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WO2021193397A1 - シスチン骨格を有する新規カチオン性脂質 - Google Patents

シスチン骨格を有する新規カチオン性脂質 Download PDF

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Publication number
WO2021193397A1
WO2021193397A1 PCT/JP2021/011298 JP2021011298W WO2021193397A1 WO 2021193397 A1 WO2021193397 A1 WO 2021193397A1 JP 2021011298 W JP2021011298 W JP 2021011298W WO 2021193397 A1 WO2021193397 A1 WO 2021193397A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
nucleic acid
cationic lipid
carbon atoms
bond
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/011298
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
晋也 玉川
耕太 丹下
悠太 中井
真倫 玉田
英万 秋田
浩揮 田中
遊 櫻井
Original Assignee
日油株式会社
国立大学法人千葉大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日油株式会社, 国立大学法人千葉大学 filed Critical 日油株式会社
Priority to JP2022510064A priority Critical patent/JPWO2021193397A1/ja
Priority to EP21776659.1A priority patent/EP4130282A4/en
Priority to US17/907,368 priority patent/US20230127080A1/en
Publication of WO2021193397A1 publication Critical patent/WO2021193397A1/ja

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    • C07C323/58—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups with amino groups bound to the carbon skeleton
    • C07C323/59—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups with amino groups bound to the carbon skeleton with acylated amino groups bound to the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation

Definitions

  • the present invention relates to a cationic lipid having a cystine skeleton, a lipid membrane structure containing the cationic lipid, and uses thereof.
  • Viral vectors are nucleic acid delivery carriers with high expression efficiency, but non-viral nucleic acid delivery carriers that can be used more safely are being developed, and among them, carriers using cationic lipids are currently the most common.
  • Cationic lipids are roughly classified into amine sites and lipid sites, and cells are formed by electrostatically interacting with cationic amine sites and nucleic acids that are polyanions to form liposomes or lipid membrane structures. It promotes uptake into cells and delivers nucleic acids into cells.
  • Non-Patent Document 1 Examples of known cationic lipids that are widely used include DOTAP and DODAP. These known cationic lipids can be combined with phospholipids to form positively charged liposomes or lipid membrane structures and electrostatically interact with nucleic acids to deliver nucleic acids to target cells ( Non-Patent Document 1).
  • lipid membrane structure using a cationic lipid in order for a lipid membrane structure using a cationic lipid to exert a practical effect in vivo as a nucleic acid delivery carrier, it has good pharmacokinetics, specifically, stability in blood. It is necessary to meet the requirements such as high concentration and high accumulation in target tissues such as liver and tumor. In response to this problem, the following reports have been made as examples of improving pharmacokinetics by adjusting the pKa on the surface of the lipid membrane structure.
  • Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 show that the pharmacokinetics and distribution in each cell in the liver can be controlled by adjusting the surface pKa of the lipid membrane structure. Furthermore, in these documents, by adjusting the pKa on the surface of the lipid membrane structure to a preferable value for endosome escape, the escape of the lipid membrane structure from the endosome is promoted, and the nucleic acid can be efficiently delivered into the cytoplasm. Is stated.
  • Non-Patent Document 4 Cationic lipids with improved pharmacokinetics have been developed in this way, but due to the nature of nucleic acid delivery carriers, which generally introduce foreign substances into cells, it is desired to exert a large effect with a small amount of uptake. ing. That is, when the lipid membrane structure is used as an intracellular delivery carrier of the expression vector, it is required to increase the expression level per unit lipid membrane structure incorporated into the cell and enhance the expression efficiency in the cell. Has been done. In order to increase the intracellular expression efficiency, it is necessary to improve the intracellular dynamics such as intracellular uptake, escape from endosomes, and nuclear envelope permeation in addition to the pharmacokinetics (Non-Patent Document 4).
  • Patent Documents 1 to 4 There is an example in which the intracellular dynamics are improved by imparting biodegradability to a cationic lipid.
  • Patent Documents 1 to 4 describe cationic lipids having a structure linked by disulfide bonds showing biodegradability, and dissociate nucleic acids from the lipid membrane structure by utilizing the cleavage of disulfide bonds in the cell.
  • the cationic lipid can improve intracellular dynamics such as improvement of nucleic acid delivery efficiency into the cytoplasm. It has been clarified, and further, the effect of reducing toxicity by imparting degradability is expected.
  • nucleic acid delivery carriers As described above, there are several reports that the pharmacokinetics and intracellular dynamics of nucleic acid delivery carriers have been improved by adjusting the surface pKa of the lipid membrane structure and introducing degradable disulfide bonds.
  • the diseases targeted by nucleic acid therapy are diverse, and in order to establish a treatment method according to each disease, it is required to increase the lipid species that can be selected and further improve the effect.
  • the subject of the present invention is a cationic lipid that can be used as a nucleic acid delivery carrier having good intracellular dynamics, a lipid membrane structure using the cationic lipid, a nucleic acid introducing agent using the cationic lipid, and the nucleic acid. It is to provide a method of performing nucleic acid introduction using an introduction agent.
  • a cationic lipid capable of adjusting the surface pKa of the lipid membrane structure and improving the pharmacokinetics and intracellular kinetics.
  • it is a cationic lipid in which a lipid site and an amine site are introduced into the cystine skeleton, and since it has a disulfide bond, it also has the effect of breaking the disulfide bond in the cell and dissociating the nucleic acid from the lipid membrane structure. .. It has been found that the lipid membrane structure containing this novel cationic lipid can efficiently deliver nucleic acid into the cytoplasm.
  • the present invention includes the following contents.
  • L 1a and L 1b independently represent an amide bond, a carbamate bond or a urea bond, respectively.
  • R 1a and R 1b independently represent an alkylene group having 8 or less carbon atoms or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms.
  • ka and kb independently represent 0 or 1, respectively.
  • X a and X b each independently represent a dialkylamino group (the two alkyl groups each independently have 1 to 5 carbon atoms) or a 3 to 6-membered cyclic amino group.
  • L 4a and L 4b independently represent an ester bond or an amide bond, respectively.
  • R 2a and R 2b independently represent an alkylene group having 8 or less carbon atoms or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms.
  • L 2a and L 2b independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond, respectively.
  • ma and mb independently represent 0 or 1, respectively.
  • R 3a and R 3b are each independently divalent derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom.
  • Represents a group L 3a and L 3b independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond, respectively.
  • na and nb independently represent 0 or 1, respectively.
  • R 4a and R 4b independently represent an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms, or R 5- CO- (CH 2 ) p- , respectively.
  • R 5 represents a residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group or a residue of a sterol derivative having a hydroxyl group, and p represents 2 or 3.
  • R 3a and R 3b have independent equations (2):
  • R 5 is a cationic lipid according to any one of the the residue of fat-soluble vitamins [1] to [6] having a hydroxyl group.
  • R 4a and R 4b are independently R 5- CO- (CH 2 ) p- , and R 5 is a residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group, as described above [1] to [ 6] The cationic lipid according to any one of.
  • a method for introducing the nucleic acid into the cell which comprises contacting the cell with the nucleic acid introducing agent according to the above [11], which encloses the nucleic acid in vitro.
  • a method for introducing a nucleic acid into the cell which comprises administering the nucleic acid-introducing agent according to the above [11], which encloses the nucleic acid, to a living body so as to be delivered to the target cell.
  • the present invention relates to a cationic lipid in which a dialkylamino group or a cyclic amino group and a lipid moiety are introduced into a biodegradable cystine skeleton, a lipid membrane structure containing the same, and uses thereof.
  • the cationic lipid of the present invention can form a lipid membrane structure.
  • the cationic lipids and lipid membrane structures of the present invention can be used for nucleic acid introduction agents.
  • the cationic lipid of the present invention can widely adjust pKa by locating the amine moiety at the end of the molecular structure and allowing the structure in the vicinity of the amine moiety to be changed.
  • the disulfide bond contained in the cystine skeleton of the cationic lipid of the present invention is cleaved in the intracellular reducing environment, and the release of inclusions (nucleic acid) is promoted. Therefore, the nucleic acid-introducing agent using the cationic lipid of the present invention can achieve high nucleic acid delivery efficiency into the cytoplasm.
  • nucleic acid When nucleic acid is introduced using the cationic lipid of the present invention or a lipid membrane structure containing the same, the decomposition of nucleic acid by serum components is suppressed. Therefore, nucleic acid introduction in the presence of serum or in vivo. It is advantageous for nucleic acid introduction.
  • a cationic lipid represented by As the cationic lipid, only one kind may be used, or two or more kinds may be used in combination. In the following, the "cationic lipid represented by the formula (1)” may be abbreviated as “cationic lipid (1)”. Compounds and the like represented by other formulas may be abbreviated in the same manner.
  • L 1a and L 1b are independently amide bonds, carbamate bonds or urea bonds, respectively, preferably independently amide bonds or carbamate bonds, and more preferably both amide bonds.
  • L 1a may be different even identical to L 1b, but preferably, L 1a is the same as L 1b.
  • L 1a and L 1b are preferably * -NH-CO-**, * -NH-CO-O-** or * -NH-CO-NH-**, respectively, and more preferably. , Independently * -NH-CO-** or * -NH-CO-O-**, more preferably both * -NH-CO-** (in the above formula, **. represents a bonding position with R 1a or R 1b, * is the R 1a or R 1b represents a bonding position to a carbon atom of the opposite side.).
  • the "bonding position with R 1a or R 1b " means "bonding position with R 1a " in L 1a
  • the "bonding position with the carbon atom on the opposite side of R 1a or R 1b” means “bonding position with the carbon atom on the opposite side of R 1a “ in L 1a , and “R “ in L 1b. It means “the bond position with the carbon atom on the opposite side of 1b”.
  • Other similar expressions have similar meanings.
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 8 or less carbon atoms or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms, and preferably each independently has an alkylene group having 8 or less carbon atoms. .. R 1a may be different be the same as R 1b, but preferably, R 1a is the same as R 1b.
  • the alkylene group having 8 or less carbon atoms in R 1a and R 1b may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the alkylene group has preferably 6 or less carbon atoms, and more preferably 4 or less carbon atoms.
  • Examples of the alkylene group having 8 or less carbon atoms in R 1a and R 1b include a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, and an isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )). -), Tetramethylene group, isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- ), pentamethylene group, hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group, etc. Can be mentioned.
  • the alkylene groups having 8 or less carbon atoms in R 1a and R 1b are preferably methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH.
  • An oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms is a divalent group having a structure in which two alkylene groups are bonded via an oxy group (-O-) (that is, an alkylene-O-alkylene). It means a group in which the total number of carbon atoms of one alkylene group is 8 or less.
  • the two alkylenes may be the same or different, but are preferably the same.
  • Examples of the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms in R 1a and R 1b include an oxydimethylene group (methyleneoxymethylene group), an oxydiethylene group (ethyleneoxyethylene group), and an oxydi (trimethylene) group (trimethylene).
  • Oxytrimethylene group), oxydibutylene group (butylene oxybutylene group) and the like can be mentioned.
  • the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms is preferably an oxydimethylene group (methyleneoxymethylene group), an oxydiethylene group (ethyleneoxyethylene group), or an oxydi (trimethylene) group (trimethyloxytrimethylene group). Yes, more preferably (ethyleneoxyethylene group).
  • R 1a and R 1b are preferably alkylene groups each independently having 8 or less carbon atoms, and more preferably independently methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, and isopropylene group.
  • isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- ), pentamethylene Group or hexamethylene group, more preferably independently methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )-).
  • ka and kb independently represent 0 or 1, respectively.
  • ka when ka is 0, it means that L 1a- R 1a does not exist.
  • kb or the like is 0.
  • ka and kb are preferably both 1.
  • the cationic lipid (1) in which both ka and kb are 0 is represented by the following formula (1a).
  • the cationic lipid (1) in which both ka and kb are 1 is represented by the following formula (1b).
  • X a and X b each independently represent a dialkylamino group (the two alkyl groups each independently have 1 to 5 carbon atoms) or a 3 to 6-membered cyclic amino group.
  • X a may be different be identical to X b, but preferably, X a is the same as X b.
  • the carbon number of the two alkyl groups in the dialkylamino group is preferably 1 to 3 independently of each other, and more preferably both.
  • the total number of carbon atoms of the two alkyl groups in the dialkylamino group is preferably 2 to 6, more preferably 2 to 4.
  • alkyl group in the dialkylamino group examples include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, cyclobutyl group and pentyl. Examples thereof include a group, an isopentyl group, a neopentyl group, a tert-pentyl group, a 1,2-dimethylpropyl group, a 2-methylbutyl group, a cyclopentyl group and the like.
  • the two alkyl groups in the dialkylamino group are preferably independent methyl groups, ethyl groups, propyl groups or isopropyl groups, and more preferably both methyl groups.
  • the 3- to 6-membered cyclic amino group means a group in which the substituents of the amino group are bonded to form a ring and the number of atoms forming the ring is 3 to 6.
  • the 3- to 6-membered cyclic amino group is preferably a 5- or 6-membered cyclic amino group, more preferably a 6-membered cyclic amino group.
  • As the cyclic amino group an amino group in which the ring is formed only of a nitrogen atom and a methylene group (-CH 2-) is preferable.
  • Examples of the 3- to 6-membered cyclic amino group include 1-aziridinyl group, 1-azetidinyl group, 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidyl group, 4-morpholinyl group, 4-thiomorpholinyl group and the like.
  • the 3- to 6-membered cyclic amino group is preferably a 1-pyrrolidinyl group or a 1-piperidyl group, more preferably a 1-piperidyl group.
  • X a and X b are preferably independently dialkylamino groups (the two alkyl groups have independently 1 to 3 carbon atoms, respectively), or 5- or 6-membered cyclic aminos.
  • Groups more preferably independently, dimethylamino group, N-methyl-N-ethylamino group, N-methyl-N-propylamino group, diethylamino group, dipropylamino group, di (isopropyl) amino.
  • X a and X b are identical to each other and have a dimethylamino group, an N-methyl-N-ethylamino group, an N-methyl-N-propylamino group, a diethylamino group, a dipropylamino group, It is a di (isopropyl) amino group or a 1-piperidyl group.
  • X a and X b are particularly preferably both dimethylamino groups.
  • L 4a and L 4b are independently ester-bonded or amide-bonded, and preferably both are ester-bonded.
  • L 4a may be the be the same or different and L 4b, but preferably, L 4a is the same as L 4b.
  • L 4a and L 4b are preferably * -O-CO-** or * -NH-CO-**, respectively, and more preferably both * -O-CO-** (the above).
  • * represents the bonding position with R 2a , R 2b , R 3a , R 3b , R 4a or R 4b
  • ** represents R 2a , R 2b , R 3a , R 3b , R 4a or R. It represents the bond position with the carbon atom on the opposite side of 4b).
  • the " bonding position with R 2a , R 2b , R 3a , R 3b , R 4a or R 4b " means that when ma is 1 (that is, L 2a- R 2a exists), L 4a Means “the position of connection with R 2a ", where ma is 0 (that is, L 2a- R 2a does not exist) and na is 1 (that is, L 3a- R 3a exists).
  • L 4a means "the position of connection with R 3a ", ma is 0 (that is, L 2a- R 2a does not exist), and na is 0 (that is, L 3a- R 3a). Does not exist), L 4a means "bonding position with R 4a".
  • Other similar expressions have similar meanings.
  • R 2a and R 2b independently represent an alkylene group having 8 or less carbon atoms or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms.
  • R 2a may be the be the same or different and R 2b but, preferably, R 2a is the same as R 2b.
  • the alkylene group having 8 or less carbon atoms in R 2a and R 2b may be linear or branched chain, but is preferably linear.
  • the alkylene group has preferably 6 or less carbon atoms, and more preferably 4 or less carbon atoms.
  • Examples of the alkylene group having 8 or less carbon atoms in R 2a and R 2b include a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, and an isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )). -), Tetramethylene group, isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- ), pentamethylene group, hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group, etc. Can be mentioned.
  • the alkylene groups having 8 or less carbon atoms in R 2a and R 2b are preferably a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, a tetramethylene group, and an isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C. (CH 3 ) 2- ), pentamethylene group, or hexamethylene group, more preferably ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, or isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 It is C (CH 3 ) 2- ), more preferably an ethylene group.
  • the two alkylenes present in the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms of R 2a and R 2b may be the same or different from each other, but are preferably the same as each other.
  • Examples of the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms in R 2a and R 2b include an oxydimethylene group (methyleneoxymethylene group), an oxydiethylene group (ethyleneoxyethylene group), and an oxydi (trimethylene) group (trimethylene). Oxytrimethylene group), oxydibutylene group and the like can be mentioned.
  • the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms in R 2a and R 2b is preferably an oxydimethylene group (methyleneoxymethylene group), an oxydiethylene group (ethyleneoxyethylene group), or an oxydi (trimethylene) group ( It is a trimethyleneoxytrimethylene group), more preferably an oxydiethylene group (ethyleneoxyethylene group).
  • R 2a and R 2b are preferably alkylene groups having 8 or less carbon atoms independently, and more preferably independently methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, and isobutylene group (respectively, respectively).
  • pentamethylene group, or hexamethylene group more preferably independently ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, respectively.
  • It is a group or an isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- ), and both are particularly preferably ethylene groups.
  • L 2a and L 2b are independently ester bonds, amide bonds, carbamate bonds, ether bonds or urea bonds, respectively, preferably independently ester bonds, amide bonds or carbamate bonds, and more preferably both. It is an ester bond.
