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WO2021049617A1 - ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地およびアルブミンフリーの培養方法 - Google Patents

ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地およびアルブミンフリーの培養方法 Download PDF

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WO2021049617A1
WO2021049617A1 PCT/JP2020/034470 JP2020034470W WO2021049617A1 WO 2021049617 A1 WO2021049617 A1 WO 2021049617A1 JP 2020034470 W JP2020034470 W JP 2020034470W WO 2021049617 A1 WO2021049617 A1 WO 2021049617A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hematopoietic stem
stem cells
cells
tpo
medium
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/034470
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
山崎　聡
素生 渡部
政寿 櫻井
啓光 中内
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US17/641,699 priority patent/US20220298479A1/en
Priority to EP20863479.0A priority patent/EP4029566A4/en
Priority to JP2021545616A priority patent/JPWO2021049617A1/ja
Priority to CA3150657A priority patent/CA3150657A1/en
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Priority to IL291250A priority patent/IL291250A/en

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Definitions

  • the present invention discloses the composition of an albumin-free serum-free medium suitable for culturing human hematopoietic stem cells and an albumin-free culture method.
  • the present invention provides a method of culturing human hematopoietic stem cells, the method comprising contacting the human hematopoietic stem cells with PVA and PI3K activator.
  • Non-Patent Document 1 In the culture of hematopoietic stem cells, research is underway on proliferation using a chemically defined medium, and it is clear that mouse hematopoietic stem cells can be cultured using a chemically defined medium.
  • the present invention provides an albumin-free serum-free medium composition suitable for culturing human hematopoietic stem cells and an albumin-free culture method.
  • mouse hematopoietic stem cells (sometimes called KSL cells because of their isolation) are long-term by adding polyvinyl alcohol (PVA) in albumin-free serum-free medium. We have found and reported that it can grow in large quantities (Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019). However, for human hematopoietic stem cells, a method for growing them in an albumin-free serum-free medium has not been established. Now we have a variety of human hematopoietic stem cells, including the PI3K and Akt pathways, in the presence of PVA, tissue factor (SCF) and thrombopoietin (TPO) in albumin-free serum-free medium.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • human hematopoietic stem cells in the presence of PVA and PI3K activators and TPO or TPO receptor agonists in albumin-free serum-free medium are megakaryocyte lineage cells when cultured for long periods of time. It was found that it becomes easy to differentiate into. We also further indicate that the differentiation of megakaryocyte lineages into cells is inhibited by adding UM171 to the medium, or the number of megakaryocyte lineage cells is reduced, and UM171 is a CD34 + cell. It was found to be beneficial for the maintenance and proliferation of hematopoietic stem cells.
  • a method for culturing human hematopoietic stem cells Including culturing human hematopoietic stem cells in culture medium
  • the culture medium contains polyvinyl alcohol, does not contain albumin, and (1) Includes phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activator and one or more selected from the group consisting of thrombopoietin (TPO) and TPO receptor agonists; (2) Containing one or more selected from the group consisting of stem cell factor (SCF) and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) Containing PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • the above culture increases the number of human hematopoietic stem cells, Method.
  • the method according to [1] above which comprises obtaining increased human hematopoietic stem cells.
  • the culture medium contains PI3K activator and does not contain stem cell factor (SCF).
  • SCF stem cell factor
  • the culture medium contains an agonist of PI3K activator and TPO.
  • the culture medium does not contain both SCF and TPO.
  • the culture medium is 4-N- [2-benzyl-7- (2-methyltetrazol-5-yl) -9H-pyrimid [4,5-b] indole-4-yl] cyclohexane-1,4. -The method according to any one of [1] to [5] above, further comprising diamine (UM171). [7] The method according to [6] above, wherein the culture period is 7 days or more. [8] A composition that does not contain albumin and does not contain albumin.
  • Human hematopoietic stem cells polyvinyl alcohol, (1) PI3K activator and one or more selected from the group consisting of TPO and TPO receptor agonists; (2) One or more selected from the group consisting of SCF and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • a composition comprising. [9] The composition according to the above [8], which comprises a PI3K activator and a TPO receptor agonist.
  • [12] Contains polyvinyl alcohol, does not contain albumin, and (1) Includes PI3K activator and one or more selected from the group consisting of TPO and TPO receptor agonists; (2) one or more selected from the group consisting of SCF and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) including PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • a method for culturing or producing human hematopoietic stem cells Including culturing human hematopoietic stem cells in culture medium
  • the culture medium contains polyvinyl alcohol and (1) Includes phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activator and one or more selected from the group consisting of thrombopoietin (TPO) and TPO receptor agonists; (2) Containing one or more selected from the group consisting of stem cell factor (SCF) and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) Containing PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • TPO thrombopoietin
  • SCF stem cell factor
  • PI3K activator and TPO receptor agonist Containing PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • the above culture increases the number of human hematopoietic stem cells
  • a composition comprising. [12] The composition according to the above [11], which comprises a PI3K activator and a TPO receptor agonist.
  • polyvinyl alcohol is contained and (1) Includes PI3K activator and one or more selected from the group consisting of TPO and TPO receptor agonists; (2) one or more selected from the group consisting of SCF and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) including PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • Culture medium for human hematopoietic stem cells [16] The culture medium according to the above [15], which is a serum-free medium. [17] The medium according to the above [15], which is a chemically defined medium. [18] The medium according to any one of [15] to [17] above, which does not contain albumin.
  • FIG. 1 shows mouse and human hematopoietic stem cells (mouse KSL cells) and human hematopoietic stem cells (CD34 + CD38-cells) at 10 ng / mL, respectively, in an albumin-free serum-free medium containing polyvinyl alcohol (PVA). The results of culturing in the presence of histological factor (SCF) and 100 ng / mL thrombopoietin (TPO) are shown.
  • SCF histological factor
  • TPO thrombopoietin
  • FIG. 2 shows hematopoietic cells obtained by culturing mouse and human hematopoietic stem cells in the presence of 10 ng / mL tissue factor (SCF) and 100 ng / mL thrombopoietin (TPO) in the absence of albumin and in the presence of PVA. It is a figure which shows the degree of phosphorylation of the signal factor downstream of SCF and TPO in a stem cell. The symbol “m” indicates mouse hematopoietic stem cells, and “h” indicates human hematopoietic stem cells.
  • SCF tissue factor
  • TPO thrombopoietin
  • FIG. 3 shows human hematopoietic stem cells in the absence of albumin and in the presence of PVA, in the presence of 10 ng / mL human tissue factor (SCF) and 100 ng / mL of human thrombopoietin (TPO), and AKT Activator II. The results of culturing in the presence of (AKTa) or PI3K activator (PI3Ka) are shown.
  • FIG. 4 shows the proliferation rates of total cells and CD34 + cells on day 7 after culturing human hematopoietic stem cells in the absence of albumin, in the presence of PVA, and in the presence of 100 ng / mL human thrombopoietin (TPO). Is shown.
  • SCF human tissue factor
  • TPO human thrombopoietin
  • FIG. 5 shows changes in the number of cells when human hematopoietic stem cells are cultured by substituting TPO with various TPO receptor agonists in the presence of albumin or PVA.
  • FIG. 6 shows the proliferation rate of total cells and CD34 + cells on day 7 when human hematopoietic stem cells were cultured by substituting TPO with various TPO receptor agonists in the presence of either albumin or PVA.
  • FIG. 7 shows human hematopoietic stem cells cultured in medium containing PI3K activator and TPO or butyzamide (Buty) in the absence of albumin and in the presence of PVA, and the total number of cells on day 7, the number of CD34 + cells, and GE mM. Indicates the number of colonies. The type of colony was determined under a microscope by collecting the colony under a microscope, preparing a cytospin sample, and then performing Giemsa staining.
  • FIG. 8 shows human hematopoietic stem cells cultured in a culture medium free of SCF and TPO but containing PI3K activator or TPO receptor agonist or a combination thereof in the absence of albumin and in the presence of PVA. It shows the proliferation rate of cells and CD34 + cells.
  • FIG. 9 shows a culture obtained on day 7 when human hematopoietic stem cells were cultured in a culture medium free of SCF and TPO but containing PI3K activator and TPO receptor agonist in the absence of albumin and in the presence of PVA. The proliferation rate of each cell population in the medium is shown.
  • FIG. 10 shows human hematopoietic stem cells cultured in a culture medium free of SCF and TPO but containing PI3K activator and TPO receptor agonist in the absence of albumin and in the presence of PVA, and cells on days 7 and 14. The transition of the total number and the transition of the number of CD34 + cells are shown.
  • FIG. 11 shows a gate of cells obtained on day 14 when human hematopoietic stem cells were cultured in a culture medium free of SCF and TPO but containing PI3K activator and TPO receptor agonist in the absence of albumin and in the presence of PVA. The result of is shown.
  • FIG. 11 is an optical micrograph of the obtained culture.
  • FIG. 12 shows a colony of cells obtained on day 14 when human hematopoietic stem cells were cultured in a culture medium free of SCF and TPO but containing PI3K activator and TPO receptor agonist in the absence of albumin and in the presence of PVA. The results of the assay are shown. The type of colony was determined under a microscope by collecting the colony under a microscope, preparing a cytospin sample, and then performing Giemsa staining.
  • FIG. 13 shows humans in culture medium in the absence of albumin and in the presence of PVA, without SCF and TPO, but with PI3K activators; with TPO receptor agonists; with either or both of SR-1 and UM171; Hematopoietic stem cells are cultured and the proliferation rates of total cells and CD34 + cells on day 14 are shown.
  • FIG. 14 shows the proliferation rate of total cells and CD34 + cells on the 14th day after culturing under each of the conditions 1 to 3, and the number of CD41 + cells.
  • FIG. 15 shows the results of flow cytometry of cells in the culture on day 14 after culturing under each of the conditions 1 to 3.
  • the upper part shows the results by CD34 (horizontal axis) and CD38 (vertical axis), and the lower part shows the results by CD41a (horizontal axis) and CD42b (vertical axis).
  • FIG. 16 is a diagram showing engraftment of human hematopoietic stem cells in the peripheral blood of mice after culturing under conditions 1 to 3 and transplanting human hematopoietic stem cells on day 7 into mice.
  • FIG. 16 is a diagram showing engraftment of human hematopoietic stem cells in the peripheral blood of mice after culturing under conditions 1 to 3 and transplanting human hematopoietic stem cells on day 7 into mice.
  • FIG. 17 shows a medium containing PVA, PI3K activator and TPO receptor agonist, which does not contain albumin, SCF and TPO after mononuclear cell isolation of the transferred cord blood, in the presence or absence of UM171.
  • the total number of cells, the proportion of CD34 + cells (%), the proportion of viable cells (%), and the number of CD34 + cells of the culture obtained by culturing for 14 days are shown.
  • the "hematopoietic stem cell” is a stem cell capable of differentiating into a hematopoietic cell.
  • Hematopoietic stem cells can be collected from bone marrow, umbilical cord, placenta, and peripheral blood.
  • Human hematopoietic stem cells are CD34-positive cells. In humans, hematopoietic stem cells are known to be abundant in CD34-positive and CD38-negative cell fractions. Therefore, human hematopoietic stem cells can be CD34 positive and CD38 negative.
  • Hematopoietic stem cells may be cells obtained by differentiating pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells with Exvivo.
  • exvivo means in vitro. In the present specification, ex vivo is used in comparison with in vivo (in vivo), and means a state in which cells existing in the living body are taken out from the living body to the outside of the living body. Culturing can be done in Exvivo.
  • polyvinyl alcohol means a polymer of vinyl alcohol.
  • Polyvinyl alcohol can be obtained by saponifying polyvinyl acetate obtained by polymerizing a vinyl acetate monomer.
  • the weight average molecular weight of polyvinyl alcohol (M W) is, for example, can be 1kDa ⁇ 20kDa, 3kDa ⁇ 17kDa, a 5 kDa ⁇ 15 kDa or 7 kDa ⁇ 13 kDa, is.
  • the saponification rate can be 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more.
  • albumin is a protein known as a plasma component. Albumin is said to account for 60% of plasma proteins and is present in large amounts in blood, serum and plasma. Albumin is thought to be responsible for maintaining the osmotic pressure of blood in the living body and for carrying it by binding to biological substances such as fatty acids and hormones. The importance of serum albumin is also known in the maintenance culture of hematopoietic stem cells.
