[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2023277730A1 - Лекарственное средство для профилактики заражения sars-cov-2 - Google Patents

Лекарственное средство для профилактики заражения sars-cov-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2023277730A1
WO2023277730A1 PCT/RU2022/000207 RU2022000207W WO2023277730A1 WO 2023277730 A1 WO2023277730 A1 WO 2023277730A1 RU 2022000207 W RU2022000207 W RU 2022000207W WO 2023277730 A1 WO2023277730 A1 WO 2023277730A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sars
cov
rnase
liposomes
rna
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/000207
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Шахноз Садыковна АЗИМОВА
Талат Саатович СААТОВ
Баходир Равилович ЗАЙНУТДИНОВ
Ойбек Норбой АШИРОВ
Собирджан Анарматович САСМАКОВ
Елена ЛЫСОВА
Артем Александрович МАХНЕВ
Мукаддас Рустамовна УМАРОВА
Умида Бахриддин кизи ХАМИДОВА
Галина Александровна ПИЯКИНА
Джалолиддин Мирджамилович АБДУРАХМАНОВ
Шухрат Шавкатович ХАСАНОВ
Фарход Бакир ЭШБОЕВ
Original Assignee
МУСАХАНОВА, Ойгуль Мирзаюсуфовна
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2021119487A external-priority patent/RU2021119487A/ru
Application filed by МУСАХАНОВА, Ойгуль Мирзаюсуфовна filed Critical МУСАХАНОВА, Ойгуль Мирзаюсуфовна
Priority to CN202280047238.2A priority Critical patent/CN117651550A/zh
Publication of WO2023277730A1 publication Critical patent/WO2023277730A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the invention relates to medicine, pharmaceuticals and biotechnology.
  • a new combined drug (pharmaceutical composition) is presented that has an antiviral effect against the SARS-CoV-2 coronavirus and related viruses, such as SARS-CoV, MERS, etc., whose genome is RNA, and the virions are provided with a lipid membrane, composition (i ) due to the destruction of the coronovirus genome by the enzyme RNase, composition (ii) due to the destruction of the coronovirus genome by the enzyme RNase and the drug niclosamide, which prevents the replication of SARS-CoV-2.
  • the proposed compositions can be used on an outpatient basis to suppress the replication of the SARS-CoV-2 virus, reduce the viral load, and reduce the risk of infection transmission by airborne droplets.
  • RNA of coronaviruses can be cleaved by the action of the enzyme ribonuclease (RNase) [2], which can cleave the RNA of coronaviruses, or additionally by suppressing the replication of coronaviruses under the action of niclosamide, a drug used to treat parasitic infections.
  • RNase ribonuclease
  • niclosamide can inhibit the replication of the SARS-CoV-2 virus [3-6].
  • the combined drug is intended for inhalation or intranasal administration.
  • the combination drugs of the present invention include: composition (i) - liposomes delivering an effective amount of RNase and composition (i) - liposomes delivering an effective amount of RNase and an effective amount of niclosamide. These pharmaceutical compositions provide cleavage of SARS-CoV-2 RNA.
  • Combination medicines can be used as nasal drops or spray, as well as inhalation.
  • the technical result is to create an effective and safe antiviral agent that ensures the destruction of SARS-CoV-2 RNA.
  • the specified technical result is illustrated by the following examples.
  • a combined drug for the prevention or treatment of coronavirus infection caused by SARS-CoV-2 is proposed, containing an effective amount of RNase molecules in liposomes.
  • a combined drug for the prevention or treatment of coronavirus infection caused by SARS-CoV-2 is proposed, containing an effective amount of RNase and niclosamide molecules in liposomes.
  • the above combination drugs may be intended for intranasal or inhalation administration.
  • FIG. 1 shows the results of the experiment according to example 4.
  • FIG. 2 shows the results of the experiment according to example 5 (gel electrophoresis method).
  • Example 1 Obtaining liposomes with RNase.
  • Phospholipids of both vegetable (soy lecithin) and animal origin (bovine brain) were used to obtain liposomes.
  • ribonuclease a commercial preparation-enzyme RNase A with MM-13.7 kDa, pH optimum - 5, 0-6.0; 50i/mg from Mol BIO HIMEDIA, obtained from bovine pancreas or ribonuclease from bovine pancreas (RNase A) from SamsonMed ( Russia).
  • phospholipids an extract from soy lecithin used in the food industry or phospholipids of animal origin (from the brain of cattle) were used.
  • Dosage forms of the pharmaceutical compositions described herein can be obtained by any known method and contain other excipients capable of increasing the stability of compositions (i) and (ii) and RNase transfection.
  • Niclosamide was used (crystalline substance, melting point 227-232 ° C.
  • the IR spectrum of the test sample corresponded to the IR spectrum of anhydrous niclosamide - standard, the structural formula of niclosamide has the following form:
  • composition i liposomes containing RNase (composition i) and liposomes containing RNase A and niclosamide (composition ii)
  • lecithin solution 1 ml
  • chloroform 6 ml
  • the solvent was distilled off in a vacuum (4 ⁇ 2 mmHg) at a temperature of +40°C.
  • 50 ⁇ l of Ribonuclease A, 30 ⁇ l of niclosamide solution (10% solution in DMSO) and 5 ml of physiological saline were added to the flask.
  • the resulting mixture was frozen at minus 20° ⁇ for 20 min, then the mixture was thawed at 23° ⁇ for 30 min.
  • Dosage forms of the pharmaceutical compositions provided herein may be prepared by any known method and contain other excipients capable of increasing the stability of compositions (i) and (i) and the transfection of RNase and niclosamide.
  • Example 3 Synthesis of primers for the N gene of SARS-CoV-2 The PCR method was used to determine whether SARS-CoV-2 RNA could be cleaved.
  • the N gene was chosen as the most stable for such types of coronaviruses as SARS and MERS, encoding the nucleocapsid [9-11]. Primers and a fluorescent probe were synthesized for the N gene using open international data from the CDC (US Center for Disease Control and Prevention) [12].