  • L 2a may be different even identical to L 2b, but preferably, L 2a is the same as L 2b.
  • L 2a and L 2b are preferably * -CO-O-**, * -O-CO-**, * -CO-NH-**, * -NH-CO-**, respectively, independently of each other.
  • * -CO-O-**, * -CO-NH-** or * -NH-CO-O-** more preferably both * -CO-O-** (in the above formula).
  • Ma and mb independently represent 0 or 1, preferably both 1.
  • the cationic lipid (1) in which both ma and mb are 0 is represented by the following formula (1c).
  • the cationic lipid (1) in which both ma and mb are 1 is represented by the following formula (1d).
  • R 3a and R 3b are each independently divalent derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom. Represents a group.
  • the divalent group means a divalent group having a structure obtained by removing two hydrogen atoms from the aromatic compound.
  • the aromatic compound preferably has 6 to 12 carbon atoms, and more preferably 6 to 7 carbon atoms.
  • the number of aromatic rings of the aromatic compound is preferably 1.
  • R 3a may be different be the same as R 3b, but preferably, R 3a is the same as R 3b.
  • the aromatic ring of the aromatic compound may be either an aromatic hydrocarbon ring or an aromatic heterocycle.
  • the aromatic hydrocarbon ring include a benzene ring, a naphthalene ring, an anthracene ring and the like.
  • aromatic heterocycle examples include an imidazole ring, a pyrazole ring, an oxazole ring, an isooxazole ring, a thiazole ring, an isothiazole ring, a triazine ring, a pyrrole ring, a furanthiophene ring, a pyrimidine ring, a pyridazine ring, a pyrazine ring, and a pyridine ring.
  • the aromatic ring of the aromatic compound is preferably a benzene ring, a naphthalene ring or an anthracene ring, and more preferably a benzene ring.
  • the aromatic ring of the aromatic compound may have a substituent.
  • substituents include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, an acyloxy group having 2 to 4 carbon atoms, and carbon.
  • Preferred examples of the substituent are an acetyl group, a methoxycarbonyl group, a methylcarbamoyl group, an acetoxy group, an acetamido group, a methoxycarbonylamino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a methylsulfanyl group and a phenylsulfonyl group.
  • R 3a and R 3b are preferably independent of each other and have the formula (2):
  • s is preferably 0 or 1, more preferably 0.
  • t is preferably an integer of 0 to 2, and more preferably 1.
  • u is preferably an integer of 0 to 2, more preferably 0 or 1, and even more preferably 0.
  • R 6 examples include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, an acyloxy group having 2 to 4 carbon atoms, and a carbon number of carbon atoms.
  • 2 to 4 acylamino group 2 to 4 carbon number alkoxycarbonylamino group, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, 1 to 4 carbon number alkylsulfanyl group, 1 to 4 carbon number Alkylsulfonyl group, arylsulfonyl group with 6 to 10 carbon atoms, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, alkyl group with 1 to 4 carbon atoms, ureido group with 1 to 4 carbon atoms, 1 carbon number Examples thereof include an alkoxy group of up to 4, an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, an aryloxy group having 6 to 10 carbon atoms, and the like.
  • R 6 examples include an acetyl group, a methoxycarbonyl group, a methylcarbamoyl group, an acetoxy group, an acetamide group, a methoxycarbonylamino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a methylsulfanyl group and a phenylsulfonyl group.
  • Nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, tert-butyl group, ureido group, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, tert-butoxy group, phenyl Groups, phenoxy groups and the like can be mentioned. If R 6 there are a plurality, the plurality of R 6 may being the same or different.
  • L 3a and L 3b are independently ester bonds, amide bonds, carbamate bonds, ether bonds or urea bonds, respectively, preferably independently ester bonds, amide bonds or ether bonds, and more preferably both. It is an ester bond.
  • L 3a may be different even identical to L 3b but, preferably, L 3a is the same group as L 3b.
  • L 3a and L 3b are preferably * -CO-O-**, * -O-CO-**, * -CO-NH-**, * -NH-CO-**, respectively, independently of each other.
  • ** represents the bonding position with R 3a or R 3b).
  • Na and nb independently represent 0 or 1, preferably both.
  • the cationic lipid (1) in which both na and nb are 0 is represented by the following formula (1e).
  • the cationic lipid (1) in which both na and nb are 1, is represented by the following formula (1f).
  • R 4a and R 4b independently represent an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms or R 5- CO- (CH 2 ) p- , and R 5 is a residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group. Represents a residue of a sterol derivative having a group or hydroxyl group, and p represents 2 or 3.
  • R 4a may be different be the same as R 4b, but preferably, R 4a is the same group as R 4b.
  • the residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group represents a monovalent group having a structure obtained by removing a hydrogen atom from the hydroxyl group of the fat-soluble vitamin.
  • the residue of the sterol derivative having a hydroxyl group represents a monovalent group having a structure obtained by removing a hydrogen atom from the hydroxyl group of the sterol derivative.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms may be either linear or branched.
  • the aliphatic hydrocarbon group preferably has 13 to 19 carbon atoms, and more preferably 13 to 17 carbon atoms.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be saturated or unsaturated.
  • the number of unsaturated bonds is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 to 2. ..
  • the unsaturated bond may be either a carbon-carbon double bond or a carbon-carbon triple bond, but is preferably a carbon-carbon double bond.
  • the aliphatic hydrocarbon group is preferably an alkyl group or an alkenyl group.
  • Examples of the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms include a dodecyl group, a tridecylic group, a tetradecyl group, a pentadecyl group, a hexadecyl group, a heptadecyl group, an octadecyl group, a nonadecil group, an icosyl group, a henicosyl group, and a docosyl group.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms is preferably a tridecylic group, a pentadecyl group, a heptadecyl group, a nonadecylic group, a heptadecenyl group, a heptadecadienyl group, or a 1-hexylnonyl group, and particularly preferably a tridecylic group.
  • the aliphatic hydrocarbon groups R 4a and R 4b having 12 to 22 carbon atoms are derived from fatty acids.
  • the fatty acid-derived carbonyl (-CO-) is contained in L 3a , L 3b , L 2a , L 2b , L 4a or L 4b.
  • R 4a and R 4b are both 8-heptadecenyl.
  • the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group examples include retinol, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciumpherol, corcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotachysterol, tocopherol, tocotrienol and the like.
  • the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group is preferably tocopherol.
  • Examples of the sterol derivative having a hydroxyl group include cholesterol, cholestanol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, lanosterol, ergosterol and the like.
  • the sterol derivative having a hydroxyl group is preferably cholesterol or cholestanol.
  • R 5 is preferably a residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group. p is preferably 2.
  • R 4a and R 4b are independently aliphatic hydrocarbon groups having 12 to 22 carbon atoms or R 5- CO- (CH 2 ) p- , and R 5 is a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group. It is a residue, and p is preferably 2 or 3, and R 4a and R 4b are the same as each other, and an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms or R 5- CO- (. CH 2 ) p- , R 5 is a residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group, and p is more preferably 2 or 3, with R 4a and R 4b being identical to each other.
  • R 5 is a residue of a fat-soluble vitamin (eg, tocopherol) having a hydroxyl group
  • L 1a is identical to L 1b
  • R 1a is identical to R 1b
  • X a is identical to X b
  • L 4a is identical to L 4b
  • R 2a is. It is preferred that it is identical to R 2b
  • L 2a is identical to L 2b
  • R 3a is identical to R 3b
  • L 3a is identical to L 3b
  • R 4a is identical to R 4b. ..
  • cationic lipid (1) of the present invention include the following cationic lipids.
  • R 1a and R 1b are alkylene groups each independently having 8 or less carbon atoms; ka and kb are independently 0 or 1;
  • X a and X b are independently dialkylamino groups (the two alkyl groups have independently 1 to 3 carbon atoms, respectively), or 5- or 6-membered cyclic amino groups;
  • L 4a and L 4b are both * -O-CO - ** (in the formula, * represents a bonding position with R 2a or R 2b, ** is the point of attachment and R 2a or R 2b Represents.);
  • u is 0 to an integer of 4
  • R 6 are each independently an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having a carbon number of 2 to 4, carbon atoms 2-4 Carbamoyl group, acyloxy group with 2 to 4 carbon atoms, acylamino group with 2 to 4 carbon atoms, alkoxycarbonylamino group with 2 to 4 carbon atoms, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, carbon number Alkoxy sulfanyl group with 1 to 4, alkylsulfonyl group with 1 to 4 carbon atoms, arylsulfonyl group with 6 to 10 carbon atoms, nitro group, trifluoromethyl group
  • L 3a and L 3b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 4a or R 4b, and ** represents the bonding position with R 3a or R 3b. Represents.); na and nb are both 1; and R 4a and R 4b are independently aliphatic hydrocarbon groups having 12 to 22 carbon atoms or R 5- CO- (CH 2 ) p- , respectively.
  • R 5 is a residue of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (eg, tocopherol), and p is 2 or 3; Cationic lipid (1).
  • L 1a and L 1b are both * -NH-CO - ** (in the formula, and ** represents the bonding position to R 1a or R 1b, * is the opposite side of the R 1a or R 1b It represents the bond position with the carbon atom.); R 1a and R 1b are independent of methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )-), isobutylene.
  • L 4a and L 4b are both * -O-CO - ** (in the formula, * represents a bonding position with R 2a or R 2b, ** is the point of attachment and R 2a or R 2b Represents.); R 2a and R 2b are independent of methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- ), respectively.
  • L 2a and L 2b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 3a or R 3b, and ** represents the bonding position with R 2a or R 2b. Represents.); ma and mb are both 1; R 3a and R 3b are independent of each other, and Eq. (2):
  • s represents 0 or 1 and represents t represents an integer of 0 to 2 and represents u represents an integer of 0 to 2
  • u number of R 6 are each independently, an acetyl group, a methoxycarbonyl group, methylcarbamoyl group, an acetoxy group, acetamido group, methoxycarbonylamino group, a fluorine atom, chlorine Atomic, bromine atom, iodine atom, methylsulfanyl group, phenylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, tert-butyl group, ureido group, methoxy group, Represents an ethoxy group, a propoxy group, an iso
  • L 3a and L 3b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 4a or R 4b, and ** represents the bonding position with R 3a or R 3b. Represents.); na and nb are both 1; R 4a and R 4b are the same as each other and have an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms or R 5- CO- (CH 2 ) p- , and R 5 is lipophilic having a hydroxyl group. It is a residue of a vitamin (eg, tocopherol) and has a p of 2 or 3; Cationic lipid (1).
  • a vitamin eg, tocopherol
  • L 1a and L 1b are both * -NH-CO - ** (in the formula, and ** represents the bonding position to R 1a or R 1b, * is the opposite side of the R 1a or R 1b It represents the bond position with the carbon atom.); R 1a and R 1b are independent of methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )-), isobutylene.
  • L 2a and L 2b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 3a or R 3b, and ** represents the bonding position with R 2a or R 2b. Represents.); ma and mb are both 1; R 3a and R 3b are independent of each other, and Eq. (2):
  • s represents 0 or 1 and represents t represents an integer of 0 to 2 and represents u represents an integer of 0 to 2
  • u number of R 6 are each independently, an acetyl group, a methoxycarbonyl group, methylcarbamoyl group, an acetoxy group, acetamido group, methoxycarbonylamino group, a fluorine atom, chlorine Atomic, bromine atom, iodine atom, methylsulfanyl group, phenylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, tert-butyl group, ureido group, methoxy group, Represents an ethoxy group, a propoxy group, an iso
  • L 3a and L 3b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 4a or R 4b, and ** represents the bonding position with R 3a or R 3b. Represents.); na and nb are both 1; R 4a and R 4b are the same as each other and have an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms or R 5- CO- (CH 2 ) p- , and R 5 is lipophilic having a hydroxyl group. It is a residue of a vitamin (eg, tocopherol) and has a p of 2 or 3; Cationic lipid (1).
  • a vitamin eg, tocopherol
  • L 1a and L 1b are both * -NH-CO - ** (in the formula, and ** represents the bonding position to R 1a or R 1b, * is the opposite side of the R 1a or R 1b It represents the bond position with the carbon atom.);
  • R 1a and R 1b are independently methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )-), tetramethylene group, or Isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- );
  • ka and kb are independently 0 or 1;
  • X a and X b are identical to each other and are dimethylamino group, N-methyl-N-ethylamino group, N-methyl-N-propylamino group, diethylamino group, dipropylamino group, di (isopropy
  • L 4a and L 4b are both * -O-CO - ** (in the formula, * represents a bonding position with R 2a or R 2b, ** is the point of attachment and R 2a or R 2b Represents.);
  • R 2a and R 2b are independently ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group, or isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- );
  • Both L 2a and L 2b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 3a or R 3b, and ** represents the bonding with R 2a or R 2b. Represents a position.);
  • ma and mb are both 1;
  • R 3a and R 3b are independent of each other, and Eq. (2):
  • L 1a and L 1b are both * -NH-CO - ** (in the formula, and ** represents the bonding position to R 1a or R 1b, * is the opposite side of the R 1a or R 1b It represents the bond position with the carbon atom.);
  • R 1a and R 1b are independently methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group (-CH (CH 3 ) CH 2- , -CH 2 CH (CH 3 )-), tetramethylene group, or Isobutylene group (-C (CH 3 ) 2 CH 2- , -CH 2 C (CH 3 ) 2- );
  • ka and kb are independently 0 or 1;
  • X a and X b are identical to each other and are a dimethylamino group, an N-methyl-N-ethylamino group, an N-methyl-N-propylamino group, a diethylamino group, or a 1-piperidy
  • L 1a and L 1b are both * -NH-CO - ** (in the formula, and ** represents the bonding position to R 1a or R 1b, * is the opposite side of the R 1a or R 1b It represents the bond position with the carbon atom.);
  • Both R 1a and R 1b are methylene groups; ka and kb are independently 0 or 1; X a and X b are identical to each other and are a dimethylamino group, an N-methyl-N-ethylamino group, an N-methyl-N-propylamino group, a diethylamino group, or a 1-piperidyl group;
  • Both R 2a and R 2b are ethylene groups;
  • Both L 2a and L 2b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 3a or R 3b, and ** represents the bonding position with R 2a or R 2b.
  • L 1a and L 1b are both * -NH-CO - ** (in the formula, and ** represents the bonding position to R 1a or R 1b, * is the opposite side of the R 1a or R 1b It represents the bond position with the carbon atom.); Both R 1a and R 1b are methylene groups; ka and kb are independently 0 or 1; Both X a and X b are dimethylamino groups; Both R 2a and R 2b are ethylene groups; Both L 2a and L 2b are * -CO-O-** (in the above formula, * represents the bonding position with R 3a or R 3b, and ** represents the bonding position with R 2a or R 2b. Represents.); ma and mb are both 1; R 3a and R 3b are identical to each other and the formula (2):
  • the cationic lipid (1) of the present invention may have steric isomers and geometric isomers, and unless otherwise specified, the cationic lipid (1) of the present invention includes those isomers. Moreover, the cationic lipid (1) of the present invention may be a mixture of a plurality of isomers. In the mixture of a plurality of isomers, the ratio of each isomer is not particularly limited.
  • the following O-Ph-cys-C2-DMA, O-Ph-cys-C2-EMA, O-Ph-cys-C2-MPA, O-Ph- cys-C2-DEA, O-Ph-cys-C2-DPA, O-Ph-cys-C2-DIA, O-Ph-cys-C2-Pip, E-Ph-cys-C2-DMA, and O-Ph -Cys-C4-DMA, O-Ph-cys-DMA can be mentioned.
  • the cationic lipid (1) of the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of these, and more preferably O-Ph-cys-C2-DMA, O-Ph-cys-C2-EMA, At least one selected from the group consisting of O-Ph-cys-C2-MPA, O-Ph-cys-C2-DEA, and O-Ph-cys-C2-Pip, most preferably O-Ph-cys. -C2-DMA.
  • the cationic lipid (1) of the present invention has an —S—S— (disulfide) bond. Therefore, as a method for producing the cationic lipid (1) of the present invention, (A) ⁇ R 4a- (L 3a- R 3a ) na- (L 2a- R 2a ) ma- L 4a- ⁇ CH (CH 2 SH) ⁇ -(L 1a- R 1a ) ka- X a ⁇ Represented thiol and ⁇ R 4b- (L 3b- R 3b ) nb- (L 2b- R 2b ) mb- L 4b- ⁇ CH (CH 2 SH) ⁇ -(L 1b- R 1b ) kb- X b ⁇ After producing the thiol represented by ⁇ , the necessary part is sequentially synthesized into the starting compound containing (B) -SS-bond, and finally the present
  • Starting compounds containing an —S—S— bond include, for example, cystine, L-cystine and its salts, N, N, N', N'-tetramethyl-L-cystine and its salts, and amino at both ends of cystine.
  • Compounds whose groups are protected with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, tert-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, acetyl group, etc. and their salts, carboxy groups at both ends of cystine are protected with methyl group, allyl group, etc. Examples thereof include the compound and a salt thereof.
  • L 1a and L 1b are both L 1
  • R 1a and R 1b are both R 1
  • ka and kb are both 1
  • X a and X b are both X
  • L 4a and L are both.
  • 4b is L 4 together
  • R 2a and R 2b are both R 2
  • L 2a and L 2b are both L 2
  • a 1 ma and mb are both
  • R 3a and R 3b are both R 3
  • One of the reactive functional groups (FG 1 ) in the compound (I) having a reactive functional group (FG 1 and FG 2 ) at the terminal with R 3 was reacted with a reagent for introducing a protecting group to be protected.
