RNA-dependent RNA polymerase and is required, along with P protein, for viral RNA synthesis.
  • the NDV-derived construct plasmid contains at least one of the nucleic acid sequences necessary to construct the NDV-derived construct and the desired gene.
  • the desired gene may be located upstream and/or downstream of any of the NP, P, M, F, HN, L genes.
  • the NDV-derived construct plasmid is configured to function in a producer cell such that the virus-derived construct plasmid and the producer cell contain the necessary nucleic acid sequences to construct the NDV-derived construct.
  • one or more (e.g., all) of the genes or gene products thereof that are not included in the virus-derived construct plasmid among the nucleic acid sequences necessary to construct the NDV-derived construct are included in the virus-derived construct plasmid. and can be supplied in trans in a producer cell.
  • the nucleic acid sequences necessary to construct the NDV-derived construct can be all genes of NDV.
  • the NDV-derived construct plasmid may be free of one or more of NP, P, M, F, HN, L.
  • the present disclosure provides a virus-derived construct-containing composition comprising a population of virus-derived constructs of the present disclosure.
  • the virus-derived construct-containing composition may have a virus-derived construct particle number to virus-derived construct genome copy number (VP/VG) of 35, 30, 25, 20, 15, 10, or 5 or less. .
  • virus-derived construct plasmids produced from packaging cells can be purified using any known method, and the present disclosure also provides virus-derived construct plasmids so purified. In one embodiment, it can be confirmed that the purified virus-derived construct plasmid has the desired nucleic acid sequence by examining the size pattern of fragments generated by restriction enzyme cleavage, PCR method, base sequencing method, etc. . In one embodiment, the virus-derived construct plasmid-containing composition prepared by the virus-derived construct plasmid production method of the present disclosure may contain a small amount of endotoxin. In one embodiment, a Bacillus subtilis is provided that includes a virus-derived construct plasmid of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition comprising a virus-derived construct plasmid or virus-derived construct described herein.
  • the virus-derived construct of the present disclosure, the virus-derived construct library, and the virus-derived construct-containing composition of the present disclosure produced by the method of the present disclosure cannot be completely analyzed or may have structural features that make it very difficult to Therefore, the feature that it was produced by the method of the present disclosure is one of the features that appropriately expresses the virus-derived construct, the virus-derived construct library, and the virus-derived construct-containing composition of the present disclosure.
  • compositions described herein can be provided in a variety of forms.
  • the composition may be in the form of, for example, an injection, a capsule, a tablet, a granule, an inhaler, or the like.
  • Aqueous solutions for injection may be stored, for example, in vials or stainless steel containers.
  • the aqueous solution for injection may also contain, for example, physiological saline, sugar (eg, trehalose), NaCl, NaOH, or the like.
  • compositions of the present disclosure include a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient can be sterile liquids such as water and oils, including, but not limited to, those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral Contains oil, sesame oil, etc. Water is the preferred carrier when the medicament is administered orally.
  • saline and aqueous dextrose are preferred carriers.
  • saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions are used as liquid carriers for injectable solutions.
  • Suitable excipients include light silicic anhydride, microcrystalline cellulose, mannitol, starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, chloride.
  • compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations, and the like.
  • the composition can also be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides.
  • Oral formulations can also include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, and the like. Examples of suitable carriers are described in E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.).
  • any liquid composition of the present disclosure is about 3, about 3.5, about 4, about 4.5, about 5, about 5.5, about 6, about 6.5, It can be about 7, about 7.5, about 8, about 8.5, about 9, about 9.5, about 10, about 10.5, about 11 or a range between any two of these values.
  • compositions of the present disclosure may be provided as a pharmaceutically acceptable salt, for example, formed with a free carboxyl group derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, etc.
  • Salts formed with free amine groups such as those derived from isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc., as well as sodium, potassium, ammonium, calcium, and ferric hydroxides. It can be a salt formed with
  • the composition can be formulated as a pharmaceutical composition adapted for human administration according to known methods. Such compositions can be administered by injection. Typically, compositions for injectable administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition can also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lidocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, e.g. in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent, lyophilized powder or water-free concentrate. It can be supplied as a product.
  • a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent, lyophilized powder or water-free concentrate. It can be supplied as a product.
  • composition is to be administered by injection, it can also be dispensed using an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. If the composition is to be administered by injection, an ampoule of sterile water or saline for injection can be provided so that the ingredients can be mixed before administration.
  • virus-derived construct plasmids or virus-derived constructs described herein, or compositions containing them can be used in a variety of applications, including gene therapy, functional genomics, cancer vaccination, and/or antiviral vaccination. can.
  • the subject When applying the virus-derived construct or virus-derived construct-containing composition of the present disclosure to a subject, the subject is not particularly limited, and may be a mammal (e.g., mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, pigs, monkeys, humans, etc.), birds, reptiles, amphibians, arthropods, fish, etc.
  • a mammal e.g., mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, pigs, monkeys, humans, etc.
  • birds reptiles, amphibians, arthropods, fish, etc.
  • the amount of a virus-derived construct or virus-derived construct-containing composition of the present disclosure will vary depending on the nature of the disorder or condition being treated or prevented, but can be determined by one of ordinary skill in the art using standard clinical techniques based on the description herein. be. In some cases, in vitro assays can also be used to help identify optimal dosage ranges.
  • the precise dose to be employed in the formulation will also vary depending on the route of administration, and the severity of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the attending physician and each patient's circumstances.
  • the dosage of the virus-derived construct or virus-derived construct-containing composition of the present disclosure is not particularly limited, but for example, 1 x 10 5 pieces, 1 x 10 6 pieces, 1 x 10 7 pieces, 1 x 10 8 pieces per dose.
  • the administration interval is not particularly limited, but for example, it may be administered once or twice every 1, 7, 14, 21, or 28 days, or once or twice within the range of any two of these values. Good too.
  • the dosage, administration interval, and administration method may be appropriately selected depending on the patient's age, weight, symptoms, target organ, etc.
  • Administration routes for the virus-derived constructs or virus-derived construct-containing compositions described herein include, for example, intravenous, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intrathecal, intraventricular, intraparenchymal, and pulmonary. , intranasal, epidural, or oral administration.
  • the compositions of the present disclosure can be used with a variety of delivery systems. Such systems include, for example, encapsulation in liposomes, microparticles, and microcapsules: the use of receptor-mediated endocytosis.
  • the medicament may be administered by any suitable route, such as by infusion, by bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (such as the oral cavity, rectum, and intestinal mucosa), and as required.
  • An inhaler or nebulizer may be used with an aerosolizing agent, and it may also be administered with other drugs. Administration can also be systemic or local.
  • the composition of the present disclosure can be provided as a kit.
  • the present disclosure provides a kit for making a virus-derived construct, the kit comprising a virus-derived construct plasmid of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a pharmaceutical pack or kit that includes one or more containers filled with one or more ingredients that can be added to the compositions of the present disclosure.
  • Manufacture, use or sale for human administration by a government agency regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products as the case may be, in the form prescribed by the agency regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products. It is also possible to indicate information indicating authorization.
  • the reagents used were the products described in the examples, but equivalent products from other manufacturers (Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemical, Nacalai, R&D Systems, USCN Life Science INC, etc.) can be substituted.
  • LB medium is prepared by dissolving 10 g of Bactotryptone, 5 g of yeast extract, and 5 g of sodium chloride in 1 L of water. When making an agar plate, add 15 g of Bacto Agar and autoclave (121°C, 20 minutes). Prepared. If necessary, carbenicillin (final concentration 100 ⁇ g/mL) or tetracycline (final concentration 10 ⁇ g/mL) was added and used.
  • TF-I medium and TF-II medium for Bacillus subtilis transformation were prepared as follows.
  • TF-I medium 500 mL was prepared by mixing and filtering, and stored at 4°C until use. Use the same medium as the TF-I medium, except use 2.5 mL of 2% casamino acids, 0.5 mL of each amino acid solution (5 mg/mL), and 435.5 mL of sterile water, and filter. A TF-II medium (500 mL) was prepared and stored at 4°C until use.
  • Bacillus subtilis transformation method Pour 2 mL of LB medium into a Falcon 14 mL test tube (2051), inoculate it with Bacillus subtilis from a glycerol stock stored at -70°C, and incubate at 37°C for 17 days while rotating in a rotary culture device. Cultured for hours. Dispense 900 ⁇ L of TF-I medium into a new 14 mL test tube (Falcon 2051), add 25 ⁇ L of 2% casamino acids, add 50 ⁇ L of preculture solution, and incubate at 37°C for 40 minutes while rotating in a rotary culture device. Cultured for hours.
  • 900 ⁇ L of TF-II medium was dispensed into a new 14 mL test tube, 100 ⁇ L of TF-I culture solution was added, and cultured at 37° C. for 1.5 hours while rotating with a rotary culture device.
  • 100 ⁇ L of TF-II culture solution was placed in a 1.5 mL centrifuge tube, and 8 ⁇ L of DNA was added.
  • 300 ⁇ L of LB medium was added, and further culturing was performed at 37° C. for 1 hour while rotating with a rotary culture device.
  • transformants were obtained by spreading on an LB medium agar plate containing 10 ⁇ g/mL of tetracycline and incubating at 37° C. overnight.
  • Centrifugation was performed at 5,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was pipetted into a new 4-screw cap 50 mL tube (Falcon 2070). 20 mL of 100% ethanol was added to each, mixed, centrifuged at 5,000 xg for 10 minutes, and the supernatant was removed. 5.4 mL of TE was added to the precipitate and completely dissolved. Next, 6.40 g of cesium chloride was added and completely dissolved. Furthermore, 2.6 mL of a 1.1 g/mL cesium chloride solution (a solution prepared by mixing 1.1 g of cesium chloride and 1 mL of water, the volume was not adjusted) was added.
  • a 1.1 g/mL cesium chloride solution a solution prepared by mixing 1.1 g of cesium chloride and 1 mL of water, the volume was not adjusted
  • Example 1 Screening using DNA barcodes from bulk transfected All-in-One library
  • All-in-One genome that serves as the seed plasmid contains the rAAV region (reporter gene surrounded by two ITR sequences), which is normally carried separately in three plasmid vectors. ), Helper region (VA, E4, E2A), and Rep/Cap region were designed to have a structure in which they were linked in this order (FIG. 1).
  • the order and direction of adjacent DNA fragments are specified by the complementarity of these overhanging parts. Therefore, the seed plasmids were designed so that the unit DNAs located at the same location had the same protruding sequence for all types of seed plasmids, as shown in FIG.
  • Some of the genes planned for use may have natural SfiI recognition sequences, but the recognition sequences on protein-encoding genes are replaced with synonymous codons, and the recognition sequences on non-coding regions such as within ITR sequences are The SfiI recognition site was deleted by changing .
  • the obtained DNA solution was measured using a micro-volume spectrophotometer (Nano drop One, Thermofisher), and diluted by adding TE buffer to 100 ng/ ⁇ L. Thereafter, the concentration was measured again, and the volume required to accurately fractionate 500 ng of DNA was calculated to two decimal places ⁇ L, and each plasmid was fractionated using a micropipette to adjust the mole of each plasmid to equimolar. The fractionated DNA solution was divided and pooled into two or three 1.5 mL centrifuge tubes depending on the type of restriction enzyme used (Table A).
  • the tube for cutting with AarI when the total volume of the plasmid solution is 1 volume, 1.94 volumes of sterile water, 0.33 volumes of 10x Buffer AarI (Thermofisher), 0.06 A volume of 50x oligonucleotide (0.025mM) and 0.17 volume of AarI (Thermofisher) were added and reacted at 37°C for 2 hours.
  • the tube for cutting with BsaI contains 2 volumes of sterile water, 0.33 volumes of 10XCutSmart buffer (NEB), and 0.17 volumes of BsaI-HF v2, when the total volume of the plasmid solution is 1 volume. was added and reacted at 37°C for 2 hours.
  • an equimolar mixture of 18 or 19 fragments of approximately 600 to 900 bp cut out from pBR-delTypeIIS-3-AarI was size-fractionated by electrophoresis using a low melting point agarose gel, and the A mixture of 18 or 19 fragments was purified according to the method for excision and purification of DNA fragments from electrophoresis gels.
  • Plasmid pGETS118-AarI (Tsuge et al., Scientific Reports, 5, 10655) was cut with the restriction enzyme AarI, size separated by low melting point agarose gel electrophoresis, and the large 15 kb fragment was removed from the gel. It was excised and purified to obtain a fragment for OGAB accumulation.
  • ⁇ Plasmid formation by OGAB method Add TE buffer solution to the obtained mixed solution of 18 to 19 types of DNA fragments (10 fmol) and the above fragment for OGAB accumulation (10 fmol) for a total of 4 ⁇ L, and add thereto. Add 5 ⁇ L of 2x ligation buffer (15% polyethylene glycol 6000, 500 mM NaCl, 132 mM Tris ⁇ HCl (pH 7.6), 13.2 mM MgCl2, 20 mM DTT, 0.2 mM ATP) to the solution, mix well, and then add 1 ⁇ L of T4 DNA Ligase (Takara Bio) was added and incubated at 37° C. for 5 hours to prepare transformation DNA ligated into tandem repeats.
  • 2x ligation buffer (15% polyethylene glycol 6000, 500 mM NaCl, 132 mM Tris ⁇ HCl (pH 7.6), 13.2 mM MgCl2, 20 mM DTT, 0.2 mM ATP
  • plasmid mass preparation method Highly pure plasmid DNA was prepared by cesium chloride-ethidium bromide density gradient ultracentrifugation. 200 mL of LB medium to which tetracycline was added at a concentration of 10 ⁇ g/mL was prepared, 100 mL of each was placed in 500 mL Erlenmeyer flasks, and the Bacillus subtilis plasmid-carrying strain was inoculated and cultured at 37° C. for 16 hours. Thereafter, IPTG was added to 1 mM and cultured for another day to increase the copy number of the plasmid, and then the plasmid was purified by ultracentrifugation.
  • DNA barcode fragment 1 nmol of chemically synthesized DNA (SEQ ID NO: 100) having a random sequence synthesized by introducing 10 consecutive N (any of A, T, G, or C bases) during synthesis.
  • 2 ⁇ L of After adding ExTaq polymerase (Takara) the mixture was denatured at 99°C for 10 minutes using a PCR device, and then reacted at 58°C for 1 minute and at 72°C for 20 minutes.
  • the reaction product was purified using MiniElute PCR Purification Kit to obtain a DNA fragment dissolved in 15 ⁇ L of TE. After adding 9 ⁇ L of water, 3 ⁇ L of 10 ⁇ CutSmart Buffer, and 3 ⁇ L of DraIII-HF and reacting at 37°C for 30 minutes, the reaction product was purified again using the MiniElute PCR Purification Kit, and the DNA dissolved in 15 ⁇ L of TE was added. Obtained barcode fragment.
  • ⁇ CombiOGAB library Mix 1 ⁇ g of 5 types of seed plasmids obtained through mass preparation, add water to 85 ⁇ L, add 10 ⁇ L of 10 ⁇ Cut Smart buffer (NEB), 5 ⁇ L of restriction enzyme SfiI, and incubate at 50°C. It reacted for 1 hour. After the reaction is complete, add 600 ⁇ L of water and 500 ⁇ L of TE-saturated phenol (Nacalai Tesque) and mix. Centrifuge at 20,000 x g for 5 minutes to separate into two phases, and transfer the aqueous phase to a new 1.5 mL tube.
  • NEB 10 ⁇ Cut Smart buffer
  • SfiI restriction enzyme
  • Plasmid DNA (plasmid derived from Bacillus subtilis) was obtained by preparing a large amount of Bacillus subtilis plasmid as described above.
  • the molecular abundance ratio of each DNA barcode was investigated using Miseq (Illumina) for the obtained DNA. Furthermore, for the ALL-in-One plasmid used for transfection, the molecular abundance ratio of each DNA barcode was determined in the same manner, and the transfection ratio for each clone was determined. The results are shown in Table 2. It was found that the amount produced per unit DNA of the viral vector differs depending on the sequence of All-in-One.
  • Viral genomic DNA was extracted using the same method as for the Bacillus subtilis-derived plasmid, and the abundance ratio was examined using MiSeq. The results are shown in Table 2. The obtained results showed almost the same results as the plasmid derived from Bacillus subtilis. *The absence of the number of the derived seed plasmid indicates that the corresponding seed plasmid could not be detected. *Out/In is the genome copy number of the viral vector obtained in one transfection experiment and the copy number of the plasmid used at the time of transfection, calculated based on the number of reads of the DNA barcode region by a next-generation sequencer. shows the ratio of
  • Example 2 All-in-One screening by individual transfection
  • Table 3 Design of CombiOGAB library
  • each recombination unit of 5'ITR, 3'ITR, Helper, and Rep was designed as shown in Table 3 and Figure 3 below.
  • a total of 8 types of seed plasmids including new seed plasmids were designed.
  • the 3'ITR of #1 in Example 1 was changed from that of AAV-2 to that of AAV-5.
  • SEQ ID NO: 104 a DNA fragment newly synthesized from the third fragment of #1 of Example 1 is shown in SEQ ID NO: 104.
  • fragments 18 to 19 prepared for synthesis of #6 to #8 are shown in SEQ ID NOs: 105 to 159.
  • restriction enzymes used to cut out DNA fragments for the OGAB method are shown in Table A.
  • each plasmid was digested with NotI, and then a short NotI fragment of approximately 100 bp to be deleted was extracted. It was removed by electrophoresis and the remaining two fragments were closed. By introducing this into E. coli JM109, a seed plasmid containing one less SfiI fragment than in Example 1 was constructed.
  • the base sequences of plasmids #1 to #8 are shown in SEQ ID NOs: 160 to 167.
  • the obtained plasmid was fragmented using Illumina prep (Illumina) and analyzed using Miseq (Illumina) to identify the seed plasmid from which each plasmid was derived.
  • the results for 48 of these clones are shown in Table 4 below.
  • construction of plasmid libraries containing various combinations of Helper recombination units and Rep recombination units was confirmed.
  • Benzonase 200 units was added to 10x Lysis buffer (20mM MgCl2 , 1.5M NaCl, 500mM Tris, 1% Triton (registered trademark) X-100; pH 7.5). /mL) was added at 10v/v% and reacted at 37°C for 60 minutes. Thereafter, 2/100 volume of 1.9M MgSO 4 solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 3,750 rpm for 10 minutes at room temperature.
  • a sample was treated with DNaseI for 30 minutes and reacted at 95° C. for 10 minutes, diluted 1000 times, and subjected to qPCR.
  • the target was ITR2, and the primer sequences SEQ ID NO: 168 and SEQ ID NO: 169 were used.
  • the reaction conditions were 95°C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95°C/15 seconds, 55°C/5 seconds, and 72°C/30 seconds.
  • Table 4 Even in the individual screening system, it was possible to screen All-in-One plasmids with different amounts of virus production. *The absence of the number of the derived seed plasmid indicates that the corresponding seed plasmid could not be detected.
  • a sample was treated with DNaseI for 30 minutes and reacted at 95°C for 10 minutes, then diluted 1000 times, and qPCR was performed.
  • the target was the 3'ITR of AAV-2, and the primer sequences SEQ ID NO: 168 and SEQ ID NO: 169 were used.
  • the reaction conditions were 95°C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95°C/15 seconds, 55°C/5 seconds, and 72°C/30 seconds. The results are shown in Figure 4.
  • the AAV2 production amount of Control (pGETS103-AAV-Helper-RC2, SEQ ID NO: 170), #20, #24, and #46 was 1.55 ⁇ 10 10 GC/mL, 1.62 ⁇ 10 9 GC/mL, 4 The production amount of #46 was high at .07 ⁇ 10 9 GC/mL and 2.44 ⁇ 10 10 GC/mL.
  • rAAV was purified to evaluate the empty/full rate of #46.
  • 0.5 mL, 2.5 mL, and 1.0 mL of three types of cesium chloride solutions (1.35 g/cm 3 , 1.27 g/cm 3 , 1.25 g/cm 3 ) were layered, and rAAV was added thereto.
  • the cell extract was overlaid.
  • Density gradient centrifugation was performed at 226,000 x g, 18°C, for 1.5 hours, and about 2 mL of a solution around 1.27 g/cm 3 was collected, and Pluronic (registered trademark) F-68 was added to a final concentration of 0.001. % was added.
  • TBS 0.005% Pluronic® F-68, 10% sucrose, 100 mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.4.
  • Pluronic® F-68 10% sucrose, 100 mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.4
  • Example 3 Assumed seed plasmid structure
  • Examples of possible seed plasmid structures are shown in FIGS. 6 to 10.
  • Each functional unit shown in the schematic diagram may be included separately in one substitute unit nucleic acid, or a plurality of adjacent functional units may be included in one substitute unit nucleic acid.
  • the method for producing a virus-derived construct plasmid of the present disclosure is carried out to obtain a plasmid with excellent desired functions (for example, the production amount of a virus-derived construct).
  • *Promoter (weak, medium, strong) is indicated by shading.
  • *Promoter (arrow) indicates positive/negative direction.
  • Figure 6 Example for AAV vector plasmid with All-in-One structure
  • Figure 6A Example of the order of ITR ⁇ Rep ⁇ Cap ⁇ Helper
  • Figure 6B Example of the order of Rep ⁇ ITR ⁇ Cap ⁇ Helper (a structure in which the positions of Rep and Cap are exchanged is also contemplated)
  • Figure 6C Example where Helper genes are divided and arranged
  • Figure 7 Examination example of Rep/Cap variations
  • Figure 7A An example of examining the arrangement where the Rep gene is divided and variations in the expression strength of the promoter.
  • Figure 7B An example of examining the arrangement where the Cep gene is divided and the variations in the expression strength of the promoter. Indicated by shading.
  • Figure 8 Example of consideration of Helper variations
  • Figure 8A Example of examination of the arrangement of divided Helper genes and variations in promoter expression intensity
  • Figure 8B Combination of AdV-derived Helper genes and Helper genes derived from other viruses and variations in positive and negative promoter orientations
  • Study example/Figure 8C Study example of combinations of AdV-derived Helper genes and nucleic acid sequences involved in biosynthesis and variations in positive and negative promoter orientations
  • Figure 9 Example for lentiviral vector plasmid
  • Figure 9A Example of examining variation in expression intensity of promoter of LV vector plasmid with All-in-One structure
  • Figure 9B Example of examining variation in expression intensity of multiple desired genes
  • Figure 10 Example for adenovirus vector plasmid
  • Figure 10A Example of examining variation in structural protein of AdV vector plasmid with All-in-One structure
  • Figure 10B Example of examining variation in expression intensity of multiple desired genes
  • Example 4 Combinatorial promoter library of helper gene expression plasmid
  • Table 5 shows five types of pHelper seed plasmids (SEQ ID NOs: 237 to 241) carrying E1A and E1B regions in addition to the VA, E4, and E2A regions normally used in helper plasmids. It was designed as follows. Using these plasmids, AAV production in producer cells other than HEK293 and HEK293T cells is possible.
  • any of the sequences of three types of promoters with different expression strengths (UBC promoter, mPGK promoter, and EF1A promoter) were linked to each gene region (see Figure 11). (see ).
  • VA each gene, and the polyA signal sequence downstream thereof are designed in common among the seed plasmids, and the target of the combinatorial library by the CombiOGAB method is the promoter portion.
  • Each 3'-terminal overhang of 3 bases generated when each SfiI recognition site was cleaved was designed to be a unique sequence within the plasmid.
  • the order and direction of adjacent DNA fragments are specified by the complementarity of these overhanging parts. Therefore, the seed plasmids were designed so that the corresponding unit DNA at each gene position had the same protruding sequence for all types of seed plasmids, as shown in FIG. 11.
  • Some genes intended for use naturally contain SfiI recognition sequences, which may be replaced by synonymous codons in the case of protein-coding sequences, or replaced by sequences in non-coding regions, such as within ITR sequences. It was erased by changing it.
  • pBR-delTypeIIS-1st pBR-delTypeIIS-2nd, pBR, which are plasmid vectors constructed so that the unit DNA containing the promoter-ORF-polyA signal can be excised with SfiI.
  • the five cloning plasmids, -delTypeIIS-3rd, pBR-delTypeIIS-4th, and pBR-delTypeIIS-5th were obtained by cleaving pBR-delTypeIIS-3-AarI (SEQ ID NO: 99) with AarI, followed by SEQ ID NO: 171 and 172, respectively.
  • SEQ ID NO: 181 and 182 For confirmation and amplification of promoter fragments for WT_E2A, WT_E4, WT_E1A, WT_E1B, UBC, mPGK, and EF1A, respectively, SEQ ID NO: 181 and 182, SEQ ID NO: 183 and 184, SEQ ID NO: 185 and 186, SEQ ID NO: 187. and 188, SEQ ID NO: 189 and 190, SEQ ID NO: 191 and 192, and SEQ ID NO: 193 and 194 were used.
  • VA For confirmation and amplification of the genes (VA) and ORFs of VA (including WT_endogenous promoter), WT_E2A, WT_E4, WT_E1A, and WT_E1B, SEQ ID NO: 195 and 196, SEQ ID NO: 197 and 198, SEQ ID NO: 199 and 200, SEQ ID NOs: 201 and 202, and SEQ ID NOs: 203 and 204 were used.
  • VA including WT_endogenous promoter
  • WT_E2A, WT_E4, WT_E1A, and WT_E1B SEQ ID NO: 195 and 196, SEQ ID NO: 197 and 198, SEQ ID NO: 199 and 200, SEQ ID NOs: 201 and 202, and SEQ ID NOs: 203 and 204 were used.
  • bGH polyA signal For confirmation and amplification of SV40 polyA signal, bGH polyA signal, hGH polyA signal, and HSV polyA signal, SEQ ID NO: 205 and 206, SEQ ID NO: 207 and 208, SEQ ID NO: 209 and 210, SEQ ID NO:
  • the primer sets shown in 211 and 212 were used.
  • a recognition site for BspQI a TypeIIS restriction enzyme that can generate any three-nucleotide sequence, is introduced at the 5' end of these primers, and by cleaving the obtained DNA fragment with BspQI, Overhang sequences were designed in five cloning plasmid vectors, pBR-delTypeIIS-1st to -5th, so that promoter-ORF-polyA signals could be integrated in this order.
  • These amplified DNAs were ligated to pTAKN-2 to construct 16 types of plasmids containing each fragment.
  • Escherichia coli carrying the OGAB block plasmid was purified from 2 mL of LB medium using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), the plasmid was purified using the automated system QIAcube, and finally 30 ⁇ L of TE. Eluted in buffer.
  • the obtained plasmid was digested with restriction enzymes SfiI (NEB) and ApaLI (NEB), and 17 types of fragments ranging from about 0.8 kb to 3.2 kb were recovered by electrophoresis using a low melting point agarose gel.
  • Plasmid pGETS161 is cut with restriction enzyme SfiI, size separated by low melting point agarose gel electrophoresis, and the large 5.8 kb fragment is cut out from the gel and purified to obtain a fragment for OGAB accumulation. obtained.
  • the aqueous phase was separated, 320 ⁇ L of the aqueous phase was transferred to a new tube, 900 ⁇ L of ethanol was added thereto, and the mixture was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. The supernatant was removed with a micropipette and 900 ⁇ L of 70% ethanol was added to rinse the entire tube. Thereafter, 70% ethanol was removed with a micropipette, and the resulting precipitate was dissolved in 25 ⁇ L of TE buffer.
  • plasmid mass preparation method Highly pure plasmid DNA was prepared by cesium chloride-ethidium bromide density gradient ultracentrifugation. Prepare 200 mL of LB medium with tetracycline added to 10 ⁇ g/mL, add 100 mL each to 500 mL Erlenmeyer flasks, inoculate with Bacillus subtilis plasmid-carrying strain, and culture at 37°C for 16 hours, followed by ultracentrifugation. The plasmid was purified by These plasmids were fragmented using Illumina prep (Illumina), and the entire base sequence was determined using MiSeq (Illumina) to obtain clones that correctly integrated each seed plasmid.
  • Illumina prep Illumina
  • MiSeq Illumina
  • ⁇ CombiOGAB library After adding water to 2 ⁇ g of four types of seed plasmids obtained by mass preparation to make 85 ⁇ L, add 10 ⁇ L of 10 ⁇ Cut Smart buffer (NEB) and 5 ⁇ L of restriction enzyme SfiI, and incubate at 50°C. Time reacted. After the reaction is complete, add 50 ⁇ L of water and 150 ⁇ L of TE-saturated phenol (Nacalai Tesque) and mix. Separate into two phases by centrifuging at 20,000 x g for 5 minutes, and transfer the aqueous phase to a new 1.5 mL tube.
  • NEB 10 ⁇ Cut Smart buffer
  • SfiI restriction enzyme
  • the mixture was centrifuged at 6,800 ⁇ g for 3 minutes, the supernatant was removed with a micropipette, and the plasmid was purified using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) using the automated system QIAcube, and finally eluted in 30 ⁇ L of TE buffer.
  • Plasmid DNA Bacillus subtilis-derived plasmids
  • plasmids derived from the 96 colonies mentioned above and seed plasmid #9. These plasmids were introduced into HeLa cells and viral particle production was evaluated.
  • HeLa cells were seeded in a 24-well plate. After 22 hours, the medium was replaced with 0.38 mL of DMEM medium (2% FBS, 1% penicillin/streptomycin), and cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 2 hours. Thereto was added 20 ⁇ L of a transfection solution containing 0.10 ⁇ g of pAAV-GFP plasmid, 0.13 ⁇ g of pR2C1 plasmid, 0.33 ⁇ g of pHelper library plasmid, and 1 volume of PEI pro and DMEM medium. After culturing for 72 hours at 37°C and 5% CO, the supernatant was collected and the rAAV genome copy number was quantified.
  • DMEM medium 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin
  • the supernatant was treated with DNaseI for 30 minutes, and the sample prepared by reacting at 95°C for 10 minutes was diluted 1000 times and qPCR was performed.
  • the primer sequences 5'-CATCAATGGGCGTGGATAGC-3' (SEQ ID NO: 213) and 5'-GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO: 314) targeting the CMV promoter were used.
  • the reaction conditions were 95°C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95°C/15 seconds, 55°C/5 seconds, and 72°C/30 seconds.
  • Example 5 Promoter library of pDual (Helper/Rep/Cap) gene expression plasmid
  • Example 5 Design of seed plasmid for CombiOGAB method
  • a pDual species carrying the VA, E4, and E2A regions normally used in helper plasmids, the Rep gene of serotype 2, and the Cap gene of serotype 1 was created.
  • Five types of plasmids (SEQ ID NOs: 242 to 246) were designed as shown in Table 6. These plasmids are capable of producing AAV in HEK293 and HEK293T cells.
  • VA each gene, and the polyA signal sequence downstream thereof are designed in common among the seed plasmids, and the target of the combinatorial library by the CombiOGAB method is the promoter portion.
  • Each 3'-terminal overhang of 3 bases generated when each SfiI recognition site was cleaved was designed to be a unique sequence within the plasmid.
  • the order and direction of adjacent DNA fragments are specified by the complementarity of these overhanging parts. Therefore, the seed plasmids were designed so that the corresponding unit DNA at each gene position had the same protruding sequence for all types of seed plasmids, as shown in FIG. 13.
  • Some genes intended for use naturally contain SfiI recognition sequences, which may be replaced by synonymous codons in the case of protein-coding sequences, or replaced by sequences in non-coding regions, such as within ITR sequences. It was erased by changing it.
  • Example 4 Of the other necessary DNAs, those constructed in Example 4 were used as they were. Those not included in Example 4 were obtained by PCR from appropriate template DNA in the same manner as in Example 4, and then cloned into pTAKN-2. For confirmation and amplification of the Cap2 and Rep1 promoter fragments, primer sets shown in SEQ ID NOs: 215 and 216, and SEQ ID NOs: 217 and 218, respectively, were used. For confirmation and amplification of the Cap2 and Rep1 ORFs, primer sets shown in SEQ ID NOs: 219 and 220 and SEQ ID NOs: 221 and 222 were used, respectively. In the same manner as in Example 4, an OGAB block plasmid for preparing the DNA fragments listed in Table 6 was constructed.
  • ⁇ CombiOGAB library Four seed plasmids #15, #16, #17, and #18 obtained by mass preparation were cut with restriction enzyme SfiI, T4 DNA ligase was added, and after mixing, incubated at 37°C for 2 hours. used for transformation. Approximately 30,000 colonies were obtained as a result of overnight culture at 37° C. at LB rate containing tetracycline.
  • rAAV Production of rAAV from pDual promoter library
  • 96 of these colonies were randomly selected and plasmids were purified.
  • a total of 97 types of plasmid DNA (Bacillus subtilis-derived plasmid) including seed plasmid #14 were introduced into HEK293 cells, and virus particle production was evaluated.
  • HEK293 cells On the day before transfection, 0.225 ⁇ 10 6 HEK293 cells were seeded in a 24-well plate. After 22 hours, the medium was replaced with 0.38 mL of DMEM medium (2% FBS, 1% penicillin/streptomycin), and cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 2 hours. Thereto was added 20 ⁇ L of a transfection solution containing 0.10 ⁇ g of pAAV-GFP plasmid, 0.34 ⁇ g of pDual library plasmid, 1 volume of PEI pro, and DMEM medium.
  • DMEM medium 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin
  • a transfection solution containing 0.10 ⁇ g of pAAV-GFP plasmid, 0.12 ⁇ g of pR2C1 plasmid, 0.22 ⁇ g of pHelper plasmid, 1 volume of PEI pro, and DMEM medium was added. After culturing for 72 hours at 37°C and 5% CO, the supernatant was collected and the rAAV genome copy number was quantified.
  • the supernatant was treated with DNaseI for 30 minutes, and the sample prepared by reacting at 95°C for 10 minutes was diluted 1000 times and qPCR was performed.
  • the primer sequences 5'-CATCAATGGGCGTGGATAGC-3' (SEQ ID NO: 213) and 5'-GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO: 214) targeting the CMV promoter were used.
  • the reaction conditions were 95°C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95°C/15 seconds, 55°C/5 seconds, and 72°C/30 seconds.
  • Each plasmid used in the above examples was obtained or produced as follows.
  • ⁇ pAAV-GFP Purchased from Vector Builder (pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE).
  • ⁇ VB3_pAAV-EF1A-dTomato-T2A-Hygro It was purchased from Vector Builder (pAAV[Exp]-EF1A>dTomato(ns):T2A:Hygro).
  • ⁇ VB6_pAAV-UBC-EBFP (VB) Purchased from Vector Builder (pAAV[Exp]-UBC>EBFP).
  • ⁇ VB7_VB211117-TRE-tTA Purchased from Vector Builder (pRP[Exp]-TRE>tTA).
  • ⁇ 6230_pAAV-CMV Purchased from TAKARA (6230_pAAV-CMV).
  • SYNp34_pHelper The pUC19 vector plasmid (Addgene: #500005) was treated with restriction enzymes (AatII, PciI). The following three fragments (VA fragment, E4 fragment, and E2A fragment) were inserted therein using InFusion.
  • the VA fragment was prepared using the Ad5 genome (see ATCC VR-1516) as a template and the following primers: primer sequence 5'-ttagtaagcttccctctgacgcggtaggaggaggggaggtgccctgcatg-3' (SEQ ID NO: 223), 5'-ccttttgctc acatgtcaattggtagatgtacctggacatccaggtgatgccggcg- 3' (SEQ ID NO: 224).
  • the E4 fragment was prepared using the Ad5 genome as a template and the following primers: primer sequence 5'-tgtacaGGCGCGCCgaattcgttttagggcggagtaacttgtatgtgttgggaattgtag-3' (SEQ ID NO: 225), 5'-agggaagcttactaaacggt acacaggaaacaggagacacaactccaagtg-3' (SEQ ID NO: 226).
  • the E2A fragment was prepared using the Ad5 genome as a template and the following primers: primer sequence 5'-gaaaagtgccacctgacgtcgcggccgcGCGATCGCggtacccaactccatgctcaacagtccccaggtacagccc-3' (SEQ ID NO: 227), 5'-gaa ttcGGCGCGCCtgtacagcccgggcgacgcaccctgtgacgaaagccgccgcaag-3' (SEQ ID NO: 228).
  • pUC19 vector plasmid (Addgene: #500005) was treated with restriction enzymes (AatII, PciI). The following three fragments (p5 gene fragment, AAV2 Rep fragment, and SV40 ori fragment) were inserted therein using InFusion.
  • the p5 gene fragment was prepared using the following primers: primer sequence 5'-gaaaagtgccacctgacgtcgcggccgcggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcataggttaggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgtt ttgcgac-3' (SEQ ID NO: 229), 5'-gttcaaacctcccgcttcaaaatggagaccctgcgtgctcactcgggcttaaatacccagcgtgaccacatggtgtcgcaaaatgtcgcaaaacactca-3' (SEQ ID NO: 230).
  • AAV2 Rep fragment was prepared using pRC2-mi342 (Takara) as a template and the following primers: primer sequence 5'-gcgggaggtttgaacgcgcagccgccATGCCGGGGTTTTAC-3' (SEQ ID NO: 231), 5'-GATCGCAGCGCTattaaat catTTATTGTTCAAAGAT-3' (SEQ ID NO: 232 ).
  • the SV40 ori fragment was prepared using the SV40 ori gene sequence (TOYOBO) as a template and the following primers: primer sequence 5'-aatAGCGCTGCGATCGCggcctccaaaaaagc-3' (SEQ ID NO: 233), 5'-cctttgctcacatgtcaattgatcccgcc cctaact-3' (SEQ ID NO: 234 ).
  • the obtained plasmid was treated with restriction enzymes (Swal, AfeI).
  • the AAV1 Cap fragment was inserted therein using InFusion.
  • the AAV1 Cap fragment was prepared using pRC1 (Takara) as a template and the following primers: primer sequences 5'-AACAATAAatgatttaaatcagg-3' (SEQ ID NO: 235), 5'-ggccGCGATCGCAGCGCTgtagccatggaaactagata-3' (SEQ ID NO: 236).
  • primer sequences 5'-AACAATAAatgatttaaatcagg-3' SEQ ID NO: 235
  • 5'-ggccGCGATCGCAGCGCTgtagccatggaaactagata-3' SEQ ID NO: 236).
  • ⁇ SYNp177_AIO_Helper-Ad5_R2C1_EGFP_wtE1_km It was produced by gene synthesis and OGAB method.
  • 5'ITR2 vector builder
  • CMV promoter vector builder
  • EGFP vector builder
  • WPRE vector builder
  • hGH polyA signal TAKARA
  • 3'ITR2 vector builder
  • E2A Ad5
  • E4 Ad5
  • VA Ad5
  • Cap AAV1
  • Rep AAV2
  • p5 AAV2
  • E1A Ad5
  • E1B Ad5
  • pUC ori pUC19
  • kanamycin resistance gene vector builder
  • mPGK promoter vector builder
  • the target introduced nucleic acid is divided into fragments of approximately 1 kb or less.
  • the ends of each fragment are designed to be unique and complementary only to a specific fragment.
  • Primers are designed for each of the fragments thus designed, and each fragment is prepared by PCR.
  • Each fragment is cloned into a vector plasmid and each vector plasmid is used to transform E. coli to obtain a clone containing the correct sequence for each fragment. Plasmids are purified from these E. coli clones, and the DNA concentration of the plasmid solution is measured. Each plasmid solution is separated and mixed so that the amount of plasmid in each fragment is equal.
  • Restriction enzymes are added to this mixture to produce DNA fragments, each with a unique end that is complementary only to a specific fragment. Thereafter, OGAB accumulation vectors cut with the same restriction enzymes are added to the solution in an amount that matches the molar concentration with each fragment, ligation is performed, and fragments with complementary ends (including fragments of OGAB accumulation vectors) are added to the solution. Connect pairs of . After adding this to Bacillus subtilis competent cells and culturing, transformed colonies are obtained. A plasmid having the desired structure is recovered from this colony. ⁇ SYNp44-2_pHelper(Ad5 ⁇ SfiI)_km It was produced by gene synthesis and OGAB method.
  • E4 Ad5
  • E2A Ad5 ⁇ SfiI
  • VA Ad5
  • pUC ori pUC19
  • kanamycin resistance gene vector builder
  • AmpR promoter pUC19
  • virus-derived construct plasmids it is possible to efficiently produce various virus-derived construct plasmids, and virus-derived construct plasmids with improved performance can be efficiently obtained.