  • Primers were synthesized on an ASM-2000 DNA synthesizer by the phosphoramidite solid-phase method [13]. After synthesis, the oligonucleotides were removed from the solid phase with concentrated 30% aqueous ammonia for 2 hours at a temperature of 60°C. The oligonucleotide solution was evaporated to remove ammonia and precipitated in 70% ethanol in the presence of 0.3M sodium acetate and 50 mM magnesium chloride. Oligonucleotides were precipitated by centrifugation at 14,000 rpm for 20 minutes. The precipitate was washed twice with 70% ethanol and dried at room temperature for 30 minutes.
  • oligonucleotides were purified from short incompletely synthesized molecules. To do this, at the end of the synthesis, the last step of removing the DMT group was not carried out; as a result, only fully synthesized oligonucleotides at the 5' end contain a DMT group for purification on cartridges by reverse phase chromatography. Reverse phase chromatography was carried out under the following conditions: oligonucleotides were washed with 5% acetonitrile with sodium chloride at a concentration of 100 mg/ml. To remove the DMT group from oligonucleotides used 3% dichloroacetic acid solution.
  • oligonucleotides After removal of the DMT group, 50% acetonitrile in 100 mM Tris buffer pH 8.5 was used to elute the purified oligonucleotides from the cartridge.
  • the purified oligonucleotides were precipitated with 70% ethanol in the presence of 50 mM magnesium chloride, by centrifugation at 14,000 rpm for 20 minutes.
  • the resulting precipitate of oligonucleotides was dissolved in TE buffer pH 8.0 to a concentration of 20 ⁇ M.
  • the resulting primer solution was used to carry out the PCR reaction.
  • the content of the virus in biological samples was determined by PCR, and gel electrophoresis of the samples was performed as described in examples 4 and 5.
  • RNA and detection of the SARS-CoV-2 virus was carried out according to the standard method using certified DNA-Technology reagent kits [14,15], as well as using primers and a probe synthesized by us.
  • the effectiveness of the action of liposomes was determined by cycle threshold shift (AACt) in PCR analysis.
  • AACt cycle threshold shift
  • RNA isolation we used the DNA-Technology reagent kit and the certified ENKOR kit developed by us. RNA detection in the samples was carried out with the synthesized primers and probe described in Example 3.
  • both the DNA-Technology SARS-CoV-2/SARS-CoV reagent kit and the PCR kit developed by us were used under the following conditions: mix 25 ⁇ l, 1x PCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.5, 20 mM ammonium sulfate, 20 mM potassium chloride, 0.1 ⁇ g/ml BSA), 3 mM magnesium chloride, 0.8 mM dNTP, 400 nm each primer, 200 nM probe, 1 u. polymerase, 25 units.
  • PCR program 50°C - 15 minutes; 95°C - 15 minutes; 40 cycles (95° ⁇ - 10 seconds; 60° ⁇ - 40 seconds, signal reading via FAM channel).
  • PCR analysis 5 ⁇ l of RNA sample were used.
  • composition (i) and (i) were also studied by gel electrophoresis [16] using primers synthesized by us for the N gene (466 bp).
  • composition i D - sample after incubation with RNase-containing liposomes (composition i) F - sample after incubation with liposomes containing RNase and niclosamide (composition i)
  • K - negative control - a sample not containing the SARS-CoV-2 virus.
  • mice in group 1 were instilled with 20 ⁇ l of physiological saline into the nasal cavity, animals of groups 3 and 4 were injected with 20 ⁇ l of compositions (i) and (ii), respectively, animals of group 5 were injected with 20 ⁇ l of RNase (1 unit/ ⁇ l). After 1 hour, all animals (except group 1) were injected with 20 ⁇ l of biological material positive for SARS-CoV-2 with a viral load of Ct 20. Then, after 1 hour, samples were taken from the nasal cavity in all animals as described in [14 ]. All obtained samples were analyzed by PCR with the DNA-Technology SARS-CoV-2/SARS-CoV reagent kit [15]. The results of the experiments are presented in table. 3. Table 3
  • compositions (i) and (ii) Study of the in vivo effect of compositions (i) and (ii) on SARS-CoV-2 RNA inhibition by a quantitative PCR method using hybridization-fluorescence detection
  • compositions (i) - group 3 and compositions (ii) - group 4 were not detected.
  • group 2 and group 5 the average value of Ct 26-27 practically does not change.
  • compositions (i) and (ii) The results indicate that under the action of compositions (i) and (ii) the RNA of the SARS-CoV-2 virus is cleaved, while free RNase practically does not work in vivo.
  • compositions (i) and (ii) in vivo were also studied by gel electrophoresis ( Figure 2) [16].
  • Free RNase (gr. 5) does not cleave coronavirus RNA in vivo (Table 3 and gr. 5).
  • compositions (i) were incubated at 36°C for various time intervals from one to six hours (table. 4). Then, biological material with coronavirus infection SARS-CoV-2 was added to each sample of composition (i) and again incubated at 36°C for one hour. The experiment was carried out as described in example 4. RNA isolation and detection of the SARS-CoV-2 virus were carried out according to the standard method using certified DNA-Technology reagent kits [15]. The experiment was carried out in 5 repetitions.
  • Table 4 shows data on the study of the stability of liposomes with RNase-composition (i) by RT-PCR.
  • composition (i) the threshold cycle (Ct) is shifted by 8 cycles, which indicates that the viral load is reduced by about 10 3 times.
  • composition i the average value of the threshold cycle (Ct) during PCR with liposomes containing RNase (composition i) practically does not change in the time interval from 1 to 6 hours, which indicates the stability of liposomes containing RNase (composition i) for 6 hours .
  • compositions (ii) were incubated at 36°C for various time intervals from one to six hours (table. 5). Then, biological material with SARS-CoV-2 coronavirus infection was added to each sample of composition (ii) and incubated again at 36°C for one hour. The experiment was carried out as described in example 4. RNA isolation and detection of the SARS-CoV-2 virus were carried out according to the standard method using certified DNA-Technology reagent kits [15].
  • composition ii Study of the stability of liposomes with RNase and niclosamide (composition ii) by RT-PCR
  • composition (ii) As can be seen from Table 5, under the action of composition (ii), the threshold cycle (Ct) is shifted by 8 cycles, which indicates that the viral the load is reduced by about 10 times. It was found that the average value of the threshold cycle (Ct) during PCR practically does not change in the time interval from 1 to 6 hours, which indicates the stability of liposomes containing RNase and niclosamide (composition i) for 6 hours.