  • a compound (II) having a functional group (PG 1) is synthesized.
  • Compound (VI) is synthesized by reacting the reactive functional group (FG 4 ) of compound (IV) with the terminal carboxy group of cystine (V) having a protected amino group (PG 2). The protecting group is removed from the protected amino group (PG 2 ) of the compound (VI) to synthesize a compound (VII) having an amino group at the terminal.
  • the reactive functional group (FG 5 ) of the compound (VIII) having R 1 and X at the terminal and the reactive functional group (FG 5) is reacted with the amino group at the terminal of the compound (VII) to react the compound (FG 5 ).
  • IX) is synthesized.
  • the protecting group is removed from the protected functional group (PG 1 ) of compound (IX) to synthesize compound (X) having a reactive functional group (FG 6) at the end.
  • reacting a reactive functional group of the compound having the R 4 with the reactive functional group (FG 7) (XI) ( FG 7) thereby, a cationic lipid (1') having a cystine skeleton, L 1 , R 1 , X, L 4 , R 2 , L 2 , R 3 , L 3 and R 4 can be obtained.
  • the solvent used for the protecting reaction of the reactive functional group (FG 1 ) of compound (I) may be any solvent that does not inhibit the reaction. It can be used without any particular restrictions.
  • the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene and the like. Of these, dichloromethane, chloroform and toluene are preferable.
  • Examples of the protecting group used for protecting the reactive functional group (FG 1 ) of the compound (I) include an acetal-based protecting group, a silyl-based protecting group, an ester-based protecting group, an ether-based protecting group, and the like. Of these, acetal-based protecting groups are preferred. Examples of the reagent forming a protecting group include 3,4-dihydro-2H-pyran and the like.
  • a catalyst may be used in the reaction for forming compound (II) from compound (I).
  • the catalyst used can be appropriately selected depending on the type of compound to be reacted.
  • the reaction temperature for forming compound (II) from compound (I) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (II) obtained by the protection reaction of the reactive functional group (FG 1 ) of the compound (I) can be generally purified by extraction, recrystallization, adsorption, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. It can be appropriately purified by the method.
  • the reaction between compound (II) and compound (III) may be carried out without using a catalyst, or may be carried out in the presence of a catalyst.
  • the catalyst used for the reaction between compound (II) and compound (III) can be appropriately selected depending on the type of compound to be reacted.
  • a base catalyst such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, triethylamine, 4-dimethylaminopyridine (hereinafter, may be abbreviated as "DMAP") may be used, and p-toluenesulfonic acid may be used.
  • an acid catalyst such as methanesulfonic acid may be used.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • EDC 1-ethyl- Condensing agents such as 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • the solvent used for the reaction between the compound (II) and the compound (III) may be any solvent that does not inhibit the reaction, and can be used without particular limitation.
  • the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene and the like. Of these, tetrahydrofuran is preferred.
  • the reaction temperature of compound (II) and compound (III) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (IV) obtained by the reaction of the compound (II) with the compound (III) is appropriately prepared by a general purification method such as extraction, recrystallization, adsorption, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. Can be purified.
  • the reaction between compound (IV) and compound (V) may be carried out without using a catalyst, or may be carried out in the presence of a catalyst.
  • the catalyst used for the reaction between compound (IV) and compound (V) can be appropriately selected depending on the type of compound to be reacted.
  • a base catalyst such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, triethylamine or DMAP may be used, or an acid catalyst such as p-toluenesulfonic acid or methanesulfonic acid may be used.
  • a condensing agent such as DCC, DIC, or EDC may be used for the reaction between compound (IV) and compound (V). After converting the compound (V) into an acid anhydride or the like using a condensing agent, the obtained acid anhydride or the like may be reacted with the compound (IV).
  • the solvent used for the reaction between the compound (IV) and the compound (V) may be any solvent that does not inhibit the reaction, and can be used without particular limitation.
  • the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene and the like. Of these, tetrahydrofuran is preferred.
  • the reaction temperature of compound (IV) and compound (V) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (VI) obtained by the reaction of the compound (IV) with the compound (V) is appropriately prepared by a general purification method such as extraction, recrystallization, adsorption, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. Can be purified.
  • the solvent used for the reaction for removing the protecting group of the amino group of the compound (VI) may be a solvent that does not inhibit the reaction, and is particularly limited. Can be used without. Examples of the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, methanol, ethanol, isopropanol and the like. Of these, tetrahydrofuran is preferred.
  • the reagent used to remove the protecting group of the amino group of the compound (VI) can be appropriately selected depending on the protecting group.
  • the reaction temperature for forming compound (VII) from compound (VI) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (VII) obtained by the reaction of removing the protective group of the amino group of the compound (VI) is obtained by a general purification method such as extraction, recrystallization, adsorption, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. , Can be appropriately purified.
  • the reaction between compound (VII) and compound (VIII) may be carried out without using a catalyst, or may be carried out in the presence of a catalyst.
  • the catalyst used for the reaction between the compound (VII) and the compound (VIII) can be appropriately selected depending on the type of the compound to be reacted.
  • a base catalyst such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, triethylamine or DMAP may be used, or an acid catalyst such as p-toluenesulfonic acid or methanesulfonic acid may be used.
  • a condensing agent such as DCC, DIC, EDC may be used for the reaction between compound (VII) and compound (VIII). Further, after converting the compound (VIII) into an acid anhydride or the like using a condensing agent, the obtained acid anhydride or the like may be reacted with the compound (VII).
  • the solvent used for the reaction between the compound (VII) and the compound (VIII) may be any solvent that does not inhibit the reaction, and can be used without particular limitation.
  • the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, methanol, ethanol, isopropanol and the like. Of these, dichloromethane and chloroform are preferable.
  • the reaction temperature of compound (VII) and compound (VIII) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (IX) obtained by the reaction of the compound (VII) with the compound (VIII) is appropriately prepared by a general purification method such as extraction, recrystallization, adsorption, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. Can be purified.
  • the solvent used for the reaction for removing the protecting group from the protected functional group (PG 1 ) of the compound (IX) is a solvent that does not inhibit the reaction. Anything is sufficient, and it can be used without any particular limitation.
  • the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene, methanol, ethanol, isopropanol and the like. Of these, water is preferred.
  • the reagent used to remove the protecting group from the protected functional group (PG 1) of compound (IX) can be appropriately selected depending on the protecting group.
  • the reaction temperature for forming compound (X) from compound (IX) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (X) obtained by the reaction of removing the protective group from the protected functional group (PG 1 ) of the compound (IX) can be extracted, recrystallized, adsorbed, reprecipitated, column chromatography, ion exchange chromatography, etc. It can be appropriately purified by the general purification method of.
  • the reaction between compound (X) and compound (XI) may be carried out without using a catalyst, or may be carried out in the presence of a catalyst.
  • the catalyst used for the reaction between the compound (X) and the compound (XI) can be appropriately selected depending on the type of the compound to be reacted.
  • a base catalyst such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, triethylamine or DMAP may be used, or an acid catalyst such as p-toluenesulfonic acid or methanesulfonic acid may be used.
  • a condensing agent such as DCC, DIC, or EDC may be used for the reaction between compound (X) and compound (XI). Further, after converting the compound (XI) into an acid anhydride or the like using a condensing agent, the obtained acid anhydride or the like may be reacted with the compound (X).
  • the solvent used for the reaction between the compound (X) and the compound (XI) may be any solvent that does not inhibit the reaction, and can be used without particular limitation.
  • the solvent include water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, toluene and the like. Of these, dichloromethane and chloroform are preferable.
  • the reaction temperature of compound (X) and compound (XI) is usually 0 to 150 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 10 to 50 ° C.
  • This reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the cationic lipid (1') obtained by the reaction of compound (X) with compound (XI) is a general purification method such as extraction, recrystallization, adsorption, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. Can be appropriately purified.
  • the lipid membrane structure of the present invention contains the cationic lipid (1) of the present invention as a constituent substance of the membrane.
  • the "lipid membrane structure” in the present invention means a structure having a membrane structure in which hydrophilic groups of amphipathic lipids are arranged toward the aqueous phase side of the interface.
  • amphipathic lipid is meant a lipid that has both hydrophilic and hydrophobic groups. Examples of amphipathic lipids include cationic lipids and phospholipids.
  • the form of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, and for example, as a form in which the cationic lipid (1) of the present invention is dispersed in an aqueous solvent, liposomes (for example, single membrane liposomes, multilamellar liposomes, etc.), O. / W type emulsion, W / O type emulsion, spherical micelle, string-like micelle, lipid nanoparticle (LNP), unspecified layered structure and the like can be mentioned.
  • the lipid membrane structure of the present invention is preferably LNP.
  • the lipid membrane structure of the present invention may further contain other constituent components in addition to the cationic lipid (1) of the present invention.
  • other constituents include lipids (phospholipids (phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, etc.)), glycolipids, peptide lipids, cholesterol, and cationic lipids of the present invention (1).
  • the content of other constituents in the lipid membrane structure of the present invention is the sum of all the constituents in the lipid membrane structure of the present invention (that is, the cationic lipid (1) of the present invention and other constituents). ), It is preferably 5 to 95 mol%, more preferably 10 to 90 mol%, and further preferably 30 to 80 mol%.
  • the content of the cationic lipid (1) of the present invention in the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, but usually, nucleic acid is introduced when the lipid membrane structure is used as a nucleic acid introducing agent described later.
  • a sufficient amount of the cationic lipid (1) of the present invention is contained therewith.
  • the content of the cationic lipid (1) of the present invention in the lipid membrane structure of the present invention is preferably 5 to 100 mol%, more preferably 5 to 100 mol%, based on all the lipids in the lipid membrane structure of the present invention. Is 10 to 90 mol%, more preferably 20 to 70 mol%.
  • the lipid membrane structure of the present invention requires that the cationic lipid (1) of the present invention and other constituents (lipids, etc.) are dispersed in a suitable solvent or dispersion medium, for example, an aqueous solvent or an alcoholic solvent. It can be prepared by performing an operation that induces organization accordingly.
  • a suitable solvent or dispersion medium for example, an aqueous solvent or an alcoholic solvent. It can be prepared by performing an operation that induces organization accordingly.
  • “Operations that induce organization” include, for example, ethanol dilution method using microchannel or vortex, simple hydration method, sonication, heating, vortex, ether injection method, French press method, cholic acid method. , Ca 2+ fusion method, freeze-thaw method, reverse phase evaporation method and other known methods, but are not limited thereto.
  • the nucleic acid By enclosing the nucleic acid in the lipid membrane structure containing the cationic lipid of the present invention and bringing it into contact with the cell, the nucleic acid can be introduced into the cell in vivo and / or in vitro. Therefore, the present invention provides a nucleic acid introducing agent containing the above-mentioned cationic lipid (1) or lipid membrane structure.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention can introduce any nucleic acid into cells.
  • the nucleic acid can be any one to three strands, but is preferably single or double strands.
  • nucleic acid examples include, but are not limited to, DNA, RNA, a chimeric nucleic acid of RNA, and a hybrid of DNA / RNA.
  • Nucleic acids other than DNA, RNA, RNA chimeric nucleic acids, and DNA / RNA hybrids may be used.
  • nucleic acids include, for example, nucleotides having N-glycosides of purine or pyrimidine bases, oligomers having a non-nucleotide skeleton (eg, commercially available peptide nucleic acid (PNA)), or oligomers having special bindings (provided that they are The oligomer contains a nucleotide having a arrangement that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • nucleic acid is, for example, a nucleic acid with a known modification, a nucleic acid with a label known in the art, a nucleic acid with a cap, a methylated nucleic acid, or one or more natural nucleotides replaced with an analog.
  • DNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose of use.
  • Examples of DNA include plasmid DNA, cDNA, antisense DNA, chromosomal DNA, PAC, BAC, CpG oligo and the like.
  • plasmid DNA, cDNA, and antisense DNA are preferable, and plasmid DNA is more preferable.
  • Circular DNA such as plasmid DNA can be appropriately digested with a restriction enzyme or the like and used as linear DNA.
  • RNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose of use.
  • examples of RNA include siRNA, miRNA, shRNA, antisense RNA, messenger RNA (mRNA), single-stranded RNA genome, double-stranded RNA genome, RNA replicon, transfer RNA, ribosomal RNA and the like.
  • siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, antisense RNA, and RNA replicon are preferable.
  • the nucleic acid used in the present invention is preferably purified by a method usually used by those skilled in the art.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention containing a nucleic acid can be administered in vivo (in vivo) for the purpose of prevention and / or treatment of a disease, for example. Therefore, the nucleic acid used in the present invention is preferably one having preventive and / or therapeutic activity for a certain predetermined disease (nucleic acid for prevention / treatment). Examples of such nucleic acids include nucleic acids used in so-called gene therapy.
  • the nucleic acid of the present invention is encapsulated by coexisting the target nucleic acid and a constituent component (lipid, etc.) of the lipid membrane structure of the present invention.
  • a membrane structure that is, the nucleic acid-introducing agent of the present invention containing the nucleic acid
  • the lipid film structure of the present invention when the lipid film structure of the present invention is formed as liposomes by the ethanol dilution method, an aqueous solution of nucleic acid and an ethanol solution of a component of the lipid film structure are vigorously mixed by a vortex, a microchannel, or the like, and then the mixture is vigorously mixed.
  • the lipid membrane structure of the present invention containing a nucleic acid that is, the nucleic acid introducing agent of the present invention containing a nucleic acid
  • the lipid membrane structure of the present invention When the lipid membrane structure of the present invention is formed as a liposome by the simple hydration method, the constituent components of the lipid membrane structure are dissolved in an appropriate organic solvent, the solution is placed in a glass container, and the solution is dried under reduced pressure. The solvent is distilled off to obtain a lipid thin film. Next, an aqueous solution of nucleic acid was added to the obtained lipid thin film, hydrated, and then ultrasonically treated with a sonicator to enclose the nucleic acid in the lipid film structure of the present invention (that is, the nucleic acid was contained therein). The sealed nucleic acid-introducing agent of the present invention) can be formed.
  • One form of the lipid membrane structure of the present invention containing a nucleic acid is an LNP containing the nucleic acid by forming an electrostatic complex between the nucleic acid and a cationic lipid.
  • This LNP can be used for a drug delivery system for selectively delivering nucleic acids and the like into specific cells, for example, DNA vaccines by introducing antigen genes into dendritic cells, gene therapy agents for tumors, and the like. , It is useful for nucleic acid drugs that suppress the expression of target genes using RNA interference.
  • the particle size of the lipid membrane structure of the present invention containing the nucleic acid is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 500 nm, and more preferably 30 nm to 300 nm.
  • the particle size can be measured using, for example, a particle size distribution measuring device such as Zethasizer Nano (Malvern).
  • the particle size of the lipid membrane structure can be appropriately adjusted by the method for preparing the lipid membrane structure.
  • the zeta potential of the lipid membrane structure of the present invention containing the nucleic acid is not particularly limited, but is preferably -15 to +15 mV, and more preferably -10 to +10 mV.
  • particles whose surface is positively charged have been mainly used. This is useful as a method for promoting electrostatic interaction with negatively charged cell surface heparin sulfate and promoting uptake into cells.
  • the positive surface charge results in (a) inhibition of nucleic acid release from the carrier by interaction with the delivery nucleic acid in the cell, or (b) inhibition of protein synthesis by interaction of the mRNA with the delivery nucleic acid. there is a possibility. This problem can be solved by adjusting the zeta potential within the above range.
  • the zeta potential can be measured using, for example, a zeta potential measuring device such as Zetasizer Nano.
  • the zeta potential of the lipid membrane structure can be adjusted by the composition of the constituent components of the lipid membrane structure containing the cationic lipid (1) of the present invention.
  • liposomal pKa The pKa on the surface of the lipid membrane of the lipid membrane structure of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as “liposomal pKa”) is not particularly limited, but is preferably 5.0 to 7.2, and more preferably 6. It is 0.0 to 6.8. Liposomal pKa is used as an index showing the susceptibility of lipid membrane structures taken up by endocytosis to protonation in endosomes in a weakly acidic environment. As described in Non-Patent Documents 2 and 3, in order to escape from endosomes and deliver nucleic acid into the cytoplasm, it is important to set liposome pKa to a preferable value for endosome escape.
  • Liposome pKa By adjusting Liposome pKa within the above range, nucleic acid can be efficiently delivered into the cytoplasm.
  • Liposomal pKa can be appropriately adjusted by selecting the cationic lipid (1) of the present invention used as a constituent component of the lipid membrane structure.
  • the nucleic acid can be introduced into the cell by contacting the cell with the nucleic acid introducing agent of the present invention containing the nucleic acid.
  • the type of the cell is not particularly limited, and prokaryotic and eukaryotic cells can be used.
  • the cell is preferably a eukaryotic cell.
  • the types of eukaryotes are also not particularly limited, and are, for example, mammals including humans (eg, humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cows, etc.), birds (eg, chickens, ostriches, etc.), amphibians (eg, frogs, etc.).
  • the cells are more preferably animal or plant cells, even more preferably mammalian cells.
  • the cell may be a cultured cell line containing a cancer cell, a cell isolated from an individual or a tissue, or a cell of a tissue or a piece of tissue. Further, the cell may be an adherent cell or a non-adherent cell.
  • the step of contacting the cell with the nucleic acid-introducing agent of the present invention in which the nucleic acid is encapsulated in vitro will be specifically described below.
  • the cells are suspended in a suitable medium several days before contact with the nucleic acid-introducing agent of the present invention containing the nucleic acid, and cultured under appropriate conditions. Upon contact with the nucleic acid-introducing agent, the cells may or may not be in the proliferative phase.