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Abstract

１つの局面において、本開示は、開始プラスミド（例えば、本開示のウイルス由来構築物プラスミド）から種々のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の少なくとも一部を含む開始プラスミドのセットを準備する工程であって、開始プラスミドのセットは、対応する代替単位核酸のセットを含み、対応する代替単位核酸のセットは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも１セットを含む、工程と、開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、切断代替単位核酸断片を含む混合溶液を調製する工程と、切断代替単位核酸断片をライゲーションして集積核酸を形成する工程と、集積核酸を形質転換生物に接触させてウイルス由来構成物プラスミドを形成する工程とを含む。

Description

ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよびその構築
　本開示は、ウイルス由来構築物プラスミドを効率的に作製する方法を提供する。本開示はまたウイルス由来構築物プラスミドライブラリーを提供する。
　遺伝子治療およびワクチン療法などのためにアデノウイルスベクター（特許文献１）など種々のウイルス由来構築物が開発されている。
　ウイルス由来構築物の調製のためには、通常、プロデューサー細胞にウイルス由来構築物プラスミドを導入する必要がある。そのため、ウイルス由来構築物プラスミドの合成・構築が必要である。ウイルス由来構築物プラスミドは、通常、個々に設計および作製され、ウイルス由来構築物の生産量などプラスミド性能の改善にはしばしば多くの労力を伴う。
国際公開第２００１／０９０３９２号
　本発明者らは、効率的に種々のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を見出した。この知見に基づき、本開示は、開始プラスミドから種々のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を提供する。さらに本発明者らは、このような方法により作製されるウイルス由来構築物プラスミドのライブラリーも提供する。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　ウイルス由来構成物プラスミドを作製する方法であって、
　ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の少なくとも一部を含む開始プラスミドのセットを準備する工程であって、前記開始プラスミドのセットは、対応する代替単位核酸のセットを含み、前記対応する代替単位核酸のセットは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも１セットを含む、工程と、
　前記開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、切断代替単位核酸断片を含む混合溶液を調製する工程と、
　前記切断代替単位核酸断片をライゲーションして集積核酸を形成する工程と、
　前記集積核酸を形質転換生物に接触させてウイルス由来構成物プラスミドを形成する工程と、
を含む方法。
（項目２）
　ウイルス由来構成物プラスミドの集合を作製する、上記項目のいずれかの方法。
（項目３）
　前記開始プラスミドのセットのうちの少なくとも１つが動物細胞において作動する転写開始配列を含む、動物細胞において作動する前記転写開始配列を含むウイルス由来構成物プラスミドを作製する、上記項目のいずれかの方法。
（項目４）
　前記開始プラスミドのセットが、３種類以上の開始プラスミドを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６）
　形成されたウイルス由来構成物プラスミドの集合から、所望する機能に優れたウイルス由来構成物プラスミドを選択する工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目７）
　前記所望する機能がウイルス由来構成物の生産量である、上記項目のいずれかの方法。
（項目８）
　前記所望する機能が、目的とするウイルス由来構成物組成物に混入する不純物量である、上記項目のいずれかの方法。
（項目９）
　前記不純物が、核酸配列を含まない外殻タンパク質、不完全な核酸配列を含む外殻タンパク質、不完全な外殻タンパク質、不完全な核酸配列から選択される、上記項目のいずれかの方法。
（項目１０）
　前記所望する機能が、目的とするウイルス由来構成物組成物における目的のウイルス由来構成物の純度である、上記項目のいずれかの方法。
（項目１１）
　前記選択されたウイルス由来構成物プラスミドの並行する代替単位核酸の組み合わせを含むウイルス由来構成物プラスミドを調製する工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１２）
　前記開始プラスミドのセットの各々が、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列を含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１３）
　前記開始プラスミドのうちの少なくとも一部が、項目１に記載の方法によって作製されたプラスミドである、上記項目のいずれかの方法。
（項目１４）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、同じ遺伝子の異なるサブタイプの少なくとも一部をコードする核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１５）
　前記開始プラスミドのセットの各々が、前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の少なくとも一部を含む３種類以上の代替単位核酸を含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１６）
　前記ライゲーションして集積核酸を形成する工程において、バーコード核酸を添加することを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１７）
　前記開始プラスミドのセットの各々が、約１０ｋｂ以上の前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列を含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１８）
　前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列が、
（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と
を含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目１９）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、種類または向きが異なるプロモーターをコードする対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２０）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、薬剤応答性のプロモーターを含む、プロモーターをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２１）
　前記プロモーターが、薬剤応答性のプロモーターを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２２）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、
（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と、
（Ｅ）プロモーターをコードする核酸配列と、
（Ｆ）所望の遺伝子をコードする核酸配列と、
（Ｇ）宿主細胞の生合成に関わる核酸配列と
から選択される異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２３）
　前記宿主細胞の生合成に関わる核酸配列が、ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原（ＳＶ４０ＬＴＡ）、ＴＡＸ、Ｋｒａｓ、Ｍｙｃ、ＭＩＲ１７ＨＧ、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＰＤＩＡ２、ＸＢＰ１、ＨＳＰＡ５、ＰＣ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）、ＰＤＫ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲＦ２、およびＣＰＳＦ６からなる群から選択される遺伝子を含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２４）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、所望の遺伝子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２５）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、所望の遺伝子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目２６）
　前記開始プラスミドが、２つの末端反復配列を含む核酸配列を含み、前記所望の遺伝子をコードする代替単位核酸が前記２つの末端反復配列を含む核酸配列の間に存在する、上記項目のいずれかの方法。
（項目２７）
　前記ウイルス由来構成物が、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、腫瘍溶解ウイルスおよびウイルスレプリコンから選択される、上記項目のいずれかの方法。
（項目２８）
　前記ウイルス由来構成物が、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、コロナウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、コクサッキ―ウイルス、およびニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されるウイルスのウイルス由来構成物である、上記項目のいずれかの方法。
（項目２９）
　前記ウイルス由来構成物が、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびセンダイウイルスからなる群から選択されるウイルスのウイルス由来構成物である、上記項目のいずれかの方法。
（項目３０）
　前記ウイルス由来構成物が、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスからなる群から選択されるウイルスのウイルス由来構成物である、上記項目のいずれかの方法。
（項目３１）
　前記ウイルス由来構成物が、アデノ随伴ウイルスのウイルスベクターである、上記項目のいずれかの方法。
（項目３２）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する異なる末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３３）
　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３４）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ボカウイルスおよびシミアンウイルスのうちの少なくとも１つに由来する機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３５）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３６）
　前記機能補助因子が、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ、ヘルペスウイルスのＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ３０、ＵＬ４２、ＵＬ５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ８、およびＩＣＰ２２、パピローマウイルスのＥ１、Ｅ２、およびＥ６、ボカウイルスのＮＰ１、ＮＳ２、ＮＳ４、およびＢｏｃａＳＲ、ならびにシミアンウイルスのＬａｒｇｅ　Ｔ抗原のうちの少なくとも１つを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３７）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３８）
　前記開始プラスミドが、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目３９）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｒｅｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４０）
　前記ｒｅｐが、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ７６、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０のうちの少なくとも１つを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４１）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記ｒｅｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４２）
　ｒｅｐをコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４３）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｃａｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４４）
　前記ｃａｐが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＡＡＰおよびＭＡＡＰのうちの少なくとも１つを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４５）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記ｃａｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４６）
　ｃａｐをコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲ、プロモーター、所望の遺伝子、３’ＩＴＲ、ｒｅｐ、ｃａｐおよび機能補助因子を含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目４８）
　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｒｅｐおよびｃａｐを含み、前記ｒｅｐおよびｃａｐの一方が、前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに挟まれる領域の下流に位置付けられ、他方が、前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに挟まれる領域の上流に位置付けられる、上記項目のいずれかの方法。
（項目４９）
　前記開始プラスミドが、２つのＩＴＲおよび前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列のその他の部分を含み、前記その他の部分が、前記２つのＩＴＲに挟まれる領域の外にある、上記項目のいずれかの方法。
（項目５０）
　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲ、プロモーター、所望の遺伝子、３’ＩＴＲ、ｒｅｐ、ｃａｐおよび機能補助因子をこの順番で含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５１）
　前記開始プラスミドが、第１のプロモーター、第１のｒｅｐ、第２のプロモーター、第２のｒｅｐ、第３のプロモーターおよびｃａｐをこの順番で含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５２）
　前記ウイルス由来構成物が、レンチウイルスのウイルスベクターである、上記項目のいずれかの方法。
（項目５３）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、レンチウイルスに由来する異なる長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）またはその改変体を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５４）
　前記開始プラスミドが、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５５）
　前記開始プラスミドが、２セット以上の前記プロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５６）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｔａｔおよびｒｅｖから選択される機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５７）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５８）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇおよびｅｎｖから選択される構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目５９）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６０）
　前記ウイルス由来構成物が、アデノウイルスのウイルスベクターである、上記項目のいずれかの方法。
（項目６１）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスに由来する異なる末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６２）
　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６３）
　前記開始プラスミドが、２セット以上の前記プロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６４）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５から選択される構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６５）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６６）
　構造タンパク質をコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６７）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２ＢおよびＥ４から選択される機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６８）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目６９）
　機能補助因子をコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目７０）
　前記ウイルス由来構成物プラスミドが、前記ウイルス由来構成物プラスミド単独を導入したプロデューサー細胞においてウイルス由来構成物の生産を可能とすることを特徴とする、上記項目のいずれかの方法。
（項目７１）
　上記項目のいずれかの方法を実行してウイルス由来構成物プラスミドライブラリーを構築する方法。
（項目７２）
　前記対応する代替単位核酸のセットが、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、６４通り以上の異なる並行する代替単位核酸の組み合わせを提供する、上記項目のいずれかの方法を実行してウイルス由来構成物プラスミドライブラリーを構築する方法。
（項目７３）
　上記項目のいずれかの方法によって生産されるウイルス由来構成物プラスミドまたウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７４）
　並行する一連の代替単位核酸として３個以上の代替単位核酸を含むウイルス由来構成物プラスミドを含む、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーであって、前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットのうちの各ウイルス由来構成物プラスミド上の並行する代替単位核酸が、約１０ｋｂ以上の長さを有する、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７４Ａ）
　複数のウイルス由来構成物プラスミドを含むウイルス由来構成物プラスミドライブラリーであって、前記複数のウイルス由来構成物プラスミドにおける組み合わせにおいて異なる部分が、プロモーターまたは機能補助因子である核酸配列を含む、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７４Ｂ）
　前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー中の複数のウイルス由来構成物プラスミドが、由来するウイルスの血清型において互いに異なる組み合わせにおいて異なる部分を構成するエレメントを含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７４Ｃ）
　前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー中の複数のウイルス由来構成物プラスミドの組み合わせにおいて異なる部分を構成するエレメントがプロモーターを含み、前記複数のウイルス由来構成物プラスミドにおける前記プロモーターは、天然において互いに異なる遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７５）
　異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットが、
（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と
のうちの少なくとも１つの異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７６）
　各ウイルス由来構成物プラスミドが、
（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と
を含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７７）
　異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットが、ＧＣ含量７５％以上である代替単位核酸を含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７８）
　異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットが、６４通り以上の異なる並行する代替単位核酸の組み合わせを可能とする対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、各ウイルス由来構成物プラスミドが同じ数の並行する代替単位核酸を含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目７９）
　各ウイルス由来構成物プラスミドがバーコード核酸配列を含む、上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
（項目８０）
　上記項目のいずれかのウイルス由来構成物プラスミドライブラリーに含まれるウイルス由来構成物プラスミド。
（項目８１）
　上記項目のいずれかの方法によってウイルス由来構成物プラスミドを作製するステップと、
　前記ウイルス由来構成物プラスミドをプロデューサー細胞に導入してウイルス由来構成物を形成させるステップと、
を含む、ウイルス由来構成物を作製する方法。
（項目８２）
　上記項目のいずれかの方法によってウイルス由来構成物プラスミドの集合を作製するステップと、
　前記ウイルス由来構成物プラスミドの集合をプロデューサー細胞に導入してウイルス由来構成物を形成させてウイルス由来構成物ライブラリーを構築するステップと、
を含む、ウイルス由来構成物ライブラリーを作製する方法。
（項目８３）
　前記ウイルス由来構成物プラスミドをプロデューサー細胞に導入するステップが、単一の前記ウイルス由来構成物プラスミドをプロデューサー細胞に導入することを含む、上記項目のいずれかの方法。
（項目８４）
　前記ウイルス由来構成物プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部が前記プロデューサー細胞の染色体に組み込まれる、上記項目のいずれかの方法。
（項目８５）
　上記項目のいずれかの方法によって作製されるプロデューサー細胞。
（項目８６）
　上記項目のいずれかの方法によって生産されるウイルス由来構成物。
（項目８７）
　上記項目のいずれかの方法によって生産されるウイルス由来構成物含有組成物。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本開示によれば、効率的に性能が改善されたウイルス由来構築物プラスミドを作製することが可能である。
実施例で使用した種プラスミドの構造の概略を示す。 最初に作製した５種類の種プラスミドの構造の概略を示す。 追加の種プラスミドを加えた８種類の種プラスミドの構造の概略を示す。 Ｃｏｎｔｒｏｌ、＃２０、＃２４、＃４６のそれぞれのプラスミドから生産されたｒＡＡＶのゲノムコピー数を示す。縦軸は１ｍＬあたりのゲノムコピー数を示す。 ＃４６のプラスミドから生産された精製ｒＡＡＶのＭａｓｓ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ法による測定結果を示す。横軸は、測定された質量（ｋDa）を示し、縦軸は、対応する質量において検出されたカウントを示す。 ウイルス由来構成物プラスミドの構築のために想定されるプラスミドの構造の例を示す。 ウイルス由来構成物プラスミドの構築のために想定されるプラスミドの構造の例を示す。 ウイルス由来構成物プラスミドの構築のために想定されるプラスミドの構造の例を示す。 ウイルス由来構成物プラスミドの構築のために想定されるプラスミドの構造の例を示す。 ウイルス由来構成物プラスミドの構築のために想定されるプラスミドの構造の例を示す。 実施例４でコンビナトリアルライブラリーを作製するために構築した種プラスミドの構造の概略を示す。 実施例４で取得されたウイルスベクタープラスミドクローンのＡＡＶ粒子生産能を示す。横軸は、クローンの番号を示し、縦軸は生産されたＡＡＶ粒子量（ゲノムコピー数）を示す。 実施例５でコンビナトリアルライブラリーを作製するために構築した種プラスミドの構造の概略を示す。 実施例５で取得されたウイルスベクタープラスミドクローンのＡＡＶ粒子生産能を示す。横軸は、クローンの番号を示し、縦軸は生産されたＡＡＶ粒子量（ゲノムコピー数）を示す。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において使用する場合、「プラスミド」とは、細胞中で染色体とは別個に存在するか、または細胞に導入した場合に染色体とは別個に存在する環状ＤＮＡを指す。本開示の方法は、プラスミドを出発材料として使用してプラスミドを作製し得るので、方法において出発材料として使用するプラスミドを「開始プラスミド」、作製されたプラスミドを「生成物プラスミド」と称し得る。一つの反応溶液中に存在する、または一つの反応溶液を形成するための開始プラスミドの総体は、本明細書において「開始プラスミドのセット」と称され得る。
　本開示の方法において使用されるＯＧＡＢ（Ordered　Gene　Assembly　in　Bacillus　subtilis）法とは、集積核酸を形質転換生物に取り込ませることでこの生物において環状のプラスミドを生成する方法である（詳細は本明細書の別の箇所に記載される）。非環状の長鎖核酸を取り込み、プラスミドを生成できる任意の生物がＯＧＡＢ法において使用でき、このような生物を本明細書では「形質転換生物」と呼ぶ。形質転換生物に取り込ませる核酸を本明細書では「集積核酸」と呼び、典型的には、集積核酸は、同じ方向に同じ配列を有する核酸単位が繰り返し現れるようなタンデムリピート状の構造を有し、このような構造の集積核酸を使用することで、形質転換生物におけるプラスミドの生成が促進され得る。本明細書において「単位核酸」とは、集積核酸の配列を構成する一部の配列を有する核酸断片またはそのような核酸断片を生じる部分を指し、典型的には制限酵素処理により生じた突出配列を両端に有する核酸断片または制限酵素処理で生じる２つの突出配列に挟まれた核酸領域を指す。
 
