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WO2023013618A1 - ヒトアストロウイルスの感染レセプターとその応用 - Google Patents

ヒトアストロウイルスの感染レセプターとその応用 Download PDF

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Publication number
WO2023013618A1
WO2023013618A1 PCT/JP2022/029580 JP2022029580W WO2023013618A1 WO 2023013618 A1 WO2023013618 A1 WO 2023013618A1 JP 2022029580 W JP2022029580 W JP 2022029580W WO 2023013618 A1 WO2023013618 A1 WO 2023013618A1
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WO
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hastv
fcgrt
gene
genetically modified
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/029580
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English (en)
French (fr)
Inventor
章 中西
和彦 片山
慧 芳賀
玲子 戸高
紫文 小池
栞 工藤
Original Assignee
国立研究開発法人国立長寿医療研究センター
学校法人北里研究所
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Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 学校法人北里研究所 filed Critical 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to the cell infection mechanism of viruses and its application. More specifically, the invention relates to an infection receptor for human astrovirus, one of major gastroenteritis viruses, and its application.
  • HstV Human Astrovirus
  • HAstV Human Astrovirus
  • Infants under the age of 5 are mainly infected after 5 to 6 months of age, causing acute gastroenteritis. It can also infect adults and cause large-scale viral food poisoning incidents.
  • HAstV is the third most frequently reported pathogenic virus for viral gastroenteritis in the epidemic prediction project of the Ministry of Health, Labor and Welfare, next to norovirus and rotavirus, along with sapovirus.
  • HAstV is transmitted from person to person via the fecal-oral route, but outbreaks can also occur with contaminated food and drink as the source of infection. Infection through food is thought to be caused by drinking water and bivalves such as oysters and green goats carrying HAstV, and the number of viral particles required for HAstV infection is said to be 100 or more.
  • Astrovirus particles are stable at pH 3 and are resistant to various detergents (nonionic, anionic, zwitterionic) and lipid solvents including chloroform.
  • HAstV remains infective by heat treatment at 60° C. for 5 minutes, but is inactivated by heat treatment for 10 minutes.
  • HAstV develops with symptoms such as diarrhea, vomiting, and abdominal pain 2-3 days after infection, and the symptoms last for about 4 days. There are also subclinical infections in which no symptoms are observed even if infected, but more serious symptoms are observed in immunocompromised patients. Shedding of HAstV in healthy infant patients can persist for several weeks even when the condition improves and becomes asymptomatic. On the other hand, persistent viral shedding may occur in immunosuppressed individuals.
  • Non-Patent Document 1 Human astrovirus (also referred to herein as HAstV) can be grown and cultured in Caco2, a continuous cell line of human colon adenocarcinoma (Non-Patent Document 1), research on the replication mechanism of the virus has progressed. Nakanishi, one of the present inventors, has also constructed a plasmid-based reverse genetics system. However, the HAstV receptor molecule has not yet been discovered, and the initial steps of replication, such as cell adhesion, invasion, and enucleation, have not been elucidated. Furthermore, HAstV vaccines, therapeutic agents, efficient HAstV detection means, etc. have not yet been developed, and the identification of receptor molecules is extremely important for the development of HAstV infection control methods.
  • the present inventors conducted intensive studies with the aim of elucidating the nature of the HAstV receptor molecule.
  • the FCGRT receptor protein and B2M protein were found to be HAstV receptor molecules. More specifically, on the cell surface of a mammal, the FCGRT receptor protein may be alone, but the FCGRT receptor protein and the B2M protein form a heterodimer as a pair with each other, and the form of the heterodimer is It was found that this is the form that best exhibits the receptor function of HAstV. They also found that the B2M protein plays a role in assisting the HAstV receptor function in the FCGRT receptor protein.
  • the FCGRT gene encodes a fetal Fc receptor (neonatal Fc receptor: FcRn).
  • the FCGRT receptor has a similar structure to the MHC1 molecule and, like the MHC1 molecule, forms a heterodimer with ⁇ 2 microglobulin (B2M) on the cell surface.
  • B2M microglobulin
  • FcRn fetal Fc receptor
  • FcRn is expressed in various tissues even in adults, and its main function is to extend the half-life of IgG in plasma by returning IgG that has been taken up into cells back into the plasma. It turns out.
  • B2M forms a heterodimer with FCGRT receptor on the cell surface and constitutes a part of Fc receptor. That is, Fc receptors are composed of two polypeptide chains, the ⁇ chain and ⁇ 2 microglobulin (B2M), which are non-covalently bound by interactions between the B2M and ⁇ 3 domains. known to be connected.
  • B2M microglobulin
  • the nucleotide sequence of the FCGRT receptor gene (NM_001136019: SEQ ID NO: 1) is and The amino acid sequence of the FCGRT receptor protein (NM_001136019: SEQ ID NO: 2) is ⁇ mgvprpqpwalglllfllpgslgaeshlsllyhltavsspapgtpafwvsgwlgpqqylsynslrgeaepcgawvwenqvswywekettdlrikeklfleafkalggkgpytlqgllgcelgpdntsvptakfalngeefmnfdlkqgtwggdwpealaisqrwqqqdkaankeltfllfscphrlrehlergrgnlewkeppsmrlkarpsspgfsvltcsafsfyppelqlrflrnglaagt
  • the base sequence of the B2M gene (NM_004048: SEQ ID NO: 3) is ⁇ atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaattttcctgaattgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtcttttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtga
  • nucleotide sequences SEQ ID NOS: 1 and 3 and amino acid sequences (SEQ ID NOS: 2 and 4) are sequences related to the human genome, and naturally there are sequences that are modified by natural occurrences and by genetic polymorphisms. .
  • the genetic polymorphism contains a single nucleotide substitution (SNP).
  • SNP single nucleotide substitution
  • the present invention has an aspect using a gene encoding an FCGRT receptor (FCGRT receptor gene or FCGRT gene) and/or a gene encoding a B2M protein (B2M gene) (first aspect); Secondly, there is an aspect (second aspect) using FCGRT receptor protein (FCGRT receptor protein or FCGRT protein) and/or B2M protein (B2M protein).
  • the general structure of the astrovirus genome has ORF1a and ORF1b encoding nonstructural proteins at the 5' end and ORF2 encoding the structural protein at the 3' end.
  • This arrangement resembles the genomic structure of caliciviruses.
  • features such as polyprotein size, number and processing, RNA helicase domains, and ribosomal frameshift mechanisms. Therefore, astroviruses are classified into the Astroviridae family, which is a virus family different from calciviruses and the like.
  • Viruses of the Astroviridae family have been isolated from humans and many other animal species and have been identified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) using the full-length polypeptide sequence of the viral capsid. According to phylogenetic analysis, they are classified into two genera: mammalian astroviruses (MAstV) that infect mammals including humans, and astroviruses isolated from birds (Avastrovirus). MAstV was further subdivided into two gene groups, Mamastrovirus genogroups I and II, and Avastrovirus was similarly subdivided into two gene groups. Furthermore, these gene groups were subdivided into multiple genotypes.
  • MAstV mammalian astroviruses
  • Avastrovirus astroviruses isolated from birds
  • the Astroviridae family consists of two virus genera (Astrovirus: Mamastrovirus, Avastrovirus), but the above Mamastrovirus includes 19 virus species (mamastrovirus 1-19), and Avastrovirus includes 3 viruses. It was assumed to contain species (avastrovirus 1-3). In other words, by integrating the gene groups and genotypes that had been established under the virus genus, the virus species were unified and organized.
  • HAstV Astroviruses that infect humans
  • MAstV a viral species included in MAstV (because the antigenicity of these eight genotypes is different from each other). synonymous with serotype).
  • HAstV genotype 1 HAstV1
  • mastroviruses 6, 8, and 9 which are genetically distant from mastrovirus 1, also infect humans like other genotypes. It has become clear since 2008 that
  • the human astrovirus (HAstV) to be the object of the present invention is an astrovirus having the ability to infect humans, and includes all of the above HAstV types 1 to 8 (genotype) and mastroviruses 6 and 8. ⁇ 9 is included.
  • a permissible B2M gene or an FCGRT receptor gene in which partial modification of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is permissible and which is infected with HAstV
  • proliferative genetically modified mammalian cultured cells hereinafter also referred to as cultured cells of the present invention.
  • the present invention provides an FCGRT receptor gene that permits partial modification of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a B2M gene that permits partial modification of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or sequences A genetically modified mammal (excluding humans) in which the FCGRT receptor gene, which permits partial modification of the base sequence represented by No. 1, is integrated, and the gene has the ability to be infected with HAstV or proliferate.
  • a recombinant mammal hereinafter also referred to as the recombinant animal of the present invention.
  • the partial modification of the base sequence above refers to the replacement, deletion, or insertion of part of the reference base sequence.
  • the modification is permissible and not particularly limited as long as the genetically modified mammalian cultured cells or genetically modified mammals into which the above-mentioned receptor gene of the modified base sequence is integrated have the ability to be infected with HAstV or proliferate. not something.
  • Genetic modifications according to natural occurrences, genetic modifications according to genetic polymorphisms, etc. based on information obtained by human gene analysis are included in the partial modifications of the base sequences described above.
  • the genetic polymorphism includes a single nucleotide substitution (SNP).
  • SNP single nucleotide substitution
  • the gene to be incorporated into cultured mammalian cells or mammals can be the FCGRT receptor gene alone, but it is preferable that both the FCGRT receptor gene and the B2M gene are incorporated.
  • the FCGRT receptor gene and the B2M gene, or the FCGRT receptor gene are introduced into cultured mammalian cells or mammals, thereby introducing HAstV into the cultured mammalian cells or mammals.
  • the point is that the ability to be infected or the ability to proliferate is conferred.
  • the origin of the mammalian cultured cells to be the subject of the above genetic recombination is not limited, and includes cells derived from mammals such as humans, rats, hamsters, guinea pigs, mice, rabbits, cats, dogs, pigs, and monkeys.
  • human cultured cells include HEK293T cells, Caco2 cells, Intestine407, macrophage-based cultured cells 15310-LN cells, NALM-6 cells, etc.
  • Mouse cultured cells include RAW264.7 cells, NIH3T3 cells, Examples include M1 cells.
  • BHK cells derived from hamsters
  • CHO cells derived from hamsters
  • CRFK cells derived from cats
  • MDCK cells derived from dogs
  • PK-15 cells derived from pigs
  • VERO cells derived from monkeys
  • COS7 cells derived from monkeys origin
  • cultured mammalian cells in addition to the above-mentioned established cultured cells, organoids derived from biopsy samples, immortalization-inducing cells, iPS cells, and the like can also be used.
  • FCGRT receptor gene and/or the B2M gene can be improved.
  • the method of introducing the FCGRT receptor gene and B2M gene, or the FCGRT receptor gene, into cultured mammalian cells is not particularly limited, and is carried out according to a conventional method.
  • a vector for gene transfer that is, a mouse leukemia virus vector incorporating an FCGRT receptor gene and a B2M gene, or an FCGRT receptor gene, a retroviral vector such as a lentiviral vector, an adenoviral vector , adeno-associated virus vector, herpes simplex type I vector, modified viral vector such as HVJ-liposome, plasmid vector having CMV promoter, GAC promoter, EF-1 ⁇ promoter, SV40 promoter that functions in cultured mammalian cells, etc. introduction method.
  • introduction method for introduction of genes, in addition to using recombinant viral vectors, calcium phosphate method, lipofection method, commercially available transfection reagent, microinjection method, stamping method, particle gun method and the like can also be used.
  • the mammals to be genetically modified above are not particularly limited, and include non-human mammals such as rats, hamsters, guinea pigs, mice, rabbits, cats, dogs, pigs, and monkeys.
  • Gene integration methods for these mammals include, for example, the FCGRT receptor gene and the B2M gene, or the FCGRT receptor gene, retroviral vectors such as mouse leukemia virus vectors, lentiviral vectors, adenovirus vectors, adenoviral vectors, adenovirus vectors, etc.
  • Associated virus vectors herpes simplex type I vectors, modified viral vectors such as HVJ-liposomes, CMV promoters that function in mammalian cells, GAC promoters, EF-1 ⁇ promoters, plasmid vectors having SV40 promoters, etc.
  • a gene can be introduced into a mammal of interest and expressed.
  • the FCGRT receptor gene and B2M gene can be secured by standard methods. That is, the above genes can be easily obtained by amplifying the gene region by a gene amplification method such as PCR using cDNA containing these genes as a template. It is possible to do this at home, but it is also possible to outsource it, and if it is available on the market, it is also possible to use a commercially available product.
  • the present invention provides the following method.
  • the present invention provides an FCGRT receptor gene that permits partial modification of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide represented by SEQ ID NO: 3 for cultured mammalian cells or mammals (excluding humans).
  • the above-mentioned mammals genetically modified by introducing the B2M gene, which permits partial modification of the sequence, or the FCGRT receptor gene, which permits partial modification of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a method for imparting or enhancing the ability to be infected with HAstV in cultured cells or mammals (hereinafter also referred to as the method for imparting/enhancing the present invention) is provided.
  • the cultured cells of the present invention and the recombinant animals of the present invention are recombinant mammalian cultured cells and recombinant mammals to which HAstV infectivity has been imparted or enhanced by the imparting method of the present invention.
  • imparting the ability to be infected" by HAstV means to newly impart the ability to be infected by HAstV to cultured mammalian cells or mammals, which initially lacked the ability to be infected by HAstV.
  • the term "enhancement of the ability to be infected” means enhancement of the ability to be infected by HAstV in cultured mammalian cells or mammals in which the ability to be infected by HAstV has already been confirmed.
  • the present invention relates to the production of HAstV by infecting the cultured cells of the present invention or the recombinant animals (excluding humans) of the present invention with HAstV and proliferating the HAstV in the cultured cells or recombinant animals.
  • a method hereinafter also referred to as the production method of the present invention.
  • the present invention provides that subculturing of HAstV in the cultured cells of the present invention (including human-derived cultured cells) or the recombinant animals of the present invention (excluding humans) is permitted as a live vaccine for pathogenicity.
  • a method for producing a live vaccine against HAstV hereinafter also referred to as a method for producing a vaccine of the present invention, in which HAstV, which has lost the ability to proliferate, is obtained as a live vaccine by continuing subculturing until it has decreased to a certain level.
  • the reduction in pathogenicity of HAstV subcultured as described above is brought about by changes in temperature sensitivity, changes in pH sensitivity, or reduction in susceptibility to original infected target cells in HAstV. be.
  • the vaccine production method of the present invention is a method aimed at producing a live HAstV vaccine.
  • the pathogenicity of HAstV is recognized because the virus possesses both the ability to infect and the ability to grow in cells to be infected.
  • a live vaccine against HAstV is obtained by eliminating or reducing the ability to proliferate in human cells while leaving only the ability to infect humans from HAstV, which originally has the ability to infect and proliferate in humans. be able to.
  • the live vaccine against HAstV obtained by the vaccine production method of the present invention eliminates or reduces the pathogenicity in humans of HAstV subcultured in the cultured cells or recombinant animals of the present invention.
  • HAstV The reduction in virulence in production of HAstV is required to be reduced compared to the wild-type strain to the extent that it is acceptable as a live vaccine.
