[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2021020509A1 - 間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物 - Google Patents

間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2021020509A1
WO2021020509A1 PCT/JP2020/029229 JP2020029229W WO2021020509A1 WO 2021020509 A1 WO2021020509 A1 WO 2021020509A1 JP 2020029229 W JP2020029229 W JP 2020029229W WO 2021020509 A1 WO2021020509 A1 WO 2021020509A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
serpin
mesenchymal stem
acid sequence
amino acid
stem cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/029229
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
克人 玉井
敬史 新保
尊彦 山崎
Original Assignee
株式会社ステムリム
国立大学法人大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ステムリム, 国立大学法人大阪大学 filed Critical 株式会社ステムリム
Priority to JP2021535424A priority Critical patent/JP7561348B2/ja
Priority to US17/631,072 priority patent/US20220265787A1/en
Publication of WO2021020509A1 publication Critical patent/WO2021020509A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)

Definitions

  • mesenchymal stem cells particularly mesenchymal stem cells of bone marrow.
  • a therapeutic effect on inflammatory bowel disease can be expected.
  • FIG. 3 shows the results of a colony assay showing changes in colony-forming cells in the bone marrow of DSS-treated mice.
  • the number of colonies (%) of DSS-administered mice on the same collection day is shown when the average value of the number of colonies formed from the bone marrow cells of healthy mice on each collection day is taken as 100%.
  • FIG. 4 shows the results of a colony assay when bone marrow cells of DSS-administered mice were cultured in a serpin A3N-added medium.
  • the bone marrow includes, but is not limited to, the bone marrow of the femur, tibia, skull, sternum, vertebrae, ribs, and pelvic bone.
  • serpin A3 or a composition comprising it promotes or suppresses the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (ie, mesenchymal stem cells contained within the bone marrow cells). In a further embodiment, serpin A3 or a composition comprising it promotes or suppresses the proliferation of bone marrow colony forming mesenchymal stem cells.
  • Serpin A3 or a composition containing it is administered to a subject in an amount capable of exerting a desired effect (referred to as "effective amount" in the present specification).
  • the dose is appropriately determined depending on the age, weight, health condition, etc. of the subject.
  • the dose can be selected in the range of 0.000000001 mg to 1000 mg per 1 kg of body weight per administration.
  • the dose can be selected in the range of 0.00001 to 100,000 mg / body per subject.
  • Serpin A3 for use in promoting or suppressing the proliferation of mesenchymal stem cells.
  • Serpin A3 for use in the treatment of inflammatory bowel disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本開示は、間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制するため組成物であって、セルピンＡ３を含む組成物などを含む。

