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WO2023149555A1 - Ｔ細胞の製造方法 - Google Patents

Ｔ細胞の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2023149555A1
WO2023149555A1 PCT/JP2023/003623 JP2023003623W WO2023149555A1 WO 2023149555 A1 WO2023149555 A1 WO 2023149555A1 JP 2023003623 W JP2023003623 W JP 2023003623W WO 2023149555 A1 WO2023149555 A1 WO 2023149555A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
differentiating
ips
disease
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/003623
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
新 金子
翔一 入口
康行 三宅
徳之 篠原
敬子 関谷
Original Assignee
国立大学法人京都大学
武田薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人京都大学, 武田薬品工業株式会社 filed Critical 国立大学法人京都大学
Priority to JP2023578648A priority Critical patent/JPWO2023149555A1/ja
Publication of WO2023149555A1 publication Critical patent/WO2023149555A1/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing T cells, T cells obtained by the method, pharmaceuticals containing the T cells, and the like. (Background of the invention)
  • T cells have been actively promoted around the world (eg, CAR T cell therapy, Treg (regulatory T cell) cell therapy, etc.). It is known that when iPS cells are induced to differentiate into T cells, CD8 single-positive (SP) T cells are mainly induced by conventional 2D culture methods, and other T cells (e.g., CD4SP T cells) are difficult to induce. ing.
  • SP single-positive
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 include a selected population of stromal cells expressing Notch ligands and a selected population of stem cells or progenitor cells, called the ATO (Artificial Thymic Organoid) method.
  • a method for preparing a composition of T cells from stem or progenitor cells by culturing three-dimensional cell aggregates is disclosed.
  • US Pat. No. 6,200,002 discloses genetically engineered mammalian cells containing a transgene encoding a lineage determinant that promotes differentiation into CD4 + Tregs.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for producing T cells with high production safety.
  • the ATO method is known as a method for inducing the differentiation of iPS cells into various T cells (CD4SP cells, CD8SP cells, ⁇ T cells, regulatory T cells, etc.).
  • mouse stromal cells are often used as feeder cells, but considering the hurdles in production from the viewpoint of GMP (Good Manufacturing Protocol), it was preferable to make them xeno-free.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, produced human iPS cell-derived stromal cells (especially fibroblasts) and used them as feeder cells in the ATO method.
  • the present inventors have found that a method for producing T cells with high production safety can be provided.
  • the present invention was completed through further studies based on these findings, and provides the following methods for producing T cells, T cells, medicines, etc.
  • a method for producing T cells comprising: (1) A method comprising the step of culturing a three-dimensional cell aggregate containing cells capable of differentiating into T cells and stromal cells expressing Notch ligands derived from pluripotent stem cells. [2] The method of [1], wherein the cells capable of differentiating into T cells are CD34 + cells or mesodermal progenitor cells. [3] The method of [1], wherein the cells capable of differentiating into T cells are hematopoietic stem cells, hematopoietic endothelial cells, T progenitor cells, or mesodermal progenitor cells.
  • [4] The method of [1], wherein the cells capable of differentiating into T cells are hematopoietic endothelial cells.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the cells capable of differentiating into T cells are cells derived from pluripotent stem cells.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the cells capable of differentiating into T cells are iPS cell-derived cells.
  • [6a] The method according to any one of [1] to [6], wherein the cells capable of differentiating into T cells are human iPS cell-derived cells.
  • [7] The method according to any one of [1] to [6a], wherein the stromal cells are fibroblasts.
  • [14b] A cell population derived from pluripotent stem cells, wherein the ratio of CD4 + T cells to CD8 + T cells in ⁇ T cells contained in the cell population is 0.6 or more.
  • [16] A pharmaceutical comprising the T cells of [15].
  • [17] A method for producing T cells expressing an exogenous T cell receptor and/or a chimeric antigen receptor, comprising: (6) A method comprising the step of introducing a nucleic acid encoding an exogenous T cell receptor and/or a chimeric antigen receptor into T cells obtained by the method according to any one of [1] to [14a].
  • the medicament of [16] which is a prophylactic and/or therapeutic agent for T cell-related diseases.
  • the medicament of [18], wherein the T cell-related disease is a tumor, an infectious disease, or a blood disease.
  • the medicament of [18] wherein the T cell-related disease is abnormally enhanced immune response.
  • [20] A method for preventing and/or treating a T cell-related disease, comprising administering the T cell of [15] to a subject in need thereof.
  • the method of [20], wherein the T cell-related disease is a tumor, an infectious disease, or a blood disease.
  • [21a] The method of [20], wherein the T-cell-related disease is an abnormally enhanced immune response.
  • the T cell of [15] for use in preventing and/or treating a T cell-related disease.
  • the T cell of [22] wherein the T cell-related disease is a tumor, an infectious disease, or a blood disease.
  • the T cell of [22] wherein the T cell-related disease is an abnormal enhancement of immune response.
  • T cells of [15] Use of the T cells of [15] in the manufacture of a medicament for preventing and/or treating T cell-related diseases.
  • T cell-related disease is a tumor, an infectious disease, or a blood disease.
  • T-cell-related disease is abnormally enhanced immune response.
  • the present invention provides a method for producing T cells with high production safety.
  • stromal cells derived from pluripotent stem cells are used as feeder cells in the production method of the present invention, differences between lots of feeder cells used are small, and T cells can be produced stably.
  • T cells with excellent anticancer activity can be produced.
  • T cells with excellent cell dynamics can be produced.
  • FIG. 2 shows the results of flow cytometry analysis of fibroblast marker CD90 and DLL4 expression in iPS cell-derived fibroblasts and MS5 into which the human DLL4 gene was introduced.
  • FIG. 3 shows the analysis results of CD3/TCR ⁇ , CD4/CD8 ⁇ , CD8 ⁇ /CD8 ⁇ , and CAR/IL15R ⁇ by flow cytometry after induction of differentiation from iPS cells to T cells.
  • the results of FfI01s04+MS5/DLL4, FfI01s04+iFibro/DLL4, QHJI01s04/G9D2+MS5/DLL4, and QHJI01s04/G9D2+iFibro/DLL4 are shown from the top.
  • FIG. 3 is a photograph showing in vivo efficacy of iPS cell-derived CD19CAR T cells. From the top, 1, 2, 3, 4 and 5 weeks after administration are shown.
  • Fig. 3 is a graph showing in vivo cell dynamics of iPS cell-derived CD19CAR T cells. Cell counts 1, 2, 3, 4, 5 weeks after administration of cells are shown and graph values are mean ⁇ SD.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of examination of the expression levels of proteins expressed in Treg, using Treg differentiated from iPS cells using iPS cell-derived Fibroblast. Dot plots in the figure indicate the CD3 + CD4 + CD8 ⁇ population. In addition, the numerical values in the graph indicate the ratio of Tregs (CD3 + /CD4 + /CD8 - /CD25 + /FOXP3 + ) in each cell population.
  • “Comprise(s) or comprising” means the inclusion of, but not limited to, the elements following the phrase. Thus, the inclusion of the elements following the phrase, but not the exclusion of any other element, is suggested.
  • “consisting of (s) of or consisting of” is meant including and limited to any and all elements following the phrase. Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed element is required or required and that other elements are substantially absent.
  • “consisting essentially of or consisting essentially of” includes any element that follows the phrase and that affects the activity or action specified in this disclosure for that element. not be limited to other elements. Thus, the phrase “consisting essentially of” indicates that the listed elements are required or required but other elements are optional and that they affect the activity or action of the listed elements. indicates that it may or may not be present, depending on whether it exerts
  • culturing refers to maintaining and/or growing cells in an in vitro environment. By “culturing” is meant maintaining and/or growing cells in vitro or in vitro, eg, in cell culture dishes or flasks.
  • positive (+) means that a protein or gene is expressed in a detectable amount by a method known in the art.
  • a reporter protein is expressed together with the protein, and the target protein is detected by detecting the reporter protein. can be detected.
  • Gene detection can be performed using, for example, nucleic acid amplification and/or nucleic acid detection methods such as RT-PCR, microarrays, biochips and RNAseq.
  • negative (-) means that the expression level of a protein or gene is below the lower limit of detection by all or any of the above known techniques.
  • the lower limit of detection for protein or gene expression may vary with each technique.
  • the term “marker” means a protein or its gene that is specifically expressed on the cell surface, in the cytoplasm, in the nucleus, etc. in a given cell type.
  • the markers are preferably "cell surface markers".
  • the term “cell surface marker” refers to a protein expressed on the cell surface that can be labeled (stained) with a fluorescent substance, and can facilitate detection, enrichment, isolation, etc. of cells expressing the cell surface marker.
  • Said cell surface marker is a gene that is specifically expressed (positive marker) or not expressed (negative marker) in a given cell type, specifically as mRNA by transcription of said gene in the genome or by translation of said mRNA.
  • a protein by refers to a substance that is produced (positive marker) or not produced (negative marker).
  • Such cell surface markers can be detected using immunological assays using antibodies specific to the cell surface markers, such as ELISA, immunostaining, and flow cytometry.
  • expression is defined as the transcription and/or translation of a specific nucleotide sequence driven by a promoter within a cell.
  • pluripotent stem cells refer to embryonic stem cells (ES cells) and similar pluripotent cells, that is, various tissues of the body (endoderm, mesoderm, ectoderm). refers to cells that have the potential to differentiate into all germ layers. Cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (also referred to herein as "iPS cells”).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • hematopoietic stem cells are multipotent stem cells that can differentiate into blood lineage cells. Hematopoietic stem cells are mainly present in the bone marrow in the human body, and are formed into leukocytes (neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes, monocytes, macrophages), erythrocytes, platelets, mast cells, dendritic cells, etc. Differentiate. As used herein, hematopoietic stem cells (HSC) can be CD34 positive and CD7 negative (CD34 + /CD7 ⁇ ). In the present specification, "/" used in expressions such as “CD34 + /CD7 - " means "and".
  • HEC hemogenic endothelial cells
  • T progenitor cells means hematopoietic cells that arise in the process of differentiating hematopoietic stem cells into CD3-positive T cells in the human body, and are positive for CD34 and CD7 (CD34 + /CD7 + cells). Also herein, proT can be negative for CD43, CD1a and/or CD116.
  • meoderm progenitor cell means, for example, T (synonymous with Brachyury), KDR, FOXF1, FLK1, BMP4, MOX1 and at least one marker gene selected from marker genes consisting of SDF1 is expressed. means cell.
  • Mesoderm progenitor cells are not distinguished from mesodermal cells, and cells with weak expression of the above-mentioned marker genes may be referred to as mesodermal progenitor cells.
  • CD4CD8 double-positive T cells means, among T cells, cells that are both positive for surface antigens CD4 and CD8 (CD8 + /CD4 + ).
  • CD4CD8 bipositive T cells can be identified as CD4, CD8, CD3 and CD45 positive cells (CD8 + /CD4 + /CD3 + /CD45 + cells).
  • CD4CD8 both negative T cells refers to T cells that are negative for both surface antigens CD4 and CD8 (CD8 ⁇ /CD4 ⁇ ).
  • CD4CD8 double negative T cells can be identified as CD4 and CD8 negative and CD3 and CD45 positive cells (CD8 ⁇ / CD4 ⁇ /CD3 + /CD45 + cells).
  • hematopoietic stem cells hematopoietic endothelial cells, T progenitor cells, mesodermal progenitor cells, CD4CD8 double-positive T cells, and CD4CD8 double-negative T cells are cells isolated from biological tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and blood. or cells derived from pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells.