  • This "permissible degree as a live vaccine” means that when administered to humans, symptoms such as diarrhea, vomiting, and abdominal pain when infected with wild-type HAstV are not observed, and in vivo immunity to HAstV is constructed.
  • aspects in which the pathogenicity of HAstV in humans disappears or decreases during subculturing include changes in temperature sensitivity, changes in pH sensitivity, or decreased susceptibility to the same original infected target cells in HAstV. is mentioned.
  • HAstV confirmedation of reduction or disappearance of pathogenicity in subcultured HAstV
  • HAstV to be tested is administered to the recombinant animal of the present invention, and the presence or absence of HAstV infection symptoms is examined. If the infection symptoms are not observed and the desired immune response to HAstV is observed, the above It can be recognized that the virulence of HAstV is reduced (including eliminated) to an "acceptable level for a live vaccine".
  • the pathogenicity of the passaged HAstV is strongly reduced, or whether or not it has disappeared can be confirmed by using the test HAstV It can be done by conducting an infection test of That is, when the human-derived cultured cells are infected with the HAstV to be tested and no proliferation is observed, or when the ability to proliferate is remarkably reduced, the completion of the live vaccine can be determined.
  • the above-mentioned "human-derived cultured cells that are infected and proliferate with HAstV” can be cultured cells of the present invention using human-derived cells.
  • human-derived cultured cells having
  • human-derived cultured cells such as Caco2 cells, which originally have the ability to be infected and proliferate with HAstV, are enhanced by the introduction of the FCGRT receptor gene and / or the B2M gene.
  • the cultured cells of the present invention infected with HAstV or the recombinant animals of the present invention are brought into contact with a substance to be screened, and the cultured cells or recombinant animals of the present invention are infected with HAstV.
  • a screening method for acquiring information on the action of the substance to be screened for HAstV by detecting proliferation By contacting the cultured cells of the present invention or the recombinant animals (excluding humans) of the present invention with a substance to be screened and HAstV, and detecting the growth of HAstV in the cultured cells or recombinant animals, A screening method (the above two methods are hereinafter also referred to as the screening method of the present invention) for obtaining information on the action of the screening target substance on HAstV is provided.
  • the action to be screened is preferably HAstV inactivation action or growth inhibitory action.
  • the present invention immunizes the cultured cells of the present invention or the recombinant animals (excluding humans) of the present invention with a vaccine to be screened, and detects the protective action against HAstV in the cultured cells or recombinant animals.
  • a screening method (hereinafter, also referred to as a vaccine screening method of the present invention) for obtaining information on the action of the screening target vaccine is provided.
  • the present invention provides a genetic set obtained by subjecting the cultured cells of the present invention or the recombinant animals of the present invention (excluding humans) to wild-type HAstV and predetermined genetic modifications using techniques such as reverse genetics. Recombinant HAstV is attempted to infect each individual group, and the Astrovirus infection mode in the genetically modified mammalian cultured cell group or the genetically modified mammalian group before and after the infection is associated with the genetic modification.
  • an information acquisition method also referred to as an information acquisition method of the present invention for acquiring information received.
  • the "aspect of astrovirus infection” that constitutes the information acquired in the information acquisition method of the present invention refers to attempts to infect the cultured cells or recombinant animals of the present invention with HAstV, which has undergone a predetermined genetic modification,
  • HAstV which has undergone a predetermined genetic modification
  • the ratio of the number of infected cells to the number of test cells, the number of HAstV introduced into each infected cell, the growth rate of HAstV introduced, the degree of cells, etc. are exemplified.
  • the presence/absence, content, and degree of symptoms of HAstV infection are exemplified.
  • a solid-phase carrier carrying an acceptable B2M protein or an FCGRT receptor protein in which a partial modification of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is allowed, wherein the solid-phase carrier has binding ability to HAstV. (hereinafter also referred to as the solid phase carrier of the present invention).
  • Partial modification of the amino acid sequence refers to substitution, deletion, or insertion of part of the reference amino acid sequence. The modification is permissible as long as the receptor protein with the modified amino acid sequence has the ability to bind to HAstV, and is not particularly limited. Modifications of amino acid sequences according to natural occurrences, modifications of amino acid sequences according to genetic polymorphisms, etc. based on information obtained by human genetic analysis are included in the above partial modifications of amino acid sequences. ing.
  • the genetic polymorphism includes a single nucleotide substitution (SNP).
  • SNP single nucleotide substitution
  • the above-mentioned receptor protein supported on a solid phase carrier can be FCGRT receptor protein alone, but the fact that the FCGRT receptor protein and B2M protein are supported as a set in a heterodimeric state indicates that the binding to HAstV Moreover, the presence of both receptors on actual human cells is reproduced, making it suitable for screening substances that act on the cell surface binding ability of HAstV.
  • FCGRT receptor protein and B2M protein can be produced by known methods, specifically genetic engineering methods or chemical synthesis methods. It is also possible to produce all of these receptor proteins together, or to produce each part separately and then combine the parts with each other by a chemical modification method. Binding between polypeptides via a linker can be achieved by binding lysine residues or cysteine residues in each polypeptide with a linker having a succinimide group or a maleimide group.
  • a nucleic acid encoding all or part of the FCGRT receptor protein or B2M protein to be produced is transformed into host cells such as E. coli, yeast, insect cells, animal cells, or E. coli. It can be expressed in a cell-free expression system such as an extract, rabbit reticulocyte extract, or wheat germ extract. Expression vectors incorporating these nucleic acids can be used according to each expression system. For example, pET for E. coli expression, pAUR for yeast expression, pIEx-1 for insect cell expression, animal cell Examples include pBApo-CMV for expression and pF3A for wheat germ extract expression.
  • the chemical synthesis method it is possible to use a known peptide chemical synthesis method. That is, it is possible to produce all or part of the conjugated protein of the present invention using liquid-phase peptide synthesis or solid-phase peptide synthesis, which have been established as conventional methods. Further, the solid-phase peptide synthesis method, which is generally recognized as a suitable chemical synthesis method, can also use the Boc solid-phase method or the Fmoc solid-phase method. It is also possible to use In addition, individual amino acids can be produced by known methods, and commercially available products can also be used.
  • the shape, size, material, and form of the solid phase carrier are not particularly limited as long as they can support all or part of the FCGRT receptor protein or B2M protein.
  • Materials include, but are not limited to, nonwoven fabric, filter paper, glass, glass fiber, nitrocellulose filter, polyethersulfone filter, nylon filter, polyvinylidene fluoride filter, and porous materials (silica, etc.). , may be singular or compounded.
  • the shape includes, but is not limited to, plate-like, perforated plate, spherical, amorphous, rod-like, elongated, and the like.
  • Insoluble carrier particles such as latex particles, silica particles, and metal colloids can also be used as solid phase carriers.
  • the FCGRT receptor protein and the B2M protein, or the FCGRT receptor protein are supported on a solid phase carrier, so that HAstV binds to the receptor protein, and the binding is
  • the main point is that it serves as a detection index for HAstV in the detection target.
  • the present invention involves contacting an object to be detected for HAstV with the solid-phase carrier of the present invention, and detecting HAstV in the object using the binding of HAstV to the receptor supported on the solid-phase carrier as a signal.
  • a detection method (hereinafter also referred to as the detection method of the present invention) is provided.
  • the object to be detected for HAstV in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as the presence of HAstV poses a problem. exemplified. Examples include preparations such as feces, vomit, food and drink, river water, and sewage, as well as washing water for clothes, furniture surfaces, and the like.
  • the binding signal of HAstV to the receptor is not particularly limited as long as it is a means capable of detecting HAstV captured by the receptor supported by the solid phase carrier of the present invention.
  • a highly sensitive ELISA-based measurement method such as a competitive method, a method of measuring binding of two molecules such as Alphascreen, a method of detecting a change in mass due to binding of two molecules such as Biacore, a method of detecting a change in mass due to binding of two molecules such as Biacore, Examples include a method of detecting change.
  • the solid-phase carrier of the present invention, HAstV, and a substance to be screened are allowed to coexist in a liquid phase, and the binding of HAstV to the receptor supported on the solid-phase carrier is used as a signal, HAstV is quantified, and the quantified value is compared with the quantified value obtained when the screening target substance is excluded in the quantification system, thereby screening the binding of HAstV to the receptor in the screening target substance.
  • Screening methods also referred to as binding screening methods of the invention are provided.
  • the substance to be screened in the binding screening method of the present invention is preferably a substance that inhibits the binding of HAstV to the FCGRT receptor protein and B2M protein, or to the FCGRT receptor protein on the solid phase carrier of the present invention.
  • Methods for quantifying binding signals include ELISA, sandwich method, competitive method, etc., ELISA-based highly sensitive measurement methods, methods for measuring binding of two molecules such as Alphascreen, and two-molecule binding methods such as Biacore. Examples include a method of detecting a change in mass due to molecular binding, a method of detecting a change in charge, and the like.
  • recombinant mammalian cultured cells and recombinant mammals endowed with human astrovirus (HAstV) infectivity and proliferation ability are provided, and the recombinant mammalian cultured cells and recombinant mammals are used.
  • Methods of producing HAstV and live vaccines of HAstV are provided.
  • a method of screening test substances and vaccines for HAstV action using the above recombinant mammalian cultured cells and recombinant mammals Also provided is a method for obtaining information that associates gene modification of HAstV with pathogenicity.
  • the present invention provides a solid-phase carrier carrying a receptor protein that binds to HAstV by a mechanism similar to that on the cell surface. Also provided are a method of detecting HAstV in a test subject and a method of screening for a substance having an effect on the binding of HAstV to the above-mentioned receptor, using the solid-phase carrier.
  • FIG. 1-A is a control with actin.
  • 1 is a drawing showing the results of examination of HAstV-1 infection susceptibility in Caco-2 cells by knocking out the FCGRT gene and B2M gene.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of examination of susceptibility to HAstV-4 infection in Caco-2 cells by knocking out the FCGRT gene and B2M gene.
  • FIG. 2 shows the results of changes in HAstV-1 RNA levels in Caco-2 cells in which the FCGRT gene and B2M gene were knocked out.
  • Fig. 3 shows the results of changes in the amount of HAstV-4 RNA in Caco-2 cells in which the FCGRT gene and B2M gene were knocked out.
  • Knockout of FCGRT protein expression in human intestinal organoids (SI1) in which the FCGRT gene was knocked out (Fig. 4-B)
  • FIG. 4-C knockout of B2M protein expression in human intestinal organoids (SI1) in which the B2M gene was knocked out
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of examination of susceptibility to HAstV infection in human intestinal organoids by knocking out the FCGRT gene and B2M gene.
  • FIG. Fig. 3 shows the results of changes in the amount of HAstV-1 RNA in human intestinal organoids in which the FCGRT gene and B2M gene were knocked out.
  • Fig. 3 shows the results of changes in the amount of HAstV-4 RNA in human intestinal organoids in which the FCGRT gene and the B2M gene were knocked out.
  • Schematic diagram showing steps for introduction of FCGRT gene and B2M gene into MDCK cells by lentivirus.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of Western blotting examination of the expression of the corresponding proteins in MDCK cells transfected with the FCGRT gene, the B2M gene, and the FCGRT gene and the B2M gene.
  • Fig. 9 shows the results of examining HAstV-1 (Fig. 9-A) and HAstV-4 (Fig. 9-B) for the amount of HAstV-RNA in the culture supernatant of candidate gene-introduced MDCK cells.
  • FIG. 2 is a drawing showing the steps of analyzing the binding between HAstV particles and heterodimers of FCGRT protein and B2M protein by ELISA.
  • HAstV receptors were identified using Caco-2 cells, which are susceptible to HAstV infection, HAstV-1, which has a large number of cases among MAstV1 types, and HAstV-4.
  • EMEM Minimum Essential Medium Eagle
  • Anti-Rabbit antibody (abcam, ab75853, derived from Rabbit) and anti-Goat antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-2020, derived from Goat) were used as secondary antibodies and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Chemi-Lumi One L (nacalai tesque, 07880-54) was used as a coloring solution.
  • Virus strain HAstV-1 (VR-1936 TM ) purchased from ATCC (the American Type Culture Collection) and stored at the Kitasato Research Institute Omura Satoshi Memorial Institute Viral Infection Control Laboratory (Katayama Laboratory) HAstV-4 was used. These were infected with Caco-2/Cas9, 1% NEAA, 1% Na pyruvate, 1% Anti-Anti, 20 mM Hepes (1 mol / l-HEPES Buffer Solution: nacalai tesque, 17557-94) was added. The cells were cultured under the conditions of 37° C. and 5% CO 2 using EMEM (to which the above was added, hereinafter referred to as EMEM( ⁇ )).
  • HAstV indicates both HAstV-1 and HAstV-4 above.
  • Virus Infection and Culture Caco-2 cells cultured in EMEM(+) and made to be 80% confluent in a collagen-coated flask or well plate were infected with HAstV.
  • HAstV was suspended in EMEM(-) to which Trypsin IX-S (Sigma, T0303-1G) was added at 10 ⁇ g/ml for virus activation treatment, and incubated at 37° C. under 5% CO 2 conditions for 1 hour.
  • 10% FBS was added before use for infection.
  • FBS was similarly added to a virus solution that had not been subjected to activation treatment in order to prepare the conditions.
  • Trypsin IX-S was added to EMEM(-) at 5 ⁇ g/ml.
  • HAstV Infection After Activation Treatment and Cultivation under Addition of Trypsin Caco-2 cells were washed with PBS( ⁇ ) to remove serum, and cultured in EMEM( ⁇ ) at 37° C. under 5% CO 2 conditions for 1 hour. .
  • the activated virus solution was added to the cells and infected for 1 hour at 37° C., 5% CO 2 conditions. After 1 hour, the cells were washed with PBS(-) and cultured in trypsin-added EMEM(-) for 6 days.
  • HAstV Infection After Activation Treatment and Cultivation Without Addition of Trypsin Viruses were infected in the same manner as in (4-1) above, and after washing Caco-2 cells, they were cultured in EMEM(-) for 6 days.
  • Non-activated HAstV infection and culture without Trypsin addition Serum was removed from Caco-2 cells, HAstV was suspended in non-activated virus solution (EMEM (-) without Trypsin added, 37 ° C., 5 % CO2 for 1 hour) was added to the cells and infected for 1 hour at 37°C, 5% CO2 . After 1 hour, the cells were washed with PBS(-) and cultured in EMEM(-) for 6 days.
  • EMEM (-) non-activated virus solution
  • HAstV Infection with Inactivated HAstV and Culture under Addition of Trypsin Prior to activation, HAstV was inactivated by heat treatment. In the preliminary test, three types of viruses were infected: untreated, 60°C for 5 minutes, and 10 minutes, but virus RNA replication was confirmed even at 60°C for 10 minutes, so in this test, 60°C for 15 minutes. , inactivated by heat treatment for 30 min. Inactivated HAstV and untreated HAstV were infected in the same manner as in (4-1) above, and cultured for 6 days.
  • HAstV Infection and Culture of Human Intestinal Organoid Human intestinal organoids (SI1) cultured in ENRA (*1) and confluent in a 96-well plate were infected with HAstV.
  • SI1 was used as a control against SI1/FCGRT KO and SI1/B2M KO in which the FCGRT gene and B2M gene were knocked out, respectively.