  • Human serum albumin (hereinafter sometimes referred to as “HSA”) is human serum albumin, for example, a protein having an amino acid sequence registered with GenBank registration number: AAN17825.1 or an amino acid sequence corresponding thereto. Can be human serum albumin with.
  • including B as an alternative to A means including B instead of A.
  • Including B instead of A means replacing A partially or completely with B.
  • Constaining B as an alternative to A may mean that A is substantially free and B is included. “Substantially not included” allows the system to be brought in to the extent that it cannot be prevented and brought in below the detection limit. “Substantially free” can be something that does not allow preventive carry-on.
  • agonist refers to a substance that activates proteins such as receptors and enzymes.
  • PI3K means phosphatidylinositol 3-kinase.
  • PI3K is an enzyme that phosphorylates inositol phospholipids, which are constituents of cells.
  • Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate (PIP3) which is phosphorylated, phosphorylates Akt (also known as protein kinase B) and transmits its signal downstream.
  • Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate (PIP3), which is phosphorylated, phosphorylates Akt (also known as protein kinase B) and transmits its signal downstream.
  • PI3K activator means an agonist of receptor tyrosine kinase and a substance that activates PI3K.
  • TPO means thrombopoietin.
  • TPO is a protein responsible for the differentiation of hematopoietic stem cells into megakaryocytes. TPO is known to be involved in the formal maintenance of hematopoietic stem cells.
  • the human thrombopoietin can be, for example, a protein having an amino acid sequence registered with GenBank's registration number: AAB333901, or a thrombopoietin having an amino acid sequence corresponding thereto.
  • the TPO has an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, or 100% identity with the amino acid sequence registered in the functional homologue of TPO and the registration number of GenBank: AAB33390.1, and the TPO Functional proteins can be included.
  • TPO receptor agonist means a substance other than TPO that activates the TPO receptor.
  • TPO receptor agonists include variants of TPO other than TPO, peptides, and compounds that activate TPO receptors.
  • compound is a concept that includes an organic compound.
  • a stem cell factor is a hematopoietic cell growth factor that works in the early stages of hematopoietic function.
  • the human stem cell factor can be, for example, a protein having an amino acid sequence registered with GenBank's registration number: AAA854501 or an SCF having an amino acid sequence corresponding thereto.
  • the SCF has an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, or 100% identity with the amino acid sequence registered in the functional homologue of the SCF and the GenBank registration number: AAB333901. Functional proteins can be included.
  • culture means incubating cells under conditions suitable for their growth or maintenance. Incubation can preferably be carried out in the case of human cells at 37 ° C. and in a 5% CO 2 atmosphere. When “culture” involves proliferation, it is understood that “culture” is the production of proliferated cells. As used herein, “culture” can be performed in serum-free medium. As used herein, “culture” can be performed in a chemically defined culture medium (or in a fully synthetic medium). The chemically defined culture medium is serum-free medium.
  • culture medium means a medium used for culturing cells.
  • Culture medium can be prepared by adding the necessary components to the basal medium. Required components include acidity regulators, sugar sources such as glucose, antibiotics (eg penicillin and streptomycin), and essential amino acids such as glutamine, as well as insulin, transferase, selenium (eg sodium selenite). And can be a culture additive such as ethanolamine.
  • the culture medium can be a liquid medium.
  • cytotoxicity means a property having an action of reducing the number of cells or an action of killing cells during culturing.
  • non-cytotoxic refers to the property of not reducing the number of cells by culturing. Depending on the substance, cytotoxicity may occur by increasing the concentration, but in this case, if the concentration is decreased to the extent that cytotoxicity does not occur, the advantageous effect expected of the substance occurs. , Can be defined as non-cytotoxic.
  • mouse hematopoietic stem cells (sometimes called KSL cells because of their isolation) are long-term by adding polyvinyl alcohol (PVA) in albumin-free serum-free medium. We have found and reported that it can grow in large quantities (Wilkinson et al., Nature, 571: 117-121, 2019). However, for human hematopoietic stem cells, a method for growing them in an albumin-free serum-free medium has not been established. We now show that human hematopoietic stem cells have weak activation of various signaling pathways, including the PI3K and Akt pathways, in the presence of PVA, SCF and TPO in albumin-free serum-free medium. I found it.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • human hematopoietic stem cells proliferate by adding PI3K activator in the presence of PVA, SCF and TPO in albumin-free serum-free medium.
  • PI3K activators can completely replace SCF in the presence of PVA in albumin-free serum-free medium.
  • TPO can be replaced by TPO receptor agonists in the presence of PVA and PI3K activators in albumin-free serum-free medium.
  • human hematopoietic stem cells in the presence of PVA and PI3K activators and TPO or TPO receptor agonists in albumin-free serum-free medium are megakaryocyte lineage cells when cultured for long periods of time.
  • the present invention is a method for culturing human hematopoietic stem cells.
  • Including culturing human hematopoietic stem cells in culture medium contains polyvinyl alcohol, does not contain albumin, and (1) Includes phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activator and one or more selected from the group consisting of thrombopoietin (TPO) and TPO receptor agonists; (2) one or more selected from the group consisting of stem cell factor (SCF) and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) including PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • TPO thrombopoietin
  • SCF stem cell factor
  • PI3K activator and TPO receptor agonist or (3) including PI3K activator and TPO receptor agonist.
  • the method is provided.
  • the culture can increase or maintain the number of human
  • the present invention is a method of culturing human hematopoietic stem cells in a culture medium.
  • a culture medium human hematopoietic stem cells and (1) phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activator are contacted with one or more selected from the group consisting of thrombopoietin (TPO) and TPO receptor agonists; (2) Contact one or more selected from the group consisting of stem cell factor (SCF) and PI3K activator with a TPO receptor agonist; or (3) Contact PI3K activator with a TPO receptor agonist.
  • TPO thrombopoietin
  • SCF stem cell factor
  • SCF stem cell factor
  • PI3K activator with a TPO receptor agonist A method including that is provided.
  • the culture can increase or maintain the number of human hematopoietic stem cells.
  • the PI3K activator does not use one having cytotoxicity against human hematopoietic stem cells in the absence of albumin and in the presence of PVA. That is, the PI3K activator used in the present invention is non-cytotoxic.
  • the TPO receptor agonist used in the present invention is non-cytotoxic to human hematopoietic stem cells in the absence of albumin and in the presence of PVA.
  • PI3K activator is non-cytotoxic can be appropriately confirmed by those skilled in the art by a culture test of human hematopoietic stem cells.
  • a culture test of human hematopoietic stem cells can be confirmed using IMDM medium containing 1% insulin-transferrin-selenium, 1% penicillin-streptomycin-glutamine, 100 ng / mL TPO and 0.1% PVA. ..
  • whether or not the TPO receptor agonist is non-cytotoxic can be appropriately confirmed by those skilled in the art by a culture test of human hematopoietic stem cells.
  • a culture test of human hematopoietic stem cells can be confirmed using IMDM medium containing 1% insulin-transferrin-selenium, 1% penicillin-streptomycin-glutamine, 10 ng / mL SCF and 0.1% PVA. ..
  • the PI3K activator is a peptide represented by the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKKSDGGYMDMS, which may be a peptide in which Y is phosphorylated (also referred to as "740Y-P").
  • the TPO receptor agonist is 3-[4-[[[4- [2-methoxy-3- (1-tert-butyl-2-oxapentan-1-yl) phenyl] thiazole-. It can be 2-yl] amino] carbonyl] -2,6-dichlorophenyl] -2-methylpropenoic acid (hereinafter, also referred to as "butyzamide").
  • the PI3K activator is 740Y-P and the TPO receptor agonist is butyzamide.
  • the culture medium used in the culture method of the present invention is a serum-free medium.
  • the culture medium used in the culture method of the invention is a chemically defined medium.
  • the culture medium used in the culture method of the invention is a serum-free medium (preferably a chemically defined medium, comprising a PI3K activator and a TPO receptor agonist, the PI3K activator.
  • the culture medium is 740Y-P and the TPO receptor agonist is butyzamide.
  • the culture medium used in the culture method of the invention Contains polyvinyl alcohol, does not contain albumin, and (1) Includes PI3K activator and one or more selected from the group consisting of TPO and TPO receptor agonists; (2) one or more selected from the group consisting of SCF and PI3K activator and TPO receptor agonist; or (3) including PI3K activator and TPO receptor agonist. It can be a culture medium for human hematopoietic stem cells.
  • the culture medium one suitable for culturing hematopoietic stem cells can be appropriately used.
  • the basal medium S-clone SF-3 medium, F12 medium, StemSpan (Stem Cell technologies), STEM ⁇ (STEM ALPHA), StemPro-34 serum-free medium (Gibco Invitrogen), StemPro MSC serum-free medium (Invitrogen) -CFU medium (Miltenyl Biotech), S-Clone serum-free medium (SF-02, SF-03, CM-B, SF-B) (Sanko Pure Drug), HPGM medium (Sanko Pure Drug), AIM V medium (Invitrogen) ), Marlow MAX bone marrow medium (Invitrogen), KnockOut DMEM / F-12 medium (Invitrogen), Stemline hematopoietic stem cell proliferation medium (Sigma), SYN serum-free medium (SYN H, SYN B) (AbCys SA), SPE IV medium.
  • DMEM medium Gibco Invitrogen et al.
  • IMDM medium Gibco Invitrogen et al.
  • PRMI1640 medium Gibco Invitrogen et al.
  • Ham F-12 medium Gibco et al.
  • RD medium and the like can be used.
  • the culture medium contains a basal medium.
  • the culture medium may contain, for example, one or more selected from insulin, trampferin (apo), sodium selenite, and ethanolamine.
  • the culture medium may contain HEPES, sodium pyruvate, vitamins, amino acids, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate and the like.
  • the culture medium may contain antibiotics (eg, penicillin and streptomycin).
  • the culture medium may contain glutamine.
  • the culture medium may contain, for example, insulin, trampferin (apo), sodium selenite, ethanolamine, and antibiotics, and may further contain HEPES.
  • the culture medium of the present invention may contain an effective amount of non-cytotoxic PI3K activator and an effective amount of PVA in order to proliferate human hematopoietic stem cells in an environment in the absence of albumin and in the presence of PVA.
  • the culture medium of the present invention may further contain either or both of SCF and TPO.
  • the culture medium of the present invention may contain an effective amount of a non-cytotoxic TPO receptor agonist instead of TPO.
  • the culture medium of the present invention contains an effective amount of a non-cytotoxic PI3K activator, an effective amount of PVA, an effective amount of TPO and a non-cytotoxic TPO receptor agonist, or both, and UM171. You may be.
  • the method for culturing human hematopoietic stem cells may be a method for producing megakaryocyte lineage cells from human hematopoietic stem cells.
  • the culture medium used in the culture method is a culture medium comprising a PI3K activator and a TPO receptor agonist, the PI3K activator being 740Y-P and the TPO receptor agonist being butyzamide. obtain.
  • the culture medium can be UM171 free.
  • the culture method of the invention is 4-N- [2-benzyl-7- (2-methyltetrazol-5-yl) -9H-pyrimid [4,5-b] indole-4- Indole] It may further include culturing in the presence of cyclohexane-1,4-diamine (hereinafter also referred to as "UM171").
  • the culture medium used in the culture method of the invention may further comprise UM171. This can facilitate the human hematopoietic stem cells to maintain their properties as human hematopoietic stem cells, or can suppress their differentiation into megakaryocyte lineage cells (eg, megakaryocyte progenitor cells and megakaryocytes).
  • the culture method of the invention is 4-N- [2-benzyl-7- (2-methyltetrazol-5-yl) -9H-pyrimid [4,5-b] indole-4- Indole] Does not include culturing in the presence of cyclohexane-1,4-diamine (hereinafter also referred to as "UM171").
  • the culture medium used in the culture method of the invention does not further contain UM171. This facilitates the differentiation of human hematopoietic stem cells into megakaryocyte lineage cells (eg, megakaryocyte progenitor cells and megakaryocytes).
  • human hematopoietic stem cells can be cultured under conditions suitable for the proliferation of human hematopoietic stem cells.
  • the present invention may further include isolating human hematopoietic stem cells from the culture. Isolation of human hematopoietic stem cells can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, by flow cytometry using hematopoietic stem cell markers.