  • CD4 + T cells means, among T cells, cells that are surface antigen CD4-positive and CD8-negative (CD4 + /CD8 ⁇ ).
  • CD4 + T cells can be identified as CD8 negative and CD4, CD3 and CD45 positive cells (CD4 + /CD8 ⁇ /CD3 + /CD45 + cells).
  • CD4 + T cells include, for example, helper T cells.
  • CD8 + T cells means, among T cells, cells that are surface antigen CD8-positive and CD4-negative (CD8 + /CD4 ⁇ ).
  • CD8 + T cells can be identified as cells that are CD4 negative and CD8, CD3 and CD45 positive (CD4 ⁇ /CD8 + /CD3 + /CD45 + cells).
  • CD8 + T cells include, for example, cytotoxic T cells.
  • ⁇ T cell means a cell that expresses CD3 and TCR (T cell receptor) TCR composed of ⁇ chain ( ⁇ TCR) and TCR ⁇ chain ( ⁇ TCR).
  • ⁇ T cell means a cell that expresses CD3 and a TCR composed of a TCR ⁇ chain ( ⁇ TCR) and a TCR ⁇ chain ( ⁇ TCR).
  • regulatory T cells refers to the ability to inhibit the activation of effector T cells when stimulated via T cell receptors, suppressing immune responses (immune tolerance).
  • T cells that are in charge of Regulatory T cells are usually CD25 + /FOXP3 + cells, among which are CD4 + or CD8 + cells.
  • regulatory T cells may be CD4 + cells (i.e. CD4 + /CD25 + /FOXP3 + ) or CD8 + cells (i.e. CD8 + /CD25 + /FOXP3 + ).
  • CD4 + cells are more preferred, and CD4 + /CD8 ⁇ /CD25 + /FOXP3 + cells are even more preferred.
  • the transcription factor FOXP3 is known as a master regulator of CD4 + /CD25 + regulatory T cells.
  • cell population means two or more cells of the same type or different types.
  • a “cell population” also means a mass of cells of the same or different types.
  • the various cells used in the present invention are preferably GMP standard cells.
  • Pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells ( EG cells), Muse cells, preferably iPS cells (more preferably human iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • Muse cells preferably iPS cells (more preferably human iPS cells).
  • the pluripotent stem cell is an ES cell or any cell derived from a human embryo
  • the cell may be a cell produced by destroying the embryo or a cell produced without destroying the embryo. It may be, preferably a cell produced without destroying the embryo.
  • mouse ES cells can be used from various mouse ES cell lines established by inGenious targeting laboratory, RIKEN (RIKEN), etc., and human ES cells from the University of Wisconsin, Various human ES cell lines established by NIH, RIKEN, Kyoto University, National Center for Child Health and Development, Cellartis, etc. are available.
  • human ES cell lines include CHB-1 to CHB-12 strains, RUES1 strain, RUES2 strain, HUES1 to HUES28 strains distributed by ESI Bio, H1 strains distributed by WiCell Research, H9 strains distributed by RIKEN, etc.
  • KhES-1 strain, KhES-2 strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, etc. that are distributed can be used.
  • “Induced pluripotent stem cells” refer to cells obtained by reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors).
  • induced pluripotent stem cells there are various types of "induced pluripotent stem cells", and Yamanaka et al. established iPS by introducing the four factors of Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc into mouse fibroblasts.
  • iPS cells derived from human cells established by introducing the same four factors into human fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S., et al.
  • Nanog-iPS cells were selected using Nanog expression as an index and established (Okita, K., Ichisaka, T.; , and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPS cells produced by a method that does not contain c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26 , 101-106), iPS cells established by introducing six factors by a virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.) can also be used.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing four factors of OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28 prepared by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells produced by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2008-307007) and the like can also be used.
  • iPS cell lines established by NIH, RIKEN, Kyoto University, etc. can be used as induced pluripotent stem cell lines.
  • Nucleic acid may be any molecule as long as it is a polymer of nucleotides and molecules having functions equivalent to the nucleotides. Polymers in which nucleotides and deoxyribonucleotides are mixed, and nucleotide polymers containing nucleotide analogues can be mentioned, and nucleotide polymers containing nucleic acid derivatives can also be used.
  • a nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • a double-stranded nucleic acid also includes a double-stranded nucleic acid in which one strand hybridizes to the other strand under stringent conditions.
  • nucleotide analogue compared with RNA or DNA, for improving or stabilizing nuclease resistance, for increasing affinity with a complementary strand nucleic acid, for increasing cell permeability, or for visualization, ribonucleotides
  • Any molecule can be used as long as it is a molecule obtained by modifying nucleotides, deoxyribonucleotides, RNA or DNA.
  • Nucleotide analogues may be naturally occurring molecules or non-naturally occurring molecules, such as sugar moiety-modified nucleotide analogues (e.g., nucleotide analogues substituted with 2′-O-methyl ribose, 2′-O- Nucleotide analogues substituted with propyl ribose, nucleotide analogues substituted with 2′-methoxyethoxyribose, nucleotide analogues substituted with 2′-O-methoxyethylribose, 2′-O-[2-(guanidinium ) ethyl] ribose-substituted nucleotide analogues, 2′-fluororibose-substituted nucleotide analogues, bridged nucleic acid (BNA), locked nucleic acid (LNA), ethylene Bridged structure type artificial nucleic acid (ENA: ethylene bridge
  • nucleic acid derivative a different chemical is added to the nucleic acid in order to improve the nuclease resistance compared to the nucleic acid, to stabilize the nucleic acid, to increase the affinity with the complementary strand nucleic acid, to increase the cell permeability, or to make the nucleic acid visible.
  • Any molecule may be used as long as it is a molecule to which a substance is added, and specific examples thereof include 5′-polyamine addition derivatives, cholesterol addition derivatives, steroid addition derivatives, bile acid addition derivatives, vitamin addition derivatives, Cy5 addition derivatives, and Cy3 addition derivatives. , 6-FAM-added derivatives, biotin-added derivatives, and the like.
  • Step (1) is a step of culturing a three-dimensional cell aggregate containing cells capable of differentiating into T cells and stromal cells expressing Notch ligands derived from pluripotent stem cells.
  • step (1) By using a production method that includes step (1), it is possible to induce differentiation into T cells with high efficiency.
  • the culturing of the three-dimensional cell aggregates in step (1) is carried out using cells capable of differentiating into T cells and stromal cells expressing Notch ligands derived from pluripotent stem cells. /075389 etc. can be referred to and implemented.
  • Cells capable of differentiating into T cells used in step (1) are not particularly limited as long as they are cells capable of differentiating into T cells. Both positive T cells and the like are included, preferably CD34 + cells or mesodermal progenitor cells, more preferably hematopoietic endothelial cells, hematopoietic stem cells, T progenitor cells, or mesodermal progenitor cells, particularly preferably hematopoietic endothelial cells.
  • the CD34 + cells are CD34-expressing (CD34 + ) cells, in particular CD34-expressing but not CD7-expressing (CD34 + /CD7 ⁇ ) cells.
  • CD34 + cells include, for example, hematopoietic endothelial cells and hematopoietic stem cells.
  • Cells capable of differentiating into T cells used in step (1) are more preferably cells induced to differentiate from pluripotent stem cells (especially iPS cells (especially human iPS cells)).
  • the cells capable of differentiating into T cells used in step (1) are cells obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells (especially iPS cells (especially human iPS cells)) into CD34 + cells (especially hematopoietic endothelial cells). should be used.
  • step (1) can be performed on CD34 + cells containing hematopoietic endothelial cells (i.e., hematopoietic Step (1) can also be performed on hematopoietic endothelial cells separated according to known methods (e.g., flow cytometry, magnetic cell separation).
  • stromal cells cells that express Notch ligands and are derived from pluripotent stem cells are used.
  • Stromal cells are a general term for connective tissue cells that support parenchymal cells, and typical examples include fibroblasts, blood cells, endothelial cells, smooth muscle cells, epithelial cells, and tissue stem cells. Stromal cells can be used singly or in combination of two or more.
  • a nucleic acid for expressing a Notch ligand is introduced into the stromal cells.
  • Stromal cells expressing Notch ligands can be produced by introducing the above nucleic acid into stromal cells. It can also be produced by introducing the above nucleic acid into pluripotent stem cells (especially iPS cells (especially human iPS cells)) and then differentiating the pluripotent stem cells into stromal cells.
  • the stromal cells used in the production method of the present invention are stromal cells that have been induced to differentiate from pluripotent stem cells (especially iPS cells (especially human iPS cells)). In particular, it is desirable to use cells obtained by inducing differentiation of human iPS cells)) into fibroblasts. Differentiation induction of pluripotent stem cells into stromal cells can be performed according to known methods, and when the pluripotent stem cells are human iPS cells, for example, PLoS ONE 8(10): e77673, 2013 Differentiation of iPS cells into fibroblasts can be induced by the method described above.
  • stromal cells derived from pluripotent stem cells it is possible to provide a method for producing T cells with higher production safety than when primary cells or cell lines are used. .
  • pluripotent stem cell-derived stromal cells T cells can be stably produced with little difference between lots of feeder cells used.
  • Notch ligands are not particularly limited, and include standard Notch ligands and non-standard Notch ligands described in WO 2017/075389.
  • Canonical Notch ligands include, for example, DLL4 (delta-like ligand 4), DLL1 (delta-like ligand 1), JAG1 (Jagged1), JAG2 (Jagged2), and the like. These can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • Non-canonical Notch ligands include, for example, contactin-1, NOV/CCN3, contactin-6, periostin/OSF-2, DLK2/EGFL9, Pref-1/DLK1/FA1, DNER, thrombospondin-2, MAGP- 1/MFAP2, thrombospondin-3, MAGP-2/MFAP5, thrombospondin-4 and netrin-1.
  • Human DLL4 is preferably used as the Notch ligand.
  • the means for introducing the nucleic acid for expressing the Notch ligand into stromal cells or pluripotent stem cells is not particularly limited, and various known or general means can be adopted.
  • the nucleic acid for expressing the Notch ligand is introduced into stromal cells using an expression vector and expressed.
  • Expression vectors may be linear or circular, and may be non-viral vectors such as plasmids, viral vectors, or transposon-based vectors.
  • the method for introducing the expression vector into the stromal cell can be appropriate according to the embodiment.
  • an expression vector can be introduced into stromal cells by known methods such as virus infection, calcium phosphate, lipofection, microinjection, and electroporation.
  • the expression vector can be prepared into a form suitable for use in each technique by known means and using a commercially available kit (according to the instructions).
  • the expression vector can be introduced into stromal cells by a virus infection method.
  • Viral vectors include, for example, retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, and adeno-associated viral vectors.
  • a vector containing a nucleic acid for expressing the Notch ligand and a packaging vector (plasmid) of each virus are transfected into host cells using a corresponding commercially available kit for recombination. After virus production, the resulting recombinant virus may be used to infect stromal cells.
  • the expression vector may contain sequences such as a nuclear localization signal (NLS) and a multiple cloning site (MCS), if necessary.
  • the expression vector further includes reporter genes (e.g., genes encoding fluorescent proteins of each color), drug selection genes (e.g., kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene), suicide genes (e.g., diphtheria A toxin, simple Herpes thymidine kinase (HSV-TK), carboxypeptidase G2 (CPG2), carboxylesterase (CA), cytosine deaminase (CD), cytochrome P450 (cyt-450), deoxycytidine kinase (dCK), nitroreductase (NR), purine Genes encoding nucleoside phosphorylase (PNP), thymidine phosphorylase (TP), varicella-zoster virus thy
  • reporter genes e.g., genes encoding fluorescent
  • the cells and stromal cells that can be differentiated into T cells may be human-derived or non-human mammalian (non-human mammalian)-derived cells, preferably human. From the viewpoint of xeno-free, it is desirable to use human-derived cells.