  • Fibroblast cells were obtained by us according to the method [17]. Rat liver hepatocytes were obtained according to the method [18].
  • compositions (i) and (ii) were determined by the in vitro MTT method [19]. Data are presented as mean value (from 3 experiments). The cytotoxic effect of each of the studied samples of the compositions was compared with the control cytostatic "Cisplatin” (Teva Pharmaceutical Industries, Ltd., Israel).
  • compositions (i) and (ii) do not have a cytotoxic effect on normal cells.
  • mice were carried out in vivo on 4 groups of animals, 5 rabbits each (Giant breed, weighing 1.6 - 1.8 kg) and outbred mice (weighing 18 - 20 g), 10 mice per group.
  • the studied compositions were instilled into the eyes of the animals 2 times a day (morning and evening), 50 ⁇ l of saline in the right eye - control, and in the left eye 50 ⁇ l - composition - (i) and (ii) for 5 days.
  • the first group - control (physiological solution)
  • composition (s) The fourth group - liposomes from soy lecithin with RNase and niclosamide (composition (s)).
  • test samples 20 ⁇ l were injected intranasally into each nostril.
  • Tables 8 and 9 show the biochemical parameters of the studied animals.
  • compositions (i) and (i) on mucous membranes were studied by studying the dynamic control of the eyes of rabbits.
  • the first test was carried out one day after the instillation of compositions (i) and (ii) and soy lecithin liposomes.
  • compositions (i) and (i) are not toxic to the eyes of rabbits.
  • Patent RU 2746362 (application 2021106335 dated March 11, 2021) - "Combined drug with antiviral effect against the new coronavirus SARS-CoV-2".

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, фармацевтике и биотехнологии. Представлена новая фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным эффектом в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и родственных вирусов, таких как SARS, MERS и др., геном которых представлен РНК, а вирионы снабжены липидной оболочкой. Комбинированное лекарственное средство для профилактики заражения (лечения) SARS-CoV-2 представляет собой (i) - липосому с эффективным количеством фермента РНКазы, или (ii) - липосому с эффективным количеством фермента РНКазы и эффективным количеством препарата никлозамида, вспомогательное средство - растворитель, разрешенный к применению в фармацевтике. Изобретение обеспечивает разрушение генетического материала - РНК коронавирусов, что дает возможность профилактики от РНК-содержащих вирусов, в том числе SARS-CoV-2, попадающих в организм человека через верхние дыхательные пути.

Description

ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАРАЖЕНИЯ SARS-COV-2
ОПИСАНИЕ Область техники
Изобретение относится к медицине, фармацевтике и биотехнологии. Представлено новое комбинированное лекарственное средство (фармацевтическая композиция), обладающая противовирусным эффектом в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и родственных вирусов, таких как SARS-CoV, MERS и др., геном которых представлен РНК, а вирионы снабжены липидной оболочкой, композиция (i) за счет разрушения генома короновируса ферментом РНКазой, композиция (ii) за счет разрушения генома короновируса ферментом РНКазой и препаратом никлозамидом, препятствующим репликации SARS-CoV-2. Предложенные композиции могут применяться амбулаторно для подавления репликации вируса SARS- CoV-2, снижения вирусной нагрузки, снижения риска передачи инфекции воздушно-капельным путем.
Уровень техники
В мире разработан целый ряд профилактических вакцин, а также средств терапии для лечения коронавирусной инфекции. Имеется патент RU 2746362 (заявка 2021106335 от 11.03.2021) - «Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2» [1] в котором описано “блокирование передачи инфекции и уменьшение риска развития клинических осложнений” за счет применения малых интерферирующих РНК (ми РНК). Основой вышеуказанного патента является получение комбинированного лекарственного средства с созданными молекулами РНК, способными опосредовать мишень-специфические подавление репликации вируса SARS-CoV-2. Однако не предложено препаратов, способных уничтожать коронавирусы путем прямого разрушения их генома - одноцепочечную (+)РНК. Очевидно, что прямое разрушения генома вируса может быть осуществлено путем воздействия фермента рибонуклеазы (РНКазы) [2], способного расщеплять РНК коронавирусов или дополнительно путем подавления репликации коронавирусов под действием никлозамида - лекарственного средства, применяемого для лечения паразитарных инфекций. В настоящее время показано, что никлозамид может ингибировать репликацию вируса SARS-CoV-2 [3-6].
Раскрытие изобретения
Комбинированное лекарственное средство предназначено для ингаляционного или интраназального введения.
Внедрение в практику препаратов на основе РНКаз и никлозамида ограничивается рядом факторов, к которым относятся недостаточная эффективность и безопасность доставки РНКазы и никлозамида в вирусные частица-мишени. Применение липосом [7] для доставки вышеуказанных препаратов (РНКазы и никлозамида) решает эту проблему, так как SARS- CoV-2, а также родственные ему вирусы MERS, SARS-CoV имеют липидную оболочку, позволяющие трансфецировать (проникать) липосомам и внедрять РНКазу и никлозамид непосредственно внутрь вируса.
Таким образом, в настоящее время существует необходимость в разработке нового противовирусного средства способного разрушать РНК коронавируса.
В состав комбинированных лекарственных средств по настоящему изобретению входит: композиция (i) - липосомы, осуществляющие доставку эффективного количество РНКазы и композиция (и) - липосомы, осуществляющие доставку эффективного количество РНКазы и эффективного количество никлозамида. Эти фармацевтические композиции обеспечивают расщепление РНК SARS-CoV-2.
Комбинированные лекарственные средства можно употреблять в виде назальных капель или спрея, а также в виде ингаляции.
Технический результат заключается в создании эффективного и безопасного противовирусного средства, обеспечивающего разрушения РНК SARS-CoV-2. Указанный технический результат поясняется следующими примерами.
Для достижения вышеуказанного технического результата предложено комбинированное лекарственное средство для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, содержащее эффективное количество молекул РНКазы в липосомах.
Также для достижения вышеуказанного технического результата предложено комбинированное лекарственное средство для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, содержащее эффективное количество молекул РНКазы и никлозамида в липосомах.
Согласно настоящему изобретению вышеуказанные комбинированные лекарственные средства могут быть предназначены для интраназального или ингаляционного введения.
