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WO2021210812A1 - 섬유질환 예방 또는 치료용 재조합 융합 단백질 - Google Patents

섬유질환 예방 또는 치료용 재조합 융합 단백질 Download PDF

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WO2021210812A1
WO2021210812A1 PCT/KR2021/003959 KR2021003959W WO2021210812A1 WO 2021210812 A1 WO2021210812 A1 WO 2021210812A1 KR 2021003959 W KR2021003959 W KR 2021003959W WO 2021210812 A1 WO2021210812 A1 WO 2021210812A1
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WO
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fusion protein
fibrosis
seq
present
albumin
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/003959
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English (en)
French (fr)
Inventor
오준서
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
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Publication date
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Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
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Priority to US17/996,202 priority patent/US20230357356A1/en
Priority to JP2022562862A priority patent/JP2023521906A/ja
Priority to CN202180028847.9A priority patent/CN115605502A/zh
Priority to BR112022020350A priority patent/BR112022020350A2/pt
Priority to EP21789246.2A priority patent/EP4137507A4/en
Priority to CA3175503A priority patent/CA3175503A1/en
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    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein of albumin and retinol binding protein that can be used to prevent or treat fibrotic diseases occurring in the liver, pancreas, lungs, etc.
  • Tissue fibrosis has fatal consequences resulting in tissue loss of function.
  • liver fibrosis progresses to liver cirrhosis and liver cancer following loss of liver function, and fibrotic tissue is commonly observed in chronic pancreatitis and pancreatic cancer.
  • tissue transplantation is the most promising method.
  • the molecular mechanism of tissue fibrosis has not yet been clearly elucidated, and research on the development of therapeutic agents for fibrosis is necessary.
  • tissue fibrosis is caused by the activation process (activation and transdifferentiation) of stellate cells, which are one of the cells constituting the tissue.
  • stellate cells which are one of the cells constituting the tissue.
  • Activated astrocytes excessively express and accumulate extracellular matrix such as collagen, and are differentiated into myofibroblasts. These activated astrocytes play a crucial role in the development of tissue fibrosis.
  • Stellate cells are distributed not only in the liver but also in the pancreas, lungs, kidneys, and intestines and play a central role in regulating retinoid homeostasis throughout the body.
  • Vitamin A retinol
  • RBP retinol binding protein
  • astrocytes through the RBP receptor STRA6, and is stored in the form of retinyl ester in the cytoplasmic fat droplets.
  • albumin inhibits its activation in astrocytes, and the expression of albumin in already activated astrocytes converts to a state prior to activation.
  • the present inventors prepared a fusion protein targeting astrocytes by binding albumin and RBP that can move into astrocytes through STRA6 for inhibition or inactivation of astrocyte activation, which is the start of tissue fibrosis, and fibrosis Preventive and therapeutic effects were confirmed (KR 10-1395394).
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to enhance the effect of inhibiting or inactivating astrocytes of conventional RBP and albumin fusion proteins. To provide RBP-albumin fusion proteins linked in different arrangements.
  • the present invention is to provide a method for mass production of the recombinant protein of the present invention by providing a vector capable of expressing the fusion protein and a transformant into which the vector is introduced.
  • the fusion protein of the present invention exhibits a superior effect on the inhibition or inactivation of astrocyte activation than the conventional RBP-albumin fusion protein, and the present invention provides a composition for preventing or treating fibrotic diseases comprising the fusion protein want to
  • the present invention provides a fusion protein consisting of or comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the present invention provides a fusion protein consisting of or comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 8.
  • the fusion protein may be used for preventing or treating tissue fibrosis.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding each of the fusion proteins, and the polynucleotide may consist of or include any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 9 to 14.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding the fusion protein, and provides a transformant comprising the recombinant vector.
  • the present invention comprises the steps of (1) preparing a recombinant vector comprising a gene encoding a fusion protein consisting of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8; (2) introducing the recombinant vector into a host cell to prepare a transformant; (3) culturing the transformant; and (4) obtaining a fusion protein from the culture medium; provides a method for producing a fusion protein comprising.
  • the gene encoding the fusion protein may include a polynucleotide consisting of one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 14.
  • the host cell may be a mammalian cell, preferably a mammalian cancer cell, and more preferably a CHO cell.
  • the present invention may provide a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrotic diseases, comprising a fusion protein consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8.
  • the present invention may provide a method for preventing or treating fibrotic disease, comprising administering to an individual a fusion protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8.
  • the subject may be a human in need of prevention or treatment of a fibrotic disease, particularly a patient with non-alcoholic fatty liver disease.
  • the method may further include diagnosing the degree of fibrosis by performing a CT scan or biopsy after administration of the fusion protein.
  • the fibrotic disease is liver fibrosis, chronic hepatitis, cirrhosis, hepatic cancer, chemotherapy-associated steatohepatitis, CASH ), lung fibrosis, renal fibrosis, renal failure, pancreatic fibrosis, chronic pancreatitis, and at least one selected from the group consisting of pancreatic cancer may be a disease.
  • the present invention provides the use of the fusion protein for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of fibrotic diseases.
  • the fusion protein of the present invention can prevent or treat fibrotic diseases by inhibiting or inducing inactivation of the activation of astrocytes that cause tissue fibrosis. It is expected to become a general-purpose base technology that can dramatically reduce the human dose and frequency of administration of protein therapeutics.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the mechanism by which albumin III and RBP-coupled fusion protein are nested in activated astrocytes and act.
  • Figure 2 is a view comparing the inactivation-inducing effect of the fusion proteins 1 and 2 of the present invention and the conventional fusion proteins (RBP-albumin III and albumin III-RBP) on activated astrocytes.