  • Non-human mammals include, for example, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, pigs, cows, horses, sheep, and monkeys.
  • a three-dimensional cell aggregate can be formed, for example, by centrifuging cells capable of differentiating into T cells or cells induced to differentiate from them and stromal cells expressing Notch ligands.
  • the ratio of stromal cells to cells capable of differentiating into T cells is 100:1 to 1:100, 20:1 to 1:20, 10:1 to 1:10, preferably 4:1 to 1. :4, more preferably 1:1.
  • the medium for culturing three-dimensional cell aggregates is not particularly limited, and examples thereof include serum-free medium, particularly serum-free medium containing insulin (further biotin, transferrin, and albumin).
  • Base media for culturing three-dimensional cell aggregates include, for example, AIMV, X-VIVO-15, NeuroBasal, EGM2, TeSR, BME, BGJb, CMRL1066, Glasgow MEM, improved MEM zinc option, IMDM, 199 medium, Eagle's MEM, ⁇ MEM, DMEM, Ham, RPMI-1640, Fisher's medium and the like. Any one of these media may be used alone, or two or more may be used in combination. In addition, medium components described in International Publication No. 2017/075389 and the like may be appropriately added.
  • the culture conditions for culturing the three-dimensional cell aggregates are, for example, a culture temperature of about 20 to 40° C., a CO 2 concentration of about 2 to 10%, and an oxygen concentration of about 1 to 20%.
  • the period can be, for example, about 1 to 12 weeks, preferably 3 to 10 weeks, more preferably 6 to 9 weeks.
  • the cell density at the start of culture can be, for example, about 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 10 cells/mL.
  • the medium, culture conditions, etc. used in the production method of the present invention can be those suitable for the type of cells to be cultured.
  • the basal medium used for such a medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing animal cells, and examples thereof include those mentioned above.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium also contains serum replacements (e.g., albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR), fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, ITS-supplements, etc.) You may have One or two or more serum substitutes can be used.
  • serum replacements e.g., albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR), fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, ITS-supplements, etc.
  • the medium also contains one or more substances such as lipids, amino acids (such as non-essential amino acids), L-glutamine, vitamins, growth factors, cytokines, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, and inorganic salts. can contain.
  • substances such as lipids, amino acids (such as non-essential amino acids), L-glutamine, vitamins, growth factors, cytokines, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, and inorganic salts. can contain.
  • the medium it is desirable to use a chemically-defined medium that does not contain serum or other substances whose components are not clear, because it reduces differences between medium lots and allows the preparation of cells with stable quality. .
  • the pH of the medium is usually 7.0-7.8, preferably 7.2-7.6.
  • the medium is preferably sterilized by a method such as filtration, ultraviolet irradiation, heat sterilization, or irradiation before use. Culturing is performed in the presence or absence of feeder cells. Culture conditions are not particularly limited, and conditions commonly used for cell culture can be used. In culture, passages may be performed as many times as necessary to obtain a desired amount of cells, and medium may be added and replaced.
  • the culture vessel is not particularly limited, and can be appropriately selected from plates, dishes, petri dishes, flasks, bags, bottles, tanks (culture tanks), bioreactors, and the like.
  • the production method of the present invention may further include a step of isolating T cells in order to enrich the obtained T cells. Separation of T cells can be performed by known methods such as a method using flow cytometry and a magnetic cell separation method.
  • the T cells obtained by the production method of the present invention are CD3 + cells, for example, helper T cells that are CD4 + T cells, cytotoxic T cells that are CD8 + T cells, regulatory T cells, Tfh cells (CXCR5 + cells), ⁇ T cells, NKT cells (CD56 + cells), naive T cells (CD45RA + CCR7 + cells), central memory T cells (CD45RA - CCR7 + cells), effector memory T cells (CD45RA - CCR7 - cells), terminal effector T cells (CD45RA + CCR7 ⁇ cells), and the like.
  • CD4 + T cells, CD8 + T cells, ⁇ T cells and regulatory T cells are desirable.
  • T cells may be either of one type alone or a mixture of two or more types.
  • a cell population derived from pluripotent stem cells is produced by the production method of the present invention, and ⁇ T cells contained in the cell population
  • a cell population can be produced that contains a high percentage of CD4 + T cells relative to CD8 + T cells in a cell.
  • the production method of the present invention provides ⁇ T cells with a high content ratio of CD4 + T cells to CD8 + T cells without the step of separating T cells in the process of producing T cells from cells capable of differentiating into T cells. It is characterized by being able to manufacture groups. When the step of isolating T cells is not included, the cell population can be produced more efficiently than when the step is included.
  • the ratio (number of cells) of CD4 + T cells to CD8 + T cells in the ⁇ T cells contained in the cell population containing CD4 + T cells and CD8 + T cells is, for example, 0.1 or more, 0.2 or more, 0.2 or more, 3 or more, 0.4 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, 0.7 or more, 0.8 or more, 0.9 or more, 1.0 or more, 1.1 or more, 1.2 or more, 1. 3 or more, 1.4 or more, 1.5 or more, 1.6 or more, 1.7 or more, 1.8 or more, 1.9 or more, 2.0 or more, 2.1 or more, 2.2 or more, 2.
  • the T cells obtained by the production method of the present invention may be T cells into which a foreign gene has been introduced.
  • a “foreign gene” is a gene that is introduced from the outside in order to express a desired protein in T cells, and can be appropriately selected according to the use of T cells.
  • the exogenous gene can be, for example, a gene for expressing CAR, and a gene for expressing cytokine and/or chemokine (for example, a fusion protein in which IL-15 and IL-15R ⁇ are linked). (IL-15R ⁇ /IL-15)) can also be included.
  • CARs expressed by T cells are basically similar to common or known CARs: (i) an antigen recognition site (e.g., single-chain antibody) that recognizes a cell surface antigen of cancer cells, (ii) a cell membrane Peptides at each site of the penetrating region and (iii) the signaling region that induces activation of T cells are constructed by linking via spacers as necessary.
  • the TCR can be either a dimer of the ⁇ chain, ⁇ chain or the ⁇ chain, ⁇ chain.
  • an exogenous TCR means exogenous to the T cell into which the nucleic acid encoding the exogenous TCR is introduced, and the amino acid sequence of the exogenous TCR is identical to the endogenous TCR of the T cell. may be different.
  • the exogenous gene to be introduced is a nucleic acid encoding an exogenous T-cell receptor
  • an example of the nucleic acid is a nucleic acid encoding Vg9Vd2TCR.
  • Means for introducing foreign genes into cells include the methods described above.
  • the cells into which the exogenous gene is introduced are not particularly limited, and may be at any stage of differentiation. Examples include pluripotent stem cells (especially iPS cells), cells capable of differentiating into T cells, and T cells mentioned.
  • T cells obtained by the production method of the present invention include (a) Foxp3 gene CNS1 (conserved non-coding sequence 1), CNS2 (conserved (b) a promoter; and (c) a nucleic acid encoding FOXP3 (herein simply “expression construct” or “CNS -Foxp3”).
  • the expression construct is not particularly limited as long as it can express FOXP3, and in addition to the above (a), (b), and (c), it includes a terminator, a polyadenylation signal, Foxp3 3'UTR, and the like. It is more preferable that they function in the cells into which they have been introduced.
  • the base sequence of the human Foxp3 gene is RefSeq Accession No. It is registered as NM_001114377 (SEQ ID NO: 1) and NM_014009 (SEQ ID NO: 2), and the amino acid sequence is also RefSeq Accession No. It is registered as NP_001107849 (SEQ ID NO: 3) and NP_054728 (SEQ ID NO: 4).
  • the RefSeq ID here is the one registered on the NCBI website.
  • the above-mentioned genes include degenerate products and mutants thereof, even if they have nucleotide sequences registered in databases as described above. It is desirable to encode a protein that has biological activity equivalent to that of the other protein.
  • FOXP3 means a protein
  • Foxp3 means a gene, but when it is appropriate to interpret FOXP3 and Foxp3 as a gene and a protein, respectively, they mean a gene and a protein.
  • the nucleic acid encoding FOXP3 is not particularly limited as long as it is a nucleic acid encoding the FOXP3 protein, preferably FOXP3 cDNA.
  • the CNS1, CNS2 and CNS3 used in the present invention are all derived from the Foxp3 gene.
  • CNS1, CNS2 and CNS3 are Foxp3 enhancer elements.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited. sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, etc., preferably the Foxp3 gene promoter.
  • Preferred nucleotide sequences of CNS1, CNS2, CNS3 and promoter of human Foxp3 gene include the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS:5 to 8, respectively.
  • the promoters, CNS1, CNS2 and CNS3 include mutants other than those having the nucleotide sequences as described above, and the mutants are equivalent to the promoters, CNS1, CNS2 and CNS3 comprising the above nucleotide sequences. is desirable to have the biological activity of As mutants, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more relative to the natural base sequence % or more, 98% or more, or 99% or more of the nucleotide sequence identity.
  • the arrangement (order) of the nucleic acids encoding the promoter, CNS1, CNS2, CNS3 and FOXP3 in the expression construct is not particularly limited, and CNS1, CNS2 and CNS3 are preferably located upstream of the promoter, and More preferably, it is a nucleic acid encoding CNS1-CNS2-CNS3-promoter-FOXP3 in that order.
  • pluripotent stem cells especially iPS cells
  • CD34 + cells especially hematopoietic endothelial cells
  • CD34 + cells especially hematopoietic endothelial cells
  • T cells produced by the production method of the present invention are useful for prevention and/or treatment of T cell-related diseases.
  • the T cells produced by the production method of the present invention are CD4 + T cells, CD8 + T cells or ⁇ T cells, for example, these cells can be used to treat tumors (blood tumors, solid tumors), infectious diseases, blood diseases, etc. and prophylactically useful, but not limited to.
  • the T cells produced by the production method of the present invention are regulatory T cells, these cells are useful for the treatment and prevention of animals (especially humans) with an abnormally enhanced immune response.
  • T cells produced by the production method of the present invention may be used for autologous transplantation or allografting. In addition, it may be used in combination with other drugs.
  • the subject from whom the cells for use in producing T cells are isolated must have the same HLA type as the subject to whom the T cells are administered.
  • the subject is the same subject to which the T cells are administered.
  • a drug containing T cells (hereinafter sometimes referred to as the drug of the present invention) can be produced.
  • the medicament of the present invention can be produced as a parenteral preparation by mixing an effective amount of T cells with a pharmaceutically acceptable carrier according to known means (e.g., methods described in the Japanese Pharmacopoeia). is preferred.
  • the medicament of the present invention is preferably produced as parenteral preparations such as injections, suspensions, drip infusions and the like.
  • Parenteral administration methods include intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal and subcutaneous administration.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include solvents, bases, diluents, excipients, soothing agents, buffers, preservatives, stabilizers, suspending agents, tonicity agents, surfactants, Dissolution aids and the like are included.
  • the dosage of the medicament of the present invention can be appropriately determined according to various conditions such as patient weight, age, sex, and symptoms. , usually 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 , preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 , more preferably 5 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 8 administered to Moreover, it may be administered once or multiple times.
  • the medicament of the invention can be in known forms suitable for parenteral administration, eg injections or infusions.