  • Cells were infected with activated HAstV for 1 hour at 37° C., 5% CO 2 . After 1 hour, cells were washed with 3+ (*2), fresh ENRA was added and cultured for 3 days.
  • EGF EGF
  • B27 Invitrogen, #17504-044
  • 10 nM Gastrin Sigma-Aldrich, G9145-1MG
  • 10% Noggin Peprotech, 250 -38
  • 3+ with 10% R-spondine R&D, #4645-RS
  • 1 mM nAc Sigma-Aldrich, A9165-5G
  • 0.5 ⁇ M A83 Tocris, #2939)
  • NucleoSpin (registered trademark) 8 virus (MACHEREY-NAGEL, 740643.5) was used to extract RNA from 100 ⁇ l of culture supernatant with 100 ⁇ l of Elution Buffer.
  • HAstV genomic RNA Extraction of HAstV genomic RNA in cells
  • Cells on day 0 after infection (day 0), culture day 3 (day 3), culture day 6 (day 6) were used as samples, and HAstV genomic RNA in infected cells was extracted at n 3.
  • NucleoSpin® RNA (MACHEREY-NAGEL, 740955.50) was used to extract 60 ⁇ l of RNA from 1 well of a 24-well plate.
  • cDNA from HAstV Genomic RNA 10 ⁇ l of cDNA was prepared from 5 ⁇ l of the RNA extracted in (5, 6) above using SuperScript TM III Reverse Transcriptase (Invitrogen, 18080-085). The HAstV-specific primer described in (9) below was used as the reverse primer.
  • HAstV genomic RNA was quantified by qPCR using THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix (TOYOBO, QPX-201). For each sample, 10 ⁇ l of THUNDERBIRD (registered trademark) Next SYBR (registered trademark) qPCR Mix, 6 pmol of Forward Primer (below: 9), 6 pmol of Reverse Primer (below: 9), and 2 ⁇ l of cDNA were added to make a total of 20 ⁇ l. was added with sterile water. A PCR fragment was used as a standard for quantifying HAstV genomic RNA.
  • cDNA derived from HAstV genomic RNA was amplified by PCR, and the genome copy number in the solution was calculated based on the concentration measured with Qubit TM dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, Q32850).
  • HAstV Primers In this test, the following primers common to HAstV-1 and HAstV-4 were used.
  • the nucleotide sequence of the forward primer shown in Table 1 below is SEQ ID NO: 5
  • the nucleotide sequence of the reverse primer is SEQ ID NO: 6.
  • FCGRT gene and the B2M gene are known to form heterodimers of expressed receptor proteins and are expressed on the cell surface, and function as receptors for HAstV. Because of this possibility, we conducted a more detailed verification. That is, the FCGRT gene and gRNA of the B2M gene were introduced into Caco-2/Cas9, single cell cloning was performed, and knockout cells of the FCGRT gene and B2M gene were established.
  • Fig. 1-A shows the results of reacting with an anti-actin antibody as a primary antibody and then reacting with an anti-Goat antibody as a secondary antibody.
  • Figure 1-B shows the results of reacting with an anti-FCGRT protein antibody as a primary antibody and then reacting with an anti-Rabbit antibody as a secondary antibody.
  • Figure 1-C shows the results of reacting with an anti-B2M protein antibody as a primary antibody and then reacting with an anti-rabbit antibody as a secondary antibody.
  • HAstV Changes in susceptibility to HAstV infection by knocking out the FCGRT gene and B2M gene
  • HAstV (as described above, The cells were infected with HAstV-1 and HAstV-4), and the cell morphology and the amount of viral RNA replication were observed. Since HAstV is said to become infectious particles when activated by Trypsin, Caco-2 was infected with Trypsin-activated virus and cultured for 6 days in a medium with or without Trypsin. The results are shown in Figures 2-1 and 2-2.
  • FIG. 2-1 relates to HAstV-1
  • FIG. 2-2 relates to HAstV-4. Both figures show micrographs of cells before infection and cells on days 3 and 6 after culture of infection.
  • HAstV RNA levels in FCGRT and B2M gene-knocked out cells After HAstV is replicated in cells and viral particles are assembled, it is released outside the cells and then activated by Trypsin to become mature viruses. ing. Therefore, in this study, the virus was activated with Trypsin prior to infection in order to efficiently infect HAstV. In addition, Trypsin was added to the culture medium and cultured so that trypsin could activate the new virus released extracellularly during the 6-day culture.
  • RNA is extracted from the collected culture supernatant, cDNA is prepared, RT - The quantified value by PCR was used as the desired amount of RNA.
  • Caco-2/Cas9, Caco-2/Cas9/FCGRT KO, and Caco-2/Cas9/B2M KO were seeded on a collagen-coated 24-well plate to construct a HAstV infection system.
  • This HAstV infection system was infected with HAstV-1 at a concentration of 6.84 ⁇ 10 4 / ⁇ l of RNA and with HAstV-4 at a concentration of 4.29 ⁇ 10 3 / ⁇ l.
  • the culture solution the new medium after infection and washing was cultured on day 0 (day0), and then cultured for 6 days. They were harvested and their RNA content was quantified.
  • Table 2-1 and Figure 3-1 for HAstV-1 and Table 2-2 and Figure 3-2 for HAstV-4 The results are shown in Table 2-1 and Figure 3-1 for HAstV-1 and Table 2-2 and Figure 3-2 for HAstV-4.
  • FIGS. 3-1 and 3-2 the common logarithms were calculated from the amounts of RNA shown in Tables 2-1 and 2-2, respectively, and their averages and standard deviations were obtained.
  • the vertical axis of the graph represents the HAstV RNA copy number present per 1 ⁇ l of the culture supernatant.
  • day 0 the average values on day 0 of infection
  • day 3 day 3
  • day 6 day 6 of culture
  • Error bars are calculated standard deviations.
  • “A” as a knockout (KO) target indicates the FCGRT gene
  • "B” indicates the B2M gene.
  • RNA copy number of Caco-2/Cas9 was amplified to about 1000-fold on day 0 after 3 days of culture, reaching a peak. After 6 days, no significant difference was observed from that after 3 days.
  • Caco-2/Cas9/FCGRT KO after 3 days of culture, the amount of RNA was amplified to about 100-fold after 0 days, but did not reach the peak. After 6 days of culture, RNA was further amplified from the 3rd day and reached about 1000-fold compared to the 0th day, similar to Caco-2/Cas9.
  • Caco-2/Cas9/B2M KO also gave generally similar results to Caco-2/Cas9/FCGRT KO.
  • Caco-2/Cas9 peaked after 3 days of culture, with the amount of RNA amplified to 100,000-fold or more on day 0. No significant difference was observed after 6 days of culture and after 3 days.
  • Caco-2/Cas9/FCGRT KO after 3 days of culture, the amount of RNA was amplified to about 100-fold on day 0, but did not reach its peak. After 6 days of culture, RNA was further amplified from the 3 day time point, reaching approximately 10000-fold compared to day 0, but not after 6 days of Caco-2/Cas9.
  • Caco-2/Cas9/B2M KO after 3 days the amount of RNA was amplified to about 10-fold on day 0, but did not reach the peak. After 6 days, the amount of RNA reached about 10000-fold compared to day 0, but as with Caco-2/Cas9/FCGRT KO, it was less than after 6 days of Caco-2/Cas9.
  • HAstV infection of human intestinal organoids and quantification of genomic RNA 3-1 Establishment of Knockout Cells It is known that HAstV infects and proliferates in human intestinal organoids (SI1). SI1 is a cell established from intestinal stem cells, and can be differentiated into epithelial or goblet cells by inducing differentiation in vitro. Also in this human intestinal organoid (SI1), knockout cells were established to evaluate whether the FCGRT gene and B2M gene are involved in HAstV infection susceptibility. For knockout, SI1/FCGRT KO in which the FCGRT gene was knocked out and SI1/B2M KO in which the B2M gene was knocked out were obtained using the same method as for Caco2 cells described above.
  • FIGS. 4-A and B were originally one membrane, cleaved at about 30 kDa after protein transcription, and reacted with different antibodies.
  • Fig. 4-A shows the results of reacting with an anti-Goat antibody as a secondary antibody after reacting with an anti-actin antibody as a primary antibody.
  • Figure 4-B shows the results of reacting with an anti-FCGRT protein antibody as a primary antibody and then reacting with an anti-Rabbit antibody as a secondary antibody.
  • Fig. 4-C shows the results of reacting with an anti-B2M protein antibody as a primary antibody and then reacting with an anti-rabbit antibody as a secondary antibody.
  • FIG. 5 shows micrographs of HAstV-infected SI1, SI1/FCGRT KO, and SI1/B2M KO on day 0 of infection (day 0) and day 3 of culture (day 3).
  • HAstV infection system was infected with HAstV-1 at a concentration of 4.32 ⁇ 10 5 / ⁇ l of RNA and with HAstV-4 at a concentration of 5.24 ⁇ 10 6 / ⁇ l.
  • SI1 infected with HAstV-1 the copy number of HAstV RNA after 3 days of culture was amplified about 1000-fold on day 0 of infection.
  • SI1/FCGRT KO the amount of RNA was amplified about 100-fold on the third day of culture.
  • the SI1/B2M KO was also amplified about 100-fold like the SI1/FCGRT KO.
  • SI1 infected with HAstV-4 the copy number of HAstV RNA on day 3 of culture was amplified to about 100-fold on day 0 of infection.
  • SI1/FCGRT KO the amount of RNA was amplified about 10-fold on the third day of culture.
  • the SI1/B2M KO was also amplified about 10-fold like the SI1/FCGRT KO.
  • FCGRT receptor and B2M may be HAstV infection receptors, and since these receptors form heterodimers, they may function as the infection receptors in conjunction with each other. was taken.
  • MDCK cells purchased from ATCC
  • MEM medium at 37° C. and 5% CO 2 until confluent.
  • seeded on a 6-well plate cultured until confluent again, added with the above lentiviral vector, and recombined lentivirus using the drug resistance of the introduced lentivirus at 37 ° C., 5% CO 2 , That is, cells into which the gene of interest was introduced were selected (step 4-5).
  • Gene transfer was carried out in three patterns of FCGRT gene only, B2M gene only, and both FCGRT gene and B2M gene to obtain respective cells.
  • step 5 The cells selected in step 5 were scaled up and cultured under the condition that a drug for cell selection was added, and the proliferated cells were stocked (step 6).
  • the blot images in FIG. 8 are, from the left, MDCK cells, MDCK cells introduced with the FCGRT gene, MDCK cells introduced with the B2M gene, MDCK cells introduced with both the FCGRT gene and the B2M gene, Caco-2/Cas9 cells ( control). From FIG. 8, it became clear that each target gene was expressed in each gene-introduced cell.
  • each recombinant MDCK cell was seeded in 24 wells, serum-free medium was added and cultured overnight at 37°C and 5% CO 2 , then the cells were washed with PBS (-), A serum-free medium was added and the cells were cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 1 hour.
  • HAstV HAstV-1, HAstV-4
  • trypsin at 37° C. for 1 hour
  • the serum-free medium was removed, the activated HAstV solution was added, culture was carried out at 37° C., 5% CO 2 , the virus solution was removed, and the cells were washed with PBS( ⁇ ).
  • HAstV-1 was infected at a concentration of 6.84 ⁇ 10 4 / ⁇ l of RNA, and HAstV-4 was infected at a concentration of 4.29 ⁇ 10 3 / ⁇ l.
  • FIG. 9-A shows the results for HAstV-1
  • FIG. 9-B shows the results for HAstV-9.
  • "A” indicates introduction of the FCGRT gene
  • "B” indicates introduction of the B2M gene.
  • MDCK cells MDCK cells introduced with the FCGRT gene
  • MDCK cells introduced with the B2M gene MDCK cells introduced with both the FCGRT gene and the B2M gene
  • Caco-2 / Cas9 cells control.
  • the adjacent left side indicates day 0 of infection (d0)
  • the adjacent right side indicates 6 days after culture (d6).
  • MDCK/FCGRT was amplified 100-fold, while no significant difference was observed in MDCK/B2M, and approximately 1000-fold amplification was observed in MDCK/FCGRT/B2M.
  • FCGRT receptor protein and B2M protein form a heterodimer and are a type of membrane protein present on the cell surface.
  • the B2M protein improves the stability of itself and the FCGRT receptor protein by forming a heterodimer with the FCGRT receptor protein, and this heterodimer structure greatly contributes to the acquisition of HAstV infectivity.
  • HAstV particles were immobilized at 600 ng/well on a 96-well plate, and serially diluted heterodimers of recombinant FCGRT protein and B2M protein (ECD, His & AVI Tag) were seeded at 12 ⁇ g/ml at 50 ⁇ l/well, The proteins bound to the virus particles were bound with an HRP-labeled anti-histidine tag antibody to develop a color, and measured at 450 nm to measure the concentration-dependent binding amount of the heterodimer to HAstV. Since the recombinant receptor protein described above is produced by expressing it in HEK293 cells (derived from human embryonic kidney), the FCGRT protein and the B2M protein exist as heterodimers.
  • FIG. 11 shows the concentration dependence of HAstV (HAstV-1: FIG. 11-A (left), HAstV-4: FIG. 11-B (right)) on the heterodimer of FCGRT protein and B2M protein observed by ELISA.
  • Fig. 10 is a drawing showing an increase in the amount of binding between The horizontal axis is the concentration of the heterodimer. Both HAstV-1 and HAstV-4 showed an increase in absorbance with an increase in the concentration of the heterodimer, and the heterodimer of FCGRT protein and B2M protein was found to bind to HAstV particles in a concentration-dependent manner. rice field.
  • FCGRT protein is a HAstV receptor alone, but when combined with the B2M protein to form a heterodimer, both receptor proteins obtain structural stability, and the heterodimer Dimers were shown to confer de novo HAstV sensitivity to HAstV-insensitive cells in the most favorable manner.