  • FIG. 3 is a view comparing the inactivation-inducing effect of fusion proteins 1 and 2 and fusion proteins 3 to 6 of the present invention on activated astrocytes.
  • FIGS. 4A and 4B are diagrams comparing and confirming the degree of liver fibrosis according to administration of fusion proteins 1 and 4 and RBP-albumin2 to an animal model of liver fibrosis through Sirius Red tissue staining.
  • Albumin is a multifunctional plasma protein synthesized primarily in hepatocytes. Albumin has three domains, each consisting of two subdomains A and B. Albumin is known to play a role in molecular movement by binding with various hydrophobic substances including fatty acids and retinoic acid and transporting them in the blood. According to crystallographic analysis, five strong fatty acid binding sites are distributed asymmetrically in albumin (one in subdomains IB, one between IA and IIA, two in IIIA, and one in IIIB).
  • the present inventors prepared a fusion protein in which albumin and a retinol binding protein (RBP) for targeting astrocytes were combined, and the fusion protein was introduced into the activated astrocytes to activate the cell morphology. It was confirmed that the reverse conversion to the previous one, thereby preventing and treating fibrotic diseases is possible. Furthermore, the present inventors have identified that retinoic acid (RA) plays an important role in the activation of astrocytes, and that the fusion protein controls the activation of astrocytes by reducing the intracellular level of RA.
  • RBP retinol binding protein
  • the present inventors replaced the 526th amino acid residue (phenylalanine) and the 600th amino acid residue (valine) in albumin domain III with valine and alanine, respectively, to design and manufacture fusion proteins 1 and 2 as follows did.
  • albumin [signal peptide(1 ⁇ 18) + III ⁇ 404 ⁇ 526(F ⁇ V) ⁇ 600(V ⁇ A) ⁇ 601 ⁇ ] + RBP(17 ⁇ 192)
  • albumin sub-domains IB and IIIA bind very stably with retinoic acid, and designed and prepared fusion proteins 3 to 6 as follows.
  • albumin [signal peptide(1 ⁇ 18) + IIIA ⁇ 404 ⁇ 517(V) ⁇ + IB(131 ⁇ 218)] + RBP(17 ⁇ 192)
  • albumin [signal peptide(1 ⁇ 18) + IIIA ⁇ 404 ⁇ 517(V) ⁇ + IB(134 ⁇ 218)] + RBP(17 ⁇ 192)
  • the present inventors treated the prepared fusion protein 1 or 2 to the activated astrocytes to measure the expression levels of ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) and collagen type I, which are activation markers of astrocytes.
  • ⁇ -SMA smooth muscle actin
  • collagen type I collagen type I
  • the inactivation effect of proteins (RBP-albumin III and albumin III-RBP) and astrocytes was compared and confirmed.
  • the fusion proteins 1 and 2 of the present invention can reduce the expression of ⁇ -SMA and collagen I from a low concentration to a high level compared to the conventionally developed fusion proteins (see Example 1).
  • the present inventors confirmed that when 526 a.a and 600 a.a of albumin III were substituted with amino acids having a small molecular weight, the binding force with retinoic acid was increased to more effectively induce inactivation of astrocytes.
  • the present invention can provide a fusion protein in which albumin III and RBP in which amino acids 526 and 600 are independently substituted each independently are substituted for the treatment of fibrotic diseases, and in the fusion protein, the amino acid residue at position 526 of albumin III can be Possible amino acids may be valine, alanine, and glycine, and the amino acid that may be positioned as the 600th amino acid residue may be alanine or glycine, and the fusion protein may consist of or include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 have.
  • the present inventors compared and confirmed the inhibitory effects of ⁇ -SMA and collagen I expression of fusion proteins 1 and 2 and fusion proteins 3 to 6, which showed superior inhibitory effects on the activation process of astrocytes than conventional fusion proteins. As a result, it was confirmed that the fusion proteins 3 to 6 can effectively inhibit the activation of astrocytes even at lower concentrations (Example 2).
  • the present inventors confirmed the effect of improving liver fibrosis of fusion proteins 1 and 4 and the conventional fusion protein (RBP-albumin III) using an animal model of liver fibrosis caused by carbon tetrachloride. It was confirmed that fibrosis can be improved more effectively at a low concentration (Example 3).
  • the present inventors can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrotic diseases comprising one or more fusion proteins selected from the group consisting of the developed fusion proteins 1 to 6, and from the group consisting of fusion proteins 1 to 6 It is possible to provide a method for preventing or treating a fibrotic disease comprising administering to an individual two or more selected fusion proteins.
  • the fusion proteins 1 to 6 of the present invention can effectively induce inactivation of activated astrocytes at a lower concentration than the conventional fusion proteins of RBP and albumin. It is expected to become a general-purpose base technology that can dramatically reduce the dose and frequency of administration.
  • fibrosis disease refers to a disease in which an organ fails to function due to fibrosis in which normal tissue is destroyed and replaced with fibrous connective tissue, and liver fibrosis, chronic hepatitis ), cirrhosis, hepatic cancer, chemotherapy-associated steatohepatitis, CASH, lung fibrosis, renal fibrosis, renal failure, pancreatic fibrosis (pancreatic fibrosis), chronic pancreatitis (chronic pancreatitis) and pancreatic cancer (pancreatic cancer), including, but not limited thereto, as long as it is a disease caused by hardening fibrosis of a part of an organ.
  • the "individual” is not limited as long as it is a mammal, but preferably a human or livestock.
  • prophylaxis means any action that delays the invention of a fibrotic disease or delays tissue fibrosis by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment means any action that delays the fibrosis of the tissue by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of fibrosis.