  • the medicament of the present invention may contain physiological saline, phosphate-buffered saline (PBS), medium, etc. in order to maintain cells stably.
  • the medium includes, but is not limited to, RPMI, AIM-V, X-VIVO10 and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers eg, human serum albumin
  • preservatives and the like may be added to the drug for the purpose of stabilization.
  • the pharmaceutical of the present invention is applied to mammals including humans.
  • iPS cell-derived Fibroblast/DLL4 cells iPS cells (Ff-I01s04 strain: healthy human peripheral (derived from blood mononuclear cells) were induced to differentiate into fibroblasts. Subsequently, using lentivirus, cells forcibly expressing DLL4, a Notch ligand, under the EF1alpha promoter were prepared.
  • the Ff-I01s04 strain was added to AK03N (Ajinomoto Co., Inc.) at 1 ⁇ 10 6 cells/well in a 6-well plate (Corning) treated with ultra-low adhesion and Y-27632 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • CHIR990211 (Tocris) was added (Day 0), and the next day the cells were added to Fibroblast medium (alpha-MEM (Invitrogen) with 20% FBS (Corning), 10 ⁇ g/ml human insulin, 5.5 ⁇ g/ml human transferrin, 5 ng/ml sodium selenite (ITS, Gibco), 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin (PSG, Sigma-Aldrich), and 50 ⁇ g/ml ascorbic acid 2-phosphate (Sigma -Added Aldrich) and seeded on a 10 cm dish (Corning) coated with 0.1% gelatin (Nacalai Tesque, Inc.) (Day 1). The medium was exchanged twice a week, and culture was continued for 7 days to obtain a cell population containing fibroblasts (Day 8).
  • Fibroblast medium alpha-MEM (Invitrogen) with 20% FBS (Corning), 10 ⁇
  • iPS cell-derived fibroblasts were seeded on a gelatin-coated 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells/well, and the next day, a lentivirus solution incorporating the human DLL4 gene downstream of the EF1alpha promoter and a final concentration of 10 ⁇ g were added.
  • iPS cell-derived Fibroblast/DLL4 cells (iFibro/DLL4) were prepared by adding protamine to 1/mL.
  • the prepared cells were stained with anti-DLL4 antibody-APC (BioLegend) or anti-CD90 antibody-APC (BioLegend), which is a fibroblast marker, and analyzed by flow cytometry. As a result, expression of DLL4 and fibroblast markers was observed as shown in FIG.
  • Vg9Vd2TCR-introduced iPS cells QHJI01s04/G9D2 cells
  • iPS cells QHJI01s04 strain: derived from peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects
  • iPS cells were seeded in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells/well, and the next day, a lentivirus solution incorporating the Vg9Vd2TCR gene downstream of the human ubiquitin promoter was added to a final concentration of 10 ⁇ g/mL. was added with protamine to generate QHJI01s04/G9D2 cells.
  • iPS cells Ff-I01s04 strain: derived from peripheral blood mononuclear cells of a healthy subject
  • Floating cell populations differentiated according to the method eg, the method described in Cell Reports 2 (2012) 1722-1735 and International Publication No. 2017/221975) were used.
  • the Ff-I01s04 strain was seeded at 1 ⁇ 10 6 cells/well on a 6-well plate (Corning) treated with ultra-low adhesion (Day 0), and 10 ⁇ g/ml human insulin was added to EB medium (StemPro34 (Gibco)).
  • the cells were cultured for another 4 days (Day 8) in a medium supplemented with 50 ng/ml bFGF, 50 ng/ml VEGF and 50 ng/ml SCF (R&D systems) to obtain a cell population containing HEC.
  • the suspension cell population containing HEC was stained using the antibody set in Table 1 below.
  • HEC human immunodeficiency virus
  • T cell differentiation induction The cell population containing iFibro/DLL4 obtained in 1) above and HEC obtained in 3) above is differentiated into T cells by referring to the method described in International Publication No. 2017/075389. let me
  • iFibro/DLL4 or cells in which DLL4 is forcibly expressed in mouse stromal cell line MS5 as a support
  • iPS cell-derived HEC prepared in 3 above and 1:1 or 4:1 were co-cultured at a cell ratio of .
  • the medium contains 2 x B27 supplement (Invitrogen), 1 x PSG (Sigma-Aldrich), 1 x Glutamax (Invitrogen), 5 ng/mL IL-7 (PeproTech), 5 ng/mL Flt3L (PeproTech), 50 ⁇ g/mL ascorbic acid (Sigma-Aldrich) at final concentrations.
  • iPS cell-derived CD19CAR T cells were obtained. Intracellular staining was performed using the set of antibodies shown in Table 2 below, and expression of T cell surface molecules and anti-CD19CAR and IL-15R ⁇ was confirmed by flow cytometry as shown in FIG.
  • mice (Charles River Japan, Inc.) were each Nalm6 (human B-cell leukemia cell-derived cell line) transfected with 5 ⁇ 10 5 cells/200 ⁇ L of luciferase.
  • the CD19CAR T cells prepared in 4) above were intravenously administered in the group composition shown in Table 3.
  • the number of cancer cells was significantly reduced in all CD19CART cell administration groups compared to the control group, indicating that it has strong efficacy. Furthermore, in a comparison between CD19CAR T cells, cells prepared using iFibro/DLL4 as a support showed stronger efficacy than cells prepared using MS5/DLL4 as a support. In addition, as shown in FIG. 4, the number of remaining CD19CAR T cells in vivo in mice tended to be positively correlated with drug efficacy.
  • the induction of differentiation from iPS cells to Treg is as follows.
  • a DNA sequence in which the mStrawberry protein sequence in the sequence (MK012431) registered in GenBank was changed to the dTomato sequence was incorporated into a transfer plasmid for producing a third generation lentiviral vector to design and synthesize a plasmid sequence.
  • This plasmid was transfected into HEK293 cells along with the packaging plasmid and envelope plasmid for lentiviral vector production, and after collecting the supernatant containing the produced lentiviral vector, it was concentrated by high-speed centrifugation and introduced into iPS cells.
  • lentiviral vector that Next, the Ff-I01s04 strain was seeded in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells/well, protamine was added at a final concentration of 10 ⁇ g/mL, and then a lentivirus solution incorporating CNS-Foxp3 was directly added, Virus-infected iPS cells were produced.
  • the virus-infected Ff-I01s04 strain was seeded at 1 ⁇ 10 6 cells/well in a 6-well plate (Corning) treated with ultra-low adhesion, and 10 ⁇ g/ml human insulin, 5.5 ⁇ g in EB medium (StemPro34 (Gibco)).
  • the cells were cultured for another 4 days in a medium supplemented with 50 ng/ml bFGF, 50 ng/ml VEGF and 50 ng/ml SCF (R&D systems) to obtain a cell population containing HEC. Furthermore, the iFibro/DLL4 obtained in 1) above was used as a support and co-cultured with CNS-Foxp3-introduced human iPS cell-derived HEC at a cell ratio of 1:1.
  • the medium contains final concentrations of 2xB27 supplement (Invitrogen), 1xPSG (Sigma-Aldrich), 1xGlutamax (Invitrogen), 5ng/mL IL-7 (PeproTech), 5ng/mL Flt3L (PeproTech), 50 ⁇ g/mL ascorbic acid (Sigma- Aldrich) containing RPMI-1640 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was co-cultured on 30 mm Millicell (hydrophilic PTFE, pore size 0.4 ⁇ m, height 5 mm, Merck Millipore) in 6 wells. It was placed in a plate (TPP) and cultured for 9 weeks while changing the medium every 3 to 4 days.
  • 2xB27 supplement Invitrogen
  • 1xPSG Sigma-Aldrich
  • 1xGlutamax Invitrogen
  • 5ng/mL IL-7 PeproTech
  • 5ng/mL Flt3L PeproTech
  • the cell population containing CNS-Foxp3-introduced human iPS cell-derived Tregs obtained above was seeded at 2.5 ⁇ 10 5 cells/well on a 48-well cell culture plate bound to an anti-CD3 antibody (eBioscience), and CO 2 incubator under conditions of 37° C. and 5.0% CO 2 for 3 days, the cells were reseeded onto a 24-well G-Rex cell culture plate and culture continued.
  • the medium contains FBS (15%, Corning) at final concentrations, L-glutamine-penicillin-streptomycin solution (1/100, Invitrogen, Sigma-Aldrich), insulin-transferrin-selenium supplement (1/100, Invitrogen), ascorbic acid.
  • IL-3 60 ng/mL, Biolegend
  • IL-4 30 ng/mL, Biolegend
  • IL-33 30 ng/mL, Biolegend
  • TGF- ⁇ 1 5 ng/mL, Biolegend
  • Each cell population was stained using the following antibody sets (Panel 1: Zombie NIR, BV510 CD3, BV421 CD4, PE/Cy7 CD8b, APC CD25, PE GZMB, AF488 FOXP3, PerCP/Cy5.5 CTLA4, Panel 2: Zombie NIR, BV510 CD3, BV421 CD4, PE/Cy7 CD8b, AF488 FOXP3, PE Helios).

