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WO2021172315A1 - Ｌａｍｃ２－ｎｒ６ａ１スプライシングバリアント及びその翻訳産物 - Google Patents

Ｌａｍｃ２－ｎｒ６ａ１スプライシングバリアント及びその翻訳産物 Download PDF

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WO2021172315A1
WO2021172315A1 PCT/JP2021/006747 JP2021006747W WO2021172315A1 WO 2021172315 A1 WO2021172315 A1 WO 2021172315A1 JP 2021006747 W JP2021006747 W JP 2021006747W WO 2021172315 A1 WO2021172315 A1 WO 2021172315A1
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WO
WIPO (PCT)
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cancer
disease
peptide
nucleic acid
splicing variant
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/006747
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English (en)
French (fr)
Inventor
直彦 越川
元治 清木
大輔 星野
Original Assignee
国立大学法人東京大学
地方独立行政法人 神奈川県立病院機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US17/798,241 priority patent/US20230340580A1/en
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    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases

Definitions

  • the present invention broadly provides novel LAMC2-NR6A1 splicing variants and translations thereof, as well as various uses using them.
  • Intractable cancer diseases often lead to death of patients, and one of the main factors is the difficulty in diagnosing and detecting micrometastases.
  • Lack of effective diagnostic methods for cancer infiltration and metastasis not only makes it difficult to cure cancer diseases, but also greatly affects the quality of life (QOL) of patients.
  • QOL quality of life
  • 20-30% of patients with stage II colorectal cancer do not detect metastases at diagnosis, and distant metastases are found after surgical treatment is selected.
  • the cancer patient will be treated for distant metastatic cancer again after the operation, which increases the physical and financial burden.
  • the establishment of an effective infiltration / metastatic evaluation method at the time of diagnosis of cancer disease is required not only for the establishment of a treatment method for intractable cancer in the future but also for the current clinical requirements. It is a thing.
  • Laminin is a group of heterotrimeric proteins found in the basement membrane and forms part of the basement membrane. These proteins are classified on the basis of three non-identical polypeptides that combine with each other to form a laminin structure. These three polypeptides are identified as alpha ( ⁇ ), beta ( ⁇ ) and gamma ( ⁇ ) chains, each of which has several molecular species (eg, ⁇ 1- ⁇ 5, ⁇ 1- ⁇ 3 and ⁇ 1- ⁇ 2). ).
  • Laminin 332 also referred to as laminin 5 or LN5
  • LN5 is known to be abundant in the basement membrane, which is present in the basal lamina and is located between epithelial cells and the connective tissue that lines the epithelial cells.
  • laminin 332 is unique among known laminins in that it is the only laminin having a structure containing a gamma-2 ( ⁇ 2) chain that forms laminin 332 when combined with the ⁇ 3 and ⁇ 3 chains.
  • laminin 332 is produced by epithelial cells and can promote cell adhesion, proliferation, differentiation and / or migration.
  • laminin 332 is secreted from epithelial cells, it is susceptible to protease degradation (eg, by membrane type 1 matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP)).
  • MT1-MMP membrane type 1 matrix metalloproteinase-1
  • laminin 332 is processed towards the N-terminus of the gamma-2 chain sequence to produce fragments with epidermal growth factor (EGF) -like activity, including promotion of cell migration and infiltration (Koshikawa). Et al., J. Cell Biol. (2000) 148: 615-624).
  • EGF epidermal growth factor
  • WO 2014/027701 is a method of providing a diagnosis, prognosis or risk classification for subjects with or at risk of having cancer, Laminin Gamma-2 in Samples Derived from Subjects.
  • a step of comparing the monomer concentration with the reference laminin gamma-2 monomer concentration value, where the laminin gamma-2 monomer concentration in the sample is higher than the reference laminin gamma-2 monomer concentration value causes the subject to have cancer or Methods for identifying an increased risk of developing cancer have been disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-209281 discloses a test method and a test kit for urological cancer, which comprises measuring a laminin ⁇ 2 single chain in urine collected from a subject.
  • the present invention is a splicing variant produced via alternative splicing after a part of the sense strand of the laminin ⁇ 2 (LAMC2) gene and a part of the antisense strand of the NR6A1 gene are bound, and a translation product of these splicing variants.
  • LAMC2 laminin ⁇ 2
  • NR6A1 NR6A1
  • exon 12 of the laminin ⁇ 2 (LAMC2) gene and intron 1 of the antisense strand of the NR6A1 gene, which is a kind of nuclear receptor, are bound to each other, and then a new gene is generated by alternative splicing.
  • the novel gene and its translation product are expressed in various cancer cells, and the present invention has been completed.
  • the LAMC2 gene and the NR6A1 gene linked at the genomic level are referred to as "LAMC2-NR6A1 gene" (SEQ ID NO: 1) (also referred to as “LAMC2 fusion gene”), and the splicing variant thereof is referred to as "LAMC2-”. It is called "NR6A1 splicing variant".
  • the translation product of the LAMC2-NR6A1 splicing variant is also referred to as a LAMC2 fusion protein or an Ln- ⁇ 2 fusion protein.
  • Such a splicing variant can also be expressed as a splicing variant derived from exon 12 of the laminin ⁇ 2 (LAMC2) gene and intron 1 of the antisense strand of the NR6A1 gene. Up to cytosine at position 1857 of SEQ ID NO: 1 is derived from the LAMC2 gene, and after adenine at position 1858, it is derived from the antisense strand intron 1 of the NR6A1 gene.
  • LAMC2 laminin ⁇ 2
  • LAMC2-NR6A1 splicing variants the one having a short base sequence of 2544 bases (SEQ ID NO: 2) is called the LAMC2-NR6A1 splicing variant of "SHORT FORM" (hereinafter, also referred to as “Ln- ⁇ 2F") and has 2651 bases (hereinafter, also referred to as “Ln- ⁇ 2F”).
  • the long sequence number 6) is called the LAMC2-NR6A1 splicing variant of "LONG FORM”.
  • CMFCNSRMDGNLA novel peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 contained in SHORT FORM is referred to as "LAMC2-NR6A1 peptide”.
  • LAMC2-NR6A1 splicing variants there are many other LAMC2-NR6A1 splicing variants, and SHORT FORM and LONG FORM are only some examples. Since the splicing client is considered to be involved in the activation of the RAS / MAPK / ERK pathway as well as PI3K and Akt downstream of the EGF receptor signaling pathway, it is considered to be involved in the activation of the EGF receptor in the state of a fusion gene. It is expected to bind and activate its downstream.
  • the ligand domain of the EGF receptor is excised with a protease and exhibits ligand activity, but since the fusion gene product exhibits ligand activity in the expressed form as it is, RSK downstream of ERK etc. It is also considered to contribute to activity control.
  • the splicing variant has the sequence of SEQ ID NO: 2, for example, the sequence shown at positions 1919 to 2544 of SEQ ID NO: 2, particularly the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the translation product thereof Those with EGF receptor ligand activity, namely PI3K and Akt downstream of the EGF receptor signaling pathway, and / or ERK downstream of the RAS / MAPK / ERK signaling pathway, and optionally further downstream RSK. Anything that activates expression and / or phosphorylation may be used.
  • [1] A splicing variant derived from exon 12 of the laminin ⁇ 2 (LAMC2) gene and intron 1 of the antisense strand of the NR6A1 gene.
  • the following peptides (a), (b) or (c): (A) Peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • (B) A peptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having an activity of enhancing the activity of the EGF receptor and its downstream signal pathway.
  • [6] A nucleic acid encoding the peptide according to [5] or a nucleic acid complementary thereto.
  • [7] A composition containing a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the peptide according to [5] or the nucleic acid according to [6].
  • [8] The composition according to [7], wherein the compound is an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or a nucleic acid.
  • the nucleic acid is siRNA that cleaves mRNA.
  • [15] A model animal transformed with the splicing variant according to any one of [1] to [3] or the nucleic acid according to [6].
  • [16] An antibody or antigen binding thereof that binds to the translation product of the splicing variant according to any one of [1] to [3] or the peptide according to [5] and does not bind to wild-type laminin ⁇ 2 (LAMC2). piece.
  • a pair of oligonucleotide primers comprising a sense primer and an antisense primer for detecting or amplifying a nucleic acid encoding the peptide according to [5].
  • [18] A nucleic acid having an activity of binding to an mRNA encoding the peptide according to [5] and inhibiting translation of the mRNA into a protein.
  • [20] A vector containing the nucleic acid according to [18] or [19].
  • [21] Recombinant cells containing the vector according to [20].
  • [22] A method for treating or preventing a disease related to the activity of an EGF receptor and its downstream signal pathway in a subject, and a compound that inhibits the expression of the peptide according to [5] or the nucleic acid according to [6]. Or a method comprising administering a salt thereof to a subject.
  • the biomarker according to [24] for diagnosing a disease associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathway.
  • the disease is cancer, and the biomarker is a tumor marker for diagnosing the susceptibility to cancer, the presence or absence of cancer, or the presence or absence of cancer progression, [25] or The biomarker according to [26].
  • [28] A method for detecting a biomarker of a disease related to the activity of the EGF receptor and its downstream signal pathway, wherein in a sample derived from a subject, the following (a) to (e): (A) The splicing variant according to any one of [1] to [3], preferably the splicing variant having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 6; (B) A protein encoded by the splicing variant according to any one of [1] to [3], preferably the splicing variant having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 6; (C) Peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (D) Nucleic acid encoding the peptide of (c) or a nucleic acid complementary thereto; (E) Antibodies to the protein of (b) or the peptide of (c); A method that includes one of the following.
  • [32] A method for diagnosing a disease related to the activity of the EGF receptor and its downstream signal pathway in the subject, wherein in the subject, the following (a) to (e): (A) The splicing variant according to any one of [1] to [3], preferably the splicing variant having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 6; (B) A protein encoded by the splicing variant according to any one of [1] to [3], preferably the splicing variant having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 6; (C) Peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (D) Nucleic acid encoding the peptide of (c) or a nucleic acid complementary thereto; (E) Antibodies to the protein of (b) or the peptide of (c); A method comprising the step of detecting a biomarker of a disease associated with the activity of an EGF receptor and its downstream signaling pathway, including any of the above.
  • [36] A method for screening a drug for treating or preventing a disease associated with the activity of an EGF receptor and its downstream signaling pathway, the peptide according to [5] or the nucleic acid according to [6].
  • a method comprising the step of selecting a substance that inhibits the expression of the drug as the drug.
  • the disease is cancer, obesity, autoimmune disorder, inflammation, heart disease, neurodegenerative disease or diabetes.
  • the LAMC2-NR6A1 splicing variant of the present invention and its translation products, particularly the LAMC2-NR6A1 peptide are novel ones specifically detected in cancer cells, they are expected to be used for various purposes. For example, by constructing a detection system for a LAMC2-NR6A1 splicing variant or a translation product thereof, cancer can also be detected.
  • a detection system that theoretically does not have a non-specific reaction can be obtained by using a system that can detect this amino acid sequence specifically. ..
  • the LAMC2-NR6A1 splicing variant since the LAMC2-NR6A1 splicing variant is considered to control the motility of cancer cells, it can also be used as a marker for predicting the malignancy of cancer. Furthermore, substances that inhibit the expression of the LAMC2-NR6A1 splicing variant are expected to have the effect of suppressing cancer infiltration and metastasis.
  • FIG. 1 shows the results of confirming chromosomal-level gene binding in Skov3 cells by the FISH method.
  • the red signal eg, the signal shown in FIG. 1a
  • the green signal eg, the signal shown in FIG. 1b
  • the yellow signal indicates that LAMC2 and NR6A1 are bound.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing how the sense strand of the LAMC2 gene and the antisense strand of the NR6A1 gene bind at the genomic level.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating how alternative splicing occurs at the mRNA level after binding of the LAMC2 gene and the NR6A1 gene to generate splicing variants of SHORT FORM and LONG FORM.
  • FIG. 4 shows the results of PCR examination of the expression distribution of LAMC2-NR6A1 splicing variants of LONG FORM and SHORT FORM in normal cells. From this result, it can be seen that the LAMC2-NR6A1 splicing variants of LONG FORM and SHORT FORM are not expressed in normal cells.
  • FIG. 5 shows the results of detecting the expression of LAMC2-NR6A1 splicing variants of LONG FORM and SHORT FORM in clinical specimens derived from cancer patients.
  • the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was 19 out of 20 ovarian cancer samples and 19 breast cancer samples. It was detected in 13 of the samples and 11 of 16 in colorectal cancer. On the other hand, the LONG FORM splicing variant was detected in 12 out of 20 samples of ovarian cancer.
  • FIG. 6 shows the functional analysis results of Ln- ⁇ 2F in the ovarian cancer cell line Ovcar8 introduced with Ln- ⁇ 2F (LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM) and the ovarian cancer cell Skov3 expressing Ln- ⁇ 2F.
  • FIG. 7 shows anti-ERK antibody, anti-phosphorylated ERK antibody, anti-Akt antibody, anti-phosphorylated Akt antibody, anti-EGFR antibody and anti-phosphorylated EGFR antibody to examine the effect of Ln- ⁇ 2F on intracellular signals. The results of Western blotting using the antibody are shown.
  • Ln- ⁇ 2F means a fusion gene product
  • Ln- ⁇ 2m means a laminin ⁇ 2 single chain.
  • FIG. 8 shows the results of microarray analysis of Skov3-scr and Skov3-kd1. Comparing the gene expression patterns of the cells in which Ln- ⁇ 2F expression was suppressed and the control cells by microarray analysis, the expression of the gene cluster controlled by Akt was decreased.
  • FIG. 9 compares the changes in cell proliferation when LAMC2 gene expression was suppressed while Scov3 cells were cultured under nutrient starvation (0.5% FBS) and normal conditions (10% FBS). Shown (scr: control; Kd1, kd2: suppression of Ln- ⁇ 2F expression). 1000 cells were sown and the number of cells after 1, 2 and 3 days was counted.
  • FIG. 10 shows a comparison of changes in cell proliferation when LAMC2 gene expression was forcibly expressed while culturing OVCAR8 cells under nutrient starvation (0.5% FBS) and normal conditions (10% FBS).
  • FIG. 11 shows the results of evaluating the motility of cancer cells in the Boyden chamber (scr: control; KD2, KD1: Ln- ⁇ 2F expression suppression). The vertical axis represents the number of cells that have moved.
  • FIG. 12A shows the results of evaluating the effect of Ln- ⁇ 2F on tumorigenicity in a mouse inoculated with ovarian cancer in the peritoneum (Scr: control; Kd1, kd2: suppression of Ln- ⁇ 2F expression; Kd2- mock: Ln- ⁇ 2F expression suppression + control; Ln- ⁇ 2F: Kd2 + Fusion: Ln- ⁇ 2F expression suppression + Ln- ⁇ 2F).
  • FIG. 12B shows the results of measuring the luminescence intensity of the tumorigenicity in FIG. 12A and graphing it over time.
  • FIG. 13A shows the results of evaluating the tumorigenicity in mice when Ln- ⁇ 2F was expressed in OVCAR8 cells not expressing Ln- ⁇ 2F and transplanted intraperitoneally into mice (Mock: control; Ln-).
  • ⁇ 2F Ln- ⁇ 2F).
  • Cells expressing luciferase were imaged 60 days after transplantation into the abdominal cavity of scid / beige mice.
  • FIG. 13B shows the result of quantifying the emission intensity of FIG. 13A.
  • FIG. 14 is a schematic diagram of translation products of LAMC2 and LAMC2-NR6A1 splicing variants.
  • FIG. 15 illustrates that the Ln- ⁇ 2 fusion protein contributes to the promotion of carcinogenesis by activating the EGF receptor as it is without being processed by MT1-MMP.
  • FIG. 16 shows the sequence determination results of SHORT FORM and LONG FORM (Ln- ⁇ 2F).