  • the culture medium at the time of contact between the nucleic acid-introducing agent of the present invention containing the nucleic acid and the cells may be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • the serum concentration in the medium is preferably 30% by weight or less, more preferably 20% by weight or less. If the medium contains excess protein such as serum, contact between the nucleic acid-introducing agent and cells may be inhibited.
  • the cell density at the time of contact between the nucleic acid-introducing agent of the present invention containing a nucleic acid and a cell is not particularly limited and can be appropriately set in consideration of the cell type and the like, but is usually 1 ⁇ 10. 4 is in the range of ⁇ 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • a dispersion of the nucleic acid-introducing agent of the present invention containing the above-mentioned nucleic acid is added to cells.
  • the amount of the dispersion to be added is not particularly limited and can be appropriately set in consideration of the number of cells and the like.
  • the concentration of the nucleic acid-introducing agent in the dispersion at the time of contact with the cells is not particularly limited as long as the introduction of the target nucleic acid into the cells can be achieved, but the lipid concentration in the dispersion is usually limited.
  • the concentration of nucleic acid in the dispersion is usually 0.01 to 100 ⁇ g / mL, preferably 0.1 to 10 ⁇ g / mL.
  • the cells After adding the above-mentioned dispersion liquid to the cells, the cells are cultured.
  • the temperature, humidity, CO 2 concentration, etc. at the time of culturing are appropriately set in consideration of the cell type. When the cells are of mammalian origin, the temperature is usually about 37 ° C., the relative humidity is about 95%, and the CO 2 concentration is about 5% by volume.
  • the culture time can also be appropriately set in consideration of conditions such as the type of cells used, but is usually in the range of 0.1 to 76 hours, preferably in the range of 0.2 to 24 hours, and more preferably 0. It ranges from .5 to 12 hours. If the culture time is too short, the nucleic acid is not sufficiently introduced into the cell, and if the culture time is too long, the cell may be weakened.
  • Nucleic acid is introduced into cells by the above-mentioned culture, but preferably the medium is replaced with a fresh medium, or a fresh medium is added to the medium and the culture is continued. If the cells are of mammalian origin, the fresh medium preferably contains serum or trophic factors.
  • nucleic acid-introducing agent of the present invention in which nucleic acid is encapsulated, it is possible to introduce nucleic acid into cells not only in vitro (in vitro) but also in vivo (in vivo). That is, by administering the nucleic acid-introducing agent to a subject, the nucleic acid-introducing agent reaches and contacts the target cell, and the nucleic acid is introduced into the cell in vivo.
  • the target to which the nucleic acid-introducing agent can be administered is not particularly limited, and for example, mammals (for example, humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cows, etc.), birds (for example, chickens, ostriches, etc.), amphibians (for example, for example).
  • the administration target of the nucleic acid-introducing agent is preferably a human or other mammal.
  • the type of target cell is not particularly limited, and by using the nucleic acid-introducing agent of the present invention, various tissues (for example, liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone, brain, stomach, small intestine) can be used. , Large intestine, skin, adipose tissue, lymph nodes, tumors, etc.) It is possible to introduce nucleic acids into cells.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention reaches and contacts a target cell, and the nucleic acid is introduced into the cell.
  • the method is not particularly limited as long as it can be introduced, and an administration method known per se (for example, oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration)) is taken into consideration in consideration of the type of nucleic acid to be introduced, the type and site of target cells, and the like.
  • Intramuscular administration, local administration, transdermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, spray, etc.) can be appropriately selected.
  • the dose of the nucleic acid-introducing agent is not particularly limited as long as the introduction of nucleic acid into cells can be achieved, and the type of administration target, administration method, type of nucleic acid to be introduced, type and site of target cell. It can be appropriately selected in consideration of the above.
  • the cationic lipid (1) and the lipid membrane structure of the present invention can also be used to introduce compounds other than nucleic acids into cells.
  • nucleic acid-introducing agent containing the cationic lipid (1) or the lipid membrane structure of the present invention can be formulated according to conventional means.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention is the cationic lipid (1) of the present invention or the lipid membrane structure of the present invention, and water or other physiologically.
  • Acceptable solvent eg, water-soluble solvent (eg, malic acid buffer, etc.), organic solvent (eg, ethanol, methanol, DMSO, tert-butanol, etc.), or mixed solvent of water-soluble solvent and organic solvent
  • water-soluble solvent eg, malic acid buffer, etc.
  • organic solvent eg, ethanol, methanol, DMSO, tert-butanol, etc.
  • mixed solvent of water-soluble solvent and organic solvent It may be provided as a sterile solution or dispersion containing the above, or as a solvent-free nucleic acid-introducing agent.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention can appropriately contain a physiologically acceptable additive known per se (eg, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc.).
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention is the cationic lipid (1) of the present invention or the lipid membrane structure of the present invention, and a pharmaceutically acceptable known additive.
  • Oral eg, tablets, capsules, etc.
  • parenteral eg, injection
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention as a pharmaceutical is preferably a parenteral agent, more preferably an injection.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention may be either an adult sawn timber or a pediatric preparation.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention in the form of a kit.
  • the kit can contain reagents used for nucleic acid introduction.
  • the nucleic acid-introducing agent (or kit) of the present invention further comprises a polycation (eg, protamine).
  • a polycation eg, protamine
  • Tables 3 and 4 show the names and structures of the cationic lipids produced in the following examples.
  • reaction solution was cooled to 10 to 20 ° C., 30.1 g (246 mmol) of DMAP (manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.) was added, and quenching was performed. After adding 590 g of 2-propanol to the solution after quenching, the mixture was cooled to 10 to 20 ° C. A mixture of 98.8 g of a 400 g / L sodium hydroxide aqueous solution and 307 g of ion-exchanged water was added dropwise to the cooled solution, and the reaction was carried out at 25 ° C. for 2 hours. The reaction solution was concentrated by an evaporator, and dichloromethane and 2-propanol were distilled off.
  • DMAP manufactured by Koei Chemical Industry Co., Ltd.
  • the obtained concentrate was washed twice with 750 g of chloroform, and then 6N hydrochloric acid was added to obtain a mixture having a pH of 5.0.
  • the obtained mixture was extracted twice with 750 g of chloroform, and then the organic layer was dehydrated by adding 75.0 g of sodium sulfate. After removing sodium sulfate by filtration, the filtrate was concentrated on an evaporator to obtain 98.2 g of Intermediate 1.
  • the filtrate was concentrated by an evaporator to remove THF.
  • 10.0 g of ion-exchanged water was added to the obtained concentrate to prepare a solution, the pH was adjusted to 12.0 using a 400 g / L aqueous sodium hydroxide solution.
  • the pH-adjusted solution was washed 3 times with 15.0 g of chloroform, the washed aqueous layer was neutralized to pH 7.0 with 6N hydrochloric acid, and the neutralized aqueous layer was concentrated by an evaporator.
  • a solution was prepared by adding 50.0 g of acetonitrile to the obtained residue, and then dehydrated by adding 4.00 g of sodium sulfate. After removing sodium sulfate by filtration, the filtrate was concentrated with an evaporator to obtain 1.35 g of N-ethyl-N-methylglycine represented by the following formula.
  • O-Ph-cys-C2-EMA was synthesized using Intermediate 4 and N-ethyl-N-methylglycine by the same synthetic route as in Example 1.
  • Example 3 Synthesis of O-Ph-cys-C2-MPA ⁇ Synthesis of N-methyl-N-propylglycine> N-Methyl-N-propylglycine represented by the following formula was synthesized in the same manner as in Example 2 except that N-methylpropylamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • O-Ph-cys-C2-MPA was synthesized using Intermediate 4 and N-methyl-N-propylglycine by the same synthetic route as in Example 1.
  • Example 4 Synthesis of O-Ph-cys-C2-DEA Using intermediate 4 and N, N-diethylglycine sodium salt (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), O was carried out in the same synthetic route as in Example 1. -Ph-cys-C2-DEA was synthesized.
  • Example 5 Synthesis of O-Ph-cys-C2-DPA ⁇ Synthesis of N, N-dipropylglycine> N, N-dipropylglycine represented by the following formula was synthesized in the same manner as in Example 2 except that dipropylamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • O-Ph-cys-C2-DPA was synthesized using Intermediate 4 and N, N-dipropylglycine by the same synthetic route as in Example 1.
  • Example 6 Synthesis of O-Ph-cys-C2-DIA ⁇ Synthesis of N, N-diisopropylglycine> N, N-diisopropylglycine represented by the following formula was synthesized in the same manner as in Example 2 except that diisopropylamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • O-Ph-cys-C2-DIA was synthesized using Intermediate 4 and N, N-diisopropylglycine by the same synthetic route as in Example 1.
  • Example 7 Synthesis of O-Ph-cys-C2-Pip ⁇ Synthesis of 2- (1-piperidyl) acetic acid> 2- (1-Piperidil) acetic acid represented by the following formula was synthesized in the same manner as in Example 2 except that piperidine (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • O-Ph-cys-C2-Pip was synthesized using Intermediate 4 and 2- (1-piperidyl) acetic acid by the same synthetic route as in Example 1.
  • Example 8 Synthesis of E-Ph-cys-C2-DMA Using the intermediate 6 and D- ⁇ -tocopherol succinate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) in the same synthetic route as in Example 1, E- Ph-cys-C2-DMA was synthesized.
  • Example 9 Synthesis of O-Ph-cys-C4-DMA Using intermediates 4 and 4- (dimethylamino) butyric acid hydrochloride (manufactured by SIGMA-ALDRICH) in the same synthetic route as in Example 1, O- Ph-cys-C4-DMA was synthesized.
  • reaction solution was washed twice with 10.0 g of 0.5 M phosphate buffer (pH 3.0) and once with 10.0 g of 7 wt% saline, and then dehydrated by adding 1.00 g of sodium sulfate. After removing sodium sulfate by filtration, the filtrate was concentrated on an evaporator to obtain 960 mg of Intermediate 7.
  • MES buffer pH 6.5
  • the resulting mixture is transferred to Amicon Ultra 4 and subjected to ultrafiltration under centrifugal conditions (25 ° C., 1000 g, 6 min) to a maximum of about 100 ⁇ L.
  • the obtained concentrate was diluted to 4 mL with PBS and concentrated again under centrifugal conditions (25 ° C., 1000 g, 6 min) twice in total.
  • the obtained concentrate was diluted with PBS to a lipid concentration of 0.5 mM to obtain a dispersion containing LNP.
  • the fluorescence intensity (excitation: 321 nm / emission: 447 nm) was measured using a plate reader (manufactured by TECAN). The relative fluorescence intensity was calculated as a percentage, with the maximum value of the fluorescence intensity in each LNP being 100% and the minimum value being 0%.
  • the pH at which the relative fluorescence intensity was 50% was defined as liposome pKa.
  • the Liposmal pKa of each LNP is shown in Table 5.
  • Liposmal pKa of any LNP was in the preferred pKa (5.0-7.2) range for endosome prolapse.
  • the Liposmal pKa of LNP could be adjusted by changing the structure of the amino group (dialkylamino group or cyclic amino group) of the cationic lipid.
  • DMG-PEG2k (2 mM ethanol solution) was further added in an amount of about 1 mol based on 100 mol of the total amount of cationic lipid, DOPC and Choll, and then ethanol was added to add ethanol of the lipid.
  • a solution (total volume: 360 ⁇ L) was prepared.
  • MES buffer pH 6.5
  • the resulting mixture is transferred to Amicon Ultra 4 and subjected to ultrafiltration under centrifugal conditions (25 ° C., 1000 g, 6 min) to a maximum of about 100 ⁇ L.
  • the obtained concentrate was diluted to 4 mL with PBS and concentrated again under centrifugal conditions (25 ° C., 1000 g, 6 min) twice in total.
  • the obtained concentrate was diluted with PBS to a lipid concentration of 2 mM to obtain a dispersion containing LNP.
  • the LNP containing the cationic lipid of Example 1 showed excellent gene expression activity. Therefore, it was revealed that the LNP containing the cationic lipid of Example 1 is useful as an LNP capable of promoting the expression of mRNA.
  • the prepared LNP dispersion containing each mRNA was administered from the tail vein of Balb / c mice (male, 5 weeks old).
  • the dose of mRNA was 0.05 mg per 1 kg of mouse body weight, and the dose of mRNA-encapsulated LNP dispersion was 10 ⁇ L per 1 g of mouse body weight.
  • a PBS solution of D-luciferin potassium was administered to the abdominal cavity of the mouse.
  • the dose of D-luciferin potassium was 3 mg per mouse, and the dose of the PBS solution of D-luciferin potassium was 200 ⁇ L per mouse.
  • mice Fifteen minutes after administration of the PBS solution of potassium D-luciferin, the mice were euthanized and the liver, spleen, kidneys, heart and lungs were removed. Luminescence in each organ was quantified at 10 sec exposure using an in vivo imaging system (IVIS). The amount of luminescence in each organ was quantified by image analysis using Live Imaging software attached to IVIS. The amount of luminescence (photons / sec) was calculated from the acquired image, and this was used as an index of gene expression activity. The results are shown in FIG. The bar graph of each example shown in FIG. 2 shows the results of the liver, spleen, kidney, heart and lung in order from the left. Further, "E + 0a'"(a': integer) shown in FIG. 2 represents “10 a' ". For example, "1.0E + 02" represents "1.0 ⁇ 10 2".
  • IVIS in vivo imaging system
  • the LNP containing the cationic lipid of Example 1 showed excellent gene expression activity in the liver and spleen. Therefore, it was revealed that the LNP containing the cationic lipid of Example 1 is useful as an LNP capable of promoting the expression of mRNA.
  • HeLa cells which are human cervical cancer cells, were seeded in 3.5 cm dishes at 5.0 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / Dish 24 hours before transfection. After 24 hours, the medium was replaced with a culture medium (D-MEM) containing 0.1 mM D-luciferin.
  • D-MEM culture medium
  • the prepared mRNA-encapsulated LNP was diluted with PBS to a concentration of mRNA of 8 ⁇ g / mL.
  • a diluted mRNA-encapsulated LNP solution 50 ⁇ L, mRNA: 0.4 ⁇ g was added to a 3.5 cm dish and set in an incubator-type luminometer KronosDio.
  • the cationic LNP of Example 1 showed excellent gene expression activity. Therefore, it was revealed that the LNP containing the cationic lipid of Example 1 is useful as an LNP capable of promoting the expression of mRNA.
  • the cationic lipid of the present invention is useful for nucleic acid medicine, gene therapy, biochemical experiments, and the like.