  • the albumin used to form the fusion protein may be derived from any species, but is preferably derived from the same species as the subject to be administered in order to avoid the risk of immunogenicity.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more known substances capable of preventing or treating tissue fibrosis in addition to fusion proteins 1 to 6, and suitable suitable It may further include carriers, excipients, and diluents.
  • carrier is also called a vehicle, and refers to a compound that facilitates the addition of proteins or peptides into cells or tissues.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • carrier is a commonly used carrier that facilitates the introduction of many organic substances into cells or tissues.
  • diot is defined as a compound that is diluted in water that not only stabilizes the biologically active form of the target protein or peptide but also dissolves the protein or peptide.
  • Salts dissolved in buffer solutions are used as diluents in the art.
  • a commonly used buffer solution is phosphate buffered saline because it mimics the salt state of human solutions. Because buffer salts can control the pH of a solution at low concentrations, buffer diluents rarely modify the biological activity of a compound.
  • the compounds containing azelaic acid may be administered to a human patient as such or as a pharmaceutical composition admixed with other ingredients as in combination therapy or with suitable carriers or excipients.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating fibrous disease according to the present invention is formulated in the form of external preparations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. and sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods.
  • the antibacterial composition of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or locally applied) according to a desired method, and the dosage is the patient's Although it varies depending on the condition and weight, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, it may be appropriately selected by those skilled in the art, for example, about 0.001 mg to 1000 mg in a mixed form with a pharmaceutically acceptable carrier. may be administered.
  • the antibacterial composition of the present invention may be administered once to several times a day as needed, and may be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug therapy, and biological response modifiers.
  • the amino terminus of the recombinant fusion protein of the present invention may be bound to an acetyl group, a fluorenyl methoxy carbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and a protecting group such as polyethylene glycol (PEG).
  • the carboxy terminus of the peptide may be modified with a hydroxyl group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an azide (-NHNH 2 ), and the like.
  • fatty acids oligosaccharides chains, all nanoparticles (gold particles, liposomes, heparin, hydrogel, etc.), amino acids, carriers It can bind to proteins (carrier proteins) and the like. Modification of the above-described amino acids serves to improve the potency and stability of the protein of the present invention.
  • the term “stability” refers not only to in vivo stability, but also storage stability (including storage stability at room temperature, refrigeration, and frozen storage).
  • the present invention provides a method for producing the fusion protein comprising the following steps:
  • the term "gene” should be considered in its broadest sense, and is not limited as long as it encodes a structural protein or a regulatory protein, and is not limited as long as it is a DNA fragment encoding fusion proteins 1 to 6 of the present application, specifically SEQ ID NOs: 9 to 14 It may include one of the nucleotide sequences.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • a vector can be a plasmid, a phage particle or simply a potential genomic insert. Upon transformation into an appropriate host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or in some cases may be integrated into the genome itself. Since plasmid is currently the most commonly used form of vector, plasmid and vector are sometimes used interchangeably in the present specification.
  • a nucleotide sequence is "operably linked" when it is placed into a functional relationship with another nucleotide sequence. It can be a gene and regulatory sequence(s) linked in such a way as to enable gene expression when an appropriate molecule (eg, a transcriptional activation protein) is bound to the regulatory sequence(s).
  • an appropriate molecule eg, a transcriptional activation protein
  • DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a preprotein that participates in secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact and, in the case of a secretory leader, in contact and in reading frame. However, the enhancer does not need to be in contact. Linking of these sequences is accomplished by ligation (ligation) at convenient restriction enzyme sites. When such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method is used.
  • transformation or “transfection” refers to introducing DNA into a host so that DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration completion, and in the present invention, for the production of a fusion protein
  • the host cell used is a CHO cell, but is not limited thereto.
  • the livers of 14-week-old male BALB/c mice were first perfused with phosphate-buffered saline (PBS), followed by a GBSS (Gey's balanced salt solution) solution containing collagenase, pronase and DNase. After perfusion, the liver was extracted. The gallbladder and connective tissue attached to the liver were removed, and the liver cell suspension was placed in the same solution as the GBSS and treated at 37° C. for 12 minutes, followed by centrifugation at 1400 g for 20 minutes on a 13.4% Nycodenz gradient.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • GBSS Greeney's balanced salt solution
  • ⁇ -SMA and collagen I were taken and cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Carlsbad, CA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the purity of astrocytes was evaluated by microscopic observation and western blotting using an anti-tyrosine aminotransferase antibody. When the cells became confluent in the dish, they were subcultured and used as activated astrocytes. Activation of hepatic stellate cells was confirmed through morphological changes and increased expression of ⁇ -SMA and collagen I.
  • Fusion protein 1 RBP (1-193) + albumin III ⁇ 404-526 (F ⁇ V)-600 (V ⁇ A)-601 ⁇ mkwvwallllaawaaa ERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDGR LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKE V NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK
  • Polynucleotides encoding fusion proteins 1 to 6 designed for the preparation of the fusion protein were prepared, and each DNA fragment was cloned into an XbaI/KpnI cut pcDNA3.1(+) vector to prepare a recombinant expression vector. Specific information on the DNA fragment encoding each fusion protein is summarized in Table 2 below.
  • Each of the vectors was introduced into CHO cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) to prepare a transformant expressing the fusion protein.
  • the fusion protein expressed and secreted by culturing the transformant was purified and used by affinity chromatography and HPLC.
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • CCl 4 dissolved in mineral oil 1:1 was injected intraperitoneally at a concentration of 1 mL/kg in BALB/c mice 3 times a week for 6 weeks to prepare a liver fibrosis mouse model induced by liver damage.