  • FIG. 17 shows the results of immunostaining of tissues recovered 4 weeks after intraperitoneal injection of OVCAR8 cells (Mock) and Ln- ⁇ 2F overexpressing cells into the abdominal cavity of nude mice. Luciferase (green); Phosphorylated AKT (red in FIG. 17A); Phosphorylated ERK (red in FIG. 17B); Nucleus (blue) Scale bar: 50 ⁇ m
  • the present embodiment will be described, but the scope of the present invention is not construed as being limited to the following embodiments.
  • the following peptides or salts thereof are provided.
  • B) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 contains an amino acid sequence in which one or several, for example, 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted and / or added, and the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathway.
  • Peptides with enhanced activity (C) A peptide containing an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having an activity of enhancing the activity of the EGF receptor and its downstream signal pathway.
  • the laminin ⁇ 2 single chain (also referred to as “Ln- ⁇ 2m” in the present specification) refers to a ⁇ 2 chain which is a component of laminin 332 expressed as a monomer.
  • Laminin 5 is one of the main constituents of the basement membrane, and is a heterotrimer in which three polypeptide chains of ⁇ 3 chain, ⁇ 3 chain, and ⁇ 2 chain are associated at a coiled coil structure part. Of the three polypeptide chains, the ⁇ 2 chain has been reported to be expressed as a monomer in malignant cancer cells.
  • the ⁇ 2 chain expressed as a trimer in order to distinguish the ⁇ 2 chain expressed as a trimer from the “laminin 332 ⁇ 2 chain”, the ⁇ 2 chain expressed as a monomer is referred to as “laminin ⁇ 2 single chain” or “laminin ⁇ 2 chain”. Called.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added loses the desired function as compared to the amino acid sequence identified by SEQ ID NO: Means a mutant amino acid sequence in which no number of amino acids has been deleted, substituted and / or added.
  • Amino acids may refer to natural and synthetic amino acids, and amino acid analogs and amino acid mimetics that function similarly to natural amino acids.
  • the amino acid may be either an L-amino acid or a D-amino acid.
  • Natural amino acids are amino acids encoded by the genetic code and amino acids modified after translation in the intracellular code.
  • the substitution is preferably a conservative amino acid substitution. This is because if it is a conservative amino acid substitution, it is highly likely that it has a structure or property substantially equivalent to that of the LAMC2-NR6A1 peptide.
  • the laminin ⁇ 2 (Ln- ⁇ 2) chain translated from LAMC2 is produced as a single chain or as laminin 332 associated with the laminin ⁇ 3 and ⁇ 3 chains.
  • MT1-MMP excises the laminin EGF-like domain (domain III) in the short arm of these Ln- ⁇ 2 chains to release the fragment containing domain III having the ligand activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR). (Fig. 14 top), it is thought that it contributes to the motility of cancer cells and the enhancement of survival signals through activation of ErbB receptors (Fig. 15).
  • processing by MT1-MMP is essential.
  • the Ln- ⁇ 2 fusion protein which is a translation product of LAMC2-NR6A1 does not require the processing of MT1-MMP and contributes to the promotion of carcinogenesis by activating the EGF receptor as it is (Fig. 14, bottom).
  • the Ln- ⁇ 2 fusion protein which is a translation product of LAMC2-NR6A1 does not require processing by protease and can efficiently activate the ErbB receptor.
  • splicing variants with the LAMC2-NR6A1 peptide directly activate the epidermal growth factor receptor (EGFR) without processing MT1-MMP and signal downstream thereof. It has an activity that enhances the activity of the pathway, and it is considered that these enhancements are involved in cancer.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the PI3K-Akt pathway begins with the phosphorylation activity of PI3K and inhibits cell survival and induction of apoptosis through phosphorylation of Akt. That is, Akt expression and / or phosphorylation is associated with cancer.
  • the PI3K-Akt pathway has been confirmed to be constitutively hyperactive in many tumors. Akt is also known to be associated with diseases other than cancer, such as obesity, autoimmune disorders, inflammation, or diabetes.
  • the MAPK / ERK pathway begins with phosphorylation activation of RAS and induces cell proliferation through phosphorylation of Raf, MEK, and ERK. That is, expression and / or phosphorylation of the Ras-ERK pathway is associated with cancer. In fact, the Ras-ERK pathway plays an important role in promoting pathway cell proliferation in many tumors and is therefore considered to be involved in carcinogenesis. In addition, it has been confirmed that the function of ERK is constitutively enhanced in cancer cells. ERK is also known to be associated with diseases other than cancer, such as heart disease and neurodegenerative diseases associated with cardiomyocyte hypertrophy. Since the LAMC2-NR6A1 peptide is expressed in various cancer cells, it is expected to be applied to various cancer-related applications regardless of its mechanism of action.
  • the LAMC2-NR6A1 peptide can be obtained by artificial conventional methods in the technical field such as chemical synthesis and recombinant DNA technology.
  • the LAMC2-NR6A1 peptide is prepared by binding an amino acid to a solid-phase carrier insoluble in a reaction solvent according to the solid-phase method, sequentially performing a condensation reaction with this amino acid, and extending the peptide chain. Can be done.
  • nucleic Acid in the second aspect, a nucleic acid encoding the amino acid sequence of the LAMC2-NR6A1 peptide or a nucleic acid complementary thereto is provided.
  • the method for obtaining the nucleic acid is not particularly limited.
  • an appropriate probe or library is prepared based on the information on the base sequence of the nucleic acid corresponding to the amino acid sequence disclosed in the present specification, and a cDNA library is prepared using them. It can be obtained by screening rallies and genomic DNA libraries. For example, it can be produced by selecting a desired clone from a genomic DNA library using an appropriate probe or the like specific to the desired gene. Separation of total RNA from cell lines, separation and purification of mRNA, acquisition of genomic DNA and cloning thereof, etc. can all be carried out according to a conventional method.
  • DNA or the like chemically synthesized based on the information on the base sequence of the desired nucleic acid can be generally used.
  • a sense primer and an antisense primer set based on the nucleotide sequence information of the nucleic acid can be used as a screening probe.
  • sense primers and antisense primers designed to sandwich the region encoding the LAMC2-NR6A1 peptide are preferably used.
  • Examples of such a pair of oligonucleotide primers include the primers set forth in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
  • a DNA amplification method by PCR can be preferably used. Isolation and purification of the amplified DNA fragment can be performed according to a conventional method. For example, gel electrophoresis and the like can be mentioned.
  • the base sequence of the nucleic acid obtained according to the above method can be determined according to a conventional method such as the Dideoxy method or the Maxam-Gilbert method.
  • Nucleic acid is also a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of a base sequence specified by a corresponding SEQ ID NO: or a base sequence complementary thereto under highly stringent conditions and encodes a peptide having the same activity as the nucleic acid. Include.
  • the "high stringent condition” means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • the high stringent condition is described in a condition in which nucleic acids having high identity hybridize with each other and nucleic acids with lower identity do not hybridize with each other, for example, Molecular cloning a Laboratory manual 2nd edition (Sambrook et al., 1989). Conditions can be mentioned. Specifically, it hybridizes at 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, which is a washing condition in normal Southern hybridization, at a corresponding salt concentration. Conditions for soaking can be mentioned.
  • the splicing variant LAMC2-NR6A1 gene is a combination of the sense strand of LAMC2 and the antisense strand of NR6A1, its translation product contains the amino acid sequence encoded by the sense strand of LAMC2, but the sense strand of the NR6A1 gene. Does not contain the amino acid sequence encoded by.
  • alternative splicing ultimately produces mature mRNA (FIGS. 2 and 3).
  • the transcript of the LAMC2-NR6A1 gene may contain multiple alternative splicing variants encoding different isoforms, such as those with 2544 bases (SEQ ID NO: 2), those with 2651 bases (SEQ ID NO: 6), and the like. Exists.
  • the splicing variant has the sequence of SEQ ID NO: 2, for example, the sequence shown at positions 1919 to 2544 of SEQ ID NO: 2, particularly the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the translation product thereof is an EGF receptor.
  • SEQ ID NO: 2 for example, the sequence shown at positions 1919 to 2544 of SEQ ID NO: 2, particularly the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the translation product thereof is an EGF receptor.
  • Those having body ligand activity that is, those that activate PI3K and Akt downstream of the EGF signal transduction pathway are preferable.
  • splicing variant refers to mature mRNA as an alternative splicing product of a gene.
  • the protein translated from mRNA has a sequence derived from laminin ⁇ 2 (up to isoleucine at position 618 of SEQ ID NO: 3) at the N-terminal, and a peptide sequence read from NR6A1-derived mRNA is added to the C-terminal.
  • the amino acid sequence added to the C-terminal changes depending on the difference in the splicing site, and a typical example is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CMFCNSRMDGNLA).
  • a vector containing a nucleic acid encoding a LAMC2-NR6A1 peptide or a nucleic acid complementary thereto, a recombinant cell containing the vector, and a model animal transformed with the nucleic acid are provided.
  • the nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 4 and other desired nucleic acids may all be contained in one expression vector, or may be divided into two or more groups. , Each may be configured to be included in a separate expression vector.
  • the nucleic acid can be inserted between the promoter and the terminator.
  • the vector also contains selectable marker genes for selection of transformed cells (genes that confer resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinosricin, genes that complement auxotrophic mutations, etc.). It can also be further contained.
  • the vector may be a plasmid or a viral vector as an expression vector.
  • the vectors include adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindbis virus, Sendaivirus, Epstein. It may be a virus vector such as bar virus.
  • Model animals can be used to study diseases associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways, such as the development, treatment or prevention of cancer.
  • Model animals include non-human primates (eg monkeys such as cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) and other mammals such as cows, pigs, camels, llamas, horses, goats, rabbits, sheep, hamsters, guinea pigs and cats. , Dogs, rats and mice), any vertebrate is intended.
  • the desired gene is introduced into the fertilized egg or early embryo, and the fertilized egg or early embryo into which the gene is introduced is introduced into the foster mother of the animal. It may be transplanted into the uterus and developed.
  • the homozygous transformation model animal uses pluripotent stem cells such as ES cells (embryonic stem cells) and iPS cells (induced pluripotent stem cells) into which the desired gene has been introduced into early embryos such as blastocysts. It can also be produced by inserting into a chimeric animal, transplanting the chimeric embryo obtained thereby into the uterus of a foster parent, and mating the chimeric animal obtained by developing the embryo.
  • compositions comprising a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the peptide or nucleic acid.
  • a compound may be an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or a nucleic acid.
  • antibody means an antibody molecule capable of immunospecifically binding to a desired antigen or the like. Antibodies include anti-serum, polyclonal antibody, monoclonal antibody, chimeric antibody, human antibody, humanized antibody, recombinant antibody, single-stranded Fvs (“scFv”), single-stranded antibody, single domain antibody, F (ab). ) Fragments, F (ab') fragments, disulfide-linked Fvs (“sdFv”), anti-idiotype antibodies and functionally active epitope-binding fragments of any of the above.
  • antigen-binding fragment refers to any fragment of an antibody that retains the ability to immunospecifically bind to a target peptide or the like.
  • Antigen-binding fragments include single-chain antibodies, Fab fragments, F (ab') 2 fragments, disulfide bond Fvs, light chain variable regions (VL) that specifically bind to target peptides, and heavy chain variable regions (VH). Fragments containing complementarity determining regions (CDRs) and the like are included.
  • the antibody-binding fragment can be obtained by a method known in the art.
  • the LAMC2-NR6A1 peptide or nucleic acid has an activity of enhancing the activity of the EGF receptor and its downstream signal pathway
  • the compound that inhibits the activity is associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signal pathway. It can be suitably used for the treatment or prevention of diseases such as cancer, obesity, autoimmune disorder, inflammation, heart disease, particularly heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegenerative disease or diabetes.
  • the compound having such activity may be, for example, an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an antisense drug such as siRNA or ribozyme.
  • any antisense nucleic acid can be used as long as it binds to the mRNA encoding the target peptide and has an activity of inhibiting the translation of the mRNA into a protein.
  • the antisense nucleic acid siRNA that cleaves mRNA or a nucleic acid that is transcribed into siRNA or a precursor thereof in the cell can also be preferably used.
  • SiRNA is usually a double-stranded RNA of about 19 to 30 bases, for example, about 21 to 25 bases, and in general, one of them has a base sequence complementary to a part of the target mRNA, and the other is complementary to this. However, it does not have to be completely complementary to the target mRNA.
  • the expression inhibition method using siRNA is a sequence-specific gene expression suppression mechanism induced by a double-stranded nucleic acid.
  • SiRNA also has high target specificity and is highly safe because it is a method that utilizes a gene expression suppression mechanism that originally exists in the living body.
  • siRNA is a double-stranded RNA with 21 base pairs, and the 3'portion of each RNA strand is a 2-base overhang.
  • SiRNA is produced by cutting out hairpin RNA (SHRNA) or longer double-stranded RNA by a Dicer.
  • SHRNA hairpin RNA
  • the shRNA or long double-stranded RNA before being cleaved by the Dicer can be suitably used in the present invention as a precursor of siRNA.
  • the siRNA can be designed according to a known method based on the base sequence of the target mRNA. Further, the siRNA may be a double-stranded RNA or a DNA-RNA chimeric double-stranded nucleic acid as long as it has an RNAi effect on the target mRNA, and is subjected to an artificial nucleic acid or various modifications. It may be nucleic acid.
  • compositions are broad and include diseases associated with the activity of EGF receptors and their downstream signaling pathways, such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegenerative diseases or It can be suitably used for the treatment or prevention of diabetes.
  • the composition is used for such pharmaceutical uses, particularly for the treatment or prevention of cancer, for example, suppression of cancer cell growth, suppression of cell canceration, suppression of cancer cell malignancy, or cancer invasion.
  • Can can be used to suppress metastasis or recurrence.
  • cancer is used in its broadest sense.
  • Cancers include, for example, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer (excluding colon cancer), anal cancer, rectal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, lung cancer, etc.
  • compositions suitable for oral administration include, for example, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, syrups, emulsions, suspensions, liquids and the like.
  • Compositions suitable for parenteral administration include, for example, injections for intravenous administration, intramuscular administration, or subcutaneous administration, drip agents, suppositories, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, nasal drops, and ear drops. Agents, eye drops, inhalants and the like can be mentioned. It is also intended that a preparation prepared as a pharmaceutical composition in the form of a dry powder such as a lyophilized product is dissolved at the time of use and used as an injection or an infusion.
  • the composition may include solid or liquid pharmaceutical additives.
  • the additive for preparation may be either an organic substance or an inorganic substance.
  • an excipient is added to a substance selected from the group consisting of the above compounds or salts thereof, which are active ingredients, and hydrates thereof and solvates thereof.
  • a binder, a disintegrant, a lubricant, a colorant, a flavoring agent, etc. are added, and then a preparation in the form of a tablet, a coated tablet, a granule, a powder, a capsule, etc. is prepared by a conventional method. be able to.
  • excipients include lactose, sucrose, sucrose, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbitol, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate, silicon dioxide and the like.
  • binder include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragant, gelatin, shelac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, dextrin, pectin and the like.
  • the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hardened spot oil.
  • any one that is approved to be added to a pharmaceutical product can be used.
  • the flavoring agent cocoa powder, mint brain, aromatic acid, mentha oil, borneol, cinnamon powder and the like can be used. Tablets and granules can be sugar-coated, gelatin-coated, or otherwise coated as appropriate. In addition, preservatives, antioxidants and the like may be added as needed.
  • liquid preparations for oral administration such as emulsions, syrups, suspensions, or liquids
  • inert diluents such as water or vegetable oils
  • auxiliary agents such as wetting agents, suspension aids, sweeteners, fragrances, colorants, preservatives and the like can be added to the liquid preparation.
  • After preparing the liquid preparation it may be filled in a capsule such as gelatin.
