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WO2023054712A1 - ペプチド - Google Patents

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Publication number
WO2023054712A1
WO2023054712A1 PCT/JP2022/036850 JP2022036850W WO2023054712A1 WO 2023054712 A1 WO2023054712 A1 WO 2023054712A1 JP 2022036850 W JP2022036850 W JP 2022036850W WO 2023054712 A1 WO2023054712 A1 WO 2023054712A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
peptide
tgf
peptide according
amino acids
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/036850
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
芳典 鈴木
政彦 杵渕
Original Assignee
ペプチドリーム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ペプチドリーム株式会社 filed Critical ペプチドリーム株式会社
Priority to CA3234324A priority Critical patent/CA3234324A1/en
Priority to IL311773A priority patent/IL311773A/en
Priority to CN202280066544.0A priority patent/CN118103387A/zh
Priority to AU2022355276A priority patent/AU2022355276A1/en
Priority to JP2023551926A priority patent/JPWO2023054712A1/ja
Priority to KR1020247013802A priority patent/KR20240082377A/ko
Priority to EP22876574.9A priority patent/EP4410816A1/en
Publication of WO2023054712A1 publication Critical patent/WO2023054712A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring

Definitions

  • the present invention relates to peptides, compositions containing the peptides, and uses of the peptides.
  • TGF- ⁇ (transforming growth factor ⁇ ) is a cytokine belonging to the TGF- ⁇ family and has many functions.
  • the TGF- ⁇ family includes three isoforms of TGF- ⁇ (TGF- ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3) and many other signaling proteins.
  • TGF- ⁇ is known to have many functions, such as controlling cell proliferation and differentiation, and affecting the production and deposition promotion of extracellular matrix proteins such as collagen and fibronectin.
  • Signal transduction pathways mediated by TGF- ⁇ are known to be involved in, for example, proliferation, metastasis and angiogenesis of cancer cells, control of immune response, etc. (Japanese PCT National Publication No. 2021-100972).
  • TGF- ⁇ signaling pathway has a great effect on cell growth, survival and differentiation, it is also being studied as an additive to culture media.
  • Antibodies (WO01/066140, WO2012/030394), small molecules (WO2015/103355), etc. are known as substances having TGF- ⁇ antagonistic activity, and therapeutic agents for renal dysfunction and myocardial infarction using them. etc., are being studied. In recent years, focusing on the tumor immunosuppressive action of TGF- ⁇ , the combined use of an immune checkpoint inhibitor and a TGF- ⁇ neutralizing antibody has also been studied.
  • the present inventors have conceived of the present invention as a result of intensive research aimed at creating peptides having TGF- ⁇ binding activity, preferably TGF- ⁇ antagonist activity.
  • the present invention provides peptides, compositions containing such peptides, and uses of such peptides.
  • the present application includes the following inventions.
  • the following amino acid sequences F-Nal1-VVNVYDD-PeG-V-Nal1-YHVCG (SEQ ID NO: 2); or, 1 selected from the group consisting of the 2nd, 4th, 7th, 8th, 9th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th and 17th amino acid residues of the above amino acid sequences; - A peptide comprising an amino acid sequence having a substitution, addition, deletion or insertion at 11 amino acid residues.
  • X1 is an amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain
  • X2 is any amino acid
  • X3 is any amino acid
  • X4 is any amino acid
  • X5 is any amino acid
  • X6 is an amino acid having an optionally substituted alkyl group in the side chain or a secondary amino acid having an optionally substituted alkyl group
  • X7 is an amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain
  • X8 is an amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain
  • X9 is any amino acid
  • X10 is any amino acid, peptides, including [3] The peptide of [2], wherein X1 is an amino acid having a condensed ring optionally substituted on a side chain.
  • [4] The peptide of [2], wherein X1 is Nal1, W6N, W7N or W.
  • [5] The peptide according to any one of [2]-[4], wherein X2 is V, K, KCOpipzaa, KCOmeglumine or Q.
  • [6] The peptide of any one of [2]-[4], wherein X2 is V, K, KCOpipzaa, or KCOmeglumine.
  • [7] The peptide of any one of [2]-[6], wherein X3 is Y, 4Py, A, E, F4G, Q, K, F3G, or 3Py.
  • X10 is an amino acid other than a substituted or unsubstituted aromatic amino acid and a sulfur-containing amino acid.
  • [28] The peptide according to any one of [1]-[27], which has TGF- ⁇ antagonist activity.
  • a medical or diagnostic composition comprising the peptide of any one of [1]-[28].
  • a composition for research comprising the peptide of any one of [1]-[28], excluding compositions used as additives to media for culturing organoids, Research composition.
  • the peptide of the present invention has TGF- ⁇ binding activity and, preferably, TGF- ⁇ antagonist activity. It is useful as a pharmaceutical composition for cancer, liver disease, etc., a diagnostic composition, a research composition, and the like.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the inhibitory activity of TGFb1 — 012 (SEQ ID NO: 13) against TGF- ⁇ 1 and TGF- ⁇ 2 by SBE reporter assay.
  • black circles indicate TGF- ⁇ 1 and black squares indicate TGF- ⁇ 2.
  • the horizontal axis indicates the concentration (nM) of TGF- ⁇ 1 — 012 (SEQ ID NO: 13), and the vertical axis indicates the inhibitory activity.
  • W6N 6-aza-L-tryptophan (CAS No. 149704-63-2);
  • W7N L-7-azatryptophan (CAS No. 49758-35-2);
  • KCOpipzaa N6-(4-(carboxymethyl)piperazine-1-carbonyl)-L-lysine (CAS No. N/A);
  • KCO meglumine N6-(methyl ((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)carbamoyl)-L-lysine;
  • 4Py 4-pyridyl-L-alanine (CAS No. 37535-49-2);
  • PeG phenethylglycine (CAS No. 7738-38-7);
  • F4G p-guanidino L-phenylalanine (CAS No. 59574-11-7);
  • F3G 3-[(aminoiminomethyl)amino]-L-phenylalanine (CAS No. 1019057-42-1);
  • 3Py 3-(3-pyridyl)-L-alanine (CAS No. 64090-98-8);
  • MeG methylglycine (CAS No. 107-97-1);
  • PEG10c 1-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-decaoxatritriacontane-33-oic acid
  • MePEG8c 2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxahexacosane-26-oic acid
  • OCOmPEG 10000 Methoxy polyethylene glycol carbonate (average molecular weight 10,000).
  • Peptide (A) The present invention relates to peptides.
  • the peptide of the invention has the following amino acid sequence: F-Nal1-VVNVYDD-PeG-V-Nal1-YHVCG (SEQ ID NO: 2); or, 1 selected from the group consisting of the 2nd, 4th, 7th, 8th, 9th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th and 17th amino acid residues of the above amino acid sequences; - A peptide comprising an amino acid sequence having a substitution, addition, deletion or insertion at 11 amino acid residues.
  • SEQ ID NO: 2 is a peptide that was confirmed to have TGF- ⁇ binding activity and TGF- ⁇ antagonist activity in the Examples of the present specification.
  • amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may have substitutions, additions, deletions or insertions at 1-11 amino acid residues.
  • the number of amino acids substituted, deleted, added and/or inserted may be 1 or more and 10 or less, and the lower limit is 1.
  • the upper limit is 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 and the minimum is 1.
  • amino acid substitutions are preferably conservative amino acid substitutions.
  • Constant amino acid substitution means substitution with functionally equivalent or similar amino acids.
  • Conservative amino acid substitutions in a peptide result in static changes in the amino acid sequence of the peptide.
  • one or more amino acids of similar polarity act functionally equivalently, resulting in static variations in the amino acid sequence of such peptides.
  • substitutions within a group can be considered conservative in structure and function.
  • the role played by a particular amino acid residue can be determined by its implications in the three-dimensional structure of the molecule containing that amino acid. For example, cysteine residues can have a less polar, oxidized (disulfide) form compared to the reduced (thiol) form.
  • the long aliphatic portion of the arginine side chain may constitute structurally and functionally important features.
  • side chains containing aromatic rings can contribute to ion-aromatic or cation-pi interactions.
  • substitution of amino acids having these side chains with amino acids belonging to acidic or non-polar groups may be structurally and functionally conservative.
  • Residues such as proline, glycine, cysteine (disulfide form) can have a direct effect on backbone conformation and often cannot be substituted without structural distortion.
  • Conservative amino acid substitutions include specific substitutions based on side chain similarity (e.g., Leninja, Biochemistry, Second Revised Edition, 1975, pp. 73-75: L. Lehninger, Biochemistry, 2nd edition, pp 73-75, Worth Publisher, New York (1975)) and typical substitutions.
  • conservative amino acid substitution is preferably substitution with an amino acid belonging to the same group to which a certain amino acid belongs, for example, in groups in which natural amino acids are divided based on the properties of their common side chains as follows.
  • Hydrophobic (also referred to as non-polar) amino acids amino acids exhibiting hydrophobicity (non-polarity), such as alanine (also referred to as “Ala” or simply “A”), glycine (also referred to as “Gly” or simply “G”) , valine (also referred to as “Val” or simply “V”), leucine (also referred to as “Leu” or simply “L”), isoleucine (also referred to as “Ile” or simply “I”), proline (also referred to as “Pro” or simply Also referred to as “P”), phenylalanine (also referred to as “Phe” or simply “F”), tryptophan (also referred to as “Trp” or simply “W”), tyrosine (also referred to as “Tyr” or simply “Y”), methionine ( Also referred to as “Met” or simply “M”).
  • alanine also referred to as “Ala” or simply “
  • hydrophobic amino acids can be further divided into the following groups.
  • Aliphatic amino acid an amino acid having a fatty acid or hydrogen in its side chain, including Ala, Gly, Val, Ile, and Leu.
  • Aliphatic/branched chain amino acids amino acids having branched fatty acids in their side chains, including Val, Ile, and Leu.
  • Aromatic amino acid An amino acid having an aromatic ring in its side chain, including Trp, Tyr, and Phe.
  • Hydrophilic (also referred to as polar) amino acids amino acids exhibiting hydrophilicity (polarity), such as serine (also referred to as “Ser” or simply “S”), threonine (also referred to as “Thr” or simply “T”), cysteine (also referred to as “Cys” or simply “C”), asparagine (also referred to as “Asn” or simply “N”), glutamine (also referred to as “Gln” or simply “Q”), aspartic acid (“Asp” or simply “ D”), glutamic acid (also referred to as “Glu” or simply “E”), lysine (also referred to as “Lys” or simply “K”), arginine (also referred to as “Arg” or simply “R” ), histidine (also abbreviated as “His” or simply “H”).
  • polarity such as serine (also referred to as “Ser” or simply “S”), threonine (also referred
  • hydrophilic amino acids can be further divided into the following groups.
  • Acidic amino acids amino acids whose side chains are acidic, including Asp, Glu, Basic amino acid: an amino acid having a basic side chain, including Lys, Arg, and His.
  • Neutral amino acid an amino acid whose side chain is neutral, including Ser, Thr, Asn, Gln, and Cys.
  • Gly and Pro can be divided into “amino acids that affect the orientation of the main chain", and amino acids containing sulfur molecules in side chains, Cys and Met, can also be divided into “sulfur-containing amino acids”.
  • groups having aromatic side chains include Trp, Tyr, and Phe.
  • amino acid includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids.
  • Non-natural amino acids include, for example, N-alkylamino acids obtained by N-alkylating the above-described natural amino acids, lower branched or unbranched nitrogens forming peptide bonds (eg, C1-C5, preferably , C1-C3, more preferably those modified with an alkyl group of C1).
  • the N-alkylamino acid is preferably N-ethylamino acid, N-butylamino acid or N-methylamino acid, more preferably N-methylamino acid.
  • Non-natural amino acids include D-type amino acids (also referred to as D-amino acids), ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, amino acid mutants, chemically modified amino acids such as amino acid derivatives, and in vivo amino acids such as norleucine and ornithine. Amino acids that are not protein building blocks are included.
  • amino acids in which a functional group is further added to the side chain of a natural amino acid or substituted with another functional group e.g., amino acids having substitutions or additions to the side chain arylene group, alkylene group, etc., side chain an arylene group, an amino acid with an increased number of carbon atoms in the alkylene group or alkyl group, an amino acid with a substitution on the aromatic ring of the side chain, or an amino acid with a structure in which the carboxylic acid functional group amino acid in the side chain is substituted with a sulfonic acid group.
  • heterocyclized and condensed amino acids such as derivatives
  • a structure such as a functional group By adding or substituting a structure such as a functional group to the side chain of a natural amino acid, properties different from those of a natural amino acid can be imparted. That is, the aforementioned grouping of naturally occurring amino acids based on their common side chain properties can include unnatural amino acids with similar side chain properties. Thus, non-natural amino acids exhibiting side chain properties similar to those of certain amino acids can also be included as targets for conservative amino acid substitutions.
  • Non-naturally occurring amino acids include, without limitation, N-methyl amino acids, 4Py, Nal1, W6N, W7N, KCOpipzaa, KCOmeglumine, PeG, and the like.
  • Nal1, PeG can be divided into hydrophobic amino acids
  • 4Py, W7N, W6N can be divided into hydrophilic amino acids
  • 4Py, W7N, W6N are basic amino acids
  • 4Py, Nal1, PeG, W6N, W7N are aromatic It can also be divided into amino acids.
  • N-methyl amino acids can be classified as N-alkyl amino acids or according to the nature of the side chain of the original non-N-methylated amino acids.
  • D-amino acids can be classified as D-amino acids, but also according to the nature of their side chains, N-methyl amino acids can also be classified as N-alkyl amino acids, N-methylated They can also be classified according to the nature of the side chain of the original amino acid that has not been modified.
  • the peptide is, without limitation, in one aspect, a cyclic peptide.
  • Cyclic peptide is described in detail in “3.
  • Peptide (B) As used herein, "without limitation” and “in one aspect” may be used interchangeably.
  • the peptide may contain additional amino acid residues in addition to SEQ ID NO:2. "Additional amino acid residue” is described in detail in “3. Peptide (B)”.
  • the peptide in one aspect, may contain a linker, preferably at the C-terminus.
  • Linker will be described in detail in "3. Peptide (B)".
  • G at the C-terminus (17th amino acid residue) of SEQ ID NO: 2 is a linker.
  • the peptide may have a linker other than G, such as a PEG linker. Alternatively, it may have another linker in addition to the C-terminal G. For example, aspects such as glycine-rich peptides are also included.
  • the peptide preferably has TGF- ⁇ binding activity, more preferably TGF- ⁇ 1 binding activity. Said peptide preferably has TGF- ⁇ antagonist activity. “Having TGF- ⁇ 1 binding activity” and “having TGF- ⁇ antagonist activity” are described in detail in “3. Peptides (B)”.
  • Peptide in the present specification includes both peptide (A) and peptide (B) unless otherwise specified.
  • Peptide (B) The present invention relates to peptides.
  • the peptides of the invention have the following amino acid sequences: F-X1-VX2-N-V-X3-X4-X5-X6-V-X7-X8-X9-X10-C (SEQ ID NO: 1) put it here, X1 is an amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain; X2 is any amino acid; X3 is any amino acid; X4 is any amino acid; X5 is any amino acid; X6 is an amino acid having an optionally substituted alkyl group in the side chain or a secondary amino acid having an optionally substituted alkyl group; X7 is an amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain; X8 is an amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain; X9 is any amino acid; X10 is any amino acid, including.
  • Amino acid having an optionally substituted aromatic ring on the side chain is an amino acid having an aromatic ring on the side chain, for example, having a phenyl group or an indole ring as the aromatic ring, and a C etc. may be substituted for other molecules such as N.
  • Aromatic rings may be heterocyclic. Alternatively, for example, it may be an amino acid in which the hydroxyl group of the side chain of tyrosine is substituted with another functional group.
  • the "amino acid having an optionally substituted aromatic ring on the side chain” is, in one aspect, preferably an amino acid having a condensed ring on the side chain.
  • amino acid having an indole ring or a naphthalene structure may be substituted with other molecules such as N.
  • Substituents are not particularly limited, and may be arbitrarily selected from alkyl groups, cycloalkyl groups, hydroxyl groups, halogens, and the like.
  • the "amino acid having an aromatic ring optionally substituted on the side chain” includes, for example, tyrosine, tryptophan, histidine, phenylalanine and the like. It may be a non-natural amino acid such as Nal1, W6N, W7N or W.
  • amino acid having an optionally substituted alkyl group in the side chain refers to amino acids having an alkyl group in the side chain, such as lysine, alanine, proline, glycine, leucine, etc., and the side chains of these amino acids is an amino acid that may or may not be substituted.
  • Alkyl groups may be linear or cyclic.
  • the “secondary amino acid having an optionally substituted alkyl group” is a secondary amino acid and includes any natural or non-natural amino acid having a cyclic or chain structure.
  • the substituent is particularly Not limited.
  • X1 is an amino acid having a condensed ring optionally substituted in the side chain. In one aspect, X1 is Nal1, W6N, W7N or W.
  • X2 is V, K, KCOpipzaa, KCOmeglumine or Q. In one aspect, X2 is V, K, KCOpipzaa, or KCOmeglumine. In one aspect, X2 is not E.
  • X3 is Y, 4Py, A, E, F4G, Q, K, F3G, or 3Py. In one aspect, X3 is Y or 4Py.
  • X4 is an amino acid other than substituted or unsubstituted aromatic amino acids and sulfur-containing amino acids.
  • amino acids having an aromatic ring are, for example, tyrosine, tryptophan, histidine, phenylalanine and the like.
  • sulfur-containing amino acids are, for example, methionine, cysteine and the like.
  • X4 is D, A, Q, K or E. In one aspect, X4 is D.
  • X5 is an amino acid other than substituted or unsubstituted aromatic amino acids and sulfur-containing amino acids. In one aspect, X5 is D, E, KCOpipzaa, KCOmeglumine, A, Q, or K. In one aspect, X5 is D, E, KCOpipzaa or KCOmeglumine.
  • X6 is PeG, K or MeG. In one aspect, X6 is Peg. In one aspect, X6 is not A, N, Q, S (D-configuration), P (D-configuration).
  • X7 is an amino acid having a condensed ring optionally substituted in the side chain. In one aspect, X7 is Nal1, W6N, or W. In one aspect, X7 is Nal1. In one aspect, X7 is not A, Q, K, E.
  • X8 is Y, 4Py, 3Py or E. In one aspect, X8 is Y or 4Py. In one aspect, X8 is not A, Q, K, F3G, F4G.
  • X9 is an amino acid other than substituted or unsubstituted aromatic amino acids and sulfur-containing amino acids.
  • amino acids having an aromatic ring are, for example, tyrosine, tryptophan, phenylalanine and the like.
  • sulfur-containing amino acids are, for example, methionine, cysteine and the like.
  • X9 is H, A, Q or E. In one aspect, X9 is H.
  • X10 is an amino acid other than substituted or unsubstituted aromatic amino acids and sulfur-containing amino acids.
  • Amino acids having an aromatic ring include, for example, tyrosine, tryptophan, histidine, phenylalanine, and the like.
  • sulfur-containing amino acids are, for example, methionine, cysteine and the like.
  • X10 is V, E, KCOpipzaa, KCOmeglumine, Q, K, or A.
  • X10 is V, E, KCOpipzaa or KCOmeglumine.
  • the peptide in one aspect, is a cyclic peptide.
  • Cyclic peptide refers to a peptide in which two amino acids are bonded and all or part of it is cyclic. The bond type between the two amino acids is not particularly limited.
  • Amide bond between the carboxy group of one amino acid and the amino group of the other amino acid thioester bond between the carboxy group of one amino acid and the thiol group of the other amino acid, thiol group of one amino acid and the other amino acid
  • a disulfide bond between the thiol group, a cyclic structure formed by lactam ring formation or a macrocyclization reaction, and those having a lasso peptide-like structure are also included in the cyclic peptide.
  • the amide bond is not limited to one formed by bonding the carboxy group of one amino acid and the amino group of the other amino acid, and the As a result, it suffices if they are bound by an amide bond. The same is true for other bond types. Preferred is cyclization by binding of a chloroacetylated amino acid and a cysteine residue, which will be described later.
  • the cyclic peptide may partially form a cyclic structure and may have a linear portion.
  • Peptides generally have poor metabolic stability in vivo, and because of their large size, they have the problem of being difficult to permeate cell membranes. A method of cyclizing a peptide has been taken to address such a problem. Peptide cyclization improves protease resistance, improves metabolic stability, and restricts conformational changes, suggesting increased rigidity, membrane permeability, and target protein affinity. It has been.
  • the peptide has a cyclic structure in which a chloroacetylated amino acid and a cysteine residue contained in the peptide are bound. In one aspect, the peptide has a cyclic structure in which the N-terminal amino acid (first amino acid residue) and the cysteine residue contained in the peptide are bound. In one aspect, the peptide has a cyclic structure in which the N-terminal amino acid (first amino acid residue) and the 16th cysteine residue contained in the peptide are bound. In one aspect, the peptide has a cyclic structure in which the chloroacetylated N-terminal amino acid (first amino acid residue) and the 16th cysteine residue contained in the peptide are bound. “Chloroacetylation” may also be “halogen acetylation” with other halogens. “Acetylation” may also be “acylation” with an acyl group other than an acetyl group.