　本明細書において複数の単位核酸が「対応する」とは、核酸断片であるそれらの単位核酸が同じ突出配列を有する関係、あるいはそれらの単位核酸をそれぞれ含む複数の核酸分子（典型的には、プラスミド）を特定の制限酵素で処理した場合に同じ突出配列を生じる関係を指す。本明細書において、互いに対応する単位核酸を「代替単位核酸」といい、断片化した代替単位核酸を集積して集積核酸を作製し、ＯＧＡＢ法によりプラスミドを形成させた場合に、代替単位核酸は、プラスミド上の同じ位置に組み込まれ得る（例えば、転写開始点から数えて同じ順位の単位核酸など）。複数の代替単位核酸の突出配列以外の塩基配列は同じであってもよいし、異なってもよい。一つの反応溶液中に存在する、または一つの反応溶液を形成するための開始プラスミドのセットに存在する代替単位核酸の総体は、本明細書において「代替単位核酸のセット」と称され得る。位置Ａの代替単位核酸のセットなどと使用される。
　本明細書において複数の単位核酸が「並行する」とは、核酸断片であるそれらの単位核酸が異なる突出配列を有する関係、あるいはそれらの単位核酸を含む核酸分子（典型的には、プラスミド）を特定の制限酵素で処理した場合に異なる突出配列を生じる関係を指す。典型的には、並行する単位核酸は、同じプラスミド上に存在する。本明細書において２つの単位核酸が「隣接する」とは、それらの単位核酸が相補的な突出配列を有する関係、あるいはそれらの単位核酸を含む核酸分子（典型的には、プラスミド）を特定の制限酵素で処理した場合に相補的な突出配列を生じる関係を指し、典型的には制限酵素処理の切断点の両側に位置する関係を指す。あるプラスミド上に存在する、あるいはあるプラスミドを制限酵素で処理した場合に生じる並行する単位核酸の総体は、本明細書において「一連の並行する単位核酸」と称され得る。開始プラスミド１上の一連の並行する単位核酸などと使用される。
　本明細書において、代替単位核酸など核酸分子の末端配列または突出配列により規定され得る核酸は、特段の記載が無ければ、配列の末端部分または突出部分を有する核酸断片の形態および潜在的にこの末端部分または突出部分を形成し得る核酸分子中の部分領域のいずれをも指し得る。「核酸断片」と記載する場合には、配列の末端部分または突出部分を実際に有する。
　本明細書において「枯草菌」とは、土壌や植物に普遍的に存在し、反芻動物やヒトの胃腸管に存在する、好気性のグラム陽性のカタラーゼ陽性の細菌であり、０．７～０．８×２～３μｍの大きさであり、中温性で、最適生育温度は２５～４０℃であり、芽胞を形成するとされ、学名Bacillus　subtilisまたはこれと近縁なBacillus属細菌であるBacillus　amyloliquefaciens、Bacillus　licheniformis、Bacillus　pumilusなどを含む、病原性を有せず、自然形質転換能を有する任意の細菌をさす。好ましい実施形態では、枯草菌は、Bacillus　subtilisの中で高い自然形質転換能を有する株であるMarburg　168株またはその派生株のRM125株である。168株は、遺伝的に最も研究されたグラム陽性菌であり、RM125株とともにATCC（American　Type　Culture　Collection）などから入手可能であり、それ自体は人畜無害であること、ＯＧＡＢ法が適応可能であることが判っていることなどからも、本開示において好適に使用され得る。
　本明細書において使用する場合、「ライブラリー」とは、類似した構造を有する同種の物質（プラスミド、ウイルスベクターなど）の集合を指す。類似した構造としては、同様の塩基配列長（例えば、互いに塩基長の差が１０％以内）を有すること、一連の並行する単位核酸が同じ数の単位核酸を有すること、構造が異なる部分の機能が同じ（例えば、同じ遺伝子の異なる血清型、同じ宿主細胞において機能するプロモーター）であることなどが挙げられる。
　本明細書において使用する場合、「パッケージング細胞」とは、ウイルス由来構成物プラスミドを生産するための細胞を指す。
　本明細書において使用する場合、「ウイルス由来構成物プラスミド」とは、ウイルス由来構成物に搭載する遺伝子を含む、プロデューサー細胞においてウイルス由来構成物を生産するためのプラスミドを指す。ウイルス由来構成物プラスミドは、２つの末端反復配列の間にウイルス由来構成物の標的細胞内で発現させる遺伝子（所望の遺伝子）の配列を含み、その他にプロモーターを含み、さらに他の要素（例えば、エンハンサー、ターミネーター等）を含んでもよい。
　本明細書において使用する場合、「プロデューサー細胞」とは、所望のウイルス由来構成物を産生できる細胞を意味し、ウイルス由来構成物の産生に必要な遺伝子が、染色体および導入したプラスミドから発現される細胞であり得る。プロデューサー細胞に本開示のウイルス由来構成物プラスミドを導入することで、所望のウイルス由来構成物が生産され得る。例えば、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターの場合、その産生にＥ１ＡとＥ１Ｂが必要であるが、ＨＥＫ２９３はこれらを有するため、これらをヘルパープラスミドから除くことができる。他の細胞でも、このような機能補助因子を有するように改変すれば、プロデューサー細胞として機能する。
　本明細書において「動物細胞」とは、動物（ヒト、マウス、ラット、サル、イヌなど）から取得された細胞または動物から取得された細胞を改変した細胞を指す。
　本明細書において、「ウイルス由来構築物」とは、ウイルスに由来する構造を少なくとも部分的に有する核酸構築物またはそこから生産されるタンパク質を含む構築物を指す。ウイルス由来構成物としては、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、腫瘍溶解ウイルス（がん細胞でのみ増殖するように改変されたものを含む）、およびウイルスレプリコン（ウイルス粒子産生能を欠失させた自己複製可能なウイルスゲノム）が挙げられる。
　本明細書において使用する場合、「ウイルスベクター」とは、ウイルスに由来する構造を少なくとも部分的に有し、標的細胞に核酸を導入できる構築物を指す。典型的には、ウイルスベクターは、ウイルスの構造タンパク質および異種遺伝子を含む核酸を含むウイルス粒子の形態である。
　本明細書において、「ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列」とは、これを含むプロデューサー細胞がウイルス由来構築物を生産できる核酸配列（例えば、核酸配列の組合せ）を指す。一つの実施形態において、ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列と、パッケージング因子をコードする核酸配列と、ウイルスの２つの末端反復配列と、機能補助因子をコードする核酸配列とを含む。「機能補助因子をコードする核酸配列」とは、例えば、ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列、パッケージング因子をコードする核酸配列、およびウイルスの２つの末端反復配列以外の任意のウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含みうるかあるいは本質的になる。これらのそれぞれの核酸配列は、ウイルス由来構築物ごとに異なり得る。これらの詳細は、本明細書の別の箇所に記載される。好ましい実施形態では、ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスに共通する有利な配列が利用され、より好ましくはＡＡＶに有利な配列が利用され得る。このようなＡＡＶおよびアデノウイルスに共通する有利な配列は、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）の間に所望の遺伝子を含み、機能補助因子、ｒｅｐ、ｃａｐまたはＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５を含でもよいという特徴を有し、ＡＡＶに有利な配列は、ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含み、機能補助因子、ｒｅｐ、ｃａｐを含んでもよい。機能補助因子、ｒｅｐ、ｃａｐの配置は２つのＩＴＲの外側でもよいという特徴を有する。例えば、このような例としては、特定の機能補助因子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４の配列が挙げられるがこれに限定されない。
　本明細書において「パッケージング因子」とは、ウイルスのゲノムを構造タンパク質に内包させるタンパク質を含み、ｒｅｐおよびψなどを挙げることができる。限定を意図しないが、パッケージング因子はアデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２、あるいはその改変体（ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）のいずれかに由来するものが利用され得る。このタンパク質は、天然のものであっても、人工的に変異を導入したものであってもよい。「人工的に変異」を導入したものは、例えば公知の文献に記載されている天然のものの配列に対して適宜の変異を導入することで作製することができる。
　本明細書において使用する場合、「構造タンパク質」は、その少なくとも一部がウイルスまたはウイルス由来構築物の表面に存在する（例えば、エンベロープを横断している）ウイルスが有する遺伝子から生産されるタンパク質を指す。構造タンパク質は細胞への感染性を担い得る。
　本明細書において使用する場合、「カプシド」は、ウイルスまたはウイルス由来構築物の表面に存在する（必要に応じてエンベロープに封入されている）ウイルスが有する遺伝子から生産されるタンパク質を指し、「カプシドタンパク質」ともいう。
　本明細書において「反復配列」または「タンデムリピート」（な核酸配列）とは、生物ゲノムの核酸配列で、同じ配列が反復して（特に数回以上）見られるものの総称である。当該分野で使用される任意の反復配列を本開示において使用することができる。典型的には、プロモーター配列が反復して出現する。
　本明細書において「末端反復配列」は、生物ゲノムの核酸配列で、同じ配列が反復して（特に数回以上）見られるもののうち、末端に存在するものの総称である。末端反復配列としては、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）などをあげることができるがこれらに限定されない。末端反復配列は、アデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２、あるいはその改変体（ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）のいずれかに由来するものが利用され得る。末端反復配列としては、天然のものであっても、人工的に変異を導入したものであってもよい。「人工的に変異」を導入したものは、例えば公知の文献に記載されている天然のものの配列に対して適宜の変異を導入することで作製することができる。
　本明細書において「機能補助因子」とは、単独では増殖できないウイルスの増幅を支援する遺伝子をいう。本開示において、機能補助因子には、例えば、そのウイルスのパッケージング因子をコードする核酸配列、ならびにそのウイルスの２つの末端反復配列以外の任意のウイルス由来構築物を構成、増殖、活性向上、毒性低減するのに必要な核酸配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。使用され得る機能補助因子としては、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ＲＰＥ、ＷＲＰＥ、ＰＰＴ、ｏＰＲＥ、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー配列等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　本明細書において使用する場合、「搭載（ｌｏａｄｅｄ）核酸」とは、ウイルス由来構築物（ウイルスベクターなど）に担持されている核酸を意味する。搭載核酸であるかどうかは、ウイルス由来構築物調製物をＤＮａｓｅ処理してウイルス粒子外の核酸を分解した後、ＤＮａｓｅを不活化し、その後ウイルス粒子から抽出した核酸を確認することによって確認することができる。搭載核酸であるかどうかは、得られた核酸生成物の配列（好ましくは全長または全長に近い長さのもの）を調べることによって確認することもできる。
　本明細書において使用する場合、「宿主細胞」とは、外来性の核酸またはタンパク質またはウイルスもしくはウイルス由来構築物が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）をさす。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、天然または人工的に改変されたポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。核酸の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡが挙げられる。この用語はまた、「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチド誘導体を含むか、またはヌクレオチド間結合が通常とは異なるポリヌクレオチドをいう。「ヌクレオチド誘導体」とは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて使用される通常のヌクレオチドとは異なる構造を有するヌクレオチドをいい、例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸(2'-O,4'-C-ethylene　bridged　nucleic　acid、ENA)などのエチレン核酸、その他の架橋核酸（bridged　nucleic　acid、BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol　nucleic　acid、HNA）、アミド架橋核酸（Amido-bridged　nucleic　acid、AmNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（例えば、米国特許第5,908,845号参照）、シクロヘキセン核酸（CeNA）などが挙げられる。ヌクレオチド間結合が通常とは異なる例として、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合、リン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合、リボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合などが挙げられる。
　他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る。例えば、アデノウイルスの血清型１～５２およびアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２など具体的な野生型配列に基づく改変体には、公知の改変体（例えば、ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）以外にも、元となる配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸も含まれる。
　本明細書において「遺伝子」とは、一定の生物学的機能を果たす核酸部分を指す。この生物学的機能として、ポリペプチドまたはタンパク質をコードすること、タンパク質非コード機能性ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡなど）をコードすること、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡの生産を制御すること、特定のタンパク質に特異的に結合されること、核酸の切断または複製を制御することが挙げられる。そのため、本明細書における遺伝子には、タンパク質またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡをコードする核酸部分以外にも、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、複製起点、内部リボソーム侵入部位などの転写翻訳調節配列、およびウイルス粒子へのパッケージングに必要となる核酸部分が含まれる。本明細書において「遺伝子産物」とは、遺伝子にコードされるポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡを指し得る。
　本明細書において２つの遺伝子がシスであるとは、同一の核酸分子または相補鎖（二本鎖核酸の場合）の核酸分子上にそれらの遺伝子が存在することを指す。また、本明細書において２つの遺伝子がトランスであるとは、（ある生物における）ある細胞において、これらの遺伝子が、同一の核酸分子または相補鎖（二本鎖核酸の場合）の核酸分子上に存在しないことを指す。例えば、ゲノム上に存在する遺伝子と、ウイルス由来構築物で導入された核酸上の遺伝子はトランスであり得る。必要に応じて、２つの遺伝子がトランスであるかどうかは、２つの遺伝子が細胞に同時に存在するようになった（例えば、細胞への核酸の導入）時点における状態において判断され得る。
　本明細書において遺伝子の数について言及する場合、１つの遺伝子は、ある生物のゲノム上に通常（最も高い頻度または５０％以上の確率）存在する形態において連続配列を有する遺伝子を指す。例えば、あるタンパク質をコードする２つのエクソンは、２つの遺伝子であり得る。例えば、プロモーター配列とタンパク質をコードする配列とが連続配列を形成している場合、プロモーター配列およびタンパク質をコードする配列を含む核酸部分は、１つの遺伝子であり得る。例えば、切断されることで機能的になるタンパク質がゲノム上で連続配列によってコードされる場合、このタンパク質は、１つの遺伝子にコードされ得る。機能の側面から遺伝子に言及する場合、核酸配列は連続配列である必要はなく、例えば、あるタンパク質をコードする複数のエクソンは集合的にそのタンパク質の遺伝子として言及される。
　本明細書において使用する場合、遺伝子を「欠損する」とは、核酸がその遺伝子を含まないか、またはその遺伝子の正常な機能（例えば、機能的なタンパク質を生産する機能）を発揮しないように改変された遺伝子を含むことを指す。
　本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
　本明細書において使用する場合、「転写翻訳調節配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、エンハンサー、IRESなどを総称し、それらが協働して、レシピエント細胞でコード配列の複製、転写及び翻訳を可能にする。選択されるコード配列の複製、転写および翻訳が適当な宿主細胞において可能である限り、これらの転写翻訳調節配列のすべてが必ずしも存在する必要があるわけではない。当業者は、公開情報から調節核酸配列を容易に同定することができる。さらに、当業者は、例えばin　vivo、ex　vivoまたはin　vitroで、使用目的に適用できる転写翻訳調節配列を同定することができる。
　本明細書において使用する場合、「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸配列の転写を制御する核酸配列のセグメントを指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによる認識、結合および転写開始のために十分である特定の配列を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合または転写開始を調節する配列を含んでもよい。
　本明細書において使用する場合、「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高める機能を有する核酸配列のセグメントを指す。
　本明細書において使用する場合、「サイレンサー」は、エンハンサーとは逆に目的遺伝子の発現効率を低下させる機能を有する核酸配列のセグメントを指す。
　本明細書において使用する場合、「インスレーター」は、ＤＮＡの配列上の離れた位置にある遺伝子の発現の調節を行うシス調節の機能を有する核酸配列のセグメントを指す。
　本明細書において使用する場合、「ターミネーター」は、タンパク質をコードする領域の下流に位置し、核酸がｍＲＮＡに転写される際の転写の終結に関与する核酸配列のセグメントを指す。
　本明細書において使用する場合、「複製起点」は、その核酸配列を認識するタンパク質（例えば、イニシエーターＤｎａＡタンパク質など）が結合することや、ＲＮＡが合成されることで部分的にＤＮＡ二重らせんが解かれ、複製が開始される核酸配列のセグメントを指す。
　本明細書において使用する場合、内部リボソーム侵入部位(「IRES」)は、その下流の核酸配列の翻訳の際、リボソームの侵入または保持を促進する核酸セグメントを指す。
　本明細書において核酸の「相同性」とは、２以上の核酸配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの核酸の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。「類似性」は、同一性に加え、類似の塩基についても計算に入れた数値であり、ここで類似の塩基とは、混合塩基（例えば、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｂ＝Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｄ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ｎ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）において、一部が一致する場合をいう。２種類の核酸が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの核酸配列を直接比較する場合、その核酸配列間で、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC－IUB　Biochemical　Nomenclature　Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST　2．10.1＋（2020．6.18発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
　本明細書において、特に断らない限り、ある生物学的物質（例えば、タンパク質、核酸、遺伝子）についての言及は、その生物学的物質の生物学的機能と同様の機能（同じ程度でなくてもよい）を発揮するその生物学的物質のバリアント（例えば、アミノ酸配列に修飾を有するバリアント）についての言及でもあることが理解される。このようなバリアントには、元の分子のフラグメント、同一サイズの元の生物学的物質のアミノ酸配列または核酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる元の分子の配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である分子が含まれ得る。バリアントには、改変されたアミノ酸（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化またはリン酸化による改変）または改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化による改変）を有する分子が含まれ得る。
　本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。ストリンジェントな条件は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel　et　al.,　Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Wiley　Interscience　Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular　Cloning　2nd　ed.,Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Supplement　1-38,　DNA　Cloning　1:Core　Techniques,　A　Practical　Approach,　Second　Edition,　Oxford　University　Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrookら、Molecular　Cloning:A　Laboratory　Manual、第３番、Vol．１、７．４２－７．４５　Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press，2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０－５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ－６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本開示において使用されるポリペプチドには、本開示で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
　本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ－Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
　本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。例えば、血清型１のＡＡＶのｃａｐは血清型２のＡＡＶのｃａｐに対応し得る。例えば、あるウイルスにおける対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となるウイルスの遺伝子配列をクエリ配列として用いてそのウイルスの配列データベースを検索することによって見出すことができる。
　本開示に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
　本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な細胞表面構造認識能、酵素活性、特定のタンパク質との結合能等を挙げることができるがそれらに限定されない。本開示においては、例えば、あるプロモーターが特定の宿主細胞において認識される機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドの対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、宿主細胞における上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
　本開示において使用する場合、ウイルスまたはウイルス由来構築物の「感染性」とは、ウイルスまたはウイルス由来構築物の細胞への接着または膜融合によって、ウイルスまたはウイルス由来構築物内の核酸を細胞内に導入する能力を指す。ウイルスまたはウイルス由来構築物の「複製能力」とは、感染細胞内で感染性のウイルス粒子またはウイルス由来構築物粒子を産生する能力を指す。
　本明細書において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入（必要に応じてウイルスまたはウイルス由来構築物を介した）を意味する。形質転換方法としては、宿主細胞に核酸を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、コンピテント化細胞の使用、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などの種々の周知の技術が挙げられる。
　本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。
　本明細書において「医薬成分」とは、医薬を構成し得る任意の成分を意味し、例えば、有効成分（それ自体が薬効を示すもの）、添加成分（それ自体は、薬効を期待されていないが、医薬として含まれる場合一定の役割（例えば、賦形剤、滑沢剤、界面活性剤等）を果たすことが期待される成分）等を例示することができる。医薬成分は、単独の物質であってもよく、複数の物質や剤の組み合わせであってもよい。有効成分と添加成分との組み合わせ、アジュバントと有効成分との組み合わせなどの任意の組み合わせも含まれ得る。
　本明細書では、「有効成分」は、意図される薬効を発揮する成分をいい、単独または複数の成分が該当し得る。
　本明細書において「添加成分」とは、薬効を期待されていないが、医薬として含まれる場合一定の役割を果たす任意の成分をいい、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤、（補）助剤、溶解度改善剤、可溶化剤、希釈剤、賦形剤、緩衝剤、結合剤、希釈剤、香味料、潤滑剤を挙げることができる。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子およびこれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、基材、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。
　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。標的タンパク質またはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。機能に影響を与えない任意の標識が使用できるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒが挙げられる。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５との組み合わせ等を挙げることができる。他の蛍光標識として、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ－アセトキシ－Ｎ２－アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等が挙げられる。本開示では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、ウイルス由来構築物、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、ウイルス由来構築物等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
　本明細書において「指示書」は、本開示を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示の医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与形態を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ　ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　用語「約」は、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。「約」が、温度について使用される場合、示された温度プラスまたはマイナス５℃を指し、「約」が、ｐＨについて使用される場合、示されたｐＨプラスまたはマイナス０．５を指す。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
　（ウイルス由来構築物プラスミドの作製）
　一つの局面において、本開示は、開始プラスミド（例えば、本開示のウイルス由来構築物プラスミド）から種々のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の少なくとも一部を含む開始プラスミドのセットを準備する工程であって、開始プラスミドのセットは、対応する代替単位核酸のセットを含み、対応する代替単位核酸のセットは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも１セットを含む、工程と、開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、切断代替単位核酸断片を含む混合溶液を調製する工程と、切断代替単位核酸断片をライゲーションして集積核酸を形成する工程と、集積核酸を形質転換生物に接触させてウイルス由来構成物プラスミドを形成する工程とを含む。開始プラスミドが複数の単位核酸を含むことで、開始プラスミドの制限酵素処理により生じる単位核酸断片はほぼ等モルとなり、煩雑な単位核酸断片のモル数調整を必要とせずに形質転換生物が効率的に取り込むことができる集積核酸を作製できる。また、開始プラスミドのセットが異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含むことで、生成物プラスミドの特定の位置に組み込まれる代替単位核酸は対応する代替単位核酸のセットの中からランダムに選択されるため、新たな構造を有するウイルス由来構成物プラスミドが容易に得られ、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットが存在する場合には、生成されるウイルス由来構成物プラスミドの構造的バリエーションは相乗的に増加する。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法において、対応する代替単位核酸のセットは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、１６通り以上、２７通り以上、３２通り以上、６４通り以上、８１通り以上、１２８通り以上、２４３通り以上、２５６通り以上、５１２通り以上、７２９通り以上、１０２４通り以上またはそれを超える異なる並行する代替単位核酸の可能な組み合わせを提供する。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、ウイルス由来構成物プラスミドの集合を作製する。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法において、開始プラスミドのセットのうちの少なくとも１つが動物細胞において作動する転写開始配列を含み、動物細胞において作動する転写開始配列を含むウイルス由来構成物プラスミドが作製される。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、３種類以上の開始プラスミドを使用する。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法において、対応する代替単位核酸のセットは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む。本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法により作製されたウイルス由来構築物プラスミドは、開始プラスミドとして使用して、次のラウンドの本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法に供することができる。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、形成されたウイルス由来構成物プラスミドの集合から、所望する機能に優れたウイルス由来構成物プラスミドを選択する工程をさらに含む。例えば、選択基準となる所望する機能として、プラスミドあたりのウイルス由来構成物の生産量、プロデューサー細胞あたりのウイルス由来構成物の生産量、プラスミドからウイルス由来構成物を生産する際に発生する不純物の量、プラスミドからウイルス由来構成物を生産する際の目的とするウイルス由来構成物の純度などが挙げられる。不純物としては、核酸配列を含まない外殻タンパク質、不完全な核酸配列を含む外殻タンパク質、不完全な外殻タンパク質、不完全な核酸配列、自己複製能を有する（生産工程中の遺伝子組換えにより生じた野生型ウイルス様の核酸配列を含む）ウイルスなどが挙げられる（変異の導入および切断など、ウイルス由来構成物プラスミドの核酸配列から想定される完全な核酸またはタンパク質と異なる構造を有することで不完全と判断され得る）。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、ライゲーションして集積核酸を形成する工程において、バーコード核酸を添加することを含んでもよく、そうすることで、形成されたウイルス由来構成物プラスミドの区別が容易になり得る。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法は、ウイルス由来構築物プラスミドの部分構造を改良するために実施できる。一つの実施形態において、これは、所望する機能に優れたウイルス由来構成物プラスミドを選択する上記の工程で選択されたウイルス由来構成物プラスミドの並行する代替単位核酸の組み合わせを含むウイルス由来構成物プラスミドを調製することで実施され得る。例えば、所望する機能に優れたウイルス由来構成物プラスミドが見出された場合、そのプラスミド上のエレメントの組み合わせは所望する機能のために好ましいと考えられ得るので、そのプラスミドの核酸配列情報または生じるアミノ酸配列情報を参考にして別のプラスミド上にこのエレメントの組み合わせと同様の構造を構築してもよいし、またはそのプラスミドから特定の領域を切り出し別のプラスミドに移植してもよい。この場合、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列全体を含むウイルス由来構築物プラスミドを作製して検討する必要はなく、ウイルス由来構築物プラスミドの中の改良を検討する部分構造のバリエーションを作製するために、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を実施することができる。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法において、構造バリエーションを検討するエレメントとして、（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列、（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列、（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列、（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列、（Ｅ）プロモーターをコードする核酸配列、（Ｆ）所望の遺伝子をコードする核酸配列、および（Ｇ）宿主細胞の生合成に関わる核酸配列などが挙げられる。これらのエレメント（またはそのエレメントに該当する個々の遺伝子）のバリアント（異なる血清型のもの、改変体、同じ宿主細胞で機能する異なるプロモーターなど）を対応する代替単位核酸のセットに含めることで、所望する機能に優れたウイルス由来構成物プラスミドの設計が促進され得る。検討すべき事項に応じて当業者は適当に代替単位核酸に含めるエレメントを決定できる。例えば、プロモーターと所望の遺伝子との適切な組み合わせを検討する場合には、異なるプロモーター配列を含む対応する代替単位核酸のセットを準備し、これに隣接する代替単位核酸として異なる所望の遺伝子の配列を含む対応する代替単位核酸のセットを準備して、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を実施することができる。その後、比較的に優れた性能を有するプロモーターと所望の遺伝子との複数の組み合わせを選択し、これらのプロモーターと所望の遺伝子との組み合わせを同時に含む単位核酸として対応する代替単位核酸のセットを準備し、異なるＩＴＲ配列を含む対応する代替単位核酸のセットと組み合わせて、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を実施することで、プロモーター、所望の遺伝子およびＩＴＲの好適な組み合わせを検討することができる。もちろん、異なるプロモーター配列、異なる所望の遺伝子の配列または異なるＩＴＲ配列を含む対応する代替単位核酸の３セットを準備して、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法を実施してもよい。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法において、対応する代替単位核酸のセットは、所望の遺伝子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む。
　一つの実施形態において、本開示は、枯草菌においてアデノ随伴ウイルス由来構築物プラスミドを作製する、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを作製する方法、そのような方法により作製されるウイルス由来構築物プラスミド、およびウイルス由来構築物を提供する。ウイルス由来の遺伝子は、変異の発生や宿主細胞への増殖阻害等により、宿主細胞によって複製が困難になる事態がしばしば発生する。特に、ＡＡＶが含むＩＴＲは、大腸菌においても変異が生じやすく、複製が困難とされる。また、現在の技術であっても、ウイルス由来構築物プラスミドの複製は任意の宿主細胞において容易に達成できるものではない。大腸菌によるウイルス由来構築物プラスミド複製においても種々の工夫がなされる中、宿主を枯草菌に変えて、ウイルス由来構築物プラスミドを構築・複製することは容易になし得たことではない。枯草菌におけるウイルス由来構築物プラスミドの形成・生産は、本開示の実験を通して初めて可能となったものである。
　（ＯＧＡＢ法）
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドおよび／またはそのライブラリーは、ＯＧＡＢ法によって作製され得る。ＯＧＡＢ（Ordered　Gene　Assembly　in　Bacillus　subtilis）法は、集積核酸を形質転換生物に取り込ませることでこの生物において環状のプラスミドを生成する方法である。ＯＧＡＢ法では、大きなサイズの核酸を含むプラスミドが簡便に調製され得る。集積核酸を調製するために使用される単位核酸は、以下で詳細に説明されるように単位ベクターとして調製してもよいし（主に新規プラスミドの構築のため）、構築したプラスミドを切断して調製してもよい。以下で、形質転換生物に取り込ませるための集積核酸の作製手順を説明する。
・単位核酸の調製
　集積核酸に組み込むための単位核酸を調製する。以下は、主に新規プラスミドの構築のための説明である。単位核酸は任意の公知の方法によって作製でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や化学合成により作製することができる。単位核酸は、所望のタンパク質（治療用タンパク質、ウイルス由来構築物を構成するタンパク質など）をコードする配列またはその部分、遺伝子を制御する配列（プロモーター、エンハンサーなど）、核酸を操作するための配列（制限酵素認識配列など）など任意の所望の配列を有し得る。集積核酸に組み込んだときに、複数種類の単位核酸が特定の順番および/または特性の方向に並ぶように、それぞれの単位核酸の末端は、特定の突出配列を生じるように構成され得る。最終的にプラスミド上に多数の単位核酸が集積され得るので、１つまたは複数の単位核酸は塩基長の長い１つまたは複数の遺伝子をコードするように設計されてもよい。塩基長の長い遺伝子としては、例えば、一連の代謝経路を構成する遺伝子群などが挙げられる。
・単位ベクターの調製
　単位核酸と、それとは異なる付加核酸とを連結することで単位ベクターを調製することができる。単位ベクターを使用することで、単位核酸をより容易に取り扱うことが可能になり得る。
　付加核酸は、直鎖状核酸であってもよいし、環状のプラスミドであってもよい。環状のプラスミドを付加核酸として使用する場合、単位ベクターも環状構造を有し得るため、例えば、大腸菌等の形質転換に使用できる。一つの実施形態において、導入された宿主中で単位ベクターが複製されるように、付加核酸は複製開始点を含み得る。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための全ての単位核酸は、同一種類の付加核酸に連結してもよく、そうすることで単位ベクター間のサイズ差を小さくし、複数種類の単位ベクターの取り扱いが容易になり得る。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための単位核酸は、異なる種類の付加核酸に連結してもよい。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための１つまたは複数の単位核酸について、（単位核酸の塩基長）/（単位ベクターの塩基長）の割合またはその平均は、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下、５％以下、２％以下、１．５％以下、１％以下または０．５％以下であり得る。付加核酸のサイズが単位核酸より大きいほど、異なる種類の単位ベクターのより均一な取り扱いが可能になり得る。単位核酸と付加核酸との連結は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション、ＴＡクローニング法など任意の方法で実施できる。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための１つまたは複数の単位核酸について、（単位核酸の塩基長）/（単位ベクターの塩基長）の割合またはその平均は、１％以上、０．３％以上、０．１％以上、０．０３％以上、０．０１％以上、０．００３％以上または０．００１％以上であり得、単位ベクターの操作が容易になり得る。
　一つの実施形態において、単位核酸の長さは、１０ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上または１５００ｂｐ以上、かつ５０００ｂｐ以下、５０００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、１２００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下または５００ｂｐ以下であり得る。
　一つの実施形態において、集積核酸は、２種以上、４種以上、６種以上、８種以上、１０種以上、１５種以上、２０種以上、３０種以上、４０種以上、５０種以上、６０種以上、７０種以上、８０種以上、９０種以上または１００種以上、かつ１０００種以下、７００種以下、５００種以下、２００種以下、１２０種以下、１００種以下、８０種以下、７０種以下、６０種以下７０種以下または５０種以下の単位核酸から構築され得る。各々の単位核酸（または単位ベクター）のモル数がほぼ同一になるように調整することで、タンデムリピート状の構造を有する所望の集積核酸が効率的に作製され得る。