  • Human hematopoietic stem cells may be acquired as human hematopoietic stem cells, and may be subsequently differentiated into other cells before use. When differentiating human hematopoietic stem cells into other cells, the cells to be differentiated can be cultured under conditions suitable for the differentiation of the other cells.
  • human hematopoietic stem cells obtained by the culture method of the present invention are provided.
  • the human hematopoietic stem cells obtained by the culture method of the present invention can be purified using CD34 and preferably CD38 as markers.
  • the human hematopoietic stem cells obtained by the culture method of the present invention have a better engraftment rate after transplantation to a recipient than the human hematopoietic stem cells obtained by the conventional method. Therefore, according to the present invention, human hematopoietic stem cells obtained by the culturing method of the present invention and having an improved engraftment rate after transplantation to a recipient as compared with those before culturing are provided.
  • cells of the megakaryocyte lineage obtained by the culture method of the present invention are provided.
  • Cells of the megakaryocyte lineage can be differentiated into polynuclear megakaryocytes by a conventional method.
  • Thrombosis can be obtained from polynuclear macronuclear cells.
  • the present invention may further include isolating megakaryocyte lineage cells from the resulting culture. Isolation of megakaryocyte lineage cells can be performed by methods known to those of skill in the art, eg, by flow cytometry using markers of megakaryocyte lineage cells (eg, CD41a and CD42b). Can be done.
  • culturing can be carried out in the presence of fibronectin.
  • hematopoietic stem cells and fibronectin can be brought into contact with each other.
  • the inside (for example, the bottom surface) of the culture vessel is preferably coated with fibronectin.
  • the albumin-free medium used in the culture method of the present invention contains less than 0.1 (w / v)% serum albumin, less than 0.05 (w / v)%, and less than 0.01 (w / v)%. , Less than 0.005 (w / v)%, less than 0.001 (w / v)%, less than 0.0005 (w / v)%, or less than 0.0001 (w / v)% Not completely included.
  • the medium used in the culture method of the present invention may contain recombinant TPO.
  • the recombinant TPO can be, for example, a mammalian recombinant TPO or a recombinant human TPO.
  • the TPO concentration is 20-200 ng / mL, more preferably 30-150 ng / mL, even more preferably 40-150 ng / mL, for example 100 ng / mL. Can be done.
  • the medium used in the culture method of the present invention may further contain recombinant SCF.
  • the recombinant SCF can be, for example, a mammalian recombinant SCF or a recombinant human SCF.
  • the SCF concentration is 1 to 200 ng / mL, more preferably 1 to 150 ng / mL, even more preferably 1 to 100 ng / mL, for example 1 to 50 ng / mL. Yes, even more preferably 1-30 ng / mL, even more preferably 1-20 ng / mL, for example 5-15 ng / mL.
  • the medium used in the culture method of the present invention may contain recombinant TPO and recombinant SCF.
  • the TPO concentration is 20-200 ng / mL, more preferably 30-150 ng / mL, even more preferably 40-150 ng / mL, for example 100 ng / mL
  • the SCF concentration is 1 to 200 ng / mL, more preferably 1 to 150 ng / mL, even more preferably 1 to 100 ng / mL, for example 1 to 50 ng / mL, even more preferably.
  • the medium used in the culturing method of the present invention may comprise 40-150 ng / mL recombinant TPO and 1-50 ng / mL recombinant SCF.
  • the medium used in the culture method of the present invention may have a TPO concentration higher than the SCF concentration, for example, any concentration included in the above concentration range, and may be twice or more. It may be 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, or 10 times or more higher.
  • the method for culturing human hematopoietic stem cells of the present invention may further include growing the hematopoietic stem cells under conditions sufficient for maintenance and / or proliferation of the hematopoietic stem cells.
  • hematopoietic stem cells may be grown 10-fold or more, 50-fold or more, 100-fold or more, 200-fold or more, 300-fold or more, 400-fold or more, or 500-fold or more from the start of culture.
  • Sufficient conditions for maintenance and / or proliferation of human hematopoietic stem cells can be, for example, conditions for culturing in the above medium.
  • Sufficient conditions for the maintenance and / or proliferation of human hematopoietic stem cells can preferably be, for example, fibronectin presence conditions, and conditions in which human hematopoietic stem cells and fibronectin can come into contact with each other.
  • the culture method of the present invention may further include recovering the proliferated human hematopoietic stem cells from the medium.
  • the recovered human hematopoietic stem cells may be further concentrated or isolated. Concentration or isolation of human hematopoietic stem cells can be performed using cell surface markers. Cell surface markers that can be used to concentrate or isolate human hematopoietic stem cells include CD34 and CD38. Concentration or isolation of hematopoietic stem cells can be performed using a cell sorter.
  • the present invention is a method for producing human hematopoietic stem cells in Exvivo.
  • a method including the culture method of the present invention is provided.
  • functional human hematopoietic stem cells can be obtained.
  • functional means that the hematopoietic system can be restored in the transplanted human individual (recipient) by human hematopoietic stem cell transplantation.
  • Example 1 Proliferation test of hematopoietic stem cells using a culture medium containing no albumin
  • KSL mouse hematopoietic stem cells
  • CD34 + CD38- human hematopoietic stem cells
  • the culture medium was prepared by Wilkinson et al. , Nature, 571: 117-121, 2019, a serum-free medium containing polyvinyl alcohol (PVA) and containing no albumin.
  • the culture medium is 1% insulin-transferase-selenium-ethanolamine (ITSX), 10 mM HEEPS, 1% penicillin-streptomycin-glutamine, 100 ng / mL mouse thrombopoietin. (MTPO) and 10 ng / mL mouse stem cell factor (mSCF) in F12 medium.
  • ITSX insulin-transferase-selenium-ethanolamine
  • 10 mM HEEPS 1% penicillin-streptomycin-glutamine
  • MTPO mouse thrombopoietin.
  • mSCF mouse stem cell factor
  • the culture medium is 1% insulin-transferase-selenium-ethanolamine (ITSX), 25 mM HEPES, 1% penicillin-streptomycin-glutamine, 100 ng / mL human thrombopoietin (hTPO), and IMDM medium containing 10 ng / mL human stem cell factor (hSCF) was used.
  • ITSX insulin-transferase-selenium-ethanolamine
  • HEPES 25 mM HEPES
  • penicillin-streptomycin-glutamine 100 ng / mL human thrombopoietin
  • hSCF human stem cell factor
  • IMDM media containing 1% insulin-transferase-selenium-ethanolamine (ITSX), 25 mM HEPES, 1% penicillin-streptomycin-glutamine, and PVA (hereinafter, PVA).
  • PVA insulin-transferase-selenium-ethanolamine
  • common medium also referred to as "common medium" was used. Therefore, in the following, the medium will be described with a focus on the components added to the common medium. For example, since the medium contains TPO and SCF in addition to the common medium, it is referred to as TPO + SCF medium for convenience. When expressing up to the concentration of each factor, it may be described as SCF10 + TPO100, or may be abbreviated as S10 + T100.
  • mouse bone marrow cells were used as the mouse hematopoietic stem cells. Specifically, mouse bone marrow cells were isolated from the tibia, femur, and pelvis and stained with APC-c-KIT antibody. c-KIT + cells were concentrated using anti-APC magnetic beads and an LS column (Miltenyi Biotec). Then, before staining the c-KIT enriched cells with anti-CD34, anti-c-KIT, anti-SCA1 and streptavidin-APC / eFluor 780 for 90 minutes, the lineage antibody cocktail (biotinylated CD4, CD8, CD45R, TER119, LY- It was stained with 6G / LY-6C and CD127). The cell population was then purified using FACS MariaII (BD), using propidium iodide as a killing stain, directly sorted into wells containing medium.
  • FACS MariaII BD
  • CD34 + CD38-cells of human bone marrow were used. Specifically, commercially available human bone marrow CD34-positive cells (Lonza 2C-101) were purchased.
  • mice hematopoietic stem cells were unable to maintain long-term growth in albumin-free serum-free medium, even in the presence of SCF and TPO.
  • Wilkinson et al. 2019, it has been shown that by adding PVA to the medium, mouse hematopoietic stem cells can proliferate for a long period of time in a serum-free medium containing no albumin.
  • mouse hematopoietic stem cells proliferated well in a serum-free medium containing PVA and not albumin, but human hematopoietic stem cells did not grow well in this medium.
  • Example 2 Differences in signal transduction between mouse hematopoietic stem cells and human hematopoietic stem cells The signal pathways of mouse hematopoietic stem cells and human hematopoietic stem cells in the presence of SCF and TPO were analyzed.
  • SCF and SCF in hematopoietic stem cells in which mouse and human hematopoietic stem cells were cultured in the presence of 10 ng / mL tissue factor (SCF) and 100 ng / mL thrombopoietin (TPO) in the absence of albumin and in the presence of PVA, respectively.
  • SCF tissue factor
  • TPO thrombopoietin
  • the degree of phosphorylation of signal factors downstream of TPO was analyzed by phosphorylation immunostaining. First, the phosphorylation state of each factor downstream of the SCF and TPO signals was detected using an antibody specific to the phosphorylation form of each factor.
  • mouse hematopoietic stem cells As shown in FIG. 2, among the seven factors examined, some factors with different phosphorylation states were found between mouse hematopoietic stem cells and human hematopoietic stem cells. Among them, for PI3K and Akt, many phosphorylated forms were required in mouse hematopoietic stem cells 24 hours after the addition of SCF and TPO, whereas almost no phosphorylated forms were observed in human hematopoietic stem cells. The amount was less than the amount of phosphorylated morphology in mouse hematopoietic stem cells.
  • human hematopoietic stem cells were cultured in a culture medium supplemented with 0.3 ⁇ M AKTa (sales company name Sigma-Aldrich, product number 123871 or 20 ⁇ M PI3Ka. The cells were counted and cultured after 3, 5, and 7 days of culture. The ratio of the number of cells at each time point when the number of cells on the first day was set to 1. In the following examples, 740Y-P (sales company name Tocris, product number 1983) was used as PI3Ka. As shown in 3, human hematopoietic stem cells showed clear proliferation in the presence of PI3Ka. On the other hand, AKTa showed no proliferative effect on human hematopoietic stem cells in the environment of this experiment.
  • AKTa showed no proliferative effect on human hematopoietic stem cells in the environment of this experiment.
  • Human hematopoietic stem cells are cultured for 7 days when 20 ⁇ M PI3Ka is added to the above culture medium for human hematopoietic stem cells (S10 + PI3Ka20 + T100) and when 20 ⁇ M PI3Ka is added to the above culture medium and SCF is removed (PI3Ka20 + T100). After that, the total number of cells and the number of isolated CD34 + cells by cell sorting using an anti-CD34 antibody were determined. The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 4, when PI3Ka was added, no significant difference was observed in the total number of cells and the number of CD34 + cells depending on the presence or absence of SCF.
  • TPO receptor agonists are butyzamide, eltrombopag, and avathrombopag. 0.1 ⁇ M butyzamide, 3 ⁇ g / mL eltrombopag, or 3 ⁇ M abatrombopag in the presence of 0.1% recombinant human serum albumin (Albumin Biosciences) or PVA in the composition obtained by removing TPO from the above culture medium.
  • Human hematopoietic stem cells were cultured in the medium supplemented with. In this experiment, Mpl32D cells were used as human hematopoietic stem cells.
  • the purchased human bone marrow CD34 + cells (trade company name Lonza, product number 2C-101) or the transferred Fresh umbilical cord blood from which CD34 + cells were separated from microbeds were used in the culture experiment.
  • TPOago TPO receptor agonists
  • human hematopoietic stem cells showed significant cell proliferation only in the presence of butyzamide in the presence of PVA in the absence of albumin. In the presence of PVA in the absence of albumin, hematopoietic stem cells died in the presence of avatronbopag or eltrombopag.
  • these TPO receptor agonists are highly safe compounds used in the in vivo environment for the treatment of surgically treated patients with liver cirrhosis and patients with aplastic anemia. The results of this example show that some TPO receptor agonists can be cytotoxic to human hematopoietic stem cells in the absence of albumin and in the presence of PVA.
  • TPO receptor agonists have cytotoxicity to human hematopoietic stem cells, and in order to culture human hematopoietic stem cells, cytotoxicity to human hematopoietic stem cells is observed. It was suggested that the ones that do not have should be used.