  • amino acids may be modified for cyclization of the peptide.
  • Amino acids partially modified as such are also included.
  • a chloroacetyl group may be added to an amino acid located at the N-terminus and cyclized by binding to a cysteine residue in the peptide.
  • Various (natural/non-natural) amino acids are also included in the amino acids of the present application.
  • the peptide is SEQ ID NOS: 2-33, or It comprises or consists of one amino acid sequence in any of SEQ ID NOS: 2, 4-13, and 15-33 that does not have a C-terminal glycine (G).
  • the peptide is SEQ ID NOS: 2-33, or It is a cyclic peptide containing or consisting of one amino acid sequence in any of SEQ ID NOS: 2, 4-13, and 15-33, which does not have glycine (G) at the C-terminus.
  • the peptide comprises or consists of one amino acid sequence in any of SEQ ID NOs: 34-69, or an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 34-69 without a C-terminal glycine (G). .
  • the peptide comprises or consists of one amino acid sequence in any of SEQ ID NOs: 34-69, or an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 34-69 without a C-terminal glycine (G). , is a cyclic peptide.
  • the peptide comprises any of SEQ ID NOS: 2-33, or an amino acid sequence without C-terminal glycine (G) among SEQ ID NOS: 2, 4-13, and 15-33, plus an additional amino acid residue may contain groups.
  • Said peptide comprises any one of SEQ ID NOS: 34-69, or an amino acid sequence without glycine (G) at the C-terminus of SEQ ID NOS: 34-69, plus an additional amino acid It may contain residues.
  • the additional amino acid residue may be contained in a peptide forming a cyclic structure, or an amino acid residue may be added to the cyclic peptide in the form of a linker.
  • the number of amide bonds (number and length of amino acids) of peptides and peptide moieties is not particularly limited. Total amino acid residues (refers to the number of amino acid residues contained in a peptide forming a cyclic structure, and if further amino acid residues are added in a linker form from the cyclic peptide, those amino acids are not included) is 22 residues Within is preferred.
  • the number of amino acids is 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, preferably 20 or less, 19 or less, 18 or less. It is more preferably 15 or more and 18 or less amino acids, and most preferably 16 or 17 amino acids.
  • Linkers include, for example, the aforementioned amino acid linkers (peptide linkers), chemical linkers, fatty acid linkers, nucleic acid linkers, sugar chain linkers, and the like, and may also be complexes such as chemical linkers and peptide linkers.
  • a chemical linker is, for example, a PEG (Polyethyleneglycol) linker. For example, it may be a PEG linker consisting of 1-24 ethylene glycol units.
  • the linker may also be a fatty acid linker containing divalent chemical moieties derived from fatty acids.
  • An amino acid (peptide) linker is a linker comprising at least one amino acid, for example the sequence [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (formula in which n is 1, 2, 3, 4, 5 or 6) or serine-rich peptide linkers as described in US Pat. No. 5,525,491.
  • a linker may change physical properties (eg, solubility) of the peptide.
  • linker addition position it does not matter where it is added.
  • it may be bound to Cys located on the C-terminal side, or may be bound to an amino acid contained in a cyclic peptide. It is preferably bound to Cys located on the C-terminal side or bound to side chains of amino acids contained in the cyclic peptide.
  • the linker is included at the C-terminus.
  • a single linker may be added, or a plurality of the same or different linkers may be added.
  • Gly-Lys may be bound as an amino acid linker
  • a PEG linker may be bound to the side chain terminal of Lys.
  • the peptide may form a multimer via a linker or the like.
  • the peptides may be homomers composed of peptides having the same sequence, or heteromers composed of peptides having different sequences.
  • the C-terminal glycine (G) of SEQ ID NOs: 2, 4-13, 15-33 is a linker.
  • the peptide may have a linker other than G. Alternatively, it may have another linker in addition to the C-terminal G.
  • the peptide has TGF- ⁇ binding activity, more preferably TGF- ⁇ 1 binding activity or TGF- ⁇ 2 binding activity.
  • the peptide has TGF- ⁇ 1 binding activity and TGF- ⁇ 2 binding activity.
  • the peptide has TGF- ⁇ antagonist activity, more preferably TGF- ⁇ 1 antagonist activity or TGF- ⁇ 2 antagonist activity. In a further aspect, preferably the peptide having TGF- ⁇ antagonist activity has TGF- ⁇ 1 binding activity.
  • the term "having TGF- ⁇ 1 binding activity" is not limited to binding activity only to TGF- ⁇ 1, and may include binding to TGF- ⁇ 2.
  • the peptide has TGF- ⁇ 1 antagonist activity and TGF- ⁇ 2 antagonist activity. Also preferably, the peptide having TGF- ⁇ 1 antagonist activity and TGF- ⁇ 2 antagonist activity has TGF- ⁇ 1 binding activity and TGF- ⁇ 2 binding activity.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • BMP bone-inducing factor
  • TGF- ⁇ which is an embodiment of the present invention is TGF- ⁇ 1 and/or TGF- ⁇ 2, preferably TGF- ⁇ 1.
  • TGF- ⁇ refers to TGF- ⁇ 1 unless otherwise specified.
  • TGF- ⁇ binds to serine/threonine kinase-type receptors composed of type I and type II receptor subunits and induces various reactions in the body by transducing signals through Smad phosphorylation.
  • TGF- ⁇ it is known to have many functions, such as controlling cell proliferation and differentiation, and affecting the production and deposition promotion of extracellular matrix proteins such as collagen and fibronectin (Massague, 2012; Zhang et al., 2017).
  • TGF- ⁇ is used in, but not limited to, mammals, including primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, livestock animals such as pigs, cattle, horses, sheep, and goats, and dogs. and TGF- ⁇ of pets such as cats, preferably human TGF- ⁇ , more preferably human TGF- ⁇ 1 (NCBI GENE ID: 7040) and human TGF- ⁇ 2 (NCBI GENE ID: 7042).
  • mammals including primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, livestock animals such as pigs, cattle, horses, sheep, and goats, and dogs.
  • TGF- ⁇ of pets such as cats, preferably human TGF- ⁇ , more preferably human TGF- ⁇ 1 (NCBI GENE ID: 7040) and human TGF- ⁇ 2 (NCBI GENE ID: 7042).
  • TGF- ⁇ 1 binding activity means an activity that specifically binds to TGF- ⁇ 1 or an activity that specifically binds to both TGF- ⁇ 1 and TGF- ⁇ 2.
  • the binding state of the peptide of the present invention to TGF- ⁇ 1 can be expressed as indicators such as affinity constant Ka, dissociation constant Kd (also referred to as KD), binding rate constant kon, and dissociation rate constant koff. .
  • the affinity constant Ka and the dissociation constant Kd are indicators of the binding affinity between two molecules in equilibrium, that is, the strength of binding, and the dissociation constant Kd is the reciprocal of the affinity constant Ka.
  • a smaller value of the dissociation constant Kd means stronger binding.
  • affinity constant Ka dissociation constant Kd (also referred to as KD)
  • association rate constant kon dissociation rate constant koff
  • dissociation rate constant koff dissociation rate constant koff
  • the binding state of the peptide to TGF- ⁇ can be measured by a known method. For example, it can be measured by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance spectroscopy
  • the surface plasmon resonance spectrum analysis can be performed using, for example, the BIACORE system (BIACORE), which is a biosensor (biomolecular mutual analysis device).
  • the Kd dissociation constant Kd for the binding of the peptide to, for example, human TGF- ⁇ is, without limitation, 50 nM or less, 30 nM or less, 20 nM or less, 15 nM or less, 10 nM or less, 8 nM or less, 6 nM. Below, it is 5 nM or less.
  • the lower limit of the dissociation constant Kd of binding between the peptide and human TGF- ⁇ is not particularly limited.
  • the peptide dissociation constant Kd is 0.01 nM or greater, 0.05 nM or greater, 0.1 nM or greater, 0.2 nM or greater, 0.3 nM or greater, 0.4 nM or greater, 0.5 nM or greater.
  • the dissociation constant Kd of said peptide is 0.01-50 nM, preferably 0.05-30 nM, more preferably 0.2-15 nM, particularly preferably 0.3-10 nM, most preferably 0.3-10 nM. 4-6 nM.
  • the binding of the peptide to TGF- ⁇ can also be examined by, for example, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ELISA may be performed, for example, by using TGF- ⁇ 1 beads and a peptide with an HA tag sequence added to the C-terminus and examining the binding activity.
  • the binding between the peptide and TGF- ⁇ is preferably non-covalent binding.
  • the peptide has a cyclic structure as shown in the chemical formulas of Examples 1-6.
  • TGF- ⁇ antagonist activity refers to the activity of inhibiting or attenuating the binding and acting of TGF- ⁇ on TGF ⁇ receptors. In the present invention, those that bind to TGF- ⁇ and exhibit an antagonistic effect are particularly preferred.
  • TGF- ⁇ antagonist activity may be evaluated, for example, by an SBE reporter assay using the SBE reporter-HEK293 cell line (BP Bioscience).
  • the inhibitory activity of a peptide can be calculated with 0% inhibition as the maximum signal induced by TGF- ⁇ and 100% inhibition as no stimulation.
  • the inhibitory activity is 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% 70% or more, 80% or more, 90% or more are inhibited.
  • the peptides of the present invention can be produced by any known method for peptide production, such as the following.
  • the hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group and the carboxyl group of the first amino acid (usually the C-terminal amino acid of the target peptide) whose ⁇ -amino group is protected with a protecting group is esterified.
  • dehydration condensation agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and diisopropylcarbodiimide (DIC) can be used as the esterification catalyst.
  • the protective group for the ⁇ -amino group of the first amino acid is eliminated, and a second amino acid having all functional groups other than the carboxy group of the main chain protected is added to activate the carboxy group. , joins the first and second amino acids. Furthermore, deprotecting the ⁇ -amino group of the second amino acid, adding a third amino acid in which all functional groups other than the carboxy group of the main chain are protected, activating the carboxy group, the second and A third amino acid is attached. After repeating this process and synthesizing a peptide of the desired length, all functional groups are deprotected.
  • Resins for solid-phase synthesis include, for example, Merrifield resin, MBHA resin, Cl-Trtre resin, SASRIN resin, Wang resin, Rink amide resin, HMFS resin, Amino-PEGA resin (Merck), HMPA-PEGA resin (Merck). ) and the like. These resins can be used after washing with a solvent (dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride, etc.).
  • a solvent dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride, etc.
  • ⁇ -amino-protecting groups examples include benzyloxycarbonyl (Cbz or Z) group, tert-butoxycarbonyl (Boc) group, fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl (Alloc) group and the like.
  • Cbz groups can be deprotected by hydrofluoric acid, hydrogenation, etc.
  • Boc groups can be deprotected by trifluoroacetic acid (TFA)
  • Fmoc groups can be deprotected by treatment with piperidine or pyrrolidine.
  • methyl ester for example, methyl ester, ethyl ester, allyl ester, benzyl ester, tert-butyl ester, cyclohexyl ester and the like can be used.
  • Condensing agents include, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC or WSC), (1H-benzotriazol-1-yloxy)tris (dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU) and the like.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • EDC or WSC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
  • BOP 1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluor
  • Cleavage of the peptide chain from the resin can be performed by treatment with an acid such as TFA or hydrogen fluoride (HF).
  • an acid such as TFA or hydrogen fluoride (HF).
  • the production of peptides by genetic recombination can be carried out using nucleic acids encoding said peptides.
  • the nucleic acid encoding the peptide may be DNA or RNA.
  • a nucleic acid encoding the peptide can be prepared by a known method or a method based thereon. For example, it can be synthesized by an automated synthesizer. A restriction enzyme recognition site may be added to insert the resulting DNA into a vector. Alternatively, a base sequence encoding an amino acid sequence for cutting out the resulting peptide chain with an enzyme or the like may be incorporated.
  • the nucleic acid when the peptide is fused with a membrane-permeable peptide or the like, the nucleic acid also includes a nucleic acid encoding the membrane-permeable peptide.
  • nucleic acid encoding a peptide of interest and a peptide binding thereto is used as the nucleic acid.
  • an expression vector is prepared using the nucleic acid encoding the peptide.
  • the nucleic acid can be inserted downstream of the promoter of the expression vector as it is, or after digestion with a restriction enzyme, addition of a linker, or the like.
  • vectors include E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pBluescript II, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, pC1912, pTP4, pE194, pC194, etc.), and yeast-derived plasmids.
  • Plasmids pSH19, pSH15, YEp, YRp, YIp, YAC, etc.
  • bacteriophages e phage, M13 phage, etc.
  • viruses retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus, baculovirus, etc.
  • cosmids and the like.
  • the promoter can be appropriately selected according to the type of host.
  • the host is animal cells, for example, SV40 (simian virus 40)-derived promoters and CMV (cytomegalovirus)-derived promoters can be used.
  • the host is E. coli, the trp promoter, T7 promoter, lac promoter and the like can be used.
  • Expression vectors include, for example, DNA replication origin (ori), selectable markers (antibiotic resistance, auxotrophy, etc.), enhancers, splicing signals, poly-A addition signals, tags (FLAG, HA, GST, GFP, etc.) can also be incorporated.
  • a suitable host cell is transformed with the expression vector.
  • a host can be appropriately selected in relation to the vector.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus), yeast, insects or insect cells, animal cells and the like are used.
  • Animal cells that can be used include, for example, HEK293T cells, CHO cells, COS cells, myeloma cells, HeLa cells, and Vero cells. Transformation can be carried out according to known methods such as the lipofection method, calcium phosphate method, electroporation method, microinjection method and particle gun method, depending on the type of host.
  • the peptide of interest is expressed by culturing the transformant according to a conventional method.
  • Purification of the peptide from the culture of the transformant is carried out by collecting the cultured cells, suspending them in an appropriate buffer, disrupting the cells by sonication, freezing and thawing, and crudely extracting them by centrifugation or filtration. get the liquid If the peptide is secreted into the culture medium, the supernatant is collected.
  • Purification from crude extracts or culture supernatants is also performed by known methods or similar methods (e.g., salting out, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reversed-phase high-performance liquid chromatography, etc.).
  • the resulting peptide may be converted from a free form to a salt or from a salt to a free form by a known method or a method analogous thereto.
  • the translation synthesis system may be a cell-free translation system.
  • Cell-free translation systems generally allow expression products to be obtained in a highly pure form without purification.
  • Cell-free translation systems include, for example, ribosomal proteins, aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), ribosomal RNA, amino acids, rRNA, GTP, ATP, translation initiation factor (IF), elongation factor (EF), terminator (RF), and Includes ribosome regeneration factors (RRFs), as well as other factors required for translation.
  • Escherichia coli extract or wheat germ extract may be added to increase expression efficiency.
  • rabbit erythrocyte extract or insect cell extract may be added.
  • RNA polymerase may also be used for transcription from gene DNA.
  • E. coli-derived systems include Roche Diagnostics' RTS-100 (registered trademark), Gene Frontier's PURE SYSTEM, and NEW ENGLAND Biolabs' PURE Express In Vitro Protein Synthesis Kit.
  • a system using a wheat germ extract those manufactured by ZoiGene, Cellfree Science, etc. can be used.
  • aminoacyl-tRNA synthesized by natural aminoacyl-tRNA synthetase instead of aminoacyl-tRNA synthesized by natural aminoacyl-tRNA synthetase, artificial aminoacyl-tRNA obtained by linking (acylating) a desired amino acid or hydroxy acid to tRNA may be used.
  • aminoacyl-tRNAs can be synthesized using artificial ribozymes.
  • Such ribozymes include flexizymes (H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662; and WO2007/066627, etc.). Flexizyme is also known by other names such as original flexizyme (Fx) and modified dinitrobenzyl flexizyme (dFx), enhanced flexizyme (eFx) and aminoflexizyme (aFx).
  • Fx original flexizyme
  • dFx modified dinitrobenzyl flexizyme
  • eFx enhanced flexizyme
  • aminoflexizyme aminoflexizyme
  • a desired codon can be translated in association with the desired amino acid or hydroxy acid.
  • a special amino acid may be used as the desired amino acid.
  • the unnatural amino acids required for cyclization as described above can also be introduced into the connecting peptide by this method.
  • Chemical synthesis of said peptides uses a variety of methods commonly used in the art, including, for example, stepwise solid phase synthesis, semi-synthesis of peptide fragments via conformationally assisted religation, chemical ligation.
  • can be synthesized by Synthesis of said peptides is described, for example, in K.K. J. Jensen, P. T. Shelton, S. L. Pedersen, Peptide Synthesis and Applications, 2nd Edition, Springer, 2013, etc., using various solid-phase techniques.
  • a preferred strategy is based on the combination of the Fmoc group, which temporarily protects the ⁇ -amino group and allows selective removal with a base, and the protective group, which temporarily protects the side chain functional group and is stable under de-Fmoc conditions. .
  • a selection of such general peptide side chains can be found in Peptide Synthesis and Applications, 2nd ed. B. Fields, R. L. Noble, Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids, Int. J. Peptide Protein Res.
  • peptide side chain protecting groups include, for example, the benzyl, tert-butyl and trityl (Trt) groups for the hydroxy groups of serine and threonine, the hydroxy groups of tyrosine; 2-bromobenzyloxycarbonyl and tert-butyl groups for groups, Boc, methyltetrazolethiol (Mtt), Alloc and ivDde groups for amino groups of lysine side chains, Trt and Boc groups for the imidazole group of histidine , 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl group (Pbf) group for arginine guanidyl group, tert-butyl group for carboxy group including glutamic acid and aspartic acid, allyl group, and There is the 3-methylpentane (Mpe) group, the Trt group for the carboxamide groups of glutamine and
  • the peptide can be synthesized in a stepwise manner on the solid-phase resin described above.
  • the C-terminal amino acid used and all amino acids and peptides used in the synthesis must have the ⁇ -amino protecting group selectively removed during the synthesis process.
  • the above-mentioned solid-phase resin is used, and the C-terminal carboxyl group of a peptide whose N-terminus is appropriately protected with Fmoc or the like or the C-terminal carboxyl group of an amino acid whose N-terminus is protected with Fmoc is activated with an appropriate reagent and then solidified. Start by adding to an amino group on the phase resin.
  • Subsequent elongation of the peptide chain can be achieved by successively repeating removal of the N-terminal protecting group (Fmoc group) and subsequent condensation of the protected amino acid derivative according to the amino acid sequence of the target peptide. In addition, these can release the target peptide at the final stage.
  • Fmoc group N-terminal protecting group
  • conditions for liberation are described in Teixeira, W.; E. Benckhuijsen, P.; E. de Koning, A. R. P. M. Valentijn, J.; W. Drijfhout, Protein Pept. Lett. , 2002, 9, 379-385.
  • a typical example is TFA/Water/TIS/DODT (volume ratio 92.5:2.5:2.5:2.5).
  • Synthesis of the peptides described herein can be performed using a single or multi-channel peptide synthesizer, such as the CEM Liberty Blue synthesizer or the Biotage Syro I synthesizer or their successors.
  • a single or multi-channel peptide synthesizer such as the CEM Liberty Blue synthesizer or the Biotage Syro I synthesizer or their successors.
  • Condensing agents include, for example, dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC or WSC), (1H-benzotriazol-1-yloxy)tris (dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU) and the like.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • EDC or WSC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
  • BOP 1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide
  • Cyclization of peptides can be performed according to known methods.
  • a peptide can be designed to contain two or more cysteine residues so that it can form a cyclic structure through disulfide bonds after being translated.
  • a peptide having a chloroacetyl group at the N-terminus was synthesized by genetic code reprogramming technology, Cyclization can also be achieved by placing a cysteine residue containing a sulfur molecule in the peptide.
  • cyclization may be achieved by placing an L-2-amino adipic acid residue in the peptide and coupling between the N-terminal backbone amino groups.
  • any known cyclization method can be used without particular limitation.
  • the present invention relates to composites.
  • This complex is a complex comprising any of the peptides described above, a linker bound to the peptide, and a substance bound to the linker. Since the peptide can bind to TGF- ⁇ , the complex can deliver the substance to TGF- ⁇ .
  • PDC peptide drug conjugate
  • the substance can be any substance desired by one of skill in the art, so long as it is desired to deliver it to TGF- ⁇ .
  • examples of said substances include, but are not limited to: Compounds: including low-molecular-weight compounds and middle-molecular-weight compounds, such as known low-molecular-weight drugs.
  • Peptide It may be a peptide that binds to a target in the body and exhibits some effect, for example, it may be a cyclic peptide different from the peptide of the present invention.
  • RI Any compound that can be labeled with a radioisotope, such as a low-molecular-weight compound, a middle-molecular-weight compound, or an antibody labeled with a radioisotope. Examples include compounds for PET examination.
  • Protein Any protein that exhibits useful functions in the body, such as antibodies and enzymes. Examples include enzymes used in enzyme replacement therapy.
  • Nucleic acid Anything that contains a base sequence, such as DNA and RNA. Examples include nucleic acid medicines.