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Abstract

本発明は、式（１）で表されるカチオン性脂質（式中の記号の定義は明細書に記載した通りである）、前記カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体、前記カチオン性脂質を用いた核酸導入剤、および前記核酸導入剤を用いて核酸導入を行う方法を提供する。

Description

シスチン骨格を有する新規カチオン性脂質
　本発明は、シスチン骨格を有するカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、およびこれらの用途に関する。
　核酸治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められており、そのなかでもカチオン性脂質を用いたキャリアは、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアである。
　カチオン性脂質は大別してアミン部位と脂質部位から構成されており、カチオン性を示すアミン部位とポリアニオンである核酸が静電的に相互作用し、リポソームまたは脂質膜構造体を形成することで、細胞への取り込みを促進し、核酸を細胞内へ送達するものである。
　一般に広く用いられている公知のカチオン性脂質としてはＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰが挙げられる。これらの公知のカチオン性脂質はリン脂質と組み合わせることによって、正に帯電したリポソームまたは脂質膜構造体を形成し、核酸と静電的に相互作用することで、標的細胞に核酸を送達し得る（非特許文献１）。
　一方で、カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体が、核酸送達キャリアとして生体内で実用的な効果を発揮するためには、体内動態が良いこと、具体的には血中での安定性が高いこと、肝臓や腫瘍等の標的組織への集積性が高いことなどの要件を満たす必要がある。この課題に対し、脂質膜構造体の表面のｐＫａを調整することで体内動態を改善させた例として以下の報告がある。
　非特許文献２および非特許文献３では、脂質膜構造体の表面ｐＫａの調整により体内動態および肝臓内の各細胞における分布を制御できることが示されている。さらにこれらの文献では、脂質膜構造体の表面のｐＫａをエンドソーム脱出のために好ましい値に調整することで、脂質膜構造体のエンドソームからの脱出が促進され、細胞質内へ効率よく核酸を送達できることが述べられている。
　このように体内動態を改善したカチオン性脂質が開発されているが、一般的に外来物質を細胞内に導入するという核酸送達キャリアの性質上、少ない取り込み量で大きな効果を発揮することが望まれている。即ち、脂質膜構造体を発現ベクターの細胞内への送達キャリアとして用いた場合、細胞内に取り込まれた単位脂質膜構造体当たりの発現量を高め、細胞内での発現効率を高めることが求められている。細胞内での発現効率を高めるためには、体内動態の他に、細胞への取り込み、エンドソームからの脱出、核膜透過などの細胞内動態を改善する必要がある（非特許文献４）。
　カチオン性脂質に生分解性を付与することにより、細胞内動態を改善させた例がある（特許文献１～４）。これら文献では、生分解性を示すジスルフィド結合で繋いだ構造を有するカチオン性脂質について述べられており、細胞内でジスルフィド結合が切断されることを利用し、核酸を脂質膜構造体から解離させることで細胞内動態が改善することが示されている。実際、公知のカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰと比較して、高い核酸送達効率を示すことから、当該カチオン性脂質は核酸の細胞質内への送達効率の向上などの細胞内動態を改善できることが明らかとなっており、さらには、分解性の付与による毒性低減の効果も期待される。
　このように、脂質膜構造体の表面ｐＫａ調整や分解性を有するジスルフィド結合の導入などにより核酸送達キャリアの体内動態および細胞内動態の改善を行った報告は複数ある。しかしながら、核酸治療が対象とする疾患は多岐にわたっており、各疾患に応じた治療法を確立するには、選択できる脂質種の増加とさらなる効果の改善が求められている。
ＵＳ９７０８６２８ 国際公開第２０１６／１２１９４２号 国際公開第２０１９／１８８８６７号 ＵＳ２０１８／０２９８３７９
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２９（２４―２５）：３４７７―９６，２００８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２４（４）：７８８－７９５，２０１６ Ａｎｇｅｗａｎｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　５１：８５２９－８５３３，２０１２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１３（４）：７８６―７９４，２００６
　本発明の課題は、細胞内動態が良好な核酸送達キャリアとして用いることができるカチオン性脂質、前記カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体、前記カチオン性脂質を用いた核酸導入剤、および前記核酸導入剤を用いて核酸導入を行う方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、脂質膜構造体の表面ｐＫａを調整でき、体内動態および細胞内動態を改善可能なカチオン性脂質を見出した。具体的には、シスチン骨格に脂質部位およびアミン部位を導入したカチオン性脂質であり、ジスルフィド結合を有することから、細胞内でジスルフィド結合が切断され、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果も併せ持つ。この新規カチオン性脂質を含んだ脂質膜構造体は、核酸を効率よく細胞質内へ送達できることを見出した。
　即ち、本発明は、以下の内容を包含する。
　［１］　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂは、それぞれ独立してアミド結合、カーバメート結合またはウレア結合を表し、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基または炭素数が８以下のオキシジアルキレン基を表し、
　ｋａおよびｋｂは、それぞれ独立して０または１を表し、
　ＸａおよびＸｂは、それぞれ独立してジアルキルアミノ基（前記二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して１～５である）、または３～６員の環状アミノ基を表し、
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂは、それぞれ独立してエステル結合またはアミド結合を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基または炭素数が８以下のオキシジアルキレン基を表し、
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ｍａおよびｍｂは、それぞれ独立して０または１を表し、
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、それぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、且つヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ｎａおよびｎｂは、それぞれ独立して０または１を表し、
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、それぞれ独立して炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基、またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－を表し、
　Ｒ５は、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基または水酸基を有するステロール誘導体の残基を表し、並びに
　ｐは、２または３を表す。）
で表されるカチオン性脂質。
　［２］　ｎａおよびｎｂが、共に１である前記［１］に記載のカチオン性脂質。
　［３］　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａ、Ｌ２ｂ 、Ｌ４ａまたはＬ４ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０～３の整数を表し、
　ｔは、０～３の整数を表し、
　ｕは、０～４の整数を表し、および
　ｕ個のＲ６は、それぞれ独立して置換基を表す。）
で表される基である前記［１］または［２］に記載のカチオン性脂質。
　［４］　ｓが０である前記［３］に記載のカチオン性脂質。
　［５］　ｋａおよびｋｂが、共に０である前記［１］～［４］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質。
　［６］　ｋａおよびｋｂが、共に１である前記［１］～［４］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質。
　［７］　Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基である前記［１］～［６］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質。
　［８］　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、それぞれ独立して炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基である前記［１］～［６］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質。
　［９］　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、それぞれ独立してＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、並びにＲ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基である前記［１］～［６］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質。
　［１０］　前記［１］～［９］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
　［１１］　前記［１］～［９］のいずれか一つに記載のカチオン性脂質、または前記［１０］に記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
　［１２］　生体外において、核酸を内封した前記［１１］に記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
　［１３］　核酸を内封した前記［１１］に記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
　本発明は、生分解性を有するシスチン骨格に、ジアルキルアミノ基または環状アミノ基および脂質部位を導入したカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、およびこれらの用途に関する。本発明のカチオン性脂質は、脂質膜構造体を形成することができる。本発明のカチオン性脂質および脂質膜構造体は、核酸導入剤のために使用することができる。本発明のカチオン性脂質はアミン部位を分子構造の末端に位置させ、アミン部位近傍の構造の変更を可能にすることで幅広くｐＫａを調整できる。さらに、本発明のカチオン性脂質のシスチン骨格に含まれるジスルフィド結合が、細胞内の還元的環境において切断され、内包物（核酸）の放出が促進される。そのため、本発明のカチオン性脂質を用いた核酸導入剤は、細胞質内への高い核酸送達効率を達成することができる。
　本発明のカチオン性脂質、またはそれを含む脂質膜構造体を用いて、核酸導入を行うと、血清成分による核酸の分解が抑制されるので、血清存在下での核酸導入や、生体内での核酸導入に有利である。
本発明のカチオン性脂質から調製された各種脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ、本明細書中「ＬＮＰ」と略称することがある）のインビトロでのＪｕｒｋａｔ細胞における遺伝子発現活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質から調製された各種ＬＮＰのインビボでの遺伝子発現活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質から調製された各種ＬＮＰのインビトロでのＨｅＬａ細胞における遺伝子発現活性を示した図である。
　以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明は、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で表されるカチオン性脂質を提供する。前記カチオン性脂質は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。なお、以下では「式（１）で表されるカチオン性脂質」を「カチオン性脂質（１）」と略称することがある。他の式で表される化合物等も同様に略称することがある。
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂは、それぞれ独立してアミド結合、カーバメート結合またはウレア結合であり、好ましくは、それぞれ独立してアミド結合またはカーバメート結合であり、より好ましくは、共にアミド結合である。
　Ｌ１ａはＬ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｌ１ａはＬ１ｂと同一である。
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂは、好ましくは、それぞれ独立して＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊、＊－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－＊＊または＊－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－＊＊であり、より好ましくは、それぞれ独立して＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊、または＊－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－＊＊であり、より好ましくは、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊である（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）。ここで「Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置」とは、Ｌ１ａでは「Ｒ１ａとの結合位置」を意味し、Ｌ１ｂでは「Ｒ１ｂとの結合位置」を意味する。また、「Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置」とは、Ｌ１ａでは「Ｒ１ａとは反対側の炭素原子との結合位置」を意味し、Ｌ１ｂでは「Ｒ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置」を意味する。他の同様の表現も同様の意味である。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基または炭素数が８以下のオキシジアルキレン基を表し、好ましくは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基である。Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一である。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂの炭素数が８以下のアルキレン基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。前記アルキレン基の炭素数は、好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂの炭素数が８以下のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができる。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂの炭素数が８以下であるアルキレン基は、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、より好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）である。
　炭素数が８以下のオキシジアルキレン基とは、二つのアルキレン基がオキシ基（－Ｏ－）を介して結合した構造の２価の基（即ち、アルキレン－Ｏ－アルキレン）であって、二つのアルキレン基の炭素数の合計が８以下である基を意味する。ここで、二つのアルキレンは、同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂの炭素数が８以下のオキシジアルキレン基としては、例えば、オキシジメチレン基（メチレンオキシメチレン基）、オキシジエチレン基（エチレンオキシエチレン基）、オキシジ（トリメチレン）基（トリメチレンオキシトリメチレン基）、オキシジブチレン基（ブチレンオキシブチレン基）等を挙げることができる。炭素数が８以下のオキシジアルキレン基は、好ましくはオキシジメチレン基（メチレンオキシメチレン基）、オキシジエチレン基（エチレンオキシエチレン基）、またはオキシジ（トリメチレン）基（トリメチレンオキシトリメチレン基）であり、より好ましくは（エチレンオキシエチレン基）である。
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、好ましくは、それぞれ独立して炭素数が８以下であるアルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、さらに好ましくは、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり、特に好ましくは、共にメチレン基である。
　ｋａおよびｋｂは、それぞれ独立して０または１を表す。ここで、ｋａが０であるとは、Ｌ１ａ－Ｒ１ａが存在しないことを意味する。ｋｂ等が０である場合も、同様の意味である。ｋａおよびｋｂは、好ましくは共に１である。
　ｋａおよびｋｂが共に０であるカチオン性脂質（１）は、下記式（１ａ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ｋａおよびｋｂが共に１であるカチオン性脂質（１）は、下記式（１ｂ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ＸａおよびＸｂは、それぞれ独立してジアルキルアミノ基（前記二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して、１～５である）、または３～６員の環状アミノ基を表す。ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一である。
　ジアルキルアミノ基中の二つのアルキル基の炭素数は、好ましくは、それぞれ独立して１～３であり、より好ましくは共に１である。ジアルキルアミノ基中の二つのアルキル基の炭素数の合計は、好ましくは２～６、より好ましくは２～４である。
　ジアルキルアミノ基中のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、シクロペンチル基等を挙げることができる。ジアルキルアミノ基中の二つのアルキル基は、好ましくは、それぞれ独立してメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、より好ましくは共にメチル基である。
　３～６員の環状アミノ基とは、アミノ基の置換基が結合して環を形成しており、前記環を形成する原子の数が３～６個である基を意味する。３～６員の環状アミノ基は、好ましくは５または６員の環状アミノ基、より好ましくは６員の環状アミノ基である。環状アミノ基としては、環が窒素原子およびメチレン基（－ＣＨ２－）のみから形成されているアミノ基が好ましい。
　３～６員の環状アミノ基としては、例えば、１－アジリジニル基、１－アゼチジニル基、１－ピロリジニル基、１－ピペリジル基、４－モルホリニル基、４－チオモルホリニル基等を挙げることができる。３～６員の環状アミノ基は、好ましくは１－ピロリジニル基または１－ピペリジル基であり、より好ましくは１－ピペリジル基である。
　ＸａおよびＸｂは、好ましくは、それぞれ独立して、ジアルキルアミノ基（前記二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して、１～３である。）、或いは５または６員の環状アミノ基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、ジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジ（イソプロピル）アミノ基、または１－ピペリジル基である。ＸａおよびＸｂは、さらに好ましくは、互いに同一であって、且つジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジ（イソプロピル）アミノ基または１－ピペリジル基である。ＸａおよびＸｂは、特に好ましくは、共にジメチルアミノ基である。
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂは、それぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり、好ましく共にエステル結合である。
　Ｌ４ａはＬ４ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｌ４ａはＬ４ｂと同一である。
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂは、好ましくは、それぞれ独立して＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊または＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊であり、より好ましくは共に＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）。ここで、「Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置」とは、ｍａが１である（即ち、Ｌ２ａ－Ｒ２ａが存在する）場合、Ｌ４ａでは「Ｒ２ａとの結合位置」を意味し、ｍａが０であり（即ち、Ｌ２ａ－Ｒ２ａが存在せず）、且つｎａが１である（即ち、Ｌ３ａ－Ｒ３ａが存在する）場合、Ｌ４ａでは「Ｒ３ａとの結合位置」を意味し、ｍａが０であり（即ち、Ｌ２ａ－Ｒ２ａが存在せず）、且つｎａが０である（即ち、Ｌ３ａ－Ｒ３ａが存在しない）場合、Ｌ４ａでは「Ｒ４ａとの結合位置」を意味する。他の同様の表現も同様の意味である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基または炭素数が８以下のオキシジアルキレン基を表す。Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂの炭素数が８以下のアルキレン基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。前記アルキレン基の炭素数は、好ましくは６以下であり、より好ましくは４以下である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂの炭素数が８以下のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができる。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂの炭素数が８以下であるアルキレン基は、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、より好ましくはエチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり、さらに好ましくはエチレン基である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂの炭素数が８以下のオキシジアルキレン基中に存在する二つのアルキレンは、互いに同一でも異なっていてもよいが、好ましくは互いに同一である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂの炭素数が８以下のオキシジアルキレン基としては、例えば、オキシジメチレン基（メチレンオキシメチレン基）、オキシジエチレン基（エチレンオキシエチレン基）、オキシジ（トリメチレン）基（トリメチレンオキシトリメチレン基）、オキシジブチレン基等を挙げることができる。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂの炭素数が８以下であるオキシジアルキレン基は、好ましくは、オキシジメチレン基（メチレンオキシメチレン基）、オキシジエチレン基（エチレンオキシエチレン基）、またはオキシジ（トリメチレン）基（トリメチレンオキシトリメチレン基）であり、より好ましくはオキシジエチレン基（エチレンオキシエチレン基）である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、好ましくは、それぞれ独立して炭素数が８以下であるアルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり、さらに好ましくは、それぞれ独立してエチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり、特に好ましくは共にエチレン基である。
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合であり、好ましくは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合またはカーバメート結合であり、より好ましくは共にエステル結合である。
　Ｌ２ａはＬ２ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｌ２ａはＬ２ｂと同一である。
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂは、好ましくは、それぞれ独立して＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊、＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊、＊－ＣＯ－ＮＨ－＊＊、＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊、＊－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－＊＊、＊－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－＊＊、＊－Ｏ－＊＊または＊－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－＊＊であり、より好ましくは、それぞれ独立して＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊、＊－ＣＯ－ＮＨ－＊＊または＊－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－＊＊であり、さらに好ましくは、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）。
　ｍａおよびｍｂは、それぞれ独立して、０または１を表し、好ましくは共に１である。
　ｍａおよびｍｂが共に０であるカチオン性脂質（１）は、下記式（１ｃ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　ｍａおよびｍｂが共に１であるカチオン性脂質（１）は、下記式（１ｄ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、それぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、且つヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。ここで、前記２価の基とは、前記芳香族化合物から二つの水素原子を除くことによって得られる構造を有する２価の基を意味する。前記芳香族化合物の炭素数は好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～７である。また、前記芳香族化合物の芳香環の数は、好ましくは１である。Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　前記芳香族化合物の芳香環としては、芳香族炭化水素環または芳香族ヘテロ環のいずれでもよい。芳香族炭化水素環としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環等を挙げることができる。芳香族ヘテロ環としては、例えば、イミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フランチオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができる。前記芳香族化合物の芳香環は、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環またはアントラセン環であり、より好ましくはベンゼン環である。
　前記芳香族化合物の芳香環は置換基を有してもよい。前記置換基としては、例えば、炭素数が２～４のアシル基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数が２～４のカルバモイル基、炭素数が２～４のアシルオキシ基、炭素数が２～４のアシルアミノ基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数が１～４のアルキルスルファニル基、炭素数が１～４のアルキルスルホニル基、炭素数が６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数が１～４のアルキル基、炭素数が１～４のウレイド基、炭素数が１～４のアルコキシ基、炭素数が６～１０のアリール基、炭素数が６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができる。前記置換基の好ましい例としては、アセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基、フェノキシ基等を挙げることができる。
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、好ましくはそれぞれ独立して、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａ、Ｌ２ｂ 、Ｌ４ａまたはＬ４ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０～３の整数を表し、
　ｔは、０～３の整数を表し、
　ｕは、０～４の整数を表し、および
　ｕ個のＲ６は、それぞれ独立して置換基を表す。）
で表される基である。
　ｓは、好ましくは０または１であり、より好ましくは０である。
　ｔは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは１である。
　ｕは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０または１であり、さらに好ましくは０である。
　Ｒ６としては、例えば、炭素数が２～４のアシル基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数が２～４のカルバモイル基、炭素数が２～４のアシルオキシ基、炭素数が２～４のアシルアミノ基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数が１～４のアルキルスルファニル基、炭素数が１～４のアルキルスルホニル基、炭素数が６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数が１～４のアルキル基、炭素数が１～４のウレイド基、炭素数が１～４のアルコキシ基、炭素数が６～１０のアリール基、炭素数が６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができる。Ｒ６の好ましい例としては、アセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基、フェノキシ基等がを挙げることができる。Ｒ６が複数存在する場合、複数のＲ６は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合であり、好ましくは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合またはエーテル結合であり、より好ましくは共にエステル結合である。