  • a control group was administered with the same amount of mineral oil alone. Mice were sacrificed 48 hours after the final CCl 4 injection.
  • livers were removed, and the liver tissues of each experimental group were fixed with 10% buffered formalin and embedded in paraffin to prepare tissue sections. Each tissue section was subjected to Sirius red staining for histological analysis and then observed with an optical microscope.
  • Results are expressed as mean ⁇ standard deviation (SD). Statistical analysis was performed using t-tests. For comparison, significance was tested at P ⁇ 0.05, and a two-sided test was performed for P values.
  • Example 1 Comparison of effects of fusion proteins 1 and 2 and a conventional albumin-RBP fusion protein
  • fusion proteins 1 and 2 designed in Example 2 were compared with RBP-albumin III and albumin III-RBP, which showed excellent effects on the inhibition or inactivation of astrocytes in the previous study. Specifically, 0.25 ⁇ M of each fusion protein was treated in activated mouse liver astrocytes for 20 hours, and expression levels of ⁇ -SMA and collagen I were measured using real-time PCR.
  • Conventional fusion proteins (RBP-albuminIII and albuminIII-RBP) are R-III and III-R fusion proteins of KR 10-1395394.
  • fusion proteins 1 and 2 decreased the mRNA expression of ⁇ -SMA and collagen I more than the conventional fusion proteins.
  • the fusion proteins 3 to 6 could reduce the expression of ⁇ -SMA and collagen I to a remarkably high level even with a smaller amount of protein.
  • the therapeutic effect of the fusion protein was comparatively evaluated using a model of liver fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl 4 ) injection.
  • control As a result of observing the tissue under an optical microscope, a control mouse administered only with mineral oil (control) showed a normal liver structure, but severe liver tissue structure destruction and fibrosis were observed in CCl 4 treated mice. In addition, it was confirmed that fibrosis was improved by the administration of the fusion protein of albumin and RBP (FIG. 4a).
  • the present invention is expected to be a general-purpose base technology that can dramatically reduce the human dose and administration frequency of protein therapeutics by being used as pharmaceuticals for the prevention and treatment of fibrotic diseases.

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Abstract

본 발명은 간, 췌장, 폐 등에 발생하는 섬유질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있는 알부민과 레티놀 결합 단백질의 융합 단백질에 관한 것으로서, 본 발명의 융합단백질은 조직의 섬유화에 원인이 되는 성상세포의 활성화를 억제 또는 불활성화를 유도하여 섬유질환의 예방 또는 치료가 가능하며, 같은 목적의 종래 융합단백질과 비교하여 낮은 농도에서 보다 우수한 효과를 나타내는바 단백질 치료제의 인체 투여 용량과 투여 빈도를 획기적으로 줄일 수 있는 범용적 기반기술이 될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

섬유질환 예방 또는 치료용 재조합 융합 단백질
본 발명은 간, 췌장, 폐 등에 발생하는 섬유질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있는 알부민과 레티놀 결합 단백질의 융합 단백질에 관한 것이다.
조직의 섬유화(fibrosis)는 조직의 기능 상실을 초래하는 치명적인 결과를 낳는다. 예를 들어, 간의 섬유화는 간 기능 상실에 이어, 간경화, 간암으로 진행되며, 만성 췌장염과 췌장암에서 공통적으로 섬유화된 조직이 관찰된다. 현재까지 이용되는 섬유질환 치료제는 없으며, 조직 이식이 가장 치료가능성이 높은 방법으로 시행되고 있다. 조직섬유화의 분자 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으며, 섬유질환 치료제의 개발 연구가 필요하다.
최근들어, 조직의 섬유화는 조직을 구성하는 세포 중 하나인 성상세포(stellate cells)의 활성화 과정(activation 및 transdifferentiation)에 의해 발생함이 밝혀졌다. 활성화된 성상세포는 콜라겐과 같은 세포외기질을 과도하게 발현하여 축적시키며, 근섬유화세포(myofibroblast)로 분화된다. 이렇게 활성화된 성상세포는 조직 섬유화 발생에 결정적인 역할을 수행한다.
성상세포(stellate cell)는 간뿐만 아니라 췌장, 폐, 신장, 그리고 장 등에 분포되어 전신에서의 레티노이드 항상성의 조절에 중심적인 역할을 한다. 식품으로부터 얻어진 비타민 A(레티놀)는 혈류에서 레티놀 결합 단백질(Retinol Binding Protein, RBP)과 결합하여 순환하다가 RBP 수용체인 STRA6를 통해 성상세포로 이동되어, 세포질 내 지방 방울 내에 레티닐 에스테르의 형태로서 저장된다. 한편, 알부민은 성상세포 내에서 그 활성화를 저해하고, 이미 활성화된 성상세포 내에서 알부민의 발현은 활성화 이전의 상태로 전환시킴이 알려져 있다.
이전의 연구에서 본 발명자들은 조직 섬유화의 시작이 되는 성상세포의 활성화 억제 또는 불활성화를 위하여 STRA6를 통해 성상세포 내로 이동할 수 있는 RBP와 알부민을 결합하여 성상세포를 타겟팅하는 융합 단백질을 제조하고 이의 섬유화 예방 및 치료 효과를 확인하였다(KR 10-1395394).