Description

間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物
　本出願は、日本国特許出願第２０１９－１４１３２５号および第２０２０－０５８５４４号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物に関する。
　損傷組織から放出されるＨＭＧＢ１（High mobility group box 1：高移動性グループ1タンパク質）が骨髄中に存在するＰＤＧＦＲα(platelet-derived growth factor receptor alpha)陽性細胞（間葉系幹細胞）を刺激して骨髄から循環系へと動員し、当該動員された細胞が損傷部位へ集積して組織の再生を誘導することが報告されている（特許文献１，２）。故に、何らかの要因により骨髄内の間葉系幹細胞が減少している場合には、組織の再生が遅延し又は不十分となるおそれがある。つまり、間葉系幹細胞を介した生体内の組織再生メカニズムが有効に機能するためには、骨髄内に必要量の間葉系幹細胞が存在していることが重要となる。このようなことから、骨髄内の間葉系幹細胞を含む細胞について、その量を維持、回復、増殖させることが望まれており、かかる作用を有する新たな薬の開発が待たれている。
　更に、近年、炎症性腸疾患の患者数が増加している。炎症性腸疾患は、慢性あるいは、寛解と再燃とを繰り返す腸管の炎症性疾患の総称で、一般に潰瘍性大腸炎とクローン病の二疾患を指す。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、いずれも原因不明の難治性の疾患である。薬物治療も行われているが、個々の患者において薬効には個人差があり、また、副作用の点から治療効果の高い既存医薬を処方できないケースも存在するため、新たな医薬の提供が待たれている。
ＷＯ／２００８／０５３８９２ ＷＯ／２００９／１３３９３９
　本開示の目的の１つは、間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制することである。
　更に本開示の目的の１つは、炎症性腸疾患を治療するための組成物を提供することである。
　ある態様において、本開示は、間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制するための組成物であって、セルピンＡ３を含む組成物に関する。
　さらなる態様において、本開示は、炎症性腸疾患を治療するための、セルピンＡ３を含む組成物に関する。
　本開示により、例えば、間葉系幹細胞、特に骨髄の間葉系幹細胞の増殖の促進または減少の抑制が可能になる。また、本開示により、例えば、炎症性腸疾患の治療効果が期待できる。
図１は、健常マウスおよびＤＳＳ投与マウスの体重変化を示す。各プロットは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、two-way ANOVA。 図２は、健常マウスおよびＤＳＳ投与マウスの大腸の長さを測定した結果を示す。左の写真は、マウスから採取した大腸を示す。右のグラフは、各採取日において測定した大腸長さを示し、３匹の平均値をバーグラフで、標準誤差をエラーバーで示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、two-way ANOVA。 図３は、ＤＳＳ投与マウスの骨髄中のコロニー形成性細胞の変化を示すコロニーアッセイの結果である。各採取日の健常マウスの骨髄細胞から形成されたコロニー数の平均値を１００％とした場合の、同じ採取日のＤＳＳ投与マウスのコロニー数（％）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、two-way ANOVA。 図４は、ＤＳＳ投与マウスの骨髄細胞をセルピンＡ３Ｎ添加培地で培養したときのコロニーアッセイの結果を示す。左のグラフは、健常マウスの骨髄細胞をセルピンＡ３Ｎ（０、０．５、１、２、または４ｎｇ／ｍＬ）存在下で１０日間培養したときのコロニー数を示す。右のグラフは、ＤＳＳ投与マウスの骨髄細胞をセルピンＡ３Ｎ（４ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で１０日間培養したときのコロニー数（グラフ中の「IBD+Seripina3n」または「IBD」）、および健常マウスの骨髄細胞をセルピンＡ３Ｎの非存在下で同期間培養したときのコロニー数（グラフ中の「Ctrl」）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、two-way ANOVA。 図５は、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+PBS」）、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含むＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+Seripina3n」）、または健常マウス（グラフ中の「Control」）から採取した骨髄細胞のコロニーアッセイ結果を示す。＊ｐ＜０．０５、one-way ANOVA。 図６は、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+PBS」）、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含むＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+Seripina3n」）、または健常マウス（グラフ中の「Control」）の体重変化（上）、大腸の写真（左下）、測定した大腸長さ（右下）を示す。体重変化を示したグラフにおける各プロットおよび大腸長さを示すグラフにおけるバーグラフは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。矢頭はセルピンＡ３Ｎの投与を示す。 図７は、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+PBS」）、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含むＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+Seripina3n」）、または健常マウス（グラフ中の「Control」）の体重変化を示す。各プロットは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。矢頭はセルピンＡ３Ｎの投与を示す。 図８は、ＤＳＳ投与後にセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳまたはセルピンＡ３Ｎを含むＰＢＳを投与したマウス（グラフ中の「DSS+PBS」または「DSS+Seripina3n」）または健常マウス（グラフ中の「Control」）の体重変化を示す。各プロットは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。矢頭はセルピンＡ３Ｎの投与を示す。 図９は、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳとを投与したマウス（黒カラム）またはＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含むＰＢＳとを投与したマウス（斜線カラム）における、追加のＤＳＳ投与後の体重変化を示す。コントロールとして健常マウス（白カラム）の結果を示す。初回のＤＳＳ投与開始日から２１日目（追加のＤＳＳ投与開始日）の各マウスの体重を１００％として示す。バーグラフは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。 図１０は、ＤＳＳ投与マウスの大腸の細胞における遺伝子発現パターンを示す。左のグラフは、Ｋ平均法（K-means clustering）によりクラスタリングされた４つのサブクラスター（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４）を示し、右のグラフはＫ４に含まれる遺伝子の発現レベルを示す。 図１１は、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+PBS」）、ＤＳＳとセルピンＡ３Ｎを含むＰＢＳとを投与したマウス（グラフ中の「DSS+Seripina3n」）、または健常マウス（グラフ中の「Control」）の大腸の細胞におけるＴＮＦ-α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６の発現を示す。＊ｐ＜０．０５、one-way ANOVA。
　特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
　本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　本開示において、「細胞」は、文脈に応じて１個の細胞または複数の細胞を意味する。複数の細胞を「細胞集団」と呼ぶ場合もあり、細胞集団は、文脈に応じて一種類の細胞からなる細胞集団または複数種の細胞を含む細胞集団であり得る。
　セルピンＡ３またはこれを含む本開示の組成物は、インビボまたはインビトロにおいて、間葉系幹細胞の増殖を促進し、または減少を抑制する。ある実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、対象に投与され、その生体内で、間葉系幹細胞の増殖を促進し、または減少を抑制するために用いられる。細胞の増殖の促進には、対象における細胞数を増加することが含まれ、細胞の減少の抑制には、対象における細胞数の低下を予防すること、および細胞数の低下を低減することが含まれる。別の実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、インビトロでの培養時に、間葉系幹細胞の増殖を促進し、または減少を抑制するために用いられる。
　対象としては、ヒト、および非ヒト動物、例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、対象はヒトである。
　本開示において、「間葉系幹細胞」（本明細書中、ＭＳＣと記載することがある）は、骨、軟骨、脂肪、筋肉などの間葉系組織への分化能を有する細胞を意味する。間葉系幹細胞は、さらに上皮系組織や神経組織への分化能を有してもよい。間葉系幹細胞は、骨髄、血液、例えば末梢血または臍帯血、皮膚、脂肪、歯髄等に存在する。ある実施形態において、間葉系幹細胞は、骨髄の間葉系幹細胞である。
　ある実施形態では、間葉系幹細胞は、コロニー形成能を有することを指標として判別することができる。コロニーの形状や大きさ、コロニーを形成する細胞の密度、形態を観察することにより、間葉系幹細胞であることは確実に判別できる。
　ヒト間葉系幹細胞のマーカーとしては、ＰＤＧＦＲα陽性、ＰＤＧＦＲβ陽性、Ｌｉｎ陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、Ｆｌｋ－１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７１陽性、Ｓｔｒｏ－１陽性、ＣＤ１０６陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ２７１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。例えば、ヒト間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性として特定されることがあり、また、ヒト間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性として特定されることがある。ある実施形態において、ヒト間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲβ陽性として特定されることがあり、また、ヒト間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲβ陽性且つＣＤ４５陰性として特定されることがある。
　マウス間葉系幹細胞のマーカーとしては、ＣＤ４４陽性、ＰＤＧＦＲα陽性、ＰＤＧＦＲβ陽性、ＣＤ４５陰性、Ｌｉｎ陰性、Ｓｃａ－１陽性、ｃ－ｋｉｔ陰性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２９陽性、Ｆｌｋ－１陰性、ＣＤ２７１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。例えば、マウス間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性として特定されることがあり、また、マウス間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性で特定されることがある。
　本開示において、「骨髄細胞」とは、骨髄に存在する細胞集団を意味する。骨髄細胞には、ＣＤ４５を発現している細胞（本明細書中、ＣＤ４５陽性細胞またはＣＤ４５＋細胞と記載することがある）と、発現していない細胞（本明細書中、ＣＤ４５陰性細胞またはＣＤ４５－細胞と記載することがある）が存在する。
　本開示において、骨髄としては、例えば、大腿骨、脛骨、頭蓋骨、胸骨、椎骨、肋骨、骨盤骨の骨髄が挙げられるが、これらに限定されない。
　ある実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、コロニー形成性の間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制する。「コロニー形成性の間葉系幹細胞」とは、固相上で培養した場合に固相に付着してコロニーを形成する間葉系幹細胞を意味する。コロニー形成性の間葉系幹細胞の増殖または減少は、例えば、コロニーアッセイによって評価することができる。
　ある実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、骨髄の間葉系幹細胞（すなわち、骨髄細胞中に含まれる間葉系幹細胞）の増殖を促進または減少を抑制する。さらなる実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、骨髄のコロニー形成性の間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制する。
　セルピンは、セリンプロテアーゼの阻害効果を持つ事で同定された類似構造を持つタンパク質のスーパーファミリーであり、幅広い界の生物で発見されている。ほとんどのセルピンは、タンパク質の分解反応を制御する機能を有し、その活性機構として、セルピン自体が立体構造の大きな変化を受ける事でプロテアーゼの活性中心を破壊し、標的を不可逆的に阻害することが知られている。
　ヒトのセルピンＡ３は、α１－アンチキモトリプシンとも呼ばれるセルピンの１つであり、ヒトのＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。セルピンＡ３は、キモトリプシン、キマーゼ、エラスターゼ、カテプシンＧ等を阻害することが知られている。ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、およびラットで保存されていることが知られている。
　マウスにおいては、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のホモログとして複数の遺伝子が存在する。これら遺伝子のうち特に、ＳＥＲＰＩＮＡ３Ｎ遺伝子は、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子と高い程度の相同性を有する。セルピンＡ３Ｎは、セルピンＡ３とセルピンＡ１（アンチトリプシンとも呼ばれる）のそれぞれと基質特異性を共有し、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、およびカテプシンＧを阻害することが報告されている。セルピンＡ３Ｎは、グランザイムＢを阻害することも報告されている。
　本開示において、「セルピンＡ３」なる用語は、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子またはそのホモログ（本明細書中、セルピンＡ３遺伝子と称する）にコードされるタンパク質を意味する。セルピンＡ３は、ヒトまたは非ヒト動物のタンパク質、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、サル、チンパンジー、オランウータンのタンパク質でありうるが、これらに限定されない。ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のホモログにコードされるタンパク質としては、例えば、表１に示される遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１は、ＮＣＢＩデータベース（NCBI data: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、オルソログデータベース（OrthoDB: https://www.orthodb.org/）、または文献（Ref. 1: Heit et al., Human Genomics, 7: 22, 2013；Ref. 2: Horvath et al., J. Biol. Chem, 280, 43168-43178, 2005；Ref. 3: Pelissier et al., BMC Genomics, 9: 151, 2008）に示される、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のホモログ（homo）、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のオルソログ（a3 ortholog）、またはマウスＳＥＲＰＩＮＡ３Ｎ遺伝子のオルソログ（a3n ortholog）を示す。表１には、各遺伝子のＩＤ（NCBI Reference Sequence；Entrez gene ID）、コードされるタンパク質のアミノ酸長（amino acids)、シグナルペプチドのアミノ酸位置（signal）、保存領域（region）およびその名称（region name）を示す。
　ある実施形態において、セルピンＡ３は、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子またはそのオルソログにコードされるタンパク質である。ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のオルソログにコードされるタンパク質としては、例えば、表１にオルソログとして示される遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
　別の実施形態において、セルピンＡ３は、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子にコードされるタンパク質、またはヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のホモログにコードされ、α１－アンチトリプシン様構造を含むタンパク質である。ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子のホモログにコードされ、α１－アンチトリプシン様構造を含むタンパク質としては、例えば、表１においてα１－アンチトリプシン様構造を含むことが示される遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
　さらなる実施形態において、セルピンＡ３は、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、マウスＳＥＲＰＩＮＡ３Ｎ遺伝子、またはラットＳＥＲＰＩＮＡ３Ｎ遺伝子によってコードされるタンパク質、すなわち、ヒトセルピンＡ３、マウスセルピンＡ３Ｎ、ラットセルピンＡ３Ｎである。
　セルピンＡ３は、生物種により異なるが、例えば全長４００～４５０残基前後のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、生体内では分泌タンパク質として細胞外に存在することが知られている。セルピン遺伝子にコードされる全長アミノ酸配列からなるタンパク質も活性を有するが、全長タンパク質のＮ末端が切断されて生じるＣ末端側のポリペプチド断片が成熟タンパク質として機能するものも知られている。
　本開示において、「セルピンＡ３」には、全長セルピンＡ３および成熟セルピンＡ３が含まれる。全長セルピンＡ３とは、セルピンＡ３遺伝子にコードされる全長アミノ酸配列からなるタンパク質を意味する。成熟セルピンＡ３とは、全長セルピンＡ３がプロテアーゼによるプロセシングを受けて生じることが確認または示唆されているＣ末端側のポリペプチドであって、生物学的活性を有するものを意味する。成熟セルピンＡ３は、例えば、全長セルピンＡ３からＮ末端シグナルペプチドを除いたＣ末端側のポリペプチドでありうる。
　例えば、セルピンＡ３は、以下のａ）～ｇ）から選択されるポリペプチドであり得る：
ａ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列を含み、且つ、全長セルピンＡ３の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟セルピンＡ３の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟セルピンＡ３と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟セルピンＡ３と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟セルピンＡ３と機能的に同等なポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟セルピンＡ３をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟セルピンＡ３と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟セルピンＡ３をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟セルピンＡ３と機能的に同等なポリペプチド。
　全長もしくは成熟セルピンＡ３と「機能的に同等」とは、当該タンパク質と同質の生物学的活性を有することをいい、ここにいう「同質」とは定性的評価において同じであることを意味する。本開示における全長もしくは成熟セルピンＡ３の生物学的活性としては、例えば、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性、およびセリンプロテアーゼの阻害活性、例えば、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カテプシンＧ、およびキマーゼから選択される１種以上のセリンプロテアーゼの阻害活性が挙げられる。ある実施形態において、全長もしくは成熟セルピンＡ３と機能的に同等なポリペプチドは、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチドである。
　本開示において、アミノ酸配列または核酸配列の同一性とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列の一致の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（アミノ酸またはヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のアミノ酸またはヌクレオチドを決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸またはヌクレオチドの総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
　「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
　代表的なヒトセルピンＡ３、マウスセルピンＡ３Ｎ、ラットセルピンＡ３Ｎをコードする核酸配列、およびこれらの全長および成熟タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。