　一つの実施形態において、単位核酸は、集積核酸における１セットの反復配列を単位核酸の数でほぼ等分した塩基長を有してもよい。そうすることで、各々の単位核酸（または単位ベクター）のモル数を揃える操作が容易になり得る。一つの実施形態において、単位核酸は、集積核酸における１セットの反復配列を単位核酸の数でほぼ等分した塩基長から３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下または５％以下の増大または減少した塩基長を有し得る。
　一つの実施形態において、単位核酸は、単位核酸の端部に非回文配列（パリンドローム配列でない配列）を有するように設計され得る。このように設計された単位核酸は、その非回文配列を突出配列にした場合、集積核酸において単位核酸が互いに順序を保ったまま連結した構造を容易に与え得る。
・集積核酸の作製
　集積核酸は、単位核酸を互いに連結することによって構築され得る。同じ開始プラスミド上に複数の単位核酸が存在する場合、この開始プラスミドを切断することで単位核酸断片を作製し、この単位核酸断片を互いに連結することによって集積核酸を構築することができる。一つの実施形態において、単位核酸は、単位ベクターから制限酵素などによって切り出されることで調製され得る。集積核酸は、反復配列のセットを１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０つ以上含み得る。集積核酸における反復配列は、単位核酸の配列および必要に応じて集積ベクター核酸の配列を含み得る。集積核酸は、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列を有し得る。一つの実施形態において、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列は、形質転換生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌（枯草菌））中で有効な複製開始点を含み得る。枯草菌中で有効な複製開始点の配列は、特に限定されないが、例えば、θ型の複製機構を有するものとしては、ｐＴＢ１９（Imanaka,T.,　et　al.　J.Gen.Microbioi.　130,　1399-1408.(1984)）やｐＬＳ３２（Tanaka,　T　and　Ogra,　M.　FEBS　Lett.　422,　243-246.(1998)）、ｐＡＭβ１（Swinfield,　T.J.,　et　al.　Gene　87,　79-90.(1990)）等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。
　集積核酸は、単位核酸の他にも、必要に応じて追加の塩基配列を含んでもよい。一つの実施形態において、集積核酸は、プロモーター、オペレーター、アクチベーター、ターミネーター等の転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。枯草菌を宿主とした場合のプロモーターとしては、具体的には、ＩＰＴＧ（isopropyl　s-D-thiogalactopyranoside）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Yansura,　D.　and　Henner,　D.J.　Pro.　Natl.　Acad.　Sci,　USA　81,　439-443.(1984.)）、あるいはＰｒプロモーター（Itaya,　M.　Biosci.　Biotechnol.　Biochem.　63,　602-604.(1999)）等が挙げられる。
　単位核酸は、集積核酸において一定の順序および向きを保った繰り返し構造を形成し得る。一つの実施形態において、単位ベクターから切り出された単位核酸の突出末端の塩基配列が互いに相補的になるように単位核酸を構築することで、集積核酸における一定の順序および向きを保った繰り返し構造の形成が可能になり得る。一つの実施形態において、異なる単位核酸毎に突出末端の構造をユニークにすることで、効率的に一定の順序および向きを保った繰り返し構造を形成し得る。一つの実施形態において、突出末端は、非回分配列を有してもよく、５’末端突出または３’末端突出のいずれであってもよい。
　一つの実施形態において、制限酵素を用いて単位ベクターから突出末端を有する単位核酸が切り出され得る。この実施形態において、単位ベクターは、１つまたは複数の制限酵素認識配列を有し得る。単位ベクターが複数の制限酵素認識配列を有する場合、それぞれの制限酵素認識配列は同じ制限酵素によって認識されてもよいし、異なる制限酵素によって認識されてもよい。一つの実施形態において、単位ベクターは、同じ制限酵素によって認識される１対の領域を、完全な単位核酸領域がこれらの領域の間に含まれるように含み得る。使用される制限酵素は、特に限定されないが、タイプＩＩ制限酵素、例えば、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＦｏｋＩ、ＳｆａＮＩなどのタイプＩＩＳ制限酵素を使用でき、これらの制限酵素は、認識配列の外側の認識配列から一定距離離れた部位に突出末端を創出可能であり得る。（例えば単独の）タイプＩＩＳ制限酵素を用いると、切り出した単位核酸の突出末端の配列が単位核酸毎に異なり得るので、複数の単位核酸を一定の順序および向きで集積させるのに有利であり得る。タイプＩＩＳ制限酵素を使用する一つの実施形態において、単位ベクターは単位核酸領域にそのタイプＩＩＳ制限酵素が認識する領域を含まない。認識領域を切断する制限酵素を使用する実施形態において、単位ベクターは単位核酸領域の末端にその制限酵素が認識する領域を含み得る。
　一つの実施形態において、複数の単位ベクターから単位核酸を切り出すために同じ種類の制限酵素を使用する場合、この複数の単位ベクターを含む溶液中で制限酵素処理を行うことができ、作業の効率が向上し得る。ある集積核酸を作製するために使用する制限酵素の種類は、例えば、５種以下、４種以下、３種以下、２種以下または１種であり得、少ない種類の制限酵素を使用することで、単位核酸間のモル数のばらつきが低減され得る。一つの実施形態において、単位ベクターから切り出された単位核酸は、アガロースゲル電気泳動など任意の公知の分画法により容易に精製され得る。
　単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸は、ＤＮＡリガーゼ等を用いて互いに連結（ライゲーション）することができる。これにより、集積核酸を作製できる。例えば、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸の連結は、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００など）および塩（例えば、１価のアルカリ金属、塩化ナトリウムなど）などの成分の存在下で実施することができる。ライゲーション反応液中の各単位核酸の濃度は、特に限定されず、１ｆｍｏｌ／μｌ以上などであり得る。ライゲーションの反応温度および時間は、特に限定されず、３７℃で３０分以上などである。一つの実施形態において、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸を連結させる前に、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸を含む組成物を制限酵素を失活させる任意の条件に供してもよい（例えば、フェノール・クロロフォルム処理）。
　単位核酸は、ＷＯ２０１５／１１１２４８に記載される方法などを使用して、ほぼ同じモル数に調整することができる。同じ開始プラスミド上に複数の単位核酸が存在する場合、この開始プラスミドを切断することで生じる（並行する）単位核酸の断片は自然と同じモル数に調整される。複数の開始プラスミドを混合および切断することで生じる（並行する）代替単位核酸のセットの合計モル数同士も自然と同じに調整される。単位核酸をほぼ同じモル数に調整することで、タンデムリピート状の構造を有する所望の集積核酸が効率的に作製され得る。単位ベクターまたは単位核酸の濃度を測定することで、単位核酸のモル数を調整することができる。
・集積核酸からのプラスミドの作製
　集積核酸を形質転換生物と接触させることで、形質転換生物においてプラスミドが形成され得る。一つの実施形態において、形質転換生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属などが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）などが挙げられる。好ましい実施形態において、形質転換生物は枯草菌である。一つの実施形態において、集積核酸を取り込ませる形質転換生物は、コンピテント状態であり、能動的に核酸を取り込むことができる。「コンピテント」とは、細胞が外来性の物質（例えば、核酸）に対してより透過性になった状態を指す。例えば、コンピテント状態の枯草菌は、基質となる２本鎖核酸を細胞上で切断し、２本鎖の内のいずれかの１本鎖をこの切断点から分解し、他方の１本鎖を菌体内に取り込む。取り込まれた1本鎖は、菌体内で環状の２本鎖核酸に修復され得る。形質転換生物をコンピテント状態にするために、任意の公知の方法を使用できるが、例えば、枯草菌は、Anagnostopoulou,　C.　and　Spizizen,　J.　J.　Bacteriol.,　81,　741-746(1961)に記載の方法を用いてコンピテント状態にすることができる。形質転換の方法は、それぞれの形質転換生物に適した公知の方法を用いることができる。
　（ウイルス由来構築物プラスミドのエレメント）
　一つの局面において、本開示は、ウイルス由来構築物プラスミドを提供する。以下でウイルス由来構築物プラスミドのエレメントについて記載するが、任意のエレメントまたはエレメントの組み合わせを代替単位核酸に含めて、本開示のウイルス由来構成物プラスミドを作製する方法を実施することができる。以下で記載するウイルス由来構築物プラスミドのエレメントは、開始プラスミドおよび生成物プラスミドのいずれにも当てはまる。また、以下で記載するウイルス由来構築物プラスミドのエレメントは、本開示のウイルス由来構築物プラスミドライブラリーにも当てはまる。
　一つの実施形態において、本開示は、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも一部を作動可能に連結されて含むプラスミドを提供する。一つの実施形態において、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列は、（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列（例えば、血清型１～１２またはその改変体のいずれかに由来する）と、（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列（例えば、ｒｅｐ、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２またはその改変体のいずれかに由来し得る）と、（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ｃａｐ、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２またはその改変体のいずれかに由来し得る）と、（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡのうちの少なくとも１つ、アデノウイルスの血清型１～５２またはその改変体のいずれかに由来し得る）とを含む。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、（Ａ）～（Ｄ）の核酸配列のうちの２つ、３つ、または４つを含む。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルス由来構築物プラスミド上のまとまった領域に配置される。ウイルスを構成するのに必要な核酸配列を含む核酸断片を元となるプラスミドに組み込むことでこのような構造のウイルス由来構築物プラスミドが形成され得る。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルス由来構築物プラスミドの全塩基長の約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、または約５％以下の塩基長の連続領域内に存在する。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列の末端反復配列以外の要素（例えば、ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列、パッケージング因子質をコードする核酸配列および機能補助因子のうちの１つまたは複数）は、各々、２つの末端反復配列の間に配置されてもよいし、外側に配置されてもよい。本開示のウイルス由来構築物プラスミドにおいて、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列の各要素は、任意の順序および位置で配置してもよく、図面などにおいて具体的に示した配置以外の種々の配置のものが使用できると理解される。機能補助因子など特定の機能で記載される核酸配列が複数の要素を含む場合、特段記載しない限り、ウイルス由来構築物プラスミドにおける各要素の順序および位置は任意であり得るが、任意の要素（例えば、ＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ４）同士を連続して（間に他の遺伝子を挟まずに）配置してもよい。機能補助因子として、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ボカウイルスおよびシミアンウイルスなどウイルス由来構築物プラスミドの起源ウイルスとは異なるウイルスに由来する遺伝子または遺伝子の組み合わせを使用してもよい。一つの実施形態において、機能補助因子として、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ、ヘルペスウイルスのＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ３０、ＵＬ４２、ＵＬ５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ８、およびＩＣＰ２２、パピローマウイルスのＥ１、Ｅ２、およびＥ６、ボカウイルスのＮＰ１、ＮＳ２、ＮＳ４、およびＢｏｃａＳＲ、ならびにシミアンウイルスのＬａｒｇｅ　Ｔ抗原が挙げられる。
　一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスの２つの末端反復配列を含み、２つの末端反復配列に挟まれる領域の塩基長（末端反復配列自体は除く）は、約１ｋｂ以上、約５ｋｂ以上、約１０ｋｂ以上、約２０ｋｂ以上、約３０ｋｂ以上、約４０ｋｂ以上、約５０ｋｂ以上、約７０ｋｂ以上、または約１００ｋｂ以上であり得る。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスの２つの末端反復配列およびその他の部分を含み、その他の部分は、前記２つの末端反復配列に挟まれる領域の外に位置付けられる。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む。特に、ウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列は、野生型配列（例えば、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２）の改変体であってもよいことが企図される。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、必要に応じて要素の上流にプロモーターを含む。例えば、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の核酸配列またはそこに含まれる遺伝子のうちの１つまたは複数の上流にプロモーターを含んでよい。例えば、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、１つまたは複数の所望の遺伝子の１つまたは複数の上流にプロモーターを含んでよい。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、薬剤選択マーカー核酸配列を、（Ａ）～（Ｄ）の核酸配列のいずれか２つの間に含む。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、薬剤選択マーカー核酸配列を、（Ａ）～（Ｄ）の核酸配列にコードされるいずれか２つの遺伝子の間に含む。一つの実施形態において、プロモーターをコードする代替単位核酸のセットが、種類または向きが異なるプロモーターをコードする対応する代替単位核酸のセットを含む。一つの実施形態において、プロモーターは、薬剤応答性のプロモーターを含む。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、腫瘍溶解ウイルス（がん細胞でのみ増殖するように改変されたものを含む）、またはウイルスレプリコン（ウイルス粒子産生能を欠失させた自己複製可能なウイルスゲノム）を生産するために使用される。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、微生物宿主細胞においてプラスミド複製を促進する核酸配列を含む。一つの実施形態において、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌において作動する複製起点、例えば、ｏｒｉＣ、およびｐＴＢ１９（Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ．　１３０，　１３９９－１４０８．　（１９８４））やｐＬＳ３２（Ｔａｎａｋａ，　Ｔ　ａｎｄ　Ｏｇｒａ，　Ｍ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４２２，　２４３－２４６．　（１９９８））、ｐＡＭβ１（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ，　Ｔ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　８７，　７９－９０．　（１９９０））等のプラスミドに含まれる複製起点を含み得る。枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージなどによる複製機構を作動させることが公知である、プラスミドもしくはその部分または複製起点あるいはそれらの改変体などが挙げられる。一つの実施形態において、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、公知の複製開始点と同一または類似の配列（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上の配列同一性）を有し得る。一つの実施形態において、微生物宿主細胞においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列が存在する連続領域内に配置されてもよいし、この連続領域外に配置されてもよい。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、枯草菌以外の生物の細胞において作製または使用され得るので、それら生物において作動する複製起点、プロモーター、転写終結配列などの転写翻訳調節配列を含み得る。生物ごとの転写翻訳調節配列は、公知であり、当業者が適宜選択できる。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、大腸菌、酵母などにおいて作製または複製され得るので、これらの微生物において作動する転写翻訳調節配列を含み得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、プロデューサー細胞に導入され得るので、プロデューサー細胞において作動する転写翻訳調節配列を含み得る。特に、プロデューサー細胞は動物細胞であり得るので、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、動物細胞において作動する転写翻訳調節配列を含み得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルスの全ゲノムのうち少なくとも一部の遺伝子の配列を含まない。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、宿主細胞の生合成に関わる核酸配列を含む。宿主細胞の生合成に関わる核酸配列とは、細胞内のコミュニケ―ション（代謝、小胞体プロセッシングなど）、抗アポトーシス、酸化ストレス、細胞増殖に関係する遺伝子を含む核酸配列であり、このような遺伝子として、Ｖ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原（ＳＶ４０ＬＴＡ）、ＴＡＸ、Ｋｒａｓ、Ｍｙｃ、ＭＩＲ１７ＨＧ、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＰＤＩＡ２、ＸＢＰ１、ＨＳＰＡ５、ＰＣ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）、ＰＤＫ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲＦ２、およびＣＰＳＦ６が挙げられる。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、２つの末端反復配列の間に配置され得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドにおける所望の遺伝子は、最終的にウイルス由来構築物の搭載核酸に含まれ得る。このような所望の遺伝子は、治療用タンパク質がコードされていてもよいし、遺伝子治療用遺伝子がコードされていてもよいし、ＣＡＲＴ療法など遺伝子細胞治療用遺伝子がコードされていてもよいし、タンパク質非コード機能性ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡなど）をコードしていてもよいし、これらと組み合わせてまたは独立にプロモーター、ターミネーター、インスレーター、エンハンサー、サイレンサー、複製起点などの転写翻訳調節配列を含んでもよい。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、サイトメガロウイルスプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーターを含む（必要に応じて、タンパク質コード遺伝子の上流に）。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ＩＲＥＳを含む（必要に応じて、タンパク質コード遺伝子の上流に）。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターという位置でウイルス由来構築物プラスミドに含まれる。一つの実施形態において、２セット以上のプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターがウイルス由来構築物プラスミドに含まれる。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ウイルス由来構築物を投与する被験体の染色体に組み込まれ得る。この実施形態において、所望の遺伝子は、被験体が元来有する遺伝子の発現を制御する機能を有してもよいし、長期にわたるタンパク質発現をもたらしてもよい。例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどに基づくウイルス由来構築物は、被験体の染色体に組み込まれ得る。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、治療用細胞（例えば、染色体）に組み込まれ得る（例えば、体外でのウイルス由来構築物による細胞の処理を介して）。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物の起源ウイルスが増殖するために必要な遺伝子を全て含むことはなく、そうすることで生産されるウイルス由来構築物が増殖能を備えないように構成されてもよい。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドにおける所望の遺伝子は、複数の遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、２～１００、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、７以上、１０以上、１２以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上または５０以上、かつ１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３５以下、３０以上、２５以下、２０以下、１７以下、１５以下、１２以下または１０以下の遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドにおける所望の遺伝子は、約０．１～１０００ｋｂｐ、例えば、約０．１ｋｂｐ以上、約０．３ｋｂｐ以上、約１ｋｂｐ以上、約２ｋｂｐ以上、約５ｋｂｐ以上、約７ｋｂｐ以上、約１０ｋｂｐ以上、約２０ｋｂｐ以上、約５０ｋｂｐ以上または約１００ｋｂｐ以上、かつ約１０００ｋｂｐ以下、約７００ｋｂｐ以下、約５００ｋｂｐ以下、約２００ｋｂｐ以下、約１００ｋｂｐ以下、約７０ｋｂｐ以下、約５０ｋｂｐ以下、約２０ｋｂｐ以下または約１０ｋｂｐ以下の塩基長を含み得る。本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ＯＧＡＢ法によって複数の遺伝子を含む複雑な構造に構築され得るので、所望の遺伝子も複雑な構造に構築され得る。ウイルス由来構築物の種類によって搭載核酸のサイズは制限され得るので、所望の遺伝子のサイズに応じてウイルス由来構築物の種類が選択されてもよい。一つの実施形態において、所望の遺伝子が複数の遺伝子を含むことで、被験体の組織（例えば、がん組織）特異的または時期特異的なプロモーターとこれに作動可能に連結された治療用遺伝子（治療用タンパク質コード配列、遺伝子治療用遺伝子、遺伝子細胞治療用遺伝子など）との組合せ、代謝カスケードを制御する一連の酵素の協調発現を可能と一連の酵素をコードする配列など、高度な機能性を有する核酸を被験体に送達可能であり得る。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドにおける所望の遺伝子にコードされるタンパク質としては、治療用ポリペプチド（例えば、補充療法）、免疫原性ポリペプチド（例えば、病原体ポリペプチド、がん抗原ポリペプチド）などが挙げられる。治療用ポリペプチドとしては、嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子）、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンドなどが挙げられる。
　病原体ポリペプチドとしては、細菌、真菌、寄生虫などの病原生物の細胞表面タンパク質、およびウイルスの表面に発現するタンパク質（例えば、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質など）が挙げられる。病原体ポリペプチドの具体例としては、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質）、レンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、マトリックス／カプシドタンパク質、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子産物）、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルスまたは日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物などのエボラウイルスまたはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、ＳＦＳウイルス免疫原）、コロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などのヒトコロナウイルス免疫原）、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、および肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原などが挙げられる。
　がん抗原ポリペプチドとして、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００　ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質、ムチン抗原、テロメラーゼ、核マトリックスタンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、パピローマウイルス抗原などが挙げられる。
一つの実施形態において、所望の遺伝子は、特定の疾患を治療するための遺伝子（例えば、遺伝子治療遺伝子）であり得る。特定の疾患に対して選択するべき遺伝子は当業者が適宜選択し得る。このような疾患として、例えば、各種病原体による感染症、嚢胞性線維症、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、癲癇、がん（メラノーマ、腺がん腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんなど）、糖尿病、筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、糖原貯蔵疾患、先天性肺気腫、レッシュ・ナイハン症候群、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病、アンジェルマン症候群、メープルシロップ尿症、加齢黄斑変性、黒内障、糖尿病性網膜症、網膜変性疾患、星状細胞腫、膠芽腫、心不全、末梢動脈疾患、関節炎、関節障害、内膜過形成、ＡＩＤＳ、筋消耗、腎臓欠損症、肝炎、ＬＤＬ受容体欠乏症、高アンモニア血症、クラッベ病、バッテン病、脊髄性大脳性運動失調症、フェニルケトン尿症、自己免疫疾患、アミノ酸代謝異常症、有機酸代謝異常症、脂肪酸代謝異常症、ミトコンドリア病、糖質代謝異常症、ライソゾーム病、ペルオキシソーム病、金属代謝異常症、プリンピリミジン代謝異常症、ビタミン代謝異常症、神経伝達物質異常症、脂質代謝異常症、結合組織異常症、先天性ポルフィリン症、α1-アンチトリプシン欠損症、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症障害、ファブリー病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脳梗塞、気分障害、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害、統合失調症、薬物依存性、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病、幻覚、妄想、認知症、パラノイア、自閉症スペクトラム障害、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食障害、体重障害、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症、過食症などが挙げられる。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ＣＡＲＴ療法などで使用する治療用細胞（例えば、染色体）に組み込まれ得る（例えば、体外でのウイルス由来構築物による細胞の処理を介して）。
　一つの実施形態において、本開示は、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを含むウイルス由来構築物プラスミドライブラリーを提供する。一つの実施形態において、本開示は、並行する一連の代替単位核酸として３個以上の代替単位核酸を含むウイルス由来構成物プラスミドを含む、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーを提供し、前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットのうちの各ウイルス由来構成物プラスミド上の並行する代替単位核酸は、約１０ｋｂ以上の長さを有し得る。一つの実施形態において、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーにおける対応する代替単位核酸のセットは、（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列とのうちの少なくとも１つの異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む。一つの実施形態において、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーにおける各ウイルス由来構成物プラスミドは、（Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列とを含む。一つの実施形態において、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーにおける対応する代替単位核酸のセットは、（Ａ）末端反復配列の間に位置する所望の遺伝子をコードする核酸配列、（Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、（Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列とのうちの少なくとも１つの異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットと、プロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットとを含む。一つの実施形態において、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーにおける異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットは、ＧＣ含量７５％以上である代替単位核酸を含む。一つの実施形態において、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーの対応する代替単位核酸のセットは、６４通り以上の異なる並行する代替単位核酸の組み合わせを可能とする対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、各ウイルス由来構成物プラスミドが同じ数の並行する代替単位核酸を含む。一つの実施形態において、各ウイルス由来構成物プラスミドはバーコード核酸配列を含む。
　本開示のウイルス由来構成物プラスミドライブラリーは、そこに含まれるウイルス由来構成物プラスミドの構造によって特徴付けることもできる。例えば、共通の遺伝子についてプロモーター部分の組み合わせが異なるプロモーターライブラリーの場合、ライブラリー中の各プラスミドは遺伝子の部分の配列および順番において共通であり得る。一つの実施形態において、ライブラリー中の各プラスミドは、タイプＩＩ制限酵素の認識配列を特定の位置（例えば、所定の遺伝子の上流または下流など）に有するという構造特徴を共通に有し得る。一つの実施形態において、ライブラリー中の各プラスミドは、タイプＩＩ制限酵素の認識配列および認識配列間の同じ配列を特定の位置（例えば、所定の遺伝子の上流または下流など）に有するという構造特徴を共通に有し得る。ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法においては、同じ制限酵素を使用して異なる切断末端を生じることが操作上効率的であり得るので、好ましくは、プラスミドはタイプＩＩ制限酵素の認識配列を含む。一つの実施形態において、ライブラリーは、共通部分および組み合わせにおいて異なる部分を有するプラスミドを含むかまたはからなる。「組み合わせにおいて異なる部分」とは、組み合わせを構成する各エレメントについては同じものがライブラリー中の異なるプラスミド上に見出されるが、エレメントの同じ組み合わせはライブラリー中の異なるプラスミド上に見出されないような、エレメントの組み合わせを指す。「共通部分」は、ライブラリー中の全てのプラスミドに見出される配列を有し得る。例えば、プロモーターライブラリーが、
プロモーター１＋遺伝子Ａ＋プロモーター３＋遺伝子Ｂ
プロモーター２＋遺伝子Ａ＋プロモーター３＋遺伝子Ｂ
プロモーター１＋遺伝子Ａ＋プロモーター４＋遺伝子Ｂ
プロモーター２＋遺伝子Ａ＋プロモーター４＋遺伝子Ｂ
という４種類のプラスミドで構成される場合、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂは共通部分であり、例えば、プロモーター１およびプロモーター３の組み合わせは、組み合わせにおいて異なる部分である。一つの実施形態において、ライブラリー中のプラスミドにおける組み合わせにおいて異なる部分を構成するエレメント（例えば、特定の位置のプロモーター）は、同じライブラリー中の他の（例えば、全ての）プラスミドの対応する位置（特定の位置の対応する単位核酸またはその部分）のエレメントと同様の機能（例えば、プロモーターとしての機能）を有することができ、例えば、他の生物種（例えば、他の血清型のウイルス）の対応するエレメントまたは同じエレメントからの改変によって作製されたバリアントを使用することができるが、特に限定されず、実施例のように同様の機能（例えば、プロモーターとしての機能）を有するが、生物学上無関係なエレメントをプラスミドの対応する位置に含んでもよい。
（ウイルス由来構築物）
　本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物を生産するために使用される。一つの実施形態において、本開示は、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを使用してウイルス由来構築物を作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、このように作製されたウイルス由来構築物含有組成物またはウイルス由来構築物を提供する。ウイルス由来構築物としては、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、コロナウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、コクサッキ―ウイルス、およびニューカッスル病ウイルスに基づくウイルス由来構築物が挙げられる。一つの実施形態において、ウイルス由来構築物は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはアデノウイルスに基づくウイルス由来構築物である。一つの実施形態において、本開示は、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを使用してウイルス由来構築物ライブラリーを作製する方法およびそのように作製されたウイルス由来構築物ライブラリーを提供する。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、プロデューサー細胞に導入されてウイルス由来構築物を生産する。プロデューサー細胞の例として、例えば、ヒト胚性腎臓細胞（ヒト胎児の腎細胞にアデノウイルス５を切断したＤＮＡをトランスフェクションさせることにより作製されたもの）、９１１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｅ１形質転換羊膜細胞、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＩＴ２９３ＳＦ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３－Ｆ（商標）、Ｅｘｐｉ２９３　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ、Ｅｘｐｉ２９３　ＮＧＴ－Ｖｉｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌｓ　１．０、Ｖｉｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌｓ　２．０（ＶＰＣ２．０細胞）、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）２９３Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）２９３Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）、ＶｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓ（商標）２９３　ＡＡＶ生産細胞、ＶｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓ（商標）　２９３Ｔレンチウイルス生産細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。生産するウイルス由来構築物の種類に応じて、任意の公知の好適なプロデューサー細胞が選択され得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物の起源ウイルスの遺伝子のうちの少数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）を欠損し、他の全ての遺伝子を含んでもよい。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物を生産するために必要な遺伝子セットのうちの一部を欠損しており、遺伝子セットのうちのウイルス由来構築物プラスミドが欠損している遺伝子は、ウイルス由来構築物プラスミドとはトランスにプロデューサー細胞において供給される。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、その他のプラスミドと組み合わせることなく単独でプロデューサー細胞に導入することでウイルス由来構築物の生産を可能にし得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物を生産するために必要な遺伝子セットのうちウイルス由来構築物プラスミドが欠損した遺伝子全てを発現するプロデューサー細胞に導入され得る。例えば、ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ、ならびにアデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡを含む本開示のウイルス由来構築物プラスミドは単独で、アデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するＨＥＫ２９３細胞に導入することでウイルス由来構築物を生産し得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物を生産するために必要な遺伝子セットのうちウイルス由来構築物プラスミドが欠損した遺伝子を含む別の核酸またはその遺伝子の産物（例えば、ウイルス粒子）とともにプロデューサー細胞に導入され得る。
　一つの実施形態において、ウイルス由来構築物は、ウイルス由来構築物プラスミドを、ウイルス由来構築物の起源ウイルスを感染させたプロデューサー細胞の中に導入し、その細胞の中で相同組み換えを生じさせることにより作製することができる。この実施形態において使用するウイルス由来構築物プラスミドは、所望の遺伝子および起源ウイルスのゲノムのいずれかの領域（例えば、遺伝子間の領域）に相同性を有する核酸配列を含む。一つの実施形態において、ウイルス由来構築物プラスミドは、生産するウイルス由来構築物の起源ウイルスのゲノムのいずれかの遺伝子の間に所望の遺伝子を含む構造を有し得る。一つの実施形態において、ウイルス由来構築物プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部がプロデューサー細胞の染色体に組み込まれる。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、生産するウイルス由来構築物の起源ウイルスの搭載核酸切り出しのためのセグメント（レトロウイルスにおけるＬＴＲ、ＡＡＶにおけるＩＴＲなど）を含み、一つの実施形態において、このセグメントの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、このセグメントの間に所望の遺伝子ならびにこれに作動可能に連結したプロモーターおよび／またはターミネーター（例えば、ウイルス由来構築物が標的とする対象において作動可能であるもの）を含む。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、このセグメントの間にウイルス由来構築物の起源ウイルスの複製のために必要な遺伝子を含まない。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、生産するウイルス由来構築物の起源ウイルスのパッケージングシグナルを含む。
　生産されるウイルス由来構築物は構造タンパク質（カプシドなど）を有し、構造タンパク質は組織または細胞との結合に関与し得る。そのため、構造タンパク質を改変して組織または細胞（またはその表面構造）との結合性を改変することでウイルス由来構築物の組織または細胞への標的化を調整することができる。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、構造タンパク質をコードする遺伝子を有してもよく、この構造タンパク質は改変されていてもよい。例えば、組織または細胞標的化を調整する構造タンパク質の改変として、他のタンパク質（他のウイルスカプシド（例えば、他の血清型のウイルスのカプシド、ＶＳＶ－Ｇ）、抗体の抗原結合領域、被験体生物のリガンドタンパク質（がん抗原に対するリガンド）など）との置換または融合が挙げられる。また、エンベロープを有するウイルス由来構築物は、プロデューサー細胞の細胞膜成分をエンベロープに含み得る。そのため、プロデューサー細胞の細胞膜成分を改変することで、エンベロープを有するウイルス由来構築物の組織または細胞への標的化を調整することができる。構造タンパク質を有さないウイルス由来構築物の場合、脂質粒子等の非ウイルス由来物質を用いて細胞への標的化を調整し得る。一つの実施形態において、ウイルス由来構築物は、神経細胞（末梢神経系または中枢神経系の細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトなどの脳細胞など）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、角膜細胞など）、上皮細胞（例えば、腸または呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞など）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、がん細胞などを標的とするように設計されてもよい。それぞれの細胞に特異的な表面構造（受容体など）は、公知であり、当業者は、その表面構造に強力にまたは特異的に結合するタンパク質を適宜選択できる。