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 종래의 RBP와 알부민 융합 단백질의 성상세포의 활성화 억제 또는 불활성화 효과를 증진시키기 위한 것으로서, 본 발명은 알부민의 하나 이상의 아미노산 서열이 치환된 RBP-알부민 융합 단백질 및 서로 다른 배열로 연결된 RBP-알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질의 발현시킬 수 있는 벡터와 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하여 본 발명의 재조합 단백질의 대량 생산 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 종래의 RBP-알부민 융합 단백질보다 성상세포의 활성화 억제 또는 불활성화에 우수한 효과를 나타내는바, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 섬유질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 융합 단백질은 조직의 섬유화를 예방 또는 치료하기 위한 용도의 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 각 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (3) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (4) 상기 배양액으로부터 융합 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 9 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 숙주세포는 포유류의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유류의 암세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 CHO cell 일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 포함하는, 섬유질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 개체는 섬유질환의 예방 또는 치료가 필요한 인간일 수 있으며, 특히 비알코올성 지방간 질환 환자일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 상기 융합단백질의 투여 이후에 CT 촬영 또는 조직검사를 수행하여 섬유화 정도를 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 섬유질환은 간 섬유증(liver fibrosis), 만성간염 (chronic hepatitis),　간경화 (cirrhosis),　간암(hepatic cancer), 화학요법-연관 지방간염(chemotherapy-associated steatohepatitis, CASH), 폐 섬유증(lung fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 신부전(renal failure), 췌장 섬유증 (pancreatic fibrosis), 만성 췌장염(chronic pancreatitis) 및 췌장암(pancreatic cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 섬유질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 융합단백질은 조직의 섬유화에 원인이 되는 성상세포의 활성화를 억제 또는 불활성화를 유도하여 섬유질환의 예방 또는 치료가 가능하며, 같은 목적의 종래 융합단백질과 비교하여 낮은 농도에서 보다 우수한 효과를 나타내는바 단백질 치료제의 인체 투여 용량과 투여 빈도를 획기적으로 줄일 수 있는 범용적 기반기술이 될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 알부민Ⅲ과 RBP가 결합된 융합단백질이 활성화된 성상세포 내에 내포되어 작용하는 기전을 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 융합단백질 1 및 2와 종래의 융합단백질 (RBP-알부민Ⅲ 및 알부민Ⅲ-RBP)의 활성화된 성상세포의 불활성화 유도 효과를 비교확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 융합단백질 1 및 2와 융합단백질 3 내지 6의 활성화된 성상세포의 불활성화 유도 효과를 비교확인한 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 간 섬유화 동물모델에 융합단백질 1 및 4와 RBP-알부민² 투여에 따른 간 섬유화 정도를 시리우스 레드 조직염색을 통해 비교확인한 도면이다.
알부민은 주로 간세포에서 합성되는 다기능성 혈장 단백질이다. 알부민은 3개의 도메인(domain)을 가지며, 각각은 두 개의 서브도메인(subdomain) A 및 B로 구성된다. 알부민은 지방산, 레티노산을 포함한 다양한 소수성 물질과 결합하여 혈액 내에서 운반시켜 주는 분자 이동의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 결정학 분석에 따르면, 5개의 강력한 지방산 결합 부위가 알부민 내에 비대칭적으로 분포한다(서브도메인 IB에 하나, IA 과 IIA 사이에 하나, ⅢA에 둘, 그리고 ⅢB에 하나).
본 발명자들은 이전의 연구에서 알부민과 성상세포 타겟팅을 위한 레티놀 결합 단백질(Retinol Binding Protein, RBP)이 결합된 융합 단백질을 제조하였으며, 상기 융합 단백질은 활성화된 성상세포 내부로 유입되어 세포의 형태를 활성화 이전으로 역전환시키고, 이로 인하여 섬유질환의 예방 및 치료가 가능함을 확인하였다. 이에 나아가 본 발명자들은 성상세포 활성화 과정에서 레티노산(retinoic acid, RA)이 중요한 역할을 하며, 융합단백질은 이러한 RA의 세포 내 레벨을 감소시킴으로서 성상세포의 활성화를 제어함을 규명하였다. 따라서 보다 안정적으로 레티노산(retinoic acid, RA)과 결합하여 성상세포의 활성화 억제 또는 불활성화를 유도할 수 있는 융합 단백질을 개발하기 위하여, 알부민의 서열 변이와 다양한 조합의 알부민 sub-domain과 RBP의 배열을 이용하여 새로운 알부민 RBP 융합 단백질을 제조하였다.
종전 연구에서 알부민의 도메인 중에서도 도메인Ⅲ과 RBP의 융합단백질에서 성상세포의 활성화 억제 또는 불활성화 효과가 가장 우수하였는바, 이를 토대로 본 발명자들은 레티노산과의 결합력이 강화된 재조합 융합단백질을 제조하고자 하였다.
이에, 종래의 알부민 도메인 Ⅲ과 RBP 융합단백질에서 도메인 Ⅲ의 526번째와 600번째 bulky한 아미노산이 RA와의 결합에 방해가 되는 것으로 추정하고, 이를 보다 작은 크기의 아미노산으로 치환하여 RA와의 결합을 통한 활성화된 성상세포의 불활성화 효과를 확인하고자 하였다(서열번호 1 및 2 참조).
구체적으로, 본 발명자들은 알부민 도메인 Ⅲ에서 526 번째 아미노산 잔기(phenylalanine)와 600번째 아미노산 잔기(valine)를 각각 발린(valine), 알라닌(alanine)으로 교체하여 아래와 같이 융합 단백질 1 및 2를 설계하여 제조하였다.
- 융합단백질 1 : RBP(1~193) + 알부민Ⅲ{404~526(F→V)~600(V→A)~601}
- 융합단백질 2 : 알부민 [signal peptide(1~18) + Ⅲ{404~526(F→V)~600(V→A)~601}] + RBP(17~192)
또한, 본 발명자들은 알부민의 sub-domain IB와 ⅢA가 레티노산과 매우 안정적으로 결합함을 확인하고, 아래와 같이 융합 단백질 3~6을 설계하여 제조하였다.