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Abstract

開示されているのは、Ｔ細胞の製造方法であって、（１）Ｔ細胞に分化可能な細胞と、多能性幹細胞由来のＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞とを含む３次元細胞凝集体を培養する工程を含む方法、該方法により得られたＴ細胞、及び該Ｔ細胞を含有してなる医薬である。

Description

Ｔ細胞の製造方法
　本発明は、Ｔ細胞の製造方法、該方法により得られたＴ細胞、当該Ｔ細胞を含有してなる医薬等に関する。
(発明の背景)
　近年、Ｔ細胞を用いた様々な細胞治療の研究開発が世界で積極的に進められている（例：ＣＡＲＴ細胞療法、Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）細胞療法等）。ｉＰＳ細胞からＴ細胞へ分化誘導する場合、従来の２Ｄ培養法ではＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞が主として誘導され、その他のＴ細胞（例、ＣＤ４ＳＰ　Ｔ細胞）は誘導されにくいということが知られている。
　一方で、特許文献１及び非特許文献１では、ＡＴＯ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｔｈｙｍｉｃ　Ｏｒｇａｎｏｉｄ（人工胸腺オルガノイド））法と呼ばれる、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択集団と幹細胞又は前駆細胞の選択集団とを含む三次元細胞凝集体を培養することによる、幹細胞又は前駆細胞からＴ細胞の組成物を調製する方法が開示されている。
　また、特許文献２では、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇへの分化を促進する分化系列決定因子をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作された哺乳動物細胞が開示されている。
国際公開第２０１７／０７５３８９号 国際公開第２０２１／０９２５８１号
Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４，５２１－５３０（２０１７）
　本発明は、製造上の安全性が高いＴ細胞の製造方法を提供することを目的とする。
　上記のように、ｉＰＳ細胞等から多様なＴ細胞（ＣＤ４ＳＰ細胞、ＣＤ８ＳＰ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞等）へ分化誘導する方法としてＡＴＯ法が知られている。ＡＴＯ法ではマウスの間質細胞がフィーダー細胞として用いられることが多いが、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）の観点から製造上のハードルを考えると、ゼノフリーとすることが好ましかった。
　しかしながら、ゼノフリーとした方法はこれまで報告されておらず、例えば、ヒトの初代線維芽細胞をフィーダー細胞として用いる場合は、増殖能に限りがあること、及び／又は個人差若しくはロット間差が大きいことがデメリットとなる。これに対して、ヒトの線維芽細胞株をフィーダー細胞として用いる場合は、ヒトの初代線維芽細胞のようなデメリットは無いが、がん細胞であるので臨床応用でのリスクが上がる可能性があることがデメリットとなる。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトｉＰＳ細胞由来の間質細胞（特に線維芽細胞）を製造し、これをＡＴＯ法におけるフィーダー細胞として使用することで、製造上の安全性が高いＴ細胞の製造方法を提供できるという知見を得た。
　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のＴ細胞の製造方法、Ｔ細胞、医薬等を提供するものである。
［１］Ｔ細胞の製造方法であって、
（１）Ｔ細胞に分化可能な細胞と、多能性幹細胞由来のＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞とを含む３次元細胞凝集体を培養する工程を含む方法。
［２］前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、ＣＤ３４＋細胞又は中胚葉前駆細胞である、［１］に記載の方法。
［３］前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、造血幹細胞、造血性内皮細胞、Ｔ前駆細胞、又は中胚葉前駆細胞である、［１］に記載の方法。
［４］前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、造血性内皮細胞である、［１］に記載の方法。
［５］前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、多能性幹細胞由来の細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、ｉＰＳ細胞由来の細胞である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［６ａ］前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、ヒトｉＰＳ細胞由来の細胞である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［７］前記間質細胞が、線維芽細胞である、［１］～［６ａ］のいずれかに記載の方法。
［８］前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［８ａ］前記多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［９］前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、ＪＡＧ１及びＪＡＧ２からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］～［８ａ］のいずれかに記載の方法。
［１０］工程（１）の前に、
（２）多能性幹細胞を間質細胞に分化誘導する工程を更に含む、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］工程（１）の前に、
（３）ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化可能な細胞に分化誘導する工程を更に含む、［６］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］工程（１）の前に、
（４）Ｔ細胞に分化可能な細胞に外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を導入する工程を更に含む、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］工程（３）の前に、
（５）ｉＰＳ細胞に外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を導入する工程を更に含む、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１種を含むＴ細胞の製造方法である、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１４ａ］ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びγδＴ細胞からなる群から選択される少なくとも１種を含むＴ細胞の製造方法である、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１４ｂ］多能性幹細胞由来の細胞集団であって、前記細胞集団に含まれるαβＴ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の比が０．６以上である、細胞集団。
［１５］［１］～［１４ａ］のいずれかに記載の方法により得られた、Ｔ細胞。
［１６］［１５］に記載のＴ細胞を含有してなる、医薬。
［１７］外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の製造方法であって、
（６）［１］～［１４ａ］のいずれかに記載の方法により得られたＴ細胞に外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を導入する工程を含む方法。
［１８］Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療剤である、［１６］に記載の医薬。
［１９］Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、［１８］に記載の医薬。
［１９ａ］Ｔ細胞関連疾患が、免疫反応の異常な亢進である、［１８］に記載の医薬。
［２０］［１５］に記載のＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療方法。
［２１］Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、［２０］に記載の方法。
［２１ａ］Ｔ細胞関連疾患が、免疫反応の異常な亢進である、［２０］に記載の方法。
［２２］Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療において使用するための、［１５］に記載のＴ細胞。
［２３］Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、［２２］に記載のＴ細胞。
［２３ａ］Ｔ細胞関連疾患が、免疫反応の異常な亢進である、［２２］に記載のＴ細胞。
［２４］Ｔ細胞関連疾患を予防及び／又は治療するための医薬の製造における、［１５］に記載のＴ細胞の使用。
［２５］Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、［２４］に記載の使用。
［２５ａ］Ｔ細胞関連疾患が、免疫反応の異常な亢進である、［２４］に記載の使用。
　本発明により、製造上の安全性が高いＴ細胞の製造方法が提供される。また、本発明の製造方法では、多能性幹細胞由来の間質細胞をフィーダー細胞として使用するため、使用するフィーダー細胞のロット間の差が小さく、安定してＴ細胞を製造することができる。本発明の一態様によれば、抗がん作用に優れたＴ細胞を製造することができる。また、本発明の一態様によれば、細胞動態に優れたＴ細胞を製造することができる。
ヒトＤＬＬ４遺伝子を導入したｉＰＳ細胞由来線維芽細胞及びＭＳ５の線維芽細胞マーカーＣＤ９０とＤＬＬ４発現のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 ｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化誘導後のＣＤ３／ＴＣＲαβ、ＣＤ４／ＣＤ８α、ＣＤ８α／ＣＤ８β、ＣＡＲ／ＩＬ１５Ｒαのフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。上からＦｆＩ０１ｓ０４＋ＭＳ５／ＤＬＬ４、ＦｆＩ０１ｓ０４＋ｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４、ＱＨＪＩ０１ｓ０４／Ｇ９Ｄ２＋ＭＳ５／ＤＬＬ４、ＱＨＪＩ０１ｓ０４／Ｇ９Ｄ２＋ｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４の結果を示す。 ｉＰＳ細胞由来ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効を示す写真である。上から、投与後１、２、３、４、５週間後を示す。 ｉＰＳ細胞由来ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏでの細胞動態を示すグラフである。細胞を投与後１、２、３、４、５週間後の細胞数が示され、グラフの値は平均±ＳＤである。 ｉＰＳ細胞由来Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔを用いてｉＰＳ細胞から分化誘導したＴｒｅｇを用いて、そのＴｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した結果を示す図である。図におけるドットプロットはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－集団を示す。また、グラフの数値は各細胞集団におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８－／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）の割合を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
　本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、又は／及び増殖させることを指す。「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、又は／及び増殖させることを意味する。
　本明細書において、「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ（＋））」とは、タンパク質又は遺伝子が当該分野で公知の手法による検出可能量で発現していることを意味する。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子又はそのサブユニットなど）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ及びＲＮＡｓｅｑ等の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法を利用して行うことができる。
　本明細書において、「陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ（－））」とは、タンパク質又は遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であることを意味する。タンパク質又は遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なりえる。
　本明細書において、「マーカー」とは、所定の細胞型において細胞表面、細胞質内、核内等に特異的に発現されるタンパク質又はその遺伝子を意味する。マーカーは、好ましくは「細胞表面マーカー」である。「細胞表面マーカー」とは、蛍光物質により標識（染色）可能であり、細胞表面マーカーを発現している細胞の検出、濃縮、単離等を容易に行える、細胞表面に発現するタンパク質を指す。当該細胞表面マーカーとは、所定の細胞型において特異的に発現する（陽性マーカー）又は発現しない（陰性マーカー）遺伝子、具体的にはゲノム中の当該遺伝子の転写によるｍＲＮＡとして、又はそのｍＲＮＡの翻訳によるタンパク質として、生成する（陽性マーカー）又は生成しない（陰性マーカー）物質を指す。
　このような細胞表面マーカーの検出は、当該細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。
　本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
　本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。
　本明細書において、「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、血球系細胞に分化し得る多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）である。造血幹細胞は、ヒト生体内では、主として骨髄に存在し、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ）、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等に分化する。本明細書において、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＣＤ３４が陽性であり、ＣＤ７が陰性であり得る（ＣＤ３４＋／ＣＤ７－）。なお、本明細書中、「ＣＤ３４＋／ＣＤ７－」などの表記において用いられる「／」とは「及び」を意味する。
　本明細書において、「造血性内皮細胞（ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ：ＨＥＣ）」とは、ＣＤ３４を発現し、ＣＤ４３、ＣＤ１８４及びＣＤ７３を発現しない（ＣＤ３４＋／ＣＤ４３－／ＣＤ１８４－／ＣＤ７３－）細胞である（なお、ＣＤ３４＋／ＣＤ４３－／ＣＤ１８４－／ＣＤ７３－細胞はＣＤ７を発現しないため、ＣＤ３４＋／ＣＤ４３－／ＣＤ１８４－／ＣＤ７３－細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ７－／ＣＤ４３－／ＣＤ１８４－／ＣＤ７３－細胞とも表される）。
　本明細書において、「Ｔ前駆細胞（ｐｒｏＴ）」とは、ヒト生体内においては造血幹細胞からＣＤ３陽性Ｔ細胞へ分化する過程で生じる造血系細胞を意味し、ＣＤ３４及びＣＤ７が陽性である（ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋細胞）。また、本明細書において、ｐｒｏＴはＣＤ４３、ＣＤ１ａ及び／又はＣＤ１１６が陰性であり得る。
　本明細書において、「中胚葉前駆細胞」とは、例えば、Ｔ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙと同義）、ＫＤＲ、ＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１及びＳＤＦ１から成るマーカー遺伝子から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が発現する細胞を意味する。中胚葉前駆細胞は、中胚葉細胞と区別されるものではなく、上記マーカー遺伝子の発現が弱いものを中胚葉前駆細胞と称してもよい。
　本明細書において、「ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４及びＣＤ８が共に陽性である細胞（ＣＤ８＋／ＣＤ４＋）を意味し、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ８＋／ＣＤ４＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋細胞）。
　本明細書において、「ＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４及びＣＤ８が共に陰性である細胞（ＣＤ８－／ＣＤ４－）を意味し、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８が陰性であり、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ８－／ＣＤ４－／ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋細胞）。
　本発明において、造血幹細胞、造血性内皮細胞、Ｔ前駆細胞、中胚葉前駆細胞、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞、及びＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞は骨髄、臍帯血、血液などの生体組織から単離された細胞であってもよいし、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に由来する細胞であってもよい。
　本明細書において「ＣＤ４＋Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４が陽性でありＣＤ８が陰性である細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ８－）を意味し、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８が陰性であり、ＣＤ４、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ４＋／ＣＤ８－／ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋細胞）。ＣＤ４＋Ｔ細胞としては、例えば、ヘルパーＴ細胞が挙げられる。