　一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、生産するウイルス由来構築物の起源ウイルスのタンパク質を弱毒化したタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。本開示のウイルス由来構築物プラスミドは、任意の公知の弱毒化ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。
　一つの実施形態において、本開示は、本開示のウイルス由来構築物プラスミドの集団を含むプラスミド含有組成物を提供する。一つの実施形態において、プラスミド含有組成物は、プラスミドのＣＣＣ（covalently　closed　circular）純度が、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９５％以上であり得る。本開示の方法により作製された本開示のウイルス由来構築物プラスミド、ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよび本開示のウイルス由来構築物プラスミド含有組成物は、プラスミドの立体構造や塩基修飾などにおいて完全には分析できないまたは分析することが非常に困難な構造特徴を有し得る。そのため、本開示の方法により作製されたという特徴は、本開示のウイルス由来構築物プラスミド、ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよび本開示のウイルス由来構築物プラスミド含有組成物を適切に表現する特徴の一つである。
・アデノウイルス由来構築物
　アデノウイルスは、アデノウイルス科マストアデノウイルス属のウイルスであり、ウイルス粒子は、ヌクレオキャプシドおよび二本鎖線状ＤＮＡゲノムから構成され、９０～１００ｎｍの正２０面体の構造を有する。アデノウイルスの感染は細胞表面のｃｏｘａｃｋｉｅ－ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）にウイルスカプシドが吸着することにより開始され、次いで細胞表面のインテグリンを介してウイルスは細胞内に侵入し得る。その後、ライソゾームから脱出したウイルスゲノムは核内に到達しウイルスゲノムの複製をもたらし得る。ウイルス複製は、まずＥ１Ａ蛋白質が発現し、他の初期蛋白質であるＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の発現を活性化することで開始される。ウイルスゲノムは、Ｅ２から発現した末端タンパク質（ＴＰ）とデオキシシチジンとが共有結合し、これにさらにポリメラーゼが結合した複合体が形成されて複製が開始される。ゲノムはまた、ペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、骨格タンパク質（Ｌ４）、および繊維タンパク質（Ｌ５）を含む構造タンパク質をコードし、単一プロモーターの制御下にある、５つの後期転写単位（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５）も含む。ゲノムの両端は、ウイルスの複製に必要な逆向き末端配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ：　ＩＴＲ）を含む。ウイルスの構造タンパク質は細胞質で翻訳された後、核内に移行してウイルス粒子を構成し、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル（ψ）を認識してゲノムをパッケージングする。また、アデノウイルスは、タンパク質非コードＶＡ　ＲＮＡを生産し、これは、ＶＡ遺伝子にコードされている。アデノウイルス粒子は、Ｌ２およびＬ３のカプシドを有し得る。
　現在までに５２のヒトアデノウイルスの抗原型が同定され、それは血球凝集反応の性質と配列相同性に基づいて６つのサブグループ：サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５および５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９および４２～４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０および４１）、および未分類の血清型群（例えば、血清型４９および５１）に分類されている。
　一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間にアデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がアデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよい。
　一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ＩＸ、ＩＶａ２をコードする遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、Ｅ３以外のアデノウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、構造タンパク質をコードする核酸配列（Ｌ２、Ｌ３）と、パッケージング因子をコードする核酸配列（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４）と、２つの末端反復配列（５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ）と、機能補助因子をコードする核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、機能補助因子をコードする核酸配列は、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ３、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ以外の全てのアデノウイルス遺伝子であり得る。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、ＶＡ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。特定の実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを含まない。一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物プラスミドは、Ｅ１Ａを欠損しており、この欠損箇所に所望の遺伝子が挿入されていてもよい。ＶＡ　ＲＮＡは、ヒトにおいてエクスポーチン、ＲＩＳＫ、Ｄｉｃｅｒなどと相互作用することが知られており、アデノウイルス由来構築物プラスミドからＶＡを欠損させることでアデノウイルス由来構築物感染細胞への副作用が低減され得る。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４は、アデノウイルスの複製に必要な遺伝子であり得るので、これらを欠損させたアデノウイルス由来構築物プラスミドは、感染細胞における複製能力が低減され得る。
　一つの実施形態において、本開示のアデノウイルス由来構築物はヒトのサブグループＣ、例えば、血清型２または血清型５由来であり得る。一つの実施形態において、本開示のアデノウイルス由来構築物は血清型１２（サブグループＡ）、血清型７または血清型３５（サブグループＢ）、血清型３０または血清型３６（サブグループＤ）、血清型４（サブグループＥ）、あるいは血清型４１（サブグループＦ）由来であり得る。アデノウイルス由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｈｅｌａ、Ｓｆ９などの細胞が挙げられる。
・アデノ随伴ウイルス由来構築物
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は，パルボウイルス科ディペンドウイルス属の線状一本鎖ＤＮＡウイルスであり、ウイルス粒子は直径２０～２６ｎｍである。ＡＡＶの増殖にはアデノウイルスエレメントが必要である。ＡＡＶゲノムの量末端にはＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれるＴ字型のヘアピン構造が存在する。このＩＴＲの部分が複製の開始点となり、プライマーの役割を果たす。また、ウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにもこのＩＴＲが必要である。ゲノムの左半分に非構造蛋白質、すなわち複製や転写を司る調節タンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子が存在し、ゲノムの右半分に構造蛋白質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の三つのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子が存在する。
　ＡＡＶの生活環は潜伏感染と溶解感染に分けられる。前者は単独で感染した場合であり、宿主細胞の第１９番染色体長腕のＡＡＶＳ１領域（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）へ組み込まれるのが特徴的である。この組込みは非相同組換えによるものでありＲｅｐが関与している。ＡＡＶＳ１領域とＩＴＲのＲｅｐ結合領域とに共通して存在する塩基配列（ＧＡＧＣ繰返し配列）に，Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ７６が結合することが報告されている。したがって、野生型ＡＡＶが標的細胞に感染した際には、ＲｅｐがＡＡＶのＩＴＲおよびＡＡＶＳ１に結合し、Ｒｅｐが介在することによりＡＡＶゲノムの第１９番染色体への部位特異的組込みが起こるものと考えられている。アデノウイルスなどのヘルパーウイルスが同時に感染した場合、ＡＡＶが潜伏感染している細胞にさらにヘルバーウイルスが重複感染した場合にＡＡＶの複製が起こり、細胞破壊により大量のウイルスが放出される（溶解感染）。
　一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物プラスミドは、ＡＡＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間にＡＡＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がＡＡＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよい。
　一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、ｒｅｐ、ｃａｐ、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、ＭＡＡＰ（膜会合アクセサリータンパク質）および３’ＩＴＲ、ならびにアデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡおよびＥ４であり得る。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＡＡＶ構造タンパク質をコードする核酸配列（ｃａｐ）と、ＡＡＶのパッケージング因子をコードする核酸配列（ｒｅｐ）と、ＡＡＶの２つの末端反復配列（５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ）と、機能補助因子をコードする核酸配列（アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、Ｅ４）とを含み得る。一つの実施形態において、ＡＡＶ由来構築物プラスミドは、ｒｅｐ、ｃａｐ、ＶＡ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、アデノウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。
　ＡＡＶは、カプシドに基づいて１～１２型までの血清型が報告されている。また、ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０の血清型も報告されている。本開示のＡＡＶ由来構築物は、標的組織に応じて好適な血清型のＡＡＶに基づいて作製されてもよい。例えば、（血清型）：（標的組織）の関係は以下の通りに選択されてもよい；（ＡＡＶ１）：（筋肉、肝臓、気道、神経細胞）、（ＡＡＶ２）：（筋肉、肝臓、神経細胞）、（ＡＡＶ３）：（筋肉、肝臓、神経細胞）、（ＡＡＶ４）：（筋肉、脳室上衣細胞）、（ＡＡＶ５）：（筋肉、肝臓、神経細胞、グリア細胞、気道）、（ＡＡＶ６）：（筋肉、肝臓、気道、神経細胞）、（ＡＡＶ７）：（筋肉、肝臓）、（ＡＡＶ８）：（筋肉、肝臓）、（ＡＡＶ９）：（筋肉、肝臓、気道）。ＡＡＶ由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｈｅｌａ、Ｓｆ９などの細胞が挙げられる。ＡＡＶのカプシドとして、野生型の他に、標的化変異を加えたカプシド（ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ９．ＨＲなど）、ランダム変異を加えたカプシド（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂなど）、インシリコで設計したカプシド（Ａｎｃ８０など）が挙げられ、一つの実施形態において、本開示のＡＡＶ由来構築物はこれらの改変カプシドを含んでもよく、本開示のＡＡＶ由来構築物プラスミドはこれらの改変カプシドをコードするように構築されてもよい。本明細書において、核酸配列が特定の血清型に由来すると記載する場合、核酸配列は、野生型のカプシドをコードしてもよいし、野生型のカプシドに基づき上記のような改変が施されたカプシドをコードしてもよいことが企図される。
・レトロウイルス由来構築物
　本明細書において、「レトロウイルス」は、一般にレトロウイルス科のウイルスを指す。レトロウイルスは、主にゲノムをＲＮＡからＤＮＡに逆転写する能力を特徴とする二本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。ビリオンの長さは直径約１００～１２０ｎｍであり、ヌクレオキャプシドタンパク質と複合体を形成した同一のプラスＲＮＡ鎖の二量体ゲノムを含有する。ゲノムは、ウイルス感染に必要な酵素タンパク質、すなわち逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼを含有するキャプシドに封入されている。マトリックスタンパク質が、ウイルス核粒子の周りを囲む、宿主細胞膜に由来する脂質二重層であるエンベロープと相互作用するキャプシドコアの外側の層を形成する。この二重層には、宿主細胞上の特異的受容体を認識し、感染プロセスを開始させるウイルスエンベロープ糖タンパク質が固定されている。エンベロープタンパク質は、タンパク質を脂質膜内に固定させる膜貫通（ＴＭ）と細胞受容体に結合する表面（ＳＵ）の２つのサブユニットによって形成される。
　レトロウイルスとして、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｆｕｊｉｎａｍｉ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ　ＭＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫症ウイルス２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスは、「霊長類」および「非霊長類」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「遅発性ウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびより最近になって記述されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
　感染プロセスの間、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に付着する。感受性の宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは宿主細胞核に輸送され、次いで宿主ゲノムに組み入れられ、この状態はプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂中の宿主染色体において安定であり、他の細胞タンパク質のように転写される。プロウイルスは、より多くのウイルスを作製するために必要とされるタンパク質およびパッケージング機構をコードし、出芽して細胞から離れることができる。レトロウイルスが宿主細胞から出芽すると、それらは宿主細胞脂質膜を含む。このようにして、宿主細胞由来膜タンパク質がレトロウイルス粒子の一部となる。
　レトロウイルスのゲノムは、ｇａｇ（群特異的抗原）、ｐｒｏ（プロテアーゼ）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）およびｅｎｖ（エンベロープ）の４つの遺伝子を含む。ｇａｇ配列は、マトリックスタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、およびキャプシドタンパク質の３つの主要な構造タンパク質をコードする。ｐｒｏ配列は、粒子の集合、出芽および成熟の間にＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌを切断する役割を担うプロテアーゼをコードする。ｐｏｌ配列は、逆転写酵素およびインテグラーゼの酵素をコードし、前者は、感染プロセスの間にウイルスゲノムのＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を触媒し、後者はＬＴＲをプロセシングし、プロウイルスＤＮＡを宿主細胞ゲノムへ組み入れる役割を担う。ｅｎｖ配列は、エンベロープ糖タンパク質のＳＵおよびＴＭサブユニットの両方をコードする。レトロウイルスが特異的な細胞表面受容体を使用してその標的宿主細胞に結合する能力はＥｎｖタンパク質の表面成分（ＳＵ）によって与えられるが、レトロウイルスが膜融合を介して細胞に進入する能力は、膜アンカー型膜貫通成分（ＴＭ）によって付与され得る。レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主細胞染色体への組み入れを促進するために必要な要素を含有し、この要素として、２つのＬＴＲ（長い末端反復）、新たに形成するビリオンへのウイルスＲＮＡの特異的パッケージングに必要なパッケージングシグナル（ψ）配列、および逆転写の間にプラス鎖ＤＮＡ合成を開始する部位として機能するポリプリントラクト（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ；ＰＰＴ）のような非コーディングシス作用性配列が挙げられる。長鎖末端反復（ＬＴＲ）は約６００ｎｔの長さであり、そのうちＵ３領域が４５０、Ｒ配列が１００、Ｕ５領域がおよそ７０ｎｔの長さである。
　レンチウイルスなどの複合レトロウイルスのゲノムは、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、ウイルス遺伝子発現、感染性粒子の集合を調節し、感染細胞におけるウイルス複製をモジュレートするアクセサリー遺伝子を含み得る。代表的なレンチウイルスはＨＩＶ－１である。レンチウイルスは、２つの制御遺伝子、ｔａｔおよびｒｅｖを含み得る。例えば、ＨＩＶ－１はｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをさらに含む。他にもｖｐｘなどのアクセサリー遺伝子が存在する。これらのアクセサリー遺伝子は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングならびに他の複製機能の制御に関与している。特に、ＨＩＶはその他にも構造的ランドマーク（ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、ＩＮＳ）などを含む。レンチウイルス粒子は、ｐ２４のカプシドタンパク質を含み得る。
　一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、レトロウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび所望の遺伝子の間にｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ（ＰＢＳ）および／またはポリプリントラクト（ＰＰＴ）を含んでもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、所望の遺伝子および３’ＬＴＲの間にウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がレトロウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物の構築の際に、ｅｎｖをＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質Ｇ）をコードする遺伝子と取り換えてもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物（レンチウイルスを含む）プラスミドは、ＶＳＶ－Ｇ遺伝子を追加で含んでもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物（レンチウイルスを含む）の構築の際に、ｅｎｖに加えてまたはこれと置き換えて、狂犬病ウイルスの糖タンパク質遺伝子（ＲＶ－Ｇ）またはＲＶ－Ｇの細胞内ドメインを水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）のもので置換した融合糖タンパク質（ＦｕＧ－Ｂ）を使用してもよく、レトロウイルス由来構築物（レンチウイルスを含む）プラスミドは、これらの遺伝子を含んでもよい。
　一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、構造タンパク質をコードする核酸配列（ｇａｇ）と、パッケージング因子（ψ）と、２つの末端反復配列（５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ）と、機能補助因子をコードする核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、機能補助因子をコードする核酸配列は、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖであり得る。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。ｐｏｌは、レトロウイルスの複製に必要な遺伝子であり得るので、これを欠損させたレトロウイルス由来構築物プラスミドは、感染細胞における複製能力が低減され得る。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間にレトロウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーター、およびターミネーターを含む。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、ＬＴＲのＵ３領域が欠損するように改変されていてもよい。レトロウイルス由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３Ｔなどの細胞が挙げられる。
　一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、構造タンパク質をコードする核酸配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇ、ｅｎｖ）と、パッケージング因子（パッケージングシグナル（ψ）配列）と、２つの末端反復配列（５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ）と、機能補助因子をコードする核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、機能補助因子をコードする核酸配列は、ｒｅｖであり得る。一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物プラスミドは、ｒｅｖ、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。ｐｏｌおよびｒｅｖは、レンチウイルスの複製に必要な遺伝子であり得るので、これらを欠損させたレンチウイルス由来構築物プラスミドは、感染細胞における複製能力が低減され得る。一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物プラスミドは、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｖｐｘ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、ＩＮＳ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰ、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＰＲＥ、ＷＲＰＥ、ｏＰＲＥのうちの１つまたは複数を含んでもよい。一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間にレンチウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーター、ターミネーター、およびＷＰＲＥを含む。一つの実施形態において、レンチウイルス由来構築物プラスミドは、ＬＴＲのＵ３領域、ＴＡＴが欠損するように改変されていてもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、ＬＴＲのＵ３領域が欠損するように改変されていてもよい。レンチウイルス由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａなどの細胞が挙げられる。
・単純ヘルペスウイルス由来構築物
　単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヘルペスウイルス科、アルファヘルペスウイルス亜科、シンプレックスウイルス属のウイルスである。ＨＳＶ粒子は直径約１００ｎｍであり、正２０面体のカプシドがエンベロープで覆われた構造を有する。カプシドの内部には，約１５０ｋｂｐの直鎖状の２本鎖ＤＮＡがパッケージングされており、ウイルスＤＮＡゲノムには少なくとも７４種のウイルスタンパク質がコードされている。これらウイルスタンパク質をコードする遺伝子は発現時期によって３群（α、β、γ）に分類され、それぞれの発現はカスケード状に制御されている。α遺伝子群にはα０、α４、α２２、α２７、α４７が含まれ、α０、α４、α２２、α２７は他のウイルス遺伝子の発現制御を行うタンパク質をコードしている。α遺伝子が発現されると、これらの遺伝子産物がβ遺伝子群の発現を活性化する。β遺伝子群はＤＮＡポリメラーゼ複合体、ＤＮＡプライマーゼ／ヘリカーゼ複合体などのウイルスＤＮＡ複製に必須な蛋白質やチミジンキナーゼ（ＴＫ）、リボヌクレオチド還元酵素などのデオキシリボヌクレオチド代謝に関わる酵素群を主にコードする。その後、ウイルス粒子の構造タンパク質をコードするγ遺伝子群が発現され、新しい感染性ウイルスが産生される。
　知覚神経終末から侵入したウイルス粒子はアクソン内を上向し、神経細胞の核に到達し、そこで増殖を開始あるいは潜伏する。知覚神経節に潜伏中のＨＳＶは感染性ウイルスを産生せず、ウイルスゲノムからはＬＡＴ（ｌａｔｅｎｃｙ　ａｓｓｏｃｉ－ａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）と呼ばれる転写物が唯一恒常的に発現される。ＬＡＴのプロモーターであるＬＡＰ（ｌａｔｅｎｃｙ　ａｃｔｉｖｅ　プロモーター）は神経細胞において永続的な遺伝子発現を可能にするプロモーターであり、これは神経細胞を標的とした遺伝子治療で有用であり得る。潜伏感染している神経細胞ＨＳＶは、再活性化されてアクソン内を遠心性に輸送され皮膚、粘膜に回帰発症を起こし得る。
　ＨＳＶ由来構築物の利点としては、（１）宿主域が広くほとんどの培養細胞に感染し、増殖する、（２）分裂・非分裂細胞の両方に感染が可能である、（３）外来性遺伝子を搭載しうる許容量が大きい、（４）自己のＴＫを保有しているため、抗ウイルス剤アシクロビルやガンシクロビアが有効であり、たとえ予期せぬ増殖が起こっても治療が可能である、（５）神経細胞内ではエピゾームとして安定に存在し，プロモーターによっては長期間にわたり遺伝子発現を持続できる、（６）マウスに対してヒトと同じような病原性を示し、モデル動物として利用できることなどが挙げられる。また、細胞傷害性が強いことは腫瘍の治療のために有益であり得る。
　一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、所望の遺伝子の上流にＤＮＡ複製開始起点（ｏｒｉ）を含む。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、ＬＡＰを含んでもよく（例えば、ｏｒｉと所望の遺伝子との間に）、そうすることでＨＳＶ由来構築物の宿主細胞において導入した遺伝子を長期発現させ得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。例えば、ウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよいし、プロデューサー細胞に導入される別の核酸分子（例えば、プラスミド）にコードされていてもよいし、ウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子の遺伝子産物（ウイルス粒子の形態であってもよい）がプロデューサー細胞に導入されてもよい。一つの実施形態において、プロデューサー細胞に導入される本開示のウイルス由来構築物プラスミドとは別の核酸分子は、ｐａｃおよびＤＮＡ複製開始起点（ｏｒｉ）のうちの１つまたは複数を欠損していてもよく、搭載核酸がこの核酸由来の核酸を含むことが回避され得る。
　一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＨＳＶの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＵＬ９、ＵＬ１９、ＵＬ２６、ＵＬ３５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ１１をコードする遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、α０、α２２、α４７のうちの１つまたは複数以外のＨＳＶの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、α２２以外のＨＳＶの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、α０、α４、α２２、α２７、α４７のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、α４およびα２７遺伝子のうちの一方または両方を欠損する。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、ＩＣＰ６を欠損する。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、α４、α２２およびα２７を欠損する。
　一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物は弱毒化するように改変され得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）、デオキシウリジントリフォスファターゼ（ｄＵＴＰａｓｅ）、γ３４．５のうちの１つまたは複数を欠損するように改変され得る。一つの実施形態において、ＨＳＶ由来構築物プラスミドは、γ３４．５欠損箇所にサイトカイン（免疫活性化サイトカインなど）をコードする遺伝子を導入するように改変され得る。一つの実施形態において、これらの遺伝子を欠損するＨＳＶ由来構築物プラスミドを含むプロデューサー細胞にこれらの遺伝子を供給せずにＨＳＶ由来構築物を生産させることで、これらを欠損するＨＳＶ由来構築物が得られ得る。例えば、ＴＫはがん細胞において高度に発現し得るので、ＴＫ欠損ＨＳＶ由来構築物は、がん細胞選択的に機能し得る。ＨＳＶ由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、Ｈｅｌａ、Ｖｅｒｏなどの細胞が挙げられる。
・センダイウイルス由来構築物
　センダイウイルス（ＳｅＶ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。センダイウイルスはニューロンを含む非分裂細胞にも感染し得る。センダイウイルスの感染後、ウイルスゲノムは宿主細胞の染色体に組み込まれずＲＮＡの状態で細胞質に留まる。
　センダイウイルスのタンパク質をコードする遺伝子としては、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子が挙げられる。Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子は、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼおよびラージ蛋白質をコードする。一般的に野生型センダイウイルスのゲノム上には、３’の短いリーダー領域（ＬＥ）に続き、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｐ（ホスホタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）、Ｆ（フュージョンタンパク質）、ＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）およびＬ（ラージタンパク質）をコードする６つの遺伝子が並んでおり、他端に短い５’トレイラー領域（ＴＲ）が存在する。Ｐ遺伝子の領域からはＣおよびＶと呼ばれるアクセサリータンパク質も翻訳される。
　センダイウイルスは、宿主細胞の細胞質におけるチューブリンおよびセンダイウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（Ｌタンパク質）の両方によって遺伝子を発現する。センダイウイルスは、宿主細胞のゲノムと相互作用せず、ヒトに対して病原性ではない。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルス由来構築物のヒトに対する安全性を示唆する。Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、およびＨＮタンパク質は、センダイウイルスのウイルス粒子の形成およびウイルス感染を担い得る。Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質は、ウイルスゲノムの発現および複製を担い得る。
　一つの実施形態では、プロデューサー細胞においてセンダイウイルス由来構築物プラスミドから転写された核酸は、センダイウイルス由来構築物の搭載核酸となる。そのため、以下のセンダイウイルス由来構築物プラスミドに関する特徴は、センダイウイルス由来構築物の搭載核酸の特徴でもあり得る。
　一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、センダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態では、所望の遺伝子は、センダイウイルス遺伝子（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子）のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態では、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、所望の遺伝子の上流または下流にＥＩＳ配列（転写終結（Ｅ）配列－介在（Ｉ）配列－転写開始（Ｓ）配列）を含むことができ、そうすることで所望の遺伝子の上流または下流の遺伝子の発現が促進され得る。一つの実施形態では、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、６の倍数の塩基数を有する配列（例えば、所望の遺伝子を含む配列）を挿入するように改変され得る。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がセンダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。
　一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、センダイウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、ＬＥおよびＴＲの間にセンダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含む。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌの遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、Ｍ、ＦおよびＨＮのうちの１つまたは複数以外のセンダイウイルスの全ての遺伝子であり得る。Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子のうちの一つまたは複数を欠損するセンダイウイルス由来構築物プラスミドを使用する場合、搭載核酸は宿主における伝播性を喪失し得る。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、Ｍ、ＦおよびＨＮのうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含んでもよい。一つの実施形態において、センダイウイルス由来構築物プラスミドは、自己切断リボザイムＲｂｚを含んでもよい。
　一つの実施形態では、センダイウイルスタンパク質の抗原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率および複製効率を高めるために、センダイウイルス遺伝子を改変してもよい。一つの実施形態では、転写または複製の機能を増強するために、複製因子であるＮ遺伝子、Ｐ遺伝子およびＬ遺伝子の一つまたは複数を改変してもよい。一つの実施形態では、構造タンパク質であるＨＮタンパク質を改変してもよく、そうすることで、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性が変化し得、ヘマグルチニン活性を弱めることで血中のウイルスの安定性が向上し得、ノイラミニダーゼ活性が変化することでウイルスの感染性が変化し得る。一つの実施形態では、膜融合に関わるＦタンパク質を改変してもよい。一つの実施形態では、アクセサリー遺伝子であるＶ遺伝子を欠損させるように改変してもよい。センダイウイルス由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、ＢＨＫ／Ｔ７などの細胞が挙げられる。
・麻疹ウイルス由来構築物
　麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）モルビリウイルス属に分類されるＲＮＡウイルスである。麻疹ウイルスは、センダイウイルスと同様に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子を有する。
　一つの実施形態において、麻疹ウイルス由来構築物プラスミドは、麻疹ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態では、所望の遺伝子は、麻疹ウイルス遺伝子のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態において、麻疹ウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞が麻疹ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、麻疹ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。一つの実施形態において、麻疹ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、麻疹ウイルスの全ての遺伝子であり得る。
・アルファウイルス由来構築物
　本明細書において、「アルファウイルス」とは、トガウイルス科アルファウイルス属のウイルスを指す。アルファウイルスは、エンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、ＤＮＡの中間体を経ることなく細胞質で増殖し、ラミニン受容体などを介して種々の細胞に感染することができる。アルファウイルスのゲノムは、一本鎖のメッセンジャーセンスＲＮＡであり、５’末端においてメチル化キャップで修飾されており、３’末端において種々の長さのポリ（Ａ）鎖で修飾されている。ウイルス粒子は、２０面体のヌクレオキャプシド中にＲＮＡゲノムを含む構造を有する。アルファウイルスのゲノムは、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４の非構造タンパク質をコードする遺伝子、ならびにキャプシド（Ｃ）タンパク質、Ｅ１糖タンパク質、およびＥ２糖タンパク質の構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。アルファウイルスとして、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス、ロス・リバー・ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニア・ウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６、エバーグレード・ウイルス、ムカンボ・ウイルス、バルマ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス、ピクスナ・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス、アウラ・ウイルス、ワタロア・ウイルス、ババンキー・ウイルス、キジラガッチェ・ウイルス、ハイランドＪウイルス、フォート・モーガン・ウイルス、ヌジュム・ウイルス、バギー・クラーク・ウイルスなどが挙げられる。
　一つの実施形態において、アルファウイルス由来構築物プラスミドは、アルファウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４のいずれかの間に配置されてもよい。一つの実施形態において、アルファウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がアルファウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、アルファウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。例えば、ウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよいし、プロデューサー細胞に導入される別の核酸分子（例えば、プラスミド）にコードされていてもよいし、ウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子の遺伝子産物（ウイルス粒子の形態であってもよい）がプロデューサー細胞に導入されてもよい。一つの実施形態において、プロデューサー細胞に導入される本開示ウイルス由来構築物プラスミドとは別の核酸分子は、５’アルファウイルス複製認識配列子および３’アルファウイルス複製認識配列のうちの１つまたは複数を欠損していてもよく、搭載核酸がこの核酸由来の核酸を含むことが回避され得る。
　一つの実施形態において、アルファウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、アルファウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、アルファウイルス由来構築物プラスミドは、５’アルファウイルス複製認識配列、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４および３’アルファウイルス複製認識配列以外のアルファウイルス遺伝子のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、アルファウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。
・狂犬病ウイルス由来構築物
　狂犬病ウイルスは、ラブドウイルス科リッサウイルス属のマイナス鎖の１本鎖ＲＮＡウイルスであり、ウイルス粒子は弾丸のような形をした円筒形である。円筒の長さは約１８０ｎｍ、直径約７５ｎｍである。Ｌ（ラージタンパク質）、Ｇ（糖タンパク質）、Ｎ（ヌクレオタンパク質）、Ｐ（ホスホタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）をコードする５つの遺伝子を有する。このうちＧタンパク質が感染性に関連し得る。狂犬病ウイルスのゲノムは、リーダー部位からＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｌの順に遺伝子が並んでいる。Ｌｅａｄｅｒ部位に近い遺伝子ほど発現量が増大し得る。
　一つの実施形態において、狂犬病ウイルス由来構築物プラスミドは、狂犬病ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｌ遺伝子のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態において、狂犬病ウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞が狂犬病ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、狂犬病ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。一つの実施形態において、狂犬病ウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、狂犬病ウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、狂犬病ウイルス由来構築物プラスミドは、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｌのうちの１つまたは複数を含まなくてもよい。