- 융합단백질 3 : RBP(1~193) + 알부민[ⅢA{404~517(V)} + IB(131~218)]
- 융합단백질 4: RBP(1~193) + 알부민[ⅢA{404~517(V)} + IB(134~218)]
- 융합단백질 5 : 알부민[signal peptide(1~18) + ⅢA{404~517(V)} + IB(131~218)] + RBP(17~192)
- 융합단백질 6 : 알부민[signal peptide(1~18) + ⅢA{404~517(V)} + IB(134~218)] + RBP(17~192)
이어서, 본 발명자들은 제작된 융합단백질 1 또는 2를 활성화된 성상세포에 처리하여 성상세포의 활성화 마커인 α-SMA(α-smooth muscle actin)와 collagen type I의 발현 수준을 측정함으로써 종래 개발된 융합단백질(RBP-알부민Ⅲ 및 알부민Ⅲ-RBP)과 성상세포의 불활성화 효과를 비교확인하였다. 그 결과, 본 발명의 융합단백질 1 및 2는 종래 개발된 융합단백질과 비교하여 낮은 농도에서 높은 수준으로 α-SMA와 collagen I의 발현을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
이를 통해, 본 발명자들은 알부민Ⅲ의 526 a.a 와 600 a.a가 작은 분자량의 아미노산으로 치환되는 경우 레티노산과의 결합력이 상승되어 보다 효과적으로 성상세포의 불활성화를 유도할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명은 526 및 600번째 아미노산이 각각 독립적으로 치환된 알부민Ⅲ과 RBP가 결합된 융합단백질을 섬유질환 치료 용도에 제공할 수 있으며, 상기 융합단백질에서 알부민 Ⅲ의 526번째 아미노산 잔기로 위치할 수 있는 아미노산은 발린, 알라닌, 글리신일 수 있고, 600번째 아미노산 잔기로 위치할 수 있는 아미노산은 알라닌, 글리신 일 수 있으며, 상기 융합단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.
이어서, 본 발명자들은 종래 융합단백질보다 우수한 성상세포의 활성화 과정 억제 효과를 나타낸 융합단백질 1 및 2와 융합단백질 3 내지 6의 α-SMA와 collagen I 발현 억제 효과를 비교확인하였다. 그 결과, 융합단백질 3 내지 6은 보다 낮은 농도에서도 성상세포의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(실시예 2).
아울러, 본 발명자들은 사염화탄소에 의한 간 섬유화 동물모델을 이용하여 융합단백질 1 및 4와 종래 융합단백질(RBP-알부민Ⅲ)의 간 섬유화 개선 효과를 확인한 결과, 융합단백질 1 및 4는 RBP-알부민Ⅲ보다 낮은 농도에서 보다 효과적으로 섬유화를 개선할 수 있음을 확인하였다(실시예 3).
이에, 본 발명자들은 상기 개발된 융합단백질 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 융합단백질을 포함하는 섬유질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 융합단백질 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유질환 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 융합단백질 1 내지 6은 종래의 RBP과 알부민의 융합단백질 보다 낮은 농도에서 효과적으로 활성화된 성상세포의 불활성화를 유도할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명의 약학적 조성물은 단백질 치료제의 인체 투여 용량과 투여 빈도를 획기적으로 줄일 수 있는 범용적 기반기술이 될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서 "섬유질환"이란 정상적인 조직이 파괴되면서 섬유성 결합조직으로 대체되는 섬유화(fibrosis)로 인하여 장기가 제 기능을 다하지 못하게 되어 나타나는 질병으로서, 간 섬유증(liver fibrosis), 만성간염 (chronic hepatitis),　간경화(cirrhosis),　간암(hepatic cancer), 화학요법-연관 지방 간염(chemotherapy-associated steatohepatitis, CASH), 폐 섬유증(lung fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 신부전(renal failure), 췌장 섬유증(pancreatic fibrosis), 만성 췌장염(chronic pancreatitis) 및 췌장암(pancreatic cancer)을 포함하며, 장기의 일부가 굳는 섬유화에 의해 나타나는 질병이라면 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에 있어서, “개체”란 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간 또는 가축일 수 있다.
본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 섬유질환의 발명을 지연시키거나, 조직의 섬유화를 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 섬유질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 융합 단백질의 형성에 사용되는 알부민은 임의의 종으로부터 유래한 것일 수 있으나, 면역원성의 위험을 피하기 위하여 투여되는 개체와 동일한 종(species)의 유래인 것이 바람직하다.
본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 융합단백질 1 내지 6 외에 조직의 섬유화를 예방 또는 치료할 수 있는 공지의 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있으며, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리우며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 섬유질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 항균용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 형태로 약 0.001mg 내지 1000mg이 투여될 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물은 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 융합 단백질의 아미노 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로 변형될 수 있다.
또한 본 발명의 융합 단백질 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 지방산(fatty acids), 당사슬(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 단백질의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 한다.
본 명세서에서 용어 “안정성”은 생체 내(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(상온, 냉장, 냉동 보관 시 저장 안정성 포함)도 의미한다.
한편, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 융합단백질의 제조방법을 제공한다:
(1) 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(3) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(4) 상기 배양액으로부터 융합 단백질을 수득하는 단계.