  • CD34 + cells were sorted with a cell sorter, and 100 cells were seeded on Mesocult H4415, and a colony assay was performed. Two weeks later, the colonies were picked up, cytospin specimens were prepared, Giemsa stained, and the type of colonies was determined under a microscope. GE mM colonies per 50 CD34 + cells were counted to determine the rate of increase in the number of colonies compared to before culturing. Then, it became clear that butyzamide can completely replace TPO in GE mM colony forming ability.
  • a culture experiment of human hematopoietic stem cells was performed in a medium in which either or both of PI3Ka 20 ⁇ M and TPOago 0.1 ⁇ M were added to a culture medium containing no SCF and TPO.
  • the total number of cells and the number of CD34 + cells contained were counted by flow cytometry, and the proliferation rate at the start of culturing was determined.
  • the increase of cells was not confirmed with PI3Ka alone or butyzamide alone, but it became clear that the number of cells increased remarkably in the presence of both PI3Ka and TPOago. It was.
  • Anti-CD34-PE-Cy7 antibody (sales company name BD Biosciences, product number 348791), anti-CD38-V450 antibody (sales company name BD Biosciences, product number 646851), anti-CD133-PE antibody (sales company name Miltenyi Biotec, product number 130) -080-801), anti-CD45RA-APC antibody (sales company name BioLegend, product number 304112), and anti-CD49f-PE antibody (sales company name BioLegend, product number 313611) were used for fractionation by a cell sorter.
  • CD34 + fraction CD34 + CD38-CD133 + fraction
  • CD34 + CD38-CD45RA-CD49f + fraction reported as purification markers of human umbilical cord blood-derived hematopoietic stem cells
  • the total number of cells and the included CD34 + were obtained on the 7th day after the start of culture.
  • the number of cells was counted by flow cytometry, and the growth rate at the start of culture was determined.
  • the results were as shown in FIG.
  • remarkable cell proliferation was observed in all the cell fractions, but in the CD34 + CD38-CD133 + fraction and the CD34 + CD38-CD45RA-CD49f + fraction, especially in the CD34 + CD38-CD45RA-CD49f + fraction. Cell proliferation was remarkable.
  • Example 3 Long-term culture experiment of human hematopoietic stem cells Human hematopoietic stem cells were cultured in the above-mentioned culture medium for human hematopoietic stem cells, which contained PI3Ka 20 ⁇ M and TPOago 0.1 ⁇ M instead of SCF and TPO. .. On the 7th and 14th days after the start of culturing, the total number of cells and the number of CD34 + cells were determined in the same manner as above. The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 10, the total number of cells increased with the lapse of culture days, while the number of CD34 + cells decreased at day 14 rather than day 7.
  • Example 4 Examination of conditions more suitable for long-term culture of human hematopoietic stem cells A long-term culture of human hematopoietic stem cells was attempted in the presence of a compound capable of proliferating human hematopoietic stem cells.
  • the culture medium for human hematopoietic stem cells which contains PI3Ka 20 ⁇ M instead of SCF and TPO, and TPOago 0.1 ⁇ M (PI3Ka 20 ⁇ M + TPOago 0.1 ⁇ M), and SR-1 (500 nM) and SR-1 (500 nM) for the medium.
  • Mediums (+ SR-1, + UM171, and + SR-1 + UM171) prepared by further adding either or both of UM171 (35 nM) were prepared.
  • the purchased human bone marrow CD34 + cells (trade company name Lonza, product number 2C-101) or the transferred fresh umbilical cord blood was separated using microbeds as described above and used in a culture experiment.
  • Condition 1 The culture medium for human hematopoietic stem cells, which is cultured for 14 days in a culture medium (PI3Ka 20 ⁇ M + TPOago 0.1 ⁇ M) containing PI3Ka 20 ⁇ M and TPOago 0.1 ⁇ M instead of SCF and TPO, Condition 2: From the 7th day onward, the medium (PI3Ka20 ⁇ M) containing no butyzamide was used for culturing (without Day7-Buty), and the condition 3: the culture medium (PI3Ka20 ⁇ M + TPOago 0.1 ⁇ M) was further added with UM171 (+ UM171).
  • CD34 + cells were cultured under three conditions, and the total number of cells and the rate of increase in the number of CD34 + cells were determined.
  • the number of CD41 + cells was determined using a flow cytometer. The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 14, under the condition 2 of culturing in the medium from which butyzamide was removed on the 7th day after the start of the culture, the number of CD34 + cells increased and the number of CD41 + cells decreased as compared with the condition 1. As shown in FIG.
  • Example 5 Transplantation of CD34 + cells after culturing Human CD34 + cells cultured for 7 days under each of the experimental conditions 1 to 3 were transplanted into irradiated NOG mice to confirm cell engraftment. Specifically, 1 ⁇ 10 4 cells were transplanted into NOG mice irradiated with 1.5 Gy of ⁇ -rays of cultured human CD34 + cells. Twelve weeks after transplantation, peripheral blood of the NOG mouse was collected and the cell components in the peripheral blood were analyzed using a flow cytometer. The results were as shown in FIG. As shown in FIG.
  • the engraftment rates of hematopoietic stem cells were 14.9% and 11.1% when the pre-cultured CD34 + cells were transplanted, respectively, after the culture. Transplantation of CD34 + cells increased to 66.6% and 54.9%, respectively. Further, under condition 3, the engraftment rate of hematopoietic stem cells increased from 17% when the pre-cultured CD34 + cells were transplanted to 67% when the post-cultured CD34 + cells were transplanted.
  • the PI3K activator and the TPO receptor agonist proliferate human hematopoietic stem cells well in the presence of PVA, and the proliferated human CD34 + cells hematopoieticize. It was clarified that the properties as stem cells are maintained and the engraftment rate after transplantation to other individuals is improved. In addition, some human hematopoietic stem cells differentiate into megakaryocytes when cultured for a long period of time under these conditions, whereby megakaryocytes can be obtained, while some tend to proliferate as CD34 + cells. It was also clarified that the addition of UM171 improved the proliferation rate of CD34 + cells and could suppress the differentiation into megakaryocytes.

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Abstract

本発明は、ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地の組成およびアルブミンフリーの培養方法を開示する。本発明によれば、ヒト造血幹細胞を培養する方法が提供され、該方法は、ヒト造血幹細胞をＰＶＡおよびＰＩ３Ｋアクチベータと接触させることを含む。

Description

ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地およびアルブミンフリーの培養方法
　本発明は、ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地の組成およびアルブミンフリーの培養方法を開示する。本発明によれば、ヒト造血幹細胞を培養する方法が提供され、該方法は、ヒト造血幹細胞をＰＶＡおよびＰＩ３Ｋアクチベータと接触させることを含む。
　造血幹細胞の培養において、化学的に定義された培地を用いた増殖について研究が進められており、マウスの造血幹細胞については、化学的に定義された培地を用いた培養が可能であることが明らかにされている（非特許文献１）。
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　５７１：１１７－１２１，　２０１９
　本発明は、ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地の組成およびアルブミンフリーの培養方法を提供する。
　本発明者らは、マウスの造血幹細胞（その分離方法に由来してＫＳＬ細胞と呼ばれることもある）が、アルブミンを含まない無血清培地中で、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を加えることによって、長期にわたって大量に増殖できることを見出し、報告している（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　５７１：１１７－１２１，　２０１９）。しかしながら、ヒトの造血幹細胞に関しては、アルブミンを含まない無血清培地中で、増殖させる方法は確立されていない。今般、本発明者らは、ヒト造血幹細胞は、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡ、組織因子（ＳＣＦ）およびトロンボポイエチン（ＴＰＯ）存在下で、ＰＩ３Ｋ経路およびＡｋｔ経路を含む様々なシグナル経路の活性化が弱いことを見出した。本発明者らはまた、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡ、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下で、ＰＩ３Ｋアクチベータを加えることによって、ヒト造血幹細胞が増殖することを見出した。本発明者らはさらに、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡ存在下で、ＰＩ３Ｋアクチベータは、ＳＣＦを完全に代替できることを見出した。本発明者はさらにまた、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡおよびＰＩ３Ｋアクチベータ存在下で、ＴＰＯをＴＰＯ受容体アゴニストで代替できることを見出した。本発明者らはさらにまた、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡおよびＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯまたはＴＰＯ受容体アゴニストとの存在下で、ヒト造血幹細胞は、長期に培養すると巨核球系列の細胞に分化しやすくなることを見出した。本発明者らはさらにまた、巨核球系列の細胞への分化が、培地にＵＭ１７１を添加することによって阻害され、または巨核球系列の細胞の数が減少し、かつ、ＵＭ１７１がＣＤ３４＋細胞であるヒト造血幹細胞の維持および増殖に有益であることを見出した。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］ヒト造血幹細胞を培養する方法であって、