  • Examples of the solvent or suspension used in the production of pharmaceutical compositions for parenteral administration, such as injections or suppositories, include water, propylene glycol, polyethylene glycol, benzyl alcohol, ethyl oleate, lecithin and the like. Can be mentioned.
  • Examples of the base used in the production of suppositories include cocoa butter, emulsified cocoa butter, lauric acid and the like.
  • the method for preparing the pharmaceutical product is not particularly limited, and any method widely used in the art can be used.
  • a carrier for example, a diluent such as water, ethyl alcohol, propylene glycol; a pH regulator or buffer such as sodium citrate, sodium acetate, or sodium phosphate.
  • Stabilizers such as ethylenediamine tetraacetic acid, thioglycolic acid, and thiolactic acid can be used. Sufficient amounts of salt, glucose, mannitol, glycerin, etc. may be added to the composition to prepare an isotonic solution, and solubilizers, soothing agents, local anesthetics, etc. may be added. You can also do it.
  • a pharmaceutical composition in the form of an ointment for example a paste, cream, or gel
  • bases for example, white petrolatum, polyethylene, paraffin, glycerin, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicon, bentonite and the like
  • preservative for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate and the like can be used.
  • the ointment, cream, gel, paste or the like can be applied to the surface of a normal support by a conventional method.
  • a woven fabric or non-woven fabric made of cotton or synthetic fibers a film such as soft vinyl chloride, polyethylene, or polyurethane, or a foam sheet can be preferably used.
  • the amount of the active ingredient in the composition is not particularly limited as long as it can be used for a desired purpose, and can be appropriately increased or decreased according to the age, weight, gender, purpose of administration, symptoms, etc. of the patient.
  • the above active ingredients are diseases associated with the activity of EGF receptors and their downstream signaling pathways, such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegenerative diseases.
  • diseases associated with the activity of EGF receptors and their downstream signaling pathways such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegenerative diseases.
  • it is administered to the subject in a manner for treating or preventing diabetes.
  • Biomarkers in another embodiment, further provided are diagnostic markers for assessing biomarkers, particularly diseases associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways, such as cancer.
  • the marker detects the expression of the target nucleic acid or its translation product, preferably the peptide of SEQ ID NO: 4, or measures its expression level in the sample derived from the subject, or the target nucleic acid or its translation product in the sample. Whether or not the subject suffers from a disease associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathway, such as cancer, by detecting or measuring the presence of a specific antibody against the peptide of SEQ ID NO: 4, preferably. Used to determine.
  • the term "subject” refers to humans and non-human primates (eg, monkeys such as cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) and other mammals such as cows, pigs, camels, llamas and horses. , Goats, rabbits, sheep, hamsters, guinea pigs, cats, dogs, rats and mice). Depending on the embodiment, the subject may be a human or a non-human animal.
  • non-human primates eg, monkeys such as cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees
  • other mammals such as cows, pigs, camels, llamas and horses. , Goats, rabbits, sheep, hamsters, guinea pigs, cats, dogs, rats and mice.
  • the subject may be a human or a non-human animal.
  • the subject will be presented with diseases associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways, such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegeneration. It may be a patient at risk of developing the disease or diabetes or a patient who has already developed such a disease.
  • diseases associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegeneration. It may be a patient at risk of developing the disease or diabetes or a patient who has already developed such a disease.
  • a biomarker is detected in a sample derived from a subject, it is determined that the patient is susceptible to a disease related to the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathway, has the disease, or has an advanced disease. can do.
  • the biomarker may be a tumor marker used to diagnose the susceptibility to cancer, the presence or absence of cancer, or the presence or absence of cancer progression.
  • sample broadly refers to biological material that is believed to contain a target. Any cell, tissue or body fluid can be utilized to obtain the sample.
  • tissue sections such as biopsy and autopsy samples, frozen sections taken for histological purposes, blood (such as whole blood), plasma, serum, sputum, stool, Tears, mucus, saliva, bronchial alveolar lavage (BAL) fluid, hair, skin, red blood cells, platelets, interstitial fluid, ocular crystal fluid, cerebrospinal fluid, sweat, nasal juice, synovial fluid, underbelly, sheep water, semen, etc.
  • BAL bronchial alveolar lavage
  • Cells and tissues may include lymph, ascites, gynecological fluids, urine, ascitic fluid, cerebrospinal fluid and the like.
  • the target peptide or the like may be isolated or purified from the sample.
  • the detection of the expression of the target peptide or the measurement of the expression level thereof can be carried out by, for example, an immunoassay, an agglutination method, a turbidimetric method, a Western blotting method, a surface plasmon resonance (SPR) method or the like. Immunoassays are particularly simple and preferred.
  • Immunoassays are classified into enzyme immunoassays (EIA or ELISA), radioimmunoassays (RIA), fluorescence immunoassays (FIA), fluorescence polarization immunoassays (FPIA), chemiluminescent immunoassays (CLIA), etc. according to the antibody labeling method. Can be used.
  • the ELISA method peroxidase, an enzyme such as alkaline phosphatase, the RIA method, 125 I, 131 I, 35 S, 3 radioactive substances such as H, in the FPIA method, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine Fluorescent substances such as isothiocyanate and near-infrared fluorescent materials, and in the ELISA method, antibodies labeled with luminescent substances such as luciferase, luciferin, and equolin are used. In addition, antibodies labeled with nanoparticles such as colloidal gold and quantum dots can be detected.
  • the antibody in the immunoassay, can be labeled with biotin, and avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like can be bound and detected.
  • the ELISA method using an enzyme label is preferable because the antigen can be measured easily and quickly.
  • the enzyme substrate used in the ELISA method may be 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), o-phenylenediamine (OPD), or the like.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • TMB 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • NPP p-nitrophenyl phosphate
  • the solid phase carrier is not particularly limited as long as it is a carrier on which an antibody can be immobilized, and examples thereof include microtiter plates made of glass, metal, resin and the like, substrates, beads, nitrocellulose membranes, nylon membranes, PVDF membranes and the like.
  • the target substance can be immobilized on these solid phase carriers according to a known method.
  • the agglutination method is also preferable as a method for easily detecting a trace amount of protein in the above immunoassay.
  • the agglutination method include a latex agglutination method in which latex particles are bound to an antibody.
  • Both monoclonal antibody and polyclonal antibody can be produced according to a known method.
  • Monoclonal antibodies can be obtained, for example, by isolating antibody-producing cells from target-immunized non-human mammals, fusing them with myeloma cells, etc. to prepare hybridomas, and purifying the antibodies produced by these hybridomas. Can be done.
  • polyclonal antibodies can be obtained from the serum of animals immunized with the target.
  • the marker is a gene such as LAMC2-NR6A1 gene or LAMC2-NR6A1 splicing variant
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • RT-PCR Real-Time PCR
  • other known gene mutation testing method can be used.
  • a person skilled in the art can select an appropriate means according to the gene of interest, and for example, the state in which the LAMC2 gene and the NR6A1 gene are bound can be confirmed by the FISH method.
  • the probe used to detect the LAMC2-NR6A1 gene can be prepared from a bacterial artificial chromosome (BAC) clone containing these genes, for example RP11-158D24 and RP11-582A18 can be used.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • the probe signals are detected distantly in the normal case and overlapped in the case of gene binding.
  • the probe that can be used for detecting LAMC2-NR6A1 splicing and the like may have a sequence that specifically recognizes the gene of interest, such as the LAMC2-NR6A1 splicing variant.
  • specifically recognizing means binding to a particular LAMC2-NR6A1 splicing variant, but not to wild-type LAMC2.
  • a method for detecting a biomarker of a disease associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathway is provided.
  • the detection method is as follows (a) to (e): in the sample derived from the subject.
  • LAMC2-NR6A1 splicing variant preferably a splicing variant having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 6
  • B A protein encoded by a LAMC2-NR6A1 splicing variant, preferably a splicing variant having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 6
  • C Peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • D Nucleic acid encoding the peptide of (c) or a nucleic acid complementary thereto
  • E Antibodies to the protein of (b) or the peptide of (c); Including any of.
  • the detection target is not limited to the above (a) to (e), and may be any that can suggest the existence of the LAMC2-NR6A1 splicing variant or its translation product.
  • the detection of the presence of the fusion gene is known to those skilled in the art and can be easily identified by using a next-generation sequencer or the like.
  • the read sequence of genomic DNA obtained from a sample derived from a subject is mapped to the standard sequence of the LAMC2 gene (or NR6A1 gene), and the unmapped portion is the NR6A1 gene (NR6A1 gene). If the mapped sequence is derived from the LAMC2 gene if it is the NR6A1 gene), the subject is determined to have the LAMC2-NR6A1 splicing variant.
  • Detection methods further include diseases associated with the activity of EGF receptors and their downstream signaling pathways, such as cancer, obesity, when biomarkers are detected or present in high concentrations compared to healthy individuals. Determines to be susceptible to disease, autoimmune disorder, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegenerative disease or diabetes, suffering from the disease, or progressing. Further steps may be included. For example, mapping the read sequence of genomic DNA from a sample from a subject suspected of having a disease associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathway to the standard sequence of the LAMC2 gene (or NR6A1 gene).
  • the subject is determined to have a disease associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways. Will be done.
  • the biomarker may be a tumor marker used for diagnosing the susceptibility to cancer, the presence or absence of cancer, or the presence or absence of cancer progression.
  • the process of determining that a disease is predisposed to the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways, is suffering from the disease, or is progressing is assisted by a clinical laboratory technician or medical device. Can be done.
  • Detection methods include diseases associated with the activity of EGF receptors and their downstream signaling pathways, such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegenerative disease or diabetes.
  • the detection method is optional: the step of determining that the subject has cancer, the step of determining the severity of the cancer, the risk of developing the subject's cancer (ie, the onset of the disease).
  • the process of determining the possibility) the process of determining the effectiveness of the cancer treatment regimen, the process of identifying the subject as a candidate for cancer treatment, and the process of assessing the risk of disease progression in subjects with cancer. It may be included.
  • diseases associated with the activity of EGF receptors and their downstream signaling pathways such as cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, especially heart disease associated with myocardial cell hypertrophy, neurodegeneration.
  • a method for screening a drug for treating or preventing a disease or diabetes is provided.
  • the screening method may optionally include a step of selecting as a drug a substance that inhibits the expression of the LAMC2-NR6A1 gene, the LAMC2-NR6A1 splicing variant or a translation product thereof, particularly the peptide of SEQ ID NO: 4.
  • a method is provided that comprises administering to the subject a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the peptide of SEQ ID NO: 4.
  • Diseases associated with the activity of the EGF receptor and its downstream signaling pathways are not particularly limited, and examples thereof include cancer, obesity, autoimmune disorders, inflammation, heart disease, neurodegenerative diseases or diabetes.
  • the probe was prepared using a commercially available BAC clone on the centromere side of LAMC2 and the telomere side of NR6A1 (LAMC2: BAC clone RP11-158D24; NR6A1: BAC clone RP11-582A18, respectively).
  • the probe on the centromere side of LAMC2 was labeled with digoxigenin (red), and the probe on the telomere side of NR6A1 was labeled with biotin (green). These probes were applied to Skov3 cells, sections and probes were simultaneously metamorphosed for 5 minutes on a 70 ° C. hot plate and hybridized overnight at 37 ° C. Hybridized sections were strainency washes at 37 ° C. with 50% formamide / 2 ⁇ SSC and 1 ⁇ SSC. It was counter-stained with (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and mounted with an anti-fading agent.
  • DAPI 4-', 6-diamidino-2-phenylindole
  • the image was captured and the FISH data was analyzed by the LEICA CW-4000 site genetic workstation. 40x and 20x objective lenses were used for imaging. The results are shown in FIG.
  • a novel splicing variant in which the LAMC2 and NR6A1 genes were bound was identified from the ovarian cancer cultured cell line (Skov3) by the RACE-PCR method.
  • the full-length base sequence of SHORT FORM, which is one of the splicing variants of the present invention, and the amino acid sequence encoded by the full-length base sequence are represented as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the sequence determination results of SHORT and LONG are shown in FIG.
  • SEQ ID NO: 3 CMFCNSRMDGNLA * (Note: The underlined part represents a novel peptide due to the binding of LAMC2 and NR6A1, and * represents a stop codon (taa).)
  • the amino acid sequence encoding the LAMC2-NR6A1 peptide was designated as SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence encoding the same (tgcatgtttgtgcaacaggccgggatgggaacttagca) was designated as SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 6 tgctcccataacagcaggacctcaacgtccaagaagaataccacaccttacttgagcccatttacaagtcacctcctgaaaatccaagatgcctgtcagaagcagctactgagggaagtgaagatgtttttattttgttcattgtcattgtgtgaagactgactaaagtcttactgatcaaggagttttgttgaacatggtcagagagctttcaaagtcatttcagaaagttttcaaagtcatttcagaaagttttcaaagtcatttcagaaagttttcaacagatggtttgatggaagtagccag
  • SEQ ID NO: 7 I * (Note: The underlined part represents a novel peptide due to the binding of LAMC2 and NR6A1, and * represents a stop codon (taa).)
  • LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was expressed in normal cells.
  • the human normal tissue cDNA used in this RT-PCR method was purchased from Filgen.
  • positive control cDNA prepared from Skov3 cells was used.
  • the LAMC2 sequence-derived primer was used, and for the detection of the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM, only the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was detected using the LAMC2 sequence-derived primer and the NR6A1 sequence-derived primer.
  • GAPDH was used as an intrinsic control. The primers used are listed below.
  • GAPDH-sense aaggctgagaacgggaagcttgtcatcaat (SEQ ID NO: 8) GAPDH-anti sense ttcccgtctagctcagggatgaccttgccc (SEQ ID NO: 9)
  • LAMC2-WT sense gctacttcggggacccattg (SEQ ID NO: 10) LAMC2-WT anti-sense caagctggacagctgaatgc (SEQ ID NO: 11)
  • LAMC2-NR6A1 sense accagtgcaaagcaggctac (SEQ ID NO: 12) LAMC2-NR6A1 anti-sense tcagggttgctcttgaga (SEQ ID NO: 13)
  • the results are shown in FIG.
  • the LAMC2 wild type was expressed in all tissues.
  • the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was expressed only in Skov3 cells. From this, it was clarified that the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM is cancer cell-specific.
  • RT-PCT was used to investigate whether the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM actually exists in cancer patients.
  • CDNA was prepared from a patient with a predetermined cancer using the tissue at the time of surgery, and the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was detected by the PCR method.
  • the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was detected in 19 out of 20 samples for ovarian cancer, 13 out of 19 samples for breast cancer, and 11 out of 16 samples for colorectal cancer (Fig. 5).
  • LAMC2-NR6A1 splicing variant function of SHORT FORM Analysis of LAMC2-NR6A1 splicing variant function of SHORT FORM.
  • LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM by gene transfer of the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM into the ovarian cancer cell line OVCAR8 that does not express the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM using lentivirus.
  • a cell line that stably expresses the variant was established.
  • the LAMC2 protein was detected at about 150 kDa. It can be estimated from the amino acid sequence that the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM is detected at about 80 kDa. In Ovcar8 cells that did not express the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM, the (mock) endogenous LAMC2 protein was detected at about 150 kDa in the control vector-introduced cell line.
  • the band was increased by about 150 kDa, and in the cell line into which the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was introduced, the band was detected in about 80 kDa (LAMC2-NR6A1).
  • the LAMC2-NR6A1 splicing variant product of shRNA FORM was detected in (scr) about 80 kDa in the control cells.
  • Skov3 is expressed at the mRNA level in both the LAMC2 wild type and the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM, but only the translation product of the LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM was detected at the protein level.
  • LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM affects intracellular signals
  • SKOV-3 cells were subjected to serum starvation under 0.5% serum culture, where the laminin ⁇ 2 single chain (laminin ⁇ 2 single chain ( Ln- ⁇ 2m), LAMC2-NR6A1 splicing variant of SHORT FORM (LAMC2 fusion protein (Ln- ⁇ 2F)) was added to 1.5 ⁇ g / mL, and then anti-ERK antibody, anti-phosphorylated ERK antibody, anti-Akt antibody, The expression and phosphorylation of EGFR, AKT, and ERK in cell lysates were examined using anti-phosphorylated Akt antibody, anti-EGFR antibody and anti-phosphorylated EGFR antibody (manufactured by cell signing).
  • Ln- ⁇ 2F induced phosphorylation of EGFR as well as positive control EGF. It was also revealed that Ln- ⁇ 2F induces phosphorylation of EGFR at a concentration lower than that of Ln- ⁇ 2m. Similarly, Ln- ⁇ 2F confirmed that AKT and ERK of EGFR downstream signals also induced phosphorylation. Therefore, Ln- ⁇ 2F contributes to activation of EGFR and its downstream signals in the same manner as Ln- ⁇ 2m. Western blots were performed using anti-ERK antibody, anti-phosphorylated ERK antibody, anti-Akt antibody, anti-phosphorylated Akt antibody, anti-EGFR antibody and anti-phosphorylated EGFR antibody (manufactured by cell signing).
  • SKOV-3 was cultured under normal serum containing 10% FCS, and cells in which the expression of Ln- ⁇ 2F expressed in SKOV-3 was knocked down (shKD1, shKD2), and mock and Ln- in shKD2 cells.
  • the expression and phosphorylation of EGFR and AKT were examined using cells that had returned ⁇ 2F.
  • FIG. 7B EGFR activity by endogenously produced Ln- ⁇ 2F was observed under serum content, but Ln- ⁇ 2F expression and EGFR phosphorylation disappeared in shKD1 and shKD2 (bottom panel) cells (top panel).
  • Akt and ERK are central to signal transduction networks that affect a wide range, and Akt activation acts as a master switch for these cellular signaling pathways, via a wide range of downstream target and interacting molecules. It is known to cause various intracellular reactions. It has been clarified that the activation of Akt and ERK is also enhanced in many cancer types.
  • Gene expression of Skov3-scr and Skov3-kd1 to investigate whether the activation of Akt and ERK controlled by the LAMC2 fusion protein (Ln- ⁇ 2F) we identified is sufficient to control downstream gene expression. The pattern was examined by the microarray method. The results are shown in FIG. Although various gene expression patterns were different, the expression of genes whose expression was known to be regulated by Akt was particularly decreased.
  • Ln- ⁇ 2F was expressed in OVCAR8 cells that did not express Ln- ⁇ 2F, and this was transplanted into the abdominal cavity of a mouse.
  • the tumorigenicity in the abdominal cavity of the mouse was evaluated, the tumor size and the tumor engraftment ability were remarkably enhanced in the Ln- ⁇ 2F expressing cells. The results are shown in FIG.
  • the effect of the present invention will be described assuming a multi-stage carcinogenesis model.
  • DNA is damaged by carcinogens, UV, etc. in the process of conversion of normal cells into cancer cells as the first stage (initiation).
  • the second step is to maintain and increase the growth of cancer cells converted by (promotional) initiation.
  • (progression) movement, infiltration, and metastatic potential increase and become malignant.
  • Ln- ⁇ 2F affects cell proliferation, cancer cell motility, and tumor engraftment, suggesting that Ln- ⁇ 2F is involved in promotion and progression. Will be done. That is, the function inhibitor (expression inhibition) of Ln- ⁇ 2F is expected to have an anticancer effect not only in the primary lesion (promotion stage) but also in the metastatic lesion (progression).
  • Ln- ⁇ 2F promotes AKT and ERK activation in vivo
  • OVCAR8 cells Mock
  • Ln- ⁇ 2F overexpressing cells were injected intraperitoneally in nude mice. After 4 weeks, the immunostaining result of the recovered tissue is shown in FIG. It was shown that the activation of AKT and ERK in cancer tissues formed in the abdominal cavity by Ln- ⁇ 2F overexpressing cells was enhanced as compared with MOCK. From the above, Ln- ⁇ 2F may contribute to tumorigenicity through proliferation and survival of cancer cells in vivo.
  • Ln- ⁇ 2F is involved in the malignant transformation of cancer and is thought to control the motility of cancer cells in particular, so it can also be used as a marker for predicting the malignancy of cancer. Furthermore, substances that inhibit the expression of Ln- ⁇ 2FF are expected to have the effect of suppressing cancer infiltration and metastasis.

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Abstract

本発明は、ラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）遺伝子のエクソン１２とＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１に由来する、スプライシングバリアント、に関する。

Description

ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント及びその翻訳産物
　本発明は広く、新規ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント及びその翻訳産物、並びにそれらを用いた種々の用途を提供する。
　難治性のがん疾患は、患者を多くの場合で死に至らしめるが、この主な要因の一つとして、微小転移巣の診断・検出の困難さがある。がん浸潤・転移の有効な診断法の欠如は、がん疾患の根治を困難にするだけではなく、患者の生活の質（ＱＯＬ）に大きく影響する。例えば、結腸直腸がんの病期ＩＩ患者の２０－３０％では診断時に転移巣が検出されず、外科的治療法を選択した後に、遠隔転移が発見される。この場合、がん患者は術後に改めて遠隔転移がんの治療を受けることとなるため、身体的・経済的負担が増大する。現状での臨床の場におけるがん治療の実際は、がん疾患の根治を目指しつつも、根治困難ながん患者に対しては、高いＱＯＬを提供する治療法が求められている。従って、がん疾患の診断時における有効な浸潤・転移性の評価法の確立は、将来的な難治性がんの治療法の確立のためのみならず、現在の臨床的要求からも必要とされるものである。
　ラミニンは、基底板中に見られる一群のヘテロ三量体タンパク質であり、基底膜の一部を形成する。これらのタンパク質は、お互いに複合してラミニン構造を形成する３つの非同一ポリペプチドに基づいて分類される。これらの３つのポリペプチドは、アルファ（α）鎖、ベータ（β）鎖及びガンマ（γ）鎖として識別され、それぞれが数種の分子種（例えば、α１－α５、β１－β３及びγ１－γ２）を有する。ラミニン３３２（ラミニン５又はＬＮ５ともいう）は、基底板中に存在し、上皮細胞と上皮細胞を裏打ちする結合組織の間に位置する基底膜において豊富であることが知られている。ラミニン３３２の構造は、α３鎖及びβ３鎖と複合した場合にラミニン３３２を形成するガンマ－２（γ２）鎖を含む構造を有する唯一のラミニンである点で、既知のラミニンの中でも独特である。生理学的に、ラミニン３３２は上皮細胞により産生され、細胞の接着、増殖、分化及び／又は遊走を促進することができることが知られている。例えば、ラミニン３３２が上皮細胞から分泌されるとき、それは（例えば、膜型１マトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＴ１－ＭＭＰ）による）プロテアーゼ分解を受けやすい。ある場合においては、ラミニン３３２は、ガンマ－２鎖配列のＮ末端に向かってプロセシングされて、細胞の遊走及び浸潤の促進を含む上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様活性を有するフラグメントを生成する（Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００）１４８：６１５－６２４頁）。
　血液等の生物学的サンプルにおける増大したラミニンガンマ２モノマーの濃度又はレベルが、がん、結腸直腸がん及び／又は膀胱がんなどと関連していることが知られている。例えば、国際公開第２０１４／０２７７０１号では、がんを有する又はがんを有するリスクのある被験者に、診断、予後又はリスク分類を提供する方法であって、被験者由来のサンプル中のラミニンガンマ－２モノマー濃度を、参照ラミニンガンマ－２モノマー濃度値と比較するステップであり、参照ラミニンガンマ－２モノマー濃度値よりも高い、サンプル中のラミニンガンマ－２モノマー濃度が、被験者を、がんを有する又はがんを発病する増大したリスクを有すると同定する方法が開示されている。また、特開２０１１－２０９２８１号公報では、被験者から採取した尿中のラミニンγ２単鎖を測定することを特徴とする泌尿器科がんの検査方法及び検査用キットが開示されている。
Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、（２０００）１４８：６１５－６２４頁
特表２０１５－５２７５６２号公報 特開２０１１－２０９２８１号公報
　本発明は、ラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）遺伝子のセンス鎖の一部とＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖の一部とが結合した後に、オルタナティブスプライシングを介して生成されるスプライシングバリアント及びこれらのスプライシングバリアントの翻訳産物、特にラミニンγ２単量体由来の新規ペプチド及びその用途を提供することを目的とする。
　本発明者は、ラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）遺伝子のエクソン１２と核内受容体の一種であるＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１とが結合し、その後オルタナティブスプライシングにより新規遺伝子が生成されること、また、同新規遺伝子やその翻訳産物が種々のがん細胞で発現していることを見出し、本発明を完成させるに至った。本明細書においては、ＬＡＭＣ２遺伝子とＮＲ６Ａ１遺伝子とがゲノムレベルで結合したものを「ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子」（配列番号１）（「ＬＡＭＣ２融合遺伝子」ともいう）といい、そのスプライシングバリアントを「ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント」という。ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの翻訳産物をＬＡＭＣ２融合タンパク質又はＬｎ－γ２融合タンパク質ともいう。
　このようなスプライシングバリアントを、ラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）遺伝子のエクソン１２とＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１に由来するスプライシングバリアントと表現することもできる。配列番号１の１８５７位のシトシンまではＬＡＭＣ２遺伝子由来であり、１８５８位のアデニン以降はＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１に由来している。
　ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントのうち、塩基配列が２５４４塩基（配列番号２）と短いものを「ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭ」のＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント（以下、「Ｌｎ－γ２Ｆ」ともいう。）といい、２６５１塩基（配列番号６）の長いものを「ＬＯＮＧ　ＦＯＲＭ」のＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントという。また、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭに含まれる、配列番号４のアミノ酸配列（ＣＭＦＣＮＳＲＭＤＧＮＬＡ）を有する新規ペプチドを「ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチド」という。ただし、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントは他にも多数存在することが想定されており、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭとＬＯＮＧ　ＦＯＲＭは一部の例にすぎない。スプライシングクライアントはＥＧＦ受容体シグナル伝達経路の下流にあるＰＩ３ＫやＡｋｔのみならずＲＡＳ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫの経路の活性化にも関与していると考えられることから、ＥＧＦ受容体に融合遺伝子の状態で結合し、その下流を活性化していることが予想される。すなわち、ラミニンγ２単鎖の場合はＥＧＦ受容体のリガンドドメインがプロテアーゼで切り出されてリガンド活性を示すが、融合遺伝子産物は発現した型そのままの状態でリガンド活性を示すことからＥＲＫ下流のＲＳＫなどの活性制御にも寄与すると考えられる。そのため、スプライシングバリアントは、配列番号２の配列、例えば配列番号２の１９１９位～２５４４位に示される配列、特に配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しており、且つその翻訳産物がＥＧＦ受容体リガンド活性を有するもの、つまりＥＧＦ受容体シグナル伝達経路の下流にあるＰＩ３ＫやＡｋｔ、及び／又はＲＡＳ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の下流にあるＥＲＫ、場合により、更にその下流のＲＳＫの発現及び／又はリン酸化を活性化するものであればよい。
　即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］ラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）遺伝子のエクソン１２とＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１に由来する、スプライシングバリアント。
［２］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド、
をコードする核酸を有する、［１］に記載のスプライシングバリアント。
［３］配列番号２の１９１９位～２５４４位に示される塩基配列を有する、［１］又は［２］に記載のスプライシングバリアント。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアントによりコードされるタンパク質。
［５］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド又はその塩：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド。
［６］［５］に記載のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸。
［７］［５］に記載のペプチド又は［６］に記載の核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を含む、組成物。
［８］前記化合物が抗体又はその抗原結合断片、あるいは核酸である、［７］に記載の組成物。
［９］前記核酸がｍＲＮＡを切断するｓｉＲＮＡである、［８］に記載の組成物。
［１０］ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防するための、［５］に記載のペプチド又は［６］に記載の核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を含む、医薬組成物。
［１１］前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］前記疾患ががんであり、がんの予防又は治療あるいは浸潤、転移又は再発抑制のための、［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント又は［６］に記載の核酸を含むベクター。
［１４］［１３］に記載のベクターを含む組み換え細胞。
［１５］［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント又は［６］に記載の核酸により形質転換されている、モデル動物。
［１６］［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアントの翻訳産物又は［５］に記載のペプチドに結合し、野生型のラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）に結合しない、抗体又はその抗原結合断片。
［１７］［５］に記載のペプチドをコードする核酸を検出又は増幅するための、センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる、一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
［１８］［５］に記載のペプチドをコードするｍＲＮＡに結合し、当該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する活性を有する核酸。