・水疱性口内炎ウイルス由来構築物
　水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）はラブドウイルス科ベシキュロウイルス属のＲＮＡウイルスで、約１１ｋｂからなるマイナス一本鎖ＲＮＡゲノムを保持している。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、狂犬病ウイルスと同様にＬ（ラージタンパク質）、Ｇ（糖タンパク質）、Ｎ（ヌクレオタンパク質）、Ｐ（ホスホタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）をコードする５つの遺伝子を有する。
　一つの実施形態において、ＶＳＶ由来構築物プラスミドは、ＶＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｌ遺伝子のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態において、ＶＳＶ由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がＶＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、ＶＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。一つの実施形態において、ＶＳＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＶＳＶの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、ＶＳＶ由来構築物プラスミドは、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｌのうちの１つまたは複数を含まなくてもよい。
・コロナウイルス由来構築物
　コロナウイルス（ＣｏＶ）科のウイルスのウイルス粒子は、直径約８０～１００ｎｍの円形（球形）を示し、ヌクレオキャプシドを包み込むエンベロープには、スパイク（Ｓ）タンパク質、膜内在性（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質が存在する。ＣｏＶのゲノムには、約３０ｋｂの（＋）鎖ＲＮＡであり、５‘側から１ａおよび１ｂの非構造タンパク質をコードする遺伝子、その下流の構造遺伝子であるＳ、Ｅ、Ｍ、Ｎ遺伝子が存在するが、Ｓ遺伝子の直下の領域にも幾つかの非構造タンパク質の遺伝子が存在する。
　一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物プラスミドは、コロナウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物プラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がコロナウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。
　一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、コロナウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物プラスミドは、１ａ、１ｂ以外のコロナウイルス遺伝子のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、コロナウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。
・インフルエンザウイルス由来構築物
　インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属するマイナス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスのゲノムは、８本に分節化されており、１１種類のタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２／ＮＥＰ、ＮＰ）がコードされる。インフルエンザウイルスＲＮＡの５’末端非翻訳領域、３’末端非翻訳領域および翻訳領域の両端がパッケージング配列であり得る。
　一つの実施形態において、インフルエンザウイルス由来構築物プラスミドは、分節化されたインフルエンザウイルスＲＮＡの５’末端非翻訳領域、翻訳領域の５’端、所望の遺伝子、翻訳領域の３’端、および３’末端非翻訳領域を含み得る。ここで、インフルエンザウイルスの遺伝子は除去してもよいし、維持してもよい。一つの実施形態において、レトロウイルス由来構築物プラスミドは、インフルエンザウイルスを構成するのに必要な核酸配列を含んでもよい。一つの実施形態において、インフルエンザウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２／ＮＥＰおよびＮＰであり得る。一つの実施形態において、インフルエンザウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がインフルエンザウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、インフルエンザウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。
・ワクシニアウイルス由来構築物
　ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科に属し、約１９０Ｋｂｐの直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質でしか複製しない。ウイルスＤＮＡ複製中に、ワクシニアウイルスは、外膜が異なる数種類の感染型：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞結合性エンベロープビリオン（ＣＥＶ）、および細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）を産生する。
　一つの実施形態において、ワクシニアウイルス由来構築物プラスミドは、ワクシニアウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列および所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、ワクシニアウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、Ｄ１Ｒ、Ｄ２Ｌ、Ｄ３Ｒ、Ｄ４Ｒ、Ｄ５Ｒ、Ｄ６Ｒ、Ｄ７Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１３Ｌ遺伝子をコードし得る。一つの実施形態において、ワクシニアウイルス由来構築物プラスミドは、チミジンキナーゼをコードする遺伝子が欠損されていてもよい。一つの実施形態において、ワクシニアウイルス由来構築物は、ウイルス由来構築物プラスミドを、ワクシニアウイルスを感染させたプロデューサー細胞の中に導入し、その細胞の中で相同組み換えを生じさせることにより作製することができる。この実施形態において使用するワクシニアウイルス由来構築物プラスミドは、所望の遺伝子およびワクシニアウイルスのゲノムのいずれかの領域に相同性を有する核酸配列を含む。一つの実施形態において、ワクシニアウイルス由来構築物プラスミドは、ワクシニアウイルスゲノムおよびワクシニアウイルス遺伝子のいずれかの間の所望の遺伝子を含み得る。
・レオウイルス由来構築物
　レオウイルス科のウイルスは、直径約６０～８０ｎｍの正二十面体構造のビリオンを有し、１０～１２本の線状の二本鎖ＲＮＡのゲノムを有し、エンベロープを持たないＲＮＡウイルスである。レオウイルス科のウイルスには、ロタウイルス、哺乳類オルソレオウイルス（MRV）などが含まれる。ＭＲＶは４つの血清型、ＭＲＶ－１、ＭＲＶ－２、ＭＲＶ
－３、ＭＲＶ－４型に分類される。１０本の分節ｄｓＲＮＡゲノムは、８つの構造タンパク質、λ１（Ｌ３遺伝子），λ２（Ｌ２遺伝子）、λ３（Ｌ１遺伝子）、μ１（Ｍ２遺伝子）、μ２（Ｍ１遺伝子）、σ１（Ｓ１遺伝子）、σ２（Ｓ２遺伝子）、σ３（Ｓ４遺伝子）および４つの非構造タンパク質、μＮＳ（Ｍ３遺伝子）、μＮＳＣ（Ｍ３遺伝子）、σＮＳ（Ｓ３遺伝子）、σ１ｓ（Ｓ１遺伝子）をコードする。ＭＲＶは２層構造のカプシドから構成され、外殻はμ１、σ３、σ１から構成され、内殻（コア構造）はλ１、λ２、σ２から構成される。コア粒子内には１０本の分節ゲノムに加え、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるλ３およびポリメラーゼコファクターとされるμ２が含まれる。非構造タンパク質μＮＳは、複製の場であるＶＦの形成に中心的な役割を担っており、様々なＭＲＶタンパク質と結合し、ＶＦ内にリクルートする。μＮＳＣは培養細胞での複製には必須でない可能性がある。σＮＳは、μＮＳと相互作用し、１本鎖ＲＮＡに高い結合能を有し、プラス鎖ウイルスＲＮＡのＶＦ内へのリクルートに関与し得る。σ１ｓはウイルスの複製に必須ではないが、病原性に関与し得る。
　一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物プラスミドは、レオウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物プラスミドは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物プラスミドは、μＮＳＣおよびσ１ｓのうちの少なくとも１つをコードしなくてもよい。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がレオウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、レオウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、レオウイルス由来構築物プラスミドは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４のうちの１つまたは複数を含まなくてもよい。レオウイルス由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、Ｌ９２９などの細胞が挙げられる。
・コクサッキ―ウイルス由来構築物
　コクサッキーウイルスは、ピコルナウイルス科エンテロウイルス属に属する、エンベロープを持たない直鎖の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。エンテロウイルスであるコクサッキーウイルスは、５’から３’にかけて、ＶＰ０（ＶＰ４およびＶＰ２）、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄの遺伝子から構成され、ＶＰ遺伝子がカプシドをコードし、その他の遺伝子は非構造タンパク質をコードする。ＶＰ４は、ＶＰ２のアミノ末端のような挙動を示す。
　一つの実施形態において、コクサッキーウイルス由来構築物プラスミドは、コクサッキーウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ遺伝子のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態において、コクサッキーウイルス由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がコクサッキーウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、コクサッキーウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。一つの実施形態において、コクサッキーウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、コクサッキーウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、コクサッキーウイルス由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４であり得る。一つの実施形態において、コクサッキーウイルス由来構築物プラスミドは、ＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄのうちの１つまたは複数を含まなくてもよい。コクサッキーウイルス由来構築物を生産するためのプロデューサー細胞として、Ｈ１２９９、ＨｅＬａなどの細胞が挙げられる。
・ニューカッスル病ウイルス由来構築物
　ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、パラミクソウイルス科に分類され、エンベロープを有する線状のマイナス１本鎖のＲＮＡウイルスである。ＮＤＶのゲノムＲＮＡは、３’から５’にかけて、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、融合タンパク質（Ｆ）、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、ラージタンパク質（Ｌ）の遺伝子を含む。ゲノムＲＮＡは、３’末端にリーダー配列も含む。融合タンパク質（Ｆ）は、内在性膜タンパク質であり、活性化されてウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を促進する。マトリックスタンパク質（Ｍ）は、ウイルス構築に関与し、ウイルス膜およびヌクレオカプシドタンパク質と相互作用する。ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）は、ヌクレオカプシドの主要なタンパク質であり、ホスホタンパク質（Ｐ）およびラージタンパク質（Ｌ）と会合する。ホスホタンパク質（Ｐ）は、リン酸化を受け、転写調節や、メチル化、リン酸化およびポリアデニル化に関与し得る。ラージタンパク質（Ｌ）遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、Ｐタンパク質と共にウイルスＲＮＡ合成に必要である。
　一つの実施形態において、ＮＤＶ由来構築物プラスミドは、ＮＤＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌ遺伝子のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態において、ＮＤＶ由来構築物プラスミドは、ウイルス由来構築物プラスミドおよびプロデューサー細胞がＮＤＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、ＮＤＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列のうちウイルス由来構築物プラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ウイルス由来構築物プラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。一つの実施形態において、ＮＤＶ由来構築物を構成するのに必要な核酸配列は、ＮＤＶの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、ＮＤＶ由来構築物プラスミドは、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌのうちの１つまたは複数を含まなくてもよい。
　一つの実施形態において、本開示は、本開示のウイルス由来構築物の集団を含むウイルス由来構築物含有組成物を提供する。一つの実施形態において、ウイルス由来構築物含有組成物は、イルス由来構築物ゲノムコピー数に対するウイルス由来構築物粒子数（ＶＰ／ＶＧ）が、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５以下であり得る。
　一つの実施形態において、パッケージング細胞から生産されたウイルス由来構築物プラスミドは任意の公知の方法を用いて精製でき、本開示は、このように精製されたウイルス由来構築物プラスミドも提供する。一つの実施形態において、精製したウイルス由来構築物プラスミドが所望の核酸配列を有することは、制限酵素切断により発生する断片のサイズパターンを調べること、ＰＣＲ法、塩基配列決定法などにより確認することができる。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミド作製方法によって調製されたウイルス由来構築物プラスミド含有組成物は、含有エンドトキシンが少量であり得る。一つの実施形態において、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを含む枯草菌を提供する。
（組成物）
　一つの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のウイルス由来構築物プラスミドまたはウイルス由来構築物を含む組成物を提供する。本開示の方法により作製された本開示のウイルス由来構築物、ウイルス由来構築物ライブラリーおよび本開示のウイルス由来構築物含有組成物は、ウイルス由来構築物の立体構造や表面修飾などにおいて完全には分析できないまたは分析することが非常に困難な構造特徴を有し得る。そのため、本開示の方法により作製されたという特徴は、本開示のウイルス由来構築物、ウイルス由来構築物ライブラリーおよび本開示のウイルス由来構築物含有組成物を適切に表現する特徴の一つである。
（剤型等）
　本明細書に記載される組成物は、種々の形態で提供され得る。組成物の形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、吸入剤等であってもよい。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖（例えばトレハロース）、ＮａＣｌ、またはＮａＯＨ等を配合してもよい。
　一つの実施形態では、本開示の組成物は、薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポロキサマー、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E.W.Martin,　Remington’s　Pharmaceutical　Sciences(Mark　Publishing　Company,　Easton,　U.S.A)に記載される。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。一つの実施形態では、本開示の任意の液体組成物のｐＨは、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１またはこれらの任意の２つの値の間の範囲であり得る。
　本開示の組成物の任意の成分は、薬学的に許容しうる塩として提供することができ、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成される塩、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成される塩、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄とともに形成される塩であり得る。
　好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
　（使用・用途）
　本明細書に記載のウイルス由来構築物プラスミドまたはウイルス由来構築物、またはこれらを含む組成物は遺伝子治療、機能的ゲノム学、癌ワクチン接種および／または抗ウイルスワクチン接種など、種々の用途で使用することができる。
　本開示のウイルス由来構築物またはウイルス由来構築物含有組成物を被験体に適用する場合、被験体は特に限定されず、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトなど）、鳥類、爬虫類、両生類、節足動物、魚類などであり得る。
　本開示のウイルス由来構築物またはウイルス由来構築物含有組成物の量は、処置または予防する障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。場合によって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。本開示のウイルス由来構築物またはウイルス由来構築物含有組成物の投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、１×１０１３個、１×１０１４個もしくは１×１０１５個の個数のウイルス由来構築物であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。
　本明細書に記載のウイルス由来構築物またはウイルス由来構築物含有組成物の投与経路は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、脳実質内、経肺、鼻内、硬膜外、または経口投与等であってもよい。一つの実施形態では、本開示の組成物、種々の送達（デリバリー）系をともに使用することができる。このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用などがある。好適な経路によって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の薬剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。
　本開示の組成物はキットとして提供することができる。一つの実施形態では、本開示は、ウイルス由来構築物を作製するためのキットであって、本開示のウイルス由来構築物プラスミドを含む、キットを提供する。一つの実施形態では、本開示は、本開示の組成物に添加され得る１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
　本開示の組成物の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
　培地
　ＬＢ培地は、Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ　１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを１Ｌの水に溶解し、寒天プレートとする場合は、さらにＢａｃｔｏ　Ａｇａｒ　１５ｇを添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）して調製した。必要に応じて、カルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）、あるいはテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を加えて用いた。枯草菌形質転換用のＴＦ－Ｉ培地とＴＦ－ＩＩ培地は、以下のように作製した。まず、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ（１Ｌあたり、１４０ｇ　Ｋ２ＨＰＯ４（無水）、６０ｇ　ＫＨ２ＰＯ４（無水）、２０ｇ　（ＮＨ４）２ＳＯ４）、１０ｇ　Ｎａ３－クエン酸・２Ｈ２Ｏ）、５０％　グルコ－ス、２％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％　カザミノ酸、および水を、それぞれオートクレーブにより個別に準備した。またトリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸の水溶液（５ｍｇ／ｍＬ）は、フィルター滅菌により準備した。１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎを５０ｍＬ、５０％　グルコ－ス、２％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％　カザミノ酸、５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸をそれぞれ５ｍＬずつ、最後に滅菌水４１５ｍＬを混合して、フィルターろ過することでＴＦ－Ｉ培地（５００ｍＬ）を作製し、使用するまで４℃で保存した。２％　カザミノ酸を２．５ｍＬ、各アミノ酸溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍＬ、滅菌水を４３５．５ｍＬにする以外は、ＴＦ－Ｉ培地と同様のものを使用して、フィルターろ過することでＴＦ－ＩＩ培地（５００ｍＬ）を作製し、使用するまで４℃で保存した。
　試験管内遺伝子操作
　他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９））に従って行った。
　枯草菌形質転換法
　Ｆａｌｃｏｎの１４ｍＬ試験管（２０５１）にＬＢ培地２ｍＬを入れ、そこに－７０℃で保存したグリセロールストックの枯草菌を植菌し、回転培養装置で回転しながら、３７℃、１７時間培養した。新しい１４ｍＬ試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５１）にＴＦ－Ｉ培地を９００μＬ分注し、２５μＬの２％　カザミノ酸を添加し、５０μＬの前培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃、４時間培養した。その後、新しい１４ｍＬ試験管にＴＦ－ＩＩ培地を９００μＬ分注し、１００μＬのＴＦ－Ｉ培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃、１．５時間培養した。１．５ｍＬの遠心チューブにＴＦ－ＩＩ培養液を１００μＬ入れ、８μＬのＤＮＡを添加した。回転培養装置で回転しながら、３７℃、３０分培養した後、ＬＢ培地を３００μＬ添加し、さらに回転培養装置で回転しながら、３７℃、１時間培養した。その後、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地寒天プレートに広げて３７℃で一晩インキュベーションすることで、形質転換体を得た。
　超遠心法によるプラスミドの大量調製
　培養終了後、５０ｍＬずつ５０ｍＬチューブ（ファルコン２０７０）４本に分注し、５，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨てて、菌ペレットをボルテックスにより完全にほぐした。大腸菌の場合はＰ１　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）単独を使用し、枯草菌の場合は、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび１０ｍｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡを添加したＰ１　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）溶液を使用し、菌を入れたチューブ４本にそれぞれ５ｍＬずつ添加し、よく混合した。これを室温で５分間インキュベーションした。４本のチューブにそれぞれＰ２　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５ｍＬずつ添加し、ゆっくりと混合し、室温で５分間インキュベーションした。さらに、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５ｍＬずつ添加し、白濁物質が均等に分散できるようにある程度強い力で混合した。５，０００×ｇで１０分間遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍＬチューブ（ファルコン２０７０）に移した。それぞれのチューブに５ｍＬのフェノール飽和ＴＥを添加し、激しく混合した。５，０００×ｇで１０分間遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍＬチューブ（ファルコン２０７０）に移した。１００％エタノールをそれぞれ２０ｍＬ添加し混合して、５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。沈殿に５．４ｍＬのＴＥを添加し、完全に溶解した。次に、６．４０ｇの塩化セシウムを投入し、完全に溶解した。更に、１．１ｇ／ｍＬの塩化セシウム溶液（１．１ｇの塩化セシウムと１ｍＬの水を混ぜて作製した溶液、体積調整せず）を２．６ｍＬ添加した。最後に、１０ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド溶液を６００μＬ添加し、よく混合した。超遠心チューブ（ベックマン３６２１８１）１本に中身を移した。バランスとの重さの違いが２０ｍｇ以内になるように、水、あるいは１．１ｇ／ｍＬ塩化セシウム溶液（比重約１．５ｇ／ｍＬ程度）を添加して重さを微調整した。超遠心装置（ベックマンコールター）で以下の条件で遠心を行った。温度：１８℃、速度：５０，０００ｒｐｍ、加速度：Ｍａｘ、減速度：Ｍａｘ。１５時間以上遠心した。
　遠心終了後、紫外線（３６５ｎｍ）観察下で、針（２１Ｇ×５／８”）をセットした１ｍＬのシリンジでｃｃｃ型のプラスミドのバンドに挿し、プラスミド溶液を回収し、１５ｍＬチューブに移した。ここにＰ３を５００μＬ添加し、次に、全体が３ｍＬになるように水を添加した。さらに、９ｍＬの１００％エタノールを添加した。５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿に７００μＬのＴＥを添加し、ＤＮＡを溶解した。これを１．５ｍＬのチューブに移し、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μＬ以下になるまで続けた。水層が４５０μＬ以下になったら、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５０μＬ添加し、更にエタノールを９００μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、得られたペレットＤＮＡを９００μＬの７０％エタノールでリンス後、２２μＬのＴＥに溶解した。
（実施例１：一括トランスフェクションしたＡｌｌ－ｉｎ－ＯｎｅライブラリーからのＤＮＡバーコードを用いたスクリーニング）
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法のための種プラスミドの設計
　種プラスミドとなるＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅゲノムは、通常は３つのプラスミドベクターに分離して搭載されている、ｒＡＡＶ領域（２つのＩＴＲ配列に囲まれたレポーター遺伝子）、Ｈｅｌｐｅｒ領域（ＶＡ、Ｅ４、Ｅ２Ａ）、Ｒｅｐ／Ｃａｐ領域をこの順番で１つに連結した構造となるように設計した（図１）。血清型の異なるＡＡＶ（ＩＴＲおよびＲｅｐ遺伝子）、および血清型の異なるアデノウイルス（Ｈｅｐｌｅｒ領域）から得られた配列を連結した＃１～＃５の５種類の種プラスミドを以下の表１の通り設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ここで、レポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）とＣａｐ遺伝子（Ａｄ２由来）については、種プラスミド間で共通の配列を使用した。すなわち、ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法によるコンビナトリアルライブラリーによる組換えの対象は、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、Ｈｅｌｐｅｒ、Ｒｅｐの４つの部分である。各領域の境界に制限酵素ＳｆｉＩ認識部位（５’－ＧＧＣＣｎＮＮＮ／ｎＧＧＣＣ－３’；ｎおよびＮは、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか；大文字部分が３’末端突出である）を配置した。各ＳｆｉＩ認識部位を切断した際に生成する３塩基の各３’末端突出は、図１に示すように、プラスミド内で唯一の配列となる。ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法によるコンビナトリアルライブラリー作成の際にこの突出部分の相補性により隣り合うＤＮＡ断片の順序と方向が指定される。よって、種プラスミドは、図２に示すように全ての種類の種プラスミドについて、同じ場所に位置する単位ＤＮＡが同じ突出配列を有するように設計した。使用予定の一部の遺伝子が天然のＳｆｉＩ認識配列を有する場合があったが、タンパク質をコードする遺伝子上の認識配列は同義コドンに置き換え、ＩＴＲ配列内などの非コード領域上の認識配列は配列を変化させることで、ＳｆｉＩ認識部位を消去した。
　これらのＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅライブラリーから作製されるｒＡＡＶベクタープラスミドが、どのような単位ＤＮＡの組合せを有するか確認するために、ｒＡＡＶ領域中に１０塩基のランダムな配列を持つＤＮＡバーコードを導入できる場所を設計した。種プラスミドの具体的な配列は、配列番号１～５に示す。
・ＯＧＡＢ法のための集積核酸の準備
　設計した種プラスミドをＯＧＡＢ法により構築するために、それぞれ１８個、もしくは１９個のＤＮＡ断片を設計した（配列番号６～９８）。各材料ＤＮＡは、種プラスミド＃１の一部の配列をＰＣＲで取得した以外は、基本的に化学合成後、ＭＡＰ法（特開２０１９－１９８２３６）により準備した。
・ＯＧＡＢ用集積断片のベクターへのクローニング
　取得したＤＮＡ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製し、最終的に１５μＬのＴＥ緩衝液（ナカライテスク）によりカラムから溶出した。得られたＤＮＡ溶液の１．４μＬに０．２μＬの１０×Ｅｘ－Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）、０．２μＬの２ｍＭ　ｄＮＴＰ（タカラバイオ）、０．２μＬの１０ｘＡ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、６０℃で１時間反応させた。その後、０．５μＬの６ｎｇ／μＬのｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ－３－ＡａｒＩ（配列番号９９）のＡａｒＩで切断して得られた４．３ｋｂの断片、２．５μＬのＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞を加えて、１６℃で３時間ライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）を用いて形質転換を行った。終夜培養後、カルベニシリン入りＬＢプレートに出現したコロニーについて塩基配列を確認することで、それぞれの断片について正しい配列を有するクローンを取得した。
・ＯＧＡＢ法のためのＤＮＡ断片等モル混合物の調整
　これらのクローンを持つ大腸菌を２ｍＬのＬＢ培地からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン）により、自動化システムＱＩＡｃｕｂｅによりプラスミドを精製し、最終的に３０μＬのＴＥ緩衝液に溶出した。そのうちの３μｇ相当のプラスミドＤＮＡを含む溶液を５０μＬになるようにＴＥ緩衝液を添加した。さらにそこに、６μＬの１０ＸＰｌａｓｍｉｄ　ｓａｆｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、２．４μＬの２５ｍＭ　ＡＴＰ、２μＬのＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ　ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を加えて、３７℃で１時間反応後、７０℃で３０分失活させることで、環状以外の構造のＤＮＡを分解した。その後、反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、最終的に１５μＬのＴＥ緩衝液（ナカライテスク）によりカラムから溶出した。得られたＤＮＡ溶液を微量分光光度計（Ｎａｎｏ　ｄｒｏｐ　Ｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定し、１００ｎｇ／μＬとなるようにＴＥ緩衝液を加えて希釈した。その後、再度濃度を測定し、正確に５００ｎｇのＤＮＡを分取するのに必要な体積を小数点以下２桁μＬまで計算して、マイクロピペットにより分取することで各プラスミドを等モルに調整した。分取したＤＮＡ溶液は、その後に使用する制限酵素の種類（表Ａ）に応じて２つもしくは３つの１．５ｍＬの遠心チューブに分けてプールした。
　その後、ＡａｒＩによる切断のためのチューブには、プラスミド溶液の容積の合計を１体積とした場合に、１．９４体積の滅菌水、０．３３体積の１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、０．０６体積の５０×オリゴヌクレオチド（０．０２５ｍＭ）、０．１７体積のＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を加えて３７℃で２時間反応させた。ＢｓａＩによる切断のためのチューブには、プラスミド溶液の容積の合計を１体積とした場合に、２体積の滅菌水、０．３３体積の１０ＸＣｕｔＳｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、０．１７体積のＢｓａＩ－ＨＦ　ｖ２を加えて３７℃で２時間反応させた。それぞれのチューブに制限酵素反応液と等量のＴＥ飽和フェノールを添加して、よく混合することで制限酵素を失活させた後、乳化した状態のフェノールとＤＮＡ溶液の混合物を一つの２ｍＬ遠心チューブに統合して、２０，０００×ｇで１０分間遠心し、フェノール相と水相とに分離した。上層を新しいチューブに移して、そこに等量の１－ブタノールを加え、よく撹拌し、２０，０００×ｇで１分間遠心した。その後、上層をピペットで吸って取り除き、下層の体積が４５０μＬ以下になるまで、再度等量の１－ブタノールを加えて、遠心し、上層を捨てる、の操作を繰り返した。その後、５０μＬのＰ３バッファーおよび９００μＬのエタノールを加え、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。沈殿物を失わないように上清を捨てたのち、９００μＬの７０％エタノールでリンス後、上清をピペットで吸って捨てた。その後、再度遠心し、残っている上清を底部に集めて、ピペットで完全に液体を取り除いた。直ちに、ＴＥ５０μＬを加えて沈殿物を５分間タッピングすることで完全に溶解した。その後、低融点アガロースゲルによる電気泳動によりｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ－３－ＡａｒＩから切り出した約６００～９００ｂｐの１８種類または１９種類の断片の等モル混合物をサイズ分画し、（ＷＯ２０２０／２０３４９６）に記載の電気泳動ゲルからのＤＮＡ断片の切り出しと精製の方法に従って、１８または１９種類の断片の混合物を精製した。
・ＯＧＡＢ集積用の断片の準備
　プラスミドｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ（Ｔｓｕｇｅら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　５，　１０６５５）を制限酵素ＡａｒＩで切断して、低融点アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離し、大きい１５ｋｂの断片をゲルから切り出し、精製して、ＯＧＡＢ集積用の断片を取得した。
・ＯＧＡＢ法によるプラスミド形成
　得られた１８～１９種のＤＮＡ断片の混合溶液（１０ｆｍｏｌ）と、上記のＯＧＡＢ集積用の断片（１０ｆｍｏｌ）とに合計４μＬとなるようにＴＥ緩衝液を追加し、そこに５μＬの２×ライゲーションバッファー（１５％ポリエチレングリコール６０００、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１３２ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３．２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２ｍＭ　ＡＴＰ）を添加してよく混合後、１μＬのＴ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を加え、３７℃で５時間インキュベーションすることで、タンデムリピート状に連結した形質転換用ＤＮＡを準備した。ここに枯草菌のコンピテントセル１００μＬを添加し、３７℃で、３０分ダックローターにより回転培養した。その後、３００μＬのＬＢ培地を添加して、３７℃で１時間ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（シグマアルドリッチ）入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養することで、種プラスミドの候補形質転換体を得た。
・形質転換体のプラスミド構造確認
　得られた候補形質転換体の中からランダムに１２株のコロニーを選択して、２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して更に３７℃で３時間培養した。得られた菌体から以下の手順で少量のプラスミド抽出を行った。９００μＬの菌液を１．５ｍＬ遠心チューブにとり、６,８００×ｇで３分遠心し、上清をマイクロピペットで取り除いた。得られた菌体ペレットをよく懸濁後、１０ｍｇ／ｍＬの卵白リゾチーム（ｗａｋｏ）を含むＰ１バッファーを１００μＬ添加後、３７℃で５分間インキュベーションした。そこに、２００μＬのＰ２バッファーを加えて４回転倒混和した。その後、Ｐ３を１５０μＬ添加し、４回転倒混和した。これを２０，０００×ｇで、１０分間遠心することにより、白い沈殿と上清に分離した。上清を新しい１．５ｍＬ遠心チューブに移して、そこに、４５０μＬのＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）を添加し、よく混和した後、２０，０００×ｇで、１０分間遠心することにより、フェノール相と水相とに分離し、水相３２０μＬを新しいチューブに移して、そこに９００μＬのエタノールを加え、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清をマイクロピペットで取り除き、９００μＬの７０％エタノールを加え、チューブ全体をリンスした。その後、７０％エタノールをマイクロピペットで取り除き、得られた沈殿を２７μＬのＴＥ緩衝液で溶解した。得られたプラスミド溶液を８μＬとり、そこに１μＬの１０×３．１　ＮＥＢ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）と、それぞれの種プラスミドの構造確認に適切な１μＬの制限酵素を添加し、３７℃で１時間反応後、アガロースゲル電気泳動により切断バターンを確認することで、想定される制限酵素切断パターンと一致するクローンをそれぞれの種プラスミドについて１つずつ取得した。これらのプラスミドをＩｌｌｕｍｉｎａ　ｐｒｅｐ（イルミナ）により断片化し、ＭｉＳｅｑ（イルミナ）全塩基配列を決定して、それぞれの種プラスミドを正しく集積したクローンを取得した。
・種プラスミド大量調製法
　塩化セシウム－エチジウムブロマイド密度勾配超遠心法により高純度のプラスミドＤＮＡを調製した。ＬＢ培地にテトラサイクリンを１０μｇ／ｍＬになるように加えたものを２００ｍＬ用意し、５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬずつ入れて、枯草菌プラスミド保持株を接種し、３７℃で１６時間培養した。その後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加し、更に１日培養することによりプラスミドのコピー数を増大させてから超遠心法によりプラスミドを精製した。
・ＤＮＡバーコード断片の準備
　合成時に、Ｎ（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれかの塩基）を１０塩基連続して導入して合成したランダム配列を有する化学合成ＤＮＡ（配列番号１００）を１ｎｍｏｌと、このＤＮＡの３’末端にハイブリダイズするプライマーＤＮＡ（配列番号１０１）１ｎｍｏｌを含む８８μＬの水溶液に、１０μＬの１０×ＥｘＴａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラ）、１０μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ溶液（タカラ）、２μＬのＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ）を添加後、ＰＣＲ装置により、９９℃で１０分変性後、５８℃で１分、７２℃で２０分反応させた。反応物をＭｉｎｉＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔにより精製し、ＴＥ１５μＬに溶解したＤＮＡ断片を得た。これに９μＬの水と、３μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ　Ｂｕｆｆｅｒと３μＬのＤｒａＩＩＩ－ＨＦを添加して、３７℃で３０分反応したのち、再度反応物をＭｉｎｉＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔにより精製し、ＴＥ１５μＬに溶解したＤＮＡバーコード断片を得た。
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢライブラリー
　大量調製により取得した５種類の種プラスミド１μｇを混合し、水を８５μＬになるように添加後、１０μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、５μＬの制限酵素ＳｆｉＩを添加して５０℃で１時間反応した。反応終了後に６００μＬの水とＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）を５００μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで５分間遠心することにより２相に分離して、水相を新しい１．５ｍＬのチューブに移し、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μＬ以下になるまで続けた。水層が４５０μＬ以下になったら、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５０μＬ添加し、更にエタノールを９００μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、得られたペレットＤＮＡを９００μＬの７０％エタノールでリンス後、１０μＬのＴＥに溶解した。