　Ｌ３ａはＬ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｌ３ａはＬ３ｂと同一の基である。
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂは、好ましくは、それぞれ独立して＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊、＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊、＊－ＣＯ－ＮＨ－＊＊、＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊、＊－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－＊＊、＊－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－＊＊、＊－Ｏ－＊＊または＊－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－＊＊であり、より好ましくは、それぞれ独立して＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊、＊－ＣＯ－ＮＨ－＊＊または＊－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－＊＊であり、さらに好ましくは、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）。
　ｎａおよびｎｂは、それぞれ独立して、０または１を表し、好ましくは共に１である。
　ｎａおよびｎｂが共に０であるカチオン性脂質（１）は、下記式（１ｅ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ｎａおよびｎｂが共に１であるカチオン性脂質（１）は、下記式（１ｆ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、それぞれ独立して炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－を表し、Ｒ５は、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基または水酸基を有するステロール誘導体の残基を表し、およびｐは、２または３を表す。Ｒ４ａはＲ４ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ４ａはＲ４ｂと同一の基である。
　本明細書中、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基とは、前記脂溶性ビタミンの水酸基から水素原子を除くことによって得られる構造を有する１価の基を表す。また、水酸基を有するステロール誘導体の残基とは、前記ステロール誘導体の水酸基から水素原子を除くことによって得られる構造を有する１価の基を表す。
　炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。前記脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１３～１９であり、より好ましくは１３～１７である。
　前記脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。前記脂肪族炭化水素基が不飽和脂肪族炭化水素基である場合、その不飽和結合の数は、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個である。不飽和結合は、炭素－炭素二重結合または炭素－炭素三重結合のいずれでもよいが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。前記脂肪族炭化水素基は、好ましくはアルキル基またはアルケニル基である。
　炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基としては、例えば、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、または１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、またはヘプタデカジエニル基である。
　本発明の一態様において、Ｒ４ａおよびＲ４ｂの炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基は脂肪酸由来である。この場合、脂肪酸由来のカルボニル（－ＣＯ－）はＬ３ａ、Ｌ３ｂ、Ｌ２ａ、Ｌ２ｂ、Ｌ４ａまたはＬ４ｂ中に含まれる。脂肪酸としてオレイン酸を用いてＲ４ａおよびＲ４ｂを形成する場合、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、共に８－ヘプタデセニル基である。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。
　水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール等を挙げることができる。水酸基を有するステロール誘導体は、好ましくはコレステロール、またはコレスタノールである。
　Ｒ５は、好ましくは水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基である。ｐは、好ましくは２である。
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、それぞれ独立して、炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基であり、並びにｐが２または３であることが好ましく、Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基であり、並びにｐが２または３であることがより好ましく、Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）の残基であり、並びにｐが２であることがさらに好ましく、Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基であることが特に好ましい。
　本発明の一態様において、Ｌ１ａはＬ１ｂと同一であり、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、ＸａはＸｂと同一であり、Ｌ４ａはＬ４ｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、Ｌ２ａはＬ２ｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であり、Ｌ３ａはＬ３ｂと同一であり、且つＲ４ａはＲ４ｂと同一であることが好ましい。
　本発明のカチオン性脂質（１）の好適な例としては、以下のカチオン性脂質が挙げられる。
＜カチオン性脂質（１－１）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊である（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、それぞれ独立して炭素数が８以下であるアルキレン基であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、それぞれ独立して、ジアルキルアミノ基（前記二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して、１～３である）、或いは５または６員の環状アミノ基であり；
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂが、共に＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、それぞれ独立して炭素数が８以下であるアルキレン基であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０～３の整数を表し
　ｔは、０～３の整数を表し、
　ｕは、０～４の整数を表し、および
　ｕ個のＲ６は、それぞれ独立して炭素数が２～４のアシル基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数が２～４のカルバモイル基、炭素数が２～４のアシルオキシ基、炭素数が２～４のアシルアミノ基、炭素数が２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数が１～４のアルキルスルファニル基、炭素数が１～４のアルキルスルホニル基、炭素数が６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数が１～４のアルキル基、炭素数が１～４のウレイド基、炭素数が１～４のアルコキシ基、または炭素数が６～１０のアリール基、炭素数が６～１０のアリールオキシ基を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；並びに
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、それぞれ独立して、炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）の残基であり、並びにｐが２または３である；
カチオン性脂質（１）。
＜カチオン性脂質（１－２）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、それぞれ独立して、ジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジ（イソプロピル）アミノ基、または１－ピペリジル基であり；
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂが、共に＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０または１を表し、
　ｔは、０～２の整数を表し、
　ｕは、０～２の整数を表し、および
　ｕ個のＲ６は、それぞれ独立して、アセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基またはフェノキシ基を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）の残基であり、並びにｐが２または３である；
カチオン性脂質（１）。
＜カチオン性脂質（１－２ａ）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、それぞれ独立して、ジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、または１－ピペリジル基であり；
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂが、共に＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）、ペンタメチレン基、またはヘキサメチレン基であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０または１を表し、
　ｔは、０～２の整数を表し、
　ｕは、０～２の整数を表し、および
　ｕ個のＲ６は、それぞれ独立して、アセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基またはフェノキシ基を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）の残基であり、並びにｐが２または３である；
カチオン性脂質（１）。
＜カチオン性脂質（１－３）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、互いに同一であって、且つジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジ（イソプロピル）アミノ基または１－ピペリジル基であり；
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂが、共に＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、それぞれ独立してエチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０を表し、
　ｔは、１を表し、および
　ｕは、０を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；並びに
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）の残基であり、並びにｐが２である；
カチオン性脂質（１）。
＜カチオン性脂質（１－３ａ）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、それぞれ独立してメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、互いに同一であって、且つジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、または１－ピペリジル基であり；
　Ｌ４ａおよびＬ４ｂが、共に＊－Ｏ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、それぞれ独立してエチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、またはイソブチレン基（－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－）であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０を表し、
　ｔは、１を表し、および
　ｕは、０を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；並びに
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）の残基であり、並びにｐが２である；
カチオン性脂質（１）。
＜カチオン性脂質（１－３ｂ）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、共にメチレン基であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、互いに同一であって、且つジメチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、または１－ピペリジル基であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、共にエチレン基であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、互いに同一であって、且つ式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０を表し、
　ｔは、１を表し、および
　ｕは、０を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基である；
カチオン性脂質（１）。
＜カチオン性脂質（１－４）＞
　Ｌ１ａおよびＬ１ｂが、共に＊－ＮＨ－ＣＯ－＊＊（前記式中、＊＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとの結合位置を表し、＊は、Ｒ１ａまたはＲ１ｂとは反対側の炭素原子との結合位置を表す。）であり；
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、共にメチレン基であり；
　ｋａおよびｋｂが、それぞれ独立して０または１であり；
　ＸａおよびＸｂが、共にジメチルアミノ基であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、共にエチレン基であり；
　Ｌ２ａおよびＬ２ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊（前記式中、＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ２ａまたはＲ２ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｍａおよびｍｂが、共に１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、互いに同一であって、且つ式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、
　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
　＊＊は、Ｌ２ａまたはＬ２ｂとの結合位置を表し、
　ｓは、０を表し、
　ｔは、１を表し、および
　ｕは、０を表す。）
で表される基であり；
　Ｌ３ａおよびＬ３ｂが、共に＊－ＣＯ－Ｏ－＊＊である（前記式中、＊は、Ｒ４ａまたはＲ４ｂとの結合位置を表し、＊＊は、Ｒ３ａまたはＲ３ｂとの結合位置を表す。）であり；
　ｎａおよびｎｂが、共に１であり；
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、互いに同一であって、且つ炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基である；
カチオン性脂質（１）。
　本発明のカチオン性脂質（１）には、立体異性体、幾何異性体が存在する場合があり、特に明示しない限り、本発明のカチオン性脂質（１）は、それらの異性体を包含する。また、本発明のカチオン性脂質（１）は、複数の異性体の混合物であってもよい。複数の異性体の混合物において、各異性体の割合に特に限定はない。
　本発明のカチオン性脂質（１）の具体例として、以下のＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＥＭＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＭＰＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＥＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＰＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＩＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－Ｐｉｐ、Ｅ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡ、およびＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ４－ＤＭＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－ＤＭＡを挙げることができる。本発明のカチオン性脂質（１）は、好ましくは、これらからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＥＭＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＭＰＡ、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＥＡ、およびＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－Ｐｉｐからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、最も好ましくはＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　次に本発明のカチオン性脂質（１）の製造方法について説明する。
　本発明のカチオン性脂質（１）は、－Ｓ－Ｓ－（ジスルフィド）結合を有している。そのため、本発明のカチオン性脂質（１）の製造方法としては、
　（Ａ）｛Ｒ４ａ－（Ｌ３ａ－Ｒ３ａ）ｎａ－（Ｌ２ａ－Ｒ２ａ）ｍａ－Ｌ４ａ－｝ＣＨ（ＣＨ２ＳＨ）｛－（Ｌ１ａ－Ｒ１ａ）ｋａ－Ｘａ｝で表されるチオールおよび｛Ｒ４ｂ－（Ｌ３ｂ－Ｒ３ｂ）ｎｂ－（Ｌ２ｂ－Ｒ２ｂ）ｍｂ－Ｌ４ｂ－｝ＣＨ（ＣＨ２ＳＨ）｛－（Ｌ１ｂ－Ｒ１ｂ）ｋｂ－Ｘｂ｝で表されるチオールを製造した後、これらを酸化およびカップリングする方法、並びに
　（Ｂ）－Ｓ－Ｓ－結合を含む出発化合物に、必要な部分を順次合成していき、最終的に本発明のカチオン性脂質（１）を得る方法
等が挙げられる。本発明のカチオン性脂質（１）の製造方法は、好ましくは、前記（Ｂ）の方法である。
　以下、前記（Ｂ）の方法を説明するが、本発明のカチオン性脂質（１）の製造方法は、これに限定されない。
　－Ｓ－Ｓ－結合を含む出発化合物としては、例えば、シスチン、Ｌ－シスチンおよびその塩、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチル－Ｌ－シスチンおよびその塩、シスチンの両末端のアミノ基を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アセチル基などで保護した化合物およびその塩、シスチンの両末端のカルボキシ基をメチル基、アリル基などで保護した化合物およびその塩などが挙げられる。
　例えば、Ｌ１ａおよびＬ１ｂが共にＬ１であり、Ｒ１ａおよびＲ１ｂが共にＲ１であり、ｋａおよびｋｂが共に１であり、ＸａおよびＸｂが共にＸであり、Ｌ４ａおよびＬ４ｂが共にＬ４であり、Ｒ２ａおよびＲ２ｂが共にＲ２であり、Ｌ２ａおよびＬ２ｂが共にＬ２であり、ｍａおよびｍｂが共に１であり、Ｒ３ａおよびＲ３ｂが共にＲ３であり、Ｌ３ａおよびＬ３ｂが共にＬ３であり、ｎａおよびｎｂが共に１であり、且つＲ４ａおよびＲ４ｂが共にＲ４であるカチオン性脂質（１）を製造する場合、以下に示す合成経路にて、下記式（１’）で表されるカチオン性脂質を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　Ｒ３と末端に反応性官能基（ＦＧ１およびＦＧ２）を有する化合物（Ｉ）中の片方の反応性官能基（ＦＧ１）に、保護基を導入する試薬を反応させて、保護された官能基（ＰＧ１）を有する化合物（ＩＩ）を合成する。化合物（ＩＩ）の反応性官能基（ＦＧ２）に対して、Ｒ２と末端に反応性官能基（ＦＧ３およびＦＧ４）を有する化合物（ＩＩＩ）中の片方の反応性官能基（ＦＧ３）を反応させて、化合物（ＩＶ）を合成する。化合物（ＩＶ）の反応性官能基（ＦＧ４）に対して、保護されたアミノ基（ＰＧ２）を有するシスチン（Ｖ）の末端のカルボキシ基を反応させて、化合物（ＶＩ）を合成する。化合物（ＶＩ）の保護されたアミノ基（ＰＧ２）から保護基を除去し、末端にアミノ基を有する化合物（ＶＩＩ）を合成する。化合物（ＶＩＩ）の末端のアミノ基に対して、Ｒ１並びに末端にＸおよび反応性官能基（ＦＧ５）を有する化合物（ＶＩＩＩ）の反応性官能基（ＦＧ５）を反応させて、化合物（ＩＸ）を合成する。化合物（ＩＸ）の保護された官能基（ＰＧ１）から保護基を除去して、末端に反応性官能基（ＦＧ６）を有する化合物（Ｘ）を合成する。最後に、化合物（Ｘ）の反応性官能基（ＦＧ６）に対して、Ｒ４と反応性官能基（ＦＧ７）を有する化合物（ＸＩ）の反応性官能基（ＦＧ７）を反応させることにより、シスチン骨格、Ｌ１、Ｒ１、Ｘ、Ｌ４、Ｒ２、Ｌ２、Ｒ３、Ｌ３およびＲ４を有するカチオン性脂質（１’）を得ることができる。
　上述の合成経路における反応性官能基の保護および脱保護は、公知の試薬および方法（例えば、GREENE’S PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第４版、WILEY-INTERSCIENCEMに記載されている試薬および方法）を使用して行うことができる。
　化合物（Ｉ）の反応性官能基（ＦＧ１）の保護反応（即ち、化合物（Ｉ）から化合物（ＩＩ）を形成する反応）に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではジクロロメタン、クロロホルム、トルエンが好ましい。
　化合物（Ｉ）の反応性官能基（ＦＧ１）の保護に使用される保護基としては、例えば、アセタール系保護基、シリル系保護基、エステル系保護基、エーテル系保護基などが挙げられる。これらの中で、アセタール系保護基が好ましい。保護基を形成する試薬としては、例えば３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン等が挙げられる。
　化合物（Ｉ）から化合物（ＩＩ）を形成する反応では、触媒を使用してもよい。使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択することができる。
　化合物（Ｉ）から化合物（ＩＩ）を形成するための反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　化合物（Ｉ）の反応性官能基（ＦＧ１）の保護反応によって得られた化合物（ＩＩ）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）との反応は、触媒を使用せずに行ってもよく、触媒の存在下で行ってもよい。化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択することができる。前記触媒として、炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン（以下、「ＤＭＡＰ」と略称することがある）などの塩基触媒を使用してもよく、ｐ－トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒を使用してもよい。
　化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）との反応のために、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下「ＤＣＣ」と略称することがある）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＣ」略称することがある）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下「ＥＤＣ」と略称することがある）などの縮合剤を使用してもよい。また、縮合剤を使用して化合物（ＩＩ）を酸無水物等に変換した後、得られた酸無水物等と、化合物（ＩＩＩ）とを反応させてもよい。
　化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）との反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではテトラヒドロフランが好ましい。
　化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）との反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）との反応によって得られた化合物（ＩＶ）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応は、触媒を使用せずに行ってもよく、触媒の存在下で行ってもよい。化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択することができる。前記触媒として、炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、ＤＭＡＰなどの塩基触媒を使用してもよく、ｐ－トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒を使用してもよい。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応のために、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用してもよい。縮合剤を使用して化合物（Ｖ）を酸無水物等に変換した後、得られた酸無水物等と、化合物（ＩＶ）とを反応させてもよい。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではテトラヒドロフランが好ましい。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応によって得られた化合物（ＶＩ）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（ＶＩ）のアミノ基の保護基を除去する反応（即ち、化合物（ＶＩ）から化合物（ＶＩＩ）を形成する反応）に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。これらの中ではテトラヒドロフランが好ましい。
　化合物（ＶＩ）のアミノ基の保護基を除去するために使用される試薬は、保護基に応じて適宜選択することができる。
　化合物（ＶＩ）から化合物（ＶＩＩ）を形成するための反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　化合物（ＶＩ）のアミノ基の保護基を除去する反応によって得られた化合物（ＶＩＩ）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応は、触媒を使用せずに行ってもよく、触媒の存在下で行ってもよい。化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択することができる。前記触媒として、炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、ＤＭＡＰなどの塩基触媒を使用してもよく、ｐ－トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒を使用してもよい。
　化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応のために、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用してもよい。また、縮合剤を使用して化合物（ＶＩＩＩ）を酸無水物等に変換した後、得られた酸無水物等と、化合物（ＶＩＩ）とを反応させてもよい。
　化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。これらの中ではジクロロメタン、クロロホルムが好ましい。
　化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応によって得られた化合物（ＩＸ）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（ＩＸ）の保護された官能基（ＰＧ１）から保護基を除去する反応（即ち、化合物（ＩＸ）から化合物（Ｘ）を形成する反応）に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。これらの中では水が好ましい。
　化合物（ＩＸ）の保護された官能基（ＰＧ１）から保護基を除去するために使用される試薬は、保護基に応じて適宜選択することができる。
　化合物（ＩＸ）から化合物（Ｘ）を形成するための反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　化合物（ＩＸ）の保護された官能基（ＰＧ１）から保護基を除去する反応によって得られた化合物（Ｘ）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（Ｘ）と化合物（ＸＩ）との反応は、触媒を使用せずに行ってもよく、触媒の存在下で行ってもよい。化合物（Ｘ）と化合物（ＸＩ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択することができる。前記触媒として、炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、ＤＭＡＰなどの塩基触媒を使用してもよく、ｐ－トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒を使用してもよい。
　化合物（Ｘ）と化合物（ＸＩ）との反応のために、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用してもよい。また、縮合剤を使用して化合物（ＸＩ）を酸無水物等に変換した後、得られた酸無水物等と、化合物（Ｘ）とを反応させてもよい。
　化合物（Ｘ）と化合物（ＸＩ）との反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。前記溶媒としては、例えば、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではジクロロメタン、クロロホルムが好ましい。
　化合物（Ｘ）と化合物（ＸＩ）との反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは、０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。この反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
化合物（Ｘ）と化合物（ＸＩ）との反応によって得られたカチオン性脂質（１’）は、抽出、再結晶、吸着、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　具体的な製造方法を、後述の実施例１～１０に記載する。当業者であれば、適宜原料を選択し、実施例１～１０に記載する方法に準じて反応を行うことにより、所望のカチオン性脂質（１）を製造することができる。
　次に本発明の脂質膜構造体について説明する。