［１９］前記核酸がｍＲＮＡを切断するｓｉＲＮＡである、［１８］に記載の核酸。
［２０］［１８］又は［１９］に記載の核酸を含むベクター。
［２１］［２０］に記載のベクターを含む組み換え細胞。
［２２］被験者におけるＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、［５］に記載のペプチド又は［６］に記載の核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を被験者に投与することを含む、方法。
［２３］前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、［２２］に記載の方法。
［２４］以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
（ｂ）［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
（ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
のいずれかを含むバイオマーカー。
［２５］ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を診断するための、［２４］に記載のバイオマーカー。
［２６］前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、［２５］に記載のバイオマーカー。
［２７］前記疾患ががんであり、前記バイオマーカーががんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するための腫瘍マーカーである、［２５］又は［２６］に記載のバイオマーカー。
［２８］ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患のバイオマーカーを検出する方法であって、被験者由来の試料において、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
（ｂ）［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
（ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
のいずれかを含む、方法。
［２９］前記バイオマーカーが検出されるか、あるいは健常者との比較で高濃度で存在している場合に、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定する工程を更に含む、［２８］に記載の方法。
［３０］前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、［２８］又は［２９］に記載の方法。
［３１］前記疾患ががんであり、前記バイオマーカーががんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するための腫瘍マーカーである、［３０］に記載の方法。
［３２］被験者におけるＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を診断する方法であって、被験者において、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
（ｂ）［１］～［３］のいずれかに記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
（ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
のいずれかを含むＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患のバイオマーカーを検出する工程を含む、方法。
［３３］前記バイオマーカーが検出されるか、あるいは健常者との比較で高濃度で存在している場合に、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定する工程を更に含む、［３２］に記載の方法。
［３４］前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、［３２］又は［３３］に記載の方法。
［３５］前記疾患ががんであり、前記バイオマーカーががんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するための腫瘍マーカーである、［３４］に記載の方法。
［３６］ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防するための医薬をスクリーニングするための方法であって、［５］に記載のペプチド又は［６］に記載の核酸の発現を阻害する物質を当該医薬として選定する工程を含む、方法。
［３７］前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、［３６］に記載の方法。
本発明の効果
　本発明のＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント、それらの翻訳産物、特にＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドはがん細胞で特異的に検出される新規なものであるため、種々の用途に供されることが期待される。例えば、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント又はその翻訳産物の検出系を構築することで、がんの検出も可能になる。特に、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドは正常細胞では存在しないアミノ酸配列を有するため、このアミノ酸配列特異的に検出できる系を用いれば理論的に非特異的反応（正常細胞由来の）のない検出系が得られる。また、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントはがん細胞の運動能を制御すると考えられることから、がんの悪性度を予測するマーカーとしても利用可能である。更に、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの発現を阻害する物質はがんの浸潤・転移を抑制する効果が期待される。
図１は、Ｓｋｏｖ３細胞における染色体レベルの遺伝子結合をＦＩＳＨ法で確認した結果を示す。赤色のシグナル（例えば、図１ａ中に示されたシグナル）はＬＡＭＣ２のセントロメア側のプローブ由来のもの、緑色のシグナル（例えば、図１ｂ中に示されたシグナル）はＮＲ６Ａ１のテロメア側のプローブ由来のものであり、黄色のシグナル（図１ｃ上の矢印が示すシグナル）はＬＡＭＣ２とＮＲ６Ａ１とが結合していることを示す。 図２は、ＬＡＭＣ２遺伝子のセンス鎖とＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖とがゲノムレベルで結合する様子を模式した図である。 図３は、ＬＡＭＣ２遺伝子とＮＲ６Ａ１遺伝子とが結合した後、ｍＲＮＡレベルでオルタナティブスプライシングが起こることによりＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭとＬＯＮＧ　ＦＯＲＭのスプライシングバリアントが生成される様子を模式した図である。 図４は、正常細胞におけるＬＯＮＧ　ＦＯＲＭとＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの発現分布をＰＣＲで検討した結果を示す。この結果から、ＬＯＮＧ　ＦＯＲＭとＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントは正常細胞において発現していないことが分かる。 図５は、がん患者由来の臨床検体におけるＬＯＮＧ　ＦＯＲＭとＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの発現を検出した結果を示す。乳がん、卵巣がん、大腸がん患者由来がん組織を用いてＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントをＰＣＲで検出した結果、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントは卵巣がんで２０検体中１９検体、乳がんで１９検体中１３検体、大腸がんで１６検体中１１検体で検出された。一方、ＬＯＮＧ　ＦＯＲＭ　のスプライシングバリアントは卵巣がんで２０検体中１２検体で検出された。 図６は、Ｌｎ－γ２Ｆ（ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント）を導入した卵巣がん細胞株Ｏｖｃａｒ８と、Ｌｎ－γ２Ｆを発現する卵巣がん細胞　Ｓｋｏｖ３におけるＬｎ－γ２Ｆの機能解析結果を示す。 図７は、Ｌｎ－γ２Ｆが細胞内シグナルに及ぼす影響を検討するために、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す。図中のＬｎ－γ２Ｆは融合遺伝子産物、Ｌｎ－γ２ｍはラミニンγ２単鎖を意味する。アスタリスク（＊）は非特異的バンドを示す。 図８はＳｋｏｖ３－ｓｃｒとＳｋｏｖ３－ｋｄ１のマイクロアレイ解析結果を示す。Ｌｎ－γ２Ｆ発現を抑制した細胞とコントロール細胞の遺伝子発現パターンをマイクロアレイ解析で比較すると、Ａｋｔによって制御させる遺伝子群の発現が低下していた。 図９は、栄養飢餓（０．５％ＦＢＳ）及び通常条件下（１０％ＦＢＳ）でＳｋｏｖ３細胞を培養している間にＬＡＭＣ２遺伝子発現を抑制した場合の細胞増殖数の変化を比較した結果を示す（ｓｃｒ：ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｋｄ１，ｋｄ２：Ｌｎ－γ２Ｆ発現抑制）。細胞をそれぞれ１０００個まいて、１，２，３日後の細胞数をカウントした。Ｌｎ－γ２Ｆ発現を抑制すると、栄養飢餓（０．５％ＦＢＳ），通常条件下（１０％ＦＢＳ）のどちらでも細胞の増殖能が減少していた。 図１０は、栄養飢餓（０．５％ＦＢＳ）及び通常条件下（１０％ＦＢＳ）でＯＶＣＡＲ８細胞を培養している間にＬＡＭＣ２遺伝子発現を強制発現した場合の細胞増殖数の変化を比較した結果を示す（Ｍｏｃｋ：ｃｏｎｔｒｏｌ；ＷＴ：ＬＡＭＣ２　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ；Ｆｕｓｉｏｎ：Ｌｎ－γ２Ｆ）。細胞をそれぞれ１０００個まいて、１，２，３日後の細胞数をカウントした。Ｌｎ－γ２Ｆを強制的に発現させると、細胞の増殖能が栄養飢餓（０．５％ＦＢＳ）でのみ有意に亢進した。野生型でも亢進の傾向はあるが有意差はなかった。 図１１は、がん細胞の運動能をボイデンチャンバーで評価した結果を示す（ｓｃｒ：ｃｏｎｔｒｏｌ；ＫＤ２，ＫＤ１：Ｌｎ－γ２Ｆ発現抑制）。縦軸は移動した細胞数を表す。 図１２Ａは、卵巣がんを腹膜に播種されたマウス生体内においてＬｎ－γ２Ｆが造腫瘍性に及ぼす影響を評価した結果を示す（Ｓｃｒ：ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｋｄ１，ｋｄ２：Ｌｎ－γ２Ｆ発現抑制；Ｋｄ２－ｍｏｃｋ：Ｌｎ－γ２Ｆ発現抑制＋ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌｎ－γ２Ｆ：Ｋｄ２＋Ｆｕｓｉｏｎ：Ｌｎ－γ２Ｆ発現抑制＋Ｌｎ－γ２Ｆ）。ルシフェラーゼを発現する細胞をｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスの腹腔内に移植後６週目に撮影した。赤い色（矢印の先の部分）ほど多くのがん細胞が存在することを示す。図１２Ｂは図１２Ａにおける造腫瘍能を発光強度を測定し、経時的なグラフ化で表した結果を示す。 図１３Ａは、Ｌｎ－γ２Ｆを発現していないＯＶＣＡＲ８細胞にＬｎ－γ２Ｆを発現させ、これをマウス腹腔内に移植した場合のマウスにおける造腫瘍能を評価した結果を示す（Ｍｏｃｋ：ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌｎ－γ２Ｆ：Ｌｎ－γ２Ｆ）。ルシフェラーゼを発現する細胞をｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスの腹腔内に移植後６０日後に撮影した。赤い色（矢印の先の部分）ほど多くのがん細胞が存在することを示す。Ｌｎ－γ２Ｆを発現させると造腫瘍能及び、腫瘍生着率が高くなった。図１３Ｂは図１３Ａの発光強度を定量した結果を示す。 図１４は、ＬＡＭＣ２とＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの翻訳産物を模式した図である。 図１５はＬｎ－γ２融合タンパク質がＭＴ１－ＭＭＰのプロセシングを受けずに、そのままの形でＥＧＦ受容体を活性化することによりがん化促進に寄与することを図示したものである。 図１６はＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭとＬＯＮＧ　ＦＯＲＭ（Ｌｎ－γ２Ｆ）の配列決定結果を示す。 図１７は、ＯＶＣＡＲ８細胞（Ｍｏｃｋ）とＬｎ－γ２Ｆ過剰発現細胞をヌードマウスの腹腔内に注入して４週間後に回収された組織の免疫染色結果を示す。ルシフェラーゼ（緑色）；リン酸化ＡＫＴ（図１７Ａの赤色）；リン酸化ＥＲＫ（図１７Ｂの赤色）；核（青色）スケールバー：５０μｍ
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。
ペプチド
　第一の態様では、ラミニンγ２遺伝子のエクソン１２と核内受容体の一種であるＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１とが融合して生成される新規スプライシングバリアントによりコードされる翻訳産物、特に以下のペプチド又はその塩が提供される。
（ａ）配列番号４（ＣＭＦＣＮＳＲＭＤＧＮＬＡ）のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個、例えば１～５個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド。
　ラミニンγ２単鎖（本明細書では「Ｌｎ－γ２ｍ」ともいう）とは、ラミニン３３２の構成要素であるγ２鎖が単量体（モノマー）として発現したものをいう。ラミニン５は、基底膜の主要な構成成分の一つであり、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の３つのポリペプチド鎖が、コイルドコイル構造部分で会合するヘテロ三量体である。３つのポリペプチド鎖のうち、γ２鎖は、悪性のがん細胞において単量体として発現することが報告されている。本明細書では、三量体として発現しているγ２鎖を「ラミニン３３２γ２鎖」と区別するために、単量体として発現しているγ２鎖を「ラミニンγ２単鎖」又は「ラミニンγ２鎖」と呼ぶ。
　本明細書で使用する場合、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、配列番号によって特定されるアミノ酸配列と比較して、所望の機能を失わない範囲の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された変異アミノ酸配列を意味する。アミノ酸は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、及び天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指すことがある。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸又はＤ－アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、及び、胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸である。
　置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドと実質的に同等な構造又は性質を有する可能性が高いためである。
　ＬＡＭＣ２から翻訳されるラミニンγ２（Ｌｎ－γ２）鎖は、単鎖として、あるいは、ラミニンα３、β３鎖と会合したラミニン３３２として産生される。ＭＴ１－ＭＭＰはこれらのＬｎ－γ２鎖の短腕にあるラミニンＥＧＦ様ドメイン（ドメインＩＩＩ）を切り出すことで、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のリガンド活性を有するドメインＩＩＩを含む断片を遊離して（図１４上）、ＥｒｂＢ受容体の活性化を介してがん細胞の運動や生存シグナルの亢進等に寄与すると考えられている（図１５）。Ｌｎ－γ２がＥＧＦ受容体リガンドとして作用するためには、ＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングが必須となる。一方、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１の翻訳産物であるＬｎ－γ２融合タンパク質はＭＴ１－ＭＭＰのプロセシングを必要とせず、そのままの形でＥＧＦ受容体を活性化することでがん化促進に寄与する（図１４下）。以上より、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１の翻訳産物であるＬｎ－γ２融合タンパク質はプロテアーゼによるプロセシングを必要とせず、ＥｒｂＢ受容体を効率的に活性化することが可能である。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドを有するスプライシングバリアントは、ＭＴ１－ＭＭＰのプロセシングを受けずに、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を直接活性化してその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有しており、これら活性亢進ががんに関与しているものと考えられる。ここで、がんに関連する重要なシグナル伝達経路であるＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ、およびＲａｓ－ＥＲＫ経路について調べた。ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路は、ＰＩ３Ｋのリン酸化活性から始まり、Ａｋｔのリン酸化を通して、細胞の生存やアポトーシス誘導を阻害する。つまり、Ａｋｔの発現及び／又はリン酸化はがんに関連している。事実、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路は、多くの腫瘍において恒常的機能亢進が確認されている。また、Ａｋｔはがん以外の疾患、例えば、肥満症、自己免疫障害、炎症、又は糖尿病にも関連していることが知られている。
　ＭＡＰＫ/ＥＲＫ経路は、ＲＡＳのリン酸化活性化から始まり、Ｒａｆ，ＭＥＫ、ＥＲＫのリン酸化を通して、細胞増殖を誘導する。つまり、Ｒａｓ－ＥＲＫ経路の発現および／またはリン酸化はがんに関連している。事実、Ｒａｓ－ＥＲＫ経路は、多くの腫瘍において経路細胞増殖の亢進に重要な役割を担うことから、がん化に関与すると考えられる。また、がん細胞ではＥＲＫの機能が恒常的亢進することが確認されている。また、ＥＲＫはがん以外の疾患、例えば、心筋細胞肥大に伴う心疾患や神経変性疾患にも関連していることが知られている。ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドは種々のがん細胞で発現しているため、作用機序を問わず、がんに関連する種々の用途への応用が期待される。
　ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドは化学合成や組換えＤＮＡ技術等の、当該技術分野における人工的な常法によって入手することができる。例えば、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドは、固相法に従い、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に順次縮合反応を行い、ペプチド鎖を伸長させていくことにより調製することができる。
核酸
　第二の態様では、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸又はそれに相補的な核酸が提供される。
　核酸の取得方法は特に限定されず、例えば、本明細書に開示されているアミノ酸配列に対応する核酸の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやライブラリーを調製し、それらを用いてｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーから、所望とする遺伝子に特有の適当なプローブ等を用いて所望クローンを選択することにより製造することができる。細胞株からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離及び精製、ゲノムＤＮＡの取得及びそのクローニングなどは、いずれも常法に従って行うことができる。
　上記方法において用いられるプローブとしては、所望とする核酸の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できる。また、核酸の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー及びアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることができる。例えば、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドをコードする領域をはさむように設計されたセンスプライマーとアンチセンスプライマーが好適に使用される。そのような一対のオリゴヌクレオチドプライマーの例として、配列番号１２と配列番号１３に記載のプライマーが挙げられる。
　核酸の取得に際しては、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅法が好適に利用できる。増幅させたＤＮＡ断片の単離精製は、常法に従って行うことができる。例えば、ゲル電気泳動法などが挙げられる。上記方法に従って得られる核酸は、例えばジデオキシ法、マキサム－ギルバート法などの常法に従って、その塩基配列を決定することができる。
　核酸は、対応する配列番号によって特定される塩基配列や、それと相補的な塩基配列からなる核酸と高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つその核酸と同一の活性を有するペプチドをコードする核酸も包含する。
　ここで、本明細書で使用する場合、「高ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。高ストリンジェントな条件としては、同一性が高い核酸同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件が挙げられる。具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
スプライシングバリアント
　ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子は、ＬＡＭＣ２のセンス鎖とＮＲ６Ａ１のアンチセンス鎖とが結合したものであるため、その翻訳産物は、ＬＡＭＣ２のセンス鎖がコードするアミノ酸配列を含むが、ＮＲ６Ａ１遺伝子のセンス鎖がコードするアミノ酸配列を含まない。このゲノムレベルでの結合の後、オルタナティブスプライシングにより最終的に成熟ｍＲＮＡが生成される（図２及び図３）。オルタナティブスプライシングの結果、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子の転写産物には、異なるアイソフォームをコードする、複数のオルタナティブスプライシングバリアント、例えば２５４４塩基（配列番号２）のものや、２６５１塩基（配列番号６）のものなどが存在する。便宜上、本明細書では前者を「ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭ」、後者を「ＬＯＮＧ　ＦＯＲＭ」という。ただし、他の塩基長のスプライシングバリアントを排除する意図ではなく、本願発明は広く、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子のあらゆるスプライシングバリアントを包含する。スプライシングバリアントは、配列番号２の配列、例えば配列番号２の１９１９位～２５４４位に示される配列、特に配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しており、且つその翻訳産物がＥＧＦ受容体リガンド活性を有するもの、つまりＥＧＦシグナル伝達経路の下流にあるＰＩ３ＫやＡｋｔを活性化するものが好ましい。本明細書で使用する場合、「スプライシングバリアント」とは遺伝子のオルタナティブスプライシング産物としての成熟ｍＲＮＡをいう。
　転座遺伝子のＬＡＭＣ２遺伝子プロモーターからの転写とスプライシングにより、複数分子種のｍＲＮＡが生じる。ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質は、Ｎ末端にラミニンγ２に由来する配列（配列番号３の６１８位のイソロイシンまで）を有しており、Ｃ末端にＮＲ６Ａ１由来ｍＲＮＡから読み取られるペプチド配列が付加される。スプライシング部位の相違によりＣ末端に付加されるアミノ酸配列は変化するが、代表例としては配列番号４のアミノ酸配列（ＣＭＦＣＮＳＲＭＤＧＮＬＡ）が挙げられる。
　ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭの翻訳はＬＡＭＣ２の翻訳産物に１３アミノ酸から成るペプチド（配列番号４）が付加された状態で停止する。一方、ＬＯＮＧ　ＦＯＲＭの翻訳産物は、アミノ酸に翻訳される際にＬＡＭＣ２の翻訳産物の１アミノ酸が付加されるものの、直後に停止コドンが入っているため、上記ペプチドは付加されない。
ベクター等
　更なる態様において、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸を含むベクター、当該ベクターを含む組み換え細胞、及び当該核酸により形質転換されているモデル動物、が提供される。当該ベクターにおいては、配列番号４のペプチドをコードする核酸や、その他の所望とする核酸がすべて一つの発現ベクター内に含まれるように構成されていてもよいし、あるいは、２グループ以上に分かれて、それぞれ別個の発現ベクターに含まれるように構成されていてもよい。発現ベクターにおいて、核酸は、プロモーターとターミネーターとの間に挿入することができる。
　ベクターは更に、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
　ベクターは、発現ベクターとして、プラスミド又はウイルスベクターであってもよい。また、ヒト等の哺乳動物への投与が意図される場合、ベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターであることもある。
　モデル動物は、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがんの発生や治療又は予防等を研究するために使用され得る。モデル動物としては、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、その他の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）を含む、任意の脊椎動物が意図される。所望の核酸を発現するように形質転換されたモデル動物を作出するためには、受精卵や初期胚に所期の遺伝子を導入し、遺伝子を導入した受精卵や初期胚を前記動物の仮親の子宮に移植し、発生されればよい。また、ホモ接合型の形質転換モデル動物は、所期の遺伝子を導入したＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等の多能性幹細を胚盤胞等の初期胚に挿入し、これにより得られたキメラ胚を仮親の子宮に移植し、発生させることで得られたキメラ動物を交配することにより作出することもできる。
　上記融合遺伝子を発現するように形質転換されたモデル動物に加え、上記融合遺伝子をノックダウン又はノックアウトした動物も本発明の範囲に含まれることが意図される。
組成物
　更に別の態様において、前記ペプチド又は核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を含む、組成物、好ましくは医薬組成物が提供される。このような化合物は抗体又はその抗原結合断片、あるいは核酸であってもよい。本明細書で使用する場合、「抗体」とは所望の抗原等と免疫特異的に結合することができる抗体分子を意味する。抗体には、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、一本鎖Ｆｖｓ（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（「ｓｄＦｖ」）、抗イディオタイプ抗体及び上記のいずれかの機能活性エピトープ結合フラグメント等が包含される。
　本明細書で使用する場合、「抗原結合断片」とは、標的ペプチド等と免疫特異的に結合する能力を保持する抗体の任意の断片を指す。抗原結合断片には、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、標的ペプチド等と特異的に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）等を含む断片が包含される。抗体結合断片は当業界で公知の方法により得ることができる。
　上述のとおり、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチド又は核酸は、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するため、当該活性を阻害する化合物は、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病の治療又は予防等に好適に使用され得る。このような活性を有する化合物は、例えば、抗体又はその抗原結合断片、あるいはｓｉＲＮＡ、リボザイム等のアンチセンス医薬であってもよい。アンチセンス核酸は、標的ペプチドをコードするｍＲＮＡに結合し、当該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する活性を有するものであればいかなるものも使用することができる。例えば、アンチセンス核酸としてはｍＲＮＡを切断するｓｉＲＮＡや、細胞内でｓｉＲＮＡ又はその前駆体に転写される核酸も好適に使用され得る。
　ｓｉＲＮＡは、通常１９～３０塩基程度、例えば２１塩基～２５塩基程度の二本鎖ＲＮＡであり、一般に、その一方が標的ｍＲＮＡの一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有するが、標的ｍＲＮＡには完全に相補的でなくてもよい。
　ｓｉＲＮＡを用いる発現阻害法、すなわちＲＮＡｉ法は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。ｓｉＲＮＡも標的特異性が高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
　ｓｉＲＮＡの典型的な構造は、２１塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、各ＲＮＡ鎖の３'部分が２塩基のオーバーハングとなっている。ｓｉＲＮＡはヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）や、より長い二本鎖ＲＮＡからＤｉｃｅｒによって切り出されて産生される。Ｄｉｃｅｒに切断される前のｓｈＲＮＡや長い二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体として、本発明において好適に用いることができる。
　ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ効果を有する限り、二本鎖ＲＮＡであっても良いし、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
　組成物は広く、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病の治療又は予防に好適に用いることができる。組成物はこのような医薬用途、特にがんの治療又は予防、例えば、がん細胞の増殖抑制のほか、細胞のがん化の抑制、がん細胞の悪性化の抑制、あるいはがんの浸潤、転移又は再発抑制などに使用され得る。本明細書において「がん」はその最も広い意味で用いられる。がんとしては、例えば、脳腫瘍、頭頚部がん、食道がん、胃がん、大腸がん（結腸がんを除く）、肛門がん、直腸がん、肝がん、肝細胞がん、肺がん、非小細胞肺がん、骨肉種、胆嚢がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、精巣腫瘍、膀胱がん、皮膚がんが挙げられるがこれらに限定されない。
　組成物の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与に適する組成物としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、又は液剤などが挙げられる。非経口投与に適する組成物としては、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、若しくは皮下投与用の注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤などを挙げることができる。凍結乾燥物など乾燥粉末形態の医薬組成物として調製された製剤を用時に溶解して注射剤又は点滴剤として使用することも意図される。
　組成物には、固体又は液体の製剤用添加物を含めてもよい。製剤用添加物は有機物質又は無機物質のいずれであってもよい。経口用固形製剤を製造する場合は、例えば、有効成分である上記化合物ら又はその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質に賦形剤を添加し、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの形態の製剤を調製することができる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、蔗糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、デンプン、タルク、ソルビット、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素などを挙げることができる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチンなどを挙げることができる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化直物油などを挙げることができる。着色剤としては、医薬品に添加することが認可されているものであればいずれも使用することができる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、龍脳、桂皮末などを使用することができる。錠剤や顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングを付することができる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤などを添加してもよい。
　経口投与のための液体製剤、例えば、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、又は液剤の製造には、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水又は植物油を用いることができる。液体製剤には補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、芳香剤、着色剤、又は保存剤などを添加することができる。液体製剤を調製した後、ゼラチンなどのカプセルに充填してもよい。
　非経口投与用の医薬組成物、例えば注射剤又は坐剤等の製造に用いられる溶剤又は懸濁剤としては、例えば、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、又はレシチンなどを挙げることができる。坐剤の製造に用いられる基剤としては、例えば、カカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂等を挙げることができる。製剤の調製方法は特に限定されず、当業界で汎用されている方法はいずれも利用可能である。
　注射剤の形態の医薬組成物を調製する場合には、担体として、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコールなどの希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、又はリン酸ナトリウムなどのpH調整剤又は緩衝剤；エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、又はチオ乳酸などの安定化剤などを使用することができる。等張性の溶液を調製するために十分な量の食塩、ブドウ糖、マンニトール、又はグリセリンなどを組成物中に配合してもよく、溶解補助剤、無痛化剤、又は局所麻酔剤などを添加することもできる。
　軟膏剤、例えば、ペースト、クリーム、又はゲルの形態の医薬組成物を調製する場合には、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、又は保存剤などを必要に応じて使用することができ、常法により成分を混合して医薬組成物を調製することができる。基剤としては、例えば、白色ワセリン、ポリエチレン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、又はベントナイトなどを使用することができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、又はパラオキシ安息香酸プロピルなどを使用することができる。貼付剤の形態の医薬組成物を調製する場合には、通常の支持体の表面に上記軟膏、クリーム、ゲル、又はペーストなどを常法により塗布することができる。支持体としては、例えば、綿、若しくは合成繊維からなる織布や不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、若しくはポリウレタンなどのフィルム、又は発泡体シートなどを好適に使用できる。
　所望の用途に使用可能である限り組成物における有効成分の量は特に限定されず、患者の年令、体重、性別、投与の目的、症状などに応じて適宜増減され得る。
　上記の有効成分は、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病を治療又は予防するための方法において被験者に投与される。
バイオマーカー
　別の態様において、更に、バイオマーカー、特にＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがんについて評価するための診断マーカーが提供される。例えば、マーカーは、被験者由来の試料中において標的核酸又はその翻訳産物、好ましくは配列番号４のペプチドの発現を検出し、又はその発現量を測定するか、あるいは試料中において標的核酸又はその翻訳産物、好ましくは配列番号４のペプチドに対する特異的抗体の存在を検出又は測定することにより、被験者ががん等のＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患しているか否かを判定するのに使用される。
　本明細書中で使用する場合、用語「被験者」は、ヒトや非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、その他の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）を含む、任意の脊椎動物を指す。実施形態によって、被験者はヒト又はヒト以外の動物であってよい。実施形態によって、被験者は、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病を発病するリスクのある患者又は既にこのような疾患を発病している患者であってよい。
　被験者由来の試料においてバイオマーカーが検出される場合、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定することができる。バイオマーカーは、がんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するために使用される腫瘍マーカーであってもよい。
　本明細書中で使用される用語「試料」は、広く、標的を含有すると考えられる生物学的材料をさす。試料を得るために、任意の細胞、組織又は体液が利用され得る。そのような細胞、組織及び体液は、生検や剖検サンプルなどの組織の切片、組織学の目的のために採取された凍結切片、（全血などの）血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、唾液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、毛、皮膚、赤血球、血小板、間質液、眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、鼻汁、滑液、帯下、羊水、精液などを含み得る。細胞及び組織は、リンパ液、腹水、婦人科学的な液体、尿、腹腔液、脳脊髄液等を含んでもよい。目的に応じて試料から標的ペプチド等の単離や精製が行われることもある。
　標的ペプチドの発現の検出又はその発現量の測定は、例えば、イムノアッセイ、凝集法、比濁法、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法等により実施することができる。イムノアッセイは特に簡便で好ましい。
　イムノアッセイは、抗体の標識法によりエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも用いることができる。
　ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
　また、イムノアッセイでは、抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
　イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができて好ましい。
　ＥＬＩＳＡ法に使用する酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３'－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３'５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。
　固相担体は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
　また、上記イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、抗体にラテックス粒子を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。
　抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、標的で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、標的で免疫した動物の血清から得ることができる。
　マーカーがＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子又はＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント等の遺伝子である場合、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法やＲＴ－ＰＣＲ法、その他公知の遺伝子変異検査方法を使用することができる。当業者は対象の遺伝子に応じて適切な手段を選択することができ、例えば、ＬＡＭＣ２遺伝子とＮＲ６Ａ１遺伝子とが結合した状態は、ＦＩＳＨ法により確認することができる。ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子の検出に使用されるプローブは、これらの遺伝子が含まれるバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンから調製することができ、例えば、ＲＰ１１－１５８Ｄ２４とＲＰ１１－５８２Ａ１８が使用され得る。プローブをそれぞれ異なる色の蛍光色素で標識すると、プローブのシグナルは正常の場合には離れて検出され、遺伝子結合の場合には重なって検出される。ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシング等の検出に使用できるプローブは、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントなどの対象の遺伝子を特異的に認識する配列を有するものであればよい。本明細書で使用する場合、「特異的に認識する」とは、特定のＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントに結合するものの、野生型のＬＡＭＣ２に結合しないことを意味する。
　より高感度でがんに特異的なマーカーを提供する観点からは、配列番号４のペプチド又はそれをコードする配列番号５の塩基配列を標的とするのが好ましい。
検出方法
　別の態様において、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患のバイオマーカーを検出する方法が提供される。検出方法は、被験者由来の試料において、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
（ｂ）ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
（ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
（ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
のいずれかを含む。