Также для достижения вышеуказанного технического результата предложен способ профилактики или лечения SARS-CoV-2 инфекции, в котором вышеуказанное(ые) комбинированное(ые) лекарственное(ые) средство(а) вводятся одновременно, отдельно или последовательно с другими терапевтическими средствами.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 приведены результаты эксперимента по примеру 4. На Фиг. 2 приведены результаты эксперимента по примеру 5 (метод гель-электрофореза).
Осуществление изобретения
Указанный выше технический результат поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение липосом с РНКазой.
Для получения липосом использовали фосфолипиды как растительного (соевый лецитин), так и животного происхождения (из мозга крупного рогатого скота). В качестве рибонуклеазы использовали коммерческий препарат-фермент РНКаза А с ММ-13.7 кД, pH оптимум - 5, 0-6,0; 50и/мг фирмы Mol BIO HIMEDIA, полученный из поджелудочной железы крупного рогатого скота или рибонуклеазу из поджелудочной железы крупного рогатого скота (РНКаза А) фирмы “СамсонМед” (Россия).
В качестве фосфолипидов использовали экстракт из соевого лецитина, применяемого в пищевой промышленности или фосфолипиды животного происхождения (из мозга крупного рогатого скота).
Для получения липосом - 1 г коммерческого (VEROLEC FLS, China) соевого лецитина растворяли в 20 мл хлороформ-метанольной смеси при соотношении 2:1. Смесь выдерживали в течение 10 ч при температуре 2 - 4°С. Затем смесь центрифугировали при 4500 об/мин в течение 5 мин. Отбирали 1 мл надосадочной жидкости и растворяли в 6 мл хлороформа. Далее растворитель отгоняли в вакууме (4±2 мм.рт ст), при температуре +40°С. После полного удаления растворителя добавляли 50 мкл Рибонуклеазы А (Ш/мкл) и 5 мл физиологического раствора. Полученную смесь замораживали при -20°С в течение 20 мин, затем смесь размораживали при перемешивании при 23 °С в течение 30 мин. (процесс замораживания и оттаивания повторяли четырежды). Затем полученную смесь обрабатывали ультразвуком при 22 кГц, 30 сек в 4 повторах. Аналогичным образом получали липосомы на основе фосфолипидов из мозга крупного рогатого скота, которые были выделены по методу [8].
Лекарственные формы фармацевтической композиции, приведенных в настоящем документе могут быть получены любым известным способом и содержать другие вспомогательные вещества, способные увеличивать стабильность композиций (i) и (ii), и трансфекцию РНКазы.
Пример 2. Получение липосом с никлозамидом и РНКазой.
Использовали никлозамид (кристаллическое вещество, температура плавления 227-232 °С. ИК-спектр тестируемого образца соответствовал ИК- спектру безводного никлозамида - стандарта, структурная формула никлозамида имеет следующий вид:
Figure imgf000007_0001
Для получения липосом, содержащих РНКазу (композиция i) и липосом, содержащих РНКазу А и никлозамид (композиция ii), 1 мл раствора лецитина (1,075мМ) смешивали с 6 мл хлороформа. Далее растворитель отгоняли в вакууме (4±2 мм.рт.ст.), при температуре +40°С. После удаления хлороформа в колбу добавляли 50 мкл Рибонуклеазы А, 30 мкл раствора никлозамида (10% раствор в ДМСО) и 5 мл физиологического раствора. Полученную смесь замораживали при минус 20°С в течение 20 мин, затем смесь размораживали при 23 °С в течение 30 мин. при перемешивании (процесс замораживания и оттаивания повторяли четырежды). Затем полученную смесь обрабатывали ультразвуком при 22 кГц, 30 сек. Аналогичным образом получали липосомы на основе фосфолипидов из мозга крупного рогатого скота, которые были выделены по методу [8]. Лекарственные формы фармацевтических композиций, приведенных в настоящем документе могут быть получены любым известным способом и содержать другие вспомогательные вещества, способные увеличивать стабильность композиций (i) и (и), и трансфекцию РНКазы и никлозамида. Пример 3. Синтез праймеров на N ген SARS-CoV-2 Для определения возможности расщепления РНК SARS-CoV-2 использовали ПЦР метод. В качестве мишени для определения возможности расщепления РНКазой генома коронавируса SARS-CoV-2 был выбран N ген, как наиболее стабильный для таких типов коронавирусов как SARS и MERS, кодирующий нуклеокапсид [9-11]. На N ген были синтезированы праймеры и флуоресцентный зонд, используя открытые международные данные CDC (Центр по контролю и профилактике заболеваний США) [12].
Синтез праймеров проводили на приборе ДНК-синтезаторе ASM-2000 фосфорамидитным твёрдофазным методом [13]. После синтеза, олигонуклеотиды снимали с твёрдой фазы концентрированным 30% водным аммиаком в течении 2 часов при температуре 60°С. Раствор олигонуклеотидов выпаривали для удаления аммиака и осаждали в 70% этаноле в присутствии 0,ЗМ ацетата натрия и 50 мМ хлорида магния. Для осаждения олигонуклеотидов центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут. Осадок промывали дважды 70% этанолом и высушивали при комнатной температуре в течение 30 минут.
После синтеза олигонуклеотиды очищали от коротких не полностью синтезированных молекул. Для этого в конце синтеза не проводили последний этап снятия ДМТ группы, в результате только полностью синтезированные олигонуклеотиды на 5’ конце содержат ДМТ группу для очистки на картриджах методом обратно-фазовой хроматографии. Обратно- фазовую хроматографию проводили в следующих условиях: промывку олигонуклеотидов проводили с помощью 5% ацетонитрила с хлоридом натрия в концентрации 100 мг/мл. Для удаления ДМТ группы с олигонуклеотидов использовали 3% раствор дихлоруксусной кислоты. После удаления ДМТ группы для элюирования очищенных олигонуклеотидов с картриджа использовали 50% ацетонитрил в 100 мМ трис буфере pH 8,5. Очищенные олигонуклеотиды осаждали 70% этанолом в присутствии 50 мМ хлорид магния, центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок олигонуклеотидов растворяли в ТЕ буфере pH 8,0 до концентрации 20 мкМ. Полученный раствор праймеров использовали для проведения ПЦР реакции.