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Abstract

本発明は、ヒトアストロウイルス（ＨＡｓｔＶ）のレセプター分子を同定し、ＨＡｓｔＶの感染制御手段開発のための途を提供することを課題とし、本発明者らはＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とＢ２Ｍタンパク質が、ＨＡｓｔＶのレセプター分子であることを突き止めた。そして、これらのＨＡｓｔＶレセプター分子をコードする遺伝子を導入した組換え哺乳動物細胞や組換え哺乳動物、さらにこれらを用いたウイルスの生産方法、薬剤のスクリーニング方法等を提供し、さらに、これらのＨＡｓｔＶレセプター分子を固定した固相担体を用いたＨＡｓｔＶの検出方法や薬剤のスクリーニング方法等を提供することに成功した。

Description

ヒトアストロウイルスの感染レセプターとその応用
　本発明は、ウイルスの細胞感染機構とその応用に関する発明である。さらに具体的には、主要な胃腸炎ウイルスの一つであるヒトアストロウイルスの感染レセプターと、その応用に関する発明である。
　ヒトに感染するアストロウイルス（Ｈｕｍａｎ　Ａｓｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ：ＨＡｓｔＶ）は、アストロウイルス科に属する、約７１００－７６００塩基のプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスである。主に生後５－６ヶ月以降、５歳以下の乳幼児に感染し、急性胃腸炎を起こす。さらに成人にも感染し、大規模なウイルス性食中毒事件を引き起こすこともある。ＨＡｓｔＶは、厚生労働省の流行予測事業におけるウイルス性胃腸炎の病原ウイルスとして、ノロウイルス、ロタウイルスに次ぎ、サポウイルスと並び報告頻度が第３位である。
　ＨＡｓｔＶは、ヒトからヒトへ糞口経路で感染するが、汚染された飲食物を感染源として集団発生を起こすこともある。食品を介しての感染は、ＨＡｓｔＶを保有するカキ・アオヤギなどの二枚貝や飲料水が原因と考えられており、ＨＡｓｔＶの感染に必要なウイルス粒子数は、１００個以上とされている。アストロウイルス粒子はｐＨ３で安定しており、さまざまな界面活性剤（非イオン性、陰イオン性、双性イオン性）およびクロロホルムを含む脂質溶媒に耐性がある。また、ＨＡｓｔＶは６０℃で５分の加熱処理では感染性を維持するが、１０分の加熱処理では不活化される。
　ＨＡｓｔＶは感染後２－３日で下痢、嘔吐、腹痛などの症状を呈して発症し、症状は約４日間持続する。また、感染しても症状の見られない不顕性感染もあるが、免疫不全患者ではより重篤な症状が見られる。健常児の患者におけるＨＡｓｔＶの排出は、病状が改善し無症状となった状態でも数週間持続する場合がある。一方、免疫抑制状態者の場合では持続的なウイルスの排出が発生する可能性がある。
Willcocks MM, Brown TD, Madeley CR, et al.Thecomplete sequence of a human astrovirus. J Gen Virol 1994;75(Pt7):1785-1788. Carlos F. Arias and Rebecca M. DuBois.TheAstrovirus Capsid: A Review Viruses 2017, 9, 15;doi:10.3390/v9010015www.mdpi.com/journal/viruses
　ヒトアストロウイルス（本明細書において、ＨＡｓｔＶともいう）は、ヒト結腸腺癌の連続細胞株であるＣａｃｏ２で増殖培養可能なため(非特許文献１)、ウイルスの複製機構に関する研究が進んでおり、本発明者の一人である中西によりプラスミドベースのリバースジェネティックス系も構築されている。しかし、ＨＡｓｔＶのレセプター分子は未だ発見されておらず、細胞への接着、侵入、脱核など、複製の初期ステップは明らかにされていない。さらにＨＡｓｔＶのワクチン、治療薬、効率的なＨＡｓｔＶの検出手段などは未だ開発されておらず、レセプター分子の同定は、ＨＡｓｔＶの感染制御法開発のために極めて重要である。
　本発明者らは、上記の課題を受けて、ＨＡｓｔＶのレセプター分子の本態についての解明を目指して鋭意検討を行った。その結果、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とＢ２Ｍタンパク質が、ＨＡｓｔＶのレセプター分子であることを突き止めた。さらに詳細には、哺乳動物の細胞表面上において、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質単独であっても良いが、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とＢ２Ｍタンパク質は互いに組としてヘテロダイマーを形成し、該ヘテロダイマーとしての形態が、ＨＡｓｔＶのレセプター機能を最も良好に発揮する形態であることを見出した。そしてＢ２Ｍタンパク質は、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質におけるＨＡｓｔＶのレセプター機能を補助する働きを担っていることを見出した。
　ＦＣＧＲＴ遺伝子は、胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＦｃＲｎ）をコードしている。ＦＣＧＲＴ受容体は、ＭＨＣ１分子と構造が似ており、ＭＨＣ１分子と同様に、細胞表面上でβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヘテロダイマーを形成している。「胎児性Ｆｃ受容体」は、胎児に母親からのＩｇＧを供給するために胎盤で発現していることからこのように名付けられている。しかしながら、成人においても様々な組織においてＦｃＲｎは発現していることがわかり、その主な機能として細胞内に取り込まれたＩｇＧを再度血漿中に戻すことで血漿中のＩｇＧの半減期をのばしていることが判明している。上記のように、Ｂ２Ｍは、細胞表面上においてＦＣＧＲＴ受容体とヘテロダイマーを形成していることと共に、Ｆｃ受容体の一部を構成している。すなわち、Ｆｃ受容体は、２本のポリペプチド鎖（α鎖とβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ））から構成されており、これらの２つの鎖は、Ｂ２Ｍとα３ドメイン間の相互作用によって、非共有結合的に連結されていることが知られている。
　ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子の塩基配列（NM_001136019：配列番号１）は、
「atgggggtcccgcggcctcagccctgggcgctggggctcctgctctttctccttcctgggagcctgggcgcagaaagccacctctccctcctgtaccaccttaccgcggtgtcctcgcctgccccggggactcctgccttctgggtgtccggctggctgggcccgcagcagtacctgagctacaatagcctgcggggcgaggcggagccctgtggagcttgggtctgggaaaaccaggtgtcctggtattgggagaaagagaccacagatctgaggatcaaggagaagctctttctggaagctttcaaagctttggggggaaaaggtccctacactctgcagggcctgctgggctgtgaactgggccctgacaacacctcggtgcccaccgccaagttcgccctgaacggcgaggagttcatgaatttcgacctcaagcagggcacctggggtggggactggcccgaggccctggctatcagtcagcggtggcagcagcaggacaaggcggccaacaaggagctcaccttcctgctattctcctgcccgcaccgcctgcgggagcacctggagaggggccgcggaaacctggagtggaaggagcccccctccatgcgcctgaaggcccgacccagcagccctggcttttccgtgcttacctgcagcgccttctccttctaccctccggagctgcaacttcggttcctgcggaatgggctggccgctggcaccggccagggtgacttcggccccaacagtgacggatccttccacgcctcgtcgtcactaacagtcaaaagtggcgatgagcaccactactgctgcattgtgcagcacgcggggctggcgcagcccctcagggtggagctggaatctccagccaagtcctccgtgctcgtggtgggaatcgtcatcggtgtcttgctactcacggcagcggctgtaggaggagctctgttgtggagaaggatgaggagtgggctgccagccccttggatctcccttcgtggagacgacaccggggtcctcctgcccaccccaggggaggcccaggatgctgatttgaaggatgtaaatgtgattccagccaccgcctga」であり、
　ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質のアミノ酸配列（NM_001136019：配列番号２）は、
「mgvprpqpwalglllfllpgslgaeshlsllyhltavsspapgtpafwvsgwlgpqqylsynslrgeaepcgawvwenqvswywekettdlrikeklfleafkalggkgpytlqgllgcelgpdntsvptakfalngeefmnfdlkqgtwggdwpealaisqrwqqqdkaankeltfllfscphrlrehlergrgnlewkeppsmrlkarpsspgfsvltcsafsfyppelqlrflrnglaagtgqgdfgpnsdgsfhasssltvksgdehhyccivqhaglaqplrvelespakssvlvvgivigvllltaaavggallwrrmrsglpapwislrgddtgvllptpgeaqdadlkdvnvipata」である。
　また、Ｂ２Ｍ遺伝子の塩基配列（NM_004048：配列番号３）は、
「atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatgtaa」であり、
　Ｂ２Ｍタンパク質のアミノ酸配列（NM_004048：配列番号４）は、
「Msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm」である。
　ただし、上記の塩基配列（配列番号１，３）ないしアミノ酸配列（配列番号２，４）はヒトゲノムに係る配列であり、当然、ナチュラルオカーエンスによる変更配列や、遺伝子多型による変更配列が存在する。該遺伝子多型は、一塩基置換（ＳＮＰ）を含むものである。本発明におけるＦＣＧＲＴ受容体をコードする遺伝子、Ｂ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質、及びＢ２Ｍタンパク質は、これらの変更配列を含むものである。
　本発明には第１に、ＦＣＧＲＴ受容体をコードする遺伝子（ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子又はＦＣＧＲＴ遺伝子）及び／又はＢ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子（Ｂ２Ｍ遺伝子）を用いる態様が有り（第１の態様）；
　第２に、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質（ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質又はＦＣＧＲＴタンパク質）及び／又はＢ２Ｍタンパク質（Ｂ２Ｍタンパク質）を用いる態様（第２の態様）が有る。
　アストロウイルスゲノムの一般的な構造は、５’末端に非構造タンパク質をコードするＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂがあり、３’末端に構造タンパク質をコードするＯＲＦ２がある。この配置は、カリシウイルスのゲノム構造に似ている。ただし、ポリタンパク質のサイズ・数・プロセッシング、ＲＮＡヘリカーゼドメイン、リボソームのフレームシフトメカニズム等の特色における違いがある。従って、アストロウイルスはカルシウイルス等とは別のウイルスファミリーであるアストロウイルス科に分類されている。アストロウイルス科のウイルスは、ヒトやその他の多くの動物種から分離されており、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ : International Committee on Taxonomy of Viruses）によって、ウイルスキャプシドの完全長ポリペプチド配列を用いた分子系統解析により、ヒトを含む哺乳類に感染する哺乳類アストロウイルス（ＭＡｓｔＶ：Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）と、鳥類から分離されたアストロウイルス（Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）の２つの属に分類されている。そして、ＭＡｓｔＶは、更にＭａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩとIIの２つの遺伝子グループ細分化され、Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓも同様に２つの遺伝子グループに細分化された。さらにこれらの遺伝子グループは、複数の遺伝子型に細分化されていた。しかし、２０２０年のＩＣＴＶレポートによると、これらのアストロウイルスにおける遺伝子グループ、遺伝子型の分類は廃止され、再整理が行われた。すなわち、アストロウイルス科は、２つのウイルス属（アストロウイルス：Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ、Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）からなるのは変わらないが、上記Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓにおいては１９種類のウイルス種（ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ１－１９）を含み、Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓは３種類のウイルス種（ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ１－３）を含むとされた。つまり、ウイルス属の下に設けられていた、遺伝子グループと遺伝子型を統合することにより、ウイルス種として統一整理がなされたのである。
　ヒトに感染するアストロウイルス（ＨＡｓｔＶ）は、ＭＡｓｔＶに含まれるウイルス種のｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ１に属する、遺伝子型ＨＡｓｔＶ１－８として分類されている（これらの８種の遺伝子型の抗原性は互いに異なっていることから血清型と同義である）。これら８種の遺伝子型の中では、ＨＡｓｔＶ genotype 1（ＨＡｓｔＶ１）の発生が多く認められるが、ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ１からは遺伝子的に離れているｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ６・８・９も、他の遺伝子型と同様にヒトに感染することが、２００８年以降明らかになっている。
　従って、本発明の対象となるヒトアストロウイルス（ＨＡｓｔＶ）は、ヒトに対する感染能を有するアストロウイルスであり、上記のＨＡｓｔＶの１型から８型（genotype：遺伝子型）の全て、及び、ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ６・８・９が含まれる。
（１）本発明の第１の態様
　本発明は、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び配列番号３で表される塩基配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、が組み込まれている遺伝子組換え哺乳動物培養細胞であって、ＨＡｓｔＶの被感染又は増殖能を有する遺伝子組換え哺乳動物培養細胞（以下、本発明の培養細胞ともいう）を提供する。
　さらに本発明は、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び配列番号３で表される塩基配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、が組み込まれている遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）であって、ＨＡｓｔＶの被感染又は増殖能を有する遺伝子組換え哺乳動物（以下、本発明の組換え動物ともいう）を提供する。
　上記の塩基配列の一部改変とは、それぞれ基準となる塩基配列の一部が置換、削除、又は挿入されていることをいう。該改変は、改変された塩基配列の上記受容体遺伝子が組み込まれた遺伝子組換え哺乳動物培養細胞又は遺伝子組換え哺乳動物が、ＨＡｓｔＶの被感染又は増殖能を有する限りにおいて許容され、特に限定されるものではない。ヒトの遺伝子解析によって取得された情報に基づいた、ナチュラルオカーレンスに従った遺伝子改変、遺伝子多型に従った遺伝子改変等は、上記の塩基配列の一部改変の中に含まれている。該遺伝子多型には、一塩基置換（ＳＮＰ）が含まれる。また、当然、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子として、配列番号１で表される塩基配列を用いても良いし、Ｂ２Ｍ遺伝子として、配列番号３で表される塩基配列を用いても良い。
　上記したように、哺乳動物培養細胞又は哺乳動物に組み込まれる遺伝子は、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子単独でも可能であるが、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子を双方組み込まれていることが好適である。
　本発明の第１の態様では、哺乳動物培養細胞又は哺乳動物にＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、が導入されることにより、上記哺乳動物培養細胞又は哺乳動物にＨＡｓｔＶの被感染能又は増殖能が付与されることが要点である。
　上記の遺伝子組換えの対象となる哺乳動物培養細胞の由来は限定されず、ヒト、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、ヒト培養細胞であれば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｃａｃｏ２細胞、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ４０７、マクロファージ系培養細胞１５３１０－ＬＮ細胞、ＮＡＬＭ－６細胞等が挙げられ、マウス培養細胞であれば、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｍ１細胞等が挙げられる。その他、ＢＨＫ細胞（ハムスター由来）、ＣＨＯ細胞（ハムスター由来）、ＣＲＦＫ細胞（ネコ由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ由来）、ＰＫ－１５細胞（ブタ由来）、ＶＥＲＯ細胞（サル由来）、ＣＯＳ７細胞（サル由来）等が挙げられる。哺乳動物培養細胞としては、上記のような株化培養細胞の他に、生検サンプルから誘導されるオルガノイド、不死化誘導細胞、ｉＰＳ細胞等を用いることも可能である。なお、Ｃａｃｏ２細胞のように、元々ＨＡｓｔＶに対する被感染・増殖能を有する細胞であっても、さらに、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び／又はＢ２Ｍ遺伝子を導入することにより、いっそうＨＡｓｔＶの被感染・増殖能を向上させることができる。この場合は、特に両遺伝子が発現後、被感染・増殖能の向上を図る細胞表面上でヘテロダイマーを容易に構成するように、両遺伝子を組として導入することが好適である。なお、コードするアミノ酸配列をＨＡｓｔＶの感染に向けて最適化する変異を導入したＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び／又はＢ２Ｍ遺伝子を導入することにより、さらにいっそうＨＡｓｔＶの被感染・増殖能を向上させることができる。