　検出対象は上記（ａ）～（ｅ）に限定されず、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント又はその翻訳産物の存在を示唆することができるものであればよい。融合遺伝子の存在の検出は当業者に公知であり、次世代シーケンサー等を用いることで簡便に同定できる。ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントについても同様であり、例えば、被験者由来の試料から得られたゲノムＤＮＡのリード配列をＬＡＭＣ２遺伝子（又はＮＲ６Ａ１遺伝子）の標準配列にマッピングし、マッピングされなかった部分がＮＲ６Ａ１遺伝子（マッピングした配列がＮＲ６Ａ１遺伝子の場合にはＬＡＭＣ２遺伝子）に由来する場合、同被験者はＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを有すると決定される。
　検出方法は更に、バイオマーカーが検出されるか、あるいは健常者との比較で高濃度で存在している場合に、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定する工程を更に含んでもよい。例えば、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患している疑いのある被験者由来の試料から得られたゲノムＤＮＡのリード配列をＬＡＭＣ２遺伝子（又はＮＲ６Ａ１遺伝子）の標準配列にマッピングし、マッピングされなかった部分がＮＲ６Ａ１遺伝子（マッピングした配列がＮＲ６Ａ１遺伝子の場合にはＬＡＭＣ２遺伝子）に由来する場合、同被験者はＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を有すると決定される。
　バイオマーカーは、がんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するために使用される腫瘍マーカーであってもよい。ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定する工程は臨床検査技師や医療機器の補助を借りて行うことができる。
　検出方法は、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病、特にがんの診断方法に好適に使用することができる。がんの診断に使用する場合、検出方法は任意に、被験者ががんを有すると決定する工程、がんの重症度を決定する工程、被験者のがんを発病するリスク（すなわち、疾患発症の可能性）を決定する工程、がん治療レジメンの有効性を決定する工程、被験者をがん治療法の候補者として同定する工程及びがんを有する被験者における疾患の進行に関するリスク評価を行う工程を含んでもよい。
スクリーニング方法
　別の態様において、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、特に、心筋細胞肥大に伴う心疾患、神経変性疾患又は糖尿病を治療又は予防するための医薬をスクリーニングするための方法が提供される。スクリーニング方法は、任意にＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント又はその翻訳産物、特に配列番号４のペプチドの発現を阻害する物質を医薬として選定する工程を含んでもよい。
治療又は予防方法
　別の態様において被験者におけるＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１遺伝子、ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント又はその翻訳産物、特に配列番号４のペプチドの発現を阻害する化合物又はその塩を被験者に投与することを含む、方法が提供される。ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患は特に限定されないが、例えばがん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病が例示される。
　以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（新規融合遺伝子の同定）
　卵巣がん細胞株Ｓｋｏｖ３のゲノムを用いて、Ｗｈｏｌｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅを行った結果、ＬＡＭＣ２とＮＲ６Ａ１の染色体レベルでの遺伝子結合を見出した（配列番号１）。続いて、Ｓｋｏｖ３細胞における染色体レベルの遺伝子結合をＦＩＳＨ法で確認した。まず、ＪＣＲＢ細胞バンクから購入したＳｋｏｖ３細胞にコルセミドを添加後、２時間培養し、トリプシンにより細胞を回収した。回収した細胞は、メタノール：酢酸＝３：１の固定液で固定した。固定した細胞をスライドグラスに広げＦＩＳＨ用プレパラートとした。プローブは、市販のＢＡＣクローンを用い、ＬＡＭＣ２のセントロメア側とＮＲ６Ａ１のテロメア側で作成した（それぞれ、ＬＡＭＣ２：ＢＡＣクローンＲＰ１１－１５８Ｄ２４；ＮＲ６Ａ１：ＢＡＣクローンＲＰ１１－５８２Ａ１８）。
　ＬＡＭＣ２のセントロメア側のプローブをジゴキシゲニン（赤）で、ＮＲ６Ａ１のテロメア側のプローブをビオチン（緑色）で標識した。これらのプローブをＳｋｏｖ３細胞に対してアプライし、７０℃のホットプレート上で切片とプローブを同時に５分間変成処理し、３７℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイズした切片を３７℃の５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ及び１×ＳＳＣでｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｗａｓｈした。（４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）にて対比染色し、退色防止剤でマウントした。
　プローブシグナルの検出及びデータの解析はＬＥＩＣＡ　ＣＷ－４０００サイトジェネティックワークステーションにより画像取り込み及びＦＩＳＨデータの解析を行った。撮影には４０倍及び２０倍の対物レンズを用いた。結果を図１に示す。
　卵巣がん培養細胞株（Ｓｋｏｖ３）からＲＡＣＥ－ＰＣＲ法により、ＬＡＭＣ２とＮＲ６Ａ１遺伝子が結合した新規スプライシングバリアントを同定した。本発明のスプライシングバリアントの一つであるＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭの全長塩基配列と、それがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号３として表す。ＳＨＯＲＴとＬＯＮＧの配列決定結果を図１６に示す。
配列番号２：
ATGCCTGCGCTCTGGCTGGGCTGCTGCCTCTGCTTCTCGCTCCTCCTGCCCGCAGCCCGGGCCACCTCCAGGAGGGAAGTCTGTGATTGCAATGGGAAGTCCAGGCAGTGTATCTTTGATCGGGAACTTCACAGACAAACTGGTAATGGATTCCGCTGCCTCAACTGCAATGACAACACTGATGGCATTCACTGCGAGAAGTGCAAGAATGGCTTTTACCGGCACAGAGAAAGGGACCGCTGTTTGCCCTGCAATTGTAACTCCAAAGGTTCTCTTAGTGCTCGATGTGACAACTCTGGACGGTGCAGCTGTAAACCAGGTGTGACAGGAGCCAGATGCGACCGATGTCTGCCAGGCTTCCACATGCTCACGGATGCGGGGTGCACCCAAGACCAGAGACTGCTAGACTCCAAGTGTGACTGTGACCCAGCTGGCATCGCAGGGCCCTGTGACGCGGGCCGCTGTGTCTGCAAGCCAGCTGTTACTGGAGAACGCTGTGATAGGTGTCGATCAGGTTACTATAATCTGGATGGGGGGAACCCTGAGGGCTGTACCCAGTGTTTCTGCTATGGGCATTCAGCCAGCTGCCGCAGCTCTGCAGAATACAGTGTCCATAAGATCACCTCTACCTTTCATCAAGATGTTGATGGCTGGAAGGCTGTCCAACGAAATGGGTCTCCTGCAAAGCTCCAATGGTCACAGCGCCATCAAGATGTGTTTAGCTCAGCCCAACGACTAGACCCTGTCTATTTTGTGGCTCCTGCCAAATTTCTTGGGAATCAACAGGTGAGCTATGGGCAAAGCCTGTCCTTTGACTACCGTGTGGACAGAGGAGGCAGACACCCATCTGCCCATGATGTGATTCTGGAAGGTGCTGGTCTACGGATCACAGCTCCCTTGATGCCACTTGGCAAGACACTGCCTTGTGGGCTCACCAAGACTTACACATTCAGGTTAAATGAGCATCCAAGCAATAATTGGAGCCCCCAGCTGAGTTACTTTGAGTATCGAAGGTTACTGCGGAATCTCACAGCCCTCCGCATCCGAGCTACATATGGAGAATACAGTACTGGGTACATTGACAATGTGACCCTGATTTCAGCCCGCCCTGTCTCTGGAGCCCCAGCACCCTGGGTTGAACAGTGTATATGTCCTGTTGGGTACAAGGGGCAATTCTGCCAGGATTGTGCTTCTGGCTACAAGAGAGATTCAGCGAGACTGGGGCCTTTTGGCACCTGTATTCCTTGTAACTGTCAAGGGGGAGGGGCCTGTGATCCAGACACAGGAGATTGTTATTCAGGGGATGAGAATCCTGACATTGAGTGTGCTGACTGCCCAATTGGTTTCTACAACGATCCGCACGACCCCCGCAGCTGCAAGCCATGTCCCTGTCATAACGGGTTCAGCTGCTCAGTGATGCCGGAGACGGAGGAGGTGGTGTGCAATAACTGCCCTCCCGGGGTCACCGGTGCCCGCTGTGAGCTCTGTGCTGATGGCTACTTTGGGGACCCCTTTGGTGAACATGGCCCAGTGAGGCCTTGTCAGCCCTGTCAATGCAACAACAATGTGGACCCCAGTGCCTCTGGGAATTGTGACCGGCTGACAGGCAGGTGTTTGAAGTGTATCCACAACACAGCCGGCATCTACTGCGACCAGTGCAAAGCAGGCTACTTCGGGGACCCATTGGCTCCCAACCCAGCAGACAAGTGTCGAGCTTGCAACTGTAACCCCATGGGCTCAGAGCCTGTAGGATGTCGAAGTGATGGCACCTGTGTTTGCAAGCCAGGATTTGGTGGCCCCAACTGTGAGCATGGAGCATTCAGCTGTCCAGCTTGCTATAATCAAGTGAAGATTCAGtgcatgttctgcaacagccggatggatgggaacttagcataatctcaaagagcaaccctgatgctcccataacagcaggacctcaacgtccaagaagaataccacaccttacttgagcccatttacaagtcacctcctgaaaaatccaagatgcctgtcagaagcagctactgagggaagtgaagatgtttttatttgttcattgtcattgtgaagactgactaaagtcttactgatcaaggagtttgtttgaacatggtcagagagctttcaaagtcatttcagaaagtgccccacaccatcctcaacagatggtttgatggaagagaagtagccagctctgctcaggaaatccattagtaaggtgcagataccaccaaagagatgtcccacatgtggcagaatgtacctttttccttattttctttaaaatctccatataaaaagggaagatggatgcatgagggcctagaaaatgtttatccctctggatcaatcttaggaatctatcctaagaatcagaaatacagaaaatagtacaaaactcgaggccatctaaaaattcaaacacaggaaaatgattaaattatgtacacttattcaatggaatattttgcgaacactataaatgttttccaagagtttacaaagggcaaataccatattaaaaatacaatgtaaaactgg
（注：大文字はＬＡＭＣ２のセンス鎖由来、小文字はＮＲ６Ａ１のアンチセンス鎖由来の配列を表し、下線部はＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭとＬＯＮＧ　ＦＯＲＭに共通の配列を表す）
配列番号３：
MPALWLGCCLCFSLLLPAARATSRREVCDCNGKSRQCIFDRELHRQTGNGFRCLNCNDNTDGIHCEKCKNGFYRHRERDRCLPCNCNSKGSLSARCDNSGRCSCKPGVTGARCDRCLPGFHMLTDAGCTQDQRLLDSKCDCDPAGIAGPCDAGRCVCKPAVTGERCDRCRSGYYNLDGGNPEGCTQCFCYGHSASCRSSAEYSVHKITSTFHQDVDGWKAVQRNGSPAKLQWSQRHQDVFSSAQRLDPVYFVAPAKFLGNQQVSYGQSLSFDYRVDRGGRHPSAHDVILEGAGLRITAPLMPLGKTLPCGLTKTYTFRLNEHPSNNWSPQLSYFEYRRLLRNLTALRIRATYGEYSTGYIDNVTLISARPVSGAPAPWVEQCICPVGYKGQFCQDCASGYKRDSARLGPFGTCIPCNCQGGGACDPDTGDCYSGDENPDIECADCPIGFYNDPHDPRSCKPCPCHNGFSCSVMPETEEVVCNNCPPGVTGARCELCADGYFGDPFGEHGPVRPCQPCQCNNNVDPSASGNCDRLTGRCLKCIHNTAGIYCDQCKAGYFGDPLAPNPADKCRACNCNPMGSEPVGCRSDGTCVCKPGFGGPNCEHGAFSCPACYNQVKIQCMFCNSRMDGNLA*
（注：下線部はＬＡＭＣ２とＮＲ６Ａ１の結合による新規ペプチドを、＊は停止コドン（ｔａａ）を表す）
　ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１ペプチドをコードするアミノ酸配列（ＣＭＦＣＮＳＲＭＤＧＮＬＡ）を配列番号４、それをコードする塩基配列（ｔｇｃａｔｇｔｔｃｔｇｃａａｃａｇｃｃｇｇａｔｇｇａｔｇｇｇａａｃｔｔａｇｃａ）を配列番号５とした。
　ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭと同様の手順で同定したＬＯＮＧ　ＦＯＲＭの全長塩基配列と、それがコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号７として以下に記す。
配列番号６：
ATGCCTGCGCTCTGGCTGGGCTGCTGCCTCTGCTTCTCGCTCCTCCTGCCCGCAGCCCGGGCCACCTCCAGGAGGGAAGTCTGTGATTGCAATGGGAAGTCCAGGCAGTGTATCTTTGATCGGGAACTTCACAGACAAACTGGTAATGGATTCCGCTGCCTCAACTGCAATGACAACACTGATGGCATTCACTGCGAGAAGTGCAAGAATGGCTTTTACCGGCACAGAGAAAGGGACCGCTGTTTGCCCTGCAATTGTAACTCCAAAGGTTCTCTTAGTGCTCGATGTGACAACTCTGGACGGTGCAGCTGTAAACCAGGTGTGACAGGAGCCAGATGCGACCGATGTCTGCCAGGCTTCCACATGCTCACGGATGCGGGGTGCACCCAAGACCAGAGACTGCTAGACTCCAAGTGTGACTGTGACCCAGCTGGCATCGCAGGGCCCTGTGACGCGGGCCGCTGTGTCTGCAAGCCAGCTGTTACTGGAGAACGCTGTGATAGGTGTCGATCAGGTTACTATAATCTGGATGGGGGGAACCCTGAGGGCTGTACCCAGTGTTTCTGCTATGGGCATTCAGCCAGCTGCCGCAGCTCTGCAGAATACAGTGTCCATAAGATCACCTCTACCTTTCATCAAGATGTTGATGGCTGGAAGGCTGTCCAACGAAATGGGTCTCCTGCAAAGCTCCAATGGTCACAGCGCCATCAAGATGTGTTTAGCTCAGCCCAACGACTAGACCCTGTCTATTTTGTGGCTCCTGCCAAATTTCTTGGGAATCAACAGGTGAGCTATGGGCAAAGCCTGTCCTTTGACTACCGTGTGGACAGAGGAGGCAGACACCCATCTGCCCATGATGTGATTCTGGAAGGTGCTGGTCTACGGATCACAGCTCCCTTGATGCCACTTGGCAAGACACTGCCTTGTGGGCTCACCAAGACTTACACATTCAGGTTAAATGAGCATCCAAGCAATAATTGGAGCCCCCAGCTGAGTTACTTTGAGTATCGAAGGTTACTGCGGAATCTCACAGCCCTCCGCATCCGAGCTACATATGGAGAATACAGTACTGGGTACATTGACAATGTGACCCTGATTTCAGCCCGCCCTGTCTCTGGAGCCCCAGCACCCTGGGTTGAACAGTGTATATGTCCTGTTGGGTACAAGGGGCAATTCTGCCAGGATTGTGCTTCTGGCTACAAGAGAGATTCAGCGAGACTGGGGCCTTTTGGCACCTGTATTCCTTGTAACTGTCAAGGGGGAGGGGCCTGTGATCCAGACACAGGAGATTGTTATTCAGGGGATGAGAATCCTGACATTGAGTGTGCTGACTGCCCAATTGGTTTCTACAACGATCCGCACGACCCCCGCAGCTGCAAGCCATGTCCCTGTCATAACGGGTTCAGCTGCTCAGTGATGCCGGAGACGGAGGAGGTGGTGTGCAATAACTGCCCTCCCGGGGTCACCGGTGCCCGCTGTGAGCTCTGTGCTGATGGCTACTTTGGGGACCCCTTTGGTGAACATGGCCCAGTGAGGCCTTGTCAGCCCTGTCAATGCAACAACAATGTGGACCCCAGTGCCTCTGGGAATTGTGACCGGCTGACAGGCAGGTGTTTGAAGTGTATCCACAACACAGCCGGCATCTACTGCGACCAGTGCAAAGCAGGCTACTTCGGGGACCCATTGGCTCCCAACCCAGCAGACAAGTGTCGAGCTTGCAACTGTAACCCCATGGGCTCAGAGCCTGTAGGATGTCGAAGTGATGGCACCTGTGTTTGCAAGCCAGGATTTGGTGGCCCCAACTGTGAGCATGGAGCATTCAGCTGTCCAGCTTGCTATAATCAAGTGAAGATTCAGatctaaacagatcattgtactccattacatggaaagagccacaaaagtcaaaacaagagaacttctattgaaagcatcttgactaataaaaccctacctttgcgcagtgcatgttctgcaacagccggatggatgggaacttagcataatctcaaagagcaaccctgatgctcccataacagcaggacctcaacgtccaagaagaataccacaccttacttgagcccatttacaagtcacctcctgaaaaatccaagatgcctgtcagaagcagctactgagggaagtgaagatgtttttatttgttcattgtcattgtgaagactgactaaagtcttactgatcaaggagtttgtttgaacatggtcagagagctttcaaagtcatttcagaaagtgccccacaccatcctcaacagatggtttgatggaagagaagtagccagctctgctcaggaaatccattagtaaggtgcagataccaccaaagagatgtcccacatgtggcagaatgtacctttttccttattttctttaaaatctccatataaaaagggaagatggatgcatgagggcctagaaaatgtttatccctctggatcaatcttaggaatctatcctaagaatcagaaatacagaaaatagtacaaaactcgaggccatctaaaaattcaaacacaggaaaatgattaaattatgtacacttattcaatggaatattttgcgaacactataaatgttttccaagagtttacaaagggcaaataccatattaaaaatacaatgtaaaactgg
（注：大文字はＬＡＭＣ２のセンス鎖由来、小文字はＮＲ６Ａ１のアンチセンス鎖由来の配列を表し、下線部はＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭとＬＯＮＧ　ＦＯＲＭに共通の配列を表す）
配列番号７：
MPALWLGCCLCFSLLLPAARATSRREVCDCNGKSRQCIFDRELHRQTGNGFRCLNCNDNTDGIHCEKCKNGFYRHRERDRCLPCNCNSKGSLSARCDNSGRCSCKPGVTGARCDRCLPGFHMLTDAGCTQDQRLLDSKCDCDPAGIAGPCDAGRCVCKPAVTGERCDRCRSGYYNLDGGNPEGCTQCFCYGHSASCRSSAEYSVHKITSTFHQDVDGWKAVQRNGSPAKLQWSQRHQDVFSSAQRLDPVYFVAPAKFLGNQQVSYGQSLSFDYRVDRGGRHPSAHDVILEGAGLRITAPLMPLGKTLPCGLTKTYTFRLNEHPSNNWSPQLSYFEYRRLLRNLTALRIRATYGEYSTGYIDNVTLISARPVSGAPAPWVEQCICPVGYKGQFCQDCASGYKRDSARLGPFGTCIPCNCQGGGACDPDTGDCYSGDENPDIECADCPIGFYNDPHDPRSCKPCPCHNGFSCSVMPETEEVVCNNCPPGVTGARCELCADGYFGDPFGEHGPVRPCQPCQCNNNVDPSASGNCDRLTGRCLKCIHNTAGIYCDQCKAGYFGDPLAPNPADKCRACNCNPMGSEPVGCRSDGTCVCKPGFGGPNCEHGAFSCPACYNQVKIQI*
（注：下線部はＬＡＭＣ２とＮＲ６Ａ１の結合による新規ペプチドを、＊は停止コドン（ｔａａ）を表す）
　ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントが正常細胞で発現しているかをＲＴ－ＰＣＲ法を用いて確認した。本ＲＴ－ＰＣＲ法で利用したヒト正常組織ｃＤＮＡはフィルジェン社より購入した。ポジティブコントロールにはＳｋｏｖ３細胞から調製したｃＤＮＡを用いた。ＬＡＭＣ２野生型はＬＡＭＣ２配列由来プライマーを用い、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント検出にはＬＡＭＣ２配列由来プライマーとＮＲ６Ａ１配列由来プライマーを用いてＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントのみを検出した。また、内在コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。使用したプライマーを以下に記載する。
GAPDH-sense               aaggctgagaacgggaagcttgtcatcaat（配列番号８）
GAPDH-anti sense          ttcccgtctagctcagggatgaccttgccc（配列番号９）