ヒトセルピンＡ３　全長タンパク質（NP_001076.2）（配列番号１）
MERMLPLLALGLLAAGFCPAVLCHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKNVIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDELQLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITDLIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFRDEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLPKFSISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATAVKITLLSALVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA

ヒトセルピンＡ３　成熟タンパク質（配列番号１の24-423番目）（配列番号２４）
HPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKNVIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDELQLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITDLIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFRDEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLPKFSISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATAVKITLLSALVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA

ヒトセルピンＡ３　成熟タンパク質（配列番号１の26-423番目）（配列番号２５）
NSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKNVIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDELQLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITDLIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFRDEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLPKFSISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATAVKITLLSALVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA

マウスセルピンＡ３Ｎ　全長タンパク質（NP_033278.2）（配列番号１１）
MAFIAALGLLMAGICPAVLCFPDGTLGMDAAVQEDHDNGTQLDSLTLASINTDFAFSLYKELVLKNPDKNIVFSPLSISAALAVMSLGAKGNTLEEILEGLKFNLTETSEADIHQGFGHLLQRLNQPKDQVQISTGSALFIEKRQQILTEFQEKARALYQAEAFTADFQQPRQAKKLINDYVRKQTQGMIKELVSDLDKRTLMVLVNYIYFKAKWKVPFDPLDTFKSEFYAGKRRPVIVPMMSMEDLTTPYFRDEELFCTVVELKYTGNASAMFILPDQGKMQQVEASLQPETLRKWKNSLKPRMIDELHLPKFSISTDYSLEDVLSKLGIREVFSTQADLSAITGTKDLRVSQVVHKAVLDVAETGTEAAAATGVKFVPMSAKLYPLTVYFNRPFLIMIFDTETEIAPFIAKIANPK

マウスセルピンＡ３Ｎ　成熟タンパク質（配列番号１１の21-418番目）（配列番号２６）
FPDGTLGMDAAVQEDHDNGTQLDSLTLASINTDFAFSLYKELVLKNPDKNIVFSPLSISAALAVMSLGAKGNTLEEILEGLKFNLTETSEADIHQGFGHLLQRLNQPKDQVQISTGSALFIEKRQQILTEFQEKARALYQAEAFTADFQQPRQAKKLINDYVRKQTQGMIKELVSDLDKRTLMVLVNYIYFKAKWKVPFDPLDTFKSEFYAGKRRPVIVPMMSMEDLTTPYFRDEELFCTVVELKYTGNASAMFILPDQGKMQQVEASLQPETLRKWKNSLKPRMIDELHLPKFSISTDYSLEDVLSKLGIREVFSTQADLSAITGTKDLRVSQVVHKAVLDVAETGTEAAAATGVKFVPMSAKLYPLTVYFNRPFLIMIFDTETEIAPFIAKIANPK

マウスセルピンＡ３Ｎ　全長タンパク質（配列番号２７）
MAFIAALGLLMAGICPAVLCFPDGTLGMDAAVQEDHDNGTQLDSLTLASINTDFAFSLYKELVLKNPDKNIVFSPLSISAALAVMSLGAKGNTLEEILEGLKFNLTETSEADIHQGFGHLLQRLNQPKDQVQISTGSALFIEKRQQILTEFQEKAKTLYQAEAFTADFQQPRQAKKLINDYVRKQTQGMIKELVSDLDKRTLMVLVNYIYFKAKWKVPFDPLDTFKSEFYAGKRRPVIVPMMSMEDLTTPYFRDEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQGRMQQVEASLQPETLRKWKNSLKPRMIDELHLPKFSISTDYSLEDVLSKLGIREVFSTQADLSAITGTKDLRVSQVVHKAVLDVAETGTEAAAATGVKFVPMSAKLYPLTVYFNRPFLIMIFDTETEIAPFIAKIANPK

マウスセルピンＡ３Ｎ　成熟タンパク質（配列番号２７の21-418番目）（配列番号２８）
FPDGTLGMDAAVQEDHDNGTQLDSLTLASINTDFAFSLYKELVLKNPDKNIVFSPLSISAALAVMSLGAKGNTLEEILEGLKFNLTETSEADIHQGFGHLLQRLNQPKDQVQISTGSALFIEKRQQILTEFQEKAKTLYQAEAFTADFQQPRQAKKLINDYVRKQTQGMIKELVSDLDKRTLMVLVNYIYFKAKWKVPFDPLDTFKSEFYAGKRRPVIVPMMSMEDLTTPYFRDEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQGRMQQVEASLQPETLRKWKNSLKPRMIDELHLPKFSISTDYSLEDVLSKLGIREVFSTQADLSAITGTKDLRVSQVVHKAVLDVAETGTEAAAATGVKFVPMSAKLYPLTVYFNRPFLIMIFDTETEIAPFIAKIANPK

ラットセルピンＡ３Ｎ　全長タンパク質（NP_113719.1）（配列番号１２）
MDGIGSALLSFPDCILGEDTLFHEDQDKGTQLDSLTLASINTDFAFSLYKKLALRNPHKNVVFSPLSISAALAVVSLGAKGSSMEEILEGLKFNLTETPETEIHRGFGHLLQRLSQPRDEIQISTGNALFIEKRLQVLAEFQEKAKALYQAEAFTADFQQSREAKKLINDYVSKQTQGKIQGLITNLAKKTSMVLVNYIYFKGKWKVPFDPRDTFQSEFYSGKRRSVKVPMMKLEDLTTPYVRDEELNCTVVELKYTGNASALFILPDQGKMQQVEASLQPETLRRWKDSLRPSMIDELYLPKFSISADYNLEDVLPELGIKEVFSTQADLSGITGDKDLMVFQVVHKAVLDVAETGTEAAAATGVKFVPMSAKLDPLIIAFDRPFLMIISDTETAIAPFLAKIFNPK

ヒトセルピンＡ３　核酸配列（NM_001085.5）（配列番号２９）
ATGGAGAGAATGTTACCTCTCCTGGCTCTGGGGCTCTTGGCGGCTGGGTTCTGCCCTGCTGTCCTCTGCCACCCTAACAGCCCACTTGACGAGGAGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGCCAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAATGTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATAATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGCAGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTGCAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCACGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGCTGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGATCTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAGCCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAAGAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGGGACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCTTCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCTGAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTTTCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCTTCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGTGGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACAGCAGTCAAAATCACCCTCCTTTCTGCATTAGTGGAGACAAGGACCATTGTGCGTTTCAACAGGCCCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCACCAATCCCAAGCAAGCCTAG

マウスセルピンＡ３Ｎ　核酸配列（NM_009252.2）（配列番号３０）
ATGGCCTTCATTGCAGCTCTGGGGCTCTTGATGGCTGGGATCTGCCCTGCTGTCCTCTGCTTCCCAGATGGCACGTTGGGAATGGATGCTGCAGTCCAAGAAGACCATGACAATGGGACACAACTGGACAGTCTCACATTGGCCTCCATCAACACTGACTTTGCCTTCAGCCTCTACAAGGAGCTGGTTTTGAAGAATCCAGATAAAAATATTGTCTTCTCCCCACTTAGCATCTCAGCGGCCTTGGCCGTCATGTCCCTGGGAGCAAAGGGCAACACCCTGGAAGAGATTCTAGAAGGTCTCAAGTTCAATCTTACAGAGACCTCTGAGGCAGACATCCACCAGGGCTTTGGGCACCTCCTACAGAGGCTCAACCAGCCAAAGGACCAGGTACAGATCAGCACGGGTAGTGCCCTGTTTATTGAAAAGCGCCAGCAGATCCTGACAGAATTCCAGGAGAAGGCAAGGGCTCTGTACCAGGCTGAGGCCTTCACAGCAGACTTCCAGCAGCCTCGTCAGGCCAAAAAGCTCATCAATGACTATGTGAGGAAACAGACCCAGGGGATGATCAAGGAACTGGTCTCAGACCTGGATAAAAGGACATTGATGGTGCTGGTGAATTATATCTACTTTAAAGCCAAATGGAAGGTGCCCTTTGACCCTCTTGACACGTTCAAGTCTGAGTTCTACGCGGGCAAGAGGAGGCCCGTGATAGTGCCCATGATGAGCATGGAGGACCTGACCACACCCTACTTCCGAGATGAGGAGCTTTTCTGCACTGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGAAATGCCAGTGCCATGTTCATCCTCCCTGACCAGGGCAAGATGCAGCAGGTGGAAGCCAGCTTGCAACCAGAGACCCTGAGGAAGTGGAAGAATTCTCTGAAACCCAGGATGATAGATGAGCTCCACCTGCCCAAGTTCTCCATCTCCACCGACTACAGCCTGGAGGATGTCCTTTCAAAGCTGGGCATCAGGGAAGTCTTCTCCACACAGGCTGACCTGTCTGCAATCACAGGAACCAAGGATCTGAGAGTCTCTCAGGTGGTCCACAAGGCTGTGCTGGACGTGGCTGAGACAGGCACAGAAGCAGCTGCTGCCACTGGAGTCAAATTTGTCCCAATGTCTGCGAAACTGTACCCTCTGACTGTATATTTCAATCGGCCTTTCCTGATAATGATCTTTGACACAGAAACTGAAATTGCCCCCTTTATAGCCAAGATAGCCAACCCCAAATGA