　哺乳動物培養細胞へのＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、の導入方法は、特に限定されず、常法に従って行われる。典型的には、遺伝子導入を行うためのベクター、すなわち、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、を組み込んだマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスＩ型ベクター、ＨＶＪ－リポソーム等の改変ウイルス性ベクター、哺乳動物培養細胞内で機能するＣＭＶプロモーター、ＧＡＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターを有するプラスミドベクターなどを用いる導入方法が挙げられる。遺伝子の導入には、組換えウイルスベクターの使用の他、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、市販のトランスフェクション試薬、マイクロインジェクション法、スタンポレーション法、パーティクルガン法等を用いることもできる。
　上記の遺伝子組換えの対象となる哺乳動物は、特に限定されず、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル等のヒト以外の哺乳動物が挙げられる。これらの哺乳動物に対する遺伝子組み込み法としては、例えば、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、を組み込んだマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスＩ型ベクター、ＨＶＪ－リポソーム等の改変ウイルス性ベクター、哺乳動物細胞内で機能するＣＭＶプロモーター、ＧＡＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターを有するプラスミドベクターなどを用いて、上記遺伝子を対象哺乳動物に導入し、発現させることができる。
　なお、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子は、常法により確保することがきる。すなわち、これらの遺伝子を含むｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により該遺伝子領域を増幅することにより、容易に上記遺伝子を得ることができる。これを自家で行うことも可能であるが、外注して行うことも可能であり、さらに市販がなされている場合には市販品を用いることも可能である。
　さらに本発明は第１の態様において、下記の方法を提供する。
　＜被感染能の付与方法＞
　本発明は、哺乳動物培養細胞又は哺乳動物（ヒトを除く）に対して、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び配列番号３で表される塩基配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、を導入することにより、遺伝子が組み換えられた上記哺乳動物培養細胞又は哺乳動物における、ＨＡｓｔＶに対する被感染能を付与若しくは増強する、被感染能の付与若しくは増強方法（以下、本発明の付与・増強方法ともいう）を提供する。本発明の培養細胞と本発明の組換え動物（ヒトを除く）は、本発明の付与方法により、ＨＡｓｔＶに対する被感染能が付与若しくは増強された、組換え哺乳動物培養細胞と組換え哺乳動物である。ここでＨＡｓｔＶに対する「被感染能の付与」とは、はじめはＨＡｓｔＶに対する被感染能が無かった哺乳動物培養細胞又は哺乳動物に対して、新たにＨＡｓｔＶに対する被感染能を付与することを意味する。同「被感染能の増強」とは、既にＨＡｓｔＶに対する被感染能が認められる哺乳動物培養細胞又は哺乳動物における、該被感染能を増強することを意味する。
　＜ウイルスの生産方法＞
　本発明は、本発明の培養細胞、又は、本発明の組換え動物（ヒトを除く）に、ＨＡｓｔＶを感染させ、上記培養細胞、又は、組換え動物において、該ＨＡｓｔＶを増殖させる、ＨＡｓｔＶの生産方法（以下、本発明の生産方法ともいう）を提供する。
　さらに本発明は、本発明の培養細胞（ヒト由来の培養細胞を含む）、又は、本発明の組換え動物（ヒトを除く）、におけるＨＡｓｔＶの継代培養を、病原性が生ワクチンとして許容される程度に低下するまで継代を継続し、該増殖能が失われたＨＡｓｔＶを生ワクチンとして取得する、ＨＡｓｔＶに対する生ワクチンの生産方法（以下、本発明のワクチン生産方法ともいう）を提供する。
　上記の継代培養されたＨＡｓｔＶにおける病原性の低下は、ＨＡｓｔＶにおける温度感受性の変化、同ｐＨ感受性の変化、又は、同元来の感染標的細胞への感受性の低下、等によってもたらさせるものである。
　本発明のワクチン生産方法は、ＨＡｓｔＶの生ワクチンの生産を行うことを目的とする方法である。ＨＡｓｔＶの病原性は、該ウイルスが、感染対象細胞における感染能と増殖能を併せ持つことにより認められる。そして、ＨＡｓｔＶに対する生ワクチンは、本来ヒトに対して感染能と増殖能を有するＨＡｓｔＶを、ヒトに対する感染能のみを残して、ヒトの細胞における増殖能を失わせる、若しくは、低下させることによって取得することができる。これを言い換えれば、本発明のワクチン生産方法によって得られるＨＡｓｔＶに対する生ワクチンは、本発明の培養細胞又は組換え動物において継代培養されたＨＡｓｔＶの、ヒトにおける病原性を失わせる、若しくは、低下させることによって取得することができるのである。上記ＨＡｓｔＶの生産における該病原性の低下は、生ワクチンとして許容される程度まで、野生型株に比べて低下していることが求められる。この「生ワクチンとして許容される程度」とは、ヒトに対して投与しても、野生型のＨＡｓｔＶが感染した場合の下痢、嘔吐、腹痛などの症状が認められず、かつ、ＨＡｓｔＶに対する体内免疫が構築されることが確認される程度である。また、継代培養時にＨＡｓｔＶのヒトにおける病原性が消失又は減少する態様としては、ＨＡｓｔＶにおける温度感受性の変化、同ｐＨ感受性の変化、又は、同元来の感染標的細胞への感受性の低下、等が挙げられる。
　本発明のワクチン生産方法における、「継代培養したＨＡｓｔＶにおける病原性の低下又は消失の確認」は、本発明の組換え動物に対する、試験対象のＨＡｓｔＶの感染試験により行うことができる。試験対象のＨＡｓｔＶを、本発明の組換え動物に投与して、ＨＡｓｔＶの感染症状の有無を検討し、該感染症状が認められず、かつ、所望するＨＡｓｔＶに対する免疫反応が認められれば、上記の「生ワクチンとして許容される程度」に、ＨＡｓｔＶの病原性が減少している（消失を含む）と認めることができる。また、特に、継代されたＨＡｓｔＶの病原性が強度に低下したか否か、又は、消失したか否かの確認は、元来ＨＡｓｔＶが感染・増殖するヒト由来の培養細胞における、上記被験ＨＡｓｔＶの感染試験を行うことにより行うことができる。すなわち、該ヒト由来の培養細胞に被験ＨＡｓｔＶを感染させても、増殖が認められない場合、若しくは増殖能力が著しく低下した場合を、生ワクチン完成の指標とすることもできる。上記の「ＨＡｓｔＶが感染、増殖するヒト由来の培養細胞」は、ヒト由来の細胞を用いた本発明の培養細胞を用いることができるが、Ｃａｃｏ２細胞のように、元々ＨＡｓｔＶの被感染、増殖能を有するヒト由来の培養細胞を用いることも可能である。また、Ｃａｃｏ２細胞のような、元々ＨＡｓｔＶの被感染・増殖能を有するヒト由来の培養細胞の、該被感染・増殖能が、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び／又はＢ２Ｍ遺伝子の導入により増強された、本発明の培養細胞を、上記の「ＨＡｓｔＶが感染、増殖するヒト由来の培養細胞」として用いることで、被験ＨＡｓｔＶの病
原性の低下を検出の感度を高めることも可能である。
　＜スクリーニング方法＞
　本発明は、ＨＡｓｔＶを感染させた本発明の培養細胞、又は、本発明の組換え動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象物質を接触させて、上記培養細胞、又は、組換え動物におけるＨＡｓｔＶの増殖を検出することにより、上記スクリーニング対象物質のＨＡｓｔＶに対する作用の情報を取得する、スクリーニング方法；
　本発明の培養細胞、又は、本発明の組換え動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象物質とＨＡｓｔＶを接触させて、上記培養細胞、又は、組換え動物におけるＨＡｓｔＶの増殖を検出することにより、上記スクリーニング対象物質のＨＡｓｔＶに対する作用の情報を取得する、スクリーニング方法（上記２つの方法を、以下、本発明のスクリーニング方法ともいう）を提供する。
　本発明のスクリーニング方法においては、スクリーニング対象作用が、ＨＡｓｔＶの不活化作用、又は、増殖の阻害作用であることが好適である。
　さらに本発明は、本発明の培養細胞、又は、本発明の組換え動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象ワクチンを免疫して、上記培養細胞、又は、組換え動物におけるＨＡｓｔＶに対する防御作用を検出することにより、該スクリーニング対象ワクチンの作用の情報を取得する、スクリーニング方法（以下、本発明のワクチンスクリーニング方法ともいう）を提供する。
　＜本発明の情報取得方法＞
　さらに本発明は、本発明の培養細胞、又は、本発明の組換え動物（ヒトを除く）に、野生型ＨＡｓｔＶと、リバースジェネティックスの技術等を用いて所定の遺伝子改変が行われた遺伝子組換えＨＡｓｔＶを、それぞれ個別の群として感染を試みて、該感染前後の上記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞群、又は、遺伝子組換え哺乳動物群における、アストロウイルスの感染態様と、上記遺伝子改変が関連付けられた情報を取得する、情報の取得方法（本発明の情報取得方法ともいう）を提供する。
　本発明の情報取得方法において取得される情報を構成する「アストロウイルスの感染態様」とは、所定の遺伝子改変が行われたＨＡｓｔＶの、本発明の培養細胞又は組換え動物への感染を試み、例えば、本発明の培養細胞においては、被験細胞数における感染細胞数の割合の多少や、感染細胞毎に導入されたＨＡｓｔＶ数、導入されたＨＡｓｔＶの増殖速度、細胞の程度等が例示され、本発明の組換え動物においては、ＨＡｓｔＶの感染症状の有無・内容・程度が例示される。これらの「感染態様」と、ＨＡｓｔＶの遺伝子改変の内容を関連付けることにより、「ＨＡｓｔＶの病原性の鍵となる遺伝子」を突き止めて、ＨＡｓｔＶ感染症に対する治療薬、治療法、ワクチンを開発するための有益な情報として取得することができる。
（２）本発明の第２の態様
　本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体タンパク質及び配列番号４で表されるアミノ酸配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍタンパク質、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体タンパク質、が担持された固相担体であって、ＨＡｓｔＶに対する結合能を有する固相担体（以下、本発明の固相担体ともいう）を提供する。
　上記のアミノ酸配列の一部改変とは、それぞれ基準となるアミノ酸配列の一部が置換、削除、又は挿入されていることをいう。該改変は、改変されたアミノ酸配列の上記受容体タンパク質が、ＨＡｓｔＶに対する結合能を有する限りにおいて許容され、特に限定されるものではない。ヒトの遺伝子解析によって取得された情報に基づいた、ナチュラルオカーレンスに従ったアミノ酸配列の改変、遺伝子多型に従ったアミノ酸配列の改変等は、上記のアミノ酸配列の一部改変の中に含まれている。該遺伝子多型には、一塩基置換（ＳＮＰ）が含まれる。また、当然、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質として、配列番号２で表されるアミノ酸配列を用いても良いし、Ｂ２Ｍタンパク質として、配列番号４で表されるアミノ酸配列を用いても良い。
　固相担体に担持される上記受容体タンパク質は、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質単独でも可能であるが、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とＢ２Ｍタンパク質がヘテロダイマーの状態で組として担持されていることが、ＨＡｓｔＶとの結合能が良好であること、また、実際のヒトの細胞上での両受容体の存在状態が再現されており、ＨＡｓｔＶの細胞表面結合能に作用する物質をスクリーニングする際に好適である。
　ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とＢ２Ｍタンパク質は、公知の方法、具体的には、遺伝子工学的手法、又は、化学合成法により生産することができる。また、これらの受容体タンパク質全てを一緒に生産することも可能であり、パーツ毎に生産して当該パーツ同士を化学修飾法により事後的に結合させることにより生産することも可能である。リンカーを介したポリペプチド同士の結合は、互いのポリペプチドにおけるリシン残基又はシステイン残基同士を、スクシンイミド基又はマレイミド基を有するリンカーにより結合させる等が可能である。
　遺伝子工学的手法では、生産対象のＦＣＧＲＴ受容体タンパク質又はＢ２Ｍタンパク質の全部又は一部をコードする核酸を、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞を形質転換体として、あるいは大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現させることができる。これらの核酸が組み込まれた発現用ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ－１、動物細胞発現用のｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ、小麦胚芽抽出液発現用のｐＦ３Ａ等が挙げられる。
　化学合成法は、公知のペプチドの化学合成法を用いることが可能である。すなわち、常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて、本発明の複合タンパク質の全部又は一部を製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法も、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能であり、上述のように、必要に応じてライゲーション法を用いることも可能である。また、個々のアミノ酸は、公知の方法により製造可能であり、市販品を用いることも可能である。
　固相担体の形状、大きさ、素材、形態は、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質又はＢ２Ｍタンパク質の全部又は一部を、担持することが可能である限り、特に限定されない。素材としては、不織布、濾紙、ガラス、グラスファイバー、ニトロセルロースフィルター、ポリエーテルスルホンフィルター、ナイロンフィルター、ポリフッ化ビニリデンフィルター、多孔質材料（シリカ等）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、単一であっても複合化されていてもよい。形状は、プレート状、多孔プレート、球形、不定形、棒状、長尺状等が挙げられるが、限定されるものではない。また、ラテックス粒子、シリカ粒子、金属コロイド等の不溶性担体粒子も、固相担体として用いることができる。
　本発明の第２の態様では、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質及びＢ２Ｍタンパク質、あるいは、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質、が固相担体上に担持されることにより、該受容体タンパク質にＨＡｓｔＶが結合して、該結合が、検出対象物におけるＨＡｓｔＶの検出指標となることが要点である。
　すなわち本発明は、本発明の固相担体に、ＨＡｓｔＶの検出対象物を接触させて、上記固相担体に担持されている受容体へのＨＡｓｔＶの結合をシグナルとして、上記対象物におけるＨＡｓｔＶの検出を行う、検出方法（以下、本発明の検出方法ともいう）を提供する。
　本発明の検出方法におけるＨＡｓｔＶの検出対象物は、ＨＡｓｔＶの存在が問題となるものであれば特に限定されず、本発明の固相担体を適用することが可能な水溶物として調製されたものが例示される。例えば、糞便、吐瀉物、飲食物、河川水、下水等の調製物の他、衣服や家具表面等の洗浄水等が挙げられる。ＨＡｓｔＶの上記受容体への結合シグナルは、本発明の固相担体に担持された上記受容体に捕捉されたＨＡｓｔＶを検出可能な手段であれば特に限定されず、ＥＬＩＳＡ法であれば、サンドイッチ法、競合法等、ＥＬＩＳＡをベースとした高感度測定法、アルファスクリーンのような２分子の結合を測定する方法、ビアコアのような２分子の結合により質量が変化するのを検出する方法、電荷が変化するのを検出する方法などが例示される。
　さらに本発明は、本発明の固相担体、ＨＡｓｔＶ、及び、スクリーニング対象物質を、液相中で共存させて、上記固相担体に担持されている受容体へのＨＡｓｔＶの結合をシグナルとして、ＨＡｓｔＶの定量を行い、該定量値と、該定量系において上記スクリーニング対象物質を除いた場合の定量値との比較を行うことにより、上記スクリーニング対象物質における、ＨＡｓｔＶの上記受容体に対する結合性のスクリーニングを行う、スクリーニング方法（本発明の結合スクリーニング方法ともいう）を提供する。
　本発明の結合スクリーニング方法におけるスクリーニング対象物質は、ＨＡｓｔＶが、本発明の固相担体上におけるＦＣＧＲＴ受容体タンパク質及びＢ２Ｍタンパク質、あるいは、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質への結合を阻害する物質が好適である。結合シグナルによる定量手段としては、ＥＬＩＳＡ法であれば、サンドイッチ法、競合法等、ＥＬＩＳＡをベースとした高感度測定法、アルファスクリーンのような２分子の結合を測定する方法、ビアコアのような２分子の結合により質量が変化するのを検出する方法、電荷が変化するのを検出する方法などが例示される。
　本発明により、ヒトアストロウイルス（ＨＡｓｔＶ）の感染能、増殖能が付与された組換え哺乳動物培養細胞と組換え哺乳動物が提供され、該組換え哺乳動物培養細胞と組換え哺乳動物を用いたＨＡｓｔＶの生産方法及びＨＡｓｔＶの生ワクチンの生産方法が提供される。また、上記組換え哺乳動物培養細胞と組換え哺乳動物を用いた、ＨＡｓｔＶに対する作用についての被験物質やワクチンのスクリーニング方法が提供される。また、ＨＡｓｔＶの遺伝子改変と病原性とを関連付けた情報の取得方法が提供される。また、哺乳動物培養細胞又は哺乳動物に対して、ＨＡｓｔＶに対する被感染能を付与若しくは増強する、被感染能の付与若しくは増強方法が提供される。
　さらに、本発明により、ＨＡｓｔＶに対し細胞表面と同様のメカニズムで結合する受容体タンパク質が担持された固相担体が提供される。また、該固相担体を用いた、被験対象物におけるＨＡｓｔＶの検出方法、及び、ＨＡｓｔＶの上記受容体の結合に対する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