　本明細書において「ＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ８が陽性でありＣＤ４が陰性である細胞（ＣＤ８＋／ＣＤ４－）を意味し、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４が陰性であり、ＣＤ８、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ４－／ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋細胞）。ＣＤ８＋Ｔ細胞としては、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。
　本明細書において「γδＴ細胞」とは、ＣＤ３を発現し、かつＴＣＲ（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ鎖（γＴＣＲ）及びＴＣＲδ鎖（δＴＣＲ）から構成されるＴＣＲを発現する細胞を意味する。
　本明細書において「αβＴ細胞」とは、ＣＤ３を発現し、かつＴＣＲα鎖（αＴＣＲ）及びＴＣＲβ鎖（βＴＣＲ）から構成されるＴＣＲを発現する細胞を意味する。
　本明細書において、「制御性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、エフェクターＴ細胞の活性化を阻害し得る能力を有し、免疫応答の抑制（免疫寛容）を司っているＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、通常ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋細胞であり、その中に、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋の細胞が存在する。本発明において、制御性T細胞は、ＣＤ４＋の細胞（すなわち、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）であってもよいし、ＣＤ８＋の細胞（すなわち、ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）であってもよく、ＣＤ４＋の細胞がより好ましく、ＣＤ４＋／ＣＤ８－／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋の細胞がさらに好ましい。また、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のマスター制御因子として、転写因子ＦＯＸＰ３が知られている。
　本明細書において、「細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」とは、同じ種類又は異なる種類の２以上の細胞を意味する。「細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」は、同じ種類又は異なる種類の細胞の一塊（ｍａｓｓ）をも意味する。
　本発明で用いる各種の細胞は、治療への適用の観点からは、ＧＭＰ規格の細胞であることが好ましい。
　多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞が挙げられ、好ましくはｉＰＳ細胞（より好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞）である。上記多能性幹細胞がＥＳ細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、又は胚を破壊することなく作製された細胞であってもよく、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ウィスコンシン大学、ＮＩＨ、理研、京都大学、国立成育医療研究センター、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社などが樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトＥＳ細胞株としては、ＥＳＩ　Ｂｉｏ社が分譲するＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈが分譲するＨ１株、Ｈ９株等、理研が分譲するＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。
　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」には様々なものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６）、ウイルスフリー法で６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（日本国特開２００８－３０７００７号公報）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、日本国特開２００８－３０７００７号公報、日本国特開２００８－２８３９７２号公報、米国特許出願公開第２００８／２３３６６１０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０４７２６３号明細書、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８２２０号、国際公開第２００８／１２４１３３号、国際公開第２００８／１５１０５８号、国際公開第２００９／００６９３０号、国際公開第２００９／００６９９７号、国際公開第２００９／００７８５２号）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性幹細胞株としては、ＮＩＨ、理研、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学のＦｆ－Ｉ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ株、ＲＷＭＨ株、ＤＲＸＴ株、ＲＪＷＩ株、ＹＺＷＪ株、ＩＬＣＬ株、ＧＬＫＶ株、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株等が挙げられる。
　「核酸」とは、ヌクレオチド及び該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、及びヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。核酸は、一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
　ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡ又はＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上又は、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体（例：２’－Ｏ－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－［２－（グアニジウム）エチル］リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、架橋構造型人工核酸（ＢＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ロックド人工核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、エチレン架橋構造型人工核酸（ＥＮＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ））、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体（例：ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体）等が挙げられる。
　核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６－ＦＡＭ付加誘導体、ビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
　本発明のＴ細胞の製造方法（本明細書において、単に「本発明の製造方法」と称することがある）は、以下の工程を含むことを特徴とする。
工程（１）は、Ｔ細胞に分化可能な細胞と、多能性幹細胞由来のＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ）とを含む３次元細胞凝集体を培養する工程である。
　工程（１）を含む製造方法を用いることにより、高い効率でＴ細胞へ分化誘導させることが可能となる。工程（１）における３次元細胞凝集体の培養は、Ｔ細胞に分化可能な細胞と、多能性幹細胞由来のＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ）とを用いて、国際公開第２０１７／０７５３８９号等の記載を参考にして実施することができる。
　工程（１）に使用するＴ細胞に分化可能な細胞としては、Ｔ細胞に分化可能な細胞であれば特に限定されず、例えば、ＣＤ３４＋細胞、中胚葉前駆細胞、ＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞等が挙げられ、好ましくはＣＤ３４＋細胞又は中胚葉前駆細胞であり、より好ましくは造血性内皮細胞、造血幹細胞、Ｔ前駆細胞、又は中胚葉前駆細胞であり、特に好ましくは造血性内皮細胞である。上記ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋）細胞であり、特にＣＤ３４を発現し、ＣＤ７を発現しない（ＣＤ３４＋／ＣＤ７－）細胞である。ＣＤ３４＋細胞としては例えば造血性内皮細胞、造血幹細胞が挙げられる。
　工程（１）に使用するＴ細胞に分化可能な細胞としては、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））から分化誘導された細胞であることがより望ましい。中でも、工程（１）に使用するＴ細胞に分化可能な細胞としては、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））をＣＤ３４＋細胞（特に造血性内皮細胞）に分化誘導した細胞を使用することが望ましい。
　多能性幹細胞のＣＤ３４＋細胞への分化誘導は、公知の方法に従って実施することができ、多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、例えば、国際公開第２０１７／２２１９７５号、国際公開第２０１８／１３５６４６号及びＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２（２０１２）１７２２－１７３５に記載された方法により、造血前駆細胞を分化誘導しＣＤ３４＋細胞を製造することができる。造血性内皮細胞に工程（１）を実施する場合、造血性内皮細胞を含有するＣＤ３４＋細胞に対して工程（１）を実施することができ（つまり、工程（１）を実施する前に造血性内皮細胞を分離する工程を実施しない）、また、公知の方法（例えば、フローサイトメトリー、磁気細胞分離法）に従って分離した造血性内皮細胞に工程（１）を実施することもできる。
　間質細胞としては、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現し、多能性幹細胞由来の細胞が使用される。間質細胞は、実質細胞を支える結合組織細胞の総称であり、代表的なものとして、線維芽細胞、血球細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、組織幹細胞が挙げられる。間質細胞は、１種類単独で、又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。また、間質細胞にはＮｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸が導入されていることが好ましい。Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞は、間質細胞に上記核酸を導入することにより製造することができる。また、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））に上記核酸を導入した後、多能性幹細胞を間質細胞に分化させることによっても製造することができる。
　本発明の製造方法で使用する間質細胞は、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））から分化誘導された間質細胞であり、中でも、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））を線維芽細胞に分化誘導した細胞を使用することが望ましい。多能性幹細胞の間質細胞への分化誘導は、公知の方法に従って実施することができ、多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である場合、例えば、ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　８（１０）：ｅ７７６７３，２０１３に記載された方法により、ｉＰＳ細胞から線維芽細胞に分化誘導することができる。このように、多能性幹細胞由来の間質細胞を使用することで、初代細胞又は細胞株を使用する場合と比べて、製造上の安全性が高いＴ細胞の製造方法を提供することができる。多能性幹細胞由来の間質細胞を使用することにより、使用するフィーダー細胞のロット間の差が小さく、安定してＴ細胞を製造することができる。さらに、後述する実施例で示すように、多能性幹細胞由来の間質細胞を使用することで、抗がん作用、細胞動態が向上したＴ細胞を製造することが可能となる。
　Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、特に限定されず、国際公開第２０１７／０７５３８９号に記載の標準的Ｎｏｔｃｈリガンドと非標準的Ｎｏｔｃｈリガンドとを含む。標準的Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、例えば、ＤＬＬ４（デルタ様リガンド４）、ＤＬＬ１（デルタ様リガンド１）、ＪＡＧ１（Ｊａｇｇｅｄ１）、ＪＡＧ２（Ｊａｇｇｅｄ２）などが挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。非標準的Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、例えば、コンタクチン－１、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、コンタクチン－６、ペリオスチン／ＯＳＦ－２、ＤＬＫ２／ＥＧＦＬ９、Ｐｒｅｆ－１／ＤＬＫ１／ＦＡ１、ＤＮＥＲ、トロンボスポンジン－２、ＭＡＧＰ－１／ＭＦＡＰ２、トロンボスポンジン－３、ＭＡＧＰ－２／ＭＦＡＰ５、トロンボスポンジン－４及びネトリン－１が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、ヒトＤＬＬ４を用いることが好ましい。
　上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸を間質細胞又は多能性幹細胞に導入するための手段は特に限定されるものではなく、公知又は一般的な各種の手段を採用することができる。典型的には上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸は、発現ベクターを用いて間質細胞に導入し、発現させる。発現ベクターは、直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。
　発現ベクターを間質細胞に導入するための手法は、実施形態に応じた適切なものとすることができる。例えば、ウイルス感染法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法により、発現ベクターを間質細胞に導入することができる。発現ベクターは、公知の手段によって、また適宜市販のキットを用いて（その指示書に従って）、各手法における使用に適した形態に調製することができる。
　発現ベクターは、ウイルス感染法により間質細胞に導入することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターを用いる場合は、対応する市販のキットを用いて、上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸を含むベクター及び各ウイルスのパッケージングベクター（プラスミド）を宿主細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製した後、得られた組換えウイルスを間質細胞に感染させるようにすればよい。
　発現ベクターは、上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸に加えて、必要に応じて、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）等の配列を含んでいてもよい。発現ベクターは更に、レポーター遺伝子（例えば、各色の蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、薬剤選択遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、自殺遺伝子（例えば、ジフテリアＡ毒素、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、チトクロームＰ４５０（ｃｙｔ－４５０）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ－ＴＫ）、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｃａｓｐａｓｅ　９）などをコードする遺伝子）のような“機能的遺伝子”をコードする核酸（塩基配列）を含んでいてもよい。
　Ｔ細胞に分化可能な細胞及び間質細胞は、ヒト由来であってもよいし、ヒト以外の哺乳類（非ヒト哺乳類）由来の細胞であってもよく、好ましくはヒトである。ゼノフリーの観点からヒト由来の細胞を使用することが望ましい。非ヒト哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルが挙げられる。
　３次元細胞凝集体は、例えば、Ｔ細胞に分化可能な細胞又はそれから分化誘導された細胞とＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞とを遠心分離することにより形成することができる。間質細胞：Ｔ細胞に分化可能な細胞の比率としては、１００：１～１：１００、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０が挙げられ、好ましくは４：１～１：４、更に好ましくは１：１である。
　３次元細胞凝集体を培養するための培地としては、特に限定されず、例えば、血清不含培地、特にインスリン（更に、ビオチン、トランスフェリン、及びアルブミン）を含有する血清不含培地が挙げられる。
　３次元細胞凝集体を培養するための基礎培地としては、例えば、ＡＩＭＶ、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、グラスゴーＭＥＭ、改良ＭＥＭ亜鉛オプション、ＩＭＤＭ、１９９培地、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ－１６４０、フィッシャー培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。その他、国際公開第２０１７／０７５３８９号に記載の培地成分などが適宜配合され得る。
　３次元細胞凝集体を培養するための培養条件としては、例えば、培養温度が約２０～４０℃、ＣＯ２濃度は約２～１０％であり、酸素濃度は約１～２０％であり、培養期間は、例えば、約１～１２週程度とすることができ、好ましくは３～１０週、より好ましくは６～９週である。培養開始時の細胞密度は、例えば、１．０×１０４～１．０×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度とすることができる。
　本発明の製造方法において使用される培地、培養条件等は、培養を行う細胞の種類に適したものを使用することができる。
　そのような培地に使用される基礎培地としては、動物細胞の培養に使用できるものであれば特に限定されず、例えば前述するものが挙げられる。
　培地は、血清を含有していてもよいし、無血清でもよい。培地はまた、血清代替物（例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、ＩＴＳ－サプリメント等）を含有していてもよい。血清代替物は、１種又は２種以上を使用することができる。
　さらに、培地には、脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸等）、Ｌ－グルタミン、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有することができる。培地としては、血清等の成分が明らかでないものを含まない既知組成（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ）の培地を使用することが、培地のロット間の差が低減され、品質の安定した細胞を調製できるため望ましい。