ラットセルピンＡ３Ｎ　核酸配列（NM_031531.1）（配列番号３１）
ATGGATGGGATCGGCTCTGCTCTCCTCTCCTTCCCAGATTGCATACTGGGAGAGGACACTCTATTCCATGAAGACCAAGACAAGGGGACACAACTGGACAGTCTCACATTGGCCTCCATCAATACTGACTTTGCCTTCAGCCTCTACAAGAAGCTGGCTTTGAGGAATCCACATAAAAATGTTGTCTTCTCCCCACTTAGCATCTCAGCCGCCTTGGCCGTCGTGTCCCTGGGAGCAAAGGGCAGCAGCATGGAAGAGATTCTAGAAGGTCTCAAGTTCAATCTCACAGAGACCCCTGAGACAGAAATCCACCGGGGCTTTGGACACCTCCTCCAGAGGCTCAGCCAGCCAAGGGACGAGATACAGATCAGTACAGGCAATGCCCTGTTTATTGAAAAACGCCTTCAGGTCCTGGCAGAGTTCCAGGAGAAGGCAAAGGCTCTGTACCAAGCTGAGGCCTTCACAGCTGATTTCCAGCAGTCTCGTGAGGCCAAAAAGCTCATCAATGACTATGTGAGTAAACAGACCCAGGGGAAGATCCAGGGACTGATCACAAACCTAGCTAAGAAGACATCCATGGTACTGGTGAATTACATCTACTTTAAAGGCAAATGGAAGGTGCCTTTTGACCCTCGGGACACATTCCAGTCTGAGTTCTACTCTGGCAAAAGGAGGTCTGTGAAAGTGCCCATGATGAAGCTTGAGGACCTGACCACACCCTACGTCCGGGATGAGGAGCTGAACTGCACTGTTGTGGAGCTGAAGTACACAGGAAATGCCAGCGCCCTGTTTATCCTCCCTGACCAGGGCAAGATGCAGCAGGTGGAAGCCAGCTTGCAACCAGAGACCCTGAGGAGATGGAAGGACTCTCTCAGGCCCAGCATGATAGATGAGCTCTACCTGCCCAAGTTCTCCATCTCTGCTGACTACAACCTGGAGGACGTCCTTCCAGAGCTGGGCATCAAAGAAGTCTTCTCCACACAGGCTGACCTGTCTGGGATCACAGGGGATAAGGACCTGATGGTCTTTCAGGTGGTCCACAAGGCTGTTCTGGATGTGGCTGAGACAGGCACAGAAGCAGCCGCTGCCACAGGGGTCAAATTTGTTCCAATGTCTGCAAAACTGGACCCTCTGATTATAGCTTTCGACCGGCCTTTCCTGATGATTATCTCTGACACAGAAACTGCAATAGCTCCCTTTTTGGCCAAGATATTTAACCCCAAATGA
　ある実施形態において、全長セルピンＡ３は、配列番号１～２３および２７から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、全長セルピンＡ３は、配列番号１、２～１７、１９、２１～２３および２７から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、全長セルピンＡ３は、配列番号１、４、５、１１、１２、１４～２３および２７から選択されるアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、全長セルピンＡ３は、配列番号１、１１、１２、または２７のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。
　ある実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号１～２３から選択されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列、または配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号１、２～１７、１９、および２１～２３から選択されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列、または配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号１、４、５、１１、１２、および１４～２３から選択されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列、または配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。
　さらなる実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号１～４、８～１１、および１３～２３から選択されるアミノ酸配列から表１に示すシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列、または配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号１、２～４、８～１１、１３～１７、１９、および２１～２３から選択されるアミノ酸配列から表１に示すシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列、または配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号１、４、１１、および１４～２３から選択されるアミノ酸配列から表１に示すシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列、または配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。
　さらなる実施形態において、成熟セルピンＡ３は、配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。
　本開示において、全長セルピンＡ３および成熟セルピンＡ３またはそれらと機能的に同等なポリペプチドは、修飾されたポリペプチドであってもよい。かかる修飾としては、例えば、タグ付加、糖鎖付加、部分的糖鎖付加、糖鎖不形成が例示され、さらに糖鎖は天然のものであっても改変されたものであってもよい。
　全長および成熟セルピンＡ３またはそれらと機能的に同等なポリペプチドの入手方法は特に限定されず、例えば組換え発現（哺乳類細胞、酵母、大腸菌、昆虫細胞等）、無細胞系を用いた合成等によって製造できるほか、市販品を購入することも可能である。
　炎症性腸疾患（本明細書中、ＩＢＤとも記載する）は、慢性あるいは寛解・再燃性の腸管の炎症性疾患を指す。ＩＢＤには、潰瘍性大腸炎およびクローン病が含まれる。実施例において、セルピンＡ３は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発ＩＢＤモデルマウスにおいて骨髄内の間葉系幹細胞の減少を抑制することが示された。それゆえ、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、ＩＢＤに起因する間葉系幹細胞の減少の抑制、またはＩＢＤの治療または予防に用いることができる。
　ＩＢＤの治療には、寛解の導入、寛解の維持、および再燃の抑制が含まれる。ある実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、寛解の維持または再燃の抑制に用いられる。本開示において、ＩＢＤを患っている対象（ＩＢＤ患者ともいう）には、活動期および寛解期のＩＢＤ患者が含まれる。
　ＩＢＤの治療には、セルピンＡ３のポリペプチドを精製し製剤化したものを用いてもよく、また、セルピンＡ３を分泌する組織、細胞や、その組織や細胞からのセルピンＡ３が含まれる分泌物または培養上清を用いてもよい。
　セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、所望の効果を発揮しうる量（本明細書中、「有効量」という）で対象に投与される。投与量は、対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜決定される。例えば、セルピンＡ３の量として、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり０．００００００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、対象あたり０．００００１から１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、１日１回で、または複数回（例えば２、３または４回）に分けて投与してもよく、１日または数日（例えば２、３、４、５または６日）、１週間または数週間（例えば２、３、４、５または６週間）、１ヶ月または数ヶ月（例えば２、３、４、５または６ヶ月）の間隔をあけて投与してもよい。投与期間も特に限定されず、１日または数日（例えば２、３、４、５または６日）、１週間または数週間（例えば２、３、４、５または６週間）、１ヶ月または数ヶ月（例えば２、３、４、５または６ヶ月）でありうる。
　セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、全身に、または局所的に投与されうる。投与方法としては、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、髄腔内投与などが挙げられる。ある実施形態において、セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、静脈内または髄腔内投与される。
　セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、間葉系幹細胞の培養に用いる場合、例えば、セルピンＡ３の最終濃度が、１ｐｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬとなるよう、培地に添加されうる。
　本開示の組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、有効成分に加え、医薬上許容される担体を含んでもよい。医薬上許容される担体としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。例えば、医薬上許容される担体は、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などであってよい。また、例えば、ＩＢＤの治療を目的とした場合であって、組成物が細胞を含む場合には、医薬上許容される担体は、上記に加え、水、培地、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、またはＤ－マンニトールなどを含む等張液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などであってもよい。
　組成物の剤形は、限定されないが、経口または非経口投与製剤、例えば注射剤である。注射剤には、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤が含まれる。組成物は、凍結されていてもよく、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロースなどの凍結保護剤を含んでもよい。
　セルピンＡ３またはこれを含む組成物は、間葉系幹細胞の培養に用いる培地の添加剤として用いても良い。培地添加剤はいかなる剤形で提供されてもよく、例えば、顆粒、粉末、錠剤などの固体、溶液、懸濁液、乳濁液などの液体、あるいは、固体、半固体または液体を封入したカプセルとして提供され得るが、これらに限定されない。培地添加剤は、例えば、間葉系幹細胞を含む一般的な動物細胞培養用の培地に添加することにより、間葉系幹細胞を含む付着性細胞の培養に使用し得る。かかる培地としては、間葉系幹細胞の培養に用いることが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、MesenCultTM（STEMCELL Technologies社）が挙げられる。これらをはじめとする任意の培地にセルピンＡ３を添加し／含有させて、間葉系幹細胞を含む付着性細胞の培養に用いることができる。当該培地には、間葉系幹細胞の増殖を阻害しない限り、さらに他の成分を添加してもよい。
　本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。
［１］
　間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制するため組成物であって、セルピンＡ３を含む組成物。
［２］
　前記間葉系幹細胞が、コロニー形成性の間葉系幹細胞である、前記１に記載の組成物。
［３］
　前記間葉系幹細胞が、骨髄の間葉系幹細胞である、前記１または２に記載の組成物。
［４］
　対象に投与される、前記１～３のいずれかに記載の組成物。
［５］
　前記対象が、炎症性腸疾患を患っている、前記４に記載の組成物。
［６］
　前記間葉系幹細胞の減少が、炎症性腸疾患に起因する、前記１～５のいずれかに記載の組成物。
［７］
　間葉系幹細胞の培養に用いるための、前記１～３のいずれかに記載の組成物。
［８］
　炎症性腸疾患を治療するための、セルピンＡ３を含む組成物。
［９］
　前記セルピンＡ３が、
ａ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列を含み、且つ、全長セルピンＡ３の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟セルピンＡ３の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟セルピンＡ３をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟セルピンＡ３をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド
からなる群から選択される、前記１～８のいずれかに記載の組成物。
［１０］
　前記セルピンＡ３が、前記ａ）またはｂ）のポリペプチドである、前記９に記載の組成物。
［１１］
　前記全長セルピンＡ３が、配列番号１、１１、１２、または２７のアミノ酸配列を含む、前記９または１０に記載の組成物。
［１２］
　前記成熟セルピンＡ３が、配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含む、前記９～１１のいずれかに記載の組成物。
［１３］
　前記全長セルピンＡ３をコードする核酸配列が、配列番号２９、３０、または３１のアミノ酸配列を含む、前記９～１２のいずれかに記載の組成物。
［１４］
　前記セルピンＡ３が、ヒトセルピンＡ３、マウスセルピンＡ３Ｎ、またはラットセルピンＡ３Ｎである、前記１～１３のいずれかに記載の組成物。
［１５］
　間葉系幹細胞の増殖の促進または減少の抑制に用いるための、セルピンＡ３。
［１６］
　炎症性腸疾患の治療に用いるための、セルピンＡ３。
　間葉系幹細胞の増殖の促進または減少の抑制に用いるための医薬の製造のための、セルピンＡ３の使用。
［１７］
　炎症性腸疾患の治療に用いるための医薬の製造のための、セルピンＡ３の使用。
［１８］
　間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制するための方法であって、対象にセルピンＡ３を投与することを含む方法。
［１９］
　炎症性腸疾患を治療するための方法であって、対象にセルピンＡ３を投与することを含む方法。
　本開示で引用するすべての文献は、出典明示により本開示の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
１.ＩＢＤモデルマウスの作製
　デキストラン硫酸ナトリウム（Dextran Sulfate Sodium Salt（ＤＳＳ）、３６～５０ｋＤａ；MP Biomedicals、カタログ番号：１６０１１０）が１．５ｗｔ/ｖｏｌ％となるように配合した飲料水を準備し、０．４５μｍ酢酸セルロース膜を用いて濾過した。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（３匹）に、上述の１．５ｗｔ/ｖｏｌ％ＤＳＳ飲料水を６日間投与することにより、大腸炎を誘発させた。６日目以降はＤＳＳを含まない通常の飲料水を投与した。実験期間におけるマウスの各日の体重を測定し、実験開始日（ＤＳＳ投与開始日）の体重を１００％として体重変化を調べた。比較のため、ＤＳＳを投与せずに飼育した健常マウス（野生型マウス）の体重変化も調べた。ｐ値は、二元配置分散分析（two-way ANOVA）によって計算した。
　また、上記と同様にＤＳＳをマウスに摂取させる実験において、ＤＳＳ投与開始日（０日目）から３、６、９、１２、１５日目においてマウスの大腸を採取し、大腸画像をカメラで撮影した。また、撮影した画像から、ImageJソフトウェアを用いて大腸長さを算出した。ｐ値は、二元配置分散分析（two-way ANOVA）によって計算した。
　健常マウスと比較して、ＤＳＳ投与マウスにおいて有意な体重減少が観察された（図１）。また、ＤＳＳ投与開始日から６、９、１２、１５日目には、ＤＳＳ投与マウスの大腸長さは、健常マウスと比較して有意に減少していた（図２）。これらの結果により、１．５ｗｔ/ｖｏｌ％ＤＳＳ溶液を投与することで大腸炎が誘発され、ＩＢＤモデルマウスを作製できることを確認した。
２.ＩＢＤモデルマウスの骨髄細胞におけるコロニー形成性細胞の減少
　実験開始（ＤＳＳ投与開始）から３、６、９、１２、１５日目に、健常マウスおよびＤＳＳ投与マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取した。なお、ＤＳＳは上記１と同様の方法で投与した。採取した骨髄細胞に１Ｘ　RBC lysis buffer（Biolegend）を加え、室温で５分間赤血球を溶血処理した。次いで、遠心分離を行ってから上清を除去して、沈殿した細胞を回収した。回収した細胞を、１０μＭ　Ｙ２７６３２（Tocris bioscience）、１５ｖｏｌ％　ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Sigma-Aldrich）、１ｖｏｌ％　ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）、１Ｘ　ＮＥＡＡ（ＭＥＭ用非必須アミノ酸、Gibco）、５５μＭ　２－メルカプトエタノール（Gibco）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid、ナカライテスク）、１Ｘ　GlutaMAX TM Supplement（Invitrogen）を含むように調整したα－ＭＥＭ培地（Invitrogen）に分散し、５×１０５細胞をコラーゲンＩ被覆プレートの各ウェルに播種し、培養した。培養条件は、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２とした。培地は３日ごとに交換した。培養１０日目に培地を除去し、１×ＰＢＳ（ナカライテスク）でウェルを洗浄した後、コロニーを０．０５ｗｔ/ｖｏｌ％　クリスタルバイオレット（ナカライテスク）で３０分間染色した。染色されたコロニーにおいて、コロニーの形状、大きさ、コロニー内の細胞密度等を指標として間葉系幹細胞のコロニーと判断できるものを計数し、二元配置分散分析（two-way ANOVA）にてＰ値を求めた。