　本発明の脂質膜構造体とは、本発明のカチオン性脂質（１）を膜の構成物質として含有するものである。ここで、本発明における「脂質膜構造体」とは、両親媒性脂質の親水基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する構造体を意味する。「両親媒性脂質」とは、親水性基および疎水性基の両方を有する脂質を意味する。両親媒性脂質としては、例えば、カチオン性脂質やリン脂質等を挙げることができる。
　本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に本発明のカチオン性脂質（１）が分散した形態として、リポソーム（例えば一枚膜リポソーム、多重層リポソームなど）、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または不特定の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体は、好ましくはＬＮＰである。
　本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質（１）に加え、その他の構成成分をさらに含有してもよい。その他の構成成分としては、例えば、脂質（リン脂質（ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン等）、糖脂質、ペプチド脂質、コレステロール、本発明のカチオン性脂質（１）以外のカチオン性脂質、ＰＥＧ脂質等）、界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート、コール酸ナトリウム塩、オクチルグリコシド、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド類等）、ポリエチレングリコール、タンパク質などが挙げられる。本発明の脂質膜構造体中のその他の構成成分の含有量は、本発明の脂質膜構造体中の全ての構成成分（即ち、本発明のカチオン性脂質（１）およびその他の構成成分の合計）に対して、好ましくは５～９５ｍｏｌ％であり、より好ましくは１０～９０ｍｏｌ％であり、さらに好ましくは、３０～８０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質膜構造体中の本発明のカチオン性脂質（１）の含有量は特に限定されないが、通常は、脂質膜構造体を後述の核酸導入剤として用いた場合に、核酸を導入するために十分な量の本発明のカチオン性脂質（１）が含まれる。例えば、本発明の脂質膜構造体中の本発明のカチオン性脂質（１）の含有量は、本発明の脂質膜構造体中の全ての脂質に対して、好ましくは５～１００ｍｏｌ％、より好ましくは１０～９０ｍｏｌ％、さらに好ましくは２０～７０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質（１）およびその他の構成成分（脂質等）を適当な溶媒または分散媒、例えば、水性溶媒やアルコール性溶媒中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより調製することができる。
　「組織化を誘導する操作」としては、例えば、マイクロ流路またはボルテックスを用いたエタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結－融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体に核酸を内封させ、これを細胞へ接触させることにより、生体内および／または生体外において核酸を該細胞内へ導入することができる。従って、本発明は、上述のカチオン性脂質（１）または脂質膜構造体を含む、核酸導入剤を提供する。
　本発明の核酸導入剤は、任意の核酸を細胞内へ導入することができる。核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖または２本鎖である。
　核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるが、これらに限定されない。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド以外の核酸（以下「他の核酸」と記載する）を使用してもよい。他の核酸としては、例えば、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドを有するヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）、または特殊な結合を有するオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を持つヌクレオチドを含有する）等を挙げることができる。
　さらに核酸は、例えば、公知の修飾が付加された核酸、当該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、分子内で架橋されたヌクレオチドを有する核酸、非荷電結合（例えば、メチルスルホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カーバメート等）を持つ核酸、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有する核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有する核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を含有する核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性を持つ金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を有する核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。
　本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。ＤＮＡとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＣｐＧオリゴ等が挙げられる。これらの中で、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡが好ましくは、プラスミドＤＮＡがより好ましい。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは、適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
　本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられる。これらの中で、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンが好ましい。
　本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤は、例えば疾患の予防および／または治療を目的として、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）投与することができる。従って、本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／または治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸などが挙げられる。
　本発明の脂質膜構造体を形成する際に、目的とする核酸と、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）とを共存させることにより、当該核酸を内封した本発明の脂質膜構造体（即ち、当該核酸を内封した本発明の核酸導入剤）を形成することができる。
　例えば、エタノール希釈法によりリポソームとして本発明の脂質膜構造体を形成する場合、核酸の水溶液と、脂質膜構造体の構成成分のエタノール溶液とをボルテックスやマイクロ流路等で激しく混合した後で、得られた混合物を、適切な緩衝液で希釈することによって、核酸を内封した本発明の脂質膜構造体（即ち、核酸を内封した本発明の核酸導入剤）を形成することができる。
　また、単純水和法によりリポソームとして本発明の脂質膜構造体を形成する場合、脂質膜構造体の構成成分を適切な有機溶媒に溶解し、該溶液をガラス容器に入れ、減圧乾燥することにより溶媒を留去し、脂質薄膜を得る。次いで、得られた脂質薄膜に、核酸の水溶液を加え、水和させた後に、ソニケーターで超音波処理することによって、当該核酸を内封した本発明の脂質膜構造体（即ち、当該核酸を内封した本発明の核酸導入剤）を形成することができる。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の一形態として、核酸とカチオン性脂質との間の静電的複合体を形成することによって、当該核酸を内封したＬＮＰが挙げられる。このＬＮＰは、核酸等を特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムのために用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療薬や、ＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子の発現を抑制する核酸医薬品などに有用である。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。この粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質膜構造体の粒子径は、脂質膜構造体の調製方法により、適宜調整することができる。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体のゼータ電位は、特に制限は無いが、好ましくは－１５～＋１５ｍＶ、さらに好ましくは－１０～＋１０ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用である。しかし、正の表面電荷によって、（ａ）細胞内において送達核酸との相互作用によるキャリアからの核酸の放出の抑制、または（ｂ）ｍＲＮＡと送達核酸との相互作用によるタンパク質合成の抑制が、生じる可能性がある。ゼータ電位を上記の範囲内に調整することにより、この問題を解決し得る。ゼータ電位の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏなどのゼータ電位測定装置を用いて行うことができる。脂質膜構造体のゼータ電位は、本発明のカチオン性脂質（１）を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。
　本発明の脂質膜構造体の脂質膜表面のｐＫａ（以下「Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａ」と略称することがある）は、特に制限はないが、好ましくは５．０～７．２であり、さらに好ましくは６．０～６．８である。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａは、エンドサイトーシスで取り込まれた脂質膜構造体がエンドソーム内の弱酸性環境下において、脂質膜構造体のプロトン化の受け易さを示す指標とされている。非特許文献２および３に記載されているように、エンドソームから脱出し、核酸を細胞質内へ送達するためには、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａをエンドソーム脱出のために好ましい値とすることが重要である。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａを、上記範囲内に調整することにより、効率よく細胞質内へ核酸の送達を行うことができる。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａは、脂質膜構造体の構成成分として用いる本発明のカチオン性脂質（１）を選択することにより、適宜調整することができる。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤と細胞とを接触させることで、当該核酸を当該細胞内へ導入することができる。当該細胞の種類は、特に限定されず、原核生物および真核生物の細胞を用いることができる。当該細胞は、好ましくは真核生物の細胞である。真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物、微生物（例えば、酵母等）等が挙げられる。当該細胞は、より好ましくは動物または植物の細胞、さらに好ましくは哺乳動物の細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株、個体または組織より単離された細胞、あるいは組織または組織片の細胞であってもよい。また、当該細胞は、接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。
　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において核酸を内封した本発明の核酸導入剤と細胞とを接触させる工程を、以下、具体的に説明する。
　細胞は、核酸を内封した本発明の核酸導入剤との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。当該核酸導入剤との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤と細胞との接触時の培養液は、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよい。培地中の血清濃度は、３０重量％以下であることが好ましく、２０重量％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、当該核酸導入剤と細胞との接触が阻害される可能性がある。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤と細胞との接触時の細胞密度は、特には限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４～１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
　細胞に、例えば、上述の核酸を内封した本発明の核酸導入剤の分散液を添加する。該分散液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の、分散液中の当該核酸導入剤の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り、特には限定されないが、分散液中の脂質濃度は、通常１～１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０～５０ｎｍｏｌ／ｍＬであり、分散液中の核酸の濃度は、通常０．０１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１～１０μｇ／ｍＬである。
　上述の分散液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、相対湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５体積％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１～７６時間の範囲であり、好ましくは０．２～２４時間の範囲であり、より好ましくは０．５～１２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
　上述の培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、または培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は、血清または栄養因子を含むことが好ましい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤を用いることで、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、当該核酸導入剤を対象へ投与することにより、当該核酸導入剤が標的細胞へ到達および接触し、生体内で核酸が細胞内へ導入される。当該核酸導入剤を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることができる。当該核酸導入剤の投与対象は、好ましくはヒトまたは他の哺乳動物である。
　標的細胞の種類は特に限定されず、本発明の核酸導入剤を用いることで、種々の組織（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組組織、リンパ節、腫瘍等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤の対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物など）への投与方法は、標的細胞へ本発明の核酸導入剤が到達および接触し、核酸を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、導入する核酸の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。当該核酸導入剤の投与量は、核酸の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入する核酸の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。
　なお、本発明のカチオン性脂質（１）および脂質膜構造体は、核酸以外の化合物を細胞に導入するためにも用いることができる。
　本発明のカチオン性脂質（１）または脂質膜構造体を含む核酸導入剤は、常套手段に従って製剤化することができる。
　本発明の核酸導入剤が研究用試薬として提供される場合、本発明の核酸導入剤は、本発明のカチオン性脂質（１）または本発明の脂質膜構造体と、水または他の生理学的に許容し得る溶媒（例えば、水溶性溶媒（例えば、リンゴ酸緩衝液、等）、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ｔｅｒｔ－ブタノールなど）、または水溶性溶媒と有機溶媒との混合溶媒）とを含む無菌性溶液または分散液として提供されてもよく、溶媒を含まない核酸導入剤として提供されてもよい。本発明の核酸導入剤は、適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことができる。
　本発明の核酸導入剤が医薬として提供される場合、本発明の核酸導入剤は、本発明のカチオン性脂質（１）または本発明の脂質膜構造体と、医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とを混合することによって得られる経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）または非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として提供されてもよく、公知の添加剤を含まない核酸導入剤として提供されてもよい。医薬としての本発明の核酸導入剤は、好ましくは非経口剤、より好ましくは注射剤である。また、本発明の核酸導入剤は、成人用の製材または小児用の製剤のいずれでもよい。
　本発明の核酸導入剤を、キットの態様で提供することも可能である。当該キットには、本発明のカチオン性脂質（１）または脂質膜構造体に加えて、核酸導入の際に使用する試薬を含むことができる。一態様において、本発明の核酸導入剤（またはキット）は、ポリカチオン（例、プロタミン）を更に含む。当該態様の本発明の核酸導入剤（またはキット）を用いることにより、核酸およびポリカチオン（例、プロタミン）の静電的複合体を本発明の脂質膜構造体に封入し、これによって核酸をより効率的に細胞内に導入することができる。
　以下に本発明の実施例について更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されない。
　実施例の説明において使用している略語の意味は、それぞれ以下の通りである。
　ＤＣＭ：ジクロロメタン
　ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
　ＤＨＰ：３,４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン
　ＰＰＴＳ：ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム
　ＤＢＵ：ジアザビシクロウンデセン
　ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
　ＥＤＣ：１－（３-ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩
　Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
　ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
　Ｃｈｏｌ：コレステロール
　ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ：１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ポリエチレングリコール鎖の重量平均分子量：２０００）
　ＤＯＰＣ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
　ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
　ＭＥＳ：２－モルホリノエタンスルホン酸
　ＴＮＳ：６－（ｐ－トルイジノ）－２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム
　ＴＥＡ：トリエチルアミン
　表３および４に、以下の実施例で製造したカチオン性脂質の名称と構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
［実施例１］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡの合成
　Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡを以下の合成経路で製造したが、本発明は、このような合成経路に限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
＜中間体１の合成＞
　４―ヒドロキシフェニル酢酸（関東化学株式会社製）７５．０ｇ（４９３ｍｍｏｌ）、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム（関東化学株式会社製）１２．４ｇ（４９．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン４００ｇに室温で溶解させ、得られた溶液を１０～２０℃まで冷却した。そこへ、ＤＨＰ（富士フイルム和光純薬株式会社製）２０７ｇ（２．４６ｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｇに溶解することによって得られた溶液を滴下により加えた後、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を１０～２０℃に冷却し、ＤＭＡＰ（広栄化学工業株式会社製）３０．１ｇ（２４６ｍｍｏｌ）を加えて、クエンチを行った。クエンチ後の溶液に２－プロパノール５９０ｇを加えた後、１０～２０℃まで冷却した。冷却後の溶液に、４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液９８．８ｇおよびイオン交換水３０７ｇの混合物を滴下により加え、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液をエバポレーターにより濃縮し、ジクロロメタン、２－プロパノールを留去した。得られた濃縮物を、クロロホルム７５０ｇで２回洗浄した後、６Ｎ塩酸を加えて、ｐＨ５．０の混合物を得た。得られた混合物を、クロロホルム７５０ｇで２回抽出した後、有機層を、硫酸ナトリウム７５．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、９８．２ｇの中間体１を得た。
＜中間体２の合成＞
　２５．０ｇ（１０６ｍｍｏｌ）の中間体１、ＤＭＡＰ　２．６０ｇ（２１．３ｍｍｏｌ）にＴＨＦ２２５ｇを加えて室温で溶解させ、得られた溶液に、脱水エチレングリコール（富士フイルム和光純薬株式会社製）２２２ｇ（３．５８ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物に、ＥＤＣ（東京化成工業株式会社製）４０．６ｇ（２１２ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液をエバポレーターにより濃縮して、ＴＨＦを留去した。得られた濃縮物にクロロホルム２５０ｇを加えて抽出した後、有機層を、０.５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）２５０ｇで２回、２０重量％食塩水２５０ｇで１回洗浄した後、硫酸ナトリウム５０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、２８．４ｇの中間体２を得た。
＜中間体３の合成＞
　１６．４ｇ（５８．５ｍｍｏｌ）の中間体２、Ｎ，Ｎ'－ビス（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－シスチン（渡辺化学工業株式会社製）２０ｇ（２９．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ　１．４３ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）に、ＴＨＦ１００ｇを加えて、室温で溶解させた。得られた溶液に、ＥＤＣ　１６．８ｇ（８７．６ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム２５０ｇを加えて抽出した後、有機層を、０.５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）２５０ｇで２回、２０重量％食塩水２５０ｇで１回洗浄した後、硫酸ナトリウム４０．０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、３１．５ｇの中間体３を得た。
＜中間体４の合成＞
　１５．０ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）の中間体３に、ＴＨＦ３３３ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液に、ＤＢＵ（東京化成工業株式会社製）１．４２ｇ（９．３３ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で１時間反応を行った。反応溶液を１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）７５０ｇで希釈し、ヘキサン４８７ｇで２回洗浄した。洗浄後の希釈液をクロロホルム１１２０ｇで２回抽出した後、有機層を２０重量％食塩水７５０ｇで洗浄した。洗浄後の有機層を硫酸ナトリウム３０．０ｇを加えて脱水した後、硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、６．３０ｇの中間体４を得た。
＜中間体５の合成＞
　６００ｍｇ（０．７８４ｍｍｏｌ）の中間体４、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン（東京化成工業株式会社製）１９４ｍｇ（１．８８ｍｍｏｌ）にクロロホルム８９．０ｇを加えて室温で溶解させた。ＥＤＣ　６０１ｍｇ（３．１４ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２時間反応させた。反応溶液を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）６０．０ｇで２回、７重量％重曹水６０．０ｇで１回、２０重量％食塩水６０．０ｇで1回洗浄した後、硫酸ナトリウム７．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、６９５ｍｇの中間体５を得た。
＜中間体６の合成＞
　６８０ｍｇ（０．７２７ｍｍｏｌ）の中間体５に０.５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）６８．０ｇを加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１００ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に、４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、そのｐＨを６．０に調整した後、ｐＨ調整後の水層をクロロホルム１００ｇで２回抽出した。有機層を硫酸ナトリウム１．３６ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、２７８ｍｇの中間体６を得た。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡの合成＞
　２５０ｍｇ（０．３２６ｍｍｏｌ）の中間体６、オレイン酸（日油株式会社製）１８４ｍｇ（０．６５２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ　１５．９ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）に、クロロホルム１７．６ｇを加えて、室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ　１８７ｍｇ（０．９７６ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水１２．０ｇで２回洗浄した後、硫酸ナトリウム５００ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、３６９ｍｇの粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムで精製することで、２２２ｍｇのＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡを得た。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３２（ｓ、１２Ｈ）、２．５２－２．５６（ｔ、４Ｈ）、２．９０－３．０３（ｍ、４Ｈ）、３．０９－３．４３（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８８－４．９７（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、７．８１－７．８８（ｄ、２Ｈ）
［実施例２］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＥＭＡの合成
＜Ｎ－エチル－Ｎ－メチルグリシンの合成＞
　Ｎ－エチルメチルアミン（東京化成工業株式会社製）８．５０ｇ（１４４ｍｍｏｌ）にＴＨＦ４５ｇを加えて常温で溶解させ、１０℃以下に冷却した。そこへ、ブロモ酢酸（東京化成工業株式会社製）２．００ｇ（１４．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ９．００ｇで溶解することによって得られた溶液を滴下により加え、２５℃で２時間反応を行った。白色沈殿を濾過によって除去した後、ろ液をエバポレーターにより濃縮し、ＴＨＦを除去した。得られた濃縮物にイオン交換水１０．０ｇを加えて溶液を調製した後、そのｐＨを、４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて１２．０に調整した。ｐＨを調整した溶液をクロロホルム１５．０ｇで３回洗浄した後、洗浄後の水層を６Ｎ塩酸でｐＨ７．０に中和し、中和後の水層をエバポレーターにより濃縮した。得られた残渣にアセトニトリル５０．０ｇを加えて溶液を調製した後、硫酸ナトリウム４．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、下記式で表されるＮ－エチル－Ｎ－メチルグリシン１．３５ｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＥＭＡの合成＞
　中間体４およびＮ－エチル－Ｎ－メチルグリシンを用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＥＭＡを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＥＭＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．０５－１．０９（ｔ、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３１（ｓ、６Ｈ）、２．４９－２．５６（ｍ、８Ｈ）、２．９６－３．０７（ｍ、４Ｈ）、３．１０－３．４３（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８８－４．９７（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、７．９４－８．０１（ｄ、２Ｈ）
［実施例３］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＭＰＡの合成