  • DDS drug delivery systems
  • the substances listed above may be complexes in which a plurality of substances are bound.
  • the multiple-binding substances may be of the same type or of different types.
  • PDC peptide drug conjugate
  • compositions comprising the peptides of the present invention.
  • peptide can also include the complex of "5. Complex”.
  • the composition is, without limitation, a medical composition, a diagnostic composition, or a research composition.
  • compositions may contain the peptide itself, but may also contain a pharmaceutically acceptable salt or solvate of the peptide.
  • peptide may include a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, unless otherwise specified.
  • the pharmaceutical composition preferably contains an effective amount of the peptide as an active ingredient.
  • Diseases targeted by the "pharmaceutical composition” include both diseases for which the above-mentioned peptides themselves are effective and diseases for which drugs that modify the peptides are effective.
  • Diseases targeted by the pharmaceutical composition include, but are not limited to, diseases associated with the TGF- ⁇ signaling pathway, such as tumors, cancers, and cell proliferation such as abnormal fibrosis of cells.
  • diseases associated with It is also useful as an active ingredient of pharmaceutical compositions for treatment of renal dysfunction including glomerulosclerosis, liver cirrhosis, myocardial infarction and the like.
  • diseases for which drugs that modify peptides are effective may be targeted.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be oral administration or parenteral administration.
  • Parenteral administration includes, for example, injection administration such as intramuscular injection, intravenous injection, and subcutaneous injection, transdermal administration, and transmucosal administration (nasal, oral, ocular, pulmonary, vaginal, and rectal) administration. etc. are raised.
  • the pharmaceutical composition can be modified in various ways in view of the properties of the polypeptide that are easily metabolized and excreted.
  • polyethylene glycol (PEG) or sugar chains can be added to polypeptides to prolong blood residence time and reduce antigenicity.
  • biodegradable polymer compounds such as polylactic acid glycol (PLGA), porous hydroxyapatite, liposomes, surface-modified liposomes, emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, nanospheres, etc. are used as sustained-release bases. , which may be used to encapsulate the polypeptide.
  • a weak electric current can be applied to the skin surface to permeate the stratum corneum (iontophoresis method).
  • the pharmaceutical composition may use the active ingredient as it is, or may be formulated by adding pharmaceutically acceptable carriers, excipients, additives, and the like.
  • Dosage forms include liquids (e.g., injections), dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, troches, Examples include inhalants, ointments, eye drops, nose drops, ear drops, poultices, and the like.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilizers, colorants, flavoring agents, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjustment Agents, preservatives, antioxidants and the like can be used as appropriate and can be carried out in a conventional manner.
  • ingredients used for formulation include purified water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, pharmaceutically acceptable organic solvents such as ethanol, animal and vegetable oils, lactose, mannitol, glucose, sorbitol, and crystalline cellulose. , hydroxypropylcellulose, starch, cornstarch, anhydrous silicic acid, magnesium aluminum silicate, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethylstarch.
  • pectin methyl cellulose, ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, tragacanth, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, octyldodecyl myristate, isopropyl myristate, higher alcohol, stearyl alcohol, stearin Examples include, but are not limited to, acid, human serum albumin, and the like.
  • the pharmaceutical composition can contain an absorption enhancer that improves the absorption of poorly absorbable drugs.
  • absorption enhancers include surfactants such as polyoxyethylene lauryl ethers, sodium lauryl sulfate, and saponin; bile salts such as glycocholic acid, deoxycholic acid and taurocholic acid; chelating agents such as EDTA and salicylic acids; Fatty acids such as caproic acid, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, mixed micelles; enamine derivatives, N-acyl collagen peptides, N-acyl amino acids, cyclodextrins, chitosans, nitric oxide donors, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition when it is a pill or tablet, it may be coated with a sugar-coating, gastric-soluble, or enteric-coating substance.
  • the pharmaceutical composition when it is an injection, it may contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, alcohols, and the like.
  • wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, solubilizers, preservatives and the like may be added.
  • the pharmaceutical composition may be intended not only for humans but also for non-human mammals or birds.
  • non-human mammals include non-human primates (monkeys, chimpanzees, gorillas, etc.), livestock animals (pigs, cows, horses, sheep, etc.), dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, rabbits, etc. included.
  • the dosage when administered to humans varies depending on symptoms, patient age, sex, weight, sensitivity difference, administration method, administration interval, type of active ingredient, type of preparation, and is not limited, for example, 30 ⁇ g ⁇ 100 g, 100 ⁇ g to 500 mg, 100 ⁇ g to 100 mg can be administered once or divided into several doses.
  • 1 ⁇ g/kg to 3000 ⁇ g/kg or 3 ⁇ g/kg to 1000 ⁇ g/kg may be administered once or in several doses depending on the body weight of the patient.
  • the present invention relates to methods for preventing or treating diseases by administering the peptides of the present invention.
  • the present invention relates to the use of the peptide of the present invention for prevention or treatment of diseases.
  • the present invention relates to the use of the peptides of the present invention for manufacturing pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of diseases.
  • the present invention relates to peptides of the present invention for use in methods of preventing or treating diseases.
  • the present invention also relates to diagnostic compositions comprising the peptides of the invention.
  • the peptide preferably has TGF- ⁇ binding activity, more preferably TGF- ⁇ 1 binding activity. “Having TGF- ⁇ 1 binding activity” is as described in detail in “3. Peptide (B)”. Since the peptide of the present invention binds to TGF- ⁇ , it can also be used as a diagnostic agent for detecting TGF- ⁇ .
  • the diagnostic agent may be an agent for detecting the amount of TGF- ⁇ , and when used as a detecting agent, the peptide of the present invention may be detectably labeled. When labeled with a labeling substance, the peptide forms a complex with TGF- ⁇ , enabling detection or quantification of TGF- ⁇ via the labeling substance.
  • the type of labeling substance is not particularly limited.
  • Non-limiting examples include fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, fluorescent substances such as near-infrared fluorescent materials, chemiluminescent dyes, radioactive substances (e.g., 125I, 131I, 35S, 3H, etc.) or radioisotope metal ion chelate complexes, such as DOTA or desferrioxamine chelate complexes), and fluorescent proteins such as biotin and GFP (green fluorescent protein), photoproteins, peroxidase, alkaline phosphatase including enzymes such as Examples of preferred labeling substances are fluorescein and fluorescein derivatives such as FITC, rhodamine derivatives such as rhodamine and tetramethylrhodamine, and fluorescent dyes such as Texas Red.
  • a disease that can be diagnosed with a diagnostic composition is not particularly limited. Examples thereof include diseases associated with the TGF- ⁇ signaling pathway, including diseases associated with cell proliferation such as tumors, cancers, and abnormal cell fibrosis. It is also useful as a diagnostic composition for renal insufficiency including glomerulosclerosis, liver cirrhosis, myocardial infarction and the like.
  • the present invention relates to methods for diagnosing diseases by using the peptides of the present invention.
  • Method of diagnosing includes in vivo or in vitro diagnostic methods. Preferably, it is an in vitro diagnostic method.
  • the present invention also relates to methods of detecting diseases by using the peptides of the present invention. Disease detection can also be performed by, for example, laboratory technicians, researchers, etc. other than doctors at research institutions (including educational institutions such as universities), companies, and the like. In one aspect, the method of detecting disease does not involve medical intervention.
  • the present invention relates to the use of the peptides of the present invention for diagnosing or detecting diseases.
  • the present invention relates to the use of the peptide of the present invention for producing a composition for diagnosing or detecting diseases.
  • the present invention relates to peptides of the present invention for use in methods of diagnosing or detecting diseases.
  • compositions for research include those used by researchers, engineers, students, doctors, etc. in research institutions (including educational institutions such as universities), companies, hospitals, and the like.
  • composition for research can be used, for example, for purification or detection of TGF- ⁇ and detection of disease.
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention has TGF- ⁇ antagonist activity, it can be used as an additive to media for culturing cells and organs. It can also be used as an additive to protective solutions to protect organs for transplantation. Without limitation, it may be a medium for culturing organs such as liver and brainstem or fragments thereof, or a medium for culturing totipotent cells such as stem cells. Furthermore, it is also possible to use, for example, cell culture for cell therapy in regenerative medicine. "Research compositions" of the present invention include compositions used in such culture media.
  • compositions for research of the present invention excludes compositions used as additives to media for culturing organoids.
  • An “organoid” is an in vitro culture that is derived from human stem cells, cultured three-dimensionally due to its self-aggregation, self-renewal and differentiation abilities, and formed by self-organization. "Organoids” are also thought of as "miniature versions of organs.”
  • the peptide Since the peptide has binding activity (affinity), particularly high binding activity, to TGF- ⁇ , particularly TGF- ⁇ 1, it is possible to selectively separate TGF- ⁇ from human serum, for example. Said peptides can therefore be used in a method for the purification of TGF- ⁇ . Methods for purifying TGF- ⁇ include, for example, binding the peptide or the immobilized peptide to TGF- ⁇ , releasing the bound TGF- ⁇ and recovering TGF- ⁇ . Additionally, the peptides may be used in methods for detecting TGF- ⁇ . A method for detecting TGF- ⁇ includes, for example, allowing TGF- ⁇ in a sample to bind to the peptide or the immobilized peptide, and detecting the bound TGF- ⁇ . Here, detection shall include either qualitative or quantitative analysis.
  • the carrier for immobilizing the peptide is not particularly limited, and examples thereof include microtiter plates made of lath, metal, resin, etc., substrates, beads, nitrocellulose membranes, nylon membranes, PVDF membranes, and the like. be done.
  • the present invention includes methods for purifying or detecting TGF- ⁇ using the peptides of the present invention.
  • the present invention also includes the use of the peptides of the present invention for purifying or detecting TGF- ⁇ .
  • the present invention relates to a diagnostic or detection kit containing the peptide of the present invention.
  • the diagnostic or detection kit includes reagents and instruments necessary for the detection (without limitation, any of the peptides of the present invention, antibodies, solid phase carriers, buffer solutions, enzyme reaction stop solutions, microplate readers, etc. or including all).
  • the present invention relates to a diagnostic or detection tester containing the peptide of the present invention.
  • the elongation of the peptide chain on the solid-phase resin was carried out using the resins described in each example as starting materials, and using the commonly used peptide coupling reaction conditions and Fmoc removal reaction conditions.
  • the reaction was carried out using an automatic peptide synthesizer, Liberty Blue from CEM, or Siro I from Biotage, according to the manufacturer's manual.
  • Fmoc-Trp(Boc)-OH Fmoc-Gly-OH; Fmoc-Asp(OMpe)-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-His(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH.
  • TGFb1_001 SEQ ID NO:2
  • TGFb1_001 SEQ ID NO:2 having the following structure was synthesized.
  • the target peptide was synthesized starting from removal of the Fmoc group by the general chemical synthesis method described above.
  • CEM's Liberty Blue HT was used as a solid-phase synthesizer, and synthesis was carried out according to the manufacturer's manual.
  • Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure (5.25 equivalents/10 equivalents/5 equivalents) was used with respect to 1 equivalent of the resin, and the reaction was carried out once in DMF at 90°C for 3 minutes. . However, the 9th residue was reacted twice at 90°C for 10 minutes. The 14th and 16th residues were reacted once at 50°C for 15 minutes.
  • the basic condition for removing Fmoc was to react with a 20% piperidine DMF solution at 75°C for 3 minutes.
  • Fmoc removal of 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, and 8th residues is 20% of piperidine.
  • the reaction was carried out twice with a DMF solution at 25°C for 5 minutes.
  • chloroacetyl group is performed by removing the Fmoc group of the ⁇ -amino group of the solid-phase resin holding the Fmoc-protected peptide obtained in the previous step by the method described above, followed by addition of 0.2M chloroacetic acid (approximately 5 equivalents) DMF solution, 0.5 M HATU (about 5 equivalents) DMF solution, and 1 M DIEA (about 10 equivalents) DMF solution were added to the solid-phase resin and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • 0.2M chloroacetic acid approximately 5 equivalents
  • 0.5 M HATU about 5 equivalents
  • DIEA about 10 equivalents
  • Deprotection of the side chain and cleavage from the solid-phase resin are performed by first washing the resin obtained after the chloroacetyl group-introducing step with DMF five times and methylene chloride three times, drying under reduced pressure, and then solid-phase resin.
  • Reagent cocktail-A (5 mL, a mixture of TFA/H 2 O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5) was added to the reaction vessel containing Shake for 60 minutes.
  • the reaction solution was collected by filtration through a frit.
  • the solid-phase resin remaining in the reaction vessel was shaken again with the cutting cocktail, and the solution component was recovered from the frit and mixed with the above filtrate.
  • the filtrate was added to excess diisopropyl ether/hexane (1/1) mixed solvent cooled to 0° C., precipitation occurred.
  • the mixture was centrifuged (9000 rpm, 1 min) and the solution decanted.
  • the obtained solid was washed with 15 mL of diethyl ether cooled to 0° C. again three times, and then dried under reduced pressure. The resulting solid was used for the next cyclization reaction.
  • the peptide was dissolved in DMSO so that the final concentration was 5 mM based on the number of moles of the solid phase resin, then 10 equivalents of triethylamine was added and shaken at room temperature for about 5 hours.
  • the resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure using Genevac EZ-2 (less than 40° C., reduced pressure time: 14 hours).
  • the obtained crude product was purified using the following conditions.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the analysis conditions and was 96.0%.
  • TGFb1_012 SEQ ID NO: 13
  • TGFb1_012 SEQ ID NO: 13
  • the target peptide was synthesized starting from the removal of the Fmoc group by the general chemical synthesis method described above. At that time, Biotage's Siro I was used as a solid-phase synthesizer, and synthesis was carried out according to the manufacturer's manual.
  • Fmoc-AA/HATU/DIPEA (4.2 equivalents/4 equivalents/8 equivalents) was used with respect to 1 equivalent of the resin, and reactions were performed twice in DMF at 75°C for 20 minutes. However, the 11th, 12th and 13th residues were reacted once at 75°C for 20 minutes. The 14th residue was reacted once at room temperature for 60 minutes. The 15th residue was reacted once at 75°C for 20 minutes. The 17th residue was reacted once at 75°C for 10 minutes. The 16th residue was reacted once at room temperature for 20 minutes.
  • the basic condition for removing Fmoc was to react with a 20% piperidine DMF solution at room temperature for 5 minutes and 15 minutes.
  • chloroacetyl group is performed by removing the Fmoc group of the ⁇ -amino group of the solid-phase resin holding the Fmoc-protected peptide obtained in the previous step by the method described above, followed by addition of 0.2M chloroacetic acid (approximately 5 equivalents) DMF solution, 0.2 M DIPCI (about 5 equivalents) DMF solution, and 0.2 M HOSu (about 5 equivalents) DMF solution were added to the solid-phase resin and shaken at room temperature for 90 minutes.
  • Deprotection of the side chain and cleavage from the solid-phase resin are performed by first washing the resin obtained after the chloroacetyl group-introducing step with DMF five times and methylene chloride three times, drying under reduced pressure, and then solid-phase resin.
  • Reagent cocktail-A (3 mL, a mixture of TFA/H 2 O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5) was added to the reaction vessel containing Shake for 60 minutes.
  • the reaction solution was collected by filtration through a frit.
  • the solid-phase resin remaining in the reaction vessel was shaken again with the cutting cocktail, and the solution component was recovered from the frit and mixed with the above filtrate.
  • Addition of the filtrate to excess diisopropyl ether solvent chilled to 0° C. resulted in precipitation.
  • the mixture was centrifuged (9000 rpm, 3 minutes) and the solution decanted.
  • the obtained solid was washed with 10 mL of diethyl ether cooled to 0° C. again three times, and then dried under reduced pressure. The resulting solid was used for the next cyclization reaction.
  • the peptide cyclization reaction was carried out by dissolving the peptide in a mixed solution of DMSO/water (9/1) so that the final concentration of the peptide was 2.5 mM based on the number of moles of the solid-phase resin, and then adding 10 equivalents of triethylamine. Shake at room temperature for about 18.5 hours. After adding 20 equivalents of acetic acid to the reaction solution, the resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure using Genevac EZ-2 (less than 40° C., reduced pressure time: 16 hours).
  • the obtained crude product was purified using the following conditions.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the analysis conditions and was 90.5%.
  • TGFb1_031 SEQ ID NO:32
  • TGFb1_031 SEQ ID NO:32
  • the target peptide was synthesized starting from removal of the Fmoc group by the general chemical synthesis method described above.
  • CEM's Liberty Blue HT was used as a solid-phase synthesizer, and synthesis was carried out according to the manufacturer's manual.
  • Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure (4.2 equivalents/8 equivalents/4 equivalents) was used with respect to 1 equivalent of resin, and the reaction was carried out once in DMF at 90°C for 3 minutes.
  • the 3rd, 4th, 6th, 7th, 11th and 15th residues were reacted once at 75°C for 20 minutes.
  • the 9th residue was reacted twice at 90°C for 3 minutes.
  • the 10th residue was reacted twice at 75°C for 20 minutes.
  • the 14th residue was reacted once at 50°C for 15 minutes.
  • the basic condition for removing Fmoc was to react with a 20% piperidine DMF solution at 75°C for 3 minutes.
  • 1st residue, 2nd residue, 3rd residue, 4th residue, 5th residue, 6th residue, 7th residue, 8th residue, 11th residue, 12th residue Fmoc removal of residues 1, 13, 15, 17 and 18 was carried out twice with a 20% piperidine solution in DMF at 25°C for 5 minutes.
  • the chloroacetyl group is introduced into the solid-phase resin holding the Fmoc-protected peptide obtained in the previous step by removing the Fmoc group of the ⁇ -amino group by the method described above, followed by addition of 0.1 M chloroacetic acid (approximately 5 equivalents) DMF solution, 0.1 M HATU (about 5 equivalents) DMF solution, and 0.2 M DIEA (about 10 equivalents) DMF solution were added to the solid-phase resin and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • 0.1 M chloroacetic acid approximately 5 equivalents
  • 0.1 M HATU about 5 equivalents
  • DIEA about 10 equivalents
  • Deprotection of the side chain and cleavage from the solid-phase resin are performed by first washing the resin obtained after the chloroacetyl group-introducing step with DMF five times and methylene chloride three times, drying under reduced pressure, and then solid-phase resin.
  • Reagent cocktail-A (5 mL, a mixture of TFA/H 2 O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5) was added to the reaction vessel containing Shake for 60 minutes.
  • the reaction solution was collected by filtration through a frit.
  • the solid-phase resin remaining in the reaction vessel was shaken again with the cutting cocktail, and the solution component was recovered from the frit and mixed with the above filtrate.
  • the filtrate was added to excess diisopropyl ether/hexane (1/1) mixed solvent cooled to 0° C., precipitation occurred.
  • the mixture was centrifuged (9000 rpm, 2 minutes) and the solution decanted.
  • the obtained solid was washed with 15 mL of diethyl ether cooled to 0° C. again three times, and then dried under reduced pressure. The resulting solid was used for the next cyclization reaction.
  • the obtained crude product was purified using the following conditions.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the analysis conditions and was 99.2%.
  • the peptide obtained here is referred to as peptide A.
  • the obtained crude product was purified using the following conditions.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the analysis conditions and was 98.2%.
  • TGFb1_032 (SEQ ID NO:33)
  • TGFb1_032 (SEQ ID NO:33) having the following structure was synthesized.
  • the obtained crude product was purified using the following conditions.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the analysis conditions and was 99.3%.
  • TGFb1_024 (SEQ ID NO:25)
  • TGFb1_024 (SEQ ID NO:25) having the following structure was synthesized.
  • the target peptide was synthesized starting from the removal of the Fmoc group by the general chemical synthesis method described above. At that time, Biotage's Siro I was used as a solid-phase synthesizer, and synthesis was carried out according to the manufacturer's manual.
  • Fmoc-AA/HATU/DIPEA (4.2 equivalents/4 equivalents/8 equivalents) was used with respect to 1 equivalent of the resin, and reactions were performed twice in DMF at 75°C for 20 minutes. However, the 4th and 9th residues were reacted twice at 75°C for 30 minutes. The 14th residue was reacted twice at room temperature for 30 minutes. The 15th residue was reacted once at 75°C for 20 minutes. The 16th residue was reacted once at room temperature for 20 minutes. The 17th residue was reacted once at 75°C for 10 minutes.
  • the basic condition for removing Fmoc was to react with a 20% piperidine DMF solution at room temperature for 5 minutes and 15 minutes.
  • the peptide cyclization reaction was carried out by dissolving the peptide in a mixed solution of acetonitrile/water (1/1) so that the final concentration of the peptide was 2.5 mM based on the number of moles of the solid-phase resin, and then adding 10 equivalents of triethylamine. Shake at room temperature for about 3 hours. After adding 20 equivalents of acetic acid to the reaction solution, the resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure using Genevac EZ-2 (less than 40° C., reduced pressure time: 16 hours).
  • the obtained crude product was purified using the following conditions.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the analysis conditions and was 79.9%.
  • HA tag resin (0.65 mmol/g, 0.004 mg, 2.5 ⁇ mol scale)
  • the target peptide was synthesized.