ＦＣＧＲＴ遺伝子をノックアウトしたＣａｃｏ－２細胞におけるＦＣＧＲＴタンパク質の発現のノックアウト（図１－Ｂ）、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたＣａｃｏ－２細胞におけるＢ２Ｍタンパク質の発現のノックアウト（図１－Ｃ）を、ウエスタンブロット法で確認した結果を示す図面である。図１－Ａは、アクチンを用いた対照である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたことによる、Ｃａｃｏ－２細胞におけるＨＡｓｔＶ－１感染感受性の検討の結果を示した図面である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたことによる、Ｃａｃｏ－２細胞におけるＨＡｓｔＶ－４感染感受性の検討の結果を示した図面である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたＣａｃｏ－２細胞におけるＨＡｓｔＶ－１のＲＮＡ量の変化についての結果を示した図面である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたＣａｃｏ－２細胞におけるＨＡｓｔＶ－４のＲＮＡ量の変化についての結果を示した図面である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子をノックアウトしたヒト腸管オルガノイド（SI1）におけるＦＣＧＲＴタンパク質の発現のノックアウト（図４－Ｂ）、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたヒト腸管オルガノイド（SI1）におけるＢ２Ｍタンパク質の発現のノックアウト（図４－Ｃ）を、ウエスタンブロット法で確認した結果を示す図面である。図４－Ａは、アクチンを用いた対照である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたことによる、ヒト腸管オルガノイドにおけるＨＡｓｔＶ感染感受性の検討の結果を示した図面である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたヒト腸管オルガノイドにおけるＨＡｓｔＶ－１のＲＮＡ量の変化についての結果を示した図面である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたヒト腸管オルガノイドにおけるＨＡｓｔＶ－４のＲＮＡ量の変化についての結果を示した図面である。 レンチウイルスによるＭＤＣＫ細胞への、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の導入についての工程を示した概略図である。 ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子、を導入したＭＤＣＫ細胞における対応タンパク質の発現を、ウエスタンブロッティング法で検討した結果を示す図面である。 候補遺伝子を導入したＭＤＣＫ細胞の培養上清中の、ＨＡｓｔＶ－ＲＮＡ量を、ＨＡｓｔＶ－１（図９－Ａ）とＨＡｓｔＶ－４（図９－Ｂ）について検討した結果を示す図面である。 ＥＬＩＳＡによるＨＡｓｔＶ粒子と、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のヘテロダイマーとの結合の解析の工程を示した図面である。 ＥＬＩＳＡによって認められた、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のヘテロダイマーに対する、ＨＡｓｔＶ（ＨＡｓｔＶ－１：図１１－Ａ、ＨＡｓｔＶ－４：図１１－Ｂ）の濃度依存的な結合量の増加を示した図面である。
　本発明の実施例として、ＨＡｓｔＶ感染感受性であるＣａｃｏ－２細胞と、ＭＡｓｔＶ１型の中でも症例数の多いＨＡｓｔＶ－１、さらにＨＡｓｔＶ－４を用いて、ＨＡｓｔＶのレセプターの同定を行った。
［試験例１］　ＨＡｓｔＶの感染レセプター候補の探索
＜材料と方法＞
１．培養細胞及びその培養方法
　以下の感染実験に用いるヒト結腸癌由来株化培養細胞（Ｃａｃｏ－２）は、限界希釈法にてクローニングを行った。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いて作出されたノックアウト細胞のクローンに対しては、Ｃａｓ９遺伝子、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に耐性遺伝子を導入しており、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（５μｇ／ｍｌ）とＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（２０μｇ／ｍｌ）によってセレクションを行った。ノックアウト細胞に対するコントロールとして、Ｃａｓ９遺伝子のみを導入したＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９を試験に用いた。加えて、ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をそれぞれノックアウトした、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯでは、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ（後述）によって遺伝子発現の消失が確認された細胞クローン（それぞれＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ１５、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ　ｇ－６）を選択して以下の実験に用いた。これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％のＭＥＭ　Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ:ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，０６３４４－５６）、１％のＮａ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（ｇｉｂｃｏ，１１３６０－０７０）、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ:ｇｉｂｃｏ，１５２４０－０６２）を加えたＭｉｎｉｍｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ（ＥＭＥＭ：ＳＩＧＭＡ，Ｍ４６５５－５００ＭＬ、上記を添加したものを以下ＥＭＥＭ（＋）とする）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
２．Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ
　各サンプルを１０％アクリルアミドゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。次に、該メンブレンをＰＶＤＦ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ，ＮＹＰＢＲ０１）を用いて室温で１時間ブロッキングした。一次抗体と二次抗体の希釈にはＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＯＹＯＢＯ，ＮＫＢ－１０１）を用いた。一次抗体は、抗ＦＣＧＲＴタンパク質（ＦＣＧＲＴ遺伝子にコードされるタンパク質）抗体、抗Ｂ２Ｍタンパク質（Ｂ２Ｍ遺伝子にコードされるタンパク質）抗体、抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ.,ｓｃ－１６１６、Ｇｏａｔ由来）をそれぞれ用いて、室温で一晩インキュベートした。二次抗体は、抗Ｒａｂｂｉｔ抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ７５８５３、Ｒａｂｂｉｔ由来）、抗Ｇｏａｔ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ.,ｓｃ－２０２０、Ｇｏａｔ由来）をそれぞれ用い、室温で１時間インキュベートした。発色液にはＣｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ　Ｌ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，０７８８０－５４）を用いた。
３．ウイルス株
　ＡＴＣＣ（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入したＨＡｓｔＶ－１（ＶＲ－１９３６ＴＭ）と、学校法人北里研究所大村智記念研究所ウイルス感染制御学研究室（片山研究室）で保管されていたＨＡｓｔＶ－４を用いた。これらをＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９に感染させ、１％のＮＥＡＡ、１％のＮａ　ｐｙｒｕｖａｔｅ、１％のＡｎｔｉ－Ａｎｔｉ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（１ｍｏｌ／ｌ－ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，１７５５７－９４）を加えたＥＭＥＭ（上記を添加したものを以下ＥＭＥＭ（－）とする）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　本実施例において、特に断らない限り、ＨＡｓｔＶと記載した場合は、上記のＨＡｓｔＶ－１とＨＡｓｔＶ－４の双方を示すものとする。
４．ウイルス感染と培養
　ＥＭＥＭ（＋）で培養し、コラーゲンコートされたフラスコやウェルプレートに、８０％コンフルエントとしたＣａｃｏ－２細胞に、ＨＡｓｔＶを感染させた。ウイルスのアクチベーション処理としてＴｒｙｐｓｉｎ　ＩＸ－Ｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｔ０３０３－１Ｇ）を１０μｇ／ｍｌで添加したＥＭＥＭ（－）に、ＨＡｓｔＶを懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートした。アクチベーション処理したウイルス液内のＴｒｙｐｓｉｎを不活化するために、１０％ＦＢＳを添加してから感染に用いた。また、アクチベーション処理を行っていないウイルス液でも条件を揃えるために、同様にＦＢＳを添加した。培養時にＴｒｙｐｓｉｎを添加する場合は、ＥＭＥＭ（－）にＴｒｙｐｓｉｎ　ＩＸ－Ｓを５μｇ／ｍｌで添加した。
　４－１．アクチベーション処理後のＨＡｓｔＶ感染とＴｒｙｐｓｉｎ添加下での培養
　Ｃａｃｏ－２細胞から血清を取り除くためにＰＢＳ（－）で洗浄し、ＥＭＥＭ（－）で３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間培養した。アクチベーション処理したウイルス液を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間感染させた。１時間後、細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎを添加したＥＭＥＭ（－）で６日間培養した。
　４－２．アクチベーション処理後のＨＡｓｔＶ感染とＴｒｙｐｓｉｎ未添加での培養
　上記（４－１）と同様にウイルスを感染させ、Ｃａｃｏ－２細胞洗浄後、ＥＭＥＭ（－）で６日間培養した。
　４－３．非アクチベーション処理のＨＡｓｔＶ感染とＴｒｙｐｓｉｎ未添加での培養
　Ｃａｃｏ－２細胞から血清を取り除き、アクチベーション処理していないウイルス液（Ｔｒｙｐｓｉｎを加えずにＥＭＥＭ（－）に、ＨＡｓｔＶを懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベート）を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間感染させた。１時間後、細胞をＰＢＳ（－）で洗浄しＥＭＥＭ（－）で６日間培養した。
　４－４．不活化ＨＡｓｔＶの感染とＴｒｙｐｓｉｎ添加下での培養
　ＨＡｓｔＶをアクチベーションする前に加熱処理によって不活化した。事前試験では未処理、６０℃で５分、１０分加熱したウイルス、の３種類を感染させたが、６０℃、１０分でもウイルスＲＮＡの複製が確認できたため、本試験では６０℃で１５分、３０分の加熱処理によって不活化した。不活化したＨＡｓｔＶと未処理のＨＡｓｔＶを上記（４－１）と同様に感染させ、６日間培養した。
　４－５．ヒト腸管オルガノイドへのＨＡｓｔＶ感染と培養
　ＥＮＲＡ（※１）で培養し、９６ウェルプレートにコンフルエントとしたヒト腸管オルガノイド（SI1）にＨＡｓｔＶを感染させた。ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子それぞれをノックアウトした、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯに対するコントロールとして、SI1が用いられた。細胞にアクチベーション処理したＨＡｓｔＶを、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間感染させた。１時間後、細胞を３＋（※２）で洗浄し、新しいＥＮＲＡを加えて３日間培養した。
　※１　ＥＮＲＡ：５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＰＭＧ８０４３）、１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１７５０４－０４４）、１０ｎＭのＧａｓｔｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇ９１４５－１ＭＧ）、１０％のＮｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，２５０－３８）、１０％のＲ－ｓｐｏｎｄｉｎｅ（Ｒ＆Ｄ，＃４６４５－ＲＳ）、１ｍＭのｎＡｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ９１６５－５Ｇ）、０．５μＭのＡ８３（Ｔｏｃｒｉｓ，＃２９３９）を加えた３＋（※２）
　※２　３＋：１％のＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ（ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ，１５６３０－０８０）、１％のＰｅｎ　Ｓｔｒｅｐ（ｇｉｂｃｏ，１５１４０－１２２）を加えたＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｇｉｂｃｏ，１２６３４－０１０）
５．培養液中のＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡの抽出
　感染後０日目（ｄａｙ０）、培養３日目（ｄａｙ３）、培養６日目（ｄａｙ６）の培養液をサンプルとしてｎ＝３で採取した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）８ｖｉｒｕｓ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ，７４０６４３．５）を用いて１００μｌの培養上清から１００μｌのＥｌｕｔｉｏｎ　ＢｕｆｆｅｒでＲＮＡを抽出した。
６．細胞中のＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡの抽出
　感染後０日目（ｄａｙ０）、培養３日目（ｄａｙ３）、培養６日目（ｄａｙ６）の細胞をサンプルとして、ｎ＝３で感染細胞中のＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡを採取した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ，７４０９５５．５０）を用いて、２４ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌから、ＲＮＡを６０μｌ抽出した。
７．ＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡからｃＤＮＡの作成
　上記（５，６）で抽出したＲＮＡ　５μｌからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０８０－０８５）を用いて、１０μｌのｃＤＮＡを作成した。Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒには下記（９）のＨＡｓｔＶ特異的なプライマーを使用した。
８．ＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡの定量
　ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）　Ｎｅｘｔ　ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，ＱＰＸ－２０１）を用いて、ＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡをｑＰＣＲで定量した。反応液は１サンプルにつき、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｎｅｘｔ　ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ１０μｌ、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（下記：９）６ｐｍｏｌ、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（下記：９）６ｐｍｏｌ、ｃＤＮＡ２μｌに加えて、合計が２０μｌになるように滅菌水を加えた。ＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡを定量するためのスタンダードとして、ＰＣＲ断片を用いた。このＰＣＲ断片はＨＡｓｔＶゲノムＲＮＡ由来のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ＱｕｂｉｔＴＭｄｓＤＮＡ　ＢＲ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ３２８５０）で計測した濃度を基に、溶液中のゲノムコピー数を計算した。
９．ＨＡｓｔＶプライマー
　本試験では、ＨＡｓｔＶ－１とＨＡｓｔＶ－４において、共通した以下のプライマーを使用した。下記表１に示すＦｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は配列番号５であり、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は配列番号６である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜結果＞
１．ノックアウト細胞の樹立
　ＨＡｓｔＶ感染感受性細胞Ｃａｃｏ－２にＣａｓ９遺伝子を導入し、Ｃａｓ９タンパク質を恒常的に発現するＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９細胞が、国立研究開発法人国立長寿医療研究センターと学校法人北里研究所との共同研究によって作出された。この細胞にｇＲＮＡライブラリーを導入しランダムに遺伝子をノックアウトし、ＨＡｓｔＶに抵抗性を示した細胞を解析することにより、ＨＡｓｔＶ感染感受性に関わる候補ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子等を、上記の共同研究によって同定した。これらの遺伝子のうち、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子については、発現される受容体タンパク質がヘテロダイマーを形成して、細胞表面上に発現することが知られており、ＨＡｓｔＶの受容体として機能している可能性があるため、より詳細な検証を行なった。すなわち、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９にＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子のｇＲＮＡを導入し、シングルセルクローニングを行い、ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子それぞれのノックアウト細胞の樹立を行った。