　ヒト造血幹細胞を培養培地中で培養することを含み、
　培養培地は、ポリビニルアルコールを含み、アルブミンを含まず、かつ、
　（１）ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）アクチベータと、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含み、
　上記培養によって、ヒト造血幹細胞の数が増加する、
方法。
［２］増加したヒト造血幹細胞を得ることを含む、上記［１］に記載の方法。
［３］培養培地が、ＰＩ３Ｋアクチベータを含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含まない、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］培養培地が、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯのアゴニストを含む、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］培養培地が、ＳＣＦおよびＴＰＯの両方を含まない、上記［４］に記載の方法。
［６］培養培地が、４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］培養期間が７日以上である、上記［６］に記載の方法。
［８］アルブミンを含まない、組成物であって、
　ヒト造血幹細胞と、ポリビニルアルコールと、
　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上と；
　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストと；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストと、
を含む、組成物。
［９］ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む、上記［８］に記載の組成物。
［１０］４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）をさらに含む、上記［８］または［９］に記載の組成物。
［１１］上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法によって得られるヒト造血幹細胞。
［１２］ポリビニルアルコールを含み、アルブミンを含まず、かつ、
　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含む、
ヒト造血幹細胞用の培養培地。　　　
〔１〕ヒト造血幹細胞を培養するまたは製造する方法であって、
　ヒト造血幹細胞を培養培地中で培養することを含み、
　培養培地は、ポリビニルアルコールを含み、かつ、
　（１）ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）アクチベータと、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含み、
　上記培養によって、ヒト造血幹細胞の数が増加する、
方法。
〔２〕前記培養培地が、無血清培地である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記培養培地が、化学的に定義された培地である、上記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記培養培地が、アルブミンを実質的に含まない、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕増加したヒト造血幹細胞を得ることを含む、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕培養培地が、ＰＩ３Ｋアクチベータを含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含まない、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕培養培地が、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯのアゴニストを含む、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕培養培地が、ＳＣＦおよびＴＰＯの両方を含まない、上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕培養培地が、４－Ｎ－〔２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド〔４，５－ｂ〕インドール－４－イル〕シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）をさらに含む、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕培養期間が７日以上である、上記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕ヒト造血幹細胞と、アルブミンの代替としてポリビニルアルコールと、
　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上と；
　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストと；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストと、
を含む、組成物。
〔１２〕ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む、上記〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕４－Ｎ－〔２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド〔４，５－ｂ〕インドール－４－イル〕シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）をさらに含む、上記〔１１〕または〔１２〕に記載の組成物。
〔１４〕上記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法によって得られるヒト造血幹細胞。
〔１５〕アルブミンの代替として、ポリビニルアルコールを含み、かつ、
　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含む、
ヒト造血幹細胞用の培養培地。
〔１６〕無血清培地である、上記〔１５〕に記載の培養培地。
〔１７〕化学的に定義された培地である、上記〔１５〕に記載の培地。
〔１８〕アルブミンを含まない、上記〔１５〕～〔１７〕のいずれかに記載の培地。
図１は、アルブミンフリーの無血清培地において、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む培地中で、マウス造血幹細胞（マウスＫＳＬ細胞）およびヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞）をそれぞれマウスおよびヒトの１０　ｎｇ／ｍＬの組織因子（ＳＣＦ）および１００　ｎｇ／ｍＬのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）存在下で培養した結果を示す。 図２は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、マウスおよびヒトそれぞれの造血幹細胞を１０　ｎｇ／ｍＬの組織因子（ＳＣＦ）および１００　ｎｇ／ｍＬのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）存在下で培養した造血幹細胞におけるＳＣＦおよびＴＰＯの下流のシグナル因子のリン酸化の程度を示す図である。記号「ｍ」は、マウス造血幹細胞を示し、「ｈ」は、ヒト造血幹細胞を示す。 図３は、ヒト造血幹細胞を、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、１０　ｎｇ／ｍＬのヒト組織因子（ＳＣＦ）および１００　ｎｇ／ｍＬのヒトトロンボポイエチン（ＴＰＯ）存在下、かつ、ＡＫＴActivator II(AKTa)またはＰＩ３Ｋアクチベータ（ＰＩ３Ｋａ）の存在下で培養した結果を示す。 図４は、ヒト造血幹細胞を、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下、かつ１００　ｎｇ／ｍＬのヒトトロンボポイエチン（ＴＰＯ）存在下において、培養し、７日目の総細胞およびＣＤ３４＋細胞の増殖率を示す。図４では、ＳＣＦを含む条件とＳＣＦを含まない条件とが比較され、培養７日目の細胞総数およびＣＤ３４＋細胞の数に、条件間で統計学的な有意差が認められないことを示す。 図５は、アルブミンまたはＰＶＡの存在下において、各種ＴＰＯ受容体アゴニストでＴＰＯを代替して、ヒト造血幹細胞を培養したときの細胞数の推移を示す。記号「Ｂｕｔｙ」はブチザミドを表し、「Ｅｌｔ」は、エルトロンボパグを表し、「Ａｖａ」は、アバトロンボパグを表す。 図６は、アルブミンおよびＰＶＡのいずれかの存在下において、各種ＴＰＯ受容体アゴニストでＴＰＯを代替して、ヒト造血幹細胞を培養したときの７日目の総細胞およびＣＤ３４＋細胞の増殖率を示す。 図７は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯまたはブチザミド（Ｂｕｔｙ）を含む培地中で、ヒト造血幹細胞を培養し、７日目の細胞総数、ＣＤ３４＋細胞の数、およびＧＥmＭコロニーの数を示す。コロニーの種類は、顕微鏡下でコロニーを採取し、サイトスピン標本を作製したのちに、ギムザ染色を行い、顕微鏡下で判定を行った。Gは「顆粒球」、Eは「赤芽球」、mは「マクロファージ」、Mは「巨核球」を意味する。 図８は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯを含まないが、ＰＩ３Ｋアクチベータ若しくはＴＰＯ受容体アゴニストまたはこれらの組合せを含む培養培地でヒト造血幹細胞を培養し、７日目の総細胞およびＣＤ３４＋細胞の増殖率を示す。 図９は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯを含まないが、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む培養培地でヒト造血幹細胞を培養し、７日目に得られた培養物中の各細胞集団の増殖率を示す。 図１０は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯを含まないが、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む培養培地でヒト造血幹細胞を培養し、７日目および１４日目の細胞総数の推移およびＣＤ３４＋細胞の数の推移を示す。 図１１は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯを含まないが、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む培養培地でヒト造血幹細胞を培養し、１４日目に得られる細胞のゲートの結果を示す。左のパネルは、ＣＤ３４とＣＤ３８をマーカーとするフローサイトメトリの結果であり、右のパネルはＣＤ４１ａとＣＤ４２ｂをマーカーとするフローサイトメトリの結果である。図１１の写真は、得られた培養物の光学顕微鏡写真である。 図１２は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯを含まないが、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む培養培地でヒト造血幹細胞を培養し、１４日目に得られる細胞のコロニーアッセイの結果を示す。コロニーの種類は、顕微鏡下でコロニーを採取し、サイトスピン標本を作製したのちに、ギムザ染色を行い、顕微鏡下で判定を行った。Gは「顆粒球」、Eは「赤芽球」、mは「マクロファージ」、Mは「巨核球」を含有するコロニーであることを意味する。 図１３は、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下で、ＳＣＦおよびＴＰＯを含まないが、ＰＩ３Ｋアクチベータと；ＴＰＯ受容体アゴニストと；ＳＲ－１およびＵＭ１７１のいずれかまたは両方と；を含む培養培地でヒト造血幹細胞を培養し、１４日目の総細胞とＣＤ３４＋細胞の増殖率を示す。 図１４は、条件１～３のそれぞれで培養し、１４日目の総細胞、およびＣＤ３４＋細胞の増殖率、並びにＣＤ４１＋細胞の細胞数を示す。 図１５は、条件１～３のぞれぞれで培養し、１４日目の培養物中の細胞のフローサイトメトリの結果である。上は、ＣＤ３４（横軸）およびＣＤ３８（縦軸）による結果を示し、下は、ＣＤ４１ａ（横軸）およびＣＤ４２ｂ（縦軸）による結果を示す。 図１６は、条件１～３のそれぞれで培養し、７日目のヒト造血幹細胞をマウスに移植し、１２週間後のマウスの末梢血中のヒト造血幹細胞の生着を示す図である。 図１７は、譲渡されたさい帯血を単核球分離した後に、アルブミン、ＳＣＦおよびＴＰＯをいずれも含まないが、ＰＶＡとＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストを含む培地で、ＵＭ１７１存在下または非存在下の条件で、１４日間培養して得られた培養物の総細胞数、ＣＤ３４＋細胞の割合（％）、生存細胞の割合（％）、およびＣＤ３４＋細胞数を示す。
発明の詳細な説明
　本明細書では、「造血幹細胞」とは、血球系細胞に分化することができる幹細胞である。造血幹細胞は、骨髄、さい帯、胎盤、および末梢血から採取することができる。ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性の細胞である。ヒトにおいて、造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性の細胞分画に多く含まれていることが知られている。従って、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性であり得る。造血幹細胞は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞をエクスビボで分化させて得られる細胞であってもよい。
　本明細書では、「エクスビボ」とは、生体外を意味する。本明細書では、エクスビボはインビボ（生体内）との対比で用いられ、生体内に存在する細胞を生体内から生体外に取り出した状態を意味する。培養は、エクスビボで行われ得るものである。
　本明細書では、「陽性」は、その直前に存在する用語で特定される分子を細胞が発現していると認められることを意味する。本明細書では、「陽性」を単に「＋」と表記することがある。
　本明細書では、「ポリビニルアルコール」とは、ビニルアルコールの重合体を意味する。ポリビニルアルコールは、酢酸ビニルモノマーを重合させて得られるポリ酢酸ビニルをケン化して得ることができる。ポリビニルアルコールの重量平均分子量（ＭＷ）は、例えば、１ｋＤａ～２０ｋＤａ、３ｋＤａ～１７ｋＤａ、５ｋＤａ～１５ｋＤａ、または７ｋＤａ～１３ｋＤａとすることができる。上記の方法でポリ酢酸ビニルをケン化してＰＶＡを得る場合には、ケン化率は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上であり得る。
　本明細書では、「アルブミン」とは、血漿成分として知られるタンパク質である。アルブミンは、血漿タンパク質の６割を占めると言われ、血液、血清および血漿中に大量に存在する。アルブミンは、生体内において血液の浸透圧の維持を担ったり、脂肪酸およびホルモンなどの生体物質と結合してこれらを運搬する働きを担っていると考えられている。造血幹細胞の維持培養においても、血清アルブミンの重要性が知られている。ヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ということがある）は、ヒトの血清アルブミンであり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＮ１７８２５．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはこれに対応するアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンであり得る。