  • Biotage's Siro II was used as a solid-phase synthesizer, and synthesis was carried out according to the manufacturer's manual.
  • the chloroacetyl group is introduced by removing the Fmoc group of the ⁇ -amino group of the solid-phase resin holding the Fmoc-protected peptide obtained in the previous step by the method described above, followed by addition of 0.3 M chloroacetic acid.
  • a DMF solution (4.2 equivalents), a 0.28 M HATU DMF solution (3.9 equivalents), and a 1.05 M DIPEA DMF solution (8.4 equivalents) were added to the solid-phase resin and shaken at room temperature for 30 minutes. It was done by repeating twice.
  • the resin obtained after the step of introducing the chloroacetyl group was washed five times with DMF and three times with methylene chloride, and then dried under reduced pressure. Subsequently, reactant cocktail-A (a mixture of TFA/H2O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5) was added to the reaction vessel containing the solid-phase resin, and for 60 minutes.
  • reactant cocktail-A a mixture of TFA/H2O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5
  • the reaction solution was collected by filtration through a frit.
  • the solid-phase resin remaining in the reaction vessel was shaken again with the cutting cocktail, and the solution component was recovered from the frit and mixed with the above filtrate.
  • the filtrate was added to diisopropyl ether (1.5 mL) chilled to 0° C. resulting in precipitation.
  • the mixture was centrifuged (8500 rpm, 30 seconds) and the solution was decanted.
  • the resulting solid was washed twice with diethyl ether/hexane (1:1, 1 mL) cooled to 0° C. again and dried under reduced pressure. The resulting solid was used for the next cyclization reaction.
  • the cyclization reaction of the peptide was performed after dissolving in isopropyl alcohol/water/DMSO (1:1:18) so that the final concentration of the peptide was 25 mM (2.5 ⁇ mol/0.1 mL) based on the number of moles of the solid-phase resin. , 20 equivalents of triethylamine was added and shaken at room temperature for 63 hours. 40 equivalents of acetic acid were added to the resulting reaction solution.
  • the obtained reaction solution was subjected to solid-phase extraction using a Gilson column (column: Gilson ASPEC C18 500 mg 3 mL).
  • the purity of one of the main peaks of the target product was 21.8% calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 220 nm) chromatogram under the following analysis conditions.
  • SEQ ID NOs: 2, 4-13, and 15-33 have a glycine (G) linker added to the C-terminus of a cyclic peptide whose amino acid sequence has a cyclic structure.
  • SEQ ID NO: 32 further has K (MePEG8c) added to the end of the G linker, and SEQ ID NO: 33 further has K (OCOmPEG 10000) added to the end of the G linker.
  • SEQ ID NO: 3 has the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2, but does not have a C-terminal glycine (G) linker.
  • SEQ ID NO: 14 has the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 13, but does not have a C-terminal glycine (G) linker.
  • a peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 34-69 also has G linked as a linker to the C-terminus of the cyclic peptide having a cyclized structure.
  • the HA-tag is bound to the G end of the C-terminal linker of the peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 34-69. This is an amino acid sequence necessary for evaluating the binding of the TGF- ⁇ inhibitory peptide to TGF- ⁇ 1 by ELISA, and does not affect the activity.
  • the synthesized peptide was analyzed under the analysis conditions described in Example 1-6, and the structure was confirmed by ESI-MS (+) in mass spectrometry. Tables 1 and 4 show the obtained ESI-MS (+) observed values and the valences in those cases.
  • Example 8 Intermolecular interaction evaluation test between TGF- ⁇ and peptide by surface plasmon resonance (SPR)
  • SPR surface plasmon resonance
  • TGF- ⁇ is human-derived TGF- ⁇ 1 or ⁇ 2 (recombinant human TGF- ⁇ 1, 2) and was obtained from R&D Systems. After immobilization, 1.0 M ethanolamine aqueous solution (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.) was allowed to react for 420 seconds at a flow rate of 10 ⁇ L/min for capping.
  • a peptide solution prepared to 10 mM in DMSO solution was diluted with running buffer to a final concentration of 10 ⁇ M peptide solution, and then 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 5 nM and 2.5 nM peptide solutions were prepared. was made. Using the samples described above, the kinetics of peptides against TGF- ⁇ was obtained by SPR measurements.
  • the kinetics evaluation model was Single Cycle Kinetics, and curve fitting was performed using Biacore T200 Evaluation Software Version 3.0 (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.). The resulting sensorgrams were subjected to curve fitting by the method of least squares, and the KD values were obtained to evaluate the binding of various peptides to TGF- ⁇ .
  • Tables 2 and 3 show the KD values of peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-33. As shown in Tables 2 and 3, the peptides of SEQ ID NOS:2-33 were shown to have binding ability to TGF- ⁇ 1.
  • the peptides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 14 have the same amino sequence forming a cyclic peptide structure as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 13, respectively, and differ only in the presence or absence of glycine addition at the linker site.
  • the peptide of SEQ ID NO: 3 has a KD of 0.46 nM
  • the peptide of SEQ ID NO: 14 has a KD of 0.82 nM. It was almost the same as the KD of. This suggests that the peptide of the present invention can bind to TGF- ⁇ 1 even if a linker is added.
  • TGF- ⁇ 1, ⁇ 2 isoforms of TGF- ⁇
  • SBE reporter-HEK293 cells were cultured in E-MEM (Wako) containing 10% FBS (Sigma). After detaching the cells using Accutase (Innovative Cell Technologies), they were suspended in E-MEM containing 0.5% FBS and seeded in a 96-well plate at 45,000 cells per well overnight. cultured. The next day, peptides were added and left to stand for 20 minutes, then recombinant human TGF- ⁇ 1 (R&D systems) and recombinant human TGF- ⁇ 2 (R&D systems) were added to 0.13 nM and cultured for 18 hours.
  • ONE-Glo luciferase assay reagent was added to each well and shaken for 5 minutes.
  • a SpectraMax Paradigm multimode microplate reader (Molecular Devices) was used for signal detection. The obtained signals were analyzed with GraphPad Prism, and the inhibitory activity of the peptide was calculated with the maximum value of the signal induced by TGF- ⁇ as 0% inhibition and no stimulation as 100% inhibition.
  • Tables 2 and 3 show the TGF- ⁇ 1 inhibitory activity evaluation results of the peptides composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-33 synthesized in Examples 1-5 and 7. As shown in Tables 2 and 3, various synthesized peptides were shown to have TGF- ⁇ 1 antagonist activity. As described above, the peptides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 14 have the same amino sequence forming a cyclic peptide structure as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 13, respectively, and the only difference is the presence or absence of glycine at the linker site. Since the binding activity is the same as in 8, the results for the SBE reporter are omitted.
  • FIG. 1 shows the results of selectivity evaluation for TGF- ⁇ isoforms (TGF- ⁇ 1, ⁇ 2).
  • TGF- ⁇ 1, ⁇ 2 TGF- ⁇ isoforms
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 synthesized in Example 2 exhibited inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 and TGF- ⁇ 2. This indicates that the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 of the present invention inhibits not only TGF- ⁇ 1 but also TGF- ⁇ 2.
  • HA-tag was bound to the end of G of the C-terminal linker of the peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 34-69.
  • HA-tag refers to the amino acid sequence of PEG10c-YPYDVPDYYA (SEQ ID NO: 70). This is the amino acid sequence necessary for evaluating the binding of TGF- ⁇ inhibitory peptides to TGF- ⁇ 1 by ELISA. It does not affect the binding activity with TGF- ⁇ 1.
  • the binding activity between the peptide and TGF- ⁇ 1 was examined by ELISA using the HA-tag-bound peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 34-69 and TGF- ⁇ 1 beads.
  • TGF- ⁇ 1 beads Preparation of TGF- ⁇ 1 beads> Recombinant human TGF- ⁇ 1 (R&D Systems) was immobilized on Dynabead M-270 Carboxylic Acid (Thermo fisher scientific) to produce TGF- ⁇ 1 beads. An Amine Coupling kit (Dojindo Laboratories) was used for the immobilization reaction.
  • TGF- ⁇ 1 beads and a peptide having an HA tag sequence attached to its C-terminus were reacted in PBS containing 0.1% Tween 20 (Nacalai Tesque) (PBS-T) for 1 hour and then washed with PBS-T.
  • PBS-T PBS containing 0.1% Tween 20
  • PBS-T Anti-HA-tag mAb-HRP-DirectT
  • TGF- ⁇ 1 beads described above were reacted in PBS-T containing 1% BSA for 30 minutes.
  • the binding activity is shown as a relative value when the binding ability of the peptide of TGFb1_061 (SEQ ID NO: 62) to TGF- ⁇ 1 is taken as 100%.
  • Table 4 shows the results. As shown in Table 4, the peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS:34-69 were shown to have the ability to bind to TGF- ⁇ 1.
  • the m/z of SEQ ID NOs: 32 and 33 in Table 1 are the values before the addition of the MePEG8c and OCOmPEG10000 structures among the linkers K (MePEG8c) and K (OCOmPEG10000), respectively.
  • the concentration (nM) under the SBE reporter column in Tables 2 and 3 describes the concentration of the peptide used for actual measurement.
  • TGF- ⁇ -binding activity in Table 4 is shown as a relative value when the TGF- ⁇ 1-binding ability of the peptide of TGFb1 — 061 (SEQ ID NO: 62) is taken as 100%.
  • REFERENCE EXAMPLES Synthesis of Novel Unnatural Amino Acids This reference example demonstrates the synthesis of unnatural amino acids contained in the peptides of the present invention.
  • the resulting product (8.70 g, 13.82 mmol) was dissolved in dichloromethane (100 mL), imidazole (2.35 g, 34.5 mmol) and triisopropylchlorosilane (3.33 g, 17.27 mmol) were added under ice cooling. The mixture was added and stirred at room temperature for 5 days. The reaction was diluted with ethyl acetate and washed with water three times. The extract layer was dried over sodium sulfate, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the peptide according to the present invention has binding activity to TGF- ⁇ , and preferably has TGF- ⁇ antagonist activity. It can be used as a pharmaceutical composition for cancer, liver disease, etc., a diagnostic composition, a research composition, and the like.

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Abstract

本発明は、ペプチド及び当該ペプチドを含む組成物に関する。本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列：　Ｆ－Ｎａｌ１－Ｖ－Ｖ－Ｎ－Ｖ－Ｙ－Ｄ－Ｄ－ＰｅＧ－Ｖ－Ｎａｌ１－Ｙ－Ｈ－Ｖ－Ｃ－Ｇ（配列番号２）；あるいは、上記のアミノ酸配列の２番目、４番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目及び１７番目のアミノ酸残基からなるグループから選択される、１－１１個のアミノ酸残基において、置換、付加、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列、を含む。

Description

ペプチド
　本発明は、ペプチド、当該ペプチドを含む組成物、及び当該ペプチドの利用に関する。
　ＴＧＦ－β（形質転換増殖因子：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β）は、ＴＧＦ－βファミリーに属するサイトカインで、多くの機能を有する。ＴＧＦ－βファミリーにはＴＧＦ－βの３つのアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、β２及びβ３）やその他の多くのシグナル伝達タンパク質が含まれる。ＴＧＦ－βは、細胞の増殖や分化の制御、コラーゲン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質の産生及び沈着促進に影響するなど、多くの機能を有することが知られている。ＴＧＦ－βを介したシグナル伝達経路は、例えばがん細胞の増殖、転移や血管新生、免疫応答制御などと関係することが知られている（特表２０２１－１００９７２）。そのため、ＴＧＦ－βの機能に作用する物質、特にＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する又は弱めるような化合物、例えばＴＧＦ－βアンタゴニストの医薬品への適用について研究開発が求められている。また、ＴＧＦ－βシグナル経路は細胞の増殖・生存・分化に大きな影響を有することから、培地への添加剤としても検討されている。
　ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する物質としては、例えば抗体（ＷＯ０１／０６６１４０、ＷＯ２０１２／０３０３９４）や低分子（ＷＯ２０１５／１０３３５５）等が知られており、それらを用いた腎機能不全、心筋梗塞の治療薬などが研究されている。また近年ＴＧＦ－βのもつ腫瘍免疫抑制作用に注目し免疫チェックポイント阻害剤とＴＧＦ－β中和抗体との併用も研究されている。
　しかしながら、ＴＧＦ－β結合活性、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有するペプチドについては、報告されていない。
特表２０２１－１００９７２ ＷＯ０１／０６６１４０ ＷＯ２０１２／０３０３９４ ＷＯ２０１５／１０３３５５
Ｍａｓｓａｇｕｅ，　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２０１２；１３（１０）． Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ　Ｂｉｏｌ．２０１７；９（４）．
　本発明者らは、ＴＧＦ－β結合活性、好ましくは、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有するペプチドを創出することを目的として鋭意研究に努めた結果、本発明を想到した。本発明は、ペプチド、当該ペプチドを含む組成物、及び当該ペプチドの利用を提供する。
　非限定的に、本出願は以下の発明を含む。
［１］
　以下のアミノ酸配列：
　Ｆ－Ｎａｌ１－Ｖ－Ｖ－Ｎ－Ｖ－Ｙ－Ｄ－Ｄ－ＰｅＧ－Ｖ－Ｎａｌ１－Ｙ－Ｈ－Ｖ－Ｃ－Ｇ（配列番号２）；
あるいは、
　上記のアミノ酸配列の２番目、４番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目及び１７番目のアミノ酸残基からなるグループから選択される、１－１１個のアミノ酸残基において、置換、付加、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列
を含む、ペプチド。
［２］
　以下のアミノ酸配列：
　Ｆ－Ｘ１－Ｖ－Ｘ２－Ｎ－Ｖ－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｖ－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｃ（配列番号１）
　ここにおいて、
　Ｘ１は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
　Ｘ２は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ４は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ５は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ６は、側鎖に置換されていてもよいアルキル基を有するアミノ酸、又は置換されていてもよいアルキル基を有する二級アミノ酸であり；
　Ｘ７は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
　Ｘ８は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
　Ｘ９は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ１０は、任意のアミノ酸である、
を含む、ペプチド。
［３］
　Ｘ１が、側鎖に置換されていてもよい縮合環を有するアミノ酸である、［２］に記載のペプチド。
［４］
　Ｘ１が、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ又はＷである、［２］に記載のペプチド。
［５］
　Ｘ２が、Ｖ、Ｋ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ又はＱである、［２］－［４］のいずれか１項に記載のペプチド。
［６］
　Ｘ２が、Ｖ、Ｋ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、又はＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅである、［２］－［４］のいずれか１項に記載のペプチド。
［７］
　Ｘ３が、Ｙ、４Ｐｙ、Ａ、Ｅ、Ｆ４Ｇ、Ｑ，Ｋ、Ｆ３Ｇ、又は３Ｐｙである、［２］－［６］のいずれか１項に記載のペプチド。
［８］
　Ｘ３が、Ｙ又は４Ｐｙである、［２］－［６］のいずれか１項に記載のペプチド。
［９］
　Ｘ４が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、［２］－［８］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１０］
　Ｘ４が、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｋ又はＥである、［２］－［８］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１１］
　Ｘ５が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、［２］－［１０］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１２］
　Ｘ５が、Ｄ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、Ａ、Ｑ、又はＫである、［２］－［１０］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１３］