　培地のｐＨは、通常７．０～７．８、好ましくは７．２～７．６である。培地は、使用前にはコンタミネーションを防止するため、濾過、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射等の方法により好ましくは滅菌される。培養は、フィーダー細胞の存在下又は非存在下で実施される。培養条件は、特に制限されず、細胞培養に通常使用される条件を使用することができる。培養では、所望の量の細胞を得るために必要な回数継代を行ってもよいし、培地の追加及び交換を行ってもよい。培養容器は特に限定されるものではなく、プレート、ディッシュ、シャーレ、フラスコ、バッグ、ボトル、タンク（培養槽）、バイオリアクターなどの中から適宜選択することができる。
　本発明の製造方法は、得られたＴ細胞を濃縮するために、Ｔ細胞を分離する工程を更に含んでいてもよい。Ｔ細胞の分離は、フローサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などの公知の方法により行うことができる。
　本発明の製造方法により得られるＴ細胞とは、ＣＤ３＋の細胞であり、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞であるヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔｆｈ細胞（ＣＸＣＲ５＋細胞）、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋細胞）、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－細胞）、ターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－細胞）などが挙げられる。中でもＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞及び制御性Ｔ細胞が望ましい。Ｔ細胞は、１種類のみ、又は２種類以上の混合物のいずれであってもよい。
　本発明の一側面において、本発明の製造方法により、多能性幹細胞（好ましくは、ｉＰＳ細胞（より好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞））由来の細胞集団であって、前記細胞集団に含まれるαβＴ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の含有割合が高い細胞集団を製造することができる。本発明の製造方法は、Ｔ細胞に分化可能な細胞からＴ細胞を製造する過程においてＴ細胞を分離する工程を含まずともαβＴ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の含有割合が高い細胞集団を製造することができる点に特徴を有する。Ｔ細胞を分離する工程を含まない場合、同工程を含む場合に比して前記細胞集団を効率よく製造することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団に含まれるαβＴ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の比（細胞数）は、例えば、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１．０以上、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、２．１以上、２．２以上、２．３以上、２．４以上、２．５以上、２．６以上、２．７以上、２．８以上、２．９以上、３．０以上、３．１以上、３．２以上、３．３以上、３．４以上、３．５以上、３．６以上、３．７以上、３．８以上、３．９以上、４．０以上である。好ましくは、０．６以上であり、より好ましくは、１．０以上であり、さらに好ましくは、２．０以上である。当該比の上限としては、例えば、１０、９．０、８．０、７．０、６．０、５．０などが挙げられる。
　本発明の製造方法により得られたＴ細胞は、外来遺伝子が導入されたＴ細胞であってもよい。
　「外来遺伝子」は、Ｔ細胞に所望のタンパク質を発現させるために、外部より導入される遺伝子であり、Ｔ細胞の用途に応じて適宜選択することができる。
　本発明の製造方法により得られたＴ細胞には外来遺伝子として１種以上の遺伝子が導入されていてもよく、外来遺伝子は、例えば、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＣＡＲ（キメラ抗原受容体）をコードする核酸とすることができる。外来遺伝子は、例えば、ＣＡＲを発現するための遺伝子とすることができ、そこに更に、サイトカイン及び／又はケモカインを発現するための遺伝子（例えば、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとが連結した融合タンパク（ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５））を含むこともできる。Ｔ細胞が発現するＣＡＲは基本的に、一般的又は公知のＣＡＲと同様に、（ｉ）がん細胞の細胞表面抗原を認識する抗原認識部位（例えば、一本鎖抗体）、（ｉｉ）細胞膜貫通領域、及び（ｉｉｉ）Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域、の各部位のペプチドが、必要に応じてスペーサーを介して連結することによって構成されている。ＴＣＲは、α鎖β鎖又はγ鎖δ鎖の二量体のいずれであってもよい。また、外因性ＴＣＲとは、外因性ＴＣＲをコードする核酸が導入されるＴ細胞にとって外因性であることを意味し、外因性ＴＣＲのアミノ酸配列は当該Ｔ細胞の内因性ＴＣＲと同一であってもよく、異なっていてもよい。導入する外因性遺伝子が、外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸である場合、当該核酸の例としてＶｇ９Ｖｄ２ＴＣＲをコードする核酸が挙げられる。
　外来遺伝子を細胞に導入するための手段としては前述する方法が挙げられる。なお、外来遺伝子を導入する細胞は、特に限定されず、分化のいずれの段階であってもよく、例えば、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）、Ｔ細胞に分化可能な細胞、Ｔ細胞などが挙げられる。
　本発明の製造方法により得られたＴ細胞に導入されている１種以上の外来遺伝子の他の一例として、（ａ）Ｆｏｘｐ３遺伝子のＣＮＳ１（保存された非コード配列１）、ＣＮＳ２（保存された非コード配列２）、及びＣＮＳ３（保存された非コード配列３）；（ｂ）プロモーター；及び（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸を含む発現構築物（本明細書において、単に「発現構築物」又は「ＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３」と称することがある）が挙げられる。このような発現構築物を多能性幹細胞、Ｔ細胞に分化可能な細胞などに導入することにより、高い効率で制御性Ｔ細胞を製造することが可能となる。発現構築物は、ＦＯＸＰ３を発現させることができるものであれば特に限定されず、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）以外にも、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、Ｆｏｘｐ３　３’ＵＴＲなどが含まれることが好ましく、これらが導入された細胞内で機能するものであればより好ましい。
　ヒトのＦｏｘｐ３遺伝子の塩基配列は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１１１４３７７（配列番号１）、ＮＭ＿０１４００９（配列番号２）として登録されており、アミノ酸配列についてもＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０７８４９（配列番号３）、ＮＰ＿０５４７２８（配列番号４）として登録されている。ここでのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＣＢＩのｗｅｂ　ｓｉｔｅに登録されているものである。本発明においては、上記遺伝子には、前述するようなデータベースに登録されている塩基配列を有するもの以外であっても、その縮重物及び変異体も含まれ、変異体としては上記アミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。変異体としては、天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有する変異型のＦＯＸＰ３が挙げられる。本明細書において、ＦＯＸＰ３はタンパク質をＦｏｘｐ３は遺伝子を意味するものとするが、ＦＯＸＰ３、Ｆｏｘｐ３をそれぞれ遺伝子、タンパク質として解釈することが適切な場合は遺伝子、タンパク質を意味するものとする。
　ＦＯＸＰ３をコードする核酸としては、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸であれば特に限定されず、好ましくはＦＯＸＰ３のｃＤＮＡである。
　本発明で使用するＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３は、全てＦｏｘｐ３遺伝子に由来するものである。ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３は、Ｆｏｘｐ３エンハンサーエレメントである。本発明で使用するプロモーターは特に限定されず、例えば、ＣＡＧプロモーター、ユビキチン遺伝子のプロモーター、Ｆｏｘｐ３遺伝子のプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどであり、好ましくはＦｏｘｐ３遺伝子のプロモーターである。ヒトのＦｏｘｐ３遺伝子のＣＮＳ１、ＣＮＳ２、ＣＮＳ３及びプロモーターの好ましい塩基配列としては、それぞれ配列番号５～８に記載された塩基配列が挙げられる。当該プロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３には、前述するような塩基配列を有するもの以外であっても、変異体も含まれ、変異体としては上記塩基配列からなるプロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３と同等の生物学的活性を有するものが望ましい。変異体としては、天然の塩基配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性の塩基配列を有するものが挙げられる。
　プロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２、ＣＮＳ３及びＦＯＸＰ３をコードする核酸の発現構築物における配置（順番）は特に限定されず、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３がプロモーターの上流に位置していることが好ましく、５’末端側から順にＣＮＳ１－ＣＮＳ２－ＣＮＳ３－プロモーター－ＦＯＸＰ３をコードする核酸であることがより好ましい。
　上記発現構築物を導入する細胞として多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）を使用し、これをＣＤ３４＋細胞（特に造血性内皮細胞）に分化誘導して、当該ＣＤ３４＋細胞（特に造血性内皮細胞）に本発明の製造方法を実施し、制御性Ｔ細胞に分化させることが望ましい。
　本発明の製造方法により製造したＴ細胞は、Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療に有用である。本発明の製造方法により製造したＴ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はγδＴ細胞である場合、例えば、これらの細胞は腫瘍（血液腫瘍、固形腫瘍）、感染症、血液疾患等の治療及び予防に有用であるが、これらに限定されない。本発明の製造方法により製造したＴ細胞が制御性Ｔ細胞である場合、この細胞は免疫反応が異常に亢進している動物（特に、ヒト）の治療及び予防に有用であり、例えば、Ｘ染色体連鎖型免疫調節異常・多発性内分泌障害・腸症（ＩＰＥＸ）症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植における拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患（花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食品アレルギー、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、薬剤アレルギー）などの治療及び予防に有用である。本発明の製造方法により製造したＴ細胞は、自家移植に用いてもよく、他家移植に用いてもよい。また、他の薬剤と併用してもよい。
　このような細胞治療を実施する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、Ｔ細胞の製造に使用するための細胞が単離される対象は、Ｔ細胞が投与される対象とＨＬＡの型が一致していることが好ましく、Ｔ細胞が投与される対象と同一の対象であることがより好ましい。
　本発明によれば、Ｔ細胞を含む医薬（以下、本発明の医薬と称することがある）を製造することができる。本発明の医薬は、公知の手段（例えば、日本薬局方に記載の方法等）に従って、有効量のＴ細胞を薬学的に許容される担体と混合するなどして、非経口製剤として製造することが好ましい。本発明の医薬は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造することが好ましい。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与などの方法が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、溶剤、基剤、希釈剤、賦形剤、無痛化剤、緩衝剤、保存料、安定剤、懸濁剤、等張化剤、界面活性剤、溶解補助剤等が挙げられる。
　本発明の医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、通常１×１０６～１×１０１０個となるように、好ましくは１×１０７～１×１０９個となるように、より好ましくは５×１０７～５×１０８個となるように投与される。また、１回で投与してもよく、複数回にわたって投与してもよい。本発明の医薬は、非経口投与に適した公知の形態、例えば、注射又は注入剤とすることができる。また、本発明の医薬は、細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含んでもよい。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１０などの培地が挙げられる。また、該医薬には医薬的に許容される担体（例：ヒト血清アルブミン）、保存剤等が安定化の目的で添加されていてもよい。本発明の医薬は、ヒトを含む哺乳動物に対して適用されるものである。
　本明細書及び請求の範囲で使用される場合、特に文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。したがって、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
　１）ｉＰＳ細胞由来Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ／ＤＬＬ４細胞の作製
　ｉＰＳ細胞からＴ細胞を分化誘導する際のフィーダー細胞として用いるために、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたｉＰＳ細胞（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株：健常人末梢血単核球由来）から線維芽細胞を分化誘導した。続いて、レンチウイルスを用いてＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬＬ４をＥＦ１ａｌｐｈａプロモーター下で強制発現する細胞を作製した。
　具体的には、超低接着処理された６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＦｆ－Ｉ０１ｓ０４株を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＡＫ０３Ｎ（味の素株式会社）にＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＣＨＩＲ９９０２１１（Ｔｏｃｒｉｓ）を添加した培地にて播種し（Ｄａｙ０）、その翌日に細胞をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ培地（ａｌｐｈａ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ，Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＰＳＧ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２－リン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加）にて０．１％ゼラチン（ナカライテスク株式会社）でコーティングした１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した（Ｄａｙ１）。週に２回培地を交換し、７日間培養を続け、線維芽細胞を含む細胞集団を得た（Ｄａｙ８）。
　得られたｉＰＳ細胞由来線維芽細胞をゼラチンコートした２４ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、その翌日に、ＥＦ１ａｌｐｈａプロモーターの下流にヒトＤＬＬ４遺伝子を組み込んだレンチウイルス溶液と終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようにプロタミンを添加して、ｉＰＳ細胞由来Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ／ＤＬＬ４細胞（ｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４）を作製した。
　作製した細胞を抗ＤＬＬ４抗体－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又は線維芽細胞マーカーである抗ＣＤ９０抗体－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて染色しフローサイトメトリー法にて解析した。その結果、図１に示すようにＤＬＬ４及び線維芽細胞マーカーの発現が認められた。
　２）Ｖｇ９Ｖｄ２ＴＣＲ導入ｉＰＳ細胞（ＱＨＪＩ０１ｓ０４／Ｇ９Ｄ２細胞）の作製
　京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたｉＰＳ細胞（ＱＨＪＩ０１ｓ０４株：健常人末梢血単核球由来）に国際公開第２０２０／０１３３１５号に記載された方法に準じてＶｇ９Ｖｄ２ＴＣＲ遺伝子を導入しＶｇ９Ｖｄ２ＴＣＲ導入ｉＰＳ細胞を作製した。
　具体的には、ｉＰＳ細胞を２４ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、その翌日に、ヒトユビキチンプロモーターの下流にＶｇ９Ｖｄ２ＴＣＲ遺伝子を組み込んだレンチウイルス溶液と終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようにプロタミンを添加して、ＱＨＪＩ０１ｓ０４／Ｇ９Ｄ２細胞を作製した。
　３）ｉＰＳ細胞からＨＥＣへの分化誘導
　造血性内皮細胞を含む細胞集団として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたｉＰＳ細胞（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株：健常人末梢血単核球由来）を公知の方法（例えば、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２（２０１２）１７２２－１７３５及び国際公開第２０１７／２２１９７５号に記載された方法）に準じて分化させた浮遊細胞集団を用いた。