　骨髄細胞を採取し固相上で培養すると、間葉系幹細胞を含む付着性の細胞が固相に付着して増殖することが良く知られている。間葉系幹細胞については、付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞のうちコロニー形成性を有するものが、コロニーを形成しつつ増殖する。ＤＳＳ投与開始日から３日目に採取した骨髄細胞では形成される間葉系幹細胞のコロニー数が減少する傾向がみられ、６、９、１２日目に採取した骨髄細胞では間葉系幹細胞のコロニー数が有意に減少した（図３）。なお、椎骨を対象に同様の実験を行っても、形成される間葉系幹細胞のコロニー数が減少する傾向が観察された。この結果は、ＤＳＳ誘発ＩＢＤモデルマウスにおいて骨髄の間葉系幹細胞が減少することを示す。
３.インビトロにおけるセルピンＡ３Ｎによるコロニー形成性細胞の増加
　ＤＳＳ投与開始日から９日目のＤＳＳ投与マウスおよび同期間通常飼育の健常マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取した。なお、ＤＳＳは上記１と同様の方法で投与した。採取した骨髄細胞に１Ｘ　RBC lysis buffer（Biolegend）を加え、室温で５分間赤血球を溶血処理した。次いで、遠心分離を行ってから上清を除去して、沈殿した細胞を回収した。回収した細胞の５×１０５細胞をコラーゲンＩ被覆プレートの各ウェルに播種し、１０μＭ　Ｙ２７６３２（Tocris bioscience）、１５ｖｏｌ％　ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Sigma-Aldrich）、１ｖｏｌ％　ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）、１Ｘ　ＮＥＡＡ（ＭＥＭ用非必須アミノ酸、Gibco）、５５μＭ　２－メルカプトエタノール（Gibco）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid、ナカライテスク）、１Ｘ　GlutaMAX TM Supplement（Invitrogen）を含むように調整したα－ＭＥＭ培地（Invitrogen）を用いて培養した。培養条件は、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２とした。培養開始時に、マウスセルピンＡ３Ｎ（R&D systems、カタログ番号：４７０９ - ＰＩ（４７０９ - ＰＩ - ０１０)）（配列番号２８）（Ｃ末端に6-His tag付加）またはＰＢＳ（１×ＰＢＳ、ナカライテスク、カタログ番号：１４２４９-２４）を培地に添加した。詳細には、セルピンＡ３Ｎの添加のため、１μＬの５００ｎｇ／ｍＬ　セルピンＡ３Ｎストック溶液を、１．２５ｍＬの前記調整済みα－ＭＥＭ培地で希釈し、４００ｎｇ／ｍＬ　セルピンＡ３Ｎ培地を作製した。このセルピンＡ３Ｎ培地と前記調整済みα－ＭＥＭ培地とを混合し、所定の最終濃度のセルピンＡ３Ｎを含む培地を作製し、この培地で細胞を懸濁した後に、各ウェルに播種した。比較のため、１μＬのセルピンＡ３Ｎストック溶液にかえて１μＬのＰＢＳを用いた。培地は３日ごとに交換し、交換時にもＰＢＳまたはセルピンＡ３Ｎを含む培地を用いた。培養１０日目に培地を除去し、１Ｘ　ＰＢＳ（ナカライテスク）でウェルを洗浄した後、コロニーを０．０５ｗｔ/ｖｏｌ％　クリスタルバイオレット（ナカライテスク）で３０分間染色した。染色されたコロニーにおいて、コロニーの形状、大きさ、コロニー内の細胞密度等を指標として間葉系幹細胞のコロニーと判断できるものを計数し、二元配置分散分析（two-way ANOVA）にてＰ値を求めた。
　健常マウスから採取した骨髄細胞をセルピンＡ３Ｎ（４ｎｇ／ｍＬ）の存在下で培養すると、間葉系幹細胞のコロニー数の有意な増加が観察された（図４、左）。ＤＳＳ投与マウスから採取した骨髄細胞では間葉系幹細胞のコロニー数の減少が観察される（図３）が、セルピンＡ３Ｎ（４ｎｇ／ｍＬ）の添加により間葉系幹細胞のコロニー数が有意に回復した（図４、右）。
４.インビボにおけるセルピンＡ３Ｎによるコロニー形成性細胞の増加
　上記１に記載のように１．５％ＤＳＳをマウスに６日間投与して大腸炎を誘発した。マウスは二群に分け、ＤＳＳ投与開始日から５日目までの６日間、ＤＳＳの経口投与と共に、一方の群にはセルピンＡ３Ｎ（R&D systems、カタログ番号：４７０９ - ＰＩ）（４００ｎｇ）を含むＰＢＳ（１００μＬ）を、他方の群にはセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳ（１×ＰＢＳ、ナカライテスク、カタログ番号：１４２４９-２４）（１００μＬ）を、一日一回、１ショットで静脈注射により投与した。ＤＳＳ投与開始日から９日目に、各群の大腿骨から骨髄細胞を採取し、採取した骨髄細胞に１Ｘ　RBC lysis buffer（Biolegend）を加え、室温で５分間赤血球を溶血処理した。次いで、遠心分離を行ってから上清を除去して、沈殿した細胞を回収した。回収した細胞の５×１０５細胞をコラーゲンＩ被覆プレートの各ウェルに播種し、１０μＭ　Ｙ２７６３２（Tocris bioscience社）、１５ｖｏｌ％　ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Sigma-Aldrich）、１ｖｏｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）、１Ｘ　ＮＥＡＡ（ＭＥＭ用非必須アミノ酸、Gibco）、１ｖｏｌ％　モノチオグリセロール（Wako）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid、ナカライテスク）、１Ｘ　GlutaMAX TM Supplement（Invitrogen）を含むよう調整したα－ＭＥＭ培地（Invitrogen）を用いて培養した。培養条件は、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２とした。培地は３日ごとに交換した。培養１０日目に、培地を除去し、１Ｘ　ＰＢＳでウェルを洗浄してから、コロニーを０．０５ｗｔ/ｖｏｌ％　クリスタルバイオレットで３０分間染色した。染色されたコロニーにおいて、コロニーの形状、大きさ、コロニー内の細胞密度等を指標として間葉系幹細胞のコロニーと判断できるものを計数し、一元配置分散分析（one-way ANOVA）によってｐ値を計算した。
　ＤＳＳ投与マウスから採取した骨髄では間葉系幹細胞のコロニー数の減少が観察されるが（図３）、ＤＳＳ投与マウスにセルピンＡ３Ｎを投与すると間葉系幹細胞のコロニー数が有意に回復した（図５）。
　以上の結果から、セルピンＡ３Ｎは、骨髄細胞中のコロニー形成性の間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制することが示された。
５．ＩＢＤモデルマウスにおけるセルピンＡ３Ｎの効果（１）
　８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（６匹）に、上述の１．５ｗｔ／ｖｏｌ％ＤＳＳ（MP biomedicals、カタログ番号：１６０１１０）の飲料水を６日間投与することにより、大腸炎を誘発させた。６日目以降はＤＳＳを含まない通常の飲料水を投与した。マウスは二群に分け、ＤＳＳ投与開始日から５日目までの６日間、ＤＳＳの経口投与と共に、一方の群にはマウスセルピンＡ３Ｎ（R&D systems，カタログ番号：４７０９ - ＰＩ - ０１０）（４００ｎｇ）を含むＰＢＳ（１×ＰＢＳ、ナカライテスク、カタログ番号：１４２４９-２４）（１００μＬ）を、他方の群にはセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳ（１００μＬ）を、一日一回、１ショットで静脈注射により投与した。各マウスの体重変化を毎日測定した。ＤＳＳ投与開始日から数えて９日目に各マウスから大腸を採取し、大腸画像をカメラで撮影した。また、撮影した画像から、ImageJソフトウェアを用いて大腸長さを算出した。ｐ値は、二元配置分散分析（two-way ANOVA）によって計算した。
　ＤＳＳ投与マウスにおける体重減少は、セルピンＡ３Ｎの投与により有意に抑制された（図６上）。また、ＤＳＳ投与マウスの大腸長さの減少も、セルピンＡ３Ｎの投与により有意に抑制された（図６下）。以上の結果は、セルピンＡ３ＮがＩＢＤを治療し得ることを示す。
６．ＩＢＤモデルマウスにおけるセルピンＡ３Ｎの効果（２）
　８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（６匹）に、上述の１．５ｗｔ／ｖｏｌ％ＤＳＳ（MP biomedicals、カタログ番号：１６０１１０）の飲料水を６日間投与することにより、大腸炎を誘発させた。６日目以降はＤＳＳを含まない通常の飲料水に変更し、２０日目まで投与した。続いて、２１日目から６日間は、再び、上記と同様のＤＳＳを含む飲料水を投与した。そして２７日目からは、通常の飲料水を投与した。マウスは二群に分け、初回のＤＳＳ投与開始日（実験開始日、０日目）から５日目までの６日間、ＤＳＳの経口投与と共に、一方の群にはマウスセルピンＡ３Ｎ（R&D systems，カタログ番号：４７０９ - ＰＩ - ０１０）（４００ｎｇ）を含むＰＢＳ（１×ＰＢＳ、ナカライテスク、カタログ番号：１４２４９-２４）（１００μＬ）を、他方の群にはセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳ（１００μＬ）を、一日一回、１ショットで静脈注射により投与した。
　実験開始日から１３日目までの各マウスの体重変化の測定結果を、通常飼育の健常マウス（ＤＳＳ非投与、コントロール）の体重測定結果と共に図７に示す。図７には、実験開始日の体重を１００％として各マウスの体重変化を示している。ＤＳＳ投与マウスにおける体重減少は、セルピンＡ３Ｎの投与により有意に抑制され、ＤＳＳ投与停止後の体重回復もセルピンＡ３Ｎの投与群の方が良好であった（図７）。更にＤＳＳ投与を停止した６日目以降、３０日目まで、セルピンＡ３Ｎ投与群のマウスの体重は、非投与群マウスに比べて高い水準にあった。
７．ＩＢＤモデルマウスにおけるセルピンＡ３Ｎの効果（３）
　８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（６匹）に、上述の１．５ｗｔ／ｖｏｌ％ＤＳＳ（MP biomedicals、カタログ番号：１６０１１０）の飲料水を６日間投与することにより、大腸炎を誘発させた。６日目以降はＤＳＳを含まない通常の飲料水に変更し、２０日目まで投与した。続いて、２１日目から６日間は、再び、上記と同様のＤＳＳを含む飲料水を投与した。そして２７日目からは、通常の飲料水を投与した。マウスは二群に分け、初回のＤＳＳ経口投与を停止した６日目から１１日目までの６日間、一方の群にはマウスセルピンＡ３Ｎ（R&D systems，カタログ番号：４７０９ - ＰＩ - ０１０）（１μｇ）を含むＰＢＳ（１×ＰＢＳ、ナカライテスク、カタログ番号：１４２４９-２４）（１００μＬ）を、他方の群にはセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳ（１００μＬ）を、一日一回、１ショットで静脈注射により投与した。
　初回のＤＳＳ投与開始日（実験開始日、０日目）から１３日目までの各マウスの体重変化の測定結果を、通常飼育の健常マウス（ＤＳＳ非投与、コントロール）の体重測定結果と共に図８に示す。図８には、実験開始日の体重を１００％として各マウスの体重変化を示している。ＤＳＳ投与マウスにおける体重減少は、ＤＳＳ投与後のセルピンＡ３Ｎの投与によっても有意に抑制され、ＤＳＳ投与停止後の体重回復もセルピンＡ３Ｎの投与群の方が良好であった（図８）。
８．ＩＢＤモデルマウスにおけるセルピンＡ３Ｎの効果（４）
　上記６の実験において、再度ＤＳＳによってマウスに大腸炎を誘発した場合におけるセルピンＡ３Ｎの効果について評価した。図９は、実験開始日から２１日目（追加のＤＳＳ投与開始日）の各マウスの体重を基準（１００％）として、その日後のマウスの体重変化を示した図である。比較のため、通常飼育の健常マウス（ＤＳＳ非投与、コントロール）の体重測定結果を共に示す。
　ＤＳＳを投与されていない健常マウス（control）の体重は順調に増加する一方、ＤＳＳを投与したマウス（DSS+PBS、DSS+Seripina3n）の体重は減少した。初回のＤＳＳ誘発時においてセルピンＡ３Ｎを投与した群（DSS+Seripina3n）の体重減少は、セルピンＡ３Ｎ非投与群（DSS+PBS）と比べて、明らかに抑制された（図９）。即ち、セルピンＡ３Ｎは、ＩＢＤの寛解維持、再燃抑制をする効果があることが示された。
９．ＩＢＤモデルマウスにおけるセルピンＡ３Ｎの発現（シングルセルＲＮＡ-ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ解析）
　８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（１８匹）に、上述の１．５ｗｔ／ｖｏｌ％ＤＳＳ（MP biomedicals、カタログ番号：１６０１１０）の飲料水を６日間投与することにより、大腸炎を誘発させた。６日目以降はＤＳＳを含まない通常の飲料水を投与した。ＤＳＳ投与開始日から数えて０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１５日目に各３匹のマウスから大腸を採取した。そして、採取した大腸の細胞を解離、分散させた細胞懸濁液を調製した。ＦＡＣＳ（装置名 ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩＩ、Becton, Dickinson and Company）を用いて、細胞分散液中の死細胞を除去するとともに、全生細胞の単離（一細胞調製）を行った。１８匹のマウスと６つの異なる時点からの合計１４６２４個の細胞が補足された。そして、smart-seq2法に則り、シークエンシングライブラリを構築した。作製したライブラリに対してシーケンサー（装置名NextSeq 500、Illumina, Inc）を使用してシークエンシングを行った。即ち、１８匹のマウスと６つの異なる時点からの合計１４６２４個の細胞についてのプロファイルを得た。
　得られた全シーケンスデータに対して、ＵＭＡＰ法でクラスタリングを行った。その結果、ＩＢＤモデルマウスの大腸の細胞は、１５のクラスターにクラスタリングされた。各クラスターの細胞型は、標識遺伝子に基づいて特定した。例えば、１つのクラスターの細胞型は、３つの標識遺伝子（Col1a1, Pdgfra, Spon2）によって、間質細胞（ストローマ細胞）であると特定された。
　また、炎症の様々な段階（経日）での遺伝子の発現変動を検出すべく、大腸のサンプリング日毎のストローマ細胞の発現遺伝子を解析したところ、その発現量が大きく変動していた２５７の発現変動遺伝子（differentially expressed gene, DEG）を特定した。これらの発現変動遺伝子をＫ平均法（K-means clustering）に基づいて解析すると、類似した発現パターンを有する遺伝子をグループ化することができ、その結果、２５７の発現変動遺伝子は４つのサブクラスター（Ｋ１～Ｋ４）に分類された（図１０、左側グラフ）。このうち１つのサブクラスターＫ４は、ＤＳＳ投与開始日から数えて６日目～９日目に発現がピークとなる遺伝子が帰属するクラスターであり、セルピンＡ３ＮはこのサブクラスターＫ４において最も発現レベルが高い遺伝子であることが確認された（図１０、右側グラフ）。
１０．ＩＢＤモデルマウスにおけるセルピンＡ３Ｎの効果（４）
　８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（６匹）に、上述の１．５ｗｔ／ｖｏｌ％ＤＳＳ（MP biomedicals、カタログ番号：１６０１１０）の飲料水を６日間投与することにより、大腸炎を誘発させた。６日目以降はＤＳＳを含まない通常の飲料水に変更して実験終了（９日目）まで投与した。マウスは二群に分け、一方のマウスの一群には、ＤＳＳ投与開始日から５日目までの６日間、ＤＳＳの投与と共に、マウスセルピンＡ３Ｎ（R&D systems，カタログ番号：４７０９ - ＰＩ - ０１０）（４００ｎｇ）を含むＰＢＳ（１×ＰＢＳ、ナカライテスク、カタログ番号：１４２４９-２４）（１００μＬ）を、他方のマウスの一群にはセルピンＡ３Ｎを含まないＰＢＳ（１００μＬ）を、一日一回、１ショットで静脈注射により投与した。ＤＳＳ投与開始日から９日目にマウスから大腸を採取した。
　採取したマウス大腸から、製造業者のプロトコールに従い、ISOGENE (株式会社ニッポンジーン)を用いて全ＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を抽出し、更に、RNeasy Plus Mini kit （QIAGEN）を用いて精製を行った。精製後の試料溶液中のトータルＲＮＡの濃度は、蛍光光度計（Qubit 3.0 Fluorometer 、Thermo Fisher Scientific）にて測定した。そして、測定濃度からＲＮＡが適正量（５００ｎｇ）となるように調整し、定量ＲＴ－ＰＣＲ（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-qPCR）用サンプルを作製した。このサンプルを用い、定量ＲＴ－ＰＣＲで、大腸でのＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６の発現量を測定した。具体的には、ｃＤＮＡ合成キット（iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR、Bio-Rad Laboratories）を用い、操作手順書に従ってトータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成したｃＤＮＡ、混合試薬（THUNDERBIRD SYBR qPCR mix 、TOYOBO）、所定のプライマーセットを用いて、定量ＲＴ－ＰＣＲを実施した。
　使用したプライマーセットを以下に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　測定は３回実施した。そして、CFX manager softward（Bio Rad Laboratories）を使用し、スタンダードカーブメソッドに基づいて、セルピンＡ３Ｎ投与群（DSS+Serpina3n）と非投与群（DSS+PBS）とにおける上記遺伝子（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６）の発現量を、通常飼育の健常マウス（ＤＳＳ非投与、コントロール）のこれらの発現量を１として比較した。なお、内部標準遺伝子にβ-アクチン（actb）を用いて発現量は補正を行った。結果を図１１に示す。
　図１１からもわかるように、ＤＳＳ投与によりＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６の遺伝子の発現量は増大するが、セルピンＡ３Ｎの投与により、これらの発現が抑制されることが認められた。即ち、セルピンＡ３Ｎの投与により炎症性のサイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６の産生が抑制されることが示唆された。