　Ｘ６が、ＰｅＧ、Ｋ又はＭｅＧである、［２］－［１２］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１４］
　Ｘ７が、側鎖に置換されていてもよい縮合環を有するアミノ酸である、［２］－［１３］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１５］
　Ｘ７が、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、又はＷである、［２］－［１３］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１６］
　Ｘ８が、Ｙ、４Ｐｙ、３Ｐｙ又はＥである、［２］－［１５］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１７］
　Ｘ８が、Ｙ又は４Ｐｙである、［２］－［１５］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１８］
　Ｘ９が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、［２］－［１７］のいずれか１項に記載のペプチド。
［１９］
　Ｘ９が、Ｈ、Ａ、Ｑ又はＥである、［２］－［１７］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２０］
　Ｘ１０が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、［２］－［１９］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２１］
　Ｘ１０が、Ｖ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、Ｑ、Ｋ，又はＡである、［２］－［１９］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２２］
　配列番号２－３３、あるいは、
　配列番号２、４－１３、１５－３３のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列
のいずれかに１つのアミノ酸配列を含む、又は、からなる、［１］－［２１］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２３］
　前記ペプチドが、環状ペプチドである、［１］－［２２］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２４］
　クロロアセチル化したアミノ酸と、前記ペプチドに含まれるシステイン残基とが結合された環状構造を有する、［２３］に記載の環状ペプチド。
［２５］
　さらに、付加的なアミノ酸残基を含む、［１］－［２４］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２６］
　そのＣ末端にリンカーを含む、［１］－［２１］、［２３］－［２５］のいずれか１項に記載のペプチド。
［２７］
　ＴＧＦ－β結合活性を有する、［１］－［２６］いずれか１項に記載のペプチド。
［２８］
　ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する、［１］－［２７］いずれか１項に記載のペプチド。
［２９］
　［１］－［２８］のいずれか１項に記載のペプチドを含む、医療用、診断用組成物。
［３０］
　［１］－［２８］のいずれか１項に記載のペプチドを含む、研究用組成物であって、ただし、オルガノイドを培養するための培地への添加剤として使用される組成物は除く、前記研究用組成物。
　本発明のペプチドは、ＴＧＦ－β結合活性、そして、好ましくは、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する。がんや肝疾患等の医薬用組成物、診断用組成物、及び研究用組成物等として有用である。
図１は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２に対する、ＴＧＦｂ１＿０１２（配列番号１３）のＳＢＥレポーターアッセイによる阻害活性測定の結果を示す。図１中、黒丸はＴＧＦ－β１を示し、黒四角はＴＧＦ－β２を示す。横軸はＴＧＦ－β１＿０１２（配列番号１３）の濃度（ｎＭ）を、縦軸は阻害活性を示す。
　１．略語
　本明細書において、特に明記しない限り、以下の略語は下記の意味で使用される。
　略語（一般）
　Å：オングストローム（単位）；
　ＣｌＡｃ：クロロアセチル；
　ＤＣＭ：ジクロロメタン；
　ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；
　ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；
　ＤＩＥＡ又はＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；
　ＤＩＰＣＩ：Ｎ，Ｎ‘－ジイソプロピルカルボジイミド；
　ＤＯＤＴ：６－ジオキサ－１，８－オクタン－ジチオール；
　Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル；
　ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド；
　ｇ：グラム（単位）；
　ＨＡＴＵ：Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩；
　ＨＯＳｕ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド；
　ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；
　ＬＣ－ＭＳもしくはＬＣ／ＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析計；
　ｍＬ：ミリリットル（単位）；
　Ｍ：モーラー（単位）；
　μＬ：マイクロリットル（単位）；
　ｍＭ：ミリモーラー（単位）；
　μＭ：マイクロモーラー（単位）；
　ｍｇ：ミリグラム（単位）；
　ＭｅＣＮ：アセトニトリル；
　ｍｍ：ミリメートル（単位）；
　μｍ：マイクロメートル（単位）
　ｎＭ：ナノモーラー（単位）；
　ＯＳｕ：スクシンイミド；
　ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；
　ｒｐｍ：回転毎分（単位）；
　ｔＢｕ：ターシャリーブチル；
　Ｍｐｅ：メチルペンタン－３－イル；
　Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル；
　ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；
　ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン；
　Ｔｒｔ又はＴｒ：トリチル基；
　ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル基。
　略語（非天然アミノ酸）
　Ｎａｌ１：１－ナフチルーＬ－アラニン（ＣＡＳ　Ｎｏ．５５５１６－５４－６）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　Ｗ６Ｎ：６－アザ－Ｌ－トリプトファン（ＣＡＳ　Ｎｏ．１４９７０４－６３－２）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　Ｗ７Ｎ：Ｌ－７－アザトリプトファン（ＣＡＳ　Ｎｏ．　４９７５８－３５－２）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ＫＣＯｐｉｐｚａａ：Ｎ６－（４－（カルボキシメチル）ピペラジンー１－カルボニル）－Ｌ－リシン（ＣＡＳ　Ｎｏ．Ｎ／Ａ）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ：Ｎ６－（メチル（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－ペンタヒドロキシヘキシル）カルバモイル）－Ｌ－リシン；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　４Ｐｙ：４－ピリジル－Ｌ－アラニン（ＣＡＳ　Ｎｏ．　３７５３５－４９－２）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ＰｅＧ：フェネチルグリシン（ＣＡＳ　Ｎｏ．７７３８－３８－７）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Ｆ４Ｇ：ｐ－グアニジノーＬ－フェニルアラニン（ＣＡＳ　Ｎｏ．５９５７４－１１－７）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　Ｆ３Ｇ：３－［（アミノイミノメチル）アミノ］―Ｌ－フェニルアラニン（ＣＡＳ　Ｎｏ．１０１９０５７－４２－１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　３Ｐｙ：３－（３－ピリジル）－Ｌ―アラニン（ＣＡＳ　Ｎｏ．　６４０９０－９８－８）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
ＭｅＧ：メチルグリシン（ＣＡＳ　Ｎｏ．１０７－９７－１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ＰＥＧ１０ｃ：１－アミノ－３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０－デカオキサトリトリアコンタン－３３－オイック酸；
　ＭｅＰＥＧ８ｃ：２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３－オクタオキサヘキサコサン－２６－オイック酸；
　ＯＣＯｍＰＥＧ１００００：メトキシポリエチレングリコールカーボネート（平均分子量１０，０００）。
　２．ペプチド（Ａ）
　本発明は、ペプチドに関する。
　一態様において、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列：
　Ｆ－Ｎａｌ１－Ｖ－Ｖ－Ｎ－Ｖ－Ｙ－Ｄ－Ｄ－ＰｅＧ－Ｖ－Ｎａｌ１－Ｙ－Ｈ－Ｖ－Ｃ－Ｇ（配列番号２）；
あるいは、
　上記のアミノ酸配列の２番目、４番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目及び１７番目のアミノ酸残基からなるグループから選択される、１－１１個のアミノ酸残基において、置換、付加、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列
を含む、ペプチド。
　配列番号２は、本願明細書の実施例において、ＴＧＦ－β結合活性、及び、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有することが確認されたペプチドである。
　配列番号２のアミノ酸配列の２番目、４番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目及び１７番目のアミノ酸残基からなるグループから選択される、１－１１個のアミノ酸残基において、置換、付加、欠失又は挿入を有していてもよい。アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸の数は、１個以上１０個以下であればよく、その下限は１個である。その上限は１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個であり、最小１個である。好ましくは、アミノ酸の「置換」である。かかるアミノ酸の置換は、好適には保存的アミノ酸置換である。
　「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価又は類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する一つ又は二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は構造及び機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的及び機能的に重要な特徴を構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）はイオン?芳香族相互作用又は陽イオン?ｐｉ相互作用に寄与し得る。かかる場合において、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性又は非極性グループに属するアミノ酸と置換しても、構造的及び機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
　保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（例えば、レーニンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ７３?７５、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７５）に記載の置換）及び典型的置換を含む。
　また、保存的アミノ酸置換は、例えば、以下のように天然のアミノ酸をその共通する側鎖の性質に基づいて分けたグループにおいて、あるアミノ酸が属するグループと同じグループに属するアミノ酸への置換が好ましい。
　疎水性（非極性とも言う）アミノ酸：疎水性（非極性）を示すアミノ酸であって、アラニン（「Ａｌａ」又は単に「Ａ」とも記す）、グリシン（「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」とも記す）、バリン（「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」とも記す）、ロイシン（「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」とも記す）、イソロイシン（「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」とも記す）、プロリン（「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」とも記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」とも記す）、トリプトファン（Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」とも記す）、チロシン（「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」とも記す）、メチオニン（「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」とも記す）を含む。
　なお、疎水性アミノ酸はさらに以下のグループに分けることもできる。
　脂肪族アミノ酸：側鎖に脂肪酸又は水素を有するアミノ酸であって、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕを含む。
　脂肪族・分岐鎖アミノ酸：側鎖に分岐型脂肪酸を有するアミノ酸であって、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕを含む。
　芳香族アミノ酸：側鎖に芳香環を有するアミノ酸であって、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅを含む。
　親水性（極性とも言う）アミノ酸：親水性（極性）を示すアミノ酸であって、セリン（「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」とも記す）、スレオニン（「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」とも記す）、システイン（「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」とも記す）、アスパラギン（「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」とも記す）、グルタミン（「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」とも記す）、アスパラギン酸（「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」とも記す）、グルタミン酸（「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」とも記す）、リジン（リシンとも記する。「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」とも記す）、アルギニン（「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」とも記す）、ヒスチジン（「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」とも記す）を含む。
　なお、親水性アミノ酸はさらに以下のグループに分けることもできる。
　酸性アミノ酸：側鎖が酸性を示すアミノ酸であって、Ａｓｐ、Ｇｌｕを含む、
　塩基性アミノ酸：側鎖が塩基性を示すアミノ酸であって、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓを含む。
　中性アミノ酸：側鎖が中性を示すアミノ酸であって、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓを含む。
　また、Ｇｌｙ及びＰｒｏについては、「主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸」に分けることもでき、側鎖に硫黄分子を含むアミノ酸、Ｃｙｓ及びＭｅｔは、「含硫アミノ酸」に分けることもできる。
　また、側鎖に芳香族を有するグループとして、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅが含まれる。
　本明細書において、「アミノ酸」は、天然のアミノ酸のみならず、非天然のアミノ酸も含む。非天然のアミノ酸には、例えば、上記記載した天然のアミノ酸がＮ－アルキル化されたＮ－アルキルアミノ酸、ペプチド結合を形成する窒素が分岐した若しくは分岐しない低級（例えば、Ｃ１－Ｃ５の、好ましくは、Ｃ１－Ｃ３、より好ましくはＣ１）のアルキル基で修飾されたもの、が含まれる。Ｎ－アルキルアミノ酸においては、好ましくはＮ－エチルアミノ酸、Ｎ－ブチルアミノ酸又はＮ－メチルアミノ酸であり、さらに好ましくはＮ－メチルアミノ酸である。また、非天然のアミノ酸には、Ｄ型アミノ酸（Ｄ－アミノ酸とも記する）、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸、ノルロイシンやオルニチン等の生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸などが含まれる。さらに、天然のアミノ酸の側鎖に官能基がさらに付加された又は別の官能基に置換されたアミノ酸（例えば、側鎖のアリーレン基、アルキレン基等の部分に置換や付加を有するアミノ酸、側鎖のアリーレン基、アルキレン基やアルキル基のＣ数が増加したアミノ酸、側鎖の芳香環に置換を有するアミノ酸や、側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換された構造を有するアミノ酸誘導体等複素環化や縮合環化したアミノ酸など）が含まれる。
　なお、天然のアミノ酸の側鎖に官能基等の構造が付加又は置換等されることで、天然のアミノ酸とは異なる性質を付与することができる。すなわち、天然のアミノ酸をその共通する側鎖の性質に基づいて分けた、前述のグループに、同様の側鎖の性質を有する非天然アミノ酸を含めることが出来る。このように、あるアミノ酸と同様の側鎖の性質を示す非天然アミノ酸についても、保存的アミノ酸置換の対象として含むことができる。
　非限定的に、非天然のアミノ酸には、Ｎ－メチルアミノ酸、４Ｐｙ、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ，ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、ＰｅＧ等を含む。
例えば、Ｎａｌ１、ＰｅＧは疎水性アミノ酸に、４Ｐｙ、Ｗ７Ｎ、Ｗ６Ｎは親水性アミノ酸に分けることができ、さらに、４Ｐｙ、Ｗ７Ｎ、Ｗ６Ｎは塩基性アミノ酸、４Ｐｙ、Ｎａｌ１、ＰｅＧ、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎは芳香族アミノ酸に分けることもできる。なお、Ｎ－メチルアミノ酸については、Ｎ－アルキルアミノ酸として分類することもでき、Ｎ－メチル化されていない元のアミノ酸の側鎖の性質に従い分類することもできる。
　Ｄ－アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸として分類することもできるが、その側鎖の性質に従い分類することもでき、Ｎ－メチルアミノ酸については、Ｎ－アルキルアミノ酸として分類することもでき、Ｎ－メチル化されていない元のアミノ酸の側鎖の性質に従い分類することもできる。
　前記ペプチドは、非限定的に、一態様において、環状ペプチドである。「環状ペプチド」については、「３．ペプチド（Ｂ）」で詳述する。本明細書において、「非限定的に」、「一態様において」は、同義に用いられ得る。
　前記ペプチドは、一態様において、配列番号２に加えて、付加的なアミノ酸残基を含んでもよい。「付加的なアミノ酸残基」については、「３．ペプチド（Ｂ）」で詳述する。
　前記ペプチドは、一態様において、リンカーを好ましくはＣ末端に含んでもよい。「リンカー」については、「３．ペプチド（Ｂ）」で詳述する。配列番号２のＣ末端（１７番目のアミノ酸残基）の「Ｇ」は、リンカーである。一態様において、前記ペプチドは、Ｇ以外のリンカー、例えばＰＥＧリンカーを有しても良い。あるいは、Ｃ末端のＧに加えて、さらに別のリンカーを有しても良い。例えば、グリシン－リッチペプチド等の態様も含まれる。
　前記ペプチドは、好ましくは、ＴＧＦ－β結合活性、さらに好ましくは、ＴＧＦ－β１結合活性を有する。前記ペプチドは、好ましくは、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する。「ＴＧＦ－β１結合活性を有する」、「ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する」については、「３．ペプチド（Ｂ）」で詳述する。
　本明細書における「ペプチド」は、特に言及しない限り、ペプチド（Ａ）及びペプチド（Ｂ）の双方を含む。
　３．ペプチド（Ｂ）
　本発明はペプチドに関する。
　本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列：
　Ｆ－Ｘ１－Ｖ－Ｘ２－Ｎ－Ｖ－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｖ－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｃ（配列番号１）
　ここにおいて、
　Ｘ１は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
　Ｘ２は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ４は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ５は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ６は、側鎖に置換されていてもよいアルキル基を有するアミノ酸、又は置換されていてもよいアルキル基を有する二級アミノ酸であり；
　Ｘ７は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
　Ｘ８は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
　Ｘ９は、任意のアミノ酸であり；
　Ｘ１０は、任意のアミノ酸である、
を含む。
　「側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸」とは、側鎖に芳香環を有するアミノ酸であって、例えば芳香環としてフェニル基やインドール環を有し、その一部のＣなどがＮなど他の分子への置換があってよい。芳香族環は複素環であってもよい。また、例えば、チロシンの側鎖の水酸基が他の官能基に置換されているようなアミノ酸であっていてもよい。「側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸」は、一態様において、好ましくは側鎖に縮合環を有するアミノ酸である。例えば、インドール環やナフタレン構造を有するアミノ酸であってよく、さらにその一部のＣなどがＮなど他の分子への置換があってよい。置換基は特に限定されず、アルキル基、シクロアルキル基、水酸基、ハロゲン等に任意に選択される。「側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸」は、例えば、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン等を含む。非天然型アミノ酸、例えば、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ又はＷであってもよい。
　「側鎖に置換されていてもよいアルキル基を有するアミノ酸」とは、側鎖にアルキル基を有するアミノ酸、例えば、リシン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン等であって、これらのアミノ酸の側鎖が、置換されていても、置換されていなくてもよいアミノ酸である。アルキル基は、鎖状でも環状でもよい。「置換されていてもよいアルキル基を有する二級アミノ酸」とは、二級アミノ酸であって、環状又は鎖状構造を有する、任意の天然又は非天然のアミノ酸を含む。
　一態様において、「側鎖に置換されていてもよいアルキル基を有するアミノ酸」、「置換されていてもよいアルキル基を有する二級アミノ酸」の側鎖が置換されている場合、置換基は特に限定されない。側鎖のアルキル基の末端に官能基を有しても良い。末端に結合する官能基としては、例えば、非限定的に、アミノ基や、ベンジル基などが挙げられる。
　Ｘ１－Ｘ１０の上記選択肢は任意の組み合わせで選択しうる。
　一態様において、Ｘ１が、側鎖に置換されていてもよい縮合環を有するアミノ酸である。一態様において、Ｘ１が、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ又はＷである。
　一態様において、Ｘ２が、Ｖ、Ｋ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ又はＱである。一態様において、Ｘ２が、Ｖ、Ｋ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、又はＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅである。一態様において、Ｘ２はＥではない。
　一態様において、Ｘ３が、Ｙ、４Ｐｙ、Ａ、Ｅ、Ｆ４Ｇ、Ｑ，Ｋ、Ｆ３Ｇ、又は３Ｐｙである。一態様において、Ｘ３が、Ｙ又は４Ｐｙである。
　一態様において、Ｘ４が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である。「芳香族環を有するアミノ酸」は、例えば、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン等である。「含硫アミノ酸」は、例えば、メチオニン、システイン等である。一態様において、Ｘ４が、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｋ又はＥである。一態様において、Ｘ４が、Ｄである。
　一態様において、Ｘ５が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である。一態様において、Ｘ５が、Ｄ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、Ａ、Ｑ、又はＫである。一態様において、Ｘ５が、Ｄ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ又はＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅである。
　一態様において、Ｘ６が、ＰｅＧ、Ｋ又はＭｅＧである。一態様において、Ｘ６が、Ｐｅｇである。一態様において、Ｘ６は、Ａ、Ｎ、Ｑ，Ｓ（Ｄ体）、Ｐ（Ｄ体）ではない。
　一態様において、Ｘ７が、側鎖に置換されていてもよい縮合環を有するアミノ酸である。一態様において、Ｘ７が、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、又はＷである。一態様において、Ｘ７が、Ｎａｌ１である。一態様において、Ｘ７は、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｅではない。
　一態様において、Ｘ８が、Ｙ、４Ｐｙ、３Ｐｙ又はＥである。一態様において、Ｘ８が、Ｙ又は４Ｐｙである。一態様において、Ｘ８は、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｆ３Ｇ、Ｆ４Ｇではない。
　一態様において、Ｘ９が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である。「芳香族環を有するアミノ酸」は、例えば、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン等である。「含硫アミノ酸」は、例えば、メチオニン、システイン等である。一態様において、Ｘ９が、Ｈ、Ａ、Ｑ又はＥである。一態様において、Ｘ９が、Ｈである。
　一態様において、Ｘ１０が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である。芳香族環を有するアミノ酸」は、例えば、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、フェニルアラニン等である。「含硫アミノ酸」は、例えば、メチオニン、システイン等である。一態様において、Ｘ１０が、Ｖ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、Ｑ、Ｋ、又はＡである。一態様において、Ｘ１０が、Ｖ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ又はＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅである。
　Ｘ１－Ｘ１０の、上記一態様の選択肢は任意の組み合わせで選択しうる。
　前記ペプチドは、一態様において、環状ペプチドである。「環状ペプチド」は、ペプチド中の２つのアミノ酸が結合し、その全部又は一部が環状になっているものをいう。当該２つのアミノ酸同士の結合型に特に限定されない。一方のアミノ酸のカルボキシ基と他方のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合、一方のアミノ酸のカルボキシ基と他方のアミノ酸のチオール基との間のチオエステル結合、一方のアミノ酸のチオール基と他方のアミノ酸のチオール基との間のジスルフィド結合、ラクタム環形成又はマクロ環化反応により環状構造を形成したものや、ラッソペプチド状構造を有するもの等も環状ペプチドに包含される。ただし、当該２つのアミノ酸同士がアミド結合により結合している場合、当該アミド結合は一方のアミノ酸のカルボキシ基と他方のアミノ酸のアミノ基が結合することにより形成されたものに限られず、合成反応の結果としてアミド結合により結合しておればよい。他の結合型についても同様である。好ましくは、後述のクロロアセチル化アミノ酸とシステイン残基の結合による環状化である。