　まず、クローン化したＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯでの標的遺伝子の発現を調べるために、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ解析を行い、その結果を図１（図１－Ａ，Ｂ，Ｃ）に示した。アプライしたタンパク量を比較するためのローディングコントロールとしてアクチン（図１－Ａ）、ＫＯ細胞での標的遺伝子の発現（図１－Ｂ、Ｃ）をそれぞれ調べた。
　すなわち、コントロールであるＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９と、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ１５、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ　ｇ－６をサンプルとしてＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔを行った。図１中では、それぞれ、Ｃｏｎｔ、Ａ　ＫＯ、Ｂ　ＫＯと表した（図１において、ノックアウト（ＫＯ）の対象としての「Ａ」は、ＦＣＧＲＴ遺伝子を示しており、「Ｂ」は、Ｂ２Ｍ遺伝子を示している。）。目的のタンパク質のバンドをそれぞれ矢印で示した。図１－ＡとＢはもともと１つのメンブレンだったものをタンパク質の転写後に約３０ｋＤａの位置で切断し、それぞれ別の抗体と反応させたものである。
　図１－Ａは、一次抗体として抗アクチン抗体と反応後、二次抗体として抗Ｇｏａｔ抗体と反応させた結果を示している。
　図１－Ｂは、一次抗体として抗ＦＣＧＲＴタンパク質抗体と反応後、二次抗体として抗Ｒａｂｂｉｔ抗体と反応させた結果を示している。
　図１－Ｃは、一次抗体として抗Ｂ２Ｍタンパク質抗体と反応後、二次抗体として抗Ｒａｂｂｉｔ抗体と反応させた結果を示している。
　Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ１５、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ　ｇ－６で４３ｋＤａの位置にアクチンの発現がほぼ同程度で確認された（図１－Ａ）。Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ１５では、１４ｋＤａの位置のＦＣＧＲＴタンパク質の発現が消失していることが確認できた（図１－Ｂ）。一方、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ　ｇ－６でのＦＣＧＲＴ遺伝子の発現はコントロールであるＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９と同程度であった（図１－Ｂ）。また、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ　ｇ－６では、４０ｋＤａの位置のＢ２Ｍタンパク質が消失していることが確認できた（図１－Ｃ）。Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ／Ｃｌｏｎｅ１５でのＢ２Ｍタンパク質の発現は消失していないが、コントロールと比較して低レベルだった（図１－Ｃ）。
２．ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたことによるＨＡｓｔＶ感染感受性の変化
　ノックアウトされた遺伝子がＨＡｓｔＶの複製にどのような影響を及ぼすのかを調べるために、上記のクローニングしたノックアウト細胞にＨＡｓｔＶ（上記したように、ＨＡｓｔＶ－１とＨＡｓｔＶ－４の２種）を感染させ、その後の細胞形態とウイルスＲＮＡの複製量を観察した。ＨＡｓｔＶは、Ｔｒｙｐｓｉｎによって活性化されることで感染性粒子になるといわれているため、ＴｒｙｐｓｉｎでアクチベートしたウイルスをＣａｃｏ－２に感染させ、Ｔｒｙｐｓｉｎを添加又は非添加の培地で６日間培養した。その結果を、図２－１及び図２－２に示す。図２－１は、ＨＡｓｔＶ－１に関し、図２－２は、ＨＡｓｔＶ－４に関するものである。両図中には、感染前の細胞と、感染培養後の３日目、６日目の細胞の顕微鏡写真を示す。
　２－１．ＨＡｓｔＶ感染による細胞の形態変化（図２－１、図２－２）
　ウイルス感染前の細胞の形態はＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯで大きな差異は認められなかった。加えて、感染したウイルスの血清型による差異もほとんど認められなかった。しかし、ＨＡｓｔＶ感染後では、細胞や培養条件によって違いが認められた。
　Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９は、Ｔｒｙｐｓｉｎ存在下では培養３日目で多くの細胞が死滅しており、６日目でも浮遊する細胞が見られた。Ｔｒｙｐｓｉｎ非存在下では、Ｔｒｙｐｓｉｎ存在下よりも緩やかではあるものの、時間依存的なＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）が確認された。
　一方、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯと、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯでは類似した細胞形態が観察された。Ｔｒｙｐｓｉｎ存在下では、培養３日目において、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９と比較して軽度ではあるものの、細胞死が確認された。また、未処理の時に円形だった細胞が、細長いまたは突起を伸ばした繊維様の形態に変化していることが確認された。しかし、多くの細胞はｗｅｌｌの底面にしっかりと付着していた。培養６日目では、３日目と比較して死細胞が増え、浮遊する細胞も認められた。Ｔｒｙｐｓｉｎ非存在下では、６日間を通してＴｒｙｐｓｉｎ存在下よりも死細胞が少なく、培養３日目では、未処理の細胞との顕著な形態の差異は認められず、６日目においては、死細胞がわずかに確認できたが、ほとんどの細胞がｗｅｌｌの底面にしっかりと付着していた。また、Ｔｒｙｐｓｉｎ非存在下では、Ｔｒｙｐｓｉｎ存在下において認められた細胞の形態変化、は認められなかった。
　２－２．ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトした細胞におけるＨＡｓｔＶのＲＮＡ量の変化
　ＨＡｓｔＶは細胞内で複製されウイルス粒子が構築された後、細胞外に放出されてからＴｒｙｐｓｉｎによって活性化され成熟ウイルスになることがわかっている。そのため、本試験では、ＨＡｓｔＶを効率的に感染させるために、感染前にウイルスをＴｒｙｐｓｉｎで活性化した。また、６日間培養している間に細胞外に放出される新生ウイルスもＴｒｙｐｓｉｎで活性化できるように、培地にもＴｒｙｐｓｉｎを添加して培養した。
　上記の「材料及び方法：４－１」に従うアクチベーション処理として、Ｔｒｙｐｓｉｎ添加下で培養した場合の培養上清中のＲＮＡ量を、採取した培養上清からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作成後、ＲＴ－ＰＣＲによる定量値を所望のＲＮＡ量として用いた。具体的には、コラーゲンコートされた２４ｗｅｌｌプレートに、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯを播種して、ＨＡｓｔＶ感染系を構築した。このＨＡｓｔＶ感染系に、ＨＡｓｔＶ－１についてはそのＲＮＡ量が６．８４ｘ１０４／μｌの濃度で感染させ、ＨＡｓｔＶ－４については４．２９ｘ１０３／μｌの濃度で感染させた。培養液は感染・洗浄後の新しい培地を、０日目（ｄａｙ０）として、その後６日間培養し、３日目（ｄａｙ３）と、６日目（ｄａｙ６）の培養上清を、ｎ＝３で採取して、それらのＲＮＡ量を定量した。結果は、ＨＡｓｔＶ－１については表２－１と図３－１に示し、ＨＡｓｔＶ－４については表２－２と図３－２に示す。図３－１と３－２においては、表２－１と２－２にそれぞれに示したＲＮＡ量から常用対数を算出し、その平均と標準偏差を求めた。グラフの縦軸は培養上清１μｌあたりに存在するＨＡｓｔＶのＲＮＡコピー数を表した。細胞毎に、感染０日目（ｄａｙ０）、培養３日目（ｄａｙ３）、培養６日目（ｄａｙ６）の平均値をそれぞれ左から順に示した。エラーバーは算出された標準偏差である。これらの表と図においては、ノックアウト（ＫＯ）の対象としての「Ａ」は、ＦＣＧＲＴ遺伝子を示し、「Ｂ」は、Ｂ２Ｍ遺伝子を示している。
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　ＨＡｓｔＶ－１では、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９は培養３日後でＲＮＡのコピー数が０日目の約１０００倍まで増幅され、ピークに達した。その後の６日後では３日後との顕著な差は認められなかった。Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯでは、培養３日後においてＲＮＡ量が０日後の約１００倍まで増幅されたが、ピークには達しなかった。培養６日後では３日後の時点からさらにＲＮＡが増幅されて、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９と同様に０日目と比較して約１０００倍に達した。Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯでも概ねＣａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯと同様の結果が得られた。
　ＨＡｓｔＶ－４では、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９は、培養３日後でＲＮＡ量が０日目の１０００００倍以上まで増幅され、ピークに達した。培養６日後では３日後との顕著な差は認められなかった。Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯでは、培養３日後においてＲＮＡ量が０日目の約１００倍まで増幅されたが、ピークには達しなかった。培養６日後では、３日後の時点からさらにＲＮＡが増幅されて、０日目と比較して約１００００倍に達したが、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９の６日後には及ばなかった。Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ　ＫＯにおいては、３日後でＲＮＡ量が０日目の約１０倍まで増幅されたがピークには達しなかった。６日後では、ＲＮＡ量は０日目と比較して約１００００倍に達したが、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９／ＦＣＧＲＴ　ＫＯと同様に、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９の６日後には及ばなかった。
３．ヒト腸管オルガノイドのＨＡｓｔＶ感染とゲノムＲＮＡの定量
　３－１．ノックアウト細胞の樹立
　ＨＡｓｔＶが、ヒト腸管オルガノイド（SI1）に感染し増殖することが知られている。SI1は腸管の幹細胞から樹立した細胞であり、in vitroで分化誘導を行うことにより上皮やゴブレット細胞などに分化することが可能であり、より生体に近い性質を維持している細胞である。このヒト腸管オルガノイド（SI1）においても、ＦＣＧＲＴ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子が、ＨＡｓｔＶ感染感受性に関与しているかどうか評価するため、ノックアウト細胞の樹立を行った。ノックアウトは、上述したＣａｃｏ２細胞と同様の方法を用い、ＦＣＧＲＴ遺伝子がノックアウトされたSI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯと、Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされたSI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯを、それぞれ得た。
　次に、SI1、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯをサンプルとしてＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔを行った。結果を、図４に示す。図中ではそれぞれ、Ｃｏｎｔ、Ａ　ＫＯ、Ｂ　ＫＯと表した。目的のタンパク質のバンドをそれぞれ矢印で示した。図４－ＡとＢはもともと１つのメンブレンだったものをタンパク質の転写後に約３０ｋＤａの位置で切断し、それぞれ別の抗体と反応させた。
　図４－Ａは、一次抗体として抗アクチン抗体と反応後、二次抗体として抗Ｇｏａｔ抗体と反応させた結果を示している。
　図４－Ｂは、一次抗体として抗ＦＣＧＲＴタンパク質抗体と反応後、二次抗体として抗Ｒａｂｂｉｔ抗体と反応させた結果を示している。
　図４－Ｃは、一次抗体として抗Ｂ２Ｍタンパク質抗体と反応後、二次抗体として抗Ｒａｂｂｉｔ抗体と反応させた結果を示している。
　SI1、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯで４３ｋＤａの位置にアクチンの発現がほぼ同程度で確認された（図４－Ａ）。Ｃａｃｏ－２と同様にSI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯではＦＣＧＲＴ遺伝子の発現の消失が確認され、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯでのＦＣＧＲＴ遺伝子の発現はコントロールのSI1と同程度であった（図４－Ｂ）。また、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯでは、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が消失していることが確認できた（図４－Ｃ）。SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯでのＢ２Ｍタンパク質の発現は消失していないが、コントロールと比較して低レベルだった（図４－Ｃ）。
　３－２．ＨＡｓｔＶに感染したヒト腸管オルガノイド（SI1）の変化
　上記のSI1、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯを用いて、ＨＡｓｔＶの感染試験を行った。オルガノイドは、培地中にＴｒｙｐｓｉｎが添加できないので、Ｔｒｙｐｓｉｎで活性化したＨＡｓｔＶ（ＨＡｓｔＶ－１とＨＡｓｔＶ－４）を、Ｔｒｙｐｓｉｎ未添加の培地においてオルガノイドに感染させ、３日間培養した。結果を、図５に示す。図５中にはそれぞれのＨＡｓｔＶに感染させたSI1、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯの、感染０日目（ｄａｙ０）、培養３日目（ｄａｙ３）における顕微鏡写真を示す。
　３－２－１．ヒト腸管オルガノイドにおけるＨＡｓｔＶ感染感受性の検討
図５に示すように、ウイルス感染前の細胞の形態はSI1、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯで大きな差異は見られなかった。加えて、感染したウイルスの血清型による差異もほとんど見られなかった。SI1は培養３日目で死細胞が認められた。SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯとSI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯでは、類似した細胞形態の変化が観察された。すなわち、感染において死細胞がわずかに確認できたが、感染０日目（ｄａｙ０）の細胞との明らかな差異は認められなかった。
　３－２－２．ヒト腸管オルガノイドでのＨＡｓｔＶのＲＮＡの複製
　次に、ＳＩ1、ＳＩ1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、Ｂ２Ｍ　ＫＯにおけるＨＡｓｔＶの感染感受性を調べるために、感染０日目、培養３、６日目のＨＡｓｔＶ－ＲＮＡ量を比較した。
　すなわち、ヒト腸管オルガノイドにＨＡｓｔＶを感染させ、「材料及び方法：４－５」に従って得られた培養上清中のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作成後、ＲＴ－ＰＣＲによる定量を行った。
　具体的には、９６ｗｅｌｌプレートに、SI1、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯ、SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯを播種して、ＨＡｓｔＶ感染系を構築した。このＨＡｓｔＶ感染系に、ＨＡｓｔＶ－１については、そのＲＮＡ量が４．３２ｘ１０５／μｌの濃度で感染させ、ＨＡｓｔＶ－４については５．２４ｘ１０６／μｌの濃度で感染させた。感染０日目（ｄａｙ０）、培養３日目（ｄａｙ３）の培養上清をそれぞれｎ＝６で採取して、それらのＲＮＡ量を定量した。結果は、ＨＡｓｔＶ－１については表３－１と図６－１に示し、ＨＡｓｔＶ－４については表３－２と図６－２に示す。図３－１と３－２においては、表３－１と３－２にそれぞれに示したＲＮＡ量から常用対数を算出し、その平均と標準偏差を求めた。グラフの縦軸は培養上清１μｌあたりに存在するＨＡｓｔＶのＲＮＡコピー数を表した。細胞毎に、感染０日目（ｄａｙ０）、培養３日目（ｄａｙ３）の平均値をそれぞれ左から順に示した。エラーバーは算出された標準偏差である。これらの表と図においては、ノックアウト（ＫＯ）の対象としての「Ａ」は、ＦＣＧＲＴ遺伝子を示し、「Ｂ」は、Ｂ２Ｍ遺伝子を示している。
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　ＨＡｓｔＶ－１を感染させたSI1では、培養３日後のＨＡｓｔＶのＲＮＡのコピー数が、感染０日目の約１０００倍に増幅された。SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯでは、培養３日目においてＲＮＡ量が約１００倍に増幅された。SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯにおいても、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯと同様に約１００倍に増幅された。
　ＨＡｓｔＶ－４を感染させたSI1では、培養３日目のＨＡｓｔＶのＲＮＡのコピー数が、感染０日目の約１００倍に増幅された。SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯでは、培養３日目において、ＲＮＡ量が約１０倍に増幅された。SI1／Ｂ２Ｍ　ＫＯでも、SI1／ＦＣＧＲＴ　ＫＯと同様に約１０倍に増幅された。
＜試験例１の結論＞
　ここまで行った、ＦＣＧＲＴ遺伝子又はＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトした、Ｃａｃｏ－２細胞及びヒト腸管オルガノイドにおける、ＨＡｓｔＶの感染テストにおいて、これらの細胞レセプター遺伝子のノックアウトにより、統計学的に有意な相対的ＨＡｓｔＶ－ＲＮＡ量の低下が認められた。このことから、ＦＣＧＲＴ受容体とＢ２Ｍは、ＨＡｓｔＶの感染レセプターである可能性と共に、これらの受容体がヘテロダイマーを形成することから、互いに連動して該感染レセプターとして機能している可能性が認められた。
［試験例２］　ＨＡｓｔＶレセプターの同定
　本試験例では、試験例１においてＨＡｓｔＶレセプター候補となった、ＦＣＧＲＴ受容体とＢ２Ｍが、真にＨＡｓｔＶの感染レセプターであることを確認するために、ＨＡｓｔＶ非感受性細胞であるＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮由来）に、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子を導入し、該導入細胞がＨＡｓｔＶ被感染・増殖能を獲得するか否かの検討を行った。