　本明細書では、「Ａの代替としてＢを含む」とは、Ａの代わりにＢを含むことを意味する。Ａの代わりにＢを含むとは、ＡをＢで部分的にまたは完全に置き換えることを意味する。「Ａの代替としてＢを含む」は、Ａを実質的に含まず、Ｂを含むことを意味し得る。「実質的に含まない」は、系に対して防げない程度の持ち込みおよび検出限界以下の持ち込みを許容する。「実質的に含まない」は、防げる持ち込みを許容しないものであり得る。
　本明細書では、「アゴニスト」とは、受容体や酵素等のタンパク質を活性化させる物質をいう。
　本明細書では、「ＰＩ３Ｋ」とは、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼを意味する。ＰＩ３Ｋは、細胞の構成成分であるイノシトールリン脂質をリン酸化する酵素である。リン酸化されて生じるホスファチジルイノシトール３，４，５－三リン酸（ＰＩＰ３）は、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢとしても知られる）をリン酸化し、そのシグナルを下流に伝える。本明細書では、「ＰＩ３Ｋアクチベータ」とは、受容体チロシンキナーゼのアゴニスト、およびＰＩ３Ｋを活性化する物質を意味する。
　本明細書では、「ＴＰＯ」とは、トロンボポイエチンを意味する。ＴＰＯは、造血幹細胞から巨核球への分化を担うタンパク質である。ＴＰＯは、造血幹細胞を正式に維持することに関与していることが知られている。ヒトトロンボポイエチンは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＢ３３３９０．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはこれに対応するアミノ酸配列を有するトロンボポイエチンであり得る。ＴＰＯには、ＴＰＯの機能的ホモログおよびＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＢ３３３９０．１で登録されたアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴＰＯの機能を有するタンパク質が包含され得る。
　本明細書では、「ＴＰＯ受容体アゴニスト」とは、ＴＰＯ以外の物質であって、ＴＰＯ受容体を活性化する物質を意味する。ＴＰＯ受容体アゴニストとしては、ＴＰＯ以外のＴＰＯの変種、ペプチド、およびＴＰＯ受容体を活性化する化合物が挙げられる。本明細書で「化合物」は、有機化合物を包含する概念である。
　本明細書では、幹細胞因子（ＳＣＦ）とは、造血機能の初期段階で働く造血細胞成長因子である。ヒト幹細胞因子は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＡ８５４５０．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはこれに対応するアミノ酸配列を有するＳＣＦであり得る。ＳＣＦには、ＳＣＦの機能的ホモログおよびＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＢ３３３９０．１で登録されたアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＳＣＦの機能を有するタンパク質が包含され得る。
　本明細書では、「培養する」とは、細胞をその増殖または維持に適した条件下でインキュベートすることを意味する。インキュベートは、ヒト細胞の場合は、好ましくは、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気下において行われ得る。「培養」が増殖を伴う場合は、「培養」は増殖した細胞の生産であると理解される。本明細書では、「培養」は、無血清培地中で行われ得る。本明細書では、「培養」は、化学的に定義された培養培地中（または完全合成培地中）で行われ得る。化学的に定義された培養培地は、無血清培地である。
　本明細書では、「培養培地」とは、細胞の培養のために用いられる培地を意味する。培養培地は、基本培地に必要な成分を追加することによって作製され得る。必要な成分とは、ｐＨ調整剤、グルコースなどの糖源、抗生物質（例えば、ペニシリン、およびストレプトマイシンなど）、およびグルタミンなどの必須アミノ酸、並びに、インシュリン、トランスフェリン、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム）およびエタノールアミンなどの培養添加物であり得る。培養培地は、液体培地であり得る。
　本明細書では、「細胞傷害性」は、培養中に細胞数を減少させる作用または細胞を死滅させる作用を有する性質を意味する。本明細書では、「非細胞傷害性」は、培養により細胞数を減少させない性質をいう。物質によっては、濃度を高めることによって細胞傷害性が生じ得るが、この場合は、細胞傷害性を生じない程度に濃度を低下させても当該物質に期待される有利な作用が発生する場合には、非細胞傷害性であると定義することができる。
　本発明者らは、マウスの造血幹細胞（その分離方法に由来してＫＳＬ細胞と呼ばれることもある）が、アルブミンを含まない無血清培地中で、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を加えることによって、長期にわたって大量に増殖できることを見出し、報告している（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　５７１：１１７－１２１，　２０１９）。しかしながら、ヒトの造血幹細胞に関しては、アルブミンを含まない無血清培地中で、増殖させる方法は確立されていない。今般、本発明者らは、ヒト造血幹細胞は、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡ、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下で、ＰＩ３Ｋ経路およびＡｋｔ経路を含む様々なシグナル経路の活性化が弱いことを見出した。本発明者らはまた、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡ、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下で、ＰＩ３Ｋアクチベータを加えることによって、ヒト造血幹細胞が増殖することを見出した。本発明者らはさらに、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡ存在下で、ＰＩ３Ｋアクチベータは、ＳＣＦを完全に代替できることを見出した。本発明者はさらにまた、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡおよびＰＩ３Ｋアクチベータ存在下で、ＴＰＯをＴＰＯ受容体アゴニストで代替できることを見出した。本発明者らはさらにまた、アルブミンを含まない無血清培地中で、ＰＶＡおよびＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯまたはＴＰＯ受容体アゴニストとの存在下で、ヒト造血幹細胞は、長期に培養すると巨核球系列の細胞に分化しやすくなることを見出した。本発明者らはさらにまた、巨核球系列の細胞への分化が、培地にＵＭ１７１を添加することによって阻害され、または巨核球系列の細胞の数が減少し、かつ、ＵＭ１７１がＣＤ３４＋細胞であるヒト造血幹細胞の維持および増殖に有益であることを見出した。
　従って、本発明によれば、ヒト造血幹細胞を培養する方法であって、
　ヒト造血幹細胞を培養培地中で培養することを含み、
　培養培地は、ポリビニルアルコールを含み、アルブミンを含まず、かつ、
　（１）ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）アクチベータと、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含む、
方法が提供される。この実施形態において、上記培養によって、ヒト造血幹細胞の数が増加するまたは維持され得る。
　本発明によれば、培養培地中においてヒト造血幹細胞を培養する方法であって、
　培養培地中において、ヒト造血幹細胞とポリビニルアルコールとを接触させることと、
　培養培地中において、ヒト造血幹細胞と
　（１）ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）アクチベータと、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを接触させる；
　（２）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを接触させる；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを接触させる、
ことを含む方法が提供される。この実施形態において、上記培養によって、ヒト造血幹細胞の数が増加するまたは維持され得る。
　本発明者らは、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、一部のＴＰＯ受容体アゴニストを含むいくつかの化合物がヒト造血幹細胞に対して細胞傷害性を示し得ることを明らかにした。
　従って、本発明によれば、本発明では、ＰＩ３Ｋアクチベータは、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、ヒト造血幹細胞に対して細胞傷害性を有するものを用いない。すなわち、本発明において用いられるＰＩ３Ｋアクチベータは、非細胞傷害性である。
　また、本発明において用いられるＴＰＯ受容体アゴニストは、アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、ヒト造血幹細胞に対して非細胞傷害性である。ＰＩ３Ｋアクチベータが非細胞傷害性であるか否かは、ヒト造血幹細胞の培養試験によって当業者であれば適宜確認することができる。ここで、ヒト造血幹細胞の培養試験は、１％インスリン－トランスフェリン－セレン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、１００　ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯおよび０．１％ＰＶＡを含むＩＭＤＭ培地を用いて確認することができる。また、ＴＰＯ受容体アゴニストが非細胞傷害性であるか否かは、ヒト造血幹細胞の培養試験によって当業者であれば適宜確認することができる。ここで、ヒト造血幹細胞の培養試験は、１％インスリン－トランスフェリン－セレン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、１０　ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦおよび０．１％ＰＶＡを含むＩＭＤＭ培地を用いて確認することができる。
　本発明のある態様では、ＰＩ３Ｋアクチベータは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＳＤＧＧＹＭＤＭＳで表されるペプチドであって、Ｙがリン酸化されたペプチド（「７４０Ｙ－Ｐ」ともいう）であり得る。
　本発明のある態様では、ＴＰＯ受容体アゴニストは、３－［４－［［［４－［２－メトキシ－３－（１－ｔｅｒｔ－ブチル－２－オキサペンタン－１－イル）フェニル］チアゾール－２－イル］アミノ］カルボニル］－２，６－ジクロロフェニル］－２－メチルプロペン酸（以下、「ブチザミド」ともいう）であり得る。
　本発明のある態様では、ＰＩ３Ｋアクチベータは、７４０Ｙ－Ｐであり、かつ、ＴＰＯ受容体アゴニストは、ブチザミドである。
　本発明のある態様では、本発明の培養方法で用いられる培養培地は、無血清培地である。本発明のある態様では、本発明の培養方法で用いられる培養培地は、化学的に定義された培地である。本発明のある態様では、本発明の培養方法で用いられる培養培地は、無血清培地（好ましくは、化学的に定義された培地であり、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含み、ＰＩ３Ｋアクチベータは、７４０Ｙ－Ｐであり、かつ、ＴＰＯ受容体アゴニストは、ブチザミドである、培養培地である。
　本発明のある態様では、本発明の培養方法で用いられる培養培地は、
　ポリビニルアルコールを含み、アルブミンを含まず、かつ、
　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含む、
ヒト造血幹細胞用の培養培地であり得る。
　培養培地は、造血幹細胞の培養に適したものを適宜用いることができる。基礎培地としては、Ｓ－ｃｌｏｎｅ　ＳＦ－３培地、Ｆ１２培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＴＥＭα（ＳＴＥＭ　ＡＬＰＨＡ）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４無血清培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＰｒｏ　ＭＳＣ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、ＨＳＣ－ＣＦＵ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｓ－Ｃｌｏｎｅ無血清培地（ＳＦ－０２、ＳＦ－０３、ＣＭ－Ｂ、ＳＦ－Ｂ）（三光純薬）、ＨＰＧＭ培地（三光純薬）、ＡＩＭ　Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、Ｍａｒｒｏｗ　ＭＡＸ骨髄培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ造血幹細胞増殖培地（Ｓｉｇｍａ）、ＳＹＮ無血清培地（ＳＹＮ　Ｈ、ＳＹＮ　Ｂ）（ＡｂＣｙｓ　ＳＡ）、ＳＰＥ　ＩＶ培地（ＡｂＣｙｓ　ＳＡ）、ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨＰＧ無血清培地（Ｌｏｎｚａ）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ培地（Ｌｏｎｚａ）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＭＥＭα（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＰＲＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、Ｈａｍ　Ｆ－１２培地（Ｇｉｂｃｏ他）、ＲＤ培地等を用いることができる。培養培地は、基礎培地を含む。培養培地は、例えば、インスリン、トランフフェリン（アポ）、亜セレン酸ナトリウム、およびエタノールアミンから選択される１以上、または全てを含んでいてもよい。培養培地は、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン類、アミノ酸類、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸等を含んでいてもよい。培養培地は、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含んでいてもよい。培養培地は、グルタミンを含んでいてもよい。培養培地は、例えば、インスリン、トランフフェリン（アポ）、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、および抗生物質を含んでいてもよく、さらにＨＥＰＥＳを含んでいてもよい。
　本発明の培養培地は、ヒト造血幹細胞をアルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下の環境下で増殖させるために、非細胞傷害性のＰＩ３Ｋアクチベータの有効量とＰＶＡの有効量とを含みうる。本発明の培養培地は、ＳＣＦおよびＴＰＯのいずれかまたは両方をさらに含んでいてもよい。本発明の培養培地は、ＴＰＯの代わりに、非細胞傷害性のＴＰＯ受容体アゴニストの有効量を含んでいてもよい。本発明の培養培地は、非細胞傷害性のＰＩ３Ｋアクチベータの有効量と、ＰＶＡの有効量と、ＴＰＯおよび非細胞傷害性のＴＰＯ受容体アゴニストの有効量のいずれかまたは両方と、ＵＭ１７１とを含んでいてもよい。
　本発明によれば、ヒト造血幹細胞を培養する方法は、ヒト造血幹細胞から巨核球系列の細胞を製造する方法であり得る。この実施態様において、培養方法で用いられる培養培地は、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含み、ＰＩ３Ｋアクチベータは、７４０Ｙ－Ｐであり、かつ、ＴＰＯ受容体アゴニストは、ブチザミドである、培養培地であり得る。この特定の態様において、培養培地は、ＵＭ１７１を含まないことができる。
　本発明のある態様では、本発明の培養方法は、４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（以下、「ＵＭ１７１」ともいう）の存在下で培養することをさらに含み得る。本発明のある態様では、本発明の培養方法で用いられる培養培地は、ＵＭ１７１をさらに含み得る。これにより、ヒト造血幹細胞は、ヒト造血幹細胞としての性質を維持し易くなり得る、または、巨核球系列の細胞（例えば、巨核球前駆細胞および巨核球）への分化が抑制され得る。