Таблица 1
Последовательность праймеров и флуоресцентного зонда на N ген
SARS-CoV-2
Figure imgf000009_0001
С помощью данных праймеров и зонда специфичных к участку N гена РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР определяли содержание вируса в биологических образцах, и проводили гель-электрофорез образцов как описано в примерах 4 и 5.
Пример 4. Изучение действия липосом с РНКазой на SARS-CoV-2 методом RT-ПЦР in vitro.
Выделение РНК и выявление вируса SARS-CoV-2 проводили по стандартному методу с помощью сертифицированных наборов реагентов « ДНК-Т ехнол огия» [14,15], а так же с помощью праймеров и зонда синтезированных нами. Эффективность действия липосом определяли по смещению порогового цикла (AACt) в ПЦР анализе. Пороговый цикл показывает какое количество РНК содержится в пробах, и он обратно пропорционален логарифму начального количества копий.
Для выделения РНК использовали набор реагентов «ДНК-Технология» так и разработанный нами сертифицированный набор «ЭНКОР». Детекцию РНК в образцах проводили с синтезированными праймерами и зондом, описанных в Примере 3. Для проведения ПЦР анализа использовали как набор реагентов «ДНК-Технология» SARS-CoV-2/SARS-CoV, так и разработанный нами ПЦР набор в следующих условиях: объём смеси 25 мкл, 1х ПЦР буфер (20 мМ трис-НС1 pH 8,5, 20 мМ сульфат аммония, 20 мМ хлорид калия, 0,1 мкг/мл БСА), 3 мМ хлорид магния, 0,8 мМ дНТФ, 400 нм каждого праймера, 200 нМ зонда, 1 ед. полимеразы, 25 ед. ревертазы. Программа ПЦР: 50°С - 15 минут; 95°С - 15 минут; 40 циклов (95°С - 10 секунд; 60°С - 40 секунд, считывание сигнала по каналу FAM). Для ПЦР анализа использовали по 5 мкл РНК образца.
Образцы биологического материала человека (по 80 мкл мазка из носоглотки), содержащие коронавирус SARS-CoV-2 инкубировали с 20 мкл композиции (i) и (и) (полученных как описано в примерах 1 и 2), в течение 1 часа при 36°С. Параллельно проводили инкубирование тех же образцов с 20 мкл свободной РНКазы (1 ед./мкл), а также с «пустыми» липосомами, не содержащими РНКазу. Результаты экспериментов представлены в табл. 2.
Таблица 2
Изучение действия in vitro липосом с РНКазой на N ген SARS-CoV-2 ПЦР методом с помощью гибридизационно-флуоресцентной детекции
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Как видно из приведенных данных (табл. 2), под действием «пустых» липосом пороговый цикл (Ct.) реакции RT-ПЦР практически не меняется, что свидетельствует о том, что липосомы сами по себе не могут разрушать РНК SARS-CoV-2. В то же время наибольшее воздействие, и сдвиг Ct происходит под действием липосом, содержащих РНКазу - на 9 циклов, и липосом, содержащих РНКазу и никлозамид - на 10 циклов, что свидетельствует о том, что липосомы, содержащие РНКазу расщепляют РНК коронавируса и снижают концентрацию РНК примерно в 103 раз. При этом сама РНКаза в наших экспериментах сдвигает Ct на 3 цикла, по-видимому, за счет расщепления «свободных» РНК COVID-19. Следует отметить, что липосомы, содержащие РНКазу с никлозамидом проявляли практически такое же действие, что и липосомы, содержащие только РНКазу, что и следовало ожидать из биологической активности никлозамида.
Действие композиции (i) и (и) исследовалось также методом гель- электрофореза [16], используя синтезированные нами праймеры на N ген (466 п.н.).
Результаты эксперимента приведены на Фиг. 1.
Фиг.1. Гель электрофорез в 3 % агарозном геле [16].
Образцы - амплификатов N гена:
А- исходный образец, положительный по COVID-19
В- образец после инкубации с “пустыми” липосомами
С- образец после инкубации с РНКазой
Д- образец после инкубации с липосомами, содержащими РНКазу (композиция i) F- образец после инкубации с липосомами содержащими РНКазу и никлозамид (композиция и)
К- отрицательный контроль - образец не содержащий вирус SARS- CoV-2.
Гель электрофорез (Фиг. 1) ПЦР анализа выявил, что после инкубации позитивных SARS-CoV-2 образцов с композициями (i) и (и) приводит к разложению N гена, так как продукт амплификации на гель электрофорезе отсутствует, что свидетельствует о том, что произошло расщепления N гена SARS-CoV-2.
Пример 5. Изучение действия липосом с РНКазой на SARS-CoV-2 in vivo.
Исследования проводили на 5 группах кроликов породы «Великан», весом 1,6-1, 8 кг, возраста 3-4 месяца, по 5 животных в каждой группе:
Группа 1- отрицательный контроль (физиологический раствор)
Группа 2- положительный контроль, образец мазка содержащий SARS-CoV-2 Группа 3 -композиция (i)
Группа 4-композиция (ii)
Группа 5-РНКаза (1ед./мкл)
В носовую полость животным в группе 1 закапывали 20 мкл физиологического раствора, животным группы 3 и 4 вводили по 20 мкл композиций (i) и (ii), соответственно, животным группы 5 вводили по 20 мкл РНКазы (1 ед/мкл). Через 1 час всем животным (кроме группы 1) вводили по 20 мкл биологического материала, позитивного по SARS-CoV-2 с вирусной нагрузкой - Ct 20. Далее через 1 час у всех животных был сделан забор образцов из носовой полости как описано в [14]. Все полученные образцы анализировали методом ПЦР с набором реагентов «ДНК-Технология» SARS- CoV-2/SARS-CoV [15]. Результаты экспериментов представлены в табл. 3. Таблица 3
Изучение действия in vivo композиции (i) и (ii) на ингибирование РНК SARS-CoV-2 количественным ПЦР методом с помощью гибридизационно- флуоресцентной детекции
Figure imgf000013_0001
Как видно из табл.З, при введении животным композиций (i) - группа 3, и композиций (ii) - группа 4 ,РНК SARS-CoV-2 не обнаруживается. В то же время в группе 2 и группе 5 среднее значение Ct 26-27 практически не меняется.