１．レンチウイルスベクターによる目的遺伝子の導入
　ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子のＭＤＣＫ細胞の導入は、該遺伝子を組み込んだレンチウイルスベクターを用いて行った。該レンチウイルスベクターの構成の概略と、導入工程の概略を図７に示した。図７上部のレンチウイルスベクターの構成の概略図において、ＣＭＶプロモーターとＩＲＥＳ(Internal Ribosome Entry Site)の中間に組み込まれた「Ａ」は、ＦＣＧＲＴ遺伝子（配列番号１）を示しており、「Ｂ」は、Ｂ２Ｍ遺伝子（配列番号３）を示している。
　ステップ１のＭＤＣＫ細胞の培養として、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣより購入）を、ＭＥＭ培地において３７℃、５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養を行った。次いで、６ｗｅｌｌプレートに播種し、再びコンフルエントになるまで培養し、上記レンチウイルスベクターを添加して、３７℃、５％ＣＯ２に導入したレンチウイルスが有する薬剤耐性を利用して組換えレンチウイルス、すなわち、目的の遺伝子が導入された細胞を選択した（ステップ４－５）。遺伝子導入は、ＦＣＧＲＴ遺伝子のみ、Ｂ２Ｍ遺伝子のみ、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の双方の３通りのパターンを行い、それぞれの細胞を得た。
　ステップ５において選択された細胞は、細胞選択のための薬剤を加えた条件でスケールアップ培養し、増殖した細胞をストックした（ステップ６）。
２．Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔによる遺伝子発現解析
　上記の遺伝子の導入を行ったＭＤＣＫ細胞に目的遺伝子が発現しているかを調べるために、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔを用いて解析を行った。具体的な方法は、試験例１の＜材料と方法＞の「２．Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ」に従った。
　その結果を、図８に示す。図８において、「Ａ」は、ＦＣＧＲＴ遺伝子を示しており、「Ｂ」は、Ｂ２Ｍ遺伝子を示している。
　図８のブロット像は、左から、ＭＤＣＫ細胞、ＦＣＧＲＴ遺伝子を導入したＭＤＣＫ細胞、Ｂ２Ｍ遺伝子を導入したＭＤＣＫ細胞、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の双方、を導入したＭＤＣＫ細胞、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９細胞（コントロール）である。図８より、それぞれ遺伝子を導入した細胞ではそれぞれの目的遺伝子が発現していることが明らかになった。
　ＭＤＣＫ細胞に、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の双方を導入した場合の、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のぞれぞれの発現量は、それぞれの遺伝子を単独で導入した場合の対応する発現量よりも増加していることが明らかになった。
３．組換えＭＤＣＫ細胞のＨＡｓｔＶ感染能の獲得性
（１）組換えＭＤＣＫ細胞へのＨＡｓｔＶの感染
　上記２において得られた、各組換えＭＤＣＫ細胞に対してＨＡｓｔＶを接触させて、その感染を試みた。
　具体的には、各組換えＭＤＣＫ細胞を、２４ｗｅｌｌに播種して、無血清培地を加えて３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養を行った後、細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、無血清培地を加えて３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養を行った。別途、ＨＡｓｔＶ（ＨＡｓｔＶ－１，ＨＡｓｔＶ－４）をトリプシンによるアクチベートを行った（３７℃で１時間）。次いで、上記無血清培地を除いて、該アクチベート済みのＨＡｓｔＶ液を添加して、３７℃、５％ＣＯ２で培養を行い、ウイルス液を除去してＰＢＳ（－）で洗浄した。次いで、トリプシンを加えた新しい無血清培地で６日間の培養を行った。ＨＡｓｔＶ－１についてはそのＲＮＡ量が６．８４ｘ１０４／μｌの濃度で感染させ、ＨＡｓｔＶ－４については４．２９ｘ１０３／μｌの濃度で感染させた。
（２）培養上清中のＨＡｓｔＶ－ＲＮＡ量の測定とその結果
　上記の培養で得られた各ｗｅｌｌの培養上清を、感染０日目（ｄａｙ０）と、培養６日目（ｄａｙ６）において、ｎ＝３で採取した。なお、感染０日目の培養上清は、洗浄後の新たな培地を用いた。
　結果は、図９（図９－Ａと図９－Ｂ）にて示した。図９－Ａは、ＨＡｓｔＶ－１についての結果であり、図９－Ｂは、ＨＡｓｔＶ－９についての結果である。これらのグラフにおいても、「Ａ」はＦＣＧＲＴ遺伝子の導入を、「Ｂ」はＢ２Ｍ遺伝子の導入を示している。両グラフの左から、ＭＤＣＫ細胞、ＦＣＧＲＴ遺伝子を導入したＭＤＣＫ細胞、Ｂ２Ｍ遺伝子を導入したＭＤＣＫ細胞、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の双方、を導入したＭＤＣＫ細胞、Ｃａｃｏ－２／Ｃａｓ９細胞（コントロール）である。各細胞について隣接し合った左側は感染０日目（ｄ０）を、隣接右側は培養６日後（ｄ６）を示している。各々得られたＲＮＡ量から常用対数を算出し、その平均と標準偏差を求めた。グラフの縦軸は培養上清１μｌあたりに存在するＨＡｓｔＶのＲＮＡコピー数を表した。図中のエラーバーは、算出された標準偏差である。
　ＨＡｓｔＶ－１の場合、ＭＤＣＫ／ＦＣＧＲＴが１００倍増幅しているのに対して、ＭＤＣＫ／Ｂ２Ｍでは有意な差は認められず、ＭＤＣＫ／ＦＣＧＲＴ／Ｂ２Ｍにおいて、約１０００倍の増幅が認められた。
　ＨＡｓｔＶ－４の場合、ＭＤＣＫ／ＦＣＧＲＴも、ＭＤＣＫ／Ｂ２Ｍと共に有意な差は認められなかったが、ＭＤＣＫ／ＦＣＧＲＴ／Ｂ２Ｍにおいて、約１００倍の増幅が認められた。
　この結果と、上述したＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔの結果から、ＦＣＧＲＴ受容体がアストロウイルスの感染感受性に直接関与していることが示唆され、さらに、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の両者を導入すると、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のぞれぞれの発現量が増加し、より強いＨＡｓｔＶに対する感染感受性を獲得できることが明らかになった。
４．ＨＡｓｔＶウイルス粒子と、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質の結合の解析
　ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とＢ２Ｍタンパク質は、ヘテロダイマーを形成して、細胞表面に存在する膜タンパク質の一種である。Ｂ２Ｍタンパク質は、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質とヘテロダイマーを形成することで、自身とＦＣＧＲＴ受容体タンパク質の安定性を向上させており、このヘテロダイマーとしての構造こそが、ＨＡｓｔＶの感染能の獲得に大きく貢献している可能性が強い。
　従って、ここでリコンビナント蛋白質であるＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍの市販品を購入し、これらのタンパク質に、ＨＡｓｔＶ粒子が直接結合するかを、ＥＬＩＳＡを用いて解析した。この解析の手法の概略は、図１０に示す通りである。
　すなわち、９６ｗｅｌｌプレートにＨＡｓｔＶ粒子を６００ｎｇ／ｗｅｌｌで固相化し、これに段階希釈した組換えＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のヘテロダイマー（ＥＣＤ，Ｈｉｓ＆ＡＶＩ　Ｔａｇ）を、１２μｇ／ｍｌを５０μｌ／ｗｅｌｌで播種し、上記ウイルス粒子に結合したタンパク質を、ＨＲＰ標識抗ヒスチジンタグ抗体を結合させて発色させ、４５０ｎｍで測定することにより、濃度依存的なＨＡｓｔＶに対する、上記ヘテロダイマーの結合量を測定した。なお、上記の組換え受容体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎由来）で発現させて生成しているため、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質がヘテロダイマーとして存在する。
　このＥＬＩＳＡによる結合の検出の結果を、図１１に示す。図１１は、ＥＲＩＳＡによって認められた、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のヘテロダイマーに対する、ＨＡｓｔＶ（ＨＡｓｔＶ－１：図１１－Ａ（左）、ＨＡｓｔＶ－４：図１１－Ｂ（右））の濃度依存的な結合量の増加を示した図面である。横軸は、上記ヘテロダイマーの濃度である。ＨＡｓｔＶ－１も、ＨＡｓｔＶ－４も、上記ヘテロダイマーの濃度の上昇と共に、吸光度の上昇が認められ、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のヘテロダイマーは、濃度依存的にＨＡｓｔＶ粒子に結合することが明らかになった。
＜試験例２の結論＞
　試験例２により、ＨＡｓｔＶ非感受性細胞であるＭＤＣＫ細胞に、ＦＣＧＲＴ遺伝子のみ、又は、ＦＣＧＲＴ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子を同時に導入したところ、ＨＡｓｔＶの増殖が確認された。つまり、これらの遺伝子の導入により、ＭＤＣＫが新たにＨＡｓｔＶ感受性を獲得したことが示された。さらに、Ｂ２Ｍ遺伝子のみを導入したＭＤＣＫ細胞では、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が確認されたにもかかわらず、有意なＨＡｓｔＶの増殖は認められなかった。このことから、Ｂ２Ｍタンパク質単独では、ＨＡｓｔＶの受容体の機能を果たさないことが示唆される。そして、ＦＣＧＲＴタンパク質とＢ２Ｍタンパク質のヘテロダイマーの組換えタンパク質と、ＨＡｓｔＶとの濃度依存的結合が認められた。
　これらのことから、ＦＣＧＲＴタンパク質は単体でＨＡｓｔＶ受容体であるが、さらにこれにＢ２Ｍタンパク質が組み合わさってヘテロダイマーを構成することによって、両受容体タンパク質は構造的な安定性を得て、該ヘテロダイマーが最も好適な形でＨＡｓｔＶ非感受性細胞に、新たなＨＡｓｔＶ感受性を与えることが示された。
　また、上記の濃度依存的な結合を利用して、ＨＡｓｔＶの高感度な検出に応用することも可能であることが示された。

Claims (21)

  1. 　配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び配列番号３で表される塩基配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、が組み込まれている遺伝子組換え哺乳動物培養細胞であって、ヒトアストロウイルスの被感染又は増殖能を有する遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
  2. 　配列番号１で表される塩基配列が一部改変されているＦＣＧＲＴ受容体遺伝子の改変、又は、配列番号３で表される塩基配列が一部改変されているＢ２Ｍ遺伝子の改変、は、ナチュラルオカーレンスに従った遺伝子改変である、請求項１に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
  3. 　配列番号１で表される塩基配列が一部改変されているＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、又は、配列番号３で表される塩基配列が一部改変されているＢ２Ｍ遺伝子、は、遺伝子多型に従った改変である、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
  4. 　遺伝子多型は、一塩基置換（ＳＮＰ）である、請求項３に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
  5. 　前記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞において、ＦＣＧＲＴ受容体遺伝子は配列番号１で表される塩基配列である、請求項１に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
  6. 　前記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子は配列番号３で表される塩基配列である、請求項１又は４に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
  7. 　配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び配列番号３で表される塩基配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、が組み込まれている遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）であって、ヒトアストロウイルスの被感染又は増殖能を有する遺伝子組換え哺乳動物。
  8. 　請求項１－６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項７に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、ヒトアストロウイルスを感染させ、上記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、遺伝子組換え哺乳動物において、該ヒトアストロウイルスを増殖させる、ヒトアストロウイルスの生産方法。
  9. 　請求項１－６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項７に記載の遺伝子組換え哺乳動物、におけるヒトアストロウイルスの継代培養を、病原性が生ワクチンとして許容される程度に低下するまで継代を継続し、該増殖能が失われたヒトアストロウイルスを生ワクチンとして取得する、ヒトアストロウイルスに対する生ワクチンの生産方法。
  10. 　継代培養されたヒトアストロウイルスにおける病原性の低下は、ヒトアストロウイルスにおける、温度感受性の変化、同ｐＨ感受性の変化、又は、同元来の感染標的細胞への感受性の低下、によってもたらさせるものである、請求項９に記載の生ワクチンの生産方法。
  11. 　ヒトアストロウイルスを感染させた請求項１－６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項７に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象物質を接触させて、上記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、遺伝子組換え哺乳動物におけるヒトアストロウイルスの増殖を検出することにより、上記スクリーニング対象物質のヒトアストロウイルスに対する作用の情報を取得する、スクリーニング方法。
  12. 　請求項１－６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項７に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象物質とヒトアストロウイルスを接触させて、上記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、遺伝子組換え哺乳動物におけるヒトアストロウイルスの増殖を検出することにより、上記スクリーニング対象物質のヒトアストロウイルスに対する作用の情報を取得する、スクリーニング方法。
  13. 　スクリーニング対象作用が、ヒトアストロウイルスの不活化作用、又は、増殖の阻害作用である、請求項１１又は１２に記載のスクリーニング方法。
  14. 　請求項１－６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項７に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象ワクチンを免疫して、上記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、遺伝子組換え哺乳動物におけるヒトアストロウイルスに対する防御作用を検出することにより、該スクリーニング対象ワクチンの作用の情報を取得する、スクリーニング方法。
  15. 　請求項１－６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項７に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、野生型ヒトアストロウイルスと、所定の遺伝子改変が行われた遺伝子組換えヒトアストロウイルスを、それぞれ個別の群として感染を試みて、該感染前後の上記遺伝子組換え哺乳動物培養細胞群、又は、遺伝子組換え哺乳動物群における、アストロウイルスの感染態様と、上記遺伝子改変が関連付けられた情報を取得する、情報の取得方法。
  16. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体タンパク質及び配列番号４で表されるアミノ酸配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍタンパク質、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体タンパク質、が担持された固相担体であって、ヒトアストロウイルスに対する結合能を有する固相担体。
  17. 　前記固相担体において、ＦＣＧＲＴ受容体タンパク質は配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１６に記載の固相担体。
  18. 　前記固相担体において、Ｂ２Ｍタンパク質は配列番号４で表されるアミノ酸配列である、請求項１６に記載の固相担体。
  19. 　請求項１６－１８のいずれか１項に記載の固相担体に、ヒトアストロウイルスの検出対象物を接触させて、上記固相担体に担持されている受容体へのヒトアストロウイルスの結合をシグナルとして、上記対象物におけるヒトアストロウイルスの検出を行う、検出方法。
  20. 　請求項１６－１８のいずれか１項に記載の固相担体、ヒトアストロウイルス、及び、スクリーニング対象物質を、液相中で共存させて、上記固相担体に担持されている受容体へのヒトアストロウイルスの結合をシグナルとして、ヒトアストロウイルスの定量を行い、該定量値と、該定量系において上記スクリーニング対象物質を除いた場合の定量値との比較を行うことにより、上記スクリーニング対象物質における、ヒトアストロウイルスの上記受容体に対する結合性のスクリーニングを行う、スクリーニング方法。
  21. 　哺乳動物培養細胞又は哺乳動物（ヒトを除く）に対して、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子及び配列番号３で表される塩基配列の一部改変が許容されるＢ２Ｍ遺伝子、あるいは、配列番号１で表される塩基配列の一部改変が許容されるＦＣＧＲＴ受容体遺伝子、を導入することにより、遺伝子が組み換えられた上記哺乳動物培養細胞又は哺乳動物における、ヒトアストロウイルスに対する被感染能を付与若しくは増強する、被感染能の付与若しくは増強方法。
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