　前記環状ペプチドは、その一部が環状構造を形成するものであればよく、直鎖部を有していてもよい。
　ペプチドは、一般的に生体内において代謝安定性が悪く、またサイズが大きいので細胞膜を透過しづらいという問題がある。そのような課題に対し、ペプチドを環状化させるという方法がとられてきた。ペプチドを環状化すると、プロテアーゼ耐性が向上し代謝安定性が向上し、またコンフォメーション変化にも制限が加わるため、剛直性が増して膜透過性や標的タンパク質との親和性が向上することが示唆されてきた。
　一態様において、前記ペプチドは、クロロアセチル化したアミノ酸と、前記ペプチドに含まれるシステイン残基とが結合された環状構造を有する。一態様において、前記ペプチドは、Ｎ末端アミノ酸（１番目のアミノ酸残基）と、前記ペプチドに含まれるシステイン残基とが結合された環状構造を有する。一態様において、前記ペプチドは、Ｎ末端アミノ酸（１番目のアミノ酸残基）と、前記ペプチドに含まれる１６番目のシステイン残基とが結合された環状構造を有する。一態様において、前記ペプチドは、クロロアセチル化したＮ末端アミノ酸（１番目のアミノ酸残基）と、前記ペプチドに含まれる１６番目のシステイン残基とが結合された環状構造を有する。「クロロアセチル化」は、他のハロゲンによる「ハロゲンアセチル化」でもよい。また、「アセチル化」は、アセチル基以外のアシル基による「アシル化」でもよい。
　本明細書において、ペプチドの環状化のためにアミノ酸の一部を改変する場合がある。そのような一部の改変がなされたアミノ酸も包含する。例えば、上述したように、Ｎ末端に位置するアミノ酸にクロロアセチル基を付加し、ペプチド中のシステイン残基と結合し環状化するような場合がある、このような、クロロアセチル基が付加された各種（天然／非天然）アミノ酸も本願のアミノ酸に包含される。　一態様において、前記ペプチドは、
　配列番号２－３３、あるいは、
　配列番号２、４－１３、１５－３３のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列
のいずれかに１つのアミノ酸配列を含む、又は、からなる。
　一態様において、前記ペプチドは、
　配列番号２－３３、あるいは、
　配列番号２、４－１３、１５－３３のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列
のいずれかに１つのアミノ酸配列を含む、又は、からなる、環状ペプチドである。
　一態様において、前記ペプチドは、配列番号３４－６９、あるいは、配列番号３４－６９のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列のいずれかに１つのアミノ酸配列を含む、又は、からなる。
　一態様において、前記ペプチドは、配列番号３４－６９、あるいは、配列番号３４－６９のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列のいずれかに１つのアミノ酸配列を含む、又は、からなる、環状ペプチドである。
　前記ペプチドは、配列番号２－３３、あるいは、配列番号２、４－１３、１５－３３のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列、のいずれかに加えて、付加的なアミノ酸残基を含んでもよい。前記ペプチドは、配列番号３４－６９、あるいは、配列番号３４－６９のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列のいずれかに１つのアミノ酸配列のいずれかに加えて、付加的なアミノ酸残基を含んでもよい。
　付加的なアミノ酸残基は、環状構造を成すペプチドに含まれてもよいし、当該環状ペプチドからさらにアミノ酸残基がリンカー状に付加されていてもよい。ペプチド、ペプチド部位のアミド結合の数（アミノ酸の数・長さ）は特に限定されない。総アミノ酸残基（環状構造を成すペプチドに含まれるアミノ酸残基数をいい、当該環状ペプチドからさらにアミノ酸残基がリンカー状に付加されている場合は、それらのアミノ酸は含めない）が２２残基以内が好ましい。好ましくはアミノ酸が６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上であり、好ましくはアミノ酸が２０以下、１９以下、１８以下である。更に好ましくはアミノ酸が１５以上１８以下であり、最も好ましくはアミノ酸が１６又は１７である。
　また、環状ペプチドからさらにリンカーが付加されていてもよい。リンカーとしては、例えば、前述のアミノ酸リンカー（ペプチドリンカー）、化学リンカー、脂肪酸リンカー、核酸リンカー、糖鎖リンカーなどが挙げられ、また、例えば化学リンカーとペプチドリンカーなどの複合体であってもよい。化学リンカーとしては、例えば、ＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）リンカーである。例えば、１～２４個のエチレングリコール単位からなるＰＥＧリンカーであってよい。また、リンカーは、脂肪酸から誘導される二価化学部分を含む脂肪酸リンカーでもよい。アミノ酸（ペプチド）リンカーは、少なくとも１個のアミノ酸を含むリンカーであり、例えば、米国特許第７，２７１，１４９号に記載のような、配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を有するペプチドなどのグリシン－リッチペプチドや、米国特許第５，５２５，４９１号に記載のセリン－リッチペプチドリンカーを用いることができる。非限定的に、リンカーの付加によりペプチドの物性（例えば溶解度）が変化する場合がある。
　リンカーの付加位置については、どこに付加されていても良い。例えば、Ｃ末端側に位置するＣｙｓに結合していてもよく、環状ペプチドに含まれるアミノ酸に結合していても良い。好ましくはＣ末端側に位置するＣｙｓに結合しているか、環状ペプチドに含まれるアミノ酸の側鎖に結合しているものである。一態様において、リンカーはＣ末端に含まれる。
　リンカーの付加は単独でもよく、あるいは、リンカーは同種のもの又は異なるものを複数個付加されていてもよい。例えば、アミノ酸リンカーとしてＧｌｙ－Ｌｙｓが結合し、さらに当該Ｌｙｓの側鎖末端にＰＥＧリンカーが結合したかたちであってよい。
　さらに、前記ペプチドは、リンカーなどを介して多量体を形成していてもよい。この場合において、前記ペプチドは、同じ配列を有するペプチドからなるホモマーであってもよく、別の配列を有するペプチドからなるヘテロマーであってもよい。
　配列番号２、４－１３、１５－３３のＣ末端のグリシン（Ｇ）は、リンカーである。配列番号２のペプチドについて上述したのと同様に、一態様において、前記ペプチドは、Ｇ以外のリンカーを有しても良い。あるいは、Ｃ末端のＧに加えて、さらに別のリンカーを有しても良い。
　一態様において、好ましくは、前記ペプチドは、ＴＧＦ－β結合活性、さらに好ましくは、ＴＧＦ－β１結合活性又はＴＧＦ－β２結合活性を有する。
　一態様において、好ましくは、前記ペプチドは、ＴＧＦ－β１結合活性及びＴＧＦ－β２結合活性を有する。
　一態様において、好ましくは、前記ペプチドは、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性、さらに好ましくは、ＴＧＦ－β１アンタゴニスト活性又はＴＧＦ－β２アンタゴニスト活性を有する。さらに一態様において、好ましくは、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有するペプチドは、ＴＧＦ－β１結合活性を有する。なお、「ＴＧＦ－β１結合活性を有する」とは、ＴＧＦ－β１のみに対する結合活性に限られるものではなく、ＴＧＦ－β２に対して結合を有していてもよい。
　一態様において、好ましくは、前記ペプチドは、ＴＧＦ－β１アンタゴニスト活性及びＴＧＦ－β２アンタゴニスト活性を有する。また、好ましくは、ＴＧＦ－β１アンタゴニスト活性及びＴＧＦ－β２アンタゴニスト活性を有するペプチドは、ＴＧＦ－β１結合活性及びＴＧＦ－β２結合活性を有する。
　ＴＧＦ－β（形質転換増殖因子：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β）は、ＴＧＦ－βファミリーに属するサイトカインで、哺乳動物で３種類のアイソフォーム（ＴＧＦ－β１，－β２，－β３）が存在する。さらに、構造的に類似したＴＧＦ－βスーパーファミリーには、アクチビンやＢＭＰ（骨形成誘導因子）などが含まれる。
　本発明の態様となる「ＴＧＦ－β」は、ＴＧＦ－β１及び／又はＴＧＦ－β２であり、好ましくはＴＧＦ－β１である。本明細書において、「ＴＧＦ－β」とは、特に明記しない場合は、ＴＧＦ－β１のことを指す。
　ＴＧＦ－βは、Ｉ型とＩＩ型の受容体サブユニットから構成されるセリン／スレオニンキナーゼ型受容体に結合し、Ｓｍａｄのリン酸化を介してシグナルを伝達することで生体において様々な反応を引き起こす。例えば、細胞の増殖や分化の制御、コラーゲン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質の産生及び沈着促進に影響するなど、多くの機能を有することが知られている（Ｍａｓｓａｇｕｅ，２０１２；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７）。
　ＴＧＦ－βは、非限定的に、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のＴＧＦ－β、好ましくはヒトのＴＧＦ－β、さらに好ましくはヒトＴＧＦ－β１（ＮＣＢＩ　ＧＥＮＥ　ＩＤ：　７０４０）、ヒトＴＧＦ－β２（ＮＣＢＩ　ＧＥＮＥ　ＩＤ：　７０４２）を含む。
　「ＴＧＦ－β１結合活性」とは、ＴＧＦ－β１に特異的に結合する活性、又はＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２の両方に特異的に結合する活性、を意味する。
　非限定的に、ＴＧＦ－β１に対する本発明のペプチドの結合状態は、親和性定数Ｋａ、解離定数Ｋｄ（ＫＤとも記す）、結合速度定数ｋｏｎ、及び解離速度定数ｋｏｆｆなどを指標として表すことができる。
　親和性定数Ｋａ及び解離定数Ｋｄは、平衡状態にある２分子間の結合親和性、すなわち結合の強さを示す指標であり、解離定数Ｋｄは親和性定数Ｋａの逆数である。そして解離定数Ｋｄの値が小さいほど、結合が強いことを意味する。一方、平衡状態にある２分子間の結合・解離反応の速さは、反応速度論的解析によって求められる結合速度定数ｋｏｎ及び解離速度定数ｋｏｆｆによって示され、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。従って同等の解離定数Ｋｄを示す場合でも、ゆっくり会合するがゆっくり解離する場合（ｋｏｎとｋｏｆｆの値が共に小さい）と、速やかに会合し速やかに解離する場合（ｋｏｎとｋｏｆｆの値が共に大きい）とがあり、それぞれの結合保持状態は全く異なる。
　前記ペプチドのＴＧＦ－βに対する結合状態を示すこれらの親和性定数Ｋａ、解離定数Ｋｄ（ＫＤとも記す）、結合速度定数ｋｏｎ、及び解離速度定数ｋｏｆｆなどは、当業者に周知の任意の分子間相互作用測定法を用いて決定することができる。
　ＴＧＦ－βに対する前記ペプチドの結合状態は、公知の方法によって測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴スペクトル解析（ＳＰＲ）によって測定することができる。非限定的に、表面プラズモン共鳴スペクトル解析は、例えば、バイオセンサー（生体分子間相互解析装置）であるＢＩＡＣＯＲＥシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて行うことができる。
　前記ペプチドのＴＧＦ－β結合活性の指標の１つとしてＫｄ解離定数がある。解離定数Ｋｄが低いほど結合活性（親和性）が高い。表面プラズモン共鳴スペクトル解析によれば、前記ペプチドと例えばヒトＴＧＦ－βとの結合に関する解離定数Ｋｄは、非限定的に、５０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、８ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下である。前記ペプチドとヒトＴＧＦ－βとの結合の解離定数Ｋｄの下限は特に限定されない。非限定的に、前記ペプチド解離定数Ｋｄは、０．０１ｎＭ以上、０．０５ｎＭ以上、０．１ｎＭ以上、０．２ｎＭ以上、０．３ｎＭ以上、０．４ｎＭ以上、０．５ｎＭ以上である。非限定的に、前記ペプチドの解離定数Ｋｄは、０．０１－５０ｎＭ、好ましくは０．０５－３０ｎＭ、さらに好ましくは０．２－１５ｎＭ、特に好ましくは０．３－１０ｎＭ、最も好ましくは０．４－６ｎＭである。
　ＴＧＦ－βに対する前記ペプチドの結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）によって調べることも可能である。ＥＬＩＳＡは、例えば、ＴＧＦ－β１ビーズとＣ末端にＨＡタグ配列を付加したペプチドを用い、結合活性を調べることによって、行ってもよい。
　非限定的に、前記ペプチドとＴＧＦ－βとの結合は、好ましくは非共有結合である。
　一態様において、前記ペプチドは実施例１－６の化学式に示した環状の構造を有する。
　「ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性」は、ＴＧＦ－βがＴＧＦβ受容体に結合し作用することを阻害又は減弱させる活性をいう。本発明においては、特に、ＴＧＦ－βに結合することでアンタゴニスト作用を及ぼすものが好ましい。
　「ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性」は、例えば、ＳＢＥレポーター－ＨＥＫ２９３細胞系（ＢＰ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＳＢＥレポーターアッセイによって、評価してもよい。非限定的に、ＴＧＦ－βで誘導されるシグナルの最大値を０％阻害、無刺激を１００％阻害としてペプチドの阻害活性を算出することができる。非限定的に、適切な濃度、例えば、最適濃度のペプチドを使用した場合、阻害活性が、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上阻害される。
　４・ペプチドの製造
　本発明のペプチドは、例えば以下のような、ペプチド製造のための任意の公知の方法によって、製造することができる。
　液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法；
　遺伝子組み換え法、等
　固相法は、例えば、水酸基を有するレジンの水酸基と、α－アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１、２、４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
　次に、第一アミノ酸のα－アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα－アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
　固相合成のレジンとしては、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　ｒｅｓｉｎ、ＭＢＨＡ　ｒｅｓｉｎ、Ｃｌ－Ｔｒｔ　ｒｅｓｉｎ、ＳＡＳＲＩＮ　ｒｅｓｉｎ、Ｗａｎｇ　ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ、ＨＭＦＳ　ｒｅｓｉｎ、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社）等が挙げられる。これらのレジンは、溶剤（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等）で洗浄してから用いることができる。
　α－アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられる。Ｃｂｚ基はフッ化水素酸、水素化等によって脱保護でき、Ｂｏｃ基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により脱保護でき、Ｆｍｏｃ基はピペリジン又はピロリジンによる処理で脱保護できる。
　α－カルボキシ基の保護は、例えば、メチルエステル、エチルエステル、アリルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等を用いることができる。
　カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣあるいはＷＳＣ）、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチル］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム－３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
　レジンからのペプチド鎖の切断は、ＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）等の酸で処理することによって行うことができる。
　遺伝子組み換え法（翻訳合成系）によるペプチドの製造は、前記ペプチドをコードする核酸を用いて行うことができる。前記ペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　前記ペプチドをコードする核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたＤＮＡをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えてもよい。あるいは、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
　上述のとおり、前記ペプチドを膜透過性ペプチド等と融合させる場合、前記核酸は、膜透過性ペプチドをコードする核酸も含む。
　宿主由来のプロテアーゼによる分解を抑制するため、目的のペプチドを他のペプチドとのキメラペプチドとして発現させるキメラタンパク質発現法を用いることもできる。この場合、前記核酸としては、目的とするペプチドと、これに結合するペプチドとをコードする核酸が用いられる。
　続いて、当該ペプチドをコードする核酸を用いて発現ベクターを調製する。核酸はそのまま、又は制限酵素で消化し、又はリンカーを付加する等して、発現ベクターのプロモータの下流に挿入することができる。ベクターとしては、例えば、大腸菌由来プラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ等）、枯草菌由来プラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９１２、ｐＴＰ４、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４等）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＩｐ、ＹＡＣ等）、バクテリオファージ（ｅファージ、Ｍ１３ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
　プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）由来プロモータ、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ等を用いることができる。
　発現ベクターには、例えば、ＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、タグ（ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＧＳＴ、ＧＦＰなど）をコードする核酸等を組み込むこともできる。
　次に、前記発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができる。宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするペプチドが発現する。
　形質転換体の培養物からのペプチドの精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
　粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
　得られたペプチドは、公知の方法又はそれに準ずる方法で遊離体から塩に、又は塩から遊離体に変換してもよい。
　一態様において、翻訳合成系は、無細胞翻訳系としてもよい。無細胞翻訳系によれば、一般に、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｒＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）、伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、及びリボソーム再生因子（ＲＲＦ）、並びに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液加えてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を加えてもよい。
　これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、非限定的に、数１００μｇから数ｍｇ／ｍＬのタンパク質を生産することができる。遺伝子ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ－１００（登録商標）ジーンフロンティア社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭやＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　Ｂｉｏｌａｂｓ社のＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
　細胞翻訳系においては、天然のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に合成されるアミノアシルｔＲＮＡに代えて、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸をｔＲＮＡに連結（アシル化）した人工のアミノアシルｔＲＮＡを用いてもよい。かかるアミノアシルｔＲＮＡは、人工のリボザイムを用いて合成することができる。
　かかるリボザイムとしては、フレキシザイム（ｆｌｅｘｉｚｙｍｅ）（Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｈ．Ｓａｉｔｏ、ａｎｄ　Ｈ．Ｓｕｇａ、（２００３）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１０、６５５－６６２；及びＷＯ２００７／０６６６２７等）が挙げられる。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Ｆｘ）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（ｄＦｘ）、エンハンスドフレキシザイム（ｅＦｘ）、アミノフレキシザイム（ａＦｘ）等の呼称でも知られる。
　フレキシザイムによって生成された、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸が連結されたｔＲＮＡを用いることにより、所望のコドンを、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸と関連付けて翻訳することができる。所望のアミノ酸としては、特殊アミノ酸を用いてもよい。例えば、上述した環状化に必要な非天然アミノ酸もこの方法により、結合ペプチドに導入することができる。
　前記ペプチドの化学合成は、例えば、段階的固相合成、配座的に支援される再ライゲーションを経るペプチドフラグメントの半合成、化学ライゲーションを含めた様々な当該技術分野において汎用される方法を使用して合成できる。前記ペプチドの合成は、例えば、Ｋ．Ｊ．Ｊｅｎｓｅｎ、Ｐ．Ｔ．Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｓ．Ｌ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１３などに記載されるような種々の固相技術を使用する化学合成である。好ましいストラテジーとして、α－アミノ基を一時的に保護及び塩基による選択的除去を可能とするＦｍｏｃ基と、側鎖官能基を一時的に保護しかつ脱Ｆｍｏｃ条件に安定な保護基の組み合わせに基づく。そのような一般的なペプチド側鎖の選択は前述のＰｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版やＧ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．Ｎｏｂｌｅ、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．３５、１９９０、１６１－２１４などで知られているが、好ましいペプチド側鎖保護基としては、例えば、セリンやトレオニンのヒドロキシ基に対するベンジル基やｔｅｒｔ－ブチル基及びトリチル（Ｔｒｔ）基、チロシンのヒドロキシ基に対する２－ブロモベンジルオキシカルボニル基やｔｅｒｔ－ブチル基、リジン側鎖のアミノ基に対するＢｏｃ基、メチルテトラゾールチオール（Ｍｔｔ）基、Ａｌｌｏｃ基、及びｉｖＤｄｅ基、ヒスチジンのイミダゾール基に対するＴｒｔ基やＢｏｃ基、アルギニンのグアニジル基に対する２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル基（Ｐｂｆ）基、グルタミン酸やアスパラギン酸をはじめとするカルボキシ基に対するｔｅｒｔ－ブチル基、アリル基、及び３－メチルペンタン（Ｍｐｅ）基、グルタミンやアスパラギンのカルボキサミド基に対するＴｒｔ基、また、システインのチオール基に対するＴｒｔ基及びモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）基がある。
　前記ペプチドは、前述した固相樹脂上で段階的方法において合成できる。使用するＣ末端アミノ酸及び合成に使用するすべてのアミノ酸やペプチドは、α―アミノ保護基が合成過程において、選択的に除去されなければならない。好ましくは前述の固相樹脂を用い、Ｎ末端がＦｍｏｃ等適切に保護されたペプチドのＣ末端カルボキシ基又はＦｍｏｃで保護されたアミノ酸のＣ末端カルボキシ基を適切な試薬により活性化エステルとしたのち固相樹脂上のアミノ基に付加することにより開始する。引き続くペプチド鎖の伸長は、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従って、Ｎ末端保護基（Ｆｍｏｃ基）の除去、次いで保護アミノ酸誘導体の縮合を順次繰り返すことにより達成することが可能である。なお、これらは目的のペプチドを最終段階で遊離させることができる。たとえば遊離させる条件として、Ｔｅｉｘｅｉｒａ、Ｗ．Ｅ．Ｂｅｎｃｋｈｕｉｊｓｅｎ、Ｐ．Ｅ．ｄｅ　Ｋｏｎｉｎｇ、Ａ．Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ、Ｊ．Ｗ．Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｅｐｔ．　Ｌｅｔｔ．、２００２、９、３７９－３８５などに挙げられる、ＴＦＡ中に捕捉剤として、水／シリルヒドリド／チオールを含むＴＦＡ溶液で遊離させることができる。典型的な例として、ＴＦＡ／Ｗａｔｅｒ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴ（体積比９２．５：２．５：２．５：２．５）が挙げられる。
　本明細書に記載するペプチドの合成は、単又は多チャネルペプチド合成機、たとえばＣＥＭ　社のＬｉｂｅｒｔｙ　Ｂｌｕｅ合成機又はＢｉｏｔａｇｅ社のＳｙｒｏ　Ｉ合成機やそれらの後継機などを使用することで実施できる。
　カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣあるいはＷＳＣ）、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチル］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム－３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
　ペプチドの環化については、公知の方法に従って行うことができる。非限定的に、例えば、ペプチドに２個以上のシステイン残基を含むよう設計することで、翻訳された後、ジスルフィド結合により環状構造を形成できる。また、Ｇｏｔｏらの方法（Ｙ．Ｇｏｔｏ、　ｅｔ　ａｌ．ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．３　１２０－１２９（２００８））に従い、遺伝暗号のリプログラミング技術により、Ｎ末端にクロロアセチル基を有するペプチドを合成し、ペプチド中に硫黄分子を含むシステイン残基を配置しておくことによっても環状化できる。これにより、翻訳後に自発的にメルカプト基がクロロアセチル基に求核攻撃し、ペプチドがチオエーテル結合により環状化する。遺伝暗号のリプログラミング技術により、結合して環状を形成するその他のアミノ酸の組合せをペプチド内に配置して環状化してもよい（本願の環化方法、ＣｌＡｃ－Ｃｙｓ）。あるいは、ペプチド中にＬ－２－アミノアジピン酸残基を配置し、Ｎ末端の主鎖アミノ基との間で結合することによって、環状化してもよい。このように、公知の環状化方法であれば、特に制限されず用いることができる。
　５．複合体
　一態様において、本発明は、複合体に関する。この複合体は、上記のいずれかのペプチドと、前記ペプチドと結合したリンカーと、このリンカーに結合した物質とを含む複合体である。前記ペプチドは、ＴＧＦ－βに結合することができるため、前記複合体は、前記物質をＴＧＦ－βに運搬することが可能である。
　ペプチドに物質（特に、薬剤等）が結合した態様を、ＰＤＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼称する場合がある。
　物質はＴＧＦ－βに送達することを希望する物質であれば，当業者の希望する何らの物質であってよい。前記物質の例としては，限られないが，以下が挙げられる：
　化合物：低分子化合物，中分子化合物を含み、例えば公知の低分子薬剤が挙げられる。
　ペプチド：体内の標的に結合して何らかの効果を示すペプチドであってよく、例えば、本発明のペプチドとは別の環状ペプチドであってよい。
　ＲＩ：放射性同位元素でラベルした低分子、中分子化合物や抗体等、放射性同位元素でラベルできる化合物であれば何でもよい。例えば、ＰＥＴ検査用の化合物が挙げられる。
　タンパク質：抗体，酵素等の、体内にて有用な機能を示すタンパク質であれば何でもよい。例えば、酵素補充療法に用いられる酵素が挙げられる。
　核酸：ＤＮＡ，ＲＮＡ等、塩基配列を含むものであれば何でもよい。例えば、核酸医薬品が挙げられる。
　ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いる分子：リポソームやミセルなどのＤＤＳに使われる公知の分子であってよい。当該ＤＤＳ分子には内部にさらに薬剤などの化合物が含まれていてもよい。
　上記挙げた物質が、複数結合した複合体であってよい。複数結合する物質は、同種であっても、異なる種であってもよい。
　ペプチドに物質（特に、薬剤等）が結合した態様を、ＰＤＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼称する場合がある。本明細書において、「ペプチド」と述べた場合、特に限定しない限り、物質が結合した複合体の態様も含みうる。
　６．組成物等
　本発明はまた、本発明のペプチドを含む、組成物に関する。本項において、「ペプチド」は、「５．複合体」の複合体も含みうる。
　前記組成物は、非限定的に、医療用組成物、診断用組成物、又は研究用組成物である。
　医薬組成物