　本発明のある態様では、本発明の培養方法は、４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（以下、「ＵＭ１７１」ともいう）の存在下で培養することを含まない。本発明のある態様では、本発明の培養方法で用いられる培養培地は、ＵＭ１７１をさらに含まない。これにより、ヒト造血幹細胞は、巨核球系列の細胞（例えば、巨核球前駆細胞および巨核球）に分化しやすくなる。
　本発明では、ヒト造血幹細胞は、ヒト造血幹細胞の増殖に適した条件下で培養され得る。本発明では、培養物からヒト造血幹細胞を単離することをさらに含んでいてもよい。ヒト造血幹細胞の単離は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば、造血幹細胞マーカーを用いてフローサイトメトリなどによって実施することができる。ヒト造血幹細胞は、ヒト造血幹細胞として取得されてもよいし、その後、さらに他の細胞に分化させてから用いてもよい。ヒト造血幹細胞から他の細胞に分化させる場合には、当該他の細胞の分化に適した条件下で分化させたい細胞を培養することができる。
　本発明によれば、本発明の培養方法によって得られたヒト造血幹細胞が提供される。本発明の培養方法によって得られたヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４および好ましくはＣＤ３８をマーカーとして精製され得る。本発明の培養方法によって得られたヒト造血幹細胞は、従来の方法で得られたヒト造血幹細胞よりもレシピエントへの移植後の生着率がよい。従って、本発明によれば、本発明の培養方法によって得られ、培養前と比較してレシピエントへの移植後の生着率が向上したヒト造血幹細胞が提供される。
　本発明によれば、本発明の培養方法によって得られた巨核球系列の細胞（例えば、巨核球前駆細胞および巨核球）が提供される。巨核球系列の細胞は、常法により多核巨核球に分化させることができる。多核巨核球からは血小板を得ることができる。本発明では、得られた培養物から巨核球系列の細胞を単離することをさらに含んでいてもよい。巨核球系列の細胞の単離は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば、巨核球系列の細胞のマーカー（例えば、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂ）を用いてフローサイトメトリなどによって実施することができる。
　本発明の培養方法では、培養は、フィブロネクチン存在下で行われ得る。本発明の培養方法では、造血幹細胞とフィブロネクチンとが接触可能な条件下で行われ得る。培養は、本発明の培養方法では、好ましくは、例えば、培養容器の内側（例えば、底面）がフィブロネクチンでコーティングされている。
　本発明の培養方法で用いられるアルブミンを含まない培地は、血清アルブミンを０．１（ｗ／ｖ）％未満、０．０５（ｗ／ｖ）％未満、０．０１（ｗ／ｖ）％未満、０．００５（ｗ／ｖ）％未満、０．００１（ｗ／ｖ）％未満、０．０００５（ｗ／ｖ）％未満、または０．０００１（ｗ／ｖ）％未満しか含まないか、完全に含まない。
　本発明の培養方法で用いられる培地は、組換えＴＰＯを含んでいてもよい。組換えＴＰＯは、例えば、哺乳動物の組換えＴＰＯであり得、組換えヒトＴＰＯであり得る。本発明のある態様では、ＴＰＯ濃度は、２０～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは３０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、４０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１００ｎｇ／ｍＬとすることができる。
　本発明の培養方法で用いられる培地は、組換えＳＣＦをさらに含んでいてもよい。組換えＳＣＦは、例えば、哺乳動物の組換えＳＣＦであり得、組換えヒトＳＣＦであり得る。本発明のある態様では、ＳＣＦ濃度は、１～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、１～１００ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１～５０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～３０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～２０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、５～１５ｎｇ／ｍＬであり得る。
　本発明の培養方法で用いられる培地は、組換えＴＰＯと組換えＳＣＦを含んでいてもよい。この態様では、ＴＰＯ濃度は、２０～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは３０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、４０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１００ｎｇ／ｍＬであり得、かつ、ＳＣＦ濃度は、１～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、１～１００ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１～５０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～３０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～２０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、５～１５ｎｇ／ｍＬであり得る。ある好ましい態様では、本発明の培養方法で用いられる培地は、４０～１５０ｎｇ／ｍＬの組換えＴＰＯと１～５０ｎｇ／ｍＬの組換えＳＣＦを含んでいてもよい。ある好ましい態様では、本発明の培養方法で用いられる培地は、ＴＰＯ濃度がＳＣＦ濃度よりも高く、例えば、例えば、上記の濃度範囲に含まれる何れかの濃度であってよく、かつ、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、または１０倍以上高くてもよい。
　本発明のヒト造血幹細胞の培養方法は、造血幹細胞を造血幹細胞の維持および／または増殖に十分な条件下で増殖させることをさらに含み得る。この態様では、例えば、造血幹細胞を、培養開始時から１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、または５００倍以上に増殖させることを含み得る。
　ヒト造血幹細胞の維持および／または増殖に十分な条件とは、例えば、上記培地中で培養する条件であり得る。ヒト造血幹細胞の維持および／または増殖に十分な条件とは、好ましくは、例えば、フィブロネクチン存在条件であり得、ヒト造血幹細胞とフィブロネクチンとが接触可能な条件であり得る。
　本発明の培養方法は、
　（Ｃ）増殖したヒト造血幹細胞を培地から回収すること
をさらに含んでいてもよい。回収したヒト造血幹細胞はさらに、濃縮または単離されてもよい。ヒト造血幹細胞の濃縮または単離は、細胞表面マーカーを用いて行うことができる。ヒト造血幹細胞の濃縮または単離に用いることができる細胞表面マーカーとしては、ＣＤ３４やＣＤ３８が挙げられる。造血幹細胞の濃縮または単離は、セルソーターを用いて行うことができる。
　本発明によれば、エクスビボにおけるヒト造血幹細胞の製造方法であって、
　本発明の培養方法を含む方法が提供される。本発明の製造方法では、機能的なヒト造血幹細胞が得られ得る。ここで、機能的とは、ヒト造血幹細胞移植により、移植を受けたヒト個体（レシピエント）において造血系を回復できることを意味する。
実施例１：アルブミンを含まない培養培地を用いた造血幹細胞の増殖試験
　本実施例では、マウス造血幹細胞（ＫＳＬ）とヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）をアルブミンを含まない培養培地を用いて増殖させる試験を行った。培養培地は、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　５７１：１１７－１２１，　２０１９に記載されたポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有し、アルブミンを含まない無血清培地とした。
　具体的には、マウス造血幹細胞の培養においては、培養培地は、１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム－エタノールアミン（ＩＴＳＸ）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、１００　ｎｇ／ｍＬマウストロンボポイエチン（ｍＴＰＯ）、および１０　ｎｇ／ｍＬマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）を含むＦ１２培地とした。上記培地には、ＰＶＡが最終濃度０．１％となるように含ませた。　ヒト造血幹細胞の培養においては、培養培地は、１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム－エタノールアミン（ＩＴＳＸ）、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、１００　ｎｇ／ｍＬヒトトロンボポイエチン（ｈＴＰＯ）、および１０　ｎｇ／ｍＬヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）を含むＩＭＤＭ培地とした。上記培地には、ＰＶＡが最終濃度０．１％となるように含ませた。
　以下実施例で用いたすべての培地において、断りの無い限り、１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム－エタノールアミン（ＩＴＳＸ）、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、およびＰＶＡを含むＩＭＤＭ培地（以下、「共通培地」ともいう）を用いた。従って、以降では、共通培地への添加成分に焦点をあてて培地を表記する。例えば、上記培地は、共通培地に加えてＴＰＯとＳＣＦを含むので、便宜的に、ＴＰＯ＋ＳＣＦ培地と呼ぶこととする。各因子の濃度まで表す場合には、ＳＣＦ１０＋ＴＰＯ１００と記載し、または、Ｓ１０＋Ｔ１００と省略して記載することもある。
　マウス造血幹細胞としては、マウス骨髄のＫＳＬ細胞を用いた。具体的には、マウス骨髄細胞は、脛骨、大腿骨、骨盤から分離され、ＡＰＣ-ｃ－ＫＩＴ抗体で染色された。ｃ－ＫＩＴ＋細胞は、抗ＡＰＣ磁気ビーズとＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して濃縮された。その後、ｃ－ＫＩＴ濃縮細胞を、抗ＣＤ３４、抗ｃ－ＫＩＴ、抗ＳＣＡ１およびストレプトアビジン-ＡＰＣ／ｅＦｌｕｏｒ　７８０で９０分間染色する前にリニエージ抗体カクテル（ビオチン化ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５Ｒ、ＴＥＲ１１９、ＬＹ－６Ｇ　／　ＬＹ－６ＣおよびＣＤ１２７）で染色した。その後、細胞集団はＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ）を使用し、ヨウ化プロピジウムを死滅染色として使用して、培地を含むウェルに直接選別して精製した。
　ヒト造血幹細胞としては、ヒト骨髄のＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞を用いた。具体的には、市販されているヒト骨髄CD34陽性細胞（Lonza 2C-101）を購入した。
　結果は図１に示される通りであった。Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１９では、マウス造血幹細胞は、アルブミンを含まない無血清培地においては、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下でさえ、長期間の増殖を維持することができなかった。しかしながら、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１９では、ＰＶＡを培地に添加することによって、マウス造血幹細胞はアルブミンを含まない無血清培地において長期に増殖することができることが示されている。図１に示されるようにマウス造血幹細胞は、ＰＶＡを含みアルブミンを含まない無血清培地で良好に増殖したが、ヒト造血幹細胞は、この培地においては、良好な増殖は観察されなかった。
実施例２：マウス造血幹細胞とヒト造血幹細胞のシグナル伝達の相違
　ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下におけるマウス造血幹細胞およびヒト造血幹細胞のシグナル経路を分析した。
　アルブミン非存在下かつＰＶＡ存在下において、マウスおよびヒトそれぞれの造血幹細胞を１０　ｎｇ／ｍＬの組織因子（ＳＣＦ）および１００　ｎｇ／ｍＬのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）存在下で培養した造血幹細胞におけるＳＣＦおよびＴＰＯの下流のシグナル因子のリン酸化の程度をリン酸化免疫染色法により解析した。まず、ＳＣＦおよびＴＰＯシグナルの下流の各因子のリン酸化状態を、それぞれの因子のリン酸化形態特異的な抗体を用いて検出した。具体的には、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、およびＳｔａｔ５などの代表的なシグナル伝達分子におけるリン酸化抗体を用いてサイトカインで刺激をした細胞へ反応させた後に蛍光顕微鏡により細胞に反応した抗体の蛍光強度を定量的に解析した。
　すると、図２に示されるように、調べた７つの因子のうち、いくつかの因子ではマウス造血幹細胞とヒト造血幹細胞とでリン酸化状態の異なる因子がいくつか発見された。その中で、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔについては、ＳＣＦおよびＴＰＯ添加２４時間後からマウス造血幹細胞ではリン酸化形態が多く求められたのに対して、ヒト造血幹細胞ではほとんどリン酸化形態が認められないか、またはマウス造血幹細胞におけるリン酸化形態量よりも少ない量を示した。
　そこで、０．３μＭ　ＡＫＴａ（販売社名Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号１２３８７１または２０μＭ　ＰＩ３Ｋａを添加した培養培地において、ヒト造血幹細胞を培養した。培養３日後、５日後、および７日後に細胞を計数し、培養初日の細胞数を１としたときの各時点での細胞数の比を求めた。以下実施例において、ＰＩ３Ｋａとしては、７４０Ｙ－Ｐ（販売社名Ｔｏｃｒｉｓ、製品番号１９８３）を用いた。すると、図３に示されるように、ＰＩ３Ｋａ存在下では、ヒト造血幹細胞は、明確な増殖を示した。他方で、ＡＫＴａについては、本実験の環境下では、ヒト造血幹細胞に対する増殖作用は認められなかった。
　次に、ヒト造血幹細胞の培養に関して、ＰＩ３Ｋａが、ＳＣＦを完全に代替するか否かを調べた。ヒト造血幹細胞用の上記培養培地に２０μＭのＰＩ３Ｋａを添加した場合（Ｓ１０＋ＰＩ３Ｋａ２０＋Ｔ１００）と、上記培養培地に２０μＭのＰＩ３Ｋａを添加し、ＳＣＦを抜いた場合（ＰＩ３Ｋａ２０＋Ｔ１００）とで、ヒト造血幹細胞を７日間培養した後の、細胞総数と、抗ＣＤ３４抗体を用いたセルソーティングによる単離ＣＤ３４＋細胞の数を求めた。結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、ＰＩ３Ｋａを添加した場合には、ＳＣＦの有無によって細胞総数およびＣＤ３４＋細胞数に有意差は認められなかった。
　次に、ヒト造血幹細胞の培養に関して、ＴＰＯをＴＰＯ受容体アゴニストにより置き換えることができるか否かを調べた。ＴＰＯ受容体アゴニストとしては、ブチザミド、エルトロンボパグ、およびアバトロンボパグが知られている。上記培養培地からＴＰＯを抜いた組成に、０．１％組換えヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下またはＰＶＡ存在下で、０．１μＭブチザミド、３μｇ／ｍＬエルトロンボパグ、または３μＭアバトロンボパグを添加した培地中で、ヒト造血幹細胞を培養した。本実験においては、ヒト造血幹細胞としては、Ｍｐｌ３２Ｄ細胞を用いた。結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、アルブミン存在下では、ブチザミド、エルトロンボパグ、およびアバトロンボパグは、ＴＰＯの非存在下でヒト造血幹細胞の増殖を支持することができた。これに対して、ＰＶＡ存在下（アルブミン非存在下）では、ＴＰＯの非存在下でブチザミドはヒト造血幹細胞に対して顕著な細胞増殖効果を奏したが、アバトロンボパグではその効果は小さく、エルトロンボパグでは効果がほとんど認められなかった。