LAMC2-WT sense            gctacttcggggacccattg（配列番号１０）
LAMC2-WT anti-sense       caagctggacagctgaatgc（配列番号１１）
LAMC2-NR6A1 sense         accagtgcaaagcaggctac（配列番号１２）
LAMC2-NR6A1 anti-sense     tcagggttgctctttgaga（配列番号１３）
　結果を図４に示す。
　図４に示されているとおり、組織間でバラツキはあるものの、どの組織でもＬＡＭＣ２野生型は発現していた。しかしながら、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントはＳｋｏｖ３細胞でのみ発現していた。このことからも、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントはがん細胞特異的であることが明らかになった。
　続いて、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントがどのようながん種で存在しているかをＰＣＲ法により確認したところ、肝臓がん、乳がん、卵巣がんと多くのがん種でＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントが検出された。特にＰＩ３Ｋ変異が入っている細胞株やＰＴＥＮ欠損株（ＰＩ３，４，５Ｐ３が増大する観点でＰＩ３Ｋ変異株と細胞の表現形）で高発現していた（結果は示さず）。
　次に、実際にがん患者でＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントが存在しているかをＲＴ－ＰＣＴで調べた。所定のがんを有する患者から手術時の組織を用いてｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法でＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの検出を行った。その結果、卵巣がんでは２０検体中１９検体、乳がんでは１９検体中１３検体、大腸がんでは１６検体中１１検体でＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントが検出された（図５）。
（ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント機能の解析）
　ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントのがん細胞における役割を検討するため、複数のがん細胞株を作成した。まず、レンチウイルスを用いて、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントをＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを発現していない卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ８に遺伝子導入することにより、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを安定発現する細胞株を樹立した。ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントをＬＡＭＣ２野生型遺伝子に置き換えた点を除き同様の手法で細胞株を樹立した。更に、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを発現している卵巣がん細胞株Ｓｋｏｖ３を用い、これに２種類のｓｈＲＮＡをレンチウイルスで導入することで、ＬＡＭＣ２の発現を安定的に抑制した細胞株を樹立した。使用したｓｈＲＮＡの配列を以下に示す。
　shRNA-1                   ctgccaaatttcttgggaatc（配列番号１４）
　shRNA-2                   gccctgtcaatgcaacaacaa（配列番号１５）
　それぞれの細胞株から細胞抽出液を調製し、抗ＬＡＭＣ２抗体（Ｄ４Ｂ５，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてウエスタンブロットを行った。結果を図６に示す。ＬＡＭＣ２タンパク質は約１５０ｋＤａで検出された。ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントは約８０ｋＤａで検出されることがアミノ酸配列から推定できる。ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを発現していないＯｖｃａｒ８細胞ではコントロールベクターを導入した細胞株で（ｍｏｃｋ）内在性ＬＡＭＣ２タンパク質が約１５０ｋＤａで検出された。ＬＡＭＣ２野生型を導入した細胞株（ＷＴ）では約１５０ｋＤａのバンドが増加し、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを導入した細胞株では（ＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１）約８０ｋＤａにバンドが検出された。一方で、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを発現しているＳｋｏｖ３の細胞抽出液を用いたウエスタンブロット解析では、コントロール細胞では（ｓｃｒ）約８０ｋＤａにＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント産物が検出され、ｓｈＲＮＡによって発現を抑制すると（ｋｄ１　ａｎｄ　ｋｄ２）約８０ｋＤａのバンドが消失した。Ｓｋｏｖ３はＬＡＭＣ２野生型とＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントのどちらもｍＲＮＡレベルでは発現しているが、タンパク質レベルではＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの翻訳産物しか検出されなかった。
（細胞内シグナルへの影響）
　ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントが細胞内シグナルに影響を及ぼすか否かを明らかにするため、ＳＫＯＶ－３細胞を０．５％血清培養下の血清飢餓状態とし、そこにラミニンγ２単鎖（Ｌｎ－γ２ｍ）、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアント（ＬＡＭＣ２融合タンパク質（Ｌｎ－γ２Ｆ））を１、５μｇ／ｍＬになるように添加後、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて細胞ライゼート中のＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ＥＲＫの発現とリン酸化を調べた。結果を図７Ａに示す。Ｌｎ－γ２Ｆは陽性コントロールのＥＧＦと同様にＥＧＦＲのリン酸化を誘導した。また、Ｌｎ－γ２Ｆは、Ｌｎ－γ２ｍよりも低い濃度でＥＧＦＲのリン酸化を誘導することが明らかとなった。同様に、Ｌｎ－γ２Ｆにより、ＥＧＦＲ下流シグナルのＡＫＴ、ＥＲＫもリン酸化の誘導が確認されたことから、Ｌｎ－γ２ＦはＬｎ－γ２ｍ同様にＥＧＦＲおよびその下流シグナルの活性化に寄与する。抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いてウエスタンブロットを行った。
　続いて、ＳＫＯＶ－３を１０％ＦＣＳ含有の通常血清下で培養し、ＳＫＯＶ－３に発現するＬｎ－γ２Ｆの発現をノックダウンした細胞（ｓｈＫＤ１、ｓｈＫＤ２）並びに、ｓｈＫＤ２細胞にｍｏｃｋ及び、Ｌｎ－γ２Ｆを戻した細胞を用いて、ＥＧＦＲ及びＡＫＴの発現とリン酸化を検討した。結果を図７Ｂに示す。血清含有下では内在的に産生したＬｎ－γ２ＦによるＥＧＦＲの活性が見られるが、ｓｈＫＤ１、ｓｈＫＤ２（最下段パネル）細胞はＬｎ－γ２Ｆの発現、ＥＧＦＲのリン酸化が消失した（最上段パネル）。一方、ｓｈＫＤ２細胞にＬｎ－γ２Ｆを発現させたリバータント細胞は、ＥＧＦＲ、ＡＫＴのリン酸化の誘導が見られた。以上より、Ｌｎ－γ２ＦがＬｎ－γ２ｍより効率的にＥＧＦＲのリン酸化を誘導し、下流のＥＲＫ、ＡＫＴシグナルの活性化に寄与していることが明らかとなった。
　ここで、ＡｋｔやＥＲＫは、広範囲に影響を及ぼすシグナル伝達ネットワークの中心的存在で、Ａｋｔ活性化は、これらの細胞シグナル伝達経路のマスタースイッチとして働き、下流の幅広いターゲット分子や相互作用分子を介してさまざまな細胞内反応を引き起こすことが知られている。多くのがん種においても、ＡｋｔやＥＲＫの活性化が亢進していることが明らかになっている。我々が同定したＬＡＭＣ２融合タンパク質（Ｌｎ－γ２Ｆ）が制御するＡｋｔやＥＲＫの活性化が下流の遺伝子発現を制御するのに十分であるかを検討するため、Ｓｋｏｖ３－ｓｃｒとＳｋｏｖ３－ｋｄ１の遺伝子発現パターンをマイクロアレイ法によって調べた。結果を図８に示す。様々な遺伝子発現パターンが異なっていたが、特にＡｋｔによって発現が制御されることが知られている遺伝子群の発現が低下していた。
（細胞増殖への影響）
　続いて、Ａｋｔシグナルはがん細胞の増殖、生存や運動などの様々な機能を制御することが知られていることから、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの細胞増殖への影響を調べた。Ｓｋｏｖ３細胞をそれぞれ１０００個まいて、１，２，３日後の細胞数をカウントした。結果を図９に示す。ＬＡＭＣ２遺伝子発現を抑制すると、細胞の増殖能が栄養飢餓（０．５％ＦＢＳ），通常条件下（１０％ＦＢＳ）どちらでも減少していた。
　続いて、ＯＶＣＡＲ８細胞をそれぞれ１０００個まいて、１，２，３日後の細胞数をカウントした。結果を図１０に示す。ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントを強制的に発現させると、細胞の増殖能が栄養飢餓（０．５％ＦＢＳ）でのみ有意に亢進した。野生型でも亢進の傾向はあるが有意差はなかった。
（細胞運動への影響）
　Ａｋｔシグナルはがん細胞の運動能にも影響することが知られているため、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントの運動能への影響をボイデンチャンバーを用いて評価した。上層にがん細胞をそれぞれ１００００個無血清培地に加え、下層に１０％血清を含む培地を加えた。１８時間培養後に下層に移動したがん細胞の数をカウントした。結果を図１１に示す。コントロール細胞では６７１個のがん細胞が移動していたが、ＬＡＭＣ２遺伝子発現抑制株（ｋｄ１　ａｎｄ　ｋｄ２）ではそれぞれ２６７個２２４個のがん細胞が移動していた。次にｋｄ２株にＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントのみを戻すと５４７個のがん細胞が下層に移動した。以上のことから、ＳＨＯＲＴ　ＦＯＲＭのＬＡＭＣ２－ＮＲ６Ａ１スプライシングバリアントはがん細胞の運動能を制御することが明らかになった。
（造腫瘍性への影響）
　Ｌｎ－γ２Ｆのマウス生体内での造腫瘍性への影響を検討するために、１００００００個のがん細胞をそれぞれｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスの腹腔に投与後、６週間目のマウス腹腔内での腫瘍を調べた。移植したがん細胞はルシフェラーゼ遺伝子を発現しているため、腫瘍サイズはルシフェリン投与による発光シグナルで評価した。結果を図１２に示す。コントロール細胞（Ｍｏｃｋ）に比べＬＡＭＣ２　遺伝子発現抑制細胞では（ｋｄ１及びｋｄ２）腫瘍増殖能が低下し、ＬＡＭＣ２遺伝子発現抑制細胞にＬｎ－γ２Ｆの発現を戻した細胞では（Ｌｎ－γ２Ｆ）腫瘍増殖能がコントロールと同程度まで回復した。
　続いてＬｎ－γ２Ｆを発現していないＯＶＣＡＲ８細胞にＬｎ－γ２Ｆを発現させて、これをマウスの腹腔内に移植した。このマウス腹腔内での造腫瘍能を評価したところ、Ｌｎ－γ２Ｆ発現細胞では腫瘍サイズ及び腫瘍生着能が著しく亢進した。結果を図１３に示す。
　多段階発がんモデルを想定して本発明の効果について説明する。多段階発がんモデルでは、第一段階（イニシエーション）として正常細胞ががん細胞へと転換する過程で発がん物質やＵＶなどによってＤＮＡに損傷が入る。第二段階として（プロモーション）イニシエーションで転換されたがん細胞の増殖を維持、増加する。第三段階として（プログレッション）運動、浸潤、転移能が増加し悪性化する。具体的な作用機序は不明であるが、Ｌｎ－γ２Ｆが細胞増殖、がん細胞の運動能、腫瘍生着能に影響を及ぼすことから、Ｌｎ－γ２Ｆはプロモーション及びプログレッションに関与することが示唆される。つまり、Ｌｎ－γ２Ｆの機能阻害剤（発現阻害）は原発巣（プロモーション段階）のみならず、転移巣（プログレッション）においても抗がん作用が期待される。
（Ｌｎ－γ２Ｆはｉｎ　ｖｉｖｏでＡＫＴ及びＥＲＫの活性化を促進する）
　ＯＶＣＡＲ８細胞（Ｍｏｃｋ）とＬｎ－γ２Ｆ過剰発現細胞をヌードマウスの腹腔内に注入した。４週間後、回収された組織の免疫染色結果を図１７に示す。Ｌｎ－γ２Ｆ過剰発現細胞が腹腔内に形成した癌組織におけるＡＫＴ，ＥＲＫの活性化がＭＯＣＫと比較して亢進していることが示された。以上から、Ｌｎ－γ２Ｆは生体内での癌細胞の増殖、生存を介した造腫瘍能に寄与している可能性がある。
　Ｌｎ－γ２Ｆはがんの悪性化に関与し、特にがん細胞の運動能を制御すると考えられることから、がんの悪性度を予測するマーカーとしても利用可能である。更に、Ｌｎ－γ２ＦＦの発現を阻害する物質はがんの浸潤・転移を抑制する効果が期待される。

Claims (37)

  1. 　ラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）遺伝子のエクソン１２とＮＲ６Ａ１遺伝子のアンチセンス鎖のイントロン１に由来する、スプライシングバリアント。
  2. 　以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド：
    （ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド、
    をコードする核酸を有する、請求項１に記載のスプライシングバリアント。
  3. 　配列番号２の１９１９位～２５４４位に示される塩基配列を有する、請求項１又は２に記載のスプライシングバリアント。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアントによりコードされるタンパク質。
  5. 　以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド又はその塩：
    （ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性を亢進する活性を有するペプチド。
  6. 　請求項５に記載のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸。
  7. 　請求項５に記載のペプチド又は請求項６に記載の核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を含む、組成物。
  8. 　前記化合物が抗体又はその抗原結合断片、あるいは核酸である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　前記核酸がｍＲＮＡを切断するｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の組成物。
  10. 　ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防するための、請求項５に記載のペプチド又は請求項６に記載の核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を含む、医薬組成物。
  11. 　前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 　前記疾患ががんであり、がんの予防又は治療あるいは浸潤、転移又は再発抑制のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント又は請求項６に記載の核酸を含むベクター。
  14. 　請求項１３に記載のベクターを含む組み換え細胞。
  15. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント又は請求項６に記載の核酸により形質転換されている、モデル動物。
  16. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアントの翻訳産物又は請求項５に記載のペプチドに結合し、野生型のラミニンγ２（ＬＡＭＣ２）に結合しない、抗体又はその抗原結合断片。
  17. 　請求項５に記載のペプチドをコードする核酸を検出又は増幅するための、センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる、一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
  18. 　請求項５に記載のペプチドをコードするｍＲＮＡに結合し、当該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する活性を有する核酸。
  19. 　前記核酸がｍＲＮＡを切断するｓｉＲＮＡである、請求項１８に記載の核酸。
  20. 　請求項１８又は１９に記載の核酸を含むベクター。
  21. 　請求項２０に記載のベクターを含む組み換え細胞。
  22. 　被験者におけるＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、請求項５に記載のペプチド又は請求項６に記載の核酸の発現を阻害する化合物又はその塩を被験者に投与することを含む、方法。
  23. 　前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、請求項２２に記載の方法。
  24. 　以下の（ａ）～（ｅ）：
    （ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
    （ｂ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
    （ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
    （ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
    のいずれかを含むバイオマーカー。
  25. 　ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を診断するための、請求項２４に記載のバイオマーカー。
  26. 　前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、請求項２５に記載のバイオマーカー。
  27. 　前記疾患ががんであり、前記バイオマーカーががんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するための腫瘍マーカーである、請求項２５又は２６に記載のバイオマーカー。
  28. 　ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患のバイオマーカーを検出する方法であって、被験者由来の試料において、以下の（ａ）～（ｅ）：
    （ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
    （ｂ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
    （ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
    （ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
    のいずれかを含む、方法。
  29. 　前記バイオマーカーが検出されるか、あるいは健常者との比較で高濃度で存在している場合に、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定する工程を更に含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 　前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、請求項２８又は２９に記載の方法。
  31. 　前記疾患ががんであり、前記バイオマーカーががんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するための腫瘍マーカーである、請求項３０に記載の方法。
  32. 　被験者におけるＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を診断する方法であって、被験者において、以下の（ａ）～（ｅ）：
    （ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアント；
    （ｂ）請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングバリアント、好ましくは配列番号２又は６の塩基配列を有するスプライシングバリアントがコードするタンパク質；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド；
    （ｄ）（ｃ）のペプチドをコードする核酸又はそれに相補的な核酸；
    （ｅ）（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドに対する抗体；
    のいずれかを含むＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患のバイオマーカーを検出する工程を含む、方法。
  33. 　前記バイオマーカーが検出されるか、あるいは健常者との比較で高濃度で存在している場合に、ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患に罹患し易い、当該疾患に罹患している、又は当該疾患が進行していると決定する工程を更に含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 　前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、請求項３２又は３３に記載の方法。
  35. 　前記疾患ががんであり、前記バイオマーカーががんへのかかり易さ、がんの罹患の有無、又はがんの進行の有無について診断するための腫瘍マーカーである、請求項３４に記載の方法。
  36. 　ＥＧＦ受容体およびその下流シグナル経路の活性に関連する疾患を治療又は予防するための医薬をスクリーニングするための方法であって、請求項５に記載のペプチド又は請求項６に記載の核酸の発現を阻害する物質を当該医薬として選定する工程を含む、方法。
  37. 　前記疾患ががん、肥満症、自己免疫障害、炎症、心疾患、神経変性疾患又は糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
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