Claims (12)

  1. 　間葉系幹細胞の増殖を促進または減少を抑制するため組成物であって、セルピンＡ３を含む組成物。
  2. 　前記間葉系幹細胞が、コロニー形成性の間葉系幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記間葉系幹細胞が、骨髄の間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　対象に投与される、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 　前記対象が、炎症性腸疾患を患っている、請求項４に記載の組成物。
  6. 　前記間葉系幹細胞の減少が、炎症性腸疾患に起因する、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　炎症性腸疾患を治療するための、セルピンＡ３を含む組成物。
  8. 　前記セルピンＡ３が、
    ａ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
    ｂ）成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列を含み、且つ、全長セルピンＡ３の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    ｃ）全長もしくは成熟セルピンＡ３の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、
    ｄ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、
    ｅ）全長もしくは成熟セルピンＡ３のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、
    ｆ）全長もしくは成熟セルピンＡ３をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド、および
    ｇ）全長もしくは成熟セルピンＡ３をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、間葉系幹細胞の増殖促進活性または減少抑制活性を有するポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
  9. 　前記セルピンＡ３が、前記ａ）またはｂ）のポリペプチドである、請求項８に記載の組成物。
  10. 　前記全長セルピンＡ３が、配列番号１、１１、１２、または２７のアミノ酸配列を含む、請求項８または９のいずれかに記載の組成物。
  11. 　前記成熟セルピンＡ３が、配列番号２４、２５、２６または２８のアミノ酸配列を含む、請求項８～１０のいずれかに記載の組成物。
  12. 　前記全長セルピンＡ３をコードする核酸配列が、配列番号２９、３０、または３１のアミノ酸配列を含む、請求項８～１１のいずれかに記載の組成物。
PCT/JP2020/029229 2019-07-31 2020-07-30 間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物 WO2021020509A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021535424A JP7561348B2 (ja) 2019-07-31 2020-07-30 間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物
US17/631,072 US20220265787A1 (en) 2019-07-31 2020-07-30 Composition for promoting growth or suppressing decrease of mesenchymal stem cells