　前記医薬組成物は、前記ペプチドそのものを含んでもよいが、前記ペプチドの薬学上許容される塩、又はその溶媒和物を含んでもよい。本明細書において「ペプチド」は、特に明記しない限り、その薬学上許容される塩、又はその溶媒和物を含みうる。前記医薬組成物は、前記ペプチドを有効成分として有効量含むものが好ましい。
　前記「医薬組成物」の対象となる疾患は、上述したペプチドそのものが効果を奏する疾患、及び、ペプチドを修飾する薬剤が効果を奏する疾患の双方を含む。前記医薬組成物の対象となる疾患としては、限定するものではないが、例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路が関連する疾病が挙げられ、例えば腫瘍、がん、細胞の異常線維化などの細胞増殖に関連する疾病がある。また、糸球体硬化などを含む腎機能不全や、肝硬変、心筋梗塞などの治療用医薬組成物の有効成分としても有用である。あるいは、ペプチドを修飾する薬剤が効果を奏する疾患を対象としてもよい。
　本明細書において、医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、経直腸）投与等が上げられる。
　前記医薬組成物は、ポリペプチドが代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ポリペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合物、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにポリペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
　前記医薬組成物は、有効成分をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
　製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、等が挙げられるがこれらに限定されない。
　前記医薬組成物は、ペプチドが一般には経粘膜吸収されにくいことに鑑みて、難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤を含むことができる。かかる吸収促進剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ－アシルコラーゲンペプチド、Ｎ－アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いることができる。
　前記医薬組成物が丸剤又は錠剤の場合、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆してもよい。
　前記医薬組成物が注射剤の場合、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含んでもよい。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えもよい。
　また、前記医薬組成物は、ヒトだけではなく、非ヒト哺乳動物又は鳥類を対象としていてもよい。非ヒト哺乳動物の例は、ヒト以外の霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラ等）、家畜動物（ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）、あるいは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等が含まれる。
　特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、非限定的に、例えば、３０μｇ～１００ｇ、１００μｇ～５００ｍｇ、１００μｇ～１００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、１μｇ／ｋｇ～３０００μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇを１回又は数回に分けて投与してもよい。
　本発明は、本発明のペプチドを投与することによる、疾患の予防又は治療する方法に関する。
　本発明は、本発明のペプチドの疾患の予防又は治療のための使用、に関する。
　本発明は、本発明のペプチドの、疾患の予防又は治療のための医薬組成物の製造のための使用、に関する。
　本発明は、疾患を予防又は治療する方法に使用するための、本発明のペプチド、に関する。
　診断用組成物及び研究用組成物
　本発明はまた、本発明のペプチドを含む、診断用組成物に関する。
　前記ペプチドは、好ましくは、ＴＧＦ－β結合活性、さらに好ましくはＴＧＦ－β１結合活性を有する。「ＴＧＦ－β１結合活性を有する」とは、「３．ペプチド（Ｂ）」で詳述した通りである。本発明のペプチドは、ＴＧＦ－βに結合するため、ＴＧＦ－βを検出する診断薬としても使用しうる。診断薬としては、ＴＧＦ－β量の検出薬であってよく、検出薬として用いる場合は、本発明のペプチドは、検出可能に標識してもよい。標識物質により標識されている場合、前記ペプチドがＴＧＦ－βと複合体を形成することで、該標識物質を介してＴＧＦ－βの検出又は定量を行うことが可能となる。
　標識物質の種類は、特に、限定されない。非限定的に、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、化学発光色素、放射性物質（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性同位元素、又は、放射性同位体金属イオンのキレート錯体、例えばＤＯＴＡ又はデスフェリオキサミンのキレート錯体）、並びにビオチン及びＧＦＰ（緑色蛍光たんぱく質）等の蛍光たんぱく質、発光たんぱく質、並びにペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素を含む。好ましい標識物質の例は、フルオレセイン及びＦＩＴＣ等のフルオレセイン誘導体、ローダミン及びテトラメチルローダミン等のローダミン誘導体、並びにテキサスレッド等の蛍光色素である。
　診断用組成物で診断し得る疾患は、特に限定されない。例えば、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路が関連する疾病が挙げられ、例えば腫瘍、がん、細胞の異常線維化などの細胞増殖に関連する疾病がある。また、糸球体硬化などを含む腎機能不全や、肝硬変、心筋梗塞などの診断用組成物としても有用である。
　本発明は、本発明のペプチドを用いることによる、疾患を診断する方法に関する。「診断する方法」は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの診断方法を含む。好ましくは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの診断方法である。本発明はまた、本発明のペプチドを用いることによる、疾患の検出方法に関する。疾患の検出は、例えば、研究機関（大学等の教育機関を含む）、企業等において、医師以外の、検査技師、研究者等によって行うこともできる。一態様において、疾患の検出方法は医療行為を含まない。
　本発明は、本発明のペプチドの疾患の診断又は検出のための使用、に関する。
　本発明は、本発明のペプチドの、疾患の診断又は検出のための組成物の製造のための使用、に関する。
　本発明は、疾患の診断又は検出する方法に使用するための、本発明のペプチド、に関する。
　本発明はまた、本発明のペプチドを含む、研究用組成物に関する。ただし、本発明の研究用組成物は、オルガノイドを培養するための培地への添加剤として使用される組成物は除く。「研究用組成物」は、研究機関（大学等の教育機関を含む）、企業、病院等において、研究者、技師、学生、医師等によって使用されるものを含む。
　前記研究用組成物は、例えば、ＴＧＦ－βの精製又は検出、疾患の検出のために使用することができる。
　一態様において、本発明のペプチドはＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有するため、細胞や臓器の培養のための培地への添加剤としても使用しうる。また、移植用の臓器を保護するための保護溶液への添加剤としても使用しうる。非限定的に、肝臓や脳幹、などの臓器又はその断片を培養するための培地であってよく、幹細胞など全能性を有する細胞を培養するための培地であってよい。さらに、例えば再生医療における細胞療法のための細胞培養などに使用することも可能である。本発明の「研究用組成物」は、このような培養培地へ使用される組成物を含む。
　ただし、本発明の研究用組成物は、オルガノイドを培養するための培地への添加剤として使用される組成物は除く。「オルガノイド」は、ヒト幹細胞に由来しその自己凝集能力、自己再生能力及び分化能力により三次元的に培養され、自己組織化により形成されたインビトロ培養物である。「オルガノイド」は、「臓器のミニチュア版」とも考えられている。
　前記ペプチドは、ＴＧＦ－β、特にＴＧＦ－β１に対する結合活性（親和性）、特に高い結合活性を有するため、例えば、ヒト血清等からＴＧＦ－βを選択的に分離することが可能である。従って、前記ペプチドは、ＴＧＦ－βの精製方法に使用しうる。ＴＧＦ－βの精製方法は、例えば、前記ペプチド又は固定化された前記ペプチドをＴＧＦ－βと結合させること、並びに、結合したＴＧＦ－βを遊離させてＴＧＦ－βを回収することを含む。さらに、前記ペプチドは、ＴＧＦ－βの検出方法に使用しうる。ＴＧＦ－βの検出方法は、例えば、前記ペプチド又は固定化された前記ペプチドにサンプル中のＴＧＦ－βを結合させ、結合したＴＧＦ－βを検出することを含む。ここで、検出には、定性又は定量のいずれかの分析を含むものとする。
　本明細書において、ペプチドを固定化するための担体は特に限定されない、例えば、ラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられる。
　本発明は、本発明のペプチドを用いた、ＴＧＦ－βの精製又は検出方法を含む。
　本発明はまた、本発明のペプチドのＴＧＦ－βの精製又は検出のための使用、を含む。
　本発明は、本発明のペプチドを含む、診断用又は検出用のキットに関する。前記診断用又は検出用キットは、上記検出に必要な試薬及び器具（非限定的に、本発明のペプチド、抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等のいずれか又は全てを含む）を含む。
　本発明は、本発明のペプチドを含む診断用又は検出用のテスターに関する。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　化学合成
　以下の実施例における化学合成において使用された全ての原料、ビルディングブロック、試薬、酸、塩基、固相樹脂、溶媒は、市販品をそのまま用いたか、もしくは当業者にて有機化学的手法を用いて合成できるものである。なお、保護基を含むアミノ酸は特記が無い限り市販品をそのまま用いた。
　固相樹脂におけるペプチド鎖の伸長は、それぞれの実施例に記載された樹脂を出発原料とし、通常用いられるペプチドカップリング反応条件とＦｍｏｃ除去反応条件を用いて行った。反応はペプチド自動合成機であるＣＥＭ社のＬｉｂｅｒｔｙ　Ｂｌｕｅ、もしくはＢｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Ｉを使用し、製造元のマニュアルに従い行った。
　例として、使用される一般的なアミノ酸の一部を下記に列挙し、側鎖保護基はカッコ内に示した。
　Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ；
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ。
　得られた粗精製ペプチドの精製方法として、Ｗａｔｅｒｓ社ＡｕｔｏＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ－ＳＱＤ２　ｓｉｎｇｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｌｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで逆相分取ＨＰＬＣを使用し、目的物由来のｍ／ｚイオンをモニタリングしながら溶出した。ＥＳＩ－ｐｏｓｉｔｉｖｅのスキャンモードで得られるマススペクトルと目的物の分子式より計算される多価イオンを含むマススペクトルが使用した質量分析器の誤差範囲で一致しているのを確認した。なお、使用したカラムを含む精製条件はそれぞれの実施例に示した。
　化学合成されたペプチドの構造決定は、目的配列に従って用いたアミノ酸と必要に応じて用いたビルディングブロックを考慮し計算された分子量を、質量スペクトル分析法におけるＥＳＩ－ＭＳ（＋）により確認した。なお、”ＥＳＩ－ＭＳ（＋）”とは、正イオンモードで実施したエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を示す。検出された質量は“ｍ／ｚ”単位表記によって報告された。なお、分子量がおおよそ１０００より大きい化合物は、２価イオン又は３価イオンとして高頻度で検出された。
　実施例１　ＴＧＦｂ１＿００１（配列番号２）の合成
　本実施例では、以下の構造を有するＴＧＦｂ１＿００１（配列番号２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　Ｆｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学、０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、０．２１３ｇ）を用い、前述の一般的な化学合成方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、ＣＥＭ社のＬｉｂｅｒｔｙ　Ｂｌｕｅ　ＨＴを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。
　各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／ＤＩＰＣＩ／Ｏｘｙｍａ　ｐｕｒｅ（５．２５当量／１０当量／５当量）を用い、ＤＭＦ中９０℃下、３分間１回反応を行った。ただし、９残基目は９０℃下、１０分間２回反応を行った。１４残基目、１６残基目は５０℃下１５分間１回反応を行った。
　また、Ｆｍｏｃ除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液と７５℃下、３分間反応させることを基本条件とした。ただし、１残基目、２残基目、３残基目、４残基目、５残基目、６残基目、７残基目、及び８残基目のＦｍｏｃ除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液と２５℃下５分間２回反応を行った。
　クロロアセチル基の導入は前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．２Ｍ　クロロ酢酸（約５当量）のＤＭＦ溶液、０．５Ｍ　ＨＡＴＵ（約５当量）のＤＭＦ溶液、１Ｍ　ＤＩＥＡ（約１０当量）のＤＭＦ溶液を固相樹脂に加え室温にて３０分振盪することにより行った。
　側鎖の脱保護及び固相樹脂からの切り出しは、まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥し、続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－Ａ（５ｍＬ、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、室温で６０分振盪した。
　反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やした過剰のジイソプロピルエーテル／ヘキサン（１／１）の混合溶媒に加えると、沈殿が生じた。この混合物を遠心分離し（９０００ｒｐｍ、１分）、溶液をデカンテーションした。得られた固体を再度０℃に冷やした１５ｍＬのジエチルエーテルにて３回洗浄後、減圧下乾燥させた。得られた固体を次の環化反応に用いた。
　ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に５ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解後、１０当量のトリエチルアミンを加えて、室温で約５時間振盪した。得られた反応溶液をＧｅｎｅｖａｃ社のＥＺ－２を用いて減圧濃縮した（４０℃未満、減圧時間１４時間）。
　得られた粗生成物を、以下の条件を用いて精製した。カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　３０ｘ１５０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．１％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：４０℃；グラジエント（％Ｂ）：３分間かけて１３－３８％、その後８分間かけて３８－４３％、その後１分かけて４３－６０％；流量：４５ｍＬ／分。
　目的物の純度は分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９６．０％であった。
　分析条件：保持時間＝１５．０１分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６μｍ　２．１ｘ１５０ｍｍ、１００Å；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：２０分間かけて２０－６０％、その後１分間かけて６０－９５％、その後５分かけて９５－９５％；流量：０．２５ｍＬ／分
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝１１１２．５３　（Ｍ＋２Ｈ）２＋
　実施例２　ＴＧＦｂ１＿０１２（配列番号１３）の合成
　本実施例では、以下の構造を有するＴＧＦｂ１＿０１２（配列番号１３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　Ｆｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学、０．６５ｍｍｏｌ／ｇ、０．１１５ｇ）を用い、前述の一般的な化学合成方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、Ｂｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Iを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。
　各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／ＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡ（４．２当量／４当量／８当量）を用い、ＤＭＦ中７５℃下、２０分間２回反応を行った。ただし、１１残基目、１２残基目、１３残基目は７５℃下、２０分間１回反応を行った。１４残基目は室温下６０分間１回反応を行った。１５残基目は７５℃下、２０分間１回反応を行った。１７残基目は７５℃下、１０分間１回反応を行った。１６残基目は室温下２０分間１回反応を行った。
　また、Ｆｍｏｃ除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液と室温下、５分間、及び１５分間反応させることを基本条件とした。
　クロロアセチル基の導入は前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．２Ｍ　クロロ酢酸（約５当量）のＤＭＦ溶液、０．２Ｍ　ＤＩＰＣＩ（約５当量）のＤＭＦ溶液、０．２Ｍ　ＨＯＳｕ（約５当量）のＤＭＦ溶液を固相樹脂に加え室温にて９０分振盪することにより行った。
　側鎖の脱保護及び固相樹脂からの切り出しは、まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥し、続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－Ａ（３ｍＬ、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、室温で６０分振盪した。
　反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やした過剰のジイソプロピルエーテル溶媒に加えると、沈殿が生じた。この混合物を遠心分離し（９０００ｒｐｍ、３分）、溶液をデカンテーションした。得られた固体を再度０℃に冷やした１０ｍＬのジエチルエーテルにて３回洗浄後、減圧下乾燥させた。得られた固体を次の環化反応に用いた。
　ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に２．５ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／水（９／１）の混合溶液に溶解後、１０当量のトリエチルアミンを加えて、室温で約１８．５時間振盪した。反応液に、２０当量の酢酸を添加後、得られた反応溶液をＧｅｎｅｖａｃ社のＥＺ－２を用いて減圧濃縮した（４０℃未満、減圧時間１６時間）。
　得られた粗生成物を、以下の条件を用いて精製した。カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　１９ｘ１５０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．１％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％Ｂ）：３分間かけて５－３０％、その後８分間かけて３０－３５％、その後１分かけて３５－６０％；流量：１７ｍＬ／分。
　目的物の純度は分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９０．５％であった。
　分析条件：保持時間＝３．６２分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６μｍ　２．１ｘ１５０ｍｍ、１００Å；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％、その後０．３分間かけて６０－９５％、その後１．５５分かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／分
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝１２０４．６４　（Ｍ＋２Ｈ）２＋
　実施例３　ＴＧＦｂ１＿０３１（配列番号３２）の合成
　本実施例では、以下の構造を有するＴＧＦｂ１＿０３１（配列番号３２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　Ｆｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学、０．４８ｍｍｏｌ／ｇ、０．５２１ｇ）を用い、前述の一般的な化学合成方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、ＣＥＭ社のＬｉｂｅｒｔｙ　Ｂｌｕｅ　ＨＴを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。
　各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／ＤＩＰＣＩ／Ｏｘｙｍａ　ｐｕｒｅ（４．２当量／８当量／４当量）を用い、ＤＭＦ中９０℃下、３分間１回反応を行った。ただし、３残基目、４残基目、６残基目、７残基目、１１残基目、１５残基目は７５℃下、２０分間１回反応を行った。９残基目は９０℃下３分間２回反応を行った。１０残基目は７５℃下２０分間２回反応を行った。１４残基目は５０℃下１５分間１回反応を行った。
　また、Ｆｍｏｃ除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液と７５℃下、３分間反応させることを基本条件とした。ただし、１残基目、２残基目、３残基目、４残基目、５残基目、６残基目、７残基目、８残基目、１１残基目、１２残基目、１３残基目、１５残基目、１７残基目、及び１８残基目のＦｍｏｃ除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液と２５℃下５分間２回反応を行った。
　クロロアセチル基の導入は前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．１Ｍ　クロロ酢酸（約５当量）のＤＭＦ溶液、０．１Ｍ　ＨＡＴＵ（約５当量）のＤＭＦ溶液、０．２Ｍ　ＤＩＥＡ（約１０当量）のＤＭＦ溶液を固相樹脂に加え室温にて３０分振盪することにより行った。
　側鎖の脱保護及び固相樹脂からの切り出しは、まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥し、続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－Ａ（５ｍＬ、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、室温で６０分振盪した。
　反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やした過剰のジイソプロピルエーテル／ヘキサン（１／１）の混合溶媒に加えると、沈殿が生じた。この混合物を遠心分離し（９０００ｒｐｍ、２分）、溶液をデカンテーションした。得られた固体を再度０℃に冷やした１５ｍＬのジエチルエーテルにて３回洗浄後、減圧下乾燥させた。得られた固体を次の環化反応に用いた。
　ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に５ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解後、１０当量のトリエチルアミンを加えて、室温で約１６時間振盪した。得られた反応溶液をＴｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＳａｖａｎｔ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて減圧濃縮した（４０℃未満、減圧時間３時間）。
　得られた粗生成物を、以下の条件を用いて精製した。カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　５０ｘ１５０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．１％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：４０℃；グラジエント（％Ｂ）：３分間かけて５－２８％、その後８分間かけて２８－３３％、その後１分かけて３３－６０％；流量：１２０ｍＬ／分。
　目的物の純度は分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９９．２％であった。ここで得られるペプチドを、ペプチドＡとする。
　分析条件：保持時間＝１．２０分；カラム：ＣＳＨ　Ｐｈ－ｈｅｘｙｌ　１．７μｍ　２．１ｘ３０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：１．１４分間かけて５－９５％、その後０．８６分間かけて９５－９５％；流量：０．７２ｍＬ／分
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝１２６９．３　（Ｍ＋４Ｈ）４＋
　上記で得られたペプチドＡ（１６．５μｍｏｌ）をペプチドの終濃度が２５ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／水（９／１）の混合溶液に溶解後、１．２当量のＭｅＰＥＧ８ｃ、１．１当量のＨＡＴＵ，３当量のＤＩＰＥＡを加えて、室温で約１時間振盪した。
　得られた粗生成物を、以下の条件を用いて精製した。カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　１９ｘ１５０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．１％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：５０℃；グラジエント（％Ｂ）：３分間かけて７－３２％、その後８分間かけて３２－３７％、その後１分かけて３７－６０％；流量：１７ｍＬ／分。
　目的物の純度は分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９８．２％であった。
　分析条件：保持時間＝４．０９分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６μｍ　２．１ｘ１５０ｍｍ、１００Å；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％、その後０．３分間かけて６０－９５％、その後１．５５分かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／分
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝９７７．７０　（Ｍ＋３Ｈ）３＋
　実施例４　ＴＧＦｂ１＿０３２（配列番号３３）の合成
　本実施例では、以下の構造を有するＴＧＦｂ１＿０３２（配列番号３３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ＴＧＦｂ１＿０３１（配列番号３２）の合成で得られたペプチドＡ（４．５μｍｏｌ）をペプチドの終濃度が２５ｍＭとなるようにアセトニトリル／水（１／１）の混合溶液に溶解後、０．６７当量のＮＨＳ－ＯＣＯｍＰＥＧ１００００、５当量のＤＩＰＥＡを加えて、室温で約１時間振盪した。
　得られた粗生成物を、以下の条件を用いて精製した。カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　３０ｘ１５０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．１％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：５０℃；グラジエント（％Ｂ）：０．５分間かけて３５－３５％、その後１１．５分間かけて３５－６０％；流量：４５ｍＬ／分。
　目的物の純度は分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９９．３％であった。
　分析条件：保持時間＝３．１６分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６μｍ　２．１ｘ１５０ｍｍ、１００Å；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて４０－８０％、その後０．３分間かけて８０－９５％、その後１．５５分かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／分
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝１３３１．０６（中央値）
　実施例５　ＴＧＦｂ１＿０２４（配列番号２５）の合成
　本実施例では、以下の構造を有するＴＧＦｂ１＿０２４（配列番号２５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　Ｆｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学、０．４８ｍｍｏｌ／ｇ、０．１５６ｇ）を用い、前述の一般的な化学合成方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、Ｂｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Iを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。