Результаты свидетельствуют о том, что под действием композиций (i) и (ii) происходит расщепление РНК вируса SARS-CoV-2, тогда как свободная РНКаза практически не действует в условиях in vivo.
Действие композиции (i) и (ii) in vivo исследовалось также методом гель-электрофореза (Фиг.2) [16].
Фиг.2. Гель электрофорез в 3 % агарозном геле [16].
Группа 1- отрицательный контроль (физиологический раствор)
Группа 2- положительный контроль, образец мазка содержащий SARS-CoV-2 Группа 3 -композиция (i)
Группа 4-композиция (и)
Группа 5-РНКаза (1 ед./мкл)
Как видно из Фиг. 2, в контрольных образцах (исходный К+ - группа 2) имеется фрагмент N гена COVID-19, тогда как под действием композиций (i) и (ii) (гр. Зи гр. 4) происходит разрушение N ген вируса SARS-CoV-2.
Свободная РНКаза (гр.5) не расщепляет РНК коронавируса in vivo (табл. 3 и гр. 5).
Пример 6. Стабильность липосом с РНКазой (композиция (i))
Для определения стабильности композицию (i) инкубировали при 36°С в течение различных интервалов времени от одного до шести часов (табл. 4). Затем к каждому образцу композиции (i) добавляли биологический материл с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2 и вновь инкубировали при 36°С один час. Эксперимент проводили как описано в примере 4. Выделение РНК и выявление вируса SARS-CoV-2 проводили по стандартному методу с помощью сертифицированных наборов реагентов «ДНК-Технология» [15]. Эксперимент проводили в 5 повторах.
В табл.4 приведены данные по изучению стабильности липосом с РНКазой -композиция (i) методом RT-ПЦР.
Таблица 4
Исследование стабильности липосом с РНКазой- композиция (i) методом RT-
ПЦР
Figure imgf000014_0001
Из приведённой таблицы видно, что под действием композиции (i) пороговый цикл (Ct) смещается на 8 циклов, что свидетельствует о том, что вирусная нагрузка уменьшается примерно в 103 раз. При этом установлено, что среднее значение порогового цикла (Ct) при ПЦР с липосомами содержащими РНК азу (композиция i) практически не меняется в интервале времени от 1 до 6 часов, что свидетельствует о стабильности липосом содержащих РНКазу (композиция i) в течение 6 часов.
Пример 7. Стабильность липосом с РНКазой и никлозамидом (композиция (ii))
Для определения стабильности композицию (ii) инкубировали при 36°С в течение различных интервалов времени от одного до шести часов (табл. 5). Затем к каждому образцу композиции (ii) добавляли биологический материл с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2 и вновь инкубировали при 36°С один час. Эксперимент проводили как описано в примере 4. Выделение РНК и выявление вируса SARS-CoV-2 проводили по стандартному методу с помощью сертифицированных наборов реагентов «ДНК-Технология» [15].
Таблица 5
Исследование стабильности липосом с РНКазой и никлозамидом (композиция ii) методом RT-ПЦР
Figure imgf000015_0001
Как видно из таблицы 5, что под действием композиции (ii) пороговый цикл (Ct) смещается на 8 циклов, что свидетельствует о том, что вирусная нагрузка уменьшается примерно в 10 раз. При этом установлено, что среднее значение порогового цикла (Ct) при ПЦР практически не меняется в интервале времени от 1 до 6 часов, что свидетельствует о стабильности липосом содержащих РНКазу и никлозамид (композиция и) в течение 6 часов.
Пример 8. Исследование безопасности и токсичности композиции (i) и (ii) на животных in vivo (кролики и мыши), а также на культурах клеток (фибробласты и гепатоциты) in vitro.
Клетки фибробластов были получены нами по методу [17]. Гепатоциты печени крысы получены по методу [18].
Цитотоксические свойства композиций (i) и (ii) определяли методом МТТ in vitro [19]. Данные, представлены в виде среднего значения (из 3 экспериментов). Цитотоксический эффект каждого из исследуемых образцов композиций сравнивали с контролем цитостатиком «Цисплатин» (Teva Pharmaceutical Industries, Ltd., Израиль).
Таблица 6.
Цитотоксичность композиций на клеточной культуре фибробластов
Figure imgf000016_0001
Таблица 7.
Цитотоксичность композиций на гепатоцитах
Figure imgf000017_0001
Как видно из полученных данных (Таблицы 6 и 7), в диапазоне концентраций 10 - 100 мкг/мл образцы не подавляли рост нормальных клеток по сравнению с препаратом сравнения (цисплатин). Таким образом, композиции (i) и (ii) не обладают цитотоксическим эффектом для нормальных клеток.
Пример 9. Изучение общей токсичности композиций на кроликах и мышах in vivo
Исследования проводили in vivo на 4 группах животных по 5 кроликов (породы “Великан”, массой 1,6 - 1,8 кг) и беспородных мышей (массой 18 - 20 г) по 10 мышей в группе. Исследуемые композиции закапывали в глаза животных 2 раза в день (утром и вечером) по 50 мкл физиологического раствора в правый глаз - контроль, а в левый глаз 50 мкл - композиция - (i) и (ii) в течение 5 дней.
Первая группа - контроль (физиологический раствор) Вторая группа - липосомы из соевого лецитина,
Третья группа - липосомы из соевого лецитина с РНКазой (композиция
(i)),
Четвертая группа - липосомы из соевого лецитина с РНКазой и с никлозамидом (композиция (и)).
Параллельно в каждой группе кроликов вводили интраназально по 20 мкл испытуемых образцов в каждую ноздрю.
Через 5 дней введения вышеперечисленных растворов определяли визуальные изменения, происходящие в глазах кроликов и общее состояние животных, а также снимали биохимические показатели крови животных (мышей и кроликов) по методу [20]. Визуальное наблюдение показало, что самочувствие экспериментальных и контрольной группы животных было одинаковым.
В таблице 8 и 9 приведены биохимические показатели исследованных животных.
Таблица 8
Биохимические показатели крови экспериментальных животных (кролики)
Figure imgf000019_0001
Таблица 9
Биохимические показатели крови экспериментальных животных (мыши)
Figure imgf000020_0001
Как видно из полученных данных (табл.8 и табл. 9), значения основных показателей крови практически не отличаются от контрольных, что свидетельствует, о не токсичности композиций (i) и (ii) на животных.