본 명세서에서 "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화하는 것으로서, 본원의 융합단백질 1 내지 6을 암호화하는 DNA 절편이라면 제한되지 아니하며, 구체적으로 서열번호 9 내지 14 중 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
염기서열은 다른 염기서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능 하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
또한, 본 명세서에서 "형질전환" 또는 “형질주입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미하며, 본 발명에서 융합단백질의 제조를 위하여 사용한 숙주 세포는 CHO cell 이나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실험방법]
1. 간 성상세포(Hepatic stellate cells, H SCs)의 분리 및 배양
14주령의 수컷 BALB/c mice의 간을 먼저 PBS(phosphate-buffered saline)로 관류하고 이어서 콜라게나아제(collagenase), 프로나아제(pronase) 및 DNase를 함유하는 GBSS(Gey's balanced salt solution) 용액으로 관류시킨 후, 간을 추출하였다. 간에 부착된 담낭 및 결합 조직을 제거하고, 간 세포 현탁액을 상기 GBSS와 동일한 용액에 넣고 37℃ 에서 12분 동안 처리한 후, 13.4% Nycodenz 구배 상에서 1400 g 에서 20분 동안 원심분리하였다. Nycodenz 용액과 수성층의 경계면 상에 있는 성상세포를 취하고, 10% 소태아혈청(FBS)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) (Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 성상세포의 순도는 현미경 관찰과 anti-tyrosine aminotransferase antibody를 이용한 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 통해 평가하였다. 세포가 디쉬에 가득 차게(confluent) 되면 계대배양을 하고, 활성화된 성상세포로 이용하였다. 간 성상세포의 활성화는 형태학적 변화와 α-SMA와 collagen I의 발현 증가를 통해 확인하였다.
2. 융합 단백질의 설계 및 제작
2-1. 융합 단백질의 설계
레티노산과의 결합력 강화를 위하여 설계된 융합단백질 1 내지 6의 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다. 소문자로 나타낸 아미노산은 signal peptide의 서열을 의미하고, 알부민 Ⅲ에서 치환된 아미노산은 굵은 글자 및 밑줄로 표시하였으며, 밑줄로 표시한 아미노산은 RBP를 의미한다.
서열번호 융합단백질 아미노산 서열
3 융합단백질1: RBP(1~193) + 알부민Ⅲ{404~526(F→V)~600(V→A)~601} mkwvwallllaawaaaERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDGRLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKE V NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKL A A
4 융합단백질2: 알부민[signal peptide(1~18) + Ⅲ{404~526(F→V)~600(V→A)~601}] + RBP(17~192) mkwvtfisllflfssaysLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKE V NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKL A AERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDG
5 융합단백질3: RBP(1~193) + 알부민[ⅢA{404~517(V)} + IB(131~218)] MkwvwallllaawaaaERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDGRLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSA
6 융합단백질4: RBP(1~193) + 알부민[ⅢA{404~517(V)} + IB(134~218)] MkwvwallllaawaaaERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDGRLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSA
7 융합단백질5: 알부민[signal peptide(1~18) + ⅢA{404~517(V)} + IB(131~218)] + RBP(17~192) mkwvtfisllflfssaysLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDG
8 융합단백질6: 알부민[signal peptide(1~18) + ⅢA{404~517(V)} + IB(134~218)] + RBP(17~192) mkwvtfisllflfssaysLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPEVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPEGLFLQDNIVAEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGNDDHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLARQYRLIVHNGYCDG
2-2. 융합 단백질의 제조
융합 단백질의 제조를 위하여 설계된 융합단백질 1 내지 6을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제작하고 각 DNA 절편을 XbaI/KpnI cut pcDNA3.1(+) 벡터로 클로닝하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 각 융합단백질을 암호화하는 DNA 절편의 구체적인 정보는 하기 표 2에 정리하였다. 상기 각 벡터를 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 CHO cells에 도입하여 융합단백질을 발현하는 형질전환체를 제조하였다. 상기 형질전환체를 배양하여 발현 분비된 융합단백질을 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 HPLC법에 의해 정제하여 사용하였다.
서열번호 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열
9 융합단백질1 CCGCTCTGGTGGAGCTGGTGAAGCATAAGCCTAAGGCTACAAAGGAGCAGCTGAAGGCCGTGATGGACGATTTCGCTGCCTTTGTGGAGAAGTGCTGTAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGTTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTGGCGGCT
10 융합단백질2 TGGATGGCACCTGTGCCGACAGCTATTCTTTCGTGTTTTCCCGCGATCCTAATGGCCTGCCCCCTGAGGCTCAGAAGATCGTGAGGCAGAGGCAGGAGGAGCTGTGCCTGGCCAGGCAGTACCGGCTGATCGTGCATAATGGCTATTGTGACGGC
11 융합단백질3 atgagatcgccagacgccatccctacttttatgctcctgagctgctgttctttgccaagcggtacaaggctgccttcacagagtgctgtcaggctgctgacaaggctgcttgcctgctgccaaagctggatgagctgagggacgagggcaaggcttcttccgcc
12 융합단백질4 ccagacgccatccctacttttatgctcctgagctgctgttctttgccaagcggtacaaggctgccttcacagagtgctgtcaggctgctgacaaggctgcttgcctgctgccaaagctggatgagctgagggacgagggcaaggcttcttccgcc
13 융합단백질5 GACTGCTGAACCTGGATGGCACATGTGCTGACTCTTATTCCTTCGTGTTTTCTCGCGATCCAAATGGCCTGCCCCCTGAGGCCCAGAAGATCGTGAGGCAGAGGCAGGAGGAGCTGTGCCTGGCTAGGCAGTACCGGCTGATCGTGCATAATGGCTATTGTGACGGC
14 융합단백질6 ACCTGGATGGCACATGTGCTGACTCTTATTCCTTCGTGTTTTCTCGCGATCCAAATGGCCTGCCCCCTGAGGCCCAGAAGATCGTGAGGCAGAGGCAGGAGGAGCTGTGCCTGGCTAGGCAGTACCGGCTGATCGTGCATAATGGCTATTGTGACGGC
3. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative Real-Time PCR)
TRIzol (Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 총 RNA를 준비하고 cDNA를 제작하였다.qRT-PCR은 ABI QuantStudio TM 3 Real-Time PCR System에서 수행하였다. 반응의 변화를 통제하기 위하여 PCR 산물은 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 수준으로 정규화하였다.