　各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／ＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡ（４．２当量／４当量／８当量）を用い、ＤＭＦ中７５℃下、２０分間２回反応を行った。ただし、４残基目、９残基目は７５℃下、３０分間２回反応を行った。１４残基目は室温下３０分間２回反応を行った。１５残基目は７５℃下、２０分間１回反応を行った。１６残基目は室温下２０分間１回反応を行った。１７残基目は７５℃下、１０分間１回反応を行った。
　また、Ｆｍｏｃ除去は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液と室温下、５分間、及び１５分間反応させることを基本条件とした。
　クロロアセチル基の導入、側鎖の脱保護及び固相樹脂からの切り出し、並びにペプチドの沈殿下は、ＴＧＦｂ１＿０１２（配列番号１３）の合成の方法に準じて行った。
　ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に２．５ｍＭとなるようにアセトニトリル／水（１／１）の混合溶液に溶解後、１０当量のトリエチルアミンを加えて、室温で約３時間振盪した。反応液に、２０当量の酢酸を添加後、得られた反応溶液をＧｅｎｅｖａｃ社のＥＺ－２を用いて減圧濃縮した（４０℃未満、減圧時間１６時間）。
　得られた粗生成物を、以下の条件を用いて精製した。カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　５０ｘ１５０ｍｍ；移動相：Ａ＝０．１％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．１％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：４０℃；グラジエント（％Ｂ）：３分間かけて５－２６％、その後８分間かけて２６－３１％、その後１分かけて３１－６０％；流量：１７ｍＬ／分。
　目的物の純度は分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し７９．９％であった。
　分析条件：保持時間＝３．０１分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６μｍ　２．１ｘ１５０ｍｍ、１００Å；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％、その後０．３分間かけて６０－９５％、その後１．５５分かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／分
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝１３３６．９６　（Ｍ＋２Ｈ）２＋
　実施例６　ＴＧＦｂ１＿０６８（配列番号６９）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　ＨＡ　ｔａｇ　ｒｅｓｉｎ（０．６５ｍｍｏｌ／ｇ、０．００４ｍｇ、２．５μｍｏｌ　ｓｃａｌｅ）を用い、前述の一般的方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、Ｂｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　IIを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。
　固相樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／　ＨＡＴＵ／　ＤＩＰＥＡ（４．２当量／３．９当量／８．４当量）を用い、ＤＭＦ中７５℃下、２０分間２回反応を行った。ただし、５残基目、７残基目、８残基目、９残基目、１０残基目、１２残基目、１３残基目、１７残基目は７５℃下、１０分間２回反応を行った。１４残基目、１６残基目は５０℃下、３０分間２回反応を行った。１８残基目は室温下、６０分間１回反応を行った。また、Ｆｍｏｃ除去は２０％ピぺリジンのＤＭＦ溶液と室温下、５分間反応させた後、１５分間反応させることを基本条件とした。
　クロロアセチル基の導入は、前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．３Ｍ　クロロ酢酸のＤＭＦ溶液（４．２当量）、０．２８Ｍ　ＨＡＴＵのＤＭＦ溶液（３．９当量）、１．０５Ｍ　ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（８．４当量）を固相樹脂に加え、室温下、３０分間振盪を２回繰り返すことにより行った。
　側鎖の脱保護及び固相樹脂からの切り出しは、まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥した。続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－　Ａ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、室温で６０分間振盪した。
　反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やしたジイソプロピルエーテル（１．５ｍＬ）に加えると、沈殿が生じた。この混合物を遠心分離し（８５００　ｒｐｍ、３０秒間）、溶液をデカンテーションにより除去した。得られた固体を再度０℃に冷やしたジエチルエーテル／ヘキサン（１：１、１ｍＬ）にて２回洗浄後、減圧下乾燥させた。得られた固体を次の環化反応に用いた。
　ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に２５ｍＭ（２．５μｍｏｌ／０．１ｍＬ）となるようにイソプロピルアルコール／水／ＤＭＳＯ（１：１：１８）に溶解後、２０当量のトリエチルアミンを加えて、室温下で６３時間振盪した。得られた反応溶液に４０当量の酢酸を加えた。
　得られた上記反応溶液はギルソン社のカラムを用い固相抽出した（カラム：Ｇｉｌｓｏｎ　ＡＳＰＥＣ　Ｃ１８　５００ｍｇ　３ｍＬ）。
　（ｉ）カラムを抽出液Ａ（０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　９５％ＭｅＣＮ／水、３ｍＬ）で洗浄した。
　（ｉｉ）抽出液Ｂ（０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　５％ＭｅＣＮ／水、３ｍＬ）でカラムを平衡化した。
　（ｉｉｉ）上記反応溶液０．１ｍＬをカラムにローディングした。
　（ｉｖ）抽出液Ｂ（４ｍＬ）でカラムを洗浄した。
　（ｖ）抽出液Ａ（４ｍＬ）で抽出した。得られた抽出液をＥＺ－２　Ｅｌｉｔｅを用いて減圧濃縮した。
　目的物は主たるピークの一つの純度は以下の分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２０　ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し２１．８％であった。
　分析条件：保持時間＝１．７４分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＥＶＯ　Ｃ１８　１．７μｍ　２．１ｘ５０ｍｍ、１００Å；移動相：Ａ＝０．０２５％　ＴＦＡ（水中）、Ｂ＝０．０２５％　ＴＦＡ（ＭｅＣＮ中）；温度：６０℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：２．１０分間かけて５－９５％、その後０．７５分間かけて９５－９５％；流量：０．６ｍＬ／分
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１９０３．５（Ｍ＋２Ｈ）２＋
　実施例７　各種ペプチド合成
　本実施例では、実施例１－６と同様に、各種環状ペプチドを化学合成した。合成したペプチドの配列を、表１及び表４に示す。表１において、配列番号２、４－１３、１５－３３は、アミノ酸配列が環化構造をとる環状ペプチドのＣ末端にグリシン（Ｇ）リンカーが付加されている。配列番号３２は、Ｇリンカーの先にさらに、Ｋ（ＭｅＰＥＧ８ｃ）が、そして、配列番号３３は、Ｇリンカーの先にさらに、Ｋ（ＯＣＯｍＰＥＧ１００００）が付加されている。なお、配列番号３は、配列番号２と同じアミノ酸配列だが、Ｃ末端のグリシン（Ｇ）リンカー付加がない。なお、配列番号１４は、配列番号１３と同じアミノ酸配列だが、Ｃ末端のグリシン（Ｇ）リンカー付加がない。
　配列番号３４－６９のアミノ酸配列からなるペプチドも、環化構造をとる環状ペプチドのＣ末端にリンカーとしてＧが結合している。なお、表４において、配列番号３４－６９のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端リンカーのＧの先にＨＡ－ｔａｇが結合している。これは、ＥＬＩＳＡによりＴＧＦ－β阻害ペプチドとＴＧＦ－β１との結合を評価する際に必要なアミノ酸配列で、活性に影響を及ぼすものでない。
　合成したペプチドは実施例１－６に記載する分析条件で分析し、質量スペクトル分析法におけるＥＳＩ－ＭＳ（＋）により構造を確認した。得られたＥＳＩ－ＭＳ（＋）観測値と、その場合における価数を表１、表４に示す。
　実施例８　表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＴＧＦ－βとペプチドとの分子間相互作用評価試験
　本実施例では、（１）実施例１－５及び実施例７で合成した配列番号２－３３のアミノ酸配列からなる各種ペプチドについてのＴＧＦ－βへの結合活性を評価するため、また、（２）実施例２で合成した配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドのＴＧＦ－βの２種類のアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、β２）に対する結合活性及び選択性を確認するため、ＴＧＦ－βに対するペプチドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による分子間相互作用を、以下に示す方法によって試験を実施した。具体的な試験方法を以下に示す。
［ＳＰＲ測定］
　ＢｉａｃｏｒｅＴ２００（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）にＣＭ３センサーチップ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を挿入し、ランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）でプライム操作を３回実施し、流速３０μＬ／分で平衡化した。
　６０ｍＭ　ＥＤＣ溶液（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）、６５０ｍＭ　ＮＨＳ溶液（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を各々５０μＬずつ混合させた後、流速１０μＬ／分で４２０秒反応させた。１０ｍＭ酢酸溶液（ｐＨ５．０）で希釈した０．２μＭ　ＴＧＦ－β溶液１５０μＬ調製し、流速１０μＬ／分で４２０秒反応させＣＭ３センサーチップにＴＧＦ－βを固定化した。ＴＧＦ－βは、ヒト由来のＴＧＦ－β１又はβ２（組換えヒトＴＧＦ－β１、２）であり、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓより入手した。固定化後、１．０Ｍ　エタノールアミン水溶液（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を流速１０μＬ／分で４２０秒反応させキャッピングを行った。
　ＤＭＳＯ溶液中で１０ｍＭに調製されたペプチド溶解液を、終濃度が１０μＭのペプチド溶解液になるようにランニング緩衝液で希釈した後、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭのペプチド溶液を作製した。上述のサンプルを用い、ＴＧＦ－βに対するペプチドのカイネティクスをＳＰＲ測定により取得した。
　カイネティックス評価モデルは、Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓとし、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．０（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を使用してカーブフィッティングを行った。得られたセンサーグラムに対して、最小二乗法によるカーブフィッティングを実施し、そのＫＤ値を求めることで各種ペプチドのＴＧＦ－βに対する結合を評価した。
　（１）配列番号２－３３のアミノ酸配列からなるペプチドのＫＤ値を表２、表３に示す。表２、表３に示されたとおり、配列番号２－３３のペプチドはＴＧＦ－β１に対する結合能を有することが示された。なお、配列番号３及び配列番号１４のペプチドについては、各々配列番号２及び配列番号１３と環状ペプチド構造を成すアミノ配列が同じでリンカー部位のグリシン付加の有無だけの差異である。それらペプチドのＴＧＦ－β１に対する結合能は、配列番号３のペプチドのＫＤが０．４６ｎＭ、配列番号１４のペプチドのＫＤが０．８２ｎＭであり、グリシンが付加されている配列番号２及び配列番号１３のＫＤとほぼ変わらなかった。これより、本発明のペプチドにリンカーを付加してもＴＧＦ－β１に結合可能であることが示唆された。
　（２）配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドのＴＧＦ－βの２種類のアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、β２）に対するＫＤ値は、ＴＧＦ－β１については表２に記載の通り０．８６ｎＭであった。ＴＧＦ－β２については２．０ｎＭであった。以上の結果より、本発明のペプチドは、ＴＧＦ－β１，２に対し特異的に結合することが示された。
　実施例９　ＴＧＦ－β阻害活性を評価
　本実施例では、実施例１－５及び実施例７で合成した配列番号２－３３のアミノ酸配列からなるペプチドのＴＧＦ－β１阻害活性を、ＳＢＥレポーター－ＨＥＫ２９３細胞系（ＢＰ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＳＢＥレポーターアッセイによって、下記の通り評価した。
　また、本発明のペプチドのＴＧＦ－βのアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、β２）に対する選択性を確認する為、実施例２で合成した配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２に対する阻害活性を評価した。
　ＳＢＥレポーター－ＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）含むＥ－ＭＥＭ（Ｗａｋｏ）で培養した。アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を剥離後、０．５％ＦＢＳを含むＥ－ＭＥＭに懸濁し１ウェルあたり４５，０００細胞となるように９６穴プレートに播種し、一晩培養した。翌日ペプチドを加え２０分静置後、組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、組換えヒトＴＧＦ－β２（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．１３ｎＭになるように添加し１８時間培養を行った。
　その後、各ウェルにルシフェラーゼアッセイ　ＯＮＥ－Ｇｌｏ試薬を加え５分間振とうした。シグナルの検出にはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｐａｒａｄｉｇｍ　ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。得られたシグナルをＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍで解析し、ＴＧＦ－βで誘導されるシグナルの最大値を０％阻害、無刺激を１００％阻害としてペプチドの阻害活性を算出した。
　実施例１－５及び実施例７で合成した配列番号２－３３のアミノ酸配列からなるペプチドのＴＧＦ－β１阻害活評価結果を表２、表３に示す。表２、表３に示されたとおり、合成した各種ペプチドはＴＧＦ－β１アンタゴニスト活性を有することが示された。なお、配列番号３及び配列番号１４のペプチドについては、前述のとおり各々配列番号２及び配列番号１３と環状ペプチド構造を成すアミノ配列が同じでリンカー部位のグリシンの有無だけの差異であり、実施例８より結合活性も変わらないため、ＳＢＥレポーターの結果は省略する。
　また、ＴＧＦ－βのアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、β２）に対する選択性評価の結果を図１に示す。図１に示されたとおり、実施例２で合成した配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドはＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２に対する阻害活性を示した。このことから、本発明の配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＴＧＦ－β１だけではなく、ＴＧＦ－β２をも阻害することが示された。
　実施例１０　ＥＬＩＳＡによるＴＧＦ－βとペプチドとの結合評価
　本実施例では、実施例６及び実施例７で合成した配列番号３４－６９のアミノ酸配列からなる各種ペプチドについて、ＴＧＦ－β１との結合を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。配列番号３４－６９のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端リンカーのＧの先にＨＡ－ｔａｇを結合させた。本明細書中、「ＨＡ－ｔａｇ」とは、ＰＥＧ１０ｃ－Ｙ－Ｐ－Ｙ－Ｄ－Ｖ－Ｐ－Ｄ－Ｙ－Ａ（配列番号７０）のアミノ酸配列を意味する。これは、ＥＬＩＳＡによりＴＧＦ－β阻害ペプチドとＴＧＦ－β１との結合を評価する際に必要なアミノ酸配列である。ＴＧＦ－β１との結合活性に影響を及ぼすものでない。
　ＨＡ－ｔａｇを結合させた配列番号３４－６９のアミノ酸配列からなるペプチドと、ＴＧＦ－β１ビーズを用いたＥＬＩＳＡにより、ペプチドとＴＧＦ－β１との結合活性を調べた。
　＜ＴＧＦ－β１ビーズの作製＞
　組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｄｙｎａｂｅａｄ　Ｍ－２７０　Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に固定化しＴＧＦ－β１ビーズを作製した。固定化反応はＡｍｉｎｅ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｋｉｔ（同仁化学研究所）を用いた。
　＜ＥＬＩＳＡ＞
　ＴＧＦ－β１ビーズとＣ末端にＨＡタグ配列を付加したペプチドを０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）中で１時間反応させた後ＰＢＳ－Ｔにより洗浄した。ＴＧＦ－β１ビーズに結合したペプチドを検出する為、１％　ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中でＡｎｔｉ－ＨＡ－ｔａｇ　ｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ（ＭＢＬ）と前述のＴＧＦ－β１ビーズを３０分反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後ＳｕｒｅＢｌｕｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により１０分間発色後ＴＭＢ　ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し発色反応を停止させた。吸光度測定にはＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用した。
　なお、結合活性はＴＧＦｂ１＿０６１（配列番号６２）のペプチドのＴＧＦ－β１に対する結合能を１００％としたときの相対値として示した。結果を表４に示す。表４に示されたとおり、配列番号３４－６９のアミノ酸配列からなるペプチドはＴＧＦ－β１に対する結合能を有することが示された。
　表１　アンタゴニスト活性を示したペプチド配列とＭＳ値（配列番号２～３３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１の配列番号３２及び３３のｍ／ｚは、各々リンカーであるＫ（ＭｅＰＥＧ８ｃ）、Ｋ（ＯＣＯｍＰＥＧ１００００）のうち、ＭｅＰＥＧ８ｃ、ＯＣＯｍＰＥＧ１００００構造の付加前の値である。
　表２　配列番号２～１９のペプチド配列のＳＰＲ測定結果とアンタゴニスト活性測定結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表３　配列番号２０－３３のペプチド配列のＳＰＲ測定結果とアンタゴニスト活性測定結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表２及び表３のＳＢＥ　ｒｅｐｏｒｔｅｒの欄の下の濃度（ｎＭ）は、実際の測定に使用したペプチドの濃度を記載している。
　表４　アンタゴニスト活性は測定していないが、ＴＧＦ－βへの結合活性を示したペプチド配列、ＭＳ値、ＴＧＦ－βへの結合活性測定結果（配列番号３４～６９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表４のＴＧＦ－βへの結合活性は、ＴＧＦｂ１＿０６１（配列番号６２）のペプチドのＴＧＦ-β１に対する結合能を１００％とした時の相対値として示した。
参考例　新規非天然アミノ酸の合成
　本参考例は、本発明のペプチドに含まれる非天然アミノ酸の合成を示す。
　ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　Ｎ２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝－Ｌ－リジン－２－プロペン－１－イルエステル塩酸塩（８．００ｇ、１７．９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８０ｍＬ）溶液に、トリホスゲン（２．６７ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）を氷冷下で加えた後、ＤＩＥＡ（１０．１ｍＬ，５７．５ｍｍｏｌ）を滴下し、氷冷下で３０分攪拌した。反応液にジオキサン（８０ｍＬ）を加えた後、メグルミン（１４．０ｇ、７１．９ｍｍｏｌ）含有０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）を加えた。反応液を終夜氷冷下で攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、０．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。その溶液を濾過し、濾液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－６０／４０）、所望の生成物（８．７０ｇ、１３．８２ｍｍｏｌ）を白色アモルファスとして得た。
　得られた生成物（８．７０ｇ、１３．８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶かし、氷冷下でイミダゾール（２．３５ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）、トリイソプロピルクロロシラン（３．３３ｇ、１７．２７ｍｍｏｌ）を加え、室温で５日間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水で３回洗浄した。抽出層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下濃縮した。
　得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００－６０／４０　その後ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－９０／１０）、所望の生成物（９．３０ｇ、１１．８３ｍｍｏｌ）を白色アモルファスとして得た。
　得られた生成物（１０．４ｇ、１３．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶かし、フェニルシラン（３．３ｍＬ、２６．５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．３８ｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００－６０／４０　その後ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－９０／１０）、表記物質（７．７ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を得た。
　ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝７４６．６　（Ｍ＋Ｈ）＋
　本発明に係るペプチドは、ＴＧＦ－βに対し結合活性を有し、そして、好ましくは、ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する。がんや肝疾患等の医薬用組成物、診断用組成物、及び研究用組成物等としての利用可能である。

Claims (30)

  1. 　以下のアミノ酸配列：
    　Ｆ－Ｎａｌ１－Ｖ－Ｖ－Ｎ－Ｖ－Ｙ－Ｄ－Ｄ－ＰｅＧ－Ｖ－Ｎａｌ１－Ｙ－Ｈ－Ｖ－Ｃ－Ｇ（配列番号２）；
    あるいは、
    　上記のアミノ酸配列の２番目、４番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目及び１７番目のアミノ酸残基からなるグループから選択される、１－１１個のアミノ酸残基において、置換、付加、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列
    を含む、ペプチド。
  2. 　以下のアミノ酸配列：
    　Ｆ－Ｘ１－Ｖ－Ｘ２－Ｎ－Ｖ－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｖ－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｃ（配列番号１）
    　ここにおいて、
    　Ｘ１は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
    　Ｘ２は、任意のアミノ酸であり；
    　Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；
    　Ｘ４は、任意のアミノ酸であり；
    　Ｘ５は、任意のアミノ酸であり；
    　Ｘ６は、側鎖に置換されていてもよいアルキル基を有するアミノ酸、又は置換されていてもよいアルキル基を有する二級アミノ酸であり；
    　Ｘ７は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
    　Ｘ８は、側鎖に置換されていてもよい芳香族環を有するアミノ酸であり；
    　Ｘ９は、任意のアミノ酸であり；
    　Ｘ１０は、任意のアミノ酸である、
    を含む、ペプチド。
  3. 　Ｘ１が、側鎖に置換されていてもよい縮合環を有するアミノ酸である、請求項２に記載のペプチド。
  4. 　Ｘ１が、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、Ｗ７Ｎ又はＷである、請求項２に記載のペプチド。
  5. 　Ｘ２が、Ｖ、Ｋ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ又はＱである、請求項２－４のいずれか１項に記載のペプチド。
  6. 　Ｘ２が、Ｖ、Ｋ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、又はＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅである、請求項２－４のいずれか１項に記載のペプチド。
  7. 　Ｘ３が、Ｙ、４Ｐｙ、Ａ、Ｅ、Ｆ４Ｇ、Ｑ，Ｋ、Ｆ３Ｇ、又は３Ｐｙである、請求項２－６のいずれか１項に記載のペプチド。
  8. 　Ｘ３が、Ｙ又は４Ｐｙである、請求項２－６のいずれか１項に記載のペプチド。
  9. 　Ｘ４が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、請求項２－８のいずれか１項に記載のペプチド。
  10. 　Ｘ４が、Ｄ、Ａ、Ｑ、Ｋ又はＥである、請求項２－８のいずれか１項に記載のペプチド。
  11. 　Ｘ５が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、請求項２－１０のいずれか１項に記載のペプチド。
  12. 　Ｘ５が、Ｄ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、Ａ、Ｑ、又はＫである、請求項２－１０のいずれか１項に記載のペプチド。
  13. 　Ｘ６が、ＰｅＧ、Ｋ又はＭｅＧである、請求項２－１２のいずれか１項に記載のペプチド。
  14. 　Ｘ７が、側鎖に置換されていてもよい縮合環を有するアミノ酸である、請求項２－１３のいずれか１項に記載のペプチド。
  15. 　Ｘ７が、Ｎａｌ１、Ｗ６Ｎ、又はＷである、請求項２－１３のいずれか１項に記載のペプチド。
  16. 　Ｘ８が、Ｙ、４Ｐｙ、３Ｐｙ又はＥである、請求項２－１５のいずれか１項に記載のペプチド。
  17. 　Ｘ８が、Ｙ又は４Ｐｙである、請求項２－１５のいずれか１項に記載のペプチド。
  18. 　Ｘ９が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、請求項２－１７のいずれか１項に記載のペプチド。
  19. 　Ｘ９が、Ｈ、Ａ、Ｑ又はＥである、請求項２－１７のいずれか１項に記載のペプチド。
  20. 　Ｘ１０が、置換若しくは未置換の芳香族アミノ酸及び含硫アミノ酸、以外のアミノ酸である、請求項２－１９のいずれか１項に記載のペプチド。
  21. 　Ｘ１０が、Ｖ、Ｅ、ＫＣＯｐｉｐｚａａ、ＫＣＯｍｅｇｌｕｍｉｎｅ、Ｑ、Ｋ，又はＡである、請求項２－１９のいずれか１項に記載のペプチド。
  22. 　配列番号２－３３、あるいは、
    　配列番号２、４－１３、１５－３３のうちＣ末端のグリシン（Ｇ）を有しないアミノ酸配列
    のいずれかに１つのアミノ酸配列を含む、又は、からなる、請求項１－２１のいずれか１項に記載のペプチド。
  23. 　前記ペプチドが、環状ペプチドである、請求項１－２２のいずれか１項に記載のペプチド。
  24. 　クロロアセチル化したアミノ酸と、前記ペプチドに含まれるシステイン残基とが結合された環状構造を有する、請求項２３に記載の環状ペプチド。
  25. 　さらに、付加的なアミノ酸残基を含む、請求項１－２４のいずれか１項に記載のペプチド。
  26. 　そのＣ末端にリンカーを含む、請求項１－２１、２３－２５のいずれか１項に記載のペプチド。
  27. 　ＴＧＦ－β結合活性を有する、請求項１－２６いずれか１項に記載のペプチド。
  28. 　ＴＧＦ－βアンタゴニスト活性を有する、請求項１－２７いずれか１項に記載のペプチド。
  29. 　請求項１－２８のいずれか１項に記載のペプチドを含む、医療用、診断用組成物。
  30. 　請求項１－２８のいずれか１項に記載のペプチドを含む、研究用組成物であって、ただし、オルガノイドを培養するための培地への添加剤として使用される組成物は除く、前記研究用組成物。
     
     
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