　具体的には、超低接着処理された６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＦｆ－Ｉ０１ｓ０４株を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し（Ｄａｙ０）、ＥＢ培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｇｉｂｃｏ）に１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ，Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４５ｍＭ　α－モノチオグリセロール（ナカライテスク株式会社）、及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２－リン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加）に５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬株式会社）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＭ　ＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬株式会社）を加えて、低酸素条件下（５％Ｏ２）にて４日間培養を行った（Ｄａｙ４）。続いて、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）が添加された培地でさらに４日間培養を行い（Ｄａｙ８）、ＨＥＣを含む細胞集団を得た。ＨＥＣを含む上記浮遊細胞集団は、以下の表１の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた細胞集団中に、フローサイトメトリー法にてＨＥＣ（ＣＤ３４＋／ＣＤ４３－／ＣＤ７３－／ＣＤ１８４－細胞）が約１５％含まれていることを確認した。さらに、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株の代わりに上記２）で作製したＱＨＪＩ０１ｓ０４／Ｇ９Ｄ２細胞を用いたこと以外は上記と同様にして、ＱＨＪＩ０１ｓ０４／Ｇ９Ｄ２細胞からＨＥＣを含む細胞集団を得た。
　４）Ｔ細胞分化誘導
　上記１）で得られたｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４と上記３）で得られたＨＥＣを含む細胞集団を国際公開第２０１７／０７５３８９号等に記載の方法を参考にしてＴ細胞へ分化させた。
　具体的にはｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４又はマウスストローマ細胞株ＭＳ５にＤＬＬ４を強制発現させた細胞（ＭＳ５／ＤＬＬ４）を支持体として、上記３）で作製したｉＰＳ細胞由来ＨＥＣと、１：１又は４：１の細胞比で、それぞれ共培養した。培地には終濃度で２ｘＢ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｘＰＳＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌt３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだＲＰＭＩ－１６４０（富士フイルム和光純薬株式会社）を用い、３０ｍｍ　Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（親水性ＰＴＦＥ、ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　０．４μｍ、高さ５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上で共培養したものを６ウェルプレート（ＴＰＰ）内に静置して、３～４日に一回の頻度で培地交換しながら９週間培養した。
　培養後、得られた細胞を回収し、国際公開第２０２０／０３２１７９号に記載の方法に準拠して拡大培養し、次いで抗ＣＤ１９－ＣＡＲ（配列番号９）遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５（配列番号１０）遺伝子を導入した。これにより、ｉＰＳ細胞由来ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を得た。以下の表２の抗体セットを用いて細胞内染色し、図２に示すようにフローサイトメトリー法にてＴ細胞表面分子並びに抗ＣＤ１９ＣＡＲ及びＩＬ－１５Ｒαの発現を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　５）ｉｎ　ｖｉｖｏでの有効性と細胞動態（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ：ＣＫ）
　上記４）で作製したｉＰＳ細胞由来ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の薬効と細胞動態とを免疫不全マウス担癌モデルにて検討した。
　具体的には、８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（日本チャールズ・リバー株式会社）に、１匹あたり５×１０５個／２００μＬのルシフェラーゼを遺伝子導入したＮａｌｍ６（ヒトＢ細胞白血病細胞由来細胞株）を静脈内投与し、その４日後に上記４）で作製したＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を表３に示す群構成にて静脈内に投与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の投与１週間後から、１匹あたり３ｍｇのＶｉｖｏＧｌｏ　ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を腹腔内投与し、１０分後にＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いてがん細胞の残存を可視化した。同時に体重測定及びヘパリン管を用いた採血をおこなった。採取した血液は表４の抗体セットで染色後にＦＡＣＳ　ｌｙｓｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）を用いて溶血及び固定し、ＦＡＣＳ　ＬＳＲ　Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）を用いて解析し、ＣＤ４５＋細胞をＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞としてＣＫを算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その結果、図３に示すように、いずれのＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞投与群においてもコントロール群と比較してがん細胞数は著しく減少したことから、強い薬効を持つことが示された。さらに、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞間の比較においては、支持体としてｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４を用いて作製した細胞の方が、支持体としてＭＳ５／ＤＬＬ４を用いて作製した細胞よりも、強い薬効を示した。また、図４に示すように、マウス生体内でＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の残存数は薬効と正の相関傾向であった。
　６）分化誘導したＴ細胞集団におけるＣＤ４ ＋ Ｔ細胞とＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の割合
　上記４）で作製したｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞集団（抗ＣＤ１９－ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を導入する前の細胞集団）において、αβＴ細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）及びＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の比を算出した。その結果、表５に示すように、支持体としてｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４を用いて作製したＴ細胞集団の方が、支持体としてＭＳ５／ＤＬＬ４を用いて作製したＴ細胞集団よりも、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が高いことがわかった（表５中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は平均値を示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　７）ｉＰＳ細胞からＴｒｅｇへの分化誘導とタンパク質の発現量の検討
　ｉＰＳ細胞からＴｒｅｇへの分化誘導は、具体的には以下のとおりである。ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（ＭＫ０１２４３１）内のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙタンパク質配列をｄＴｏｍａｔｏ配列に変更したＤＮＡ配列を、第３世代レンチウイルスベクター作製用のトランスファープラスミドに組み込んだプラスミド配列をデザイン、合成した。このプラスミドをレンチウイルスベクター作製用のパッケージングプラスミドとエンベローププラスミドと共にＨＥＫ２９３系統の細胞にトランスフェクションを行い、産生されたレンチウイルスベクターを含む上清を回収後、高速遠心法で濃縮しｉＰＳ細胞へ導入するレンチウイルスベクターを取得した。次に、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株を２４ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、終濃度１０μｇ／ｍＬでプロタミンを添加した後に、ＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３を組み込んだレンチウイルス溶液を直接添加して、ウイルス感染ｉＰＳ細胞を作製した。
　超低接着処理された６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウイルス感染させたＦｆ－Ｉ０１ｓ０４株を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＥＢ培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｇｉｂｃｏ）に１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ，Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４５ｍＭ　α－モノチオグリセロール（ナカライテスク株式会社）、及び５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸２－リン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加）に５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬株式会社）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＭ　ＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬株式会社）を加えて、低酸素条件下（５％Ｏ２）にて４日間培養を行った。続いて、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）が添加された培地でさらに４日間培養を行い、ＨＥＣを含む細胞集団を得た。さらに上記１）で得られたｉＦｉｂｒｏ／ＤＬＬ４を支持体として、ＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３導入ヒトｉＰＳ細胞由来ＨＥＣと、１：１の細胞比で共培養した。培地には終濃度で２ｘＢ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｘＰＳＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだＲＰＭＩ－１６４０（富士フイルム和光純薬株式会社）を用い、３０ｍｍ　Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（親水性ＰＴＦＥ、ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　０．４μｍ、高さ５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上で共培養したものを６ウェルプレート（ＴＰＰ）内に静置して、３～４日に一回の頻度で培地交換しながら９週間培養した。
　上記で得られたＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３導入ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔｒｅｇを含む細胞集団を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を結合させた４８穴細胞培養プレートに２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５．０％ＣＯ２条件下で３日間培養した後、２４穴Ｇ－Ｒｅｘ細胞培養プレートに播き直して培養を続けた。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ３０抗体（１．５μｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、ラパマイシン（１０ｎＭ，ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び抗ＴＮＦＲ２抗体（３μｇ／ｍＬ，Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、最初の３日間は抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を上記の組成に対してさらに添加した。このようにして得られた細胞をＣＤ４　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）の推奨プロトコルに従って単離することでＣＤ４陽性細胞を得た。この細胞を同様の方法で１回拡大培養したのち（ｄａｙ　０）、これを同様の培地にさらにＩＬ－３（６０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－４（３０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を追加した培地を用いて再度１８日間培養した（ｄａｙ　１８）。各細胞集団は以下の抗体セットを用いて染色した（Ｐａｎｅｌ　１：Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＢＶ５１０　ＣＤ３，ＢＶ４２１　ＣＤ４，ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ８ｂ，ＡＰＣ　ＣＤ２５，ＰＥ　ＧＺＭＢ，ＡＦ４８８　ＦＯＸＰ３，ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５　ＣＴＬＡ４，Ｐａｎｅｌ　２：Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＢＶ５１０　ＣＤ３，ＢＶ４２１　ＣＤ４，ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ８ｂ，ＡＦ４８８　ＦＯＸＰ３，ＰＥ　Ｈｅｌｉｏｓ）。
　その結果、図５に示すように、１回目の拡大培養で３１．０％の細胞がＴｒｅｇとして分化しており（Ｄａｙ０）、さらに続く２回目の拡大培養を通じてＴｒｅｇ集団が７７．１％に濃縮された（Ｄａｙ１８）。
　本出願は、日本で２０２２年２月４日に出願された特願２０２２－０１６２７１号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。

Claims (25)

  1. 　Ｔ細胞の製造方法であって、
    （１）Ｔ細胞に分化可能な細胞と、多能性幹細胞由来のＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞とを含む３次元細胞凝集体を培養する工程を含む方法。
  2. 　前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、ＣＤ３４＋細胞又は中胚葉前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、造血幹細胞、造血性内皮細胞、Ｔ前駆細胞、又は中胚葉前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、造血性内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、多能性幹細胞由来の細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記Ｔ細胞に分化可能な細胞が、ｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記間質細胞が、線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記多能性細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 　前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、ＪＡＧ１及びＪＡＧ２からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
  10. 　工程（１）の前に、
    （２）多能性幹細胞を間質細胞に分化誘導する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  11. 　工程（１）の前に、
    （３）ｉＰＳ細胞をＴ細胞に分化可能な細胞に分化誘導する工程を更に含む、請求項６に記載の方法。
  12. 　工程（１）の前に、
    （４）Ｔ細胞に分化可能な細胞に外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を導入する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  13. 　工程（３）の前に、
    （５）ｉＰＳ細胞に外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を導入する工程を更に含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 　ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１種を含むＴ細胞の製造方法である、請求項１に記載の方法。
  15. 　請求項１に記載の方法により得られた、Ｔ細胞。
  16. 　請求項１５に記載のＴ細胞を含有してなる、医薬。
  17. 　外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の製造方法であって、
    （６）請求項１に記載の方法により得られたＴ細胞に外因性Ｔ細胞受容体及び／又はキメラ抗原受容体をコードする核酸を導入する工程を含む方法。
  18. 　Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療剤である、請求項１６に記載の医薬。
  19. 　Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、請求項１８に記載の医薬。
  20. 　請求項１５に記載のＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療方法。
  21. 　Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　Ｔ細胞関連疾患の予防及び／又は治療において使用するための、請求項１５に記載のＴ細胞。
  23. 　Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、請求項２２に記載のＴ細胞。
  24. 　Ｔ細胞関連疾患を予防及び／又は治療するための医薬の製造における、請求項１５に記載のＴ細胞の使用。
  25. 　Ｔ細胞関連疾患が、腫瘍、感染症、又は血液疾患である、請求項２４に記載の使用。
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