　全ての種プラスミドは、ＳｆｉＩでの切断により、７つの断片に切断されるが、そのうちの最も小さい１７ｂｐのＤＮＡ断片は、上記の制限酵素切断後のエタノール沈殿操作の際に沈殿せずに洗浄されて消失する。この断片の代わりに、上述のＤＮＡバーコード断片を添加してライブラリーを構築した。上述の精製ＤＮＡ２μｇ（０．１ｐｍｏｌ）と、同じモル数のＤＮＡバーコードを添加し、全体を１８μＬに調整した。このうちの９μＬについて、ここに２×ライゲーションバッファー１０μＬと、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加して、混合後室温で１時間反応した。２本のチューブでライゲーション産物１０μＬにつき１００μＬの枯草菌コンピテントセル培養液を加え、ダックローターで３０分旋回培養した。その後、それぞれＬＢ培地を３００μＬ添加し、３７℃で１時間旋回培養ののち、全培養液を１０枚のテトラサイクリン入りプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養を行った。その結果、８８個のコロニーが得られた。これらのコロニーを２ｍＬのテトラサイクリン入りＬＢ培地に植菌し、終夜培養により培養液を得て、それぞれプラスミドを得た。各プラスミドをＩｌｌｕｍｉｎａ　ｐｒｅｐ（イルミナ）を用いて断片化し、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ）により塩基配列解析を行い、由来する種プラスミドの同定と、ＤＮＡバーコードの対応付けを行った（表２）。その結果、ＩＴＲ配列は特定の種プラスミド由来の組換え単位が優勢であったが、Ｒｅｐ組換え単位とＣａｐ組換え単位については、様々な種プラスミド由来の組換え単位が含まれた。
・Ａｌｌ－ｉｎ－ＯｎｅライブラリーからのｒＡＡＶの作製
　上述の８８コロニーに由来する培養液から１ｍＬずつ培養液を集約し得られた８８ｍＬの培養液を遠心し、得られた菌ペレットに対して、上述の枯草菌プラスミドの大量調製により、プラスミドＤＮＡ（枯草菌由来プラスミド）を得た。
　トランスフェクションの前日に２．５×１０６個の２９３Ｔ細胞を６ｃｍ－ｄｉｓｈに播種した。２２時間後、４．７５ｍＬのＤＭＥＭ培地（２％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換し、３７℃、５％　ＣＯ２で２時間培養した。そこへプラスミドを９．３μｇ含むＤＭＥＭ培地１２５μＬとＤＮＡの１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏを含むＤＭＥＭ培地１２５μＬを混合したトランスフェクション溶液を添加した。
　３７℃、５％　ＣＯ２で７２時間培養後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１／８０容量添加し、室温で１０分静置した。剥離した細胞懸濁液を回収し、１８０×ｇで５分遠心分離して上清を完全に除去した。細胞ペレットを４００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００；ｐＨ８．５）で懸濁し、さらにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（７５ユニット／ｍＬ）を添加して３７℃で３０分反応させた。その後、１．９Ｍ　ＭｇＳＯ４溶液を２／１００容量添加し、室温で１０分静置した。１２，０００×ｇ、４℃、１０分の遠心分離によって上清を回収し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８を終濃度０．００１％で添加した。
・ｒＡＡＶゲノムの抽出
　上清１００μＬに水を６００μＬ添加し、そこに５００μＬのＴＥ飽和フェノールを添加して、よく混合後、２０，０００×ｇで５分間遠心することにより２相に分離して、水相を新しい１．５ｍＬのチューブに移し、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μＬ以下になるまで続けた。水層が４５０μＬ以下になったら、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５０μＬ添加し、更にエタノールを９００μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、得られたペレットＤＮＡを９００μＬの７０％エタノールでリンス後、１０μＬのＴＥに溶解した。このＤＮＡを１００倍希釈した溶液１μＬと、配列番号１０２と配列番号１０３に示すプライマーを各５ｐｍｏｌ、５μＬの１０×ＥｘＴａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）、５μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（タカラバイオ）、１μＬのＥｘ－Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）に、全体積が５０μＬとなるように水を加え、９６℃２分ののち、９８℃２０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを１０回繰り返して、バーコード領域を増幅した。得られたＤＮＡについてＭｉｓｅｑ（イルミナ）により、各ＤＮＡバーコードの分子存在比を調べた。また、トランスフェクションに使用したＡＬＬ―ｉｎ―Ｏｎｅプラスミドについても、各ＤＮＡバーコードの分子存在比を同様に方法で決定し、各クローンについてのトランスフェクション比率を求めた。その結果を表２に示す。Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅの配列の違いによりウイルスベクターの単位ＤＮＡ当たりの産生量が異なることが判明した。
・大腸菌を経由したＡｌｌ－ｉｎ－ＯｎｅライブラリーによるｒＡＡＶの作製
　上記枯草菌で調製したＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅプラスミドを大腸菌に導入し、得られたライブラリープラスミドの結果が、枯草菌由来のＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅと一致するかどうかを確認するために、以下の実験を行った。上記枯草菌で調製したＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅプラスミド０．１μＬをＪＭ１０９のエレクトロコンピテントセル（タカラバイオ）にエレクトロポレーション（バイオラッド）で導入し、クロラムフェニコール１２．５μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートで選択し、数万個のコロニーを得た。スプレッダーを用いてコロニーが混合したペレットを回収し、前述の大量調製用超遠心法によりプラスミドＤＮＡ（大腸菌由来プラスミド）を回収した。
　トランスフェクションの前日に３×１０６個の２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ－ｄｉｓｈに播種した。２２時間後、９．５ｍＬのＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換し、３７℃、５％　ＣＯ２で２時間培養した。そこへプラスミドを１２．５μｇ含むＤＭＥＭ培地２５０μＬとＤＮＡの１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏを含むＤＭＥＭ培地２５０μＬを混合したトランスフェクション溶液を添加した。
　３７℃、５％　ＣＯ２で７２時間培養後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１／８０容量添加し、室温で１０分静置した。剥離した細胞懸濁液を回収し、１８０×ｇで５分遠心分離して上清を完全に除去した。細胞ペレットを４００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００；ｐＨ８．５）で懸濁し、さらにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（７５ユニット／ｍＬ）を添加して３７℃で３０分反応させた。その後、１．９Ｍ　ＭｇＳＯ４溶液を２／１００容量添加し、室温で１０分静置した。１２，０００×ｇ、４℃、１０分の遠心分離によって上清を回収し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８を終濃度０．００１％で添加した。
　枯草菌由来プラスミドの際と同様の方法でウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、ＭｉＳｅｑにより存在比を調べた。その結果を表２に示す。得られた結果は、枯草菌由来のプラスミドとほぼ同様の結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 ＊由来する種プラスミドの番号の記載がないことは、対応する種プラスミドが検出できなかったことを示す。
＊Ｏｕｔ／Ｉｎは、次世代シーケンサーによるＤＮＡバーコード領域のリード数を元に算出した、１回のトランスフェクション実験における得られたウイルスベクターのゲノムコピー数とトランスフェクション時に用いたプラスミドのコピー数との比率を示す。
（実施例２：個別トランスフェクションによるＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅのスクリーニング）
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢライブラリーのデザイン
　実施例１の５種類のライブラリーの拡張を目的に、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、Ｈｅｌｐｅｒ、Ｒｅｐの各組換え単位について、以下の表３および図３に示すように新たな種プラスミドを足した合計８種類の種プラスミドを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　このうち、＃１については、実施例１の＃１の３’ＩＴＲをＡＡＶ－２のものからＡＡＶ－５のものに変更した。その際に、実施例１の＃１の第３断片を新規合成したＤＮＡ断片を配列番号１０４に示す。また、＃６～＃８の合成に準備した１８～１９断片については、配列番号１０５～１５９に示す。また、ＯＧＡＢ法用のＤＮＡ断片を切り出すために使用する制限酵素は表Ａに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＯＧＡＢ法により一旦実施例１と同様にプラスミドを作製した後、プラスミドに存在するＳｆｉＩ（ＧＴＴ）認識部位を消失させるために、各プラスミドをＮｏｔＩで消化後、消失させたい約１００ｂｐの短いＮｏｔＩ断片を電気泳動により除去し、残りの２断片を閉環させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することにより、実施例１よりもＳｆｉＩ断片が１つ少ない種プラスミドを構築した。＃１～＃８のプラスミドの塩基配列は、配列番号１６０～１６７に示す。
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢライブラリーの構築
　各種プラスミドを持つ大腸菌を２００ｍＬのクロラムフェニコール（ナカライテスク）を１２．５μｇ／ｍＬの濃度で含むＬＢ培地で終夜培養し、超遠心法により種プラスミド大量調製法を行った。大量調製により準備した８種類の種プラスミドを１μｇずつ用いて、実施例１と同様にＳｆｉＩで切断し、断片を精製した。その他は、実施例１と同様にライゲーションと形質転換を行った。その結果、２３３個の形質転換体を得た。全コロニーを２ｍＬのテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬと１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で培養後、６，８００×ｇ、３分間遠心することで菌体ペレットを回収し、リゾチーム入りＰ１　Ｂｕｆｆｅｒ　２００μＬで室温で５分反応後、再度同遠心条件でペレットを回収後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン）により、ＱＩＡｃｕｂｅ（キアゲン）自動化装置を用いて精製した。得られたプラスミドをＩｌｌｕｍｉｎａ　ｐｒｅｐ（イルミナ）で断片化し、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ）で解析することにより、各プラスミドの由来となる種プラスミドを同定した。このうちの４８個のクローンの結果は、以下の表４に示す。実施例１と同様、Ｈｅｌｐｅｒ組換え単位およびＲｅｐ組換え単位の種々の組み合わせを含むプラスミドライブラリーの構築が確認できた。
・ｒＡＡＶの作製
　トランスフェクションの前日に５×１０４個の２９３Ｔ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種した。２２時間後、９０μＬのＤＭＥＭ培地（２％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換し、３７℃、５％　ＣＯ２で２時間培養した。そこへ各プラスミドを１８５ｎｇ含む溶液とＤＮＡの１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏを含むＤＭＥＭ培地を混合したトランスフェクション溶液をそれぞれ添加した。
　３７℃、５％　ＣＯ２で７２時間培養後、１０×Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１．５Ｍ　ＮａＣｌ、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００；ｐＨ７．５）にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２００ユニット／ｍＬ）を添加した溶液を１０ｖ／ｖ％添加し、３７℃で６０分反応させた。その後、１．９Ｍ　ＭｇＳＯ４溶液を２／１００容量添加し、室温で１０分静置した。３，７５０ｒｐｍ、１０分、室温で遠心分離して上清を回収した。
　ｒＡＡＶのゲノムコピー数を定量するために、ＤＮａｓｅＩ処理を３０分行い、９５℃で１０分反応させたサンプルを１０００倍希釈してｑＰＣＲを行った。ターゲットはＩＴＲ２であり、プライマー配列は配列番号１６８および配列番号１６９を用いた。反応条件は９５℃で１０分の後、９５℃／１５秒、５５℃／５秒、７２℃／３０秒を４０サイクル繰り返した。結果を表４に示す。個別スクリーニング系においてもウイルス産生量が異なるＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅプラスミドをスクリーニングすることが出来た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 ＊由来する種プラスミドの番号の記載がないことは、対応する種プラスミドが検出できなかったことを示す。
・ｒＡＡＶの評価
　トランスフェクションの前日に１×１０６個の２９３Ｔ細胞を６ｗｅｌｌプレートに播種した。２２時間後、２．８５ｍＬのＤＭＥＭ培地（２％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換し、３７℃、５％　ＣＯ２で２時間培養した。そこへ各プラスミド（Ｃｏｎｔｒｏｌ、＃２０、＃２４、＃４６）を４μｇ含む溶液とＤＮＡの１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏを含むＤＭＥＭ培地を混合したＴトランスフェクション溶液をそれぞれ添加した。
　３７℃、５％　ＣＯ２で７２時間培養後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１／８０容量添加し、室温で１０分静置した。剥離した細胞懸濁液を回収し、１８０×ｇで５分遠心分離して上清を完全に除去した。細胞ペレットを３００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００；ｐＨ８．５）で懸濁し、さらにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（８３ユニット／ｍＬ）を添加して３７℃で３０分反応させた。その後、１．９Ｍ　ＭｇＳＯ４溶液を２／１００容量添加し、室温で１０分静置した。１２，０００×ｇ、４℃、１０分の遠心分離によって上清を回収し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８を終濃度０．００１％で添加した。
　ｒＡＡＶのゲノムコピー数を定量するために、ＤＮａｓｅＩ処理を３０分行い、９５℃で１０分反応させたサンプルを１０００倍希釈してｑＰＣＲを行った。ターゲットはＡＡＶ－２の３’ＩＴＲで、プライマー配列は配列番号１６８および配列番号１６９を用いた。反応条件は９５℃で１０分の後、９５℃／１５秒、５５℃／５秒、７２℃／３０秒を４０サイクル繰り返した。結果を図４に示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２、配列番号１７０）、＃２０、＃２４、＃４６それぞれのＡＡＶ２生産量は１．５５×１０１０　ＧＣ／ｍＬ、１．６２×１０９　ＧＣ／ｍＬ、４．０７×１０９　ＧＣ／ｍＬ、２．４４×１０１０　ＧＣ／ｍＬで、＃４６の生産量が高かった。
　＃４６のＥｍｐｔｙ／Ｆｕｌｌ率を評価するためにｒＡＡＶの精製を行った。まず、３種類の塩化セシウム溶液（１．３５ｇ／ｃｍ３、１．２７ｇ／ｃｍ３、１．２５ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ０．５ｍＬ、２．５ｍＬ、１．０ｍＬ重層し、そこへｒＡＡＶの細胞抽出液を重層した。２２６，０００×ｇ、１８℃、１．５時間の密度勾配遠心分離を行い、１．２７ｇ／ｃｍ３付近の溶液を約２ｍＬ回収し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８を終濃度０．００１％で添加した。次に、溶媒交換を行うために、３０Ｋの限外ろ過Ｆｉｌｔｅｒ（メルク；　Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５）を用いて、ＴＢＳ（０．００５％　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８、１０％　スクロース、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に置換した。このｒＡＡＶサンプルのＦｕｌｌ率を評価するために、Ｒｅｆｅｙｎ　Ｏｎｅ（ライフサイエンスソリューションズ）を用いたＭａｓｓ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ法で測定した。結果を図５に示す。Ｆｕｌｌ率は６１．３％であった。
（実施例３：想定される種プラスミド構造）
　図６～図１０に想定される種プラスミド構造の例を示す。模式図に示す各機能単位は別個に１つの代替単位核酸に含めてもよいし、隣接する複数の機能単位を１つの代替単位核酸に含めてもよい。これらの種プラスミドを使用して、本開示のウイルス由来構成物プラスミドを作製する方法を実施して、所望の機能（例えば、ウイルス由来構成物の生産量）に優れたプラスミドを取得する。
＊プロモーター（弱・中・強）が濃淡で示される。
＊プロモーター（矢印）は正・負の向きを示す。
（図６：Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ構造のＡＡＶベクタープラスミドのための例）
・図６Ａ：ＩＴＲ→Ｒｅｐ→Ｃａｐ→Ｈｅｌｐｅｒの順序の例
・図６Ｂ：Ｒｅｐ→ＩＴＲ→Ｃａｐ→Ｈｅｌｐｅｒの順序の例（Ｒｅｐの位置とＣａｐの位置を交換した構造も企図される）
・図６Ｃ：Ｈｅｌｐｅｒ遺伝子が分割して配置されている例
（図７：Ｒｅｐ／Ｃａｐのバリエーションの検討例）
・図７Ａ：Ｒｅｐ遺伝子を分割した配置およびプロモーターの発現強度のバリエーションの検討例
・図７Ｂ：Ｃｅｐ遺伝子を分割した配置およびプロモーターの発現強度のバリエーションの検討例
＊プロモーター（弱・中・強）が濃淡で示される。
（図８：Ｈｅｌｐｅｒのバリエーションの検討例）
・図８Ａ：Ｈｅｌｐｅｒ遺伝子を分割した配置およびプロモーターの発現強度のバリエーションの検討例
・図８Ｂ：ＡｄＶ由来Ｈｅｌｐｅｒ遺伝子と他のウイルス由来のＨｅｌｐｅｒ遺伝子との組み合わせおよびプロモーターの正・負の向きのバリエーションの検討例
・図８Ｃ：ＡｄＶ由来Ｈｅｌｐｅｒ遺伝子と生合成に関わる核酸配列との組み合わせおよびプロモーターの正・負の向きのバリエーションの検討例
（図９：レンチウイルスベクタープラスミドのための例）
・図９Ａ：Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ構造のＬＶベクタープラスミドのプロモーターの発現強度のバリエーションの検討例
・図９Ｂ：複数の所望の遺伝子の発現強度のバリエーションの検討例
（図１０：アデノウイルスベクタープラスミドのための例）
・図１０Ａ：Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ構造のＡｄＶベクタープラスミドの構造タンパク質のバリエーションの検討例
・図１０Ｂ：複数の所望の遺伝子の発現強度のバリエーションの検討例
（実施例４：ヘルパー遺伝子発現プラスミドのコンビナトリアルプロモーターライブラリー）
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法のための種プラスミドの設計
　ヘルパープラスミドに通常使用されているＶＡ、Ｅ４、Ｅ２Ａ領域に加えて、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ領域も搭載したｐＨｅｌｐｅｒ種プラスミド５種類（配列番号２３７～２４１）を表５のように設計した。こられのプラスミドを使用した場合、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞以外のプロデューサー細胞におけるＡＡＶ産生が可能である。Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂそれぞれの野生型プロモーターに加えて、発現強度の異なる３種類のプロモーター（ＵＢＣプロモーター、ｍＰＧＫプロモーターおよびＥＦ１Ａプロモーター）の配列のいずれかを各遺伝子領域に連結した（図１１も参照のこと）。
　ここで、ＶＡ、各遺伝子およびその下流のポリＡシグナル配列は種プラスミド間で共通に設計しており、ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法によるコンビナトリアルライブラリーの対象はプロモーター部分である。各領域の境界に制限酵素ＳｆｉＩ認識部位（５’－ＧＧＣＣｎＮＮＮ／ｎＧＧＣＣ－３’；ｎおよびＮは、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれかであり、大文字Ｎが３’末端突出部分となる）を配置した。各ＳｆｉＩ認識部位を切断した際に生成する３塩基の各３’末端突出は、プラスミド内で唯一の配列となるように設計した。ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法によるコンビナトリアルライブラリー作成の際にこの突出部分の相補性により隣り合うＤＮＡ断片の順序と方向が指定される。よって、種プラスミドは、図１１に示すように全ての種類の種プラスミドについて、それぞれの遺伝子の位置の対応する単位ＤＮＡが同じ突出配列を有するように設計した。使用予定の一部の遺伝子は、天然にＳｆｉＩ認識配列を含むが、このようなＳｆｉＩ認識配列は、タンパク質コード配列の場合は同義コドンに置き換え、ＩＴＲ配列内などの非コード領域の場合は配列を変化させることで消去した。
・ＯＧＡＢ法のための集積核酸の準備
　プロモーター－ＯＲＦ―ポリAシグナルを含む単位ＤＮＡをＳｆｉＩで切り出すことができるように構築したプラスミドベクターである、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―１ｓｔ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―２ｎｄ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―３ｒｄ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―４ｔｈ、およびｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―５ｔｈの５つのクローニング用プラスミドは、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―３－ＡａｒＩ（配列番号９９）をＡａｒＩで切断後、それぞれ配列番号１７１と１７２、配列番号１７３と１７４、配列番号１７５と１７６、配列番号１７７と１７８、配列番号１７９と１８０の合成ＤＮＡをアニールして構築したリンカーＤＮＡを連結することにより構築した。
　その他の必要なＤＮＡは、適当なテンプレートＤＮＡからＰＣＲ法により得た。反応は、テンプレートＤＮＡの溶液（約０．０１ｎｇ／μｌ）の１μＬに１３．３μＬの水、２μＬの１０×Ｅｘ－Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）、１．６μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（タカラバイオ）、０．１μＬのＥｘ－Ｔａｑ、３．２ｐｍｏｌ／μＬの下記に示すプライマーをそれぞれ１μＬ加えて、９８℃で２分間、９８℃で２０秒間と５８℃で３０秒間、７２℃で１ｋｂにつき１分間の反応を３０サイクル行った。その後ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製し、０．５μＬの６ｎｇ／μＬのｐＴＡＫＮ－２（バイオダイナミック研究所）、２．５μＬのＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞を加えて、１６℃で３時間ライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）を用いて形質転換を行った。終夜培養後、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン入りＬＢプレートに出現したコロニーについて塩基配列を確認することで、それぞれの断片について正しい配列を有するクローンを取得した。ＷＴ＿Ｅ２Ａ、ＷＴ＿Ｅ４、ＷＴ＿Ｅ１Ａ、ＷＴ＿Ｅ１Ｂ、ＵＢＣ、ｍＰＧＫ、およびＥＦ１Ａについてのそれぞれプロモーター断片の確認および増幅のために、それぞれ、配列番号１８１と１８２、配列番号１８３と１８４、配列番号１８５と１８６、配列番号１８７と１８８、配列番号１８９と１９０、配列番号１９１と１９２、配列番号１９３と１９４に示すプライマーの組を用いた。ＶＡ（ＷＴ＿内在プロモーターを含む）、ＷＴ＿Ｅ２Ａ、ＷＴ＿Ｅ４、ＷＴ＿Ｅ１Ａ、およびＷＴ＿Ｅ１Ｂの遺伝子（ＶＡ）およびＯＲＦの確認および増幅のために、それぞれ、配列番号１９５と１９６、配列番号１９７と１９８、配列番号１９９と２００、配列番号２０１と２０２、配列番号２０３と２０４に示すプライマーの組を用いた。ＳＶ４０ポリＡシグナル、ｂＧＨポリＡシグナル、ｈＧＨポリＡシグナル、およびＨＳＶポリＡシグナルの確認および増幅のために、それぞれ、配列番号２０５と２０６、配列番号２０７と２０８、配列番号２０９と２１０、配列番号２１１と２１２に示すプライマーの組を用いた。なお、これらのプライマーの５’末端側には、任意の３塩基配列を生成可能なＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素であるＢｓｐＱＩの認識部位が導入されており、得られたＤＮＡ断片をＢｓｐＱＩで切断することにより、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―１ｓｔからー５ｔｈの５つのクローニング用プラスミドベクター内に、プロモーター－ＯＲＦ―ポリＡシグナルがこの順番で集積可能なように突出配列を設計した。これらの増幅したＤＮＡをｐＴＡＫＮ－２に連結し、それぞれの断片を有するプラスミド１６種類を構築した。これらのプラスミドと、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―１ｓｔからー５ｔｈの５つのクローニング用プラスミドベクターを表１に従って組み合わせて混合し、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法により、種プラスミドの構築に必要な１７種類のＯＧＡＢブロックプラスミドを構築した。具体的には、ＤＮＡ溶液（１００ｎｇ／μｌ）の各１μＬに１２μＬの水、２μＬの１０×３．１　ＮＥＢ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、０．５μＬのＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ）、１．５μＬのＴ４－Ｌｉｇａｓｅを加えて、３７℃で１分間と１６℃で１分間の反応を３０サイクル行い、その後、１６℃で３時間以上放置した。得られた反応物を用いてＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養することにより形質転換体を得た。
・ＯＧＡＢ法のためのＤＮＡ断片の等モル混合物の調整
　ＯＧＡＢブロックプラスミドを有する大腸菌を２ｍＬのＬＢ培地からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン）により、自動化システムＱＩＡｃｕｂｅによりプラスミドを精製し、最終的に３０μＬのＴＥ緩衝液に溶出した。得られたプラスミドを制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ）、ＡｐａＬＩ（ＮＥＢ）で切断して、低融点アガロースゲルによる電気泳動により約０．８ｋｂ～３．２ｋｂの１７種類の断片を回収した。ＤＮＡ濃度を蛍光光度計（Ｑｕｂｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）により測定した後、正確に等モルのＤＮＡを分取するのに必要な体積を小数点以下２桁μＬまで計算して、マイクロピペットにより各断片を分取することでそれぞれの種プラスミドに必要な５種のＤＮＡ断片が等モルに混合した溶液を準備した。
・ＯＧＡＢ集積用の断片の準備
　プラスミドｐＧＥＴＳ１６１を制限酵素ＳｆｉＩで切断して、低融点アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離し、大きい５．８ｋｂの断片をゲルから切り出して精製して、ＯＧＡＢ集積用の断片を取得した。
・ＯＧＡＢ法によるプラスミド形成
　得られた５種のＤＮＡ断片の混合溶液（６．８ｆｍｏｌ）と、上記のＯＧＡＢ集積用の断片（６．８ｆｍｏｌ）とに合計８μＬとなるようにＴＥ緩衝液を追加し、そこに１０μＬの２×ライゲーションバッファー（１５％ポリエチレングリコール６０００、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１３２ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３．２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２ｍＭ　ＡＴＰ）を添加してよく混合後、２μＬのＴ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を加え、３７℃で０．５時間インキュベーションすることで、タンデムリピート状に連結した形質転換用ＤＮＡを準備した。ここに枯草菌のコンピテントセル１００μＬを添加し、３７℃で、３０分ダックローターにより回転培養した。その後、３００μＬのＬＢ培地を添加して、３７℃で１時間ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（シグマアルドリッチ）入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養することで、種プラスミドの候補形質転換体を得た。
・形質転換体のプラスミド構造確認
　得られた候補形質転換体の中からランダムに６株のコロニーを選択して、２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン入りＬＢ培地で５ｈ培養し、得られた菌体から以下の手順で少量のプラスミド抽出を行った。２ｍＬの菌液を１．５ｍＬ遠心チューブにとり、６，８００×ｇで３分遠心し、上清をマイクロピペットで取り除いた。得られた菌体ペレットをよく懸濁後、１０ｍｇ／ｍＬの卵白リゾチーム（ｗａｋｏ）を含むＰ１バッファーを１００μＬ添加後、３７℃で５分間インキュベーションした。そこに、２００μＬのＰ２バッファーを加えて４回転倒混和した。その後、Ｐ３を１５０μＬ添加し、４回転倒混和した。これを２０，０００×ｇで５分間遠心することにより、白い沈殿と上清に分離した。上清を新しい１．５ｍＬ遠心チューブに移して、そこに、４５０μＬのＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）を添加し、よく混和した後、２０，０００×ｇで５分間遠心することにより、フェノール相と水相とに分離し、水相３２０μＬを新しいチューブに移して、そこに９００μＬのエタノールを加え、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清をマイクロピペットで取り除き、９００μＬの７０％エタノールを加え、チューブ全体をリンスした。その後、７０％エタノールをマイクロピペットで取り除き、得られた沈殿を２５μＬのＴＥ緩衝液で溶解した。得られたプラスミド溶液を８μＬとり、そこに１μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）と、それぞれの種プラスミドの構造確認に適切な１μＬの制限酵素を添加し、３７℃で１時間反応後、アガロースゲル電気泳動により切断バターンを確認することで、想定される制限酵素切断パターンと一致するクローンをそれぞれの種プラスミドについて１つずつ取得した。
・種プラスミド大量調製法
　塩化セシウム－エチジウムブロマイド密度勾配超遠心法により高純度のプラスミドＤＮＡを調製した。ＬＢ培地にテトラサイクリンを１０μｇ／ｍＬになるように加えたものを２００ｍＬ用意し、５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬずつ入れて、枯草菌プラスミド保持株を接種し、３７℃で１６時間培養後、超遠心法によりプラスミドを精製した。これらのプラスミドをＩｌｌｕｍｉｎａ　ｐｒｅｐ（イルミナ）により断片化し、ＭｉＳｅｑ（イルミナ）全塩基配列を決定して、それぞれの種プラスミドを正しく集積したクローンを取得した。
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢライブラリー
　大量調製により取得した４種類の種プラスミド２μｇに、水を８５μＬになるように添加後、１０μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、５μＬの制限酵素ＳｆｉＩを添加して５０℃で１時間反応した。反応終了後に５０μＬの水とＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）を１５０μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで５分間遠心することにより２相に分離して、水相を新しい１．５ｍＬのチューブに移し、５００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。新たに、５００μＬの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μＬ以下になるまで続けた。水層が４５０μＬ以下になったら、Ｐ３　Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）を５０μＬ添加し、更にエタノールを９００μＬ添加して混合後、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、得られたペレットＤＮＡを９００μＬの７０％エタノールでリンス後、２０μＬのＴＥに溶解した。
　上述の精製ＤＮＡ約1μｇを１２μＬに調整した。ここに２×ライゲーションバッファー１５μＬと、３μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加して、混合後室温で４時間反応した。３本のチューブでライゲーション産物１０μＬにつき１００μＬの枯草菌コンピテントセル培養液を加え、ダックローターで３０分旋回培養した。その後、それぞれＬＢ培地を３００μＬ添加し、３７℃で１時間旋回培養ののち、全培養液を１２枚のテトラサイクリン入りプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養を行った。その結果、約３０，０００個のコロニーが得られた。
・ｐＨｅｌｐｅｒプロモーターライブラリーからのｒＡＡＶの作製
　これらのコロニーのうち９６個をランダムに選択し、２ｍＬのテトラサイクリン入りＬＢ培地に植菌し、終夜培養により培養した。得られた培養液から以下の手順で少量のプラスミド抽出を行った。２ｍＬの菌液を１．５ｍＬ遠心チューブにとり、６，８００×ｇで、３分遠心し、上清をマイクロピペットで取り除いた。得られた菌体ペレットをよく懸濁後、１０ｍｇ／ｍＬの卵白リゾチーム（ｗａｋｏ）を含むＰ１バッファーを１００μＬ添加後、３７℃で５分間インキュベーションした。６，８００×ｇで、３分遠心し、上清をマイクロピペットで取り除き、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン）により、自動化システムＱＩＡｃｕｂｅによりプラスミドを精製し、最終的に３０μＬのＴＥ緩衝液に溶出した。
　上述の９６コロニーに由来するプラスミドと種プラスミド＃９の計９７種類のプラスミドＤＮＡ（枯草菌由来プラスミド）を得た。これらのプラスミドをＨｅＬａ細胞に導入して、ウイルス粒子生産を評価した。
　トランスフェクションの前日に０．１７×１０６個のＨｅＬａ細胞を２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。２２時間後、０．３８ｍＬのＤＭＥＭ培地（２％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換し、３７℃、５％　ＣＯ２で２時間培養した。そこへｐＡＡＶ－ＧＦＰプラスミド０．１０μｇ、ｐＲ２Ｃ１プラスミド０．１３μｇ、ｐＨｅｌｐｅｒライブラリープラスミド０．３３μｇ、１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏおよびＤＭＥＭ培地を混合したトランスフェクション溶液２０μＬを添加した。３７℃、５％　ＣＯ２で７２時間培養後、上清を回収し、ｒＡＡＶのゲノムコピー数を定量した
・ｒＡＡＶの評価
　上清に対してＤＮａｓｅＩ処理を３０分行い、９５℃で１０分反応させて調製したサンプルを１０００倍希釈してｑＰＣＲを行った。ここで、ＣＭＶプロモーターを標的とする５’－ＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’（配列番号２１３）および５’－ＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号３１４）のプライマー配列を用いた。反応条件は９５℃で１０分の後、９５℃／１５秒、５５℃／５秒、７２℃／３０秒を４０サイクル繰り返した。
　結果を図１２に示す。ＷＴプロモーターで構成される種プラスミド＃９と比較して、Ｔｉｔｅｒが向上するクローンが確認された。
・選択したｒＡＡＶのプロモーターの同定
　ウイルスゲノム量が最も多かったクローン（ｐＨｅｌｐｅｒ　ｃｌｏｎｅ　＃６０）を選択し、そのウイルスベクター生産に用いたプラスミドの塩基配列を以下の様に決定してプロモーターの組合せを同定した。プラスミドＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ　ｐｒｅｐ（イルミナ）を用いて断片化し、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ）により塩基配列解析を行った。
（実施例５：ｐＤｕａｌ（ヘルパー／Ｒｅｐ／Ｃａｐ）遺伝子発現プラスミドのプロモーターライブラリー）
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法のための種プラスミドの設計
　実施例４と同様に、ヘルパープラスミドに通常使用されているＶＡ、Ｅ４、Ｅ２Ａ領域と血清型２のＲｅｐ遺伝子および血清型１のＣａｐ遺伝子を搭載したｐＤｕａｌ種プラスミド５種類（配列番号２４２～２４６）を表６のように設計した。これらのプラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＡＡＶを産生可能である。Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｒｅｐ２およびＣａｐ１それぞれの野生型プロモーターに加えて、発現強度の異なる３種類のプロモーター（ＵＢＣ　プロモーター、ｍＰＧＫ　プロモーターおよびＥＦ１Ａ　プロモーター）から得られる配列のいずれかを各遺伝子領域に連結した（図１３も参照のこと）。
　ここで、ＶＡ、各遺伝子およびその下流のポリＡシグナル配列は種プラスミド間で共通に設計しており、ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法によるコンビナトリアルライブラリーの対象はプロモーター部分である。各領域の境界に制限酵素ＳｆｉＩ認識部位（５’－ＧＧＣＣｎＮＮＮ／ｎＧＧＣＣ－３’；ｎおよびＮは、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれかであり、大文字Ｎが３’末端突出部分となる）を配置した。各ＳｆｉＩ認識部位を切断した際に生成する３塩基の各３’末端突出は、プラスミド内で唯一の配列となるように設計した。ＣｏｍｂｉＯＧＡＢ法によるコンビナトリアルライブラリー作成の際にこの突出部分の相補性により隣り合うＤＮＡ断片の順序と方向が指定される。よって、種プラスミドは、図１３に示すように全ての種類の種プラスミドについて、それぞれの遺伝子の位置の対応する単位ＤＮＡが同じ突出配列を有するように設計した。使用予定の一部の遺伝子は、天然にＳｆｉＩ認識配列を含むが、このようなＳｆｉＩ認識配列は、タンパク質コード配列の場合は同義コドンに置き換え、ＩＴＲ配列内などの非コード領域の場合は配列を変化させることで消去した。
・ＯＧＡＢ法のための集積核酸の準備
　ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―１ｓｔ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―２ｎｄ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―３ｒｄ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―４ｔｈ、ｐＢＲ－ｄｅｌＴｙｐｅＩＩＳ―５ｔｈの５つのクローニング用プラスミドは、実施例４で構築したものを使用した。
　その他の必要なＤＮＡのうち、実施例４で構築したものはそのまま使用した。実施例４にないものについては、実施例４と同様に、適当なテンプレートＤＮＡからＰＣＲ法により得たのち、ｐＴＡＫＮ－２にクローニングした。Ｃaｐ２、Ｒｅｐ１の各プロモーター断片の確認および増幅のために、それぞれ、配列番号２１５と２１６、配列番号２１７と２１８に示すプライマーの組を用いた。Ｃａｐ２、Ｒｅｐ１のＯＲＦの確認および増幅のために、それぞれ、配列番号２１９と２２０、配列番号２２１と２２２に示すプライマーの組を用いた。実施例４と同様に、表６に記載のＤＮＡ断片を準備するためのＯＧＡＢブロックプラスミドを構築した。
・種プラスミドの構築
　実施例４と同様にＯＧＡＢ法により行った。正しい構造を持つプラスミドを構築し、超遠心法により大量調製した。
・ＣｏｍｂｉＯＧＡＢライブラリー
　大量調製により取得した＃１５、＃１６、＃１７、＃１８の４つの種プラスミドを制限酵素ＳｆｉＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して、混合後３７℃で２時間反後、形質転換に用いた。テトラサイクリン入りＬＢ部レートで３７℃で終夜培養を行った結果、約３０，０００個のコロニーが得られた。
・ｐＤｕａｌプロモーターライブラリーからのｒＡＡＶの作製
　実施例４と同様に、これらのコロニーのうち９６個をランダムに選択し、プラスミドを精製した。これに種プラスミド＃１４を加えた計９７種類のプラスミドＤＮＡ（枯草菌由来プラスミド）をＨＥＫ２９３細胞に導入して、ウイルス粒子生産を評価した。
　トランスフェクションの前日に０．２２５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。２２時間後、０．３８ｍＬのＤＭＥＭ培地（２％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換し、３７℃、５％　ＣＯ２で２時間培養した。そこへｐＡＡＶ－ＧＦＰプラスミド０．１０μｇ、ｐＤｕａｌライブラリープラスミド０．３４μｇ、１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏおよびＤＭＥＭ培地を混合したトランスフェクション溶液２０μＬを添加した。コントロールとしてｐＡＡＶ－ＧＦＰプラスミド０．１０μｇ、ｐＲ２Ｃ１プラスミド０．１２μｇ、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド０．２２μｇ、１倍量のＰＥＩ　ｐｒｏおよびＤＭＥＭ培地を混合したトランスフェクション溶液２０μＬを添加した。３７℃、５％　ＣＯ２で７２時間培養後、上清を回収し、ｒＡＡＶのゲノムコピー数を定量した
・ｒＡＡＶの評価
　上清に対してＤＮａｓｅＩ処理を３０分行い、９５℃で１０分反応させて調製したサンプルを１０００倍希釈してｑＰＣＲを行った。ここで、ＣＭＶプロモーターを標的とする５’－ＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’（配列番号２１３）および５’－ＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号２１４）のプライマー配列を用いた。反応条件は９５℃で１０分の後、９５℃／１５秒、５５℃／５秒、７２℃／３０秒を４０サイクル繰り返した。
　結果を図１４に示す。ＷＴプロモーターで構成される種プラスミド＃１４と比較して、Ｔｉｔｅｒが向上するクローンが確認された。
・選択したｒＡＡＶのプロモーターの同定
　ウイルスゲノム量が最も多かったクローン（ｐＤｕａｌ　ｃｌｏｎｅ　＃１５）を選択し、そのウイルスベクター生産に用いたプラスミドの塩基配列を以下の様に決定してプロモーターの組合せを同定した。プラスミドＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ　ｐｒｅｐ（イルミナ）を用いて断片化し、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ）により塩基配列解析を行った。
　上記の実施例で使用した各プラスミドは、以下の通り入手または作製した。
・ｐＡＡＶ－ＧＦＰ
ベクタービルダーから購入した（ｐＡＡＶ［Ｅｘｐ］－ＣＭＶ＞ＥＧＦＰ：ＷＰＲＥ）。
 