　＜Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルグリシンの合成＞
　Ｎ－メチルプロピルアミン（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、下記式で表されるＮ－メチル－Ｎ－プロピルグリシンを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＭＰＡの合成＞
　中間体４およびＮ－メチル－Ｎ－プロピルグリシンを用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＭＰＡを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＭＰＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９３（ｍ、１２Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．４７－１．５２（ｍ、４Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．３８－２．４２（ｍ、４Ｈ）、２．５２－２．５６（ｔ、４Ｈ）、２．９６－３．０７（ｍ、４Ｈ）、３．１１－３．４３（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８８－４．９７（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、７．９４－８．０１（ｄ、２Ｈ）
［実施例４］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＥＡの合成
　中間体４およびＮ，Ｎ－ジエチルグリシンナトリウム塩（東京化成工業株式会社製）を用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＥＡを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＥＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．０３－１．０６（ｔ、１２Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．５２－２．６１（ｍ、１２Ｈ）、３．００－３．４３（ｍ、８Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８８－４．９７（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、８．１３－８．２０（ｄ、２Ｈ）
［実施例５］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＰＡの合成
＜Ｎ，Ｎ－ジプロピルグリシンの合成＞
　ジプロピルアミン（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、下記式で表されるＮ，Ｎ－ジプロピルグリシンを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＰＡの合成＞
　中間体４およびＮ，Ｎ－ジプロピルグリシンを用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＰＡを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＰＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ０．８６－０．９２（ｍ、１８Ｈ）、１．２２－１．５１（ｍ、４８Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．４３－２．４６（ｔ、８Ｈ）、２．５２－２．５５（ｔ、４Ｈ）、３．０２－３．４３（ｍ、８Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８６－４．９５（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、８．０９－８．１６（ｄ、２Ｈ）
［実施例６］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＩＡの合成
＜Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルグリシンの合成＞
　ジイソプロピルアミン（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、下記式で表されるＮ，Ｎ―ジイソプロピルグリシンを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＩＡの合成＞
　中間体４およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルグリシンを用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＩＡを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＩＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．０２（ｓ、２４Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．５２－２．６０（ｍ、８Ｈ）、３．０２－３．４３（ｍ、８Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８６－４．９５（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、８．０９－８．１６（ｄ、２Ｈ）
［実施例７］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－Ｐｉｐの合成
＜２－（１－ピペリジル）酢酸の合成＞
　ピペリジン（富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、下記式で表される２－（１－ピペリジル）酢酸を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－Ｐｉｐの合成＞
　中間体４および２－（１－ピペリジル）酢酸を用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－Ｐｉｐを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－Ｐｉｐの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．２２－１．４８（ｍ、４４Ｈ）、１．６０－１．６３（ｍ、８Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．４３－２．５６（ｍ、１２Ｈ）、２．９４－３．０２（ｍ、４Ｈ）、３．１３－３．４３（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８８－４．９７（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、８．０２－８．０９（ｄ、２Ｈ）
［実施例８］Ｅ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡの合成
　中間体６およびコハク酸Ｄ－α－トコフェロール（東京化成工業株式会社製）を用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｅ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡを合成した。
＜Ｅ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ２－ＤＭＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８３－０．８８（ｍ、２４Ｈ）、１．００－１．８１（ｍ、５２Ｈ）、１．９８（ｓ、６Ｈ）、２．０１（ｓ、６Ｈ）、２．０８（ｓ、６Ｈ）、２．３２（ｓ、１２Ｈ）、２．５５－２．６０（ｔ、４Ｈ）、２．８０－２．８３（ｍ、４Ｈ）、２．９０－３．０３（ｍ、８Ｈ）、３．０９－３．４３（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８８－４．９７（ｍ、２Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、７．８１－７．８８（ｄ、２Ｈ）
［実施例９］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ４－ＤＭＡの合成
　中間体４および４－（ジメチルアミノ）酪酸　塩酸塩（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて実施例１と同様の合成経路で、Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ４－ＤＭＡを合成した。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－Ｃ４－ＤＭＡの１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．７２－１．８３（ｍ、８Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．２０－２．４０（ｍ、２０Ｈ）、２．５２－２．５６（ｔ、４Ｈ）、３．０２－３．３９（ｍ、４Ｈ）、３．６３（ｓ、４Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、４．８０－４．８９（ｍ、２Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）、７．６８－７．７８（ｄ、２Ｈ）
［実施例１０］Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－ＤＭＡの合成
　Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－ＤＭＡを以下の合成経路で製造したが、本発明は、このような合成経路に限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
＜中間体７の合成＞
　７５７ｍｇ（２．７０ｍｍｏｌ）の中間体２、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｌ－シスチン二塩酸塩（Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）５００ｍｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（関東化学株式会社製）８２０ｍｇ（８．１０ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ　１９８ｍｇ（１．６２ｍｍｏｌ）にクロロホルム１５．０ｇを加えて室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ　１．０４ｇ（５．４０ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１０．０ｇで２回、７重量％食塩水１０．０ｇで１回洗浄した後、硫酸ナトリウム１．００ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、９６０ｍｇの中間体７を得た。
＜中間体８の合成＞
　９００ｍｇ（１．１０ｍｍｏｌ）の中間体７に０.５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）９０．０ｇを加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液にクロロホルム１３０ｇを加えて洗浄した。洗浄後の水層に、４００ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、そのｐＨを６．０に調整した後、クロロホルム１３０ｇで２回抽出した。有機層を硫酸ナトリウム１．８０ｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、３５９ｍｇの中間体８を得た。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－ＤＭＡの合成＞
　３４０ｍｇ（０．５２１ｍｍｏｌ）の中間体８、オレイン酸２９４ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ　２５．４ｍｇ（０．２０８ｍｍｏｌ）に、クロロホルム２３．９ｇを加えて、室温で溶解させた。得られた溶液にＥＤＣ　４００ｍｇ（２．０８ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２時間反応を行った。反応溶液を２０重量％食塩水１６．０ｇで２回洗浄した後、硫酸ナトリウム６８０ｍｇを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、５０１ｍｇの粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラム精製することで、３０３ｍｇのＯ－Ｐｈ－ｃｙｓ－ＤＭＡを得た。
＜Ｏ－Ｐｈ－ｃｙｓ－ＤＭＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞δ：０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、１．２２－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、１．７２－１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．９９－２．０５（ｍ、８Ｈ）、２．３３（ｓ、１２Ｈ）、２．５２－２．５６（ｔ、４Ｈ）、２．９３－３．０４（ｍ、４Ｈ）、３．５５－３．６１（ｍ、６Ｈ）、４．３０－４．３７（ｍ、８Ｈ）、５．３２－５．３８（ｍ、４Ｈ）、７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、７．２７－７．３０（ｍ、４Ｈ）
［試験例１］Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの測定
　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの評価には、核酸を含まない脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用した。
１．マイクロ流路法によるＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
　エッペンドルフチューブにカチオン性脂質の１０ｍＭエタノール溶液、ＤＯＰＣの５ｍＭエタノール溶液、Ｃｈｏｌの１０ｍＭエタノール溶液を総脂質量７２０ｎｍｏｌとなるように目的の割合（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０（モル比））で混合した。得られた混合物に、さらにＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ（２ｍＭエタノール溶液）を、カチオン性脂質、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの総量１００モルに対して１．５モル程度の量で添加し、次いでエタノールを添加して、脂質のエタノール溶液（全量：３６０μＬ）を調製した。
（２）マイクロ流路を用いたＬＮＰの調製
　終濃度３０ｍＭのＮａＣｌを含む酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）１０８０μＬおよび脂質のエタノール溶液３６０μＬをそれぞれシリンジにはかり取った。超高速ナノ医薬作成装置ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、酸性バッファー溶液の添加速度：３ｍＬ／ｍｉｎ、脂質のエタノール溶液の添加速度：１ｍＬ／ｍｉｎ、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製し、１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＰＢＳを用いて４ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で濃縮する操作を計２回行った。得られた濃縮物を、ＰＢＳを用いて脂質濃度が０．５ｍＭになるよう希釈して、ＬＮＰを含む分散液を得た。
２．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの測定
　ｐＨ３．０～１０．０の範囲で種々のｐＨに合わせた、終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液およびトリスＨＣｌ緩衝液を用意した。ＴＮＳ（Ｓｉｇｍａ製）溶液は、０．６ｍＭとなるように超純水で希釈した。黒色９６ｗｅｌｌプレートにＴＮＳ溶液を２μＬ、［試験例１］１．で調製したＬＮＰを含む分散液を１２μＬ、および種々のｐＨに調整した緩衝液を１８６μＬ加えた。プレートを遮光し、４００ｒｐｍで１０分間振盪した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、蛍光強度（励起：３２１ｎｍ／発光：４４７ｎｍ）を測定した。各ＬＮＰにおける蛍光強度の最大値を１００％、最小値を０％として、相対蛍光強度を百分率で算出した。また、相対蛍光強度が５０％であるｐＨをＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａとした。各ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
３．結果
　いずれのＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａも、エンドソーム脱出のために好ましいｐＫａ（５．０～７．２）の範囲内であった。また、カチオン性脂質のアミノ基（ジアルキルアミノ基または環状アミノ基）の構造を変更することで、ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａを調整することができた。
［試験例２］ｍＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価
１．マイクロ流路法によるＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
　エッペンドルフチューブにカチオン性脂質の１０ｍＭエタノール溶液、ＤＯＰＣの５ｍＭエタノール溶液、Ｃｈｏｌの１０ｍＭエタノール溶液を総脂質量７２０ｎｍｏｌとなるように目的の割合（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５５：５：４０（モル比））で混合した。得られた混合物に、さらにＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ（２ｍＭエタノール溶液）を、カチオン性脂質、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの総量１００モルに対して１モル程度の量で添加し、次いでエタノールを添加して、脂質のエタノール溶液（全量：３６０μＬ）を調製した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製
　５ｍＬチューブに０．６ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社））の溶液を７．２μｇとなるようにはかり取り、これに、終濃度３０ｍＭのＮａＣｌを含む酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）を加えることで、核酸の酸性バッファー溶液（全量：１０８０μＬ）を調製した。
（３）マイクロ流路を用いたＬＮＰの調製
　核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。超高速ナノ医薬作成装置ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、核酸の酸性バッファー溶液の添加速度：３ｍＬ／ｍｉｎ、脂質のエタノール溶液の添加速度：１ｍＬ／ｍｉｎ、およびシリンジホルダー温度：２５℃の条件にて、ＬＮＰを調製し、１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０００μＬ加えた後、得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で限外濾過を行って、約１００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＰＢＳを用いて４ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で濃縮する操作を計２回行った。得られた濃縮物を、ＰＢＳを用いて脂質濃度が２ｍＭになるよう希釈して、ＬＮＰを含む分散液を得た。
２．ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、ＰｄＩおよびゼータ電位の測定
　上記１．の方法で調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、ＰｄＩ（多分散度、Polydispersity）、およびゼータ電位を、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）により測定した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
３．結果
　いずれのｍＲＮＡ封入ＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０～３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい範囲（－１５～＋１５ｍＶ）であった。
［試験例３］インビトロでのＪｕｒｋａｔ細胞における遺伝子発現の評価
１．ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社））を封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ＝５５：５：４０：１（モル比））を［試験例２］１．に記載の方法で調製した。
２．インビトロでのＪｕｒｋａｔ細胞における遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前に、ヒト白血病Ｔ細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＤ－ルシフェリン入りの培地（ＲＰＭＩ１６４０）２００μＬをディッシュに加えた。前記ディッシュに各ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液４０～１２０μＬ（ｍＲＮＡとして０．４μｇ）を加え、前記ディッシュをインキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を３時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積ルシフェラーゼ発光強度を算出した。結果を図１に示す。なお、図１に記載の「Ｅ＋０ａ’」（ａ’：整数）は「１０ａ’」を表す。例えば「５．０Ｅ＋０５」は「５．０×１０５」を表す。
３．結果
　図１に示すように、実施例１のカチオン性脂質を含むＬＮＰが、優れた遺伝子発現活性を示した。よって、実施例１のカチオン性脂質を含むＬＮＰは、ｍＲＮＡの発現を促進し得るＬＮＰとして有益であることが明らかとなった。
［試験例４］インビボにおける遺伝子発現の評価
１．ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社））を封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ＝５５：５：４０：１（モル比））を［試験例２］１．に記載の方法で調製した。
２．インビボにおける遺伝子発現の評価
　Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄、５週齢）の尾静脈から、調製した各ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液を投与した。ｍＲＮＡの投与量をマウスの体重１ｋｇあたり０．０５ｍｇとし、ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液の投与量をマウスの体重１ｇあたり１０μＬとした。ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液の投与から４．５時間後、マウスの腹腔へＤ－ルシフェリンカリウムのＰＢＳ溶液を投与した。Ｄ－ルシフェリンカリウムの投与量をマウス一匹あたり３ｍｇとし、Ｄ－ルシフェリンカリウムのＰＢＳ溶液の投与量をマウス一匹あたり２００μＬとした。Ｄ－ルシフェリンカリウムのＰＢＳ溶液を投与してから１５分後にマウスを安楽死させ、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺を摘出した。各臓器における発光をＩｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）を用いて露光１０ｓｅｃで定量した。各臓器における発光量は、ＩＶＩＳ付属のＬｉｖｅ　Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアを用いた画像解析により定量した。取得した画像から発光量（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ）を算出し、これを遺伝子発現活性の指標とした。結果を図２に示す。なお、図２に示す各実施例の棒グラフは、左から順に肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺の結果を示す。また、図２に記載の「Ｅ＋０ａ’」（ａ’：整数）は「１０ａ’」を表す。例えば「１．０Ｅ＋０２」は「１．０×１０２」を表す。
３．結果
　図２に示すように、実施例１のカチオン性脂質を含むＬＮＰが、肝臓および脾臓において優れた遺伝子発現活性を示した。よって、実施例１のカチオン性脂質を含むＬＮＰは、ｍＲＮＡの発現を促進し得るＬＮＰとして有益であることが明らかとなった。
［試験例５］インビトロでのＨｅＬａ細胞における遺伝子発現の評価
１．ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社））を封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ＝５５：５：４０：１（モル比））を［試験例２］１．に記載の方法で調製した。
２．ＨｅＬａ細胞における遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前にヒト子宮頚がん細胞であるＨｅＬａ細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ－ルシフェリンを含む培養培地（Ｄ－ＭＥＭ）へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、ｍＲＮＡの濃度が８μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液（５０μＬ、ｍＲＮＡ：０．４μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を１時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積ルシフェラーゼ発光強度を算出した。結果を図３に示す。なお、図３に記載の「Ｅ＋０ａ’」（ａ’：整数）は「１０ａ’」を表す。例えば「１．０Ｅ＋０６」は「１．０×１０６」を表す。
３．結果
　図３に示すように、実施例１のカチオン性を含むＬＮＰは、優れた遺伝子発現活性を示した。よって、実施例１のカチオン性脂質を含むＬＮＰは、ｍＲＮＡの発現を促進し得るＬＮＰとして有益であることが明らかとなった。
　本発明のカチオン性脂質は、核酸医薬、遺伝子治療、生化学実験等に有用である。
　本願は、日本で出願された特願２０２０－０５７３８３号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。

Claims (13)

  1. 　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｌ１ａおよびＬ１ｂは、それぞれ独立してアミド結合、カーバメート結合またはウレア結合を表し、
    　Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基または炭素数が８以下のオキシジアルキレン基を表し、
    　ｋａおよびｋｂは、それぞれ独立して０または１を表し、
    　ＸａおよびＸｂは、それぞれ独立してジアルキルアミノ基（前記二つのアルキル基の炭素数は、それぞれ独立して１～５である）、または３～６員の環状アミノ基を表し、
    　Ｌ４ａおよびＬ４ｂは、それぞれ独立してエステル結合またはアミド結合を表し、
    　Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、それぞれ独立して炭素数が８以下のアルキレン基または炭素数が８以下のオキシジアルキレン基を表し、
    　Ｌ２ａおよびＬ２ｂは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ｍａおよびｍｂは、それぞれ独立して０または１を表し、
    　Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、それぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、且つヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
    　Ｌ３ａおよびＬ３ｂは、それぞれ独立してエステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ｎａおよびｎｂは、それぞれ独立して０または１を表し、
    　Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、それぞれ独立して炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基、またはＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－を表し、
    　Ｒ５は、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基または水酸基を有するステロール誘導体の残基を表し、並びに
    　ｐは、２または３を表す。）
    で表されるカチオン性脂質。
  2. 　ｎａおよびｎｂが、共に１である請求項１に記載のカチオン性脂質。
  3. 　Ｒ３ａおよびＲ３ｂが、それぞれ独立して式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　＊は、Ｌ３ａまたはＬ３ｂとの結合位置を表し、
    　＊＊は、Ｌ２ａ、Ｌ２ｂ 、Ｌ４ａまたはＬ４ｂとの結合位置を表し、
    　ｓは、０～３の整数を表し、
    　ｔは、０～３の整数を表し、
    　ｕは、０～４の整数を表し、および
    　ｕ個のＲ６は、それぞれ独立して置換基を表す。）
    で表される基である請求項１または２に記載のカチオン性脂質。
  4. 　ｓが０である請求項３に記載のカチオン性脂質。
  5. 　ｋａおよびｋｂが、共に０である請求項１～４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  6. 　ｋａおよびｋｂが、共に１である請求項１～４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  7. 　Ｒ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基である請求項１～６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  8. 　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、それぞれ独立して炭素数が１２～２２の脂肪族炭化水素基である請求項１～６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  9. 　Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、それぞれ独立してＲ５－ＣＯ－（ＣＨ２）ｐ－であり、並びにＲ５が、水酸基を有する脂溶性ビタミンの残基である請求項１～６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、または請求項１０に記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
  12. 　生体外において、核酸を内封した請求項１１に記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
  13. 　核酸を内封した請求項１１に記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
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