Пример 10. Биомикроскопическое исследование слизистых глаз экспериментальных животных (кролики)
Действие липосом, содержащих композиции (i) и (и) на слизистые было изучено путем исследования динамического контроля глаз кроликов.
В ходе эксперимента проводился динамический контроль состояния глаз (офтальмологический статус) кроликов методом биомикроскопии. Биомикроскопическое исследование осуществляли при помощи офтальмологического биомикроскопа - щелевой лампы «SL 115» фирмы Carl Zeiss (Германия) при увеличении в 10 и 16 раз ежедневно в течение всего срока наблюдения. Оценивали состояние конъюнктивы, склеры, роговицы, передней камеры, радужки и рефлекс с глазного дна. Различные степени увеличения (х10, х16) при биомикроскопии позволяли более детально изучить состояние структур переднего сегмента глаза.
Перед проведением биомикроскопических исследований всех кроликов туго пеленали, голову плотно фиксировали за щелевой лампой.
В ходе проведения биомикроскопических исследований парные глаза кроликов были приняты за норму и использовались в качестве контроля в ходе экспериментов.
Первая проверка проводилась через сутки после закапывания композиций (i) и (ii) и липосом из соевого лецитина.
При осмотре методом биомикроскопии отмечалось, что глаза были спокойны без отделяемого, роговица прозрачная и гладкая, конъюнктива век бледно розовая и блестящая, склера белая без инъекции сосудов. Влага передней камеры также была прозрачной без примеси каких-либо элементов. Радужка рельефна, зрачок круглый, реакция на свет живая. Оптические среды на всех глазах оставались прозрачными, рефлекс с глазного дна был розовый. Признаков воспаления и токсико-аллергической реакции выявлено не было. За весь период наблюдения у всех кроликов офтальмологический статус обоих глаз был идентичным без клинических признаков воспалительных и аллергических реакций.
Эти данные свидетельствуют о том, что композиции (i) и (и) не токсичны для глаз кроликов.
Литература
1. Патент RU 2746362 (заявка 2021106335 от 11.03.2021) - «Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2».
2. О. Н. Ильинская, Р. Шах Махмуд. РИБОНУКЛЕАЗЫ КАК ПРОТИВОВИРУСНЫЕ АГЕНТЫ // МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, No 5, с. 707-717.
3. Wu С, Jan J, et int., and Hsu JTA. Inhibition of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Replication by Niclosamide. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004. doi.org/10.1128/aac.48.7.2693-2696.2004.
4. Ashlee D. Brunaugh, Hyojong Seo, Zachary Wamken, Li Ding, Sang
Heui Seo, Hugh D. C. Smyth. Development and evaluation of inhalable composite niclosamide-lysozyme particles: A broad-spectrum, patient-adaptable treatment for coronavirus infections and sequalae. Published: February 11, 2021 doi.org/ 10.1371 /j oumal.pone.0246803.
5. http://www.pmewswire.com/news-releases/hvundai-bioscience- announced-that-its-covid-19-oral-drug-solved-niclosamides-inhibitorv- concentration-problem-301188126.html.
6. ANA Therapeutics Begins Phase 2/3 Clinical Trial of Proprietary Oral Niclosamide Formulation to Treat COVID-19. Study is first in U.S. to test safety and efficacy of niclosamide as an antiviral for COVID-19. October 26, 2020 08:44 AM Eastern Daylight Time. 7. Liposomes with a large trapping capacity prepared by freezing and thawing of sonicated phospholipid mixtures. Archives of Biochemistry and Biophysics, 212(1), 186-194. doi:10.1016/0003-9861(81)90358-l
(https://doi.org/10.1016/00Q3-986 К8П90358-П
8. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований (Липидный и энергетический обмен). Учебное пособие. Ленинград 1982.
9. Sergio С. Oliveira, Mariana T.Q. de Magalhaes and E. Jane Homan. Immunoinformatic Analysis of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein and Identification of COVID-19 Vaccine Targets. 2020. Front. Immunol. 11: 587615. https://doi.org/l 0.3389/fimmu.2020.587615.
10. Kim TW, Lee JH, Hung CF, Peng S, Roden R, Wang MC, Viscidi R, Tsai YC, He L, Chen PJ, Boyd DA, Wu TC. Generation and Characterization of DNA Vaccines Targeting the Nucleocapsid Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. 2004. J Virol. https://doi.Org/10.1128/JVI.78.9.4638- 4645.2004.
11. Ya Peng, Ning Du, Yuqing Lei, Sonam Doije, Jianxun Qi, Tingrong Luo, George F Gao, Hao Song. Structures of the SARS-CoV-2 nucleocapsid and their perspectives for drug design. The EMBO Journal (2020) 39: el05938.
12. DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Public Health Service Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, GA 3033324, Jan 2020.
13. Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach. Твёрдофазный амидофосфитный метод или фосфорамидитный метод. Beaucage S. L., Iyer R. Р. (англ.) // Tetrahedron. 1992. Vol. 48, no.12, P. 2223-2311. doi: 10.1016/S0040-4020(01)88752-4.
14. Лабораторное тестирование случаев, подозреваемых на коронавирусную инфекцию (COVID-19). 19 марта 2020 г, ВОЗ. 15. ООО «НПО ДНК-Технология». Инструкция по применению набора реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 и подобных SARS-CoV методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени SARS-CoV-2/SARS-CoV.
16. Green M.R., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. Fourth edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012.
17. Khan M., Gasser S. Generating primary fibroblast cultures from mouse Ear and Tissues / Journal of Visualized Experiment. 1/10/2016.
18. Cabral, F., Miller, C.M., Kudma, K.M., Hass, B.E., Daubendiek, J.G., Kellar, B.M., Harris, E.N. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments. 2/12/2018.
19. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay// Journal of Immunological Methods, 1990, 130, p.149- 151
20. Дерюгина A.B., Корягин А. С., Копылова С. В., Таламанова М. Н. // Методы изучения стрессовых и адаптационных реакций организма по показателям системы крови. Нижний Новгород - 2010. - стр. 11.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение лекарственного средства, содержащее в липосомах эффективное количество молекул РНКазы А, для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.