・ＶＢ３＿ｐＡＡＶ－ＥＦ１Ａ－ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔ２Ａ－Ｈｙｇｒｏ（ＶＢ）
ベクタービルダーから購入した（ｐＡＡＶ［Ｅｘｐ］－ＥＦ１Ａ＞ｄＴｏｍａｔｏ（ｎｓ）：Ｔ２Ａ：Ｈｙｇｒｏ）。
 
・ＶＢ５＿ｐＡＡＶ－ｍＰＧＫ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｏＰＲＥ（ＶＢ）
ベクタービルダーから購入した（ｐＡＡＶ［Ｅｘｐ］－ｍＰＧＫ＞ｍＣｈｅｒｒｙ：ｏＰＲＥ）。
 
・ＶＢ６＿ｐＡＡＶ－ＵＢＣ－ＥＢＦＰ（ＶＢ）
ベクタービルダーから購入した（ｐＡＡＶ［Ｅｘｐ］－ＵＢＣ＞ＥＢＦＰ）。
 
・ＶＢ７＿ＶＢ２１１１１７－ＴＲＥ－ｔＴＡ
ベクタービルダーから購入した（ｐＲＰ［Ｅｘｐ］－ＴＲＥ＞ｔＴＡ）。
 
・６２３０＿ｐＡＡＶ－ＣＭＶ
ＴＡＫＡＲＡから購入した（６２３０＿ｐＡＡＶ－ＣＭＶ）。
 
・ＳＹＮｐ３４＿ｐＨｅｌｐｅｒ
ｐＵＣ１９ベクタープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ：＃５００００５）を制限酵素（ＡａｔＩＩ、ＰｃｉＩ）で処理した。そこに以下の３断片（ＶＡ断片、Ｅ４断片およびＥ２Ａ断片）をＩｎＦｕｓｉｏｎを用いて挿入した。ＶＡ断片は、Ａｄ５のゲノム（ＡＴＣＣ　ＶＲ－１５１６を参照のこと）をテンプレートとして以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ｔｔａｇｔａａｇｃｔｔｃｃｃｔｃｃｔｇａｃｇｃｇｇｔａｇｇａｇｇａｇｇｇｇａｇｇｇｔｇｃｃｃｔｇｃａｔｇ－３’（配列番号２２３）、５’－ｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇｔｃａａｔｔｇｇｔａｇａｔｇｔａｃｃｔｇｇａｃａｔｃｃａｇｇｔｇａｔｇｃｃｇｇｃｇ－３’（配列番号２２４）。Ｅ４断片は、Ａｄ５のゲノムをテンプレートとして以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ｔｇｔａｃａＧＧＣＧＣＧＣＣｇａａｔｔｃｇｔｔｔｔａｇｇｇｃｇｇａｇｔａａｃｔｔｇｔａｔｇｔｇｔｔｇｇｇａａｔｔｇｔａｇ－３’（配列番号２２５）、５’－ａｇｇｇａａｇｃｔｔａｃｔａａａｃｇｇｔａｃａｃａｇｇａａａｃａｇｇａｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇ－３’（配列番号２２６）。Ｅ２Ａ断片は、Ａｄ５のゲノムをテンプレートとして以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ｇａａａａｇｔｇｃｃａｃｃｔｇａｃｇｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃＧＣＧＡＴＣＧＣｇｇｔａｃｃｃａａｃｔｃｃａｔｇｃｔｃａａｃａｇｔｃｃｃｃａｇｇｔａｃａｇｃｃｃ－３’（配列番号２２７）、５’－ｇａａｔｔｃＧＧＣＧＣＧＣＣｔｇｔａｃａｇｃｃｃｇｇｇｃｇａｃｃｇｃａｃｃｃｔｇｔｇａｃｇａａａｇｃｃｇｃｃｃｇｃａａｇ－３’（配列番号２２８）。
 
・ＳＹＮｐ２１＿ｐＲ２Ｃ１
ｐＵＣ１９ベクタープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ：＃５００００５）を制限酵素（ＡａｔＩＩ、ＰｃｉＩ）で処理した。そこに以下の３断片（ｐ５遺伝子断片、ＡＡＶ２　Ｒｅｐ断片およびＳＶ４０　ｏｒｉ断片）をＩｎＦｕｓｉｏｎを用いて挿入した。ｐ５遺伝子断片は、以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ｇａａａａｇｔｇｃｃａｃｃｔｇａｃｇｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇａｇｇｇｇｔｇｇａｇｔｃｇｔｇａｃｇｔｇａａｔｔａｃｇｔｃａｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇａｇｇｔｃｃｔｇｔａｔｔａｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇａｇｔｇｔｔｔｔｇｃｇａｃ－３’（配列番号２２９）、５’－ｇｔｔｃａａａｃｃｔｃｃｃｇｃｔｔｃａａａａｔｇｇａｇａｃｃｃｔｇｃｇｔｇｃｔｃａｃｔｃｇｇｇｃｔｔａａａｔａｃｃｃａｇｃｇｔｇａｃｃａｃａｔｇｇｔｇｔｃｇｃａａａａｔｇｔｃｇｃａａａａｃａｃｔｃａ－３’（配列番号２３０）。ＡＡＶ２　Ｒｅｐ断片は、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２（Ｔａｋａｒａ）をテンプレートとして以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ｇｃｇｇｇａｇｇｔｔｔｇａａｃｇｃｇｃａｇｃｃｇｃｃＡＴＧＣＣＧＧＧＧＴＴＴＴＡＣ－３’（配列番号２３１）、５’－ＧＡＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴａｔｔｔａａａｔｃａｔＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴ－３’（配列番号２３２）。ＳＶ４０　ｏｒｉ断片は、ＳＶ４０ｏｒｉ遺伝子配列（ＴＯＹＯＢＯ）をテンプレートとして以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ａａｔＡＧＣＧＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣｇｇｃｃｔｃｃａａａａａａｇｃ－３’（配列番号２３３）、５’－ｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇｔｃａａｔｔｇａｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔａａｃｔ－３’（配列番号２３４）。得られたプラスミドを制限酵素（ＳｗａＩ、ＡｆｅＩ）で処理した。そこにＡＡＶ１　Ｃａｐ断片をＩｎＦｕｓｉｏｎを用いて挿入した。ＡＡＶ１　Ｃａｐ断片は、ｐＲＣ１（Ｔａｋａｒａ）をテンプレートとして以下のプライマーを使用して調製した：プライマー配列５’－ＡＡＣＡＡＴＡＡａｔｇａｔｔｔａａａｔｃａｇｇ－３’（配列番号２３５）、５’－ｇｇｃｃＧＣＧＡＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴｇｔａｇｃｃａｔｇｇａａａｃｔａｇａｔａ－３’（配列番号２３６）。
 
・ＳＹＮｐ１７７＿ＡＩＯ＿Ｈｅｌｐｅｒ－Ａｄ５＿Ｒ２Ｃ１＿ＥＧＦＰ＿ｗｔＥ１＿ｋｍ
遺伝子合成とＯＧＡＢ法により作製した。このプラスミドが有する遺伝子とその順番を以下に示す：５’ＩＴＲ２（ベクタービルダー）、ＣＭＶプロモーター（ベクタービルダー）、ＥＧＦＰ（ベクタービルダー）、ＷＰＲＥ（ベクタービルダー）、ｈＧＨ　ｐｏｌｙＡ　ｓｉｇｎａｌ（ＴＡＫＡＲＡ）、３’ＩＴＲ２（ベクタービルダー）、Ｅ２Ａ（Ａｄ５）、Ｅ４（Ａｄ５）、ＶＡ（Ａｄ５）、Ｃａｐ（ＡＡＶ１）、Ｒｅｐ（ＡＡＶ２）、ｐ５（ＡＡＶ２）、Ｅ１Ａ（Ａｄ５）、Ｅ１Ｂ（Ａｄ５）、ｐＵＣ　ｏｒｉ（ｐＵＣ１９）、カナマイシン耐性遺伝子（ベクタービルダー）、ＨＳＶ　ＴＫ　ＰｏｌｙＡ　ｓｉｇｎａｌ（ＴＡＫＡＲＡ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ベクタービルダー）、ｍＰＧＫプロモーター（ベクタービルダー）。ここで、ＯＧＡＢ法の例示的な手順を以下に示す。目的の導入核酸を、約１ｋｂ以下の断片に分割する。各断片の末端がユニークかつ特定の断片とのみ相補的になるように設計する。このように設計した各断片それぞれについてプライマーを設計してＰＣＲに法により各断片を調製する。各断片をベクタープラスミドにクローニングし、各ベクタープラスミドを使用して大腸菌の形質転換を行い、各断片について正しい配列を含むクローンを取得する。これらの大腸菌クローンからプラスミドを精製し、プラスミド溶液のＤＮＡ濃度を測定する。各断片のプラスミドの量が等しくなるように、それぞれのプラスミド溶液を分取して混合する。この混合液に制限酵素を添加し、それぞれがユニークかつ特定の断片とのみ相補的になる末端を有するＤＮＡ断片を生成する。その後、同じ制限酵素で切断したＯＧＡＢ集積用ベクターを各断片とモル濃度を合わせるような量で溶液に添加し、ライゲーションを行い、相補的な末端を有する断片（ＯＧＡＢ集積用ベクターの断片を含む）のペア同士を連結する。これを枯草菌コンピテントセルに添加し、培養した後、形質転換されたコロニーを取得する。このコロニーから目的の構造を有するプラスミドを回収する。
 
・ＳＹＮｐ４４－２＿ｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｄ５ΔＳｆｉＩ）＿ｋｍ
遺伝子合成とＯＧＡＢ法により作製した。このプラスミドが有する遺伝子とその順番を以下に示す：Ｅ４（Ａｄ５）、Ｅ２Ａ（Ａｄ５）ΔＳｆｉＩ、ＶＡ（Ａｄ５）、ｐＵＣ　ｏｒｉ（ｐＵＣ１９）、カナマイシン耐性遺伝子（ベクタービルダー）、ＡｍｐＲ　プロモーター（ｐＵＣ１９）。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　本出願は、２０２２年５月２日に日本国特許庁に出願された特願２０２２－７６０５８号に対する優先権の利益を主張し、その内容全体が本明細書に参考として援用される。
　本開示によれば、効率的に種々のウイルス由来構築物プラスミドを作製することが可能であり、性能が改善されたウイルス由来構築物プラスミドが効率的に取得され得る。

Claims (90)

  1. 　ウイルス由来構成物プラスミドを作製する方法であって、
    　ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の少なくとも一部を含む開始プラスミドのセットを準備する工程であって、前記開始プラスミドのセットは、対応する代替単位核酸のセットを含み、前記対応する代替単位核酸のセットは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも１セットを含む、工程と、
    　前記開始プラスミドのセットを制限酵素で処理して、切断代替単位核酸断片を含む混合溶液を調製する工程と、
    　前記切断代替単位核酸断片をライゲーションして集積核酸を形成する工程と、
    　前記集積核酸を形質転換生物に接触させてウイルス由来構成物プラスミドを形成する工程と、
    を含む方法。
  2. 　ウイルス由来構成物プラスミドの集合を作製する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記開始プラスミドのセットのうちの少なくとも１つが動物細胞において作動する転写開始配列を含む、動物細胞において作動する前記転写開始配列を含むウイルス由来構成物プラスミドを作製する、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記開始プラスミドのセットが、３種類以上の開始プラスミドを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　形成されたウイルス由来構成物プラスミドの集合から、所望する機能に優れたウイルス由来構成物プラスミドを選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記所望する機能がウイルス由来構成物の生産量である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記所望する機能が、目的とするウイルス由来構成物組成物に混入する不純物量である、請求項６に記載の方法。
  9. 　前記不純物が、核酸配列を含まない外殻タンパク質、不完全な核酸配列を含む外殻タンパク質、不完全な外殻タンパク質、不完全な核酸配列から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記所望する機能が、目的とするウイルス由来構成物組成物における目的のウイルス由来構成物の純度である、請求項６に記載の方法。
  11. 　前記選択されたウイルス由来構成物プラスミドの並行する代替単位核酸の組み合わせを含むウイルス由来構成物プラスミドを調製する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
  12. 　前記開始プラスミドのセットの各々が、ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 　前記開始プラスミドのうちの少なくとも一部が、請求項１に記載の方法によって作製されたプラスミドである、請求項１に記載の方法。
  14. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、同じ遺伝子の異なるサブタイプの少なくとも一部をコードする核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 　前記開始プラスミドのセットの各々が、前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列の少なくとも一部を含む３種類以上の代替単位核酸を含む、請求項１に記載の方法。
  16. 　前記ライゲーションして集積核酸を形成する工程において、バーコード核酸を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
  17. 　前記開始プラスミドのセットの各々が、約１０ｋｂ以上の前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  18. 　前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列が、
    （Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
    （Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
    （Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
    （Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と
    を含む、請求項１に記載の方法。
  19. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、種類または向きが異なるプロモーターをコードする対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項１に記載の方法。
  20. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、薬剤応答性のプロモーターを含む、プロモーターをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項１に記載の方法。
  21. 　前記プロモーターが、薬剤応答性のプロモーターを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、
    （Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
    （Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
    （Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
    （Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と、
    （Ｅ）プロモーターをコードする核酸配列と、
    （Ｆ）所望の遺伝子をコードする核酸配列と、
    （Ｇ）宿主細胞の生合成に関わる核酸配列と
    から選択される異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、請求項１に記載の方法。
  23. 　前記宿主細胞の生合成に関わる核酸配列が、ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原（ＳＶ４０ＬＴＡ）、ＴＡＸ、Ｋｒａｓ、Ｍｙｃ、ＭＩＲ１７ＨＧ、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＰＤＩＡ２、ＸＢＰ１、ＨＳＰＡ５、ＰＣ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）、ＰＤＫ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲＦ２、およびＣＰＳＦ６からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、所望の遺伝子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の少なくとも２セットを含む、請求項１に記載の方法。
  25. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、所望の遺伝子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 　前記開始プラスミドが、２つの末端反復配列を含む核酸配列を含み、前記所望の遺伝子をコードする代替単位核酸が前記２つの末端反復配列を含む核酸配列の間に存在する、請求項２４に記載の方法。
  27. 　前記ウイルス由来構成物が、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、腫瘍溶解ウイルスおよびウイルスレプリコンから選択される、請求項１に記載の方法。
  28. 　前記ウイルス由来構成物が、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、コロナウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、コクサッキ―ウイルス、およびニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されるウイルスのウイルス由来構成物である、請求項１に記載の方法。
  29. 　前記ウイルス由来構成物が、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびセンダイウイルスからなる群から選択されるウイルスのウイルス由来構成物である、請求項１に記載の方法。
  30. 　前記ウイルス由来構成物が、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスからなる群から選択されるウイルスのウイルス由来構成物である、請求項１に記載の方法。
  31. 　前記ウイルス由来構成物が、アデノ随伴ウイルスのウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  32. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する異なる末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ボカウイルスおよびシミアンウイルスのうちの少なくとも１つに由来する機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３１に記載の方法。
  35. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 　前記機能補助因子が、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ、ヘルペスウイルスのＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ３０、ＵＬ４２、ＵＬ５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ８、およびＩＣＰ２２、パピローマウイルスのＥ１、Ｅ２、およびＥ６、ボカウイルスのＮＰ１、ＮＳ２、ＮＳ４、およびＢｏｃａＳＲ、ならびにシミアンウイルスのＬａｒｇｅ　Ｔ抗原のうちの少なくとも１つを含む、請求項３４に記載の方法。
  37. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３４に記載の方法。
  38. 　前記開始プラスミドが、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含む、請求項３１に記載の方法。
  39. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｒｅｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３１に記載の方法。
  40. 　前記ｒｅｐが、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ７６、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０のうちの少なくとも１つを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記ｒｅｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 　ｒｅｐをコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｃａｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項３１に記載の方法。
  44. 　前記ｃａｐが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＡＡＰおよびＭＡＡＰのうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記ｃａｐをコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項４３に記載の方法。
  46. 　ｃａｐをコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項４３に記載の方法。
  47. 　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲ、プロモーター、所望の遺伝子、３’ＩＴＲ、ｒｅｐ、ｃａｐおよび機能補助因子を含む、請求項３１に記載の方法。
  48. 　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｒｅｐおよびｃａｐを含み、前記ｒｅｐおよびｃａｐの一方が、前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに挟まれる領域の下流に位置付けられ、他方が、前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに挟まれる領域の上流に位置付けられる、請求項３１に記載の方法。
  49. 　前記開始プラスミドが、２つのＩＴＲおよび前記ウイルス由来構成物を構成するのに必要な核酸配列のその他の部分を含み、前記その他の部分が、前記２つのＩＴＲに挟まれる領域の外にある、請求項３１に記載の方法。
  50. 　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲ、プロモーター、所望の遺伝子、３’ＩＴＲ、ｒｅｐ、ｃａｐおよび機能補助因子をこの順番で含む、請求項３１に記載の方法。
  51. 　前記開始プラスミドが、第１のプロモーター、第１のｒｅｐ、第２のプロモーター、第２のｒｅｐ、第３のプロモーターおよびｃａｐをこの順番で含む、請求項３１に記載の方法。
  52. 　前記ウイルス由来構成物が、レンチウイルスのウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  53. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、レンチウイルスに由来する異なる長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）またはその改変体を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 　前記開始プラスミドが、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 　前記開始プラスミドが、２セット以上の前記プロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｔａｔおよびｒｅｖから選択される機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項５２に記載の方法。
  57. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＶＳＶ－Ｇおよびｅｎｖから選択される構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項５２に記載の方法。
  59. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 　前記ウイルス由来構成物が、アデノウイルスのウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  61. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスに由来する異なる末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 　前記開始プラスミドが、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、請求項６０に記載の方法。
  63. 　前記開始プラスミドが、２セット以上の前記プロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、請求項６０に記載の方法。
  64. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５から選択される構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６０に記載の方法。
  65. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記構造タンパク質をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 　構造タンパク質をコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６４に記載の方法。
  67. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２ＢおよびＥ４から選択される機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６０に記載の方法。
  68. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、前記機能補助因子をコードする異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセット、およびプロモーターをコードする異なる核酸配列を含むその上流に隣接する対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 　機能補助因子をコードする対応する代替単位核酸のセットが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項６７に記載の方法。
  70. 　前記ウイルス由来構成物プラスミドが、前記ウイルス由来構成物プラスミド単独を導入したプロデューサー細胞においてウイルス由来構成物の生産を可能とすることを特徴とする、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 　請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法を実行してウイルス由来構成物プラスミドライブラリーを構築する方法。
  72. 　前記対応する代替単位核酸のセットが、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、６４通り以上の異なる並行する代替単位核酸の組み合わせを提供する、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法を実行してウイルス由来構成物プラスミドライブラリーを構築する方法。
  73. 　請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法によって生産されるウイルス由来構成物プラスミドまたウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  74. 　並行する一連の代替単位核酸として３個以上の代替単位核酸を含むウイルス由来構成物プラスミドを含む、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーであって、前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリーは、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットのうちの各ウイルス由来構成物プラスミド上の並行する代替単位核酸が、約１０ｋｂ以上の長さを有する、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  75. 　複数のウイルス由来構成物プラスミドを含むウイルス由来構成物プラスミドライブラリーであって、前記複数のウイルス由来構成物プラスミドにおける組み合わせにおいて異なる部分が、プロモーターまたは機能補助因子である核酸配列を含む、ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  76. 　前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー中の複数のウイルス由来構成物プラスミドが、由来するウイルスの血清型において互いに異なる、組み合わせにおいて異なる部分を構成するエレメントを含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  77. 　前記ウイルス由来構成物プラスミドライブラリー中の複数のウイルス由来構成物プラスミドの組み合わせにおいて異なる部分を構成するエレメントがプロモーターを含み、前記複数のウイルス由来構成物プラスミドにおける前記プロモーターは、天然において互いに異なる遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項７３～７６のいずれか一項に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  78. 　異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットが、
    （Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
    （Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
    （Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
    （Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と
    のうちの少なくとも１つの異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸のセットを含む、請求項７４に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  79. 　各ウイルス由来構成物プラスミドが、
    （Ａ）末端反復配列を含む核酸配列と、
    （Ｂ）パッケージング因子をコードする核酸配列と、
    （Ｃ）構造タンパク質をコードする核酸配列と、
    （Ｄ）機能補助因子をコードする核酸配列と
    を含む、請求項７４に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  80. 　異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットが、ＧＣ含量７５％以上である代替単位核酸を含む、請求項７４に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  81. 　異なる核酸配列を含む対応する代替単位核酸の前記複数のセットが、６４通り以上の異なる並行する代替単位核酸の組み合わせを可能とする対応する代替単位核酸の複数のセットを含み、各ウイルス由来構成物プラスミドが同じ数の並行する代替単位核酸を含む、請求項７４に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  82. 　各ウイルス由来構成物プラスミドがバーコード核酸配列を含む、請求項７４に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリー。
  83. 　請求項７４に記載のウイルス由来構成物プラスミドライブラリーに含まれるウイルス由来構成物プラスミド。
  84. 　請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法によってウイルス由来構成物プラスミドを作製するステップと、
    　前記ウイルス由来構成物プラスミドをプロデューサー細胞に導入してウイルス由来構成物を形成させるステップと、
    を含む、ウイルス由来構成物を作製する方法。
  85. 　請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法によってウイルス由来構成物プラスミドの集合を作製するステップと、
    　前記ウイルス由来構成物プラスミドの集合をプロデューサー細胞に導入してウイルス由来構成物を形成させてウイルス由来構成物ライブラリーを構築するステップと、
    を含む、ウイルス由来構成物ライブラリーを作製する方法。
  86. 　前記ウイルス由来構成物プラスミドをプロデューサー細胞に導入するステップが、単一の前記ウイルス由来構成物プラスミドをプロデューサー細胞に導入することを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 　前記ウイルス由来構成物プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部が前記プロデューサー細胞の染色体に組み込まれる、請求項８５に記載の方法。
  88. 　請求項８５に記載の方法によって作製されるプロデューサー細胞。
  89. 　請求項８５に記載の方法によって生産されるウイルス由来構成物。
  90. 　請求項８５に記載の方法によって生産されるウイルス由来構成物含有組成物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024068990A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Polyplus Transfection A chimeric helper nucleic acid molecule comprising helper elements from three distinct helper viruses

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002528049A (ja) * 1998-07-22 2002-09-03 イミューソル インコーポレイテッド 実質的に完全なリボザイムライブラリー
US20180155740A1 (en) * 2015-09-23 2018-06-07 Wuhan Institute Of Physics And Mathematics, Chinese Academy Of Sciences Recombinant baculovirus and method of using the same for preparing recombinant adeno-associated virus vector
WO2020203496A1 (ja) * 2019-04-01 2020-10-08 国立大学法人神戸大学 キメラプラスミドライブラリーの構築方法
JP2020188763A (ja) * 2019-05-20 2020-11-26 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えａａｖビリオンの製造に用いる核酸分子
JP2021502799A (ja) * 2017-09-19 2021-02-04 オックスフォード ジェネティクス リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ レトロウイルスベクター
JP2021510496A (ja) * 2018-01-19 2021-04-30 オックスフォード ジェネティクス リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ａａｖ粒子の産生を目的としたベクター
WO2022097646A1 (ja) * 2020-11-04 2022-05-12 株式会社シンプロジェン 枯草菌におけるウイルスベクタープラスミド生産

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002528049A (ja) * 1998-07-22 2002-09-03 イミューソル インコーポレイテッド 実質的に完全なリボザイムライブラリー
US20180155740A1 (en) * 2015-09-23 2018-06-07 Wuhan Institute Of Physics And Mathematics, Chinese Academy Of Sciences Recombinant baculovirus and method of using the same for preparing recombinant adeno-associated virus vector
JP2021502799A (ja) * 2017-09-19 2021-02-04 オックスフォード ジェネティクス リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ レトロウイルスベクター
JP2021510496A (ja) * 2018-01-19 2021-04-30 オックスフォード ジェネティクス リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ａａｖ粒子の産生を目的としたベクター
WO2020203496A1 (ja) * 2019-04-01 2020-10-08 国立大学法人神戸大学 キメラプラスミドライブラリーの構築方法
JP2020188763A (ja) * 2019-05-20 2020-11-26 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えａａｖビリオンの製造に用いる核酸分子
WO2022097646A1 (ja) * 2020-11-04 2022-05-12 株式会社シンプロジェン 枯草菌におけるウイルスベクタープラスミド生産

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER VOIGT (ED.): "Computer aided design and DNA assembly: Synthetic biology, Pt. B IN: Methods in Enzymology; ISSN 0076-6879; Vol. 498", vol. 498, 1 January 2011, ELSEVIER, ACAD. PRESS , NL , ISBN: 978-0-12-385120-8, article MITSUHIRO ITAYA, TSUGE KENJI, VOIGT CHRISTOPHER A.: "Construction and Manipulation of Giant DNA by a Genome Vector", pages: 427 - 447, XP055355825, DOI: 10.1016/B978-0-12-385120-8.00019-X *
TSUGE KENJI, MATSUI K, ITAYA M: "One step assembly of multiple DNA fragments with a designed order and orientation in Bacillus subtilis plasmid.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 31, no. 21, 1 November 2003 (2003-11-01), GB , pages E133.1 - E133.8, XP002569369, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/NAR/GNG133 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024068990A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Polyplus Transfection A chimeric helper nucleic acid molecule comprising helper elements from three distinct helper viruses

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