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-141325 2019-07-31
JP2019141325 2019-07-31
JP2020058544 2020-03-27
JP2020-058544 2020-03-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021020509A1 true WO2021020509A1 (ja) 2021-02-04

Family

ID=74230673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/029229 WO2021020509A1 (ja) 2019-07-31 2020-07-30 間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220265787A1 (ja)
JP (1) JP7561348B2 (ja)
WO (1) WO2021020509A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3556378A4 (en) 2017-01-27 2020-11-18 StemRIM Inc. THERAPEUTIC AGENT FOR CARDIOMYOPATHY, OLD MYOCARDINAL INFARM AND CHRONIC HEART FAILURE

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03181422A (ja) * 1989-12-04 1991-08-07 John Lezdey 炎症の治療方法及び炎症の治療用合成薬
JPH09512423A (ja) * 1994-03-31 1997-12-16 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルベニア エラスターゼ阻害活性を有するα−１−アンチキモトリプシンアナログ
WO2008053892A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 Genomix Co., Ltd. Produit pharmaceutique servant à favoriser la régénération fonctionnelle d'un tissu endommagé
WO2009133939A1 (ja) * 2008-04-30 2009-11-05 株式会社ジェノミックス 末梢循環への骨髄由来多能性幹細胞動員薬
JP2018502579A (ja) * 2015-01-08 2018-02-01 アプセト ゲーエムベーハー アンド ツェーオー．カーゲー α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）を発現する遺伝子改変された間葉系幹細胞

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03181422A (ja) * 1989-12-04 1991-08-07 John Lezdey 炎症の治療方法及び炎症の治療用合成薬
JPH09512423A (ja) * 1994-03-31 1997-12-16 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルベニア エラスターゼ阻害活性を有するα−１−アンチキモトリプシンアナログ
WO2008053892A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 Genomix Co., Ltd. Produit pharmaceutique servant à favoriser la régénération fonctionnelle d'un tissu endommagé
WO2009133939A1 (ja) * 2008-04-30 2009-11-05 株式会社ジェノミックス 末梢循環への骨髄由来多能性幹細胞動員薬
JP2018502579A (ja) * 2015-01-08 2018-02-01 アプセト ゲーエムベーハー アンド ツェーオー．カーゲー α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）を発現する遺伝子改変された間葉系幹細胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ORIMA, ICHIRO: "The Evaluation of the Human Neutrophil Elastase in Inflammatory Bowel Disease", JOURNAL OF THE KYORIN MEDICAL SOCIETY, vol. 25, no. 4, 1994, pages 537 - 544, XP055789732 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021020509A1 (ja) 2021-02-04
JP7561348B2 (ja) 2024-10-04
US20220265787A1 (en) 2022-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240050460A1 (en) Pharmaceuticals That Promote Functional Regeneration of Damaged Tissues
JP5960735B2 (ja) 損傷組織の機能的再生促進医薬
JP6199936B2 (ja) 骨髄間葉系および／または多能性幹細胞の血中動員による組織再生促進剤
US8673580B2 (en) Agent for recruitment of bone-marrow-derived pluripotent stem cell into peripheral circulation
Yan et al. ETS1 governs pathological tissue-remodeling programs in disease-associated fibroblasts
CN113194978B (zh) 具有间充质干细胞的动员活性的肽
US20240368235A1 (en) Disease Treatment Drug Based on Mesenchymal-Stem-Cell Mobilization
KR102146822B1 (ko) Hmgb1 단편을 이용한 척수 손상에 대한 신규 치료법
EP4291239A2 (en) Compounds, compositions and methods for treating age-related diseases and conditions
WO2021020509A1 (ja) 間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物
EP4144359A1 (en) Peptide having mesenchymal stem cell mobilizing activity
AU2014200688C1 (en) Pharmaceuticals that promote functional regeneration of damaged tissues
JPH0987199A (ja) 腎糸球体疾患治療剤
Oikarinen et al. Synthesis and degradation of connective tissue macromolecules in pachydermoperiostosis (PDF): evidence for altered processing of plasminogen activator inhibitor‐1 (PAI‐1)
JPWO2018003997A1 (ja) 臓器線維症の予防または治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20847533

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2021535424

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20847533

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1