2. Применение по п.1 для интраназального или ингаляционного введения.
3. Применение лекарственного средства, содержащее в липосомах эффективное количество молекул РНКазы А с никлозамидом, для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.
4. Применение по п.З для интраназального или ингаляционного введения.
5. Способ профилактики или лечения SARS-CoV-2 инфекции, в котором молекулы РНКазы А с никлозамидом, содержащиеся в эффективном количестве в липосомах лекарственного средства вводятся одновременно, отдельно или последовательно.
PCT/RU2022/000207 2021-07-02 2022-06-30 Лекарственное средство для профилактики заражения sars-cov-2 WO2023277730A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202280047238.2A CN117651550A (zh) 2021-07-02 2022-06-30 用于预防SARS-CoV-2感染的药物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021119487 2021-07-02
RU2021119487A RU2021119487A (ru) 2021-07-02 Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом для профилактики заражения SARS-CoV-2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023277730A1 true WO2023277730A1 (ru) 2023-01-05

Family

ID=84690534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/000207 WO2023277730A1 (ru) 2021-07-02 2022-06-30 Лекарственное средство для профилактики заражения sars-cov-2

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN117651550A (ru)
WO (1) WO2023277730A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090047272A1 (en) * 2004-04-14 2009-02-19 Appelbaum Jacob G Compositions with Modified Nucleases Targeted to Viral Nucleic Acids and Methods of Use for Prevention and Treatment of Viral Diseases
US11045434B1 (en) * 2020-04-01 2021-06-29 UNION therapeutics A/S Niclosamide formulations for treating disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090047272A1 (en) * 2004-04-14 2009-02-19 Appelbaum Jacob G Compositions with Modified Nucleases Targeted to Viral Nucleic Acids and Methods of Use for Prevention and Treatment of Viral Diseases
US11045434B1 (en) * 2020-04-01 2021-06-29 UNION therapeutics A/S Niclosamide formulations for treating disease

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTENSEN DENNIS ET AL.: "Cationic liposomes as vaccine adjuvants", EXPERT REVIEW OF VACCINES, vol. 6, no. 5, 2007, pages 785 - 796, XP008137314, DOI: 10.1586/14760584.6.5.785 *
ILYINSKAYA O.N., SHAH MAHMOOD R. : "Ribonukleazy kak protivovirusnye agenty", MOLEKULYARNAYA BIOLOGIYA, IZDATEL'STVO NAUKA, RU, vol. 48, no. 5, 30 November 2013 (2013-11-30), RU , pages 707 - 717, XP009542395, ISSN: 0026-8984, DOI: 10.7868/S0026898414040053 *
NISHIBATA YUKA, KOSHIMOTO SHOTA, OGAKI KENTA, ISHIKAWA ERIKA, WADA KOSUKE, YOSHINARI MIKU, TAMURA YUTO, UOZUMI RYO, MASUDA SAKIKO,: "RNase in the saliva can affect the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 by real-time one-step polymerase chain reaction using saliva samples", PATHOLOGY - RESEARCH AND PRACTICE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 220, 1 April 2021 (2021-04-01), AMSTERDAM, NL , pages 153381, XP093021765, ISSN: 0344-0338, DOI: 10.1016/j.prp.2021.153381 *
ROSSI GIOVANNI A. ET AL.: "Diferences and similarities between SARS-CoV and SARS-CoV-2: spike receptor-binding domain recognition and host cell infection with support of cellular serine proteases", INFECTION, vol. 48, 2020, pages 665 - 669, XP037255803, DOI: 10.1007/s15010-020-01486-5 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117651550A (zh) 2024-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9629884B2 (en) Compositions and methods for increasing lifespan and health span
US10195145B2 (en) Method for treating fibrosis using siRNA and a retinoid-lipid drug carrier
EP3087988A2 (en) Use of inhibitors of toll-like receptors in the prevention and treatment of hypercholesterolemia and hyperlipidemia and diseases related thereto
WO2005004903A1 (fr) Methode de traitement de maladies oncologiques
CN101115505A (zh) 治疗由过氧亚硝酸盐过度表达引起的哺乳动物疾病和创伤的方法和组合物
JP7001599B2 (ja) 急性骨髄性白血病の処置のためのダクチノマイシン組成物および方法
KR20060063788A (ko) 올리고 핵산 담지 복합체, 이 복합체를 함유하는 의약조성물
US20060241066A1 (en) Decoy composition for treating and preventing inflammatory disease
Xiaohong et al. CFLAR is a critical regulator of cerebral ischaemia-reperfusion injury through regulating inflammation and endoplasmic reticulum (ER) stress
JP2004512287A (ja) 糖尿病性網膜症の予防または処置のための網膜細胞アポトーシス抑制剤の使用
CN110564842B (zh) 细胞色素酶cyp26a1在制备治疗神经病理性疼痛的药物中的应用
EP1418922A1 (en) Compositions comprising negatively charched phospholipids for treatment and/or prevention of macular degeneration and method for its manufacture
WO2023277730A1 (ru) Лекарственное средство для профилактики заражения sars-cov-2
Pan et al. Valproate reduces retinal ganglion cell apoptosis in rats after optic nerve crush
EA042253B1 (ru) Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом для профилактики заражения sars-cov-2
EA043501B1 (ru) ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ЭФФЕКТОМ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАРАЖЕНИЯ SARS-CoV-2
CN113082208B (zh) 阻断微生物感染、降低胆固醇、防治相关肿瘤的药物及其应用
Gakhramanov Effect of natural antioxidants on antioxidant activity and lipid peroxidation in eye tissue of rabbits with chemical burns
CN112569338B (zh) Tdfa在制备预防和/或治疗眼表炎症疾病的药物中的应用
RU2245137C1 (ru) Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных процессов вирусной этиологии в глазном яблоке
Shukurova et al. A study into the effectiveness of the application of saffron extract in ocular pathologies in experiment
US20070219150A1 (en) Nerve Cell Differentiation Inducer
ES2920052T3 (es) Formulaciones de alicaforsen
WO2002080938A1 (fr) Application de nucleospermate de sodium pour traiter le sida et procede de traitement
CN116077503A (zh) Mettl3酶抑制剂在制备白癜风药物中的应用及其药物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22833748

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280047238.2

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22833748

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1