　さらに、購入したヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞（販売社名Ｌｏｎｚａ、製品番号２Ｃ－１０１）あるいは、譲渡されたＦｒｅｓｈな臍帯血をｍｉｃｒｏｂｅａｄｓをＣＤ３４＋細胞を分離したものを培養実験に用いた。２４ウェルプレートに１ウェルあたり０．２～１．０×１０５細胞を分注し、ヒト造血幹細胞用の培養培地からＴＰＯを抜いて、上記ＴＰＯ受容体アゴニスト（以下、「ＴＰＯａｇｏ」ということがある）のいずれかと置き換えて実験を行った。培養初日に対する培養７日目の細胞数の比を求めた。結果は、図６に示される通りであった。図６に示されるように、ヒト造血幹細胞は、アルブミン非存在下ＰＶＡ存在下では、ブチザミド存在下でのみ有意な細胞増殖を示した。アルブミン非存在下ＰＶＡ存在下では、アバトロンボパグ存在下またはエルトロンボパグ存在下では、造血幹細胞が細胞死を起こしていた。しかしながら、これらのＴＰＯ受容体アゴニストは、生体内の環境では、肝硬変の外科的治療患者や再生不良性貧血の患者の治療に用いられる安全性の高い化合物である。本実施例の結果からは、アルブミン非存在下ＰＶＡ存在下では、いくつかのＴＰＯ受容体アゴニストは、ヒト造血幹細胞に対して細胞傷害性を示し得ることを示すものである。また、このことから、ＴＰＯ受容体アゴニストにはヒト造血幹細胞に対して細胞傷害性を有するものが存在すること、およびヒト造血幹細胞を培養するためには、ヒト造血幹細胞に対して細胞傷害性を有しないものを用いればよいことが示唆された。
　次に、アルブミン非存在下ＰＶＡ存在下においてＳＣＦとＴＰＯをＰＩ３ＫａおよびＴＰＯ受容体アゴニストで代替することができるか否かを調べた。以下実施例においては、ＴＰＯ受容体アゴニストとしてブチザミドを用いた。購入したヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞（販売社名Ｌｏｎｚａ、製品番号２Ｃ－１０１）あるいは、譲渡されたＦｒｅｓｈな臍帯血をｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いてＣＤ３４＋細胞を上記のように分離して培養実験に用いた。２４ウェルプレートに１ウェルあたり０．２～１．０×１０５細胞を分注し、ＳＣＦを２０μＭ　ＰＩ３Ｋａに置き換えた組成の培地（ＰＩ３Ｋａ２０μＭ＋ＴＰＯ１００）、およびＳＣＦを２０μＭ　ＰＩ３Ｋａに置き換え、ＴＰＯを０．１μＭブチザミドに置き換えた組成の培地（ＰＩ３Ｋａ２０μＭ＋ＴＰＯａｇｏ０．１μＭ）中でそれぞれ培養した。７日後に、細胞総数を求め、フローサイトメトリによりＣＤ３４＋細胞の数を求めた。その後、培養開始時と比較した増殖率を求めた。結果は、図７に示される通りであった。図７に示されるように、ブチザミドは、ＴＰＯを完全に代替できることが明らかとなった。さらに培養前後でＣＤ３４＋細胞をセルソーターでソーティングし、１００細胞ずつＭｅｔｈｏｃｕｌｔＨ４４１５に播種し、コロニーアッセイを行った。２週間後にコロニーをピックアップし、サイトスピン標本を作製して、ギムザ染色を行ったうえで、コロニーの種類を顕微鏡下で判定した。ＣＤ３４＋細胞５０個あたりのＧＥｍＭコロニーをカウントし培養前と比較したコロニー数の増加率を求めた。すると、ＧＥｍＭコロニー形成能において、ブチザミドは、ＴＰＯを完全に代替できることが明らかとなった。
　さらに次には、ＳＣＦとＴＰＯを含まない培養培地に対して、ＰＩ３Ｋａ２０μＭ、およびＴＰＯａｇｏ　０．１μＭのいずれかまたは両方を添加した培地中で、ヒト造血幹細胞の培養実験を行った。培養７日目に総細胞数および含まれるＣＤ３４＋細胞数をフローサイトメトリによって計数し、培養開始時に対する増殖率を求めた。すると、図８に示されるように、ＰＩ３Ｋａ単独またはブチザミド単独では、細胞の増加は確認され無かったが、ＰＩ３ＫａとＴＰＯａｇｏの両方が存在する場合に、細胞数が顕著に増加することが明らかとなった。
　更に次には、ＳＣＦとＴＰＯをＰＩ３ＫａとＴＰＯａｇｏで代替した培地において、いずれの細胞集団が増殖し易いかを調べた。譲渡されたＦｒｅｓｈな臍帯血をｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いてＣＤ３４＋細胞を上記のように分離して培養実験に用いた。細胞を抗ＣＤ３４-PE-Cy7抗体（販売社名ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、製品番号３４８７９１）、抗ＣＤ３８－Ｖ４５０抗体（販売社名ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、製品番号６４６８５１）、抗ＣＤ１３３－ＰＥ抗体（販売社名Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、製品番号１３０－０８０－８０１）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ抗体（販売社名ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、製品番号３０４１１２）、および抗ＣＤ４９ｆ－ＰＥ抗体（販売社名ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、製品番号３１３６１１）を用いてセルソーターによって分画した。ヒトさい帯血由来造血幹細胞の純化マーカーとして報告されているＣＤ３４＋分画、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ１３３＋分画、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４９ｆ＋分画のそれぞれについて、培養開始後７日目に総細胞数および含まれるＣＤ３４＋細胞数をフローサイトメトリによって計数し、培養開始時に対する増殖率を求めた。結果は、図９に示される通りであった。図９に示されるように、いずれの細胞分画においても顕著な細胞増殖が認められたが、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ１３３＋分画、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４９ｆ＋分画、特に、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４９ｆ＋分画において細胞増殖が顕著であった。
実施例３：ヒト造血幹細胞の長期培養実験
　ヒト造血幹細胞を、上記ヒト造血幹細胞用の培養培地であって、ＳＣＦとＴＰＯの代わりにＰＩ３Ｋａ２０μＭ、およびＴＰＯａｇｏ　０．１μＭを含む培養培地中で、培養した。培養開始後７日目、および１４日目に上記と同様にして細胞総数およびＣＤ３４＋細胞数を求めた。結果は、図１０に示される通りであった。図１０に示されるように、細胞総数は、培養日数が経過すると共に増加したが、その一方で、ＣＤ３４＋細胞数は、７日目よりも１４日目において減少した。
　光学顕微鏡を用いて培養した細胞を観察すると、１４日目には、巨大な細胞が認められた。この巨大な細胞が、巨核球または巨核球前駆細胞である可能性を確認するため、抗ＣＤ４１ａ－ＦＩＴＣ抗体（販売社名ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、製品番号５５５４６６）および抗ＣＤ４２ｂ抗体（販売社名ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、製品番号５５５４７３）を用いて、フローサイトメーターにより細胞を分画した。その結果、図１１に示されるように、培養開始後１４日目の細胞の大半は、ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋の細胞であった。但し、図１１に示されるように、この条件においてもＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞は増殖していた。
　また、培養開始後１４日目に得られた培養物中のＣＤ３４＋細胞を１００細胞ずつＭｅｔｈｏｃｕｌｔＨ４４１５に播種し、コロニーアッセイを行った。２週間後にコロニーを採取し、サイトスピン標本を作製した。その後、標本に関して、ギムザ染色を行った後、顕微鏡下でコロニー種類を判定した。結果は図１２に示される通りであった。コロニーの種類は、Ｇは「顆粒球」、Ｅは「赤芽球」、ｍは「マクロファージ」、Ｍは「巨核球」を含有するコロニーであることを意味する。図１２に示されるように、細胞コロニーの多くは、巨核球を含むものであった。
実施例４：ヒト造血幹細胞の長期培養に更に適した条件の検討
　ヒト造血幹細胞を増殖させることができる化合物存在下で、ヒト造血幹細胞の長期の培養を試みた。
　上記ヒト造血幹細胞用の培養培地であって、ＳＣＦとＴＰＯの代わりにＰＩ３Ｋａ２０μＭ、およびＴＰＯａｇｏ　０．１μＭを含む培養培地（ＰＩ３Ｋａ２０μＭ＋ＴＰＯａｇｏ　０．１μＭ）、および当該培地に対して、ＳＲ－１（５００ｎＭ）およびＵＭ１７１（３５ｎＭ）のいずれかまたは両方を更に添加して作製した培地（＋ＳＲ－１、＋ＵＭ１７１、および＋ＳＲ－１＋ＵＭ１７１）を用意した。購入したヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞（販売社名Ｌｏｎｚａ、製品番号２Ｃ－１０１）あるいは、譲渡されたＦｒｅｓｈな臍帯血をｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いてＣＤ３４＋細胞を上記のように分離して培養実験に用いた。２４ウェルプレートに１ウェルあたり０．２～１．０×１０５細胞を分注し、用意した培地においてＣＤ３４＋細胞を培養した。培養開始後１４日目に上記と同様にして細胞総数およびＣＤ３４＋細胞を計数し、培養開始前からの増殖率を求めた。結果は、図１３に示される通りであった。図１３に示されるように、ＵＭ１７１を更に含む培養培地においては、細胞総数およびＣＤ３４＋細胞数が増加し、ＣＤ３４＋細胞の増加率は、ＵＭ１７１を含まない培地と比較してＵＭ１７１を含む培地において有意に増大した。これに対して、ＳＲ－１は、本実験条件においては、細胞を死滅させた。
　さらに、条件１：上記ヒト造血幹細胞用の培養培地であって、ＳＣＦとＴＰＯの代わりにＰＩ３Ｋａ２０μＭ、およびＴＰＯａｇｏ　０．１μＭを含む培養培地（ＰＩ３Ｋａ２０μＭ＋ＴＰＯａｇｏ　０．１μＭ）で１４日間培養するもの、条件２：７日目以降はブチザミドを含まない培地（ＰＩ３Ｋａ２０μＭ）条件で培養するもの（Ｄａｙ７－Ｂｕｔｙなし）、および、条件３：培養培地（ＰＩ３Ｋａ２０μＭ＋ＴＰＯａｇｏ　０．１μＭ）にＵＭ１７１を更に添加した培地（＋ＵＭ１７１）で１４日間培養するものの、３つの条件下でＣＤ３４＋細胞を培養して、細胞総数およびＣＤ３４＋細胞数の増加率を求めた。また、ＣＤ４１＋細胞数をフローサイトメーターを用いて求めた。結果は、図１４に示される通りであった。図１４に示されるように、培養開始後７日目にブチザミドを抜いた培地で培養する条件２では、条件１と比較して、ＣＤ３４＋細胞数が増加し、ＣＤ４１＋細胞数が減少した。図１４に示されるように、ＵＭ１７１を更に添加した培地で培養する条件３では、条件１や２と比較して、ＣＤ３４＋細胞の増加率が顕著に増大し、ＣＤ４１＋細胞数が顕著に減少した。このことから、ＰＶＡ、ＰＩ３ＫａおよびＴＰＯａｇｏ存在下の無血清培地条件において、ＵＭ１７１は、ヒト造血幹細胞を増殖させ、巨核球前駆細胞や巨核球への細胞の分化を抑制することが明らかとなった（図１５参照）。
実施例５：培養後のＣＤ３４＋細胞の移植実験
　条件１～３のそれぞれで７日間培養したヒトＣＤ３４＋細胞を照射ＮＯＧマウスへ移植して細胞の生着を確認した。具体的には、培養後のヒトＣＤ３４＋細胞を１．５Ｇｙのγ線照射したＮＯＧマウスに１×１０４細胞移植した。移植１２週間後に、前記ＮＯＧマウスの末梢血を採取し、フローサイトメーターを用いて末梢血中の細胞成分を分析した。結果は、図１６に示される通りであった。図１６に示されるように、条件１および２において、造血幹細胞の生着率が、培養前ＣＤ３４＋細胞を移植したときにそれぞれ１４．９％および１１．１％であったのが、培養後のＣＤ３４＋細胞を移植するとそれぞれ６６．６％および５４．９％に増加した。また、条件３において、造血幹細胞の生着率が、培養前ＣＤ３４＋細胞を移植したときに１７％であったのが、培養後のＣＤ３４＋細胞を移植すると６７％に増加した。
　このことから、アルブミン非存在下の無血清培地条件において、ＰＶＡ存在下で、ＰＩ３Ｋ活性化剤およびＴＰＯ受容体アゴニストは、ヒト造血幹細胞を良好に増殖させること、および増殖したヒトＣＤ３４＋細胞は、造血幹細胞としての性質を維持し、他個体への移植後の生着率を向上させることが明らかとなった。また、ヒト造血幹細胞は、この条件下において長期培養するとその一部が巨核球に分化し、これにより巨核球を得ることができる一方で、一部がＣＤ３４＋細胞として増殖する傾向を有する。ここにＵＭ１７１を添加すると、ＣＤ３４＋細胞の増殖率が向上し、巨核球への分化を抑制しうることも明らかとなった。
　次に、新鮮なヒトさい帯血からヒト単核球を分離した。条件１および条件３で、得られた細胞（５×１０５細胞）を培養し、培養開始７日後および１４日後に総細胞数、ＣＤ３４＋細胞数、総細胞に占めるＣＤ３４＋細胞の割合、および細胞の生存率をそれぞれ求めた。結果は、図１７に示される通りであった。図１７に示されるように、いずれの条件下においても、ヒトさい帯血から得られた単核球は、培養と共に細胞総数を減少させた。一方で、条件３では、総細胞に占めるＣＤ３４＋細胞の割合が条件１よりも顕著に向上した。また、細胞の生存率も、条件３において条件１よりも有意に高かった。さらに、ＣＤ３４＋細胞数は、条件３で顕著な増大を示したのに対して、条件１では、細胞数は維持された点では良好であったものの、細胞数の増加は認められなかった。

Claims (18)

  1. 　ヒト造血幹細胞を培養するまたは製造する方法であって、
    　ヒト造血幹細胞を培養培地中で培養することを含み、
    　培養培地は、ポリビニルアルコールを含み、かつ、
    　（１）ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）アクチベータと、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
    　（２）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
    　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含み、
    　上記培養によって、ヒト造血幹細胞の数が増加する、
    方法。
  2. 　前記培養培地が、無血清培地である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記培養培地が、化学的に定義された培地である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記培養培地が、アルブミンを実質的に含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　増加したヒト造血幹細胞を得ることを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　培養培地が、ＰＩ３Ｋアクチベータを含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　培養培地が、ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯのアゴニストを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　培養培地が、ＳＣＦおよびＴＰＯの両方を含まない、請求項７に記載の方法。
  9. 　培養培地が、４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　培養期間が７日以上である、請求項９に記載の方法。
  11. 　ヒト造血幹細胞と、アルブミンの代替としてポリビニルアルコールと、
    　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上と；
    　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストと；または
    　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストと、
    を含む、組成物。
  12. 　ＰＩ３ＫアクチベータおよびＴＰＯ受容体アゴニストを含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 　４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（ＵＭ１７１）をさらに含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
  14. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒト造血幹細胞。
  15. 　アルブミンの代替として、ポリビニルアルコールを含み、かつ、
    　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
    　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
    　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含む、
    ヒト造血幹細胞用の培養培地。
  16. 　無血清培地である、請求項１５に記載の培養培地。
  17. 　化学的に定義された培地である、請求項１５に記載の培地。
  18. 　アルブミンを含まない、請求項１５～１７のいずれかに記載の培地。 

     
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