4. 간 섬유화 동물 모델 제조
미네랄 오일 중에 1:1로 용해시킨 CCl4를 BALB/c 마우스 복강 내 1 mL/kg 농도로 주 3회, 6주 동안 주사하여 간 손상을 유도한 간 섬유화 마우스 모델을 제조하였다. 대조군(control)은 동일한 양의 미네랄 오일 단독을 투여하였다. 최종 CCl4 주사 48시간 후 마우스를 희생시켰다.
희생된 마우스의 섬유화를 평가하기 위하여 간을 적출하고, 각 실험군의 간조직을 10% 완충 포르말린으로 고정 후 파라핀으로 포매하여 조직절편을 제작하였다. 각 조직 절편은 조직학적 분석을 위하여 시리우스 레드(Sirius red) 염색을 수행 후 광학현미경으로 관찰하였다.
5. 통계학적 분석
결과들은 평균±표준 편차 (SD)로 표현하였다. 통계학적 분석은 t-tests를 이용하여 수행하였다. 비교는 P<0.05 에서 유의도를 검정하였으며, P 수치는 양측검정을 수행하였다.
[실험결과]
실시예 1. 융합단백질 1 및 2와 종래의 알부민-RBP 융합 단백질의 효과 비교
종전 연구에서 성상세포의 활성화 억제 또는 불활성화에 우수한 효과를 나타낸 RBP-알부민Ⅲ 및 알부민Ⅲ-RBP과 실시예 2에서 설계한 융합단백질 1 및 2의 효과를 비교하였다. 구체적으로 활성화된 생쥐의 간 성상세포에 각 융합단백질 0.25 μM를 20시간 동안 처리하고 real-time PCR 을 이용하여 α-SMA과 collagen I의 발현 수준을 측정하였다. 종래의 융합 단백질(RBP-알부민Ⅲ 및 알부민Ⅲ-RBP)은 KR 10-1395394의 R-Ⅲ과 Ⅲ-R 융합 단백질이다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 종래의 융합단백질과 비교하여 융합단백질 1 및 2는 α-SMA과 collagen I의 mRNA 발현을 더 많이 감소시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 융합단백질 1 내지 6의 효과 비교
활성화된 성상세포의 불활성화 효과에 있어서 종래의 융합단백질보다 우수한 효과를 확인한 융합단백질 1 및 2와 융합단백질 3 내지 6의 효과를 비교하여 확인하고자 하였다. 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되 활성화된 성상세포에 처리하는 융합단백질의 양은 0.125 μM로 하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 융합단백질 3 내지 6은 보다 적은 양의 단백질량으로도 현저하게 높은 수준으로 α-SMA과 collagen I의 발현을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. In vivo 에서 융합단백질 1 및 4와 종래의 알부민-RBP 융합 단백질의 효과 비교
사염화탄소(CCl4) 주사로 유도된 간 섬유화 모델을 이용하여 융합 단백질의 치료 효과를 비교 평가하였다. 구체적으로, 미네랄 오일 중에 1:1로 용해시킨 사염화탄소를 1ml/kg 농도로 주 3회, 6주 동안 BALB/c 마우스 복강 내 주사하고, 상기 융합 단백질 (25, 12.5, 6.25, 또는 3ug) 또는 식염수를 CCl4 처리 마지막 2주 동안 주당 3회 정맥 투여하였다(n=5마리).
광학현미경으로 조직을 관찰한 결과, 미네랄 오일만 투여한 대조군 마우스(control)는 정상적인 간 구조를 보여주나, CCl4 처리된 마우스에서는 심각한 간 조직 구조의 파괴 및 섬유화를 관찰할 수 있었다. 또한, 알부민과 RBP의 융합 단백질의 투여로 섬유화가 개선됨을 확인할 수 있었다(도 4a).
Image J Software (NIH)에 의한 Siruis red 염색의 정량 분석 결과, 섬유화 개선 효과는 시료에 따라 차이를 보였다(도 4b). 종래의 융합 단백질 RBP-알부민Ⅲ의 경우 25ug 투여군에서만 유의한 개선효과가 보인 반면, 융합 단백질 4는 6.25ug 투여에서도 우수한 효과를 보였다. 상기 결과로부터 융합 단백질 1 및 4는 종래의 융합 단백질과 비교하여 낮은 농도에서 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 섬유질환 예방 및 치료용 의약품으로 이용되어 단백질 치료제의 인체 투여 용량과 투여 빈도를 획기적으로 줄일 수 있는 범용적 기반기술이 될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
  2. 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
  3. 제2항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
  6. (1) 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    (3) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 배양액으로부터 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 생산 방법.
  7. 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 포함하는, 섬유질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 섬유질환은 간 섬유증(liver fibrosis), 만성간염 (chronic hepatitis),　간경화 (cirrhosis),　간암(hepatic cancer), 화학요법-연관 지방간염(chemotherapy-associated steatohepatitis, CASH), 폐 섬유증(lung fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 신부전(renal failure), 췌장 섬유증 (pancreatic fibrosis), 만성 췌장염(chronic pancreatitis) 및 췌장암(pancreatic cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 섬유질환 예방 또는 치료 방법.
  10. 섬유질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질의 용도.
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